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Manifestations cardiaques de la drepanocytose | WMT16 | Scientific |
Evaluation de l'élasticité du muscle in situ par une méthode de quick-release | WMT16 | Scientific |
INSTABILITÉ STRUCTURALE ET CLONAGE L JanniÈre, D Brunier, Bertrand Michel, Sd Ehrlich To cite this version : L JanniÈre, D Brunier, Bertrand Michel, Sd Ehrlich. INSTABILITÉ STRUCTURALE ET CLON- AGE. Annales de Recherches Vétérinaires, INRA Editions, 1988, 19 (1), pp. 77-78. hal-00901799 HAL Id : hal-00901799 Submitted on 1 Jan 1988 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. parasite, agent de l'hypodermose (Varon). La purification de ces enzymes a été réalisée et leur séquence N terminale est connue (Lecroisey et al 19831. Le clonage du cDNA codant pour ces enzymes a été entrepris au laboratoire par les méthodes classiques. L'ARN total de larves de premier stade recueillies dans le tissu conjonctif d'oesophage de bovins abattus et conservées dans de l'azote liquide a été extrait par la méthode à l'isothiocyanate de guanidine et au chlorure de césium (Glisin et a11974) et l'ARN polyadénylé purifié à l'aide d'une colonne d'oligo dt-cellulose. Un microgramme d'ARNm d'une taille comprise entre 1 et 2 kb a été obtenu à partir de 200 larves. La synthèse de l'ADNe double brin (220 ng à partir de 0, 5 ! ig d'ARN) puis le clonage de l'ADNc dans le phage )gt10 ont été réalisés en utilisant les kits Amersham correspondants. La banque constituée à partir de 70 ng d'ADNc contient 100 000 recombinants. Après amplification, les clones recombinants sont testés avec une sonde radioactive qui a été synthétisée d'après la séquence 27- 31 de l'hypodermine A (Phe-Pro-Trp-Glu-Ile). L'analyse des clones reconnus par la sonde permettra de rechercher des inserts de taille voulue et d'envisager leur transfert dans un système d'expression. Références Glisin V, Crkvenjakov R, Byus C, 1974. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry 13 : 2633- 2637 LecroiseyA, Tong NT, Keil B, 1983. Hypodermin B, a trypsin-related enzyme from the insect Hypoderma lineatum. EurJ J Biochem 261-267 INSTABILITÉ STRUCTURALE ET CLONAGE L JANNIÈRE D BRUNIER B MICHEL SD EHRLICH Institut de Génie Moléculaire, 2 place Jussieu, 75005 Paris, France L'instabilité structurale des molécules d'ADN est un phénomène largement rencontré dans le monde vivant. La plupart du temps, cette instabilité est due à des événements de recombinaison entre des séquences ayant peu (< 25pb) ou pas d'homologie. Chez Bacillus subtilis, une bactérie à gram , il a été démontré que : 1 ) la fréquence des événements de recombinaison entre des séquences ayant peu d'homologie (9 pb) est 150 à 1 500 fois plus élevée dans les plasmides que dans le chromosome bactérien (Jannière et Ehrlich 1987), 2) que ces plasmides génèrent des molécules d'ADN simple-brin (ADN-SB) au cours de leur réplication (Te Riele et al 1986) 3) et que leur origine de réplication, quand elle est active, stimule la recombinaison homologue en son voisinage (Noirot et al 1987). Ces résultats nous ont incité à étudier l'impact que peut avoir la génération d'ADN-SB sur la recombinaison entre de courtes séquences dupliquées en utilisant des bactéries comme systèmes modèles. Dans ce but, nous avons construit des plasmides qui portent de courtes duplications et qui, chez E coli et suivant les conditions d'expérimentation, génèrent ou non des molécules d'ADN-SB au cours de leur réplication. Ces plasmides étaient composés des séquences de pBR322, de l'origine de réplication du phage M13 et de duplications de 9pb générées par l'insertion d'un dérivé du transposon Tn10. Ainsi, quand l'origine de réplication du phage M13 n'est pas active, ces plasmides ne génèrent pas d'ADN-SB. Par contre, quand cette origine est active (complémentée en trans par la protéine de réplication phagique), ces plasmides génèrent de l'ADN-SB. En utilisant ce système, nous avons démontré que la génération d'ADN-SB stimule très fortement la recombinaison entre les duplications de 9pb (104 à 106 fois). Par conséquent, la forte fréquence de recombinaison observée dans les plasmides de B subtilis pouvait être due à l'ADN-SB qu'ils génèrent au cours de leur réplication. Si tel est le cas, dans des plasmides ne générant pas d'ADN-SB, cette fréquence de recombinaison devrait être faible. Pour tester cette prédiction nous avons recherché des plasmides qui ne génèrent pas d'ADN-SB au cours de leur réplication puis mesuré la recombinaison en leur sein. Plusieurs plasmides de ce type ont été répertoriés et, dans deux d'entre eux, nous avons démontré que la fréquence de recombinaison entre des séquences répétées de 9pb est faible et voisine de celle observée dans le chromosome de B subtilis. Des vecteurs issus de ces plasmides ont alors été construits. Ils nous ont permis de cloner de nombreux fragments d'ADN de plus de 15 kb (jusqu'à 33 kb) chez B subtilis alors que dans les vecteurs classiques producteurs d'ADN-SB, les inserts ont une taille moyenne de 2 à 3 kb. Finalement, des résultats préliminaires indiquent que ces grands inserts peuvent être propagés pendant de nombreuses générations chez B subtilis sans subir de remaniement. En conclusion, ces résultats montrent que la génération d'ADN-SB peut avoir un effet important sur la structure des génomes, que cet effet semble être un phénomène général puisqu'il a été observé dans deux organismes différents, E coli et B subtilis, et souligne l'importance du choix des plasmides dans des expériences de clonage. Références Jannière L, Ehrlich SD, 1987. Recombinaison between short repeated sequences is more frequent in plasmids than in the chromosome of Bacillus subtilis. Mol Gen Genet. Sous presse. Noirot P, Petit MA, Ehrlich SD, 1987. Plasmid replication stimulates DNA recombination in Bacillus subtilis. J Mol Biol 195. sous presse Te Riele H, Michel B, Ehrlich SD, 1986. Single-stranded plasmid DNA in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci USA 83 : 2541-2545. VECTEURS D'EXPRESSION CHEZ LES EUCARYOTES DÉRIVÉS DE VIRUS À ADN G DEVAUCHELLE Station de Recherches de Pathologie Comparée INRA-CNRS, 30380 St-Christol-lez-Alès, France Aujourd'hui, nous disposons d'un grand nombre de vecteurs capables d'exprimer chez les Procaryotes, les levures ou les cellules Eucaryotes des gènes étrangers. Cependant, l'obtention de protéines fonction- nelles chez l'animal nécessite le plus souvent l'utilisation de vecteurs spécifiques. Tous les virus à ADN des animaux représentent des candidats potentiels, mais aucun d'entre eux n'est vraiment un vecteur idéal (Baichwal et Sugden 1986). En effet, le plus souvent, ce sont des vecteurs d'expression transitoire dont certains ont besoin d'un système Helper (cellule ou virus) pour pouvoir fonctionner. Seuls actuellement les virus de type papillome sont capables de se comporter comme de véritables plasmides et les cellules transformées peuvent alors exprimer un gène étranger pendant plusieurs générations. Cependant, des résultats très significatifs ont déjà été obtenus à partir de plusieurs virus en particulier du SV40, production d'antigènes du virus de l'hépatite B par exemple, et des Poxvirus, production de nombreux antigènes viraux susceptibles d'être utilisés comme vaccin en médecine humaine et en médecine vétérinaire. Depuis quelques années (Smith et ai 1983), un nouveau type de vecteur d'expression est utilisé par plusieurs chercheurs, il s'agit de vecteurs dérivés des Baculovirus. Ces virus d'insectes possèdent deux régions codantes pour des protéines (polyédrine, P10) qui s'expriment en très grande quantité en phase tardive du cycle de réplication et dont les produits ne sont pas indispensables à l'infectiosité des virions. L'utilisation de ces promoteurs forts permet ainsi la synthèse de très grandes quantités de protéines exogènes, protéines qui sont correctement maturées (glycosylation, phosphorylation. ) et souvent excrétées. La possibilité de multiplier ces virus in vitro et in vivo dans des conditions relativement simples les rend particulièrement attractifs comme vecteurs d'expression de gènes étrangers provenant de cellules Eucaryotes pour la production de molécules d'intérêt médical ou vétérinaire. | HAL | Scientific |
Comparaison de trois réactifs pour la détection de la résistance à la protéine C activée liée à la mutation du facteur V Leiden en cours de grossesse | WMT16 | Scientific |
La décontamination est l'opération visant à extraire ou inerter des contaminants (dont produits chimiques industriels toxiques et/ou écotoxiques, contaminants d'origine agro-industrielle (pesticides), radionucléides, toxiques de guerre) d'un liquide, du sol, de l'habitat ou de l'environnement.
Le décapage, l'extraction par solvants, la biodégradation (quand elle est possible), l'adsorption, la phytoremédiation, la fongoremédiation ou l'absorption sur divers supports sont utilisés.
La recherche teste de nombreux moyens de décontaminer les solides ou les milieux gazeux ou liquides.
Description
Ainsi, en 2011, une étude a montré que des pollens (d'Ambrosia artemisiifolia) magnétisés sont efficaces pour éliminer des composés organiques hydrophobes (COHs) toxiques ou indésirables tels que des pesticides, des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) (ont été testés : acénaphtène, phénanthrène, atrazine, diuron et lindane) ou encore des polychlorobiphényles (PCB) dans différentes matrices aqueuses contaminées. Avantage : les grains de pollen magnétisés peuvent facilement être retirés du milieu aqueux, par exposition à un champ magnétique après qu'ils ont adsorbé les polluants.
Cette étude a aussi montré que le pollen a été aussi efficace que le charbon actif pour extraire les COHs, et qu'il peut être régénéré pour être plusieurs fois réutilisé comme sorbant. Le charbon de bois activé est à ce jour[Quand ? ] moins coûteux que de grandes quantités de pollens, mais cette étude montre qu'un usage du pollen pourrait être réaliste, et aussi que les pollens pourraient jouer un certain rôle dans les phénomènes de bioconcentration de certains polluants.
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Références
Voir aussi
Bibliographie
(en) Gerald McDonnell et Denise Sheard, A Practical Guide to Decontamination in Healthcare, John Wiley & Sons, 2012.
Articles connexes
Contamination
Dépollution
Lien externe
(en) Methods of decontamination , sur le site de Health and Safety Executive (HSE) (consulté le 9 octobre 2014)
Portail de la chimie Portail de l'environnement Nettoyage et hygiène | WIKIPEDIA | Wiki |
La satisfaction des pharmaciens au Liban et la perspective de la pharmacie clinique | WMT16 | Scientific |
Mieux communiquer avec les patients non hospitalisés Didier Sciard, Marc Beaussier To cite this version : Didier Sciard, Marc Beaussier. Mieux communiquer avec les patients non hospitalisés. Praticien en Anesthésie Réanimation, Elsevier Masson, 2016, 20 (2), pp. 73-77. 10. 1016/j. pratan. 2016. 02. 008. hal-01298645 HAL Id : hal-01298645 Submitted on 6 Apr 2016 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Mieux communiquer avec les patients non hospitalisés D Sciard, M Beaussier Département d'Anesthésie-Réanimation chirurgicale. Unité de Chirurgie Ambulatoire. Hôpital St-Antoine. Groupe Hospitalier Est-Parisien. APHP. Sorbonne Universités. UPMC Univ Paris 06. France. Tel : 33(0)149282362 Adresse électronique : didier. sciard@aphp. fr La chirurgie ambulatoire est basée sur un concept d'organisation centrée sur le patient (1). Elle s'inscrit dans une continuité entre la ville et l'unité de chirurgie ambulatoire. Un plan de communication entre tous les acteurs de cette prise en charge doit être mis en place que ce soit avant, pendant ou après l'acte opératoire. Le groupe de travail HAS/ANAP a défini le parcours patient en 6 étapes (2) (3). A chacune de ces étapes il faudra avoir une communication claire avec le patient, son accompagnant ainsi qu'avec tous les acteurs de soins qu'ils soient médicaux ou paramédicaux, en ville ou à l'hôpital. En tant qu'acteur de ses soins le patient devra être informé de toutes les étapes de son séjour pour qu'il participe à sa prise en charge péri-opératoire. Les 6 étapes de cette prise en charge sont : Eligibilité du patient Organisation de la prise en charge du patient éligible Actions à mener la veille ou l'avant-veille de l'intervention prévue (J-1 ou J-2) Prise en charge du patient le jour de l'intervention (J0) Suivi immédiat après la sortie (J 1) Suivi du patient à distance de la sortie. A chacune de ces étapes il faudra connaitre, anticiper et maitriser les risques auxquels le patient sera exposé. 1) Eligibilité du patient Pour que le patient soit éligible à une prise en charge ambulatoire il faut qu'il réponde à des critères médicaux et chirurgicaux d'une part, psycho-sociaux et environnementaux d'autre part. Qui mieux que le médecin traitant peut apprécier avec la famille du patient certains critères d'éligibilité. Pour cela il faut que le chirurgien correspondant du médecin traitant informe celui-ci avec précision du geste qui sera effectué et de sa prise en charge en ambulatoire. 2) Organisation de la prise en charge du patient éligible 1 La programmation par le chirurgien est une étape importante qui doit tenir compte des impératifs de ce mode de prise en charge. Il faut passer du je vous opère le à quand puis-je vous opérer ? car c'est à ce moment que le patient ayant été informé des conséquences de cette chirurgie sur son autonomie devra s'enquérir de la disponibilité de son accompagnant et des éventuels soins à domicile et de la nature et la durée du handicap lié à la chirurgie. C'est aussi à ce moment qu'il faut anticiper quelques consignes de sortie telles que la nécessité de béquilles ou la prise en charge de la douleur. Lors de cette consultation il faudra dans certain cas communiquer largement avec l'accompagnant lorsqu'il s'agit de la prise en charge d'un enfant, d'une personne âgée et/ou dépendante ou lorsqu'il existe une barrière linguistique. Une fiche de liaison avec l'anesthésiste permettra aussi de préciser la nature et la durée prévisible de l'acte ainsi que certains besoins spécifiques comme ceux liés à la position opératoire souhaitée. La consultation d'anesthésie suit celle du chirurgien et prendra en compte tout ce qui a été décidé lors de cette consultation. Le patient et son accompagnant éventuel se verront réitérer toutes les informations concernant la prise en charge, la nécessité d'avoir un accompagnant pour la sortie et possiblement pour la première nuit. Lui seront aussi données les informations spécifiques sur le mode d'anesthésie choisi avec en particulier la prise en compte du risque de nausées/vomissements, de rétention urinaire ou de douleur postopératoire. Si une technique d'analgésie par un bloc périnerveux continu est envisagée, toutes les informations concernant le suivi à domicile de cette infusion lui seront données. Le patient doit sortir de la consultation du chirurgien et de l'anesthésiste avec en sa possession toutes les informations et documents nécessaires à sa prise en charge. Ces documents seront regroupés dans un dossier spécifique encore appelé passeport ambulatoire. Idéalement à l'issu de ces consultations, le patient prendra contact avec l'unité de chirurgie ambulatoire pour visualiser le parcours qu'il devra effectuer le jour de l'intervention et recevoir les consignes du personnel de l'UCA l'informant entre autre de la procédure d'appel le ou les jours précédents l'intervention. 3) Actions à mener la veille ou l'avant-veille de l'intervention prévue (J-1 ou J-2) Dans les jours précédents la chirurgie et habituellement la veille (appel J-1), le patient doit être recontacté par le secrétariat de l'UCA soit par téléphone soit par un système d'appel automatisé. Cet appel de la veille vise à réduire les dysfonctionnements de prise en charge. Les principaux objectifs sont de : Dépister les modifications de l'état de santé du patient Informer de l'heure de rendez-vous du patient et de son accompagnant Rappeler les consignes préopératoires Diminuer le risque d'annulation 2 Préparer les patients à l'intervention Cet appel actuellement réalisé dans la plupart des centres par téléphone présente plusieurs inconvénients. Il est chronophage et représente un temps-coût en secrétariat ou personnels soignants non négligeable pour la structure. Il est en général opérateur-dépendant, n'est pas toujours compatible avec la disponibilité du patient et dépend donc du moment de réception et ne résout pas le problème de la barrière linguistique si elle existe. Le nombre croissant de patients pris en charge en CA incite à développer des techniques de rappel automatisées avec pour but de : Décharger les équipes infirmières de tâches répétitives à faible valeur ajoutée Identifier les patients présentant une anomalie dans le suivi Allouer les ressources aux seuls patients qui en ont besoin Les nouvelles techniques relatives à l'informatique connectée à l'internet (NTIC) au service de la santé permettent de développer des nouveaux outils de suivi médical basés sur ces nouvelles technologies avec pour objectif une meilleure observance et une meilleure efficience des protocoles de prise en charge. Plusieurs études ont montré que l'utilisation d'un système de communication par un service de message court Short Message Service (SMS) permet de réduire significativement les annulations et d'augmenter le respect des consignes préopératoires (4). Deng et al ont ainsi montré une diminution significative du taux d'annulation dans le groupe des patients recevant un SMS avec 40% de probabilité en moins d'annulation. De même le respect des consignes était plus important dans le groupe SMS comparé au groupe contrôle (5). En pédiatrie, l'utilisation d'un programme de préparation des enfants et de leurs parents via un système d'information par internet a montré son efficacité pour réduire l'anxiété préopératoire des enfants (6) (7). Une étude récente du Credoc souligne que la m-health ou médecine connectée va bouleverser les pratiques (8). Le graphique n 1 montre que l'utilisation des NTIC varie en fonction de l'âge mais ne chute vraiment qu'après 70 ans. Les Smartphones ou l'utilisation courante d'internet sont encore inégalement répartis dans la population mais seront sans doute le moyen de communication privilégié dans le futur car la majorité des moins de 30 ans sont connectés (graphique n 2). En attendant, le SMS peut être le moyen privilégié pour une automatisation. En effet cette étude du Credoc montre que 89 % de la population française possède un téléphone portable et que 78 % sont utilisateurs habituels des SMS. Les avantages des SMS par rapport à l'appel téléphonique classique sont : 97% sont lus dans les 5 secondes Choix du moment et du nombre de lectures 3 Choix dans la langue de lecture Trace numérique du contact Dans le service de chirurgie ambulatoire de St Antoine nous avons mis en place avec la société Calmedica et son système Memoquest (outil de dialogue automatisé entre les professionnels de santé et le patient) un dialogue automatisé par SMS entre notre centre de soins et le patient de chirurgie ambulatoire. Nous avons défini un protocole de suivi en indiquant les questions que l'on veut poser au patient ambulatoire, les dates et les heures d'envoi ainsi que les réponses attendues. Toute réponse non attendue, ou toute non-réponse déclenchera une alerte chez le patient et le professionnel de santé. Le dialogue automatisé consistera donc à suivre un algorithme défini par le médecin. Le système Memoquest va : Envoyer des SMS au patient aux dates et heures convenues Recueillir les réponses Activer les questions suivantes ou les alertes en fonction des réponses Avant de mettre en place ce système d'appel J-1 automatisé nous avons mené une étude visant à comparer le rappel des consignes préopératoires par SMS avec l'appel individuel réalisé par un soignant, sur une hypothèse de non-infériorité . Par rapport à l'appel téléphonique, l'utilisation de SMS à J-1 en chirurgie ambulatoire améliore le respect des consignes préopératoires (CPO) et cette modalité de rappel des CPO a satisfait la majorité des patients. (Tableau 1) 4) Prise en charge du patient après l'intervention (J0) Les instructions sont dispensées au patient après la phase de récupération post anesthésique de façon à s'assurer que ces consignes sont bien comprises. Cette communication se fera lors de la visite de sortie par le chirurgien et l'anesthésiste. Cette communication orale des consignes de sortie sera renforcée par une communication d'un certain nombre de documents mis à la disposition du patient dans son passeport ambulatoire. Le respect de l'article D 6124-304 du code de la santé publique doit être absolue. Ces dispositions prévoient que le patient soit en possession d'un bulletin de sortie mentionnant notamment des recommandations sur les conduites à tenir en matière de surveillance post-opératoire et les coordonnées de l'établissement de santé assurant la permanence et la continuité des soins. Figureront donc dans son passeport ambulatoire une : Une communication avec un éventuel médecin (CRH / CRO) Une communication à l'aide d'une fiche de liaison pour des soins infirmiers Une communication des documents relatifs à l'éducation du patient 4 Une communication des informations relatives à la continuité des soins et à l'accessibilité de structures adéquates en cas de besoin (permanence téléphonique dans un service hospitalier de référence) 5) Suivi immédiat après la sortie (J 1) La continuité des soins après chirurgie implique un suivi du patient à domicile notamment en ce qui concerne les premières 24h postopératoires (9). Ce suivi est généralement assuré par un appel téléphonique à domicile et vise à s'enquérir du respect des consignes de sortie, de l'efficacité des traitements de sortie, de l'absence de complications liées à la chirurgie et à l'anesthésie (saignement, douleurs, nausées/vomissements) et du degré de satisfaction du patient quant à sa prise en charge. Cet appel est en principe fait par une infirmière. Comme pour l'appel J-1 le temps qui y est consacré est très important et ne fait l'objet d'une réponse par le patient que dans environ 50% des cas. Lorsque le volume de patients traités quotidiennement devient important, il est quasi impossible d'être exhaustif. Il devient alors nécessaire d'être sélectif sur le type de patient et/ou de pathologie qui nécessite un appel téléphonique, et de développer un système d'appel automatisé à J 1. Dans cet esprit nous avons mis en place à St Antoine, avec la même société, un système d'appel automatisé de certains patients à J 1. Pour l'instant nous avons limité cet appel à certaines chirurgies de la main (canal carpien, kystes, doigt à ressaut, Dupuytren non compliqué, plaies simples, AMO) et du pied, à la stomatologie et à certaines chirurgies générales (lipome, examen anal) (Annexe 1). Cet appel automatisé à J 1 est en cours d'évaluation. Cet appel du lendemain automatisé permet aussi de récupérer le maximum de questionnaires de satisfaction. Une étude australienne a montré qu'une enquête de satisfaction envoyée par SMS et internet avait un taux de réponse de 69%, largement supérieur au taux de réponse obtenu par appel téléphonique (10). Le suivi du patient en postopératoire peut parfois être étendu sur plusieurs jours notamment dans le cadre du suivi de cathéters périnerveux mais aussi possiblement pour un suivi de drains, redons, ou sonde urinaire à domicile. Dans notre centre nous travaillons avec un prestataire extérieur pour le suivi à domicile par des infirmières libérales des patients bénéficiant de cathéters périnerveux. Le patient sort de l'unité avec un dossier de suivi de son cathéter, la société ayant pris contact avec lui dans les jours précédents l'intervention. Le patient à domicile peut aussi bénéficier pour son suivi médical ou chirurgical de la télémédecine. La télémédecine est réglementée en France depuis 2009 (article L. 6316-1 du Code de la santé publique). Dans le cadre de la chirurgie ambulatoire cette approche médicale via les nouvelles technologies peut permettre d'effectuer une surveillance de l'état du patient comme par exemple un suivi du site chirurgical, d'un bloc nerveux continu ou de paramètres vitaux comme le suivi du pouls et de la température (fuite anastomotique) (11) (12). Des systèmes d'auto-surveillance à domicile après intervention via un appareil mobile (smartphone ou tablette) et sur internet existent. Plusieurs sociétés proposent une solution informatique de suivi 5 des patients à domicile avant ou après chirurgie ou médecine ambulatoire. Parmi celles-ci il y a les systèmes AMBUCARE ou SOVINTY implémentés par des collègues libéraux. Conclusion Communiquer avec le patient à toutes les étapes de sa prise en charge en chirurgie ambulatoire est donc d'une très grande importance pour minimiser les risques associés à ce mode de prise en charge. Lors de la journée ambulatoire de l'AFCA en 2011, Christian Saout, Président du Collectif Inter associatif Sur la Santé (CISS), nous a donné le point de vue des usagers sur la chirurgie ambulatoire en insistant sur la nécessité d'une information du patient plus claire et plus exhaustive. Bibliographie IAAS. Chirurgie ambulatoire. Recommandations sur le suivi d'indicateurs cliniques de qualité. HAS. Ensemble pour le développement de la Chirurgie Ambulatoire. Recommandations organisationnelles 06/recommandations vd. pdf 2013. Beaussier M, Marchand-Maillet F, Dufeu N, Sciard D. Organizational aspects to optimize patient's ambulatory pathway. Curr Opin Anaesthesiol 2015 ; 28 : 636-41. Pratap JN, Varughese AM, Mercurio P, Lynch T, Lonnemann T, Ellis A, Rugg J, Stone WR, Bedinghaus C. Reducing Cancelations on the Day of Scheduled Surgery at a Children's Hospital. Pediatrics. 2015 ; 135(5) : 1292-9 Kain ZN, Fortier MA, Chorney JM, Mayes L. Web-based tailored intervention for preparation of parents and children for outpatient surgery (WebTIPS) : development. Anesth Analg. 2015 ; 120(4) : 905-14. Fortier MA, Bunzli E, Walthall J, Olshansky E, Saadat H, Santistevan R, Mayes L, Kain ZN. Web-based tailored intervention for preparation of parents and children for outpatient surgery (WebTIPS) : formative evaluation and randomized controlled trial. Anesth Analg. 2015 ; 120(4) : 915-22 Belavy D. A mobile telephone-based SMS and internet survey system for self-assessment in Australian anaesthesia : experience of a single practitioner. Anaesth Intensive Care. 2014 ; 42(6) : 771-6 Deng X, Wang Y, Zhu T, Zhang W, Yin Y, Ye L. Short message service (SMS) can enhance compliance and reduce cancellations in a sedation gastrointestinal endoscopy center : a prospective randomized controlled trial. J Med Syst. 2015 ; 39(1) : 169. La diffusion des technologies de L'information et de La communication dans La société française (2013). N 297 novembre 2013 6 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. Beaussier M, Vons C. [Post-hospital home care after ambulatory surgery]. Presse Med 2013 ; 43 : 305-8 Rebibo L1, Blot C1, Verhaeghe P1, Cosse C1, Dhahri A1, Regimbeau JM2. Effect of perioperative management on short-term outcomes after sleeve gastrectomy : a 600-patient single-center cohort study. Surg Obes Relat Dis. 2014 ; 10(5) : 853-8. Rebibo L1, Dhahri A1, Badaoui R2, Dupont H2, Regimbeau JM3. Laparoscopic sleeve gastrectomy as day-case surgery (without overnight hospitalization). Surg Obes Relat Dis. 2015 ; 11(2) : 335-42. 7 Tableau 1 8 Graphique 1 Utilisation des NTIC en fonction de l'âge (Source Credoc Juin 2012) 120 100 80 60 40 20 0 12-17 18-24 25-39 40-59 60-69 70 Téléphonie fixe Téléphone mobile Smartphone Envoi de sms Internet Graphique n 2 Annexe 1 Automatisation de l'appel J 1 en chirurgie ambulatoire Après chirurgie ambulatoire, il est recommandé de prévoir un contact le lendemain de l'intervention afin de s'assurer du bon déroulement des suites opératoires. Si vous en êtes d'accord, nous vous proposons de réaliser ce contact par SMS automatisé. Voici les messages que vous allez recevoir. Nous vous demandons de les lire attentivement et d'y répondre tel qu'indiqué dans le message. 1ère question : Avez-vous actuellement une douleur non calmée par les médicaments ? Répondez simplement un chiffre de 0 à 10 (0 pas de douleur du tout 10 douleur insupportable) 2ème question : Avez-vous eu des nausées-vomissements, des saignements ou des vertiges importants, un trouble du sommeil anormal ? Répondez simplement Oui si vous avez eu l'un de ces symptômes 3ème question : - Si vous avez été opéré de la main : Si vos doigts sont gonflés ou que vous avez l'impression que le pansement est trop serré : Gardez la main levée, bougez les doigts, desserrez un peu le pansement. Si les symptômes persistent dans 48h ou pour tout autre problème ou question appelez-nous au 01 71 97 01 74 du lundi au vendredi de 8h à 17h - Pour les autres interventions : Pour tout problème ou question appelez-nous au 01 71 97 01 74 du lundi au vendredi de 8h à 17h 4eme question : Avez-vous été satisfait de votre prise en charge dans l'unité de chirurgie ambulatoire ? Répondez simplement un chiffre de 0 à 10 (0 pas du tout satisfait 10 très satisfait) 1 Information des patients bénéficiant de l'automatisation par SMS de l'appel du lendemain de l'intervention Protocole J 1 Hôpital Saint-Antoine Main Heure Question 10h Avez-vous actuellement une douleur non calmée par les médicaments ? Répondez simplement un chiffre de 0 à 10 (0 pas de douleur du tout 10 douleur insupportable) Avez-vous eu des nausées-vomissements, des saignements ou des vertiges importants, un trouble du sommeil anormal ? Répondez simplement Oui si vous avez eu l'un de ces symptômes Si vos doigts sont gonflés ou que vous avez l'impression que le pansement est trop serré : Gardez la main levée, bougez les doigts, desserrez un peu le pansement. Si les symptômes persistent dans 48h ou pour tout autre problème ou question appelez-nous au 01 71 97 01 74 du lundi au vendredi de 8h à 17h Avez-vous été satisfait de votre prise en charge dans l'unité de chirurgie ambulatoire ? Répondez simplement un chiffre de 0 à 10 (0 pas du tout satisfait 10 très satisfait) Avez-vous actuellement une douleur non calmée par les médicaments ? Répondez simplement un chiffre de 0 à 10 (0 pas de douleur du tout 10 douleur insupportable) Avez-vous eu des nausées-vomissements, des saignements ou des vertiges importants, un trouble du sommeil anormal ? Répondez simplement Oui si vous avez eu l'un de ces symptômes Pour tout problème ou question appelez-nous au 01 71 97 01 74 du lundi au vendredi de 8h à 17h Avez-vous été satisfait de votre prise en charge dans l'unité de chirurgie ambulatoire ? Répondez simplement un chiffre de 0 à 10 (0 pas du tout satisfait 10 très satisfait) Conditions d'alerte >3 Oui Aucune réponse à 14h Alerte >3 Oui Aucune réponse à 14h 10h 10h 14h 10h 10h 14h Général Heure Question 10h Calmedica SAS au capital de 20 000 euros, 793 727 785 R. C. S. Paris, Siège social : 24 rue du Faubourg Saint Jacques 75014 Paris, TVA intracommunautaire FR 27 793 643 917 | HAL | Scientific |
Des effets indésirables sont parfois observés dont : éternuements, toux et écoulements oculaires ou nasaux légers et passagers. | EMEA_V3 | Medicinal |
Augmentation des concentrations plasmatiques de l'acide fusidique et du ritonavir. | EMEA_V3 | Medicinal |
Facteurs déterminant l'apparition de l'hypertension intraoculaire dans les uvéites | WMT16 | Scientific |
Il s' agit également de patients dont la carence d' anticorps est due à un cancer du sang (myélome ou leucémie lymphoïde chronique) ou d' enfants nés avec le syndrome d' immunodéficience acquise (SIDA), atteints d' infections fréquentes. | EMEA_V3 | Medicinal |
Le traitement des otites moyennes du nourrisson et de l'enfant en bas âge facteur important de la prophylaxie de la surdité | WMT16 | Scientific |
Syndromes extra-urologiques et urographie I. V | WMT16 | Scientific |
Correction d'un prognathisme mandibulaire chez deux soeurs jumelles | WMT16 | Scientific |
Le training autogène dans les maladies et les dysfonctions cardiovasculaires | WMT16 | Scientific |
Athérome et antagonistes calciques | WMT16 | Scientific |
Manifestations neurologiques transitoires révélatrices d'hématomes épiduraux cervicaux aigus spontanés | WMT16 | Scientific |
Voyage et prévention paludique en 2007 | WMT16 | Scientific |
Les mycoses systémiques tropicales | WMT16 | Scientific |
Les résultats d' efficacité sont rapportés dans le tableau 4. | EMEA_V3 | Medicinal |
Germectomie des dents de sagesse. L'anesthésie | WMT16 | Scientific |
