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ICP) en urgence (< 120 min) n' est pas indiquée (voir rubriques 4. 4 et 5. 1). | EMEA_V3 | Medicinal |
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Rudolf Dreikurs (né le 8 février 1897 à Vienne (Autriche) - mort le 25 mai 1972 à Chicago) est un psychiatre et enseignant autrichien ayant développé une approche particulière de la psychologie individuelle d'Alfred Adler. Il a fondé la North American Society of Adlerian Psychology (en) en 1952.
Biographie
Dreikurs fait ses études à l'université de Vienne o il obtient son diplôme de médecin en 1923. Il émigre aux États-Unis en 1937.
Bibliographie
A Parent's Guide to Child Discipline par Rudolf Dreikurs et Loren Grey (ISBN 978-0-801-55736-1)
The Challenge of Marriage (ISBN 978-1-560-32662-5)
The Challenge of Parenthood (ISBN 978-0-801-51182-0)
Children : The Challenge by Rudolf Dreikurs, Vicki Soltz (ISBN 978-0-470-83508-1)
Coping With Children's Misbehavior, a Parent's Guide (ISBN 978-0-801-51764-8)
Discipline Without Tears by Rudolf Dreikurs, et al. (ISBN 978-0-452-26898-2)
Encouraging Children to Learn par Don, Sr. Dinkmeyer et Rudolf Dreikurs (ISBN 978-1-583-91082-5)
Family council : the Dreikurs technique for putting an end to war between parents and children (and between children and children) (ISBN 978-0-809-29010-9)
Fundamentals of Adlerian Psychology (ISBN 978-0-918-56008-7)
Maintaining Sanity in the Classroom : Classroom Management Techniques by Rudolf Dreikurs, et al. (ISBN 978-1-560-32727-1)
New Approach to Discipline : Logical Consequences (ISBN 978-0-452-27170-8)
Psychology in the Classroom : A Manual for Teachers (ISBN 978-0-060-41756-7)
Social Equality the Challenge of Today (ISBN 978-0-918-56030-8)
The Courage to Be Imperfect : The Life and Work of Rudolf Dreikurs Biography by Janet Terner, W. L. Pew. New York 1978 (ISBN 978-0-801-51784-6)
Notes et références
(en) Cet article est partiellement ou en totalité issu de l'article de Wikipédia en anglais intitulé Rudolf Dreikurs (voir la liste des auteurs).
Liens externes
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SUPPOSITOIRE A LA GLYCERINE CENTRAPHARM ENFANTS, suppositoire en vrac - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 08/07/2016 Glycérol. 1, 152 g Pour un suppositoire de 1, 92 g. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Suppositoire Préparations aux examens endoscopiques du rectum. Voie rectale - Réservé à l'enfant de plus de 2 ans. Le suppositoire peut être trempé dans l'eau froide pour en faciliter l'introduction. Enfants de 2 à 6 ans 1 suppositoire enfant 5 à 30 minutes avant l'heure choisie pour l'exonération. Enfants de plus de 6 ans 1 suppositoire enfant 5 à 30 minutes avant l'heure choisie pour l'exonération à renouveler éventuellement dans la demi-heure ou l'heure qui suit en cas de constipation rebelle. Le traitement de la constipation ne doit pas, en moyenne, dépasser 10 jours. Une utilisation prolongée dans le cadre du traitement de la constipation est déconseillée. Le traitement médicamenteux de la constipation n'est qu'un adjuvant au traitement hygiéno-diététique : enrichissement de l'alimentation en fibres végétales et en boissons, conseils d'activité physique et de rééducation de l'exonération. Chez l'enfant, la prescription de laxatifs doit être exceptionnelle : elle doit prendre en compte le risque d'entraver le fonctionnement normal du réflexe d'exonération. Précautions d'emploi Il est préférable de ne pas utiliser ce médicament dans les cas de poussées hémorroïdaires, de fissures anales, de rectocolite hémorragique. Grossesse En l'absence de données cliniques chez la femme enceinte, il est préférable de ne pas prendre ce médicament. En l'absence de données cliniques chez la femme allaitante, il est préférable de ne pas prendre ce médicament. Un usage prolongé peut donner lieu à des sensations de brûlures anales et exceptionnellement des rectictes congestives. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . Peu probable du fait du mode d'administration. Laxatif par voie rectale. Non renseignée. Non renseignée. 3 ans 10 suppositoires en sachet. 25 suppositoires en sachet. 50 suppositoires en sachet. Pas d'exigences particulières pour l'élimination. Tout 52 AVENUE DU GENERAL LECLERC 75014 PARIS 34009 334 777 3 8 : 25 suppositoires en sachet (PE). 34009 334 779 6 7 : 50 suppositoires en sachet (PE). Sans objet. Sans objet. Médicament non soumis à prescription médicale. | BDPM | Medicinal |
Chez certains patients ayant un stade avancé d'infection par le VIH ainsi que des antécédents d'infection opportuniste, des signes et des symptômes d'inflammation provenant d'infections précédentes peuvent survenir peu de temps après le début du traitement anti -VIH. | EMEA_V3 | Medicinal |
La cytarabine a induit une transformation des cellules embryonnaires du hamster et des cellules H43 du rat in vitro. | EMEA_V3 | Medicinal |
troubles musculaires ont été rapportés comme graves. | EMEA_V3 | Medicinal |
QUELLES SONT LES INFORMATIONS A CONNAITRE AVANT DE PRENDRE OLANZAPINE TEVA | EMEA_V3 | Medicinal |
Consultez immédiatement votre médecin en cas d' apparition de signes précoces des réactions allergiques (hypersensibilité) telles que : | EMEA_V3 | Medicinal |
Étude de l'effet de l'injection de Cellules Stromales Mésenchymateuses sur un modèle de fibrose colorectale radio-induite chez le rat Benot Usunier To cite this version : Benot Usunier. Étude de l'effet de l'injection de Cellules Stromales Mésenchymateuses sur un modèle de fibrose colorectale radio-induite chez le rat. Cancer. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2016. Français. NNT : 2016PA066434. tel-01544870 HAL Id : tel-01544870 Submitted on 22 Jun 2017 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Thèse de Doctorat de L'Université Pierre et Marie Curie École Doctorale 394 : Physiologie, physiopathologie et thérapeutique Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN) Laboratoire de Recherche en Régénération des tissus sains Irradiés (LR2I) Étude de l'effet de l'injection de Cellules Stromales Mésenchymateuses sur un modèle de fibrose colorectale radio-induite chez le rat Présentée par Benot USUNIER Dirigée par le Docteur Marc Benderitter Encadrée par le Dr Alain Chapel Présentée et soutenue publiquement le 14 décembre 2016 Devant un jury composé de : M le Professeur Norbert-Claude GORIN Mme le Docteur Rima HADDAD M le Docteur Jan VOSWINKEL Mme le Docteur Annette K. LARSEN M le Docteur Jean-Marc SIMON M le Docteur Alain CHAPEL M le Docteur Abdellatif ELM'SELMI Président Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Membre invité Membre invité i La recherche, c'est l'acte par lequel une société avancée exprime sa foi en un avenir ouvert. Claude Détraz ii iii Remerciements Je tiens à remercier chacun des membres de mon jury d'avoir accepté d'évaluer ce travail de thèse : - - - - - Le Professeur Norbert-Claude Gorin, pour avoir accepté de présider ce jury Le Docteur Rima Haddad, pour avoir accepté d'en être rapporteur Le Docteur Jan Voswinkel, pour avoir accepté d'en être rapporteur Le Docteur Annette K. Larsen, pour avoir accepté d'en être examinateur Le Docteur Jean-Marc Simon, pour avoir accepté d'en être examinateur J'adresse également mes sincères remerciements au Docteur Alain Chapel et au Docteur Abdellatif Elm'Selmi pour avoir accepté de siéger en tant que membre invité au sein de ce jury. Je tiens à remercier Marc Benderitter de m'avoir accueillie au sein du LRTE, puis du SRBE, et d'avoir dirigé ces travaux de thèse. Mes sincères remerciements pour sa confiance et les nombreuses occasions qu'il m'a données de présenter mes travaux en congrès internationaux. Merci à Radia Tamarat pour son accueil au sein du LR2I, ainsi que pour sa disponibilité. Un chaleureux merci à Alain Chapel pour sa confiance, sa disponibilité et ses conseils qui m'ont permis d'affiner mon esprit scientifique. Merci pour tes encouragements, nombreux, qui m'ont permis d'avancer au cours de ces travaux. Merci pour tes conseils et ton expérience que, malgré mon envie constante de te contredire, me suivront au cours de ma carrière et de ma vie. J'ai été honoré de profiter de ton encadrement. Je tiens également à remercier mes collègues du LR2I, à l'écoute, disponibles et bienveillants, et qui ont contribué à rendre cette expérience mémorable. Bruno, merci pour ton aide, continue la surveillance des nouveaux thésards, des fois qu'il y ait besoin de recadrer tout ça. Christine, merci pour nos séances de psychanalyse dans ton bureau, pour ta gentillesse et ton entrain communicatif ! Merci à Alexandra, Christelle et Nolle pour votre aide, vos conseils et le partage de votre expérience. Merci d'avoir répondu présentes à mes nombreuses sollicitations. Valérie, merci pour l'aide que tu m'as apportée, notamment dans la dernière ligne droite. Merci à toi Claire pour ta gentillesse et pour l'importance que tu as portée à mon avis de jeune chercheur. Merci à Carine pour sa bienveillance et ses propositions d'aide répétées. Stéphane, merci pour ta bonne humeur et ta disponibilité permanente, quelle que soit la question. iv Merci à tout le L3R, mon labo d'adoption (si vous voulez bien, même à titre honorifique). Merci à tous les chercheurs, Fabien, Agnès, Olivier, Vincent et Céline, avec lesquels les discussions scientifiques (ou pas) ont toujours été intéressantes. Valérie et Georges, merci pour cette confortable chaise dans laquelle je me suis assis si souvent pour nos conversations endiablées ! Merci à tous pour votre bienveillance et votre considération vis-à-vis des étudiants. J'ai beaucoup apprécié m'incruster à vos pots divers et variés, et j'espère que vous n'avez pas trop regretté de m'avoir invité . Je tiens à remercier les membres du GSEA pour leur aide et leur camaraderie au cours de ces années. Amandine, merci d'avoir supportée mon humeur si imprévisible. Merci d'avoir été une collègue gentille et attentionnée, je ne t'oublierai pas. Merci à Mélanie pour sa disponibilité et sa bonne humeur. Merci à Delphine, Romain, Salif, Frédéric et Sébastien pour leur aide. Merci au LRTOX, chez lesquels j'ai également souvent profité des anniversaires et autres pots de départ. Les petits tours de vos bureaux vont me manquer, et j'espère qu'ils vous manqueront également. Merci à tous pour votre bienveillance et votre sourire, j'ai beaucoup apprécié passer ce temps avec vous. Mesdames et messieurs du LDB, ne pensez pas que je vais vous oublier ! Ces 3 ans pendant lesquels j'ai tenté de décoder l'ADN du laboratoire le plus mystérieux du SRBE ont été passionnants. S'il-vous-plait, visitez le rez-de-chaussée plus souvent, ils le méritent ! Merci pour votre sourire constant, malgré le caractère imprévisible de mes apparitions ! Continuez d'envoyer les vidéos ! Merci à Amine pour sa disponibilité et sa gentillesse ! J'étais très heureux de te côtoyer à nouveau après nos aventures orientales. Continue de ménager les pauvres biologistes, malgré leur ignorance de la science statistique. Merci à Véronique pour sa gentillesse et son sourire. Chloé, tu as contribué à rendre mon séjour à l'IRSN plus agréable par ta bonne humeur, j'espère en échange avoir contribué à la santé mentale des techniciens SFR. Sandra, tu le sais, merci pour tout ! Merci pour ta bonne humeur permanente, pour ton dynamisme extraordinaire et pour toutes ces choses improbables dont toi seule a le secret (poulpes) ! Grâce à toi l'univers des grandes femmes de ce Monde, et de KimK en particulier, n'a plus de secret pour moi. Merci d'avoir rendu les journées moins mornes (et appelez-moi Berthier). Thésards, post-doctorants et stagiaires anciens et présents qui êtes arrivés jusqu'ici, vous vous demandez sûrement pourquoi votre nom n'a pas été cité avec ceux des membres de votre laboratoire. Ça arrive tout de suite. Lara, tu as toujours été présente pour moi pendant ces 3 ans. Merci pour ta joie de vivre communicative, ton amitié inconditionnelle et ta disponibilité à tout moment. Reste telle que tu es, et n'oublie pas Mabrouk. Christelle, merci pour ton oreille attentive dans n'importe quelle v situation. En tant que l'une de mes plus anciennes collègues, tu as su m'écouter et m'apporter des conseils avisés qui m'ont aidé à évoluer dans le bon sens. Merci pour ta bonne humeur de toujours. Elodie, merci pour ton amitié pendant ces (presque) 3 ans. Merci pour ton accueil lors de mon arrivée dans ce milieu déroutant des thésards IRSN. Merci pour tes rires et pour ta tolérance à la souffrance psychologique que je t'ai infligée (pas trop j'espère). Ça n'aurait vraiment pas été pareil sans toi ! Mon petit Cyprien, mon compagnon de voyage, merci pour tes blagues improbables et ton humeur constante. J'ai apprécié t'avoir comme partenaire de traversée de cet océan qu'est la thèse. Merci aux sœurs Musigrand, Stéfania et Marie, les deux inséparables du LRTOX ! Le tour du soir n'a plus jamais été le même sans vous. Prenez garde à votre fenêtre, on ne sait jamais qui pourrait toquer ! Merci à Clélia pour son dynamisme de toujours, et son humeur bretonne légendaire ! Aurélie, notre séjour japonais restera un souvenir fort de ma thèse. J'espère que tu peux enfin travailler en toute tranquillité maintenant que je suis parti, te perturber en plein travail me manquera ! Yoann, merci pour ton aide au cours de ces années. Nous avons été heureux de t'adopter au sein du SRBE. Amélie, ma fille adoptive, continue à être la plus jeune et à traiter les vieux thésards de ringards . Ton rire va me manquer ! Fanny, ton départ a laissé un vide au rez-de-chaussée. Merci pour ta bonne humeur de toujours. Je pense à toi et te souhaite bonne chance pour la suite. Merci à Alexandre pour sa gentillesse et ses connaissances cinématographiques qui m'ont permis de m'ouvrir au monde incroyable de Marvel. Bon courage pour ta thèse et merci de prendre la relève ! Merci à Emilie, l' ancêtre des thésards du bâtiment 05, pour sa bonne humeur de toujours. Merci à Jérémy et Frédéric de reprendre le flambeau de l'élite des thésards de l'IRSN. J'ai été heureux de finir ma thèse en votre compagnie. Bon courage à vous pour la suite. Julianna, ton sourire et ta joie communicative vont me manquer. Merci à Céline et Christèle du LRTOX. Faites attention aux fenêtres ! Dimitri, surveille-moi bien tout ça et merci pour les histoires d'autoroute. Merci à Sabine et Lucie du LEPID pour leur compatissance lors de ces parties de squash endiablées. Merci à tous les autres que j'ai croisé au cours de ces années : Bastien, Sarra, Maéva, Brice, Baptiste, Louison, Christine, Alexia, Sonia, Aurore, Alyson, Virginie, Morgane, Anthony, Nadia, Nicolas, Tiffany. Merci à tous ceux que j'ai pu oublier et qui ont contribué à mon expérience de thèse. Merci du fond du cœur à ma famille pour leur soutien au cours de cette épreuve. Vous m'avez toujours compris et épaulé au cours de ces années et je n'aurai pas pu faire ce travail sans votre aide. Merci enfin à mon épouse, Camille. Rien n'aurait été possible sans toi et ton soutien permanent. Tu as fait preuve d'un courage immense, jonglant entre ta vie de femme active et l'éducation de nos enfants, et tu as relevé ce défi comme personne n'aurait pu le faire. Merci pour nos deux filles, et merci d'être là à mes côtés. vi vii Communications Publications Publiées Lara Moussa, Benot Usunier, Christelle Demarquay, Marc Benderitter, Radia Tamarat, Alexandra Sémont, Nollle Mathieu, Bowel Radiation Injury : Complexity of the pathophysiology and promises of cell and tissue engineering Cell Transplantation, 2016. Benot Usunier, Marc Benderitter, Radia Tamarat, and Alain Chapel, Management of fibrosis : The Mesenchymal Stromal Cells Breakthrough, Stem Cells International, vol. 2014, Article ID 340257, 26 pages, 2014. doi : 10. 1155/2014/340257. Aniya Larbi, Maria Teresa Mitjavila-Garcia, Stéphane Flamant, Yannick Valogne, Denis Clay, Benot Usunier, Bruno l'Homme, Olivier Féraud, Ibrahim Casal, Emilie Gobbo, Dominique Divers, Alain Chapel, Ali G. Turhan, Annelise Bennaceur-Griscelli, Rima Haddad, Generation of Multipotent Early Lymphoid Progenitors from Human Embryonic Stem Cells, Stem Cells and Development. December 2014, 23(24) : 2983-2995. doi : 10. 1089/scd. 2014. 0171. Sabine François, Benot Usunier, Luc Douay, Marc Benderitter, Alain Chapel, Long-Term Quantitative Biodistribution and Side Effects of Human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) Engraftment in NOD/SCID Mice following Irradiation, Stem Cells International. 2014 ; 2014 : 939275. doi : 10. 1155/2014/939275. Soumises Benot Usunier, Bruno L'Homme, Marc Benderitter, Alain Chapel, HGF and TSG-6 released by Mesenchymal Stem Cells attenuate radiation-induced colorectal fibrosis by suppressing the pro- fibrotic activity of colonic smooth muscle cells and macrophages Sabine François, Benot Usunier, Marie-Elisabeth Forgue-Lafitte, Thi Cam Ha Che, Bruno L'Homme, Sandrine Bouchet, Fahd Hached, Djaber Benaoumeur, Marc Benderitter, Luc Douay, Norbert-Claude Gorin, Annette K. Larsen, Alain Chapel, Mesenchymal stem cell administration inhibits colorectal cancer progression and promotes survival : mechanism of action and rationale for clinical use viii Communications orales Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Mesenchymal stem cell therapy reduces fibrosis induced by abdomino-pelvic radiotherapy, JED 2016, ED 394, 25 et 26 mai 2016, Paris. Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Étude de l'effet de l'injection de Cellules Souches Mésenchymateuses sur la fibrose induite par radiothérapie abdomino-pelvienne , Journées des thèses IRSN 2016, 21-24 mars 2016, Le Croizic. Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Effets des Cellules Souches Mésenchymateuses sur les complications sévères et chroniques des radiothérapies abdomino-pelviennes , Journées des thèses SRBE 2016, 10 mars 2016, Fontenay-aux-Roses. Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Effets des Cellules Souches Mésenchymateuses sur les complications sévères et chroniques des radiothérapies abdomino-pelviennes , Journées des thèses IRSN 2015, 31 mars-2 avril 2015, L'Isle-sur-la-Sorgue. Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Effets des Cellules Souches Mésenchymateuses sur les complications sévères et chroniques des radiothérapies abdomino-pelviennes , Journées des thèses SRBE 2015, 18 mars 2015, Fontenay-aux-Roses. Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Mesenchymal Stem Cell therapy for the treatment of severe and chronic radiation-induced abdomino-pelvic complications refractory to standard therapy, Cell & Gene Therapy, 2014, Las Vegas, USA. Communications affichées Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Mesenchymal Stem Cell therapy for the treatment of severe and chronic radiotherapy-induced abdomino-pelvic complications refractory to standard therapy, JED 2015, ED 394, 6 et 7 mai 2015, Paris. ix Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Mesenchymal Stem Cell (MSC) therapy for the treatment of severe and chronic radiotherapy-induced abdomino- pelvic complications refractory to standard therapy, ICRR 2015, 25-29 mai 2015, Kyoto, Japon. Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Mesenchymal Stem Cell (MSC) therapy for the treatment of severe and chronic radiotherapy-induced abdomino- pelvic complications refractory to standard therapy, ESRAH 2015, 23-24 mai 2015, Hirosaki, Japon. Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Mesenchymal Stem Cell therapy for the treatment of severe and chronic radiotherapy-induced abdomino-pelvic complications refractory to standard therapy, JED 2015, ED 394, 22 et 23 mai 2014, Paris. Prix Benot Usunier, Bruno L'Homme, Radia Tamarat, Marc Benderitter and Alain Chapel. Mesenchymal Stem Cell (MSC) therapy for the treatment of severe and chronic radiotherapy-induced abdomino- pelvic complications refractory to standard therapy. Young Investigator Award, 42nd Annual Meeting of the European Radiation Research Society ERR 2016, 2016 x xi Table des matières Avant-propos . 1 État de l'art . 7 A. Effets secondaires de la radiothérapie : les survivants du cancer . 7 I. Radiothérapie . 7 1. Rayonnements ionisants . 8 a. Effets biologiques des rayonnements ionisants . 8 2. Modalités de la radiothérapie . 11 a. Dose et organes à risque . 11 b. Optimisation du protocole . 12 II. Radiothérapies abdomino-pelviennes . 16 1. Cancers et organes à risque . 16 2. Le cancer colorectal . 18 a. Carcinogénèse colorectale . 19 b. Le microenvironnement tumoral . 20 3. Radiothérapies abdomino-pelviennes et complications colorectales . 23 a. Anatomie du côlon-rectum . 23 b. Complications des radiothérapies abdomino-pelviennes . 27 c. Traitements des effets secondaires au côlon-rectum . 31 d. Thérapie cellulaire par les CSM pour le traitement des atteintes radio-induites au côlon-rectum . 34 B. La fibrose : principale séquelle tardive des radiothérapies . 41 I. La cicatrisation à l'origine de la fibrose . 41 II. La fibrose radio-induite . 42 1. L'initiation de la fibrose . 45 2. L'inflammation chronique à l'origine de la fibrose . 47 a. Réponse des lymphocytes T . 48 b. Influence de la polarisation des macrophages . 51 xii 3. Les myofibroblastes : principaux acteurs cellulaires de la fibrose . 54 a. Migration des myofibroblastes . 58 b. EMT et EndoMT . 59 4. Les acteurs moléculaires de la fibrose. 61 a. TGF-1. 61 b. CTGF . 68 5. Les spécificités de la fibrose intestinale . 69 C. Le potentiel de la thérapie cellulaire . 71 I. Fonction des cellules souches . 72 1. Types de cellules souches . 72 2. Hématopoïèse, niche et quiescence des cellules souches . 73 II. La thérapie cellulaire . 75 1. Le choix des cellules souches en thérapie cellulaire (ES, IPs, CSH, CSM) . 75 a. Les cellules différenciées . 76 b. Les cellules souches embryonnaires . 76 c. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSc) . 78 d. Les cellules souches hématopoïétiques . 79 III. Les cellules souches mésenchymateuses . 79 1. Origines et différences phénotypiques des CSM . 80 2. Différenciation des CSM . 81 3. Fonction des CSM . 82 a. Soutien de l'hématopoïèse . 82 b. Régénération . 83 c. Immunomodulation . 85 d. Homing des CSM. 91 e. Sécrétion par les CSM . 92 4. Effets secondaires de la thérapie cellulaire par les CSM . 96 a. Immunogénicité . 96 xiii b. Effet pro-fibrosant des CSM . 96 c. Effet des CSM sur la tumeur . 97 5. Reprogrammation des CSM . 105 6. Isolement, amplification et caracterisation des CSM . 107 7. Application des CSM en clinique . 110 a. Régénération osseuse . 110 b. Régénération du myocarde . 110 D. Les CSM : la réponse recherchée ? . 112 I. Traitements anti-fibrosants actuels . 112 II. CSM et fibrose . 114 1. Études précliniques . 114 a. Immunomodulation . 114 b. La voie TGF-1 . 116 c. Hypoxie/stress oxydant . 118 d. Remodelage matriciel . 119 e. Modalités de traitement par les CSM . 122 f. HGF et TSG-6 participent à l'effet anti-fibrosant des CSM . 125 2. Essais cliniques de traitement de la fibrose par les CSM . 134 Problématique et objectifs . 137 Article 1 : Mesenchymal stem cell administration inhibits colorectal cancer progression and promotes survival : mechanism of action and rationale for clinical use . 139 Article 2 : HGF and TSG-6 released by Mesenchymal Stem Cells attenuate radiation-induced colorectal fibrosis by suppressing the pro-fibrotic activity of colonic smooth muscle cells and macrophages . 183 Discussion et perspectives . 221 A. Mesenchymal stem cell administration inhibits colorectal cancer progression and promotes survival : mechanism of action and rationale for clinical use . 222 I. Description du modèle . 222 1. Le modèle de cancérogène colorectale . 222 xiv 2. Le modèle de stérilisation tumorale par irradiation fractionnée . 223 II. Effet des CSM . 224 1. Évolution de la cancérogénèse colorectale après traitement par les CSM . 224 2. Évolution de la cancérogénèse colorectale et des tissus sains irradiés après radiothérapie puis traitement par les CSM . 226 III. Conclusion . 226 B. Article 2 : Mesenchymal Stromal Cells attenuate radiotherapy-induced colorectal fibrosis through the release of HGF and TSG-6 . 227 I. Le modèle d'irradiation à 29 Gy en dose unique . 227 1. Le choix du modèle . 227 2. Transplantation de CSM . 228 II. Description de la lésion . 228 1. Évolution de la lésion tardive . 229 a. Remodelage matriciel . 229 b. Cellules pro-fibrosantes . 232 c. Inflammation. 234 d. Mécanismes de développement de la fibrose dans le modèle d'irradiation colorectale dose unique . 239 2. Conclusion . 239 III. Effet des CSM sur le développement de la fibrose colorectale radio-induite . 240 1. Remodelage matriciel . 241 2. Myofibroblastes/voie TGF-/Smad . 243 a. Myofibroblastes . 244 b. CML . 244 3. Inflammation . 245 a. Apoptose/prolifération . 245 b. Réponse des cellules T CD4 . 246 c. Macrophages . 247 4. Conclusion sur l'effet des CSM . 248 xv IV. HGF et TSG-6 sécrétés par les CSM participent à la réduction de la fibrose . 248 1. Implication de HGF dans l'effet anti-fibrosant des CSM . 249 2. Implication de TSG-6 dans l'effet anti-fibrosant des CSM . 251 V. Perspectives . 255 1. Description du modèle . 255 2. Effet des CSM . 255 3. Implication de HGF et TSG-6 dans l'effet des CSM sur la fibrose . 256 4. Optimisation du protocole . 257 Conclusion . 259 xvi xvii Table des figures Figure 1 : pouvoir de pénétration des différents types de rayonnements ionisants . 8 Figure 2 : séquences d'évènements moléculaires et cellulaires induits par l'irradiation (D'après Bentzen, 2006) (Bentzen, 2006) . 10 Figure 3 : Pic de Bragg : comparaison entre le dépôt d'énergie des photons (orange) et des protons (bleu). Le dépôt de dose des protons peut être modulé en largeur et en profondeur. (source : consulté le 22/07/2016) . 13 Figure 4 : incidence du cancer colorectal dans le Monde. (Taux estimé sur 100, 00 personnes). Le cancer colorectal est le troisième en termes d'incidence chez l'homme (746, 000 cas, 10% du total) et le second chez les femmes (614, 000 cas, 9, 2% du total) (source : IARC) . 18 Figure 5 : illustration des 4 grades de l'évolution tumorale, du stade 0 au stade IV avec l'invasion des cellules cancéreuses vers d'autres organes via la circulation sanguine (source : . 19 Figure 6 : Mécanismes de cancérogenèse induite par les agents chimiques. . 20 Figure 7 : Microenvironnement tumoral (D'après Quail et Joyce, 2013) (Quail et Joyce, 2013) . 21 Figure 8 : anatomie du côlon-rectum humain (Source : . 22 Figure 9 : coupe de côlon (coloration Hématoxyline-Éosine-Safran) . 23 Figure 10 : Organisation d'une crypte colique (d'après Barker, 2014) (Barker, 2014) . 25 Figure 11 : mécanismes et manifestations de la PRD . 29 Figure 12 : séquence d'évènements initiant la fibrogénèse au cours de la cicatrisation (D'après Rieder et coll. , 2007) (Rieder et coll. , 2007) . 42 Figure 13 : mécanismes cellulaires et moléculaires de développement de la fibrose . 44 Figure 14 : caractéristiques des différents états d'activation des macrophages (Wynn et Barron, 2010, Duffield et coll. , 2013, Lech et Anders, 2013) . 53 xviii Figure 15 : mécanismes de différenciation des fibroblastes en myofibroblastes : plusieurs paramètres sont nécessaire à l'acquisition des capacités contractiles des myofibroblastes : la présence de contraintes mécaniques au sein du tissu, la disponibilité de TGF-1 activé et la production du variant d'épissage ED-A de la fibronectine (D'après Tomasek et coll. , 2002) (Tomasek et coll. , 2002) . 56 Figure 16 : marqueurs spécifiques de la transition épithélium-mésenchyme (D'après Kalluri et Weinberg, 2009) (Kalluri et Weinberg, 2009) . 60 Figure 17 : mécanismes d'activation et d'inhibition de la voie Smad (D'après Akhurst, 2012) (Akhurst et Hata, 2012) . 62 Figure 18 : interactions entre la voie TGF-/Smad et d'autres voies de signalisation (D'après Meng et coll. , 2016) (Meng et coll. , 2016) . 64 Figure 19 : origine des cellules souches chez l'Homme. 72 Figure 20 : population cellulaire du système médullaire stromal (D'après Winslow T. et Kibiuk L. , 2001) . 74 Figure 21 : hypothèse du mesengenic process : différenciation des CSM en cellules du mésoderme in vivo et in vitro (D'après Singer et Caplan, 2011) (Singer et Caplan, 2011) . 81 Figure 22 : mécanismes impliqués dans l'immunomodulation par les cellules souches mésenchymateuses (D'après Singer et Caplan, 2011) (Singer et Caplan, 2011) . 90 Figure 23 : mécanismes de réparation tissulaire et cellulaire par les CSM (D'après Spees et coll. , 2016) (Spees et coll. , 2016) . 93 Figure 24 : interaction des CSM avec le microenvironnement tumoral (D'après Hass, 2012) (Hass et Otte, 2012) . 103 Figure 25 : reprogrammation des CSM par activation des TLR : l'activation des CSM via des récepteurs différents induit une modification de leur phénotype (D'après Bétancourt, 2013) (Betancourt, 2013) . 105 Figure 26 : méthodes d'obtention des CSM et des ASC. La partie gauche de la figure illustre l'obtention des ASC ; noter l'importance de l'étape de digestion. La partie droite de la figure illustre l'obtention des CSM ; noter que l'étape de séparation des cellules mononucléées n'est pas indispensable (voir texte). . 109 xix Figure 27 : effet des CSM sur les cellules du système immunitaire . 115 Figure 28 : mécanismes d'action des CSM sur les modèles précliniques de fibrose . 121 Figure 29 : mécanismes d'action du HGF (D'après Gallo et coll. , 2015) (Gallo et coll. , 2015) 129 Figure 30 : mécanisme d'action du TSG-6 sur les macrophages (D'après Choi et coll. , 2011) (Choi et coll. , 2011) . 132 Figure 31 : mécanismes d'action supposés du TSG-6 sur la fibrose . 133 Figure 32 : voies d'activation et de répression du signal TGF- pendant la fibrose. . 231 Figure 33 : mécanismes impliqués dans le développement de la fibrose colorectale radio- induite chez le rat. 1 : les rayonnements ionisants induisent des dommages aux cellules résidentes et le recrutement des cellules immunitaires, la production de ROS et l'activation de TGF-1. La production de cytokines et de ROS par les cellules immunitaires contribue à l'activation de TGF-1 et la différenciation des myofibroblastes. 2 : L'activation de la réponse Th2/M2 participe au remodelage de la matrice extracellulaire par les myofibroblastes. 3 : La levée de l'inhibition de la voie Smad et l'activation des CML par IGF-1 amplifie le phénomène de remodelage. 4 : Le remodelage chronique induit la fibrose. . 240 Figure 34 : hypothèse sur la régulation autocrine de la fonction des CSM par TGF- et HGF . 251 Figure 35 : hypothèse sur le mécanisme d'immunomodulation par TSG-6. TSG-6 agit par deux mécanismes principaux au cours de la fibrose : l'augmentation de la disponibilité en hyaluronane de haut poids moléculaire (PM) et l'inhibition de la polarisation M1 des macrophages. . 253 Figure 36 : influence de HGF et TSG-6 sécrétés par les CSM sur la fibrose colorectale radio- induite . 254 xx xxi Table des tableaux Tableau 1 : projections en 2015 de l'incidence des cancers de la zone abdomino-pelvienne par sexe en France (Source : Institut National du Cancer - Les cancers en France - édition 2015). * : estimation pour 2011 . 16 Tableau 2 : organes à risque en fonction de l'organe de la sphère abdomino-pelvienne traité par radiothérapie (Source : Institut National du Cancer - Les cancers en France - édition 2015). . 17 Tableau 3 : Étapes impliqués dans le processus de cancérogénèse (D'après Riboli, 2014) (Riboli, 2014) . 19 Tableau 4 : interventions chirurgicales et non-chirurgicales pour le traitement des complications colorectales chroniques et sévères des radiothérapies (D'après Denton et coll. , 2002 ; Hong et coll. , 2001 ; Rustagi et coll. , 2011) (Hong et coll. , 2001, Denton et coll. , 2002, Rustagi et Mashimo, 2011). 32 Tableau 5 : effet des CSM sur les modèles précliniques de complications intestinales des radiothérapies abdomino-pelviennes . 35 Tableau 6 : résultats de l'utilisation des CSM en clinique pour le traitement des atteintes radio- induites, des pathologies inflammatoires et des MICI . 38 Tableau 7 : caractéristiques cliniques des patients d'Épinal traités par transplantation de CSM . 40 Tableau 8 : résumé des critères miminum pour identifier les CSM in vitro (D'après Dominici et al. , 2006) (Dominici et coll. , 2006) . 108 Tableau 9 : voies d'action des CSM sur les modèles de fibrose précliniques . 125 xxii xxiii cyclique 3', 5'- : Adénosine Liste des abréviations -SMA : -Smooth Muscle Actin ACE : Angiotensin Converting Enzyme Akt PKB : Protein kinase B AMPc MonoPhosphate cyclique AOM : AzOxyMethane AP-1 : Activator Protein-1 APC : Argon Plasma Coagulation Arg : Arginase BAD : Bcl-2-Associated Death promoter Bcl-2 : B cell lymphoma-2 BMP : Bone Morphogenic Protein C4S ; Chondroïtine-4-Sulfate c-Abl (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 CAF : Cancer-Associated Fibroblasts CCL : chemokine (C-C motif) ligand CDC-42 : Cell Division Control protein 42 homolog CDH1 : CaDHérine-1 CIC : Cellule Interstitielle de Cajal CMH : Complexe Majeur d'Histocompatibilité CML : Cellule Musculaire Lisse CMP : collagen-to-MMP-to-TIMP c-Myc : v-Myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog COL : COLlagène Co-Smad : Common mediator Smad CPA : Cellules Présentatrices de l'Antigène CREB protein CSC : Cancer Stem Cell CSH : Cellules Souches Hématopoïétiques CSM : Cellules Souches Mésenchymateuses CTGF : Connective Tissue Growth Factor CXCL : chemokine (C-X-C motif) Ligand CXCR : CXC chemokine Receptor DAMP Patterns DKK : DicKKopf-related protein DMH : DiMéthylHydrazine EGF : Epidermal Growth Factor eGFP : enhanced Green Fluorescent Protein) EMT : Epithelial-to-Mesenchymal Transition EndMT EndoMT Mesenchymal Transition EPGN : EPiGeN ERK : Extracellular signal-Regulated Kinase ES : Embryonic Stem : C-AMP Response Element-binding : Damage-Associated Molecular Endothelial-to- : : de Facteurs Croissance EV : Extracellular Vesicles FCH Hématopoïétiques FDA : Food and Drug Administration FGF-2 : Fibroblast Growth Factor-2 FLT : Fms-Like Tyrosine kinase Foxp3 : Foxhead box P3 FPI : Fibrose Pulmonaire Idiopathique FSP : Fibroblast-Specific Protein FVS : Fraction Vasculaire Stromale GAG : Glycosaminoglycanes G-CSF : Granulocyte-Colony Stimulating Factor GM-CSF : Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor GPx : Glutathione Peroxidase Gr : Glutathione reductase GSK : Glycogen Synthase Kinase GTPases : Guanosine TriPhosphatases GVHD : Graft-Versus-Host Disease HA : Hyaluronane HES1 : Hairy and Enhancer of Split 1 HGF : Hepatocyte Growth Factor HGFA : HGF Activator HIF-1 : Hypoxia-Inducible Factor-1 HK2 : Human Kidney 2 HLA : Human Leukocyte Antigen HLA-DR : Human Leukocyte Antigen antigen D Related HLA-I : Human Leukocyte Antigen-1 HMOX1 : HeMe Oxygenase 1 HO-1 : Heme Oxygenase 1 HR : Homologous Recombination ICAM-1 : Intercellular Adhesion Molecule-1 IDO : Indoleamine-pyrrole 2, 3-DiOxygenase IFN- : Interferon- IGF-1 : Insulin-like Gowth Factor-1 IGFBP : Insulin-like Growth Factor-Binding Protein IL : Interleukine ILC2 : type 2 Innate Lymphoid Cells ILK : Integrin-Linked Kinase INCa : Institut National du Cancer iNOS NOS2 : inducible Nitric Oxide Synthase iPSc : induced Pluripotent Stem cell ISCT : International Society for Cellular Therapy I-SMAD : Smad inhibiteur ITG : Integrin II : Inter-Inhibitor) JNK : c-Jun N-terminal Kinase KLF : Kruppel-Like Factor KRT : KeRaTin LAP : Latency Associated Peptide xxiv N-Methyl-N'-Nitro-N- LIF : Leukemia Inhibitory Factor LLC : Large Latent Complex LPS : LipoPolySaccharides LRP5/6 : Lipoprotein Receptor-related Protein 5/6 LTBP : Latent TGF- Binding Protein M cell : microfold cell MAP : Mitogen-Activated Protein MAP3K : Mitogen-Activated Protein kinase kinase kinase MCP : Monocyte Chemoattractant Protein M-CSF : Macrophage-Colony Stimulating Factor MDSC : Myeloid-derived Suppressor Cells MEC : Matrice ExtraCellulaire MEK1 : MAPK/ERK Kinase-1 MELD : Model for End-stage Liver Disease MET : Mesenchymal-to-Epithelial Transition MICI : Maladie Inflammatoire Chronique de l'Intestin MIP : Macrophage Inflammatory Protein Miro : Mitochondrial Rho GTPase MKK : Mitogen-activated protein Kinase Kinase MMP : Matrix MetalloProteinases MNNG : NitrosoGuanidine mpCCL2 : MMP-processed CCL2 MPO : MyéloPérOxydase MPZL : Myelin Protein Zero Like Mrc : Mannose Receptor C type Mreg : Macrophage M régulateur MRTF Factor mTOR : mammalian Target Of Rapamycin NF-B : Nuclear Factor-kappa B NHEJ : Non-Homologous End Joining NK : Natural Killer NOD Domain NQO : NADPH Quinone Oxidoreductase Nrf2 : Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 OAR : Organes A Risque OCT : OCTamer-binding transcription factor OSF : Osteoblast Specific Factor PAI-1 : Plasminogen Activator Inhibitor-1 PAMP Patterns PAR6 : PARtitioning defective 6 homolog alpha PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen PDGF : Platelet-Derived Growth Factor PECAM-1 : Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 : Nucleotide-binding Oligomerization : Myocardin-Related Transcription : Pathogen-Associated Molecular : RAs-related C3 botulinum toxin PGE : ProstaGlandine E PGI2 : prostacycline PI3K : Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3- kinase PIGF : PhosphatidylInositol-Glycan biosynthesis class F protein PRD : Pelvic Radiation Disease PTX : PenTaXine RAC-1 substrate-1 RAF : Rapidly Accelerated Fibrosarcoma RANKL : Receptor Activator of NF-B Ligand RANTES : Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted RCMI : Radiothérapie Conformationnelle par Modulation d'Intensité RHO : Ras Homologous RNS : Reactive Nitrogen Species ROCK : Rho-associated Coiled-coil-containing Kinase ROR : RAR-related Orphan Receptor gamma ROS : Reactive Oxygen Species R-SMAD : Receptor-activated Smad SARA : Smad Anchor for Receptor Activation SCEL : SCiELlin SCF : Stem Cell Factor SDF : Stromal-Derived Factor SED : SubEpithelial Dome siRNA : small interfering RNA SMA : Smooth Muscle Actin SMAD : Small Mother Against Decapentaplegic SnoN Skil : Ski-like protein SOD : SuperOxide Dismutase SOX2 : (Sex determining region Y)-bOX 2 Sp-1 : Specificity Protein-1 TA cells : Transit Amplifying cells TAK1 : Transforming growth factor beta- Activated Kinase 1 TAL protein TAM : Tumor-Associated Macrophages TBX : T-BoX transcription factor TERT : TElomerase Reverse Transcriptase TFF : TreFoil Factor TGF- : Transforming Growth Factor TGIF : Transforming Growth Interacting Factor Th : T helper TIMP : Tissue Inhibitors of MetalloProteinases TLR : Toll-Like Receptor TMPRSS : TransMembrane PRotease Serine S1 member TNF- : Tumor Necrosis Factor- : T-cell Acute Lymphocytic leukemia xxv : Related Tumor-necrosis-factor TNT : Tunneling NanoTubes tPA : tissue-type Plasminogen Activator TRAF6 : TNF receptor associated factor 6 TRAIL Apoptosis Inducing Ligand Treg : lymphocytes T régulateurs TSG-6 : Tumor necrosis factor Stimulated Gene- 6 TSP : ThromboSPondine-1 : Tumor Growth Factor- TXA2 : Thromboxane TR TGFR Receptor uPA : urokinase-type Plasminogen Activator VCAM-1 : Vascular Cell Adhesion Molecule-1 VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor WNT : Wingless Type XIAP : X-linked Inhibitor of Apoptosis xxvi xxvii xxviii xxix Avant-propos En France, le nombre de nouveaux cas de cancers a augmenté de 109% entre 1980 et 2012. L'Institut National du Cancer prévoit 384 442 nouveaux cas en 2015. Néanmoins, les progrès de la médecine ont permis de limiter la progression de la mortalité des patients concernés, qui a augmentée dans des proportions 5 à 10 fois inférieures au cours de la même période. En particulier, les méthodes de diagnostic et de traitement des tumeurs ont été significativement améliorées au cours des 50 dernières années. A l'heure actuelle, la détection précoce des cancers et la mise en place de protocoles de traitement plus adaptés à la pathologie permettent de diminuer la mortalité et le risque de récidive. La radiothérapie est une méthode de stérilisation tumorale locorégionale employée dans le traitement d'environ 50% des tumeurs solides. Son principe repose sur une sensibilité aux rayonnements ionisants accrue des cellules tumorales comparées aux cellules saines. Elle est souvent employée en association avec la chimiothérapie et/ou la chirurgie. Grâce, notamment, aux progrès de l'imagerie médicale, la délivrance des rayonnements est aujourd'hui plus précise et plus efficace. Cependant, l'irradiation de la tumeur implique l'exposition de tissus sains alentours à des doses variables de rayonnements. Ainsi, la radiothérapie peut induire de nombreux effets secondaires précoces, apparaissant dans les heures à semaines suivant le traitement, et tardifs, pouvant survenir 20 ans après arrêt du traitement. Ces complications sont souvent bénignes mais peuvent parfois prendre des formes létales, dans le cas d'une fibrose radio-induite par exemple. La prise en charge des patients survivants du cancer est donc devenue une problématique majeure, tant pour l'amélioration de la qualité de vie des patients que du coût des traitements. La sphère abdomino-pelvienne concentre le plus grand nombre de cas de cancers, tous sexes confondus. Les cancers de la prostate, du côlon-rectum, de la vessie et du corps de l'utérus font partie des 6 plus fréquents. En particulier, chez l'homme, le cancer de la prostate représentait environ un quart des nouveaux cas de cancer en 2011 en France. Cette zone regroupe également des organes particulièrement radiosensibles, notamment en raison du taux de renouvellement élevé de certains des tissus. C'est le cas par exemple du côlon et du rectum dont l'épithélium est remplacé en quelques jours. Les radiothérapies de la sphère abdomino-pelvienne peuvent induire des effets secondaires allant de légères diarrhées à des complications très sévères telles que la rectite radique. La principale complication tardive sévère des radiothérapies est la fibrose, caractérisée par un épaississement et une rigidification du tissu, pouvant mener à une occlusion létale dans le cas de l'intestin. Il n'existe actuellement pas de thérapie efficace de ces séquelles et la prise en charge des patients repose majoritairement sur des traitements palliatifs. 1 La question de la prise en charge des complications des radiothérapies abdomino-pelviennes est illustrée par l'accident d'irradiation d'Épinal. Entre 2001 et 2006, au centre hospitalier d'Épinal, plus de 400 patients ont reçu une dose de rayonnements de 10 à 20% plus élevée que préconisée lors du traitement de cancers de la prostate. Pour des doses équivalentes, certains de ces patients n'ont pas développé de séquelles, alors que d'autres présentaient quelques mois plus tard des rectites ou cystites invalidantes. Ces lésions ont nécessité dans certains cas des chirurgies lourdes et occasionnaient parfois des douleurs intenses résistantes aux composés morphiniques. En l'absence de traitements efficaces, un essai compassionnel de thérapie par les Cellules Souches Mésenchymateuses a été proposé à quatre patients présentant des colites hémorragiques radio-induites. Les Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) sont des cellules pluripotentes adultes pouvant être facilement isolées à partir d'explants de moelle osseuse ou de tissu adipeux. Au sein de l'organisme, elles ont de nombreux rôles, notamment dans le soutien de l'hématopoïèse, le maintien de l'homéostasie tissulaire et la modulation de la réponse inflammatoire. Depuis leur découverte en 1996, ces cellules ont fait l'objet de nombreuses études qui ont montré, entre autres, le pouvoir régénératif de la greffe de CSM. En particulier, les propriétés immunomodulatrices des CSM ont été exploitées avec succès pour le traitement de pathologies du système immunitaire telles que la maladie du greffon contre l'hôte ou les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin. De plus, l'efficacité des CSM a déjà été démontrée dans le cadre de brûlures radiologiques accidentelles et de séquelles des radiothérapies. Enfin, leur effet de régénération du côlon irradié a été démontré sur des modèles animaux au sein de notre laboratoire. Chez les patients surirradiés d'Épinal traités, la transplantation de CSM a permis de diminuer la douleur, la fréquence des diarrhées et les saignements, en raison en partie d'un effet immunosuppresseur. Malgré le potentiel apparent de la thérapie par CSM, il existe de nombreuses questions concernant l'innocuité d'un tel traitement. Ces doutes tiennent notamment à l'impossibilité de prédire avec exactitude le comportement des CSM après transplantation. Ce problème est particulièrement prononcé dans le cas de survivants du cancer en raison du possible effet pro-tumoral des CSM, qui pourraient induire la récidive de la maladie. De nombreuses études ont évalué l'effet des CSM sur des modèles de tumeurs injectées in vivo, sans qu'aucun consensus n'ait pu être établi sur leur effet pro ou anti-tumoral. Néanmoins, il n'existe à notre connaissance aucun travaux portant sur l'effet des CSM sur le développement tumoral in vivo avant et après radiothérapie abdomino-pelvienne. De plus, l'impact de la transplantation de CSM sur la fibrose colorectale radio-induite n'est que peu documenté à l'heure actuelle. 2 Ainsi, au cours des travaux présentés dans ce document, nous nous sommes attachés à mettre en évidence : (i) l'innocuité de la transplantation de CSM chez des animaux irradiés, (ii) l'absence d'effet pro-tumoral des CSM et (iii) l'effet des CSM sur les complications colorectales sévères des radiothérapies. Lors d'une première étude sur des tumeurs coliques induites à une cohorte de rats Sprague-Dawley auxquels un protocole d'irradiation fractionnée similaire à celui employé pour le traitement de tumeurs prostatiques chez l'homme a été appliqué. Des CSM ont été injectées à différents temps afin d'évaluer leur effet sur la tumorigénèse, l'évolution de la tumeur après radiothérapie et l'apparition de complications tardives. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'efficacité de cette thérapeutique sur un modèle de fibrose colorectale radio-induite, également chez le rat. Deux injections de CSM ont été réalisées chez ces animaux dans les semaines suivant l'irradiation afin d'observer l'évolution des marqueurs caractéristiques de la fibrose. Nous avons démontré l'absence d'effets secondaire des CSM dans nos modèles. En effet, aucune augmentation du nombre ou de la taille des tumeurs n'a été observée au cours de cette étude. Après radiothérapie, la transplantation de CSM a induit une diminution du volume tumoral au sein du côlon. L'effet anti-tumoral des CSM a été notamment associé à la modification du statut immunitaire à savoir la population de leucocytes au sein du tissu, en particulier de la polarisation des macrophages et lymphocytes T ainsi qu'à une modification de la balance entre miRNA anti et pro-oncogéniques. De même, la transplantation de CSM a permis de limiter la progression de la fibrose après irradiation colorectale, mis en évidence par une diminution du dépôt de matrice extracellulaire chez les animaux traités. Cet effet, attribué également à la modulation de la nature de l'infiltrat inflammatoire, a permis d'améliorer la survie des animaux transplantés. Nous avons également montré l'importance de deux protéines sécrétées par les CSM et nécessaires pour la mise en place de la réponse anti-fibrosante, HGF (Hepatocyte Growth Factor) et TSG-6 (Tumor necrosis factor Stimulated Gene-6). Nos résultats démontrent la faisabilité, l'innocuité et l'efficacité de la transplantation de CSM chez les patients développant une fibrose induite par radiothérapie et apporte de nouvelles preuves de l'intérêt des CSM dans le traitement de pathologies résistantes aux thérapies médicamenteuses. Par un effet pléiotropie et durable dans le temps, les CSM sont en mesure de reprogrammer le microenvironnement afin d'orienter les processus cellulaires vers la régénération du tissu. 3 4 5 6 État de l'art A. Effets secondaires de la radiothérapie : les survivants du cancer I. Radiothérapie La radiothérapie est un traitement locorégional des tumeurs cancéreuses ; ainsi, son action se limite à la tumeur et à la région avoisinante. La radiothérapie diffère donc de la chimiothérapie ou l'hormonothérapie qui sont des traitements agissant sur l'ensemble de l'organisme. Elle repose sur la différence de radiosensibilité entre les cellules tumorales cibles et les cellules saines de l'organisme. La zone à traiter est exposée à des rayonnements ionisants, c'est-à-dire pouvant induire l'ionisation des atomes cibles, produits à l'aide d'une source radioactive ou d'un accélérateur. Les dommages induits par les rayonnements ionisants au niveau de l'ADN des cellules cibles entrainent la mort de celles-ci. Les cellules tumorales, plus radiosensibles que les cellules saines, sont donc plus susceptibles d'être impactées par cette exposition. Les tissus normaux pouvant se régénérer plus rapidement, la radiothérapie est souvent administrée par fractions, sur des périodes de plusieurs semaines de façon à créer un effet différentiel entre la destruction des tissus sains et celle des tissus tumoraux. Suivant l'emplacement de la source du rayonnement, on distingue : - La radiothérapie externe : les rayons sont émis par un accélérateur de particules (photons, électrons, protons) ou, plus rarement, par une source radioactive. Il existe différents types d'appareils, permettant de recourir à différentes techniques d'irradiation : rayonnement par modulation d'intensité, tomothérapie, stéréotaxie (Novalis) - La radiothérapie interne : la source des rayons est implantée dans l'organisme, au contact de la tumeur. Cette technique n'est utilisée que pour traiter des tumeurs situées dans certaines zones du corps : sein, utérus, vagin, prostate, verge, langue, voile du palais, peau, bronches, œsophage et anus. 7 1. Rayonnements ionisants Le terme rayonnement (ou radiation) désigne un processus d'émission d'énergie sous forme de photons ou de particules chargées. Les rayonnements sont dits ionisants lorsqu'ils sont susceptibles d'induire l'ionisation de la matière par excitation ou arrachement d'électrons. Il existe différents types de rayonnements ionisants : , , et X. Les rayonnements électromagnétiques et X sont privilégiés lors des protocoles de radiothérapie. En effet, leur capacité de pénétration est beaucoup plus importante que celle des rayonnements et , qui ne peuvent passer la barrière cutanée (Figure 1). De plus, ils permettent la délivrance de rayonnements d'énergie plus importante et donc plus impactants au niveau des cellules tumorales. Les rayonnements et X sont émis par des méthodes différentes. Les rayons sont émis par une source radioactive telle que le Cobalt60 ou le Césium137 et sont la résultante de désintégrations radioactives des atomes de la source. Les rayonnements X, les plus couramment utilisés lors des protocoles de radiothérapie, sont produits par un accélérateur linéaire de particules ou un tube à rayon X. Figure 1 : pouvoir de pénétration des différents types de rayonnements ionisants a. Effets biologiques des rayonnements ionisants i. Aspect moléculaire Les rayonnements ionisants induisent principalement des dommages à l'ADN, qui sont la première cause de mort cellulaire après irradiation (Figure 2). On peut distinguer les effets des rayonnements selon deux catégories : 8 - Les effets directs correspondent à l'interaction des rayonnements avec les composants cellulaires tels que l'ADN, les protéines, les lipides et les glucides. - Les effets indirects regroupent principalement les interactions avec les molécules d'eau. Les rayonnements ionisant induisent la radiolyse de l'eau qui conduit à la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS : Reactive Oxygen Species) qui sont des radicaux libres hautement réactifs. Ces ROS, tels que H2O2 ou OH-, sont responsables d'environ 80% des lésions radio- induites à l'ADN et ont également un effet délétère sur les autres composants cellulaires (Chapman, 1981). Les lésions à l'ADN sont de différentes natures. Les rayonnements ionisant peuvent induire des modifications des nucléotides telles que l'oxydation ou la désamination mais également des pontages ou cassures. Ces cassures peuvent être simple ou double brin. Dans ce cas, le devenir de la cellule dépend de la capacité de la cellule à réparer ces dommages. Les radicaux libres interagissent avec les acides aminés soufrés, générant des radicaux libres qui formeront des ponts disulfures inter et intramoléculaires capables d'altérer les fonctions des protéines. Les lipides sont une autre cible majeure par peroxydation des acides gras insaturés qui induisent une modification de la fluidité membranaire. Les dommages radio-induits entrainent l'apparition de différents phénomènes de mort cellulaire : - - la nécrose des cellules ayant reçu une dose directe de rayonnements trop importante l'apoptose des cellules dont l'ADN est trop endommagé pour être pris en charge par les systèmes de réparation par recombinaison homologue (HR : Homologous Recombination) ou jonction d'extrémités non homologues (NHEJ : Non-Homologous End Joining) - la mort mitotique ou reproductive si les dommages à l'ADN sont importants mais n'entrainent pas l'apoptose. La cellule peut alors perdre sa capacité de division et entrer dans un processus de mort différée. Les cellules dont les altérations de l'ADN n'induisent pas la mort transmettent ces mutations aux cellules filles, pouvant entrainer à terme l'apparition de tumeurs. Les cellules cancéreuses prolifèrent de façon incontrôlée et sont résistantes aux signaux d'apoptose et d'arrêt de cycle cellulaire. Ces propriétés sont à l'origine de la différence de sensibilité des cellules cancéreuses par rapport aux cellules saines vis-à-vis des rayonnements ionisants. Les lésions cellulaires induites par l'exposition aux rayonnements ionisants sont aussi associées au phénomène décrit en 1992 par Nagasawa et Little, appelé effet bystander (Nagasawa et Little, 9 1992). Ce processus désigne les effets aux cellules non irradiées à proximité de cellules exposées. L'exposition aux rayonnements ionisants induit la sécrétion de protéines responsables d'un effet délétère sur les cellules saines. L'effet bystander complète la théorie existante jusqu'alors de la cellule cible , qui décrit l'effet des rayonnements ionisants comme localisé aux cellules qui y sont directement exposées. Figure 2 : séquences d'évènements moléculaires et cellulaires induits par l'irradiation (D'après Bentzen, 2006) (Bentzen, 2006) ii. Aspect tissulaire Les effets des rayonnements ionisants sur les cellules cibles induisent à terme, dans les jours à années suivants, la perte d'homéostasie tissulaire. Denham et coll. ont décrit trois origines d'atteintes tissulaires radio-induites (Denham et Hauer-Jensen, 2002) : - L'effet cytocide désigne la mort des cellules exposées aux rayonnements ionisants. Cet effet est directement lié à la radiosensibilité des cellules considérées. Les compartiments cellulaires à renouvellement rapide, tels que l'épithélium intestinal, sont plus radiosensibles et les effets sur le tissu apparaissent donc rapidement. A l'inverse, dans les compartiments à renouvellement lent, les atteintes tissulaires apparaissent tardivement - Les effets indirects apparaissent en réponse aux lésions radio-induites d'autres cellules ou tissus. Ils incluent o l'effet bystander ou effet de voisinage : observé dans les cellules non directement touchées ou non traversées par le rayonnement et impliquant l'émission de signaux par les cellules irradiées. Les cellules irradiées peuvent produire des signaux tels que les espèces actives de l'oxygène et l'oxyde d'azote (NO) ainsi que des cytokines (TNF- : Tumor Necrosis Factor-, IL 1 : Interleukine-1, IL-6. ). La stimulation des cellules 10 irradiées par ces signaux aboutit à l'induction de cassures double brin dans l'ADN, d'aberrations chromosomiques, de micronoyaux et d'apoptose. Ce terme désigne plus particulièrement l'influence des médiateurs vasoactifs, pro-coagulants et inflammatoires sécrétés en réponse à l'irradiation. Ces médiateurs incluent des cytokines, facteurs de croissance et chimiokines. o l'effet abscopal. Originellement défini par Mole en 1953 (Mole, 1953), l'étymologie du mot vient du latin ab qui signifie loin de et du grec skopos qui veut dire cible . Ce phénomène représente tous les effets produits en dehors de la cible irradiée (Sun et coll. , 2014). - Les effets fonctionnels résultent des effets non-létaux sur les compartiments intra et extracellulaires ainsi que sur le transcriptome. Ces effets peuvent conduire à l'activation de facteurs de croissance latents comme le Transforming Growth Factor 1 (TGF-1) ou encore à l'activation de protéases. En règle générale, les lésions tissulaires apparaissent comme une conséquence d'une association complexe de ces trois types d'effets. Pour exemple, la rectite radique est induite par des effets cytocides sur les cellules épithéliales et endothéliales, des effets fonctionnels qui promeuvent la coagulation, l'inflammation et la production de matrice extracellulaire et des effets indirects comme l'activation de TGF-1 (Denham et coll. , 2001, Denham et Hauer-Jensen, 2002). 2. Modalités de la radiothérapie Les protocoles de radiothérapie sont définis afin de (i) bloquer la progression tumorale et de provoquer la mort des cellules cancéreuses et (ii) limiter les atteintes aux tissus sains présents dans le champ d'irradiation, également appelés organes à risque (OAR). a. Dose et organes à risque La Société Française de Radioprotection a édité le Guide des procédures de radiothérapie externe ( 08/guide de rth des tumeurs v7 complet. pdf) définissant les modalités d'optimisation des protocoles de radiothérapie. Il est nécessaire de respecter : - La dose de contrôle tumoral qui correspond à la dose nécessaire pour obtenir la stérilisation locale définitive de la tumeur dans 90% des cas. 11 - La dose aux OAR qui doit être la plus faible possible afin de limiter les complications de la radiothérapie. Cette dose de tolérance est définie comme une dose maximale à ne pas dépasser sur un volume donné. La dose de contrôle tumorale est connue de façon empirique. Elle dépend du type histologique de la tumeur, le volume tumoral et l'aspect de tumeur, par exemple en termes de vascularisation. Ces doses sont exprimées en Grays (Gy), 1 Gy correspondant à 1 J. kg-1. b. Optimisation du protocole i. Type de radiothérapie En fonction des caractéristiques de la tumeur et des OAR à proximité, deux types de radiothérapie peuvent être choisis : la radiothérapie externe et la radiothérapie interne. La radiothérapie externe représentait 92% des prises en charge en 2014 (Les cancers en France - édition 2015 Institut National du cancer). Les travaux présentés dans ce document portent sur des protocoles de radiothérapie externe et il sera donc sujet de cette technique dans les pages suivantes. La radiothérapie externe repose sur l'utilisation d'une source de rayonnements extracorporelle. Les progrès technologiques ont permis d'améliorer les méthodes de radiothérapie externe. La radiothérapie conformationnelle est actuellement largement utilisée. Elle consiste en l'utilisation de plusieurs faisceaux de rayonnements, d'intensité moindre afin de limiter la dose aux OAR, convergeant sur la tumeur. Les progrès de l'imagerie médicale permettent de mieux définir le volume tumoral et de prendre en compte les variations anatomiques du patient au cours du protocole. La Radiothérapie Conformationnelle par Modulation d'Intensité (RCMI) permet ainsi d'orienter le faisceau en cours d'irradiation afin de suivre au mieux la tumeur. De même, les méthodes de stéréotaxie utilisent des faisceaux de taille adaptable afin d'irradier de façon précise des volumes réduits. Méthodes innovantes de radiothérapie Principe de la RCMI, Tomothérapie Le préalable à la réalisation de la radiothérapie conformationnelle est de disposer d'un scanner et de stations de travail associées (ordinateurs) qui permettront de reconstruire la région anatomique du patient à traiter et de projeter les faisceaux de l'accélérateur sur cette région. Cette technique de simulation virtuelle du traitement permet la reconstruction en 3D des volumes à traiter (patient 12 virtuel) et assure une grande précision dans le repérage des tumeurs et la mise en place de la balistique de faisceaux. L'IMRT utilise des scans 3D du corps pour guider les faisceaux de rayons vers la tumeur sous de nombreux angles différents. À chacun de ces angles, l'intensité du rayonnement est modulée et la forme du faisceau est modifiée pour correspondre à la forme de la tumeur. Ces réglages permettent de délivrer la dose prescrite de radiation à chaque partie de la tumeur, tout en minimisant l'exposition pour les tissus sains environnants. La protonthérapie La protonthérapie est une méthode de radiothérapie utilisant des faisceaux de protons, contrairement à la radiothérapie conventionnelle qui utilise des faisceaux de photons ou d'électrons. Les protons présentent des propriétés balistiques avantageuses (Figure 3). En effet, le dépôt d'énergie dépend de la vitesse d'émission des protons. À faible vitesse, les protons interagissent fortement avec la matière et perdent leur énergie sur une faible distance. A l'inverse, à haute vitesse, les protons perdent leur énergie sur un parcours plus long. On peut ainsi faire varier la profondeur à laquelle l'énergie des protons va être déposée en faisant varier le niveau d'énergie du rayonnement. Il est également possible de moduler l'énergie en cours de traitement afin d'augmenter la gamme de profondeurs traitées. Figure 3 : Pic de Bragg : comparaison entre le dépôt d'énergie des photons (orange) et des protons (bleu). Le dépôt de dose des protons peut être modulé en largeur et en profondeur. (source : protontherapie/proprietes-balistiques, consulté le 22/07/2016) 13 Mais pour atteindre la haute précision permise par ces propriétés, des technologies lourdes sont requises (un accélérateur de particules à protons, une enceinte de radioprotection) et sophistiquées (des systèmes de planification du traitement, de conformation du faisceau et de positionnement). La protonthérapie s'avère pertinente pour les traitements nécessitant une très grande, précision par exemple pour le mélanome de la choroïde ou pour certaines tumeurs intracrâniennes. ii. Dose Comme expliqué précédemment, la dose de rayonnements prescrite dépend des caractéristiques de la tumeur et des OAR compris dans le champ d'irradiation. La radiosensibilité des tumeurs malignes est très variable. Par exemple, les lymphomes non hodgkiniens nécessitent en général des doses de 35 à 40 Gy. A l'inverse, les adénocarcinomes requièrent généralement une dose de plus de 70 Gy. En outre, la radiosensibilité varie fortement selon les OAR. Par exemple, la dose seuil (dose à laquelle apparaissent les complications) est de 20 Gy pour le larynx et de 50 Gy pour le tronc cérébral. Il est donc nécessaire d'opérer un compromis entre ces doses. iii. Le cycle cellulaire Les cellules sont les plus radiosensibles lors des phases G2 et M du cycle cellulaire (Pawlik et Keyomarsi, 2004). Or, les cellules irradiées sont temporairement bloquées en G2 et sont donc synchronisées après une séance de radiothérapie. iv. Oxygénation de la tumeur Les effets des rayonnements ionisants reposent en grande partie sur la production de ROS (. Les espèces réactives produites par radiolyse de l'eau réagissent avec l'oxygène et produisent des dommages au niveau de l'ADN. L'état d'oxygénation de la tumeur et sa vascularisation sont donc des paramètres importants pour la radiothérapie. 14 Différentes stratégies ont été développées afin d'optimiser l'apport d'oxygène à la tumeur (oxygène hyperbare, respiration de carbogène). Le fractionnement de l'irradiation reste à l'heure actuelle le moyen le plus efficace de contourner cet obstacle. En effet, au fil des séances de radiothérapie, les couches supérieures de la tumeur, les mieux oxygénées, sont détruites et les cellules internes sont ré-oxygénées entre chaque séance. v. Fractionnement Plusieurs facteurs sont à prendre en compte lors de l'établissement d'un protocole de radiothérapie fractionnée : le nombre de fractions, la dose par fraction et l'étalement du protocole dans le temps : - La durée totale de traitement influe à la fois sur l'efficacité de la stérilisation tumorale et sur les atteintes secondaires aux tissus sains. Un étalement plus long du protocole permettra aux tissus sains de se régénérer, au moins partiellement, entre chaque séance. En revanche, cela profitera aux tumeurs à prolifération rapide qui se repeupleront au cours du traitement. A l'inverse, un étalement court augmentera le risque d'effet secondaire mais assurera une meilleure destruction de la tumeur. La durée classique d'un protocole de radiothérapie fractionnée est de 7 semaines. - La dose par fraction est un paramètre important, influençant notamment les risques de complications. Le schéma étalement-fractionnement classique compte 5 séances de 2 Gy par semaine. En général, la dose prescrite par fraction est de 1, 8 à 2 Gy. En effet, l'augmentation de la dose par fraction n'a que rarement d'impact sur la stérilisation tumorale. En revanche, les doses plus élevées, à dose totale égale, induisent plus de toxicité à long terme. L'étalement du traitement permet donc de protéger les tissus sains. Néanmoins, de nombreuses études montrent l'intérêt de l'hypo-fractionnement qui consiste à réduire le nombre de fractions et donc à augmenter la dose par fraction. Pour les cancers de la prostate, des essais de radiothérapies extrêmement hypo-fractionnées ont donné de bons résultats en termes d'efficacité et de complications pour les patients. Les médecins soulignent également que ce type de traitements est moins coûteux et que la diminution du nombre de séances améliore le confort du patient (Arcangeli et Greco, 2016). A l'inverse, des études suggèrent un intérêt de l'hyper-fractionnement pour certains types de cancers. Une étude des résultats obtenus au cours de 15 essais cliniques suggère que, dans le cas des cancers tête et cou, l'hyper-fractionnement permettrait un meilleur contrôle tumoral (Baujat et coll. , 2010). 15 II. Radiothérapies abdomino-pelviennes 1. Cancers et organes à risque Le dernier rapport de l'Institut National du Cancer sur les cancers en France fait état d'une projection de 384 442 nouveaux cas de cancers en France pour 2015. Ce chiffre est en augmentation constante depuis le XXème siècle. Entre 1980 et 2012, le nombre de nouveaux cas de cancers a augmenté de 109%. La sphère abdomino-pelvienne concentre la plus grande incidence de cancers : chez l'homme, la prostate, le côlon-rectum, la vessie, les testicules. Chez la femme, le côlon-rectum, le corps et le col de l'utérus, les ovaires font partie des organes à taux de cancer élevé. Ces cancers et leur incidence respective en France sont détaillés dans le Tableau 1. Tableau 1 : projections en 2015 de l'incidence des cancers de la zone abdomino-pelvienne par sexe en France (Source : Institut National du Cancer - Les cancers en France - édition 2015). * : estimation pour 2011 Sexe Hommes Hommes Femmes Hommes Femmes Femmes Femmes Femmes Hommes Organe Prostate* Côlon-rectum Vessie Corps de l'utérus Ovaire Col de l'utérus Testicule Incidence 53 913 23 535 19 533 9 758 2 547 8 151 4 575 2 797 2 300 16 Environ 60% des patients atteints de cancer seront traités par radiothérapie au cours de leur parcours de soins. En 2014, 198 168 personnes ont été traitées par radiothérapie. Un pourcentage important de ces séances cible la sphère abdomino-pelvienne : prostate (14, 2% des prises en charge), côlon-rectum-anus (4, 7%) et corps et col de l'utérus (3, 3%). De nombreux OAR sont compris dans cette zone et sont donc impactés par ces protocoles : intestin grêle, vessie, testicules Le Tableau 2 liste les OAR concernés lors des radiothérapies de la sphère abdomino-pelvienne. Tableau 2 : organes à risque en fonction de l'organe de la sphère abdomino-pelvienne traité par radiothérapie (Source : Institut National du Cancer - Les cancers en France - édition 2015). Organe traité par radiothérapie Organes à risque Rectum Intestin grêle Canal anal Intestin grêle, vessie, vulve, grandes lèvres Col de l'utérus Rectum, vessie, canal anal, intestin grêle, colon sigmoïde, vagin Endomètre Rectum, vessie, canal anal, intestin grêle, côlon sigmoïde, vagin Vulve Rectum, vessie, urètre, canal anal, intestin Prostate Vessie grêle, côlon sigmoïde, vagin Rectum, vessie, canal anal Rectum, canal anal, intestin grêle, côlon sigmoïde Testicule Moelle épinière, rein, estomac, intestin grêle, côlon Comme indiqué sur le Tableau 2, le côlon et le rectum sont fréquemment à risque lors des radiothérapies de la zone pelvienne. Il existe des méthodes permettant de limiter les effets secondaires à ces tissus sains. Par exemple, réaliser la séance de radiothérapie sur un patient ayant la 17 vessie pleine limite l'exposition de cette dernière lors de l'irradiation du rectum ou du col de l'utérus. A l'inverse, il est difficile de protéger l'intestin grêle qui est très mobile et pourra donc avoir changé de position entre deux séances. Il est impossible à l'heure actuelle de prévenir totalement les atteintes aux tissus sains et une forte proportion de ces patients développera des complications aiges, voire tardives dans un nombre plus limité de cas. 2. Le cancer colorectal Le cancer colorectal est au premier rang des cancers (tous sexes confondus), représentant 15 à 20% des cancers. En France son incidence est estimée à plus de 34 000 nouveaux cas par an (avec une augmentation d'environ 40% dans les vingt dernières années) (Figure 4). Figure 4 : incidence du cancer colorectal dans le Monde. (Taux estimé sur 100, 00 personnes). Le cancer colorectal est le troisième en termes d'incidence chez l'homme (746, 000 cas, 10% du total) et le second chez les femmes (614, 000 cas, 9, 2% du total) (source : IARC) Les cancers du côlon et du rectum étant assez semblables, on les regroupe sous le terme de cancer colorectal. Les différents stades du cancer colorectal (Figure 5) sont : -Stade I : le cancer est encore localisé dans la paroi du côlon Stade II : le cancer s'est propagé à la couche musculaire du côlon - - 18 - - Stade III : le cancer s'est propagé à un ou plusieurs ganglions lymphatiques en place Stade IV : le cancer s'est propagé à d'autres organes des parties du corps, tels que le foie, les poumons ou les os (métastases). Figure 5 : illustration des 4 grades de l'évolution tumorale, du stade 0 au stade IV avec l'invasion des cellules cancéreuses vers d'autres organes via la circulation sanguine (source : colorectal-cancer-overview) a. Carcinogénèse colorectale Le développement de la maladie est un phénomène prolongé dans le temps pouvant comporter plusieurs étapes et implique des interactions complexes entre différents facteurs exogènes de types environnementaux et/ou endogènes de types génétique et épigénétique qui sont résumé dans le Tableau 3. Tableau 3 : Étapes impliqués dans le processus de cancérogénèse (D'après Riboli, 2014) (Riboli, 2014) 19 L'initiation consiste en la formation de lésions stables et irréversibles de l'ADN de la cellule souche et transmissible aux cellules filles. Différents mécanismes sont susceptibles d'entraner ces lésions. Les mutations spontanées sont de faible probabilité (10-8 à 10-5 selon les gènes). Les mutations induites par de brèves expositions avec des agents cancérigènes sont conditionnées par les capacités de métabolisation des agents chimiques et l'efficacité des systèmes de réparation de l'ADN (Figure 6). Figure 6 : Mécanismes de cancérogenèse induite par les agents chimiques. Tout individu possède un certain nombre de cellules initiées, phénotypiquement indistinctes des cellules normales, mais qui mémorise une altération génétique exprimée lors d'une stimulation ultérieure. L'étape de promotion se produit sous l'action continue ou répétée d'un agent promoteur en concentration suffisante sur les cellules initiées. L'étape de progression consiste en la transformation irréversible de cellules initiées précancéreuses et aboutit à l'émergence clinique de la tumeur (Gurzu et coll. , 2016, Simon, 2016). b. Le microenvironnement tumoral La communication bidirectionnelle entre les cellules et leur microenvironnement est critique pour la croissance tumorale (Figure 7). L'interaction entre cellules tumorales et le stroma associé influe sur l'initiation et la progression de la maladie. Dans le cancer, les interactions intercellulaires coordonnées qui sont présentes dans les tissus adultes normaux sont perturbées car la tumeur acquiert la capacité de détourner le microenvironnement à son profit, et à son tour, le microenvironnement évolue pour favoriser la croissance tumorale (Fessler et coll. , 2013, Quail et Joyce, 2013). 