[Cancer and HIV infection. ] Emilie Lanoy, Marguerite Guiguet To cite this version : Emilie Lanoy, Marguerite Guiguet. 2010, 26 (4), pp. 423-6. inserm-00480502 [Cancer and HIV infection. ]. médecine/sciences, EDP Sciences, HAL Id : inserm-00480502 Submitted on 1 Oct 2010 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Cancer et infection à VIH Cancer and HIV infection Emilie Lanoy, Marguerite Guiguet INSERM & UPMC Université Paris 6 UMR-S-943 56 Bd Vincent Auriol BP 335 75625 Paris Cedex 13 Email : elanoy@ccde. chups. jussieu. fr ; mguiguet@ccde. chups. jussieu. fr Trois cancers - maladie de Kaposi, lymphomes malins non hodgkiniens et le cancer du col utérin, sont très vite apparus comme ayant une incidence élévée chez les personnes infectées par le VIH (PVVIH) et font partie des événements classant le passage de l'infection à VIH dans le stade SIDA. Après 1996, avec l'arrivée des nouvelles combinaisons antirétrovirales (cART), l'incidence de ces cancers classant SIDA a fortement diminué même si elle reste bien supérieure à celle de la population générale. L'analyse de l'évolution temporelle entre 1992 et 2003 des taux d'incidences montrait, chez les PVVIH, une diminution significative des sarcomes de Kaposi et des lymphomes malins non hodgkiniens et une augmentation significative des lymphomes de Hodgkin et des cancers du canal anal [1]. L'incidence des cancers ne définissant pas le SIDA est désormais plus élevée que l'incidence des cancers classant SIDA (Figure 1). L'analyse de 18 études comparant l'incidence de cancers ne définissant pas le SIDA chez les PVVIH et dans la population générale a montré que, globalement, le risque était deux fois plus élevé chez les PVVIH [2]. Dix ans après l'introduction des cART, la pathologie tumorale était associée à un tiers des décès survenus en France chez les PVVIH dont la majorité était des cancers ne définissant pas le SIDA. [3]. L'allongement de la durée de survie des PVVIH à l'ère des cART a coïncidé avec une augmentation de l'incidence des cancers ne définissant pas le SIDA dans cette population exposée plus fréquemment que la population générale aux carcinogènes tels le tabac et aux infections virales. Une méta-analyse a estimé l'augmentation d'incidence par type de cancer chez les PVVIH et chez des transplantés d'organes comparativement à la population générale [4]. Alors que les facteurs de risque environnementaux sont différents entre les deux groupes, le rôle de l'immunodépression apparat probable pour un grand nombre de cancers au vu de la similarité de l'augmentation du risque observée chez les PVVIH et chez les transplantés d'organes. Une étude menée dans la cohorte FHDH-ANRS CO4 sur la période 1998-2006, au cours de laquelle les thérapies antirétrovirales étaient largement disponibles, a étudié le risque de 7 cancers classant ou non classant SIDA sarcome de Kaposi, lymphome non hodgkinien et lymphome de Hodgkin, cancer pulmonaire, hépatocarcinome, cancer du col utérin et cancer du canal anal, en fonction de l'immunodépression, de la réplication virale du VIH, et du traitement antirétroviral [5]. A l'exception du cancer du canal anal, l'augmentation du risque de cancers était associée à la baisse du nombre de lymphocytes CD4, et cette augmentation était observée dès un niveau modéré d'immunodépression caractérisé par un nombre de lymphocytes CD4 compris entre 350 et 500/mm3 y compris pour les cancers ne définissant pas le SIDA (Table 1). Le risque de cancer du canal anal était augmenté avec la durée passée avec une forte immunodépression (CD4 et une forte réplication virale. L'ensemble de ces observations semble indiquer que le processus de vieillissement qui contribue aux comorbidités hors SIDA, dont les cancers, pourrait être accéléré chez les PVVIH, y compris lorsque la réplication virale du VIH apparat contrôlée par le traitement antirétroviral, conséquence de la persistance de phénomènes d'activation et d'inflammation. Parmi les virus facteurs de risque connus de cancer, le virus de l'herpès humain HHV-8 est retrouvé dans les sarcomes de Kaposi, le virus d'Epstein-Barr dans les lymphomes en particulier dans les lymphomes non-hodgkiniens, et le papillomavirus humain dans le cancer invasif du col utérin, ces trois types de cancer étant les premiers cancers qui ont été associés à l'infection à VIH. Plus généralement, les cancers dont le risque est augmenté avec l'immunodépression sont le plus souvent associés à une infection virale et une revue récente synthétise la variabilité des processus d'oncogénèse en cause [6]. Dans le contexte de l'infection à VIH, certains virus pourraient avoir un effet oncogène directement ou via un processus de facilitation, l'immunodépression limitant la capacité de l'hôte de contrôler précocement l'expansion tumorale ou la réplication virale. L'apparition des combinaisons de traitements antirétroviraux s'est accompagnée d'une diminution du risque pour les cancers classant SIDA mais pas pour les cancers ne définissant pas le SIDA [7]. Devant cette apparente contradiction, l'hypothèse d'une toxicité de certaines molécules antirétrovirales a été posée, mais les résultats des différentes études rapportant les associations entre une classe thérapeutique particulière et le risque de cancers ne définissant pas le SIDA sont contradictoires [8]. L'étude de l'impact des molécules antirétrovirales sur le risque de cancers est compliquée par le fait que certaines molécules ont des effets néoplasiques, d'autres pourraient interagir avec des carcinogènes comme par exemple le tabac. L' utilisation de données issues de cohortes observationnelles pour répondre à cette question de l'impact du traitement antirétroviral en tant que facteur de risque de cancer est difficile en présence de facteurs de confusion dont ceux liés à l'immunodépression car ces facteurs président au choix du traitement mais sont également associés à la survenue de cancer, des méthodologies adaptées doivent être appliquées [9]. Même si la diversité des types tumoraux entraine une variabilité des taux de survie, il apparat que les taux de survie après un diagnostic de cancer sont significativement plus faibles chez les PVVIH que dans la population générale posant la question de la sévérité de leur présentation, et aussi celle de leur prise en charge [10]. Les recommandations préconisent d'associer prise en charge de l'infection à VIH par thérapie antiretrovirale et chimiothérapie anti-tumorale ce qui nécessite de tenir compte des interactions médicamenteuses et des pharmaco-cinétiques des deux traitements pour établir des protocoles adaptés. Dans le contexte de l'amélioration de l'espérance de vie des PVVIH et donc de leur vieillissement, la prévention des cancers dans cette population est également posée même si la multiplicité des mécanismes potentiels et leurs interactions rend cette prévention particulièrement complexe. Au vu du rôle joué par l'immunodépression dans la survenue des cancers chez les PVVIH, l'essai thérapeutique START qui compare deux stratégies thérapeutiques d'initiation à un seuil de CD4 supérieur à 500/mm3 ou supérieur à 350/mm3 a retenu un critère de jugement principal de morbi-mortalité incluant la survenue de cancers, dont les cancers ne définissant pas le SIDA. L'hypothèse de cet essai est que l'éventuelle augmentation du risque de morbi-mortalité de maladies hors-SIDA associée au traitement antirétroviral serait largement contrebalancée par un risque réduit du à la suppression de la réplication virale du VIH, d'un nombre plus élevé de CD4 ou d'autres effets bénéfiques du traitement antirétroviral. Par ailleurs le bénéfice d'interventions, comme l'aide à l'arrêt du tabac ou la prise en charge des co-infections par les virus des hépatites, doivent faire l'objet d'évaluations chez les PVVIH et parallèlement, pour les cancers pouvant faire l'objet d'un dépistage précoce comme le cancer du canal anal, des études doivent être menées pour estimer l'utilité de campagnes de dépistage systématiques dans cette population. Références 1. Patel P, Hanson DL, Sullivan PS, et al. Incidence of types of cancer among HIV-infected persons compared with the general population in the United States, 1992-2003. Ann Intern Med 2008 ; 148 : 728-736 2. Shiels MS, Cole SR, Kirk GD, Poole C. A meta-analysis of the incidence of non-AIDS cancers in HIV-infected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr 2009 ; 52 : 611-622 3. Bonnet F, Burty C, Lewden C, et al. Changes in cancer mortality among HIV-infected patients : the Mortalité 2005 survey. Clin Infect Dis 2009 ; 48 : 633-639 4. Grulich AE, van Leeuwen MT, Falster MO, Vajdic CM. Incidence of cancers in people with HIV/AIDS compared with immunosuppressed transplant patient recipients : a meta-analysis. Lancet 2007 ; 370 : 59-67 5. Guiguet M, Boué F, Cadranel J, et al. Effect of immunodeficiency, HIV viral load, and antiretroviral therapy on the risk of individual malignancies (FHDH-ANRS CO4) : a prospective study. Lancet oncol. 2009 ; 10 : 1152-1159. 6. Schulz T. Cancer and viral infections in immunocompromised individuals Int J Cancer 2009 ; 125 : 1755-1763 7. Crum-Cianflone N, Hullsiek KH, Marconi V, et al. Trends in the incidence of cancer among HIV infected persons and the impact of antiretroviral therapy : a 20-year cohort study. AIDS 2009 ; 23 : 41-50 8. Silverberg MJ, Abrams DI. Do antiretroviral reduce the risk of non-AIDS defining malignancies. Curr Opin HIV AIDS 2009 ; 4(1) : 42-51 9. HIV-Causal Collaboration. The effect of combined antiretroviral therapy on the overall mortality of HIV infected individuals. AIDS 2010 ; 24 : 123-137 10. Spano JP, Costagliola D, Katlama C, et al. AIDS-related malignancies : state of the art and therapeutic challenges. J Clin Oncol 2008 ; 26 : 4834-4842 Figure 1 : Evolution de l'incidence des cancers classant SIDA (sarcome de Kaposi, lymphomes non hodgkiniens), et des cancers ne définissant pas le SIDA entre 1994 et 2008 dans la base de données hospitalière française sur l'infection à VIH (cohorte FHDH-ANRS CO4). Table 1 : Analyse multivariée des facteurs de risque de trois cancers ne définissant pas le SIDA (149 lymphomes de Hodgkin, 207 cancers pulmonaires, 119 hépatocarcinomes) (5) Hépatocarcinome Lymphome de pulmonaire Hodgkin Cancer p Modèle 1 RR (IC 95%) 1. 0 2. 0 (0. 9-4. 5) 4. 1 (2. 0-8. 2) 7. 3 (3. 5-15. 3) 6. 6 (2. 4-17. 6) 7. 6 (2. 7-20. 8) p p Modèle 2 RR (IC 95%) 1. 0 1. 6 (0. 7-3. 9) 4. 1 (1. 9-8. 7) 5. 9 (2. 6-13. 3) 5. 0 (1. 6-15. 7) 4. 3 (1. 1-15. 8) 1. 0 1. 0 2. 4 (0. 3-18. 2) 6. 6 (0. 9-48. 9) 15. 6 (2. 0-119. 3) 26. 6 (3. 3-212. 8) 0. 8 (0. 5-1. 5) 3. 8 (2. 1-6. 7) 1. 0 0. 2 (0. 1-0. 5) 1. 8 (0. 9-3. 6) 1. 5 (0. 2-11. 8) 4. 3 (0. 6-31. 6) 14. 7 (1. 9-112) 25. 2 (3. 1-203) 1. 0 (0. 5-2. 0) 1. 4 (0. 7-2. 9) 1. 0 0. 2 (0. 1-0. 7) 2. 0 (0. 9-4. 0) . 14 14. 4 (7. 1-29. 0) . 14 . 005 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0 . 16 p RR (IC 95%) RR (IC 95%) 1. 5 (0. 7-3. 0) 1. 0 (0. 4-2. 1) 0. 7 (0. 3-1. 9) 1. 2 (0. 4-3. 4) 2. 2 (1. 3-3. 6) 3. 4 (2. 1-5. 5) 4. 8 (2. 8-8. 0) 4. 9 (2. 3-10. 2) 8. 5 (4. 3-16. 7) 1. 2 (0. 7-2. 2) 2. 2 (1. 3-3. 8) 4. 8 (2. 8-8. 3) 7. 7 (3. 9-15. 2) 5. 4 (2. 4-12. 1) Dernier taux de CD4 cellules/mm3 >500 350-499 200-349 100-199 50-99 0-49 Age, années 30-40 40-50 50-60 >60 Sexe et mode d'exposition au VIH Lieu de séjour hors de France : Afrique subsaharienne Coinfection par les virus des hépatites RR : risque relatif, IC : intervalle de confiance. Estimations par modèle de Poisson. Homosexuel Injection de drogue Autre - homme Autre - femme 1. 0 (0. 7-1. 6) 0. 8 (0. 5-1. 3) 0. 7 (0. 5-1. 1) 1. 6 (1. 1-2. 5) 2. 1 (0. 5-8. 7) 7. 0 (1. 7-28. 2) 14. 1 (3. 4-57. 7) 28. 4 (6. 9-118. 0) 0. 7 (0. 3-1. 4) 0. 2 (0. 1-0. 4) 0. 3 (0. 2-0. 6) 0. 4 (0. 2-0. 9) 1. 0 1. 0 . 26 | HAL | Scientific |
INFLUENCE DE L'INFECTION PAR BRUCELLA ABORTUS SUR L'HYPERSENSIBILITÉ ET L'HYPERRÉACTIVITÉ DE LA SOURIS AUX ENDOTOXINES DE BRUCELLA MELITENSIS, YERSINIA ENTEROCOLITICA ET ESCHERICHIA COLI Régis Diaz, Nicole Bosseray To cite this version : Régis Diaz, Nicole Bosseray. INFLUENCE DE L'INFECTION PAR BRUCELLA ABORTUS SUR L'HYPERSENSIBILITÉ ET L'HYPERRÉACTIVITÉ DE LA SOURIS AUX ENDOTOXINES DE BRUCELLA MELITENSIS, YERSINIA ENTEROCOLITICA ET ESCHERICHIA COLI. Annales de Recherches Vétérinaires, INRA Editions, 1974, 5 (1), pp. 41-56. hal-00900789 HAL Id : hal-00900789 Submitted on 1 Jan 1974 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. INFLUENCE DE L'INFECTION PAR BRUCELLA ABORTUS SUR L'HYPERSENSIBILITÉ ET L'HYPERRÉACTIVITÉ DE LA SOURIS AUX ENDOTOXINES DE BRUCELLA MELITENSIS, YERSINIA ENTEROCOLITICA ET ESCHERICHIA COLI R. DIAZ Nicole BOSSERAY Station de Pathologie de la Reproduction, Gentve de Recherches de Tours, I. N. R. A. , Nouzilly B. P. 1, 3i380 Monnaie RÉSUMÉ On a suivi sur des souris infectées par Brucella abortus 5 l'évolution de : 10 l'hypersensibilité cutanée à l'injection d'endotoxine de Brucella (fraction 5, préparée selon la technique de REDFEARN, traitée à la pronase) ; 20 des agglutinines et des précipitines contre l'endotoxine de Bvucella ; 30 l'hyperréactivité, mesurée par la baisse de la DL50' aux endotoxines de Brucella (REDFEARN), de Eschevichia coli (WESPHAL), de Y. enterocolitica types 8 et 9, ceci en raison des relations antigéniques entre Brucella et Yevsinia entevocolitica type 9. L'hypersensibilité à l'endotoxine de Brucella, mise en évidence par le test cutané plantaire, apparat après 2 semaines d'infection et augmente ensuite. Cette réaction de type immédiat est maximale heures après l'injection d'endotoxine ; elle se développe parallèlement aux anticorps agglutinants et précipitants. L'infection provoque une hyperréactivité non spécifique, momentanée, aux endotoxines. La DL. , de l'endotoxine de Brucella est de 29 ! , g après i semaine, 76 après 2 semaines et 220 après semaines, contre 220-282 (ig pour les témoins. Il n'y a pas de corrélation entre le développement de l'hypersensibilité et de l'hyperréactivité. Après 8 semaines d'infection, les souris recevant l'endotoxine de Brucella par voie veineuse meurent en moins d'une heure d'un choc anaphylactique. Un choc identique est obtenu sur les souris infectées depuis 8 semaines par injection d'endotoxine de Y. entevocolitica type 9, mais non avec les endotoxines de Y. enterocolitica type 8 et E. coli. Le même effet est obtenu par injec- tion préparante de sérum bovin anti-Brucella à des souris saines, 3 heures avant l'inoculation de l'endotoxine. En conclusion, l'endotoxine de Brucella injectée par voie veineuse agit par au moins trois mécanismes : une toxicité directe sur l'animal non infecté ; une hyperréactivité non spécifique résultant de l'infection ; une hypersensibilité de type immédiat due à la réaction antigène-anti- corps. (1) Adresse actuelle : Departamento de Microbiologia, Facultad de medecina, Universitad de Navarra, Pamplona, (Espana). INTRODUCTION Le mode d'action des endotoxines n'est pas actuellement connu avec précision. Les propriétés biologiques des endotoxines peuvent résulter d'une action directe sur les cellules de l'hôte, ou d'une réaction d'hypersensibilité immédiate ou retardée (CHÉDID et PARANT, 1971). BERRY et SMYTHE (1961), CARPENTTR, FUKUDA et HEISKELL (1962), KESSEL, BRAUN et PLÈSCIA (1966), FR ! DMAN et al. (1968), pour démontrer que l'activité biologique attribuée aux endotoxines est dépendante d'un état d'hypersensibilité de nature immunologique, proposent l'endotoxine de Brucella comme modèle. Ils emploient une endotoxine commerciale préparée par le laboratoire Difco selon la méthode de BOIVIN et MESROBEANU (I935), à partir d'une souche de Brucella aboytus. Cet antigène n'est actif que sur les animaux sensibilisés, avec une DL. sur souris supérieure à 10 mg (BERRY et SMYTHE, Ig6I ; FR ! DMAN et al. , Ig68). Par contre, pour AB1 ! RNATHY, BRADLEY et SPINK (Ig58), BAKER et WILSON (1965 a), et VERSHI- I, OVA, CHERNYSHEVA et DRANOVSKAYA (Ig7I), une endotoxine de Brucella extraite par la méthode de BOIVIN et MESROBEANU (1935) a une DLso comprise entre 500 et 770 ! . g. Les différences de toxicité obtenues par ces deux groupes d'auteurs sont si manifestes qu'elles suggèrent que l'endotoxine Difco n'est pas suffisamment purifiée. Aucun des auteurs ayant travaillé avec l'antigène Difco n'a étudié l'influence d'une sensibilisation préalable avec des Brucella, ou avec de l'endotoxine, sur la DL ! . LEONG et al. (1970) en extrayant l'endotoxine de Brucella selon la méthode de W ! SPHAI&dquo ; I, UD ! RITZ et BISTER (1952) modifiée par REDFEARN (1960) obtiennent un produit dont la DL50 sur souris est de 250 yg, valeur comparable à celles obtenues avec les endotoxines des Entérobactéries. Ces résultats contradictoires nous ont conduits à étudier : i Sur des souris infectées par Brucella abortus, le développement de l'hyper- sensibilité contre l'endotoxine de Brucella melitensis 16 M, mis en évidence par le test cutané. 2 L'influence de l'état d'hypersensibilité sur l'action létale de l'endotoxine de Brucella melitensis 16 M. Si les activités biologiques attribuées à l'endotoxine de Brucella sont fonction de l'hypersensibilité, une augmentation de celle-ci doit entra- ner une augmentation de la sensibilité (ou hyperréactivité) de la souris à l'action létale de l'endotoxine ('). On a vérifié à cette occcasion que l'action létale sur la souris normale de l'endotoxine de Brucella donne des résultats reproductibles confirmant ceux de I, ! ONG et al. (Ig7o). 3 L'action létale de différentes endotoxines sur des souris infectées par Brucella pour analyser la spécificité du phénomène d'hyperréactivité. Nous avons choisi l'endotoxine de Yersinia enterocolitica type 9 en raison des relations antigéniques entre cette souche et Brucella (AHVONEN, JANSSON et AHO, 1969), et les endotoxines de Y. enterocolitica type 8 et de Escherichia coli, en raison de l'absence de relations antigéniques avec Brucella. Nous employons dans ce travail le terme hyperréactivité dans le sens n augmentation de la sensibilité , mesurée par la baisse de la DLso. C'est aussi dans ce sens qu'il est employé par SUTER dans le traité classique sur les endotoxines, édité par LANDY et BRAUN (ig6ç). MATÉRIEL ET MÉTHODES I. - Protocole expérimental Développement de l'hypevsensibilité cutanée au cours de l'infection pav Brucella. Des souris femelles pesant 21 ! i g (souche CD i : Charles River) ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec 3, 6 X io5 Brucella abortus souche 544 puis réparties en 4 lots de 10 ou 15 ani- maux. Après respectivement 1, z, 4 ou 8 semaines d'infection, des groupes de 5 souris reçoivent dans le coussinet plantaire d'une patte postérieure o, i, i ou 10 yg d'endotoxine de Brucella meli- tensis 16 M en solution saline apyrogène (tabl. i). On mesure l'épaississement de la patte, 4, 12, 24 et 48 heures après l'injection, comparativement à la patte symétrique, qui a reçu le même volume (0, 05 ml) de solution saline apyrogène, avec un palpeur Quick Test précis à 0, 05 mm. Après la dernière mesure, les souris sont sacrifiées par anesthésie à l'éther puis on effectue les prélève- ments de sang. La rate est prélevée aseptiquement pour un dénombrement des Brucella. Mise en évidence de l'hypevvéactivité aux différentes endotoxines. L'hyperréactivité est mesurée par l'évolution de la DLSO aux différentes endotoxines sur la souris infectée. Pour chaque dose, un lot de 6 souris inoculées, par voie intrapéritonéale, avec 4 X io5 B. abortus 544 depuis 1, z, 4 ou 8 semaines a été utilisé pour déterminer la DLbo aux endo- toxines de Brucella meliténsis 16 M, Yevsinia entevocolitica type 8 et type 9 et de Escherichia coli. Quatre doses au moins des différentes endotoxines diluées de 1/2 en 1/2 en solution saline apyro- gène sont injectées par voie veineuse. Après l'injection, les souris sont observées ; on note le nombre de morts et le moment de la mort. Observation des réactions anaphylactiques sur les souris infectées. Des lots de 20 souris, inoculées comme précédemment depuis 8 semaines, reçoivent par voie veineuse 800 yg des différentes endotoxines, et sont observées pendant 48 heures. On enregistre le moment du décès et les symptômes de l'agonie. Transmission passive de l'anaphylaxie immédiate. Des lots de 15 ou 20 souris ont reçu par voie intrapéritonéale 0, 1 ml d'un sérum de vaches infectées par B. abovtus 544 ! Ce sérum a un titre agglutinant de y64o et contient de nombreuses précipitines contre l'endotoxine de Brucella (DIAZ et LEmEUx, 1972). Trois heures plus tard, les souris reçoivent 800 yg des différentes endotoxines par voie veineuse. On observe le moment de la mort et les symptômes la précédant. 2. - Extraction des endotoxines et pvéavatïon des solutions inoculées Les endotoxines de B. melitensis 16 M et de Y. entevocolitica type 9 (souche My 79 fournie par le D ! AHVONEN, Helsinki, Finlande) sont extraites de la phase phénol selon la technique de REDFEARN (1960) et correspondent à la Fraction 5. Cette extraction est suivie, pour l'endotoxine de Brucella, d'un traitement à la pronase selon la méthode employée par LEONG et al. (1970). BAKER et WiLSOr1 (1965 b), DIAZ et al. (1970), HURVELL (1973 a), et LEONC et al. (1970) ont publié une description détaillée de cette méthode et des propriétés biologiques des deux endotoxines. L'endotoxine de Y. entevocolitiéa type 8, souche Py 636 du Dr AHVONFN, est extraite par la méthode de WESPHAL, LUDERITZ et BISTER (1952) à partir de la phase aqueuse (DiAz, résultats non publiés). L'endotoxine de E. coli o III 1 B4, extraite par la méthode de WESPHAL à partir de parois cellu- laires, nous a été aimablement fournie par le Dr RIBI (Hamilton, Montana). Toutes les dilutions d'endotoxine nécessaires à nos expériences ont été préparées le même jour. Elles sont fractionnées puis congelées. L'inoculation des souris est faite par voie intraveineuse avec o, 2 ml de produit décongelé une seule fois. 3. - Étude sérologique et évaluation du nombre de Brucella pav vate La sérologie est étudiée par microagglutination selon la technique de RENOUX, Pr. oMMEx et PHILIPPON (1971) et par agglutination de l'antigène au Rose Bengale (BxiNLEY-MoxcnN et al. 1969). La recherche des précipitines contre l'endotoxine de B. melitensis 16 M par la technique de OUCHTERLONY (1949) est effectuée sur des dilutions au 1/2 successives des pools des sérums de chaque lot d'animaux. Pour la numération des Brucella, la rate est broyée et diluée au 1/10 par addition de 9 fois son poids de solution saline stérile. On ensemence 0, 2 ml de 3 dilutions successives sur 2 botes de Petri, incubées 5 jours en atmosphère à 10 p. 100 de gaz carbonique. 4. - Calcul de la DL50 Pour déterminer la DL50 et l'intervalle de confiance correspondant à chaque expérience, nous avons utilisé la méthode de TOOTILL, ROBINSON et ADAMS (ig6g). Certains résultats n'étant pas exploitables par cette méthode (réponses non linéaires, ou doses trop éloignées de la valeur de la DLo), nous avons dans ce dernier cas adopté la méthode de REED et MUENCH (1938). xr : a u l. ! ra ! r ! i. - Réactions cutanées du coussinet Plantaire à l'injection d'endotoxine (fraction 5) en fonction de l'ancienneté de l'infection et de la dose d'endotoxine ! e tableau i représente la répartition des lots et les résultats des tests cutanés. Pendant les 12 premières heures nous n'avons pas observé de réaction avec les souris témoins et les souris infectées depuis i semaine. La réaction ne se manifeste qu'après 24 heures, par un léger épaississement de la patte. A partir de la 2 ! semaine d'infection, la réaction d'hypersensibilité se manifeste par de l'oedème, de l'érythème et une augmentation de l'épaisseur de la patte, qui apparaissent 4 heures après l'injection. La réaction diminue progressivement en 48 heures. Les réactions les plus intenses sont observées après 4 et 8 semaines d'infection. Actuellement, nous ne savons pas si la réaction persistant 24 heures après l'in- jection est la suite du processus inflammatoire produit par la réaction cutanée obser- vée au bout de 4 heures, ou si une réaction d'hypersensibilité retardée vient s'ajouter à celle-ci. 2. - Relations entre la réaction ci-dessus, le développement de l'infection et la réponse sérologique Pour connatre la relation existant entre le degré d'infection, les résultats séro- logiques et l'hypersensibilité cutanée développée contre l'endotoxine, chaque lot de souris est sacrifié 48 heures après l'injection. La figure i représente l'évolution du nombre moyen de Brucella par rate, le pourcentage d'épaississement des pattes et le titre moyen d'agglutination. On observe que l'hypersensibilité ne se développe que lorsque le degré d'infection commence à diminuer. Les résultats de l'étude sérologique montrent qu'une semaine après le début de l'infection 14 p. ioo des souris donnent un titre d'agglutination inférieur à y2o et que 40 p. ioo des souris n'agglutinent pas l'antigène au Rose Bengale. A partir de la 2e semaine, toutes les souris deviennent sérologiquement positives. La précipita- tion en gélose effectuée sur des dilutions successives des pools de sérums révèle la présence de précipitines contre l'endotoxine dans les sérums correspondant à 4 et 8 semaines d'infection, dilués au 1/4. Les résultats les plus élevés en agglutination et en réactions cutanées sont obtenus avec les souris infectées depuis 4 semaines. Le titre d'agglutination est de i/5i2 et le pourcentage d'augmentation de l'épaisseur des pattes est légèrement supérieur à 100 p. 100, 4 heures après l'injection de 10 [ig d'endotoxine. Il convenait de vérifier l'influence de l'injection d'endotoxine sur les titres des agglutinines des souris infectées. Pour cela, nous avons comparé les titres moyens obtenus pour chaque lot en fonction de la dose d'endotoxine injectée, puis les titres obtenus sur des souris inoculées non testées avec l'endotoxine. Aucune différence n'a été mise en évidence. 3. - Évolution de la DLso de l'endotoxine de Brucella en fonction de l'ancienneté de l'infection et de la réaction cutanée Si le développement de l'hypersensibilité a une influence sur l'action létale des endotoxines, elle doit se manifester au moment o l'hypersensibilité, telle qu'elle est mesurée par le test cutané, est la plus importante, c'est-à-dire 4 à 8 semaines après l'infection. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons calculé la DLso de l'endotoxine de Brucella à différents moments, par rapport à l'inoculation. La DLse sur souris normales est de 220 yg au début de l'expérience ; elle augmente légèrement entre 2 et 8 semaines corrélativement avec l'augmentation du poids des souris (tabl. 2). Les résultats obtenus avec les souris infectées sont très différents. Nous avons observé une hyperréactivité à l'endotoxine chez les animaux infectés depuis i et 2 semaines, les Dlrba étant de 29 yg (51-6, 9) et 76, 2 ! . g respectivement. Cette hyper- réactivité n'est plus mise en évidence après 4 semaines d'infection. L'observation clinique des animaux recevant de l'endotoxine permet de distin- guer trois types de réactions conduisant ou non à la mort : - la mort des animaux témoins survient en 12-48 heures avec des symptômes analogues à ceux décrits par SPINK et ANDERSON (1954). Quelques heures après l'injection, les animaux paraissent malades : le poil est hérissé, le rythme respiratoire augmente ; on observe des sécrétions nasales abondantes, de la conjonctivite et, dans certains cas, de la diarrhée ; - la mort des souris infectées depuis peu, en particulier la première semaine, survient à partir de la 3e heure avec des symptômes d'agitation, de spasmes et de contractions généralisées déclenchés facilement par des stimuli mécaniques ou lumineux. Les souris meurent dans une phase de spasmes généralisés en adoptant une position typique ; - les souris infectées depuis 8 semaines, recevant les doses les plus élevées d'endotoxine (q. oo et 800 ! tg), ont des symptômes d'anaphylaxie immédiate avec difficultés respiratoires, cyanose des extrémités et du museau, suivis 20 à 30 minutes plus tard par la paralysie des membres postérieurs et un gonflement abdominal obli- geant les animaux à se traner sur le sol à l'aide des membres antérieurs. La moitié environ des souris ayant montré ces symptômes meurt après une série de contractions cloniques et toniques et émission d'urine ; la mort survient dans la majorité des cas en moins d'une heure. Les souris survivant à cette crise traversent une période d'appa- rence normale, mais elles peuvent mourir ensuite avec des symptômes analogues à ceux décrits pour les souris infectées depuis une semaine. Après 8 semaines d'infection, la réaction d'anaphylaxie immédiate bien que provoquant la mort d'un certain nombre de souris ne conduit pas à une réduction de la DI, so. On mesure, par conséquent, à ce moment-là, un phénomène complexe, o interviennent sans doute, en s'ajoutant, une sensibilisation et une augmentation de la résistance. Ces résultats indiquent que le plus haut degré d'hyperréactivité contre l'endo- toxine est obtenu après i semaine d'infection et que l'hyperréactivité n'a pas de rela- tion avec l'hypersensibilité mise en évidence par test cutané. 4. - Étude du pouvoir létal des endotoxines extraites de Y. enterocolitica type 9, de Y. enterocolitica type 8 et de E. coli 0111 B, sur des souris infectées par B. abortus Les valeurs de la DI, SO correspondant à chaque endotoxine étudiée sur des souris infectées depuis i et 8 semaines sont indiquées sur le tableau 3. Après une semaine d'infection, on obtient, comme dans le cas des souris testées avec l'endotoxine de Brucella, une hyperréactivité correspondant à une sensibilité aux endotoxines 22 à 52 fois plus grande que pour les souris témoins. Les symptômes précédant la mort de ces souris sont comparables à ceux notés pour les souris injectées avec l'endotoxine de Brucella. Elles meurent 3 heures après l'injection, tandis que la mort des souris témoins ne survient pas avant 12 heures. Les souris infectées depuis 8 semaines ont perdu leur hyperréactivité ; elles réagissent normalement aux différentes endotoxines, toutefois la mort se produit souvent en moins de 12 heures. Seuls les animaux testés avec 800 et 400 {ig d'endotoxine de Y. enteyocolitica type 9 présentent, io minutes après l'injection, des signes d'anaphylaxie comparables à ceux observés après l'inoculation d'endotoxine de Brucella ; la moitié de ces animaux meurt en moins de 3 heures. Le tableau 4 exprime les résultats obtenus avec des lots de 2o souris infectées depuis 8 semaines et testées par inoculation intraveineuse de 800 yg de chaque endo- toxine. Toutes les souris injectées avec de l'endotoxine de Brucella ou de Y. entero- colitica type 9 ont montré les symptômes caractéristiques du choc anaphylactique. La mort survient en moins de 3 heures dans i3 cas sur 20 pour le lot testé avec l'endo- toxine de Brucella, et dans i5 cas sur 2o avec l'endotoxine de Y. enterocolitica type 9. Les souris surmontant l'état de choc meurent après une phase sans difficulté respi- ratoire ni cyanose. Au contraire, les souris testées avec les endotoxines de E. coli et de Y. entero- colitica type 8 n'ont montré aucun signe de choc anaphylactique immédiat, et leur mort n'est survenue qu'après un délai de 3 heures au moins. I, es résultats obtenus au bout de huit jours d'infection indiquent que le phéno- mène d'hyperréactivité est un phénomène non spécifique, puisque même les endo- toxines extraites de Y. enterocolitica type 8 et de E. coli, bactéries sans relation anti- génique avec les Byucella, ont une action similaire. Après 8 semaines d'infection, le phénomène est spécifique ; il semble dû à une réaction antigène-anticorps, puisque l'endotoxine de Y. enterocolitica type 9 qui contient des déterminants antigéniques communs avec l'endotoxine de Brx ! cella produit le même type de réaction. 5. - Transmission passive de l'anaphylaxie immédiate Toutes les souris ayant reçu le sérum anti-brncella puis testées avec les endo- toxines de Brucella et de Y. enterocolitica type 9 manifestent des signes d'anaphylaxie immédiate en 10 minutes, entranant la mort de la plupart d'entre elles en moins de 3 heures (tabl. 5). Les survivantes meurent entre 12 et 24 heures. Au contraire, les endotoxines de Y. enterocolitica type 8 et de E. coli ne produisent pas de réaction d'anaphylaxie, mais tuent les souris en moins de 24 heures. DISCUSSION R ! DP ! ARN (ig6o), premier auteur à appliquer au genre Brucella l'extraction à chaud par le mélange phénol-eau, étudia les souches représentatives de chacune des 3 espèces de Brucella, ce qui lui permit de mettre en évidence deux lipopolysaccha- rides : l'un obtenu à partir de la phase phénol par précipitation au méthanol-acétate de sodium, l'autre extrait de la phase aqueuse. Le premier (fraction 5) est le plus toxique pour les animaux sains et il adsorbe les agglutinines des sérums anti-Brucella. Le second (fraction 3) a une toxicité minime pour le cobaye et n'adsorbe pas les immun- sérums. BAKER et WWSOrr (1965 a) étudièrent les propriétés biologiques de l'endotoxine de B. abortus extraite par les méthodes de BOIVIN et MESROBEANU (1935), RIBI, MILNER et PERRINE (1959) et REDFEARN (1960). Les résultats démontrèrent que la fraction 5 de REDFEARN possédait le plus grand pouvoir létal pour la souris, avec une DL, de 393 [Lg. HINSDrrr, et BERMAN (1968) montrèrent ultérieurement que cette fraction détruisait les cultures de macrophages péritonéaux préparés à partir de cobayes normaux. I, ACAV ! et al. (1969, 1970) ont effectué l'analyse chimique la plus complète des antigènes polysaccharidiques extraits par la méthode phénol-eau. Ils ont confirmé l'absence de toxicité du lipopolysaccharide de la phase aqueuse, et montré que le polysaccharide de la phase phénol contient une quantité importante de lipide A. Ce lipide est constitué par des acides (3-hydroxyles dont le terme C, 6 est fortement prépondérant. BERGER et al. (1969) obtiennent, à partir d'une souche B. abortus 19 Rough, des résultats analogues à ceux de I, ACAV ! et al. (1969) concernant le lipopolysaccharide de la phase aqueuse. Ce résultat semble montrer que la mutation Smooth-Rough n'affecte pas ce lipopolysaccharide, alors que les bactéries Rough ne contiennent pas d'endotoxine (SPINK et ANDERSON (i954) ; BAKER et WILSON (1965 a) ; JONES et al. (1968) ; DIAZ et al. (rg68). L'étude chimique et biologique des fractions préparées selon la méthode de REDFEARN (1960), effectuée par LEONG et al. (1970) et HURVELL (1973 a), confirme que la fraction 5 est un complexe lipide-hydrate de carbone-protéine-KDO (1), ther- mostable et résistant à la pronase. La structure en microscopie électronique est similaire à celle des endotoxines des Entérobactéries. Le lipopolysaccharide de la fraction 5 est létal pour la souris avec une DI, SO de 250 P. 9, produit une leucopénie suivie de leucocytose et est immunogène. Il est possible de former des hybrides molé- culaires avec ce lipopolysaccharide et les endotoxines de E. coli et de Salmonella enteritidis. Malgré les ressemblances structurales et biologiques, le lipopolysaccharide de Brucella diffère des endotoxines des Entérobactéries par certaines propriétés bio- logiques. En effet, il est apyrogène pour le lapin normal non sensibilisé et n'est létal pour l'embryon de poulet que pour des doses très supérieures à celles normalement nécessaires avec les endotoxines des Entérobactéries (les DLso étant respectivement de IO yg pour le lipopolysaccharide extrait de B. abortus et de 0, 003 V. 9 pour l'endo- toxine de E. coli). Le lipopolysaccharide de Brucella ne possède comparativement à l'endotoxine de E. coli que 1/75 de la capacité de protection de la souris contre Salmonella typhi (LEONG et al. , 1970). Nos résultats confirment ceux publiés par BAKER et WiLsoN (1965 a) et LEONG et al. (1970) ; l'endotoxine obtenue à partir de la phase phénol possède une DLso pour la souris comparable aux valeurs données pour les endotoxines classiques des Entéro- bactéries. D'autre part, les résultats montrent que la méthode de purification de (1) KDO Acide 2-céto, 3-déoxyoctulosonique. REDFEARN (1960) est adéquate pour l'obtention d'endotoxines de qualités repro- ductibles. Des préparations faites dans des laboratoires différents et testées sur diverses souches de souris ont des valeurs de DLso proches : BAKER et WILSON (1965 a), sur souris Swiss Webster ; indiquent une DL/so de 393 Fg 1 LEONG et al. (Ig7o), sur souris de la souche du Rocky Mountain Laboratory, donnent une DI, SQ de 250 ! 9. Dans ce travail, nous avons obtenu sur souris Charles River une DLso de 220 yg (385-I3 ! ) ! RENOUX, RENOUX et TiNXLLi (1973) n'ont mis en évidence aucune fraction toxique pour la souris en employant l'extraction par la méthode de W ! sPxAt ; , I, uD ! RITZ et BISTER (rg52), modifiée. Ces modifications comprennent le traitement des bactéries à l'acétone avant l'extraction par le phénol, puis la dialyse de la phase phénol contre l'eau distillée. On obtient ainsi deux fractions, solubles et précipitées, aucune n'étant toxique. Il est possible que l'acétone ait extrait le lipide A. La méthode d'extraction de REDFEARN (1960) ne fait pas intervenir l'acétone et le mode de frac- tionnement est différent. Les bactéries sont inactivées par addition de o, 5 p. 100 de phénol et le lipopolysaccharide de la phase phénol (fraction 5) est purifié par précipi- tation au méthanol. De plus, RENOUX, RENOUX et TINELU (1973) éprouvent la toxicité de ces fractions par voie sous-cutanée. Cette voie doit ralentir la diffusion de l'endotoxine et favoriser une inactivation locale. AB ! RNATHY, BRADI, ! Y et SpiNK (1958) ont mis en évidence que l'infection expé- rimentale par B. melitensis ou par B. abortus augmente la sensibilité des souris à l'action létale de l'endotoxine de Brucella. Ce résultat est, pour plusieurs auteurs (WILSON, KOI, BY ! et BAKER, Ig6. ! ; FREEDMAN et GCt. , rg68 ; BERGER et al. , 1969 ; 1973), un argument en faveur de la thèse selon RENOUX, RENoux et TiNEi laquelle un état d'hypersensibilité est indispensable pour que la toxicité de l'endo- toxine se manifest ? . Une lecture attentive des résultats de AB ! RNATxy, BRADLEY et SPINK (1958) montre cependant que cette sensibilisation n'est pas spécifique pui- qu'elle est du même ordre envers les endotoxines de Brucella, E. coli et S. typhi. Nous savons actuellement que les infections expérimentales confèrent aux animaux un état de sensibilisation non spécifique aux endotoxines. Le thème a été développé par SUTER (1964) qui n'a pas pu mettre en évidence un mécanisme immunologique, humoral ou cellulaire. Nos résultats confirment les observations de As ! RNATHY, BRAD ! , ! Y et SPINK (I958), L'infection des souris par B. abortus 544 produit un état d'hyperréactivité, révélé par une diminution de la DLso de l'endotoxine de Brucella, mais également par une diminution des DLso des endotoxines sans relation antigénique avec le germe infectant, comme celles extraites de E. coli et de Y. enterocolitica type 8. Nous avons obtenu avec toutes les endotoxines testées un état d'hyperréactivité maximum après I semaine d'infection. Si l'hyperréactivité était liée à un état d'hypersensibilité, nous aurions dû mettre en évidence l'hyperréactivité sur les souris infectées depuis 4 et 8 semaines, moment o les tests cutanés sont les plus positifs. Bien qu'à ce moment la DLso atteigne des valeurs normales, les souris infectées meurent en majorité en 3 à 12 heures au lieu de plus de 12 heures pour les témoins. Cette manifestation plus précoce de la mortalité n'est pas spécifique car elle est observée avec les trois endo- toxines étudiées. Elle doit donc relever d'un même mécanisme que l'hyperréactivité, mais atténué au point de ne pas provoquer la mort d'un plus grand nombre de souris. Après 8 semaines d'infection, les souris inoculées avec l'endotoxine de Brucella et de Y. enteyocolitica type 9 réagissent par un choc anaphylactique immédiat. L'in- jection de sérum anti-Brucella à des souris normales avant l'inoculation des endo- toxines permet de reproduire ce choc. L'anaphylaxie est par conséquent le résultat d'une réaction antigène-anticorps ; la communauté antigénique décrite par AHvo- NEN, JANSSON et AHO (ig6g) entre le genre Brucella et Y. enteyocolitica type 9, due à des déterminants antigéniques communs situés sur la chane polysaccharidique (Hux- 1973 b), est responsable de cette réaction croisée ; elle autorise à avancer l'hypo- VEi thèse selon laquelle c'est la fraction polysaccharidique de l'endotoxine qui intervient dans la réaction. Les résultats de l'anaphylaxie passive expliquent d'autre part les observations décrites antérieurement par WILSON, Ko ! , sy ! et BAKER (1964) qui transmirent l'anaphylaxie à des souris par injection de sérum anti-Brucella, puis des Brucella totales. En conclusion, nos résultats démontrent que le lipopolysaccharide de Brucella, extrait de la phase phénol par la méthode de REDFEARN (ig6o), possède une activité létale pour la souris comparable à celle des endotoxines des Entérobactéries. La théo- rie selon laquelle les activités biologiques de l'endotoxine de Brucella résultent d'un mécanisme d'hypersensibilité de nature immunologique ne peut être retenue. En effet, au moment o l'hyperréactivité aux endotoxines est observée, les tests cutanés sont négatifs. L'hyperréactivité des souris infectées depuis une semaine n'est pas spé- cifique. Les réactions cutanées les plus intenses se manifestent après 4 à 8 semaines d'infection, moment o la valeur de la DLso est revenue à un même ordre de grandeur pour les souris infectées et pour les souris témoins du même âge. Le seul phénomène mettant en jeu l'immunité dans l'action de l'endotoxine est l'anaphylaxie immédiate observée sur les souris infectées depuis 8 semaines. Cette réaction, qui n'entrane pas une diminution de la DI, SO, est due à une réaction antigène- anticorps, puisqu'elle peut être transmise passivement par le sérum anti-Brucella ; elle est également observée dans les mêmes conditions par injection d'endotoxine de Y. enteyocolitica type 9, bactérie possédant des sites antigéniques communs avec les Brucella. La nature des anticorps qui interviennent dans l'anaphylaxie doit être étudiée. BROWN, DOUGLAS et BRAUDE (1971), dans leur travail sur l'anaphylaxie passive contre les endotoxines d'Entérobactéries, ont conclu à la formation d'un complexe antigène-anticorps, mais ils n'ont pas mis en évidence l'intervention d'anticorps cytotropes. L'endotoxine de Brucella diffère des endotoxines des Entérobactéries par le fait qu'elle ne produit pas de fièvre chez le lapin non sensibilisé et ne tue pas l'embryon de poulet aux doses normalement actives avec ces dernières (LEONG, 1970). Cela peut suggérer deux hypothèses : selon la première, il manquerait à l'endotoxine de Brucella tout ou partie de la fraction responsable de ces deux activités ; selon la deuxième, les deux activités seraient dues à l'existence d'un état d'hypersensibilité naturelle spécifique envers l'endotoxine des Entérobactéries, qui n'existerait pas naturellement envers l'endotoxine de Brucella. Dans l'un ou l'autre cas, l'analyse de ces différences d'activité permettra de mieux comprendre le mode d'action des endo- toxines d'une manière générale. Reçu pour publication en décembre 1973. REMERCIEMENTS Nous remercions le Dr L. JONES et le Dr PLOMMET de l'aide qu'ils nous ont apportée au cours de ce travail. SUMMARY EFFECT OF INFECTION WITH B. ABORTUS ON HYPERSENSITIVITY AND HYPERREACTIVITY OF THE MOUSE TO ENDOTOXINS OF BRUCELLA MEL1TENSlS, YERSINIA ENTEROCOLITICA AND ESCHERICHIA COL ! Using mice infected with B. abovtus 544 the following parameters have been investigated : i. Foot-pad reactions following the injection of Byucella endotoxin (Pronase treated, fraction 5, prepared by REDFEARN'S method). 2. Agglutinins and precipitins to Brucella endotoxin. 3. Hyperreactivity, assessed by the LDSO method, to Brucella endotoxin (REDFEARN). E. coli endotoxin (WESPHAL) and also to Y. entevocolitica types 8 and 9 endotoxins which were studied in view of the antigenic relationship between Bvucella and Y. entevocolitica type 9. Hypersensitivity to Byucella endotoxin, as indicated by the foot-pad test, appeared two weeks after infection and increased subsequently. This immediate type reaction was maximal 4 hours after endotoxin injection, and developed concurrently with the appearance of agglutina- ting and precipitating antibodies. Infection provoked a temporary non-specific hyperreactivity to the endotoxins. The LDso of Bvucella endotoxin was 2g yg after I week, 76 after 2 weeks and 220 after 4 weeks, as compared with 220-282 fLg in the controls. There was no correlation between development of this hyper- sensitivity and the hyperreactivity, Mice receiving Brucella endotoxin intravenously, 8 weeks after injection, died within one hour, of anaphylactic shock. An identical anaphylactic reaction was also obtained in mice infected for 8 weeks, after the injection of Y. enterocolitica type 9 endotoxin, but not after injection of Y. entevocolitica type 8 or E. coli endotoxin. The same effect was obtained after injection of bovine anti-Bvucella serum to non-infected mice, 3 hours before endotoxin injection. In conclusion, Brucella endotoxin injected intravenously into mice has at least three diffe- rent effects : a direct toxicity for non-infected animals ; a non-specific hyperreactivity resulting from infection ; an immediate type hypersensitivity due to antigen-antibody reaction. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ABERNATHY R. S. , BRADLEY G. M. , SPINK W. W. , 1958. Increased susceptibility of mice with bru- cellosis to bacterial endotoxins. J. Immunol. , 81, 271-275. AxvoNErr P. , J ANSSOH E. , AHO K. , 1969. Marked cross-agglutination between Brucellae and a subtype of Yersinia enteracolitica. Acta pathol. microbiol, scand. , 75, 291-295. BAKER P. 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Investigation du rapport aux objets chez dix enfants diagnostiqués dysphasiques Marion Godel To cite this version : Marion Godel. Médecine humaine et pathologie. 2011. hal-01878138 Investigation du rapport aux objets chez dix enfants diagnostiqués dysphasiques. HAL Id : hal-01878138 Submitted on 20 Sep 2018 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. AVERTISSEMENT l'ensemble de Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l'utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact : ddoc-theses-contact@univ-lorraine. fr LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335. 2- L 335. 10 UNIVERSITE HENRI POINCARE NANCY I FACULTE DE MEDECINE ECOLE D'ORTHOPHONIE DE LORRAINE Directeur : Professeur Claude SIMON Investigation du rapport aux objets chez dix enfants diagnostiqués dysphasiques MEMOIRE Présenté en vue de l'obtention du CERTIFICAT DE CAPACITE D'ORTHOPHONISTE Par Marion GODEL Le 30 juin 2011 Jury : Président : Monsieur le Professeur Bruno LEHEUP, Directrice : Madame Lydie MOREL, Assesseur : Madame Cécile JARNAUD, Généticien pédiatre Orthophoniste Orthophoniste 2 REMERCIEMENTS Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Bruno LEHEUP, généticien pédiatre, de m'avoir fait l'honneur d'accepter la présidence de ce jury. J'adresse mes remerciements les plus sincères à Madame Lydie MOREL, orthophoniste et directrice de ce mémoire, pour l'intérêt qu'elle a porté à mon travail tout au long de cette année. Merci pour sa disponibilité, sa gentillesse et ses encouragements. A ses côtés, j'ai appris à construire mon regard clinique et à réfléchir quant à ma future pratique orthophonique. Je remercie chaleureusement Madame Cécile JARNAUD, orthophoniste, de m'avoir fait confiance dès le début de ce travail. Merci pour tout le temps qu'elle m'a consacré, son aide précieuse, son soutien rassurant et stimulant. Nos échanges et son modèle professionnel m'ont beaucoup apporté au cours de cette année. Un grand merci à Mademoiselle Marjorie MARCHE, orthophoniste, d'avoir éveillé mes premiers questionnements quant à ces enfants diagnostiqués dysphasiques mais surtout de m'avoir suivie attentivement dans ce travail, même Outre-Atlantique. Je remercie tout particulièrement les enfants qui ont participé avec bonne humeur et motivation à mes expérimentations. Je leur souhaite un très bel avenir. Merci également à leurs parents de m'avoir autorisée à les rencontrer et à les filmer. Mes remerciements à Monsieur GARNIER, directeur de l'IME qui m'a reçue pour une partie de mes expérimentations, ainsi qu'à Mesdames Marion GINEYS, Sylvie REVERET, Claire SAFFROY, Bérengère GALMICHE et toute l'équipe de l'établissement pour leur accueil. Merci également à Mesdames Laurence MAURICE et Céline LECLERC, respectivement directrice et enseignante de l'école Marcel Leroy à Nancy. 3 Je remercie intervenants et matres de stage qui ont contribué à ma formation durant ces quatre années. Une pensée également pour la promotion 2007-2011. Merci à mes amis, futurs orthophonistes ou non, pour leur amitié sincère, leur soutien et pour tous les moments partagés ensemble. Merci d'être là pour moi. Je remercie Sébastien de m'avoir encouragée mais surtout supportée cette année. Enfin, je tiens à remercier mes parents et mon frère d'avoir toujours cru en moi. Merci pour leurs conseils mais surtout pour leur présence et leur amour. 4 TABLE DES MATIÈRES INTRODUCTION PARTIE THEORIQUE I. LE RAPPORT AUX OBJETS 1. Le développement cognitif 1. 2. Une théorie constructiviste 1. 2. 1. Les schèmes 1. 2. 2. L'assimilation 1. 2. 3. L'accommodation 1. 2. 4. L'adaptation 1. 3. Les stades piagétiens 1. 3. 1. Le stade sensori-moteur : de la naissance à 1 an 2 ans 1. 3. 2. Le stade pré-opératoire : de 2 ans à 7 ans 1. 3. 3. Le stade opératoire concret : de 7 ans et 11 ans 1. 3. 4. Le stade opératoire formel : à partir de 11 ans 2. Liens entre pensée et langage 2. 1. Développement du langage 2. 1. 1. Lexique et langage 2. 1. 2. Morphosyntaxe et langage 2. 2. L'investigation du rapport aux objets 10 11 12 12 12 13 14 14 15 15 15 18 20 21 21 21 23 24 25 5 II. LA DYSPHASIE 1. Terminologie 2. Définitions 2. 1. Les troubles du langage par AJURIAGUERRA 2. 2. Définition par exclusion 2. 3. Définition évolutive 2. 4. Les marqueurs de dysphasie 3. Classifications 3. 1. Classifications internationales 3. 2. Sémiologie et classification des dysphasies 4. Troubles associés 4. 1. Aspects perceptifs 4. 2. Aspects comportementaux 4. 3. Aspects psychomoteurs 4. 4. Aspects cognitifs 5. Hypothèses étiologiques 5. 1. Hypothèse neurophysiologique 5. 2. Hypothèse génétique 6. Le développement cognitif chez les enfants dysphasiques III. PROBLÉMATIQUE ET HYPOTHÈSES 27 27 27 28 28 29 30 31 31 32 33 34 34 34 34 35 35 35 36 39 6 PARTIE EXPERIMENTALE IV. DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL 1. Présentation de la population d'étude 2. Déroulement des ateliers 2. 1. Les lieux 2. 2. La durée 2. 3. Le recueil des observations 2. 4. Notre positionnement 3. Présentation des ateliers 3. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes 3. 1. 1. Matériel 3. 1. 2. Objectifs 3. 1. 3. Déroulement et consignes 3. 2. Atelier 2 : Parcours de billes 3. 2. 1. Matériel 3. 2. 2. Objectifs 3. 2. 3. Déroulement et consignes 3. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques 3. 3. 1. Matériel 3. 3. 2. Objectifs 3. 3. 3. Déroulement et consignes 3. 4. Atelier 4 : Caisse-enregistreuse et objets symboliques 3. 4. 1. Matériel 3. 4. 2. Objectifs 3. 4. 3. Déroulement et consignes 41 42 42 43 43 43 43 44 45 45 45 45 45 46 46 47 47 47 47 48 48 49 49 50 50 7 ANALYSES ET INTERPRÉTATIONS V. PASSATIONS ET ANALYSES INDIVIDUELLES 1. Sylvain, 7 ans et 1 mois 2. Louis, 8 ans et 5 mois 3. Léna, 9 ans et 6 mois 4. Victoire, 9 ans et 8 mois VI. ANALYSE GLOBALE 1. Grilles d'observation et résultats globaux pour chaque atelier 1. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes 1. 2. Atelier 2 : Parcours de billes 1. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques 1. 4. Atelier 4 : Caisse-enregistreuse et objets symboliques 2. Les différents profils 2. 1. Les enfants en juxtaposition d'actions avec un langage descriptif, quel que soit l'atelier 2. 2. Les enfants en mise en relation d'objets et succession d'actions dans les situations contraintes 2. 3. informatif, quel que soit l'atelier Les enfants en organisation d'actions avec un langage 3. Analyse des conduites des enfants diagnostiqués dysphasiques 51 53 53 60 66 72 77 77 77 83 84 84 86 86 87 89 89 8 3. 1. Les conduites ludiques 3. 2. Les conduites langagières 3. 3. Liens entre conduites ludiques et langagières VII. DISCUSSION 1. Précautions méthodologiques 2. Validation des hypothèses 3. Apports de ce mémoire de recherche 4. Ouvertures CONCLUSION REPÈRES BIBLIOGRAPHIQUES ANNEXES 89 91 91 93 93 94 95 96 97 99 9 INTRODUCTION La dysphasie se définit comme un trouble du développement du langage oral et se caractérise par sa sévérité et sa durabilité dans le temps. Décrite comme un trouble spécifiquement linguistique, la dysphasie soulève pourtant un certain nombre d'interrogations. Les limites de mon langage signifient les limites de mon propre monde 1. Cette citation de WITTGENSTEIN nous amène à nous questionner sur le lien entre pensée et langage. Ce mémoire de recherche propose de s'intéresser à ce lien sous l'angle du rapport aux objets. Ce rapport aux objets peut être étendu au rapport au réel au sens large. Ainsi l'objectif de notre travail est d'observer comment l'enfant diagnostiqué dysphasique pense et signifie son rapport aux objets dans ses conduites ludiques et langagières. Une première partie viendra exposer les éléments théoriques retenus pour ce travail. Tout d'abord, nous expliquerons le développement cognitif puis le lien entre pensée et langage. Nous détaillerons ensuite les données concernant le concept de dysphasie. La deuxième partie permettra la présentation de notre dispositif expérimental : la population de notre étude, le déroulement des ateliers et le matériel proposé aux enfants. Une troisième et dernière partie viendra exposer les passations et analyses individuelles pour quatre enfants, puis une analyse globale et croisée, à partir des grilles d'observation, nous permettra de mettre en évidence des profils. Nous proposerons ensuite une analyse des conduites ludiques et langagières des enfants diagnostiqués dysphasiques. Enfin, une discussion validera nos hypothèses initiales et présentera les apports de ce mémoire de recherche et les pistes de recherches éventuelles. 1 WITTGENSTEIN L. , 1921, Tractatus logico-philosophicus 10 PARTIE THÉORIQUE 11 I. LE RAPPORT AUX OBJETS Observer comment l'enfant se situe dans son rapport aux objets correspond à observer comment l'enfant nous signifie, par ses actions et par son langage, ce qu'il comprend du monde qui l'entoure. Cette première partie apportera alors des éléments théoriques sur le développement cognitif puis langagier chez l'enfant tout-venant 1. Le développement cognitif 1. 2. Une théorie constructiviste PIAGET, biologiste puis psychologue suisse qui a étudié le développement des connaissances depuis la naissance jusqu'à l'âge adulte, est le fondateur de la psychologie génétique. Selon lui, l'intelligence n'est pas innée, elle s'acquiert et se construit progressivement en s'adaptant aux milieux et situations changeants. On parle de théorie constructiviste en parlant de la théorie piagétienne, car elle tente d'expliquer l'évolution des structures cognitives de plus en plus élaborées par le fait que leur mode de formation s'établisse par des stades successifs. Pour PIAGET, l'intelligence n'est qu'un cas particulier de l'adaptation biologique, c'est une capacité qui permet au sujet d'adapter son comportement, ses connaissances et sa pensée, aux modifications du milieu 2. En effet, l'intelligence constitue l'état d'équilibre vers lequel tendent toutes les adaptations successives d'ordre sensori-moteur et cognitif, ainsi que les échanges assimilateurs et 2 BRIN F. & coll. , 2004, p 126 12 accommodateurs entre l'organisme et le milieu . 3 Cette adaptation de l'individu à son milieu se fait grâce à l'équilibre de deux processus qui sont l'assimilation et l'accommodation. Mais avant de définir ces deux processus, il nous parat important de décrire la notion de schème. 1. 2. 1. Les schèmes Un schème est une entité mentale, donc abstraite, qui permet la réalisation d'une action ou d'un ensemble d'actions. Le schème n'est pas directement perceptible mais on en conclut l'existence quand on constate des régularités dans les comportements de la personne : dans des situations analogues, les mêmes organisations sensori-motrices seront observées. Un schème, c'est l'organisation d'une action donnée stable au cours de répétitions de celle-ci et est susceptible d'être appliquée à de nouveaux objets ou de nouvelles situations. Agir, c'est donc coordonner des schèmes entre eux. Et ces schèmes fonctionnent selon les principes de l'assimilation et l'accommodation : L'assimilation, en intégrant un objet ou une situation nouvelle à un schème ou un ensemble de schèmes, permet de le ou les consolider. L'accommodation permet d'une part de différencier les schèmes de plus en plus finement pour mieux les adapter aux différentes situations, et d'autre part de créer de nouveaux schèmes. Les schèmes vont à la fois devenir plus généraux et plus nombreux et surtout plus mobiles. La mobilité des schèmes est déterminante pour le développement de l'intelligence puisque c'est la coordination de certains schèmes qui rendra possible la résolution de problèmes pratiques. Finalement, les schèmes sensori-moteurs se réélaboreront sur le plan de la représentation et deviendront ensuite opératoires. Cette constante évolution des schèmes est le reflet de l'adaptation de l'individu au milieu qui elle-même dépend de l'équilibration entre assimilation et accommodation. 3 Idem 13 1. 2. 2. L'assimilation On parle d'assimilation quand l'enfant intègre un nouvel objet ou une nouvelle situation à un schème d'action matrisé dans le but de coordonner les deux et par conséquent modifier et faire évoluer ses structures mentales internes. Cette intégration se traduit de différentes manières : L'assimilation fonctionnelle ou reproductrice : basée sur la répétition d'une action qui permet de consolider le schème correspondant à cette action ; L'assimilation généralisatrice : permet l'élargissement d'un schème par application de celui-ci sur divers objets ; L'assimilation recognitive : permet à l'enfant de distinguer les objets auxquels il a appliqué un même schème ; L'assimilation réciproque : correspond à la coordination de plusieurs schèmes. Ce processus d'assimilation n'est pas toujours possible. Parfois, les structures mentales doivent subir des modifications pour réussir à intégrer certains objets ou situations afin de permettre à l'individu de s'adapter au milieu. On parle dans ce cas d'accommodation. 1. 2. 3. L'accommodation L'accommodation consiste en une modification des schèmes déjà construits par assimilation pour les ajuster aux situations nouvelles. L'assimilation et l'accommodation sont deux mécanismes antagonistes puisque l'assimilation intègre les situations extérieures aux schèmes du sujet alors que l'accommodation modifie ces schèmes en fonction des contraintes du milieu. Bien qu'ils soient antagonistes, ces deux processus restent indissociables car l'accommodation implique l'existence de schèmes déjà construits. Et toute accommodation est matière à des nouvelles assimilations. Ce double mécanisme est à l'origine de l'adaptation de l'individu à son milieu et donc de l'activité intelligente de celui-ci. 14 1. 2. 4. L'adaptation L'adaptation, en tant que processus essentiel de l'intelligence, est donc une équilibration progressive entre deux actions antagonistes et complémentaires. Cet état est en perpétuel mouvement car chaque nouvelle situation entranera un déséquilibre et des constructions de nouvelles structures mentales viendront rééquilibrer cet état provisoirement. PIAGET définit donc l'intelligence comme une adaptation aux situations nouvelles et correspond donc à une construction continue dont il distingue quatre stades de développement. 1. 3. Les stades piagétiens PIAGET décrit le développement cognitif de l'enfant en quatre stades : Le stade sensori-moteur : de la naissance à 1 an 2 ans ; Le stade pré-opératoire : de 2 ans à 7 ans ; La stade opératoire concret : de 7 ans à 11 ans ; Le stade opératoire formel : à partir de 11 ans. Ces stades sont caractérisés par leur succession invariante mais l'âge d'accès à un stade peut varier selon l'individu, le milieu, etc. Les structures construites à un moment donné le sont définitivement et s'intègrent aux structures construites ultérieurement. 1. 3. 1. Le stade sensori-moteur : de la naissance à 1 an 2 ans Lors de ce premier stade, l'intelligence est essentiellement pratique. En effet, le bébé résout les problèmes par l'action. Il n'a pas encore accès à la représentation et donc ni au langage, ni aux concepts. Ce stade est primordial dans l'élaboration des structures cognitives ultérieures puisqu'à la fin de la deuxième année, l'enfant va construire ses premières représentations mentales à partir de l'intériorisation de ses actions. 15 Sous-stade I : L'exercice des réflexes (de la naissance à 1 mois) Pour PIAGET, le réflexe est la première réponse globale de l'individu à une stimulation provenant de son milieu. Cette réponse a déjà une fonction adaptative. Par exercice fonctionnel, ces réflexes vont se consolider et donner lieu à la constitution de schèmes. A ce stade, les processus d'assimilation et d'accommodation ne se différencient pas. Sous-stade II : Les premières habitudes (de 1 à 4 mois ) C'est le stade des premières habitudes et des réactions circulaires primaires. De nouveaux éléments vont être intégrés aux schèmes de départ et de nouvelles conduites apparaissent grâce aux réactions circulaires primaires, c'est-à-dire grâce à la reproduction d'actions fortuites qui ont provoqué par hasard un résultat nouveau et intéressant et qui concerne le corps propre du bébé. Pendant ce sous-stade, assimilation et accommodation commencent à se distinguer. Sous-stade III : Les adaptations sensori-motrices intentionnelles (de 4 mois à 8-9 mois) On parle désormais de réactions circulaires secondaires car elles vont s'appliquer à des objets extérieurs et se caractérisent par l'intentionnalité du bébé. Il cherche à reproduire les actions qui lui ont permis d'obtenir par hasard un résultat intéressant. On assiste à la mise en place de la coordination vision et préhension, qui est à l'origine de nouvelles découvertes de l'enfant. Il peut ainsi commencer à mettre en correspondance différents espaces sensoriels. C'est durant ce sous-stade qu'apparat le début de la coordination moyen-but. Cependant, ce but n'est pas encore posé au préalable de l'action, il apparat au hasard au cours de l'action de l'enfant. L'enfant va aussi appliquer tous les schèmes qu'il possède aux nouveaux objets. Enfin, si les réactions circulaires secondaires ne sont pas encore des actes d'intelligence, les schèmes secondaires sont la première esquisse de ce que seront les classes ou les concepts dans l'intelligence réfléchie 4. A partir de ses actions, l'enfant pourra appréhender les objets selon leurs propriétés et donc considérer leurs différences, leurs équivalences, ainsi que les relations qu'ils peuvent entretenir entre eux. Ce phénomène est à la base de l'élaboration des concepts. 4 DOLLE J-M. , 1999, Pour comprendre Jean Piaget, p 108 16 Sous-stade IV : La coordination des schèmes secondaires et application aux situations nouvelles (de 8-9 mois à 11-12 mois) L'enfant commence à agir sur le milieu en mettant en application des schèmes dans des situations nouvelles. Les schèmes se détachent de leur contenu habituel pour s'appliquer à un plus grand nombre d'objets. L'enfant coordonne plusieurs schèmes en les hiérarchisant pour agir sur plusieurs objets et obtenir le résultat souhaité. L'action se complique et aboutit à toute sorte de combinaisons. Là encore nous pouvons faire l'analogie fonctionnelle des schèmes avec les concepts, l'analogie de leurs coordinations avec les raisonnements. On assiste à une dissociation du but et des moyens et à une coordination intentionnelle des schèmes. L'enfant passe de l'intérêt pour l'action en elle-même à l'intérêt pour les conséquences de l'action. L'acte intelligent est ainsi constitué, qui ne se borne pas à reproduire, sans plus, les résultats intéressants, mais à atteindre ceux-ci grâce à des combinaisons nouvelles. 5 A ce sous-stade, le résultat de l'action de l'enfant est encore dépendant des objets eux-mêmes et des relations que ceux-ci entretiennent entre eux. De ce fait, l'accommodation est dissociée de l'assimilation mais elle ne la dirige pas comme ultérieurement. Sous-stade V : La découverte de moyens nouveaux par expérimentation active (de 11- 12 mois à 18 mois) C'est le stade des réactions circulaires tertiaires. L'enfant recherche la nouveauté et résout les problèmes pratiques par tâtonnements et expérimentations. Il cherche à obtenir un résultat nouveau au cours de répétitions et de variations d'actions. La coordination des schèmes s'intensifie grâce à la recherche de moyens nouveaux. Il ne s'agit plus ici pour l'enfant d'appliquer des schèmes connus à des objets nouveaux mais de faire des expériences pour voir . En d'autres termes, il agit sur le milieu pour le découvrir et s'y adapter peu à peu. Cette adaptation de l'intelligence au réel va de pair avec la construction de l'objet permanent, de l'espace, du temps et de la causalité. Sous-stade VI : L'invention de moyens nouveaux par combinaison mentale (de 18 mois à 24 mois) Ce stade effectue la transition entre l'intelligence sensori-motrice et l'intelligence représentative qui débute vers deux ans avec l'apparition de la fonction symbolique ou 5 PIAGET J. , 1963, La naissance de l'intelligence chez l'enfant, p 187 17 sémiotique. Désormais, l'enfant ne passe plus par l'action mais par la réflexion pour résoudre un problème. On parle de conduite insight . Il y a intériorisation des tâtonnements et des combinaisons, ce qui témoigne d'un début de représentation mentale. Le sujet se détache de l'action et permet aux schèmes de fonctionner indépendamment de la perception immédiate. L'accommodation devient représentative et l'assimilation structure les schèmes et les coordonne sous forme de combinaisons mentales. Il y a une décentration progressive tout au long de ce premier stade. Tout au début, l'enfant est dans un état de confusion totale car il ne possède que des réflexes héréditaires. La prise de contact avec le monde l'amène à développer des habitudes puis des intentions, des moyens nouveaux et enfin des combinaisons mentales. L'enfant se construit lui-même en tant que sujet petit à petit. Il prend conscience d'être une personne, et donc d'être différencié du monde qui l'entoure. Et plus le monde devient cohérent, plus lui-même devient cohérent. L'intelligence des deux premières années se construit avant tout sur la base des activités sensorielles et motrices mais un début de pensée intervient dès la deuxième année : construction des pré-représentations. 1. 3. 2. Le stade pré-opératoire : de 2 ans à 7 ans L'enfant reconstruit toutes ses acquisitions sensori-motrices sur le plan de la représentation. Il voit mentalement ce qu'il évoque mais sa pensée se limite à des tableaux perceptifs qui correspondent à des situations vécues personnellement. De ce fait, cette période est caractérisée par l'égocentrisme intellectuel. A ce stade, la pensée est plus mobile mais n'est pas encore réversible. L'apparition de la fonction symbolique ou sémiotique (de 2 ans à 4 ans) On appellera fonction symbolique la capacité d'évoquer des objets ou situations non perçus actuellement, en se servant de signes ou de symboles 6. Autrement dit, c'est la capacité d'évoquer des signifiés à l'aide de signifiants. La pensée sémiotique détache la pensée de 6 DOLLE J-M. , 1999, Pour comprendre Jean Piaget, p 148 18 l'action et crée la représentation. La capacité évocatrice renvoie à la fonction symbolique ; les moyens, ce sont le langage, l'imitation différée, l'image mentale, le dessin, le jeu symbolique 7 : L'imitation différée : L'imitation constitue tout à la fois la préfiguration sensori-motrice de la représentation et par conséquent, le terme de passage entre le niveau sensori-moteur et celui des conduites proprement représentatives 8. En d'autres termes, l'imitation différée requiert une représentation mentale préalable de l'action et permet ainsi une dissociation par rapport à celle-ci. L'image mentale : Les images mentales résultent d'une imitation intériorisée de l'objet réel mais elles ne s'élaborent qu'en l'absence de l'objet par reproduction intériorisée. Elles correspondent à des représentations mentales d'objets ou d'événements que l'enfant évoque et forme en pensée. Les premières images mentales sont statiques, elles ne peuvent pas représenter le mouvement. Le jeu symbolique : Dans le jeu symbolique, l'enfant s'intéresse aux réalités symbolisées. Les jeux symboliques qui supposent la représentation mentale, ajoutent à l'exercice un élément structural nouveau qui est le symbole grâce à cette capacité de représenter par des gestes une série de réalités non actuelles, absentes et non données dans le champ perceptif 9. Par exemple, lorsque l'enfant fait semblant de dormir, il constitue un schème symbolique qu'il s'applique et qu'il inclut dans son jeu. Il est dans un jeu de faire semblant, de faire comme si . Le dessin : Le dessin est une forme de la fonction sémiotique qui s'inscrit à mi-chemin entre le jeu symbolique, dont il présente le même plaisir fonctionnel et le même autotélisme10 et l'image mentale avec laquelle il partage l'effet d'imitation du réel 11. Le langage : A ce stade, le langage correspond à une réalité propre à l'enfant. Le mot ne représente pas 7 Idem 8 DOLLE J-M. , 1999, Pour comprendre Jean Piaget, p 151 9 BRIN F. & coll. , 2004, p 130 10 Autotélisme : désigne une activité qui n'est entreprise sans autre but qu'elle-même 11 PIAGET J. , INHELDER B. , 1966, Psychologie de l'enfant, p 48 19 encore un concept. Il est donc dans une période d'égocentrisme intellectuel. Le monde est représenté par des images en rapport avec les expériences personnelles mais qui n'entretiennent pas de liens entre elles. Les mots utilisés ont leur correspondants imagés, vus en même temps qu'ils sont prononcés. Le langage n'a pas la même valeur que chez l'adulte, il ne lui permet d'évoquer que des réalités particulières. La représentation est symbolique : le signifiant est un symbole et non pas encore un signe. Les organisations représentatives fondées sur des configurations statiques (de 4 ans à 5 ans ) Vers quatre ans, l'enfant devient capable de s'expliquer. Cependant, il a tendance à privilégier son point de vue sur celui des autres et à privilégier son point de vue actuel sur les autres points de vue possibles. Penser de manière égocentrique a des conséquences sur le raisonnement de l'enfant. Il ne prend en considération que les configurations, les apparences perceptives statiques et pas les transformations. L'aspect figuratif domine ici. L'enfant ne peut pas mettre en relation, coordonner les informations perceptives. Il ne procède que par schémas globaux et subjectifs. Il ne dispose que de pré-concepts qui sont basés sur une pensée symbolique, intuitive ; soit une forme de connaissance immédiate qui ne recourt pas encore à l'analyse. Les représentations articulées par régulation (de 5 ans à 7 ans) Lors de ce sous-stade, une décentration et une régulation des représentations va s'opérer. L'enfant essaie d'analyser ce qu'il voit. La pensée reste dominée par l'intuition perceptive mais elle est maintenant plus mobile et articulée et non plus globale puisqu'elle est capable d'analyser les rapports et de coordonner les éléments perceptifs pour aboutir aux opérations réversibles. Lors de la résolution d'un problème, l'enfant procède par essai-erreur. Il est capable de rétroaction et d'anticipation tout en sachant que ces capacités restent limitées car il n'a pas encore de vue d'ensemble des démarches à accomplir. Cela prépare à la réversibilité qui est propre aux opérations. 1. 3. 3. La stade opératoire concret : de 7 ans à 11 ans A ce stade, l'enfant dépasse sa vision figurative du réel et entrevoit celui-ci sous un aspect 20 opératif, autrement dit, sous un aspect qui a trait aux transformations qu'il exerce sur les objets. L'enfant ne se contente plus d'observer les états du réel mais tient compte des transformations. L'appréhension du résultat final est donc basée sur des étapes logiques, sur une démarche opératoire et donc des certitudes. Ces deux aspects de la connaissance sont nécessairement liés et indispensables, même si l'on observe une prédominance de l'aspect opératif sur l'aspect figuratif de la connaissance. RAMOZZI-CHIAROTTINO écrit : Les sujets qui développent de façon exclusive les procédés figuratifs de la connaissance sont enfermés dans le constat empirique, ne construisent pas l'espace, le temps, la causalité [], n'anticipent pas les transformations du réel et sont, dans le pire des cas, sans projets, capables de demeurer dans une rêvasserie indéfinie. De tels sujets peuvent paratre actifs, surtout s'ils sont agités ; mais cette activité-là, totalement désordonnée, est sans finalité ni matrise. [] Contraints à la passivité, par impuissance, ils subissent le réel, se contentant de l'enregistrer sans plus 12. 1. 3. 4. Le stade opératoire formel : à partir de 11 ans L'enfant se libère du concret et accède à l'abstraction. Il devient capable de formuler des hypothèses et de déduire des solutions : il utilise un raisonnement hypothético-déductif. Celui-ci permet à l'individu de s'inscrire dans des situations plus complexes, dans lesquelles l'anticipation et l'analyse sont indispensables. 2. Liens entre pensée et langage 2. 1. Développement du langage PIAGET a décrit le rapport existant entre pensée et langage, rapport qui a été approfondi, entre autres, par RAMOZZI-CHIAROTTINO. Ainsi, elle écrit : l'enfant, pour acquérir la capacité de se représenter le monde par des 12 RAMOZZI CHIAROTTINO Z. , 1990, De la théorie de Piaget à ses applications 21 images, passera par une nouvelle et lente évolution structurale qui reproduira, sur le nouveau plan des représentations, ce qu'il a réalisé et organisé dans le domaine sensori-moteur 13. Elle poursuit en disant : c'est à ce moment et seulement à partir de ce moment que le langage devient possible et que la parole ou le signe collectif permet d'évoquer les schèmes jusqu'ici simplement pratiques 14. Le développement du langage se fait donc en parallèle du développement cognitif. Lorsque l'enfant s'est approprié le monde par ses expériences, il peut s'approprier le langage avec toutes ses fonctions et tous ses possibles et ceci parce qu'il aura eu, à un moment ou à un autre, besoin de signifier les transformations qu'il a observées lors de ses expériences. Il accède donc à la sémiotisation. Cette fonction sémiotique consiste à distinguer les signifiants des signifiés, de telle manière que les premiers permettent l'évocation et la représentation des seconds. L'émergence du discours implique nécessairement la représentation et ici, elle commence comme reconstitution ou évocation de l'action. Le mécanisme d'abstraction est alors lancé. Après avoir été dénominatif et collé au réel, le langage de l'enfant prend une fonction objectivante sur le réel. Il s'en détache et crée un lien entre ce dernier et le mental. Il pourra alors se référer au passé mais aussi imaginer, prévoir, anticipé. Lorsque l'objet n'est pas différencié du geste, le langage de l'enfant est plutôt du type démonstratif puis, au fur et à mesure, on observe l'imitation non différée et l'imitation différée dans le geste et dans le langage. L'enfant, qui en est à expérimenter des schèmes de type action-effet présente conséquemment un langage qui se situe dans l'immédiateté. Il est donc difficile pour lui d'anticiper ou de rétroagir physiquement et mentalement et donc la constitution de son langage s'en ressent : les temps et les liens logiques sont mal matrisés par exemple. De plus, en développant sa connaissance du monde et des effets que ses actions peuvent avoir sur lui, l'enfant prend conscience du pouvoir que son langage peut exercer de la même façon. En exerçant sa pensée, l'enfant met en place un système d'organisation mentale et lorsqu'il est capable d'organiser ainsi sa pensée, il devient apte à organiser son langage mentalement. Selon FLORIN, comprendre le sens des mots implique la capacité de découper le monde en unités et de catégoriser 15 et elle reconnat que l'activité d'extraire des régularités est nécessaire à la 13 RAMOZZI CHIAROTTINO Z. , 1990, De la théorie de Piaget à ses applications, p 107 14 RAMOZZI CHIAROTTINO Z. , 1990, De la théorie de Piaget à ses applications, p 108 15 FLORIN, ! 1999), cité par MOREL L. , Les approches thérapeutiques en orthophonie, tome 1, p 164 22 construction de certains aspects du langage 16. Notre manière d'organiser le réel, structuré et perçu dans l'action, amène le langage à s'organiser lui aussi d'une certaine manière. Il est donc intéressant de se pencher sur le choix des mots et leur combinaison car cela [permet] d'appréhender o [les enfants] en sont dans leur activité cognitive et dans leur nécessité d'exprimer ce qu'ils comprennent du monde 17. Enfin, à la suite de BERNARDI, MOREL considère que les échecs, les retards graves de la conquête et de l'application du système des lois régissant la réalité linguistique ont un rapport avec la conquête et l'application des lois régissant la réalité physique. Les difficultés d'abstraire les lois régissant la réalité physique résultent d'un défaut de constitution des invariants fondamentaux et de mises en relation des objets les uns avec les autres. Ainsi, considérer les troubles du langage comme révélant des difficultés dans la construction de liens dans la pensée, c'est accorder une fonction essentielle à la capacité de construire des activités signifiantes au sens de coordinations entre actions en tenant compte des propriétés des objets ou de situations sur lesquels portent ces actions. Autrement dit, c'est analyser les conduites de l'enfant sous l'angle de son activité de sémiotisation . 2. 1. 1. Langage et lexique De nombreuses études menées durant ces dernières décennies ont largement prouvé que l'émergence du langage prend appui sur la mise en place d'un faisceau de capacités cognitives sans lesquelles l'acquisition lexicale ne pourrait se développer. Les travaux de GOPNIK et MELTZOFF (1987) ont trouvé une corrélation étroite entre l'émergence de la catégorisation [] et l'explosion du vocabulaire, ou de la dénomination 18. Plus précisément, BROWN (1973) et BLOOM (1973) considèrent que, pour acquérir les noms des objets, l'enfant doit avoir atteint le sous-stade VI de l'intelligence sensori-motrice et de la permanence de l'objet, soit entre 18 et 24 mois. L'enfant doit au préalable bâtir des représentations 16 Idem 17 MOREL, 2007, Rééducation orthophonique, n 231, p 256. 18 KAIL M. , FAYOL M. , 2000, L'acquisition du langage, le langage en émergence de la naissance à trois ans, Tome 1, p 158 23 mentales stables des objets et des relations qu'ils entretiennent entre eux et avec le monde environnant pour construire des relations de significations et saisir la nature de cette relation qui lie les signifiants langagiers à leurs signifiés19. 2. 1. 