20 Figure 7 : Microenvironnement tumoral (D'après Quail et Joyce, 2013) (Quail et Joyce, 2013) Après avoir contourné les mécanismes cellulaires intrinsèques de l'apoptose, les cellules tumorales sont soumis à des pressions d'élimination par le système immunitaire. Les antigènes spécifiques des cellules tumorales jouent un rôle au cours de ce processus. Ils sont reconnus par les cellules immunitaires cytotoxiques, conduisant à leur destruction. Les fibroblastes et les macrophages dans le microenvironnement tumoral contribuent également à un état de croissance-suppressive ; cependant, ces cellules peuvent plus tard devenir instruits par la tumeur afin d'acquérir des fonctions pro-tumorigène (Egeblad et coll. , 2010). Par exemple, les macrophages associés à la tumeur (TAM : Tumor-Associated Macrophages) prennent en charge divers phénotypes au sein de la tumeur primitive, dont la croissance, l'angiogenèse et l'invasion en sécrétant une pléthore de protéases pro- tumorigènes, de cytokines et de facteurs de croissance, par exemple EGF (Epidermal Growth Factor), qui participe à une boucle de signalisation paracrine via une sécrétion tumorale de CSF-1) (Qian et Pollard, 2010). Lors du développement des tumeurs, les cellules immunitaires-suppressives, y compris les Cellules myéloïdes suppressives (MDSC : Myeloid-derived Suppressor Cells) et les cellules Treg (lymphocytes T régulateurs) sont mobilisés dans la circulation en réponse aux cytokines induite par la tumorigénèse : TGF-, CXCL5 (chemokine (C-X-C motif) Ligand 5) et CXCR2 (CXC chemokine Receptor 2) (Almand et coll. , 2001). Les MDSC et les cellules Treg infiltrent la tumeur croissante visant à désorganiser la surveillance immunitaire par l'intermédiaire de plusieurs mécanismes notamment la perturbation de la présentation des antigènes par les cellules dendritiques, l'inhibition de la 21 prolifération des cellules T et des lymphocytes B et de la cytotoxicité des NK (Natural Killer) (Diaz- Montero et coll. , 2009). Les fibroblastes associés au cancer (CAF : Cancer-Associated Fibroblasts) activés par des facteurs dérivées de tumeurs (TGF-, FGF-2 : Fibroblast Growth Factor-2, PDGF : Platelet-Derived Growth Factor, etc. ) sécrètent des protéines de la Matrice ExtraCellulaire (MEC) et des composants de la membrane basale, régulent la différenciation, modulent la réponse immunitaire et contribuent à la dérégulation de l'homéostasie (Tomasek et coll. , 2002). Les CAF sont également une source essentielle de VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), qui induit l'angiogenèse au cours de la croissance tumorale (Kalluri et Zeisberg, 2006). Outre ses contributions cellulaires, plusieurs propriétés extracellulaires contribuent à la progression tumorale, y compris l'hypo-oxygénation, la haute pression du fluide interstitielle et les changements dans les composants spécifiques de la matrice extra cellulaire (Kalluri et Zeisberg, 2006). Les stratégies thérapeutiques contre le cancer ciblent la tumeur directement ; cependant, les cellules du stroma dans le microenvironnement tumoral sont génétiquement stables par rapport aux cellules tumorales et sont donc susceptibles d'être moins sensible aux mécanismes classiques de résistance thérapeutique (Quail et Joyce, 2013). Figure 8 : anatomie du côlon-rectum humain (Source : 22 3. Radiothérapies abdomino-pelviennes et complications colorectales a. Anatomie du côlon-rectum L'intestin est un organe à risque particulièrement radiosensible en raison du renouvellement rapide de son épithélium. En particulier, la fréquence des complications de radiothérapie au côlon et au rectum est élevée en raison de la forte incidence des cancers de la zone abdomino-pelvienne. Nous avons donc choisi d'axer ce projet sur le traitement des effets secondaires colorectaux. Le côlon et le rectum, aussi appelés gros intestin, ont une structure similaire. Le gros intestin mesure environ 1, 5 m de long et est légèrement plus large que l'intestin grêle (entre 3 et 7 cm de diamètre). Il se situe entre le caecum et le canal anal et comprend : le côlon ascendant, le côlon transverse, le côlon descendant, le côlon sigmoïde et le rectum (Figure 8). Le gros intestin a plusieurs fonctions : (i) La transformation du bol intestinal en fèces par absorption de l'eau et des sels solubles par les entérocytes. Il n'y a pas d'activité enzymatique de digestion à cette étape. La contraction des muscles du côlon permet le brassage du bol fécal. (ii) La digestion finale de la cellulose est assurée par la flore microbienne et certaines vitamines sont absorbées. (iii) Les mouvements péristaltiques propulsent les fèces vers le rectum. Cette progression est facilitée par la sécrétion de mucus par les cellules caliciformes. Figure 9 : coupe de côlon (coloration Hématoxyline-Éosine-Safran) 23 Le côlon et le rectum diffèrent de l'intestin grêle par la disparition des villosités, laissant place à une muqueuse lisse. Le gros intestin est composé de 5 couches distinctes (Figure 9). En partant de la lumière : la muqueuse (comprenant l'épithélium et le chorion), la musculaire muqueuse (muscle lisse), la sous-muqueuse (composée de tissu conjonctif), la musculeuse (une tunique constituée de muscles lisses innervés) et la séreuse (une couche externe riche en tissu adipeux). i. La muqueuse colique La muqueuse colique est constituée de cryptes, également appelées glandes de Lieberkhn, ouvrant sur la lumière intestinale. Ces cryptes reposent dans le chorion (ou lamina propria), terme désignant le tissu conjonctif de la muqueuse. Un important réseau de microvaisseaux assure l'irrigation des cryptes et est associé à un réseau lymphatique de canaux chylifères. Les glandes de Lieberkhn sont composées de nombreux types cellulaires (Figure 10) : - Des cellules souches responsables du renouvellement de l'épithélium - Des cellules non-différenciées, également impliquées dans le renouvellement de l'épithélium - Des entérocytes, aussi appelés colonocytes, garants de l'activité d'absorption de l'épithélium - Des cellules en gobelet ou caliciformes, sécrétant du mucus afin de faciliter la progression des fèces - Des cellules entéroendocrines ou neuroendocrines assurant la régulation de différentes activités du côlon. - Des cellules Tuft dont la fonction est encore peu connue. - Des myofibroblastes péricryptaux situés sous la base de la crypte - Des cellules M (M cells : Microfold cells) couvrant les follicules lymphoïdes et capables de présenter les pathogènes aux cellules du système immunitaire 24 Figure 10 : organisation d'une crypte colique (d'après Barker, 2014) (Barker, 2014) Le compartiment prolifératif A la base des cryptes se situent environ 4 à 6 cellules souches pluripotentes. Ces cellules prolifèrent rapidement afin de participer au renouvellement constant de l'épithélium. Chez l'Homme, le renouvellement complet de l'épithélium colique se fait en 5 à 7 jours, ce qui correspond à la durée de vie des colonocytes et cellules caliciformes. Les cellules souches se différencient en progéniteurs des cellules épithéliales, également appelés TA cells (Transit Amplifying cells). Ces cellules progénitrices remontent progressivement le long de la crypte. Les cellules TA se différencient et assurent le renouvellement des types cellulaires composant l'épithélium (entérocytes, cellules en gobelets, cellules entéroendocrines et cellules Tuft). Arrivées dans la lumière intestinale, les cellules cessent de se différencier et meurent par anoïkis. La prolifération des cellules souches permet en outre le maintien de la niche à la base de la crypte. L'épithélium colique fonctionnel Différents types cellulaires assurent les fonctions de l'épithélium colique. Les entérocytes sont responsables de l'activité d'absorption du côlon. Ils assèchent les fèces en absorbant l'eau contenue dans le bol intestinal. Ils permettent également la récupération de certaines vitamines et d'électrolytes. 25 Les cellules en gobelet sécrètent le mucus afin de lubrifier la lumière du côlon et de faciliter la progression des fèces. Elles sont en nombre plus important à mesure que l'on s'approche du canal anal. Les cellules endocrines sécrètent des hormones vers le sang, mais également vers l'épithélium afin de réguler la prolifération des cellules épithéliales ainsi que les fonctions de sécrétion, d'absorption, de motilité et de contrôle de la barrière immunitaire. La fonction des cellules Tuft est encore mal connue, mais il semble qu'elles soient responsables de l'initiation de la réponse immunitaire de type T helper 2 (Th2). Elles sont capables de reconnaitre les parasites présents dans la lumière intestinale. Il semble que, en réponse à ce stimulus, les cellules Tuft favorisent l'expansion et la prolifération des cellules lymphoïdes innées de type 2 (ILC2 : type 2 Innate Lymphoid Cells), via la sécrétion de IL-25 (von Moltke et coll. , 2016). En réponse, les ILC2 sécrètent IL-13 qui stimule les cellules souches des cryptes et promeut leur différenciation en nouvelles cellules Tuft. Les myofibroblastes empruntent des propriétés aux fibroblastes et aux cellules musculaires, comme leur activité contractile. Les myofibroblastes péricryptaux, outre leur fonction de soutien de la crypte, activent les récepteurs Frizzled des cellules souches épithéliales, via la sécrétion de ligands de la voie Wnt (Fevr et coll. , 2007). Ils contrôlent différentes activités des cellules souches : maintenance de la niche, migration et différenciation (Humphries et Wright, 2008). Les cellules M sont spécialisées dans l'assimilation et le transport d'antigènes. Ces antigènes sont transportés depuis la lumière vers la région du dôme subépithélial (SED : SubEpithelial Dome), riche en cellules dendritiques, dans laquelle ils sont présentés aux cellules immunitaires. Les cellules M couvrent les follicules lymphoïdes, principalement constitués de cellules B, de cellules dendritiques et de cellules de la réponse innée. Des cellules de Paneth, spécifiques à l'intestin grêle, sont parfois observées au sein du côlon ascendant ou dans des situations pathologiques et ont un rôle de protection contre les micro- organismes pathogènes en secrétant le lysozyme. La lamina propria contient également des lymphocytes B et T, des macrophages ainsi que des éosinophiles et des mastocytes. 26 ii. La sous-muqueuse Située entre la muqueuse et la musculaire muqueuse, la sous-muqueuse ou submucosa est constituée de tissu conjonctif fibreux dans lequel se trouvent des fibroblastes, des mastocytes, des vaisseaux sanguins et lymphatiques. Elle contient également un plexus de fibres nerveuses, le plexus de Meissner, composé de fibres sympathiques et parasympathiques. iii. La musculaire muqueuse Aussi appelée muscularis mucosa, elle sépare la couche muqueuse de la sous-muqueuse. C'est une couche de tissu musculaire lisse d'épaisseur variable. Elle est traversée par les complexes lymphoglandulaires, des invasions des cryptes à travers la musculaire musculeuse, et des réseaux vasculaires et nerveux. iv. La musculaire propre ou musculeuse Cette tunique est principalement responsable des mouvements péristaltiques du côlon. Elle est constituée de deux couches de muscles lisses : une couche interne circulaire et une couche externe longitudinale. Un important plexus de fibres nerveuses est localisé entre ces deux couches : le plexus myentérique ou plexus d'Auerbach. Les cellules interstitielles de Cajal se trouvent dans le plexus myentérique, ainsi que dans la musculeuse et la sous-muqueuse. Ces cellules sont responsables de la régulation de la motilité du côlon. v. La séreuse C'est une mince couche de cellules mésothéliales qui bordent la sous-séreuse. Elle est composée de tissu conjonctif qui soutient les vaisseaux et les nerfs de la musculaire externe. Le tissu adipeux y est abondant. b. Complications des radiothérapies abdomino-pelviennes L'exposition des organes sains entourant la tumeur lors d'une séance de radiothérapie induit une toxicité forte au niveau de ces organes. De nombreux patients subissent des effets secondaires après radiothérapie, allant de l'érythème cutané à des pathologies potentiellement létales, telles que 27 la fibrose. En raison de l'incidence des cancers abdomino-pelviens et de la forte radiosensibilité des organes y siégeant, les effets secondaires au côlon et au rectum sont particulièrement fréquents. Les effets secondaires des radiothérapies dans la zone abdomino-pelvienne sont classés par délai d'apparition : aigus (0-3 mois) et tardifs (supérieurs à 3 mois). La toxicité tardive peut se manifester jusqu'à 30 ans après le traitement. Les effets secondaires aigus sont de différentes natures selon l'organe considéré : érythème sur la peau, diarrhées et douleurs en ce qui concerne l'intestin et pneumopathie entre autres. Ils touchent essentiellement les tissus à renouvellement rapide, telle que la peau, les muqueuses et la moelle osseuse. Le côlon, dont l'épithélium se renouvelle en 5 à 6 jours chez l'Homme, est donc particulièrement sensible aux rayonnements ionisants. Les effets tardifs atteignent majoritairement les tissus de soutien avec développement d'une fibrose pouvant entrainer la perte de fonctionnalité de l'organe atteint. L'activation d'oncogènes par les rayonnements ionisants peut également engendrer l'apparition de tumeurs radio-induites à des temps tardifs. Il est à l'heure actuelle impossible de circonscrire l'effet de l'irradiation aux seules cellules tumorales et le traitement des effets secondaires reste un enjeu prioritaire dans l'amélioration de la prise en charge des patients. Lors du traitement des cancers abdomino-pelviens, les organes du tractus gastro-intestinal (intestin grêle, côlon et rectum) sont donc à risque. Aux États-Unis, environ 300 000 patients reçoivent une radiothérapie abdominale ou pelvienne chaque année. L'incidence des effets aigus au tractus gastro-intestinal est d'environ 60 à 80% (Hauer-Jensen et coll. , 2014). Les effets tardifs sont moins fréquents, mais leur incidence augmente avec la survie des patients. Ainsi, on compte 4 à 10% de patients atteints de complications chroniques 5 à 10 ans après radiothérapie, et jusqu'à 20% sur 20 ans (Andreyev et coll. , 2011). Il y a plus de 13 millions de survivants de cancers aux États-Unis et des estimations projettent une augmentation jusqu'à 18 millions en 2022. Plus de la moitié de ces patients ont subi une radiothérapie abdominale ou pelvienne. Il est donc probable que le nombre de patients souffrant de séquelles tardives de radiothérapies abdomino-pelviennes croitra dans les mêmes proportions au cours de cette période. La réduction de l'incidence et le traitement de ces complications est donc une priorité. Andreyev et coll. ont proposé en 2011 d'établir un nouveau formalisme pour les atteintes secondaires des radiothérapies abdomino-pelviennes. L'ensemble des troubles liés à l'utilisation thérapeutique des rayonnements ionisants au niveau abdomino-pelvien est à présent désigné par le terme Pelvic Radiation Disease (PRD). Cette nouvelle terminologie est destinée à mettre en avant cette pathologie, mal connue des médecins et à laquelle peu d'attention est apportée d'après les auteurs (Andreyev et coll. , 2011). La Figure 11 présente les mécanismes d'apparition de la PRD ainsi que les manifestations physiopathologiques et cliniques de cette pathologie. 28 Figure 11 : mécanismes et manifestations de la PRD i. Dommages aigus au côlon-rectum Les dommages aigus apparaissent chez 60 à 80% des patients subissant une radiothérapie abdomino-pelvienne. Au niveau de l'intestin, ils deviennent apparents dans les jours suivant le début de la radiothérapie et sont principalement la conséquence de la mort des cellules épithéliales des cryptes et d'une réaction inflammatoire prolongée au sein de la lamina propria. La mort des cellules épithéliales et des cellules souches des cryptes produit des ulcères et favorise la destruction de la barrière muqueuse et l'inflammation de cette dernière (Theis et coll. , 2010). Les symptômes de ces dommages aigus sont : nausées, douleurs abdominales, diarrhées et fatigue. Chez la majorité des patients, ces symptômes disparaissent 1 à 3 mois après arrêt du traitement. ii. Dommages chroniques au côlon-rectum 20 ans après la radiothérapie, le nombre de patients souffrant de complications intestinales chroniques peut atteindre 20%. Les symptômes apparaissent typiquement dans un délai de 6 mois à 3 29 ans, mais la période de latence peut dans certains cas atteindre 20 ans. En situation de complication chronique, l'activation des fibroblastes et des cellules musculaires lisse du côlon-rectum se traduit par l'accumulation de collagène menant à la fibrose. Cette activation des cellules résidentes résulte de la mise en place d'une réaction inflammatoire chronique, permettant l'activation de facteurs de croissance pro-fibrosant. La mort des cellules endothéliales associée à la production de matrice extracellulaire (MEC) dense induit l'ischémie du tissu, pouvant mener à la nécrose. Ces modifications peuvent résulter en la dégénération vasculaire, la formation de vaisseaux télangiectasiques, l'ulcération de la muqueuse et l'adhésion de la séreuse. Les principales caractéristiques cliniques de ces pathologies sont : l'altération du transit intestinal (diarrhées, constipation), l'incontinence, les vomissements, les saignements et des douleurs viscérales chroniques. Les modifications pathologiques de la barrière intestinale peuvent conduire à l'obstruction par perte des mouvements péristaltiques et sténose. Certains patients développent des fistules en conséquence des effets décrits ci-dessus. Il est important de noter que l'association de la radiothérapie avec d'autres types de traitements, tels que la chimiothérapie ou la chirurgie, peut augmenter les risques de complications. Les facteurs de risque sont également nombreux : Maladie Inflammatoire Chronique de l'Intestin (MICI), diabète, pathologies vasculaires, collagénoses des vaisseaux, tabagisme Ces facteurs sont à prendre en compte lors des prises en charge de patients atteints de complications radio-induites chroniques. iii. Effets secondaires aux autres organes de la sphère abdomino-pelvienne Vessie La cystite radique est une lésion de la vessie associée aux radiothérapies pelviennes externes qui peut survenir des années après le traitement (Crew et coll. , 2001). La cystite radique se traduit par l'apparition d'hématurie caractérisée par une inflammation hémorragique de la muqueuse du tractus urinaire. Les symptômes cliniques varient de l'hématurie microscopique asymptomatique à l'apparition de caillots et la survenue de l'obstruction du tractus urinaire (Trotman et coll. , 1999, Lee et coll. , 2003). Cette pathologie provoque des douleurs sévères, une hématurie importante ainsi que des incontinences et syndromes d'irritation. Dans sa forme sévère, la cystite hémorragique détériore la qualité de vie des patients, prolonge leur hospitalisation et peut devenir létale. De plus, les patients en rémission de cette pathologie présentent une survie sans maladie plus faible que les patients n'ayant pas présenté ce type de troubles (Cesaro et coll. , 2003, Cesaro et coll. , 2008). Les dommages causés par les rayonnements aux muscles et aux cellules endothéliales de la vessie compromettent l'apport sanguin et de nutriments au tissu (Neheman et coll. , 2005, Haldar et coll. , 2014). La survenue 30 de la cystite radique est difficile à prévenir, en particulier car les vaisseaux endommagés peuvent survivre des mois voire des années. Les mécanismes d'induction de la cystite radique incluent : - Le passage d'irritants tels que la caféine ou l'urokinase à travers l'urothélium, causant l'inflammation chronique de la vessie ainsi que la destruction ou la dysfonction de la couche de glycosaminoglycanes (Parsons, 2011) - La sécrétion chronique d'histamine par les mastocytes, induisant des dommages à l'urothélium, une inflammation chronique et des douleurs (Sant et coll. , 2007). - La pyroptose, principale cause d'hyperplasie et de mort des cellules musculaires de la vessie au cours de la cystite hémorragique. Ce phénomène entraine notamment la production de ROS ainsi que la sécrétion de cytokines par les cellules immunitaires (Lee et Lee, 2013). c. Traitements des effets secondaires au côlon-rectum Il existe trois types de thérapies possibles pour traiter la PRD : pharmacologique, endoscopique et chirurgical. La plupart des traitements existant sont symptomatiques : anti-diarrhéiques, anti- vomitifs, anti-inflammatoires entre autres. Trois mécanismes à l'origine des symptômes de la PRD ont particulièrement été visés : l'inflammation, l'hypoxie et le stress oxydant. Hanson et coll. ont réalisé une méta-analyse des résultats obtenus lors d'essais cliniques de thérapies innovantes pour la PRD (Hanson et coll. , 2012). Ces traitements sont décrits dans le Tableau 4. La méthode endoscopique de coagulation par plasma argon (APC : Argon Plasma Coagulation) a fait l'objet de nombreuses études cliniques. L'APC consiste à appliquer un courant à haute fréquence sur le tissu afin de cautériser les vaisseaux hémorragiques. Les essais cliniques réalisés jusqu'à présent montrent que cette méthode permet de réduire les saignements rectaux à court et long terme. Des cas de résolution complète de ces symptômes ont également été observés. Néanmoins, les effets secondaires sont nombreux et parfois lourdement impactant pour la qualité de vie des patients. En effet, le plasma produit des brûlures sur le tissu environnant les vaisseaux à traiter. Ces lésions peuvent par conséquent donner lieu à divers effets secondaires dont les plus fréquents sont des crampes abdominales et des ulcérations. En revanche, des lésions plus sévères apparaissent avec une fréquence moindre : explosion gazeuse, perforation, fistule, sténose et douleur chronique (Frazzoni et coll. , 2015). D'autres méthodes reposant sur un principe similaire, telles que la coagulation par laser Nd : YAG, ont été utilisées sans succès en raisons d'effets secondaires lourds ou d'un manque de 31 données fiables en cliniques. En ce qui concerne l'APC, il est encore nécessaire de réaliser des essais sur des cohortes plus importantes, randomisés, en double aveugle et contre placebo, et ce à court et long terme. Les méthodes pharmacologiques sont à l'heure actuelle considérées comme moins prometteuses. Le formaldéhyde peut être appliqué directement sur les vaisseaux hémorragiques afin de stopper les saignements, mais les effets secondaires sont sévères (ulcérations, incontinence, colite). Le stress oxydant est un mécanisme majeur d'induction des dommages radio-induit. Différents agents ont été utilisés pour limiter ce stress oxydant chez les patients irradiés : le tocophérol et la pentoxifylline par exmple. Cependant, aucune de ces molécules n'a pour l'instant produit un effet satisfaisant sur la réduction des lésions radio-induites (Hanson et coll. , 2012). Des stratégies visant à favoriser l'angiogenèse au sein du tissu lésé sont à l'étude. La thérapie par oxygène hyperbare induit la régénération des tissus endothéliaux et épithéliaux. Les méthodologies employées lors des essais cliniques correspondant ne permettent pas à l'heure actuelle de conclure sur l'efficacité du traitement. Un essai sur 120 patients souffrant de saignements rectaux réfractaires aux traitements médicamenteux a permis de montrer une diminution de 32% du risque absolu de nouvelles hémorragies chez ces patients. En revanche, une analyse rétrospective sur des patients souffrant de cancers récurrents de la tête et du cou a montré une augmentation du risque de récidive cancéreuse chez les patients traités par oxygène hyperbare. Enfin, la chirurgie est la méthode actuellement la plus employée en dernière intension, mais les taux de morbidité et de mortalité qui y sont associés sont élevés. Il n'existe en conclusion aucun traitement validé en termes d'efficacité et d'innocuité pour la PRD et les thérapies innovantes, telles que la thérapie cellulaire, font donc l'objet d'études approfondies. Tableau 4 : interventions chirurgicales et non-chirurgicales pour le traitement des complications colorectales chroniques et sévères des radiothérapies (D'après Denton et coll. , 2002 ; Hong et coll. , 2001 ; Rustagi et coll. , 2011) (Hong et coll. , 2001, Denton et coll. , 2002, Rustagi et Mashimo, 2011) Thérapie Mécanisme Résultat Effets secondaires Anti-inflammatoires : Prednisolone Sulfasalazine Hydrocortisone Traitement anti- inflammatoire de première intention Réduction des saignements, des ulcères de la muqueuse (4 semaines) des diarrhées, des œdèmes, des Pas d'effets secondaires enregistrés 32 Bétaméthasone Métronidazole Acide gras à chanes dilatation des parois des Effet trophique sur la muqueuse colique, courtes Sucralfate Polysulfate de pentosane artères : entraine l'amélioration du flux sanguin Stimulation de la régénération de l'épithélium, formation d'une barrière protectrice, réduction de la perméabilité épithéliale et prévention de l'adhérence érythèmes rectaux (1 an, 22/24 patients) Efficace à court terme : diminution des saignements (5 semaines), pas d'effet significatif à long terme Pas d'effets secondaires enregistrés Amélioration de l'état clinique et de la muqueuse sans score permettant de démontrer l'efficacité Un cas d'éruption cutanée avec le pentosane Formaline Sclérose et fermeture de la néovascularisation prévenant les saignements. L'application locale induit la cautérisation 208 patients suivis en moyennes sur 6 mois. Réduction des saignements pendant au moins 3 mois 11 cas d'effets secondaires sévères : 5 cas d'ulcérations anales, 2 cas de sténose rectale, 2 cas d'incontinence et 2 cas de douleurs anales Thérapies par coagulation thermique : Coagulation locale des Laser ND : YAG vaisseaux télangiectasiques, cicatrisation et ré- épithélialisation avec apparition de tissu normal à long terme Diminution des saignements rectaux (80 90% des cas), des ténèsmes (60 75%) et de la qualité de vie 19 à 35% de complications Nécrose transmurale, fibrose, sténose, fistules recto-vaginales, douleurs. Augmentation du risque de résurgence dans le cas des cancers de la tête et du cou (67, 3% contre 30% chez les patients non traités) 1 cas de douleurs abdominales et 1 cas de perforation Taux de morbidité et de mortalité élevés 33 Laser argon Ablation par radiofréquence Cryoablation Oxygène hyperbare Autres traitements : Vitamine C et E Pentoxifylline Effet pro-angiogénique, particulièrement adapté aux phases chroniques des lésions radio-induites Pas d'évaluation de l'efficacité disponible Antioxydants Pas d'évaluation de l'efficacité disponible Généralement réservé aux cas sévères et réfractaires aux traitements Chirurgie conventionnels impliquant : - hémorragies, occlusions, sténoses, fistules et/ou perforations d. Thérapie cellulaire par les CSM pour le traitement des atteintes radio- induites au côlon-rectum i. Études précliniques L'utilisation de la thérapie cellulaire pour les complications des radiothérapies de la sphère abdomino-pelvienne a fait l'objet de plusieurs études précliniques (Tableau 5). Les atteintes observées dans le cas de MICI, telles que la maladie de Crohn, sont similaires aux complications apparaissant lors de la PRD, hormis les effets auto-immuns et ophtalmiques. De plus, l'inflammation joue un rôle central dans ces pathologies, à l'instar des complications radio-induites. Les manifestations cliniques des MICI sont identiques à celles de la PRD au niveau intestinal : fibrose, nécrose, fistules. Les symptômes sont également les mêmes : douleurs, diarrhées, saignement. Ainsi, les résultats d'études précliniques et cliniques sur les MICI peuvent être transposés aux atteintes digestives de la PRD. En 2003, Chapel et coll. ont démontré la capacité des CSM à migrer spécifiquement vers l'intestin après irradiation (Chapel et coll. , 2003), résultat confirmé ensuite par d'autres études (Francois et coll. , 2006, Mouiseddine et coll. , 2007, Zhang et coll. , 2008). Spécifiquement, les CSM peuvent se localiser dans la muqueuse entérique dans laquelle elles inhibent l'ulcération et favorisent la régénération (Semont et coll. , 2006, Kudo et coll. , 2010, Semont et coll. , 2010). En 2010, une étude chez la souris humanisée a permis de montrer que la transplantation de CSM améliore l'homéostasie cellulaire de l'intestin, notamment au niveau de la muqueuse, en augmentant la prolifération et en inhibant l'apoptose (Semont et coll. , 2010, Francois et coll. , 2012). Cet effet passe en particulier par la stimulation de la prolifération des cellules épithéliales, potentialisée par la sécrétion autocrine de WNT4 (Wingless Type 4) par les cellules épithéliales (Semont et coll. , 2013). La transplantation de cellules stromales dérivées de la moelle osseuse augmente la concentration sanguine de facteurs de croissance intestinaux et induit la régénération des villosités, accélérant ainsi la récupération fonctionnelle de l'intestin (Saha et coll. , 2011). Une étude in vitro sur des organoïdes issus de l'épithélium intestinal de souris indique que les CSM exercent un effet anti-apoptotique et de stimulation de la prolifération sur les cellules des cryptes (Chang et coll. , 2016). De plus, les CSM améliorent la régénération musculaire et augmentent la fonction contractile des sphincters de l'anus (Lorenzi et coll. , 2008). Gao et coll. ont montré que l'injection répétée de milieu conditionné par les CSM augmente la survie et diminue la fréquence des diarrhées sur un modèle murin d'irradiation intestinale (Gao et coll. , 2012). Ce résultat suggère une action paracrine des CSM, ne nécessitant pas de contacts intercellulaires. Dans un modèle d'irradiation colorectale chez le rat, la transplantation de CSM induit la production de glucocorticoïdes qui participent à la diminution de la migration des cellules T, favorisant ainsi également la régénération de l'épithélium (Bessout et coll. , 2014). Cet effet immunosuppresseur a également été identifié après irradiation abdominale chez le rat, o une 34 diminution de l'infiltration des polymorphonucléaires a été observée (Chang et coll. , 2013). Chez le cochon, les CSM améliorent la rectite radique par un effet pro-angiogénique associé au remodelage de la MEC. La régression de la fibrose ainsi que la diminution de l'inflammation ont également été observées dans ce modèle (Linard et coll. , 2013). Enfin, les CSM induisent une réversion de l'hypersensibilité viscérale dans un modèle d'irradiation colorectale chez le rat. Cet effet a été attribué à la diminution des interactions entre mastocytes et fibres nerveuses (Durand et coll. , 2015). Tableau 5 : effet des CSM sur les modèles précliniques de complications intestinales des radiothérapies abdomino- pelviennes Effet Référence Migration dans la muqueuse entérique Chapel et coll. , 2003 ; François et coll. , 2006 ; Mouiseddine et coll. , 2007 : Zhang et coll. , 2008 ; Sémont et coll. , 2010 Amélioration de l'architecture intestinale Sémont et coll. , 2006 ; Sémont et coll. , 2010 ; Kudo et coll. , 2010 ; Saha et coll. , 2011 Augmentation de la prolifération/diminution de l'apoptose Sémont et coll. , 2010 ; François et coll. , 2012, Chang et coll. , 2016 Effet pro-angiogénique Linard et coll. , 2013 ; Chang et coll. , 2013 Effet immunosuppresseur Bessout et coll. , 2014 ; Chang et coll. , 2013 Augmentation de la survie Diminution des diarrhées Gao et coll. , 2012 Gao et coll. , 2012 Réversion de l'hypersensibilité viscérale Durand et coll. , 2015 Les CSM ont également été utilisées sur des modèles précliniques de MICI. Ainsi, la transplantation de CSM a un effet bénéfique sur des modèles expérimentaux de colite (Duijvestein et coll. , 2011, Castelo-Branco et coll. , 2012, He et coll. , 2012). Cet effet se traduit par une diminution de la perte de poids et des saignements rectaux, ainsi que par une amélioration de la consistance des fèces. L'effet des CSM sur ces modèles repose en partie sur leurs propriétés immunomodulatrices, en particulier par la diminution de l'expression de cytokines pro-inflammatoires, telles que TNF- et IL-1 (Castelo-Branco et coll. , 2012, He et coll. , 2012). Plus généralement, l'injection de CSM permet de limiter l'infiltrat inflammatoire dans ces modèles (Duijvestein et coll. , 2011, He et coll. , 2012). La régénération de la muqueuse colique a également été observée au cours de ces études, associée à la réduction du nombre d'évènements apoptotiques (Castelo-Branco et coll. , 2012). Enfin, la transplantation de CSM a induit une diminution du dépôt de collagène au sein du tissu (Castelo-Branco et coll. , 2012). 35 ii. Cas cliniques Dans un premier temps, les CSM ont été utilisées afin d'améliorer la reconstitution hématopoïétique. Leur aspect immunomodulateur a été mis à profit dans le traitement de pathologies telles que la maladie du greffon contre l'hôte (GVHD : Graft-Versus-Host Disease). Des essais cliniques ont été menés pour le traitement des fistules chez les patients atteints de la maladie de Crohn. Dans ce dernier cas, les résultats montrent un potentiel de régénération de la muqueuse intestinale par les CSM (Duijvestein et coll. , 2010, Rastegar et coll. , 2010). Les CSM ont été utilisées pour le traitement des atteintes secondaires chroniques des radiothérapies. Les premiers résultats positifs ont été obtenus chez des patients présentant une insuffisance médullaire suite à une prise de greffe incomplète survenue après transplantation de cellules souches hématopoïétiques autologues. Après chimiothérapie, l'injection de CSM a amélioré le stroma de la moelle osseuse (Fouillard et coll. , 2003) et induit une récupération rapide et à long terme de l'hématopoïèse (Fouillard et coll. , 2007). Une diminution de la toxicité hématopoïétique et une amélioration de la reconstitution hématopoïétique ont été mises en évidence (Fouillard et coll. , 2013). Plusieurs essais compassionnels ont déjà été entrepris pour traiter des patients après irradiation accidentelle. En 2006, un patient chilien ayant subi une brûlure radiologique a été traité avec succès par une association de greffes de peau et de transplantation de CSM. 11 mois de suivi post-transplantation ont permis d'observer une évolution positive de la lésion, sans résurgence de la brûlure. De plus, aucune altération de la fonctionnalité de la zone lésée n'a été notée (Lataillade et coll. , 2007). Ce type de protocole a été employé au total chez 7 patients ayant développé des brûlures sévères (nécrose musculo-cutanée) et réfractaires aux traitements conventionnels. Le suivi de ces patients, jusqu'à 9 ans après traitement, a montré une cicatrisation de bonne qualité sans résurgence de la lésion initiale ou d'effets secondaires. Une diminution de la douleur soutenue dans le temps, de 80 à 40% sur l'échelle de douleur numérique (VAS), a été observée (Tamarat et coll. , 2012). Dans le cas du cancer du sein, plusieurs études ont montré le bénéfice de l'injection locale de cellules stromales pour le traitement des complications chroniques des radiothérapies. L'amélioration des lésions a pu être obtenue dans ce cas par l'injection de fraction vasculaire stromale (FVS), contenant pour partie des CSM, obtenue par lipoaspiration (Vinci et coll. , 2013). Kursova et al ont montré sur 11 patientes, présentant des lésions pulmonaires suite à une radiothérapie du cancer du sein, que la FVS stabilisait la progression des lésions dans l'année après le traitement. De plus, les paramètres de spirographie, le statut immun, la scintigraphie pulmonaire et les marqueurs 36 d'inflammation et d'hypoxie étaient améliorés (Kursova et coll. , 2009). D'autres études se sont concentrées sur la reconstruction du tissu conjonctif et de la peau, toujours dans le cadre de la radiothérapie du cancer du sein. Rigotti et coll. ont mis en évidence, sur 20 patientes en 2007 (Rigotti et coll. , 2007), et 137 en 2010(Rigotti et coll. , 2010), la capacité de la FVS à favoriser la régénération tissulaire (impossible auparavant) sans résurgence de cancer, avec un suivi de 8 ans en moyenne. Ces propriétés régénératives ont permis une amélioration de la perfusion ainsi que du remodelage du tissu. Akita et coll. ont obtenu des résultats similaires en 2010 et 2012 (Akita et coll. , 2010). Enfin, 72 patientes souffrant de douleurs post-mastectomie ont été traitées par injection de graisse autologue. Une diminution significative de la douleur a été observée après greffe, permettant à 28 patientes de stopper leur traitement analgésique (Caviggioli et coll. , 2011, Caviggioli et coll. , 2013). De nombreuses données sont disponibles sur l'utilisation des CSM sur les MICI. Chez des patients atteints de la maladie de Crohn, la transplantation de CSM a produit des effets bénéfiques sur des fistules périanales complexes (Garcia-Olmo et coll. , 2005, Garcia-Olmo et coll. , 2009, Ciccocioppo et coll. , 2011, Guadalajara et coll. , 2012, Herreros et coll. , 2012). Lors d'une étude de phase I, l'administration de CSM a permis d'obtenir la guérison de 75% des fistules (Garcia-Olmo et coll. , 2005). Dans une étude de phase II, 71% des fistules étaient guéries 8 semaines après transplantation de CSM combinée à un traitement à la colle de fibrine, et la qualité de vie des patients était améliorée comme indiqué par les résultats du questionnaire SF-12 (Garcia-Olmo et coll. , 2009). 42 mois après transplantation, 7 des 12 patients traités ne présentaient plus de fistules (Guadalajara et coll. , 2012). D'après les résultats d'un troisième essai clinique, cet effet est lié à l'augmentation du pourcentage de cellules T régulatrices, à la fois dans la muqueuse rectale et dans le sang (Ciccocioppo et coll. , 2011). Dans les pathologies luminales, ce sont les propriétés immunosuppressives des CSM qui sont exploitées. Dans une étude de phase I, quatre patients atteints de maladie de Crohn et trois de colites ulcérantes ont été traités par transplantation de CSM. 5 d'entre eux sont entrés en rémission, dont deux d'entre eux pour 2 ans (Liang et coll. , 2012). Dans un essai de phase II, 14 patients souffrant de maladie de Crohn luminale ont été transplantés avec des CSM allogéniques. L'état de douze de ces patients s'est amélioré et huit d'entre eux sont entrés en rémission (Forbes et coll. , 2014). La fibrose intestinale est une manifestation fréquente des MICI, en particulier de la maladie de Crohn. Bien que les marqueurs de la fibrose n'aient pas été évalués dans ces études, il est probable que l'inhibition de la fibrogénèse fasse partie des mécanismes induisant l'amélioration du statut clinique de ces patients. Les premiers succès cliniques de transplantation de CSM en conditions inflammatoires furent obtenus sur des GVHD sévères, notamment pour les atteintes viscérales (Weng et coll. , 2010). Entre octobre 2001 et janvier 2007, 55 patients ont été traités par transplantation de CSM lors d'un essai 37 clinique de phase II pour des GVHD sévères et résistantes aux stéroïdes. Après une injection de CSM, 27 patients ne présentaient plus aucun des symptômes associés à la GVHD. Des autres patients, 16 répondirent au traitement après une à plusieurs injections supplémentaires, et seuls 12 patients ne répondirent pas malgré plusieurs transplantations (Le Blanc et coll. , 2008). Dans une autre étude, le traitement par CSM a permis de diminuer significativement la proportion de GVHD de grade II à IV (Bernardo et coll. , 2011). Ces résultats suggèrent la capacité des CSM à reverser les effets secondaires tardifs de la radiothérapie et ont ouvert la voie à de nouvelles études cliniques sur le sujet. Tableau 6 : résultats de l'utilisation des CSM en clinique pour le traitement des atteintes radio-induites, des pathologies inflammatoires et des MICI Pathologie Traitement Résultats Références Brûlure radio-induite Greffe de peau et Cicatrisation après greffe de peau et Lataillade et coll. , 2007 accidentelle transplantation de CSM injection de CSM Tamarat et coll. , 2012 Pas de résurgence des lésions Diminution de la douleur Complications chroniques des radiothérapies : aplasie médullaire Complications chroniques des radiothérapies : cancer du sein Transplantation de CSM Amélioration du stroma de la moelle Fouillard et coll. , 2003 osseuse Récupération de l'hématopoïèse Diminution de la toxicité hématopoïétique Fouillard et coll. , 2007 Fouillard et coll. , 2013 Injection de fraction Stabilisation des lésions pulmonaires Kursova et coll. , 2009 vasculaire stromale ou de graisse autologue Amélioration de la fonctionnalité Rigotti et coll. , 2007 pulmonaire Diminution de l'inflammation Diminution de l'hypoxie Remodelage matriciel Diminution de la douleur Rigotti et coll. , 2010 Caviggioli et coll. , 2011 Caviggioli et coll. , 2013 Maladie de Crohn Transplantation de CSM Fermeture de fistules périanales Rigotti et coll. , 2007 complexes Amélioration de la qualité de vie GVHD Transplantation de CSM Diminution du grade de la GVHD LeBlanc et coll. , 2008 Rémission complète chez certains Bernardo et coll. , 2011 patients 38 iii. L'accident d'irradiation d'Épinal Entre 2001 et 2006, 397 patients ont reçu une surdose d'irradiation d'environ 10% au centre hospitalier d'Épinal, lors d'un protocole de radiothérapie pour le cancer de la prostate (Peiffert et coll. , 2007). 24 patients ont reçu une surdose d'irradiation de plus de 20%. Quelques mois plus tard, la plupart de ces patients souffraient de rectites et de cystites invalidantes, nécessitant pour certains de lourdes interventions chirurgicales (Peiffert et coll. , 2007, Marchesi et coll. , 2009). Plusieurs de ces patients ont subi une colostomie ou une urétérostomie et présentaient des douleurs intenses résistantes aux traitements morphiniques. Sept patients présentaient des lésions de grade III à IV avec colostomie de décharge et des fistules complexes ou recto-vésiculaires. En l'absence de traitements efficaces permettant de soulager ces patients, un essai compassionnel de thérapie par les CSM a été proposé à quatre patients atteints de colites hémorragiques radio-induites. Pour ce traitement, les CSM ont été isolées à partir de la moelle osseuse de donneurs intrafamiliaux. Ces patients ont reçu entre 2, 6 et 5. 106 cellules/kg par voie intraveineuse. La transplantation de CSM a induit un effet analgésique, anti-inflammatoire et a permis de réduire les hémorragies (Chapel et coll. , 2013). Ces résultats étaient associés à une réduction de l'activation des lymphocytes T et une hausse du nombre de lymphocytes T régulateurs, soulignant l'importance des effets immunomodulateurs des CSM. La douleur est réapparue chez un de ces patients 6 mois après transplantation, et une nouvelle injection de CSM a été réalisée. Ce deuxième traitement a permis de réduire la douleur de façon significative. La transplantation de CSM a également stoppé la progression d'une fistule chez l'un de ces patients. Chez l'ensemble de ces patients, le cancer de la prostate est resté en rémission stable. Aucune toxicité n'a été observée (Voswinkel et coll. , 2013). Les résultats de cet essai sont rapportés dans le Tableau 7. Cet essai compassionnel permet d'envisager de traiter des patients pour les séquelles des radiothérapies abdomino-pelviennes notamment pour les rectites radiques. Il est donc important de déterminer l'effet de cette thérapie sur la fibrose radio-induite. Actuellement, un nouveau Protocole Hospitalier de Recherche Clinique est financé par l'INCa (Institut National du Cancer) en prolongement de l'essai compassionnel d'Épinal. Cet essai thérapeutique de phase II a pour but d'évaluer l'efficacité de l'injection de CSM sur la symptomatologie de complications chroniques sévères des radiothérapies abdomino-pelviennes, après échec des thérapeutiques conventionnelles (Acronyme PRISME Numéro de protocole d'étude : P130935 ; EUDRACT 2014-001462-99 ; NCT02814864 Cette étude a pour objectif de mesurer l'efficacité de trois injections intraveineuses de CSM sur la fréquence des rectorragies et des hématuries chez des patients souffrant de PRD. 39 Tableau 7 : caractéristiques cliniques des patients d'Épinal traités par transplantation de CSM Patient Dose prescrite Complications radio-induites Traitement après radiothérapie Résultats de la transplantation de CSM Dose reçue 1 78 Gy 93, 2 Gy 2 73 Gy 91 Gy 3 69 Gy 86 Gy 4 70 Gy 78 Gy Écoulements d'urine dans le rectum Colostomie Pollakiurie Cathéter sous-pubien Disparition de la douleur 10 jours après injection et réapparition 3 semaines plus tard Douleurs mictionnelles Saignements Large zone nécrotique Fistule dans la cavité prostatique Douleurs chroniques Colostomie de décharge Saignements rectaux permanents Application d'une sonde de Foley Rétraction vésicale Cystite et rectite actives Perte du lien vessie prostate Fistule recto-prostatique Réduction de la capacité de la vessie Colostomie de décharge due à l'épaississement des parois vésicales Atrophie des glandes séminales Conversion des acides gras suite à l'irradiation de l'épine sacro-iliaque 20 séances d'oxygénothérapie Suppression de la douleur et des saignements 4 semaines après injection et rechute 6 semaines après Suite à la deuxième injection de CSM : disparition de la douleur et des saignements et rechute 3 mois après Réponse clinique 6 mois après transplantation avec réduction de la thérapie analgésique Rectorragie de grade3 et diarrhées Colostomie de décharge Réponse clinique 6 mois après de grade 2 20 séances Cystite de grade 1 associée à une d'oxygénothérapie pollakiurie de grade 1 Douleur permanente accompagnée de crises de douleurs plus intenses une ou deux fois par semaine transplantation : réduction stable des saignements, diarrhées et douleurs Amélioration de la qualité de vie 40 B. La fibrose : principale séquelle tardive des radiothérapies I. La cicatrisation à l'origine de la fibrose Les lésions tissulaires induisent des dommages aux cellules résidentes, par exemple aux cellules épithéliales et endothéliales. Les cellules mourantes sécrètent différents médiateurs de l'inflammation qui initient une cascade de coagulation antifibrinolytique associée à la congestion vasculaire. Une MEC temporaire est synthétisée pour servir de support au remplacement des cellules mortes. L'activation des plaquettes entraine la libération de divers médiateurs incluant des facteurs vasoactifs (vasodilatation, augmentation de la perméabilité vasculaire et œdème par exsudation plasmatique), des cytokines et chimiokines qui permettent le recrutement des leucocytes. Un caillot de fibrine est formé et sert de matrice pour la migration cellulaire et l'adhésion des plaquettes. La fibrinolyse est ensuite activée et conduit à la dissolution du caillot de fibrine qui laisse place au tissu conjonctif appelé tissu de granulation. La dissolution de la fibrine permet également la libération de plasmine qui active le système du complément, déclenchant ainsi le relargage d'anaphylatoxines chimiotactiques et vasoactives. Dans une seconde phase, les leucocytes recrutés adhèrent à différentes molécules telles que les sélectines, les intégrines et les immunoglobulines. Les macrophages et les neutrophiles phagocytent les débris cellulaires, les cellules mortes ainsi que les organismes exogènes. Ils produisent également des cytokines et chimiokines participant au recrutement des cellules endothéliales nécessaires à la néovascularisation. L'interaction des fibroblastes, des fibrocytes et d'autres cellules résidentes avec le microenvironnement induit leur différenciation en myofibroblastes qui synthétisent de la MEC et des facteurs de croissance, en particulier le TGF-1 pro-fibrosant (Figure 12). La sécrétion d'hormones autocrines induit la maturation des myofibroblastes. -SMA (-Smooth Muscle Actin) et la vimentine exprimées par les myofibroblastes sont responsables de leur activité contractile [9]. Cette contractibilité est requise pour la fermeture de la plaie. La formation de ce tissu de granulation est caractérisée par la présence de nombreux capillaires sanguins nécessaires à l'apport de nutriments, d'hormones et de gaz respiratoires. Enfin, la migration et la maturation des cellules épithéliales et endothéliales permet la formation du tissu cicatriciel et la néovascularisation. La MEC provisoire est dégradée par les métalloprotéinases matricielles (MMP : Matrix MetalloProteinases) une fois le remplacement des 41 cellules complété. L'équilibre subtil entre les MMP et leurs inhibiteurs, les tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) contrôle l'accumulation et la dégradation de la MEC pendant le processus de réparation. Ainsi, cette balance garantit le remodelage de la MEC en induisant une modification de sa composition. Pour terminer, les myofibroblastes meurent par apoptose, déclenchée par l'établissement d'une boucle d'activation négative signifiant la régénération du tissu lésé (Rieder et coll. , 2007). Figure 12 : séquence d'évènements initiant la fibrogénèse au cours de la cicatrisation (D'après Rieder et coll. , 2007) (Rieder et coll. , 2007) II. La fibrose radio-induite Les mécanismes inducteurs de fibrose sont pour la plupart communs à l'ensemble des pathologies fibrotiques, en particulier en ce qui concerne l'inflammation chronique (Figure 13). Il existe néanmoins certains mécanismes spécifiques à la fibrose radio-induite, notamment en raison des effets physico-chimiques des rayonnements. Les caractéristiques cliniques de la fibrose radio-induite sont une diminution de la souplesse, voire une rigidification du tissu, ainsi qu'un épaississement pouvant mener à l'occlusion dans le cas de l'intestin. 42 La fibrose débute par un processus de régénération tissulaire classique. Les cellules résidentes et recrutées, fibroblastes, fibrocytes et cellules musculaires lisses du côlon-rectum, sont activées en myofibroblastes pour produire la MEC provisoire. Dans le cas de la radiothérapie, l'exposition aux rayonnements ionisants induit la production massive d'espèces réactives de l'oxygène et de l'azote (respectivement ROS et RNS : Reactive Oxygen Species et Reactive Nitrogen Species). L'apoptose des cellules lésées, en particulier des cellules endothéliales, induit l'inflammation et l'ischémie du tissu. Les myofibroblastes activés produisent des chimiokines et recrutent les cellules du système immunitaire (macrophages, lymphocytes B et T, neutrophiles et éosinophiles). De nombreuses cytokines pro-inflammatoires et facteurs de croissance sont produits par les leucocytes recrutés. Notamment, des facteurs pro-fibrosants tels que le TGF-1 sont sécrétés en grande quantité par les cellules inflammatoires. Ces facteurs participent au recrutement et à la différenciation de nouveaux myofibroblastes. La production massive de MEC par les myofibroblastes participe à la mort cellulaire et donc à l'installation de l'inflammation chronique et de l'ischémie. Les cellules immunitaires induisent des dommages répétés aux cellules résidentes par la production de ROS supplémentaires, la mise en place de réactions auto-immunes et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Les cellules immunitaires étant les principales productrices de métalloprotéinases, la modification du profile inflammatoire mène à un déséquilibre entre les MMP et les TIMP, empêchant la dégradation de la MEC excédentaire. Les contraintes mécaniques et les signaux pro-inflammatoires perpétuent le recrutement et la différenciation des myofibroblastes et des cellules immunitaires. Une boucle d'activation chronique de myofibroblastes s'installe, menant à l'accumulation progressive de MEC. La matrice pathologique envahit progressivement le tissu, résultant en une cicatrice fibrotique permanente [9]. L'augmentation progressive du volume de MEC au sein du tissu induit des contraintes mécaniques sur les cellules et provoque l'ischémie du tissu. En particulier, on observe une diminution de la vascularisation (Yarnold et Brotons, 2010). Les différentes contraintes imposées par la fibrose entretiennent les phénomènes de mort cellulaire et de remodelage qui participent au développement de la pathologie. La fibrose établie peut conduire à la perte de fonction et/ou l'atrophie du tissu, voire à la nécrose. 43 Figure 13 : mécanismes cellulaires et moléculaires de développement de la fibrose Du point de vue histologique, la fibrose peut être définie selon deux étapes distinctes. La phase de développement correspond à l'initiation de l'accumulation de MEC pendant laquelle seules des zones de fibrose éparses sont visibles. La deuxième phase, la fibrose établie, est caractérisée par des plages diffuses de MEC, parfois sur l'ensemble du tissu. Le remplacement progressif des cellules mortes par la MEC conduit à la perte de fonctionnalité du tissu et induit sa rigidité. D'un point de vue clinique, les symptômes de la fibrose colorectale radio-induite apparaissent lors de la deuxième phase, notamment par occlusion nécessitant la résection du tissu fibrosé. 44 1. L'initiation de la fibrose La lésion initialement induite par les rayonnements ionisants provoque une réponse aige caractérisée par l'inflammation, le recrutement de fibroblastes et leur activation par la matrice extracellulaire. La production massive de ROS sous l'effet des rayonnements est spécifique des lésions radio-induites et joue un rôle important dans les lésions résultantes. En effet, on estime que les radicaux hydroxyles (-OH) sont responsables de 60 à 70% des dommages radio-induits aux cellules (Zhao et Robbins, 2009). Bien que moins étudiés, les RNS semblent intervenir dans l'apparition des lésions. L'administration d'un inhibiteur de iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase) chez des rats irradiés au niveau du poumon réduit les dommages à l'ADN à l'intérieur et à l'extérieur du champ d'irradiation (Khan et coll. , 2003). Si les ROS et RNS sont en quantité trop élevée, l'organisme n'est pas en mesure de produire suffisamment d'enzymes pour contrôler le stress oxydant. Les cellules sont alors endommagées par l'interaction des espèces réactives avec l'ADN, les protéines et les lipides (Zhao et Robbins, 2009). Les cellules lésées sécrètent en réponse des chimiokines activant l'inflammation non- spécifique. De plus, il semble que le peroxyde d'hydrogène, issu de la conversion des ROS, active les lymphocytes en bloquant la protéine tyrosine phosphatase (Reth, 2002). Cet effet est amplifié par la poussée respiratoire des macrophages pendant laquelle ils produisent du peroxyde d'hydrogène, notamment pour participer à la destruction des pathogènes (Reth, 2002). Les ROS et RNS favorisent l'inflammation en induisant enfin la libération et l'activation de cytokines et facteurs de croissance (TGF-1 par exemple) présents dans la MEC. La thrombose et l'ischémie du tissu participent également aux dommages et induisent une sécrétion accrue de cytokines et chimiokines. L'activation du système de coagulation est la première réponse à la majorité des lésions. Les rayonnements ionisants peuvent activer le système de coagulation sans effet direct sur l'architecture vasculaire. La thrombomoduline est une protéine de surface des cellules endothéliales, responsable de l'inhibition de l'activité pro-coagulante de la thrombine. Les ROS peuvent inactiver la thrombomoduline et ainsi induire la coagulation (Abe et coll. , 1994). L'irradiation entraine l'apoptose des cellules endothéliales (Paris et coll. , 2001) et la modulation de l'expression, de la production et de l'activité de nombreuses protéines. Le facteur tissulaire, ou facteur III, participe, à l'activation de la coagulation. Son expression et son activité sont augmentés après irradiation (Verheij et coll. , 1995). L'irradiation de cellules endothéliales humaines induit l'augmentation de l'expression du facteur Von Willebrand, également pro-coagulant (Jahroudi et coll. , 1996). L'expression de molécules d'adhésion, telles que ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1) (Hallahan et coll. , 2002), PECAM-1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule-1) (Quarmby et coll. , 1999) ou les sélectines (Hallahan et coll. , 1995), est augmentée suite à l'irradiation. La prostacycline 45 (PGI2) est un inhibiteur de l'agrégation des plaquettes et un vasodilatateur ayant un effet opposé au thromboxane (TXA2). Dans les poumons irradiés chez le rat, la production de ces deux facteurs est augmentée (Ward et coll. , 1988). L'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE : Angiotensin Converting Enzyme) convertit l'angiotensine I en angiotensine II possédant une activité vasoconstrictrice. Son activité est diminuée après exposition aux rayonnements ionisants (Ward et coll. , 1988). Enfin, l'activité de PLA (Plasminogen Activator ; activateur du plasminogène) est diminuée après irradiation. PLA est responsable de la conversion du plasminogène en plasmine, intervenant dans la dégradation des caillots de fibrine. L'activation de la coagulation induit une augmentation de la formation de thrombine, une protéase à sérine intervenant notamment dans la formation des caillots de fibrine. La thrombine régule la perméabilité endothéliale (DeMichele et Minnear, 1992), le chimiotactisme des neutrophiles (Bizios et coll. , 1986) et des monocytes (Bar-Shavit et coll. , 1983) ainsi que la production de TGF-1 (Yamabe et coll. , 1997). Elle active la prolifération des cellules musculaires lisses, ainsi que leur migration, et stimule la production de collagène et de fibronectine (Shirato et coll. , 2003), probablement par des mécanismes dépendant de TGF-1 (Noda-Heiny et Sobel, 1995, Ragosta et coll. , 1996). Ces modifications phénotypiques peuvent être permanentes et ainsi induire un pouvoir pro-coagulant constant à l'endothélium. Suite à l'irradiation, l'augmentation de l'expression des molécules d'adhésion et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires induit l'activation des macrophages résidents et favorise le recrutement, l'extravasation et la transmigration d'autres cellules inflammatoires circulantes vers le tissu. Les neutrophiles sont les premières cellules inflammatoires à être recrutées au site de la lésion (Abreu et coll. , 2005). Ce processus est rendu possible par la sécrétion de cytokines et chimiokines pro- inflammatoires par les macrophages (CXCL1, CXCL2, TNF- et IL-6) (Soehnlein et Lindbom, 2010). Les neutrophiles possèdent des propriétés de phagocytose et antimicrobiennes et ont pour première fonction l'élimination des débris cellulaires. La stimulation des neutrophiles par la MEC (collagènes et fibronectine en particulier), induit la production de cytokines pro-inflammatoires telles que TNF-, IL- 1, IL-6 et TGF-1 (Rubin et coll. , 1995, Okunieff et coll. , 1998, Ong et coll. , 2010). Ces cytokines contribuent à la production de ROS et au recrutement d'autres cellules inflammatoires. L'augmentation du stress oxydatif est accrue par la sécrétion de myéloperoxydase (MPO) par les neutrophiles (Moussa et coll. , 2016). La MPO catalyse la réaction de formation de l'acide hypochloreux, hautement oxydant. La fonction des neutrophiles au cours de la fibrose intestinale radio-induite est encore mal connue. Bien qu'ils soient considérés comme délétères au cours de l'inflammation intestinale, plusieurs études ont montré que la diminution des dommages radio-induits était associée à une augmentation du nombre de neutrophiles au sein du tissu (Flanders et coll. , 2008, Blirando et coll. , 2011). 46 Les lymphocytes et monocytes sont ensuite recrutés au site irradié, en particulier grâce aux signaux produits par les neutrophiles. L'interaction des monocytes avec les lymphocytes entraine la différenciation des monocytes en macrophages, puis leur polarisation en macrophages classiquement activés pro-inflammatoires (M1) ou alternativement activés anti-inflammatoires (M2). Les macrophages produisent alors du PDGF qui promeut l'angiogenèse et la migration des fibroblastes localement ou depuis la circulation vers le tissu lésé (Li et coll. , 2007). Ils sécrètent également du TGF- 1, fortement impliqué dans la fibrose radio-induite. , notamment en stimulant la différenciation des progéniteurs de la moelle en fibroblastes (Rodemann et Bamberg, 1995), ainsi que l'activation de ces derniers en myofibroblastes (Verrecchia et Mauviel, 2007). Les myofibroblastes peuvent également provenir de progéniteurs circulants appelés fibrocytes, ainsi que de cellules épithéliales dans le cadre de l'EMT (Epithelial-to-Mesenchymal Transition) (Hinz et coll. , 2007) ou de cellules endothéliales lors de l'EndoMT (Endothelial-to-Mesenchymal Transition) (Zeisberg et coll. , 2007). La stimulation des myofibroblastes par TGF-1 induit la sécrétion de composants de la MEC (collagènes, fibronectine, protéoglycanes) menant à la fibrose. De plus, TGF-1 induit une diminution de l'activité des MMP, en particulier MMP-2 et MMP-9, et l'augmentation de l'activité des TIMP (Pardo et Selman, 2006). 2. L'inflammation chronique à l'origine de la fibrose Le microenvironnement inflammatoire présent à cette étape favorise la différenciation et la maturation des cellules dendritiques, nécessaires à la mise en place de la réponse immunitaire adaptative. La présentation de l'antigène par les cellules dendritiques induit la différenciation des cellules T CD4 naïves en différents sous-ensembles (Th1, Th2, Th17 ou Treg) possédant des caractéristiques et fonctions différentes (Francois et coll. , 2013). Les lymphocytes Th1 sont responsables de l'immunité cellulaire contre les pathogènes intracellulaires, ainsi que de la stimulation des macrophages. Les cellules Th2 sont les effecteurs de la réponse immunitaire contre les parasites extracellulaires. Ils sont également impliqués dans la réponse humorale en activant les cellules B et participent aux réactions allergiques. Les cellules Th17 sont des lymphocytes pro-inflammatoires caractérisés par l'expression d'IL-17. Elles recrutent les neutrophiles et jouent un rôle important dans l'homéostasie des muqueuses ainsi que dans la clairance des pathogènes à leur surface. Enfin, elles sont impliquées dans des pathologies auto-immunes telles que la sclérose en plaques ou la polyarthrite rhumatoïde. Les lymphocytes Treg sont responsables du maintien de l'immunotolérance indispensable dans la prévention de maladies auto-immunes. La balance entre ces différentes populations de lymphocytes permet la mise en place d'une réponse adaptée en cas d'infections, mais est également nécessaire pour éviter l'inflammation chronique et les réactions auto-immunes. Après irradiation, la 47 proportion de ces différents ensembles de cellules est déséquilibrée, donnant lieu à des réactions délétères. Par exemple, l'irradiation peut induire des réactions auto-immunes. Chez l'Homme, l'exposition de la thyroïde aux rayonnements ionisants induit une augmentation transitoire des auto- anticorps (Brent, 2010). Ce déséquilibre est d'autant plus important que les différentes populations de lymphocytes présentent des radiosensibilités variables. Parmi ceux-ci, les Treg semblent ainsi plus résistants que les cellules Th (Schaue et McBride, 2012). Cet effet semble dû aux différences de capacité proliférative entre les cellules concernées. Les phénomènes de déséquilibre entre les différentes populations de lymphocytes T sont observés chez les patients atteints de MICI. Pour les patients souffrant de la maladie de Crohn, les lymphocytes T s'orientent vers une polarisation Th1, alors qu'un profile Th2 est favorisé lors de la recto-colite hémorragique (Francois et coll. , 2013). La modification du profil inflammatoire au sein du tissu entraine la production accrue de cytokines pro-inflammatoires et pro-fibrosantes. Ces molécules participent à l'activation constante de nouveaux myofibroblastes ainsi qu'aux dommages répétés aux cellules résidentes, induisant la chronicité de la pathologie. Le défaut de dégradation causé par le déséquilibre entre MMP et TIMP est également imputable aux cellules immunitaires. Ainsi l'inflammation, même si elle ne régit pas l'ensemble des étapes de la fibrose, notamment établie, est une composante nécessaire de la fibrogénèse. a. Réponse des lymphocytes T Les lymphocytes T auxiliaires, ou T helper (Th) peuvent adopter différents états de polarisation (Th1, Th2). Les lymphocytes Th1 participent à la réponse immunitaire cellulaire, alors que les Th2 sont des lymphocytes auxiliaires de la réponse humorale. Les lymphocytes Th1 produisent la réaction pro-inflammatoire nécessaire notamment à l'élimination des pathogènes. Les Th2 sécrètent un ensemble de cytokines, dont l'interleukine anti-inflammatoire IL-10, associées à l'immunosuppression, à la production d'anticorps et à la promotion du remodelage de la MEC. La réponse Th1 est ainsi considérée comme pro-inflammatoire, à l'inverse de la réponse Th2, anti- inflammatoire. Les lymphocytes Th17 sont caractérisés par la production d'IL-17. Ils ont un rôle important dans les processus d'inflammation chronique, notamment par la sécrétion de cytokines pro- inflammatoires (IL-17, IL-21, IL-22) et de chimiokines. Enfin, les Treg inhibent la prolifération et la production de cytokines des lymphocytes T effecteurs et induisent l'immunotolérance. 48 i. Th1 Les lymphocytes T Th1 sont caractérisés par leur expression de l'IFN-. Cette propriété de la réponse Th1 semble être à l'origine de l'effet anti-fibrotique de ces lymphocytes. En effet, l'IFN- inhibe la phosphorylation de Smad3 (Small Mother Against Decapentaplegic 3) induite par le TGF- (Ulloa et coll. , 1999). En activant la voie Jak1/Stat1, l'IFN- induit l'expression de Smad7, un inhibiteur des effecteurs de la voie TGF-/Smad. L'activité inhibitrice de l'IFN- induit l'inhibition de la production de collagènes par les myofibroblastes. Il inhibe également la différenciation des monocytes du sang périphérique en fibrocytes, induite notamment par les cytokines de la réponse Th2 (IL-4 et IL-13) (Shao et coll. , 2008). ii. Th2 La réponse immunitaire de Th2 semble être un acteur clé dans la progression de la fibrose (Mavalia et coll. , 1997, Shi et coll. , 1997). Les lymphocytes T sont activés en Th2 par IL-4. Ces cellules expriment alors des cytokines spécifiques de cette réponse, notamment IL-4 et IL-13, qui sont impliquées dans le développement de la fibrose entre autres au niveau hépatique (Chiaramonte et coll. , 1999, Reiman et coll. , 2006) et cutanée (Ong et coll. , 1998). Ces deux cytokines jouent un rôle important dans la polarisation des macrophages, en induisant une polarisation M2a. IL-13 en particulier est un médiateur majeur du remodelage matriciel pathologique et son implication a été démontrée dans de nombreux modèles, dont des modèles de fibrose radio-induite (Han et coll. , 2011) ou de MICI (Heller et coll. , 2002). IL-13 peut directement activer TGF-1 et induire sa production (Lee et coll. , 2001). Cet effet est probablement à l'origine d'une augmentation de la transition épithélium-mésenchyme sous l'effet d'IL-13 (et IL-4) dans le poumon (Richter et coll. , 2001). La stimulation de l'EMT par IL-4 et IL-13 semble passer par l'augmentation de la production de TGF-2 (Richter et coll. , 2001). Dans un modèle de fibrose hépatique infectieuse chez la souris, la suppression de l'IL-13 induit une diminution significative de la fibrose, associée à une expression constante de TGF- 1, suggérant un effet de l'IL-13 indépendant du TGF- (Kaviratne et coll. , 2004). IL-13 stimule les capacités sécrétoires et prolifératives des fibroblastes, cellules épithéliales et CML et est donc probablement impliquée dans les processus de différenciation myofibroblastique (Doucet et coll. , 1998, Jakubzick et coll. , 2003, Murray et coll. , 2008). Plus précisément, IL-13 induit l'augmentation de l'expression de TGF-1, CTGF (Connective Tissue Growth Factor), -SMA, des collagènes de type I et III, MMP-2, MMP-3 et MMP-9 et de TIMP-1 (Kaviratne et coll. , 2004, Murray et coll. , 2008). Il est intéressant de noter que sur des fibroblastes pulmonaires sains, IL-13 n'a pas d'effet sur l'expression 49 de TGF-1 et CTGF à l'inverse des fibroblastes de patients souffrant de fibrose pulmonaire idiopathique (Murray et coll. , 2008). Il est donc probable que l'IL-13 ne puisse pas induire la fibrose seul et nécessite un signal initiateur pour exercer son effet. iii. Th17 Les lymphocytes Th17 entrent en jeu lors des étapes d'initiation de la fibrose par la sécrétion de l'IL-17A. Cette cytokine pro-inflammatoire a été impliquée dans de nombreuses pathologies fibrosantes, telles que la fibrose pulmonaire (Wilson et coll. , 2010), la fibrose du myocarde (Feng et coll. , 2009) et la fibrose intestinale radio-induite (Bessout et coll. , 2015). La réponse Th17 est majoritairement induite par IL-1 et IL-23 (Gasse et coll. , 2011). Dans la majorité des cas, la surexpression de IL-17A est associée à une augmentation significative du recrutement des neutrophiles (Laan et coll. , 1999). Or, le recrutement massif de neutrophiles peut conduire au développement de la fibrose en induisant la mort des cellules endothéliales (Zhu et coll. , 2011). IL-17A participe également à la fibrose en induisant l'expression de MMP-1 par les fibroblastes (Cortez et coll. , 2007). TGF- est nécessaire au développement de la réponse Th17 chez la souris et pour le développement de la fibrose induite par IL-17A (Wilson et coll. , 2010). Ainsi, la fibrose induite par IL- 1 nécessite la coopération de l'IL-17A et du TGF-. Dans les modèles de fibrose pulmonaire, l'inhibition de l'expression de l'IL-17A favorise la résolution de la pathologie (Wilson et coll. , 2010, Mi et coll. , 2011). iv. Treg Le rôle des lymphocytes T régulateurs au cours de la fibrose est encore mal connu. Ils ont une fonction immunosuppressive vis-à-vis des cellules effectrices de la réponse T en produisant différentes cytokines anti-inflammatoires telles que TGF- et IL-10. Il a donc été longtemps considéré que l'augmentation de la proportion de Treg limiterait la fibrose en inhibant la réponse inflammatoire. En effet, des études ont montré un lien entre les Treg et l'amélioration de la fibrose au cours de la Fibrose Pulmonaire Idiopathique (Kotsianidis et coll. , 2009), la GVHD (Zhang et coll. , 2010) et la fibrose hépatique (Claassen et coll. , 2010). Néanmoins, la production de TGF-1 par cette sous-population pourrait expliquer que les Treg induisent la fibrose dans plusieurs modèles (Estes et coll. , 2007, Liu et coll. , 2010). Enfin, l'une des implications majeures des Treg est la régulation de la proportion des autres 50 sous-types de cellules T. Ceci pourrait expliquer les effets opposés observés dans différents modèles, les Treg limitant l'induction de la fibrose par les lymphocytes T helper, mais favorisant la fibrose induite par TGF-1. b. Influence de la polarisation des macrophages Les macrophages sont des éléments essentiels de la mise en place de l'immunité innée et de la réponse immunitaire adaptative. Ils sont capables de phagocytose et participent donc à l'élimination des débris cellulaire et des agents exogènes. Leur rôle de cellules présentatrices de l'antigène et leur capacité à l'opsonisation les rend indispensable à l'immunité adaptative. Les cellules dérivées de monocytes (macrophages, cellules dendritiques et fibrocytes) exercent des effets immunomodulateurs, ainsi que sur le remodelage matriciel et la régulation de la différenciation myofibroblastique lors de la fibrose. Les cytokines telles que l'IFN- (Interferon-), le TNF- et le GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor), ainsi que des motifs microbiens, comme les lipopolysaccharides (LPS) peuvent induire la polarisation M1. L'état M2 est induit par l'IL-4 et l'IL-13 (Gordon, 2003). A l'instar des cellules T, les macrophages peuvent présenter différents états de polarisation (Figure 14) : classiquement activés (M1) et alternativement activés (M2). La polarisation M1 est impliquée dans la réponse inflammatoire et la réponse immunitaire aux infections. Elle est scindée en deux groupes : M1a, responsable de la lutte contre les pathogènes, et M1b, intervenant lors de lésions sans infection. La polarisation M1a est induite par les PAMP (Pathogen-Associated Molecular Patterns) et les cytokines pro-inflammatoires, notamment TNF- et IFN-. A l'inverse, la polarisation M1b est induite par les signaux de danger endogènes (Fer, histone, ATP) (Lech et Anders, 2013). Les macrophages polarisés M2 sont divisés en plusieurs sous-groupes différenciés entre autres par leur stimulus inducteur : IL-4 et IL-13 pour les macrophages M2a, LPS et complexes immuns pour les M2b et TGF-, IL-10 et les glucocorticostéroïdes pour les M2c (Adhyatmika et coll. , 2015). Il est intéressant de noter que l'IL-21 et l'IL-33, des cytokines classiquement associées à la polarisation Th2, sont également impliquées dans la polarisation M2 (Pesce et coll. , 2006, Kurowska-Stolarska et coll. , 2009). La fonction exacte de ces différents sous-groupes de macrophages est encore mal connue. Les macrophages M1 sont producteurs d'intermédiaires des ROS et RNS et de cytokines pro- inflammatoires (IL-1, TNF, IL-6). Ils participent à la réponse Th1 en tant qu'inducteurs et effecteurs. 51 Ils jouent également un rôle dans la résistance aux parasites intracellulaires et aux tumeurs (Mantovani et coll. , 2013). Les macrophages alternativement activés produisent des cytokines inflammatoires en fonction du stimulus les ayant activés. Les macrophages M2 sont impliqués dans la réponse Th2, dans la clairance des parasites (Noel et coll. , 2004) et l'inhibition de l'inflammation. Ils interviennent également dans l'angiogenèse, la progression tumorale et ont un rôle immunomodulateur (Biswas et Mantovani, 2010). Enfin, ils favorisent le remodelage du tissu (Wynn, 2004). Les macrophages produisent des cytokines pro-fibrosantes, dont le TGF-1 et le PDGF, des MMP et des TIMP (Wynn et Barron, 2010). Ils sont donc capables de réguler la fibrogénèse de façon positive ou négative. Leur activité, pro ou anti-fibrosante, dépend de leur état de polarisation : M1, classiquement activé, ou M2, alternativement activé. Les différents états de polarisation des macrophages peuvent intervenir au cours de phases distinctes de la fibrose, de l'inflammation à la résolution. Au cours de la phase aige, les PAMP et DAMP (Damage-Associated Molecular Patterns) produits lors de la lésion sont reconnus par les macrophages qui sont alors préférentiellement activés en M1 (Daley et coll. , 2010). Les macrophages M1a sécrètent des quantités élevées de cytokines pro-inflammatoires (IL-1, IL-12, IL-23 et TNF-) ainsi que des ROS (Mantovani et coll. , 2004). Ils possèdent des capacités de phagocytose et d'endocytose accrues, associées à une augmentation de la présentation de l'antigène, pour lutter efficacement contre les infections (Lech et Anders, 2013). Ils participent également à la mise en place des réponses Th1 et Th17 (Cf. Réponse des lymphocytes T) (Galli et coll. , 2011). La polarisation M1b apparait dans le cas d'une lésion stérile et présente des caractéristiques similaires en termes de profil d'expression. Ces macrophages sont notamment responsables de la clairance des cellules apoptotiques. Bien que nécessaire à la lutte contre les pathogènes, cet état d'activation peut entrainer des dommages. La production de ROS, par exemple, favorise la mort des pathogènes mais induit également des dommages aux cellules résidentes. De plus, les macrophages M1 favorisent la mise en place de l'inflammation chronique à l'origine de nombreuses pathologies. Ils semblent ainsi impliqués dans diverses pathologies inflammatoires, telles que la maladie de Crohn (Smith et coll. , 2009). Les macrophages M1 participent au développement de la fibrose en sécrétant des MMP, notamment MMP-2 et MMP-9, accroissant le remodelage et la prolifération des myofibroblastes par EMT/EndoMT (Cheng et Lovett, 2003, Tan et coll. , 2013). 52 Figure 14 : caractéristiques des différents états de polarisation des macrophages : en haut : stimuli inducteurs ; en bas : activité spécifique (Wynn et Barron, 2010, Duffield et coll. , 2013, Lech et Anders, 2013) La phagocytose des cellules apoptotiques par les macrophages induit leur changement d'un état pro-inflammatoire vers un phénotype anti-inflammatoire (Voll et coll. , 1997). Ces macrophages alternativement activés, ou M2, sécrètent des cytokines anti-inflammatoires telles que l'IL-4, l'IL-13, l'IL-10 et le TGF-1 qui permettent la transition vers le processus de réparation (Buttner et coll. , 1997, Voll et coll. , 1997, Huynh et coll. , 2002). Les cellules M2 pourraient également être impliquées dans la suppression de la réponse Th1 en faveur des lymphocytes Th2 (Mantovani et coll. , 2002, Herbert et coll. , 2004). A l'inverse, une étude menée sur un modèle de fibrose pulmonaire infectieuse indique que les macrophages M2 exprimant l'arginase suppriment la réponse Th2 en déplétant le milieu en arginine (Pesce et coll. , 2009). Cet effet est en accord avec les études montrant le recrutement des lymphocytes Treg par CCL22 (chemokine (C-C motif) ligand 22) synthétisé par les M2 (Curiel et coll. , 2004). Les facteurs sécrétés par les macrophages M2a favorisent l'activation des myofibroblastes et la formation du tissu de granulation. De plus, l'arginase-1 est impliquée dans le contrôle de la synthèse de la proline, un constituant essentiel du collagène, et favorise donc la production de MEC (Li et coll. , 2001). Les cellules M2a produisent également des facteurs pro-fibrosants tels que la galectine-3, le PDGF, le FGF-2, IGFBP5 (Insulin-like Growth Factor-Binding Protein 5) et CCL18, capables d'activer la différenciation myofibroblastique (Duffield et coll. , 2013). Dans le foie, IL-13, un activateur des M2a, 53 peut induire la fibrose indépendamment de TGF-1 (Kaviratne et coll. , 2004). IL-13 est une cytokine caractéristique de la réponse Th2, et inductrice de la polarisation M2a. Cette observation suggère que l'axe Th2/M2 serait capable d'entretenir, voire d'induire la fibrose. Les macrophages M2c, également nommés M régulateurs ou Mreg, sont identifiés comme favorisant la résolution de la fibrose en activant la dégradation de la matrice excédentaire. En particulier, la production de MMP-9 et MMP-13 par les macrophages a été liée à une amélioration significative dans des modèles de fibrose hépatique et pulmonaire (Cabrera et coll. , 2007, Fallowfield et coll. , 2007). De plus, les Mreg expriment IL-10, un puissant anti-fibrosant dans des modèles de fibrose intestinale ou rénale (Murai et coll. , 2009, Anders et Ryu, 2011). IL-10 favorise également le maintien de la réponse T régulatrice. Ainsi, il apparait que différents états de polarisation des macrophages aient pour fonction de supporter l'organisme au cours des différentes étapes de la prise en charge d'une lésion. L'activation de macrophages pro-inflammatoires lors de la phase aige permet la lutte contre les pathogènes et l'élimination des débris cellulaires. Le basculement vers un état anti-inflammatoire prévient l'apparition d'un phénomène d'inflammation chronique. Les macrophages alternativement activés prennent alors en charge la réparation du tissu en activant le système de production de MEC. Il est nécessaire que cette étape soit limitée dans le temps afin d'éviter l'apparition de la fibrose. L'apparition de macrophages régulateurs permettrait de limiter cette étape et de favoriser le retour vers un état physiologique. L'équilibre quantitatif et temporel entre ces différents états d'activation semble indispensable à la résolution non pathologique de la lésion. 