2. Langage et morphosyntaxe NELSON (1993) s'appuie sur une approche constructiviste pour expliquer de quelle façon et sur quels outils cognitifs l'enfant s'approprie les règles morphosyntaxiques de sa langue. Cette étude est fondée sur la notion de schèmes d'évènements . Selon elle, l'enfant pré-linguistique construit à partir de son expérience du monde, des représentations organisées autour des évènements importants et fréquemment répétés qui constituent sa vie quotidienne. Ces schèmes d'évènements sont des représentations mentales globales constituées de séquences d'actions mais aussi d'acteurs et d'objets intégrés aux séquences d'actions 20. L'objet est donc dans un premier temps contextualisé, c'est-à-dire que sa signification n'est pas autonome et dépend d'un contexte social et spatio-temporel connu. Ce n'est que dans un second temps, durant la deuxième année, que l'enfant devient capable d'analyser ces représentations d'évènements et d'individualiser les personnes, les objets, les actions et les relations qui les composent. Ce n'est donc qu'à partir de ce moment, sous-stade VI de l'intelligence sensori-motrice, que l'enfant accède aux natures grammaticales et aux flexions des mots. Il doit être capable de se représenter les choses en leur absence et de les savoir cause ou effet pour utiliser les différents temps verbaux par exemple. Ou encore, il doit pouvoir se situer par rapport aux objets et matriser les relations qu'ils entretiennent entre eux pour pouvoir manier les accords et les fonctions des mots. O'GRADY (1987) a établi un ordre et un rythme d'acquisition des différentes catégories de mots. Selon lui, les noms apparaissent en premier lieu, car ils sont pour la plupart des éléments primaires qui ont une autonomie de sens et de fonction. Viennent ensuite les prédicats (adjectifs) et enfin les mots de fonction, mots grammaticaux. Un certain stock de mots de contenu est 19 Ibidem 20 KAIL M. , FAYOL M. , 2000, L'acquisition du langage, le langage en émergence de la naissance à trois ans, Tome 1, p 156 24 nécessaire pour que les mots de fonction, hautement relationnels, puissent se développer 21. Toutefois, même si les premières catégories de mots émergent vers deux ans, la morphosyntaxe poursuit sa construction durant de nombreuses années. 2. 2. L'investigation du rapport aux objets Dans son rapport aux objets, l'enfant nous montre dans ses actions et son langage ce qu'il comprend du monde environnant. L'investigation du rapport aux objets est donc au centre du lien entre pensée et langage. Les travaux de MOREL22 permettent d'analyser les conduites d'actions et langagières obtenues suite à un recueil de données en situation de jeu : Juxtaposition d'actions ; Les conduites d'actions : Actions simples ; Actions simples réitérées ; Différenciation d'actions selon les objets ; Différenciation d'objets en fonction d'anticipation du résultat ; Exploration de relations endroit/envers, faire/défaire et alternance actif/passif ; Succession d'actions dirigées vers un but ; Conduites d'outil ; Organisation d'actions et organisation d'objets ; Faire-semblant ; Projet de jeu et jeu symbolique. Imitation différée ; Le langage : Moment d'énonciation : avant, pendant ou après l'action ; 21 KAIL M. , FAYOL M. , 2000, L'acquisition du langage, le langage en émergence de la naissance à trois ans, Tome 1, p 147 22 MOREL L. , membre Cogi'act, travaux cliniques Premiers raisonnements et émergence du langage . 25 Avec regard dirigé vers l'adulte ; Décentration ; Fonction de dénomination, de désignation, de commentaire ou d'explication de son action ; Fonction de lien entre son expérience et ses connaissances : causalité, temporalité, signifiants précis ; Une observation et une analyse précise de ces conduites permettent de connatre l'enfant sous l'angle de son développement cognitif et langagier, et ainsi le situer dans son rapport aux objets. Ainsi, nous prendrons appui sur ces travaux pour établir notre grille d'observation et analyser les conduites des enfants diagnostiqués dysphasiques retenus dans notre recherche. 26 II. LA DYSPHASIE Quelques notions concernant cette pathologie nous permettront d'entrevoir les profils particuliers des enfants diagnostiqués dysphasiques composant notre population d'étude. 1. Terminologie De nombreuses terminologies se sont succédé pour décrire les troubles sévères et durables du développement du langage apparaissant chez des enfants sans autre pathologie primaire reconnue. De dysphasie développementale à aphasie congénitale , nous avons plus récemment vu apparatre les termes de Trouble Spécifique du Langage Oral (TSLO) ou Specific Language Impairment (SLI) dans la littérature scientifique internationale. Toutefois, le terme anglo-saxon de SLI recouvre les troubles du langage de l'enfant, sans faire de distinction entre le retard simple de parole et de langage et la dysphasie. Le terme de dysphasie reste majoritaire dans le milieu clinique français, c'est pourquoi nous faisons le choix de conserver cette terminologie dans notre travail. 2. Définitions Si depuis quelques années, les interrogations portant sur la dysphasie se sont élargies et enrichies, les recherches n'ont pas abouti à une conception unitaire des dysphasies. Ainsi, les enfants dysphasiques continuent de poser tout une série de questions cliniques, diagnostiques et étiologiques. C'est pour cela qu'il est fondamental de garder une ouverture d'esprit suffisante à des approches théoriques différentes qui ne s'excluent pas forcément pour autant. 27 2. 1. Les troubles du langage par AJURIAGUERRA Le terme de dysphasie a été employé pour la première fois par AJURIAGUERRA et ses collaborateurs en 1965. Ils en donnent la définition suivante : Les désordres présentés par [les] dysphasiques se caractérisent par : un trouble de la réception et de l'analyse du matériel auditivo-verbal ; des désordres dans l'agencement des éléments syntaxiques constituants du récit ; des difficultés dans les mises en relation lexicales ; une homogénéité relative du déficit entre compréhension, réalisation et support sémantique ; une communication essentiellement physionomique avec approximations verbales et utilisation d'apports non-verbaux 23. Ils notent un niveau mental considéré normal ainsi que des capacités sensorielles et phonatoires suffisantes. 2. 2. Définition par exclusion Beaucoup d'auteurs partent d'une définition par exclusion. GERARD (1991) définit la dysphasie comme un déficit durable des performances verbales significatif en regard des normes établies pour l'âge. Cette condition n'est pas liée à : un déficit auditif ; une malformation des organes de la phonation ; une insuffisance intellectuelle ; une lésion cérébrale acquise au cours de l'enfance un trouble envahissant du développement ; une carence grave, affective ou éducative. 24. Toutefois, cette définition par exclusion ne permet pas de situer la frontière entre dysphasie et l'ensemble des troubles de l'acquisition du langage. 23 AJURIAGUERRA in DE WECK G. , ROSAT M-C. , 2003, Troubles dysphasiques. Comment raconter, relater, faire agir à l'âge préscolaire 24 GERARD C-L, 1993, L'enfant dysphasique, p 12 28 2. 3. Définition évolutive Certains auteurs préfèrent alors donner une définition évolutive afin de mieux situer cette frontière. De plus, cette définition évolutive reste en cohérence avec la définition par exclusion, qu'elle précise. Cette définition (MONFORT, 2001) est fondée sur l'idée qui consiste à affirmer que le retard de langage diminue avec le temps et offre de bons résultats à l'intervention langagière : le déficit le plus important s'observerait entre 3 et 4 ans et puis se réduirait progressivement 25. Au contraire, l'enfant dysphasique ne progresserait que très lentement et la différence aux normes de son âge tiendrait plutôt à augmenter. En 1989, VAN HOUT souligne également que chez l'enfant dysphasique, la courbe d'évolution sera irrégulière, avec des taux de croissance faibles et des plafonnements précoces tant pour les aspects expressifs que réceptifs du langage. GERARD (1991) reprend la métaphore qui fait du langage une construction avec un cadre et un contenu. On peut attribuer la dysphasie à l'atteinte du cadre linguistique et le retard simple à l'atteinte du contenu. Cette métaphore fait alors de la dysphasie un trouble structurel, ce qui explique la permanence du déficit, et du retard simple un trouble fonctionnel résultant d'un mauvais remplissage du cadre et susceptible de s'améliorer. CHEVRIE-MULLER différencie, dans ce qu'elle appelle les T. S. D. L (Troubles Spécifiques du Développement du Langage) le retard simple et la dysphasie en relevant trois facteurs communs à toutes les dysphasies et qui n'apparaissent pas dans le retard simple. Il s'agit du caractère durable, de la gravité du trouble et du critère de déviance. Toutefois, des conceptions s'opposent sur ce sujet. Ainsi, il existe pour AJURIAGUERRA un continuum entre un retard de langage et un trouble dysphasique. Pour les auteurs cités en premier lieu, la dysphasie serait la conséquence de la non-mise en place des instruments qui gèrent le code verbal donc un déficit structurel, alors qu'elle serait un trouble d'intégration du langage pour AJURIAGUERRA. 25 MONFORT M. , 2001, L'intervention dans les troubles graves de l'acquisition du langage et les dysphasies développementales, p 56 29 Les caractères durables et sévères de la dysphasies communs à ces définitions peuvent aussi être complétés par le caractère déviant du langage des enfants dysphasiques. 2. 4. Les marqueurs de déviance Le langage de la personne dysphasique serait caractérisé par des déviances particulières que l'on ne rencontrerait à aucun moment dans l'évolution normale du langage. GERARD, inspiré des travaux de BISHOP et RAPIN a retenu six principaux marqueurs de déviance. La présence d'au moins trois de ces marqueurs serait nécessaire pour évoquer le diagnostic de dysphasie : Les troubles de l'évocation lexicale : le sujet cherche ses mots alors qu'ils appartiennent à son lexique interne. Il en résulte une lenteur d'évocation, un manque du mot, des paraphasies sémantiques et phonémiques, des périphrases ou des mots-valise (truc, machin, ). Les troubles de l'encodage syntaxique : l'enfant est incapable d'utiliser les marqueurs morpho-syntaxiques (flexions de genre et de nombre, flexions verbales) et les mots- fonctions. Cette incapacité se traduira par une dyssyntaxie ou un agrammatisme. Les troubles de la compréhension verbale : lorsque ceux-ci ne sont pas liés à une insuffisance lexicale ou à un trouble de la rétention verbale, ils sont caractérisés par l'altération de compréhension et de représentation mentale à partir d'une entrée auditive. L'hypospontanéité verbale : les productions verbales sont très pauvres, souvent réduites à des phrases minimales. Pour parler, la personne dysphasique doit être constamment encouragée par les sollicitations de son entourage. Le trouble de l'informativité : l'impossibilité pour le sujet de donner des informations pertinentes et précises par le seul biais du canal verbal, indépendamment des difficultés d'intelligibilité. 30 La dissociation automatico-volontaire : certains dysphasiques ne peuvent produire certains mots ou structures syntaxiques sur commande ou en situation dirigée, alors qu'en situation spontanée, ces productions sont possibles. Au terme de ces différentes définitions, les dysphasies développementales correspondraient donc à des troubles structurels, spécifiques, déviants et durables, d'o la notion de handicap reliée au diagnostic de dysphasie. L'observation clinique nous amène à constater une grande hétérogénéité au sein des dysphasies, néanmoins, certaines classifications diagnostiques sont proposées. 3. Classifications 3. 1. Classifications internationales La CIM 10 (Classification statistique Internationale des Maladies et des problèmes de santé connexes, 10ème révision) élaborée et mise à jour sous l'égide de l'O. M. S. (Organisation Mondiale de la Santé) parle de troubles spécifiques du développement de la parole et du langage , eux- mêmes classés dans les troubles du développement psychologique . Sont entre autres inclus dans ces troubles spécifiques du développement de la parole et du langage : Le trouble spécifique d'acquisition de l'articulation ; Le trouble de l'acquisition du langage, de type expressif ; Le trouble de l'acquisition du langage, de type réceptif. Le DSM IV-R (Manuel diagnostique et statistique des troubles mentaux réalisé par l'American Psychiatric Association) regroupe sous la rubrique troubles de la communication : Le trouble du langage de type expressif ; Le trouble du langage de type mixte réceptif-expressif ; Le trouble phonologique. Enfin, dans la CFTMEA R-2000 (Classification Française des Troubles Mentaux de l'Enfant et l'Adolescent), les dysphasies sont situées dans les troubles du développement et des fonctions instrumentales et plus particulièrement dans les troubles du développement du 31 langage en les distinguant des retards de parole et des retards (simples) de langage. Cette classification parle aussi de troubles du raisonnement qui correspondent à des perturbations plus ou moins localisées de la pensée et du raisonnement, compatibles avec une efficience intellectuelle satisfaisante, voire élevée, telle qu'elle peut être appréciée par les tests de niveau intellectuel avec des répercussions dans la vie scolaire et dans les situations de la vie courante. On parlera de dysharmonie cognitive et de retard d'organisation du raisonnement. 3. 2. Sémiologie et classification des dysphasies Deux auteurs, en outre, ont proposé une classification des dysphasies : RAPIN, à partir de ses observations cliniques et GERARD à partir d'un modèle anatomo-fonctionnel (modèle de CROSSON). On pourrait d'ailleurs critiquer ce dernier qui a utilisé initialement un modèle adulte, portant sur des personnes ayant déjà construit normalement leur langage, sur lequel il calque le fonctionnement d'un enfant. Cependant, les observations des deux auteurs se recoupent. La classification de GERARD est l'application de celle de RAPIN au modèle de CROSSON. GERARD utilise donc pour sa classification la connaissance des unités anatomo- fonctionnelles en partant d'un modèle neurologique. Il se sert par défaut d'un modèle issu de l'étude des aphasies de l'adulte car il n'existe pas de modèle opératoire, largement accepté, qui rende compte du fonctionnement du langage en voie de maturation 26. Ainsi, en confirmant la classification de RAPIN aux avancées apportées par le modèle de CROSSON, l'auteur français GERARD présente un regroupement de cinq syndromes dysphasiques différents, parfois utilisés lors de l'établissement du diagnostic de dysphasie : Le syndrome phonologique-syntaxique Il s'agit du trouble le plus représenté et correspondrait à une défaillance de la jonction formulation-programmation. Il touche principalement les capacités expressives de l'enfant : discours réduit, mauvaise intelligibilité due à une altération majeure du système phonologique, encodage syntaxique perturbé (agrammatisme), stock lexical restreint. Des 26 GERARD C-L, 1993, L'enfant dysphasique, p 25 32 difficultés pour la programmation motrice sont souvent associées. Le trouble de la production phonologique Il est marqué comme le précédent par des difficultés essentiellement expressives dues à un trouble du contrôle phonologique mais chez des enfants fluents. On note alors des déformations phonologiques massives, des conduites d'approche ou encore un discours plutôt dyssyntaxique. La dysphasie réceptive C'est ici le décodage qui serait en cause. Cela provoque des difficultés de discrimination phonétiques, de segmentation de la chane parlée en unités mots et d'attribution de sens à ces unités linguistiques. La dysphasie mnésique ou lexicale-syntaxique Il s'agirait d'un trouble du contrôle sémantique associé à des difficultés mnésiques. Le discours est marqué par un manque du mot massif, une informativité pauvre, une dyssyntaxie et des difficultés de compréhension. La dysphasie sémantique-pragmatique Nous serions dans le cas d'une atteinte de la fonction de formulation, c'est-à-dire du choix des mots et des structures syntaxiques pour habiller la pensée. On observe essentiellement un trouble de l'informativité et une incohérence du discours. Mais la réalité nous montre qu'il est difficile de classer les enfants dysphasiques dans tel ou tel type préalablement défini. On s'accorde plus communément à parler de dysphasie expressive et de dysphasie réceptive selon les atteintes qui se dégagent chez chaque enfant. 4. Les troubles associés Bien qu'on parle de trouble spécifique du langage oral pour la dysphasie, il est important de noter les difficultés et les troubles rencontrés dans d'autres domaines. Nous avons réuni ici les données les plus fréquemment mentionnées par la recherche. 33 4. 1. Aspects perceptifs Difficultés dans la discrimination de stimuli auditifs (TALLAL et al. 1973 et 1981) ; Temps de latence plus long (TALLAL et al. 1988, VISTO et al. 1996) ; Troubles du décodage, de la perception des phonèmes non-isolés avec incapacité à classer les sons ainsi qu'à stocker et restituer les signes verbaux (EISENNSON 1972). 4. 2. Aspects comportementaux Troubles de l'attention, hyperactivité (EISENSON 1972, GASCON et coll. 1986, NETTELBLADT 1989) ; Troubles des relations affectives et du contrôle des émotions ou difficultés dans l'organisation de la personnalité (AJURIAGUERRA, AIMARD, 1972). 4. 3. Aspects psychomoteurs Difficultés de type praxique (AJURIAGUERRA) ; Troubles de la latéralisation (idem) : Immaturité des habiletés motrices (BISHOP et EDMUNDSEN) 4. 4. Aspects cognitifs Difficultés dans le développement du jeu symbolique (UDWIN et YULE 1983) et d'autres fonctions symboliques non linguistiques (MONTGOMERY 1993) ; Difficultés dans la construction d'images mentales (JOHNSTON et WEISMER 1983, KAHMI et al. 1984) ; Troubles de la structuration de l'espace et du temps (AJURIAGUERRA et AIMARD 1972) : 34 Hétérogénéité des résultats dans l'application des batteries psychométriques (LEBLANC 1982) ; Retard dans la matrise des opérations concrètes pour des tâches de type piagétien (SIEGEL et coll. 1981). Ces difficultés ne sont bien entendu pas toutes présentes chez un même enfant dysphasique. 5. Hypothèses étiologiques A ce jour, l'origine de la dysphasie n'a pas été déterminée mais deux grandes hypothèses étiologiques sont retenues. En effet, la dysphasie est reconnue comme un trouble primaire, soit non consécutif à une cause. 5. 1. Hypothèse neurophysiologique Comme nous l'avons précédemment vu, la définition de la dysphasie exclut l'existence d'une lésion cérébrale acquise au cours de l'enfance. Aucun moyen d'investigation ne l'a remis en cause jusqu'à présent. Toutefois, des techniques comme l'imagerie fonctionnelle ont fourni de nouvelles informations qui suggèrent un trouble de la spécialisation hémisphérique et une asymétrie moindre chez les sujets dysphasiques. Leur cerveau serait organisé différemment de celui d'un individu tout-venant. Mais les études restent encore trop peu nombreuses pour confirmer avec certitude cette organisation cérébrale particulière. 5. 2. Hypothèse génétique Sachant que 23 à 41% des parents d'enfants porteurs de difficultés de langage en sont eux- même porteurs 27, qu'il existe plusieurs cas de troubles sévères chez ces parents et qu'enfin la dysphasie est trois fois plus répandue chez les garçons, de nombreux chercheurs s'intéresse à un 27 SOARES-BOUCAUD I. , LABRUYÈRE N. , JERRY S. , GEORGIEFF N. , 2009, Dysphasies développementales ou troubles spécifiques du développement du langage, p 3 35 éventuel facteur génétique. A l'heure actuelle, plusieurs régions chromosomiques ont été identifiées mais aucun gêne candidat n'a été retenu 28. 6. Le développement cognitif chez les enfants dysphasiques Il est intéressant de reprendre le raisonnement de MONFORT qui souligne la présence de déficits linguistiques et non linguistiques chez l'enfant dysphasique et se demande alors dans quelle mesure les symptômes linguistiques sont spécifiques ou dans quelle mesure sont-ils le résultat d'un ralentissement dans le développement des compétences cognitives, symboliques ou instrumentales plus générales 29. AJURIAGUERRA a été à la tête d'une recherche en 1963 portant sur l'aspect linguistique, le développement mental (capacités intellectuelles, dynamique mentale et capacités opératoires) et l'organisation affective des enfants dysphasiques. Concernant le deuxième point de sa recherche, les résultats ont été les suivants : 70% des sujets atteignent un niveau normal de niveau opératoire global (meilleurs résultats dans les épreuves à contenu manipulatoire) ; Les résultats sont nettement inférieurs pour 58% des sujets et légèrement inférieurs pour 27% pour les épreuves de représentation spatiale et d'anticipation. L'ensemble de leurs résultats montre que la plupart des sujets parviennent à un niveau d'efficience mental normal en dépit de troubles linguistiques et tout en présentant des troubles d'organisation spatiale. Les auteurs en arrivent même à dire que l'intégrité absolue des processus de découpage et d'opposition à un niveau moins élaboré que celui des opérations ne parat pas indispensable à la formation de ces dernières 30. 28 Idem 29 MONFORT M. , 2001, L'intervention dans les troubles graves de l'acquisition du langage et les dysphasies 30 AJURIAGUERRA in BERNARDI M. , 1989, L'enfant dysphasique : le développement cognitif et son cadre. Etude développementales, p 78 psychopathologique 36 Cela voudrait dire qu'il existerait des sauts dans le développement : des opérations complexes pourraient être réalisées alors que d'autres, de niveau inférieur, ne pourraient pas l'être. Cette hypothèse s'oppose aux conceptions de PIAGET sur les stades de développement, sur lesquels nous nous appuyons pour ce travail de recherche. Un rapprochement entre enfants dysphasiques et enfants sourds est parfois fait. OLERON, suite à une étude sur des enfants sourds, conclut que l'absence de langage ne détermine pas de modifications importantes dans le développement de l'intelligence concrète. La première recherche d'AJURIAGUERRA arrive à des résultats proches. Toutefois, les résultats évolutifs ne semblent pas aller pleinement dans le sens du développement cognitif normal : la dysphasie entrane des difficultés dans l'organisation de la sphère cognitive, certainement différente de celle de l'enfant normal ainsi qu'un manque de mobilité mentale 31. Comme BERNARDI le commente dans sa thèse : si l'étiologie des considérables difficultés de développement de langage de l'enfant sourd sévère ou profond est le trouble sensoriel, l'étiologie des troubles d'intégration du langage est tout à fait incertaine et peut renvoyer à des troubles du développement dont l'aspect langagier occulterait les troubles portant sur d'autres aspects du développement 32. Il pose aussi l'hypothèse d'une co-présence des troubles profonds du langage et de retards notables du développement opératoire. Cette hypothèse appuierait le développement des articulations langagières sur une organisation des actions sur le monde et sur l'émergence de représentations. Arrivé à 6-7 ans, l'enfant dysphasique est souvent là en grande difficulté [] pour s'approprier des modes de pensée et d'action qui élargissent son univers, notamment s'ils sont liées avec l'esprit ludique et l'imaginaire 33. Pour LEVI-PIPERNO, les enfants dysphasiques rencontrent trois types de problèmes : la difficulté de l'acquisition de l'instrument linguistique et de ses règles de fonctionnement ; mais aussi, dans la connaissance du monde et l'action exercée sur lui, des difficultés d'intégration et d'utilisation du langage comme instrument cognitif parmi p 91 31 AJURIAGUERRA in BERNARDI M. , 1989, L'enfant dysphasique : le développement cognitif et son cadre. Etude, 32 BERNARDI M. , 1989, L'enfant dysphasique : le développement cognitif et son cadre. Etude psychopathologique 33 Ibidem, p 22 37 d'autres ; mais encore, dans la relation aux autres et à soi-même, une difficulté pour développer la communication verbale et pour exprimer par son intermédiaire le vécu. 34 La construction de certains fonctionnements cognitifs est donc mise en doute. DE TROGOFF35, qui s'appuie sur les travaux de BERNARDI, conclut dans son mémoire que les enfants dysphasiques ont des difficultés à mentaliser les actions et à élaborer des images de transformations et ressentent alors le besoin de manipuler. Ils ont aussi des difficultés dans l'élaboration des invariants. Ces enfants ne parviennent pas à se représenter l'objet concret comme extérieur à eux et comme support d'activité de pensée. L'évolution des enfants dysphasiques semble donc ne pas aller dans le sens d'un développement cognitif normal. 34 LEVI-PIPERNO in BERNARDI M. , 1989, L'enfant dysphasique : le développement cognitif et son cadre. Etude psychopathologique, p 60 35 DE TROGOFF J. , 2002, Exploration des conduites d'enfants dysphasiques au travers d'activités de langage et d'activités de raisonnement logique 38 III. PROBLÉMATIQUE ET HYPOTHÈSES Grâce à l'éclairage apporté par les fondements théoriques qui ont été retenus pour ce travail, nous avons pu établir des liens entre développement cognitif, langagier et dysphasie. Si nous considérons : D'une part, que l'enfant construit progressivement le réel, et donc sa pensée, par l'exploration des objets, de ses actions, des relations qu'entretiennent les objets entre eux ainsi qu'entre les notions spatiales, temporelles et causales. Il se construit progressivement du connu et grâce à cela ses propres représentations mentales des objets et des actions, puis son langage, outil de pensée. D'autre part, que les enfants dysphasiques rencontrent, en plus de leurs difficultés langagières, des difficultés dans leur développement cognitif, en particulier dans leur connaissance du monde, les représentations et les anticipations et ressentent le besoin de manipuler. Nous considérons pertinent d'explorer le rapport que ces sujets entretiennent aux objets. Nous nous interrogerons tout à la fois sur la capacité des enfants diagnostiqués dysphasiques à coordonner leurs actions, symboliser avec des objets et utiliser des mots pour rendre compte et représenter. 39 Nos hypothèses de travail sont les suivantes : Les enfants dysphasiques rencontrent des difficultés dans les mises en relation entre les objets et l'organisation des actions. Les conduites ludiques des enfants diagnostiqués dysphasiques sont en décalage avec leur âge. Les enfants diagnostiqués dysphasiques rencontrent des difficultés d'accès au jeu symbolique. Les enfants diagnostiqués dysphasiques emploient majoritairement un langage descriptif, qui ne marque pas les mises en relation, qui ne fait pas le lien entre expériences et connaissances. Le niveau de langage des enfants diagnostiqués dysphasiques est en lien avec leurs conduites d'actions. Le rapport aux objets, sous l'angle des conduites ludiques et langagières, est très différent entre enfants diagnostiqués dysphasiques et enfants tout-venant. 40 PARTIE EXPÉRIMENTALE 41 IV. DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL 1. Présentation de la population d'étude Notre population d'étude se compose de dix enfants diagnostiqués dysphasiques ou porteurs d'un trouble spécifique du langage oral (TSLO) et sont âgés de 7 ans et 1 mois à 12 ans et 6 mois. Le diagnostic de dysphasie ou de TSLO a été posé par différents centres référents suite à un bilan pluridisciplinaire. Sept de ces enfants sont suivis en milieu spécialisé, au sein d'un IME (Institut Médico- Educatif), et ainsi pris en charge par une équipe pluridisciplinaire. Deux enfants sont scolarisés en CLIS TSL (Classe d'Intégration Scolaire Troubles Spécifiques du Langage). Et un enfant est scolarisé en milieu ordinaire, sans aide particulière. Tous bénéficient d'une prise en charge orthophonique depuis plusieurs années et à raison de deux à quatre séances par semaine cette année scolaire. Nous avons pu rencontrer ces enfants trois séances, espacées sur six à huit semaines au cours des mois de décembre 2010 à mars 2011. Chaque première rencontre avec l'enfant a eu lieu en présence de l'orthophoniste de l'enfant, ce qui n'a pas toujours été possible pour les séances suivantes. Trois enfants tout-venant âgés de 7 ans et 3 mois à 10 ans et 10 mois forment notre population contrôle. Ces enfants n'ont jamais eu de suivi orthophonique et présentent un développement global ordinaire. Les ateliers ont été réalisés en une ou deux fois, au cours des mois de janvier à février 2011. Afin de conserver l'anonymat des enfants, tous les prénoms cités dans ce mémoire ont été modifiés. 42 2. Déroulement des ateliers 2. 1. Les lieux Avec les enfants diagnostiqués dysphasiques, les différents ateliers se sont déroulés dans le bureau de l'orthophoniste connu de l'enfant ou dans une salle de l'établissement mise à disposition pour nos ateliers. Nous avons pu rencontrer les enfants tout-venant à leur domicile et les séances ont eu lieu dans leur chambre ou dans le salon et de façon duelle. Le matériel plus ou moins important présent dans les pièces n'a pas semblé gêner ou distraire la majorité des enfants. Le cas contraire, cela sera indiqué dans les analyses individuelles. 2. 2. La durée Des créneaux de 30 à 45 minutes ont été libérés pour chaque séance, avec chacun des enfants diagnostiqués dysphasiques. L'enfant pouvait décider de la fin de la séance s'il l'exprimait, comme cela a été parfois le cas. Un temps global d'1h à 1h30 a été nécessaire pour réaliser les quatre ateliers avec les enfants de la population contrôle. 2. 3. Le recueil des observations Nous avons pu obtenir l'autorisation de filmer pour douze enfants sur les treize. La présence de la caméra n'a pas paru déranger les enfants ou changer leur comportement. Nous leur avons proposé en début de séance de regarder une partie du film à la fin s'ils le désiraient mais tous n'en ont pas fait la demande. Des analyses détaillées et riches des conduites ludiques et langagières36 des enfants ont pu être possibles à partir du support vidéo. Des grilles d'observation37 ont été ensuite réalisées avec 36 MOREL L. , membre Cogi'act, travaux cliniques Premiers raisonnements et émergence du langage , partie théorique, p 25 37 Annexes 1, p II 43 Madame Lydie MOREL et Madame Cécile JARNAUD. Nous avons conscience que toute lecture est une interprétation à un moment donné. 2. 4. Notre positionnement Nous avons choisi de nous positionner en tant qu'observateur le plus neutre possible. Nous voulons que l'enfant se sente libre de ses explorations, de ses actions en se positionnant ainsi. Par notre attitude bienveillante, nous apportons un cadre o l'enfant peut alors s'exprimer avec ses mains et avec ses mots sans qu'il ne sente une certaine attente de notre part. Si nous sentons que l'enfant pense que nous sommes dans une attente particulière ou qu'il semble vouloir nous faire plaisir en faisant telle ou telle chose, nous pourrons intervenir pour lui signaler qu'il n'y a pas de bonne ou de mauvaise réponse, que [nous voulons] juste [le] voir jouer Nous reconnaissons les conduites de l'enfant, qui cherche parfois notre regard d'adulte et d'interlocuteur. Cette reconnaissance peut se faire aussi par des mots ; nous parlerons alors d'une mise en sens. Mais nous essayons le moins possible d'intervenir verbalement pour ne pas influencer l'enfant d'une quelconque manière. Nous laissons l'enfant libre de ses manipulations mais nous nous devons d'autant plus vigilants dans nos observations de conduites : gestes, mimiques, énoncés. Lorsque nous sentons l'enfant en difficulté pour réaliser quelque chose ou lorsqu'il en fait lui-même la demande, nous sommes bien entendu au service de l'enfant pour l'aider. Cette aide peut être simplement se rapprocher de l'enfant pour qu'il se sente accompagné dans son exploration ou construction. Pour certains enfants, le fait d'être observateur extérieur rend semble-t-il la situation trop artificielle ou plus difficile à supporter. Par conséquent, nous nous sommes adaptés à chaque enfant pour que la situation reste naturelle. Nous sommes là pour le rassurer et l'encourager. Une aide manuelle peut également être apportée. Nous demandons alors à l'enfant de nous expliquer ce que nous devons faire. 44 3. Présentation des ateliers Les ateliers ont été choisis afin de favoriser chez le sujet un intérêt prolongé qui l'engage à mener la résolution à son terme et il est important que la tâche favorise les activités cognitives et leur exercice, fasse appel à l'imagination et à l'inventivité du sujet, qui doit éprouver le besoin de réussir 38. Les ateliers présentent donc des difficultés réelles mais assimilables par l'enfant ainsi que des situations assez riches et ouvertes pour permettre l'application de schèmes variés. 3. 1. Atelier 1 : Oeufs gigognes 3. 1. 1. Matériel Le matériel de cette épreuve initiale est constitué de six œufs gigognes 39 Cogilud , soit un ensemble de six encastrements dont les deux moitiés sont identiques. En effet, tous les œufs sont de la même couleur pour qu'il n'y ait aucune information induite et de rapprochement par la couleur. Les œufs seront identités de la façon suivante : de O1 pour le plus petit à O6 pour le plus grand. 3. 1. 2. Objectifs Les objectifs de cette épreuve sont d'observer les conduites de mise en relation avec un matériel contraint mais aussi l'organisation des actions, la capacité d'anticipation et de réversibilité. 3. 1. 3. Déroulement et consignes Nous présentons les douze éléments à l'enfant avec comme consigne : Qu'est-ce que tu peux faire avec ça ? . L'enfant peut alors manipuler les différents éléments, faire des correspondances terme à terme ou encore former un ou plusieurs oeufs par exemple. Nous attendons que l'enfant forme les six œufs. 38 INHELDER B. et CELLERIER G. , 1992, Le cheminement des découvertes de l'enfant, p 25 39 Annexe 2, p V 45 Lorsque les six encastrements sont obtenus, nous défaisons le tout pour revenir à la situation initiale avec les douze éléments. La consigne est alors la suivante : Maintenant, j'aimerais voir cinq œufs / Débrouille-toi pour en voir cinq . Si l'enfant n'y parvient pas, nous lui demandons de se tourner et nous réalisons les cinq œufs. Nous montrons le résultat à l'enfant, puis il se retourne à nouveau et nous remettons les douze éléments de départ pour qu'il réalise à son tour les cinq œufs. Nous poursuivons l'épreuve en lui demandant : Maintenant, débrouille-toi pour en voir quatre / J'aimerais voir quatre œufs . Puis trois, deux et un. 3. 2. Atelier 2 : Parcours de billes 3. 2. 1. Matériel Un parcours de billes 40, type Tobobilles est proposé aux enfants lors de cet atelier. Différents éléments composent ce matériel : des éléments droits de différentes couleurs ; des éléments arrondis de différentes couleurs ; des éléments escaliers de différentes couleurs ; des tuyaux de différentes tailles et couleurs ; des réceptacles qu'on appellera bases de différentes couleurs ; des pieds de différentes couleurs ; un entonnoir bleu ; des billes. D'autres éléments sont aussi présents dans le matériel mais appartiennent à un autre parcours de billes donc ces éléments s'assemblent entre eux mais ne peuvent pas l'être avec les précédents : trois éléments droits jaunes ; un élément zigzag rouge ; un petit élément arrondi bleu ; un pied bleu. 40 Annexes 3, p VI 46 3. 2. 2. Objectifs Au cours de cet atelier, nous observerons les conduites de mise en relation des objets, l'organisation des actions, le langage utilisé par l'enfant. Notons ici que la réussite est plus précoce que la conceptualisation, la compréhension, qui ensuite finissent par guider la réussite 41. Un enfant peut réussir à construire un parcours sans avoir procédé par des conduites de mise en relations d'objets mais seulement par simples juxtapositions. Nous serons attentifs à cela, ainsi qu'à l'anticipation et à l'élaboration à partir d'un résultat, réussi ou non. En effet, une erreur corrigée peut être plus féconde qu'une réussite immédiate car elle apporte des connaissances. Cette conduite de réussite sans compréhension concerne tous les ateliers mais elle sera bien plus visible avec ce matériel. 3. 2. 3. Déroulement et consigne Nous proposons à l'enfant de se mettre par terre pour cet atelier et lui donnons tout le matériel avec comme consigne : Est-ce que tu pourrais construire un parcours de billes ? / J'aimerais que tu construises un parcours pour les billes . Au cours de l'atelier, nous pouvons lui rappeler que la bille doit passer partout , c'est-à- dire dans les différents éléments du parcours. 3. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques 3. 3. 1. Matériel Le choix du matériel est inspiré de celui présenté dans Les bébés et les choses42 et a été complété. Ce matériel est appelé non-symbolique ou non-signifiant car il ne nécessite pas de la part de l'enfant une symbolisation permettant de reconnatre leurs fonctions. Ces objets n'appellent pas une mise en lien avec des objets plus usuels, connus de l'enfant dans la vie quotidienne. 