3. Les myofibroblastes : principaux acteurs cellulaires de la fibrose Les myofibroblastes sont des cellules contractiles caractérisées par l'expression de la vimentine et de l'-SMA et par l'absence d'expression de la desmine. Ils participent à la croissance, le développement et la réparation des tissus ainsi qu'à différentes pathologies telles que le cancer ou la fibrose. La terminologie myofibroblaste a été choisie car ce type cellulaire présente des caractéristiques des fibroblastes, notamment en termes de morphologie et d'activité sécrétoire, ainsi que des cellules musculaires lisses, en particulier l'expression de l'actine des muscles lisses. Les myofibroblastes sont responsables de la production de la MEC lors de la formation du tissu de granulation, mais également au cours de la fibrose. 54 Suite à une lésion, la production de cytokines par les cellules endommagées et les cellules inflammatoires permet le recrutement de proto-myofibroblastes dans différents compartiments de l'organisme. Dans un premier temps, les fibroblastes sains proches de la lésion migrent vers la zone endommagée et expriment des faisceaux de microfilaments de - et -actine cytoplasmique (Tomasek et coll. , 2002). Dans un même temps, les autres sources de myofibroblastes sont également stimulées (moelle osseuse, sang). Les cellules nouvellement différenciées produisent les éléments de la MEC formant le tissu de granulation : collagènes de type I et III (Tomasek et coll. , 2002)et fibronectine (Brown et coll. , 1993). Ils produisent également d'importantes quantités de TIMP-1 afin de bloquer la dégradation de la MEC (Robert et coll. , 2016). Deux variants d'épissage de la fibronectine sont sécrétés : EDA (ou EIIIA) et EDB (EIIIB) (Brown et coll. , 1993). Le variant EDA de la fibronectine est indispensable à la différenciation des myofibroblastes (Serini et coll. , 1998). En effet, en présence d'un anticorps dirigé contre ED-A, les fibroblastes traités par TGF-1 ne sur-expriment ni -SMA, ni le collagène de type I. Sous l'action de TGF-1, les proto-myofibroblastes se différencient en myofibroblastes exprimant l'-SMA et responsables de la contraction de la blessure (Desmouliere et coll. , 1995). La forme latente de TGF-1 est clivée par des enzymes protéolytiques ainsi que par des effets mécaniques. Les myofibroblastes ayant acquis une activité contractile par l'expression -SMA exercent des contraintes sur la MEC via les intégrines couplées à leur cytosquelette (Wipff et coll. , 2007). Il semble que les forces exercées sur la MEC induisent un changement de conformation du complexe latent contenant TGF-1 qui est alors libéré (Van De Water et coll. , 2013). Cette hypothèse est appuyée par le fait que l'augmentation du stress mécanique au sein du tissu accélère la différenciation des myofibroblastes, alors que la perte de ces forces bloque l'acquisition de l'-SMA (Hinz et coll. , 2001). La rigidification de la MEC, due à l'activité de remodelage des myofibroblastes, participe aussi à la libération de TGF-1 (Klingberg et coll. , 2014). Enfin, les myofibroblastes mettent en place une boucle d'activation autocrine par la production de TGF-1 latent (Dabiri et coll. , 2006). 55 Figure 15 : mécanismes de différenciation des fibroblastes en myofibroblastes : plusieurs paramètres sont nécessaire à l'acquisition des capacités contractiles des myofibroblastes : la présence de contraintes mécaniques au sein du tissu, la disponibilité de TGF-1 activé et la production du variant d'épissage ED-A de la fibronectine (D'après Tomasek et coll. , 2002) (Tomasek et coll. , 2002) Ces processus sont fondamentaux dans la mise en place de la chronicité de la lésion. Après l'activation initiale de la réserve de progéniteurs de proto-myofibroblastes, plusieurs mécanismes sont induits et participent à la libération de TGF-1 et donc à l'activation de nouvelles cellules pro- fibrosantes. Le stress mécanique résultant de la contraction des myofibroblastes favorise l'ischémie tissulaire, et donc la mort de nouvelles cellules et la poursuite de l'inflammation. Ces processus contribuent à l'activation de nouveaux myofibroblastes et donc au remodelage constant de la MEC et à la continuité de la fibrogénèse (Figure 15). Des cellules présentant des caractéristiques proches des myofibroblastes sont retrouvées en conditions physiologiques dans quasiment tous les tissus : intestin, stroma de la moelle osseuse, foie (Tomasek et coll. , 2002). Les myofibroblastes impliqués dans la fibrose sont pour la plupart issus de cellules résidentes : les cellules étoilées dans le foie (Moreira, 2007), les kératocytes dans l'œil (Torricelli et coll. , 2016) et les péricytes dans de nombreux organes (Greenhalgh et coll. , 2013). Les myofibroblastes peuvent également provenir de progéniteurs circulants dérivés de la moelle osseuse appelés fibrocytes (Galligan et Fish, 2013), ainsi que de cellules épithéliales dans le cadre de l'EMT (Epithelial-to-Mesenchymal Transition) (Hinz et coll. , 2007) ou de cellules endothéliales lors de l'EndoMT (Endothelial-to-Mesenchymal Transition) (Zeisberg et coll. , 2007). Enfin, les CSM résidentes 56 et circulantes constituent des précurseurs majeurs de myofibroblastes dans de nombreux organes et pathologies (Direkze et coll. , 2004). Dans l'intestin, deux types de myofibroblastes sont présents : les cellules interstitielles de Cajal (CIC) et les myofibroblastes subépithéliaux. Les CIC se trouvent dans la sous-muqueuse et la musculaire propre de l'intestin et participent notamment au contrôle de la motilité intestinale (Sanders, 1996). Elles sont classiquement localisées entre les tuniques circulaire et longitudinale de la musculaire propre dans l'estomac, l'intestin grêle et le côlon. Elles ont trois fonctions majeures : (i) elles sont le pacemaker des muscles lisses gastro-intestinaux (ii) elles facilitent la propagation des signaux électriques et (iii) elles modulent la neurotransmission (Sanders, 1996). Les myofibroblastes sub-épithéliaux sont présents le long du tractus gastro-intestinal, de l'œsophage à l'anus, ainsi que dans la vésicule biliaire et le pancréas. Ils forment un syncytium s'étendant le long de la lamina propria de l'intestin, fusionnant avec les péricytes entourant les vaisseaux sanguins (Joyce et coll. , 1987). Ils participent à : (i) l'organogénèse de la muqueuse en favorisant la formation des cryptes et des villosités et (ii) la cytodifférenciation des cellules épithéliales en entérocytes, cellules en gobelets, cellules entéroendocrines et cellules de Paneth (Powell et coll. , 1999). La muqueuse intestinale comporte également des fibroblastes sub-épithéliaux dépourvus d'activité contractile. Ces cellules présentent des granules de sécrétion de collagène et se lient à la MEC par des adhésions focales (Eyden et coll. , 2011). La culture de fibroblastes coliques dans une matrice reproduisant la rigidité du tissu sténosé au cours de la maladie de Crohn induit une augmentation de leur prolifération et de l'expression de -SMA, suggérant une implication durant la fibrose (Johnson et coll. , 2013). Dans les pathologies impliquant la fibrose intestinale, telles que la maladie de Crohn, les myofibroblastes ne sont pas les seules cellules incriminées. Les cellules musculaire lisses sont également responsables de la production de MEC (Graham, 1995). Dans la maladie de Crohn, on observe un épaississement de la musculaire muqueuse ainsi qu'une accumulation de collagène autour des cellules musculaires lisses (CML). Des plages de cellules similaires aux CML se développent dans la sous-muqueuse et des plages de MEC s'invaginent dans la musculaire propre. Une augmentation de la quantité de collagène de type III ainsi que de l'expression des pro-collagènes I, III et V se produit (Graham, 1995). IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1) est surexprimé au cours de la maladie de Crohn (Simmons et coll. , 2002). Or, IGF-1 stimule l'hyperplasie des CML et pourrait donc être à l'origine de l'épaississement des tuniques musculaires de l'intestin (Lund, 1998). 57 Ainsi, alors que les cellules productrices de MEC sont relativement bien décrites dans la fibrose de différents organes (cœur, rein, foie), la question reste encore floue concernant l'intestin. En conditions physiologiques, les CML intestinales expriment l'-SMA, la desmine et la tropomyosine. Les CML isolées d'intestins de patients souffrant de la maladie de Crohn présentent une expression accrue de l'-SMA, de l'actine entérique- et de la desmine (Graham, 1995). Les myofibroblastes sub- épithéliaux n'expriment pas la desmine in situ, mais une étude indique une augmentation de son expression au cours de la maladie de Crohn (Powell et coll. , 1999). Les cellules responsables de la fibrose intestinale possèdent des caractéristiques proches des myofibroblastes : une apparence proche des cellules stellaires, des fibres de stress proéminentes et un réticulum endoplasmique dilaté (Powell et coll. , 1999). Il est donc possible que l'ensemble de ces cellules, CML, CIC et myofibroblastes sub- épithéliaux soient responsables de la fibrose au niveau intestinal. a. Migration des myofibroblastes La migration des myofibroblastes dans et à travers la MEC est une étape indispensable de la régénération tissulaire. Elle cesse en temps normal lorsque le tissu est repeuplé et que les signaux chimioattractants produits par les cellules immunitaires décroit. Néanmoins, plusieurs mécanismes peuvent induire la poursuite de ces phénomènes de migration. Les myofibroblastes subépithéliaux peuvent par exemple stimuler leur propre migration par la production de facteurs autocrines et paracrines, comme indiqué par l'augmentation de leur capacité migratoire sous l'effet de milieu conditionné par d'autres myofibroblastes (Leeb et coll. , 2002, Leeb et coll. , 2004). De nombreux facteurs de croissance, dont PDGF1, PDGFB, TGF-1, IGFI et EGF peuvent stimuler la migration des myofibroblastes intestinaux (Leeb et coll. , 2002). Il semble cependant que la fibronectine soit nécessaire à l'induction autocrine de la migration des myofibroblastes intestinaux (Leeb et coll. , 2004). Les myofibroblastes sub-épithéliaux de patients souffrant de la maladie de Crohn ou de rectocolite hémorragique présentent une réponse migratoire significativement réduite par rapport aux cellules contrôles (Leeb et coll. , 2003). Ce phénomène est classiquement induit par une exposition prolongée au TNF- ou à l'IFN- (Leeb et coll. , 2003). L'importance de ce mécanisme dans le développement des MICI est mal connue mais une diminution de la migration des myofibroblastes a été observée dans d'autres organes. Les fibroblastes de patients atteints de mucopolysaccharidose ont une activité migratoire fortement réduite également (Pontz et coll. , 1984). Au cours de la fibrose pulmonaire, les fibroblastes issus de tissus fortement fibrosés ont une réponse migratoire accrue vis- à-vis de PDGF par rapport aux fibroblastes de tissus présentant une fibrose jeune (Suganuma et coll. , 58 1995). Un effet inhibiteur d'IFN- a été observé sur la migration des fibroblastes normaux (Adelmann- Grill et coll. , 1987). Les myofibroblastes intestinaux sont exposés à de hautes concentrations d'IFN- pendant des périodes prolongées lors d'inflammations chroniques de la muqueuse et pourraient donc voir leur potentiel migratoire réduit par ce mécanisme. b. EMT et EndoMT L'EMT et l'EndoMT (ou EndMT) sont deux processus par lesquels des cellules de lignées non- mésenchymateuses, en l'occurrence des cellules épithéliales ou endothéliales, changent de phénotype pour acquérir des caractéristiques mésenchymateuses. Ces mécanismes jouent un rôle au cours du développement, de la régénération tissulaire, ainsi que lors de la fibrose et du cancer. i. EMT L'EMT et le processus opposé, la MET (Mesenchymal-to-Epithelial Transition) sont cruciaux au cours du développement, notamment lors de la gastrulation. À l'âge adulte, ce mécanisme est en particulier impliqué dans la réponse physiologique aux blessures, en assurant l'apport de nouveaux myofibroblastes lors de la formation du tissu de granulation. De la même façon, l'EMT amplifie la réponse pro-fibrosante en conditions pathologiques. Au cours de l'EMT, les cellules perdent leurs marqueurs épithéliaux (Figure 16). La E-cadhérine est considérée comme le principal marqueur de cette première étape, étant en partie responsable du maintien de l'adhérence des cellules au tissu et entre elles (Whiteman et coll. , 2008, Huang et coll. , 2012). L'augmentation de l'expression de la vimentine participe à l'inhibition de la E-cadhérine (Mendez et coll. , 2010). La cellule perd alors l'adhérence au tissu par dégradation de la lame basale et gagne des caractéristiques mésenchymateuses : motilité, perte de la polarité du cytosquelette, expression de FSP-1 (Fibroblast-Specific Protein-1), -SMA et collagène I (Kalluri et Weinberg, 2009, Lin et coll. , 2011). De nombreux facteurs de croissance et cytokines, tels que FGF-2, EGF, TGF- et IL-1 peuvent induire l'EMT au cours de la régénération physiologique et de la fibrose (Stone et coll. , 2016). En particulier, TGF- est un puissant inducteur de l'EMT, via des voies de signalisation dépendantes ou non de Smad (Stone et coll. , 2016). TGF- est en effet un inhibiteur des marqueurs épithéliaux (E- cadhérine, occludine) et un activateur des marqueurs mésenchymateux (N-cadhérine, vimentine) (Vincent et coll. , 2009). 59 Figure 16 : marqueurs spécifiques de la transition épithélium-mésenchyme (D'après Kalluri et Weinberg, 2009) (Kalluri et Weinberg, 2009) ii. EndoMT L'EndoMT a été décrite comme participant à l'angiogenèse (Welch-Reardon et coll. , 2014) et au développement du cœur lors de l'embryogénèse (Kovacic et coll. , 2012). À l'identique de l'EMT, ce processus est également impliqué dans l'apport de fibroblastes et myofibroblastes au cours de la régénération tissulaire et de la fibrose (Lin et coll. , 2012). Au cours de l'EndoMT, sous l'influence de signaux spécifiques, tels que TGF-2, les cellules endothéliales opèrent une réorganisation de leur cytosquelette associée à la perte de molécules d'adhésion telles que la VE-cadhérine (Vascular Endothelial-cadhérine). Ce mécanisme permet la perte d'adhérence des cellules endothéliales aux cellules voisines (Crosby et coll. , 2005). La perte de l'expression d'autres marqueurs endothéliaux, facteur von Willebrand et CD31, et l'expression de nouvelles protéines (-SMA, Smooth Muscle 22, vimentine et N-cadhérine) sont les caractéristiques principales des cellules en transition (Goumans et coll. , 2008). Les cellules acquièrent ensuite un phénotype migratoire et sécrétoire (MEC : collagènes et fibronectine) spécifiques des myofibroblastes (Good et coll. , 2015). Les facteurs de croissance de la famille TGF- sont des inducteurs de l'EndoMT : TGF-1, TGF- 2, BMP2 (Bone Morphogenic Protein 2), BMP4, BMP6, BMP9 et BMP10 (Medici, 2016). L'activation de l'EndoMT par TGF- dépend de voies de signalisation Smad-dépendantes et indépendantes (Medici et coll. , 2011). D'autres voies sont impliquées dans l'induction de ce mécanisme, en particulier les voies Wnt/-caténine (Aisagbonhi et coll. , 2011) et Notch (Gasperini et coll. , 2012). 60 4. Les acteurs moléculaires de la fibrose a. TGF-1 TGF-1 fait partie de la superfamille TGF- de facteurs de croissance pléiotropies, comprenant les BMP, les TGF- et l'activine. Ces cytokines sont impliquées dans de nombreux processus, dont le contrôle de la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire. Elles interviennent également dans la régulation de l'inflammation. Enfin, elles ont un rôle majeur dans la régénération tissulaire et la fibrose. Chez les mammifères, trois isoformes (TGF-1, TGF-2 et TGF-3) ont été identifiées. Ces isoformes se lient au récepteur TR2 (ou TGFR2 : Tumor Growth Factor- Receptor 2) qui recrute en conséquence TR1 pour activer la voie de signalisation correspondante (Xu et coll. , 2012). TGF- est synthétisé sous forme de précurseur, lié à la LAP (Latency Associated Peptide) qui facilite la liaison à la Latent TGF- Binding Protein (LTBP) (Robertson et coll. , 2015). Sous cette forme de complexe TGF- /LAP/LTBP, appelé LLC (Large Latent Complex) TGF- est inactif et ne peut pas se lier à ses récepteurs. Ce complexe est retrouvé en quantité importante associé à la MEC. LTBP est capable de se lier à différentes protéines de la MEC, telles que la fibronectine, la vitronectine et la fibrilline (Annes et coll. , 2003). Le complexe peut être clivé au niveau de LAP et/ou LTBP par de nombreuses protéases dont la plasmine, les MMP2 et 9, la thrombospondine, certaines intégrines et les espèces réactives de l'oxygène (Annes et coll. , 2003). Le clivage de ce complexe permet la libération de TGF- sous sa forme active. La liaison de TGF- à ses récepteurs induit l'activation des protéines de la voie Smad, comprenant des facteurs de transcription agissant sur la production de MEC et l'activation des myofibroblastes. L'activation des récepteurs aux TGF- induit également l'activation d'autres voies de signalisation, telles que la voie MAP kinase (Mitogen-Activated Protein kinases) et de PI3K/Akt/mTOR (Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 3-kinase-Protein kinase B- mammalian Target Of Rapamycin) (Derynck et Zhang, 2003). Le TGF-1 est l'acteur moléculaire central dans le développement de la fibrose. Il intervient dans la régulation de la croissance cellulaire et de l'apoptose, possède des propriétés immunomodulatrices et est responsable de la production de MEC. Le TGF-1 exerce un pouvoir antiprolifératif sur de nombreux types cellulaires dont les cellules épithéliales et endothéliales. A l'inverse, les fibroblastes mis en présence de TGF-1 présentent une activité proliférative accrue (Martin et coll. , 2000). Il supprime la prolifération des cellules B et T, la cytotoxicité des Natural Killer, la production d'immunoglobuline par les lymphocytes B (Letterio et Bottinger, 1998) et la production de NO par les macrophages (Vodovotz et coll. , 1993). Il peut induire l'apoptose de cellules en cultures, dont les hépatocytes (Oberhammer et coll. , 1992) et kératinocytes (Benassi et coll. , 1997). Il stimule également la production de collagène par les fibroblastes (Stallmach et coll. , 1992) et cellules 61 musculaires lisses de l'intestin (Graham et coll. , 1990). TGF-1 favorise la sécrétion de molécules d'adhésion, par exemple ICAM-1 (Brannigan et coll. , 2002), et de facteurs pro-fibrosants, tels que VEGF (Beddy et coll. , 2004) et PDGF (Kumagai et coll. , 2001). Enfin, il intervient dans la différenciation classique des myofibroblastes, ainsi que dans les processus de transdifférenciation de cellules épithéliales (EMT : Epithelial-to-Mesenchymal Transistion) (Lee et Joo, 1999) et endothéliales (EndoMT : Endothelial-to-Mesenchymal Transition) (Rieder et coll. , 2011). Dans l'intestin de rats irradiés, l'expression et l'immunoréactivité de TGF-1 sont augmentées moins de 24h après irradiation. L'augmentation est d'autant plus importante que la dose reçue est élevée (Hauer-Jensen et coll. , 1998). Figure 17 : mécanismes d'activation et d'inhibition de la voie Smad (D'après Akhurst, 2012) (Akhurst et Hata, 2012) 62 i. Les protéines de la voie Smad Les Smad sont une famille de 8 protéines effectrices des ligands de la superfamille TGF- (Figure 17). Les récepteurs de type I reconnaissent et phosphorylent (activent) spécifiquement les R- Smad (Receptor-activated Smad). Cette famille de protéines comprend Smad1, Smad5 et Smad8 (effecteurs des BMP) et Smad2 et Smad3 (effecteurs de TGF- et de l'activine). Ces protéines sont recrutées vers le TR1 activé par une protéine cytoplasmique, SARA (Smad Anchor for Receptor Activation), liée à la membrane. Les Smad2 et 3 phosphorylées suite à l'activation de TR1 par TGF-1 forment un complexe avec la Common mediator Smad (Co-Smad), Smad4. La formation de ce complexe permet la translocation du R-Smad vers le noyau par l'importine. Smad6 et Smad7 sont les Smad inhibiteurs (I-Smad), bloquant la fixation de Smad2 et Smad3 au complexe TR1/TR2. La fonction de Smad3 peut être régulée par un grand nombre de co-activateurs (AP-1 : Activator Protein- 1, Sp-1 : Specificity Protein-1, CREB : C-AMP Response Element-binding protein) et de corépresseurs (SnoN Skil : Ski-like protein, Ski proto-oncogene, Smad nuclear-interacting protein-1) peuvent se lier aux complexes contenant Smad3 (Meng et coll. , 2013) et influencer l'expression de ses gènes cibles. Smad2, Smad3 et Smad4 ont des fonctions distinctes, voire opposées au cours du développement de la fibrose. Smad3 est le seul de ces éléments à produire un effet transcriptionnel direct en se liant aux promoteurs correspondant. Smad2 et Smad4 agissent comme régulateurs de l'activité de Smad3 (Dennler et coll. , 1998, Chen et coll. , 1999, Piek et coll. , 2001, Yuan et Varga, 2001). Les gènes cibles de Smad3 ne sont pas tous connus à l'heure actuelle. L'une des premières pistes explorées furent, en raison de l'implication des Smad dans la fibrose, les gènes codant pour les éléments de la MEC. L'activation de la voie Smad par TGF- induit la surexpression de nombreuses protéines : - Éléments de la MEC : COL1A1 (chane 1 du collagène de type I), COL1A2, COL3A1, COL5A2, COL6A1, COL6A3, COL7A1, fibronectine (Verrecchia et Mauviel, 2002, Zhang et coll. , 2011, Akhurst et Hata, 2012) - Métalloprotéinases matricielles et inhibiteurs : MMP-2, MMP-3, MMP-12, TIMP-1 (Verrecchia et Mauviel, 2002, Qin et coll. , 2009, Zhang et coll. , 2011) - Serpines : SERPINE1 (PAI-1 : Plasminogen Activator Inhibitor-1), SERPINEA9, SERPINB3, SERPINA10, SERPINB1, SERPINI1 (Zhang et coll. , 2011) Smad : SMAD3, SMAD4, SMAD6, SMAD7 (Zhang et coll. , 2011) TGF- : TGFB1, TGFB2, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TGFB1T1, TGFB1, LTBP2, LTBP3, LTBP4 (Zhang et coll. , 2011) 63 - - - CTGF (Zhang et coll. , 2011) - - JUN, JUNB (Zhang et coll. , 2011) Intégrines : ITGA3 (InTeGrin subunit 3), ITGAV, ITGB1, ITGB6 (Zhang et coll. , 2011) - -SMA (Qin et coll. , 2009) La voie Smad est donc au cœur de la fibrogénèse en favorisant l'activation myofibroblastique, la production de MEC et en dérèglant l'équilibre entre MMP et TIMP, accentuant ainsi le défaut de dégradation de la MEC. De plus, la surexpression des protéines de la famille TGF- ainsi que le CTGF induit une boucle d'activation contribuant au maintien voire à l'augmentation du nombre de myofibroblastes pro-fibrosant au sein du tissu. Figure 18 : interactions entre la voie TGF-/Smad et d'autres voies de signalisation (D'après Meng et coll. , 2016) (Meng et coll. , 2016) ii. Autres voies activées par TGF- TGF- exerce un effet pléiotropique en activant de nombreuses voies de signalisation qui lui permettent d'exercer des effets régulateurs sur différents processus cellulaires (Figure 18). Ces 64 mécanismes permettent notamment d'induire ou d'entretenir la fibrose par des voies indépendantes des protéines Smad. La voie non-canonique rho/ROCK Les GTPases (Guanosine TriPhosphatases) de la famille Rho (Ras homologous) sont des molécules régulatrices jouant le rôle de lien entre les récepteurs de surface et le cytosquelette d'actine. Ils interviennent dans la régulation de la motilité cellulaire, du cycle cellulaire, de la survie cellulaire, de la transcription, du trafic membranaire et de la cytodiérèse (Ridley, 2001). L'activation des RhoGTPases (RhoA, RhoB, RhoC, Rac-1 : Ras-related C3 botulinum toxin substrate-1 et CDC-42 : Cell Division Control protein 42 homolog) par TGF- est appelée voie non-canonique, par opposition à la voie Smad, canonique. Les effets des protéines Rho sont produits par différents effecteurs, dont les ROCK (Rho-associated Coiled-coil-containing kinase) après ancrage de Rho sur la membrane cellulaire. Les ROCK activent le facteur MRTF (Myocardin-Related Transcription Factor) qui en retour induit l'expression de -SMA, PAI-1, Bcl-2 (B cell lymphoma-2) et XIAP (X-linked Inhibitor of APoptosis), deux gènes anti-apoptotiques. Cette voie favorise donc l'activation des myofibroblastes ainsi que leur survie (Riches et coll. , 2015). L'induction de CTGF par la voie Rho/ROCK est plus importante qu'à travers la voie des Smad (Yarnold et Brotons, 2010). L'activation de la voie Rho/ROCK induit l'expression de l'endothéline 1, un puissant vasoconstricteur intervenant dans la régulation de la contraction des myofibroblastes (Shimokawa et Yasuda, 2008). Dans les cellules souches mésenchymateuses, de nombreux stimuli peuvent activer les protéines Rho : facteurs de croissance, ROS, acide lysophosphatidique, molécules d'adhésion, stress mécanique (Haydont et coll. , 2007) Dans les cellules musculaires lisses intestinales de patients atteints d'entérite radique, l'inhibition de l'activation de Rho induit la diminution de l'expression de CTGF, TGF-1 et de la chane 2 du collagène I (Haydont et coll. , 2005). Ce résultat suggère une implication forte de cette voie dans la fibrogénèse. RhoA est un acteur majoritaire de l'induction de l'EMT par TGF-. L'activation de cette voie induit la formation de fibres de stress et l'acquisition d'un phénotype mésenchymateux chez les cellules épithéliales et kératinocytes (Bhowmick et coll. , 2001, Edlund et coll. , 2002). L'utilisation d'un mutant dominant négatif de Smad3 ne bloque pas l'effet de RhoA chez les cellules épithéliales, indiquant une activation indépendante de la Smad2 et Smad3 (Bhowmick et coll. , 2001). Le TGF- régule RhoA selon deux modes lors de l'EMT. Dans un premier temps, RhoA est rapidement activé afin de permettre l'acquisition du phénotype mésenchymateux. Dans un deuxième temps, TGF- induit 65 l'activation de Par6 (Partitioning defective 6 homolog alpha), une protéine régulant la polarité des cellules épithéliales. La formation d'un complexe Par6-Smurf1 permet la diminution de la production de RhoA et la dégradation des jonctions serrées, nécessaire à la poursuite de l'EMT (Ozdamar et coll. , 2005). La voie Erk/MAPK L'activation rapide de Erk (Extracellular signal-regulated kinase) a été observée dans de nombreux types cellulaires, dont les cellules épithéliales (Hartsough et Mulder, 1995) et les fibroblastes (Mucsi et coll. , 1996). Cette voie fait intervenir Raf (Rapidly accelerated fibrosarcoma), une Mitogen-Activated Protein kinase kinase kinase (MAP3K), recrutée en réponse à TGF- et capable d'activer Erk via MEK1 (MAPK/ERK Kinase-1 MAP2K1) (Yan et coll. , 1994). La signalisation par Erk régule l'expression de gènes notamment impliqués dans les interactions cellules-matrice, la motilité cellulaire et l'endocytose (Davies et coll. , 2005). En particulier, cette voie induit l'EMT, caractérisée par une augmentation de l'expression de la vimentine et une diminution de l'expression de la E-cadhérine (Davies et coll. , 2005). Erk peut également activer les R-Smad, dont Smad1, Smad2 et Smad3, et ainsi réguler leur activité (Kretzschmar et coll. , 1997, Funaba et coll. , 2002, Matsuura et coll. , 2005). La voie JNK/p38 L'activation de JNK (c-Jun N-terminal Kinase) et p38 MAPK constitue une autre voie de signalisation de TGF- indépendante de Smad. A l'instar de Erk, JNK et p38 sont activés à travers une cascade de MAPK (Weston et Davis, 2002). MKK4 (Mitogen-activated protein Kinase 4 MAP2K4) et MKK3/6 sont les activateurs directs respectifs de JNK et p38 (Zhang, 2009). Cette voie intervient dans l'apoptose et l'EMT induites par TGF-, mais, contrairement à la voie Erk, en coopération avec la voie Smad. TRAF6 (TNF receptor associated factor 6) et TAK1 (Transforming growth factor beta-Activated Kinase 1) sont nécessaires à l'induction par TGF- de l'activation de JNK et p38 (Sorrentino et coll. , 2008, Yamashita et coll. , 2008). L'inhibition de TRAF6 bloque l'effet pro-apoptotique de TGF- (Asanuma et coll. , 2011). De la même manière, les cellules exprimant une forme inactive de la TAK1 sont protégées contre l'apoptose induite par BMP et TGF- (Edlund et coll. , 2003). 66 Cette voie intervient également dans l'induction de l'EMT par TGF-. L'inhibition de p38 dans une culture de cellules épithéliales bloque les modifications morphologiques et la réorganisation du cytosquelette d'actine caractéristiques de l'EMT (Bakin et coll. , 2002). La voie PI3K/Akt L'activation de PI3K par le TGF-, permet la phosphorylation de son effecteur, Akt (Wilkes et coll. , 2005). Cette voie est impliquée dans l'EMT, la prolifération et la différenciation des myofibroblastes, ainsi que dans la régulation de la voie Smad. L'inhibition par la rapamycine de mTOR, un effecteur de Akt, dans des cellules épithéliales murines, induit une inhibition de l'augmentation de la sécrétion de protéines, du pouvoir migratoire et invasif induits par TGF- lors de l'EMT (Lamouille et Derynck, 2007). D'autre part, l'inhibition de c-Abl (Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), un effecteur de PI3K, réduit la différenciation myofibroblastique (-SMA et vimentine), l'expression des gènes de la MEC (collagènes, fibronectine) et la prolifération sur des fibroblastes rénaux traités par TGF- (Wang et coll. , 2005). La voie Wnt/-caténine Les Wnt sont des glycoprotéines qui, en se fixant sur les récepteurs Frizzled et LRP5/6 (Lipoprotein Receptor-related Protein 5/6), inhibent la translocation nucléaire de la -caténine (Tan et coll. , 2014). Les cibles transcriptionnelles de la voie Wnt/-caténine participent à l'organogénèse, l'homéostasie tissulaire et à la progression de nombreuses pathologies, dont le cancer et la fibrose (Liu, 2010). L'activation de la voie Wnt/-caténine stimule la prolifération, la capacité migratoire et la production de MEC par les fibroblastes (Poon et coll. , 2009, Carre et coll. , 2010). Elle intervient également dans la régulation de l'EMT au cours du développement et à l'âge adulte, au cours de la régénération tissulaire et de la fibrose (Zhou et coll. , 2012, Zhou et coll. , 2013, Matheson et coll. , 2016). Il existe une communication entre les voies Wnt/-caténine et TGF-/Smad. Au cours de la fibrose pulmonaire, la formation de complexes -caténine/Smad2 a été observée dans des cellules épithéliales alvéolaires humaines (Kim et coll. , 2009). Les protéines Wnt peuvent induire la production de TGF- par les fibroblastes (Carre et coll. , 2010) et TGF-1 induit l'activation de la -caténine (Sato, 67 2006). Au cours de l'EMT, ces deux voies de signalisation agissent en synergie pour réguler l'expression de -SMA . (Zhou et coll. , 2012) b. CTGF Le Connective Tissue Growth Factor (CTGF), également appelé CCN2, possède de nombreuses fonctions, dont la stimulation de la prolifération, l'angiogenèse, la migration, la production de MEC (notamment du collagène de type I), la survie et l'apoptose (Blom et coll. , 2002). L'expression de CTGF est majoritairement régulée par le TGF-, entre autres par l'activation de la voie Smad (Zhang et coll. , 2011). La voie Rho/ROCK est également impliquée dans ce mécanisme, l'inhibition de la GTPase RhoA induit une diminution significative de l'expression de CTGF induite par le TGF-1 (Heusinger-Ribeiro et coll. , 2001). L'activation de la voie Rho/ROCK a été observée dans l'iléon de patients souffrant d'entérique radique, suggérant un rôle de CTGF dans cette pathologie (Vozenin-Brotons et coll. , 2004). En outre, à l'instar de TGF-1, le CTGF peut activer sa propre expression, induisant une nouvelle boucle d'activation participant à la fibrogénèse (Riser et coll. , 2000). Ce mécanisme présente un intérêt particulier car il semble restreint aux cellules pro-fibrosantes. Le CTGF favorise la fixation de TGF- sur son récepteur TGF-R2 et amplifie ainsi l'activation de la voie Smad (Abreu et coll. , 2002). L'expression à long terme de CTGF, dans des pathologies comme l'entérique radique (Bourhis et coll. , 2006) ou la sclérodermie (Sato et coll. , 2000, Leask, 2004), semble indépendante de TGF-1. En effet, aux temps tardifs, l'expression de TGF-1 est faible alors que l'expression de CTGF est élevée et corrélée avec la sévérité de ces pathologies (Sato et coll. , 2000). Plusieurs explications ont été proposées pour ce phénomène. Les contraintes mécaniques produites par les myofibroblastes et la MEC au cours de la fibrose induisent la production chronique de CTGF par stimulation du stretch-responsive element présent dans son promoteur (Schild et Trueb, 2002). Ce mécanisme est dépendant de l'activation de RhoA et de la polymérisation des fibres d'actine, induisant de nouveaux stress mécaniques et une augmentation de l'activation de CTGF (Chaqour et coll. , 2006). La fibronectine est surexprimée sous l'action de CTGF au cours de la fibrose (Frazier et coll. , 1996). En retour, la fibronectine agit de concert avec CTGF pour activer l'expression de ce dernier (Chen et coll. , 2004) et favoriser la polymérisation du collagène (Velling et coll. , 2002). De plus, la fibronectine active la voie Rho par sa fixation aux intégrines 51 et v3 (Bourdoulous et coll. , 1998) et contribue ainsi à la prolifération et à la différenciation des cellules musculaires lisses (Mack et coll. , 2001). 68 5. Les spécificités de la fibrose intestinale Au sein de l'intestin, l'inflammation chronique se traduit dans un premier temps par la perte des cellules épithéliales de la muqueuse et la dégradation de la MEC de la lamina propria, induisant des ulcérations. Les enzymes et médiateurs sécrétées par les monocytes, macrophages et granulocytes intestinaux sont majoritairement responsables des dommages au tissu. Ces lésions induisent un recrutement constant de médiateurs de l'inflammation, eux-mêmes produisant de nouveaux dommages au tissu. Une boucle d'activation se met alors en place, pouvant mener à la fibrose (Rieder et coll. , 2007). Les espèces réactives interviennent en grande partie dans l'induction de ces dommages. Outre ceux directement formés suite à l'irradiation, les leucocytes infiltrant la muqueuse produisent de grandes quantités d'espèces réactives de l'oxygène (Kruidenier et Verspaget, 2002). L'intestin sain ne contient que peu d'enzymes antioxydantes (Kruidenier et coll. , 2003) et ne dispose donc pas d'un système de neutralisation permettant de prendre en charge les ROS néoformés. Ainsi, une augmentation de l'expression de la NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) oxydase a été observée au niveau des macrophages intestinaux en contexte inflammatoire (Chanock et coll. , 1994). Les cellules immunitaires répondent également par la production d'enzymes modifiant et /ou dégradant la MEC (Vaday et Lider, 2000). La modification de la matrice permet l'infiltration de cellules supplémentaires, immunitaires et de remplacement, au sein de la zone enflammée. Deux groupes majoritaires de protéinases sont sécrétées à cette étape : les protéases à sérine, telles que les élastases et collagènases, et les MMP. Les élastases sont stockées sous leur forme active dans les neutrophiles, monocytes et macrophages, contrairement aux MMP qui sont en général sécrétées sous forme inactive (zymogènes) (Vaday et Lider, 2000). Les leucocytes expriment 9 des quelques 23 MMP présentes chez l'Homme. Ces enzymes sont toutes responsables de la dégradation de la MEC. Leur activité est régulée par les TIMP. La balance entre les MMP et les TIMP est l'un des éléments déterminant l'étendue des dommages à l'intestin. Les cathépsines interviennent également dans les processus de remodelage matriciel en cas d'inflammation (Bosi et coll. , 1993). Dans la muqueuse intestinale activée, la cathépsine D est surexprimée (Hausmann et coll. , 2004). L'inhibition des cathépsines B, D et L dans un modèle de colite induite par sulfate de dextran induit une amélioration significative des dommages à la muqueuse (Menzel et coll. , 2006). 69 En conditions physiologiques, le processus d'inflammation s'arrête et le tissu entreprend une phase régénérative. Les cellules épithéliales restantes à la marge de la lésion se déplacent le long de la membrane basale jusqu'à rencontrer d'autres cellules et forme de nouvelle jonctions serrées lors d'un processus appelé restitution (Silen et Ito, 1985, Komuro, 1990). Ce phénomène fait intervenir de nombreux facteurs de croissance tels que HGF, EGF et FGF-2 (Dignass, 2001). Dans le cas o les dommages touchent également les tissus sub-épithéliaux, la contraction de la lamina propria permet de diminuer la surface à régénérer. En effet, la fermeture rapide de la lésion est nécessaire afin de limiter la durée pendant laquelle la fonction de barrière de l'intestin n'est plus assurée. Le passage des bactéries de la lumière intestinale vers la muqueuse peut induire des effets délétères sévères (Cho, 2003). Il semble que les myofibroblastes intestinaux participent à la réponse aux infections en exprimant des molécules de reconnaissance aux motifs bactériens : TLR (Toll-Like Receptors), NOD1 (Nucleotide-binding Oligomerization Domain 1) et NOD2 (Otte et coll. , 2003). Il est donc possible que le passage de pathogènes dans la muqueuse intestinale induise le recrutement de myofibroblastes qui pourraient participer au développement de la fibrose. De plus, l'infection par des pathogènes induit une augmentation de l'inflammation et amplifie donc les phénomènes inflammatoires déjà en place. 70 C. Le potentiel de la thérapie cellulaire Les cellules souches participent au développement des organes et des tissus et au maintien de l'homéostasie tissulaire. L'homéostasie est la capacité d'un système à maintenir son fonctionnement malgré les contraintes. Au niveau tissulaire, ce concept désigne l'équilibre entre les processus de mort, de prolifération, de différenciation et de migration cellulaire. Le maintien de l'homéostasie est contrôlé par des mécanismes complexes au cours du développement et à l'âge adulte et permet la mise en place et la conservation de la fonction des tissus. Il est assuré notamment par les cellules souches, au niveau local et à distance. Les cellules souches servent en particulier de cellules de remplacement aux cellules mortes. En effet, la plupart des tissus sont en renouvellement constant. On distingue alors les tissus à renouvellement rapide, tels que l'épithélium intestinal, des tissus à renouvellement lent, tels que le foie. Différents types de cellules souches sont présents dans l'organisme adulte, avec des processus de renouvellement différents permettant de remplacer l'ensemble des cellules. Certaines de ces cellules souches suivent un modèle pyramidal, c'est-à-dire qu'elles peuvent donner un large éventail de cellules spécialisées. C'est le cas par exemple des cellules souches hématopoïétiques à l'origine de l'ensemble des cellules du sang et de la lymphe. Par opposition, la différenciation en ligne désigne les cellules souches unipotentes, ne pouvant donner qu'un seul type cellulaire spécifique. Les cellules souches des cryptes intestinales font partie de ce dernier groupe. L'équilibre entre ces différents évènements permet de conserver l'intégrité de l'organisme. La découverte des cellules souches et de leurs propriétés régénératives a donné lieu à de nombreuses études concernant la faisabilité de leur utilisation thérapeutique. A l'heure actuelle, le domaine de la thérapie cellulaire est ainsi largement étudié car il présente de nombreux avantages par rapport aux méthodes pharmacologiques conventionnelles. Les cellules souches sont définies par leur capacité d'auto-renouvellement et de différenciation. L'auto-renouvellement correspond à l'aptitude de ces cellules à se multiplier de façon répétée (théoriquement à l'infini) sans perte de leurs possibilités de différenciation. La capacité de différenciation désigne l'aptitude des cellules souches à se différencier en un ou plusieurs types cellulaire spécialisés et fonctionnels. La division d'une cellule souche produit donc des cellules filles pouvant suivre deux voies distinctes : la conservation de leur caractère souche ou la différenciation en un autre type cellulaire. La principale fonction des cellules souches est de maintenir une réserve de cellules destinées à remplacer ou réparer les tissus endommagés, quelle qu'en soit la cause. 71 Figure 19 : origine des cellules souches chez l'Homme I. Fonction des cellules souches 1. Types de cellules souches Il existe 5 principaux types de cellules souches : embryonnaires, fœtales (issues d'interruptions volontaires de grossesse), adultes, les cellules souches du sang de cordon et les cellules souches pluripotentes induites (iPSc : induced Pluripotent Stem cell). Les iPS, découvertes plus récemment, sont produites en laboratoire par reprogrammation de cellules différenciées adultes. Cette classification est basée sur l'origine de ces cellules dans l'organisme ainsi que sur leur potentiel de différenciation. La classification peut également se faire sur ce potentiel de différenciation. Les cellules souches sont alors réparties selon 4 groupes (Figure 19) : - Les cellules totipotentes : désigne l'ovocyte fécondé ainsi que les cellules filles (blastomère) produites lors des premières divisions cellulaires. Elles sont capables de se différencier en tous les types cellulaires de l'organisme - Les cellules pluripotentes : ce terme désigne principalement les cellules souches embryonnaires et les iPSc. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES : Embryonic Stem) se trouvent dans la masse cellulaire interne du blastocyste (5ème ou 6ème jour de l'embryogénèse chez l'Homme). Elles peuvent se différencier en cellules des feuillets embryonnaires (ectoderme, mésoderme et endoderme) 72 - Les cellules multipotentes : elles ont la capacité de se différencier en types cellulaires de la même famille. Par exemple, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) se différencient en leucocytes, érythrocytes, plaquettes Ces cellules sont présentes dans l'organisme à l'âge adulte - Les cellules unipotentes : elles ne peuvent donner qu'un seul type cellulaire, mais leur capacité dauto-renouvellement les différencie des cellules non souches (par exemple les cellules souches des cryptes qui se différencient uniquement en entérocytes) Les cellules souches totipotentes et pluripotentes disparaissent au court du développement, après prolifération et différenciation, permettant l'apparition de l'ensemble des types cellulaires de l'organisme adulte. Les cellules souches embryonnaires peuvent se différencier, sous des conditions spécifiques, en plus 200 types cellulaires différents. Les cellules souches fœtales sont des cellules primitives présentes dans les tissus fétaux. Des cellules souches de la crête neurale, des cellules souches hématopoïétiques fétales et des progéniteurs des cellules des lots de Langerhans ont été isolées à partir de fétus humains (Beattie et coll. , 1997). A l'inverse, les cellules souches dites adultes , sont présentes à partir du stade postnatal et durant toute l'existence de l'individu. Elles constituent une réserve de cellules souches nécessaire au renouvellement et à la réparation des tissus. Les cellules souches multipotentes et unipotentes font partie de cette catégorie. Les cellules souches mésenchymateuses et les cellules souches hématopoïétiques appartiennent à cette catégorie. Pour assurer leur auto-renouvellement, ces cellules peuvent suivre deux types de division : - Symétrique, c'est-à-dire aboutissant à la formation de deux cellules filles identiques possédant les mêmes propriétés que la cellule mère. - Asymétrique : qui donne lieu à la production d'une cellule souche et d'une cellule progénitrice ayant un potentiel de division réduit. Ces cellules progénitrices se différencient en cellules spécialisées matures. 2. Hématopoïèse, niche et quiescence des cellules souches L'hématopoïèse chez adulte est localisée dans les sites médullaires (Figure 20). Ils sont composés des cellules du réseau vasculaire, cellules endothéliales et cellules de la membrane abluminale, et des adipocytes. A ces deux composantes médullaires sont associés des cellules recouvrant les trabécules osseux, appelées cellules endostéales. L'activité des cellules du 73 microenvironnement, va conférer à ces cellules un rôle critique dans le développement de l'hématopoïèse. Plus précisément, l'hématopoïèse est localisée au niveau de la niche hématopoïétique au sein de laquelle les CSH sont associées à un microenvironnement. Il constitue le support physique de l'hématopoïèse et permet sa régulation locale responsable du maintien, de la prolifération et de la différenciation des CSH en progéniteurs clonogéniques puis en cellules matures. Il est composé de cellules stromales et sécrétant une matrice extracellulaire (MEC), agissant par contacts étroits avec les CSH au moyen de molécules d'adhérence (intégrines), de facteurs solubles (cytokines et chimiokines) et de leurs récepteurs. Le microenvironnement médullaire est constitué de l'ensemble des cellules médullaires non hématopoïétiques. Les CSH sont capables de se différencier dans un des trois types de cellule sanguine : leucocyte, globule rouge ou plaquette. Figure 20 : population cellulaire du système médullaire stromal (D'après Winslow T. et Kibiuk L. , 2001) Afin de maintenir un stock constant de cellules souches, permettant d'assurer l'homéostasie tissulaire tout au long de la vie, une partie des cellules souches doivent demeurer en phase de quiescence. La quiescence est un état de dormance correspondant à l'arrêt en phase G0 du cycle cellulaire et caractérisé par une faible activité métabolique. Cette état est favorisé par l'augmentation du taux intracellulaire de protéines inhibitrices du cycle cellulaire tels que les kinases cycline- dépendantes (p16, p21, p53) (Cheng et coll. , 2000). Seule une faible partie des cellules souches sont en prolifération et la régulation de leur capacité à proliférer ou à demeurer quiescentes est contrôlée 74 par leur niche. Ces mécanismes permettent d'assurer le maintien de la niche et de fournir des progéniteurs des cellules différenciées. II. La thérapie cellulaire La thérapie cellulaire consiste à l'utilisation de cellules vivantes, souches ou différenciées, pour prévenir, traiter ou atténuer une maladie. Elle repose sur différents mécanismes, soit de remplacement, soit d'effets paracrines ou endocrines. La thérapie cellulaire de remplacement est la reconstitution d'un tissu par l'incorporation fonctionnelle de cellules dérivées de cellules souches. Par opposition, l'effet bystander en thérapie cellulaire comprend les effets trophiques, immunomodulateurs et régénératifs produits par les cellules exogènes introduites dans l'organisme. Différents paramètres entrent en ligne de compte lors de l'élaboration d'un protocole de thérapie cellulaire : - Le type de cellules transplantées : notamment cellules souches ou cellules différenciées. Ce choix dépend de l'organe et de la pathologie à traiter, ainsi que de la disponibilité des donneurs et de la facilité d'obtention de ces cellules d'un point de vue technique. - Le donneur : la greffe peut être autologue lorsque les cellules sont isolées à partir de prélèvements réalisés sur le patient ou allogénique lorsque le donneur est un autre individu que le patient. Ce choix repose essentiellement sur le risque de rejet de greffe inhérent à l'introduction de cellules d'un autre individu dans l'organisme. Dans le cas d'une greffe allogénique, le choix d'un donneur intrafamilial limite le risque de rejet. - Le nombre de cellules, le nombre d'injections, les co-traitements : différents paramètres devant être optimisés afin d'améliorer l'efficacité du traitement. - La voie et le mode de délivrance : en intraveineuse ou injection locale, dans un biomatériau ou autre type de matrice 2D ou 3D. 1. Le choix des cellules souches en thérapie cellulaire (ES, IPs, CSH, CSM) De nombreux types cellulaires ont été utilisés ou suggérés pour une application en thérapie cellulaire. On peut distinguer deux familles de cellules en thérapie cellulaire : les cellules différenciées, spécialisées et spécifiques à un organe, et les cellules souches, non-différenciées. Des questions d'efficacité, d'innocuité et éthiques se posent quant à l'utilisation de ces différents types cellulaires. 75 a. Les cellules différenciées L'un des objectifs initiaux de la thérapie cellulaire était de remplacer les cellules mortes ou non fonctionnelles dans les tissus lésés afin de corriger la dysfonction du tissu. La transplantation de cellules spécialisées correspondant à l'organe visé a donc été largement étudiée. On peut citer différents exemples : - Le traitement du diabète de type I par transplantation d'lots de Langerhans isolés de pancréas humains. Cette méthode permet en théorie de supprimer les injections d'insuline chez les patients traités. Les lots transplantés produisent l'insuline nécessaire au rétablissement du métabolisme du glucose. Entre 2007 et 2010, les données recueillies chez 677 patients traités par transplantation d'lots ont montré que 44% d'entre eux ne prenaient plus d'insuline 3 ans après traitement (Barton et coll. , 2012). - La transplantation de cardiomyocytes améliore la fonction cardiaque après un infarctus du myocarde. En particulier, l'injection de cardiomyocytes a pour objectif la récupération de l'activité contractile du myocarde. Dans différents modèles de dommages au myocarde, il a été démontré que les cardiomyocytes se localisent dans le myocarde, forment un syncytium fonctionnel et améliore la fonction cardiaque proportionnellement à la survie des cellules transplantées (Li et coll. , 1996). D'autres exemples d'utilisation thérapeutique de cellules différenciées existent, pour le foie par exemple. Néanmoins, cette technique présente divers inconvénients. Premièrement, la disponibilité des cellules dont l'isolation est réalisée à partir d'explants de tissus, difficilement obtenus. De plus, la difficulté d'amplifier les cellules in vitro sans dérive génétique implique l'obtention d'un grand nombre de cellules directement isolées d'organes donneurs. Enfin, il est souvent impossible de recourir à des greffes autologues en raison de l'état pathologique des cellules du patient. La greffe nécessite donc un traitement immunosuppresseur afin de limiter les rejets. Pour contourner ces obstacles, plusieurs solutions ont été proposées, telles que la greffe xénogénique (porc vers humain pour le cœur) ou la différenciation de cellules pluripotentes (cellules souches embryonnaire, iPSc). b. Les cellules souches embryonnaires Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont obtenues à partir du stade blastocyste de l'embryon. Elle présente une capacité d'auto-renouvellement théoriquement infinie in vitro et 76 peuvent se différencier en l'ensemble des cellules de l'organisme adulte. Pour répondre strictement à la définition des cellules ES, elles doivent également former des tératomes lorsqu'elles sont implantées in vivo. La pluripotence et la capacité de prolifération des cellules souches embryonnaires constituent un avantage certain dans les protocoles de thérapie cellulaire. Elles peuvent être amplifiées in vitro, contrairement aux cellules différenciées. Elles sont capables de se différencier en l'ensemble des cellules somatiques et germinales d'un organisme. Les cellules souches embryonnaires sont souvent prédifférenciées avant transplantation, en fonction de l'organe à traiter. Des essais cliniques utilisant ces cellules souches sont en cours : - Les lésions à la moelle épinière : en 2010, 5 patients ont été traités par injection de progéniteurs d'oligodendrocytes dérivés de cellules souches embryonnaires. Aucune amélioration significative des fonctions moteurs et sensorielles n'a été observée (Ilic et coll. , 2015). C'est le premier essai clinique réalisé sur la transplantation de cellules dérivées de cellules souches embryonnaires. - Dégénérescence maculaire de la rétine : plusieurs essais cliniques utilisant des cellules épithéliales pigmentaires de la rétine dérivées de cellules souches embryonnaires sont en cours (Schwartz et coll. , 2012, Schwartz et coll. , 2015, Song et coll. , 2015). Les résultats préliminaires de ces essais, avec un suivi médian de 22 mois, sont prometteurs, en termes d'amélioration de l'acuité visuelle. - Infarctus du myocarde : un essai portant sur la transplantation de patchs de fibrine contenant des progéniteurs de cellules cardiaques a débuté en 2014 en France sur un patient. Les résultats définitifs ne sont pas encore connus, mais les symptômes étaient améliorés 3 mois après transplantation, avec une augmentation de la fraction d'éjection du ventricule gauche de 26 à 36% et une augmentation de la contractibilité du myocarde (Menasche et coll. , 2015). D'autres essais sont en cours, pour le traitement du diabète de type I ou l'utilisation des cellules souches embryonnaires comme vecteurs de vaccins anti-cancéreux (Ilic et Ogilvie, 2016). Malgré les résultats obtenus et le potentiel de ce type de thérapie, l'utilisation des cellules souches embryonnaires pose de lourds problèmes éthiques, en plus des risques de rejet de greffe. L'isolation de ces cellules nécessite la destruction de l'embryon et pose donc des questions identiques à celles soulevées par l'IVG. Plusieurs pays, tels que les États-Unis d'Amérique, autorisent la recherche sur ce type de cellules, mais le cas général reste l'interdiction. Ainsi, certaines équipes ont tenté de développer des méthodes non destructrices de l'embryon. Une méthode consiste à récupérer un ou deux blastomères de la phase de segmentation de l'embryon, et de laisser l'embryon restant se développer au stade blastocyste (Klimanskaya et coll. , 2007). Enfin, le risque de carcinogénèse associé à la transplantation de cellules souches embryonnaires est un autre obstacle à leur utilisation. 77 c. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSc) L'apparition des iPSc émerge du désir de s'affranchir des problèmes éthiques liés à l'utilisation des cellules ES. L'obtention des iPSc est basée sur la reprogrammation de cellules différenciées par l'intégration de 4 facteurs de transcription : Oct3/4 (Octamer-binding transcription factor 3 et 4), Sox2 (Sex determining region Y)-box 2), Klf4 (Kruppel-like factor 4) et c-Myc (v-Myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog). Cette technique a été initialement développée sur des fibroblastes murins et humains par l'équipe du Professeur Yamanaka (Takahashi et Yamanaka, 2006, Takahashi et coll. , 2007, Yamanaka, 2007). Les iPSc présentent les caractéristiques biologiques inhérentes aux cellules ES : auto-renouvellement, capacité de différenciation en l'ensemble des cellules des feuillets embryonnaires et formation de tératomes in vivo. En plus de contourner les problèmes éthiques, l'utilisation des iPSc accroit la possibilité de greffes autologues car elles peuvent être produites à partir d'un simple explant de peau. Théoriquement, les iPSc peuvent être utilisées en remplacement de n'importe quel type cellulaire, qu'il s'agisse de cellules souches ou de cellules différenciées. L'utilisation des iPSc lors d'essais clinique est encore limitée, mais de nombreux résultats d'études précliniques émergent depuis leur découverte : - Anémie falciforme : dans un modèle murin, la transplantation de progéniteurs hématopoïétiques issus d'iPSc corrigés au niveau de l'allèle responsable de la pathologie induit l'amélioration des symptômes (Hanna et coll. , 2007). L'utilisation de fibroblastes autologues pour la génération des iPSc a permis de supprimer les risques de rejet de greffe dans cette étude. - Maladie de Parkinson : la transplantation de neurones dopaminergiques dérivés d'iPSc dans un modèle de maladie de parkinson chez le rat permet de diminuer significativement les défauts moteurs liés à la maladie (Rhee et coll. , 2011). De nombreux autres exemples sont disponibles pour l'infarctus du myocarde (Nelson et coll. , 2009), la cirrhose (Liu et coll. , 2011), les lésions à la moelle épinière (Nori et coll. , 2011) La première étude clinique utilisant des iPSc a commencé à recruter des patients au Japon en 2013. La première transplantation de cellules dérivées d'iPSc chez un patient humain a ainsi été réalisée en 2014. La patiente concernée, souffrant de dégénérescence maculaire liée à l'âge, a été traitée par injection de cellules épithéliales pigmentaires de la rétine après résection du tissu fibrotique 78 sous-rétinien. 6 mois plus tard, l'acuité visuelle de la patiente était stabilisée, sans effets secondaires apparents ( Les iPSc semblent donc une alternative viable à l'utilisation des cellules ES en thérapie cellulaire. Néanmoins, le risque de carcinogénèse reste présent, et le maintien du phénotype des iPSc en culture est parfois problématique. Ainsi, le traitement du deuxième patient de l'essai clinique mentionné ci-dessus a dû être interrompu en raison de mutation des cellules. d. Les cellules souches hématopoïétiques La transplantation de CSH permet de restaurer les systèmes immunologique et hématologique après myéloablation. La greffe de CSH est un traitement du cancer et des maladies hématologiques. Utilisée depuis plus de 30 ans, elle est l'application principale de la thérapie cellulaire. L'utilisation de greffons cellulaires, enrichis en CSH et appauvris en cellules matures, permet de réduire l'impact de la maladie du greffon contre l'hôte (GVH), par suppression des lymphocytes T alloréactifs, et de réduire le risque de contamination du greffon par des cellules tumorales (Brugger et coll. , 1994). L'utilisation de CSH du sang périphérique (CSHP) permet une reprise hématologique plus rapide, réduisant les risques de thrombopénie et les risques d'infection liée à la neutropénie (Champlin et coll. , 2000). Cette sécurité plus grande de la greffe de CSH permet leur utilisation pour le traitement des maladies auto- immunes. III. Les cellules souches mésenchymateuses Les cellules souches mésenchymateuses, également appelées cellules stromales mésenchymateuses, sont des cellules adhérentes et non-hématopoïétiques présentes dans une niche périvasculaire dans le stroma de la moelle osseuse. Elles possèdent les capacités d'auto- renouvellement et de différenciation nécessaires à l'utilisation du terme cellules souches . Friedenstein et coll. furent les premiers, en 1966, à décrire une population de cellules souches présentes dans la fraction stromale de la moelle osseuse, capables de forme des os hétérotopiques et un microenvironnement médullaire après transplantation chez la souris (Friedenstein et coll. , 1966). La même équipe a décrit par la suite les cellules souches ostéogéniques de la moelle osseuse comme des cellules formant des colonies fibroblastiques et servant de précurseurs communs à l'os et au cartilage (Friedenstein et coll. , 1987). Caplan et coll. baptisèrent ces cellules cellules souches mésenchymateuses , responsables de la formation de l'os et du cartilage ainsi que de la réparation et 79 du renouvellement tissulaire durant le développement embryonnaire et à l'âge adulte (Caplan, 1991). Le caractère souche et l'emploi du terme mésenchymateux ont été largement débattus, notamment au vu des différents phénotypes et origines des cellules désignées comme CSM (Horwitz et coll. , 2005, Bianco et coll. , 2013). 1. Origines et différences phénotypiques des CSM Afin de dissiper les confusions dans la désignation des cellules considérées comme CSM, la société internationale pour la thérapie cellulaire (ISCT : International Society for Cellular Therapy) a défini les critères minimaux d'appartenance à cette famille : - Les CSM adhèrent sur une plaque de culture en plastique non traité, sous des conditions normales de culture - Elles expriment simultanément CD105, CD73 et CD90 mais pas CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79alpha, CD19 et HLA-DR (Human Leukocyte Antigen antigen D Related) - Sous des conditions définies, les CSM peuvent se différentier en ostéoblastes, adipocytes ou chondrocytes in vitro Ainsi, on différenciera les cellules souches mésenchymateuses, présentant la totalité de ces caractéristiques, des cellules stromales mésenchymateuses, qui ne satisfont pas à l'ensemble de ces critères. Il existe de nombreuses sources de cellules CSM-like . Les cellules répondant à l'ensemble des critères des CSM sont isolées à partir de la moelle osseuse et des tissus extra-embryonnaires tels que le placenta (Yang et coll. , 2013), la membrane amniotique (Soncini et coll. , 2007) ou le cordon ombilical (Xu et coll. , 2009). En revanche, des cellules similaires ont été retrouvées dans pratiquement la totalité des tissus : tissu adipeux (Zuk et coll. , 2001), pulpe dentaire (Pierdomenico et coll. , 2005), muscle (Kuroda et coll. , 2006), membrane synoviale (De Bari et coll. , 2001), tendon (Salingcarnboriboon et coll. , 2003), ligament parodontal (Seo et coll. , 2004), périoste (Nakahara et coll. , 1991, Nakahara et coll. , 1991), cerveau (da Silva Meirelles et coll. , 2006), sang (Zvaifler et coll. , 2000), poumon (Sabatini et coll. , 2005) et peau (Toma et coll. , 2001, Zaher et coll. , 2014). Une autre source de CSM a été identifiée récemment. En 2008, Crisan et coll. ont observé que les péricytes présentent les mêmes marqueurs de surface que les CSM (Crisan et coll. , 2008). Les péricytes, également appelées cellules de Rouget, encerclent les cellules endothéliales dans les capillaires et microvaisseaux. Crisan et coll. ont isolé ces cellules de nombreux tissus : pancréas, cœur, 80 peau, poumon, cerveau, yeux Chacune des populations produites à partir de ces explants présentaient les marqueurs de surface des CSM et étaient capables de se différencier en adipocytes, ostéoblastes et chondrocytes in vitro (Crisan et coll. , 2008). Ces découvertes ont amené la communauté scientifique à évoquer une possible origine péricytaire de toutes les CSM de l'organisme, ce qui expliquerait leur présence dans de nombreux organes (Caplan, 2008). Néanmoins, Blocki et collègues ont démontré que les CSM de la moelle osseuse n'exprimant pas CD146, un marqueur positif chez les pérycites, ne se différentiaient pas en pérycites et ne possédaient pas les mêmes propriétés pro-angiogéniques. Ils suggèrent donc que les péricytes soient une sous-population de CSM spécialisées dans les processus vasculaires (Blocki et coll. , 2013). Figure 21 : hypothèse du mesengenic process : différenciation des CSM en cellules du mésoderme in vivo et in vitro (D'après Singer et Caplan, 2011) (Singer et Caplan, 2011) 2. Différenciation des CSM Les cellules souches de l'organisme, quelles que soit leur capacités de différenciation, constituent un ensemble nécessaire à la production de progéniteurs et de cellules spécialisées permettant le maintien de l'homéostasie tissulaire. Les cellules souches sont programmées pour se différencier en types cellulaires définis sous l'influence de stimuli spécifiques. Les premières études 81 réalisées sur les CSM ont montré leur capacité à se différencier en lignées des tissus mésenchymateux : os, cartilage, graisse, tendon, muscle et stroma de la moelle (Pittenger et coll. , 1999). Plusieurs études ont depuis démontré la capacité des CSM à la transdifférenciation. Elles peuvent ainsi se différencier en cellules de l'endoderme et de l'ectoderme, contrairement au dogme du mesengenic process les limitant à la différenciation en cellules du mésoderme (Figure 21) (Caplan, 1994). Ces types cellulaires comprennent les hépatocytes, les neurones et les cellules épithéliales. (Kopen et coll. , 1999, Petersen et coll. , 1999, Hung et coll. , 2002, Jiang et coll. , 2002, Kadivar et coll. , 2006). 3. Fonction des CSM Les CSM ont deux rôles principaux à l'âge adulte : - - Le soutien de l'hématopoïèse La réparation des tissus lésés a. Soutien de l'hématopoïèse L'implication des CSM dans le soutien de l'hématopoïèse a été mise en évidence dans des modèles in vitro de culture de cellules hématopoïétique, dans lesquels la présence de cellules stromales est nécessaire au maintien de la culture à long terme (Dexter et coll. , 1977, Sutherland et coll. , 1991). Les cellules stromales sécrètent des cytokines et facteurs de croissance nécessaires à la survie, la prolifération et la différenciation des cellules hématopoïétiques (Bennaceur-Griscelli et coll. , 2001, Majumdar et coll. , 2003). Mourcin et coll. ont démontré un effet anti-apoptotique et pro- prolifératif des CSM sur les cellules hématopoïétiques primitives (Mourcin et coll. , 2005). En outre, il a été démontré que les CSM sécrètent un grand nombre de facteurs impliqués dans la différenciation et la prolifération des CSH, ainsi que dans le maintien de la niche hématopoïétique : G-CSF (Granulocyte- Colony Stimulating Factor), M-CSF (Macrophage-Colony Stimulating Factor), GM-CSF, LIF (Leukemia Inhibitory Factor), IL-1, IL-6, IL-11, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, Flt-3 ligand (FLT3 : Fms-Like Tyrosine kinase 3), thrombopoïétine, TGF-, osteoprogénine, RANKL (Receptor Activator of NF-B Ligand, SDF-1 (Stromal-Derived Factor-1), TNF- et VEGF (Haynesworth et coll. , 1996, Majumdar et coll. , 2000, Di Nicola et coll. , 2002, Taichman, 2005). Ces résultats, bien qu'issus pour la plupart d'études in vitro, suggère la capacité des CSM à produire ces molécules sous des conditions physiologiques spécifiques. 82 Les CSM promeuvent également la prise de greffe des CSH et la régénération de la niche hématopoïétique. La co-transplantation de CSH et de CSM humaines résulte en une augmentation du chimérisme et/ou de la reprise hématopoïétique dans des modèles animaux et en clinique (Koc et coll. , 2000, Bensidhoum et coll. , 2004). Cette notion est supportée par la prise de greffes de CSM humaines dans le stroma de la moelle osseuse de souris NOD/SCID (Muguruma et coll. , 2006). Dans cette même étude, la présence de CSM humaines dans la moelle osseuse améliorait la prise de greffes et la fonction des cellules hématopoïétiques primitives humaines. Les CSM transplantées dans ce modèle interagissent avec les CSH par l'expression de N-cadhérine et SDF-1. Ces données ont également été confirmées cliniquement. Chez des patientes traitées par administration de CSH autologues, la co- transplantation de CSM améliore significativement la vitesse de reprise de l'hématopoïèse (Koc et coll. , 2000). b. Régénération Les CSM produisent des signaux favorisant la régénération tissulaire. Des études chez l'animal et l'Homme ont montré une augmentation de la quantité de CSM circulantes suite à une lésion. Chez des rats soumis à une hypoxie chronique, le nombre de CSM circulantes augmente de 15 fois (Rochefort et coll. , 2006). Chez des patients souffrant de brûlures aiges, le nombre de CSM circulantes est augmenté de plus de 40 fois par rapport à des donneurs sains. Le pourcentage de CSM circulantes a été corrélé à la sévérité de la brûlure dans cette étude (Mansilla et coll. , 2006). La capacité des CSM à migrer au site de la lésion est également indicatrice de leur fonction régénérative. Sur un modèle d'irradiation localisée chez la souris, les CSM transplantées sont retrouvées en quantités plus élevées au niveau des organes atteints, que ce soit lors d'une irradiation abdominale (intestin, foie et rate) ou de la patte (peau et quadriceps) (Francois et coll. , 2006). Cette propriété a été confirmée par de nombreuses études et est l'une des raisons de l'utilisation accrue des CSM en thérapeutique. La fonction de régénération des CSM endogènes est également suggérée par leur capacité à sécréter un large panel de facteurs solubles produisant des effets : - anti-apoptotique : permet de limiter les dommages aux cellules indirectement lésées, limite également la production de signaux pro-inflammatoires et permet de réduire l'ischémie due à la mort des cellules endothéliales : VEGF, HGF, IGF-1, Stanniocalcine-1, TGF-, FGF-2, GM-CSF (Rehman et coll. , 2004, Togel et coll. , 2007, Block et coll. , 2009). - immunomodulatoire : l'inflammation est nécessaire à la réparation tissulaire. Les cellules du système immunitaire détruisent les pathogènes, éliminent les cellules mortes et débris 83 cellulaires et produisent de nombreuses cytokines, notamment chimioattractantes, permettant le recrutement des cellules. En revanche, une inflammation chronique produit des effets délétères, notamment par le remodelage constant du tissu, menant éventuellement à la fibrose. Les CSM produisent des cytokines pro et anti-inflammatoires stimulant ou inhibant le processus inflammatoire en fonction de l'état de la lésion : PGE-2 (ProstaGlandine E-2), TGF- , HGF, mpCCL2 (mp : MMP-processed), IDO (Indoleamine-pyrrole 2, 3-DiOxygenase), iNOS, HLA-G5, LIF, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15 (Di Nicola et coll. , 2002, Meisel et coll. , 2004, Kim et coll. , 2005, Sotiropoulou et coll. , 2006, Nasef et coll. , 2007, Nasef et coll. , 2007, Sato et coll. , 2007, Di Ianni et coll. , 2008, Nasef et coll. , 2008, Rafei et coll. , 2008, Rizzo et coll. , 2008). - anti-fibrosant : la fibrose résulte d'un état inflammatoire prolongé et correspond à une accumulation de matrice extracellulaire. Les CSM sécrètent des cytokines et facteurs de croissance agissant sur la production de matrice extracellulaire : FGF-2, HGF, TSG-6 (Suga et coll. , 2009, Choi et coll. , 2011). - de stimulation de la prolifération et différenciation des progéniteurs et cellules souches : SCF (Stem Cell Factor), LIF, IL-6, M-CSF, SDF-1, angiopoïétine-1 (Haynesworth et coll. , 1996, Majumdar et coll. , 1998, Ohab et coll. , 2006, Sugiyama et coll. , 2006). - pro-angiogénique : la formation de nouveaux vaisseaux est nécessaire à l'apport des nutriments et des progéniteurs nécessaires au remplacement des cellules mortes : FGF-2, VEGF, PIGF (PhosphatidylInositol-Glycan biosynthesis class F protein), MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1 CCL2), IL-6 (Kinnaird et coll. , 2004, Hung et coll. , 2007, Sorrell et coll. , 2009). - trophiques : permettant le recrutement des cellules immunitaires et des cellules saines destinées au remplacement du tissu lésé : MCP-1, MIP-1 (Macrophage Inflammatory Protein- 1 CCL3), MIP-1 (CCL4), RANTES (Regulated on Activation, Normal T cell Expressed and Secreted CCL5), MCP-3 (CCL7), MIP-3 (CCL20), éotaxine-3, factalkine, CXCL5, CXCL11, CXCL1, IL-8, CXCL10, SDF-1 (Ji et coll. , 2004, Sordi et coll. , 2005, Honczarenko et coll. , 2006, Croitoru-Lamoury et coll. , 2007, Ponte et coll. , 2007). La production de ces facteurs par les CSM, permet de favoriser la résolution rapide et non- pathologique des lésions tissulaires. Ces résultats proviennent pour la plupart d'expérimentations in vitro et de modèles de transplantation de CSM exogènes, chez l'animal. Concernant les CSM endogènes, elles produiraient des signaux analogues dans des conditions de stimulation spécifique, par exemple par des cytokines telles que l'IFN- (Krampera et coll. , 2006). 84 c. Immunomodulation L'impact des CSM sur le système immunitaire a été mis en évidence peu après leur découverte et a suscité un grand intérêt, en premier lieu pour limiter le rejet de greffes et l'apparition de pathologies auto-immunes telles que la maladie du greffon contre l'hôte. L'effet pléiotropique des CSM sur les cellules immunitaires permet une action orchestrée induisant un effet significatif. L'effet inhibiteur des CSM sur les lymphocytes T semble passer à la fois par des interactions intercellulaires et par un effet paracrine. Les CSM inhibent l'activation, la prolifération et les fonctions effectrices des lymphocytes T, les rendant tolérogènes. Les monocytes CD14 sécrètent des facteurs solubles, notamment l'IL-1, qui activent les CSM qui produisent en réponse des molécules inhibant la prolifération et l'activation des lymphocytes T alloréactifs. Dans un modèle de co-culture de CSM et de lymphocytes T, Groh et coll. ont montré que les CSM activées par les cellules mononuclées du sang produisaient les mêmes effets d'inhibition que le milieu de culture conditionné de ces mêmes cellules activées (Groh et coll. , 2005). L'action inhibitrice des CSM disparait dans ce modèle lorsque les CSM ne sont pas activées préalablement. D'autres études ont suggéré que l'expression de HGF, TGF- et PGE-2 par les CSM induisent un effet similaire (Di Nicola et coll. , 2002, Aggarwal et Pittenger, 2005). LIF et HLA-g semblent également participer à l'effet immunosuppresseur des CSM (Nasef et coll. , 2007, Nasef et coll. , 2008). Une autre hypothèse repose sur la déplétion du tryptophane, dégradé via l'action de IDO, sécrété par les CSM (Meisel et coll. , 2004). Cette théorie est néanmoins contrebalancée par le fait que la déplétion en tryptophane devrait résulter en l'apoptose des lymphocytes T, ce qui n'est pas le cas dans ce modèle (Tse et coll. , 2003). Les CSM exercent le même effet inhibiteur sur les cellules T activées par des mitogènes ou des alloantigènes. La prolifération des lymphocytes du sang périphérique activés par le Phorbol Myristate Acetate (PMA) est inhibée par l'ajout de CSM (Rasmusson et coll. , 2005). Lorsque les lymphocytes sont activés par la phytohémagglutinine (PHA), les CSM induisent une diminution de la production d'IL- 2 et de son récepteur. Dans cette même étude, l'ajout d'IL-2 recombinant aux lymphocytes améliore leur prolifération et cet effet est supprimé par les CSM. Le blocage de PGE-2 dans les co-cultures de lymphocytes activés par PHA et de CSM inhibe partiellement l'effet antiprolifératif. La suppression par les CSM de l'activation des cellules T par les mitogènes a été démontrée dans d'autres modèles (Di Nicola et coll. , 2002, Le Blanc et coll. , 2003) et constitue un autre mécanisme d'action anti- inflammatoire des CSM. Les CSM diminuent l'expression de TNF- par les cellules dendritiques de type 1 matures, augmentent la sécrétion de IL-10 par les cellules dendritiques de type 2 matures, diminuent la 85 sécrétion d'IFN- par les cellules Th1 et augmentent la sécrétion de IL-4 par les cellules Th2. Dans la même étude, il a été montré que les CSM augmentent la proportion de cellules T régulatrices (Treg) et diminuent la sécrétion d'IFN- par les cellules NK (Aggarwal et Pittenger, 2005). Cet effet est associé à la production de PGE-2 par les CSM, les inhibiteurs de son expression limitant l'action des CSM. Ces résultats suggèrent que les CSM présentent en environnement inflammatoire pourraient induire un changement d'un milieu pro-inflammatoire vers un milieu anti-inflammatoire ou tolérant. Les CSM bloquent la maturation et l'activation des cellules présentatrices de l'antigène (CPA), nécessaires à l'activation et à la prolifération des lymphocytes T. Beyth et coll. proposent que, par contact cellule-cellule, les CSM convertissent les CPA en cellules inhibitrices des lymphocytes T, en les bloquant dans un état semi-mature ou de maturation aberrante . Cet état des CPA est associé à une diminution de l'expression de cytokines pro-inflammatoires (IL-12, TNF-, Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe II) et une augmentation de l'expression de la cytokine anti- inflammatoire IL-10 (Beyth et coll. , 2005). Les CPA ainsi obtenues sont appelées régulatrices , anti- inflammatoires. Chez la souris, les cellules dendritiques régulatrices protègent de la GVHD aige et limitent la résurgence de la leucémie (Sato et coll. , 2003). Ces résultats sont appuyés par les travaux de Zhang et coll. , suggérant un effet direct des CSM sur la différenciation, la maturation et la fonction des cellules dendritiques (Zhang et coll. , 2004). Dans ce modèle, les CSM, mais pas le milieu conditionné inhibent la différenciation des monocytes en cellules dendritiques. En revanche, les CSM et leur milieu conditionné inhibent la maturation, l'endocytose, la production d'IL-2 et la stimulation de la prolifération des lymphocytes T par les cellules dendritiques. Ces résultats impliquent la nécessité de contacts intercellulaires pour exercer l'effet complet des CSM sur les lymphocytes T (Zhang et coll. , 2004, Nasef et coll. , 2007). Les CSM agissent également sur les lymphocytes T au niveau du cycle cellulaire, en particulier sur la phase G1 et la transition G0/G1 induisant l'anergie des lymphocytes T. Glennie et coll. ont observé qu'en présence de CSM, les lymphocytes T sous-expriment la cycline D2 et sur-expriment p27kip1, indiquant l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1/G1 (Glennie et coll. , 2005). A l'inverse, Krampera et coll. suggèrent la nécessité de contacts entre les CSM et les lymphocytes T pour permettre l'effet inhibiteur des CSM. Dans cette étude, l'ajout de milieu de culture conditionné par les CSM sur une culture de lymphocytes T n'a pas produit l'effet inhibiteur observé lorsque les deux types cellulaires sont au contact (Krampera et coll. , 2003). Les CSM sont aussi capables de moduler la différenciation des lymphocytes T CD4 . Dans les modèles d'arthrite, le TNF- inhibe les fonctions des Treg CD4 CD25 (Valencia et coll. , 2006). Étant 86 donné que les CSM induisent une diminution de l'expression de TNF-, elles pourraient par ce mécanisme augmenter le nombre de Treg et leur fonction (Gonzalez et coll. , 2009). En co-culture avec des CSM, les lymphocytes adoptent une polarisation Th2 en majorité. Batten et coll. ont en effet observé dans ce modèle une diminution des cytokines associées aux cellules Th1 (IL-1, IFN- et TNF-) et une augmentation des cytokines de la réponse Th2 (IL-3, IL-5, IL-10 et IL-13) (Batten et coll. , 2006). Dans un modèle de sclérose multiple, l'augmentation de la proportion en Th2 est corrélée à une diminution des cellules Th1 et Th17. L'augmentation du pourcentage de lymphocytes Th2 est liée à une diminution des dommages tissulaires dans ce cas (Bai et coll. , 2009). Cette modification de la balance Th1/Th2 est également impliquée dans l'amélioration de l'hypersensibilité de contact par les CSM, via la sécrétion de PGE-2 (Li et coll. , 2016). Dans un modèle d'encéphalomyélite auto-immune, les CSM inhibent la réponse Th17. Cet effet paracrine est associé, de façon non-exclusive, à la sécrétion de CCL2 par les CSM, puisque le milieu conditionné des CSM CCL2-/- reproduit en partie l'inhibition des cellules T (Rafei et coll. , 2009). Larocca et coll. ont montré une action similaire dans un modèle d'allogreffe de peau (Larocca et coll. , 2013). In vitro, les CSM inhibent la polarisation Th1 et Th17 des cellules T, comme indiqué par la diminution de l'expression de l'IFN- et l'IL-17 (Larocca et coll. , 2013). Au cours de cette étude, l'augmentation de l'expression d'IL-10, induite par les CSM, indique une augmentation de la proportion de Treg. Les lymphocytes B sont responsables de la production des immunoglobulines. Les CSM ont différents effets sur les cellules B, pouvant augmenter ou diminuer la production d'anticorps en fonction du contexte. Krampera et coll. ont montré que l'inhibition de la prolifération des lymphocytes B par les CSM dépend de la stimulation des CSM par IFN-, produit par les lymphocytes T et cellules NK mais pas par les cellules B (Krampera et coll. , 2006). Corcione et coll. ont montré à l'inverse un effet indépendant de IFN-, mais dépendant de la quantité de CSM (Corcione et coll. , 2006). Dans ce modèle, les CSM inhibent la prolifération des cellules B, leur différenciation en cellules productrices d'anticorps et leur chimiotactisme. Cet effet diminue proportionnellement au ratio CSM/cellules B. L'arrêt de la prolifération des lymphocytes B est associé, comme pour les cellules T, à un arrêt en phase G0/G1 du cycle cellulaire. L'inhibition de la prolifération n'est pas observée lorsque les CSM sont remplacées par un milieu de culture conditionné, suggérant la nécessité des communications entre CSM et cellules B. Enfin, l'expression par les lymphocytes B des chimiokines CXCR4, CXCR5 et CCR7 est réduite en présence de CSM et le chimiotactisme des cellules B en réponse à CXCL12 et CXCL13 est diminué (Corcione et coll. , 2006). Ces résultats impliquent une diminution du recrutement des lymphocytes B sous l'influence des CSM. 87 L'activation des cellules B est majoritairement due à l'interaction avec les cellules T CD4 . Dans une culture mixte de lymphocytes, l'absence de cellules T supprime la production d'anticorps (Kunori et Ringden, 1980). L'inhibition des lymphocytes T par les CSM a par conséquent un effet indirect sur l'activation des cellules B. Les CSM induisent la sécrétion d'IgG par les lymphocytes B dans des modèles de co-culture de cellules mononucléées du sang et de la rate (Rasmusson et coll. , 2007). Cet effet dépend de facteurs solubles, comme démontré par co-culture en transwells. En revanche, la stimulation des cellules B par les CSM dépend de contacts intercellulaires. Ceci tend à montrer que la présence d'autres cellules mononucléées du sang (cellules T, NK) est nécessaire pour l'activation sans contact des lymphocytes B. L'action des CSM est associée à une augmentation de la production d'IL-6, requis pour la différenciation et la production d'immunoglobulines par les cellules B (Muraguchi et coll. , 1988). Cette voie est dépendante d'IL-2 (Splawski et coll. , 1990), dont la production est également inhibée par les CSM. i. Macrophages L'effet immunomodulateur des CSM sur la polarisation et la fonction des macrophages a été mis en évidence au cours de diverses études. En 2009, Kim et Hematti furent les premiers à décrire le changement de polarisation des macrophages, en faveur des M2, en co-culture avec les CSM (Kim et Hematti, 2009). Une étude de Nemeth et coll. sur un modèle de septicémie chez la souris a montré une amélioration de la survie après transplantation de CSM. Cet effet était supprimé après la déplétion des macrophages ou prétraitement des souris par un anticorps anti-IL-10 ou dirigé contre le récepteur de l'IL-10. Les auteurs suggèrent que PGE2, sécrété par les CSM, active les macrophages, qui produisent en réponse de l'IL-10, cytokine anti-inflammatoire, participant à la résolution de la pathologie (Nemeth et coll. , 2009). Dans un modèle de co-culture de CSM activées par l'IFN- et de cellules mononucléées du sang périphérique, les CSM induisent la différenciation des monocytes en macrophages M2 via l'action de l'IDO (Francois et coll. , 2012). L'IL-10 produit en réponse par les macrophages M2 participe à la suppression de la prolifération des lymphocytes T. Enfin, les travaux de Melief et coll. sur la co- culture de CSM et de cellules mononucléées du sang ont montré l'importance de l'effet des CSM sur la polarisation des macrophages pour l'augmentation de la proportion de lymphocytes T régulateurs (Melief et coll. , 2013). Dans ce modèle, lorsque la culture était déplétée en monocytes, la formation de Treg était abrogée. Cette étude a également montré un effet d'augmentation de la survie des monocytes par les CSM. Enfin, la formation de Treg semble dépendante de l'expression de CCL18 par les macrophages M2 (Melief et coll. , 2013). 88 ii. Cellules NK Les cellules NK sont une composante importante de l'immunité innée. Elles possèdent une activité cytolytique vis-à-vis des cellules n'exprimant pas le CMH de classe I et sont donc capables de lyser les cellules tumorales, infectées ou présentant d'autres anomalies de manière indépendante de l'antigène. Enfin, leur activité de sécrétion de cytokines contribue à la mise en place de la réponse des lymphocytes B et T. Les CSM produisent différents effets inhibiteurs sur les cellules NK, notamment vis-à-vis de leur prolifération, activité cytotoxique et de la production de cytokines. La co-culture de CSM et de cellules NK induit l'inhibition de la prolifération des NK induite par IL-2 et IL-15. Cet effet est moindre sur des cellules NK activées que sur des cellules quiescentes (Spaggiari et coll. , 2006). Des études complémentaires ont permis de montrer que l'interaction CSM-cellules NK induit une diminution de l'expression des récepteurs d'activation des cellules NK (NKp30, NKp44 et NKG2D), suggérant une diminution de l'activité des NK. Cette hypothèse est confirmée par une réduction de l'activité cytolytique des NK envers plusieurs lignées cellulaires de leucémie, de neuroblastome et de cellules dendritiques immatures. Une inhibition de la production d'IFN- par les cellules NK est induite par les CSM. L'utilisation d'inhibiteurs de PGE2 et d'IDO a également mis en évidence l'importance de ces facteurs solubles sécrétés par les CSM. L'inhibition d'IDO, mais pas celle de PGE2, diminue la prolifération des cellules NK. En revanche, l'inhibition des deux facteurs restaure pratiquement intégralement la prolifération de NK (Spaggiari et coll. , 2008). A l'inverse, Cui et coll. ont montré une augmentation de la sécrétion d'IFN- par les NK sous l'influence des CSM. Cet effet est induit par CCL2 produit par les CSM. Ce mécanisme permet la mise en place d'une boucle d'activation, IFN- activant également la production de CCL2 par les CSM. Ces résultats suggèrent la possibilité d'une stimulation de l'activité des NK par les CSM sous certaines conditions (Cui et coll. , 2016). iii. Cellules dendritiques Les cellules dendritiques ont un rôle primordial dans la mise en place de l'immunité adaptative en tant que premières cellules présentatrices de l'antigène à initier la réponse des cellules T. Les CSM inhibent la différenciation des monocytes en cellules dendritiques matures. En présence de CSM, les monocytes stimulés par GM-CSF et IL-4 n'acquièrent pas les marqueurs des cellules dendritiques immatures (CD14-, CD1a ) ou matures (CD80 , CD86 , CD83 ). L'effet des CSM est par contre supprimé lors de la maturation des cellules dendritiques induite par LPS. L'absence de production d'IL-12 par les cellules dendritiques immatures en présence de CSM est un autre marqueur 89 de leur effet inhibiteur. De plus les cellules dendritiques inhibées par les CSM ont une capacité de stimulation de la prolifération des cellules T diminuée. La corrélation entre l'inhibition de la différenciation des monocytes et la concentration en PGE2 dans le milieu suggère une importance majeure de ce facteur soluble (Spaggiari et coll. , 2009). Jiang et coll. ont produit des données confirmant ces résultats, et suggérant la réversibilité de l'effet des CSM sur les cellules dendritiques (Jiang et coll. , 2005). Figure 22 : mécanismes impliqués dans l'immunomodulation par les cellules souches mésenchymateuses (D'après Singer et Caplan, 2011) (Singer et Caplan, 2011) L'effet immunomodulateur des CSM implique des mécanismes complexes de communication entre les différents acteurs de la réponse immunitaire (Figure 22). Les CSM, en agissant sur l'ensemble des cellules impliquées dans cette réponse, sont capables d'affecter de manière significative les processus d'inflammation et de limiter ainsi la chronicité de ces phénomènes. Elles peuvent inhiber la fonction des cellules B et T, des macrophages, des cellules NK et des cellules dendritiques. Ces effets semblent reposer sur la production de facteurs solubles par les CSM, tels qu'IDO et PGE2. En outre, elles orientent la réponse des cellules T et des macrophages en modifiant leur état de polarisation, 90 favorisant un état régulateur. Ces caractéristiques sont la principale cause de l'utilisation massive des CSM dans le contexte de maladies auto-immunes et inflammatoires, que ce soit lors d'études précliniques ou d'essais cliniques. d. Homing des CSM Une autre caractéristique majeure des CSM exogènes est leur capacité à migrer spécifiquement vers les tissus lésés. En 2003, Chapel et coll. ont démontré cette propriété des CSM sur un modèle murin. Après irradiation corps entier, les animaux ont reçu une co-transplantation de CSM et de CSH. Les CSM ont été retrouvées au sein des tissus lésés (muscle, peau, moelle osseuse et intestin) jusqu'à 83 jours après transplantation. Dans une autre étude, l'irradiation corps entier induisait le homing des CSM transplantées vers le cerveau, le cœur, la moelle osseuse et les muscles. Une irradiation supplémentaire au niveau abdominal augmentait la migration des cellules vers l'intestin, le foie et la rate. De même, l'irradiation de la patte arrière favorisait le homing des cellules dans la peau, le quadriceps et les muscles (Francois et coll. , 2006). Dans un modèle de lésion ischémique du cerveau, les CSM migrent également vers la zone lésée (Wang et coll. , 2008). Ce phénomène est attribué à l'activation de CXCR4, exprimé à la surface des CSM, par SDF-1. L'expression de différents facteurs est à l'origine de cette propriété : - récepteurs aux chimiokines : CCR1, CCR2, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5 et CXCR6 (Honczarenko et coll. , 2006, Ringe et coll. , 2007) - molécules d'adhésion : intégrines (1, 2, 3, 5, 6, v3, v5, 1, 3, 4) et molécules d'adhésion intercellulaires (ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1) (Conget et Minguell, 1999, Majumdar et coll. , 2003). Ces molécules permettent aux CSM de reconnaitre les signaux de recrutement, également propres aux cellules du système immunitaire, et de migrer selon leur provenance. Leur rôle a été largement décrit dans la migration des leucocytes et des CSH : - migration suite à un stimulus inflammatoire - migration et adhésion à la matrice extracellulaire et aux cellules endothéliales - extravasation des cellules de la lumière des vaisseaux vers le tissu Grâce à l'expression de ces molécules, les CSM peuvent migrer vers les tissus lésés par la circulation sanguine et passer la barrière des vaisseaux afin de se localiser dans le tissu. Cette propriété permet aux CSM de produire un effet spécifique à l'organe et limite donc les risques d'effets non désirés. 91 e. Sécrétion par les CSM Les CSM sécrètent de nombreuses protéines dans le milieu extracellulaire afin d'exercer leur fonction. Récemment, de nouveaux modes de sécrétion par les CSM ont été mis en évidence, permettant notamment de transférer du matériel génétique tel que des miRNA (Figure 23). i. Transfert d'ARN et d'autres molécules par Vésicule Extracellulaire (EV) Le terme général vésicule extracellulaire (EV) se réfère à des vésicules membranaires sécrétées par la plupart des types de cellules somatiques (revu dans (Thery et coll. , 2002, Lee et coll. , 2012, Raposo et Stoorvogel, 2013). L'ensemble EV inclus les exosomes, les vésicules de membrane plasmique de 30 à 100 nm, les microvésicules, les vésicules de 50 à 1000 nm et les corps apoptotiques, des vésicules de 1-5 m libérées durant bourgeonnement membranaires des cellules apoptotiques (Lai et coll. , 2016). Les exosomes sont libérés lors du trafic multi vésiculaires et fusionnent avec la membrane cytoplasmique. Les exosomes purifiés à partir des CSM ont suscité un intérêt important dans le domaine de la médecine régénérative en raison sur leur capacité à réduire l'apoptose/nécrose chez les rongeurs après une lésion ischémique du cœur (Lai et coll. , 2010, Arslan et coll. , 2013), cerveau (Xin et coll. , 2013, Xin et coll. , 2014), poumon (Lee et coll. , 2012), foie (Kanazawa et coll. , 2011), ou des reins (Gatti et coll. , 2011). La production d'exosomes par les CSM réduit l'inflammation et augmente la prolifération des cellules au cours de la réparation des tissus (Bruno et coll. , 2009, Lee et coll. , 2012, Zhang et coll. , 2014). Tomasoni et coll. (Tomasoni et coll. , 2013) ont montré que les CSM, via les exosomes, transfèrent les ARNm codant pour IGF1R et IGF1 aux cellules rénales tubulaires proximales endommagées par le cisplatine. Il en résulte une augmentation de l'expression du récepteur de l'IGF1, ce qui accroit son activité. Le transfert exosomal améliore la survie des cellules rénales et augmente leur prolifération au cours de la réparation après une blessure. Dans de multiples modèles pharmacologiques d'atteinte hépatique, le traitement avec des exosomes de CSM au moment de la blessure augmente le nombre de cellules en prolifération tout en réduisant le nombre des hépatocytes apoptotiques (Tan et coll. , 2014). Dans un modèle murin de lésion hépatique, le traitement par les exosomes de CSM dérivés du cordon ombilical humain a permis une réduction de la fibrose du foie (Li et coll. , 2013). Après un accident vasculaire cérébral chez le rat, le traitement par des exosomes dérivés des CSM favorisent l'angiogenèse, la neurogenèse et la croissance des neurites par le transfert de miR- 133 b (Xin et coll. , 2012, Xin et coll. , 2013). En plus de délivrer des ARN, les exosomes et microvésicules peuvent fournir un effet paracrine par transfert de peptides/protéines comme des facteurs de 92 croissance, des cytokines et des hormones. Par exemple, le transfert de Wnt4 par les exosomes issus de CSM humaines provenant du cordon ombilical améliore la réparation des plaies cutanées chez des rats (Zhang et coll. , 2015). Figure 23 : mécanismes de réparation tissulaire et cellulaire par les CSM (D'après Spees et coll. , 2016) (Spees et coll. , 2016) A l'heure actuelle, beaucoup de chercheurs et de cliniciens sont intéressés par le potentiel de produits thérapeutiques dérivés des EV issus de CSM pour la réparation des tissus lésés et le traitement du cancer (Baglio et coll. , 2012, Akyurekli et coll. , 2015). La plupart des études avec des exosomes sur des tissus et des organes lésés rapportent des résultats positifs. Cependant, les effets pro ou anti- tumoraux des exosomes, microvésicules, et/ou de leurs constituants demeurent controversés. Par exemple, les CSM de la moelle osseuse réduisent la croissance des cellules cancéreuses en transférant miR-127, -197 -222 et-223 à travers des jonctions et des exosomes. Ces miRNA sont connus pour cibler CXCL12 (SDF-1) (Lim et coll. , 2011). Lee et coll. (Lee et coll. , 2013) ont suggéré que les exosomes de CSM peuvent supprimer l'angiogenèse car ils contiennent miR-16, un miRNA qui cible le VEGF et qui a été montré comme réduisant l'expression de VEGF dans une lignée cellulaire de cancer du sein. En 93 revanche, Zhu et coll. (Zhu et coll. , 2012) ont signalé que les exosomes de CSM humaines favorisaient la croissance tumorale in vivo en induisant l'expression du VEGF dans les cellules tumorales. Boelens et coll. (Boelens et coll. , 2014) ont rapporté un échange entre les cellules stromales et les cellules de cancer du sein par des exosomes des cellules stromales augmentant ainsi le nombre de cellules de tumorales résistantes aux traitements. ii. Transfert de mitochondries par nanotubes (TNT) et microvésicules Rustom et coll. (Rustom et coll. , 2004) ont découvert un nouveau système de communication intercellulaire sous forme de filaments fins de 50 à 200 nm de diamètre qui s'étendait entre les cellules. Ces tubes intercellulaire ont été appelés Tunneling NanoTubes (TNT). Ils permettent l'échange d'organites comme les mitochondries, de calcium et d'autres molécules. Découverte du transfert de mitochondries par les CSM in vitro La première preuve du transfert de mitochondries depuis les CSM vers des cellules lésées a été démontrée grâce à une lignée de cellules épithéliales du poumon qui ne disposaient pas de mitochondries fonctionnelles (A549rhocellules) (Spees et coll. , 2006). Le groupe de Prockop a montré que les CSM humaines pouvaient rétablir la respiration aérobie des cellules A549rho par le transfert de mitochondries ou d'ADN mitochondrial (ADNmt) (Spees et coll. , 2006). Les CSM sont maintenant connues pour transférer des mitochondries à plusieurs types de cellules différentes, y compris les cellules épithéliales, les cellules endothéliales et les myocytes cardiaques (Plotnikov et coll. , 2008). Ces transferts sont particulièrement évidents lorsque les cellules cibles sont endommagées ou en état de stress. Par exemple, les CSM empêchent l'apoptose dans les cellules endothéliales en transférant des mitochondries pendant le stress hypoxique/ischémique (Liu et coll. , 2014). Formation de TNT et transfert mitochondrial in vivo La première preuve que les TNT pouvaient jouer un rôle in vivo provenait d'études sur l'œil. À l'aide de souris de type sauvage, ou des souris transgéniques chimériquse eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) et Cx3cr1(GFP) et de microscopie confocale, Colignon et coll. (Chinnery et coll. , 2008) ont montré la formation de nanotubes des cellules la moelle osseuse MHC classe II( ) avec le 94 tissu cornéen. Notamment, ils ont observé une augmentation de la fréquence des TNT au cours de l'inflammation et de lésion de la cornée. Protéines impliqués dans le contrôle du transfert des mitochondries par les CSM après lésion tissulaire Plusieurs études récentes ont fourni des preuves convaincantes que les CSM peuvent transférer des mitochondries in vivo et que le transfert des mitochondries depuis les CSM peut sauver des cellules pulmonaires endommagées et atténuer les lésions pulmonaires. Islam et coll. (Islam et coll. , 2012) ont démontré que l'instillation de CSM humaines par les voies aériennes pourrait réduire les dommages pulmonaires induits par le LPS, en partie, par le transfert de mitochondries. À l'aide d'imagerie optique direct, ils ont documenté le transfert de vésicules contenant des mitochondries issues de CSM vers les cellules épithéliales alvéolaires Le résultat est une augmentation des niveaux d'ATP alvéolaires et de la survie des cellules. L'utilisation de CSM génétiquement modifiées pour la connexine 43, les rendant incapable de former des jonctions, ne permettait plus alors de réduire les lésions pulmonaires aiges (Islam et coll. , 2012). Des données récentes d'un modèle de lésion pulmonaire induit par la fumée de cigarette suggèrent que l'âge et la source de CSM peuvent affecter la réparation par le transfert de mitochondries. Li et coll. (Li et coll. , 2014) ont constaté que la transplantation de CSM dérivées d'IPs peut accroitre la réparation par rapport à des CSM adultes grâce à un nombre plus grand de TNT et un transfert accru de mitochondries. En utilisant des approches de perte et de gain de fonction, Ahmad et coll. (Ahmad et coll. , 2014) ont démontré que Miro-1 (Mitochondrial Rho GTPase 1), une Rho like GTPase associée à la membrane mitochondriale externe, régule la quantité de mitochondries transférées des CSM aux cellules épithéliales pulmonaires. Une expression accrue de Miro-1 a été montrée comme augmentant le transfert des mitochondries depuis les CSM et le traitement des souris par des CSM sur exprimant Miro-1 réduit les lésions pulmonaires induites par la roténone et l'hyperréactivité bronchique et le remodelage négatif dans plusieurs modèles d'asthme (Ahmad et coll. , 2014). 95 4. Effets secondaires de la thérapie cellulaire par les CSM a. Immunogénicité L'un des intérêts majeurs de l'utilisation des CSM en clinique, en particulier chez des patients immunodéprimés ou souffrant de pathologies auto-immunes, est leur faible immunogénicité. Leur capacité à passer outre les systèmes de détection de l'organisme ainsi que leur effet immunosuppresseur (Cf. Immunomodulation), sont à l'origine de cette caractéristique. Les CSM présentent à leur surface une faible expression du CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité) de classe I et n'expriment pas le CMH de classe II, ni les molécules co- stimulatrices CD80, CD86 et CD40 nécessaires à l'activation des cellules T. La stimulation des CSM par l'IFN- augmente l'expression des deux classes de CMH, sans pour autant augmenter l'immunogénicité des CSM vis-à-vis des cellules T (Le Blanc et coll. , 2003, Klyushnenkova et coll. , 2005). En l'absence de stimulation l'IFN-, la faible expression du CMH de classe I les rend vulnérable aux cellules NK (Spaggiari et coll. , 2006). En revanche, les CSM traitées à l'IFN- sont moins exposées à la lyse par les NK (Spaggiari et coll. , 2006). Lors d'études cliniques impliquant la transplantation de CSM, peu d'effets secondaires ont été observés. Une méta-analyse a montré que seule une fièvre transitoire pouvait être occasionnellement observée après injection de CSM (Lalu et coll. , 2012). Globalement, la faible immunogénicité des CSM s'explique par leur capacité à inhiber le système immunitaire dans son ensemble et selon un processus de communications intercellulaires. Ces processus sont détaillés dans la partie précédente, portant sur l'aspect immunomodulateur des CSM. b. Effet pro-fibrosant des CSM L'un des principaux obstacles à l'utilisation des CSM pour le traitement de la fibrose en clinique est la possibilité qu'elles exercent un effet pro-fibrosant. Différentes causes expliquent cette hypothèse : - les CSM peuvent produire de nombreux facteurs de croissance, dont le TGF-1, l'un des acteurs principaux de la fibrose 96 - Dans certaines situations, les CSM acquièrent des propriétés proches des myofibroblastes, en termes de morphologie et de phénotype. L'expression de l'actine des muscles lisses est parfois observée sur des CSM en culture - Les cellules responsables de l'accumulation de matrice extracellulaire peuvent être d'origine mésenchymateuse Ngo et coll. ont comparé le phénotype des CSM de la moelle osseuse en culture et des myofibroblastes cardiaques et ont observé que, bien que les CSM conservent leur pluripotence, elles expriment plusieurs marqueurs des myofibroblastes (-SMA, vimentine, fibronectine ED-A, collagène type I) (Ngo et coll. , 2014). In vitro, il est possible de différencier les CSM en myofibroblastes avec un stimulus adéquat (TGF-1, co-culture avec une lignée de cellules tumorales) (Emura et coll. , 2000). Dans le cœur de souris âgées, les fibroblastes producteurs de collagène I sont issus de la différenciation de CSM et sont responsables de la fibrose interstitielle (Cieslik et coll. , 2013). Plusieurs études ont montré la différenciation des CSM en myofibroblastes sous l'effet du microenvironnement tumoral (Cho et coll. , 2011, Chowdhury et coll. , 2015, Zhang et coll. , 2016). Chez la souris, Humphreys et coll. suggèrent que les myofibroblastes responsables de la fibrose rénale sont d'origine péricytaire (Humphreys et coll. , 2010). L'hypothèse posée par Caplan selon laquelle les CSM sont en réalité des péricytes impliquerait donc que les myofibroblastes de la fibrose rénale soient différenciés à partir de CSM (Caplan, 2008). Il existe également des preuves de la différenciation des CSM en myofibroblastes au niveau du foie (Friedman, 2008). Il existe de nombreuses données indiquant que les cellules souches mésenchymateuses endogènes peuvent se différencier en myofibroblastes en contexte normal ou pathologique. Néanmoins, il est à noter qu'il n'existe à notre connaissance aucune occurrence de transplantation de CSM ayant un effet pro-fibrosant (Cf. CSM et fibrose). De plus, certaines études tendent à montrer que le phénotype myofibroblastique des CSM est réversible. Desai et coll. ont montré que le traitement de cellules souches du tissu adipeux par TGF-1 induisait leur différenciation en myofibroblastes, reversée en partie par FGF-2 (Desai et coll. , 2014). Enfin, il est probable que la différence de phénotype des CSM endogènes et exogènes provienne de la différence dans les stimuli qui les activent, dépendant de l'état de développement de la pathologie, de la niche dont elles proviennent et des facteurs les recrutant. c. Effet des CSM sur la tumeur L'une des principales contraintes à l'utilisation des CSM dans le contexte des complications de la radiothérapie est le risque de récidive tumorale ou de potentialisation des cellules tumorales. À 97 nouveau, la problématique nait de la difficulté à prédire l'effet des CSM transplantées et du large panel de facteurs de croissance produits par les CSM, certains pro-tumoraux. Chez de nombreux patients atteints de cancer, certaines cellules tumorales sont tolérantes aux traitements conventionnels, notamment à la radiothérapie. Ces cellules persistent pendant des années dans un état indétectable et dormant, après quoi elles peuvent reprendre leur croissance et induire des lésions cancéreuses récurrentes et presque toujours fatales. En tenant compte de ces cellules cancéreuses résiduelles la sécurité demeure un problème majeur à résoudre pour les patients traité par thérapie cellulaire (Pantel et coll. , 2009). Savoir si les CSM répriment ou favorisent le développement tumoral est un élément de controverse au sein de la littérature. De nombreuses études indiquent que les CSM exercent des effets anti-tumoraux et suppriment la croissance tumorale, tandis que d'autres études font état d'effets pro- tumoraux (Prakash et coll. , 2016). Une caractéristique principale des CSM est leur capacité à migrer aux sites tumoraux (Studeny et coll. , 2004). Cette propriété est due aux facteurs sécrétés par le microenvironnement tumoral qui seraient impliquées dans le chimiotactisme tumoral des CSM. Par exemple le FGF-2 serait impliqué dans le recrutement des CSM et leur trans-différenciation en Fibroblastes Associés aux Cancer (Yang et coll. , 2016). Après homing dans la tumeur, les CSM jouent un rôle important dans le développement et la progression tumorale. Plus précisément, les CSM recrutés sélectivement aux tumeurs se multiplient et contribuent à la formation du stroma associé à la tumeur et régulent la croissance tumorale. Les CSM ont plusieurs fonctions de promotion de la croissance tumorale dans le microenvironnement tumoral, notamment en exprimant des facteurs de croissance, en favorisant la formation de vaisseaux et en créant des niches pour la dissémination des cellules souches tumorales (Roorda et coll. , 2009, Jung et coll. , 2013), par exemple dans les carcinomes mammaires (Karnoub et coll. , 2007). i. Inhibition tumorale par les CSM Par opposition, plusieurs études ont montré que les CSM inhibent la croissance de la tumeur dans un modèle murin de gliome par inhibition de l'angiogenèse (Ho et coll. , 2013) et dans un modèle de carcinome hépatocellulaire en induisant l'apoptose des cellules tumorales (Abd-Allah et coll. , 2014). Les CSM reconnaissent des déterminants des cellules cancéreuses issues du sein. Les CSM seraient cannibalisées par ces cellules cancéreuses. Ce processus altère distinctement le phénotype cellulaire 98 des cellules cancéreuses, supprime la formation de tumeurs et induit la dormance tumorale (Bartosh et coll. , 2016). Un autre mécanisme d'inhibition est produit par la molécule TRAIL (Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing Ligand). TRAIL est sécrétée par les CSM et limite le développement tumoral dans les modèles de sarcome orthotopique de Ewing (Guiho et coll. , 2016). Cependant, il existe des controverses sur l'effet inhibiteur des CSM sur la croissance tumorale. Zipori et coll. ont montré que les CSM inhibent les cellules tumorales de sarcomes in vitro (Zipori et coll. , 1987), observations confirmées plus tard par la démonstration que les CSM antagonisent significativement la croissance du sarcome de Kaposi in vivo (Khakoo et coll. , 2006). Des résultats semblables ont été observés dans un modèle expérimental de carcinome pancréatique (Kidd et coll. , 2009) et chez la souris SCID porteuse de lymphomes non hodgkiniens disséminés. De vastes zones de nécrose dans la masse de la tumeur ont été observées après injection de CSM dans la tumeur, probablement induit par un effet anti-angiogénique, puisqu'ex vivo des expériences ont démontré que les CSM induisaient l'apoptose des cellules endothéliales dans ce modèle (Secchiero et coll. , 2010). Les CSM inhibent la croissance du cancer du côlon de rat lorsqu'elles sont injectées conjointement en nombre égal avec les cellules tumorales ou en quantité dix fois supérieure (Ohlsson et coll. , 2003). Les CSM fœtales humaines inhibent les lignées cellulaires du cancer du foie humaine, en diminuant leur prolifération et l'expression d'oncogènes in vitro et in vivo (Qiao et coll. , 2008). Le traitement par du milieu conditionné entrane une diminution des facteurs de survie, tels que la -caténine, c-Myc et la survivine. Cet effet est induit par un inhibiteur de la -caténine, le DKK-1 (DicKKopf-related protein-1), qui est sécrété par les CSM. Les effets de DKK-1 ont été supprimés par l'utilisation d'un anticorps neutralisant ou des siRNA (small interfering RNA), éliminant ainsi les effets inhibiteurs induits par les CSM (Qiao et coll. , 2008). Différents mécanismes ont été proposés comme un effet indirect des CSM sur l'angiogenèse tumorale et l'activation des MMP ou un effet inhibiteur sur la reconnaissance des cellules tumorales par le système immunitaire. Cousin et coll. ont démontré que les CSM inhibent les tumeurs pancréatiques en altérant le cycle cellulaire in vitro avec une augmentation des taux d'arrêt de la phase G1 dans les cellules de cancer du pancréas et également in vivo, après injection de CSM suite à une xénogreffe de cancer du pancréas (Cousin et coll. , 2009). Dans une approche similaire, les CSM injectées dans un modèle établi de mélanome sous-cutané induisent l'apoptose et bloquent la croissance tumorale (Otsu et coll. , 2009). Les CSM jouent un double rôle dans la croissance tumorale in vitro et in vivo. Une étude montre que les CSM inhibent la prolifération des cellules tumorales du poumon et des cellules tumorales œsophagiennes in vitro, mais, qu'in vivo, les CSM favorisent la formation de tumeurs et leur croissance (Tian et coll. , 2011). Ces controverses peuvent être attribuées 99 aux différences dans les types de tumeurs ou aux conditions expérimentales. Les modèles animaux utilisés sont basés sur des injections de cellules tumorales issues de lignées d'origine humaine ou animale chez des souris immunodéprimées. Ces cellules sont généralement injectées en même temps que les CSM, ce qui ne permet pas de distinguer l'effet propre des CSM sur la croissance tumorale d'un effet des CSM sur l'implantation des cellules tumorales (effet niche). De plus le recours à des animaux immunotolérants ne permet pas de tenir compte de la composante inflammatoire dans la cancérogénèse notamment au niveau du microenvironnement tumoral. ii. Conséquences moléculaires et fonctionnelles au cours de l'interaction des CSM avec les cellules tumorales Le développement et la progression tumorale n'est pas seulement déterminée par les cellules tumorales mais aussi par leur microenvironnement. Cela inclut un réseau orchestré d'interactions cellulaires (cellules immunitaires, cellules endothéliales, fibroblastes et CSM) via la MEC et des facteurs solubles tels que les cytokines, chimiokines, facteurs de croissance et divers métabolites. Les populations de cellules du microenvironnement tumoral peuvent interagir directement et indirectement avec les cellules cancéreuses en altérant mutuellement des propriétés et des fonctions de leurs partenaires. Ces communications intercellulaires jouent un rôle important au cours de la cancérogenèse. Les changements fonctionnels et les conséquences pour les différents types de cellules pourraient entraner la création d'une niche de cellules souches de carcinome ou la génération de nouvelles populations de cellules de tumeur par fusion cellulaire CSM-tumeurs (Melzer et coll. , 2016). Plusieurs mécanismes directs et/ou indirects d'interaction sur ou par les CSM contribuent à la stimulation de la croissance des cellules cancéreuses dont la signalisation Notch, la formation de nanotubes, les communications intercellulaires ou l'échange de cytokines/chimiokines, les vésicules extracellulaires et les exosomes (Mandel et coll. , 2013, Yang et coll. , 2015, Yang et coll. , 2015). Il est donc important de souligner que ces différents types d'interactions directes et indirectes sont toujours multidirectionnels. Le microenvironnement tumoral contribue à la malignité des cellules de la tumeur primitive, mais aussi leur capacité métastatique (Ungefroren et coll. , 2011). Les CSM augmentent la prolifération des cellules cancéreuses dans des modèles de co-culture de CSM avec des populations de différents types de cancer du sein ou de cellules de tumeur ovarienne (Yang et coll. , 2015). Plusieurs interactions cellulaires entre les CSM et les cellules cancéreuses du cancer du sein induisent la croissance accrue du cancer du sein tant in vitro et in vivo (Muehlberg et coll. , 2009). L'une des interactions implique l'induction par les CSM de l'expression du CD90 dans les cellules tumorales (Yang et coll. , 2015). Il est à noter que la fonctionnalité des CSM peut changer pendant la chimiothérapie 100 induisant des effets différents sur les cellules cancéreuses du sein (Skolekova et coll. , 2016). De même dans les cellules de cancer de l'ovaire, les CSM peuvent induire des marqueurs de surface comme le CD90 et des récepteurs fonctionnels comme le CD73 et le CD105. Ainsi, les cellules de carcinome ovarien hypercalcémique primaire à petites cellules (SCCOHT-1) acquièrent la capacité de métaboliser l'adénosine cyclique 3', 5'-monophosphate cyclique (AMPc) soulignant l'échange moléculaire bidirectionnelle entre cellules tumorales et CSM (Yang et coll. , 2015). De plus, la régulation positive de MZT2A et de l'EPGN (EPiGeN) favorisent la capacité de prolifération des cellules de cancer de l'ovaire. En parallèle, la modulation de facteurs de transcription comme TAL1 (T-cell Acute Lymphocytic leukemia protein 1), des facteurs de transcription de FOS et OSF (Osteoblast Specific Factor), HES1 (Hairy and Enhancer of Split 1) et HES5 sont également liés à la promotion du développement du cancer. En outre, des facteurs de croissance de la famille de protéines morphogénétiques osseuses sont acquis par les cellules de cancer de l'ovaire en présence de CSM (Yang et coll. , 2015) et contribuent au développement de certains adénocarcinomes. L'induction de gènes lors de la co-culture de CSM et cellules tumorales démontrent que les CSM soutiennent la capacité de prolifération de cellules de cancer de l'ovaire, mais aussi induisent des propriétés pro-métastatiques des cellules de cancer de l'ovaire. Réciproquement chez les CSM, une altération fonctionnelle est observée au cours de la co- culture avec des cellules tumorales comprenant des facteurs de transcription des gènes des cellules souches (Lis et coll. , 2014). Les CSM expriment des niveaux croissants de facteurs de transcriptions spécifiques des cellules épithéliales dont un groupe de gènes de la famille des KRT (KeRaTin), qui interviennent dans la production de kératine pour soutenir la structure des cellules épithéliales. Aussi, certains gènes liés aux interactions cellule-cellule, le gène de jonction intercellulaire (DSP), les gènes liés à adhérence de cellules (MPZL2 : Myelin Protein Zero Like 2 ; SCEL : SCiELlin) et le gène de glycoprotéine d'adhérence dépendante du calcium cellules (CDH1 : CaDHérine-1) sont tous positivement régulés dans les CSM après co-culture avec des cellules de cancer de l'ovaire. À l'inverse, des ARNm codant pour des cytokines telles que G-CSF, IL1A, CCL20, TNF, CXCL1, CXCL2, CXCL3 et CXCL12 sont diminués dans les CSM en présence de cellules de cancer de l'ovaire (Yang et coll. , 2015). L'expression et la production de la molécule d'adhérence de cellules épithéliales (ECAM), normalement indétectable dans les CSM, augmente considérablement après co-culture avec des lignées cellulaires de cancer de l'ovaire telles que SK-OV-3 ou NIH : OVCAR-3 (Yang et coll. , 2015). L'ensemble de ces résultats corroborent le fait que les CSM acquièrent certaines fonctionnalités de cellules épithéliales lors de l'interaction avec les cellules de cancer de l'ovaire. Les CSM peuvent donc développer un phénotype aberrant associé aux tumeurs. Des travaux antérieurs montrent que les cellules tumorales initiatrices (Tumor Initiating Cell) dans le carcinome mammaire, aussi appelées les cellules souches du cancer (CSC : Cancer Stem Cell), présentent une augmentation de l'expression de marqueurs caractéristiques des cellules mésenchymateuses dont la vimentine, la fibronectine et la N- 101 cadhérine au lieu de E-cadhérine (Mani et coll. , 2008). D'autres études dans les tumeurs mammaires ont révélé que l'IL6 produite par les cellules cancéreuses interagit avec son récepteur sur les cellules mésenchymateuses positives à l'aldéhyde déshydrogénase 1. Cet IL6 pourrait faciliter le recrutement de CSM supplémentaires dans le microenvironnement tumoral et l'induction de la production de CXCL7 par ces cellules. Inversement, le facteur CXCL7 (issu des CSM) stimule les cellules cancéreuses via l'activation du récepteur CXCR2 et induit la synthèse de cytokines supplémentaires telles que l'IL6 et l'IL8 pour générer une boucle de rétroaction positive qui contribue à augmenter l'attraction des CSM et à améliorer les interactions avec les cellules tumorales (Liu et coll. , 2011). Suite à une interaction continue au sein du microenvironnement de la tumeur, les cytokines et en particulier l'IL1 libérées par les cellules tumorales peuvent stimuler le métabolisme de l'acide arachidonique et la production de PGE2 par les CSM. Inversement, les cytokines libérées et le PGE2 ensemble peuvent induire la voie de signalisation des -caténine dans les cellules néoplasiques et contribuer ainsi au développement de cellules souches immatures (Li et coll. , 2012). Au cours de ces interactions, des caractéristiques d'un phénotype mésenchymateux sont progressivement acquises par les cellules cancéreuses (Yang et coll. , 2015) qui peut inclure l'EMT dans les cellules cancéreuses. Ceci suggère un processus de rétro-différenciation des cellules cancéreuses vers un phénotype de cellules souches (Hass, 2009, Li et coll. , 2012) induit par l'interaction des CSM avec les cellules cancéreuses. Alternativement, au cours des interactions cellulaires ou des reprogrammations, les CSM peuvent acquérir des propriétés fonctionnelles de cellules cancéreuses. Cette reprogrammation oncogénique peut transformer les CSM en cellules de sarcome agressif (Eid et Garcia, 2015) et peut également jouer un rôle dans les tumeurs mésenchymateuses caractéristiques telles que les tumeurs desmoïdes (Wu et coll. , 2010). Suite à l'EMT et aux interactions avec les CSM, les nouvelles populations de cellules cancéreuses ont une plasticité phénotypique, un potentiel métastatique et une sensibilité/résistance aux approches thérapeutiques modifiés. Les CSM peuvent altérer la confluence et la migration des cellules de cancer du sein SKBR3, augmenter la formation de mammosphères, induire l'EMT et modifier la morphologie des cellules tumorales (Kucerova et coll. , 2013). Les cellules de carcinome du nasopharynx (NPC) présentent une plus grande capacité de prolifération et de migration après adsorption des exosomes dérivés de CSM. De plus, les marqueurs de l'EMT, y compris la E-cadhérine et l'up-régulation de la vimentine et de la N-cadhérine, ont été largement modifiés après adsorption des exosomes. Cette communication indirecte entre les exosomes dérivés de CSM et des cellules de cancer induites en EMT, favorise la croissance tumorale in vitro et in vivo et la propagation des métastases (Shi et coll. , 2016). 102 Figure 24 : interaction des CSM avec le microenvironnement tumoral (D'après Hass, 2012) (Hass et Otte, 2012) iii. Les CSM et le cancer colorectal Les CSM augmentent la croissance des cellules de cancer du côlon, des lymphomes et des mélanomes in vivo (Klopp et coll. , 2011). Les CSM injectées conjointement avec les cellules cancéreuses du côlon dans un modèle murin de xénogreffe (Zhu et coll. , 2006), induisent une augmentation de l'incidence des tumeurs avec une vascularisation et une nécrose accrue. Néanmoins, les CSM inhibent la croissance du cancer du côlon de rat lorsqu'elles sont injectées conjointement avec une quantité égale de CSM et de cellules tumorales (Ohlsson et coll. , 2003). Récemment, il a été démontré que les cellules de cancer du côlon ont une expression accrue des facteurs de transcription de l'EMT comme Zeb1/2, Slug, Snail et Twist qui est accompagnée d'une down-régulation de l'expression de la E- cadhérine. De plus, ces cellules de cancer du côlon ont acquis l'expression des gènes de cellules souches y compris Oct4 et Sox2 après co-culture avec les CSM. La morphologie des cellules cancéreuses du côlon a été changée en forme de cellules allongées, comme des fibroblastes qui sous-tendent la conversion à un phénotype mésenchymateuse. Inversement, les cellules cancéreuses du côlon ont été capables d'induire la sécrétion de cytokines (TNF, IL10, IFN) et de facteurs métastatiques (VEGFC, TERT : TElomerase Reverse Transcriptase) dans les CSM via l'activation de la voie Wnt. L'inhibition de la signalisation Wnt réduit le pouvoir invasif et la tumorigénicité des cellules cancéreuses in vitro et in vivo (Chen et coll. , 2015). Des études approfondies sont nécessaires à la compréhension des mécanismes directs et indirects des CSM et des cellules cancéreuses conduisant à l'induction de l'EMT, 103 altérant ainsi la structure cellulaire et la morphologie des cellules du cancer vers un phénotype mésenchymateux pro-métastatique (So et coll. , 2015). iv. Double fonction des CSM sur la tumeur En réaction à des stimuli discrets, les CSM peuvent changer leur phénotype pour influencer la transition entre une condition pré-néoplasique et néoplasique ou, à l'inverse, maintenir un microenvironnement qui entrave la croissance tumorale. Théoriquement, les CSM peuvent ainsi avoir un effet pro ou anti-tumorigène. Cet effet dynamique est induit selon les différentes réactions aux types de cellules tumorales ou par le contact avec leurs microenvironnements spécifiques. Les effets variables des CSM sur la croissance tumorale pourraient être attribués à des différences dans les modèles de tumeur, l'hétérogénéité des CSM, la dose ou les modalités d'injection de CSM, le type d'animal utilisé (par exemple souris immunotolérante ou immunocompétente) ou d'autres facteurs qui n'ont pas encore été appréciés (D'Souza et coll. , 2013). Par exemple, Zipori et coll. ont démontré une action bimodale de CSM murines et humaines contre plusieurs lignées de cellules tumorales (Cf. Inhibition tumorale par les CSM) (Zipori et coll. , 1987). Néanmoins, des considérations expérimentales des études cliniques sur des patients atteints de cancer fournissent certaines données contradictoires quant à l'effet médié par les CSM sur la progression du cancer. Des rapports indépendants ont indiqué que les CSM n'affectent pas la progression du cancer du sein ou des hémopathies malignes (Lazarus et coll. , 2005). En revanche, une cohorte de patients souffrant d'hémopathies malignes qui ont été traités par chimiothérapie puis co-transplantés avec des CSM et des CSH a montré une plus grande incidence de rechute de la maladie comparé à ceux recevant des CSH seules (Ning et coll. , 2008). Cependant dans une plus grande cohorte de plus de 200 patients traités par des CSM pour des applications différentes de médecine régénérative (Centeno et coll. , 2010), aucune augmentation du risque de néoplasie n'a été signalée. De plus une méta-analyse a montré que seule une fièvre transitoire pouvait être occasionnellement observée après injection de CSM [428]. Néanmoins, nous ne pouvons pas totalement exclure une incidence néfaste du traitement par les CSM et une investigation préclinique supplémentaire est nécessaire pour assurer l'utilisation des CSM sans risques. Les CSM sont connues pour sécréter des exosomes et microparticules, qui peuvent influer la signalisation dans le microenvironnement tumoral (Lai et coll. , 2010, Zhu et coll. , 2012). Introduisant de nouveaux paradigmes, Roodhart et coll. ont récemment fait remarquer que le traitement d'un modèle animal de cancer avec des CSM pourrait entraner une résistance à la chimiothérapie au platine (Roodhart et coll. , 2011). La double nature des CSM en ce qui concerne les interactions avec la tumeur, est d'une 104 importance capitale dans des modèles expérimentaux visant à clarifier la relation entre une tumeur et de son milieu. 5. Reprogrammation des CSM Suite à une infection, un dommage ou à la destruction d'un tissu, les molécules exprimées par les pathogènes ou associées aux dommages sont reconnues par les Toll-Like Receptors (TLR) présents sur les cellules effectrices de l'immunité innée. Les TLR sont une famille de récepteurs (13 découverts chez l'Homme à ce jour) activés par des signaux de dangers sécrétés au cours de la plupart des pathologies (Matzinger, 2002). Les signaux exogènes, comme les endotoxines et les lipopolysaccharides sont en général sécrétés lors d'une infection microbienne. Les signaux de danger endogènes sont sécrétés par des cellules anormales ou endommagées sous forme de composants intracellulaires tels que les protéines de choc thermique ou HSP (Heat Shock Proteins) ou des ARN. Ces signaux de danger activent les TLR sur les cellules sentinelles de l'immunité innée, par exemple les cellules dendritiques afin d'activer une réponse appropriée et de ré-établir l'homéostasie tissulaire (Kaisho et Akira, 2001). Plusieurs équipes ont établi un lien entre l'activation des TLR et l'activité immunomodulatoire et migratoire des CSM (Hwa Cho et coll. , 2006, Pevsner-Fischer et coll. , 2007, Tomchuck et coll. , 2008). Figure 25 : reprogrammation des CSM par activation des TLR : l'activation des CSM via des récepteurs différents induit une modification de leur phénotype (D'après Bétancourt, 2013) (Betancourt, 2013) 105 En particulier, la stimulation de TLR3 ou TLR4 sur les CSM induit un changement de polarisation. Ainsi, les CSM activées via TLR3 ont un profile immunosuppressif alors que l'activation de TLR4 induit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Ces deux états de polarisation ont été nommés par Waterman et coll. CSM1, pro-inflammatoire, et CSM2, anti-inflammatoire (Waterman et coll. , 2010). Ce nouveau paradigme est basé sur des différentes constantes entre ces deux populations : profile de sécrétion de cytokines et chimiokines, capacités de différenciation, sécrétion de MEC, voie de signalisation TGF- et expression de Jagged, IDO et PGE-2 (Figure 25) (Waterman et coll. , 2010). L'un des effets majeurs de cette polarisation porte sur l'effet des CSM sur l'activation des cellules T. Dans une expérience de co-culture de cellules mononucléées du sang et de CSM, les CSM non traitées induisaient une diminution de l'activation des cellules T d'environ 90%. Les CSM1, activées via TLR4, n'avaient pas d'effet significatif sur le pourcentage de cellules T activées. En revanche, les CSM2 induisaient un effet similaire aux CSM non traitées (Waterman et coll. , 2010). L'incubation des CSM pendant 1 heure avec des ligands de TLR3 (poly(I : C) ou TLR4 (LPS) augmente leur pouvoir migratoire. Par contraste, il est nécessaire d'incuber les cellules 24 heures avec TNF- ou CCL5 pour obtenir un effet similaire (Tomchuck et coll. , 2008). Les auteurs de cette étude suggèrent qu'une activation à court terme des CSM par les ligands des TLR est proche de ce qui est observé in vivo suite à une infection ou 'une lésion (Betancourt, 2013). Suivant le protocole expérimental, les TLR induisent ou non une variation du potentiel de différenciation des CSM. Liotta et coll. n'ont observé aucun changement dans les différenciations adipogénique, ostéogénique et chondrogénique après stimulation des TLR (Liotta et coll. , 2008). En revanche, Lombardo et coll. suggèrent une augmentation de la différenciation ostéogénique après activation de TLR3 ou TLR4 (Lombardo et coll. , 2009). Enfin, une étude de Waterman et coll. a montré que l'activation de TLR3 inhibe la différenciation en ostéoblastes et adipocytes, alors que l'activation de TLR4 favorise la différenciation ostéogénique et inhibe la différenciation adipogénique (Waterman et coll. , 2010). La polarisation CSM1/CSM2 affecte également le profil sécrétoire des CSM. Les CSM1 sécrètent davantage d'IL-6 et IL-8 alors que les CSM2 produisent IL-4, CXCL10, RANTES et IL-1RA en quantité plus importante. Les CSM stimulées via TLR3 sécrètent également moins de TGF-1 et TGF- 3 que les cellules non activées ou activées par TLR4. L'activation de TLR4 induit la production de collagène I et III par les CSM, alors que les CSM1 sécrètent plus de fibronectine. Cet effet peut être expliqué par une surexpression et sur-activation de Smad3 par les CSM1, alors que Smad7, un 106 inhibiteur de la voie Smad, est surexprimé chez les CSM2. Enfin, les CSM2 sur-expriment IDO et PGE2 (Waterman et coll. , 2010). L'état de polarisation des CSM influe sur leur effet in vitro et in vivo. La reconnaissance de motifs microbiens par les CSM induit un profil pro-inflammatoire alors que les molécules associées aux autres types de lésions induisent un profil anti-inflammatoire. Ainsi, cette observation pourrait expliquer la majorité d'occurrences d'effet immunosuppresseur des CSM dans la littérature. En effet, il est probable que l'état par défaut des CSM soit immunosuppressif afin d'éviter des dommages, notamment à la niche hématopoïétique. Un stimulus spécifique serait alors nécessaire pour induire un changement vers un phénotype pro-inflammatoire indispensable aux premières étapes de la régénération tissulaire. L'orientation de la polarisation des CSM pourrait être primordiale dans le traitement de cancers ou de maladies auto-immunes et inflammatoires. Waterman et coll. ont montré une inhibition de la croissance tumorale sous l'effet des CSM1 dans un modèle de tumeurs ovariennes chez la souris. A l'inverse, la co-culture de CSM2 avec des sphéroïdes de tumeurs ovariennes favorisait la croissance tumorale (Waterman et coll. , 2012). L'effet anti-inflammatoire des CSM2 est certainement à l'origine de cette observation, l'inhibition du système immunitaire limitant la capacité de l'organisme à lutter contre la tumeur. De façon prévisible, l'utilisation de CSM2, anti- inflammatoires, est préférable dans les pathologies inflammatoires, telles que la neuropathie diabétique périphérique (Waterman et coll. , 2012). 6. Isolement, amplification et caracterisation des CSM Les CSM sont obtenues chez l'homme par un procédé très simple. Après ponction médullaire ou liposuccion, les cellules sont mises en suspension et ensemencées dans des botes de culture dans un milieu liquide additionné de sérum (humain ou bovin), sélectionné pour obtenir la croissance optimale des cellules adhérentes. Mises en culture dans un milieu nutritif de base (Minimal Essential Medium alpha) supplémenté en SVF (sérum de veau fœtal) ou en lysat plaquettaire, les CSM adhèrent rapidement au support et peuvent être séparées des cellules hématopoïétiques par des changements de milieu répétés. Il a été démontré dans les années 1970 par l'équipe de Friedenstein que les CSM sont des cellules facilement amplifiables in vitro (Friedenstein et coll. , 1968, Friedenstein et coll. , 1976). En fonction du temps et des conditions de culture, les CSM peuvent présenter des morphotypes et des antigènes différents. Dans des conditions de culture adaptées, des colonies distinctes se forment, chacune dérivant d'une cellule précurseur unique : la CFU-F (Colony Forming Unit Fibroblast). De nombreux travaux ont caractérisé le phénotype des CSM au fil des passages. Ces études ont montré que les CSM sont une population de cellules adhérentes distincte des populations hématopoïétiques 107 ou endothéliales. Cependant, aucune de ces caractéristiques ne peut être considérée comme spécifique des CSM, ni ne sont suffisantes pour définir la population en l'absence des critères fonctionnels de différenciation en précurseurs adipocytaires, ostéogéniques et chondrogéniques. Les marqueurs CD73, CD90 (antigène Thy-1), CD105 (endogline), CD146 (melanoma cell adhesion molecule, MCAM ou glycoprotéine MUC18) et CD200 présents sur les CSM natives permettent leur enrichissement (Tableau 8) (Dominici et coll. , 2006). Cet enrichissement sera d'autant plus efficace que, par sélection négative, les cellules hématopoïétiques CD45 auront été éliminées. Il est nécessaire d'inclure des critères fonctionnels pour l'identification d'une population cellulaire en tant que CSM. L'identification des CSM nécessite de démontrer que ces cellules peuvent se différencier en précurseurs adipocytaires, ostéogéniques et chondrogéniques. Les cellules sont cultivées en présence d'inducteurs. La différenciation est mise en évidence par des méthodes histochimiques (colorations spécifiques) et par l'expression de facteurs de transcription clés des différentes voies (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma [PPARG] pour A, RUNX2 pour O et SOX9 pour C) Tableau 8 : résumé des critères miminum pour identifier les CSM in vitro (D'après Dominici et al. , 2006) (Dominici et coll. , 2006) La différence dans l'obtention de CSM à partir d'autres tissus que la moelle, est la nécessité de digérer le tissu par des enzymes protéolytiques. Le tissu adipeux, étant donné sa facilité de prélèvement en grande quantité par liposuccion, semble une alternative prometteuse. L'isolement à partir de tissu adipeux de précurseurs capables de se différencier en adipocytes a été décrit dès les années 1960 (Gimble et coll. , 2007). Ces cellules sont depuis appelées ASC pour adipose-derived stromal/stem cells. La digestion est une étape importante pour libérer les cellules de la matrice extracellulaire (Figure 26) mais elle induit de grandes différences dans les populations obtenues en fonction du protocole et des enzymes protéolytiques utilisées. L'isolement de populations cellulaires 108 distinctes dues à l'utilisation de protocoles différents peut expliquer des résultats expérimentaux variables. Après digestion, les adipocytes qui, remplis de lipides, flottent dans la suspension cellulaire sont éliminés de la fraction dite stromale-vasculaire du tissu. Cette fraction correspond à une population cellulaire hétérogène qui contient, entre autres, des cellules hématopoïétiques, des cellules endothéliales et des cellules immatures. La mise en culture de cette fraction permet aux CSM d'adhérer et d'être sélectionnées par cette capacité. Figure 26 : méthodes d'obtention des CSM et des ASC. La partie gauche de la figure illustre l'obtention des ASC ; noter l'importance de l'étape de digestion. La partie droite de la figure illustre l'obtention des CSM ; noter que l'étape de séparation des cellules mononucléées n'est pas indispensable (voir texte). La fréquence des CSM dans le tissu adipeux est 100 à 500 fois supérieure à celle des CSM dans la moelle osseuse. Il existe plusieurs différences. La première d'entre elles est que les CSM issu du tissu adipeux expriment la protéine CD34 en début de culture, contrairement aux CSM de moelle osseuse. Elles sont capables de se différencier en adipocytes, ostéoblastes, chondrocytes et cellules vasculaires musculaires lisses. Elles ont un potentiel angiogénique supérieur. Des résultats comparables ont été obtenus pour des cellules de type CSM d'autres tissus (Jansen et coll. , 2010). 109 7. Application des CSM en clinique Les propriétés régénératives des CSM les font émerger comme une alternative prometteuse dans le traitement de nombreuses pathologies pour lesquelles les thérapies pharmacologiques traditionnelles sont inefficaces. Comme indiqué précédemment, les pathologies auto-immunes telles que la GVHD ou la maladie de Crohn font l'objet de nombreuses études cliniques impliquant la transplantation de CSM. Le potentiel thérapeutique des CSM a également été démontré sur d'autres maladies : infarctus du myocarde, cirrhose, asthme et diabète (Heldring et coll. , 2015). a. Régénération osseuse La régénération du tissu osseux est nécessaire dans un grand nombre de pathologies, telles que les défauts non-jointifs de l'os apparaissant après retrait d'une tumeur ou à l'issue d'une fracture complexe. Chez 60 patients présentant des fractures non-jointives, l'injection de cellules mononucléées du sang, contenant des CSM, a conduit à la jointure de l'os chez 88, 3% des individus. Chez les 6 patients pour lesquels le traitement était inefficace, le nombre de CFU-f en culture était faible, indiquant une quantité inférieure de CSM et de cellules progénitrices, suggérant donc leur importance au cours du traitement (Hernigou et coll. , 2005). 12 patients souffrant d'arthrose ont été traités par injection intra-articulaire de CSM lors d'une étude pilote récente. Une amélioration rapide de la fonctionnalité des articulations et de la qualité du cartilage a été observée chez 11 de ces patients (Orozco et coll. , 2013). Des effets bénéfiques ont également été observés lors du traitement de l'ostéonécrose de la tête fémorale (Gangji et coll. , 2004, Kawate et coll. , 2006). b. Régénération du myocarde Le myocarde possède une capacité de régénération limitée. Après un infarctus du myocarde, la régénération conduit généralement à la formation de tissu fibrotique, diminuant la contractibilité du myocarde. L'injection de CSM chez 32 patients souffrant d'insuffisance cardiaque chronique a induit une amélioration de la fonctionnalité du ventricule gauche (Diederichsen et coll. , 2010). Un autre essai clinique, contre placebo, portant sur la transplantation de CSM autologues dans les 12 heures suivant l'infarctus du myocarde, a été conduit sur 69 patients. 3 mois après traitement, les patients ayant reçu des CSM présentaient une fonctionnalité cardiaque accrue comparé au groupe contrôle (Chen et coll. , 2004). 110 Depuis la découverte des CSM en 1991, de nombreuses études ont démontré leur importance dans le maintien de l'homéostasie tissulaire, que ce soit dans le soutien de l'hématopoïèse ou pour la régénération des tissus lésés. Ces propriétés ont rapidement suscité l'intérêt de la communauté scientifique, du point de vue de leur utilité en contexte thérapeutique. Alors que l'hypothèse originelle reposait sur le remplacement des cellules endommagées par les CSM exogènes, il s'avère que l'intérêt de ce type de thérapie repose davantage sur la capacité des CSM à produire un panel de facteurs agissant sur l'inflammation, l'angiogenèse, l'apoptose La disponibilité, la faible immunogénicité et la capacité des CSM à migrer vers la lésion sont des caractéristiques avantageuses par rapport aux autres types cellulaires employées en thérapie. La compréhension accrue des mécanismes régissant le phénotype des CSM, ainsi que le nombre croissant d'essais cliniques sur cette thématique, rendent leur utilisation de plus en plus incontournable, en particulier dans le cadre de pathologies complexes pour lesquelles les traitements pharmacologiques sont inefficaces. Le traitement par les CSM des atteintes viscérales de la GVHD, des MICI et des irradiations est traité dans le paragraphe Thérapie cellulaire par les CSM pour le traitement des atteintes radio-induites au côlon-rectum. 111 D. Les CSM : la réponse recherchée ? Les atteintes secondaires tardives des radiothérapies, notamment la fibrose, sont extrêmement impactantes pour la qualité de vie des patients. En particulier, les séquelles au tractus gastro-intestinal induisent des symptômes sévères. Il n'existe pas à l'heure actuelle de protocole efficace de prise en charge de ces patients. Dans cette partie, nous détaillons les résultats obtenus suite à la transplantation de CSM sur différents modèles de fibrose afin d'évaluer le potentiel de cette thérapeutique sur la fibrose colorectale radio-induite. I. Traitements anti-fibrosants actuels Les traitements contre la fibrose ont un effet palliatif, les CSM sont une alternative thérapeutique qui a déjà démontré son efficacité dans de nombreuses pathologies. Les résultats des études précliniques et cliniques mettent en évidence de nombreux mécanismes d'action par les CSM : (i) immunosuppression (ii) action anti-oxydante (iii) remodelage et (iv) régénération tissulaire. L'avantage de ce traitement réside donc dans la capacité des CSM à agir sur plusieurs mécanismes impliqués dans les pathologies à traiter. De nombreuses drogues anti-fibrosantes sont actuellement utilisées ou à l'étude et il est important de comparer l'efficacité de ces traitements à celle de la transplantation de CSM. Les protocoles thérapeutiques anti-fibrosants sont des traitements symptomatiques. Pour exemple, les patients atteints de Fibrose Pulmonaire Idiopathique (FPI) sont souvent traité par des séances d'oxygénothérapie, visant à faciliter la respiration, sans résultats démontrés La vaccination contre les pathogènes des voies respiratoires est fortement recommandée, lorsqu'elle est disponible. Il en est de même pour la fibrose hépatique d'origine virale, les efforts se concentrant ici sur la lutte contre le virus. L'amélioration de l'hygiène de vie est également indispensable : l'arrêt de l'alcool pour les fibroses hépatiques ou du tabac pour la fibrose pulmonaire. Les médicaments évalués ou approuvés à ce jour agissent sur deux mécanismes majeurs de l'induction de la fibrose : l'inflammation et le stress oxydant. De nombreux anti-inflammatoires et antioxydants ont été testés sans démontrer d'efficacité réelle : corticostéroïdes, statines, IFN- (Rafii et coll. , 2013) La transplantation d'organe est souvent nécessaire à plus ou moins long terme pour assurer la survie du patient. La pirfénidone est le premier exemple d'agent anti-fibrosant utilisé en clinique. Elle possède des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et d'inhibition du TGF1 (Salazar-Montes et coll. , 2008). De plus, la pirfénidone altère directement l'expression, la synthèse et l'accumulation de 112 collagène en inhibant le recrutement et la prolifération des cellules productrices de MEC (Carter, 2011). Elle a été approuvée pour le traitement de la FPI en Europe, au Canada, en Corée du Sud et au Japon. Les études précliniques montrent sa capacité à bloquer l'expression de TGF-1 et à réduire significativement sa concentration dans le fluide de lavage bronchoalvéolaire dans les modèles de fibrose pulmonaire (Iyer et coll. , 1999). La pirfénidone est également efficace sur les modèles animaux de fibrose du cœur (Mirkovic et coll. , 2002), du rein (Takakuta et coll. , 2010), du foie (Di Sario et coll. , 2004) et de fibrose radio-induite (Simone et coll. , 2007). Cependant, la Food Drug Administration (FDA) n'a pas approuvé la pirfénidone en raison d'un manque d'efficacité et de bénéfice sur la survie dans les essais cliniques de longue durée (2010). De plus, une méta-analyse des résultats d'études cliniques montre que la pirfénidone induit des effets secondaires sévères au niveau gastro-intestinal, neurologique et dermatologique (Jiang et coll. , 2012). L'imatinib est un inhibiteur des tyrosines kinase ayant démontré son efficacité sur des modèles animaux de fibrose du rein (Wang et coll. , 2005), du poumon (Daniels et coll. , 2004), du foie (Yoshiji et coll. , 2005) et de la peau (Distler et coll. , 2007). L'imatinib inhibe c-Abl, bloquant ainsi des effecteurs de la voie TGF-, et inhibe simultanément PDGF. Il a été extensivement utilisé dans le traitement de cancers tels que la leucémie myéloïde chronique. Sur 5 essais cliniques sur des patients atteints de sclérose systémique sévère, 3 ont produit des résultats encourageants pour l'imatinib (Bournia et coll. , 2013). Récemment, un essai sur des patients atteints de FPI n'a pas produit les résultats escomptés avec un effet bénéfique léger sur la survie et la fonction pulmonaire (Iwamoto et coll. , 2011). Une partie significative des patients inclus dans des essais pour l'imatinib se sont retirés en raison des effets secondaires. D'autres drogues anti-fibrosantes sont testées à l'heure actuelle (revues dans (Wynn et Ramalingam, 2012, Rosenbloom et coll. , 2013). Ces agents pharmacologiques sont principalement des anti-inflammatoires et des inhibiteurs de la voie de signalisation TGF-1. Malgré le fait que certains de ces composés ont montré un effet anti-fibrosant sur les modèles animaux, le manque de données cliniques ne permet pas leur approbation. Les effets secondaires liés à l'utilisation des drogues anti-fibrosantes peuvent être sévères. En outre, ces effets secondaires sont aggravés par le manque de spécificité de ces composés, tant en termes d'organe visé que de cible cellulaire. La capacité des CSM à migrer vers le site de la lésion et à se reprogrammer en fonction du microenvironnement local en sécrétant de façon transitoire des facteurs spécifiques fait de la thérapie cellulaire un candidat prometteur. Il est à présent nécessaire de réunir des données précliniques et cliniques sur ce type de traitements. 113 II. CSM et fibrose 1. Études précliniques Les propriétés immunomodulatrices et régénératives des CSM ont été largement décrites. Néanmoins, les effets des CSM sur la fibrose et les mécanismes qui les sous-tendent sont encore mal connus. Dans cette partie seront exposés les résultats d'études portant sur la transplantation de CSM sur des modèles animaux de fibrose. Différents organes (foie, poumon, rein) et espèces (souris, rat, cochon) seront cités afin de dresser un bilan le plus exhaustif possible des connaissances actuelles sur cette thématique. a. Immunomodulation Les propriétés immunorégulatrices des CSM ont été utilisées pour le traitement des pathologies à inflammation chronique, telles que la fibrose (Figure 27) (Singer et Caplan, 2011, Mok et coll. , 2013). L'aspect immunosuppresseur des CSM est largement documenté. Les CSM agissent sur les lymphocytes B et T en bloquant leur cycle en phase G0/G1, inhibant ainsi la production d'immunoglobulines (IgA, IgG et IgM) et la différenciation des lymphocytes B. Elles induisent le changement de polarité des lymphocytes T d'un état Th1 pro-inflammatoire vers une polarité Th2 anti- inflammatoire (Corcione et coll. , 2006, Keating, 2008). Les CSM agissent sur la différenciation et la maturation des cellules dendritiques pour les rendre tolérogènes (Bifari et coll. , 2008). Elles inhibent l'activité cytotoxique des cellules natural killers sur les cellules HLA-I négatives. Plusieurs études ont montré la capacité des CSM à induire le changement de polarité des macrophages d'un état classiquement activé M1, pro-inflammatoire, vers un état alternativement activé M2, considéré comme favorisant la régénération du tissu (Prockop, 2013). Cet effet semble en partie induit par la production par les CSM de TSG-6, une cytokine anti-inflammatoire. Enfin, elles inhibent la production de cytokines telles que TNF-, IFN- et IL-10 (Sotiropoulou et coll. , 2006). Ainsi, la thérapie cellulaire par les CSM est un candidat majeur pour le traitement des maladies auto-immunes ou avec une forte composante inflammatoire. 114 Figure 27 : effet des CSM sur les cellules du système immunitaire De nombreuses études ont mis en évidence les bénéfices inhérents aux propriétés immunomodulatrices des CSM pour le traitement de la fibrose. L'inhibition par les CSM de l'expression des TLR (Toll-Like Receptor) suggère leur capacité à limiter l'inflammation chronique (Linard et coll. , 2013). Les TLR sont impliqués dans la réponse immunitaire innée et reconnaissent des motifs moléculaires conservés chez la plupart des pathogènes. Dans plusieurs modèles, la transplantation de CSM a permis de limiter l'infiltration des monocytes/macrophages, des neutrophiles et des lymphocytes au niveau du tissu lésé (Lee et coll. , 2010, Linard et coll. , 2013, Ueno et coll. , 2013, Zhou et coll. , 2013, Choi et coll. , 2014). Ce phénomène peut en partie être expliqué par la diminution de l'expression de MCP-1, une chimiokine impliquée dans le recrutement des monocytes, lymphocytes et basophiles (Zhou et coll. , 2013). La sous-expression de VCAM-1 et ICAM-1, impliquées dans les interactions entre cellules endothéliales et leucocytes, est également responsable de la réduction de l'infiltrat inflammatoire (Zhou et coll. , 2013). Dans un modèle de fibrose cutanée radio-induite, la transition des macrophages d'un état M1 à M2 a été observée suite à l'injection de CSM (Horton et coll. , 2013). La diminution de l'expression de iNOS suite à la transplantation de CSM dans un modèle de rectite radio-induite suggère une réduction de l'activité des macrophages M1 (Linard et coll. , 2013). Une augmentation de la proportion de macrophages M2 a été observée dans des modèles de fibrose du cœur (Ishikane et coll. , 2013) et du rectum (Linard et coll. , 2013). Dans le poumon, les microvésicules purifiées du milieu conditionné par les CSM, bien qu'induisant une diminution 115 significative du nombre de cellules immunitaires, a produit des effets moindres que la transplantation de CSM (Choi et coll. , 2014). Les CSM inhibent l'expression de l'IFN-, qui possède une activité pro-inflammatoire en induisant la surexpression de l'IL-6 et du TNF- (Moodley et coll. , 2009). Une diminution de l'expression et de la concentration de TNF- a été observée dans différents modèles après transplantation (Moodley et coll. , 2009, Semedo et coll. , 2009, Lee et coll. , 2010, Asanuma et coll. , 2011, Qiao et coll. , 2011, Bai et coll. , 2013, Horton et coll. , 2013, Linard et coll. , 2013, Zhou et coll. , 2013, Qi et coll. , 2014). IL-1 (Horton et coll. , 2013), IL-1 (Lee et coll. , 2010, Horton et coll. , 2013) et IL-6 (Semedo et coll. , 2009, Lee et coll. , 2010, Franquesa et coll. , 2012, Linard et coll. , 2013, Zhou et coll. , 2013) sont sous- exprimés sous l'influence des CSM dans plusieurs modèles. L'augmentation de l'expression de l'IL-4 et l'IL-10 par les CSM suggère la transition des lymphocytes T vers un profil Th2 (Semedo et coll. , 2009). L'augmentation de la concentration de l'IL-10 a été rapportée dans des modèles de fibrose cutanée et rectale (Horton et coll. , 2013, Linard et coll. , 2013). L'effet anti-apoptotique des CSM participe également à la diminution de l'inflammation. Dans plusieurs modèles de fibrose, une diminution du nombre de cellules apoptotiques a été notée suite à la transplantation de CSM (Semedo et coll. , 2009, Zhang et coll. , 2011, Mohammadi Gorji et coll. , 2012, Song et coll. , 2013). Les CSM semblent donc protéger les cellules résidantes, limitant ainsi la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et améliorant la fonctionnalité du tissu. Ces résultats suggèrent la capacité des CSM à inhiber les processus physiopathologiques associés à la fibrose. Ces effets sont en partie induits par la réduction de l'inflammation chronique. Les résultats présentés ici suggèrent que les CSM agissent par différentes voies : (i) modification de la polarisation des cellules immunitaires (ii) diminution de l'expression des cytokines pro-inflammatoires (iii) augmentation de l'expression des cytokines anti-inflammatoires (iv) protection des cellules résidantes vis-à-vis de l'apoptose. Ces phénomènes contribuent à la modification du microenvironnement. Ces modifications permettent de diminuer la fibrose et de favoriser la régénération tissulaire. b. La voie TGF-1 Le TGF-1 est considéré comme l'un des acteurs majeurs de la fibrogénèse (Cf. TGF-1). L'activation de ses récepteurs induit l'activation d'une cascade de signalisation menant à la prolifération et l'activation des cellules pro-fibrosantes telles que les myofibroblastes. En particulier, 116 TGF-1 induit l'EMT et l'EndMT, en partie responsables de l'accumulation de cellules productrices de MEC. La voie de signalisation TGF-1 est l'une des principales cibles des thérapies anti-fibrosantes et l'influence des CSM sur son activation a donc été largement étudiée. Dans de nombreuses études, la transplantation de CSM induit la réduction de l'expression et de la concentration de TGF-1 (Fang et coll. , 2004, Zhao et coll. , 2008, Moodley et coll. , 2009, Semedo et coll. , 2009, Tsai et coll. , 2009, Lee et coll. , 2010, Bai et coll. , 2013, Horton et coll. , 2013, Linard et coll. , 2013, Ueno et coll. , 2013, Zhou et coll. , 2013, Jang et coll. , 2014, Wu et coll. , 2014). Le même effet a été obtenu en injectant des exosomes isolés de milieu de culture conditionné par les CSM (Li et coll. , 2013). Dans un modèle de co- culture de CSM et de cellules mésothéliales péritonéales, une étude a mis en évidence l'inhibition de la surexpression de TGF-1 induite par le glucose (Ueno et coll. , 2013). Cet effet était associé à la diminution de la phosphorylation de Smad2, également observée après injection d'exosomes dans un autre modèle (Li et coll. , 2013, Ueno et coll. , 2013). Dans le foie, la diminution de l'expression de TGF- 1 est corrélée à la diminution de la concentration en Smad3 phosphorylée, indiquant une réduction de l'activation des récepteurs à TGF-1 (Jang et coll. , 2014). La diminution de l'expression de -SMA (Mias et coll. , 2009, Semedo et coll. , 2009, Rabani et coll. , 2010, Asanuma et coll. , 2011, Pan et coll. , 2011, Ali et coll. , 2012, Bai et coll. , 2013, Ueno et coll. , 2013, da Silva et coll. , 2015, Li et coll. , 2015) et du nombre de cellules positives à -SMA (Tsai et coll. , 2009, Zhang et coll. , 2011, Alfarano et coll. , 2012, Wang et coll. , 2012, Zhou et coll. , 2013, Baulier et coll. , 2014, Wu et coll. , 2014, da Silva et coll. , 2015) suggère l'inhibition de la prolifération des myofibroblastes et, dans une moindre mesure, de l'EMT et l'EndMT induites par TGF-1. In vitro, la réduction de la concentration de -SMA dans un modèle de co-culture de CSM et de cellules rénales humaines prétraitées au TGF-1, montre un effet direct des CSM sur les changements phénotypiques menant à l'accumulation de cellules pro- fibrosantes (Alfarano et coll. , 2012). L'inhibition de l'expression et de la production de CTGF dans plusieurs modèles contribue également à cette propriété (Franquesa et coll. , 2012, Linard et coll. , 2013). Il est intéressant de noter que diverses études ont montré l'importance de HGF, sécrété par les CSM et responsable d'une partie significative de leur effet anti-fibrosant (Mias et coll. , 2009, Li et coll. , 2013, Ueno et coll. , 2013). Les CSM sur-exprimant HGF via un vecteur d'expression sont plus efficaces que les cellules non transfectées dans des modèles de fibrose pulmonaire et hépatique (Gazdhar et coll. , 2013, Seo et coll. , 2014, Lai et coll. , 2016). L'ajout de HGF recombinant a permis de reproduire partiellement les effets des CSM dans un modèle de co-culture de CSM et de cellules épithéliales tubulaires proximales traitées à l'albumine (Wu et coll. , 2014). L'inhibition de l'expression de TGF-1 par HGF et sa capacité à améliorer la dégradation du collagène via l'augmentation de la concentration en MMP-1 souligne également l'intérêt de ce facteur de croissance (Taniyama et coll. , 117 2002). En outre, l'augmentation de l'expression de p-Met, la forme phosphorylée de c-Met, le récepteur à HGF, révèle une augmentation de l'activation de ce récepteur (Tsai et coll. , 2009). Récemment, Qi et coll. ont mis en évidence l'importance de TSG-6 dans l'effet anti-fibrosant des CSM. En plus de supprimer la sécrétion de TNF- par les macrophages activés, cette protéine induit des modifications de la balance TGF-1/TGF-3, d'un ratio élevé pro-fibrosant vers un ratio faible anti- fibrosant (Qi et coll. , 2014). Ces résultats ont été confirmés dans un modèle in vitro dans lequel du TSG-6 recombinant a permis de reproduire partiellement les effets des CSM (Wu et coll. , 2014). Dans cette même étude, l'ajout d'un anticorps anti-HGF dans la co-culture a abolit en partie les effets des CSM. L'impact des CSM sur la voie de signalisation TGF-1 est un mécanisme important de leur effet anti-fibrosant. Notamment, l'inhibition de cette voie diminue l'activation et l'accumulation des cellules pro-fibrosantes. Les mécanismes à l'origine de cet effet sont mal connus mais des études ont permis de montrer deux voies d'inhibition, par HGF et TSG-6. c. Hypoxie/stress oxydant L'accumulation de MEC dans le tissu, la mort des cellules endothéliales et l'augmentation de la quantité de ROS et de RNS induisent des dommages accrus aux cellules résidantes lors de la fibrose. Ces phénomènes entrainent l'augmentation de l'apoptose au sein du tissu et l'activation de la réserve de TGF-1 latent. L'amélioration de la vascularisation du tissu et une neutralisation accrue des radicaux libres sont ainsi des cibles privilégiées des thérapies anti-fibrosantes. La capacité des CSM à diminuer le stress oxydant a été mise en évidence dans plusieurs travaux. Premièrement, elles semblent augmenter l'expression et la concentration des enzymes de neutralisation des radicaux libres, tels que NQO1 (NADPH Quinone Oxidoreductase 1), Gr (Glutathione reductase), GPx (Glutathione Peroxidase) et HO-1 (Heme Oxygenase 1) (Chen et coll. , 2011, Sun et coll. , 2011). L'activation de Nrf2 (Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2) protège du stress oxydant et induit la production de SOD (Superoxide Dismutase) responsable de la neutralisation des ROS. Dans le foie, la transplantation de CSM induit l'augmentation de la concentration en Nrf2 et SOD (SuperOxide Dismutase) et diminue ainsi la quantité de ROS (Francois et coll. , 2014, Ewida et coll. , 2016). Dans un modèle de co-culture, une augmentation de la survie des neurones cérébelleux a été corrélée à la sécrétion de SOD3 par les CSM (Kemp et coll. , 2010). 