41 INHELDER B. et CELLERIER G. , 1992, Le cheminement des découvertes de l'enfant, p 37 42 SINCLAIR B. , STAMBAK M. , LEZINE I. , RAYNA S. , VERBA M. , 1982, Les bébés et les choses ou la créativité du développement cognitif, p 22 47 Le matériel est le suivant43 : 6 pics en bois ; plusieurs poignées de chips en polystyrène (avec ou sans trous) ; 3 grillages souples de tailles différentes ; 3 tubes en carton de différents diamètres et longueurs ; 1 rouleau de ficelle ; 2 rouleaux de ruban cadeau / bolduc ; 6 fils de fer entourés de tissu ; 6 élastiques ; 4 morceaux de carton de tailles différentes ; 6 pinces à linge ; 2 boules de pâte à modeler de couleurs différentes ; 4 gobelets gigognes ; coton ; 3 morceaux de tissu blanc ; 2 feuilles de journal ; 10 bâtonnets en bois de différentes longueurs ; 2 paires de ciseaux (gaucher et droitier) ; 1 rouleau de scotch. 3. 3. 2. Objectifs L'objectif de cet atelier est d'observer, par la manipulation libre de matériel non-signifiant, les préoccupations cognitives actuelles des enfants : intérêt pour les aspects logiques, physiques ou symboliques des objets, par des actions simples juxtaposées jusqu'à des organisations d'actions. Nous observerons donc les conduites ludiques mais aussi langagières de l'enfant durant cet atelier. 43 Annexe 4, p VIII 48 3. 3. 3. Déroulement et consigne Le matériel sera présenté dans une bote mise à disposition au sol devant l'enfant. La consigne donnée à l'enfant sera la suivante : Je t'ai apporté différents objets. Tu peux faire tout ce que tu veux avec, je veux juste te voir jouer . Si l'enfant n'ose pas sortir le matériel, nous pourrons l'inciter en regardant dans la bote ou en sortant nous-même quelques objets. 3. 4. Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques 3. 4. 1. Matériel La première partie du matériel est composée de la caisse enregistreuse44 FisherPrice . Intéressons-nous plus en détails au fonctionnement de cette caisse enregistreuse. Pour ouvrir le tiroir-caisse, il faut tourner la manivelle située sur le côté droit de la caisse vers l'arrière. Un gling retentit lorsque le tiroir s'ouvre. Trois sortes de pièces sont alors à la disposition de l'enfant : deux rouges, deux orange, deux jaunes. Elles diffèrent également par leur taille. Sur la caisse se trouvent trois encoches correspondant en taille et en couleurs aux pièces. L'enfant peut donc prendre en compte le critère couleur afin d'associer la bonne pièce à la bonne encoche. Un bouton se situe sous chaque encoche, celui-ci permet de faire descendre les pièces à un premier niveau à l'intérieur de la caisse. A ce moment, deux choix s'offrent alors au sujet : appuyer sur le bouton change qui permet de faire descendre les pièces sur le côté de la caisse par le toboggan ou appuyer sur le bouton sale qui permet de faire tomber les pièces dans le tiroir- caisse. La seconde partie du matériel est constituée d'objets symboliques45 : fruits et légumes en plastique ; 1 grand panier bleu ; 2 petits paniers rouges ; 44 Annexe 5, p IX 45 Annexe 5, p IX 49 fausses pièces et faux billets. 3. 4. 2. Objectifs L'objectif premier de cet atelier est d'observer les conduites d'actions avec la caisse enregistreuse : L'enfant met-il du temps à s'approprier le matériel ? Est-il dans une simple succession d'actions sans lien logique ou dans une organisation d'actions ? Anticipe-t-il en actions et en langage ? A-t-il besoin de manipuler ? Le second objectif est d'observer comment l'enfant s'approprie le matériel symbolique et s'il est dans de l'imitation différée, du faire-semblant ou du jeu symbolique. Ce jeu sera lui aussi observé et analysé sous l'angle des conduites ludiques et également langagières. 3. 4. 3. Déroulement et consignes Cet atelier se déroule en deux temps. Nous présentons dans un premier temps la caisse enregistreuse FisherPrice , Après demande auprès de l'enfant, elle sera mise à sa disposition sur une table ou à même le sol, avec comme consigne : Je te donne ça / cette machine, je te laisse regarder et jouer avec . Les pièces seront dans le tiroir-caisse, lui-même fermé. Après un temps d'appropriation du matériel plus ou moins long, nous demanderons à l'enfant de nous expliquer le fonctionnement de la caisse enregistreuse. Dans un second temps, nous introduirons le matériel symbolique tout en laissant la caisse enregistreuse à disposition. Nous donnons le matériel avec pour consigne : Maintenant, je te donne tout ça, tous ces objets, qu'est-ce que tu peux faire avec ? 50 ANALYSES ET INTERPRÉTATIONS 51 Nous allons tout d'abord exposer les passations et analyses individuelles de trois enfants diagnostiqués dysphasiques et d'un enfant de la population contrôle afin de proposer une illustration de nos observations et des profils proposés par la suite. Nous exposerons ensuite les grilles d'observations de l'ensemble des enfants diagnostiqués dysphasiques et tout-venant que nous analyserons de façon globale et croisée, atelier par atelier. Nous présenterons les différents profils obtenus ainsi que les analyses globales des conduites ludiques et langagières. Viendra enfin la partie discussion qui décrira les précautions méthodologiques, validera les hypothèses initiales et fera part des apports de ce mémoire de recherche et des ouvertures possibles pour les recherches futures. 52 V. PASSATIONS ET ANALYSES INDIVIDUELLES Nous allons dans cette partie procéder à l'analyse individuelle de trois enfants diagnostiqués dysphasiques et d'un enfant tout-venant. Les autres analyses individuelles sont proposées en annexes46. Ces quatre analyses ont été retenues afin d'illustrer le décalage des conduites ludiques entre les enfants diagnostiqués dysphasiques et tout-venant ainsi que leur hétérogénéité au sein même de la population pathologique. Après une brève présentation de l'enfant, nous expliquerons le déroulement des différents ateliers et ferons une analyse qualitative de leurs conduites ludiques et langagières. 1. Sylvain, 7 ans et 1 mois Nous rencontrons Sylvain en janvier 2011 lors d'une de ses séances d'orthophonie pour qu'on puisse faire connaissance avant le début des passations. Nous nous sommes revus par la suite à trois reprises au cours des mois de janvier à mars, en présence de son orthophoniste. Le diagnostic de trouble spécifique du langage oral en présence d'un raisonnement non langagier adapté à l'âge a été posé en 2009. Sylvain est suivi en orthophonie depuis septembre 2006 et est scolarisé en CLIS TSL depuis la rentrée de septembre 2010. Le langage de Sylvain est parfois peu intelligible mais toujours très intoné et mélodieux. Son 46 Annexes 6, p X 53 visage est également expressif. Sylvain est un enfant qui initie facilement la conversation et qui ne semble pas timide en notre présence. Cependant, son langage ne nous est pas toujours adressé, des ruptures dans la communication et l'échange seront ressenties à plusieurs reprises. Sylvain peut facilement changer d'activité au cours d'une séance et être attiré par le reste du matériel présent dans la pièce. Il faudra alors que nous redirigions son attention sur les objets mis à sa disposition pour l'atelier. 1. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Lorsque nous présentons les douze éléments à Sylvain, il nous demande pourquoi c'est tout cassé ? et nous dit ensuite on peut réparer . Il assemble un premier œuf : le plus petit. Il continue d'assembler les œufs en introduisant dans le plus grand celui qu'il vient de réunir. Il obtient alors un seul œuf apparent, qui contient les cinq autres œufs. La première consigne est redonnée, Sylvain reproduit la même chose. Nous lui proposons alors de se tourner et nous assemblons à notre tour deux œufs. Sylvain parvient ensuite à assembler les six œufs à partir de cette initiation, en nous demandant à notre tour que nous nous retournions pour ne pas voir ce qu'il fait. Nous donnons alors la deuxième consigne à Sylvain, c'est-à-dire voir cinq œufs . Sylvain rassemble les œufs devant lui sur la table. Un des œufs tombe au sol et se brise en ses deux parties : bah, il a enlevé tout seul ! , comme si l'objet était animé. Amusé et surpris par ce résultat, il cherche alors à le reproduire et le vérifier en jouant avec les œufs sur la table et en les faisant rouler doucement afin qu'ils tombent : I(l) va tomber ! . Il poursuit son jeu et fait glisser tous les œufs dans notre direction : nous parvenons ou non à les rattraper. Sylvain rit beaucoup, tape des mains sur la table et nous dit à la fin a gagné, a gagné ! . Sylvain n'extrait pas les propriétés de mise en relation du matériel car il est concerné par les actions de lancer et tomber . Il réitère ces actions afin de retrouver le résultat qui l'a surpris et intéressé. 54 1. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Sylvain se montre davantage intéressé par le matériel de cet atelier : A plein de jouets ! . Il commence son exploration en assemblant deux éléments arrondis, puis trois autres éléments différents dont l'entonnoir. Il essaie alors de lui-même avec une bille : Wouah, ça descend ! . Sylvain poursuit ses expériences avec le matériel afin de se créer des certitudes quant aux propriétés physiques des différents éléments mis à sa disposition. Il se situe dans un assemblage des éléments car il parvient facilement à fixer ensemble plusieurs éléments. Toutefois, Sylvain demeure dans une juxtaposition d'actions car il persiste dans un enrichissement linéaire sans projet défini et le passage de la bille n'est pas toujours bien anticipé. Sylvain obtient un parcours47 qu'il modifie au cours de l'atelier mais la structure principale reste présente. Il rencontre certaines difficultés avec les billes. En effet, celles-ci restent coincées à plusieurs endroits du parcours et Sylvain met du temps à s'ajuster. Il pousse les billes, les récupère mais n'ajuste pas son parcours. Il se retrouve alors face au même problème. Sylvain fixe un long tuyau au-dessus d'un élément dans son parcours. Nous mettons des billes à l'intérieur du tuyau mais celles-ci restent également bloquées. Une bille est apparente à l'extrémité supérieure : Oh il est bloqué, pas tombé . Sylvain constate la situation, enlève la bille et met son doigt à l'intérieur du tuyau. Il sent alors une autre bille, regarde dans le tuyau puis l'enlève du reste de la structure. Surpris de voir tomber des billes, Sylvain dit : Oh ! Il était plein ! . Tant qu'il n'avait pas vu les billes sortir du tuyau, Sylvain ne comprenait pas pourquoi les billes ne tombaient pas. Il est difficile pour lui d'imaginer ce qu'il ne voit pas, de se créer une image mentale de l'intérieur de tuyau. Par ailleurs, Sylvain porte plusieurs fois à la bouche les billes au cours de l'atelier. Il explore le matériel par son corps. Ces billes se voient également attribuer une fonction animée, tout comme pour les œufs de l'atelier 1, lorsque Sylvain dit : Roule, roule tout seul ou Mais i(l) s'en va ? I(l) s'en va. Pou(r)quoi i(l) s'en va ? . Les propriétés physiques des billes sont mal connues de Sylvain. 47 Annexes 7, p LXXXIV 55 Son langage reste descriptif tout au long de l'atelier. Il constate les résultats de ses actions : Gade (regarde), c'est bloqué , (en)core coincé , ça tombé dedans . Plusieurs fois au cours de l'atelier, Sylvain demande notre aide, tu peux m'aider ? , ou attire notre attention, rega(r)de ! , bien qu'il ne regarde pas dans notre direction lors de ses énoncés. 1. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Sylvain explore le matériel et commence par prendre une boule de pâte à modeler rouge à laquelle il juxtapose petit à petit d'autres objets : pince à linge, grillage, bâtonnet, pic, bolduc, chips en polystyrène, tissu, etc. Il se situe dans une juxtaposition d'actions simples avec ces objets : pincer, enfoncer, dérouler, couper, scotcher, ou encore recouvrir. Sylvain n'annonce pas un projet, ses actions ne sont pas dirigées vers un but prédéfini. Il se situe ainsi dans un fonctionnement linéaire qui mène toutefois à la création d'un objet nouveau48. Il obtient cet objet au bout de quinze minutes d'atelier. Il le pose ensuite sur le papier journal, sur une table de la pièce. Il poursuit l'exploration de la bote contenant le matériel et fait alors des aller-retour entre la bote et la table et continue ainsi la juxtaposition d'autres éléments. Sylvain se montre très intéressé par les rouleaux de ficelle et bolduc. Il les déroule jusqu'au bout, les emmêle, les coupe. Lorsqu'il déplace une nouvelle fois sa construction sur une autre table de la pièce, Sylvain trouve des feutres pour tableaux blancs. Il s'en saisit et commence à dessiner des choses au tableau en nous expliquant une histoire : Faut pas faire (l)a bêtise, pas la bagarre Nous attirons de nouveau son attention sur la bote. Sylvain nous demande de faire un rond (une boule) avec la pâte à modeler qu'il nous tend. Il enfonce ensuite un bâtonnet au travers de cette boule. Nous tournons ensuite chacun notre tour ce bâtonnet sur lui-même afin de faire tourner la boule également. Cette dernière se détache du bâtonnet mais Sylvain s'ajuste efficacement 48 Annexes 8, p XCI 56 et soude la pâte à modeler au bâtonnet : Il faut coller comme ça . Sylvain signifie seulement sa première construction suite à notre demande : Un vaisseau spatial, il vole la fusée ! . Il attribue une signification mais l'objet n'est pas agi tel qu'il est signifié. Le langage de Sylvain reste descriptif pendant tout l'atelier. Enfin, lors des cinq dernières minutes de l'atelier, Sylvain rejoue avec les feutres et le tableau blanc. 1. 4. Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Sylvain passe les deux premières minutes à explorer les différents boutons de la caisse- enregistreuse sans chercher les pièces. Il appuie sur les boutons et regarde les petits écrans o les images changent. Il essaie ensuite d'ouvrir le tiroir-caisse en tirant dessus puis tourne la manivelle : Ah voilà, a p(l)ein d'sous ! . Sylvain continue son exploration avec les pièces. Il les met dans les différentes encoches, appuie sur les boutons sale ou change et recommence. Lorsqu'il récupère les pièces, il dit très souvent : a gagné ! . Puis il parle de voleur : Voleur va voler les sous . Le thème du voleur est un thème qui revient souvent dans les jeux de Sylvain. Il part alors cacher les sous (une pièce de chaque couleur) dans un des placards de la pièce. Avec la caisse-enregistreuse, Sylvain demeure dans une succession temporelle d'actions contrainte par le matériel. L'organisation logique de l'objet n'est pas atteinte. Sylvain peut appuyer sur les boutons change ou sale sans avoir appuyé sur les boutons sous les encoches. Lorsqu'il appuie sur change et que les billes tombent sur le côté de la caisse, il est surpris du résultat : Oh non, c'est pas la bonne ! . Il marque dans son langage l'écart entre son action et l'effet attendu. Sylvain est très attiré par les autres objets présents dans la pièce, comme lors de l'atelier 3, notamment trois maisons gigognes que l'on peut fermer à l'aide d'une clé. Il revient également à son histoire de voleur , fermer à clé , cacher les sous . Il est difficile de le sortir de cette 57 situation et de ramener son attention au matériel de l'atelier. Nous décidons alors d'introduire le reste des objets symboliques, mais Sylvain reste à jouer avec les maisons gigognes. Une fois toutes les maisons refermées, il se tourne vers le matériel disposé au sol, prend une banane et nous la tend tiens, mange . Nous faisons alors semblant de la manger. Cependant, Sylvain change tout de suite d'activité et cherche un jeu sonore dans les étagères. Il ne semble pas intéressé par le matériel proposé, nous le laissons jouer quelques instants puis lui proposons de nouveau de regarder les autres objets. Sylvain touche les paniers, met les deux petits paniers rouges dans le grand panier bleu puis dit : Tiens, achète ! . C'est finalement lui qui prend les fruits et légumes. Il recherche des identiques : Lui : Achète. celui-là ! , prend une banane et la met dans le panier bleu, une banane Il regarde et prend une seconde banane qu'il ajoute dans le panier. Lui : Encore banane ! A plus banane Nous : Ah non, il n'y a plus de bananes Lui : Carottes. , cherche toutes les carottes, Oh, a plus carottes et les pose dans le panier. Il prend deux pommes de terre. Ca aussi. euh non pas ça et repose les pommes de terre. Il prend alors les deux citrons. Ca aussi. euh. c'est tout ! . Nous annonçons ensuite un prix à Sylvain, il nous donne l'argent et part avec son panier et la caisse-enregistreuse. Il revient, repose le tout au sol et dit : Allez, on va manger ! . Il répartit les fruits et légumes dans les deux paniers rouges et nous en donne un. Il fait semblant de manger les aliments puis les pose sur le bureau : poubelle ! . Sylvain reconnat les propriétés symboliques des objets mais il fonctionne par imitation différée. Ses actions restent juxtaposées et il n'installe pas son jeu dans une situation. Il reproduit des paquets d'actions qu'il connat mais ne se les approprie pas. 58 1. 5. Analyse globale Sylvain demeure dans une juxtaposition d'actions, sans mise en relation des objets, au cours des différents ateliers. Il se situe dans un rapport particulier aux objets. A plusieurs reprises, Sylvain attribue une fonction d' être animé aux objets, notamment lorsque ceux-ci roulent. Il explore également ces objets par le corps, lorsqu'il porte les objets à la bouche par exemple. Nous pouvons parler d'une ambivalence des conduites relationnelles. Ses préoccupations cognitives tournent autour d'actions simples et réitérées : enfoncer, couper, scotcher, dérouler. Il juxtapose ces actions sans projet défini ou anticipé. Son jeu avec les objets symboliques correspond à une imitation différée, o Sylvain réitère les mêmes actions. Son langage ne notifie pas les transformations, les mises en relation, la causalité. Ses énoncés restent descriptifs, quel que soit l'atelier. Enfin, Sylvain est facilement attiré par le reste du matériel présent dans la salle. Son langage suspend alors les actions en cours et ne signifie pas des actions qui ont précédé. Lors de ces moments, il est difficile d'obtenir son attention, Sylvain ne semble pas nous entendre. Nous pouvons dire que la fonction phatique du langage n'est pas toujours présente en réception chez Sylvain. 59 2. Louis, 8 ans et 5 mois Nous faisons la connaissance de Louis en décembre 2010, en présence de son orthophoniste. En février 2008 a été posé le diagnostic de trouble spécifique du langage oral, de type dysphasie phonologique-syntaxique . Il est noté que le versant réceptif est également entravé et des difficultés praxiques sont relevées. Louis est actuellement scolarisé en milieu spécialisé et suivi en orthophonie depuis 2006. Lors de notre première rencontre, Louis est un garçon plutôt timide mais il s'ouvrira à nous au fil des deux séances suivantes, o nous serons seulement tous les deux. Louis parle peu et ne me regarde que très rarement lorsque nous échangeons. Son visage est peu expressif et il semble toujours très centré sur ce qu'il est en train de faire. 2. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Louis associe un premier œuf, le plus grand : on peut faire ça . Il poursuit alors en assemblant les cinq autres œufs par tâtonnement et les ordonne debout du plus grand au plus petit devant lui : voilà ! . Afin de ne voir plus que cinq œufs, il défait alors cinq œufs en comptant à voix basse : un, deux, trois, . . Il obtient alors dix éléments séparés et le plus petit œuf O1 toujours formé. Nous redonnons la consigne et il rassemble les six œufs. Nous initions alors l'encastrement en lui demandant de se tourner. Il émet un wouah de surprise lorsque nous lui disons qu'il peut regarder. Quand il doit à son tour obtenir cinq œufs, il modifie la place des œufs sur la table et en prend un dans sa main. Durant cet atelier, Louis essaie aussi à plusieurs reprises de superposer les œufs, de les accoler entre eux. Il explore également le matériel en mettant sa main dans une demi-coquille ou en la portant à sa bouche : il expérimente directement avec son corps. Louis ne parvient pas à mettre davantage en relation les éléments. La relation de grandeur est identifiée car il va sérier les œufs du plus grand au plus petit mais il ne réussit pas à encastrer un 60 élément dans un élément plus grand. Cette sériation, non notifiée dans son langage, est certainement possible pour Louis car le matériel doit lui évoquer d'autres objets à sérier. Il reproduit alors quelque chose qu'il connat mais ne semble pas avoir acquis. Enfin les aspects physiques des œufs intéressent également beaucoup Louis durant cet atelier. 2. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Louis commence par explorer le matériel et essaie d'assembler des éléments entre eux mais y parvient très difficilement. Il exprime ses difficultés à plusieurs reprises au début de l'atelier : ah c'est dur ! . Au bout de dix minutes, Louis n'a pas réussi à superposer plus de deux éléments. Nous décidons avec son orthophoniste d'intervenir en lui demandant de nous expliquer ce qu'il a déjà fait. Nous l'incitons à essayer avec une bille à plusieurs reprises pour qu'il se crée ses premières certitudes face à ce matériel. Rassuré, Louis poursuit son exploration et sa recherche d'identiques, en couleur et en forme. Louis réussit facilement à superposer les tuyaux qui sont des éléments plus simples à juxtaposer que les éléments arrondis ou droits. Il commence alors à superposer plusieurs tuyaux et obtient un parcours constitué d'une base, de plusieurs tuyaux et d'un élément arrondi au sommet. Cette construction49 sera reprise avec pour seules différences : la couleur de la base, le nombre de tuyaux superposés et l'élément final au sommet. Louis obtient plusieurs parcours de ce genre car il ne parvient pas à assembler d'autres éléments entre eux. Il reste donc dans des juxtapositions de paquets d'éléments qu'il connat. Il essaie parfois d'ajouter un élément arrondi à un élément droit par exemple, mais il n'y parvient pas. Suite à ces situations de déséquilibre, il poursuit sa superposition de tuyaux. De plus, Louis est très intéressé par le parcours de la bille dans les différents éléments. Il suit la bille du regard dans l'élément au sommet et lorsqu'elle tombe dans les tuyaux. Il colle son oeil au tuyau du haut. Il ne cherche pas à voir o la bille tombe au début, puis regarde par o elle sort ensuite. 49 Annexes 7, p LXXXIV 61 Ses parcours se cassent parfois mais Louis n'exprime rien, ni par des mots, ni par des mimiques. Il ne parlera pas lors de l'atelier, mais il dira à la fin elle est grande ma tour ! . Malgré les difficultés initiales, Louis semble fier de son parcours final qui est en effet très haut. 2. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Louis débute l'atelier par une juxtaposition d'actions simples sans projet défini : rouler, écraser, trouer, couper, scotcher, fractionner. Ces actions peuvent être réitérées avec ou sur des objets différents. Il passe d'un objet à un autre, revient parfois sur ce qu'il a déjà fait. Louis explore les différents objets proposés et leurs propriétés physiques durant les vingt premières minutes. Puis, à partir d'un tuyau en carton et de pâte à modeler bleue, Louis répète la même séquence d'actions plusieurs fois : prend un bout de pâte à modeler, forme une boule en roulant la pâte à modeler entre ses mains puis l'écrase sur le tuyau en carton. Par cette succession d'actions, Louis obtient un alignement de plusieurs points de pâte à modeler au sommet du tuyau en carton qu'il pose debout au sol. Nous : Super ! Qu'est-ce que c'est ça. ? Lui : Ca, c'est un bonhomme . Louis ne décrit sa création que lorsque nous lui demandons, nous ne pouvons pas parler d'un projet défini et annoncé. Louis trouve une ressemblance fortuite au terme de sa répétition d'action et la signifie certainement parce que nous le lui demandons. Louis réitère alors les mêmes actions afin d'obtenir un second bonhomme très ressemblant au premier. Il prend alors les deux tuyaux dans ses mains50 et les tape l'un contre l'autre, des morceaux de pâte à modeler tombent au sol. Avant de terminer l'atelier, nous demandons à Louis de nous expliquer ce qu'il a fait : Lui : Moi j'ai fait. il est o mon bonhomme ? Lui il est cassé ! Lui (le non cassé) il s'est battu avec celui-là (celui qui est cassé). Et l'autre il veut faire hop hop hop hop. Ah j'ai 50 Annexes 8, p XCI 62 perdu mon oreille ! Le reste de l'atelier, Louis ne dira rien d'autre spontanément. Son visage reste toujours très neutre également. Louis n'éprouve pas le besoin de parler durant son exploration des aspects physiques du matériel. Tout comme lors de l'atelier précédent, il réitère les mêmes actions et varie peu les éléments. 2. 4. Atelier 4 : Caisse-enregistreuse et objets symboliques Louis commence à explorer la caisse enregistreuse en essayant à plusieurs reprises d'introduire les pièces par le trou sur le côté de la caisse et non par les encoches. Il découvre ensuite les encoches et leur fonctionnement. Une fois une pièce de chaque couleur dans la caisse- enregistreuse, Louis appuie au hasard sur le bouton change et les pièces tombent dans le toboggan. Louis nous regarde et sourit. Nous : Oh ! Comment t'as fait ? Lui : J'ai fait, j'ai fait ça (fait tomber la pièce rouge), après j'ai fait ça (puis la pièce jaune) et ça (puis la pièce orange), attends (pièce coincée) et après (il appuie sur sale ) Oh quand il ne voit pas tomber les pièces dans le toboggan. Il tourne la manivelle, regarde par le trou sur le côté, dans les encoches et enfin dans le tiroir-caisse : Ah elles sont là ! , très surpris. Louis continue son exploration de la caisse et répète longuement les mêmes paquets d'actions afin de se construire des certitudes. Comme lors du parcours de billes, Louis regarde longuement à l'intérieur de la caisse-enregistreuse. Lorsque nous lui demandons de nous expliquer comment fonctionne cette machine, Louis a besoin de manipuler en même temps. De plus, ses explications ont lieu après l'action : si j'appuie ici (le fait), ça tombe ici . 63 L'organisation logique des actions n'est pas encore évidente pour Louis, qui ne peut élaborer en dehors de ses actions. Il envisage une succession temporelle contrainte par la caisse- enregistreuse. Nous proposons ensuite à Louis les objets symboliques. Il manipule rapidement le matériel et commence à rechercher des identiques dans les fruits et légumes qu'il aligne de proche en proche sur une autre partie de la table. Nous : Qu'est-ce que tu es en train de faire ? Lui : Là je fais mon magasin Tout comme lors de l'atelier 3, Louis ne signifie pas spontanément ce qu'il fait. Il attribue des propriétés plus spécifiques à ces objets et les reconnat seulement quand nous lui posons la question. Il continue d'installer le jeu en prenant un panier, ça c'est mon sac , puis il répartit l'argent. Il prend son panier, met quelques fruits et légumes, revient vers la caisse et dit : quatre euros ! . Nous lui proposons alors de tenir la caisse, Louis accepte volontiers, mais ne nous regarde toujours pas. Louis continue de jouer et répète toujours les mêmes groupes d'actions : remplir le panier, le vider, donner les pièces. Il reconnat une situation mais il n'élabore pas à partir de ce qu'il reconnat. Il reste dans une imitation différée. On ne peut pas parler d'un jeu symbolique car Louis réitère les mêmes actions et son langage ne donne pas d'éléments d'un projet symbolique. Enfin, bien qu'il accepte notre participation, Louis ne nous indique pas ce que nous devons faire, s'adresse peu à nous ou sans nous regarder. 2. 5. Analyse globale Louis demeure actuellement dans une exploration des aspects logiques et physiques des objets. Il recherche très souvent des identiques et se situe dans une réitération de juxtaposition 64 d'actions qui l'amène à retrouver les mêmes organisations d'objets. Louis apporte peu de variations à ce qu'il construit, que ce soit avec le parcours de billes ou les objets non-symboliques. Il ne dépasse pas les situations de déséquilibre et revient alors aux mêmes actions et résultats. En répétant les mêmes actions, il se crée des certitudes sur les objets, les actions et leurs relations. Louis a toujours besoin d'un long temps d'exploration du matériel. Louis réitère des actions simples avec les objets non-symboliques, dont celle prédominante de fractionnement. Cette activité transformatrice lui sert alors de support pour la création de son objet nouveau . Avec les objets symboliques, il reconnat leurs propriétés plus spécifiques mais ses préoccupations sont toujours la recherche de même et la répétition de paquets d'actions en imitation différée. Louis est un garçon qui parle très peu et encore moins de façon spontanée. Il parat de plus en plus à l'aise avec nous mais il nous regardera rarement pendant nos échanges. Il n'élabore pas en dehors de ses actions, ne marque pas les relations entre les objets ni entre ses actions. Louis est guidé par l'action et signifie ce qu'il fait seulement lorsque nous le questionnons sur ses actions. Son langage lui sert à désigner et commenter les situations qu'il comprend mais n'a pas encore pour fonction de faire le lien entre ses expériences et ses connaissances. 65 3. Léna, 9 ans et 6 mois Nous avons rencontré Léna pour la première fois un peu avant les vacances de fin d'année 2010. Léna est la seule fille de notre population d'enfants diagnostiqués dysphasiques. Le diagnostic de trouble significatif et spécifique du développement du langage oral est posé en juin 2008. Ce diagnostic est posé dans un contexte de bilinguisme : les parents parlent une autre langue à la maison et il est noté que des difficultés apparaissent également dans celle-ci même si elle semble mieux matrisée par Léna. Une prise en charge orthophonique est mise en place depuis 2006 et Léna suit sa scolarisation en milieu spécialisé durant cette année. Lors des séances, nous découvrons une petite fille très inhibée, avec un visage peu expressif et des gestes lents. Elle recherche souvent le regard de l'adulte ou son aide. Lorsque Léna se sent en difficultés, elle fait peu de choses et souhaite arrêter rapidement comme cela sera le cas pour les ateliers 2 et 3. Léna recherche également notre attention en dehors des séances et nous sollicitera souvent dans les couloirs de l'établissement. De plus, on notera une évolution positive lors du dernier atelier, qui avait eu lieu de façon duelle. 3. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Une fois la première consigne donnée, Léna regarde longuement le matériel sans y toucher puis dit on peut faire ça tout en assemblant le plus petit œuf O1. Elle continue ensuite à assembler les cinq autres œufs, de façon plus ou moins immédiate. Après la deuxième consigne, Léna positionne debout les six œufs en les sériant du plus grand au plus petit puis met un œuf sur le côté. Nous réalisons alors la tâche d'initiation et lui redonnons la consigne. Léna parvient alors à obtenir cinq œufs en commençant par encastrer le plus petit œuf O1 dans O2 et ainsi de suite. Léna réussit à mettre en relation ces différents éléments après avoir initié l'encastrement d'un œuf dans un autre. Cependant, elle ne marque pas cette relation par des mots au cours de l'atelier. 66 3. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Léna ne réussit pas à s'approprier la spécificité du matériel et reste dans une simple juxtaposition de deux ou trois éléments51. Elle recherche beaucoup d'identiques dans les éléments qu'elle choisit : même couleur et/ou même forme. On ne peut pas parler d'assemblage car elle ne tient pas toujours compte du sens des éléments. De plus, lorsqu'elle ne parvient pas à juxtaposer deux éléments entre eux, elle ne cherche pas de solutions. Léna est dans le constat simple : ça roule pas , ça marche pas . Son langage ne marque pas de mise en relation, de coordinations. Son visage reste sans mimique quand elle constate que cela ne marche pas. Léna a du mal à s'ajuster lorsque la bille ne roule pas dans un des éléments car elle n'a pas pris la pente en considération : comment tenir le truc ? dit-elle en nous regardant. Le terme comment marque la première relation, mais cette question évoque une toute-puissance de l'adulte. Elle reste dans une action directe sur l'environnement, dans l'immédiateté. Il semble que Léna ne peut envisager l'action que si l'action vient d'elle : la bille bouge si elle bouge la structure. Elle ne peut pas envisager l'action si elle agit de manière plus indirecte : placer un élément pour tenir la structure, changer un élément de place. Nous pouvons nous demander s'il existe une dissociation de l'objet et de l'action. Léna n'explore pas le matériel seule, elle a besoin que l'adulte l'accompagne et constate avec elle, l'encourage, mette en sens par des mots. L'atelier durera peu de temps : un peu moins de huit minutes. Léna ne souhaite pas continuer lorsque nous lui proposons de faire un autre parcours. Son orthophoniste nous indique que Léna préfère arrêter lorsqu'elle est en difficulté, comme ce sera le cas ici et dans l'atelier suivant. 3. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Léna juxtapose différents éléments : tuyaux, bolduc, coton, chips en polystyrène. Elle 51 Annexes 7, p LXXXVI 67 juxtapose plus ou moins facilement ces éléments grâce au scotch. Dès le début, Léna a besoin de l'encouragement et du soutien de l'adulte : Elle juxtapose deux tuyaux, dont l'un est un plus large de diamètre. Elle : Ça tient pas Nous : Comment tu peux faire pour que ça tienne ? Elle : Je sais pas Nous : Essaie de regarder dans la bote si quelque chose peut t'aider. Elle : Ça ? en me montrant le scotch. Le scotch est visible dans la bote, mais Léna a besoin que nous l'orientons dans sa recherche de solution à son problème et attend notre approbation. Nous parlons là encore de simple juxtaposition et non d'une construction car Léna n'est pas dans la réalisation d'un projet. Elle est dans un enrichissement linéaire. Aussi, Léna réitère les mêmes actions à un même objet ou à des objets différents : scotcher des tuyaux entre eux, scotcher du bolduc de différentes couleurs aux tuyaux. Son langage, souvent adressé à l'adulte, sert à constater le résultat immédiat : ça tient pas , voilà , j'ai fini , ça tient un peu . On note une différence avec ce un peu mais ce terme évoque toujours une juxtaposition et non une relation comme avec mieux par exemple. Son visage restera toujours neutre et non expressif durant tout l'atelier. Par ailleurs, Léna ne symbolisera pas son assemblage final52. L'atelier durera un quart d'heure, pendant lequel nous devons souvent la relancer pour qu'elle poursuive ses expériences avec ce matériel. 3. 4. Atelier 4 : Caisse-enregistreuse et objets symboliques Avec la caisse enregistreuse, Léna est dans une succession temporelle d'actions contrainte par le matériel, et non dans une organisation d'actions. 52 Annexes 8, p XCII 68 Elle cherche l'action là o on la voit en regardant dans le trou sur le côté de la caisse ou dans les encoches. Elle réitère longuement ses actions pour se créer des certitudes avant de pouvoir modifier ses actions : je refais , je vais essayer par là . Elle passe beaucoup de temps à s'approprier le fonctionnement de la caisse et est parfois en déséquilibre : Elle récupère deux pièces dans le toboggan mais cherche une troisième pièce (dans le tiroir- caisse) Nous : Alors, elle est o l'autre ? Elle : J'en sais rien. Léna a surtout un langage descriptif et là encore, le premier mot qui indique un début de relation est comment dans sa question comment sortir ça ? qui demande à l'adulte qui sait tout . Mais nous relevons ensuite de vraies mises en relation dans cet atelier : pourquoi ça sort pas ici ? , ça, c'est pour faire dans la caisse, et ça, c'est pour faire sur le toboggan . L'atelier se poursuit avec l'ajout des objets symboliques : Elle : Je fais quoi ? Nous : Alors, à quoi ça te fait penser tout ça ? Qu'est-ce que tu pourrais faire avec ? Elle : Acheter des fruits Nous : Oui, on pourrait acheter des fruits ! Elle : Alors, t'es la caisse . Nous commençons alors à jouer. Cependant, Léna n'organise pas son magasin ou ne demande pas combien elle nous doit, par exemple. Son jeu est réduit au début. Par la suite, elle reprend ce que nous propose lorsque nous inversons les rôles. Elle est alors dans de l'imitation différée, aussi bien en ce qui concerne ses actions que ses énoncés. Enfin, Léna s'approprie davantage le jeu dans les dernières minutes et nous le constatons aussi dans son langage : 69 Nous : Qu'est-ce que vous me conseillez ? Elle : Des bananes. Aussi avec des oranges. Aussi la banane avec la poire c'est très bon Elle regarde notre panier : Que des fruits ! [] Nous : J'espère qu'ils seront bons les fruits ! Elle : Ils sont excellents ! Durant son jeu, Léna porte surtout un intérêt aux actions de vider et de remplir le panier ainsi que de mettre les pièces dans la caisse enregistreuse. Elle reste autour de la table o sont posés les différents objets et ne signale pas des espaces différents selon les situations qu'elle joue. Léna est dans une réitération de scènes qu'elle enrichit par l'imitation différée puis elle s'approprie petit à petit le jeu et semble prendre plaisir à jouer. Son visage devient également plus expressif au cours de cette séance. C'est la première fois que Léna ne souhaite pas arrêter plus tôt l'atelier. 3. 5. Analyse globale Léna est une petite fille qui a sans cesse besoin d'être relancée et encouragée. Elle ose peu quand elle se sent en difficulté et préfère demander l'aide de l'adulte ou alors abréger la séance. Après un long temps d'observation, les œufs gigognes sont formés puis embotés suite à l'initiation de l'encastrement. Léna agit par juxtapositions réitérées. Elle superpose les éléments du parcours de billes sans tenir compte de la spécificité du matériel. Et elle ajoute des éléments au tuyau initial sans avoir de projet dans l'atelier 3. Elle explore très peu le matériel au cours des ateliers 2 et 3 et elle souhaite rapidement arrêter ces séances. Léna demeure dans la situation immédiate et dans un enrichissement linéaire non-anticipé. 