118 Les CSM favorisent également l'angiogenèse. Elles peuvent sécréter une large gamme de facteurs pro-angiogéniques, tels que VEGF, FGF-2 et MCP-1 (Kinnaird et coll. , 2004, Hung et coll. , 2007, Niu et coll. , 2008). Certaines études suggèrent la capacité des CSM à promouvoir la prolifération des cellules endothéliales (Kinnaird et coll. , 2004, Rehman et coll. , 2004). Après transplantation de CSM sur un modèle de fibrose pulmonaire, une amélioration de la microcirculation, associée à la diminution de l'expression de VEGF, a été observée (Wang et coll. , 2012). Une autre étude a montré la stimulation de l'angiogenèse par les CSM (Mias et coll. , 2009). La pose de feuilles de CSM sur le myocarde lésé a favorisé la néovascularisation dans un modèle d'infarctus du myocarde (Ishikane et coll. , 2013). Les auteurs ont mis en évidence la capacité des CSM à se différencier pour participer à la formation de nouveaux vaisseaux dans ce modèle. Inversement, l'augmentation de l'expression de VEGF après transplantation, concomitante à la surexpression de HIF-1 (Hypoxia-Inducible Factor-1), a été montrée dans le rein, indiquant une élévation de l'hypoxie (Ebrahimi et coll. , 2013). HIF-1 stimule l'expression de VEGF en conditions hypoxiques. De la même manière, dans un modèle de rectite radio-induite, la surexpression de VEGF était accompagnée d'une diminution de l'expression de l'angiopoïétine et de PDGF (Linard et coll. , 2013). Il semble que le défaut d'angiogenèse dans ces modèles soit à l'origine des variations observées. Ces profils d'expression génique sont probablement le reflet des signaux pro-angiogéniques produits par les CSM. L'évaluation de la vascularisation du tissu fibrosé permettrait de mieux caractériser l'effet des CSM sur l'angiogenèse dans ces modèles. Les CSM sont donc susceptibles d'agir par différentes voies sur l'hypoxie et le stress oxydant : (i) en améliorant la vascularisation (ii) en augmentant l'inactivation des ROS et RNS. Cette dernière propriété contribue également à l'inhibition de l'activation de TGF-1, dont la forme latente peut être clivée par les ROS. d. Remodelage matriciel La production excessive et le défaut de dégradation de la MEC sont les causes principales de la fibrose. En cas de fibrose l'objectif est de restaurer un processus de régénération non-pathologique en inhibant la production de MEC et en activant les systèmes de dégradation. En effet, le déséquilibre entre MMP (Matrix Metalloproteinases), responsables de la dégradation de la MEC, et TIMP (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases), leurs inhibiteurs, résulte en un remodelage anormal de la matrice, empêchant ainsi le retour à une matrice non-pathologique. 119 Une diminution de l'expression et de la concentration en collagène a été observée dans de nombreux modèles de fibrose après transplantation de CSM (Ortiz et coll. , 2003, Fang et coll. , 2004, Li et coll. , 2008, Zhao et coll. , 2008, Chang et coll. , 2009, Mias et coll. , 2009, Moodley et coll. , 2009, Semedo et coll. , 2009, Tsai et coll. , 2009, Rabani et coll. , 2010, Asanuma et coll. , 2011, Pan et coll. , 2011, Qiao et coll. , 2011, Zhang et coll. , 2011, Alfarano et coll. , 2012, Ali et coll. , 2012, Wang et coll. , 2012, Horton et coll. , 2013, Ishikane et coll. , 2013, Nasir et coll. , 2013, Song et coll. , 2013, Ueno et coll. , 2013, Baulier et coll. , 2014, da Silva et coll. , 2015, Moghadasali et coll. , 2015). Le même effet est obtenu par transplantation de microvésicules ou d'exosomes issus de cultures de CSM, ce qui suggère une action paracrine sur le remodelage matriciel (Li et coll. , 2013, Choi et coll. , 2014). Dans le foie, une étude a montré que cet effet est lié à l'activation de l'autophagie, probablement au niveau des myofibroblastes, par les CSM (Park et coll. , 2015). Des changements d'expression et de concentration des MMP et TIMP ont également été observés. Après transplantation, une augmentation de l'expression de MMP-2, MMP-9, MMP-13 et MMP-14 est induite in vivo (Semedo et coll. , 2009, Rabani et coll. , 2010, Wu et coll. , 2014). L'ajout de milieu de culture conditionné par les CSM dans une culture de fibroblastes cardiaques induit l'augmentation de l'activité de MMP-2 et MMP-9 (Mias et coll. , 2009). A l'opposé, plusieurs travaux ont montré une réduction de l'expression, de la concentration et de l'activité des MMP. Dans un modèle d'ischémie-reperfusion, la transplantation de CSM a entrainé une diminution de l'activité de MMP-2 (Alfarano et coll. , 2012). D'autres études ont montré une diminution de l'expression et de la concentration de MMP-2, MMP-9 and MMP-13 (Ortiz et coll. , 2003, Li et coll. , 2008, Ebrahimi et coll. , 2013). Cependant, ces variations semblent aboutir à un retour à des niveaux proches de ceux observés chez les animaux sains. Il semble que les CSM aient un effet inhibiteur sur l'expression des TIMP, en particulier TIMP- 1 (Semedo et coll. , 2009, Ali et coll. , 2012). Dans une autre étude, la production de l'ensemble des TIMP, 1 à 4, étaient réduite après traitement (Moodley et coll. , 2009). Dans un modèle in vitro, l'ajout de milieu conditionné par les CSM sur une culture de myofibroblastes cardiaques a induit la diminution de l'expression de TIMP-2 (Mias et coll. , 2009). Enfin, le calcul du ratio collagen-to-MMP-to-TIMP, indicateur de la tendance à l'accumulation/dégradation, a permis de démontrer une tendance à la dégradation suite à la transplantation de CSM dans un modèle d'irradiation rectale (Linard et coll. , 2013). L'expression des MMP et des TIMP est déséquilibrée au cours de la fibrose. La diminution de l'expression des TIMP est généralement associée à la résolution de la fibrose. Dans le cas d'un arrêt cardiaque, une augmentation de l'expression des MMP a été observée dans les phases initiales et 120 finales (Reinhardt et coll. , 2002, Vanhoutte et coll. , 2006). Dans le rein, l'augmentation de l'activité de MMP-2 est associée au remodelage pathologique de la matrice (Cheng et coll. , 2006). La diminution de l'activité de MMP-2 après transplantation de CSM suggère donc une transition vers un état non- pathologique. A l'inverse, MMP-2 est impliquée dans la régénération alvéolaire, ce qui expliquerait qu'une augmentation de son activité dans le poumon soit associée à un pronostic favorable (Yaguchi et coll. , 1998). En outre, étant donné que certaines MMP participent au clivage de la forme latent de TGF-1, la diminution de la concentration de ces enzymes pourrait limiter l'activation des myofibroblastes. Enfin, les macrophages étant les principaux producteurs de MMP et TIMP, une modification de leur polarisation sous l'influence des CSM expliquerait les variations exposées ci- dessus. Figure 28 : mécanismes d'action des CSM sur les modèles précliniques de fibrose La modulation du système MMP/TIMP, associée à la diminution de la surface de fibrose et de la production de composants de MEC (collagènes, fibronectine) indiquent une modification de la composition de la matrice. Il semble que la matrice nouvellement formée soit de composition proche 121 de celle observée au sein du tissu non lésé. Ainsi, les CSM améliorent la qualité de la MEC et favorisent la mise en place d'un microenvironnement propice à la régénération du tissu. e. Modalités de traitement par les CSM Bien que la transplantation de CSM permette de limiter la fibrose, il n'existe à l'heure actuelle que très peu d'études montrant une réversion complète de la pathologie. Des études ont donc été entreprises pour potentialiser l'effet des CSM selon différentes méthodes : - - - - - - La source de CSM Le timing d'injection La méthode et la voie d'administration Le prétraitement des CSM Le co-traitement avec une drogue anti-fibrosante La transplantation de CSM génétiquement modifiées Dans le cœur, la transplantation de CSM issues de la membrane fœtale ou de la moelle osseuse a produit les mêmes résultats sur un modèle d'infarctus du myocarde (Ishikane et coll. , 2013). Dans des modèles de fibrose pulmonaire ou de sclérose systémique, les CSM isolées de la moelle osseuse et du tissu adipeux ont également induit des résultats similaires (Fikry et coll. , 2015, Maria et coll. , 2016). Certaines procédures de prélèvement de tissu pour produire les CSM sont très invasives. Le prélèvement de moelle osseuse, par exemple, est une procédure douloureuse. L'utilisation de cellules d'origines différentes, telles que les cellules souches du tissu adipeux, améliore la disponibilité des cellules ainsi que l'impact sur la qualité de vie du donneur. Il est donc primordial de comparer l'efficacité de ces différentes sources. Il semble au vu de ces résultats que l'origine des CSM transplantées n'impacte pas le résultat du traitement. Ces données ont permis aux cliniciens de se tourner notamment vers le tissu adipeux pour ce type de procédures. L'état d'évolution de la fibrose au moment de la transplantation est également un facteur important à prendre en compte. Plusieurs études ont ainsi eu pour objet de comparer les effets des CSM en fonction du timing d'injection. Dans un modèle d'ischémie-reperfusion, la transplantation de CSM 7 jours après la lésion initiale est plus efficace sur le dépôt de MEC, la prolifération des myofibroblastes et l'activité des MMP que lorsqu'elle est réalisée 14 jours après (Alfarano et coll. , 2012). De même, les CSM exercent un effet plus important sur la fibrose pulmonaire lorsqu'elles sont transplantées précocement (Ortiz et coll. , 2003). 122 Récemment, de nouvelles méthodes d'administration ont été proposées afin d'améliorer l'efficacité des CSM en augmentant le nombre de cellules recrutées au niveau de la lésion et la durée de séjour de ces cellules dans le tissu. Des CSM cultivées en feuillets bicouches et transplantées directement sur le tissue lésé dans un modèle d'infarctus du myocarde sont retrouvées 28 jours après transplantation. Certaines de ces cellules présentaient des signes de différenciation et participaient ainsi à la néovascularisation (Ishikane et coll. , 2013). En général, la localisation des CSM au niveau de la lésion est transitoire et les cellules sont rarement retrouvées au-delà d'une semaine après transplantation. L'utilisation de biomatériaux ou de matrices permettant le maintien des CSM au site de transplantation améliore, de la même manière, leur efficacité (Le Visage et coll. , 2012, Ceccaldi et coll. , 2014). La microencapsulation des CSM est un autre procédé favorisant le maintien des cellules dans le tissu fibrosé. Au niveau du rein, des cellules ont été retrouvées jusqu'à 6 mois après transplantation grâce à cette méthode (Meier et coll. , 2015). Le prétraitement des CSM avant transplantation vise à augmenter la survie et l'efficacité des cellules, mais peut également servir à leur pré-différenciation vers un type cellulaire choisi en fonction de l'organe à traiter. Il a été montré que la mélatonine permet d'augmenter la survie des CSM après transplantation et d'améliorer leur effet pro-angiogénique (Mias et coll. , 2008, Yip et coll. , 2013). Les CSM traitées à la mélatonine produisaient de meilleurs effets que les cellules non traitées, comme le montrent la diminution du dépôt de MEC et de l'inflammation (Mias et coll. , 2009, Yip et coll. , 2013). Dans un modèle de fibrose hépatique, la pré-différenciation des CSM en hépatocytes par la baicaline offre une meilleure efficacité en termes de réduction de l'inflammation et du stress oxydant (Qiao et coll. , 2011). Enfin, le pré-conditionnement des CSM en atmosphère hypoxique a permis d'augmenter l'efficacité des CSM dans un modèle pulmonaire (Lan et coll. , 2015). Des méthodes de co-traitement associant CSM et drogues anti-fibrosantes ont été proposées lors d'études in vivo. L'administration d'atorvastatine, utilisé habituellement en prévention des infarctus du myocarde, en plus de la transplantation de CSM, dans un modèle d'infarctus aigu du myocarde, augmente la survie des CSM ainsi que leur efficacité (Song et coll. , 2013). Deux études, portant sur des modèles de fibrose rénale et des voies respiratoires, ont montré l'intérêt d'un co- traitement avec la serelaxine, actuellement à l'essai comme médicament vasodilatateur. Cette thérapie a permis de diminuer davantage l'infiltrat inflammatoire et l'étendue du dépôt de MEC. De plus, il a été observé que la serelaxine accroit la prolifération des CSM in vitro, ce qui pourrait favoriser la localisation d'un nombre de cellules plus élevé au niveau de la lésion (Huuskes et coll. , 2015, Royce et coll. , 2015). Enfin, l'administration de lisinopril, un antihypertenseur, potentialise l'effet des CSM dans un modèle de fibrose rénale. L'association des deux traitements a permis de diminuer l'infiltrat 123 de macrophages et l'apoptose au sein du tissu (Gregorini et coll. , 2016). L'exploitation de ces effets de synergie permet d'agir sur une gamme plus large de facteurs pro-fibrosant, et donc d'offrir une meilleure prise en charge des patients. Enfin, l'utilisation de CSM génétiquement modifiées permet d'augmenter la sécrétion de certains facteurs anti-fibrosant. La transplantation de CSM sur-exprimant HGF induit une diminution plus importante du dépôt de MEC que les CSM non modifiées dans un modèle de fibrose hépatique (Seo et coll. , 2014). Il en est de même lorsque des CSM sur-exprimant IGF-1, un facteur de croissance connu pour ses propriétés régénératives. Dans cette étude, les cellules modifiées ont produit un meilleur effet en terme de diminution du dépôt de matrice et de prolifération des myofibroblastes, et ce notamment par l'induction de la production de HGF au sein du tissu (Fiore et coll. , 2015). Des CSM modifiées pour exprimer la thiorédoxine-1, une enzyme antioxydante, permettent de réduire davantage le dépôt de MEC et d'améliorer la fonction cardiaque dans un modèle d'infarctus du myocarde (Suresh et coll. , 2015). L'utilisation de la thérapie cellulaire a ouvert de nombreuses questions techniques qu'il est nécessaire de traiter. En particulier, l'optimisation de l'effet du traitement permettrait de réduire les coûts d'hospitalisation en limitant la durée des séjours par la diminution du nombre d'injections de CSM. De plus, il est à l'heure actuelle rare d'observer une réversion du processus de fibrose, notamment dans ses phases les plus avancées. Les connaissances acquises sur le traitement médicamenteux de la fibrose ont permis de proposer des associations de thérapeutiques potentialisant l'effet des CSM. La localisation des CSM en nombre plus important et sur une plus longue durée au niveau du tissu fibrosé améliore leur effet. L'emploi de biomatériaux ou de microcapsules suscite donc un intérêt croissant. Ainsi, de nombreux paramètres, en plus de la quantité de cellules et du nombre d'injections, doivent être pris en compte lors de la mise en place d'un protocole de thérapie cellulaire. 124 Tableau 9 : voies d'action des CSM sur les modèles de fibrose précliniques Mode d'action Mécanisme Références Immunomodulation Diminution de l'infiltrat inflammatoire Linard et coll. , 2013 Changement de polarité des macrophages : M1 -> M2 Diminution de l'expression et de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (TNF-, IL-1, IL-6) Diminution de l'apoptose Zhou et coll. , 2013 Semedo et coll. , 2009 Horton et coll. , 2013 Inhibition de la voie TGF-1 Diminution de l'expression et de la Ueno et coll. , 2013 sécrétion de TGF-1 Diminution de l'activation de la voie Smad Diminution du nombre de myofibroblastes Augmentation de l'expression et de la sécrétion des enzymes antioxydantes (NQO1, HO-1, SOD) Effet pro-angiogénique : augmentation de VEGF et FGF-2 Augmentation de la prolifération des cellules endothéliales Diminution de l'expression et de la production des composants de la MEC Rééquilibrage de la balance MMP/TIMP Wu et coll. , 2014 Jang et coll. , 2014 Li et coll. , 2013 Chen et coll. , 2011 Kinnaird et coll. , 2004 Niu et coll. , 2008 Kinnaird et coll. , 2004 Moodley et coll. , 2009 Mias et coll. , 2009 Ebrahimi et coll. , 2013 Pro-angiogénique/anti-oxydant Remodelage matriciel f. HGF et TSG-6 participent à l'effet anti-fibrosant des CSM Les CSM produisent une large gamme de facteurs solubles responsables de leurs effets. L'étude de la littérature concernant l'effet des CSM sur la fibrose nous a permis d'identifier deux facteurs solubles participant à ces effets : HGF et TSG-6. i. HGF HGF est un facteur pléiotropique paracrine sécrété par les cellules mésenchymateuses, en particulier les hépatocytes, sous forme inactive (pro-HGF). Elle est activée par clivage protéolytique par différentes protéases : HGFA (HGF Activator), uPA (urokinase-type Plasminogen Activator), la kallikreine plasmatique, les facteurs de coagulation XI et XXI, TMPRSS13 (transmembrane protease serine S1 member 13), la matriptase et l'hepsine. Le récepteur à HGF, c-Met, est exprimé par les cellules épithéliales et endothéliales (Panganiban et Day). HGF active sa propre expression de manière autocrine (Liu, 2004). La transduction du signal HGF induit diverses réponses biologiques incluant la migration, la prolifération et la 125 morphogénèse (Rubin et coll. , 1993). Chez l'adulte, la fonction principale de HGF est la régénération tissulaire (Matsumoto et Nakamura, 1993). La voie HGF-Met permet la protection et la régénération dans différents tissus : rénal, pulmonaire, nerveux, cardiovasculaire, cutané et gastro-intestinal. L'activation de cette voie prévient l'inflammation et le développement de la fibrose dans le tissu (Nakamura et coll. ). L'expression de HGF est augmentée dans de nombreuses pathologies, notamment inflammatoires. Chez les patients souffrant de MICI, une concentration élevée de HGF est observée dans le sérum, associée à une augmentation de l'expression de HGF et c-Met dans la muqueuse (Srivastava et coll. , 2001). L'administration de HGF exerce un effet bénéfique sur des modèles animaux de rectocolite hémorragique (Tahara et coll. , 2003, Numata et coll. , 2005). Cette amélioration est caractérisée par une régénération épithéliale accrue permettant de limiter la perte de poids associée à cette pathologie. Il semble que les propriétés immunosuppressives de HGF soient à l'origine de ses effets anti-fibrosantes et régénératifs. L'expression faible de HGF au cours de la fibrose dans de nombreux tissus (poumon, rein, cœur) pourrait expliquer en partie l'impossibilité de régénérer le tissu (Taniyama et coll. , 2000, Yang et coll. , 2002, Marchand-Adam et coll. , 2003). Effet immunosuppresseur La voie HGF/c-Met est impliquée dans l'hématopoïèse et l'immunité. HGF exerce une action immunomodulatrice en diminuant l'infiltration des cellules inflammatoires et en inhibant l'expression de plusieurs cytokines pro-inflammatoires (TNF-, IFN-, MCP-1 et IL-12). Le fait que l'expression de HGF soit augmentée par les cytokines pro-inflammatoires IL-1, IL-1, TNF- et IFN- supporte ce rôle anti-inflammatoire (Matsumoto et coll. , 1992). De même, l'expression de HGF est inhibée par les composés anti-inflammatoires, tels que la dexaméthasone et le TGF-1 (Takai et coll. , 1997). Dans le compartiment hématopoïétique, c-Met est exprimé par les cellules B, monocytes/macrophages et cellules dendritiques, ainsi que par leurs progéniteurs (Molnarfi et coll. , 2015). Ainsi, l'axe HGF/c-Met est notamment impliqué dans l'activation des monocytes/macrophages, le homing des lymphocytes B et la modulation de la fonction des cellules dendritiques. 126 Monocytes/macrophages HGF intervient dans la régulation de la fonction des monocytes/macrophages. Ainsi, une augmentation de l'expression de c-Met a été observée dans les monocytes activés (Beilmann et coll. , 1997). La sécrétion de HGF par les macrophages suggère également la possibilité d'un effet autocrine (Yamada et coll. , 1998). HGF induit la migration ainsi que la production de cytokines telles que IL-4, IL- 1, M-CSF et GM-CSF par les monocytes (Beilmann et coll. , 2000). HGF semble produire un effet différent selon la polarisation des macrophages. L'activation de c-Met stimule la prolifération des macrophages classiquement activés (Moransard et coll. , 2010). En revanche, des études suggèrent l'inhibition de l'activation des macrophages vers la polarisation M1. En effet, HGF supprime l'expression de RANTES induite par NF-B (Nuclear Factor-kappa B) (Giannopoulou et coll. , 2008). Cet effet résulte de la phosphorylation et l'inactivation de GSK-3 (Glycogen Synthase Kinase-3) induits par l'activation de la voie PI3K/Akt. Giannopoulou et coll. rapportent que cette action est produite au niveau transcriptionnel, aucune différence n'ayant été observée dans la phosphorylation et la dégradation de IB, ni dans la phosphorylation et la translocation nucléaire de p65 NF-B, nécessaires à l'activation des cibles de NF-B (Giannopoulou et coll. , 2008). A l'inverse, Bendinelli et coll. attribuent l'inhibition de la voie NF-B à une augmentation de l'expression de IB, favorisant ainsi le maintien de p65 dans le cytoplasme (Bendinelli et coll. , 2010). L'inhibition de RANTES, impliqué notamment dans le recrutement des leucocytes (cellules T, éosinophiles, basophiles), supporte l'effet anti-inflammatoire de HGF. D'autre part, la suppression de l'activation de p65 pourrait limiter l'acquisition de la polarité M1 par les macrophages. Cellules dendritiques HGF intervient dans le recrutement et la régulation de la fonction des cellules dendritiques. La suppression de la voie HGF/c-Met inhibe le recrutement des cellules dendritiques dans différents organes (Scarpino et coll. , 2000, Baek et coll. , 2012). Chez la souris, HGF inhibe l'activation des cellules dendritiques (Singhal et Sen, 2011) ou induit une activité suppressive favorisant la tolérogénicité, notamment par la promotion de la réponse T régulatrice (Benkhoucha et coll. , 2010). HGF induit la production de l'IL-10 par les cellules dendritiques et une action autocrine d'inhibition de leurs fonctions (Rutella et coll. , 2006). L'activation de la voie PI3K/Akt par HGF participe à la régulation de la fonction des cellules dendritiques (Singhal et coll. , 2011) en supprimant l'activation de NF-B. 127 Autres cellules immunitaires L'effet de HGF sur les cellules T est mal connu. Dans une culture de thymus fœtal de souris, HGF induit une augmentation du nombre de lymphocytes T matures (Tamura et coll. , 1998). L'expression de c-Met est élevée dans le thymus fœtal de 14 jours et à la naissance et chute à 1 semaine, suggérant un rôle de HGF lors du développement de certains organes lymphoïdes (Tamura et coll. , 1998) ainsi que dans l'adhésion et la migration des lymphocytes T mémoire (Adams et coll. , 1994). Chez la souris, le traitement du thymus par HGF améliore la maturation des lymphocytes T. L'implication de HGF dans la régulation de la fonction des cellules B est mise en évidence par l'augmentation de la production d'anticorps dans une culture de splénocytes murins traités par HGF (Delaney et coll. , 1993). Il semble que HGF sécrété par les cellules souches folliculaires régule la croissance, la survie et l'adhésion des lymphocytes B ainsi que leurs interactions avec le stroma (Molnarfi et coll. , 2015). HGF augmente la production de ROS chez les neutrophiles (Jiang et coll. , 1992). Il stimule l'adhésion des neutrophiles aux cellules endothéliales et leur transmigration par un mécanisme dépendant de la voie PI3K/Akt (Mine et coll. , 1998). Les neutrophiles produisent HGF dans un contexte inflammatoire. Ce mécanisme pourrait participer au recrutement de nouveaux neutrophiles et donc à la perpétuation de l'inflammation et/ou à la régénération du tissu. Il existe peu de données sur le rôle de HGF sur la fonction des cellules NK. Chez le rat, l'administration de HGF réduit l'activité cytotoxique des NK (Francavilla et coll. , 1997). Voie TGF-1/Smad Suite à une lésion, l'expression de TGF-1 et HGF sont induites afin de supporter la réparation et la régénération tissulaire. HGF et TGF-1 inhibent leur expression respective, suggérant une régulation réciproque nécessaire à la résolution de la lésion. HGF inhibe l'activation des fibroblastes interstitiels en myofibroblastes en bloquant la translocation de Smad-2/3 activé vers le noyau (Yang et coll. , 2003). Dans les cellules mésangiales, il stabilise et induit l'expression du corépresseur transcriptionnel de Smad-2/3, TGIF (Transforming Growth Interacting Factor), qui agit en formant un complexe inactif avec Smad-2/3 et bloque l'expression de -SMA induite par TGF-1 (Dai et Liu, 2004). Dans les cellules épithéliales tubulaires, il bloque l'EMT en induisant la surexpression de SnoN, corépresseur transcriptionnel formant un 128 complexe inactif avec Smad-2/3 (Liu, 2004, Yang et coll. , 2005). L'inhibition de la voie TGF-/Smad permet de limiter l'expression des composants de la MEC, tels que le collagène et la fibronectine (Mizuno et Nakamura, 2004). Cet effet dépend de l'inhibition de l'induction de l'ILK (Integrin-Linked Kinase) par TGF-1. Figure 29 : mécanismes d'action du HGF (D'après Gallo et coll. , 2015) (Gallo et coll. , 2015) Effet anti/pro-apoptotique HGF inhibe l'apoptose dans différents types cellulaires, dont les cellules épithéliales (Liu, 1999) et musculaires (Kitta et coll. , 2003). Cet effet dépend de deux mécanismes complémentaires. D'une part, l'activation de la voie PI3K/Akt induit l'inhibition de l'expression du facteur pro-apoptotique BAD (Bcl-2-Associated Death promoter) (Liu, 1999). D'autre part, l'activation de ERK 1/2 induit la phosphorylation de GATA-4, favorisant ainsi l'expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-xL (Kitta et coll. , 2003). A l'inverse, HGF peut induire l'apoptose des myofibroblastes par un effet dépendant des MMP. Au cours de la fibrose pulmonaire, l'administration de HGF induit l'augmentation de l'activité de MMP- 2 et MMP-9, résultant en une augmentation de la dégradation de la fibronectine et de l'apoptose des myofibroblastes. L'inhibition des MMP induit un effet opposé (Mizuno et coll. , 2005). Cet effet est en 129 accord avec les mécanismes de progression de la fibrose, étant donné la nécessité de l'ancrage à la fibronectine pour la différenciation des myofibroblastes. ii. TSG-6 Le TSG-6 ou tnfaip6 (TNF-induced protein 6) est une protéine de 35 kDa originellement identifiée dans une culture de fibroblastes humains traités au TNF-. Il est composé de deux domaines, Link et CUB, possédant des propriétés distinctes. Il est sécrété dans de nombreux tissus en réponse à des médiateurs de l'inflammation, majoritairement le TNF-. Il est donc détectée dans les cas de pathologies inflammatoires (Wisniewski et Vilcek, 2004). Il est également détecté dans les situations de remodelage de la MEC. Le TSG-6 interagit avec une grande variété de glycosaminoglycanes (GAG) et de ligands protéiques dont la hyaluronane (HA), la chondroïtine-4-sulfate (C4S), l'héparine, II (inter-inhibitor), la versicane, l'agrécane, la thrombospondine-1 (TSP1) et la pentaxine-3 (PTX3 ou TSG-14) (Milner et coll. , 2006). Le TSG-6 n'est pas exprimé en conditions physiologiques à l'âge adulte mais son expression peut être induite dans de nombreux types cellulaires, dont les CSM, par des médiateurs de l'inflammation tels que l'IL-1, le TNF-, les LPS et le PGE2 (Getting et coll. , 2002). TSG-6 et hyaluronane Le TSG-6 possède plusieurs activités anti-inflammatoires distinctes, notamment par son interaction avec la HA. La HA possède des propriétés immunomodulatrices différentes en fonction de son poids moléculaire. Les polymères de HA de haut poids moléculaire peuvent par exemple favoriser l'effet suppresseur des cellules T régulatrices (Bollyky et coll. , 2007). A l'inverse, la HA de faible poids moléculaire est considérée comme pro-inflammatoire, en particulier par sa capacité à activer CD44, TLR2 et TLR4 (Stern et coll. , 2006). Une autre propriété intéressante de TSG-6 est sa capacité à transférer une chaine lourde de II (Inter-Inhibitor) sur HA (Sanggaard et coll. ). Ce mécanisme confère à la HA de haut poids moléculaire des caractéristiques pro-inflammatoires par la formation de câbles de HA adhérents aux leucocytes (Albeiroti et coll. , 2015). Wisniewski et al ont observé une inhibition de la plasmine 100 fois plus importante en présence du complexe TSG-6/II qu'avec II seul (Wisniewski et coll. , 1996). Glant et coll. ont suggéré que l'inhibition de la plasmine et d'autres sérines protéases par TSG-6 permettrait d'inhiber l'activation des MMP (Glant et coll. , 2002). Ces interactions entre TSG-6 et HA sont à l'origine de l'augmentation de l'adhésion des leucocytes au niveau des voies aériennes chez les patients 130 asthmatiques ou dans le fluide synovial au cours de l'arthrite rhumatoïde (Abbadi et coll. , 2016). L'exposition aux allergènes augmente l'expression de TSG-6 par les cellules épithéliales des voies aériennes (Lilly et coll. , 2005). La présence de HA de haut PM est également due à la capacité de HA à induire la formation d'oligomères de TSG-6 se liant ensuite aux fragments de HA pour les interconnecter et former ainsi un réseau (Baranova et coll. ). Initialement, l'implication de HA dans la fibrose a été suggérée par l'augmentation de sa concentration dans le fluide de lavage bronchoalvéolaire de patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique (Bjermer et coll. , 1989). Il a été par la suite démontré que le TGF- stimule la production de HA dans différentes populations de fibroblastes (peau, poumon) (Dubaybo et Thet, 1990, Ellis et Schor, 1996). D'autres facteurs pro-fibrosant, dont PDGF, EGF et FGF-2 induisent des effets similaires (Heldin et coll. , 1989). D'autre part, après une lésion rénale, l'inhibition de la production de HA réduit significativement la fibrose (Kato et coll. , 2011). TSG-6 et fibrose Il semble que l'activation de la voie MAPK par le TGF- soit à l'origine de la surexpression et de l'augmentation de l'activité de la Hyaluronan Synthase (HAS) responsable de la formation de la HA (Stuhlmeier et Pollaschek, 2004). HA promeut la migration et le recrutement des fibroblastes et macrophages par l'activation du récepteur RHAMM (HA-Mediated Motility receptor) (Tolg et coll. , 2012), participant ainsi à l'inflammation et à la fibrogénèse. Cet effet est supprimé par le blocage de CD44 (Ito et coll. , 2004), suggérant la nécessité de l'interaction de HA avec les deux récepteurs pour activer la migration. HA participe à la stimulation de la différenciation myofibroblastique. L'inhibition de la production de HA entraine la suppression de la surexpression de -SMA induite par le TGF- (Kato et coll. , 2011). De plus, la concentration en HA semble déterminante dans l'effet du TGF- sur la prolifération des fibroblastes. Le TGF- stimule la prolifération des fibroblastes dermiques, qui expriment des niveaux élevés de HA. A l'inverse, il inhibe la prolifération des fibroblastes oraux, produisant de faibles quantités de HA (Meran et coll. , 2008). Ce mécanisme dépend de l'expression de CD44 ainsi que de son interaction avec EGFR. L'implication de HA/CD44/EGFR est également nécessaire à la différenciation myofibroblastique des fibroblastes (Midgley et coll. , 2013). Certaines études mettent en évidence un effet opposé de HA. Dans le poumon, Evanko et coll. ont montré que l'inhibition de la synthèse de HA, ou la perturbation des interactions HA-MEC, induisaient une augmentation du dépôt de collagène et de fibronectine ainsi que de l'expression de - 131 SMA (Evanko et coll. , 2015). D'autre part, en inhibant l'activation des MMP, TSG-6 pourrait favoriser l'augmentation du dépôt de matrice au sein du tissu (Glant et coll. , 2002). Dans un modèle d'inflammation du mésentère chez la souris, Cao et coll. ont observé l'inhibition des interactions entre leucocytes et cellules endothéliales sous l'effet de TSG-6 (Cao et coll. , 2004). Plus particulièrement, le module Link de TSG-6 interviendrait en inhibant l'adhésion, le roulement et la diapédèse des leucocytes vis-à-vis de l'endothélium. Cette hypothèse est confortée par l'inhibition de la migration des neutrophiles par le module Link de TSG-6, indépendamment de HA (Getting et coll. , 2002). TSG-6 et macrophages Choi et coll. ont étudié l'interaction de TSG-6 avec CD44 exprimé par les macrophages dans un modèle de péritonite induite par le zymosane. Les résultats de cette étude indiquent que la fixation de TSG-6 sur CD44 inhibe la voie de signalisation NF-B induite par l'activation de TLR2 par le zymosane (Figure 30). Cet effet de TSG-6 permet de limiter l'activation des macrophages en M1 au profit de la polarisation M2. La diminution de la concentration TNF- dans le tissu induit une inhibition de l'activation des cellules mésothéliales qui en retour sous-expriment IL-6, IL-8 et CCL2 (Choi et coll. , 2011). A l'inverse, les polymères de HA de faible PM sont capables d'activer NF-B en stimulant CD44 et TLR2 (Hanabayashi et coll. , 2016) et pourrait ainsi favoriser la polarisation M1 des macrophages. Figure 30 : mécanisme d'action du TSG-6 sur les macrophages (D'après Choi et coll. , 2011) (Choi et coll. , 2011) 132 TSG-6 et CSM Le TSG-6 constitue un candidat intéressant dans les méthodes de thérapie cellulaire par les CSM. Dans un modèle de dommage à la cornée induit par un traitement à l'éthanol absolu et l'excision de l'épithélium de la cornée et du limbe, Roddy et coll. ont montré que les CSM exerçaient un effet anti-inflammatoire matérialisé notamment par la diminution de l'infiltration des neutrophiles et de l'expression de cytokines pro-inflammatoires (IL-1, CCL2 et CCL3). Un jour et 3 jours après injection, les CSM n'étaient pas détectable dans la cornée des animaux traités, indiquant un effet à distance. L'injection de TSG-6 recombinant a permis d'obtenir un effet proche de celui obtenu avec les CSM et le traitement des CSM par un siRNA contre le TSG-6 a fortement limité leur effet. Ces résultats indiquent que la sécrétion de TSG-6 par les CSM constitue un facteur majeur dans leur effet anti- inflammatoire et leur permet d'agir à distance lorsqu'elles ne sont pas localisées dans le tissu atteint (Roddy et coll. , 2011). Figure 31 : mécanismes d'action supposés du TSG-6 sur la fibrose 133 Cependant, les propriétés pro-inflammatoires du HA doivent être prises en considération. En effet, il semble que le TSG-6 ne puisse exercer son action anti-inflammatoire qu'en l'absence de formation de complexe avec II et la HA. De tels complexes peuvent en effet induire l'activation de CD44, notamment au niveau des fibroblastes, et activer la différenciation des myofibroblastes. L'état du HA dans le tissu (faible ou haut PM, lié à la MEC ou non) semble donc déterminant dans l'effet de TSG-6. 2. Essais cliniques de traitement de la fibrose par les CSM Près de 100 essais cliniques sont actuellement enregistrés pour l'évaluation de l'effet des CSM sur la fibrose ( La fibrose du foie et du poumon sont les plus représentées du fait de leur incidence et de la migration préférentielle des CSM vers ces organes. Des essais cliniques sur le rein, le cœur, les cordes vocales, la mucoviscidose, entre autres, sont également en cours. Dans la plupart de ces études, seule la fonctionnalité de l'organe est évaluée et non des marqueurs de la fibrose. Ainsi, il est difficile de déterminer si les effets bénéfiques observés après transplantation de CSM sont dus à la suppression de la fibrose ou à l'amélioration d'autres paramètres. Les CSM dérivées de moelle osseuse améliorent la fonction hépatique chez les patients atteints de cirrhose, comme démontré lors de plusieurs essais cliniques de phase I (Mohamadnejad et coll. , 2007, Kharaziha et coll. , 2009, Zhang et coll. , 2012). Le score du Model for End-stage Liver Disease (MELD) permet d'évaluer le risque de mortalité pour les patients souffrant d'insuffisance hépatique en phase terminale (Kamath et coll. , 2001). Les CSM induisent des modifications résultant en la diminution de ce score, comparé au placebo. Dans le cas de la cirrhose décompensée, les CSM améliorent significativement la qualité de vie, comme indiqué par l'augmentation des résultats sur les échelles physiques et mentales (Mohamadnejad et coll. , 2007) ainsi que du questionnaire SF-36 sur la qualité de vie (Ware et Sherbourne, 1992). Les CSM prédifférenciées en hépatocytes avant transplantation améliorent la fonction hépatique chez les patients atteints d'insuffisance hépatique (Kharaziha et coll. , 2009). Durant un autre essai de phase I, les marqueurs de fibrose ont été mesurés chez 30 patients atteints de cirrhose (Zhang et coll. , 2012). La laminine, l'acide hyaluronique et le collagène de type IV étaient significativement réduits 48 semaines après intervention. Chez ces patients, la fonction hépatique était améliorée. Ces résultats peuvent en partie être expliqués par l'augmentation de la concentration en HGF dans le sérum des individus traités. 134 Un essai de phase I a montré la capacité des CSM à réduire l'allogreffe après transplantation rénale (Reinders et coll. , 2013). Cet effet est associé aux propriétés immunomodulatrices des CSM ainsi qu'à leur capacité, dans ce cas, à prévenir l'apparition de fibrose interstitielle. L'absence de placébo lors de cet essai empêche l'identification des effets spécifiques des CSM. Il est donc nécessaire de récolter plus de données sur ce type de thérapie. La thérapie cellulaire par les CSM est également efficace sur les complications des infarctus aigus du myocarde (Hare et coll. , 2009, Hare et coll. , 2012). Dans un premier essai, les tests fonctionnels ont montré une amélioration des fonctions cardiaques et pulmonaires. Les signes de remodelage matriciel observés après transplantation lors de cette étude suggèrent l'inhibition de la fibrogénèse par les CSM (Saito et coll. , 2010). 6 mois après traitement, les scores symptomatiques globaux étaient significativement meilleurs chez les patients transplantés, comparés au groupe placebo (Hare et coll. , 2009). Lors du second essai, les CSM ont induit une diminution des symptômes associés à la cardiomyopathie ischémique. Les signes de remodelage reverse et de diminution de la taille de l'infarctus suggèrent la suppression de la fibrogénèse (Hare et coll. , 2012). Quatre patients sur-irradiés d'Épinal ont bénéficié de transplantations de CSM suite à un accident de radiothérapie du cancer de la prostate. L'administration de CSM a permis de diminuer les saignements, la fréquence des diarrhées et la douleur (Chapel et coll. , 2013). Ces résultats soulignent le potentiel des CSM à limiter les effets secondaires des radiothérapies et, possiblement, la fibrose radio-induite. Les résultats de ces études cliniques démontrent l'innocuité et l'efficacité de la thérapie par les CSM sur les patients atteints de pathologies fibrosantes. Aucun effet secondaire n'a été observé, si ce n'est des fièvres sans gravité. Il est néanmoins nécessaire de réaliser des études cliniques randomisées sur de plus grands effectifs pour démontrer le potentiel anti-fibrosant des CSM. De plus, les mécanismes mis en place par les CSM doivent être élucidés pour permettre leur utilisation en routine. 135 136 Problématique et objectifs Le cancer est l'une des principales causes de mortalité dans le monde, et son incidence a fortement augmenté au cours des 30 dernières années. L'amélioration des méthodes de diagnostic et de traitement des tumeurs a permis d'augmenter la survie des patients de manière significative. Néanmoins, les traitements anti-cancéreux actuels peuvent induire des effets secondaires lourds. En particulier, la radiothérapie provoque des dommages aux tissus sains environnant la tumeur, qui peuvent entrainer des complications jusqu'à plusieurs dizaines d'années après la fin du traitement. La sphère abdomino-pelvienne est le foyer de cancer le plus fréquent, et contient plusieurs organes à risque lors de la radiothérapie. Le côlon et le rectum sont particulièrement radiosensibles et concentrent une part importante des complications des radiothérapies abdomino-pelviennes. La principale séquelle tardive des radiothérapies est la fibrose, pour laquelle il n'existe pas de traitement efficace. La thérapie cellulaire par transplantation de CSM, cellules aux propriétés immunomodulatrices et régénératives démontrées, semble être une alternative prometteuse aux traitements actuellement proposés aux patients souffrant de complications tardives des radiothérapies. Des études précliniques et cliniques ont permis de montrer l'efficacité des CSM dans le contexte de brûlures radiologiques ou au cours de pathologies fibrotiques. Il reste cependant des interrogations sur l'innocuité de ce type de traitement, en particulier concernant le potentiel CSM à promouvoir la croissance tumorale ainsi que les mécanismes inducteurs des effets secondaires tardifs des radiothérapies. En outre, il existe peu de données sur l'effet des CSM sur la fibrose colorectale radio-induite. Les travaux réalisés au sein de notre laboratoire ont montré un effet bénéfique de la transplantation de CSM sur différents modèles animaux de lésions radio-induites au côlon et au rectum. Les travaux présentés dans la suite de ce manuscrit se sont articulés selon deux axes principaux : - L'effet des CSM sur l'évolution de la tumorigénèse colorectale, avant et après radiothérapie et mettre en évidence les mécanismes d'action de ces CSM sur la tumeur dans un modèle de carcinogénèse colorectale chimio-induite chez le rat. - L'effet des CSM sur les complications tardives des radiothérapies abdomino- pelviennes, en particulier sur la fibrose colorectale sur un modèle d'irradiation colorectale en dose unique, également chez le rat. 137 138 : Mesenchymal Article 1 stem cell administration inhibits colorectal cancer progression survival : mechanism of action and rationale for clinical use and promotes Le nombre de cancer dans le monde atteindra 20 millions en 2025 et 60% seront traité par radiothérapie. Cependant 5% des patients développeront des séquelles tardives graves. Pour ces patients le traitement demeure limité à un management des symptômes, c'est pourquoi de nouvelles alternatives doivent-être proposées. L'administration de CSM a démontré son efficacité dans le traitement des lésions intestinales similaires à celles rencontrées dans les complications chroniques sévères des radiothérapies abdomino-pelviennes. Une méta-analyse sur 36 essais cliniques utilisant des CSM n'a pas montré d'effet secondaire cependant de nombreux essais précliniques ont montré la dualité des CSM qui possèdent à la fois des propriétés pro et anti-tumorales. Ces résultats sont hautement dépendant des modèles utilisés. Dans le cadre du traitement des complications sévères des radiothérapies pelviennes nous nous sommes intéressés aux effets secondaires que pourraient induire un traitement par les CSM notamment au niveau du cancer colorectal. Afin de répondre à cette question nous avons développé chez le rat un modèle de cancérogénèse colorectale similaire à celle de l'homme et étudié l'influence de la transplantation de CSM sur l'évolution de cette cancérogénèse. Dans un second temps après avoir généré des tumeurs, les animaux ont subi une stérilisation tumorale par radiothérapie. Deux semaines plus tard les animaux ont reçu trois injections de CSM. L'influence des CSM a été étudiée à la fois sur la tumorisation et sur la réparation du tissu sain irradié. Le traitement local par un agent alkylant (MNNG) induit des lésions de la muqueuse dans les premières semaines suivi de l'apparition d'adénomes à 32 semaines et d'adénocarcinomes à 52 semaines. L'injection de CSM dans les premières semaines permet de diminuer les lésions principalement par une régulation de l'inflammation. La conséquence est une diminution de l'initiation de la cancérogénèse colorectale, cela se traduit par un nombre moins important de tumeur chez les animaux ayant reçu un traitement par les CSM. A des temps plus tardif les CSM inhibent le développement de la cancérogénèse colorectale en modifiant le microenvironnement tumoral au 139 niveau de la composante inflammatoire. À terme le traitement par les CSM permet d'augmenter la survie des animaux. Après radiothérapie une diminution du nombre et de la taille des tumeurs est observée Ce phénomène est accrut par l'injection de CSM après irradiation. Une modification immunitaire dans l'environnement tumoral a été observée notamment par une augmentation du phénotype Th1 des lymphocytes CD3 . Au niveau du tissu sain irradié la transplantation de CSM permet une protection du colon impliquant une sécrétion locale d'HGF, VEGF et TFF3. Au final, la transplantation de CSM permet l'accroissement notable de la survie. Il existe un antagonisme entre la présence très transitoire des CSM exogènes et leur effet durable sur la cancérogénèse colique que ce soit avec ou sans radiothérapie. Ce phénomène pourrait être expliqué par une reprogrammation durable des CSM résidentes et des macrophages endogènes. L'ensemble de ces résultats suggèrent que les CSM modulent durablement l'environnement immunitaire tumoral. La conséquence est une inhibition de la progression du cancer colorectal ainsi qu'une protection du tissu sain des séquelles des radiothérapies. Cette étude a permis de s'assurer que l'utilisation des CSM pour le traitement des complications chroniques sévères des radiothérapies abdomino-pelviennes est sans effet secondaire en ce qui concerne la tumorisation et est un traitement prometteur des complications chroniques sévères des radiothérapies abdomino-pelviennes. 140 Reprogramming by Mesenchymal Stem Cells Inhibits Colorectal Cancer Progression and Preserves Tissue Integrity after Radiotherapy *Sabine François1, 2, 3, *Benoit Usunier1, Marie-Elisabeth Forgue-Lafitte4, 5, Thi Cam Ha Che5, Bruno L'Homme1, Sandrine Bouchet2, Fahd Hached3, 4, Djaber Benaoumeur3, 4, Marc Benderitter1, Luc Douay2, 3, 6, Norbert-Claude Gorin2, 3, 6, *Annette K. Larsen4, 5, *Alain Chapel1, 2, 3 1Laboratory of Research on Irradiated Healthy Tissues Regeneration (LR2I), Institute for Radiological Protection and Nuclear Safety (IRSN), F-92260 Fontenay-aux-Roses, France 2Proliferation and Differentiation of Stem Cells, Centre de Recherche Saint-Antoine (CRSA), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) U938, Paris, France 3Université Pierre et Marie Curie (UPMC), Sorbonne Universités, F-75012 Paris, France 4Cancer Biology and Therapeutics, Centre de Recherche Saint-Antoine (CRSA), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) U938, Paris, France 4Institut Universitaire de Cancérologie (IUC), Université Pierre et Marie Curie (UPMC), Sorbonne Universités, F75012 France 5Service d'Hématologie Biologique, Hôpital Saint-Antoine/Armand Trousseau, AP-HP, F-75012 Paris, France 6Service d'Hématologie Clinique et Thérapie Cellulaire, Hôpital Saint-Antoine, AP-HP, F-75012 Paris, France * SF and BU should be considered as joint first author 141 * AKL and AC should be considered as joint last author Running title MSC-mediated reprogramming attenuates carcinogenesis Keywords Mesenchymal stem cells, colorectal cancer, tumor microenvironment, reprogramming of immune cells, pelvic radiation disease, radiotherapy, cell therapy, tissue integrity. Contact information : Lead Contact : Alain Chapel IRSN, PRP-HOM/SRBE/LR2I BP-17, 92262 Fontenay-aux-Roses CEDEX, FRANCE Tel : 33 1 58 35 95 46 ; Fax : 33 1 58 35 84 67 ; E-mail : alain. chapel@irsn. fr Second corresponding author : Annette K Larsen Centre de Recherche Saint-Antoine (CRSA), 184 rue du Faubourg Saint Antoine 75571 PARIS Cédex 12 France Tel : 33 1 49 28 46 87 ; E-mail : Annette. Larsen@upmc. fr 142 Conflicts of interest The authors declare no conflict of interest. Abstract word count : 120 words Manuscript word count : 8866 words Characters (including spaces, title, author list, affiliation, summary, main text, experimental procedures, acknowledgments, figure legends, and references) : 59001 Number of figures and tables : 7 figures SUMMARY Administration of mesenchymal stem cells (MSCs) to limit tissue damage has proved safe and efficient in cancer patients following radiation overdose. To establish the long-term effects of MSCs on residual tumor cells, we evaluated the influence of MSCs in an immunocompetent rat model of colorectal cancer (CRC) with or without radiotherapy. MSCs alone attenuated tumor progression. Combined with radiotherapy, MSCs limited tumor size and prolonged survival. Importantly, MSCs modified the immune component of the tumor microenvironment with an increase in CD3 cells with a Th1/Treg phenotype and a decrease in CD68 macrophages. This effect was mediated by reprogramming of resident MSC and immune cells. Our findings indicate that MSC administration limits radiation damage and attenuates growth of residual tumor cells. 143 Highlights - MSC administration attenuates colorectal carcinogenesis in animal models - MSC administration attenuates tumor infiltration and is accompanied by sustained alterations of the local immune profile - MSC administration prevents the deleterious effects of radiation therapy on healthy tissues and reduces the development of residual tumor cells Significance Radiotherapy can be accompanied by substantial normal tissue damage. Although mesenchymal stem cells (MSCs) have been used to alleviate radiation damage, uncertainly remains regarding their potential to support growth of residual tumor cells. We here show that administration of MSCs attenuates colorectal cancer progression in immunocompetent animals in the absence or presence of radiotherapy. Although only transiently present in the colon tissue of treated animals, exogenous MSCs were able to modify the immune profile of the tumor microenvironment almost one year after the last MSC administration, most likely due to reprogramming of resident MSCs and immune cells. These results suggest that administration of MSCs would be a safe and innovative therapeutic option to heal normal tissue following cancer radiotherapy. 144tissue irradiatedResidual tumor INTRODUCTION The worldwide number of cancer patients is expected to increase from 14 million in 2012 to more than 19 million in 2025 ( Sixty percent of all cancer patients receive radiation therapy which is accompanied by detrimental local lesions in about 5% of patients. In particular, pelvic radiation disease (PRD) remains a major side effect (Andreyev et al. , 2010). The current treatment is limited to managing the symptoms ; therefore new strategies are warranted (Benderitter et al. , 2014). No side effects of mesenchymal stem cells (MSCs) were reported in a meta-analysis of 36 clinical trials representing more than 1000 patients (Lalu et al. , 2012). However, preclinical tumor models with exogenous administration of MSCs have resulted in conflicting results concerning their ability to support or inhibit tumor development (Lee et al. 2012). Depending on the experiment, it has been suggested that MSCs either inhibit or increase immunity, angiogenesis and apoptosis. Importantly, most of these studies have used mice deficient in T lymphocytes (Zhao et al. , 2010) although these cells are important MSC targets for modulation of the tumor microenvironment (Lazennec et al. 2010). In order to evaluate the interest of MSC administration to prevent pelvic radiation disease after cancer radiotherapy, an immunocompetent animal model representative of human cancer development and treatment is needed to address essential questions about mechanism, safety and efficacy. We here show that MSC administration to immunocompetent rats treated locally with MNNG (methylnitronitrosoguanidine), a potent carcinogen, decreased tumor progression and increased overall survival. At early time points, MSCs reversed local acute inflammation by protecting the mucosal structure and function from MNNG. Furthermore, MSC administration was accompanied by a marked modification of the tumor microenvironment which was still apparent one year after the last MSC administration. When MNNG and MSC were combined with fractionated irradiation, MSCs inhibited residual tumor growth and prolonged animal survival. MSCs protected healthy tissue from radiation damage by increasing the levels of growth factors, decreasing fibrosis and mediating 145 intestinal recovery. These results suggest that MSCs induce reprogramming of resident MSC and immune cells, thereby counteracting CRC development as well as the detrimental side-effects of radiotherapy on healthy tissues. RESULTS The MSC secretome does not protect CRC cells against oxidative stress and DNA damage after acute MNNG exposure We first characterized the different situations where MSCs might have a direct influence on CRC cells. MNNG is an alkylating agent that produces strong oxidative damage followed by DNA strand breaks, genomic instability, inflammation and proliferation (Figure 1A, B) (Koi et al. , 1994). We selected 3 human CRC cell lines with different defects in DNA damage response and DNA repair. HT-29 cells show loss of heterozygosity (LOH) and have mutant p53, HCT-116 cells have defective mismatch repair (MMR) while LS513 cells are intrinsic multidrug resistant (MDR). The influence of the MSC secretome on CRC cell proliferation (Figure 1C), oxidative stress (as measured by the presence of oxidative DNA adducts, Figure 1D) and DNA damage (as measure by DNA strand breaks by the comet assay, Figure 1E) following MNNG exposure was determined. MNNG exposure was accompanied by the formation of oxidative DNA adducts (Figure 1D, red columns), induction of DNA strand breaks (Figure 1E, red columns) and inhibited proliferation (Figure 1C, red curves, compare with the untreated control cells in black) for all three cell lines. Co-exposure with MSCs decreased the amount of oxidative DNA adducts in a non-significant manner (Figure 1D, blue columns) and had no detectable influence on the levels of DNA strand breaks (Figure 1E, blue columns) or cell proliferation (Figure 1C, blue curves). It should be noted, that since a trans-well assay was used in order to be able to separate CRC and MSC cells following co-incubation, the data reflects the influence of the MSC secretome on MNNG-exposed CRC cells, but not potential heterotypic cell-cell interactions. 146 Transient presence of MSCs in the colon MSCs were administered twice (by i. v. injection), 4 and 6 weeks after the initiation of MNNG treatment (Figure 2 A and B). The presence of exogenous MSCs in the colon was verified using an eGFP tag (Figure 2C, left panel, indicated by white arrows). Amplification of the signal by use of anti-GFP antibodies (Figure 2C, right panel indicated by white arrows) revealed the transient presence of scarce GFP-labeled cells (indicated in red) localized in (a) the lamina propria, (b) around the bottom of crypts in the muscularis mucosae and (c) in the sub mucosa, one week after the second MSC injection, but not at later time points. The transient implantation of eGFP-MSCs was further confirmed by PCR of the eGFP gene in extracts from fixed colon tissue (3. 4 1. 4 copies of eGFP per 10 ng of DNA, n 6, data not shown). MSCs prevent the early events induced by MNNG MNNG induced an alteration of the mucosal structure (Figure 2D) as indicated by histological alterations of the mucosa, distortion of the crypts and immune infiltration (compare controls (left) with MNNG (middle), which was attenuated by administration of MSCs (right). The number of crypts per m, the height of the crypts as well as the number of goblet cells per crypt were significantly reduced by MNNG to 88%, 80% and 73% of control values, respectively (Figure 2E, red columns), whereas MSC administration (blue columns) restored the values to the initial levels (white columns). Ki67 expression (in red), reflecting the proliferation of mucosal cells, is shown in Figure 2F (left image, MNNG ; right image, MNNG MSCs). The analysis of labeled cells as a fraction of the total number of epithelial cells is shown in Figure 2F right. The expression of Ki67 increased significantly in the MNNG mucosa (4. 1 0. 2 positive cells/m2, red column), compared to control animals (3. 3 0. 2 positive 147 cells/m2, white column) while MSC administration restored Ki67 expression to normal levels (3. 0 0. 2 positive cells/m2, blue column). MSCs modulate the inflammatory response during the early phase of MNNG-induced carcinogenesis The inflammatory response after MNNG treatment is believed to play a pivotal role in cancer initiation. At the early phase of the experiment (1 week after the second MSC injection), MNNG induced inflammation and mucosal damage, which was attenuated by MSC administration (data not shown). In addition, MNNG induced a systemic inflammation, as evidenced by the serum concentration of C-reactive protein (CRP) which increased almost 6-fold (Figure 3A, left panel, red column). Locally, the protein levels in the mucosa increased for IL-6 (17-fold), IL-1 (2. 1-fold), IL-4 (3. 2-fold), TGF1 (2- fold), TNF(4-fold) and IFN (1. 8-fold) (Figure 3A, red columns). The presence of MSCs restored the concentration of CRP and mucosal IL-6, IL-1, IL-4, TNFand IFN to basal levels (Figure 3A, blue columns compared to control samples, white columns) while TGF increased, clearly indicating an anti- inflammatory activity of the MSCs. Gene expression analysis of the mucosa of animals treated with MNNG MSCs compared to mucosa from animals treated with MNNG alone, further confirmed these findings (Figure 3A, upper table). The mRNA of several pro-inflammatory genes including IL-1 (0. 3-fold), IL-6 (0. 2-fold), TNF- (0. 4-fold) and MIP-2 (0. 1-fold) were significantly down-regulated, whereas the mRNA of the anti- inflammatory genes IL-10 (1. 9-fold) and TGF- (1. 9-fold) were up-regulated. Immunomodulation of the MSCs was associated with a decrease in the mRNA of T-Bet (0. 2-fold), TLR4 (0. 4-fold) and an increase in the mRNA of Arginase-1 (Arg1, 1. 7-fold), GATA3 (1. 4-fold), FoxP3 (1. 6-fold), and TLR5 (1. 8-fold). These findings suggest that the MSCs predominantly stimulated cells of the Treg (IL-10, FoxP3), Th2 (GATA3) and M2 (TNF-, Arg1, TLR4) phenotypes. 148 In addition, the increase in the expression of TFF3 (2-fold) indicates that the MSCs restored the functionality of the mucosa in agreement with the histological findings. MicroRNAs are involved in gene regulation and their aberrant expression has been implicated in various pathologies including cancer. MicroRNA profiling revealed nine microRNAs that were differentially expressed between the mucosa from MNNG and MNNG MSC animals by 7 weeks, which was confirmed by qRT-PCR (data not shown). This included 7 miRNAs that increased significantly in the mucosa of animals treated with MNNG MSC, compared to MNNG alone, including miR-150 (4. 7-fold), 142. 5p (3. 9-fold), 7. 1 (2. 9-fold), 92A (2. 1-fold), 17 (1. 8-fold), 15b (1. 7-fold), 128 (1. 7-fold), while 2 miRNAs decreased significantly including (miR19b 0. 3-fold, ) and miR191 (0. 2-fold) (Figure 3A, lower table). The increase in IL-10, miR-92a and miR-17 as well as the decrease in TLR4 and IL-6 transcripts suggest a polarization of resident MSCs into the MSC2 phenotype. In order to clarify the interaction between MSCs, cancer cells and inflammatory cells, a co- culture model was used to characterize the alterations in miRNA expression in the cancer cells without ambiguity (Figure 3B). As experimental model system, we chose the classical CC531 cell line, originally established from a DMH (dimethylhydrazine)-induced rat colon adenocarcinoma which is a widely used model to study different aspects of tumor growth. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were used as inflammatory cells. The presence of MSCs resulted in increased levels of miR150 (4. 2- fold 0. 2) and miR7. 1 (2. 7-fold 0. 2) in CC531 cells compared to CC531 alone. The presence of both MSCs and PBMCs, increased the levels of miR150 (5. 1-fold 0. 3), miR142. 5 (4. 2 fold 0. 2), miR7. 1 (3. 1-fold 0. 2) and miR128 (2. 5-fold 0. 2) compared to CC531 cells alone. Therefore, the presence of MSCs or MSCs PMBCs had a significant influence on the expression of miRNA in surrounding CRC cells. Interestingly, the results also suggest that the cross-talk between MSCs and immune cells can influence the tumor cells since neither MSCs nor PMBCs by themselves had any influence on the expression of miRNA 142. 5 and 128 while their expression was increased when MSCs and PBMCs were together. 149 MSC administration modifies the phenotype of immune cells in the tumor microenvironment One year after the initial MNNG exposure, the tumor microenvironment of animals treated with MNNG alone was very different from that of animals exposed to MNNG MSCs. In particular, in the tumor, the density of cells expressing the T-cell marker CD3 was 0. 69% 0. 03 compared with 1. 0% 0. 05 for MNNG and MNNG MSCs tumors, respectively. Therefore, the number of CD3 cells was 30% higher in the tumors of MSCs-treated rats (Figure 4A upper panels). In contrast, the density of cells expressing the macrophage marker CD68 was 50% lower in tumors from animals treated with MNNG MSCs (0. 8% 0. 1) compared to the tumors of animals treated with MNNG alone (1. 6% 0. 1) (Figure 4B left panels). The expression of cytokines and transcription factors (Figure 4A, bottom left) showed highly significant differences between tumors from animals treated with MNNG or with MNNG MSCs. The MSC-mediated increase in mRNA expression levels was particularly prominent for IFN- (3. 1-fold 0. 3), IL-12a (3. 4-fold 0. 3), IL-12b (2. 1-fold 0. 2), T-bet (1. 9 fold 0. 2), IL-1 (2. 5 fold 0. 1), IL-7 (1. 8- fold 0. 05) and Notch1 (2. 1-fold 0. 2) (Figure 4A, bottom left). In contrast, MSC administration decreased the mRNA levels for IL-4 (0. 18-fold 0. 03) and STAT6 (0. 55-fold 0. 01), whereas GATA3 levels were slightly increased (1. 5-fold 0. 07). The ratio between IL-4/ IFN- was reduced by a factor of 6. 6 while the ratio between T-bet/GATA3 was increased by a factor of 2. 4 (Figure 4A lower right). These findings suggest a predominance of the Th1 phenotype in MNNG MSCs tumors. The expression of other genes involved in the regulation of the tumor microenvironment is shown in Figure 4C. MSC administration was accompanied by a significant decrease in the mRNA levels of TGF-1 (0. 5-fold 0. 02), IL6 (0. 4-fold 0. 02), STAT3 (0. 3-fold 0. 01) and IL-17a (0. 39-fold 0. 04), suggesting a low activity of differentiated Th17 cells. The expression of genes typical of Treg cells showed that MSC treatment increased the mRNA levels of Foxp3 (2. 4-fold 0. 1), IL-10 (3. 8-fold 0. 4) 150 and IL-2 (2. 0-fold 0. 3). The higher levels of IL-2 expression in MSC-treated tumors are coherent with a stimulation of Treg cells. In addition, the expression of M1 macrophage-related genes including iNOS (3. 9-fold 0. 08), Arg1 (0. 5-fold 0. 03), TLR2 (1. 4-fold 0. 07) and TLR4 (1. 5-fold 0. 04) increased, whereas the expressions of IL-8 (0. 67-fold 0. 02) and TNF (0. 64-fold 0. 05) decreased (Figure 4C). MSC administration limits the number and the growth of colon tumors following carcinogen treatment The appearance of the tumors in control animals (without MNNG), in MNNG-treated animals and in animals treated with MNNG MSCs by 52 weeks is shown in Figure 5A. Quantitative analysis (Figure 5B) shows that the number of tumors per rat was significantly reduced in animals treated with MSCs at both 32 and 52 weeks. In addition, there were significantly more tumor-free rats in the MNNG MSC group indicating that the administration of MSCs attenuated tumor initiation, thereby decreasing the number of tumors per rat (data not shown). The average size of tumors by 52 weeks (Figure 5C) was 3-times less in animals injected with MSCs (34 mm2) compared to animals treated with MNNG alone (106 mm2). Similarly, at 52 weeks, the expression of Ki67 mRNA as measured by qRT-PCR was lower (0. 76-fold 0. 04) in tumors from the MNNG MSCs group than for the MNNG group, suggesting a long-term effect of the MSCs on tumor proliferation. At 52 weeks, the invasion of tumor cells was limited to the sub-mucosa. In reference to the TNM nomenclature for human tumors, only Tis Nx M0 and T1 Nx M0 (Figure 5C) tumors were observed at this stage. MSC treatment resulted in a non-significant decrease in tumor grade. MSC administration significantly increased the survival of MNNG-treated animals 151 The influence of MSC administration on the overall survival is shown in Figure 5D. MNNG treatment significantly reduced the life span of rats (Figure 5E, red line, median survival 55 weeks), compared to the untreated control animals (black line, 165 weeks). In clear contrast, the injection of MSCs significantly increased the survival of MNNG-treated animals (blue line, median survival 95 weeks). After fractioned irradiation, MSC administration significantly decreased the size of colon tumors and increased survival Our experimental protocol was based on a clinical case where patients undergoing radiotherapy for prostate cancer by accident received more than 70 Gy on the rectum. One year after radiation, colonoscopy revealed the presence of congested mucosa, telangiectasia and large area of fibrosis. These patients were subsequently treated successfully by intravenous injection of MSCs. To characterize the influence of MSCs on residual tumors after radiotherapy as well as their effect on healthy tissue, we used three groups of MNNG-treated rats as outlined in Figure 6A. Thirtytwo weeks later, when adenoma had occurred, two groups were irradiated with 75 Gy. One week after the last irradiation, one group of animals received three intravenous injections of MSCs. At the time fibrosis had developed (26 weeks after irradiation and 60 weeks after the first MNNG treatment) tumors were removed for histological and molecular characterization while the remaining animals were used to determine the influence of the different treatments on the overall survival (Figure 6B). Fractionated irradiation reduced the size of the tumors four-fold (20 mm2 2) compared to the non-irradiated control group (82 mm2 20). Importantly, MSC administration further decreased the size of the tumors more than 2-fold (9 mm2 3), compared to irradiation alone (Figure 6C). 152 MSC treatment significantly increased the life span of rats after irradiation (Figure 6D, blue line, median survival 65 weeks after irradiation) as compared with irradiation alone (red line, median survival 40 weeks after irradiation). MSC administration decreased fibrosis and prevented tissue degradation after fractioned irradiation Chronic radiation damage is characterized by an aberrantly repair process associated with chronic inflammation, excessive collagen accumulation and vascular disorganization resulting in fibrosis, which may lead to organ dysfunction and occlusion (Andreyev et al. , 2010). Accordingly, fractionated irradiation alone induced an alteration of the mucosal structure as indicated by distortion of the crypts, sub-mucosal edema and immune infiltration and accumulation of components of the extracellular matrix (Figure 6E, compare irradiated tissue (middle panels) with non-irradiated normal tissue (left panels). These changes were attenuated following MSC exposure (right panels). Morphometric analysis showed that the height of the crypts per m (348 crypts/ m in average vs 268 crypts/ m) as well as the number of goblet cells per crypt (24/ crypt vs 18/ crypt in average) were significantly increased in irradiated colons (Figure 6F, red columns) compared to non-irradiated controls (white columns) while MSC administration restored basal levels to 288 crypts/ m and the goblet cells to 18/ crypt in average (blue columns). The crypt number per 300 m was significantly decreased after irradiation (4. 1 crypts/ 300 m in average, red column) compared to non-irradiated controls (mean 5. 2 crypts/ 300 m in average, white column) without any detectable effects of the MSCs on the irradiated group (4. 2 crypts/ 300 m in average). Fractioned irradiation promoted fibrosis (Figure 6G, red column, 14% in average) whereas MSC administration significantly decreased fibrosis (blue column, 7. 1% in average) to similar levels as the non-irradiated controls (white column, 6. 8% in average). Therefore, MSC administration limited 153 fibrosis and prevented mucosal damage clearly suggesting an anti-fibrosis and mucosa-protective effect of the MSCs against tissue damage induced by fractionated irradiation. On the molecular level, fractioned irradiation increased the protein levels of TGF (2. 1-fold) and TIMP1 (2. 2-fold) while the protein levels of VEGF in the mucosa decreased (Figure 7A). MSC treatment normalized both TGF and TIMP1 but increased the concentration of VEGF 4. 1-fold (p compared to basal levels, coherent with the influence of MSCs on fibrosis. Gene expression analysis did not show any significant influence of MSC treatment on the expression levels of the pro-inflammatory genes IL-1IFN- and TNF- following irradiation (Figure 7B). In contrast, the expression of TGF decreased 1. 8-fold while the expression increased for TFF3 (1. 6-fold), HGF (2-fold) and VEGF (1. 6-fold). These findings indicate that the MSCs restored the functionality of the mucosa while limiting fibrosis, in agreement with the histological findings. 154 DISCUSSION Radiotherapy is an essential part of cancer treatment for a wide range of tumor types. However, a fraction of patients develop toxic side effects due to normal tissue damage. In particular, pelvic radiation disease (PRD) remains a major problem which is only treated symptomatically (Andreyev et al. , 2010). The digestive symptoms of pelvic radiation disease are similar to those observed in the so- called Bowel Disease as well as for the visceral disorders associated with Graft Versus Host Disease (GVHD) where administration of mesenchymal stem cells (MSCs) emerge as a promising approach to alleviate the gastrointestinal syndromes (Moussa et al. , 2016). Although MSC administration is also able to alleviate tissue damage in irradiated animal models, conflicting data exist concerning their potential influence on residual tumor cells (Voswinkel et al. , 2013). Most reported studies have been carried out in immunodeficient mouse models which would not be able to reproduce the immunomodulatory effects of MSCs on resident immune cells. In addition, most studies have focused on orthotopic tumor xenografts rather than on endogenous tumor development. We here evaluate the influence of MSCs on tumor growth in an immunocompetent rat model following local exposure to a chemical carcinogen in the presence or absence of fractionated radiotherapy and describe the underlying molecular mechanisms. Specifically, we evaluate the impact of MSCs on tumor development, the inflammatory/immune response and the tumor microenvironment from CRC initiation to its complete development over an entire year. The results show for the first time that intravenous administration of MSCs increase the life span of carcinogen-exposed rats which was correlated with a smaller number of tumors (tumor initiation) as well as a decrease in tumor size (tumor progression) indicating that the exogenous MSCs durably inhibited both CRC initiation and progression (Katsuno et al. , 2013). To mimic human colon carcinogenesis, which is a long-term process, we selected an immunocompetent MNNG-induced CRC rat model. The MNNG model is relevant for human carcinogenesis since rectal deposits of MNNG mimic the detrimental action of alimentary nitroso- 155 compounds (Li et al. 2016) that are closely associated with the induction of colorectal cancer (Narisawa et al. , 1971). Furthermore, intra-rectal deposits of MNNG act only on the colon mucosa (Reddy et al. , 1974), in contrast to carcinogenesis induced by 1, 2 Dimethylhydrazine (DMH) or azoxymethane (AOM) which also induce tumors in other tissues (Schmahl et al. , 1976). The prominent early effect of MNNG is the induction of inflammation which has been closely linked to tumor initiation (Che et al. , 2010). Inflammation is accompanied by mucosal lesions as evidenced by a decrease in the number of mucus-secreting cells as well as a decrease in crypt number, crypt height and the number of goblet mucus-secreting cells which may result in colon dysfunction. Administration of MSCs seems to decrease CRC initiation via an effect on the immune system rather than by a direct activity toward the tumor cells. Specifically, MSCs had only marginal effect on MNNG- mediated oxidative stress, DNA damage and cell proliferation in isolated CRC cells. MSCs modulate the MNNG-induced inflammation, at least in part, by lowering the local IL-6 concentration, since IL-6 has been implicated in tumor initiation in inflammatory bowel disease (Grivennikov et al. , 2009). Furthermore, MSC treatment protected the structure of the colon epithelium by reducing the ulcerations caused by MNNG (Che et al. , 2010) in agreement with previous reports (Sémont et al. , 2013). These early effects of MSCs, which counteract the deleterious action of MNNG, are likely associated with TGF- and/or TFF3-dependent tissue repair in agreement with the results presented here. Indeed, these two regulatory peptides can stimulate the restitution on the basolateral (TGF) and apical (TFF) sides of the colon mucosa, via independent pathways (Sturm et al. , 2010). Finally, the administration of MSCs restored gut morphology and function in agreement with previous findings (Semont et al. , 2006, 2010). We then characterized the expression of miRNAs that have been implicated in modulating tumor initiation. The microRNA expression profile identified 9 microRNAs that were differentially expressed. To clarify the interplay between tumor cells, MSCs and immune cells, an in vitro model was used. The results show that the presence of MSCs increased the levels of miR150 and miR7. 1 in the tumor cells. 156 Interestingly, the joint presence of MSCs and inflammatory cells specifically increased tumor cell expression of miR142. 5 and miR128 pointing to the importance of cross-talk between MSCs and inflammatory cells. The inhibition of MNNG-induced inflammation by the MSCs was reflected by an increase in miR150 and miR7. 1 which are known to inhibit inflammation in sepsis (miR150) and gastritis (miR7. 1), and a decrease in miR19b, which has been described to increase inflammation in rheumatoid arthritis (Gantier et al. , 2012). Similarly, MSCs induced an increase in anti-oncogenic miRNA (miRs 150, 142-5p, 7. 1, 15b, 128 and 17) and a decrease in pro-oncogenic miRNA (miRs 19b and 191). Interestingly, miR-17 is produced by MSC2s and negatively regulates expression of Smurf1 (Liu et al. , 2011), a potential oncogene that has been implicated in CRC (Xie et al. , 2014). Taken together, the results indicate that MSCs inhibited tumor initiation by preventing MNNG-mediated inflammation thereby protecting the colon and decreasing the number of tumors. The inhibition of tumor initiation by MSCs is in agreement with a previous report in a rat model treated with a different carcinogen (Katsuno et al. , 2013), although the exact events cannot be compared directly since the cited study did not include a characterization of the local inflammation or epithelial function (Nasuno et al. , 2014). Next, we characterized the long-term influence of MSCs on the tumor microenvironment since the microenvironment is known to influence tumor evolution (Bissell et al. , 2011) and the composition of tumor-infiltrating immune cells might represent a valuable prognostic tool (Tosolini et al. , 2011). Indeed, a comparison of tumors induced by MNNG alone with those developed after treatment with both MNNG and MSCs showed important differences in terms of microenvironment, tumor cytokines and transcription factors almost one year after the initial administration of MSCs. By 52 weeks, MNNG MSCs tumors were infiltrated with more CD3 lymphocytes compared to MNNG tumors. MSCs directed the lymphocyte response toward a Th1/Treg. The increased expression of IL-10, TGF-, Foxp3 and IL-1 suggests an important Treg population activated by the high level of IL-2 in the microenvironment. FoxP3 Tregs have been associated with a better prognosis in CRC while the Th1 response has been shown to be anti-carcinogenic in CRC (Salama et al. , 2009). Decrease 157 expression of IL-17a suggested a decrease of Th17 cell activity. This result is in agreement with Yoshida et al. who suggested that a decreased of Th17 expression may improve the survival of patients with CRC (Yoshida et al. , 2016). Human colon carcinoma tumors infiltrated with more CD3 cells, presenting a high Th1 adaptive cluster have a better prognosis. Similarly, patients with high levels of T-Bet and FoxP3 showed better survival while no correlation was found between prognosis and the Th2 gene cluster (Salama et al. , 2009). In comparison, the number of infiltrating CD68 macrophages decreased in MNNG MSCs tumors. High levels of TAMs (tumor-associated macrophages) are generally correlated with a non- favorable outcome in various cancers including CRC (Peddareddigari et al. , 2010). The lower levels of CD68-positive cells may explain the decreased expression of IL-8 mRNA (which is implicated in the carcinogenic process) (Waugh et al. , 2008). It is generally accepted that macrophages may be activated into M1 (classical) or M2 (alternative) subtypes. A switch from M1 to M2 macrophages has been described during tumor progression (Schmieder et al. , 2012). We found an increase in iNOs, TLR2 and TLR4 expression in MNNG MSCs tumors, suggesting a differentiation toward the M1 subtype (Lowel et al. , 2010). In agreement, MNNG MSCs tumors exhibited low levels of STAT6, Arg1 and IL-4 suggesting a low degree of M2 differentiation (Gordon et al. , 2010). Furthermore, the inhibition of tumor growth observed in MNNG MSCs-treated animals was associated with an increased expression of perforin (secreted by NK and cytotoxic T cells), FasL and iNOs (which contribute to tumor cell killing). Expression levels of IL-6 and STAT3 were low in MNNG MSCs tumors. A Systematic review and meta- analysis have shown that STAT3 may have oncogenic activities (Ji et al. , 2016). In addition, high levels of STAT3 and IL-6 have been associated with CRC progression (De Simone et al. , 2015). Therefore, our results are in agreement with the current understanding of the IL-6/STAT3 pathway. The pelvic radiation syndrome is characterized by the severity of gastrointestinal disorders. In this study we selected a rat model of fractionated -irradiation (Gremy et al. , 2008) which is considered to be representative of the colonic irradiation damage observed in patients (Bessout et al. , 2015). 158 Importantly, administration of MSCs after radiotherapy decreased the size of residual tumors and protected colon integrity, thereby improving animal survival. This model of colorectal irradiation generates histopathological lesions similar to those observed clinically during the severe chronic phase. Our results highlights a dynamic progression of extracellular matrix remodeling with a balance towards fibrogenesis in irradiated tissues which is counteracted by MSC administration coherent with previous findings in rat (Bessout et al. , 2014) and pig (Linard et al. , 2013) models. The regenerative capacity of MSCs was, at least in part, mediated by secretion of HGF and VEGF. Taken together, these data support the capacity of MSCs to establish a normal microenvironment after irradiation by acting on endogenous tissue cells. Importantly, the presence of exogenous MSCs was only observed at early time points after injection. Therefore, the strong and durable antitumor effects of the MSCs observed in this study is likely explained by reprogramming of resident cells by the MSCs, for example by epigenetic mechanisms, in agreement with the hit and run mechanism suggested by Von Bahr et al. (2012). The results presented here suggest that at early time points, MSCs promotes an anti-inflammatory response via polarization of resident MSCs into anti-inflammatory MSC2s as well as tissue repair thereby protecting tissue integrity and decreasing tumor initiation. At later time points, we observed a long-lasting polarization of resident macrophages into the M1 subtype in agreement with the findings of Eggershoffer et al. (2014) who reported that MSCs are able to induce M1 polarization of resident macrophages, even after being phagocytosed, thereby inducing a microenvironment unfavorable to tumor progression. Taken together, the results presented here show for the first time that administration of MSCs increase the life span of carcinogen-exposed rats by durably attenuating both CRC initiation and progression. Considering the transient presence of the MSCs this is likely mediated by reprogramming of resident cells which in turn interferes with tumor growth. After fractionated irradiation, MSCs inhibited residual tumor growth, protected healthy tissue and prolonged animal survival. These 159 findings support the use of MSC administration for treatment and, possibly, prevention of, severe radiation damage in patients. EXPERIMENTAL PROCEDURES Isolation and culture of MSC and CRC cells HCT116, HT29 and LS513 human colorectal cancer cells were purchased from European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK). Bone marrows were obtained from seven week old rats as previously described (Rochefort et al. , 2006). First, CRC cells were incubated with MNNG (50 nM) for 2 hours. Then, MSCs and tumor cells were plated in the upper and lower chambers, respectively, of trans-well plates (0. 4 mm pore size, Corning) and co-incubated for 24 hours followed by collection of cells and culture media. The protocol is further detailed in Figure 1A. Oxidative stress Formation of 8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) DNA adducts was used to estimate oxidative stress using the Oxidative DNA Damage OxiSelect ELISA Kit (Cell Biolabs inc). DNA fragmentation MNNG is genotoxic toward human CRC cells as shown by single cell electrophoresis under alkaline conditions (the alkaline comet assay). This method permits the detection of DNA strand breaks and alkali-labile sites in individual cells with the percentage of DNA in the comet tail being proportional to the induction of DNA strand breaks (Soares et al. , 2007). Genotoxic activity was determined using a 160 comet assay kit (Trevigen 4253-096-K). Data are expressed as the % of DNA in the tail compared to the total DNA). Animals All experiments were performed in compliance with institutional guidelines as well as with French laws for animal experimentation and approved by an Ethics Committee for Animal Experimentation. MSCs were isolated from transgenic rats (green rat CZ-C04 Tg Act eGFP) obtained by IRSN from Pr. Otabe (Japan). Sprague-Dawley rats (Janvier Labs), aged eight weeks at the beginning of the experiment, were divided into three groups (Figure 2A). 36 untreated animals were used as control group ; 75 rats were injected with MNNG alone while 75 rats received MNNG MSCs. Alternatively, animals were divided into 3 groups of 30 rats each as shown (Figure 6A). All groups were exposed to MNNG. Two groups also received local fractioned irradiation while one group received MSCs in addition. Carcinogenesis and MSC treatment MNNG was administered by 4 intra-rectal deposits of a 5 mg/ml solution (0. 5 ml per dose) over two weeks as described (Maurin et al. , 2007). At 6 and 8 weeks after the first MNNG treatment, 107 MSCs were two injected i. v. into the tail vein of anesthetized animals. The irradiated animals received 3 intravenous injections of MSCs (one per month) at weeks 36, 40 and 44. Survival, modifications of the mucosa and the development of colonic tumors were determined at 7, 10, 32 and 52 weeks after MNNG treatment and at 60 weeks for the irradiated groups. 161 Tumors collected 52 weeks after MNNG treatment were classified by TNM after examination at necropsy and by histology. Radiation and MSC treatment Thirty weeks after the first MMNG administration, when adenomas had appeared, rats were exposed to a -ray source (60Co, 1 Gy/min) with a radiation field confined to the colorectum (field size : 2 x 2. 5 cm). Radiation was delivered 3 times a week in 5-Gy fractions at a total dose of 75 Gy (Gremy et al. , 2008). One week after the last irradiation, 107 MSCs were injected intravenously into the tail vein of anesthetized animals. The radiation response, animal survival, modification of the mucosa and the development of colonic tumors were determined 25 days after the last irradiation. The protocol is further detailed in Figure 6 B. Tissue sampling and analysis After euthanasia, colons were dissected. Part of the samples (the first 12 centimeters of the colon from the rectum as well as the tumor masses) were frozen in liquid nitrogen followed by protein extraction by tissue disruption in PBS containing protease inhibitors (Complete Mini, Roche) and stored at -80 C until use. Another part of samples were stored at -80 C in RNAlater (Qiagen). For histological analysis, tissues were fixed in 70% ethanol or 4% buffered formaldehyde and paraffin-embedded. Tumors were measured using the bi-dimensional method as recommended by WHO. IHC analysis was performed as previously described (Che et al. , 2010). Primary antibodies included : CD3, Rabbit monoclonal antibody (clone SP7 ; Thermo Scientific). CD68, Anti-rat CD68 mouse MAb (Santa Cruz sc-70760). Ki67, Anti-rat mouse MAb (clone MIB-5, Dako). For GFP detection, slides were incubated for 30 minutes with rabbit anti-GFP polyclonal antibody 162 (AB3080, Chemicon). Secondary antiserum was Cy3 goat anti-rabbit IgG (Molecular Probes). Quantification was performed by image analysis using Histolab 4. 3. 6. PCR was used for confirmation of GFP expression in the colons as previously published (Sémont et al. , 2006). miRNA was purified from total RNA prepared from MNNG-treated animals by 7 weeks in comparison with animals treated with MNNG MSCs. To determine the miRNA expression early after MNNG treatment, miRNA profiles were analyzed by the Affymetrix GeneChip miRNA Array 2. 0. The expression of selected miRNAs was confirmed by qRT-PCR (Life Technologies) including mir150 (00473), 142. 5 (002248), 7. 1 (001338), 92A (000431), 17 (002308), 15b (000390), 128 (000453), 19B (00396), 191 (000490) according to the manufacturer's instructions (Life Technologies). Statistical analysis Results were compared between groups by the Mann-Whitney and Fisher exact test with Statview. Survival curves were compared with the Gehan-Breslow-Wilcoxon test. In the figures, results are expressed as mean standard error of the mean (SEM), asterisks correspond to p (*), p (*) and p (*). AUTHOR CONTRIBUTIONS 163 AC, AKL and ME F-L conception and design, data collection, data analysis and interpretation, manuscript writing. SB, BLH, BU, TCHC, FH, DB and SF : technical support. SF, BLH, BU, TCHC : animal assistance. SF and BU : study concept. LD and MB : manuscript revision. Final approval of manuscript : all. ACKNOWLEDGMENTS The authors thank Bettina Fabiani (Hôpital Saint-Antoine, Paris, France) for tumor analysis, Christian Gespach (Hôpital Saint-Antoine, Paris, France) for helpful discussions and Pierre P. Levy (Hôpital Tenon, Paris, France) for fruitful discussions on statistical analysis. GRANT SUPPORT This work was supported by IRSN, INSERM and by a collaborative research grant from Centre de Recherche Saint-Antoine (CRSA). 164 REFERENCES Andreyev H. J. , Wotherspoon A ; , Denham J. W. , Hauer-Jensen M. (2010). 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(A) Model illustrating the influence of the alkylating agent MNNG on proliferation, oxidative stress and DNA damage toward neoplastic and normal CRC cells and tissue. (B) CRC cells were incubated in the presence or absence of MNNG (50 mM) for 2 hours, followed by post-incubation in the presence or absence of MSCs in trans-wells for an additional 24 hours. Then, CRC cells were harvested for determination of adduct formation and DNA damage or, alternatively, post-incubated in standard media for 120 hours for determination of proliferation. (C) Proliferation of HT-29, HCT-116 and LS513 cells for the indicated times. (D) Presence of 8-OHdG DNA- adducts caused by oxidative stress in CRC cells exposed to MNNG in the absence (red columns) or presence (blue columns) of MSCs. (E) DNA damage as determined by single cell electrophoresis (the comet assay). Upper panel, representative images are shown for HT-29 cells. Comet tails are indicated with a white arrow (original magnification x40). Lower panel, quantitative analysis of fragmented DNA in CRC cells exposed to MNNG in the absence (red columns) or presence (blue columns) of MSCs. * p * p and * p as determined by the Mann-Whitney test. Figure 2. Early effects of MNNG and MSCs. (A and B) Protocol used for the animal studies. The study was initiated by local MNNG treatments (two times weekly for two weeks) followed by i. v. administration of MSCs on weeks 4 and 6. The red stars indicate the times of sampling for data analysis corresponding to 7, 10, 32 and 52 weeks after the start of the experiment. (C) Presence of MSCs in MNNG-treated colon tissue one week after the second injection. Exogenous MSCs are detected by direct GFP fluorescence (left panel, white arrows) or with Cy3-anti-GFP antibodies (right panel, white arrows). The presence of MSCs was observed in a) the lamina propria between the crypts, b) the muscularis mucosae and c) the sub mucosa. Nuclei are colored by DAPI. Original magnification x40. (D) 171 Micrographs of the colon mucosa (HE staining) for control animals (left panel) and after treatment with MNNG (middle panel) or with MNNG MSC (right panel). Original magnification x10. Bars, 100 m. (E) Morphometry of the mucosa. Left panel, number of crypts per 300 m. Middle panel, crypt height. Right panel, number of goblet cells per crypt. White columns, normal mucosa. Red columns, MNNG- treatment. Blue columns, MNNG MSC treatment. (F) Proliferating cells as measure by Ki67 immunofluorescence (red) in mucosa treated with MNNG (left) or with MNNG MSCs (right). Original magnification x20. * p * p and * p as determined by the Mann-Whitney test. Figure 3. Early inflammatory effects in rats treated with MNNG or with MNNG MSCs. (A) Histograms of serum C-reactive protein (CRP), an indicator of systemic inflammation, and the local concentrations of IL-6, IL-1, IL-4, TGFTNF-1 and IFN protein one week after the second MSC administration. The columns show the protein content in the mucosa of control animals (white columns), after treatment with MNNG (red columns) or with MNNG MSCs (blue columns). Right panel, expression of mRNA (top) and miRNA (bottom) in colon mucosa in animals treated with MNNG alone or with MNNG MSCs one week after the second MSC administration. The ratio indicates the expression of MNNG MSCs versus MNNG alone (2-Ct SEM, as determined by the Mann-Whitney test). (B) CC531 CRC cells were incubated with MSCs, with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) or with both PBMCs and MSCs in trans-wells for 24 hours followed by harvesting of the CRC cells for determination of miRNA expression. * p as determined by the Mann-Whitney test. Figure 4. Characteristics of the tumor-infiltrating immune cells in animals treated with MNNG or with MNNG MSCs by 52 weeks. (A) upper panels, CD3-positive tumor-infiltrating T lymphocytes (in green, visualization by immunofluorescence, original magnification x40) in animals treated with MNNG or with MNNG MSCs. Upper right panel, percentage of CD3-positive infiltrating 172 cells. Bottom left panel. Influence of MSCs on the expression of cytokines and transcription factors as determined by qRT-PCR. Bottom right panels, the influence of MSC administration on the Th1/Th2 phenotype was determined for animals treated with MNNG alone (white boxes) or with MNNG MSCs (grey boxes). The initial presence of MSCs reduced the ratios between IL-4/ IFN- 6. 6-fold (p 0. 0022) and increased the T-bet/GATA3 ratio 2. 4-fold (p 0. 00022). These findings suggest a predominance of the Th1 phenotype in MNNG MSCs treated tumors. (B) upper panels, CD68-positive tumor-infiltrating macrophages (in green, visualization by immunofluorescence, original magnification x20) in animals treated with MNNG or with MNNG MSCs. Upper right panel, percentage of CD68-positive infiltrating cells in tumors from MNNG treated animals (circles) compared to animals treated with MNNG MSCs (triangles). (C) left panel, expression of genes associated with the tumor microenvironment in tumors from MNNG MSC treated animals compared to animals treated with MNNG alone. Right panel, expression of mRNA in the colon mucosa of animals treated with MNNG or with MNNG MSCs by 52 weeks. The ratio indicates the expression of MNNG MSCs versus MNNG (2-Ct SEM) as determined by the Mann-Whitney test. Figure 5. Late effects of MNNG and MSCs on the colon. (A) The appearance of representative colons from untreated control animals and from animals treated with MNNG alone or with MNNG MSCs by 52 weeks. White arrows, tumor growth. (B) Box plot of the number of tumors by 32 and 52 weeks. White boxes, MNNG alone. Grey boxes, MNNG MSCs. (C) Analysis of the size of 8 representative tumors per group collected by 52 weeks. Circles, MNNG alone ; triangles, MNNG MSCs. (D) D1 and D2, Adenocarcinomas (magnification x2. Bar, 2, 000 m). D3, Cancer in situ (magnification x10). D4, Adenocarcinoma invading the sub mucosa (magnification x10. Bar, 500 m). (E) Kaplan-Meyer survival curves of control animals (black line), animals treated with MNNG (red line) or with MNNG MSCs (blue line). The median survival was 55 weeks for animals treated with MNNG alone, 95 weeks for animals treated with MNNG MSCs and 165 weeks for control animals. (F) Model 173 for the long-term effects of exogenous MSCs. 1, Inflammation is induced in the colon mucosa by MNNG. 2, Interaction and reprogramming of resident MSCs and immune cells by the exogenous MSCs. 3, Polarization of resident MSCs in the colon into MSC2 and of macrophages into M2 will counteract the inflammation and preserve tissue integrity. 4, Decreased tumor initiation (plain lines) will result in 5, a lower number of tumors. 6, The protein and gene expression profile suggests a dominant presence of MSC-1 and macrophages of a mixed M1/M2 phenotype in the colons of MSC-treated animals. 7, Reprogramming of resident MSCs and immune cells is accompanied by a decreased tumor volume. 8, The decreased number and size of MNNG-induced tumors is accompanied by increased life span. Figure 6. Effects of MSCs administered after fractionated irradiation on tumor size, survival and tissue integrity. A) Three groups of animals (30 animals/group) were used to determine the influence of MSC administration on tumor size, tissue integrity and overall survival after radiotherapy. (B) Study Protocol. The red arrows indicate the various time of fractioned irradiation (15 fractions of 5 Gy each, 3 fractions per week delivered by a 60Co source through a 2 x 3 cm window centered on the colorectal region). The green arrows indicate the times of MSCs injection (one injection per month for 3 months, at 36, 40 and 44 weeks after the start of the experiment). The red star indicates the removal of animals (15 animals per group) by 60 weeks for functional and molecular analysis. (C) Tumor size of tumors collected by 60 weeks. (D) Kaplan-Meyer survival curves after irradiation of MNNG-treated (red line) and MNNG-treated plus MSC-treated animals (blue line). (E) Morphometry of the mucosa. Left panels, Magnification x20. Bar 200 m. Right panels Magnification x40. Bar 100 m. The colored boxes illustrate the parameters depicted in F. White arrows indicate deposition of extracellular matrix components. (F) Left, crypt height. Middle, number of goblet cells per crypt. Right, number of crypts per 300 m. Normal mucosa (white columns), MNNG irradiation (red columns), MNNG irradiation MSCs (blue columns). (G) Scaling of fibrosis. Normal mucosa (white columns), MNNG irradiation 174 (red columns), MNNG irradiation MSCs (blue columns). The number indicates the presence of fibrotic tissue in % of total surface. NS 0. 05 ; * p as determined by the Mann-Whitney test. Figure 7. Influence of MSC administration after fractionated irradiation. (A) Protein content of TGF, TIMP1 and VEGF in the colon mucosa of control animals and after irradiation followed or not by MSC administration. (B) Expression of inflammatory and regenerative genes in the colon mucosa after irradiation, followed or not by MSC administration. The data illustrates the expression of the indicated genes and are expressed as the ratio of irradiation or irradiation MSCs, compared to non- irradiated control tissue (2-Ct SEM) as determined by the Mann-Whitney test. * p 175 FIGURES 176 177 178 179 180 181 182 Article 2 : HGF and TSG-6 released by Mesenchymal attenuate radiation-induced colorectal fibrosis by suppressing the pro-fibrotic activity of colonic and macrophages smooth muscle Stem Cells cells La fibrose colorectale est une affection grave du tube digestif caractérisée par une augmentation progressive du dépôt de matrice extracellulaire (MEC) menant à la rigidification du tissu et à la sténose. C'est une caractéristique de pathologies diverses, dont les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) et les atteintes chroniques des radiothérapies. Dans les pays développés, le nombre de cas de cancer augmente continuellement. Le traitement des tumeurs est de plus en plus efficace mais l'augmentation des chances de survie pose le problème de la prise en charge des patients. Le côlon-rectum est particulièrement radiosensible et donc susceptible de développer des atteintes secondaires suite à la radiothérapie. De même, le nombre de MICI est en augmentation constante. En l'absence de traitement efficace de ces lésions, la prise en charge est majoritairement palliative. Les Cellules Souches Mésenchymateuses possèdent des propriétés régénératives et anti- fibrosantes démontrées dans divers modèles (GVHD, Crohn). Il n'existe pour l'instant que peu de données sur leur effet sur les atteintes secondaires des radiothérapies colorectales. Nous avons évalué, au cours des travaux présentés ci-après, l'effet des CSM sur la fibrose colorectale radio-induite. Dans un modèle d'irradiation colorectale chez le rat, produisant des atteintes proches de celles observées après radiothérapie et lors des MICI, nous avons démontré l'effet anti-fibrosant des CSM. Cet effet est majoritairement supporté par un effet inhibiteur exercé par les CSM sur les cellules productrices de MEC : myofibroblastes, cellules musculaires lisses et macrophages. En particulier, nous avons démontré une stimulation intense de l'activation des macrophages M2, anti-inflammatoires et intervenant dans le remodelage matriciel. In vitro, nous avons également démontré un effet paracrine direct des CSM sur les myofibroblastes et cellules musculaires lisses. Nous avons identifié deux effecteurs majeurs de l'effet pro-fibrosant des CSM sur la fibrose : HGF et TSG-6. Ces protéines agissent respectivement en inhibant la voie de signalisation pro-fibrosante de TGF- et en régulant la polarisation des macrophages. Des expériences in vitro de coculture nous ont permis de démontrer un 183 effet différentiel de HGF et TSG-6 sur chaque type cellulaire. L'amélioration de la lésion induite par les CSM était accompagnée d'une amélioration de la survie. Nos résultats supportent l'utilisation des CSM après radiothérapie abdomino-pelvienne et dans le cas de la fibrose colorectale associée aux MICI. Ils soulignent également l'intérêt de la réponse orchestrée des CSM, capables de produire de nombreux facteurs solubles, par rapport aux traitements pharmacologiques classiques 184 HGF and TSG-6 released by Mesenchymal Stem Cells attenuate radiation-induced colorectal fibrosis by suppressing the pro-fibrotic activity of colonic smooth muscle cells and macrophages Benot Usuniera, Bruno L'Hommea, Valérie Hollera, Christine Linarda, Olivier Guipaudb, Marc Benderitterc, Alain Chapela a-Laboratory of Research on Irradiated Healthy Tissues Regeneration (LR2I), Institute for Radiological Protection and Nuclear Safety (IRSN), F-92260 Fontenay-aux-Roses, France. b-(L3R), Institute for Radiological Protection and Nuclear Safety (IRSN), F-92260 Fontenay-aux-Roses, France. c-(SRBE), Institute for Radiological Protection and Nuclear Safety (IRSN), F-92260 Fontenay-aux- Roses, France. Running title Administration of MSC inhibits colorectal fibrosis after radiotherapy Keywords Mesenchymal stem cells, colorectal, radiotherapy, fibrosis, HGF, TSG-6 Corresponding author : Alain Chapel IRSN, PRP-HOM/SRBE/LR2I BP-17, 92262 Fontenay-aux-Roses CEDEX, FRANCE Tel : 33 1 58 35 95 46 ; Fax : 33 1 58 35 84 67 E-mail : alain. chapel@irsn. fr Conflicts of interest The authors declare no conflict of interest. Manuscript word count : 7995 Number of figures : 7 figures Significance - MSC administration inhibits colorectal fibrosis after irradiation in vivo - HGF and TSG-6 are key effectors of MSC-mediated inhibition of fibrosis, respectively by suppressing TGF- signaling and regulating the polarization of macrophages. - MSC administration might prevent the deleterious effects of radiation therapy on healthy tissues and attenuate the development of bowel disorders. 185 Abstract The number of patients suffering from inflammatory bowel Diseases (IBDs) and chronic severe damages after pelvic radiotherapy (pelvic radiation disease, PRD) is expanding. Their common feature is fibrosis in the colon and rectum. Treatments are palliative, and the growing numbers of patients urges for alternative strategies. Evidences from preclinical and clinical studies highlight the efficiency of Mesenchymal Stem Cell (MSC) therapy for the treatment of IBDs and radiation-induced bowel toxicity after cancer treatment. The ability of MSCs to reduce radiation-induced fibrosis to the colon- rectum was investigated in vivo, in a model of rat receiving a colorectal radiation. This model produced damages analogous to those observed in patients after pelvic radiotherapy. To analyze mechanism of transplanted MSCs on the development of fibrosis, MSCs were injected intravenously after radiation exposure. MSCs limited fibrogenesis, through the inhibition of inflammatory pathways, the reduction of smooth muscle cells and myofibroblast activation in agreement with an increase in survival animals. MSCs inhibited myofibroblast differentiation by reducing the expression of pro-fibrotic IGF-1. MSCs oriented T lymphocytes and macrophages polarization toward an anti-fibrotic profile. HGF and TSG-6 were identified in vivo as key effectors secreted by MSCs. These two factors exerted different and complementary effects. These results propose MSC therapy as a first line treatment of colorectal fibrosis in chronic inflammatory intestinal diseases and after pelvic radiotherapy complications such as PRD. Introduction Fibrosis is defined as the accumulation of extracellular matrix (ECM) resulting from a pathological repair process. It is a feature of many chronic inflammatory diseases, such as liver cirrhosis, cystic fibrosis and hepatitis. While a lot of attention has been focused on the treatment of fibrotic diseases of the heart, kidneys, liver and lungs, there seems to be a lack of data on therapies for intestinal fibrosis, in particular following radiotherapy. The colon and rectum are susceptible to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs), such as Crohn's disease, which often feature fibrosis. Following radiotherapy of the pelvic area (e. g. for prostate or cervix cancer), the distal colon and the rectum, which are particularly radiosensitive due to their fast renewing epithelium, can develop late complications, including fibrosis. These disorders greatly impact the quality of life of patients, induce debilitating symptoms such as chronic pain, hemorrhages and incontinency, and can lead to lethal loss of tissue function. 186 Although the need for a treatment for IBDs has been extensively highlighted, late side effects of pelvic radiotherapy, known as Pelvic Radiation Disease (PRD), have long been neglected [1]. This means that the potential number of patients who will suffer from colorectal fibrosis in the future may have been underestimated. In fact, the number of cancers worldwide has been continuously rising during the past decades and is expected to reach 19. 3 million in 2025 [2]. The pelvic area homes some of the most frequent cancers (e. g. prostate, colorectal, cervix, bladder) for which 60% of treatment protocols include radiotherapy. An estimated 20% of patients suffer from late complications 20 years after pelvic radiotherapy [1]. Since the number of patients suffering from IBDs is also growing [3], the prevalence of colorectal fibrosis should progressively climb in future years, pressing the need for new management strategies. Indeed, there is currently no efficient treatment for fibrosis. Fibrosis appears following injury in almost any tissue. Chronic insults, such as persisting inflammation, prevent proper tissue regeneration and continuously activate repair pathways. In particular, while the production of ECM by myofibroblasts is necessary to the formation of granulation tissue, the constant activation of new myofibroblasts leads to the overgrowth of the connective tissue, which can't be rescued by the host's ECM-degradation systems. The progressive infiltration of ECM in the organ, replacing functional and structural cells, induces tissue stiffness and loss of functionality. In the colon and-rectum, loss of muscle contractibility and stenosis can lead to a fatal occlusion. Similar to IBDs, radiation-induced colorectal damages involve severe mucosal damages, chronic inflammation and activation of the pro-fibrotic TGF-/Smad pathway, a major contributor to the fibrogenic process [4]. This leads to the differentiation of resident and recruited myofibroblasts, and the acquisition of a pro-fibrotic phenotype by Smooth Muscle Cells (SMCs) of the muscular layer, which shift from a contractile to a secretory phenotype [5, 6]. The concomitant upregulation of ECM components, ECM degrading enzymes (MMPs : Matrix Metalloproteinases) and their inhibitors (TIMPs : Tissue Inhibitors of Metalloproteinases) causes a defect in ECM turnover [7]. The late phase of colorectal fibrosis is characterized by long spans of ECM, sometimes infiltrating the muscle layers, and a paucicellular microenvironment due to ischemia and mechanical stress [5, 8]. Despite numerous candidate drugs, including mostly anti-inflammatory molecules and compounds targeting TGF- signaling, no efficient treatment exists yet. Recently, Mesenchymal Stem Cell (MSC) therapy has been used successfully in the treatment of inflammatory diseases, including Crohn's disease [9, 10] and Graft-Versus-Host-Disease (reviewed in [11]). Moreover, clinical studies show a beneficial effect of the injection of MSCs on radiological burns [12] and on colorectal complications induced by overexposure to ionizing radiations during prostate cancer radiotherapy [13]. Finally, a large number of preclinical and clinical studies suggest the ability of MSCs to inhibit 187 fibrosis development in various organs, such as the heart, liver, kidneys and gut (reviewed in [14]). Adding to already known regenerative and immunomodulatory properties of MSCs, these data highlight other anti-fibrotic effects, including the inhibition of ECM accumulation, in particular by suppressing TGF- signaling. Accordingly, studies in our lab have also put forth the regenerative and anti-fibrotic effects of MSCs in models of radiation-induced fibrosis in pigs [15] and rats [16-19]. In these models, MSCs act by modulating immune cells response, as evidenced by changes in T helper cells profiles [17, 18] and macrophage polarization [15]. These results also evidence the inhibition of TGF- signaling and the promotion of ECM degradation by MSCs [15, 18]. MSCs have been referred to as an injury drugstore, in regard to their ability to secrete many soluble factors mediating their effects (reviewed in [20]). These molecules allow for multiple effects, ranging from pro-angiogenic to anti-apoptotic [14]. As far as fibrosis is concerned, specific anti-fibrotic proteins secreted by MSCs have been identified. Of note, Hepatocyte Growth Factor (HGF) and Tumor necrosis factor-Stimulated Gene-6 (TSG-6) have proven to be major effectors of the anti-fibrotic effects of MSCs in several models (e. g. skin and kidney fibrosis) [21, 22]. HGF is a pleiotropic growth factor with immunomodulatory properties and the ability to inhibit TGF- signaling. On the other hand, TSG- 6 is involved in the recruitment and differentiation of leucocytes, mainly through its interactions with pro-inflammatory hyaluronan [23, 24]. In vitro experiments support these observations, as recombinant HGF or TSG-6 partially reproduced MSCs' effects on pro-fibrotic proximal tubular epithelial cells [22]. Based on these observations, and the need to better manage colorectal fibrosis, we aimed at studying the mechanisms involved in the effect of MSCs on an animal model of pelvic radiotherapy- induced fibrosis. Sprague-Dawley rats were irradiated to the colon-rectum, and injected 2 and 3 weeks later with MSCs. To confirm the implication of HGF and TSG-6 in MSC-mediated effects, two distinct groups of rats were injected with MSCs silenced for either Hgf or Tsg-6 after irradiation, in a separate experiment. We assessed the effects of MSCs on radiation-induced damages to the colon-rectum, inflammation and ECM turnover. In vitro, we cocultured MSCs with irradiated myofibroblasts or SMCs to determine whether a direct effect was induced on these cell types. Material and Methods Animals All experiments were performed in compliance with French laws and guidelines for animal experiments (Act no. 92333 of 2 October 2009) and approved by the Ethics Committee of Animal Experimentation CEEA number 810 (Protocol numbers : P0910). Sprague-Dawley (SD) male rats 188 (300 g) were purchased from Janvier Labs (LeGenest St Isle, France). eGFP transgenic rats (strain green rat CZ-C04 Tg Act eGFP) derived from the Sprague-Dawley strain, were obtained by the IRSN from Pr. Otabe (Osaka university, Osaka, Japan) with MTA and subsequently bred in the IRSN's animal housing facility. The progeny of eGFP rats was systematically tested for the expression of the transgene. Transgenic rats were used as the source of GFP-labeled MSCs. The animals were housed in double- decker cages, two or three to a cage, with access to food and water ad libitum and light and dark cycles. All efforts were made to minimize suffering and all experiments were performed under gaseous anesthesia with isoflurane (Aerrane, Baxter SA, Lessines, Belgium). Animal behavioral and physiological parameters (e. g. bleeding and diarrhea) were monitored daily and suffering animals were euthanized. Euthanasia was performed in a CO2 chamber. Sprague-Dawley rats, aged ten weeks (250-300g) at the beginning of the experiment were divided in 2 batches. The control batch consisted in 6 animals neither irradiated nor injected with MSCs (control group). The other batch underwent colorectal irradiation, followed or not by the transplantation of MSCs. 18 animals were irradiated without MSC transplantation (IRR group) and 18 received wild-type MSC injections (MSC group). The protocol is further detailed in Figure 1A. Finally, two groups of 6 animals received GFP-MSCs silenced for either Hgf (MSC-HGF group) or Tsg-6 (MSC-TSG-6 group). The protocol is further detailed in Figure 6A. In another experiments, 24 rats were irradiated and 26 rats were irradiated and injected with MSCs according to the same protocol as described above, to determine the effect of MSCs on the survival of irradiated rats. Radiation schedule, MSC treatment and tissue sampling Rats were exposed to an X-ray source (2. 43 Gy/min) and received a single radiation dose of 29 Gy as previously described [18]. The radiation field was confined to a 2x3 cm window localized to the colon-rectum. In groups treated with MSCs, 5. 106 cells were injected via the tail vein 2 and 3 weeks after irradiation to study the effect of MSC therapy on radiation-induced fibrogenesis. Rats were euthanized 4, 5 and 7 weeks after irradiation. Rats having received MSC-HGF of MSC-TSG-6 were euthanized 7 weeks after irradiation. Colon and rectum were sampled to evaluate the progression of radiation-induced lesions (e. g. mucosal damages and ECM deposition). The protocol is further detailed in figures 1 and 6. Euthanasia was performed under isoflurane anesthesia. After euthanasia, we sampled 3 cm of the colon-rectum included in the radiation field. The colon-rectum was opened lengthwise, and separated in 3 longitudinal sections and processed in view of future experiments. RNALater (ref : AM7024, Qiagen, Les Ulis, France) was used to preserve samples intended for gene 189 expression analysis. For protein quantification, samples were rapidly frozen in liquid nitrogen before storage at -80C with samples intended for RNA extraction. The last sections were immersed in 4% buffered formaldehyde then dehydrated and paraffin-embedded. Results for each group were compared as follows : IRR was compared to control ; MSC was compared to control and IRR ; MSC-HGF and MSC-TSG-6 ware compared to MSC. Isolation, characterization and culture of MSCs GFP-MSCs were extracted from adipose tissue obtained from seven-week-old eGFP transgenic rats as previously described [18]. Briefly, subcutaneous inguinal adipose tissue was removed from eGFP-SD rats, finely minced and enzymatically digested with 0. 1% collagenase type I (reference : C0130, Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) at 37C, then filtered through a 30 m filter. This process was repeated three times and the remaining collagenase was neutralized with 10% FBS in the extract. Cells were washed with Phosphate Buffered Saline (PBS) and suspended in MEM- containing 20% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin and 1% L-Glutamin. Cells were seeded at 1000 cells/cm and medium was changed 4 days after. On day 7, the monolayer of adherent cells was trypsinized (Trypsin- 0. 25% EDTA, Thermo Fisher Scientific), washed three times in PBS and resuspended at 107 cells/mL. The phenotype of amplified Ad-MSCs was verified by flow cytometry. Cultures were assessed for the presence of CD90 (clone OX-7 ; BD Biosciences, Le Pont de Claix, France) and CD73 (clone 5F/B9 ; BD Biosciences), and the absence of haematopoietic lineage cells was verified with CD34 (clone ICO115 ; Santa Cruz Biotechnology, Inc. , Dallas, USA) and CD45 (clone OX-1 ; BD Biosciences) markers. Controls were performed using isotype identical antibodies. In vitro experiments A coculture system was implemented to investigate the influence of human MSCs on the main cell types responsible for colon fibrosis. Primary human Colonic Smooth Muscle Cells (hCoSMCs, ref : 2940) or human Intestinal Fibroblasts (hIFs, ref : 2920-SC) were obtained from ScienCell (6076 Corte Del Cedro Carlsbad, CA 92011, USA) and cultivated respectively in Smooth muscle Growth Medium-2 (SmGM-2, ref : CC-3182) and Fibroblasts Growth Medium-2 (FGM-2, ref : CC-3132) obtained from 190 Lonza Verviers (Verviers, Belgium). MSCs were cultured in Minimal Essential Medium containing 20% Fetal Bovine Serum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin and 1% L-Glutamine obtained from Thermo Fisher Scientific (Illkrich, France). Cells were used between passages 2 and 5. Briefly, 6000 MSCs/cm were seeded on Transwells with 0. 4 m pores (Corning Life Sciences). On day 4, hIFs or hCoSMCs were seeded on 6 well plates (Falcon) at a respective density of 6000 and 5000 cells/cm. 4 days later, hIFs and hCoSMCs were irradiated with a single 20 Gy dose (2. 43 Gy/min) to induce their pro-fibrotic phenotype. 12 hours later, medium was emptied from Transwells containing the MSCs, which were transferred to hIF and hCoSMC cultures. hIFs and hCoSMCs were collected 12 hours after the transfer and dry cell pellets were stored at -80C prior to RNA extraction. The protocol is further detailed in Figure 8A. RNA interference against Hgf and Tsg-6 HGF and TSG-6 effectors of MSCs, as evidenced both in vitro and in vivo. HGF or TSG-6 genes were silenced in MSCs for in vitro coculture and in vivo transplantation experiments. ON-TARGETplus SMARTpools of siRNAs, designed to improve knockdown efficiency, were purchased from GE Healthcare Sa (Vélizy-Villacoublay, France), as were other transfection reagents. siRNAs used during these experiments were specific for the following genes : human HGF (reference L-006650-00-0050 ), rat Hgf (reference L-089896-02-0050), human TSG-6 (ref : L-012379-00-0050) and rat Tsg-6 (ref : L- 108341-00-0050). Transfection of human and rat MSCs was performed as instructed by the manufacturer. Briefly, human or rat MSCs were seeded at a density of 3x103 cells/cm2. Cells were transfected at 80% confluence with a solution containing 2 L/mL Dharmafect1 (ref : T-2001-03) and 1 M of either siRNA in complete MSC growth medium (as described before. A preliminary experiment was performed to assess silencing efficiency. RNA interference against the GAPD gene was used as positive control (ON-TARGETplus GAPD Control Pool, ref : D-001830-10-05) and a non-targeting siRNA served as negative control (ref : D-001810-10-05). mRNA was extracted from these cells and the levels of HGF and TSG-6 expression were measured using RT-qPCR. During in vitro and in vivo experiments, MSCs were used 48 hours after transfection, when silencing was most effective. RNA isolation, reverse transcription, quantitative real-time PCR, array analysis The expression of the eGFP gene in GFP-MSCs was assessed by RT-qPCR as previously published (Sémont et al. 2013). Tissue and cell total RNA was extracted using the RNeasy Mini Kit (ref : 191 74106, Qiagen) for cell cultures and the RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (ref : 74704) for colon-rectum samples. Rat samples were first disrupted using TissueRuptor disposable probes (ref : Qiagen). The purity and concentration of RNA extracts was assessed by spectrophotometry before reverse transcription. One g of mRNA was used to produce cDNAs for each sample using the High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (ref : 4368813, Thermo Fisher Scientific). RT-qPCR was performed with TaqMan Universal PCR Master Mix (ref : 4326708) and TaqMan Gene Expression Assays (ref : 4331182) purchased from Thermo Fisher Scientic. The QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System (ref : 4471090, Thermo Fisher Scientific) was used to evaluate gene expression profiles. Gene expression data analysis was performed with QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR Software and ExpressionSuite Software 1. 1 (Thermo Fisher Scientific). The Relative Quantity (RQ) for each gene was calculated using the 2-Ct method. During in vitro experiments, GAPDH served as endogenous control and irradiated cells were selected as the reference group. Gene expression profiles in rats were measured using Ywhaz (Tyrosine 3-Monooxygenase/Tryptophan 5-Monooxygenase Activation Protein Zeta) as an endogenous control and non-irradiated animals as the control group. Protein extraction, quantification and ELISAs Tissue samples stored at -80C were thawed and finely minced prior to protein extraction. Proteins were extracted by tissue disruption with the TissueRuptor (Qiagen) in ice-cold PBS containing protease inhibitors (Complete Mini, Roche). After centrifugation, protein concentration was assessed in the supernatant using the Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). ELISAs for rat MMP-2 (ref : EK0639, Boster Biological Technology Co. , Ltd. , Pleasanton, CA, USA), MMP-9 (ref : E-EL- R0624, Elabscience Co. , Ltd. , Wuhan Shi, China) and TGF-1 (ref : EK0514, Boster Biological Technology Co. , Ltd. ) were performed as instructed by their respective manufacturers. Histology and immunohistochemistry (IHC) Paraffin-embedded samples were cut into 4 m sections and stained with hematoxylin-eosin- saffron (HES) or PicroSirius (Direct Red 80, ref : 365548-25G, Sigma-Aldrich, Lyon, France). Full length longitudinal tissue sections were analyzed for lengths and fibrosis area measurements. ECM areas were automatically measured using Histolab software (Microvision Instruments, Lisses, France) to automatically detect Picrosirius stained surfaces (magnification 40X). The percentage of fibrosis area is obtained by dividing the ECM area by the total surface of tissue in each field, which was manually 192 measured on Histolab. For immunohistochemical protocols, paraffin-embedded sections were dewaxed and rehydrated, then permeabilized with a solution containing 0. 1% Triton (N3020-100ML, Sigma-Aldrich). Staining of -SMA required an extra step in a methanol solution containing 0. 3% H2O2 to inhibit endogenous peroxidases. Antigen retrieval was performed by 3x5 minutes microwave cycles in Target Retrieval Solution (ref : S169984-2, Agilent Technologies, Les Ulis, France). Primary antibodies against -SMA (ref : A2547, Sigma-Aldrich), CD68 (ab125212, Abcam, Paris, France) and CD206 (bs- 2664R, Bioss antibodies, Woburn, USA) were used for myofibroblast and M2 macrophages quantification. We used HRP Horse Anti-Mouse IgG secondary antibody (ref : PI-2000, Vector Laboratories, Inc. , Burlingame, USA) and Histogreen (ref : E109, Linaris, Dossenheim, Germany) to reveal -SMA staining followed by counterstaining with Nuclear Fast Red solution (ref : N3020, Sigma- Aldrich). For co-staining of CD68 and CD206, secondary antibodies conjugated with fluorescent dyes Alexa Fluor 568 (Goat anti-Rabbit, red, ref : A-11011, Thermo Fisher Scientific) or Alexa Fluor 488 (Donkey anti-Rabbit, green, ref : A-21206, Thermo Fisher Scientific) were employed respectively. Fluorescent slides were mounted with Vectashield HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI (ref : H-1500, Vector Laboratories, Inc. ), thus showing cell nuclei in blue under fluorescence microscopy. We used the Fiji software (Fiji Is Just Imagej, to make measurements on these slides. Myofibroblasts, M1 and M2 macrophages were numbered on their respective slides, on 5 fields per sample (magnification : 100X), and the total surface of the tissue on each field was measured to calculate cell density. M1 macrophages stained positive for CD68 only (red), while M2 macrophages appeared yellow, being positive for both CD68 (red) and CD206 (green). Statistical analysis Statistical analyses were achieved with SigmaPlot v11 (Systat Software GmbH, Erkrath, Germany). Two-group comparison were performed with t-tests, while one-way ANOVAs followed by Bonferroni t-tests were used for multiple group comparison. Survival curves were compared with the log-rank test. Results are expressed as mean standard error of the mean (SEM). A value of p0. 05 is considered to be statistically significant. In the figures, asterisks correspond to p (*), p (*) and p (*). LogRank survival analysis was performed using R (R Foundation). The competitive risks methodology was used to discriminate between non radiation-related deaths (during anesthesia or MSC injection) and radiation-induced mortality. 193 Results We investigated the ability of MSCs to reduce radiation-induced fibrosis to the colon and rectum. A model of colorectal irradiation in rats, which has been described in our lab, was used. This model produces damages similar to those observed in patients suffering from side effects of radiotherapy. We described the fibrosis-related features of the irradiated colon-rectum of Sprague- Dawley rats. MSCs were injected to a group of irradiated animals to study their effect on fibrogenesis. Comparison between irradiated and irradiated and MSC-treated rats showed a marked reduction in fibrosis following MSC injection. We identified two key mediators secreted by MSCs, HGF and TSG-6, which are necessary to yield MSCs' anti-fibrotic effects. Pelvic irradiation-induced fibrosis In order to characterize fibrogenesis in rats after colorectal irradiation, we first described the changes in the expression profile of ECM-related genes (collagens, MMPs, TIMPs) using real-time quantitative PCR : ECM components (e. g. collagens and fibronectin), MMPs (ECM-degrading enzymes) and TIMPs (MMP inhibitors). Four weeks post-IR, ECM components collagen type III and Sparc were overexpressed when compared to the control group (Figure 1B). Genes coding for MMPs (-2, -9, -12, - 13 and -14), TIMPs (-1, -2, -3 and -4) were upregulated at the same time. Since plasmin is a major activator of MMPs, we measured the expression of components of the plasminogen activation system. Serpine-1, the inhibitor of plasminogen activation, was overexpressed 4 weeks post-IR. Since ECM turnover is controlled by the amount of ECM components produced, the degradation of ECM by MMPs and the inhibition of MMPs by TIMPs, we used the collagen-to-MMP-to-TIMP ratio adapted to radiation enteritis [7] : Fold change of ECM component Fold change of MMP specific to ECM component ( Fold change of TIMP specific to MMP ) Results lower than 1 indicate a tendency toward ECM degradation, whereas values over 1 show ECM accumulation. 4 weeks post-IR in our model, Collagen-to-MMP-to-TIMP ratios showed a strong tendency toward the accumulation of various ECM components (collagen type I, collagen type III, fibronectin and Sparc) (Figure 1C). Chronic inflammation and fibrosis are often associated with specific immune infiltrated. Alternatively activated macrophages markers Arg-1 and Mrc-1 were upregulated 4 weeks post-IR as compared to control rats, as well as Gata3 (T helper 2 cells) (Figure 1D). Moreover, the Gata-3/T-bet ratio, indicative of the Th2/Th1 ratio of T helper cells, showed higher Th2 immune 194 response. 7 weeks post-IR, irradiated animals showed a significant increase in ECM deposition in the colon and rectum, as compared to control rats (Figure 1E-1G, black arrows). Irradiation induced mucosal ulceration, edema in the submucosa prompted by ECM accumulation, and overall thickening of the tissue 7 weeks post-IR (Figure 1F-1H, black arrows). Four weeks after irradiation, overall imbalance in the components regulating ECM turnover (ECM components, MMPs and TIMPs) is responsible for the accumulation of ECM. MSCs inhibit fibrogenesis following colorectal irradiation To evaluate the effect of MSCs on radiation-induced colorectal fibrosis, Sprague-Dawley rats were injected with 5. 106 MSCs one and two weeks after colorectal irradiation as described in figure 1A. Irradiation induced a strong upregulation of ECM-related genes (Figure 2A, red bars), which was prevented by MSCs (Figure 2A, blue bars). Four weeks after irradiation, transplanted rats displayed a significant downregulation of the pro-fibrotic gene Ctgf accompanied by the inhibition of collagen I and III, fibronectin and Sparc expression. This effect induced a severe decrease in collagen-to-MMP- to-TIMP ratios (Figure 2B, blue bars), showing a tendency toward less ECM accumulation. 5 weeks after irradiation, MMP-2 concentration in the colon-rectum of MSC-treated rats was significantly increased (Figure 2C, blue bar) when compared to the control group (Figure 2C, white bar) and irradiated animals (Figure 2C, red bar), in favor of ECM degradation. Seven weeks after irradiation, Picrosirius red staining of paraffin-embedded colon tissue showed a significant reduction in ECM deposition in the colon- rectum of MSC-transplanted rats, in particular in the submucosa (Figure 2E, black arrows). This observation was confirmed by measuring the surface of fibrosis in longitudinal tissue sections. 7 weeks after irradiation, ECM deposition, which was dramatically increased in irradiated rats (Figure 2D, red bar), was reduced to control level after MSC injection (Figure 2D, blue bar). These results show the potent inhibitory effect exerted by MSCs on radiation-induced colorectal fibrosis, through the downregulation of ECM components and a more efficient control over ECM turnover. MSCs limit the proliferation of ECM-producing cells During fibrosis in the colon and rectum, subepithelial myofibroblasts located in the mucosa and Smooth Muscle Cells in the muscularis mucosa and the muscularis propria are responsible for the production of pathological ECM. To determine whether the inhibition of ECM accumulation by MSCs was linked to a suppressive effect on pro-fibrotic cells, we first evaluated the amount of myofibroblasts 195 in the mucosa. The expression of -SMA, the main marker of differentiated myofibroblasts, was decreased in the colon-rectum of MSC treated animals four weeks after irradiation (Figure 3A, blue bars), supporting the reduction of myofibroblasts' proliferation. MSCs also suppressed the overexpression of Igf-1 (Figure 3B, blue bar), a major regulator of SMCs maturation, also regulating their ECM secretory properties. Four and 5 weeks after irradiation, MSC injection significantly reduced the density of -SMA positive cells in the mucosa of the colon-rectum (Figure 3D-E, blue bars) compared to irradiated animals (Figure 3D-E, red bars). Interestingly, while there was a high number of -SMA positive cells in the mucosa (Figure3C), the submucosa showed no evidence of myofibroblastic differentiation and -SMA expression was restricted to blood vessels, despite a marked increase in ECM deposition. MSCs thus seem to reduce ECM production by inhibiting the activation of pro-fibrotic cells after colorectal irradiation. MSCs ameliorate fibrosis by favoring the Th2/M2 response Macrophages and T cells are involved in fibrosis development through various mechanisms, potentially favoring or limiting fibrogenesis. In particular, recent discoveries have shown that MSCs could act on fibrosis by orienting the polarization of macrophages and the differentiation of CD4 T cells. Four weeks after irradiation, we measured a strong increase in the alternatively-activated macrophages (M2) marker arginase-1 in irradiated animals (Figure 4A, red bar), which was further elevated by MSC injection (Figure 4A, blue bar). 5 weeks after irradiation, M2 promotion seemed to persist as the mannose receptor gene Mrc-1, expressed by M2 macrophages, was overexpressed in MSC-treated animals (Figure 4B, blue bar) when compared to the non-transplanted irradiated group (Figure 4B, red bar). Since T helper type 2 response supports alternative activation of macrophages, we measured the Gata3/T-bet ratio of gene expression and observed a higher ratio after MSC injection, indicating a shift toward Th2 differentiation of T cells (Figure 4C blue bar). Irradiation caused a decrease in the proportion of M2 macrophages, as measured on paraffin-embedded slides stained with fluorescent antibodies against the macrophage marker CD68 and the M2 marker CD206 (Figure 4E, red bar). MSC injection promoted M2 polarization when compared to both the control group and non- transplanted irradiated rats (Figure 4E, blue bar). MSCs seem to promote a strong burst in Th2/M2 cells which appears primordial to the effective degradation of the pathological ECM. These cells have previously been associated with anti-inflammatory and ECM remodeling activity, in particular during fibrosis. MSC-mediated regeneration in the colon-rectum induced a significant improvement in animals' survival (Figure 4F). While 30% of irradiated rats died before 50 days (Figure 4F, red line), there was a 100% survival rate at the same time in the MSC group (Figure 4F, blue line). The reduction 196 of ECM deposition could thus ameliorate survival, most notably by restoring tissue functionality and preventing occlusion. Hgf silencing in transplanted-MSCs promote fibrosis through a TGF-dependent mechanism The Hepatocyte Growth Factor (HGF) is a potent anti-fibrotic protein with pleiotropic activities including immunosuppression and the inhibition of TGF- signaling. As HGF has been identified as mediating part of MSCs' anti-fibrotic effects, we used RNA interference to knockdown the Hgf gene in MSCs prior to injection to irradiated rats, as described in figure 5A. The results were obtained 7 weeks after irradiation. Knockdown of Hgf in MSCs (MSC-HGF) suppressed the inhibition of TGF- and ECM- related genes. Seven weeks after radiation exposure, Tgfb1, Tgfb2, Tgfb3 and Ctgf were upregulated in the colon-rectum of animal transplanted with MSCs silenced for HGF (Figure 5B, blue hatched bars) when compared to irradiated (not shown) and irradiated and MSC-treated rats (Figure 5B, blue bars). Concomitantly, collagens I and III, as well as fibronectin and Sparc were overexpressed (Figure 5B, blue hatched bars) in the MSC-HGF group. Similarly to what was observed in non-treated irradiated animals, the upregulation of Mmp3, Mmp9, Mmp12, Mmp13, Timp1 and Serpine1 (Figure5C, blue hatched bars) induced the increase of collagen-to-MMP-to-TIMP ratios in the colon-rectum after injection of MSC-HGF (Figure 5D, blue hatched bar) compared to MSC-treated colon-rectum (Figure 5D, blue bar). The stimulation of pro-fibrotic mechanisms after MSC-HGF injection resulted in the accumulation of pathological ECM (Figure 5E, blue hatched bar), to a level comparable to non-transplanted irradiated rats (Figure 1F, red bar). Hence, HGF secreted by MSCs seems to act as a safeguard mechanism preventing TGF-mediated activation of fibrogenic pathways and consequent fibrosis. TSG-6 inhibits fibrosis through de regulation of the polarization of macrophages The Tumor necrosis factor-Stimulated Gene-6 (TSG-6) protein is mostly produced during inflammation. It is mostly involved in hyaluronan-induced leucocyte recruitment. Thus, MSCs' immunomodulatory and anti-fibrotic properties have been previously associated in part to their production of TSG-6. Parallel to MSC-MGF, we induced Tsg-6 knockdown in MSCs by RNA interference (MSC-TSG-6). The results were obtained 7 weeks after irradiation. MSC-TSG-6 induced the upregulation of IGF-1 and collagens type I and III (Figure 7A, blue dotted bars), in a manner comparable to that observed in irradiated animals. At the same time, Tsg-6 silencing induced a strong increase in collagen-to-MMP-to-TIMP ratios in favor of ECM accumulation (Figure 7B, blue dotted bars). Since the 197 TSG-6 protein is able to influence macrophage polarization, which is likely involved in our model, we measured the proportion of M2 macrophages after MSC-TSG-6 injection as described above. The group injected with MSCs silenced for Tsg-6 displayed an important increase in the proportion of M2 macrophages (Figure 7C, blue dotted bar) when compared to the MSC group (Figure 7C, blue bar). Finally, ECM deposition was significantly increased in the colon-rectum of MSC-TSG-6-treated rats (Figure 7D, blue dotted bar), when compared to the control group and MSC treatment (Figure 7D, blue bar). Alike HGF, TSG-6 secretion by MSCs is necessary to produce their anti-fibrotic effects. Furthermore, loss of Tsg-6 expression results in a gross increase in ECM accumulation, similar to this observed after irradiation without MSC injection. MSCs directly act on fibroblasts and smooth muscle cells to inhibit their pro-fibrotic phenotype Few transplanted cells are generally found in the pathological tissue soon after injection, despite long-lasting effects, which hinted that exogenous MSCs may act in a paracrine manner. Accordingly, we found no GFP-MSCs in the colon-rectum irradiated rats more than 6 days after transplantation. We tested this hypothesis by adding MSCs in irradiated hIFs and hCoSMCs cultures using a Transwell system allowing molecular exchanges without cell-to-cell contact as described in figure 8A. This allowed to highlight a direct effect of MSCs on both cell types. When cocultured 24 hours with MSCs, hIFs displayed marked reduction in the expression of genes coding for TGF-1, - SMA and collagen type III when compared with irradiated cells (Figure 8B, blue bar). Similarly, MSCs downregulated Tgfb1, Col1a2 (collagen type I) and Fn1 (fibronectin) genes in hCoSMCs (Figure 8C, blue bars). Tsg-6 silencing in MSCs induced the upregulation of -SMA, collagen type III and fibronectin in hIFs (Figure 8B, blue dotted bars). Regarding hCoSMCs, HGF secreted by MSCs seemed to yield better anti-fibrotic effects, since knockdown of its gene resulted in the overexpression of collagen type III and fibronectin (Figure 8B, blue hatched bars). Both soluble factors play a part in MSC-mediated inhibition of fibrosis, but these data evidence the involvement of other MSC-secreted molecules in their inhibitory properties over myofibroblasts. 198 Discussion Colorectal fibrosis is a feature of many chronic inflammatory disorders, including Crohn's disease and severe chronic complications of pelvic radiotherapy, for which an efficient therapy is yet to be found. MSCs exert anti-fibrotic effects numerous in human and animal models. They have regenerative and anti-inflammatory properties which have been used to treat inflammatory conditions, including GVHD and radiological burns. However, despite proven beneficial effects of MSC therapy on IBDs and radiation enteritis, there is little evidence of their anti-fibrotic effects in these pathologies. Furthermore, the mechanisms underlying these effects are not yet known. In this original research article, we evaluated the effects of MSC transplantation on a rat model of radiation-induced colorectal fibrosis mimicking late severe complications of radiotherapy, such as PRD. This models exhibits histopathological lesions similar to those seen in patients suffering from late complications of radiotherapy and IBDs, characterized in particular by the accumulation of ECM which can lead to lethal loss of tissue function (occlusion in the case of the intestine). We based our treatment procedure on previous reports from preclinical and clinical therapeutic protocols employing exogenous MSCs to treat IBDs or symptoms associated with overdosage of radiotherapy during prostate cancer treatment [13]. Transplantation of MSCs after colorectal X-radiation exposure inhibited fibrosis development, thus resulting in an increase of animal survival. Our results suggest that MSCs, by releasing various soluble factors, limit the activation of pro-fibrotic cells, in particular myofibroblasts, SMCs and macrophages. These results suggest that irradiation induce the recruitment of a specific immune population, responsible for the production of IGF-1, which activates SMCs' pro-fibrotic phenotype. MSCs are able to orient T lymphocytes and macrophages in a pattern inhibiting pro-fibrotic signals such as IGF-1. Furthermore, we evidenced that HGF and TSG-6 released by MSCs act through distinct but complementary mechanisms necessary to yield MSCs' anti-fibrotic effects. Fibrosis is driven by macrophages in our model. In order to evaluate MSCs' effect on radiation- induced colorectal fibrosis, we set up an irradiation protocol according to previous studies. Sprague- Dawley rats were exposed to a single dose of 29 Gy, delivered to a 2x3 cm colorectal window. This model displays lesions close to those observed in patients suffering from late adverse effects of radiotherapy [8, 16, 18]. We aimed at characterizing the main features of fibrosis development in this model to further evidence the mechanisms by which MSCs act on fibrosis. After colorectal irradiation, acute damages appear within days and are characterized by deep mucosa ulceration and a massive immune cells infiltrate [16-18]. TGF-1 expression is induced early in radiation enteritis [8], and it 199 contributes, later with CTGF, in the induction and progression of radiation-induced fibrosis [25]. We described the chronic phase of fibrogenesis in this model as being driven by factors independent of TGF-1 and CTGF, which displayed low expression throughout the study. Nevertheless, common features of radiation-induced colorectal fibrogenesis were observed during this study. In agreement with in vivo studies [7, 15], we found a global increase in the expression of ECM components, MMPs and TIMPs. Consequently, fibrosis is the result of a general ECM production/degradation imbalance, as shown by the collagen-to-MMP-to-TIMP ratio. Moreover, plasminogen activation into plasmin, one of the main activators of MMPs, is most likely inhibited by increased Serpine-1 expression in the colon- rectum of irradiated rats. Various cell types, such as myofibroblasts and macrophages, are responsible for ECM turnover. Alternatively activated macrophages (M2 macrophages) can produce ECM components, mainly fibronectin, and MMPs, thus participating in fibrosis progression and/or resolution [26]. In the colon and rectum, SMCs of the muscle layers and myofibroblasts of the mucosa are the main ECM producing cell types [8]. Following irradiation, a dense population of -SMA positive sub-epithelial myofibroblasts was found, possibly accounting for the ECM deposition in the mucosa. However, the submucosa showed no evidence of -SMA positive cells proliferation, despite a marked ECM accumulation responsible for the thickening of this layer. This is most likely due to fibrogenic signals from resident SMCs, in muscularis mucosa and the muscularis propria encasing the submucosa. Evidences from previous studies on patients suffering from radiation enteritis suggest that SMCs are the main cells responsible for radiation-induced fibrosis in the colon-rectum [5, 8]. During fibrosis, the activation of SMCs' secretory phenotype, i. e. their differentiation in ECM producing cells, is accompanied by tissue hypertrophy and hyperplasia, and loss of cell contractibility [5] necessary to the progression of stools. In our model, Bessout et al. have shown a decrease in muscle contractibility following irradiation, suggesting the accumulation of secretory SMCs [18]. The thickening of the muscularis propria, as well as ECM deposit surrounding muscle fibers, support the involvement of pro- fibrotic SMCs in our study. Similar to fibroblasts, TGF-1 is the best known inducer of secretory SMCs. Low TGF-1 expression in this study suggests the contribution of other pro-fibrotic growth factors. IGF- 1 has been studied as a candidate drug for the treatment of IBDs (reviewed in [27]). However, IGF-1 has also been associated with the progression of fibrosis during Crohn's disease [28]. IGF-1 seem to induce collagen synthesis by SMCs, suggesting its implication on the acquisition of SMCs' secretory phenotype [28, 29]. We showed a significant overexpression of IGF-1, thus potentially responsible for the continuation of the fibrogenic process. Macrophages can promote fibrosis progression and resolution depending on their polarization state [30]. The increase in macrophage density (data not shown), along with the reduction in the M2/M1 ratio, could thus also account for fibrosis in this model. First, M1 macrophages are known to favor inflammation which is considered to initiate fibrogenesis. Secondly, they produce large amounts of ROS which activate TGF-1 and are responsible for oxidative 200 stress-induced damages to resident cells [26]. The infiltration of macrophages and overall increase in the number of M1 macrophages is emphasized in our study by a strong overexpression of HIF-1 (data not shown), which is known to be correlated with ROS concentration in the tissue [31]. On the other hand, the increase in M2 markers' expression (Arg1 and Mrc-1) suggests the activation of alternatively activated macrophages. Furthermore, the overexpression of Mrc-1, IL-10 and fibronectin (data not shown) supports the involvement of M2a macrophages, a subset believed to promote fibrosis [26]. They produce fibronectin, required for the differentiation of myofibroblasts [32]. M2a are also IGF-1- producing cells and could therefore participate in the acquisition of SCMs' secretory phenotype. Finally, they are known to stimulate Th2 cells recruitment, in accordance with increased Gata3/T-bet ratio (Th2/Th1) in our model. Colorectal irradiation induced a marked ECM accumulation in rats, similar to what is observed in patients suffering from late complications of radiotherapy. In particular, macrophage polarization appears to play a major role in promoting fibrogenesis, by participating in the upregulation of MMPs and TIMPs, and by producing pro-fibrotic IGF-1. MSCs limit fibrosis by modulating macrophage polarization. Previous studies have demonstrated MSCs' ability to reduce fibrosis in a wide range of pathologies [14]. Hence, we aimed at highlighting the effect of MSCs on colorectal radiation-induced fibrosis by injecting MSCs to Sprague- Dawley rats 1 and 2 weeks after irradiation. Results from the present study show that MSCs exert a long-lasting inhibitory effect on ECM deposition more than 4 weeks after treatment (7 weeks after irradiation). MSCs are able to inhibit the radiation-induced upregulation of ECM genes (collagen and fibronectin), in accordance with other reports (reviewed in [14]). This effect is responsible for the decrease of collagen-to-mmp-to-timp ratios, which allow the restoration of ECM deposition to its basal value (control group). Moreover, MSCs induced a significant increase in MMP-2 concentration in the colon-rectum, thus facilitating ECM degradation. Colon-rectum of MSC-treated animals exhibited lower CTGF expression. CTGF is believed to perpetuate fibrogenesis in place of TGF-1 during the chronic stage of radiation-induced fibrosis [25]. Downregulation of CTGF could thus reduce pro-fibrotic signals in the tissue, in particular regarding myofibroblastic differentiation. Indeed, we observed fewer pericryptic -SMA-positive cells in the mucosa of MSC-treated rats compared to non-transplanted animals. This effect is commonly associated with lesser TGF-1/CTGF/Smad pathway activity [14], as seems to be the case in our study. Although the number of sub-epithelial myofibroblasts increased in irradiated animals between 4 and 5 weeks after irradiation, MSCs were able to significantly limit myofibroblastic differentiation in our model, which could in part explain lower ECM genes expression. The concomitant reduction of IGF-1 expression corroborates previous assumptions that this growth 201 factor plays an important role in promoting fibrosis in this model. In a model of liver fibrosis in mice, MSCs overexpressing IGF-1 exerted more efficient anti-fibrotic effects than wild-type MSCs. MSC injection was associated with upregulation of IGF-1 in the tissue, even more so when using IGF-1-MSCs, suggesting the existence of an IGF-1 activation loop. Our results infer that MSCs can induce an opposite loop during colorectal fibrosis, thus inhibiting IGF-1 expression and subsequent shift in SMCs' phenotype. In agreement with these observations, Bessout et al. showed MSCs' ability to restore the contractibility of colonic muscles in rats after irradiation to the control group level [18]. MSCs could therefore inhibit the contractile-to-secretory shift in SMCs by limiting the availability of IGF-1. Restoration of muscle contractibility is essential to preserve the functionality of the gastrointestinal tract, which is impaired by fibrosis. Our in vitro results also show a direct effect of MSCs on irradiated human Intestinal Fibroblasts (hIFs) and Colonic Smooth Muscle Cells (hCoSMCs). MSCs directly inhibit TGF-1 expression by both cell types. In hIFs, they induce the downregulation of -SMA and collagen type III while they reduce collagen type I and fibronectin expression in CoSMCs. MSCs could then reduce myofibroblastic differentiation by inhibiting TGF-1 dependent and independent pathways and act directly on fibroblasts and SMCs, as well as other resident and recruited cells, such as macrophages and T cells. Indeed, we found a significant increase in the M2/M1 ratio of macrophage polarization, supported by the modulation of T cell differentiation in favor of the Th2 immune response. Comparable to non-transplanted irradiated rats, MSC-treated animals exhibited high IL-10 and Mrc-1 expression. On the other hand, the downregulation of fibronectin suggests the activation of a different subset of macrophages, M2c or regulatory macrophages [26, 30]. M2c cells have been associated with the resolution of fibrosis, most notably by producing large amounts of MMPs [26, 30]. The strong surge of M2c macrophages may thus help control ECM deposition after MSC transplantation. ECM deposition, mechanical stress induced by actin-expressing myofibroblasts and loss of tissue contractibility contribute to tissue stiffness and thickening, which are the major reasons for potentially lethal intestinal occlusion, the main cause of death in the case of colorectal fibrosis. MSCs are able to inhibit these features associated with fibrosis and as a result improve survival in our model. HGF is necessary to maintain low TGF- signaling after MSC injection. HGF is a potent anti- fibrotic protein with immunosuppressive properties and capable of inhibiting TGF-dependent mechanisms. MSCs secrete HGF, which seem to play a major role in their inhibition of fibrogenesis. To evaluate the importance of MSC-derived HGF, we used RNA interference to knowkdown Hgf prior to injection. HGF silencing in MSCs resulted in high ECM deposition 4 weeks after transplantation. The most important effect of HGF silencing is a significant upregulation of genes coding for TGF-, ECM 202 components, MMP and TIMP. Expectedly, the high level of expression of TGF- and CTGF resulted in a concomitant overexpression of collagens, fibronectin and Sparc. Although the shift in collagen-to- MMP-to-TIMP ratios doesn't seem to fully account for the increase in ECM deposition between normal MSC treatment and HGF-knockdown cells, higher SERPINE-1 expression in the latter could result in reduced MMP activity. HGF is known to inhibit TGF- expression while stimulating its own [33, 34], and previous experiments have shown that MSCs overexpressing HGF produced better anti-fibrotic effects on lung and liver fibrosis than wild-type MSCs [35-37]. However, rats injected with MSCs silenced for HGF displayed higher TGF- signaling that non-transplanted animals, thus most likely an MSC-induced effect. Most reserves on the use of MSC therapy against fibrosis arise from the mesenchymal lineage of myofibroblasts, which could imply the possibility of MSCs differentiating into pro-fibrotic cells. Similar to HGF, TGF- inhibits the expression of HGF and upregulates its own [38-40]. Hence, HGF expression in MSCs might be necessary as an autocrine control system, limiting TGF- signaling by MSCs and subsequent differentiation of pro-fibrotic myofibroblasts. Cocultures of irradiated hIFS or hCoSMCs with MSCs silenced for HGF resulted in a different effect on each cell type. While these cells yielded the same effects on hIFs as wildtype MSCs, they induced a strong upregulation of collagen III and fibronectin in HCoSMCs. These observations suggest a direct inhibition of the secretory phenotype of SMCs by HGF. Since the expression of TGF-1 didn't vary between cells cocultured with MSCs or MSCs silenced for HGF, the inhibitory effect of HGF on hIFs and HCoSMCs seems independent of TGF- signaling. To conclude, HGF secreted by MSCs acts via different mechanisms on radiation-induced fibrosis, inhibiting the activation of TGF- dependent and independent mechanisms, and contributing to the degradation of ECM. TSG-6 secreted by MSCs participate in the regulation of macrophage activity. The TSG-6 protein is another potent anti-fibrotic protein secreted by MSCs and involved in their immunomodulatory properties. Alike experiments regarding HGF, we suppressed TSG-6 expression in MSCs by RNA interference. TSG-6 silencing in transplanted MSCs resulted in a significant increase in ECM deposition in the colon and rectum, to a level similar to non-treated irradiated animals. Although significant, the increase in collagen expression and collagen-to-MMP-to-TIMP ratio cannot by itself justify the high level of tissue fibrosis in TSG-6 knockdown cells. TSG-6 is an immunomodulatory cytokine found in inflammatory conditions. It is involved in the regulation of pro-inflammatory and pro-fibrotic hyaluronan activity [41, 42]. Additionally, Choi et al. have shown that TSG-6 released by MSCs inhibits M1 macrophage polarization in favor of M2 activation [43]. Accordingly, the increase in the percentage of M2 macrophages in TSG-6 knockdown MSC-treated animals was unexpected. 