70 Sa compréhension du fonctionnement de la caisse-enregistreuse est également linéaire, soit une succession temporelle d'actions. Léna verbalise principalement le résultat immédiat de ses actions : voilà , j'ai fini , ça roule pas . Ses énoncés sont souvent accompagnés d'un regard vers l'adulte, qui est alors posé comme la personne qui sait tout . Elle utilise peu le langage pour mettre en relation. Léna utilise le langage pour décrire des situations, des états mais non comme outil pour élaborer en dehors de l'action. Elle s'approprie davantage les objets symboliques du dernier atelier et nous le constatons également dans son langage qui commence à apporter des choses nouvelles à la situation. Néanmoins, Léna reste dans une imitation différée et une répétition de groupes d'actions mais il aurait été intéressant de poursuivre cet atelier avec elle. 71 4. Victoire, 9 ans et 8 mois Nous faisons la rencontre de Victoire en février 2011 à son domicile. Les quatre ateliers se feront en une heure et quart, les uns à la suite des autres. Nous ne noterons aucune fatigabilité ni lassitude de la part de Victoire. Par ailleurs, Victoire avait le pied plâtré, ce qui a pu la restreindre pour certaines conduites, notamment avec le parcours de billes. Victoire est en classe de CM1 cette année scolaire et n'a jamais bénéficié d'une prise en charge orthophonique. Victoire est une jeune fille peu timide et très habile de ses mains. Elle se montre très créative au cours des ateliers et joue également avec les mots. Le langage est un réel outil à mettre en sens, organiser et inventer pour Victoire. 4. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Victoire assemble les six œufs en les embotant petit à petit : Je prends et j'embote, après je prends celui qui est juste un peu plus grand et je rembote, etc. Elle obtient ensuite le même résultat mais en embotant les demi-coquilles, et les assemble seulement à la fin pour obtenir un seul œuf visible. Après l'avoir relancée, elle assemble les six œufs de façon séparée. Suite à la deuxième consigne, elle prend rapidement O2 pour y mettre O1 : Disparu, comme par magie ! Ou on peut dire que je l'ai mangé ! . Elle continue de la même façon et nous dit en souriant à la fin : et plus aucun maintenant ? en cachant l'œuf derrière son dos. Victoire exprime la relation entretenue par les différents éléments du matériel. Elle manipule aisément le matériel et joue avec. Elle joue également avec le langage et crée ainsi une situation nouvelle autour de ce matériel. 72 4. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Victoire connat ce jeu même si celui qu'elle a n'est pas tout à fait le même . Elle cherche dans un premier temps des bases puis elle assemble rapidement des éléments droits, escaliers ou arrondis entre eux. Elle ajoute seulement à la fin les tuyaux à certains endroits du parcours afin de faire tenir la structure : Maintenant il faut rééquilibrer . Victoire semble avoir un projet et utilise une procédure particulière afin d'y parvenir. Elle réalise très rapidement ce premier parcours, nous lui proposons alors d'en faire un autre si elle le souhaite. Victoire accepte volontiers et construit un second parcours53, très ressemblant au premier, mais elle apporte quelques modifications. Elle installe par exemple un raccourci , c'est-à-dire un tuyau à mi-parcours qui sert de nouveau départ. Tout au long de cet atelier, Victoire anticipe dans son langage son projet ou l'effet de ses actions. Elle procède ainsi par organisation d'actions et l'assemblage des éléments de ses parcours est aisé. 4. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Nous mettons ensuite la bote contenant les objets non-symboliques à disposition de Victoire : Du journal, du carton, c'est un atelier création ? . Nous lui donnons alors la consigne. Victoire prend de suite un carton et du coton, qu'elle forme en boule dans ses mains. Nous : Tu as déjà une idée ? Elle : Oui, je vais faire un peu les nuages Victoire s'installe ainsi dans un projet symbolique qu'elle enrichit petit à petit. Pendant qu'elle coupe des morceaux de fils de fer bleu : 53 Annexes 7, p LXXXIX 73 Elle : Quoi que n'importe quelle couleur pouvait aller Nous : C'est pour quoi faire ? Elle : En fait je vais recouvrir, je vais donner une forme, un peu arrondie, et je vais recouvrir encore de coton et je vais faire des flocons de neige qui tombent Elle anticipe dans ses mots ce qu'elle projette de réaliser. Elle élabore ainsi en dehors de son action. Victoire réalise ce premier paysage mais elle a encore beaucoup d'autres idées. Elle poursuit donc l'atelier et crée un paysage avec un arc-en-ciel car le soleil plus la pluie, ça crée l'arc-en-ciel . Elle crée alors ces différents éléments qu'elle scotche sur le carton. Elle termine cet atelier en réalisant un personnage, une crevette à l'aide la pâte à modeler rose. Nous voyons là encore comme Victoire joue avec le langage : Elle prend son personnage crevette Elle : Après, il faut le scotcher au carton, comme ça en mettant debout le personnage en pâte à modeler. Ah il dort pas. ! quand la pâte à modeler tombe Oh bah on va plutôt le faire dormir ! et couche alors le personnage sur le carton. Victoire se situe dans un projet de symbolisation tout au long de l'atelier54. Son langage sert à mettre en sens ses actions mais aussi à l'installer dans une réelle création. 4. 4. Atelier 4 : Caisse-enregistreuse et objets symboliques Victoire assimile très vite le fonctionnement de la caisse-enregistreuse. Son explication donnée, sans qu'elle ne manipule la caisse-enregistreuse, marque qu'elle se situe bien dans une organisation logique des actions : Elle : En fait, à l'intérieur, il y a deux planches je pense. Quand on appuie sur ce bouton (montre le bouton sale ), y'en a une qui se libère et donc ça les fait aller là-dedans (montre le tiroir) et quand on appuie sur l'autre bouton ( change), y'a l'autre qui se libère 54 Annexes 8, p XCV 74 et ça les fait aller là (montre le toboggan) Et donc là, il y a un système (montre la manivelle), dès qu'on entend la cloche, ça s'ouvre et on voit les pièces quand on a appuyé sur sale . Victoire imagine ce qu'elle ne voit pas pour expliquer le fonctionnement de la caisse- enregistreuse ; nous notons ainsi une grande décentration par rapport à l'objet et à la situation. Nous introduisons alors le reste du matériel symbolique. Victoire associe ces objets à l'idée du marché . Elle installe la situation en répartissant l'argent entre la caisse et nous-même. Ainsi, elle nous intègre directement dans son jeu et initie l'échange : Alors, qu'est-ce que tu veux acheter ? . Victoire s'approprie la scène qu'elle met en place petit à petit et qu'elle enrichit et organise grâce à ses énoncés. Nous : Qu'est-ce que vous me conseillez ? Elle : Nos bananes sont exquises ! Et elles sont en réduction, 250 la banane Lorsqu'elle répartit sur le plateau les fruits et légumes achetés. Elle : Je vais être généreuse ! Surtout qu'on n'est que quatre dans la famille Elle répartit ensuite l'argent. Elle : En plus de la nourriture, de l'argent ! J'ai trop d'argent, c'est mon banquier qui me l'a dit ! Victoire se situe ainsi dans ce qu'on appelle le jeu symbolique avec une scène, un projet qu'elle construit et imagine au fur et à mesure. 4. 5. Analyse globale Victoire se situe dans une organisation d'actions pour tous les ateliers. Elle anticipe ses projets ou l'effet de ses actions. Elle élabore à partir du résultat et s'ajuste 75 ainsi efficacement. Elle s'appuie sur les propriétés du matériel qu'elle a reconnues pour construire son parcours de billes ou des objets nouveaux symboliques. Victoire utilise le langage dans un but informatif mais aussi créatif. Le langage contribue à ses jeux et les enrichit. Il est aussi un véritable outil de communication. Les temps d'exploration du matériel sont très courts, contrairement aux enfants diagnostiqués dysphasiques. 76 VI. ANALYSE GLOBALE Cette sixième partie nous permettra de présenter les résultats globaux pour chaque atelier à l'aide des grilles d'observation, et de comparer ainsi plus aisément les conduites de l'ensemble des enfants diagnostiqués dysphasiques et celles des enfants tout-venant. Puis, nous présenterons les trois profils d'enfants qui se dessinent suite à nos analyses globales et croisées. Une analyse des conduites ludiques et langagières sera enfin proposée. 1. Grilles d'observations et résultats globaux pour chaque atelier 1. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes La formation des six œufs est possible pour la totalité de notre population d'enfants diagnostiqués dysphasiques et tout-venant. Mais seulement 8/10 des enfants diagnostiqués dysphasiques parviennent à l'embotement successif des œufs. En effet, Sylvain et Louis, qui sont les deux enfants les plus jeunes, semblent davantage intéressés par les propriétés physiques du matériel que par leur propriété de mise en relation comme nous l'avons relevé dans la cinquième partie. Léna quant à elle, réussit suite à l'initiation que nous lui proposons. Et 3/8 de ces enfants seulement anticipent leur projet en l'annonçant : Arthur, Paul et Brice. Leur langage devient alors informatif car il annonce leur action future mais il marque également la propriété principale du matériel, soit la taille. Tous les enfants de la population contrôle embotent les six œufs. Les projets et mises en relation sont énoncés par tous. De plus, il s'ajustent et anticipent efficacement. 77 Légende : x : peu présent ; X : présent ; 1 : présent seulement dans l'atelier 1 : Les enfants en juxtaposition d'actions avec un langage descriptif, quel que soit l'atelier : Les enfants en mise en relation d'objets et succession d'actions dans les situations contraintes avec un langage descriptif : Les enfants en mise en relation d'objets et succession d'actions dans les situations contraintes avec prémices d'un langage informatif : Les enfants en organisation d'actions avec un langage informatif, quel que soit l'atelier Sylvain 7 ans 1 mois Louis 8 ans 5 mois Loïc 8 ans 8 mois 9 ans 6 mois Les enfants diagnostiqués dysphasiques Quentin Léna 9 ans 6 mois Arthur 10 ans 6 mois Marc 10 ans 11 mois Les enfants tout-venant Paul 11 ans Brice 12 ans Romaric 12 ans 6 mois Léonie 7 ans 3 mois Victoire 9 ans 8 mois Valentine 10 ans 9 mois X . X X X X X X X X X X 1 X X X x X X 1 X X X X 1 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Anticipation : effet annoncé projet annoncé Réitération : d'actions d'organisation d'objets Atelier 1 : Œufs gigognes Embotement non réussi Embotement des œufs réussi sans aide Embotement des œufs réussi suite à l'aide Langage informatif et avant l'action 78 Sylvain 7 ans 1 mois Louis 8 ans 5 mois Loïc 8 ans 8 mois Quentin 9 ans 6 mois Léna 9 ans 6 mois Arthur 10 ans 6 mois Marc 10 ans 11 mois Paul 11 ans Brice 12 ans Romaric 12 ans 6 mois Léonie 7 ans 3 mois Victoire 9 ans 8 mois Valentine 10 ans 9 mois X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X x X X X X X X X X X x X X X X X X X x X X X X X x X Atelier 2 : Parcours de billes Actions : Actions simples juxtaposées Organisation d'actions Organisation d'objets : Juxtaposition d'objets Réitération d'une même juxtaposition d'objets Recherche d'identiques Couples Disposition spatiale particulière Assemblage Elaboration à partir du résultat : Ajustement efficace Ajustement inefficace Langage : avant l'action pendant l'action après l'action Moment d'énonciation : Adressé à l'adulte Répétition Descriptif Informatif 79 Sylvain 7 ans 1 mois Louis 8 ans 5 mois Loïc 8 ans 8 mois Quentin 9 ans 6 mois Léna 9 ans 6 mois Arthur 10 ans 6 mois Marc 10 ans 11 mois Paul 11 ans Brice 12 ans Romaric 12 ans 6 mois Léonie 7 ans 3 mois Victoire 9 ans 8 mois Valentine 10 ans 9 mois X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X x x X X X X X X X X X X x x X X X X X X x X X X X x x X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X x X X X X X X X X X x X X X X X X X x X X X X X x X Atelier 3 : Matériel non symbolique Actions : Actions simples juxtaposées Organisation d'actions Organisation d'objets : Juxtaposition d'objets Disposition spatiale particulière Recherche d'identiques Couples Alignements Groupements Assemblage Construction Elaboration à partir du résultat : Ajustement efficace Ajustement inefficace Langage : avant l'action pendant l'action après l'action Moment d'énonciation : Adressé à l'adulte Répétition Descriptif Informatif 80 Sylvain 7 ans 1 mois Louis 8 ans 5 mois Loïc 8 ans 8 mois Quentin 9 ans 6 mois Léna 9 ans 6 mois Arthur 10 ans 6 mois Marc 10 ans 11 mois Paul 11 ans Brice 12 ans Romaric 12 ans 6 mois Léonie 7 ans 3 mois Victoire 9 ans 8 mois Valentine 10 ans 9 mois X X X X X X X X X X X X X X X X X X X x X X X X X X X X x X X X X x X X X X X X X X X X X x Atelier 4 : Caisse enregistreuse et matériel symbolique Actions : Succession temporelle d'actions contrainte au matériel Organisation d'actions Réitération Organisation d'objets : Disposition spatiale particulière Recherche d'identiques Couples Alignements Groupements Assemblage Ajustement : Exprime par des gestes ou des mots l'écart entre effet produit et résultat attendu Ajustement efficace à partir du résultat Ajustement inefficace à partir du résultat 81 Sylvain 7 ans 1 mois Louis 8 ans 5 mois Loïc 8 ans 8 mois Quentin 9 ans 6 mois Léna 9 ans 6 mois Arthur 10 ans 6 mois Marc 10 ans 11 mois Paul 11 ans Brice 12 ans Romaric 12 ans 6 mois Léonie 7 ans 3 mois Victoire 9 ans 8 mois Valentine 10 ans 9 mois X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X x X X X X X X X X X X X X x X X x X X X X X X X X x X X X X X x X X X X X X X X x X X X Langage : avant l'action pendant l'action après l'action Moment d'énonciation : Adressé à l'adulte Répétition Descriptif Informatif Aspects symboliques : Imitation immédiate Imitation différée Détournement d'objets Mise en place d'une Faire-semblant scène, d'un projet 82 1. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Tous les enfants construisent un parcours lors de cet atelier, mais il sera plus ou moins long, complexe et organisé. 8/10 enfants diagnostiqués dysphasiques réalisent leur parcours en juxtaposition d'actions, c'est-à-dire qu'ils superposent les éléments car les propriétés physiques spécifiques ne sont pas identifiées et qu'ils ne s'organisent pas mais procèdent de façon linéaire et immédiate. Un enfant n'est plus dans une superposition des éléments mais dans un assemblage. Cependant, il juxtapose ses actions car il ne parvient pas à anticiper et à ajuster les dénivelés nécessaires au bon déroulement de son parcours. Il s'agit de Marc. Notons toutefois qu'il nous a dit connatre le jeu, ce qui peut expliquer sa matrise pour assembler les éléments contrairement aux autres enfants. Un autre enfant, Romaric, connat et joue très régulièrement à ce jeu. Il se situe donc dans une organisation d'actions pour la construction de ses différents parcours. Il est le seul enfant diagnostiqué dysphasique à anticiper, à s'ajuster efficacement et à identifier dans son langage les éléments différents et donc à proposer un langage informatif. Enfin, 3/3 des enfants tout-venant demeurent dans une organisation d'actions lors de cet atelier. Léonie mettra plus de temps à s'organiser que les deux autres enfants mais elle s'approprie la spécificité du matériel au cours de l'atelier. Victoire et Valentine se montrent très rapides pour la construction de leur parcours. Toutes les trois utilisent des énoncés informatifs qui anticipent leurs actions et qui marquent les relations entre les objets. Ces résultats confirment le phénomène de réussite sans compréhension exposé dans la présentation du matériel de cet atelier. En effet, tous les enfants réussissent à construire un parcours, mais la compréhension des propriétés du matériel et de son organisation nécessaire n'est vraiment acquise que par Romaric et les trois jeunes filles de la population contrôle. 83 1. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques La totalité des enfants diagnostiqués dysphasiques procède par juxtaposition d'actions au cours de cet atelier. Aucun enfant n'anticipe et établit un projet. Ils juxtaposent les objets sans les mettre en relation. 8/10 de ces enfants attribuent une signification à leur création. Cependant, cet objet nouveau n'est pas annoncé, il est seulement signifié lorsque nous questionnons l'enfant. Nous ne pouvons donc pas parler de symbolisation car cette procédure dépend de l'anticipation d'un projet. 5/8 enfants signifient son objet nouveau par ressemblance à quelque chose de connu : le panneau pour Paul, le grappin pour Arthur, les bonshommes de Louis, Quentin et Brice. Le lien entre la signification attribuée et l'objet obtenu n'est pas un lien de ressemblance pour le vaisseau spatial de Sylvain, le pistolet de Marc et les colonel et sergent de Romaric. Aucun de ces objets n'est agi tel qu'il est signifié. Cela confirme qu'il s'agit bien d'une signification et non d'une symbolisation. Les trois enfants de la population contrôle créent un objet nouveau par organisation d'actions. Leur projet est annoncé ou établi en pensée, comme pour Valentine. Leurs actions sont organisées et dirigées vers un but, une réelle recherche du matériel adéquat est présente. Les propriétés physiques des objets sont reconnues et utilisées. Toutes les trois symbolisent leur création. Léonie et Victoire montrent une grande inventivité dans cet atelier et leur langage contribue à cette création et symbolisation. 1. 4. Atelier 4 : Caisse-enregistreuse et objets symboliques 9/10 enfants diagnostiqués dysphasiques demeurent dans une succession temporelle d'actions contrainte par la caisse-enregistreuse. Ils explorent longuement l'objet, répètent les mêmes paquets d'actions et ne parviennent pas toujours à se créer des certitudes. Leur explication du fonctionnement n'est pas possible en dehors de l'action, ils ont besoin de manipuler. Ils n'ont pas accès à une élaboration en pensée. 84 Un seul enfant diagnostiqué dysphasique, Paul, comprend l'organisation logique de la caisse- enregistreuse après exploration et expérimentation de celle-ci. Il parvient à élaborer en dehors de l'action, même si son explication suit juste une dernière manipulation de l'objet. Léonie, Victoire et Valentine se situent également dans une organisation logique des actions. La différence de temps d'exploration et d'appropriation du matériel entre enfants diagnostiqués dysphasiques et enfants tout-venant est là encore très importante. Aussi, leurs énoncés se détachent de l'action et marquent les liens de causalité. Pour la suite de l'atelier avec les objets symboliques, 3/13 enfants ne souhaitent pas jouer avec ce matériel : Paul et Brice chez les enfants diagnostiqués dysphasiques et Valentine de la population contrôle. Ils font partie des enfants les plus âgés. Conscients de la connotation enfantine du matériel pour les plus grands, nous n'insistons pas et nous contentons de leurs explications, plus ou moins brèves. Soit 8/10 enfants diagnostiqués dysphasiques acceptent la suite de l'atelier et jouent volontiers avec le matériel symbolique. La propriété symbolique du matériel est reconnue par tous, mais les enfants restent dans une imitation différée avec répétitions de paquets d'actions et un langage descriptif. Ils n'installent, ni dans leurs gestes, ni dans leurs mots, leur situation dans un projet de création et donc dans un jeu symbolique. De plus, ils ne nous introduisent pas d'eux- mêmes dans leur jeu. Léonie et Victoire de notre population contrôle jouent volontiers et installent un jeu symbolique. Elles créent une situation qu'elles enrichissent et s'approprient au cours de l'atelier. Elles prennent des initiatives et nous intègrent dans leur jeu. Leur langage apporte à la scène, à leur projet. Il organise, complexifie, contribue à leur jeu. 85 2. Les différents profils 2. 1. Les enfants en juxtaposition d'actions avec un langage descriptif, quel que soit l'atelier Nous retrouvons ici Sylvain et Louis dont nous avons présenté les passations et analyses individuelles détaillées en cinquième partie. Sylvain, 7 ans et 1 mois, demeure dans une juxtaposition d'actions dans les différents ateliers. Ses actions ne sont pas dirigées vers un but et ses préoccupations cognitives concernent essentiellement l'exploration des propriétés physiques des objets. Son rapport aux objets rappelle celui présent chez de plus jeunes enfants. Il ne montre pas d'intérêt pour la mise en relation des objets dans l'atelier 1 ou pour l'organisation logique de la caisse-enregistreuse dans l'atelier 4. De plus, bien qu'il parle beaucoup, le langage de Sylvain reste descriptif, répétitif et juxtaposé également. Il ne lui sert pas d'outil d'objectivation. Louis, 8 ans et 5 mois, procède lui aussi par juxtaposition d'actions. Il n'anticipe et ne s'ajuste pas au cours des ateliers et ses actions sont juxtaposées et non coordonnées. Louis explore longuement les différents objets mis à sa disposition. Les aspects physiques des objets semblent être au centre de ses préoccupations cognitives. Son langage reste descriptif et n'apporte pas un aspect symbolique à ses conduites ludiques. Ces deux enfants sont les plus jeunes de notre population d'enfants diagnostiqués dysphasiques. Ils ne parviennent pas à mettre en relation les objets de l'atelier 1, alors que l'embotement des oeufs gigognes est normalement obtenu à leur âge. Sylvain et Louis manipulent la caisse-enregistreuse mais ils sont dans une succession temporelle d'actions contrainte par le matériel. En effet, la causalité est contrainte dans ces deux ateliers. Sylvain et Louis ne réussissent donc pas à trouver cette causalité pour les deux ateliers, mais seulement avec la caisse-enregistreuse. 86 2. 2. Les enfants en mise en relation d'objets et succession d'actions dans les situations contraintes Ce groupe englobe les enfants qui parviennent seulement à mettre en relation les objets de l'atelier 1, soit les oeufs gigognes, et à être en succession d'actions face à la caisse-enregistreuse de l'atelier 4. Il s'agit donc de situations o la causalité est contrainte ; les enfants n'ont pas à la trouver comme pour les ateliers 2 et 3. Nous avons souhaité distinguer les enfants en deux sous-groupes : ceux avec un langage descriptif et ceux avec un début de langage informatif. Avec un langage descriptif Loïc, 8 ans et 8 mois, accède à la mise en relation des oeufs gigognes dans l'atelier 1 mais on ne retrouve pas cette mise en relation des objets dans le parcours de billes ou avec les objets non- symboliques. Les objets sont dans ces ateliers seulement juxtaposés et non assemblés. De plus, Loïc n'est pas dans une organisation d'actions mais dans une juxtaposition immédiate, voire une succession temporelle contrainte. Son langage, principalement des onomatopées et mots isolés, lui sert essentiellement à faire des constats après ses actions. Il n'apporte pas d'informations sur la situation, les changements. Arthur, 10 ans et 6 mois, se situe également dans ce sous-groupe. En effet, bien qu'il manipule aisément les oeufs et parvienne à m'expliquer le fonctionnement de la caisse, il reste cependant dans une succession d'actions contrainte par ces objets. Dans les autres ateliers, Arthur juxtapose les objets et n'a pas de projet annoncé à l'avance. Son langage est descriptif. Il marque le résultat de ses actions, ses surprises quant à l'effet obtenu et ne se détache pas de ses actions. Marc, 10 ans et 11 mois, accède lui aussi à la relation entre objets et actions uniquement dans les situations contraintes des ateliers 1 et 4. Dans les autres ateliers, même lorsqu'il connat le matériel, Marc ne parvient pas à une organisation d'actions dirigées vers un projet prédéfini. Il crée un parcours et un objet nouveau mais il subsiste dans une juxtaposition linéaire d'actions. Son langage reste dans l'immédiateté et n'offre pas d'anticipation ou de mise en lien entre ses expériences et ses connaissances. 87 Avec les prémices d'un langage informatif Quentin, 9 ans et 6 mois, parvient à mettre en relation les objets de l'atelier 1 mais il ne notifie pas cette relation dans son langage. Les prémices d'un langage informatif ont lieu dans l'atelier avec les objets non-symboliques. Quentin nous informe des aspects physiques qu'il constate au cours de son exploration. On ne retrouve pas non plus de marqueurs de causalité lors de son explication du fonctionnement de la caisse-enregistreuse. Après une longue exploration de l'objet, il reste dans une succession temporelle d'actions contrainte par le matériel et n'accède pas à une organisation logique. Lorsque Léna, 9 ans et 6 mois, accède au fonctionnement de la caisse-enregistreuse, après de longues répétitions, elle marque dans son langage une causalité. Cette causalité est contrainte mais on sent que Léna évolue au fil des séances et l'apparition de cette fonction informative est intéressante. Néanmoins, elle reste dans l'immédiateté, le simple constat, sans parvenir à un ajustement efficace dans les autres ateliers. Paul, 11 ans, utilise un langage informatif au cours des ateliers 1 et 4, ateliers o il accède à la compréhension du matériel et à son appropriation. Il parvient à anticiper, à s'ajuster, à se détacher de l'action et son langage devient alors informatif. Durant les ateliers 2 et 3, qui posent davantage de difficultés à Paul, son langage reste alors descriptif. Nous ne pouvons pas juger de son langage lors de la manipulation des objets symboliques car Paul ne souhaite pas jouer avec. Brice, 12 ans, se situe dans la même situation que Paul, c'est-à-dire que son langage informatif se retrouve dans les ateliers o la causalité est contrainte par le matériel. Le reste du temps, Brice parle peu et procède par juxtaposition d'actions sans avoir de projet prédéfini ou annoncé. De plus, il a besoin d'un long temps d'exploration du matériel composant le parcours de billes avant de ne pouvoir construire un parcours. Contrairement aux deux enfants précédents, Romaric, 12 ans et 6 mois, marque des relations entre les objets et élabore en dehors de l'action lors des ateliers 2 et 3. Le parcours de billes est connu et compris de Romaric, ce qui explique l'apparition d'un langage informatif. Il fait le lien entre ses expériences et ses connaissances. Ses mots expliquent aussi ses actions lors de l'exploration du matériel non-symbolique. 88 Nous parlons ici de prémices d'un langage informatif car le langage descriptif est encore prédominant chez ces enfants. Par ailleurs, chacun est dans un rapport au réel différent et ce langage informatif se manifeste mieux dans certains ateliers selon les enfants. 2. 3. Les enfants en organisation d'actions avec un langage informatif, quel que soit l'atelier Nous retrouvons ici les trois enfants tout-venant : Léonie, 7 ans et 3 mois, Victoire, 9 ans et 8 mois, et Valentine, 10 ans et 9 mois. En effet, seuls ces enfants se situent dans une organisation d'actions, quel que soit le matériel mis à leur disposition, et utilisent un langage informatif. Toutes les trois peuvent exercer avec la même efficacité des mises en relation qui nous renseignent sur leur compréhension du monde et des changements produits par leurs actions. 3. Analyse des conduites des enfants diagnostiqués dysphasiques 3. 1. Les conduites ludiques La phase d'exploration du matériel est variable d'un atelier à l'autre et d'un enfant diagnostiqué dysphasique à un autre, mais celle-ci est généralement beaucoup plus longue chez ces enfants que chez ceux de la population contrôle. Après avoir observé, touché, déplacé les objets, nombreux sont les enfants en découverte et vérification des propriétés des objets. Cette méconnaissance des propriétés des objets entrane un ajustement des conduites souvent inefficace. Ils rencontrent des difficultés dans l'analyse des éléments qui constituent les situations. Les répétitions des actions sont aussi importantes chez ces enfants. Ces réitérations contribuent à la construction d'une certitude de la permanence de leurs conduites, ce qui développe la pensée. Ils semblent fixés à un stade : une action a un effet immédiat. Cette immédiateté ne 89 permet pas l'introduction de variations sur les actions, ni sur les objets. Ces enfants sont dans le moment et la recherche d'une mise en relation est difficile. Les préoccupations cognitives sont réduites vis-à-vis de l'objet. On relève très souvent une absence de mise en relation et de travail à partir de ces préoccupations. Par ailleurs, ces conduites de rapport aux objets sont présentes chez des enfants plus jeunes. Les mises en liens des objets et des actions sont essentiellement relevées dans les situations contraintes qui suggèrent une succession, une organisation. Toutefois, nous pouvons nous poser la question d'un certain apprentissage pour ces ateliers. En effet, ces enfants rencontrent des difficultés dans leur rapport aux objets mais ils sont capables d'apprentissage. Nous pouvons alors être face à une illusion dans leur organisation. On remarque également que lorsqu'un enfant attribue une signification à un objet nouveau , il ne l'introduit pas dans le faire-semblant. Cet objet est juste dénommé comme tel, mais il n'est pas agi. En outre, nous notons une grande hétérogénéité des conduites selon les ateliers chez les enfants diagnostiqués dysphasiques, alors qu'on retrouve une certaine homogénéité pour la population contrôle. Cette homogénéité chez les enfants tout-venant est due au fait que les ateliers proposés sont normalement réussis par des enfants plus jeunes. Par conséquent, les différences liées à l'âge s'estompent. Alors que, chez les enfants diagnostiqués dysphasiques, nous relevons des différences en fonction de l'âge. Ainsi, aucun enfant diagnostiqué dysphasique ne se situe dans une organisation d'actions et dans le faire-semblant. Rappelons ici que, dans la littérature, ces conduites sont relevées chez l'enfant de deux ans. Enfin, il est important de noter que, malgré les difficultés rencontrées, les enfants se sont montrés intéressés par le matériel qui leur était proposé. Ce dernier leur permettait de faire ce qui était à leur niveau et au centre de leurs préoccupations cognitives. Ainsi, nous avons ressenti moins d'angoisse ou de frustration, comme il peut y avoir dans des activités plus dirigées. Nous avons également relevé des évolutions positives au cours des ateliers. 90 3. 2. Les conduites langagières Nous tenons à relever une réduction du domaine infra-verbal chez les enfants diagnostiqués dysphasiques. En effet, beaucoup n'utilisent pas les mimiques au cours des ateliers alors que ces dernières contribuent à la communication et à la compréhension pour l'interlocuteur. Mais plus qu'un simple instrument de communication, le langage illustre la façon dont on se représente mentalement une réalité. Le langage, chez ces enfants diagnostiqués dysphasiques, sert essentiellement à décrire et constater le résultat de leurs actions. Il est alors collé au réel. Il ne peut donc s'exprimer au-delà de ce qu'ils voient et touchent, dans l'immédiateté. Les schèmes verbaux sont liés aux schèmes sensori- moteurs. L'organisation et la réélaboration mentales de leurs expériences posent difficulté à ces enfants. Leurs énoncés sont majoritairement courts, juxtaposés et de type descriptif. Les relations entre les mots sont rares et ne sont pas présentes dans tous les ateliers. En panne de liens , aucun n'anticipe, n'annonce un projet, contrairement aux enfants tout- venant. Leur langage, tout comme certaines de leurs conduites, peut apparatre comme une illusion. En effet, lorsqu'ils attribuent une signification à un objet nouveau ou lorsqu'ils jouent avec les objets symboliques, leurs mots et énoncés sont trompeurs . Ils signifient mais ne symbolisent pas, ils demeurent dans une imitation différée et n'utilisent pas le langage comme outil de création. 3. 3. Liens entre conduites ludiques et langagières Une de nos hypothèses de départ s'intéressait au lien entre le développement cognitif et le langage chez les enfants diagnostiqués dysphasiques. L'enfant accède au langage, et donc à la sémiotisation, lorsqu'il s'est approprié le monde par ses expériences. Le langage est d'abord descriptif et collé au réel et prend ensuite une fonction 91 objectivante quand il se détache du réel et crée un lien entre ce dernier et la pensée. Souvent, ces enfants restent silencieux durant les ateliers. Ils se situent dans une exploration des objets, une vérification de leurs propriétés et des actions. Ainsi ils se créent encore du connu afin d'organiser leur réel et ils élaborent alors peu en dehors de l'action. Comme nous l'avons écrit précédemment, les énoncés informatifs apparaissent pour la plupart dans les situations contraintes ou bien connues de l'enfant. Au terme de nos analyses, nous pouvons dire que le niveau de langage de ces enfants reflète leur niveau de compréhension et d'appropriation des composants de la situation. Plus les objets seront mis en relation et les actions seront coordonnées, plus leur langage sera lui aussi organisé. 92 VII. DISCUSSION 1. Précautions méthodologiques Notre population d'étude comprend seulement dix enfants diagnostiqués dysphasiques, ce qui représente un échantillon très faible et qui ne permet donc de généraliser les résultats obtenus dans ce mémoire de recherche. De plus, nous avons fait le choix de critères d'inclusion larges : les âges vont de 7 ans et 1 mois à 12 ans et 6 mois, et des diagnostics de dysphasie de différents types. Ces critères peuvent être en partie une raison de la grande hétérogénéité des résultats. Notre population contrôle comporte seulement trois enfants, de sexe féminin, alors que nous comptons neuf garçons diagnostiqués dysphasiques. Nous avons aussi conscience que nos analyses se font à partir de quatre ateliers seulement, qui représentent globalement une heure et demie de passation pour chaque enfant. Lors de la formation de notre population d'enfants diagnostiqués dysphasiques majoritairement de sexe masculin, la question du refus de jouer avec les objets symboliques s'est posée avant les expérimentations. Celle-ci est finalement davantage en lien avec l'âge que le sexe de l'enfant. Le matériel était parfois connu des enfants, comme cela a été le cas avec le parcours de billes, ce qui a pu jouer sur les conduites des enfants. Enfin, les conditions de passations ont été parfois très différentes. Nous avons dû changer de lieu à chaque séance avec certains enfants et la pièce mise à notre disposition n'était pas toujours connue de l'enfant. Le matériel présent dans la pièce o nous étions était plus ou moins important et a pu parfois influencer certaines conduites. Le bruit environnant était important lors de certaines séances. 93 Les ateliers se sont déroulés en présence de l'orthophoniste ou de façon duelle, les enfants ont pu être intimidés en fonction de la situation. La présence de la caméra a pu également influer sur les conduites des enfants. Généralement, elle ne semblait pas gêner. Toutefois, les conditions pour filmer étaient différentes. Seule, ma disponibilité a pu être ressentie comme moins importante comme je devais également filmer. 2. Validation des hypothèses La première de nos hypothèses était : Les enfants dysphasiques rencontrent des difficultés dans les mises en relation entre les objets et l'organisation des actions . Cette première hypothèse est validée. Aucun enfant diagnostiqué dysphasique ne procède par organisation d'actions dans l'ensemble des ateliers, contrairement aux enfants tout-venant. Et tous rencontrent des difficultés à mettre en relation les objets par manque de connaissances sur les propriétés de ces derniers. La deuxième hypothèse était : Les conduites ludiques des enfants diagnostiqués dysphasiques sont en décalage avec leur âge . Cette hypothèse est validée. Nous avons vu que les préoccupations cognitives de ces enfants, et donc leur rapport aux objets, étaient similaires à ceux d'enfants plus jeunes. Les enfants diagnostiqués dysphasiques rencontrent des difficultés d'accès au jeu symbolique constituait notre troisième hypothèse. Cette hypothèse est elle aussi validée. Aucun enfant diagnostiqué dysphasique n'a accès au jeu symbolique. Notre quatrième hypothèse était : Les enfants diagnostiqués dysphasiques emploient majoritairement un langage descriptif, qui ne marque pas les mises en relation, qui ne fait pas le lien entre expériences et connaissances . Notre hypothèse de départ est là encore validée. Le langage descriptif est prédominant chez ces enfants. Des prémices d'un langage informatif sont relevées quand les composantes de la situation sont comprises, principalement dans des situations contraintes. La cinquième hypothèse, en lien avec la précédente, était : Le niveau de langage des 94 enfants diagnostiqués dysphasiques est en lien avec leurs conduites d'actions . Elle est également validée. Le langage descriptif est fortement présent lorsque l'enfant est collé au réel et ne s'approprie pas les propriétés du matériel. Les premières manifestations d'un langage informatif sont quant à elles présentes dans les ateliers o l'enfant se situe dans une compréhension de la situation. Enfin, notre dernière hypothèse, qui est elle aussi validée, était : Le rapport aux objets, sous l'angle des conduites ludiques et langagières, est très différent entre enfants diagnostiqués dysphasiques et enfants tout-venant . L'ensemble des analyses réalisées dans ce mémoire confirme l'écart important des conduites de la population pathologique et de la population contrôle. 