203 Nevertheless, TSG-6 has been shown to stimulate inflammation in airway diseases [23]. While it can directly inhibit M1 polarization through CD44, TSG-6 is also able to form hyaluronan polymers which trigger NF-B activation and subsequent acquisition of the M1 phenotype [44]. Thus, TSG-6 could act as a negative regulator of M2 activity by favoring hyaluronan availability. Since prolonged M2 activity has been previously associated with the worsening of fibrosis [45, 46], newly secreted TSG-6 might be one major regulator of inflammation after MSC transplantation. Furthermore, high IGF-1 expression in animals treated with TSG-6-silenced-MSCs supports the presence of pro-fibrotic macrophages. Finally, the hyaluronan/CD44 axis has a crucial role in the differentiation of myofibroblasts, and the regulation of hyaluronan turnover by TSG-6 may be another inhibitory mechanism exerted by MSCs on ECM production. In vitro, TSG-6 silencing in MSCs cocultured with irradiated hIFs and hCoSMCsinduced a strong upregulation of the myofibroblast marker -SMA, as well as genes coding for collagen III and fibronectin. A mild effect on fibronectin expression was also observed in hCoSMCs cultures. Opposite to HGF, TSG-6 appears to have a selective effect on hIFs, by reducing their shift to a myofibroblast profile. Hyaluronane has a stimulating effect on myofibroblasts' activation and proliferation, which could be impaired by TSG-6 secreted by MSCs. Our results support the involvement of TSG-6 in MSC- mediated immunomodulation, in particular in orienting macrophages' response toward fibrosis resolution, and in inhibiting the proliferation of pro-fibrotic myofibroblasts. HGF and TSG-6 appear to exert different but complementary effects, necessary to the maintenance of MSCs' anti-fibrotic effects during radiation-induced fibrosis. Conclusion Inflammatory conditions of the colon and rectum, such as IDBs and radiation-induced damages, are severe pathologies that greatly impact the quality of life of patients and are potentially lethal. Fibrosis is a common feature of these diseases and others, including hepatitis and liver fibrosis. While there are currently only palliative treatments for fibrosis, therapeutic use of Mesenchymal Stem Cells have exhibited a potent anti-fibrotic effect in various models of fibrosis, in the liver, kidneys, heart We aimed at showing the potential of such treatments on colorectal fibrosis, as displayed in IBDs and radiation enteritis. In a model of radiation-induced colorectal fibrosis in Sprague-Dawley rats, MSC injections reduced ECM deposition by inhibiting the activation of pro-fibrotic cells. This study supports the use of MSC therapy for the treatment of radiationinduced colorectal fibrosis during PRD. While no adverse effect was observed on irradiated animals after MSC injection, the treatment induced a long-lasting effect resulting in a significant reduction of ECM deposition. We describe a new mechanism in which MSCs limit fibrosis by regulating macrophage polarization to favor tissue 204 regeneration. The impact of HGF and TSG-6 silencing highlights the importance of the secretion of a wide range of factors by therapeutic MSCs. When compared to pharmacological treatments, MSC therapy offers the advantage of providing a pleiotropic response, activating multiple mechanisms instead of acting on a single pathway. Similarities between radiation-induced fibrosis and other pathological conditions of the intestine, e. g. IBDs and Crohn's disease, also imply that mechanisms involved in MSCs' effect on late complications of radiotherapy could apply to these other disorders. MSC injection should thus be considered as a first line treatment for chronic inflammatory intestinal diseases. Acknowledgments The authors thank Sache Amandine for her technical support and the Support Group to Animal Testing (GSEA, Groupe de Soutien à l'Experimentation Animale) of the IRSN for their excellent technical assistance Competing interests : The authors declare no competing interests. Funding This work was supported by IRSN. Author contributions B. U. and A. C. : conception, manuscript writing, final approval of manuscript ; B. U. : study design, data collection, data analysis, interpretation, animal assistance ; B. L. H. , C. L. , V. H. and O. G : technical support ; M. B. : manuscript revision, final approval of manuscript work. 205 References 1. Andreyev, H. J. , et al. , Pelvic radiation disease : new understanding and new solutions for a new disease in the era of cancer survivorship. Scand J Gastroenterol, 2011. 46(4) : p. 389-97. 2. Ferlay J, S. I. , Ervik M, Dikshit R, Eser S, Mathers C, Rebelo M, Parkin DM, Forman D, Bray, F. GLOBOCAN 2012 v1. 0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide : IARC CarcerBase No. 11. 2013 [cited 2016 11/18/2016] ; Available from : 3. Burisch, J. and P. Munkholm, Inflammatory bowel disease epidemiology. Curr Opin Gastroenterol, 2013. 29(4) : p. 357-62. 4. Meng, X. M. , D. J. Nikolic-Paterson, and H. Y. 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(C) Collagen-to- MMP-to-TIMP genes ratios indicating the tendency toward ECM accumulation 4 weeks after irradiation. (D) mRNA fold changes of macrophage and T cell response show the stimulation of the M2/Th2 type response. (E) Representative images of the colon of control and irradiated rats showing the ECM (red) stained with Picrosirius red (origin magnification : 40X). 7 weeks after irradiation, animals display edema in the submucosa caused by the accumulation of ECM. (F) Representative images of the colon of control and irradiated rats stained with HES 7 weeks after irradiation (original magnification : 40X). (G) Fibrosis deposition in the colon-rectum of control and irradiated animals 7 weeks after irradiation. Percentage of fibrosis area quantified on Picroirius red stained slides showing a significant increase of ECM deposition after irradiation (H) Irradiation induces a significant thickening of the tissue in particular in the submucosa and muscularis propria, 7 weeks after irradiation. Results are expressed as mean SEM. * : p * : p * : p0. 001. Figure 2 : Effect of MSC transplantation on radiation-induced Extracellular Matrix (ECM) remodeling. (A) mRNA fold changes of genes 4 weeks after irradiation and 1 week after MSC injection, normalized to Ywhaz and standardized against control. mRNA fold changes of genes coding for CTGF and ECM components indicate the suppression of pro-fibrotic signals by MSCs. (B) Collagen-to-MMP- to-TIMP genes ratios indicating the inhibition of ECM accumulation induced by MSCs 4 weeks after irradiation. (C) 5 weeks after irradiation : MSCs stimulate the secretion of MMP-2 in the irradiated colon-rectum. (D) Percentage of fibrosis area quantified on Picroirius red stained slides. MSC significantly inhibit ECM deposition in the colon-rectum of irradiated animals, as observed 7 weeks after irradiation. (E) Representative images showing the ECM (red) stained with Picrosirius red (origin magnification : 40X). Fibrosis deposition in the colon-rectum of control (left), irradiated (middle) and irradiated MSC-treated (right) animals 7 weeks after irradiation (original magnification : 40X). Results are expressed as mean SEM. * : p * : p * : p0. 001. 210 Figure 3 : involvement of myofibroblasts and Smooth Muscle Cells (SMCs) in radiation-induced fibrosis and anti-fibrotic effects of MSCs. (A, B) mRNA fold changes of -SMA 4 weeks after irradiation and 1 week after MSC injection, normalized to Ywhaz and standardized against control. (A) MSCs inhibit the activation of -SMA-positive myofibroblasts. (B) MSCs suppress the expression of Igf-1, a potent activator of SMCs' pro-fibrotic phenotype. (C) Representative images of paraffin-embedded slides of colon-rectum samples stained for -SMA : 4 weeks and 5 weeks after irradiation (irradiated : left ; irradiated MSCs : right ; original magnification : 100X). (D, E) Quantification of -SMA-positive cells in the mucosa of the colon-rectum of irradiated of rats with or without MSC therapy. MSCs significantly reduce the amount of -SMA-positive cells in the mucosa of irradiated rats 4 weeks (a) and 5 weeks (b) after irradiation. Results are expressed as mean SEM. * : p * : p * : p0. 001. Figure 4 : Effect of MSC transplantation on macrophage polarization in the irradiated colon- rectum. (A, B) mRNA fold changes of the M2 markers Arginase-1 and Mannose receptor-1, normalized to Ywhaz and standardized against control. (C) MSCs invert the Th2/Th1 balance in favor of Th2 cells, 5 weeks after irradiation, as shown by increased Gata3/T-bet ratio gene expressions. (D) M2 polarization was identified by costaining paraffin-embedded tissue slide with DAPI (cell nuclei, blue), CD68 antibody (red) and CD206 antibody (green). M2 macrophages are shown in yellow (merge) (original magnification : 100X). MSC injection induced a strong M2 polarization of macrophages 4 weeks after irradiation. (E) MSCs favor M2 polarization compared to control and irradiated animals. (F) Survival curve of animals irradiated (red line) and irradiated and transplanted with MSCs (blue line). Risk comparison analysis showed a significant increase in survival after MSC transplantation (p 0. 048). Results are expressed as mean SEM. * : p * : p * : p0. 001. Figure 5 : Hgf silencing in transplanted MSCs induces pro-fibrotic signals in irradiated rats, and stimulate Extracellular Matrix (ECM) production (7 weeks after irradiation) (A) Protocol : two distinct groups of rats were injected with MSCs silenced respectively for HGF and TSG-6 genes. (B, C) mRNA fold changes of genes 4 weeks after irradiation, normalized to Ywhaz and standardized against control. MSCs silenced for Hgf induce a strong remodeling in the colon-rectum of irradiated rats, mainly by activating TGF- signaling (B) mRNA fold changes of genes coding for proteins of the TGF- family and ECM components (C) mRNA fold changes of genes coding for MMPs, TIMP-1 and Serpine-1. (D) Collagen-to-MMP-to-TIMP genes ratios indicating the tendency toward ECM accumulation after injection of MSCs silenced for Hgf. (E) Percentage of fibrosis area quantified on Picrosirius red stained 211 paraffin-embedded slides showing a significant increase of ECM deposition after transplantation of MSCs silenced for Hgf. Results are expressed as mean SEM. * : p * : p * : p0. 001. Figure 6 : Tsg-6 silencing in transplanted MSCs induces pro-fibrotic signals in irradiated rats, and stimulates Extracellular Matrix (ECM) production (7 weeks after irradiation). (A) mRNA fold changes of fibrosis-related genes 4 weeks after irradiation, normalized to Ywhaz and standardized against control. MSCs silenced for Tsg-6 induce a strong remodeling in the colon-rectum of irradiated rats, mainly by collagen produced by SMCs activated by IGF-1. (B) Collagen-to-MMP-to-TIMP genes ratios indicating the tendency toward ECM accumulation after injection of MSCs silenced for Tsg-6. (C) Percentage of M2 macrophages 7 weeks after irradiation (4 weeks after MSC injection), identified by CD68-CD206 co-staining. MSCs silenced for Tsg-6 stimulate the chronic activation of pro-fibrotic M2 macrophages. (D) Percentage of fibrosis area quantified on Picrosirius red stained paraffin-embedded slides showing a significant increase of ECM deposition after transplantation of MSCs silenced for Tsg- 6. Results are expressed as mean SEM. * : p * : p * : p0. 001. Figure 7 : In vitro experiments show a direct effect of MSCs and their effectors, HGF and TSG-6 on the pro-fibrotic activity of human Intestinal Fibroblasts (hIFs) and Colonic Smooth Muscle Cells (hCoSMCs). (A) hIFs and hCoSMCs were irradiated with a single 20 Gy dose, and wild-type AdMSCs, or MSCs silenced for Hgf or Tsg-6 were added in Transwells chambers 12 hours after irradiation. (B, C) mRNA fold changes of fibrosis-related genes 24 hours after MSCs addition, normalized to Gapdh and standardized against control. (B) MSCs strongly reduce the common features of pro-fibrotic myofibroblasts and the silencing of Tsg-6 counteracts their effect on -SMA, collagen III and fibronectin. (C) While MSCs inhibit the common features of pro-fibrotic SMCs, the silencing of Hgf counteracts their effect on collagen III and fibronectin. Results are expressed as mean SEM. * : p * : p * : p0. 001. 212 Figure 1 213 Figure 2 214 Figure 3 215 Figure 4 216 Figure 5 217 Figure 6 218 Figure 7 219 220 Discussion et perspectives L'objectif de cette thèse est d'évaluer les potentiels effets secondaires et le bénéfice thérapeutique de la transplantation de CSM pour le traitement des complications tardives sévères des radiothérapies. La fibrose est la complication chronique majeure des radiothérapies. Cette pathologie est invalidante et peut conduire au décès des patients. La persistance de l'inflammation du tissu sain dans le champ d'irradiation est responsable du développement de cette pathologie. A l'heure actuelle, les traitements sont palliatifs. Il est donc nécessaire de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Les pathologies inflammatoires sévères telles que la maladie du greffon contre l'hôte ou les MICI engendrent des dommages tissulaires similaires aux séquelles chroniques des radiothérapies pelviennes (PRD). De nombreux essais cliniques ont utilisés les CSM avec succès dans ces maladies. De plus l'efficacité thérapeutique des CSM sur des tissus sains irradiés a été démontrée dans le cadre d'essais compassionnels de traitement de brûlures radiologiques sévères. Les CSM semblent donc une alternative prometteuse de traitement des fibroses induites par la radiothérapie. Néanmoins, le manque de données sur les mécanismes sous-tendant l'action des CSM ne permet pas à l'heure actuelle d'assurer l'innocuité de ce type de traitement chez les patients ayant subi une radiothérapie. D'une part, la capacité des CSM à produire une large gamme de facteurs de croissance pourrait favoriser la croissance de cellules tumorales résiduelles après radiothérapie. De plus, la capacité des CSM à se différencier en cellules productrices de MEC, responsables de la fibrose, pose la problématique d'un possible effet pro-fibrosant des CSM transplantées. Cette étude a donc été développée selon trois axes principaux : (i) Évaluer l'effet des CSM sur la progression tumorale avant et après radiothérapie (ii) Évaluer l'effet des CSM sur les séquelles chroniques sévères des radiothérapies, en particulier vis-à-vis de la fibrose (iii) Mettre en évidence les mécanismes par lesquels les CSM agissent sur la tumorigénèse et la fibrogénèse colorectales Afin d'évaluer l'effet des CSM sur la progression tumorale avant et après radiothérapie, un modèle de tumorigénèse colorectale chimio-induite a été développé chez le rat Sprague-Dawley. Ce modèle présente l'avantage de développer une cancérogénèse colorectale proche de celle de l'homme. Dans ce modèle nous avons vérifié que la transplantation de CSM ne favorisait pas la croissance tumorale. Après induction de la cancérogénèse colorectale, les rats ont reçu une radiothérapie abdomino-pelvienne, puis ont reçu un traitement par CSM. Nous avons mis en évidence 221 l'effet anti-tumoral des CSM, après radiothérapie. Cette action a été associée à une amélioration de la survie des animaux transplantés. Afin d'étudier l'effet des CSM sur la fibrose colorectale radio-induite, nous avons utilisé un modèle d'irradiation colorectale à dose unique, également chez le rat Sprague-Dawley, suivi d'un traitement par les CSM au cours du développement de la fibrose. Nous avons ainsi montré que l'injection des CSM limitait le développement de la fibrose dans le contexte de la radiothérapie abdomino-pelvienne. Les mécanismes par lesquels les CSM agissent sur la tumorigénèse et la fibrogénèse colorectales mettent en évidence dans les deux cas une action des CSM sur l'inflammation. Deux médiateurs en partie responsable de cette action ont été identifiés : HGF et TSG-6. A. Mesenchymal stem cell administration inhibits colorectal cancer progression and promotes survival : mechanism of action and rationale for clinical use I. Description du modèle 1. Le modèle de cancérogène colorectale Dans l'objectif d'étudier l'innocuité des CSM sur le développement localisé de tumeurs solides, nous avons fait le choix de la MNNG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine : agent alkylant) comme carcinogène sur le côlon du rat. L'instillation intrarectale de MNNG permet l'action directe au site de dépôt sur les cellules épithéliales coliques. En effet, contrairement à d'autres carcinogènes comme l'AOM (AzOxyMethane) et la DMH (DiMéthylHydrazine), l'action cancérigène de la MNNG ne nécessite pas de métabolisation. Il n'y a pas de tumeurs dans d'autres organes suite à l'instillation intra-rectale de MNNG, et les rats gardent longtemps un bon état général. L'action de la MNNG est directe sur l'épithélium colique après instillation. Le mode d'action de la MNNG cible l'ADN sur lequel elle induit des cassures double brin ainsi que des mutations. Par ailleurs la MNNG induit une élévation du stress oxydatif et de l'inflammation locale (Narisawa et coll. , 1974). Pour étudier l'effet des CSM sur le développement des lésions précancéreuses et cancéreuses induites par la MNNG, nous avons établi le protocole suivant : les rats sont traités par instillations intra- rectales de MNNG. Un temps de latence de 2 semaines est ensuite observé afin que la MNNG résiduelle soit éliminée des organes du rat. Après ces deux semaines, deux injections intraveineuses de CSM-GFP 222 sont effectuées. La cancérogénèse colorectale a été étudiée depuis les étapes très précoces des lésions coliques induit par la MNNG, l'initiation du cancer et jusqu'au développement des adénocarcinomes. Nous avons observé chez les rats traités à la MNNG des lésions adénomateuses et adénocarcinomateuses tout à fait similaires à celles observées chez l'homme. Le microenvironnement tumoral est conditionné par la composition en cytokines et chimiokines produites par les cellules immunitaires du stroma tumoral (cellule T, NKT, NK et macrophages). Nous avons analysé les composantes inflammatoires et angiogéniques dans les côlons macroscopiquement sains et les tumeurs des rats traités injectés ou non avec des CSM. 2. Le modèle de stérilisation tumorale par irradiation fractionnée Les études s'intéressant à la radiothérapie et aux cancers colorectaux combinent une anastomose et une irradiation (à des doses moins élevées, 22-25 Gy chez le rat) sans induire préalablement de cancer colorectaux. Leur but est de se focaliser sur la réparation tissulaire (Biert et coll. , 1996, Kuzu et coll. , 1999) Notre objectif était d'analyser l'effet des CSM sur les tumeurs résiduelles et sur le tissu sain après irradiation fractionnée, ce qui justifie notre protocole. Nous avons vérifié par coloscopie la présence de tumeurs dans la partie la plus distale du côlon et ségrégé les animaux en deux groupes identiques avant radiothérapie. Ce résultat nous a permis d'utiliser une fenêtre d'irradiation n'incluant pas l'intestin grêle. Cette localisation est obtenue systématiquement avec l'instillation intra-rectale de MNNG alors que plus de 50% des tumeurs sont décelées dans le côlon plus proximal avec le traitement par DMH (Decaens et coll. , 1989). Notre protocole d'irradiation fractionnée est basé sur les travaux de Gremy et coll (Gremy et coll. , 2008), à partir desquels une gamme de dose a été effectuée de 55 à 85 Gy. La dose de 75 Gy a été retenue car elle induit des lésions similaires à celles observées chez l'homme après radiothérapie du cancer de la prostate (Beckendorf et coll. , 2002, Peiffert et coll. , 2007). Dans ce modèle nous avons montré que l'irradiation fractionnée réduit significativement la taille des tumeurs par rapport aux animaux non irradiés. 223 II. Effet des CSM 1. Évolution de la cancérogénèse colorectale après traitement par les CSM Une implantation précoce (après une semaine) et transitoire des CSM au niveau du côlon a été observé dans notre modèle. La localisation des CSM-GFP révèle à 7 jours après la dernière injection la présence de cellules positives pour la GFP dans le compartiment conjonctif du colon. Quelques cellules sont mises en évidence au niveau de la base des cryptes coliques. Les CSM ont un effet trophique sur le côlon au niveau de l'épithélium colique. Ces résultats sont en accord avec Sémont et coll. qui retrouvent des CSM-GFP dans la sous muqueuse et dans le mésentère près des vaisseaux jusqu'à une semaine après injection (Semont et coll. , 2013). Le traitement par le carcinogène induit des dommages au niveau du côlon qui se traduisent par une diminution du nombre de cryptes, de la hauteur des cryptes ainsi que du nombre de cellules en gobelet et de la prolifération cellulaire au niveau de la muqueuse colique. En revanche, les CSM restaurent ces valeurs au niveau du contrôle. Ce processus est médié en partie par une inhibition de l'inflammation. Le traitement à la MNNG induit au niveau systémique un niveau élevé de CRP et au niveau du côlon une augmentation des facteurs pro- inflammatoire comme l'IL-1, 6, TGF-, TNF- et IFN-. La présence de CSM restaure ces concentrations au niveau des contrôles et une augmentation de facteurs anti-inflammatoire associés à une polarisation de macrophages de type 2, de lymphocytes Th2, de CSM résidentes de type 2 et de T régulateurs comme décrit par Linard et coll. chez le cochon (Linard et coll. , 2013). Cet effet est également associé à la production de 9 miRNA connus pour leur action anti-inflammatoire ou anti- tumorale. Lors des étapes précoces de la cancérogénèse les CSM favorisent la réparation de la muqueuse colique comme cela a été montré sur l'intestin grêle et le côlon (Semont et coll. , 2010) et dans le traitement de la maladie de Crohn (Ringden et coll. , 2007). Les CSM inhibent la phase initiale de la cancérogénèse par action sur l'inflammation plutôt que par un effet direct sur les cellules tumorales. Comme le confirment in vitro les co-cultures de CSM avec des lignées de cellules de cancer colorectaux. En présence de CSM la prolifération de ces lignées n'est pas modifiée suite à un traitement à la MNNG. Le rôle des CSM in vitro et in vivo est analogue. Chez les rats traités avec des CSM, cette inhibition de la phase d'initiation du cancer-colorectal se traduit par un moins grand nombre de tumeurs. Ces résultats sont en opposition aux effets pro tumoraux décrits préalablement dans la littérature (Roorda et coll. , 2009) Cependant les effets pro tumoraux des CSM ont été montrés dans des modèles de co-injections de CSM et de greffe ectopique de tumeurs en modèle immunotolérant. Ces modèles ne tiennent pas compte de la composante 224 inflammatoire et immunitaire qui sont essentielles dans l'action des CSM sur l'initiation de la cancérogénèse colorectale (Hass et Otte, 2012). Dans les phases tardives à 32 et 52 semaines après instillation de la MNNG, lors du développement des adénomes puis des adénocarcinomes, le traitement par les CSM ralenti la progression tumorale. Bien que présentes très transitoirement après leur injection, les CSM agissent de manière durable sur la progression tumorale, plus d'un an après avoir disparu. Ce phénomène passe par une modification immunitaire du microenvironnement tumoral. Le microenvironnement tumorale est un élément essentiel de la cancérogénèse en produisant un effet anti-inflammatoire (Fessler et coll. , 2013, Quail et Joyce, 2013). Les études antérieures décrivent les propriétés immunosuppressives des CSM au niveau du microenvironnement, favorisant la croissance tumorale. En effet, in vitro, les CSM sont immunosuppressives sur les cultures de cellules T au sein d'une réaction mixte lymphocytaire (Nasef et coll. , 2007, Nasef et coll. , 2007, Nasef et coll. , 2008), les lymphocytes B (Corcione et coll. , 2006) et les cellules dendritiques (Ramasamy et coll. , 2007). Dans un modèle de cancérogénèse colorectale similaire au nôtre, un résultat opposé est observé. Une infiltration accrue par les cellules immunitaires (CD3 ) de phénotype Th1, Treg, Th17, des lymphocytes NK et une diminution du nombre de macrophages M1 au niveau des adénocarcinomes sont observées chez les rats qui ont été injectés avec des CSM. Ces résultats démontrent que les CSM reversent le microenvironnement tumoral depuis un état anti vers un état pro-inflammatoire. Cet environnement pro-inflammatoire est particulièrement défavorable à la croissance tumorale qui se traduit par une réduction de la taille des tumeurs chez les rats traités par administration de CSM. Pour résumer l'action des effets anti-tumoraux des CSM sur la progression de la cancérogénèse colique peuvent être attribués à : - une modification précoce du microenvironnement de la muqueuse colique par sécrétion de facteurs trophiques par les CSM, comme cela a été décrit dans de nombreux processus de cicatrisation (Semont et coll. , 2013, Bessout et coll. , 2015). La conséquence est l'inhibition de l'initiation du cancer, ce qui se traduit par un moins grand nombre de tumeurs après transplantation de CSM. - un effet anti tumoral direct lors du développement des tumeurs par la modification du microenvironnement tumoral. La conséquence est une l'inhibition du développement 225 de la cancérogénèse. Le résultat est une taille des tumeurs plus petite pour les rats traités par les CSM. - une survie accrue des animaux traités par injection de CSM. 2. Évolution de la cancérogénèse colorectale et des tissus sains irradiés après radiothérapie puis traitement par les CSM Les résultats majeurs de cette étude sont que le traitement par les CSM diminue la taille des tumeurs après irradiation fractionnée de manière accrue par rapport aux animaux qui n'ont pas reçu de CSM, et protège le tissu sain des effets délétères de l'irradiation. De plus le traitement par les CSM accroit notablement la survie des animaux. Au niveau du côlon sain irradié, un processus de réparation aberrant est observé, associé à une inflammation chronique, une accumulation excessive de matrice et une désorganisation vasculaire aboutissant à une fibrose comme décrit par Bessout et coll. chez le rat (Bessout et coll. , 2014) et Linard et coll. chez le cochon (Linard et coll. , 2013). La désorganisation de la muqueuse colique et la fibrose sont corrigées par l'injection de CSM. L'irradiation fractionnée induit une augmentation du TGF- et de TIMP-1, tandis que l'injection de CSM restaure un niveau similaire au témoin non irradié et augmente la production de VEGF. Au niveau moléculaire, l'injection de CSM ne modifie pas les facteurs pro-inflammatoires par rapport aux animaux irradiés mais diminue les ARNm du TGF- et augmente les ARNm de TFF3 (TreFoil Factor 3), HGF et VEGF montrant un effet trophique des CSM sur le colon irradié en accord avec les résultats publiés par Bessout et coll chez le rat et Linard et coll. chez le cochon (Linard et coll. , 2013, Bessout et coll. , 2015). III. Conclusion En conclusion l'ensemble de ces résultats montrent pour la première fois que l'administration de CSM augmente la survie des animaux exposés à un carcinogène en diminuant l'initiation et la progression du cancer colorectal. Après irradiation fractionné les CSM inhibent les tumeurs résiduelles et protègent le tissu sain de l'irradiation, prolongeant ainsi la survie des animaux. Ces résultats sont en faveur de l'utilisation des CSM pour le traitement des complications sévères des radiothérapies pelvienne sous réserve que les CSM ne favorisent pas la fibrogénèse radio-induite. 226 B. Article 2 : Mesenchymal Stromal Cells attenuate radiotherapy-induced colorectal fibrosis through the release of HGF and TSG-6 I. Le modèle d'irradiation à 29 Gy en dose unique 1. Le choix du modèle Depuis les prémices de la recherche sur les effets des radiothérapies, de nombreux modèles d'étude des effets de l'irradiation abdomino-pelvienne ont été mis en place. Nous avons choisi le modèle d'ulcération colorectale radio-induite chez le rat Sprague-Dawley, développé au sein de notre Institut (Jullien et coll. , 2009). Le protocole consiste à irradier une fenêtre colorectale de 2 par 3cm à une dose unique de 29 Gy délivrée par un accélérateur médical à rayonnements X (2, 43 Gy. min-1). L'irradiation est réalisée sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane, sur des animaux de 250 à 300 g. Les protocoles de radiothérapie sont la plupart du temps échelonnés par fractions de dose (2 Gy en général), la pertinence d'un modèle dose unique peut être remise en cause. Le fractionnement des doses permet d'améliorer l'efficacité de la radiothérapie, en exploitant la plus grande radiorésistance des cellules saines comparées aux cellules cancéreuses. Cependant, la plus grande radiorésistance des rongeurs et le temps nécessaire à l'application d'un protocole de radiothérapie fractionnée induisant la fibrose chez le rat ont rendu nécessaire le développement de nouveaux modèles. Plusieurs études ont ainsi montré que l'application d'une dose unique élevée de rayonnements ionisants produit des lésions plus proches de celles observées chez l'Homme (Gremy et coll. , 2008, Francois et coll. , 2013, Semont et coll. , 2013). Le modèle d'irradiation colorectale à 27 Gy produit des dommages sévères et irréversibles similaires à ceux observés chez des patients ayant été traité par irradiation fractionnée. Ces lésions sont principalement caractérisées par l'ulcération de la muqueuse colique et la mise en place d'un processus inflammatoire chronique participant à l'établissement de la fibrose (Francois et coll. , 2013, Semont et coll. , 2013). Chez le rat, le côlon est constitué d'un seul segment longitudinal peu mobile, à l'inverse de l'humain, permettant la reproductibilité de l'irradiation entre chaque animal. Les irradiations sont réalisées exclusivement sur des rats mâles afin de s'affranchir des incertitudes liées au cycle menstruel. La fenêtre d'irradiation est localisée entre les testicules de l'animal et l'intestin grêle. En effet, au-delà du risque d'erreur sur le modèle en lui-même, l'irradiation de ces organes, en particulier de l'intestin grêle, induit une mortalité élevée dans les jours suivant l'irradiation. 227 Au cours de cette étude, nous avons utilisé un irradiateur médical à rayons X, différent de l'irradiateur au 60Co (rayons ) employé à l'origine dans ce modèle. La caractérisation des lésions produites sur le nouvel irradiateur au sein de notre laboratoire a mis en évidence des dommages moins sévères que ceux observés après irradiation au 60Co. Une gamme de doses croissantes a été appliquée à des rats selon le protocole d'irradiation classique et nous a permis de déterminer qu'une irradiation à 29 Gy produisait des atteintes identiques à celles observées précédemment. Cette dose a donc été utilisée au cours de notre étude. 2. Transplantation de CSM Les animaux ont été traités par deux injections de CSM issu du tissu adipeux de rats GFP. Les animaux ont reçu 5 millions de CSM par voie intraveineuse à deux et trois semaines après irradiation. Pour l'étude de l'impact de HGF et TSG-6 dans l'effet des CSM, nous avons réalisé la transfection des siRNA au 5ème jour de culture puis la transplantation 2 jours après. Les injections ont été réalisées selon le même protocole, et les animaux ont été euthanasiés 1, 2 et 4 semaines après transplantation, afin d'évaluer la cinétique d'évolution de la lésion. II. Description de la lésion Le modèle d'irradiation colorectale dose unique à 29 Gy induit des lésions aiges entre 7 et 14 jours, caractérisées notamment par l'ulcération de la muqueuse. Les lésions évoluent par la suite vers la fibrose, dont le développement est observable 7 à 8 semaines après irradiation. A 3 jours, l'analyse histologique du tissu irradié permet d'observer une augmentation de l'infiltrat leucocytaire. L'ulcération du tissu est maximale autour de 7 jours, avec une dénudation complète de l'épithélium. On observe la perte de l'architecture normale des cryptes après J7. L'infiltrat inflammatoire est maximal à J14, avec une forte densité de neutrophiles, de macrophages, de mastocytes et de lymphocytes T activés (Bessout et coll. , 2014). On observe une régénération partielle de la muqueuse à partir de J21, laissant toutefois apparaitre de longues plages d'ulcération, parfois profondes (Bessout, 2012, Bessout et coll. , 2014). L'impossibilité de régénérer le tissu, entre autres en raison d'une inflammation latente, produit la fibrose observable 7 semaines après irradiation. La fibrose est associée à un épaississement du tissu, caractérisé par une hyperplasie des zones de muqueuse en régénération ainsi que de la musculaire propre, un épaississement de la sous-muqueuse résultant de l'augmentation du dépôt de matrice, une sténose des vaisseaux et une accumulation de matrice dans les tuniques musculaires. 228 Dans les semaines suivant l'irradiation, de fréquentes diarrhées sont observables chez les animaux. Cela est notamment dû à l'ulcération de la muqueuse et au défaut de perméabilité en résultant, entrainant une mauvaise absorption des éléments du bol alimentaire. La fibrose envahissant notamment la musculaire propre, est probablement en partie à l'origine de l'occlusion intestinale observée à des temps plus tardifs (6 à 10 semaines environ) et responsable dans la majorité des cas du décès de l'animal. Il semble en effet que la fibrose participerait, avec l'altération de la fonctionnalité du système nerveux entérique, à limiter la contractibilité des muscles du côlon-rectum et donc à empêcher l'avancée du bol alimentaire (Bessout et coll. , 2015). L'épaississement du tissu contribue également à ce phénomène par la sténose de l'intestin. L'autopsie des animaux permet d'observer dans le cas d'une occlusion une augmentation de la surface de la lumière intestinale, associée à un épaississement conséquent (jusqu'à dix fois l'épaisseur du côlon des animaux non irradiés) et parfois à une nécrose de la muqueuse. 1. Évolution de la lésion tardive Dès 4 semaines, on observe une augmentation du dépôt de matrice extracellulaire au sein du tissu, notamment dans la sous-muqueuse. Nous avons étudié l'évolution de la fibrogénèse à partir de ce temps et nous concentrerons donc sur cette période au cours de la discussion. a. Remodelage matriciel Dès 4 semaines, l'irradiation provoque un phénomène de remodelage matriciel conséquent, matérialisé par une augmentation du dépôt de matrice au sein du tissu, ainsi qu'une augmentation de l'expression de gènes codant pour : - des éléments de la MEC : collagène I, collagène III, fibronectine, Sparc - des métalloprotéinases : MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13, MMP-14 - - les inhibiteurs de métalloprotéinases : TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 et TIMP-4 les éléments du système du plasminogène : plasminogène, tPA (tissue-type Plasminogen Activator), PAI-1 L'augmentation de l'expression de ces gènes est en accord avec des observations réalisées auparavant sur des modèles in vivo ainsi que chez des patients souffrant d'entérite radique. Après une irradiation abdominale à 10 Gy chez le rat, Strup-Perrot et coll. ont noté une augmentation de l'expression de plusieurs MMP (-2, -3, -9 et -14) (Strup-Perrot et coll. , 2006). Sur le même modèle, l'augmentation de l'expression des TIMP-1 et -2 a également été démontrée (Strup-Perrot et coll. , 2005). Des résultats similaires ont été obtenus sur des biopsies de patients atteints d'entérite radique 229 et présentant une augmentation de l'expression des MMP (-1, -2, -18, -19, -14 et -3), TIMP (-1 et -2) et collagènes (type I et type III) (Strup-Perrot et coll. , 2004). Le système du plasminogène joue également un rôle important dans le développement des lésions radiques et de la fibrose. La plasmine est une des principales enzymes responsables de l'activation des MMP et exerce une activité directe de dégradation de la matrice extracellulaire (sur la fibronectine, la laminine, le collagène IV) (Deryugina et Quigley, 2012). D'autre part, PAI-1 est un inhibiteur indirect de l'activation des MMP en inhibant le clivage du plasminogène, et sa surexpression est classiquement retrouvée au cours de l'entérite radique (Vozenin-Brotons et coll. , 2004, Milliat et coll. , 2008). Le calcul des ratios d'accumulation/dégradation de MEC (CMP : collagen-to-MMP-to-TIMP : collagène sur MMP sur TIMP) (Sandler et coll. , 2003) indique une forte tendance à l'accumulation de MEC, précédemment observée au cours de l'entérite radique (Strup-Perrot et coll. , 2004) et dans des modèles animaux chez le cochon (Linard et coll. , 2013) et le rat (Bessout et coll. , 2015). Il semble donc, en accord avec les hypothèses formulées au cours d'études précédentes, que l'accumulation de MEC soit due à un dysfonctionnement du système de production/dégradation, plutôt qu'à une sous-expression des MMP au profit des éléments de la MEC et des TIMP. De plus, malgré l'augmentation de l'expression du plasminogène, PAI-1 pourrait inhiber son activation et le clivage des Pro-MMP par la plasmine. Ainsi, une diminution de l'activité des MMP serait responsable du défaut de dégradation de la MEC. L'augmentation de l'activation de la voie TGF-/Smad est généralement associée au développement de la fibrose. Nos résultats suggèrent une faible implication des protéines de la voie TGF-/Smad au cours de la fibrogénèse, à partir de 4 semaines. TGF-1 et 3 sont légèrement surexprimés dès 4 semaines, alors que TGF-2 est sous-exprimé. De plus, le dosage du TGF-1 total au sein du tissu indique une diminution de sa concentration chez les animaux irradiés dès 4 semaines, devenant significative à 7 semaines. En revanche, la diminution de l'expression des inhibiteurs de la voie Smad (Skil, TGIF1, Smad 6 et Smad 7) pourrait conduire à une perte d'inhibition des Co-Smad et donc à une augmentation de la transcription de leurs gènes cible (Figure 32). Cela pourrait notamment impliquer l'augmentation de l'expression des gènes impliqués dans la production/dégradation de MEC (collagènes, MMP, TIMP, marqueurs des myofibroblastes). 230 Figure 32 : voies d'activation et de répression du signal TGF- pendant la fibrose. Ce résultat n'a à notre connaissance pas encore été décrit dans la littérature. L'augmentation de l'expression de TGF-1 est un évènement précoce observé lors de l'entérite radique (Francois et coll. , 2013) ainsi que dans les modèles animaux (Martin et coll. , 2000). Dans l'intestin grêle de rats, la concentration en TGF-1 est augmentée dès le premier jour et jusqu'à plus de 26 jours après irradiation (Langberg et coll. , 1994). Néanmoins, dans la peau irradiée chez le cochon (Martin et coll. , 1997) et chez la souris (Randall et Coggle, 1995), l'expression de TGF-1 revient à son état basal entre 24 et 48 heures après irradiation. Ces résultats suggèrent que la surexpression de TGF-1 est précoce, transitoire et suffisante pour induire la fibrose dans notre modèle. Cependant, l'activité de TGF-1 est aussi régulée par la disponibilité de sa forme active dans le microenvironnement. TGF-1 peut être activé par différents facteurs : MMP-2 et -9, la thrombospondine, certaines intégrines et les ROS. Dès 4 semaines, nous avons observé une augmentation de l'expression de la thrombospondine, de MMP-2 et -9 et de nombreuses intégrines. La concentration de MMP-2 était significativement augmentée chez les animaux irradiés au cours de notre étude. Ces résultats suggèrent l'augmentation de la disponibilité en agents activateurs de TGF-1 et pourraient impliquer l'accroissement de son activité. Le CTGF amplifie l'effet de TGF- au cours de la fibrose en favorisant sa fixation à son récepteur TGF-R2. Son expression est élevée au cours de la fibrose intestinale radio-induite (Vozenin-Brotons et coll. , 2003). Lors de la phase tardive de l'entérite radique, une expression élevée de CTGF est observée, associée à une concentration faible de TGF-1 (Vozenin-Brotons et coll. , 2003). L'augmentation élevée de CTGF permettrait ainsi d'entretenir la fibrose en l'absence de TGF-1. Au cours de notre étude, nous avons observé un niveau d'expression identique de CTGF chez les animaux 231 irradiés, comparé aux non-irradiés. Ces résultats suggèrent que la fibrogénèse est entretenue par des mécanismes indépendants de la voie TGF-/Smad dans ce modèle. b. Cellules pro-fibrosantes Les myofibroblastes sont les principales cellules responsables de la production de MEC au cours de la fibrose. Ils sont activés par différentes voies, la principale étant la voie canonique TGF- /Smad. Le côlon-rectum comprend trois principaux types cellulaires résidents pouvant produire la MEC : les fibroblastes sub-épithéliaux, les myofibroblastes (sub-épithéliaux et CIC) et les CML. Nous avons souhaité évaluer l'évolution phénotypique de ces cellules au sein du côlon-rectum des rats irradiés. i. Myofibroblastes et fibroblastes Chez les patients atteints de fibrose intestinale radio-induite, une augmentation du nombre de myofibroblastes a été observée dans la muqueuse et la sous-muqueuse intestinales (Vozenin- Brotons et coll. , 2003). Nous avons également noté une quantité élevée de cellules positives à -SMA au sein de la muqueuse, pouvant en partie expliquer le dépôt matriciel dans ce compartiment. L'activation et la prolifération des myofibroblastes dans ce modèle sont soutenues par la surexpression de facteurs de croissance et cytokines pro-fibrosantes : Akt1, Ilk, IL-1, IL-1, EGF et FGF-2. Ces facteurs favorisent la prolifération des fibroblastes et myofibroblastes, et induisent l'EMT. En particulier, IL-1 est capable d'induire l'activation des myofibroblastes en favorisant la réponse Th17 par un mécanisme indépendant de TGF-1, soutenant davantage l'implication de mécanismes indépendants de cette voie (Ghoreschi et coll. , 2010). A l'inverse, un nombre négligeable de cellules -SMA était présent dans la sous-muqueuse, à l'exception des cellules musculaires lisses vasculaires. L'activation des cellules musculaires lisses de la musculaire muqueuse et du musculaire propre, serait à l'origine de l'épaississement de la sous- muqueuse due à la surproduction de MEC, apparent dès 4 semaines et non pas au recrutement de myofibroblastes au sein de la sous muqueuse. ii. Cellules musculaires lisses (CML) La stimulation de CML intestinales isolées de fibroses radiques par TGF-1 induit une faible activation de Smad3 et Smad4 (Haydont et coll. , 2005). Il semble en effet que le signal de TGF-1 soit préférentiellement transmis par la voie Rho/ROCK au cours de la phase chronique de la fibrose radique. 232 Les CSM productrices de MEC issues de patients souffrant de fibrose intestinale radio-induite présentent un phénotype immature, caractérisé par une diminution du ratio -SMA/-SMA et une activité élevée de RhoA (Haydont et Vozenin-Brotons, 2007). FGF-2 et PDGF-BB sont capables d'activer la voie Rho/ROCK et de bloquer ainsi la maturation des CML. Au cours de notre étude, nous avons observé une surexpression de ces deux facteurs de croissance 4 et 5 semaines après irradiation. Ceci pourrait expliquer l'augmentation de la production de MEC par la promotion du phénotype pro- fibrosant des CML. Néanmoins, nous avons observé une légère augmentation du ratio -SMA/-SMA 4 semaines après irradiation, suivie d'un retour à un état basal à 5 semaines. La maturation des CML est fortement stimulée par l'activation, entre autres, de PI3K et Akt par IGF-1 (Lim et coll. , 2007). Dans notre modèle, une forte expression de IGF-1 et Akt1 est observable jusqu'à 7 semaines et pourraient expliquer un ratio -SMA/-SMA proche de l'état basal. À l'inverse, la fixation de l'IGF-1 à son récepteur induit une cascade d'activation de la voie Rho/ROCK et pourrait donc activer le phénotype sécrétoire des CML, comme il a notamment été montré dans des cultures de CML coliques (Simmons et coll. , 2002). Chen et coll. ont montré que l'expression de l'IL-1 était nécessaire pour l'activation par PDGF-BB, à travers la voie PI3K/Akt, du phénotype sécrétoire des CML aortiques (Chen et coll. , 2006). Il existe des interconnexions entre les voies Rho/ROCK et la voie PI3K/Akt (Yang et coll. , 2012), qui pourraient être à l'origine d'une amplification du phénomène d'activation des CML au cours de la fibrose. Un autre effet notable induit par l'irradiation colorectale dans notre modèle est l'épaississement du tissu, et plus spécifiquement de la musculaire propre. Cette caractéristique est observée au cours de la maladie de Crohn (Graham, 1995) et de l'entérite radique (Haydont et Vozenin- Brotons, 2007). IGF-1 peut induire l'hyperplasie des CML du côlon et pourrait donc être responsable de l'épaississement de la musculaire propre et de la sténose du tissu menant à l'occlusion chez la majorité des animaux irradiés. Cette donnée tend à valider l'activation des CML par IGF-1. Les CML expriment -SMA de manière constitutive, ce qui leur confère leur contractibilité. Néanmoins, le phénotype immature des CML se caractérise par une activité contractile réduite au profit de la sécrétion de diverses molécules, en particulier des composants de la MEC (Brittingham et coll. , 1998). Cette modification phénotypique des CML est illustrée par la perte de mobilité dans l'intestin après irradiation (Husebye et coll. , 1994), qui a également été observée au cours d'une précédente étude sur le modèle que nous avons utilisé (Bessout et coll. , 2015). La perte de contractibilité de la musculaire propre, dont les deux couches perpendiculaires assurent les mouvements péristaltiques du côlon, pourrait participer à la survenue de l'occlusion. 233 c. Inflammation Nous avons souligné précédemment l'importance de la composante inflammatoire lors du développement de la fibrose. La lésion initiale induit la mise en place d'une réaction inflammatoire prolongée, voire chronique par différents mécanismes, en particulier par la destruction directe (effets à l'ADN) ou indirecte (production de ROS) des cellules résidentes. Nous avons souhaité mettre en évidence l'impact de cette composante dans le modèle d'irradiation colorectale dose unique. i. Apoptose/prolifération dans la muqueuse L'apparition d'ulcères conséquente à l'apoptose des cellules épithéliales est l'un des premiers évènements survenant suite à l'irradiation. Les précédentes études sur notre modèle ont montré l'apparition de plages de régénération de l'épithélium à partir de la 3ème semaine. À partir de la 4ème semaine, nous avons observé une augmentation de la surface positive pour PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) au sein de la muqueuse des animaux irradiés. Cette stimulation de la prolifération a été maintenue à un niveau supérieur à celui des animaux non-irradiés jusqu'à la fin de l'étude. FGF-2 et EGF, deux facteurs de croissance activateurs de la prolifération des cellules épithéliales étaient surexprimés 4 et 5 semaines après irradiation. La production prolongée de ces facteurs de croissance pourrait expliquer la forte prolifération observée au sein de la muqueuse, et participe au remaniement constant de l'architecture du tissu. En accord avec les descriptions précédentes de ce modèle, nous avons démontré une augmentation de l'apoptose au sein de la muqueuse, maximale 5 semaines après irradiation. 7 semaines après irradiation, la muqueuse présentait un niveau d'apoptose similaire à celui des animaux non irradiés. L'apoptose des cellules résidentes est l'un des éléments déclencheurs et d'entretien de l'inflammation au cours de la fibrose. ii. Profil inflammatoire L'augmentation de l'apoptose induite par l'irradiation entraine une forte inflammation au sein des tissus sains. Le système immunitaire est initialement activé par la reconnaissance des motifs associés aux dommages cellulaires (DAMP) et aux pathogènes (PAMP) d'une part, et, d'autre part, par l'induction de la production de chimiokines par les cellules endommagées, puis les leucocytes (Francois et coll. , 2013). Dans le tractus gastro-intestinal, l'épithélium de surface à une fonction de protection à 234 l'entrée des pathogènes dans l'organisme. La forte radiosensibilité de cet épithélium augmente le risque d'infection causé par d'ulcération radio-induite et donc l'activation des leucocytes. Ces signaux initiaux de la lésion, avec les cytokines produites par les cellules résidentes puis recrutées, orientent la réponse inflammatoire afin d'organiser au mieux la réparation du tissu. Les animaux irradiés au cours de nos travaux présentaient à 4 semaines un profil d'expression fortement inflammatoire, s'atténuant à 5 semaines pour rejoindre à 7 semaines un état proche des animaux sains. Nous avons observé la surexpression de gènes codant pour : - des chimiokines et récepteurs de chimiokines : CCL2 et son récepteur CCR2, CCL3, CCL11, CXCR4 - des cytokines pro-inflammatoires : IL-1, IL-1, IL-6 - des cytokines anti-inflammatoires : IL-10, HMOX1 (HeMe Oxygenase 1) - des marqueurs de la différenciation des lymphocytes T : Foxp3 (Foxhead box P3), Gata3, Ror- (RAR-related orphan receptor gamma), T-bet (TBX21 : T-BoX transcription factor 21) - des marqueurs des macrophages : Arg1 (Arginase 1), Mrc1 (Mannose Receptor C type 1), iNOS. De nombreuses cellules immunitaires sont recrutées lors de la phase initiale de la lésion radio- induite : neutrophiles, lymphocytes et monocytes. La surexpression de chimiokines par les cellules résidentes (cellules endommagées et macrophages) est à l'origine de la mobilisation des éléments du système immunitaire. Réponse T Lors de la réponse immunitaire adaptative, l'infiltration des lymphocytes T est une réponse classique des irradiations localisées aux tissus sains, notamment lors de la phase chronique de l'inflammation (Francois et coll. , 2013). La présentation de l'antigène par les CPA induit la différenciation des lymphocytes T CD4 en différents sous-groupes possédant des orientations immunitaires distinctes : Th1, Th2, Th17 et Treg. Dans le côlon-rectum, Grémy et coll. ont montré l'apparition d'une réponse Th2 prononcée après irradiation et maintenue jusqu'à 6 mois, accompagnée d'une suppression de la réponse Th1 (Gremy et coll. , 2008). Dans notre modèle, les réponses Th1 et Th2, caractérisées respectivement par l'expression de T-bet et Gata3 (Gremy et coll. , 2008), sontt modifiées à 4 et 5 semaines. Le ratio T- 235 bet/Gata-3 indiquait une forte réponse de type Th2 à 4 semaines. À 5 semaines, il semble que la réponse soit inversée en faveur d'une réponse Th1, pour retourner à un état basal à 7 semaines avec une faible surexpression de Gata3. Dans un modèle infectieux, par un effet de rétrocontrol, iNOS réprime la réponse Th1 au profit de la réponse Th2 (Lawrence et coll. , 2000). La forte expression d'iNOS à 4 semaines, puis da répression à 5 semaines pourrait expliquer la levée de la répression des Th1. L'augmentation des Treg, qui semble être caractéristique de la réponse intestinale à l'irradiation, est caractérisée dans notre modèle par une surexpression persistante de l'IL-10 associée à l'augmentation à 4 et 5 semaines de l'expression de Foxp3, le facteur de transcription majoritairement exprimé par les Treg. L'expression de l'IL-10 est maintenue à 7 semaines, sans surexpression de Foxp3, suggérant ainsi une autre source de cette cytokine, telle que les macrophages M2. Bessout et coll. ont montré une augmentation de la proportion de lymphocytes Treg et Th17 dans le modèle d'irradiation colorectale (Bessout et coll. , 2015). Lors de cette étude, la réponse T régulatrice semblait défective, l'expression de l'IL-10, caractéristique des Treg, n'étant pas corrélée à l'augmentation du nombre de cellules. Dans l'intestin grêle, bien que l'infiltration de Treg soit élevé, ces cellules présentent un défaut de leurs fonctions immunosuppressives observé jusqu'à 90 jours après irradiation (Billiard et coll. , 2011). Dans cette dernière étude, il a été démontré que les Treg maintenaient un niveau d'expression élevé de l'IL-10. La réponse Th17 est induite par l'IL-1 et caractérisée par la production de quantités élevées de TGF-1 et d'IL-17. Les lymphocytes Th17 ont été associés au développement de la fibrose dans plusieurs organes, et notamment dans le côlon-rectum après irradiation (Cf. Th17). Malgré l'expression forte de l'IL-1, TGF-1 reste marginalement surexprimé, voire sous-exprimé au cours de l'étude. Dans un modèle de GVHD chez la souris, le blocage du récepteur à l'IL-1 inhibe la différenciation des cellules T en Th17 (Park et coll. , 2015). Il pourrait donc exister un système d'inhibition de la réponse Th17 agissant directement sur la signalisation de l'IL-1. Malgré ces observations, l'expression de RORC, impliquée dans la différenciation des cellules T CD4 en Th17, reste augmentée pendant l'étude. Le profil d'expression des marqueurs de différenciation des lymphocytes T suggère la présence d'un fort infiltrat immunitaire 4 semaines après irradiation, suivi par une diminution progressive jusqu'à 7 semaines. La présence de nombreux Th2, dont l'activité pro-fibrosante a été identifiée dans de nombreux modèles, pourrait justifier pour partie l'accumulation de MEC au sein du tissu. Les Th2 favorisent la fibrose en activant la synthèse de collagène par les fibroblastes (Barron et Wynn, 2011). Associée à cette réponse pro-fibrosante, la persistance de lymphocytes Th1 participerait au maintien de l'inflammation caractéristique de la phase chronique du développement de la fibrose. 236 Réponse des macrophages L'irradiation induit un recrutement massif et chronique de macrophages au site de la lésion (Linard et coll. , 2008, Blirando et coll. , 2011, Linard et coll. , 2013). Nous avons également observé une augmentation significative de l'infiltrat de macrophages au sein du côlon des animaux irradiés à 4 semaines. Cette infiltration de macrophages est associée à l'augmentation de l'expression d'Arg1, Mrc1 et Nos2, trois marqueurs spécifiques de ce type cellulaire. 7 semaines après irradiation, nous n'avons pas noté de différence de densité de macrophages entre les animaux irradiés et contrôles, et l'expression des marqueurs de macrophages était proche de l'état basal. Le recrutement des macrophages est principalement réalisé via la production de CCL2 et CCL3 par les cellules résidentes. Le récepteur CCR2 présent sur les macrophages permet leur chimiotactisme. Au cours de notre étude, ces 3 facteurs étaient surexprimés dès 4 semaines, suggérant leur implication dans l'augmentation de l'infiltrat de macrophages. CCL2 est produit par de nombreux types cellulaires, dont les fibroblastes, cellules endothéliales, cellules épithéliales, les CML et les monocytes eux-mêmes (Deshmane et coll. , 2009). CCL3 est principalement produit par les macrophages et cellules épithéliales (Smith et coll. , 1994). Les dommages importants induits à l'épithélium et l'endothélium par l'irradiation pourraient expliquer la production importante de ces chimiokines. D'autre part, les macrophages sont en mesure d'induire le recrutement et la différenciation de monocytes circulants, amplifiant la chronicité de l'inflammation. Dans l'intestin, les macrophages sont d'importants producteurs de MMP et de TIMP, en particulier MMP-1, -3, -9, -12 et -13 favorisent la production de MMP-9 par les cellules T en les activant par l'IL-1 (Pender et coll. , 1997, Schuppan et Hahn, 2000). L'augmentation de leur infiltration dans le tissu pourrait en partie expliquer la modification du profil de remodelage collagen-to-MMP-to-TIMP. La polarisation des macrophages, déterminante dans leur fonction, est fortement influencée par la composition de la population de lymphocytes T. Les macrophages classiquement activés, M1, sont pro-inflammatoires et donc souvent associés à la mise en place de l'inflammation responsable de la fibrose. Les macrophages alternativement activés, M2, sont considérés comme anti-inflammatoires et favorisant notamment le remodelage matriciel. Chez le cochon, l'augmentation de la proportion de macrophages M2 est associée à l'amélioration de la fibrose (Linard et coll. , 2013). Au cours de notre étude, nous n'avons pas observé de différence dans la proportion de macrophages M2 au sein du tissu. Il semble donc que l'augmentation du nombre de macrophages soit 237 accompagnée du maintien de l'équilibre de la polarisation des macrophages, accompagné par la surexpression de marqueurs de la réponse M1 (Nos2) et M2 (Arg-1, Mrc-1) à 4 semaines. Plus particulièrement, la présence d'un fort infiltrat de M1 est observée dans la muqueuse, ce qui est en accord avec l'apoptose élevée trouvée au sein du tissu. En effet, les M1 sont principalement activés par la reconnaissance de PAMP et de DAMP, élevés dans notre cas en raison de l'ulcération de la muqueuse. De même, la quasi-totalité des macrophages M2 sontt localisés dans la sous-muqueuse. Les M2 sont classiquement associés aux phases chroniques de la fibrose et au remodelage matriciel, et leur localisation au niveau de la sous-muqueuse dans notre modèle pourrait expliquer l'hypertrophie de la sous-muqueuse. Il existe des connexions entre la réponse des cellules T et celle des macrophages. La différenciation des lymphocytes T CD4 est en générale précédée ou suivie par l'acquisition d'un profil similaire des macrophages. Les macrophages M2 sont activés par et promeuvent la réponse anti- inflammatoire Th2. Dans notre modèle, la promotion de la réponse Th2 par les M2 est supportée par la surexpression de nombreux marqueurs des M2 : IL-10, IGF-1, Arg-1, MRC-1, MMP-12, PDGF, VEGF et fibronectine (Lech et Anders, 2013). Ces macrophages pourraient donc participer à la production de l'IL-10 et expliquer les résultats obtenus par Bessout et coll. qui avaient observé après irradiation une augmentation de Treg sans augmentation de l'expression de l'IL-10. Ces résultats pourraient également expliquer la surexpression de l'IGF-1 et l'activation des CML par un processus indépendant de TGF-1. Bien que nécessaire afin de limiter l'inflammation au sein du tissu, la réponse M2 a été associée à l'apparition de la fibrose dans plusieurs modèles (Wynn et Barron, 2010). En particulier, dans un modèle de fibrose pulmonaire, la polarisation M2 est nécessaire à la mise en place de la réponse Th2 responsable de l'initiation de la fibrose (Migliaccio et coll. , 2008). La réponse M1 était maintenue chez les animaux irradiés au cours de l'étude. Les macrophages M1 favorisent l'inflammation dans le tissu en produisant des cytokines pro-inflammatoires dont nous avons observé la surexpression : CCL-2, CCL-3, IL-1 et IL-6. Ces cytokines participent au recrutement de nouveaux macrophages ainsi qu'à l'activation des myofibroblastes. Elles permettent aussi d'entretenir la réponse M1 de manière autocrine (Wynn et Vannella, 2016). Le maintien d'un pool important de M1 est en accord avec la présence d'un infiltrat de cellules Th1, comme suggéré précédemment. Ces macrophages sont également responsables de la production massive de ROS, nécessaires à leur action bactéricide. 238 d. Mécanismes de développement de la fibrose dans le modèle d'irradiation colorectale dose unique Il existe relativement peu de données sur le développement de la fibrose colorectale radio- induite. Néanmoins, les précédentes études réalisées sur des modèles similaires au notre permettent d'émettre des hypothèses sur les mécanismes impliqués. L'irradiation induit une augmentation rapide de l'inflammation au sein du tissu, avec le recrutement de différentes populations de leucocytes chargés de la clairance des débris cellulaires et des pathogènes, ainsi que de la réparation du tissu. L'augmentation de la proportion de lymphocytes Th2 et de la quantité de macrophages M2 lors de la phase chronique permet de réduire l'inflammation et de promouvoir le remodelage matriciel nécessaire à la régénération. Cette phase est également caractérisée par la production importante de médiateurs de la fibrose, tels que TGF-1 et CTGF. 2. Conclusion Notre étude suggère que TGF-1 et CTGF ne sont pas impliqués dans la phase chronique de la pathologie, caractérisée par une population mixte de lymphocytes T et de macrophages participant à la mise en place de l'inflammation chronique et de la fibrogénèse (Figure 33). L'augmentation de l'apoptose et de la prolifération au sein de la muqueuse suggère un remaniement permanent de l'architecture tissulaire, caractéristique d'un processus de réparation défectueux. Cette étape est marquée par la production d'autres molécules pro-fibrosantes, en particulier PDGF, et par une production de MEC excédentaire. La surexpression des TIMP favorise l'accumulation de MEC en bloquant l'activité enzymatique des MMP, également surexprimés. La production de facteurs de croissance et cytokines stimulateurs de fibroblastes, tels que FGF-2, pourrait participer à l'augmentation et au maintien de la population de myofibroblastes sub-épithéliaux. En accord avec les études réalisées précédemment sur la fibrose intestinale (Linard et coll. , 2013, Semont et coll. , 2013, Bessout et coll. , 2014, Bessout et coll. , 2015), il semblerait que les myofibroblastes sub-épithéliaux aient une faible implication dans la production de la MEC excédentaire dans les couches musculaires et la sous-muqueuse. La production d'IGF-1, en particulier par les macrophages M2, serait à l'origine de l'acquisition du phénotype pro-fibrosant par les CML. La phase tardive de notre étude est caractérisée par la diminution de l'inflammation et des médiateurs de la dégradation de la MEC. Le dépôt de MEC est maximal à 7 semaines, point définit comme critique du point de vue du décès de l'animal. À cette période, l'épaississement important du tissu, associé à une perte de contractibilité musculaire, pourrait être à l'origine de la sténose et de l'occlusion. 239 Figure 33 : mécanismes impliqués dans le développement de la fibrose colorectale radio-induite chez le rat. 1 : les rayonnements ionisants induisent des dommages aux cellules résidentes et le recrutement des cellules immunitaires, la production de ROS et l'activation de TGF-1. La production de cytokines et de ROS par les cellules immunitaires contribue à l'activation de TGF-1 et la différenciation des myofibroblastes. 2 : L'activation de la réponse Th2/M2 participe au remodelage de la matrice extracellulaire par les myofibroblastes. 3 : La levée de l'inhibition de la voie Smad et l'activation des CML par IGF-1 amplifie le phénomène de remodelage. 4 : Le remodelage chronique induit la fibrose. III. Effet des CSM sur le développement de la fibrose colorectale radio-induite Comme nous l'avons présenté dans la partie CSM et fibrose, les études réalisées à ce jour suggère un potentiel anti-fibrosant des CSM, quel que soit l'organe et la pathologie considérée. Il existe à l'heure actuelle peu de littérature traitant de l'utilisation de ce type de thérapie dans le cadre de la fibrose radio-induite au côlon-rectum. Néanmoins, les résultats existant sur l'utilisation des CSM dans le cadre des complications des radiothérapies sont prometteurs et il semble que ce traitement permette d'améliorer la régénération du côlon irradié. Nous avons mis en évidence différents effets des CSM que nous avons souhaité mettre en évidence dans notre modèle. 240 1. Remodelage matriciel L'accumulation de MEC au sein du tissu et la perte de fonctionnalité qui en résulte sont les principales caractéristiques de la fibrose. Dans notre modèle, nous avons observé une augmentation significative du dépôt de MEC au sein du tissu dès 4 semaines. À 7 semaines, la proportion de MEC dans le côlon-rectum est maximale. Les CSM produisent de nombreux effets, en particulier sur la voie TGF-/Smad, permettant de réduire la production de MEC et d'améliorer sa dégradation. En effet, 4 et 5 semaines après irradiation, les animaux transplantés présentaient une proportion de MEC dans le côlon-rectum équivalente à celle observée chez les animaux non transplantés. En revanche, le dépôt de MEC était significativement inférieur 7 semaines après irradiation dans le groupe traité par les CSM. À la fin de l'étude, la surface de fibrose observée dans le groupe traité était similaire à celle observée chez les animaux non-irradiés. Ce résultat contredit les données par Sémont et coll. qui n'ont pas observé de différence de score de fibrose 8 semaines après irradiation dans un protocole d'injections itératives de CSM de la moelle osseuse (Semont et coll. , 2013). Dans cette étude, le processus de fibrose semblait continuer malgré l'injection de CSM, comme indiqué par l'augmentation du score de fibrose entre 8 et 21 semaines. Le timing d'injection des cellules pourraient être à l'origine de cette différence. En effet, ce protocole consistait en une première injection 3 semaines après irradiation, suivi d'une nouvelle transplantation toutes les 2 semaines. Les données présentées dans la partie CSM et fibrose montrent que l'injection précoce des CSM permet d'optimiser leurs effets sur la fibrose du rein et du poumon (Ortiz et coll. , 2003, Alfarano et coll. , 2012). L'origine des cellules transplantées pourraient avoir également une influence sur leur potentiel anti-fibrosant. Les cellules souches du tissu adipeux constituent une population plus hétérogène que les CSM de la moelle osseuse et ont donc été longtemps considérées comme potentiellement moins efficaces. Des études réalisées au sein de notre laboratoire ont montré une meilleure efficacité des cellules souches du tissu adipeux dans le modèle d'irradiation colorectale dose unique. De même, les CSM de la membrane fœtale, de la moelle osseuse ou du tissu adipeux produisent des résultats identiques sur l'infarctus du myocarde, la fibrose pulmonaire et la sclérose systémique (Ishikane et coll. , 2013, Fikry et coll. , 2015, Maria et coll. , 2016). Chez les animaux irradiés, le déséquilibre entre la production de MEC et la synthèse des MMP et des TIMP conduit à la fibrose. Malgré l'augmentation de l'expression des MMP, leur inhibition par 241 un nombre de TIMP accrue limite la dégradation de la MEC. Plusieurs études montrent que la transplantation de CSM permet de réduire les ratios CMP et de restaurer les fonctions de dégradation de la MEC. Dans un modèle de fibrose rectale radio-induite, Linard et coll. ont montré l'induction d'un profil favorisant la dégradation de la MEC suite à la transplantation de CSM (Linard et coll. , 2013). Bessout et coll. ont également observé une importante diminution de ces ratios après transplantation de CSM (Bessout et coll. , 2015). Nos résultats indiquent une modulation du profil d'accumulation/dégradation de MEC par les CSM, avec une activité de remodelage importante 5 semaines après irradiation. À l'instar de l'étude réalisée par Bessout et coll. , les valeurs élevées des ratios CMP 4 et 5 semaines après irradiation dans le groupe traité par CSM suggère une tendance à l'accumulation de MEC au sein du tissu (Bessout et coll. , 2015). Néanmoins, le retour du dépôt de MEC à l'état basal à 7 semaines est en adéquation avec la diminution des ratios CMP. En revanche, seule une légère augmentation du pourcentage de fibrose a été observée à 5 semaines chez les animaux transplantés, malgré la tendance à l'accumulation suggérée. De plus, la différence d'évolution des ratios CMP entre les groupes irradiés et irradiés CSM ne permet pas de justifier les dépôts de MEC observés à 7 semaines. Les CSM semblent exercer un effet inhibiteur sur l'expression et la production des éléments de la MEC dans de nombreux modèles de fibrose (Cf. Remodelage matriciel). Le même effet a été observé sur des modèles de fibrose radio- induite (Linard et coll. , 2013, Bessout et coll. , 2015). Nous avons montré le retour à l'état basal de l'expression des collagènes de type 1 et 3, de la fibronectine et de Sparc chez les animaux transplantés 4 semaines après irradiation. À 7 semaines, le collagène de type 3 était sous-exprimé sous l'effet des CSM. La transplantation de CSM induit une modulation de l'expression des MMP et TIMP dans plusieurs modèles de fibrose (Cf. Remodelage matriciel) ainsi qu'après irradiation colorectale. La capacité des CSM à induire l'activation de certaines MMP a également été mise en évidence. Nos travaux suggèrent l'induction par les CSM de la surexpression de plusieurs MMP. Cinq semaines après irradiation, les MMP-9 et MMP-19 étaient surexprimés chez les animaux transplantés, puis les MMP- 12 et MMP-13, 2 semaines plus tard. À 7 semaines, la concentration de MMP-2, une métalloprotéinase à spectre large, était significativement augmentée dans le groupe traité. Le système du plasminogène est le principal régulateur de l'activité des MMP. Dans notre étude, l'augmentation de l'expression du plasminogène pourrait contrebalancer la surexpression de PAI-1 en permettant la disponibilité de quantités accrues de plasmine, favorisant ainsi l'activation des MMP. Cinq semaines après irradiation, la transplantation de CSM induit la levée de l'inhibition de l'expression de l'activateur du plasminogène Plau. 242 Entre 5 et 7 semaines, l'augmentation de la concentration et de l'activité des MMP dans le tissu, associées à la diminution de la production de MEC, serait à l'origine de la diminution du dépôt de MEC dans le tissu, en accord avec les observations réalisées précédemment dans plusieurs modèles de fibrose radio-induite. Les CSM semblent modifier la cinétique de remodelage de la MEC, en induisant une phase d'accumulation de MEC intense à 5 semaines, suivie d'une phase de dégradation tardive aboutissant à un retour du dépôt de MEC à l'état basal. 2. Myofibroblastes/voie TGF-/Smad Au centre du processus de fibrogénèse se trouvent les myofibroblastes et la voie TGF-/Smad, respectivement principaux acteurs cellulaires et moléculaires de la fibrose. Les données de la littérature suggèrent que l'effet anti-fibrosant des CSM est majoritairement induit par l'inhibition de l'activation des protéines Smad effectrices qui induisent la différenciation myofibroblastique et la production de MEC en activant leurs gènes cible (-SMA, collagènes). Cette hypothèse est appuyée par la diminution de l'expression des collagènes et de l'activation des myofibroblastes dans de nombreux modèles, y compris radio-induits (Cf. Remodelage matriciel). Bessout et coll. ont observé une corrélation entre l'augmentation de l'expression du TGF-1 et des collagènes de type I et III dans une culture de CML coliques traitées à l'IL-17. Dans la muqueuse rectale, Linard et coll. ont également montré une corrélation de l'inhibition de TGF-1 et des collagènes après transplantation de CSM. Au cours de notre étude, la sous-expression des collagènes I et III, de la fibronectine, de Sparc et de l'-SMA était simultanée à la répression transcriptionnelle de CTGF et TGF- 3 par les CSM à 4 semaines. La concentration en TGF-1 était significativement diminuée durant la totalité de l'étude dans le groupe irradié CSM par rapport au groupe non irradié. L'expression de Smad7 et Tgif1, deux inhibiteurs de la voie Smad, était restaurée à son état basal suite à l'injection de CSM, respectivement à 4 et 7 semaines. Le point 5 semaines était caractérisé dans notre modèle par la surexpression de plusieurs intégrines dans le groupe irradié CSM comparé aux irradiés. En particulier, les chanes V et 6 sont impliquées dans l'activation du TGF- latent (Munger et coll. , 1999). L'augmentation de la concentration de MMP-2 chez les animaux transplantés avec des CSM pourrait également entrainer une augmentation de l'activation de TGF-1. L'inhibition de TGF- et CTGF, ainsi que la levée de la répression de certains inhibiteurs de la voie Smad, permettrait en partie aux CSM de limiter la fibrose induite par ce mécanisme. Néanmoins, 243 les faibles variations observées sur l'expression de ces gènes renforcent l'hypothèse proposée concernant l'entretien de la fibrose par un mécanisme indépendant de cette voie de signalisation. a. Myofibroblastes Le recrutement et l'activation des précurseurs de myofibroblastes est une caractéristique commune des modèles de fibrose. Les myofibroblastes et CML sont les principaux producteurs de MEC lors de la fibrose colorectale. Nous avons mis en évidence la présence de nombreux myofibroblastes sub-épithéliaux ainsi que l'hypertrophie de la musculaire propre qui suggère l'activation des CML en cellules sécrétrices de MEC. Les CSM induisent une diminution de l'expression de l'-SMA et du nombre de myofibroblastes au cours de la fibrose (Cf. Remodelage matriciel). La conséquence de l'activité inhibitrice des CSM est une réduction de la production des éléments de la MEC, ainsi que de la production des TIMP et MMP produits par les myofibroblastes. Quatre et 5 semaines après irradiation, le nombre de cellules -SMA était réduit dans la sous- muqueuse dans le groupe irradié traité par les CSM comparé au groupe irradié, en accord avec la sous- expression de -SMA à 4 semaines. La fibronectine étant essentielle à la différenciation des myofibroblastes, son inhibition à 4 semaines supporte la diminution des myofibroblastes dans la muqueuse. L'inhibition de la différenciation des myofibroblaste pourrait expliquer la diminution de l'expression des gènes de la MEC observée chez les animaux traités à 4 semaines. b. CML Nous avons suggéré que la perte du phénotype contractile des CML au profit d'un profil sécrétoire était à l'origine de l'épaississement de la musculaire propre observé, et de la perte de contractibilité supposée produire l'occlusion dans notre modèle. Bessout et coll. ont montré que l'injection de cellules souches du tissu adipeux après irradiation colorectale induit la restauration du tonus musculaire à son état basal (Bessout et coll. , 2015). Les CSM seraient donc en mesure de bloquer, voire reverser le changement phénotypique observé chez les CML pro-fibrosantes. Quatre semaines après irradiation, le ratio -SMA/-SMA est en faveur du phénotype pro- fibrosant des CML. Nous avons posé l'hypothèse que différents facteurs de croissance, en particulier l'IGF-1, étaient responsables de la poursuite de la fibrose dans ce modèle en favorisant la production de MEC par les CML. L'augmentation de l'expression de PDGF-B chez les animaux traités par les CSM, 244 5 semaines après irradiation suggère l'inhibition de la maturation des CML et est en accord avec le profil de remodelage observé à ce temps. A l'instar des résultats présentés dans la partie Remodelage matriciel, nous avons montré un effet d'inhibition de la prolifération des myofibroblastes par les CSM. La diminution du dépôt de MEC au sein du tissu pourrait donc être en partie due à la diminution de la densité de cellules pro- fibrosantes dans la muqueuse. L'effet produit par les CSM est suffisant pour induire un retour de la proportion de MEC dans le tissu au niveau basal. Néanmoins, nous n'avons pas été en mesure d'identifier un mécanisme permettant aux CSM de reverser l'activation du profil sécrétoire des CML. 3. Inflammation L'évolution de la lésion induite par irradiation colorectale est fortement liée aux modulations de l'inflammation, en particulier des populations de leucocytes recrutées. Conformément aux observations réalisées lors de précédentes études, la fibrose semble être amplifiée par une réponse Th2 prononcée, ainsi qu'un infiltrat de macrophages pro-fibrosants. L'augmentation de l'apoptose au sein du tissu favorise le recrutement de nombreux leucocytes et le remaniement chronique de l'architecture tissulaire. a. Apoptose/prolifération A 4 et 7 semaines, le nombre de cellules en prolifération (surface de cellules positives à PCNA) était augmenté dans la muqueuse suite à l'injection de CSM. La surexpression à 7 semaines de l'EGF observée dans le groupe CSM semble favoriser la régénération de l'épithélium. Sémont et coll. ont montré un effet similaire induit par la stimulation des progéniteurs de cellules endothéliales via la voie non-canonique Wnt (Semont et coll. , 2013). Cet effet était lié à une amélioration de la survie des animaux transplantés. La régénération de l'épithélium colique permet de restaurer la fonction d'absorption et de barrière à l'entrée des pathogènes et limiter ainsi les fréquences des diarrhées ainsi que le risque d'infection. Des résultats obtenus récemment au sein de notre laboratoire montrent une amélioration de la perméabilité du côlon irradié après transplantation de CSM (Moussa et coll. , article soumis). 245 Au sein de la muqueuse, la quantité de cellules apoptotiques était significativement augmentée à 4 semaines. Le recrutement massif de cellules inflammatoires pourrait induire des effets délétères sur les cellules saines et être à l'origine pour partie de l'apoptose. b. Réponse des cellules T CD4 Nous avons observé une réponse mixte des lymphocytes T CD4 après irradiation dans notre modèle. En particulier, il semble que la réponse Th2 soit favorisée par rapport aux autres sous-groupes de cellules T. Les cellules Th2 ont une activité pro-fibrosante incriminée dans différents modèles. Bessout et coll. ont associé l'effet bénéfique des CSM sur le côlon irradié à une diminution de la réponse Th17 (Bessout et coll. , 2015). Dans une autre étude, la diminution de la réponse Treg et de la production d'IL-10 qui la caractérise était observable après transplantation de CSM (Bessout et coll. , 2014). Le ratio T-bet/Gata3 représentatif du ratio Th1/Th2 au sein du tissu indique une modulation de l'infiltrat inflammatoire dès 4 semaines. L'évolution de ce ratio indique des proportions inverses à celles observées dans le groupe irradié. En effet, l'injection de CSM semble induire préférentiellement une réponse Th1 à 4 semaines, suivie d'une augmentation de l'infiltrat de Th2 à 5 semaines. Ce résultat est en accord avec les profils de remodelage de MEC mis en évidence par les ratios CMP. En effet, l'augmentation de la réponse Th2 est concomitante à l'apparition d'un profil d'accumulation de la MEC. 5 semaines après irradiation, l'expression de Gata3 est significativement plus élevée dans le groupe irradié CSM. L'augmentation de l'expression d'iNos au même temps permettrait d'inhiber la réponse Th1. La phase tardive correspond à surexpression de nombreux médiateurs de l'inflammation chez les animaux transplantés avec les CSM (CCL2, CCL3, IL-1, IL-1 et IL-6). Ce profil pro- inflammatoire pourrait être dû à l'activité des macrophages ainsi qu'à la reprise de la réponse Th17 mise en évidence par Bessout et coll. (Bessout et coll. , 2015). Lors d'une étude in vitro, le traitement de CML du côlon par l'IL-17 a induit la surexpression de l'IL-6 et de l'IL-1 (Bessout et coll. , 2015). L'expression de RORC, caractéristique des Th17, est augmentée jusqu'à 7 semaines dans notre modèle, ce qui suggère la persistance de cette réponse. La transplantation de CSM induit également le maintien de la population de Treg, comme indiqué par la surexpression de Foxp3 à un niveau constant. Lors de l'essai compassionnel réalisé sur les patients d'Épinal, l'amélioration des lésions induite par les CSM a été associée à la répression des lymphocytes T helper ainsi qu'à une augmentation des Treg. Ce résultats souligne l'importance de l'effet anti-inflammatoire des CSM dans le traitement des atteintes radio-induites (Voswinkel et coll. , 2013). 246 c. Macrophages Linard et coll. ont attribué pour partie l'amélioration de la lésion radio-induite à l'augmentation de la proportion de macrophages M2 (Linard et coll. , 2013). Des données récentes suggèrent que la cinétique d'apparition des différentes formes de polarisation serait plus importante que l'augmentation des M2 dans la détermination de l'évolution de la lésion. Nous avons observé que la lésion radio-induite est associée à un infiltrat de macrophages conséquent caractérisé par une augmentation simultanée du nombre de M1 et de M2. Dans le groupe d'animaux traités par injection de CSM, la proportion de macrophages M2 était significativement accrue par rapport aux groupes irradié et non-irradié, 4 semaines après irradiation. À 7 semaines, la proportion de M2 était retourné à son état basal chez les animaux irradiés, avec ou sans CSM. Cependant, la densité de macrophages dans le tissu est restée plus élevée dans les groupes irradiés durant la totalité de l'étude. L'augmentation de l'infiltrat de macrophages est confirmée par une augmentation significative de l'expression de Nos2, Arg-1 et Mrc-1 au cours de l'étude. Quatre semaines après irradiation, les animaux transplantés présentaient une surexpression significative de Arg1 par rapport aux irradiés, en accord avec l'augmentation constatée de la proportion de M2. À 5 semaines, l'augmentation significative de l'expression de Mrc1, spécifique des M2, suggère la promotion de cette polarisation par les CSM. Cette phase étant caractérisée par une activité de remodelage intense favorisée par l'infiltrat de lymphocytes Th2, une forte activité des M2 était prévisible. L'augmentation induite par les CSM de l'expression de l'IL-10, PDGFA et PDGFB appuie cette hypothèse. Sept semaines après irradiation, l'activité des macrophages M2 reste élevée dans le groupe CSM, comme indiqué par la forte expression d'Arg1, Mrc1 et IL-10. A l'instar des résultats observés concernant la réponse T, la phase tardive de l'étude est caractérisée par une forte activité pro- inflammatoire (augmentation de l'expression de CCL2, CCL3, IL-1, IL-1 et IL-6), probablement régulée par les lymphocytes Th1 et les macrophages M1. Cet effet supporte vraisemblablement la phase de dégradation de la MEC aboutissant à la diminution de la surface de fibrose suite à l'injection de CSM. En particulier, l'augmentation de l'expression de MMP-12 et -13 chez les animaux transplantés appuie ce postulat. Bessout et coll. ont montré que les CSM inhibaient l'activité des lymphocytes en induisant la production de glucocorticoïdes dans le côlon irradié de rat (Bessout et coll. , 2014). Or, les glucocorticoïdes induisent la polarisation M2 des macrophages (Gratchev et coll. , 2008). Les macrophages induits par les glucocorticoïdes présentent une activation prolongée de la signalisation 247 liée à Smad2 lorsqu'ils sont stimulés par TGF-. Cet effet semble dû à la surexpression de SIRT1, un répresseur de Smad7. En synthétisant des glucocorticoïdes, les CSM participeraient donc à la promotion de la réponse M2 4. Conclusion sur l'effet des CSM La transplantation de CSM deux semaines après irradiation permet de limiter la fibrose dans le modèle de fibrose colorectale radio-induite dans notre modèle. L'effet anti-fibrosant des CSM est appuyé par une amélioration significative de la survie des animaux transplantés par rapport au groupe irradié. L'action notable des CSM sur ce modèle semble consister en une cinétique de réparation différente en comparaison des animaux irradiés. En effet, alors que la phase de remodelage apparait 4 semaines après irradiation chez le groupe témoin, ce temps correspond à une réponse inflammatoire plus intense chez les animaux transplantés, caractérisée notamment par une forte activité Th1 et M1. L'augmentation de la réponse Th2 et M2 induite par les CSM après 4 semaines permet de supprimer l'inflammation et d'induire une phase de remodelage intense de la MEC. À l'issue de cette phase, la proportion de MEC au sein du tissu est restaurée à son état basal par les CSM. La phase de remodelage chez les animaux irradiés semble trop courte ou insuffisamment efficace pour induire un retour du tissu à état physiologique normal. L'amélioration fonctionnels du côlon rectum, en particulier de la contractibilité musculaire, de la barrière épithéliale et de la perméabilité, semble participer à l'amélioration de la survie des animaux, en accord avec les études antérieures (Linard et coll. , 2013, Semont et coll. , 2013, Bessout et coll. , 2015). IV. HGF et TSG-6 sécrétés par les CSM participent à la réduction de la fibrose L'analyse de la littérature sur l'utilisation de la thérapie par les CSM dans le contexte de la fibrose nous a permis d'identifier deux facteurs anti-fibrosants sécrétés par les CSM et responsables d'une part importante de leur effet : HGF et TSG-6. La production de HGF par les CSM a été associée à une régression de la fibrose dans des modèles cardiaques, pulmonaires, hépatiques et péritonéaux (Mias et coll. , 2009, Gazdhar et coll. , 2013, Ueno et coll. , 2013, Seo et coll. , 2014). TSG-6 a été proposé comme un acteur majeur de l'immunosuppression par les CSM, notamment par un effet direct sur les macrophages (Prockop, 2013). Dans la peau et le rein, l'expression de TSG-6 par les CSM permet de réduire le dépôt de MEC au sein du tissu (Qi et coll. , 2014, Wu et coll. , 2014). Nous avons mis en place 248 un protocole d'extinction des gènes correspondant par interférence ARN afin de mettre en évidence les mécanismes impliqués dans l'action du HGF et du TSG-6. Cette stratégie nous a permis de transplanter des CSM sous-exprimant le HGF ou le TSG-6 d'environ 80% au moment de l'injection. Tous les résultats présentés dans cette partie ont été observés 7 semaines après irradiation (4 semaines après la dernière injection de CSM). 1. Implication de HGF dans l'effet anti-fibrosant des CSM Nous avons présenté dans la partie HGF les mécanismes d'action supposés de HGF sur la fibrose portant notamment sur : la modulation de l'apoptose, l'immunosuppression et l'inhibition de la voie TGF-/Smad. Ce sont ces effets qui sont exploités dans le cadre de la fibrose. L'injection de CSM déficientes pour l'expression du HGF induit une modification radicale de la réponse du tissu. Le groupe d'animaux transplanté avec ces cellules (groupe siHGF dans la suite du texte) présentait un dépôt de MEC similaire à celui observé chez les animaux irradiés non transplantés. La surface de MEC mesurée était significativement augmentée par rapport aux groupes non-irradiés et irradiés CSM. Au même temps, nous avons mis en évidence une augmentation du ratio CMP par rapport aux autres groupes, signifiant une tendance accrue à l'accumulation de MEC. Ce profil était simultané à la surexpression de nombreux gènes impliqués dans la régulation de la MEC par rapport au groupe CSM : - composants de la MEC : Collagènes de type I et III, fibronectine et Sparc - MMP : -3, -9, -12, -13, -14 - - TIMP : -1 et -4 Système du plasminogène : Plau, Plg, PAI-1 La surexpression des MMP ne semble pas suffisante pour contrebalancer la production massive d'éléments de la MEC et la surexpression des TIMP. Le niveau d'expression très élevé de PAI- 1 dans le groupe siHGF pourrait induire un défaut d'activation des MMP résultant en l'impossibilité de dégrader la MEC excédentaire. HGF exerce deux fonctions d'inhibition distinctes sur la voie TGF-/Smad en inhibant l'expression de TGF-1 et en bloquant la translocation du complexe Smad2/3 activé vers le noyau. Ce dernier mécanisme semble reposer sur la stabilisation et la surexpression des répresseurs de la voie Smad : SnoN (Skil) et TGIF. 249 Dans le groupe siHGF, nous avons observé la diminution de l'expression de deux inhibiteurs de la voie Smad : Skil, Smad6. Cet effet inhibiteur était associé à la surexpression de composés pro- fibrosants de la voie TGF-/Smad : CTGF, TGF-1, -2 et 3. Une augmentation de l'expression des activateurs de TGF-, thrombospondine (Thbs1 et Thbs2) et MMP-9, était induite dans le groupe siHGF par rapport au groupe CSM. Le groupe siHGF présente un profil inflammatoire similaire à celui observé dans le groupe d'animaux irradié, caractérisé par une élévation de Gata3 et Foxp3, marqueurs respectifs des lymphocytes Th2 et Treg. L'accumulation de macrophages M2 dans ce groupe pourrait expliquer le remodelage de la MEC conduisant à la fibrose. L'inflammation semble entretenue par un taux élevé d'apoptose dans la muqueuse, en accord avec les effets anti-apoptotiques connus de HGF (Cf. HGF). La suppression de HGF semble également limiter la capacité de l'épithélium à se régénérer, la surface de cellules en prolifération étant inférieure à celle des autres groupes. En conformité avec les données connues sur les mécanismes d'action de HGF dans la fibrose, le groupe siHGF semble présenter une activité élevée de TGF- et des protéines apparentées. Bien que nous ayons émis l'hypothèse que la fibrose n'était pas entretenue dans notre modèle par l'activation de la voie TGF-/Smad, il semble que la perte d'inhibition induite par HGF favorise l'activation de cette voie. Deux hypothèses peuvent expliquer l'action de HGF : - HGF est capable d'induire sa propre expression ainsi que celle de son récepteur c-Met (Cf. HGF) et il est donc possible que l'expression de HGF par les CSM transplantées permette d'induire une boucle d'activation anti-fibrosante au sein du tissu - Une autre hypothèse suggère que le HGF produit par les CSM exerce une action autocrine permettant d'orienter la réponse à la fibrose, éventuellement en modulant leur production de TGF-. Cette deuxième proposition semble mieux s'adapter à notre modèle, étant donné qu'aucune augmentation significative de l'expression de HGF n'a été observée au cours de l'étude, quel que soit le groupe. En réalité, malgré une expression modérée de TGF-, l'expression de HGF était réduite de moitié dans la majorité des groupes. Ceci suggère l'implication d'un autre système de régulation de HGF au sein du tissu fibrosé. Les CSM sont connues pour pouvoir acquérir des caractéristiques myofibroblastiques selon des mécanismes similaires à ceux observés chez les autres précurseurs de cellules pro-fibrosantes. Ainsi, la levée de l'inhibition de TGF- pourrait induire un effet autocrine de 250 ce facteur sur les CSM et favoriser une réponse pro-fibrosante. La capacité de HGF et TGF- à activer leur propre expression en inhibant l'expression de l'autre est en faveur de cette hypothèse et servir de système de régulation autocrine chez les CSM (Figure 34). La promotion de la réponse Th2/M2 sous l'influence des CSM sous-exprimant le HGF participe à la mise en place d'une dynamique proche de celle mise en évidence chez les animaux irradiés et non-transplantés. Figure 34 : hypothèse sur la régulation autocrine de la fonction des CSM par TGF- et HGF 2. Implication de TSG-6 dans l'effet anti-fibrosant des CSM Le TSG-6 est une protéine immunomodulatrice exprimée en réponse à différents médiateurs de l'inflammation, principalement le TNF-. Il est exprimé par les CSM en réponse à l'IL-1, au TNF-, aux LPS et au PGE2 entre autres. Il est majoritairement détecté dans le cas de pathologies inflammatoires et dans les situations de remodelage de la MEC. TSG-6 interagit avec la hyaluronane pour lui conférer ses propriétés pro-inflammatoires et pro-fibrosantes. A l'inverse, Choi et coll. ont mis en évidence l'action immunosuppressive de TSG-6 par inhibition de la voie NF-B, induisant l'inhibition de l'activation classique des macrophages (Cf. TSG-6). L'injection de CSM sous-exprimant TSG-6 (groupe siTSG-6) sur le modèle d'irradiation colorectale dose unique a induit à 7 semaines l'augmentation du dépôt de MEC à un niveau proche de 251 celui du groupe irradié. Au même temps, les ratios CMP du groupe siTSG-6 étaient en faveur de l'accumulation de MEC, notamment concernant le collagène de type I et la fibronectine. Nous avons observé la surexpression des collagènes de type I et III par rapport au groupe CSM. Plus généralement, ce groupe présentait une expression importante de : - Collagène de type I, fibronectine et Sparc - MMP-2, -3, -9, -12, -13 et -19 - TIMP-1 - Plat, Plg, PAI-1 Ces résultats suggèrent une surproduction de MEC accompagnée de la production de nombreuses MMP inhibées par un excès de TIMP-1 et un défaut d'activation par la plasmine, en raison de l'expression élevée de PAI-1. A l'instar des observations réalisées sur les groupes irradiés et CSM, il semble que la fibrose ne soit pas conduite par l'axe TGF-/CTGF/Smad, puisqu'aucune différence significative de l'expression des gènes de cette famille n'a été mise en évidence. L'injection des CSM sous-exprimant HGF induit une forte expression de l'IGF-1 et la surexpression du PDGFB et de l'IL-1, suggérant l'implication d'un mécanisme d'activation des CML identique à celui décrit dans le groupe irradié. L'effet le plus conséquent de la suppression de TSG-6 dans les CSM transplantées concerne la polarisation des macrophages. Le groupe siTSG-6 était le seul à présenter une élévation significative de la densité et de la proportion de M2 dans le tissu, par rapport à l'ensemble des groupes, y compris siHGF. Cette observation est appuyée par la sous-expression, par rapport au groupe CSM, de différents gènes impliqués dans la réponse M1 : iNOS, NF-B1, CCL3. Plusieurs gènes de la réponse M2 étaient fortement exprimés dans ce groupe, Arg1, Mrc1 et IL-10 en particulier. La réponse des lymphocytes T était en revanche à un état proche de celui des animaux non-irradiés, suggérant un mécanisme pro- fibrosant indépendant de la réponse Th2. La persistance de la réponse M2 semble donc induire, une augmentation de la fibrose. Sur la base des observations réalisées par Choi et coll. sur l'inhibition de la réponse M1 par le TSG-6, nous supposions que la délétion de TSG-6 induirait une augmentation de la proportion de M1 dans le tissu. N'ayant pas de données sur l'évolution de la lésion entre l'injection des CSM défectives pour TSG-6 et le temps 7 semaines post-irradiation, nous ne pouvons conclure sur l'infiltration éventuelle de macrophages M1. Néanmoins, les résultats présentés ici semblent impliquer directement la réponse M2 dans l'augmentation du dépôt de MEC. 252 L'intérêt porté sur l'influence de TSG-6 au cours de l'inflammation est récent, et peu de données existent à l'heure actuelle sur les mécanismes sous-tendant l'effet de TSG-6. La quantité et la nature de la hyaluronane (HA) présente dans le tissu semblent être étroitement liées à l'effet de TSG- 6, et cette donnée n'est à l'heure actuelle que peu voire pas prise en compte. Comme explicité dans la partie TSG-6, la présence de polymères de HA de haut poids moléculaire dans le tissu produit un effet immunosuppresseur, alors que le HA de faible poids moléculaire favorise l'inflammation en activant les cellules T. TSG-6 peut limiter la polarisation M1 des macrophages en inhibant la voie NF-B via l'activation de CD44, mais HA peut également favoriser l'inflammation et la fibrose en activant ce même récepteur. Enfin, la capacité de HA à se fixer au récepteur TLR2, exprimé par les CSM, suggère la possibilité d'une action de reprogrammation des cellules transplantées. Figure 35 : hypothèse sur le mécanisme d'immunomodulation par TSG-6. TSG-6 agit par deux mécanismes principaux au cours de la fibrose : l'augmentation de la disponibilité en hyaluronane de haut poids moléculaire (PM) et l'inhibition de la polarisation M1 des macrophages. Sur la base des données de la littérature, nous suggérons l'existence d'un système de régulation de l'inflammation et du remodelage matriciel par modulation de la disponibilité en HA de haut poids moléculaire par TSG-6. L'induction de la production de TSG-6 lors de la phase aige de l'inflammation permettrait la formation de polymères de HA de haut poids moléculaire en mesure de 253 favoriser le recrutement et l'activation des cellules du système immunitaire. Lors des phases de remodelage matriciel, le même mécanisme permettrait de promouvoir le recrutement, la différenciation et la prolifération des myofibroblastes et de favoriser ainsi le remodelage. Le déplacement temporel de la phase de remodelage dans le groupe siTSG-6 par rapport au groupe CSM pourrait donc être dû à une diminution de la disponibilité en HA de haut PM lors de la phase précoce de l'action des CSM. Dans ce modèle, l'augmentation de la concentration en HA pro-fibrosant serait opérée par les fibroblastes et myofibroblastes présents dans le tissu et nécessiterait donc davantage de temps. Si le phénotype observé à 7 semaines dans le groupe siTSG-6 correspond à une cinétique de réparation plus tardive que celle observée après transplantation de CSM, il serait intéressant d'étudier l'évolution de la lésion au-delà de 7 semaines. Figure 36 : influence de HGF et TSG-6 sécrétés par les CSM sur la fibrose colorectale radio-induite 254 V. Perspectives 1. Description du modèle Nous avons décrit un processus de fibrogénèse dans lequel l'évolution intermédiaire et chronique de la fibrose est contrôlée par l'infiltrat inflammatoire de lymphocytes T et macrophages. Ces mécanismes semblent indépendants de l'axe TGF-/Smad/CTGF, habituellement décrit comme à l'origine de la fibrose et responsable de la chronicité de la pathologie. Dans notre étude, l'activation des lymphocytes Th2 et des macrophages M2 induit un remodelage intense de la MEC associé à un remaniement permanent de l'architecture du tissu caractérisé par une prolifération et une apoptose accrues. L'épaississement du tissu résultant de l'accumulation de MEC dans les différentes couches du côlon-rectum et la perte de contractibilité du muscle induit par le changement phénotypique des CML conduisent à la sténose et à l'occlusion létale. En l'absence de données concernant les phases précoces de la lésion dans notre modèle, nous avons supposé que les mécanismes décrits auparavant, notamment au sein de l'IRSN, s'appliquaient à notre étude. Cependant, il conviendrait de caractériser la lésion lors des premières semaines suivant l'irradiation afin de confirmer ces données. De plus, il est nécessaire de confirmer les hypothèses développées dans ce document en confirmant par exemple la capacité de l'IGF-1 à soutenir le phénotype pro-fibrosant des CML, dans le cadre d'une expérimentation in vitro. Nous souhaitons également confirmer l'implication des différentes populations leucocytaires identifiées lors de cette étude. Une meilleure caractérisation des mécanismes impliqués dans les dommages radio-induits au côlon-rectum permettrait une identification plus efficace des agents anti-fibrosants impliqués dans l'effet des CSM. 2. Effet des CSM La transplantation de CSM chez les rats irradiés a permis de réduire la fibrose au sein du côlon- rectum et d'améliorer la survie des animaux. Les CSM induisent une réponse orchestrée composée d'une phase inflammatoire précoce, suivie d'une phase de remodelage intense permettant de restituer le dépôt de MEC à son niveau basal. Cet effet semble principalement produit par la modulation successive des populations de lymphocytes Th1 et Th2 et de macrophages M1 et M2. Il est nécessaire de confirmer cette hypothèse in vitro, en analysant les interactions des CSM et de lymphocytes T ou macrophages issus d'animaux irradiés dans les mêmes conditions. Les données de la littérature suggèrent la capacité des CSM à induire des changements de cette nature et renforcent les hypothèses formulées quant à l'effet des CSM. 255 3. Implication de HGF et TSG-6 dans l'effet des CSM sur la fibrose Conformément à notre hypothèse de travail, la sous-expression de HGF ou TSG-6 dans les CSM transplantées accroit la fibrose. De façon inattendue, l'injection de ces cellules a induit une augmentation significative du dépôt de MEC par rapport aux groupes non-irradiés et irradiés et transplantés avec des CSM. Bien qu'agissant par différents mécanismes, ces deux facteurs semblent donc indispensables à l'effet anti-fibrosant des CSM. Nous suggérons que le HGF et le TSG-6 produits par les CSM transplantées limitent la fibrogénèse en inhibant la voie TGF-/Smad pour HGF et en modulant la réponse des macrophages pour TSG-6. En revanche, il est à l'heure actuelle difficile de déterminer l'origine des effets pro- fibrosants des CSM modifiées par interférence ARN. Nous avons émis l'hypothèse que ces composés ont une action de contrôle sur le phénotype des CSM en plus de leur effet sur le tissu dans lequel ils sont sécrétés. Ainsi, en l'absence de ces systèmes de contrôle, les CSM orienteraient la réponse du tissu vers la fibrogénèse plutôt que de la limiter. L'administration de HGF ou de TSG-6 recombinant, en systémique ou localement, après irradiation colorectale, nous permettrait également de confirmer nos résultats. Ces données soulignent l'intérêt de l'utilisation des CSM lors du traitement de pathologies complexes telles que la fibrose. La perte de l'expression d'un seul des facteurs sécrétés par les CSM peut induire une réponse totalement différente aboutissant à un effet délétère du traitement. Nous n'avons pas connaissance d'autre exemple de ce type d'effet, concernant la transplantation de CSM pour le traitement de la fibrose. Contrairement aux traitements pharmacologiques, les CSM injectées ponctuellement peuvent induire une modification profonde et durable de l'évolution d'une lésion. Cet effet est lié à la capacité des CSM à sécréter une large gamme de protéines, miRNA, facteurs de transcriptions et de facteurs de croissance et à adapter leur sécrétome en fonction de la lésion. Ces résultats posent également la question de la modulation du profil d'expression des CSM lors d'un protocole de thérapie cellulaire. Ainsi, la sur ou la sous-expression de gènes spécifiques chez les CSM pourrait permettre de favoriser leurs effets de protection ou de régénération tissulaire. En outre, l'utilisation d'un phénotype de CSM spécifique de l'état de la lésion au moment du traitement pourrait en améliorer l'efficacité. 256 4. Optimisation du protocole Comme nous l'avons détaillé dans la partie Modalités de traitement par les CSM, les protocoles de thérapie cellulaire peuvent être optimisés selon de nombreux paramètres : origine des cellules, quantité de cellules, nombre d'injections, timing d'injection, méthode de délivrance A l'heure actuelle, la recherche sur la thérapie par les CSM semble s'orienter vers l'utilisation des cellules souches dérivées du tissu adipeux, à l'instar des méthodes utilisées dans notre étude. En effet, ces cellules sont disponibles en grande quantité et la méthode de prélèvement reste moins impactante pour le patient que le prélèvement de moelle. Des études réalisées au sein de notre laboratoire montrent un effet similaire des cellules souches du tissu adipeux et des CSM de la moelle osseuse (résultats non publiés). Les données de la littérature semblent confirmer que les propriétés anti-fibrosantes des CSM sont similaires suivant leur origine. Néanmoins, des différences phénotypiques des CSM en fonction de leur origine ont été démontrées et l'évaluation de l'effet de ces différentes populations sur notre modèle est nécessaire. La courbe de survie des animaux irradiés avec ou sans transplantation de CSM montre une amélioration significative de la survie suite au traitement par CSM. Dans le cadre de l'essai compassionnel réalisé sur quatre patients d'Épinal, l'administration d'une injection supplémentaire de CSM a induit une nouvelle amélioration de l'état de l'un des patients. Une troisième injection de CSM pourrait permettre d'améliorer l'effet du traitement, voire de reverser la pathologie. Enfin, l'amélioration des méthodes de délivrance des CSM, notamment par utilisation de matrices et autres biomatériaux, permet d'optimiser la dose de cellules délivrée à la lésion ainsi que de favoriser le maintien des cellules dans le tissu. Au cours de notre étude, les CSM, suivies grâce à leur expression de la GFP, n'ont pas été retrouvées dans le tissu 1 semaine après transplantation Moussa et coll. ont démontré que l'injection locale de CSM dans un hydrogel au niveau du côlon irradié permettait d'augmenter le nombre de CSM présentes au niveau du tissu de façon durable. Ce type de méthode pourrait améliorer le coût et l'efficacité des traitements en délivrant un nombre de cellules plus restreint à un endroit précis. 257 258 Conclusion La transplantation de CSM est reconnue comme une méthode efficace dans le traitement des pathologies inflammatoires et des brûlures radiologiques. Néanmoins, leur utilisation dans le contexte clinique reste controversée, notamment dans le cas des patients atteints de cancer ou ayant subi une radiothérapie. Le manque de données sur les mécanismes responsables de l'effet des CSM ne permet pas de prédire avec certitude leur effet, notamment sur la croissance tumorale et la fibrose. Les essais compassionnels réalisés sur 4 patients impliqués dans l'accident de radiothérapie du centre hospitalier d'Épinal ont montré un effet bénéfique des CSM sur les atteintes coliques radio-induites ainsi que l'absence d'effets secondaires notable. Nous avons montré au cours de cette étude que les CSM n'induisent pas d'effet pro-tumoral au cours de la tumorigénèse colique et après radiothérapie. A l'inverse, les CSM potentialisent l'effet de la radiothérapie en induisant la diminution du volume tumoral au sein du côlon et améliorent ainsi la survie des animaux transplantés. Après radiothérapie abdomino-pelvienne, nous avons montré que la transplantation de CSM permet de réduire le développement de la fibrose radio-induite et d'améliorer également ainsi la survie des animaux. Ces effets des CSM sont majoritairement dus à leurs propriétés immunomodulatrices, tel que décrit dans des modèles de pathologies inflammatoires. Nos résultats démontrent l'innocuité et l'efficacité de la transplantation des CSM pour le traitement des atteintes radio-induites tardives. A l'heure actuelle, l'augmentation du nombre de patients survivant du cancer pose le problème de la prise en charge des complications des radiothérapies. En l'absence de traitement efficace, nous proposons un protocole thérapeutique permettant d'améliorer la prise en charge de ces patients. À l'avenir, la transplantation de CSM pourrait être utilisée en routine pour le traitement des patients souffrant de complications des radiothérapies. Un nouvel essai clinique va être mené dès 2017 sur un nouveau groupe de patients sur-irradiés d'Épinal. Nous serons ainsi en mesure d'évaluer plus précisément l'effet des CSM dans le cadre de la radiothérapie abdomino-pelvienne. 259 260 261 262 Références Bibliographiques (2010, March 9, 2010). Pulmonary-Allergy Drugs Advisory Committee Complete Response on Pirfenidone. 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La sphère abdomino-pelvienne concentre de nombreux cancers (prostate, vessie), et des organes à risque lors de la radiothérapie. Le côlon-rectum développe des séquelles sévères chez 20% des patients 20 ans après traitement. La fibrose colorectale est la principale de ces complications. Les traitements actuels de ces lésions sont palliatifs. Les Cellules Souches Mésenchymateuses (CSM) favorisent la régénération tissulaire dans de nombreuses pathologies, y compris fibrosantes, et semblent donc adaptées au traitement des atteintes radio-induites. Néanmoins, les effets des CSM sur la tumeur et sur les complications des radiothérapies sont méconnus. Nos travaux évaluent la sureté et l'efficacité de la transplantation de CSM avant et après radiothérapie colorectale chez le rat. Sur un modèle de tumorigénèse colorectale suivie de radiothérapie, l'injection de CSM a inhibé la croissance tumorale en modifiant le profil des lymphocytes T et macrophages du microenvironnement tumoral. Dans un second modèle, les CSM ont induit une suppression durable de la fibrose colorectale radio- induite. Les protéines HGF et TSG-6 sécrétées par les CSM bloquent l'acquisition du phénotype pro- fibrosant par les cellules sécrétrices de matrice extracellulaire dans le côlon-rectum. Les CSM ont amélioré la survie des animaux dans ces deux modèles. Dans l'ensemble, nos résultats supportent l'utilisation des CSM dans le contexte des complications des radiothérapies abdomino-pelviennes. Mots-clés Mésenchymateuses. ; Cellules Souches : côlon-rectum fibrose ; tumorigenèse ; radiothérapie ; Abstract Despite the growing number of cancer cases, current anti-cancer treatments greatly improve patients' survival. Although it is efficient, radiotherapy can induce severe complications. The abdomino-pelvic area regroups cancers with high prevalence (prostate, bladder) and organs at risk during radiotherapy. Colon and rectum display severe side effects in 20% of patients 20 years after treatment. Colorectal fibrosis is the most frequent of these complications. Existing treatments are only palliative. Mesenchymal Stem Cells (MSCs) promote tissue regeneration in a wide variety of pathologies, fibrosis included, and thus seem fitted for the treatment of radiation-induced disorders. However, the effects of MSCs on tumor growth and radiotherapy induced damages are still unclear. Our work evaluates the safety and efficacy of MSC transplantation before and after colorectal radiotherapy in rats. In a model of chemically-induced colorectal carcinogenesis, followed by radiotherapy, MSC injection suppressed tumor growth by modifying the phenotype of T lymphocytes and macrophages of the tumor microenvironment. In a second model, transplanted MSCs suppressed radiation-induced fibrosis. Two proteins secreted by MSCs, HGF and TSG-6, are responsible for inhibiting extracellular matrix- producing cells, which are the major contributors to fibrosis. MSC injection was associated with increased survival in both studies. Overall, our results support the use of MSCs to treat the side effects of abdomino-pelvic radiotherapy. Keywords : colorectal ; tumorigenesis ; radiotherapy ; fibrosis ; Mesenchymal Stem Cells. 414 | HAL | Scientific |
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Il existerait dans la cellule un tout autre type de réseau que celui constitué par les microtubules, microfilaments, et les filaments intermédiaires. Ce micro réseau de nature particulière serait à l'origine de la consistance gélatineuse de la cellule et permettrait la fixation des ribosomes fixés à lui et accompagnés par les enzymes solubles du cytosol. Composé par un réseau complexe de bâtonnets qui traversent de part en part le cytosol, le squelette de la cellule, cytosquelette, permet de soutenir celle-ci et de participer à ces mouvements. Il s'agit en quelque sorte de sa musculature composée de trois types de bâtonnets qui sont les microtubules les microfilaments et les filaments intermédiaires.
Source
Encyclopédie Vulgaris Médical : Réseau microtrabéculaire
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Une myalgie est une douleur musculaire. C'est le terme générique englobant toutes les douleurs musculaires du corps charnu du muscle.
Diagnostic
Les myalgies peuvent être localisées et sont alors souvent de diagnostic facile, ou diffuses et alors de diagnostic plus difficile car les causes sont nombreuses et variées.
Le dosage des CPK et de la myoglobine peut être utile.
Un EMG détermine l'origine myogène ou neurogène.
La biopsie musculaire peut parfois être indiquée et reste souvent la clé du diagnostic, elle doit être orientée par la clinique et les examens complémentaires. Elle peut montrer une atrophie, une inflammation, une dégénérescence ou des signes plus spécifiques.
L'IRM musculaire est un examen intéressant et est complémentaire de la biopsie ; il peut montrer une atrophie, une infiltration graisseuse ou une inflammation.
Le diagnostic reste indéterminé dans 10 à 15 % des cas.
Les myalgies fonctionnelles représentent jusqu'à 30 % des cas.
Références
Articles connexes
Myalgie épidémique de Bornholm
Myopathie
Myorelaxant
Myofasciite à macrophages
Syndrome de la fesse morte
Fibromyalgie
Crampe
Anatomie
Liens externes
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Nous rapportons l' observation de Madame Z .
, 55 ans , opérée en juillet 1999 d' un prolapsus de néo - vagin survenu dans les suites d' une pelvectomie antérieure avec reconstruction vaginale .
Cette patiente avait été opérée en octobre 1997 d' un cancer de l' urèthre étendu au trigone vésical , sans autre localisation sur les voies excrétrices ni métastase à distance .
Le traitement avait consisté en une exentération pelvienne antérieure emportant la vessie et l' utérus par voie abdominale et le vagin par voie périnéale , associée à un curage ilio - obturateur bilatéral .
Un petit mur postérieur de vagin avait été laissé en place .
Une poche sigmoïdienne avait été confectionnée , à laquelle étaient anastomosés les uretères selon le procédé anti - reflux de Camey - Leduc .
Le réservoir sigmoïdien avait été maintenu en continuité avec le rectum et fixé au promontoire selon la technique de Mayence II .
La reconstruction vaginale , nécessaire chez cette patiente jeune souhaitant garder une activité sexuelle , avait été réalisée par abaissement du bas - fond caecal au périnée , ourlé en couronne à la peau et au vagin postérieur restant .
Le fond du néo - vagin avait été créé en suturant par un surjet résorbable le moignon colique droit .
La continuité digestive avait été réalisée par une anastomose iléocolique droite .
Les suites opératoires immédiates avaient été simples .
L' examen histologique avait confirmé l' existence d' un carcinome urothélial de l' urèthre envahissant le trigone vésical , classé pT3b .
L' utérus , les annexes et le vagin étaient indemnes .
Une adénopathie ilio - obturatrice gauche était tumorale .
Madame Z .
avait reçu 6 cures de chimiothérapie complémentaire par MVAC durant 5 mois .
Dix - huit mois plus tard , en avril 1999 , la patiente ne présentait aucun signe de récidive tumorale après surveillance clinique et tomodensitométrique régulière .
Le résultat fonctionnel de la néo - vessie sigmoïdienne était excellent , avec une bonne continence urinaire et fécale , 4 à 5 mictions diurnes et 2 mictions nocturnes .
Aucune complication métabolique n' était notée .
Cependant , la patiente se plaignait d' une saillie anormale de son néovagin , parfois hémorragique , avec issue fréquente de mucus .
Les rapports sexuels étaient peu fréquents en raison de cette gêne .
Madame Z .
nous était alors adressée .
L' examen clinique révélait l' existence d' un prolapsus du néo - vagin d' une longueur d' environ 5 centimètres , dont le fond ne pouvait pas être atteint .
Le sphincter anal était tonique .
La cicatrice abdominale était solide .
Une opacification dynamique du néo - vagin était réalisée , qui confirmait son déroulement à prédominance antérieure , et la bonne position du bas - fond caecal en retenue comme en poussée ( Figures 1 et 2 ) .
Il paraissait donc illogique et dangereux de proposer une promontofixation du néo - vagin caecal par voie abdominale .
Une reprise par voie vaginale a été réalisée en juillet 1999 .
Après incision sur la zone d' anastomose muco - vaginale , une libération ascendante du caecum abaissé a été réalisée et a permis de comprendre qu' une partie de la dernière anse iléale ( environ 4 centimètres ) avait été descendue avec le caecum .
Le méso de celle - ci a été lié à son contact en respectant la vascularisation caecale , permettant sa résection puis celle de l' ensemble du cul - de - sac colique droit .
L' intervention s' est terminée par une nouvelle anastomose caeco - vulvaire , en ne laissant plus que 8 centimètres environ de néo - vagin .
Les suites opératoires ont été simples .
Le transit est réapparu au 3ème jour , la patiente a quitté l' hôpital au 5ème jour .
Un toucher vaginal réalisé avant sa sortie montrait que le fond du néo - vagin était en place .
Madame Z .
a été revue en consultation à 1 mois puis à 7 mois .
Elle signalait des douleurs à la pénétration mais elle était satisfaite de l' absence de saillie vulvaire et de son activité sexuelle .
L' examen clinique mettait en évidence une rigidité péri - orificielle modérée .
Il n' existait plus de prolapsus , y compris en poussée . | DEFT2021 | Question Answering |
Introduction Définie comme l'incapacité persistante ou récurrente d'obtenir et/ou de maintenir une érection suffisante pour une activité sexuelle , la dysfonction érectile ne peut plus être méconnue ou négligée par les cardiologues D'abord considérée comme une pathologie de confort ou peu sérieuse malgré son impact négatif fréquent sur la vie quotidienne du patient , la dysfonction érectile s'est trouvée récemment associée à de multiples et fréquentes pathologies chroniques cardiovasculaires Ces intrications ont conduit à placer la dysfonction érectile au-delà de la sphère sexuelle devant l'obligation d'une prise en charge médicale transversale En moins de dix ans, trois bouleversements majeurs expliquent cette évolution Trois bouleversements majeurs Médicalisation croissante et irréversible L'hypermédiatisation du lancement du sildénafil en 1998 a sorti la dysfonction érectile d'un petit cercle de spécialistes pour l'introduire dans le grand public et dans la pratique quotidienne des médecins généralistes et spécialistes en large majorité, non ou peu familiarisés avec la pathologie sexuelle La réalité est que la méconnaissance des troubles sexuels et les difficultés d'en parler sont encore largement partagées par les soignants et les soignés d'o le paradoxe persistant d'un sous-traitement malgré les preuves d'une prévalence élevée et d'une demande réelle quoique souvent masquée La santé sexuelle étant définie par l'OMS comme l' expérience d'un processus continu de bien-être physique, psychique et socioculturel concernant la sexualité , il n'est pas étonnant que la dysfonction érectile affecte souvent la vie quotidienne de l'homme et du couple car, elle a la particularité d'être en règle subie à deux Dès 1999, le Comité consultatif national d'éthique pour les sciences de la vie et de la santé a clairement légitimé cette demande de prise en charge et cette médicalisation : la reconnaissance de l'activité sexuellecomme expression et facteur de bien-être , implique que sa défaillance puisse être traitée par la médecinetoute amélioration des troubles de la vie sexuelle concourt au bien-être de l'individu La dysfonction érectile est un baromètre clinique pertinent de la santé et de la qualité de vie La dysfonction érectile est apparue certes comme un symptôme de la santé sexuelle (et marqueur de la qualité de vie) et aussi de la santé non sexuelle (physique et psychique) comme l'a démontré la multiplication d'enquêtes épidémiologiques à partir des années 1990 Cette distinction dysfonction érectile symptôme ou maladie n'est pas que conceptuelle, elle est aussi pratique car les objectifs de prise en charge sont très différents quoique souvent complémentaires La dysfonction érectile maladie concerne d'abord la qualité de vie tandis que la dysfonction érectile symptôme concerne avant tout la santé Elle permet notamment de ne pas faire un bilan systématique à tout sujet mais une évaluation ciblée qui hiérarchise les priorités en fonction des données cliniques primordiales La dysfonction érectile est une dysfonction endothéliale et un marqueur clinique prédictif du risque cardiovasculaire Le troisième bouleversement, peut-être le plus important, réside dans l'évolution du concept physiopathologique prévalent pour expliquer une dysfonction érectile Plutôt qu'une maladie vasculaire locorégionale limitée aux seuls corps caverneux, une dysfonction érectile est apparue, en fait, comme la partie émergée d'une plus vaste dysfonction endothéliale touchant tous les territoires vasculaires à des degrés divers Ainsi, la dysfonction érectile pourrait être considérée comme un symptôme sentinelle, véritable marqueur clinique prédictif d'événements cardiovasculaires potentiellement fatals Physiologiquement , l'érection est avant tout un phénomène hydraulique à prédominance vasculaire et la phase de tumescence est assimilable à un test d'effort vasculaire ultrasensible La vasodilatation NO dépendante des artérioles des corps caverneux y joue un rôle physiologique prépondérant Son altération résulte d'une dysfonction endothéliale non limitée aux corps caverneux mais ubiquitaire de tout l'arbre artériel La classe thérapeutique des inhibiteurs de la phosphodiestérase de type 5 (IPDE-5) principalement localisée au niveau des corps caverneux de la verge bloquent la dégradation du GMPc et renforcent ainsi la vasodilatation NO dépendante des artérioles La dysfonction érectile est apparue être un marqueur prédictif du risque d'événements cardiovasculaires chez les diabétiques , chez les sujets dyslipidémiques , chez les patients à haut risque cardiovasculaire , et même chez des sujets sans facteur de risque cardiovasculaire à un horizon plus ou moins rapproché de quelques mois à quelques années La dysfonction érectile pourrait ainsi être considérée comme le premier signe décelable d'une maladie vasculaire généralisée ou encore la partie émergée de l'iceberg d'un désordre vasculaire global Les conséquences pour la pratique cardiologique : comment et pourquoi dépister la dysfonction érectile ? Un dépistage qui doit intégrer l'âge du patient Schématiquement, l'âge permet déjà d'orienter le diagnostic et le bilan étiologique : avant 35 ans : la prévalence dans la population générale est minime (inférieure à 3 %) et relève de cas très particuliers (post-traumatique, antécédent familial ou personnel cardiovasculaire) La dysfonction érectile peut être le symptôme d'un manque de confiance, d'anomalies génitales (réelles ou supposées), de troubles identitaires, de la personnalité et/ou relationnels, puis, éventuellement d'un état morbide (dépression, diabète, addictions) Si la simple réassurance et la correction des idées reçues suffisent parfois, un avis spécialisé (andrologique, sexopsychologique voire psychiatrique) est souvent nécessaire (d'autant plus que le trouble est ancien) du fait d'une souffrance et d'un retentissement sur la qualité de vie souvent important chez ces hommes jeunes à l'origine parfois de comportements suicidaires ; de 35 à 50 ans : la prévalence est faible mais non négligeable (310 %) et une étiologie vasculaire doit être évoquée de principe Elle peut être aussi le symptôme d'un trouble anxiodépressif ou relationnel ( conjugopathies ) puis de diverses morbidités chroniques et/ou de situations à risque pour la santé après 50 ans : la prévalence varie de 10 à 20 % chez les hommes de 50 à 60 ans pour augmenter à plus de 25 % après 60 ans La dysfonction érectile reste en priorité un symptôme vasculaire Elle doit faire aussi rechercher un trouble de l'humeur ou relationnel ainsi qu'un trouble iatrogène, urologique, hormonal (hypogonadisme secondaire) dont la prévalence augmente avec l'âge Un dépistage orienté chez les sujets à risque cardiovasculaire Actuellement, le dépistage de masse n'est pas licite Les recommandations actuelles portent sur un dépistage orienté des populations à risque définies par l'âge et par le terrain cardiovasculaire Ainsi en est-il des hommes diabétiques et des sujets ayant un syndrome métabolique à haut risque d'accidents vasculaires aigus Ce dépistage opportuniste proactif pourrait raisonnablement être élargi à tout homme, quel que soit son âge, présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire Enfin, un dépistage communautaire de principe pourrait être proposé chez tout homme consultant après 50 ans Cela pour plusieurs raisons : ce nouveau marqueur clinique de risque cardiovasculaire a une très bonne valeur prédictive d'événements ; l'épidémiologie montre qu'il s'agit d'une période o sa valeur diagnostique est la plus rentable du fait de l'augmentation de prévalence de la dysfonction érectile ; la demande de prise en charge est fréquente quoique souvent masquée car la vie sexuelle reste un paramètre de qualité de vie encore important chez une majorité d'individus avançant en âge ; cette alarme clinique a l'avantage d'être très concrète pour tous les individus et facilement décelable par un simple interrogatoire lors d'une consultation ; la dysfonction érectile a tendance à une autoaggravation soulignant l'intérêt d'une prise en charge précoce La dysfonction érectile, un nouveau symptôme pour le cardiologue Les relations physiopathologiques, épidémiologiques et cliniques désormais établies entre dysfonction érectile et maladie coronaire doivent conduire à intégrer un trouble de l'érection comme un symptôme potentiellement cardiologique devant faire rechercher une ischémie myocardique silencieuse associée Une très récente mise au point pour le clinicien met en exergue ces bruits du silence , symptômes chuchotés autre que l'angine de poitrine, qui doivent être connus et doivent attirer l'attention du cardiologue et conduire à suspecter l'existence d'une ischémie myocardique silencieuse Ainsi à côté de la dyspnée, des palpitations et de l'asthénie à l'effort, la dysfonction érectile est désignée comme un symptôme qui pourrait être un excellent marqueur d'une maladie coronaire silencieuse, en particulier chez le diabétique et/ou chez le sujet à haut risque cardiovasculaire Selon les recommandations du consensus de Princeton de 2000 réactualisées en 2005 , la découverte d'une dysfonction érectile devrait conduire à la réalisation d'un test d'effort chez une majorité de ces hommes dès lors que le risque global parat intermédiaire et a fortiori s'il est élevé avant l'initiation d'un traitement par inhibiteur de la phosphodiestérase de type 5 (IPDE-5) Les précautions d'utilisation de cette classe thérapeutique chez le coronarien sont connues : contre-indication en cas d'instabilité clinique et lors de la prise récente de dérivés nitrés ou de donneurs de NO en raison d'un risque de potentialisation de l'effet vasodilatateur hypotensif Après une période initiale de doute sur la tolérance cardiovasculaire des IPDE-5, plusieurs registres de pharmacovigilance nord-américain et anglais ont démontré l'absence de risque coronaire comparativement à une population témoin appariée par tranches d'âge Enfin, plusieurs études conduites chez des coronariens avérés ont confirmé que le sildénafil avait des effets hémodynamiques et ergométriques favorables et une très bonne tolérance clinique Dès lors, devant une dysfonction érectile le rôle du cardiologue est multiple : relever le symptôme et évoquer une pathologie vasculaire sous-jacente ; rechercher une atteinte coronaire par un test d'effort selon le niveau de risque cardiovasculaire en référence au consensus de Princeton ; indiquer les réserves des contre-indications des IPDE-5 ; adapter le traitement anti-ischémique en modulant le recours aux dérivés nitrés selon le contexte clinique pour pouvoir autoriser les IPDE-5 le cas échéant Conclusion De façon inattendue, la dysfonction érectile est en train de déborder largement le seul cadre de la sphère sexuelle du fait de son intrication avec de multiples pathologies cardiovasculaires Le cardiologue ne peut plus méconnatre ou négliger ce symptôme en raison de sa valeur de marqueur pertinent de l'état de santé globale et de son impact négatif fréquent sur la vie quotidienne à l'origine d'une demande réelle mais souvent masquée Son potentiel de symptôme sentinelle révélateur de pathologies cardiovasculaires a ouvert la perspective d'un dépistage ciblé opportuniste et proactif notamment chez les patients à haut risque vasculaire en prévention primaire des accidents vasculaires aigus La dysfonction érectile apparat de plus en plus comme un problème de santé publique, d'o l'accord professionnel actuel d'inscrire le bilan de ce symptôme dans une démarche de prise en charge globale de la santé À son niveau, au même titre qu'il recherche par l'interrogatoire une angine de poitrine, le cardiologue devrait désormais rechercher ce nouveau symptôme cardiologique, la dysfonction érectile. | ISTEX | Scientific |
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INTRODUCTION Le sel de sodium de l'acide dinaphtylméthanedisulfonique noté D. N. M. D est un dispersant obtenu par une succession de réactions chimiques basées principalement sur la sulfonation du naphtalène avec de l'oléum à 160 C, suivie d'une condensation avec du formaldéhyde à 37 % sous reflux Enfin, la masse réactionnelle est neutralisée avec de la soude caustique à 50 % Ce produit est commercialisé sous deux formes : liquide et solide (granulé) Il est largement utilisé Tirés-à-part : Ladhari Néji, 14 rue de TOasis, 4070 Msaken, Tunisie dans l'industrie textile comme agent de dispersion des colorants, en particulier dans la teinture des matières synthétiques, notamment les polyesters Dans ce travail, nous avons étudié la deuxième phase du procédé de fabrication de ce produit (D. N. M. D. ) qui est la réaction de condensation de la masse de sulfonation avec du formaldéhyde sous reflux Le but est de montrer, après la détermination exacte de la composition de la masse de sulfonation (% de naphtalène restant, % des monoacides, % des diacides) en utilisant la technique CLHP (Chromatographie Liquide à Haute Performance), l'effet de certains paramètres sur les propriétés des produits de condensation de ce type de produits Egalement la détermination des différents degrés de condensation a été effectuée en utilisant deux techniques : la C. C. M (Chromatographie sur Couche Mince) et la MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption-Mass Spectrometry) L'utilisation de ces techniques s'est avérée très bénéfique pour la détermination des masses molaires des différents produits condensés en fonction des différents paramètres Egalement, l'influence de la concentration en formaldéhyde, du rapport molaire ; formaldéhyde/naphtalène, et de la durée de la condensation sur le déroulement et la vitesse de réaction ont été étudiées lors de la condensation Etant donné que, dans le procédé industriel, la masse de sulfonation est directement condensée, il est fort intéressant d'étudier l'effet de composition de cette masse de sulfonation (reste de naphtalène, % des monoacides sulfoniques, etc. ) sur le déroulement de la réaction de condensation (cinétique et degré de polycondensation) Vue la complexité de la composition de la masse de sulfonation, peu de travaux ont décrit correctement la masse molaire et le degré de polycondensation des produits obtenus En effet, le mélange de produits obtenus, après la réaction de condensation de la masse de sulfonation avec du formaldéhyde sous reflux, présente différents degrés de polycondensation n , figure 1 : m H2O Réaction de condensation des acides naphtalène-sulfoniques avec du formaldéhyde La condensation des acides naphtalène-sulfoniques avec du formaldéhyde a fait l'objet de plusieurs travaux Plusieurs paramètres (rapport molaire entre les différents réactifs, température, concentration de l'acide sulfurique, celle du formaldéhyde et durée de la réaction) influençant cette réaction de condensation ont été étudiés Yasuoka a étudié la condensation du 2-monosulfonique acide noté l'acide (2-) avec 0, 5 à 1 mole de formaldéhyde à une température comprise entre 383 et 393 K, catalysée par 10 % d'acide sulfurique (calculé par rapport à la quantité de l'acide (2-) Nagoro et coll ont constaté que la vitesse de condensation des constituants augmente de manière proportionnelle à la concentration d'acide sulfurique et de formaldéhyde Basam et coll ont proposé de condenser 0, 65 mole de formaldéhyde avec 1 mole de mélange d'acides sulfoniques préparés par sulfonation de naphtalène pendant 5 h à 433 K Chao a étudié, également, la condensation de la masse de sulfonation à température inférieure à 373 K avec du formaldéhyde à 37%, en faisant varier la durée de la réaction et la concentration de l'acide sulfurique ; il est parvenu aux constatations suivantes : -le pourcentage des condensats de degré de condensation n & ; lt ; 5 (n nombre de monomères polycondensés) diminue au fur et à mesure que la durée de la réaction augmente (25 % pour une heure, 3 % pour deux heures et 0, 75 % pour trois heures), -la durée favorise la formation des condensats de degré élevé n & ; gt ; 9 (à partir de 3 heures), -pour augmenter le degré de condensation de la masse de sulfonation avec du formaldéhyde, Chao [6] a augmenté la quantité d'acide sulfurique, mais il y a un risque que le produit prenne en masse car la viscosité augmente Pour éviter ce phénomène, un ajout d'eau est nécessaire, tout en respectant le degré de condensation visé, car si on ajoute une grande quantité d'eau on n'atteindra pas le degré de condensation voulu, -pour une quantité d'acide sulfurique supérieure à 1, 75 fois celle de l'un (ou l'autre) constituant, on obtient des condensats supérieurs à neuf unités de monomères Cette valeur devient inférieure à cinq si la quantité d'acide sulfurique passe en dessous de 1, 25 fois En étudiant quelques propriétés des produits de eondensation des acides naphtalènesulfoniques, Kariyone est parvenu aux résultats suivants : -leur force de dispersion est élevée, -la lumière provoque un changement de couleur par rapport à l'état initial après synthèse et, suivant les conditions d'utilisation, ceci peut constituer un inconvénient, -un produit comportant plusieurs noyaux ne diminue que légèrement la tension superficielle (degré élevé de condensation), -lorsque le nombre de noyaux condensés augmente, la solubilité vis-à-vis de l'eau augmente Par ailleurs, Thomson a supposé que le produit de condensation dépend énormément de la quantité de naphtalène non sulfoné En effet, c'est autour de ce naphtalène que les ramifications se forment, 6 : La chaleur de dilution de l'acide sulfurique excédentaire entrane une élévation de la température ; c'est pourquoi on refroidit à nouveau le mélange de manière à ramener la température à 373 K Condensation Afin de déterminer sa composition, après chaque réaction de sulfonation, la masse obtenue est analysée par CLHP selon la méthode décrite dans le paragraphe 2. 3 et le tableau I La quantité de formaldéhyde (concentration initiale 37%) nécessaire est ajoutée progressivement sur la masse de sulfonation pendant dix minutes pour éviter l'emballement de la réaction La température est ajustée entre 383 et 388 K Le mélange engagé dans la réaction est constitué de la masse aqueuse de sulfonation obtenue et de la masse du formaldéhyde additionnée selon les conditions de chaque essai Lorsque la température est supérieure à 358 K, le formaldéhyde s'échappe sous forme gazeuse du milieu réactionnel, provoquant un moussage modéré autour de l'axe de l'agitateur Le travail dans un réacteur fermé est plus approprié, étant donné qu'il est moins sensible aux fluctuations de la température du mélange réactiormel Si l'on porte la température au-dessus de 383 K (393 K), la pression augmente, mais l'augmentation de la température se traduit par une augmentation de la vitesse réactiormelle : le formaldéhyde est consommé d'autant plus rapidement et la pression baisse rapidement Lors de la condensation, l'influence de la concentration en formaldéhyde, du rapport molaire : formaldéhyde/naphtalène, et de la durée de la condensation sur le déroulement et la vitesse de réaction ont été étudiées RESULTATS 3. 1 Influence de la concentration du formaldéhyde sur la réaction de condensation La concentration du formaldéhyde utilisée joue un rôle important sur la vitesse de eondensation La vitesse de condensation crot avec l'augmentation de la concentration initiale du formaldéhyde, 7 : La coneentration du formaldéhyde ne peut pas dépasser certaines valeurs du fait de la chaleur de dilution et de la chaleur de condensation ; la réaction devient difficilement contrôlable La vitesse réactioimelle dépend fortement de la concentration initiale Pour du formaldéhyde à 25 %, on peut raccourcir la durée à moins d'ime heure Il est vrai que l'on peut continuer à raccourcir la durée, mais la réaction devient déjà difficile à contrôler Influence de la quantité de naphtalène restante sur la réaction de condensation En général, le naphtalène se condense en partie avec le formaldéhyde Cependant, la réaction est lente Au bout de 8 h à une température de 383 K, on n'atteint que 60 % de conversion du naphtalène Ce dernier qui est toujours présent en assez faibles quantités dans le mélange de sulfonation peut également se condenser Des essais de condensation avec du formaldéhyde ont été réalisés à partir des mélanges contenant différents pourcentages de naphtalène Ces mélanges sont les suivants : -un mélange massique de 1 et 2-monoacide sulfonique pur (30/70 %), -le même mélange massique de monoacides sulfoniques avec 3 % de naphtalène, -le même massique de monoacides sulfoniques avec 5 % de naphtalène, -le même massique de monoacides sulfoniques avec 10 % de naphtalène Pour le choix de la composition de différents mélanges, nous avons essayé de nous approcher au mieux de la composition réelle obtenue après la réaction de sulfonation 3. 2. 1 Analyse nar C. C. M des produits de condensation Une goutte de solution de la masse de condensation est déposée sur une plaque de C. C. M. , l'éluant utilisé est un mélange de butanolacide acétique-eau dans un rapport volumique Masse (g) Spectre de masse obtenu avec la méthode MALDI-MS agrandi (durée 2 h, 10 % naphtalène) Influence de la durée de condensation Afin d'étudier l'influence de la durée de la condensation sur la réactivité des différents produits existant dans la masse de sulfonation (% monoacides, % diacides et % naphtalène restant), des séries d'essais de sulfonation dont la durée est Acides naphtalène-sulfoniques et formaldéhyde 3. 3, 2 Analyse nar MAT DT-MS des Produits de condensation La méthode MALDI-MS a permis d'obtenir les différentes masses des produits qui constituent les échantillons En conséquence, on peut connatre le nombre d'unités de monomères qui forment les différents produits (voir la discussion ci-dessous) DISCUSSION En se basant sur les recherches de Hatori qui a établi une relation entre le rapport frontal Rf (Rf est le rapport de la distance parcourue par le produit sur la plaque de silice par celle parcourue par l'éluant), la masse molaire et le degré de condensation, tableau III, les différents constituants de la masse de condensation ont été identifiés à partir de leur Rf Pour qu'une séparation soit significative entre deux produits, une différence supérieure à 0, 20, entre les Rf de chacun des deux produits, a été considérée D'après les résultats obtenus figurant dans le tableau IV, nous avons constaté que parmi les produits détectés dans l'échantillon ne contenant pas du naphtalène, se trouvent les monoacides non condensés, alors qu'ils n'existent pas dans les autres échantillons contenant du naphtalène Ceci peut s'expliquer par le fait que le naphtalène possède des noyaux plus actifs que ceux des monoacides sulfoniques ; alors ils s'associent davantage avec les autres molécules de monoacides, ce qui se traduit par une consommation plus élevée des monoacides sulfoniques Par ailleurs, l'analyse par la méthode MALDI-MS des essais contenant les différents pourcentages de naphtalène a montré que : -pour tous les échantillons, la présence de plusieurs séries de signaux communs qui présentent les mêmes masses molaires ont été détectés surtout au début du spectre (474, 717 et ^59), , -jusqu'à la sixième bande d'absorbance, l'échantillon ayant 0 % de naphtalène semble constitué de condensats réguliers (la différence entre deux pics consécutifs est de 242, 6), -pour les échantillons contenant du naphtalène (3, 5 et 10 %), les spectres obtenus par le MALDI-MS démarrent directement du signal correspondant au dimère (474), ils ne montrent pas l'existence du signal correspondant au monomère figure 9a Ceci peut impliquer que la présence du naphtalène favorise et catalyse la réaction de la condensation (apport des noyaux non désactivés) ; en conséquence, on consomme plus de monomères Ladhari et al -les autres échantillons représentent une variation aléatoire ; ils ne vérifient pas l'hypothèse des condensats linéaires, mais plutôt se rapprochent de l'hypothèse émise par Thomson qui a affirmé que c'est autour du naphtalène que la condensation s'effectue, ^igiire 9b La comparaison des résultats obtenus par C. C. M et ceux obtenus par le MALDI-MS a montré que la C. C. M donne une première information qualitative sur la composition de l'échantillon, alors que le MALDI-MS parvient à déduire plus d'informations (masse d'un monomère, masse de chaque produit formé, degré de condensation) En effet, dans notre cas, chaque tache obtenue par C. C. M représente en réalité un ensemble de produits très proches en poids moléculaire, /igures 9a et 9b (difficilement séparables par C. C. M. ) et non pas un seul produit comme peut le laisser penser la C. C. M Par ailleurs, l'étude de l'effet de la durée de la condensation à différentes températures, tableau VU, a montré que ; -le nombre de taches augmente au fur et à mesure que la durée de la condensation augmente ainsi que la température, ce qui implique la continuité de la réaction de la condensation, -comme nous l'avons déjà constaté, chaque tache contient un ensemble de produits qui sont très proches en masse et difficilement séparables avee l'analyse par C. C. M Cette dernière méthode nous a permis seulement de suivre l'évolution de la réaction, l'augmentation du nombre de taches dans les échantillons sulfonés à 413 et 433 K, tableau VII peut être due à la formation des condensats des diacides puisque ces derniers se forment davantage à haute température D'après les spectres de masse des échantillons qui sont similaires à celui de la figure 9a et qui ne diffèrent que par le nombre des bandes d'absorbance, on peut déduire que les échantillons obtenus suite à une durée de six heures de condensation et selon leurs compositions, tableau VIII, représentent les masses moyennes les plus élevées (2508, 2576 et 3014) : ce sont les produits de condensation les plus longs Les condensats semblent provenir à la fois des acides mono acide 1-et 2-naphtalènesulfonique et, en particulier, de l'acide 2-naphtalènesulfonique En effet plus la concentration en acide 2-augmente, plus la masse moyenne des condensats augmente et les propriétés dispersantes du produit fini s'améliorent Par ailleurs, le nombre de noyaux condensés n'est pas forcément pair comme le prévoit Arduini Tableau VIII Masses moyennes obtenues à partir de différentes compositions de la masse de sulfonation après six heures de condensation Ceci peut nous faire penser que le début de la condensation commence par la formation des condensais à chanes linéaires jusqu'à l'ordre n 6 ou 8 ; ensuite les condensais à chanes ramifiés se forment pour atteindre les différents degrés de condensation selon les conditions expérimentales CONCLUSION Ce travail nous a permis de montrer l'effet de certains paramètres sur le déroulement de la réaction de la condensation des acides naphtalènesulfoniques avec le formaldéhyde La nature des produits finaux dépend de la température, de la concentration du formaldéhyde et de la durée de la condensation En début de réaction, on forme des produits de condensation à chanes linéaires qui se ramifient ultérieurement Vraisemblablement une courte durée de condensation (1 heure) permet d'obtenir en majorité des produits de condensation à chmnes linéaires plus facilement que la méthode proposée par Arduini Toutefois, on note deux différences : premièrement les condensais peuvent provenir à la fois des monoacides 1 et 2 naphtalènesulfonique et non pas uniquement de l'acide 2 naphtalènesulfonique, deuxièmement le nombre de noyaux condensés n'est pas forcément pair comme le prévoit Arduini La méthode MALDI-MS a permis d'obtenir les différentes masses des produits qui constituent les échantillons En conséquence, on peut connatre le nombre d'unités de monomères qui forment les différents produits, qui varie de 1 à 18 unités, ce qui influence directement les propriétés dispersantes du produit fini Cependant, lorsqu'on arrête la réaction après une heure, il reste du formaldéhyde et des acides sulfoniques non condensés qui peuvent être gênants pour des applications pratiques. | ISTEX | Scientific |
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COMMISSION DE LA TRANSPARENCE Avis 7 mars 2018 linézolide LINEZOLIDE FRESENIUS KABI 600mg, comprimé pelliculé B/10 (CIP : 34009 301 013 6 0) Laboratoire FRESENIUS KABI FRANCE Code ATC J01XX08 (autres antibactériens) Motif de l'examen Inscription Liste concernée Collectivités (CSP L. 5123-2) Pneumonies nosocomiales Pneumonies communautaires LINEZOLIDE FRESENIUS KABI est indiqué dans le traitement chez les adultes des pneumonies nosocomiales et communautaires lorsqu'elles sont documentées ou suspectées d'être à bactéries à Gram positif sensibles. Afin de déterminer si LINEZOLIDE FRESENIUS KABI est un traitement approprié, il convient de tenir compte des résultats de l'antibiogramme ou des données de prévalence de la résistance aux antibiotiques des bactéries à Gram positif (voir rubrique 5. 1 du RCP). Le linézolide n'est pas actif dans le traitement des infections dues à des germes à Gram négatif. Un traitement spécifique des germes à Gram négatif doit être initié de façon concomitante si un germe à Gram négatif Indications est documenté ou suspecté. concernées Infections compliquées de la peau et des tissus mous (voir rubrique 4. 4 du RCP). LINEZOLIDE FRESENIUS KABI est indiqué chez les adultes dans le traitement des infections compliquées de la peau et des tissus mous uniquement lorsque l'infection a été microbiologiquement documentée à bactérie à Gram positif sensible. Le linézolide n'est pas actif dans le traitement des infections dues à des germes à Gram négatif. En cas d'infection bactérienne à Gram positif compliquée de la peau et des tissus mous associée à une infection à Gram négatif documentée ou suspectée, le linézolide ne doit être utilisé qu'en l'absence d'alternative thérapeutique (voir rubrique 4. 4 du RCP). Dans de telles circonstances, HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 1/3 Avis 1 un traitement couvrant les germes à Gram négatif doit être initié de façon concomitante. Un traitement par le linézolide devra être débuté uniquement en milieu hospitalier et après avis d'un spécialiste tel qu'un microbiologiste ou un infectiologue. Il convient de tenir compte des recommandations officielles concernant l'utilisation appropriée des antibactériens. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 2/3 Avis 1 01 INFORMATIONS ADMINISTRATIVES ET REGLEMENTAIRES AMM Date initiale (procédure décentralisée) : 24/01/2018 Conditions de prescription et de Liste I délivrance / statut Médicament soumis à prescription hospitalière. particulier 02 CONTEXTE Il s'agit d'une demande d'inscription de la spécialité LINEZOLIDE FRESENIUS KABI 600 mg, comprimé pelliculé, aux seules collectivités. Cette spécialité est destinée à remplacer la spécialité LINEZOLIDE KABI 600 mg, comprimé pelliculé, actuellement agréée aux collectivités, dont l'AMM a été obtenue en procédure nationale. Cette spécialité est un générique de ZYVOXID 600 mg, comprimé pelliculé. 03 CONCLUSIONS DE LA COMMISSION Considérant l'ensemble de ces données et informations et après débat et vote, la Commission estime : 03. 1 Service Médical Rendu La Commission considère que le service médical rendu par LINEZOLIDE FRESENIUS KABI 600 mg, comprimé pelliculé est important dans les indications de l'AMM. La Commission donne un avis favorable à l'inscription sur la liste des spécialités agréées à l'usage des collectivités dans les indications et aux posologies de l'AMM. 03. 2 Amélioration du Service Médical Rendu Cette spécialité est un générique qui n'apporte pas d'amélioration du service médical rendu (ASMR V) par rapport au princeps ZYVOXID 600 mg, comprimé pelliculé. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 3/3 Avis 1 | HAS | Scientific |
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