3. Apports de ce mémoire de recherche Au-delà des moments de doutes et des difficultés rencontrés au cours de cette année, nous retenons surtout l'apport de ce mémoire de recherche pour notre future pratique professionnelle. Ce travail a grandement contribué à notre réflexion sur le rôle et le positionnement de l'orthophoniste. Nous avons également appris à affiner notre regard clinique, notamment grâce au support vidéo. Les visionnages multiples des films nous ont permis de nous questionner, d'affiner l'analyse des conduites, d'être attentifs aux gestes, aux mots et aux regards des enfants. Ce mémoire nous a permis d'approfondir nos connaissances des enfants diagnostiqués dysphasiques. Les recherches théoriques nous ont essentiellement apporté des renseignements qui concernent le domaine du langage. Mais notre travail a mis en évidence que ces enfants avaient un rapport aux objets, et donc au monde, particulier. Leur langage qui parat inorganisé serait lui- même le reflet de leur rapport au réel. Un diagnostic a été posé pour ces dix enfants, mais il semble important d'aller au-delà d'une étiquette . Il nous parat nécessaire de prendre appui sur nos observations et analyses pour notre clinique. Un bilan et une rééducation, non uniquement centrés sur le langage, permettraient à ces enfants de se créer des certitudes, de s'organiser, de mettre en relations dans leurs actions puis dans leurs mots. En effet, ce travail d'observation peut être à la fois un outil d'approfondissement d'un bilan et par la suite un outil clinique. 95 L'élaboration de ce mémoire nous a permis de vivre une expérience plus qu'enrichissante, tant sur le plan professionnel que personnel. Ce travail nous a rappelé les remises en questions et démarches de réflexion nécessaires à notre futur métier. Par ailleurs, nous avons appris à ne pas être en attente d'une conduite particulière mais à nous laisser surprendre par ces enfants. Nous nous devons d'être attentifs à ce que l'enfant nous propose et nous montre. Ainsi, nous pourrons lui proposer une prise en charge adaptée à ses préoccupations et qui lui permettra de construire des connaissances, mais surtout de se construire. 4. Ouvertures Il serait intéressant dans les recherches à venir de proposer notre dispositif expérimental à un échantillon de population plus important afin de confirmer, ou non, les résultats obtenus dans ce mémoire. Il serait également pertinent de proposer un suivi longitudinal de ces enfants avec une rééducation axée sur leurs préoccupations cognitives et d'analyser si une évolution de leur langage a lieu à la suite de ce suivi. Enfin, une analyse des verbes employés chez ces enfants diagnostiqués dysphasiques parat elle aussi intéressante. Pour ce faire, il faudrait repenser le matériel proposé afin qu'il fasse émerger davantage de verbes dans leurs énoncés. 96 CONCLUSION Ce mémoire de recherche avait pour objectif l'investigation du rapport aux objets chez des enfants diagnostiqués dysphasiques, donc porteurs d'un trouble sévère du langage oral. Nous nous sommes interrogés sur la capacité de ces enfants à coordonner leurs actions, symboliser avec des objets et utiliser des mots pour rendre compte et représenter. Nos hypothèses étaient que ces enfants avaient des conduites ludiques en décalage avec leur âge, qu'ils n'agissaient pas en organisation d'actions et n'accédaient pas au jeu symbolique. De plus, leur langage était majoritairement descriptif et leur niveau de langage était en rapport avec leurs conduites d'actions. Pour répondre à ces hypothèses, nous avons étudié les conduites ludiques et langagières de dix enfants diagnostiqués dysphasiques et de trois enfants tout-venant à partir de différents objets, symboliques ou non, avec une contrainte de causalité ou non. Malgré le faible échantillon de notre population, son hétérogénéité et des analyses réalisées sur seulement quatre ateliers, cette étude a pu mettre en évidence un rapport particulier aux objets de la part des enfants diagnostiqués dysphasiques. Ces enfants ne sont pas seulement des enfants qui parlent mal et peu . Ils seraient en panne dans leur développement langagier, donc dans leur capacité à sémiotiser, en partie parce qu'ils n'ont pas construit les invariants fondamentaux : propriétés des objets, des actions et des relations entre les objets. Ce travail de recherche montre également que le langage est un outil : outil de communication mais aussi outil de pensée, d'objectivation et de création. Les mots permettent le passage des expérimentés aux représentations et nous signalent la compréhension des choses et du monde qui nous entoure. Puis les mots permettent aussi de se détacher du réel et ainsi créer, inventer, raconter. Il nous parat donc indispensable de proposer à ces enfants une prise en charge 97 orthophonique non seulement axée sur la dimension langagière. Nous devons leur proposer des espaces à penser 55 o ils pourront explorer et découvrir les objets, le réel et faire des liens entre leurs expériences et leur langage. L'enfant doit être acteur de sa prise en charge car son activité crée le besoin de langage. Le thérapeute est là pour s'adapter et proposer une pratique répondant aux préoccupations cognitives de son patient. 55 MOREL L. 2007, Invitation à l'observation du jeu et de la main et des mots chez des enfants en difficultés avec le langage, Rééducation Orthophonique, n 231, p 54 98 REPÈRES BIBLIOGRAPHIQUES OUVRAGES : BRIN F. , COURRIER C. , LEDERLE E. , MASY V. , 2004, Dictionnaire d'orthophonie, Isbergues : Ortho-Edition, 2ème édition. DE WECK G. , ROSAT M-C. , 2003, Troubles dysphasiques. Comment raconter, relater, faire agir à l'âge préscolaire, Paris : Masson. DOLLE J-M. , 1999, Pour comprendre Jean Piaget, Paris : Dunod, 3ème édition. CHEVRIE-MULLER C. , NARBONA J. , 1999, Le langage de l'enfant, aspects normaux et pathologiques. Paris : Masson, 2ème édition. GERARD C-L. , 1993, L'enfant dysphasique, Bruxelles : De Boeck. GOLSE B. , BURSZTEIN C. , 1990, Penser, parler, représenter. 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E. , n99 101 ANNEXES Annexes 1 : Grilles d'observation Annexe 2 : Œufs gigognes Annexes 3 : Parcours de billes Annexe 4 : Objets non-symboliques Annexe 5 : Caisse-enregistreuse et objets symboliques Annexes 6 : Passations et analyses individuelles 1. Les enfants diagnostiqués dysphasiques 1. 1. Sylvain, 7 ans et 1 mois 1. 2. Louis, 8 ans et 5 mois 1. 3. Loïc, 8 ans et 8 mois 1. 4. Quentin, 9 ans et 6 mois 1. 5. Léna, 9 ans et 6 mois 1. 6. Arthur, 10 ans et 6 mois 1. 7. Marc, 10 ans et 11 mois 1. 8. Paul, 11 ans 1. 9. Brice, 12 ans 1. 10. Romaric, 12 ans et 6 mois 2. Les enfants tout-venant 2. 1. Léonie, 7 ans et 3 mois 2. 2. Victoire, 9 ans 8 mois 2. 3. Valentine, 10 ans et 9 mois II V VI VIII IX X X X XVII XXIII XXIX XXXV XLI XLVI LII LVIII LXIV LXX LXX LXXV LXXX Annexes 7 : Les différents parcours de billes des enfants LXXXIV Annexes 8 : Les différentes réalisations des enfants avec les objets non-symboliques XCI I Annexes 1 : Grilles d'observation Anticipation : effet annoncé projet annoncé Réitération : d'actions d'organisation d'objets Atelier 1 : Oeufs gigognes Embotement non réussi Embotement des œufs réussi sans aide Embotement des œufs réussi suite à l'aide Langage informatif et avant l'action Atelier 2 : Parcours de billes Actions : Actions simples juxtaposées Organisation d'actions Organisation d'objets : Juxtaposition d'objets Réitération d'une même juxtaposition d'objets Recherche d'identiques Couples Disposition spatiale particulière Assemblage Élaboration à partir du résultat : Ajustement efficace Ajustement inefficace Langage : avant l'action pendant l'action après l'action Moment d'énonciation : Adressé à l'adulte Répétition Descriptif Informatif II Atelier 3 : Matériel non symbolique Actions : Actions simples juxtaposées Organisation d'actions Organisation d'objets : Juxtaposition d'objets Disposition spatiale particulière Recherche d'identiques Couples Alignements Groupements Assemblage Construction Élaboration à partir du résultat : Ajustement efficace Ajustement inefficace Langage : avant l'action pendant l'action après l'action Moment d'énonciation : Adressé à l'adulte Répétition Descriptif Informatif Atelier 4 : Caisse enregistreuse et matériel symbolique Succession temporelle d'actions contrainte au matériel Actions : Organisation d'actions Réitération Organisation d'objets : Disposition spatiale particulière Recherche d'identiques Couples Alignements Groupements Assemblage Ajustement : Exprime par des gestes ou des mots l'écart entre effet produit et résultat attendu Ajustement efficace à partir du résultat Ajustement inefficace à partir du résultat III Langage : avant l'action pendant l'action après l'action Moment d'énonciation : Adressé à l'adulte Répétition Descriptif Informatif Aspects symboliques : Imitation immédiate Imitation différée Détournement d'objets Mise en place d'une scène, d'un projet Faire-semblant IV Annexe 2 : Œufs gigognes Matériel Cogi'lud 5 Annexe 3 : Parcours de billes Éléments principaux Nathan Éléments d'un autre jeu ne pouvant être assemblés aux précédents Nathan VI Exemple d'une construction VII Annexe 4 : Objets non-symboliques VIII Annexe 5 : Caisse-enregistreuse et objets symboliques Caisse-enregistreuse FisherPrice IX Annexes 6 : Passations et analyses individuelles 1. Les enfants diagnostiqués dysphasiques 1. 1 Sylvain, 7 ans et 1 mois Nous rencontrons Sylvain en janvier 2011 lors d'une de ses séances d'orthophonie pour qu'on puisse faire connaissance avant le début des passations. Nous nous sommes revus par la suite à trois reprises au cours des mois de janvier à mars, en présence de son orthophoniste. Le diagnostic de trouble spécifique du langage oral en présence d'un raisonnement non langagier adapté à l'âge a été posé en 2009. Sylvain est suivi en orthophonie depuis septembre 2006 et est scolarisé en CLIS TSL depuis la rentrée de septembre 2010. Le langage de Sylvain est parfois peu intelligible mais toujours très intoné et mélodieux. Son visage est également expressif. Sylvain est un enfant qui initie facilement la conversation et qui ne semble pas timide en notre présence. Cependant, son langage ne nous est pas toujours adressé, des ruptures dans la communication et l'échange seront ressenties à plusieurs reprises. Sylvain peut facilement changer d'activité au cours d'une séance et être attiré par le reste du matériel présent dans la pièce. Il faudra alors que nous redirigions son attention sur les objets mis à sa disposition pour l'atelier. 1. 1. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Lorsque nous présentons les douze éléments à Sylvain, il nous demande pourquoi c'est tout X cassé ? et nous dit ensuite on peut réparer . Il assemble un premier œuf : le plus petit. Il continue d'assembler les œufs en introduisant dans le plus grand celui qu'il vient de réunir. Il obtient alors un seul œuf apparent, qui contient les cinq autres œufs. La première consigne est redonnée, Sylvain reproduit la même chose. Nous lui proposons alors de se tourner et nous assemblons à notre tour deux œufs. Sylvain parvient ensuite à assembler les six œufs à partir de cette initiation, en nous demandant à notre tour que nous nous retournions pour ne pas voir ce qu'il fait. Nous donnons alors la deuxième consigne à Sylvain, c'est-à-dire voir cinq œufs . Sylvain rassemble les œufs devant lui sur la table. Un des œufs tombe au sol et se brise en ses deux parties : bah, il a enlevé tout seul ! , comme si l'objet était animé. Amusé et surpris par ce résultat, il cherche alors à le reproduire et le vérifier en jouant avec les œufs sur la table et en les faisant rouler doucement afin qu'ils tombent : I(l) va tomber ! . Il poursuit son jeu et fait glisser tous les œufs dans notre direction : nous parvenons ou non à les rattraper. Sylvain rit beaucoup, tape des mains sur la table et nous dit à la fin a gagné, a gagné ! . Sylvain n'extrait pas les propriétés de mise en relation du matériel car il est concerné par les actions de lancer et tomber . Il réitère ces actions afin de retrouver le résultat qui l'a surpris et intéressé. 1. 1. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Sylvain se montre davantage intéressé par le matériel de cet atelier : A plein de jouets ! . Il commence son exploration en assemblant deux éléments arrondis, puis trois autres éléments différents dont l'entonnoir. Il essaie alors de lui-même avec une bille : Wouah, ça descend ! . Sylvain poursuit ses expériences avec le matériel afin de se créer des certitudes quant aux propriétés physiques des différents éléments mis à sa disposition. Il se situe dans un assemblage des éléments car il parvient facilement à fixer ensemble plusieurs éléments. Toutefois, Sylvain demeure dans une juxtaposition d'actions car il persiste dans un enrichissement linéaire sans projet défini et le passage de la bille n'est pas toujours bien anticipé. XI Sylvain obtient un parcours56 qu'il modifie au cours de l'atelier mais la structure principale reste présente. Il rencontre certaines difficultés avec les billes. En effet, celles-ci restent coincées à plusieurs endroits du parcours et Sylvain met du temps à s'ajuster. Il pousse les billes, les récupère mais n'ajuste pas son parcours. Il se retrouve alors face au même problème. Sylvain fixe un long tuyau au-dessus d'un élément dans son parcours. Nous mettons des billes à l'intérieur du tuyau mais celles-ci restent également bloquées. Une bille est apparente à l'extrémité supérieure : Oh il est bloqué, pas tombé . Sylvain constate la situation, enlève la bille et met son doigt à l'intérieur du tuyau. Il sent alors une autre bille, regarde dans le tuyau puis l'enlève du reste de la structure. Surpris de voir tomber des billes, Sylvain dit : Oh ! Il était plein ! . Tant qu'il n'avait pas vu les billes sortir du tuyau, Sylvain ne comprenait pas pourquoi les billes ne tombaient pas. Il est difficile pour lui d'imaginer ce qu'il ne voit pas, de se créer une image mentale de l'intérieur de tuyau. Par ailleurs, Sylvain porte plusieurs fois à la bouche les billes au cours de l'atelier. Il explore le matériel par son corps. Ces billes se voient également attribuer une fonction animée, tout comme pour les œufs de l'atelier 1, lorsque Sylvain dit : Roule, roule tout seul ou Mais i(l) s'en va ? I(l) s'en va. Pou(r)quoi i(l) s'en va ? . Les propriétés physiques des billes sont mal connues de Sylvain. Son langage reste descriptif tout au long de l'atelier. Il constate les résultats de ses actions : Gade (regarde), c'est bloqué , (en)core coincé , ça tombé dedans . Plusieurs fois au cours de l'atelier, Sylvain demande notre aide, tu peux m'aider ? , ou attire notre attention, rega(r)de ! , bien qu'il ne regarde pas dans notre direction lors de ses énoncés. 1. 1. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Sylvain explore le matériel et commence par prendre une boule de pâte à modeler rouge à laquelle il juxtapose petit à petit d'autres objets : pince à linge, grillage, bâtonnet, pic, bolduc, chips 56 Annexes 7, p LXXXIV XII en polystyrène, tissu, etc. Il se situe dans une juxtaposition d'actions simples avec ces objets : pincer, enfoncer, dérouler, couper, scotcher, ou encore recouvrir. Sylvain n'annonce pas un projet, ses actions ne sont pas dirigées vers un but prédéfini. Il se situe ainsi dans un fonctionnement linéaire qui mène toutefois à la création d'un objet nouveau57. Il obtient cet objet au bout de quinze minutes d'atelier. Il le pose ensuite sur le papier journal, sur une table de la pièce. Il poursuit l'exploration de la bote contenant le matériel et fait alors des aller-retour entre la bote et la table et continue ainsi la juxtaposition d'autres éléments. Sylvain se montre très intéressé par les rouleaux de ficelle et bolduc. Il les déroule jusqu'au bout, les emmêle, les coupe. Lorsqu'il déplace une nouvelle fois sa construction sur une autre table de la pièce, Sylvain trouve des feutres pour tableaux blancs. Il s'en saisit et commence à dessiner des choses au tableau en nous expliquant une histoire : Faut pas faire (l)a bêtise, pas la bagarre Nous attirons de nouveau son attention sur la bote. Sylvain nous demande de faire un rond (une boule) avec la pâte à modeler qu'il nous tend. Il enfonce ensuite un bâtonnet au travers de cette boule. Nous tournons ensuite chacun notre tour ce bâtonnet sur lui-même afin de faire tourner la boule également. Cette dernière se détache du bâtonnet mais Sylvain s'ajuste efficacement et soude la pâte à modeler au bâtonnet : Il faut coller comme ça . Sylvain signifie seulement sa première construction suite à notre demande : Un vaisseau spatial, il vole la fusée ! . Il attribue une signification mais l'objet n'est pas agi tel qu'il est signifié. Le langage de Sylvain reste descriptif pendant tout l'atelier. Enfin, lors des cinq dernières minutes de l'atelier, Sylvain rejoue avec les feutres et le tableau blanc. 57 Annexes 8, p XCI XIII 1. 1. 4. Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Sylvain passe les deux premières minutes à explorer les différents boutons de la caisse- enregistreuse sans chercher les pièces. Il appuie sur les boutons et regarde les petits écrans o les images changent. Il essaie ensuite d'ouvrir le tiroir-caisse en tirant dessus puis tourne la manivelle : Ah voilà, a p(l)ein d'sous ! . Sylvain continue son exploration avec les pièces. Il les met dans les différentes encoches, appuie sur les boutons sale ou change et recommence. Lorsqu'il récupère les pièces, il dit très souvent : a gagné ! . Puis il parle de voleur : Voleur va voler les sous . Le thème du voleur est un thème qui revient souvent dans les jeux de Sylvain. Il part alors cacher les sous (une pièce de chaque couleur) dans un des placards de la pièce. Avec la caisse-enregistreuse, Sylvain demeure dans une succession temporelle d'actions contrainte par le matériel. L'organisation logique de l'objet n'est pas atteinte. Sylvain peut appuyer sur les boutons change ou sale sans avoir appuyé sur les boutons sous les encoches. Lorsqu'il appuie sur change et que les billes tombent sur le côté de la caisse, il est surpris du résultat : Oh non, c'est pas la bonne ! . Il marque dans son langage l'écart entre son action et l'effet attendu. Sylvain est très attiré par les autres objets présents dans la pièce, comme lors de l'atelier 3, notamment trois maisons gigognes que l'on peut fermer à l'aide d'une clé. Il revient également à son histoire de voleur , fermer à clé , cacher les sous . Il est difficile de le sortir de cette situation et de ramener son attention au matériel de l'atelier. Nous décidons alors d'introduire le reste des objets symboliques, mais Sylvain reste à jouer avec les maisons gigognes. Une fois toutes les maisons refermées, il se tourne vers le matériel disposé au sol, prend une banane et nous la tend tiens, mange . Nous faisons alors semblant de la manger. Cependant, Sylvain change tout de suite d'activité et cherche un jeu sonore dans les étagères. Il ne semble pas intéressé par le matériel proposé, nous le laissons jouer quelques instants puis lui proposons de nouveau de regarder les autres objets. XIV Sylvain touche les paniers, met les deux petits paniers rouges dans le grand panier bleu puis dit : Tiens, achète ! . C'est finalement lui qui prend les fruits et légumes. Il recherche des identiques : Lui : Achète. celui-là ! , prend une banane et la met dans le panier bleu, une banane Il regarde et prend une seconde banane qu'il ajoute dans le panier. Lui : Encore banane ! A plus banane Nous : Ah non, il n'y a plus de bananes Lui : Carottes. , cherche toutes les carottes, Oh, a plus carottes et les pose dans le panier. Il prend deux pommes de terre. Ca aussi. euh non pas ça et repose les pommes de terre. Il prend alors les deux citrons. Ca aussi. euh. c'est tout ! . Nous annonçons ensuite un prix à Sylvain, il nous donne l'argent et part avec son panier et la caisse-enregistreuse. Il revient, repose le tout au sol et dit : Allez, on va manger ! . Il répartit les fruits et légumes dans les deux paniers rouges et nous en donne un. Il fait semblant de manger les aliments puis les pose sur le bureau : poubelle ! . Sylvain reconnat les propriétés symboliques des objets mais il fonctionne par imitation différée. Ses actions restent juxtaposées et il n'installe pas son jeu dans une situation. Il reproduit des paquets d'actions qu'il connat mais ne se les approprie pas. 1. 1. 5. Analyse globale Sylvain demeure dans une juxtaposition d'actions, sans mise en relation des objets, au cours des différents ateliers. Il se situe dans un rapport particulier aux objets. A plusieurs reprises, Sylvain attribue une fonction d' être animé aux objets, notamment lorsque ceux-ci roulent. Il explore également ces objets par le corps, lorsqu'il porte les objets à la bouche par exemple. Nous pouvons parler d'une XV ambivalence des conduites relationnelles. Ses préoccupations cognitives tournent autour d'actions simples et réitérées : enfoncer, couper, scotcher, dérouler. Il juxtapose ces actions sans projet défini ou anticipé. Son jeu avec les objets symboliques correspond à une imitation différée, o Sylvain réitère les mêmes actions. Son langage ne notifie pas les transformations, les mises en relation, la causalité. Ses énoncés restent descriptifs, quel que soit l'atelier. Enfin, Sylvain est facilement attiré par le reste du matériel présent dans la salle. Son langage suspend alors les actions en cours et ne signifie pas des actions qui ont précédé. Lors de ces moments, il est difficile d'obtenir son attention, Sylvain ne semble pas nous entendre. Nous pouvons dire que la fonction phatique du langage n'est pas toujours présente en réception chez Sylvain. XVI 1. 2. Louis, 8 ans et 5 mois Nous faisons la connaissance de Louis en décembre 2010, en présence de son orthophoniste. En février 2008 a été posé le diagnostic de trouble spécifique du langage oral, de type dysphasie phonologique-syntaxique . Il est noté que le versant réceptif est également entravé et des difficultés praxiques sont relevées. Louis est actuellement scolarisé en milieu spécialisé et suivi en orthophonie depuis 2006. Lors de notre première rencontre, Louis est un garçon plutôt timide mais il s'ouvrira à nous au fil des deux séances suivantes, o nous serons seulement tous les deux. Louis parle peu et ne me regarde que très rarement lorsque nous échangeons. Son visage est peu expressif et il semble toujours très centré sur ce qu'il est en train de faire. 1. 2. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Louis associe un premier œuf, le plus grand : on peut faire ça . Il poursuit alors en assemblant les cinq autres œufs par tâtonnement et les ordonne debout du plus grand au plus petit devant lui : voilà ! . Afin de ne voir plus que cinq œufs, il défait alors cinq œufs en comptant à voix basse : un, deux, trois, . . Il obtient alors dix éléments séparés et le plus petit œuf O1 toujours formé. Nous redonnons la consigne et il rassemble les six œufs. Nous initions alors l'encastrement en lui demandant de se tourner. Il émet un wouah de surprise lorsque nous lui disons qu'il peut regarder. Quand il doit à son tour obtenir cinq œufs, il modifie la place des œufs sur la table et en prend un dans sa main. Durant cet atelier, Louis essaie aussi à plusieurs reprises de superposer les œufs, de les accoler entre eux. Il explore également le matériel en mettant sa main dans une demi-coquille ou en la portant à sa bouche : il expérimente directement avec son corps. Louis ne parvient pas à mettre davantage en relation les éléments. La relation de grandeur est identifiée car il va sérier les œufs du plus grand au plus petit mais il ne réussit pas à encastrer un XVII élément dans un élément plus grand. Cette sériation, non notifiée dans son langage, est certainement possible pour Louis car le matériel doit lui évoquer d'autres objets à sérier. Il reproduit alors quelque chose qu'il connat mais ne semble pas avoir acquis. Enfin les aspects physiques des œufs intéressent également beaucoup Louis durant cet atelier. 1. 2. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Louis commence par explorer le matériel et essaie d'assembler des éléments entre eux mais y parvient très difficilement. Il exprime ses difficultés à plusieurs reprises au début de l'atelier : ah c'est dur ! . Au bout de dix minutes, Louis n'a pas réussi à superposer plus de deux éléments. Nous décidons avec son orthophoniste d'intervenir en lui demandant de nous expliquer ce qu'il a déjà fait. Nous l'incitons à essayer avec une bille à plusieurs reprises pour qu'il se crée ses premières certitudes face à ce matériel. Rassuré, Louis poursuit son exploration et sa recherche d'identiques, en couleur et en forme. Louis réussit facilement à superposer les tuyaux qui sont des éléments plus simples à juxtaposer que les éléments arrondis ou droits. Il commence alors à superposer plusieurs tuyaux et obtient un parcours constitué d'une base, de plusieurs tuyaux et d'un élément arrondi au sommet. Cette construction58 sera reprise avec pour seules différences : la couleur de la base, le nombre de tuyaux superposés et l'élément final au sommet. Louis obtient plusieurs parcours de ce genre car il ne parvient pas à assembler d'autres éléments entre eux. Il reste donc dans des juxtapositions de paquets d'éléments qu'il connat. Il essaie parfois d'ajouter un élément arrondi à un élément droit par exemple, mais il n'y parvient pas. Suite à ces situations de déséquilibre, il poursuit sa superposition de tuyaux. De plus, Louis est très intéressé par le parcours de la bille dans les différents éléments. Il suit la bille du regard dans l'élément au sommet et lorsqu'elle tombe dans les tuyaux. Il colle son oeil au tuyau du haut. Il ne cherche pas à voir o la bille tombe au début, puis regarde par o elle sort ensuite. 58 Annexes 7, p LXXXIV XVIII Ses parcours se cassent parfois mais Louis n'exprime rien, ni par des mots, ni par des mimiques. Il ne parlera pas lors de l'atelier, mais il dira à la fin elle est grande ma tour ! . Malgré les difficultés initiales, Louis semble fier de son parcours final qui est en effet très haut. 1. 2. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Louis débute l'atelier par une juxtaposition d'actions simples sans projet défini : rouler, écraser, trouer, couper, scotcher, fractionner. Ces actions peuvent être réitérées avec ou sur des objets différents. Il passe d'un objet à un autre, revient parfois sur ce qu'il a déjà fait. Louis explore les différents objets proposés et leurs propriétés physiques durant les vingt premières minutes. Puis, à partir d'un tuyau en carton et de pâte à modeler bleue, Louis répète la même séquence d'actions plusieurs fois : prend un bout de pâte à modeler, forme une boule en roulant la pâte à modeler entre ses mains puis l'écrase sur le tuyau en carton. Par cette succession d'actions, Louis obtient un alignement de plusieurs points de pâte à modeler au sommet du tuyau en carton qu'il pose debout au sol. Nous : Super ! Qu'est-ce que c'est ça. ? Lui : Ca, c'est un bonhomme . Louis ne décrit sa création que lorsque nous lui demandons, nous ne pouvons pas parler d'un projet défini et annoncé. Louis trouve une ressemblance fortuite au terme de sa répétition d'action et la signifie certainement parce que nous le lui demandons. Louis réitère alors les mêmes actions afin d'obtenir un second bonhomme très ressemblant au premier. Il prend alors les deux tuyaux dans ses mains59 et les tape l'un contre l'autre, des morceaux de pâte à modeler tombent au sol. Avant de terminer l'atelier, nous demandons à Louis de nous expliquer ce qu'il a fait : Lui : Moi j'ai fait. il est o mon bonhomme ? Lui il est cassé ! Lui (le non cassé) il s'est battu avec celui-là (celui qui est cassé). Et l'autre il veut faire hop hop hop hop. Ah j'ai 59 Annexes 8, p XCI XIX perdu mon oreille ! Le reste de l'atelier, Louis ne dira rien d'autre spontanément. Son visage reste toujours très neutre également. Louis n'éprouve pas le besoin de parler durant son exploration des aspects physiques du matériel. Tout comme lors de l'atelier précédent, il réitère les mêmes actions et varie peu les éléments. 1. 2. 4. Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Louis commence à explorer la caisse enregistreuse en essayant à plusieurs reprises d'introduire les pièces par le trou sur le côté de la caisse et non par les encoches. Il découvre ensuite les encoches et leur fonctionnement. Une fois une pièce de chaque couleur dans la caisse- enregistreuse, Louis appuie au hasard sur le bouton change et les pièces tombent dans le toboggan. Louis nous regarde et sourit. Nous : Oh ! Comment t'as fait ? Lui : J'ai fait, j'ai fait ça (fait tomber la pièce rouge), après j'ai fait ça (puis la pièce jaune) et ça (puis la pièce orange), attends (pièce coincée) et après (il appuie sur sale ) Oh quand il ne voit pas tomber les pièces dans le toboggan. Il tourne la manivelle, regarde par le trou sur le côté, dans les encoches et enfin dans le tiroir-caisse : Ah elles sont là ! , très surpris. Louis continue son exploration de la caisse et répète longuement les mêmes paquets d'actions afin de se construire des certitudes. Comme lors du parcours de billes, Louis regarde longuement à l'intérieur de la caisse-enregistreuse. Lorsque nous lui demandons de nous expliquer comment fonctionne cette machine, Louis a besoin de manipuler en même temps. De plus, ses explications ont lieu après l'action : si j'appuie ici (le fait), ça tombe ici . L'organisation logique des actions n'est pas encore évidente pour Louis, qui ne peut élaborer XX en dehors de ses actions. Il envisage une succession temporelle contrainte par la caisse- enregistreuse. Nous proposons ensuite à Louis les objets symboliques. Il manipule rapidement le matériel et commence à rechercher des identiques dans les fruits et légumes qu'il aligne de proche en proche sur une autre partie de la table. Nous : Qu'est-ce que tu es en train de faire ? Lui : Là je fais mon magasin Tout comme lors de l'atelier 3, Louis ne signifie pas spontanément ce qu'il fait. Il attribue des propriétés plus spécifiques à ces objets et les reconnat seulement quand nous lui posons la question. Il continue d'installer le jeu en prenant un panier, ça c'est mon sac , puis il répartit l'argent. Il prend son panier, met quelques fruits et légumes, revient vers la caisse et dit : quatre euros ! . Nous lui proposons alors de tenir la caisse, Louis accepte volontiers, mais ne nous regarde toujours pas. Louis continue de jouer et répète toujours les mêmes groupes d'actions : remplir le panier, le vider, donner les pièces. Il reconnat une situation mais il n'élabore pas à partir de ce qu'il reconnat. Il reste dans une imitation différée. On ne peut pas parler d'un jeu symbolique car Louis réitère les mêmes actions et son langage ne donne pas d'éléments d'un projet symbolique. Enfin, bien qu'il accepte notre participation, Louis ne nous indique pas ce que nous devons faire, s'adresse peu à nous ou sans nous regarder. 1. 2. 5. Analyse globale Louis demeure actuellement dans une exploration des aspects logiques et physiques des objets. Il recherche très souvent des identiques et se situe dans une réitération de juxtaposition d'actions qui l'amène à retrouver les mêmes organisations d'objets. Louis apporte peu de variations à ce qu'il construit, que ce soit avec le parcours de billes ou les objets non-symboliques. Il ne dépasse pas les situations de déséquilibre et revient alors aux XXI mêmes actions et résultats. En répétant les mêmes actions, il se crée des certitudes sur les objets, les actions et leurs relations. Louis a toujours besoin d'un long temps d'exploration du matériel. Louis réitère des actions simples avec les objets non-symboliques, dont celle prédominante de fractionnement. Cette activité transformatrice lui sert alors de support pour la création de son objet nouveau . Avec les objets symboliques, il reconnat leurs propriétés plus spécifiques mais ses préoccupations sont toujours la recherche de même et la répétition de paquets d'actions en imitation différée. Louis est un garçon qui parle très peu et encore moins de façon spontanée. Il parat de plus en plus à l'aise avec nous mais il nous regardera que rarement pendant nos échanges. Il n'élabore pas en dehors de ses actions, ne marque pas les relations entre les objets ni entre ses actions. Louis est guidé par l'action et signifie ce qu'il fait seulement lorsque nous le questionnons sur ses actions. Son langage lui sert à désigner et commenter les situations qu'il comprend mais n'a pas encore pour fonction de faire le lien entre ses expériences et ses connaissances. XXII 1. 3. Loïc, 8 ans et 8 mois Loïc est un jeune garçon que nous rencontrons en décembre 2011 pour la première fois, en présence de son orthophoniste. Nous serons en situation duelle seulement pour le dernier atelier. Un diagnostic de trouble spécifique du langage oral du type dysphasie réceptive a été posé en 2007. Un bilinguisme familial est à noter, comme cela sera le cas pour plusieurs autres enfants. Loïc présenterait également des difficultés dans son autre langue. Loïc est scolarisé au sein d'un IME cette année scolaire. Loïc utilise beaucoup de gestes et de mimiques pour se faire comprendre. Il utilise principalement des mots isolés, des onomatopées et de courtes phrases qui paraissent parfois comme plaquées . De plus, Loïc est un enfant qui a du mal à supporter les difficultés et les échecs et peut alors devenir opposant et nerveux. Cela a été le cas lors du troisième atelier, nous sommes alors intervenues pour le rassurer et l'encourager à continuer sans l'influencer dans ses explorations. 1. 3. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Loïc forme un seul œuf visible dans lequel se trouvent les cinq autres œufs. A chaque ajout d'un nouvel œuf dans le plus grand, il secoue l'ensemble pour entendre celui qui est à l'intérieur. Lorsqu'il défait cet œuf final, il le pose sur la table pour l'ouvrir et il émet un han ! de surprise, et ainsi de suite pour retrouver les douze éléments de départ. Il parvient à constituer les six œufs et les ordonne debout du plus grand au plus petit en ligne devant lui. Lorsque nous lui proposons la deuxième consigne, il prend le plus petit œuf dans sa main : cinq ! . Puis il ouvre O2 et y met O1 dedans, sans refermer. Il rouvre alors tous les autres œufs et reforme ensuite un seul œuf en partant du plus petit vers le plus grand, sans que nous puissions redonner les consignes intermédiaires. Nous considérons donc que Loïc a su mettre en relation de grandeur les différents éléments, même si son langage ne nous informe pas de cette compréhension de sériation et d'embotement. XXIII 1. 3. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Loïc construira cinq parcours au cours de l'atelier mais ils resteront très similaires. En effet, Loïc réitère la même action aux mêmes types d'objets : base, tuyau et élément arrondi/droit. Il fonctionne par paquets . Chaque parcours créé sera laissé tel quel sur le sol60. Loïc reprend un de ses parcours mais reste dans une superposition très linéaire. Nous ne pouvons pas parler d'assemblage mais plutôt de superposition, de rapprochement car Loïc ne s'approprie pas la spécificité du matériel malgré ses longs temps d'exploration. De plus, certains éléments sont seulement posés et ne sont pas fixés aux autres éléments. Loïc n'apporte pas de variations lors de la construction de ses parcours : il ne change ni l'ordre des actions, ni les propriétés de la structure. Il n'anticipe pas et ne s'appuie pas sur les résultats précédents. Loïc utilise essentiellement des mimiques et des onomatopées pour s'exprimer : mh. ah ah ! quand il a une idée, hé ! quand il n'arrive pas à superposer deux éléments. Quelques mots et phrases courtes annoncent une action, comme c'est pati ! avant de mettre une bille en haut du parcours, ou au contraire un résultat final voilà ! lorsqu'il parvient à assembler plusieurs éléments ensemble. Son langage ne marque pas davantage de mise en relation entre les objets ou ne notifie pas les différentes situations par des verbes. Par ailleurs, Loïc ne s'adresse pas à nous et ne cherche pas notre soutien. L'atelier durera un quart d'heure, Loïc ne voudra pas poursuivre plus longtemps. 1. 3. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Loïc explore le matériel et applique des actions simples à différents objets. Il réitère ces actions : mettre dans , fractionner , dérouler , scotcher , aligner Il se crée également des certitudes en appliquant une même action à des objets différents comme lorsqu'il enfile des chips en polystyrène le long d'un bâtonnet puis de fils de fer entourés de tissus. Loïc passera du temps à répéter cette action. 60 Annexes 7, p LXXXV XXIV Loïc rencontre des difficultés pour faire tenir verticalement les bouts de cartons en les superposant légèrement les uns contre les autres. Il utilise ensuite la pâte à modeler pour fixer les différents éléments en carton. Cette conduite est plus ou moins efficace car la pâte à modeler ne colle pas suffisamment pour tenir les morceaux ensemble. Loïc commence à avoir du mal à gérer cette frustration et s'énerve petit à petit. Lui : Pourquoi tu tiens pas ? en tapant sur le carton C'est tout cassé Par sa question dirigée à l'objet, nous faisons l'hypothèse que Loïc donne une fonction animée au carton. Nous décidons alors d'intervenir pour rassurer Loïc et l'encourager à poursuivre son idée en lui proposant de regarder dans la bote et voir si quelque chose peut l'aider. Il saisit alors le scotch et la paire de ciseaux. Il s'ajuste efficacement mais Loïc a eu besoin de notre présence pour calmer sa frustration et ainsi pouvoir reprendre son projet de fixer les différents morceaux de carton entre eux pour former comme un mur. Loïc poursuit l'atelier en fractionnant des morceaux de pâte à modeler qu'il roule entre ses mains puis qu'il écrase au sol. Il forme ainsi deux lignes en quinconce, devant le mur en carton qu'il vient d'assembler. Il déroule ensuite le bolduc devant ces lignes de pâte à modeler. Plusieurs alignements sont alors formés. Loïc place ensuite des fils de fer en correspondance terme à terme. Il explore encore le matériel dans la bote et collectionne alors les bâtonnets de différentes tailles, qu'il positionne de façon sériée. Il s'intéresse ici à l'aspect logique de ce matériel et à son organisation spatiale. Beaucoup d'objets sont utilisés par Loïc au cours de cet atelier et nous pensons à la fin qu'il a certainement voulu créer un parcours 61 lorsqu'il pose sa main au sol, index et majeur représentant les jambes, et que ce bonhomme se promène à travers les différents éléments : la main passe au-dessus du mur en carton, saute au-dessus de la pâte à modeler, sursaute près du bolduc, évite les pics qui lui tombent dessus, etc. Loïc parat rechercher différents éprouvés sensoriels tout au long de cette séance. 61 Annexes 8, p XCII XXV Loïc ponctue son jeu par différentes onomatopées et mimiques : tchiii ! quand la main sursaute près du bolduc, héééé ahahahah quand la main passe entre les fils de fer, ou encore le fait d'avaler sa salive pour, semble-t-il, marquer la peur. Mais Loïc ne signifie pas plus son jeu par des mots. Loïc explore les aspects logiques et surtout physiques des objets présents dans cet atelier et recherche également différents éprouvés sensoriels en jouant avec sa main ou dans sa façon de toucher les objets. 1. 3. 4. Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Loïc commence par explorer la caisse enregistreuse sans utiliser les pièces. Il tourne la manivelle pendant plusieurs secondes, il appuie sur les différents boutons plusieurs fois, il regarde par le trou sur le côté ou dans les encoches de couleurs. Il saisit par la suite une pièce orange qu'il teste dans chaque encoche : rouge, jaune puis orange. Il appuie alors sous le bouton en-dessous puis sur change . Il récupère la pièce dans le toboggan en disant merci ! , la remet dans l'encoche et cette fois-ci appuie sur sale . La pièce tombe dans le tiroir-caisse encore ouvert mais nous ne la voyons pas. Loïc s'agite, tape sur la caisse et répète : donne-moi ça allez ! . Là encore, Loïc s'adresse à l'objet comme s'il était animé et qu'il était la cause de la situation. Loïc poursuit son exploration de la caisse sans être en attente particulière lorsque la pièce tombe à tel ou tel endroit. Il n'est pas dans une recherche de résultat mais dans une répétition d'actions : mettre dans , appuyer sur , prendre . Le lien entre son action cause de et le résultat n'est pas établi. Loïc est donc davantage dans une succession temporelle d'actions contrainte par le matériel, et non dans une organisation logique des actions. Loïc initie un jeu quand il appuie sur le bouton rouge qui fait apparatre une glace en dessin et qu'il fait semblant de manger une glace après avoir mis une pièce rouge dans la caisse. Nous décidons alors d'introduire le reste du matériel. XXVI S'installe une répétition de scènes très similaires o l'intérêt de Loïc persiste essentiellement sur les actions de mettre dans , appuyer sur et autres actions liées à la caisse. Il reste à sa place devant la table, ne se déplace pas et reste très fermé sur son jeu. Des mots isolés et des phrases courtes accompagnent son jeu : Lui : Li (livre) ? quand il appuie sur le bouton jaune qui fait apparatre le dessin d'un livre Dix ? Quoi ? et met une première pièce jaune dans l'encoche Encore une ? puis met une seconde pièce jaune. Loïc joue deux personnages et parle donc pour les deux personnages. Il ne nous intègre pas dans son jeu au début, même lorsque nous lui posons des questions pour interagir avec lui. Il acceptera notre participation seulement sur notre initiative, mais il ne s'adresse pas à nous quand il parle, son regard reste toujours porté sur la caisse et les pièces. Loïc reconnat les propriétés symboliques des objets présents devant lui mais reste dans une répétition d'un groupe d'actions lié à la situation. Il n'invente pas davantage autour de cette situation, ni dans ses actions, ni dans ses énoncés. 1. 3. 5. Analyse globale Loïc met facilement en relation les objets quand le matériel est contraint comme avec les œufs gigognes, bien que son langage ne signale pas cette mise en relation. Pour le parcours de billes, Loïc juxtapose les éléments et répète les mêmes organisations d'objets. Il est dans une retrouvabilité du couple action-objet et il n'apporte pas de variations au cours de l'atelier. Loïc explore les propriétés logiques et physiques des objets lors du troisième atelier par une suite de juxtapositions d'actions simples. Il établit une organisation spatiale des objets. Il collectionne et établit des correspondances en mettant en contact ou bout à bout des objets XXVII identiques. Il fractionne la pâte à modeler jusqu'à épuisement. Il enfile les chips en polystyrène sur différents objets. Par ailleurs, nous relevons une recherche importante d'éprouvés sensoriels tout au long de cet atelier. Lorsque Loïc n'obtient pas le résultat souhaité, il supporte difficilement la situation et nous le sentons alors nerveux. De plus, lors de ces moments, Loïc s'adresse aux objets et leur attribue un statut animé pouvant être agissable sans lui. Loïc rencontre aussi des difficultés pour établir un lien entre son action cause de et le résultat lors de l'exploration de la caisse-enregistreuse. Il ne recherche pas de résultats mais une répétition d'actions. Le matériel symbolique est reconnu mais Loïc n'installe pas une situation plus large autour et reste là encore dans une réitération d'actions liées à la caisse essentiellement. Loïc communique énormément par onomatopées et mimiques au cours de ces trois ateliers. Celles-ci accompagnent ses actions et marquent les résultats mais sont rarement destinées à attirer notre attention. En effet, Loïc peut exprimer beaucoup de choses mais ne nous intègre pas dans ses jeux ou ne recherche pas notre aide quand il est en difficulté. Quelques mots et phrases ponctuent son jeu avec les objets symboliques et il installe ainsi un dialogue entre deux personnages mais cela reste très répétitif et plaqué . Il répète des séquences et signifie par son langage un résultat ou une émotion. XXVIII 1. 4. Quentin, 9 ans et 6 mois Nous faisons connaissance avec Quentin en janvier 2010 lors d'une de ses séances d'orthophonie. Nous nous reverrons ensuite à trois reprises pour les ateliers, toujours en présence de son orthophoniste. Quentin présente un trouble spécifique du langage oral en présence de séquelles d'une fente labio-palatine , diagnostiqué en 2009. Il est suivi en orthophonie depuis septembre 2005 et suit sa scolarisation en CLIS TSL depuis la rentrée scolaire de septembre 2009. Dès notre première séance, Quentin est communiquant, dans l'échange et nous sollicite beaucoup pour que nous l'aidions. Il est peu sûr de lui et l'exprime beaucoup lors de chaque atelier : c'est dur, c'est trop dur , j'arrive pas , tu peux m'aider ? . En effet, Quentin semble avoir besoin de notre présence et de nos encouragements pour se sentir rassuré et ainsi continuer ses expériences et explorations. Il parle beaucoup, mais son visage reste très fermé et figé. Quentin semble intéressé par le matériel qui lui est proposé et nous reparlera souvent du parcours pour les billes . 1. 4. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Quentin forme les six œufs très facilement et les laisse couchés sur la table. Nous lui proposons alors la deuxième consigne, il saisit alors le plus grand œuf O6, l'ouvre et attrape l'œuf O5 avec les deux éléments de O6. Il obtient alors cinq œufs. Il procède de la même manière pour les consignes suivantes, Quentin doit donc rouvrir à chaque fois tous les œufs déjà formés pour introduire le plus petit dans cet œuf unique. Quentin reste silencieux tout au long de l'épreuve et son visage est sans mimique. Quentin met facilement en relation les différents éléments mais il n'exprime pas cette relation par des mots. Il réussit à obtenir cinq, quatre, puis un œuf visible bien que sa procédure ne soit pas la plus anticipatrice et aisée car il doit défaire ce qu'il vient d'assembler à chaque nouvelle consigne. Quentin n'a pas anticipé et ne s'est pas ajusté au fil des consignes. XXIX 1. 4. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Quentin commence par superposer deux, puis trois éléments afin d'explorer le matériel. Il applique une même action à un même type d'objet, à un même couple d'objets : un élément base et un tuyau. Il est donc dans une recherche d'identiques. Il va également disposer ces couples d'objets spatialement, comme s'ils marquaient les quatre angles d'un carré. Quentin souhaite rejoindre ces quatre parties en construisant son parcours mais il abandonnera ce projet par la suite face à ses difficultés. Ce qui fait sens pour Quentin, c'est le fait de superposer les éléments. Quand il juxtapose un élément sur un autre, il pense que cela fonctionne alors que ce n'est pas toujours le cas car il n'a pas perçu la spécificité du matériel. Quentin ne s'appuie pas sur ce qu'il a déjà fait, il n'élabore pas à partir des résultats fortuits qu'il a obtenus. Il continue de superposer des groupes d'éléments sans chercher la cause d'une situation non souhaitée. Quentin n'est pas dans une organisation d'actions, il n'assemble pas des éléments. Il réitère des actions, des couples d'objets et des résultats, c'est-à-dire qu'il réitère des juxtapositions qui le mènent à la construction d'un parcours. 62 Son langage procède par identification du résultat immédiat : j'ai krouvé , yes ! , voilà quand le résultat souhaité est obtenu. Mais aussi c'est dur , il tombe le truc , ses onomatopées de déception comme oh ! ou encore ses soupirs lorsque le résultat attendu n'est pas là. Quentin n'utilise pas de verbes pour notifier la situation, les déséquilibres ou encore une relation entre deux objets. Par ailleurs, Quentin a énormément besoin de notre présence et de nos encouragements durant l'atelier. Il nous regarde beaucoup, nous demande de l'aider et attire notre attention : Regarde ! C'est bloqué ici , Hé, regarde, ça a fait vouuuh vouuuh pour me montrer le trajet de la bille. 62 Annexes 7, p LXXXV XXX 1. 4. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Dans un premier temps, Quentin sort tout le matériel mis à sa disposition dans la bote et explore les objets suivants : la bote retournée au sol, les pics, la ficelle, la pâte à modeler, les gobelets. Comme lors de l'atelier précédent, Quentin dispose spatialement ces éléments : il plante un pic à chaque angle de la bote en carton. Il procède aussi par couples d'objets auxquels il applique la même action. Il annonce son projet, je veux faire une guirlande , lorsqu'il déroule la ficelle car cette dernière doit lui rappeler les guirlandes. Il affine ensuite ce projet : je vais faire un sapin ! en formant des boules de pâte à modeler rouges qu'il enfonce dans les pics. Il associe alors l'idée de sapin à celle de guirlande . Des mises en relation entre les objets sont verbalisées : c'est trop lourd quand je lui demande pourquoi le pic tombe, ah c'est petit, je veux un plus grand . Quentin expérimente certaines propriétés physiques : il superpose un gobelet en plastique au pic, qui tombe sous le poids du gobelet : c'est trop lourd. . Il passe beaucoup de temps à appliquer la même action de couper à différents objets : grillages, tissus, fils de fer entourés de tissu, tuyaux en carton. Il n'utilise pas pour autant ce qu'il obtient après cette action, son projet de faire un sapin ne semble plus présent. Il est dans ce qu'on appelle un faire pour faire . Dans un second temps, Quentin change d'idée et souhaite construire un bonhomme : il crée un bonhomme de neige en accolant deux boules de pâte à modeler rouge, qui ont fait natre cette idée de bonhomme. Il précise son bonhomme en ajoutant des détails comme les yeux, le nez, la bouche, des boutons de vêtement, ou encore des pieds. Il n'anticipe pas lorsqu'il enfonce des pics en bois dans le corps du bonhomme en pâte à modeler qu'il souhaite faire tenir debout. Les pics s'enfoncent dans la boule de pâte à modeler. Cette situation rejoint celle avec le gobelet et note une insuffisance des connaissances physiques des objets. Quentin ponctue ses actions sur la pâte à modeler par des onomatopées : hip hip hip , youp, youp, youp ! , yah yah ! . Il identifie ensuite le résultat : voilà ! ou ça tient pas très XXXI souvent. Il nous sollicite souvent pour l'aider et nous montre le résultat de ses actions, tout comme lors de l'atelier précédent. Quentin réussit plus ou moins facilement son bonhomme63 mais il ne semble pas satisfait du résultat malgré nos encouragements et félicitations. Il semble de moins en moins gérer la situation qu'il considère comme un échec et ne parvient pas à s'ajuster. Quentin se montre impulsif envers la création de ce nouvel objet à la fin de l'atelier : il détruit son bonhomme ( et crac ! ), lui crève les yeux ( oeu crevé ) et donne des coups de ciseaux dedans. 1. 4. 4. Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Le fonctionnement de la caisse ne semble pas être acquis par Quentin au terme des dix minutes d'exploration. Quentin n'a pas su se créer des certitudes quant à la succession logique des actions, aux liaisons causales. Au cours de son exploration : Nous : Et si on veut faire tomber les pièces par là, par le toboggan, comment on fait ? Lui : Bah j'en sais rien. Lorsque nous lui demandons de nous expliquer comment il faut faire : Nous : Alors moi j'aimerais que ça aille ici (en montrant le toboggan), alors j'appuie ? Lui : Euh, peut-êkre là en montrant le bouton sale alors que c'est normalement l'autre bouton. Nous appuyons sur le bouton sale , on entend les pièces tomber dans le tiroir-caisse. Lui : Peut-êkre ça ( sale ) ça va ici (toboggan) ou ça ( change ) ça va ici (tiroir- caisse) . Il s'agit toujours de l'inverse. De plus, Quentin a toujours besoin de manipuler même quand nous lui demandons de nous expliquer pour que nous le fassions nous-même. Ses énoncés sont dans l'action ou après l'action. Quentin ne peut donc anticiper et élaborer en dehors de ses actions. 63 Annexes 8, XCII XXXII Il ne marque pas non plus de relation dans ses énoncés. Il reste dans le constat, la description. Suite à l'ajout des objets symboliques, Quentin répartit l'argent et les paniers entre nous deux : il garde les pièces de la caisse-enregistreuse et nous laisse les autres pièces et billets ainsi que les paniers. Il dit ensuite : Tu passes à la caisse, tu paies à la caisse et puis voilà . Son jeu consiste en la réitération de paquets d'actions et il reste en une imitation différée. Quentin reproduit toujours les mêmes petites scènes : mettre des fruits et légumes dans le panier, mettre les pièces dans la caisse, partir vers un autre endroit de la pièce. Une fois ces paquets d'actions terminés, on remarque que Quentin ne sait plus quoi faire, ne sait pas comment enrichir son jeu alors il recommence la même scène. Au-delà des actions, le langage contribuerait à la fiction, à la complexifier et à l'organiser mais les énoncés de Quentin restent également plaqués, répétés et n'apportent pas de significations nouvelles à son jeu. 1. 4. 5. Analyse globale Face à un matériel contraint comme les œufs gigognes, Quentin parvient facilement à mettre en relation les éléments mais son langage ne signifie pas cette relation ou n'anticipe pas ses actions. Lors des ateliers 2 et 3, Quentin demeure dans une juxtaposition d'actions réitérées et il ne parvient pas à anticiper et à élaborer à partir du résultat. Il répète les mêmes paquets d'actions et retrouve ainsi les mêmes organisations d'objets. Ses énoncés notent surtout les résultats, lorsqu'il construit le parcours de billes, c'est-à-dire qu'ils ont lieu après l'action et constatent la situation. Quentin trouve également des ressemblances avec des choses connues qui vont amener une symbolisation. En effet, il n'a pas pour projet de faire une guirlande, un sapin ou encore un bonhomme, c'est la ressemblance qui appelle ici à la dénomination. Nous notons les premières mises en relation entre les objets au cours de l'atelier 3. Mais ces XXXIII mises en relation ( c'est trop lourd , c'est petit, je veux plus grand ) montrent aussi les difficultés de Quentin à anticiper le résultat de ses actions et son manque de connaissances quant aux propriétés physiques des objets. Quentin ne parvient pas à mettre en relation ses différentes actions sur la caisse- enregistreuse et reste dans une compréhension de son fonctionnement par succession temporelle contrainte. Son langage reste alors juxtaposé et ne peut se détacher de l'action. Il fonctionne par immédiateté. Enfin, son jeu autour des objets symboliques est interprété comme une imitation différée, une répétition de scènes, sans autre apport symbolique. XXXIV 1. 5. Léna, 9 ans et 6 mois Nous avons rencontré Léna pour la première fois un peu avant les vacances de fin d'année 2010. Léna est la seule fille de notre population d'enfants diagnostiqués dysphasiques. Le diagnostic de trouble significatif et spécifique du développement du langage oral est posé en juin 2008. Ce diagnostic est posé dans un contexte de bilinguisme : les parents parlent une autre langue à la maison et il est noté que des difficultés apparaissent également dans celle-ci même si elle semble mieux matrisée par Léna. Une prise en charge orthophonique est mise en place depuis 2006 et Léna suit sa scolarisation en milieu spécialisé durant cette année. Lors des séances, nous découvrons une petite fille très inhibée, avec un visage peu expressif et des gestes lents. Elle recherche souvent le regard de l'adulte ou son aide. Lorsque Léna se sent en difficultés, elle fait peu de choses et souhaite arrêter rapidement comme cela sera le cas pour les ateliers 2 et 3. Léna recherche également notre attention en dehors des séances et nous sollicitera souvent dans les couloirs de l'établissement. De plus, on notera une évolution positive lors du dernier atelier, qui avait eu lieu de façon duelle. 1. 5. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Une fois la première consigne donnée, Léna regarde longuement le matériel sans y toucher puis dit on peut faire ça tout en assemblant le plus petit œuf O1. Elle continue ensuite à assembler les cinq autres œufs, de façon plus ou moins immédiate. Après la deuxième consigne, Léna positionne debout les six œufs en les sériant du plus grand au plus petit puis met un œuf sur le côté. Nous réalisons alors la tâche d'initiation et lui redonnons la consigne. Léna parvient alors à obtenir cinq œufs en commençant par encastrer le plus petit œuf O1 dans O2 et ainsi de suite. Léna réussit à mettre en relation ces différents éléments après avoir initié l'encastrement d'un œuf dans un autre. Cependant, elle ne marque pas cette relation par des mots au cours de l'atelier. XXXV 1. 5. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Léna ne réussit pas à s'approprier la spécificité du matériel et reste dans une simple juxtaposition de deux ou trois éléments64. Elle recherche beaucoup d'identiques dans les éléments qu'elle choisit : même couleur et/ou même forme. On ne peut pas parler d'assemblage car elle ne tient pas toujours compte du sens des éléments. De plus, lorsqu'elle ne parvient pas à juxtaposer deux éléments entre eux, elle ne cherche pas de solutions. Léna est dans le constat simple : ça roule pas , ça marche pas . Son langage ne marque pas de mise en relation, de coordinations. Son visage reste sans mimique quand elle constate que cela ne marche pas. Léna a du mal à s'ajuster lorsque la bille ne roule pas dans un des éléments car elle n'a pas pris la pente en considération : comment tenir le truc ? dit-elle en nous regardant. Le terme comment marque la première relation, mais cette question évoque une toute-puissance de l'adulte. Elle reste dans une action directe sur l'environnement, dans l'immédiateté. Il semble que Léna ne peut envisager l'action que si l'action vient d'elle : la bille bouge si elle bouge la structure. Elle ne peut pas envisager l'action si elle agit de manière plus indirecte : placer un élément pour tenir la structure, changer un élément de place. Nous pouvons nous demander s'il existe une dissociation de l'objet et de l'action. Léna n'explore pas le matériel seule, elle a besoin que l'adulte l'accompagne et constate avec elle, l'encourage, mette en sens par des mots. L'atelier durera peu de temps : un peu moins de huit minutes. Léna ne souhaite pas continuer lorsque nous lui proposons de faire un autre parcours. Son orthophoniste nous indique que Léna préfère arrêter lorsqu'elle est en difficulté, comme ce sera le cas ici et dans l'atelier suivant. 1. 5. 3 Atelier 3 : Objets non-symboliques Léna juxtapose différents éléments : tuyaux, bolduc, coton, chips en polystyrène. Elle juxtapose plus ou moins facilement ces éléments grâce au scotch. Dès le début, Léna a besoin de 64 Annexes 7, p LXXXVI XXXVI l'encouragement et du soutien de l'adulte : Elle juxtapose deux tuyaux, dont l'un est un plus large de diamètre. Elle : Ca tient pas Nous : Comment tu peux faire pour que ça tienne ? Elle : Je sais pas Nous : Essaie de regarder dans la bote si quelque chose peut t'aider. Elle : Ca ? en me montrant le scotch. Le scotch est visible dans la bote, mais Léna a besoin que nous l'orientons dans sa recherche de solution à son problème et attend notre approbation. Nous parlons là encore de simple juxtaposition et non d'une construction car Léna n'est pas dans la réalisation d'un projet. Elle est dans un enrichissement linéaire. Aussi, Léna réitère les mêmes actions à un même objet ou à des objets différents : scotcher des tuyaux entre eux, scotcher du bolduc de différentes couleurs aux tuyaux. Son langage, souvent adressé à l'adulte, sert à constater le résultat immédiat : ça tient pas , voilà , j'ai fini , ça tient un peu . On note une différence avec ce un peu mais ce terme évoque toujours une juxtaposition et non une relation comme avec mieux par exemple. Son visage restera toujours neutre et non expressif durant tout l'atelier. Par ailleurs, Léna ne symbolisera pas son assemblage final65. L'atelier durera un quart d'heure, pendant lequel nous devons souvent la relancer pour qu'elle poursuive ses expériences avec ce matériel. 1. 5. 4. Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Avec la caisse enregistreuse, Léna est dans une succession temporelle d'actions contrainte par le matériel, et non dans une organisation d'actions. Elle cherche l'action là o on la voit en regardant dans le trou sur le côté de la caisse ou dans 65 Annexes 8, p XCII XXXVII les encoches. Elle réitère longuement ses actions pour se créer des certitudes avant de pouvoir modifier ses actions : je refais , je vais essayer par là . Elle passe beaucoup de temps à s'approprier le fonctionnement de la caisse et est parfois en déséquilibre : Elle récupère deux pièces dans le toboggan mais cherche une troisième pièce (dans le tiroir- caisse) Nous : Alors, elle est o l'autre ? Elle : J'en sais rien. Léna a surtout un langage descriptif et là encore, le premier mot qui indique un début de relation est comment dans sa question comment sortir ça ? qui demande à l'adulte qui sait tout . Mais nous relevons ensuite de vraies mises en relation dans cet atelier : pourquoi ça sort pas ici ? , ça, c'est pour faire dans la caisse, et ça, c'est pour faire sur le toboggan . L'atelier se poursuit avec l'ajout des objets symboliques : Elle : Je fais quoi ? Nous : Alors, à quoi ça te fait penser tout ça ? Qu'est-ce que tu pourrais faire avec ? Elle : Acheter des fruits Nous : Oui, on pourrait acheter des fruits ! Elle : Alors, t'es la caisse . Nous commençons alors à jouer. Cependant, Léna n'organise pas son magasin ou ne demande pas combien elle nous doit, par exemple. Son jeu est réduit au début. Par la suite, elle reprend ce que nous propose lorsque nous inversons les rôles. Elle est alors dans de l'imitation différée, aussi bien en ce qui concerne ses actions que ses énoncés. Enfin, Léna s'approprie davantage le jeu dans les dernières minutes et nous le constatons aussi dans son langage : Nous : Qu'est-ce que vous me conseillez ? XXXVIII Elle : Des bananes. Aussi avec des oranges. Aussi la banane avec la poire c'est très bon Elle regarde notre panier : Que des fruits ! [] Nous : J'espère qu'ils seront bons les fruits ! Elle : Ils sont excellents ! Durant son jeu, Léna porte surtout un intérêt aux actions de vider et de remplir le panier ainsi que de mettre les pièces dans la caisse enregistreuse. Elle reste autour de la table o sont posés les différents objets et ne signale pas des espaces différents selon les situations qu'elle joue. Léna est dans une réitération de scènes qu'elle enrichit par l'imitation différée puis elle s'approprie petit à petit le jeu et semble prendre plaisir à jouer. Son visage devient également plus expressif au cours de cette séance. C'est la première fois que Léna ne souhaite pas arrêter plus tôt l'atelier. 1. 5. 5. Analyse globale Léna est une petite fille qui a sans cesse besoin d'être relancée et encouragée. Elle ose peu quand elle se sent en difficulté et préfère demander l'aide de l'adulte ou alors abréger la séance. Après un long temps d'observation, les œufs gigognes sont formés puis embotés suite à l'initiation de l'encastrement. Léna agit par juxtapositions réitérées. Elle superpose les éléments du parcours de billes sans tenir compte de la spécificité du matériel. Et elle ajoute des éléments au tuyau initial sans avoir de projet dans l'atelier 3. Elle explore très peu le matériel au cours des ateliers 2 et 3 et elle souhaite rapidement arrêter ces séances. Léna demeure dans la situation immédiate et dans un enrichissement linéaire non-anticipé. Sa compréhension du fonctionnement de la caisse-enregistreuse est également linéaire, soit une succession temporelle d'actions. XXXIX Léna verbalise principalement le résultat immédiat de ses actions : voilà , j'ai fini , ça roule pas . Ses énoncés sont souvent accompagnés d'un regard vers l'adulte, qui est alors posé comme la personne qui sait tout . Elle utilise peu le langage pour mettre en relation. Léna utilise le langage pour décrire des situations, des états mais non comme outil pour élaborer en dehors de l'action. Elle s'approprie davantage les objets symboliques du dernier atelier et nous le constatons également dans son langage qui commence à apporter des choses nouvelles à la situation. Néanmoins, Léna reste dans une imitation différée et une répétition de groupes d'actions mais il aurait été intéressant de poursuivre cet atelier avec elle. XL 1. 6 Arthur, 10 ans et 6 mois Nous faisons la connaissance d'Arthur en février 2011 en présence de son orthophoniste. Arthur est suivi en orthophonie depuis l'âge de 2 ans et demi et un diagnostic de trouble spécifique du langage oral prédominant sur le versant expressif a été posé en 2006. Après trois ans dans un établissement spécialisé, Arthur est actuellement scolarisé en classe de CM1 dans son école de quartier sans aide particulière. Arthur est un jeune garçon qui parlera peu pendant les séances mais qui semble intéressé par le matériel qu'on lui propose. Son visage reste neutre alors que ses gestes peuvent montrer une certaine force et vivacité, comme lors des ateliers 3 et 4. 1. 6. 1 Atelier 1 : Œufs gigognes Arthur commence par mettre tous les éléments posés ouverts vers le haut, puis il forme un seul œuf contenant les autres en partant du plus petit, soit O1 : et voilà . Nous lui demandons s'il a une autre idée, il me répond alors par taille et commence à assembler les œufs et les positionne debout devant lui du plus petit au plus grand, de O1 à O6. Suite à la deuxième consigne, il ouvre O6, approche une moitié de l'œuf O5 puis reforme O6 et cache l'œuf sous le bureau : on enlève celui-là . Nous lui précisons alors la consigne et il ouvre O2 pour mettre O1 dedans. Il poursuit ensuite en mettant le plus petit œuf dans celui de taille juste supérieure. Arthur parvient aisément à manipuler ce matériel et tient compte de sa spécificité. Par ailleurs, il s'ajuste au cours de l'épreuve lorsqu'il change d'œuf pour commencer l'embotement. Il est aussi le seul enfant à parler de taille , il extrait alors le critère essentiel du matériel. XLI 1. 6. 2 Atelier 2 : Parcours de billes Arthur se situe dans une simple juxtaposition des différents éléments car il ne tient pas compte de la spécificité du matériel pour superposer les éléments et procède beaucoup par tâtonnement. La superposition devient plus rapide à la fin de l'atelier mais il fonctionne par recherche d'identiques (même forme) et ne fait pas toujours bien coïncider les ouvertures des éléments, par conséquent la bille ne passe pas dans tous les éléments comme souhaité. Toutefois, il réalise un plus grand parcours66 que d'autres enfants qui sont eux aussi dans la juxtaposition d'éléments. Face à une situation de déséquilibre, c'est-à-dire lorsqu'il ne parvient pas à assembler deux éléments ensemble, Arthur revient à ce qu'il sait faire : superposer des tuyaux. Son langage note seulement par ça ne va pas ou mince ces situations. Les juxtapositions réussies sont notées par et voilà et et c'est bon essentiellement. Arthur verbalise après l'action. D'une manière générale, Arthur parle peu durant l'atelier et n'échange pas avec moi. Arthur rencontre aussi des difficultés d'anticipation pour les dénivelés du parcours. En effet, il peut ajouter des éléments qui vont créer une pente montante o la bille ne pourra pas aller. Il arrive à s'ajuster après plusieurs essais avec les billes. Nous notons également une certaine force dans ses gestes, que l'on retrouvera dans les autres ateliers. Il semblerait qu'il y ait peu de différenciation au niveau de l'intensité. 1. 6. 3 Atelier 3 : Objets non-symboliques Arthur explore les aspects physiques du matériel tout au long de l'atelier. Il procède par juxtaposition et réitération de groupes d'actions telles que : enrouler, envelopper, enfiler, enfoncer, scotcher, etc. 66 Annexes 7, p LXXXVI XLII Suite à ses actions, Arthur obtient un objet nouveau qu'il nomme seulement lorsque je lui demande ce que c'est : C'est un grappin 67. Il donne une signification à cet objet, une fois qu'il l'a obtenu et qu'il a identifié certaines de ses propriétés. En effet, il fait tourner au-dessus de lui cet objet et lance vivement l'une des extrémités à travers la pièce. Il reconnat donc qu'une partie peut être lancée. Son orthophoniste nous fera part plus tard qu'Arthur est souvent centré sur l'action de lancer . Nous pourrons nous-même le constater lors de cet atelier et du suivant. Arthur construit un second grappin au cours de cette séance, sur le même principe que le premier. Arthur ne prête pas attention à ce qui l'entoure lorsqu'il lance son grappin dans n'importe quelle direction. Il ne semble pas conscient du risque, pour lui, pour les autres ou pour le matériel présent dans la pièce. Il est même surpris par le résultat de ses actions : oups , mince . Tout comme lors du premier atelier, Arthur communique peu et n'utilise pas le langage pour informer de ce qu'il fait, des changements ou encore des relations entre les objets. 1. 6. 4 Atelier 4 : Caisse-enregistreuse et objets symboliques Face à la caisse-enregistreuse, Arthur reste dans une succession temporelle d'actions contrainte au matériel. Il passe un long moment à explorer la caisse, la tourne dans tous les sens, la secoue et regarde dans les différentes ouvertures. Il cherche à comprendre le fonctionnement et réitère les mêmes actions afin de se créer des certitudes. Nous remarquons toujours une certaine force et intensité dans ses gestes pour mettre les pièces dans les encoches ou encore appuyer sur les boutons. Arthur a besoin d'agir lorsque nous lui demandons de nous expliquer le fonctionnement de la caisse-enregistreuse. Il ne peut substituer les mots à son action : Lui : Bah faut mettre les pièces au bon endroit (le fait), tu fais ça (appuie sur les boutons 67 Annexes 8, p XCIII XLIII en-dessous) après on appuie sur change ou sale (appuie sur les boutons) Nous : Qu'est-ce que ça fait quand on appuie sur les boutons-là ? en montrant sale et change Lui : Bah sur sale , ça va dans la , ouvre le tiroir-caisse, ça va dans la caisse Et sur change , ça passe par là et montre le toboggan sur le côté. Il ne se représente pas la situation causale et reste dans une succession temporelle. Son langage ne marque pas de mise en relation de causalité. Lors de l'ajout du matériel symbolique, Arthur essaie d'appliquer les mêmes actions aux objets symboliques avec l'utilisation de la caisse-enregistreuse, c'est-à-dire qu'il met les petites pièces dans les encoches et essaie d'en faire autant avec des fruits et légumes en plastique. Ne sachant pas quoi faire ensuite, il commence à lancer les pièces, les billets puis les aliments en plastique. Il ne semble pas intéressé par leurs propriétés symboliques mais seulement par la propriété de pouvoir être lancé, là encore. Comme lors de l'atelier précédent, Arthur crée alors un objet nouveau, qu'il nomme de nouveau grappin , à partir du matériel symbolique et d'autres éléments disponibles dans le bureau. Sa préoccupation étant de créer quelque chose qu'il pourra lancer, nous le laissons construire cet objet. Il lance ce grappin avec une certaine vivacité. Bien qu'il dise être conscient des risques, Arthur poursuit son activité car il cherche à attraper des objets dans la salle. Comme pour les autres ateliers, Arthur élabore très peu en dehors de l'action, l'observation de son langage est donc limitée. 1. 6. 5 Analyse globale Alors qu'Arthur manipule aisément et met en relation les éléments de l'atelier 1, cela sera plus difficile pour la construction du parcours de billes. XLIV En effet, Arthur persiste dans une juxtaposition des éléments et ne tient pas toujours compte de la spécificité du matériel pour son parcours. Il recherche souvent des identiques dans la seconde partie de l'atelier. Il n'anticipe pas le passage de la bille mais il parvient à élaborer à partir du résultat après plusieurs essais. Nous pouvons parler d'un fonctionnement par essai-erreur . Arthur se situe également dans une succession temporelle d'actions face à la caisse- enregistreuse qu'il explore longuement auparavant. Lors des ateliers 3 et 4, Arthur explore les aspects physiques du matériel disponible et crée un objet nouveau au centre de ses préoccupations. Assurément, Arthur porte un intérêt particulier aux actions de lancer et jeter , activités majeures chez le tout jeune enfant. Pour tous les ateliers, Arthur s'exprime rarement par des mots ou même des mimiques. Il a besoin d'agir et ne peut substituer les mots à son action. Ses énoncés signalent le résultat de ses actions : le résultat souhaité, ou non, ainsi que la surprise de ce résultat. Ainsi, il réitère souvent les mêmes actions afin de constater la permanence du résultat. XLV 1. 7 Marc, 10 ans et 11 mois Marc est un jeune garçon que nous rencontrons en décembre 2010 en présence de son orthophoniste. Les séances suivantes auront lieu de façon duelle. Le diagnostic de dysphasie réceptive sévère associée à un trouble expressif important dans un contexte de bilinguisme a été posé en avril 2006. Marc semble rencontrer des difficultés dans son autre langue. De plus, Marc a deux sœurs qui présentent elles aussi des troubles du langage importants. Marc est actuellement en milieu spécialisé pour poursuivre sa scolarisation. Marc est un enfant qui parle peu spontanément mais il parat tout à fait intéressé par le matériel que nous lui proposons au cours des séances. Son visage reste également neutre, même lorsqu'il est face à une situation problème . Il prend peu d'initiatives, mais il accepte toujours volontiers nos propositions. 1. 7. 1 Atelier 1 : Œufs gigognes Marc me dit que cela ressemble à une bol et qu' on peut le fermer . Il assemble alors O6. Il poursuit et ferme d'autres œufs sans ordre particulier, parfois il laisse d'autres éléments dedans. Il assemble finalement les six œufs et les dispose de façon aléatoire devant lui. Suite à la deuxième consigne, Marc réfléchit très longuement puis déplace sur la table un œuf pour obtenir cinq œufs alignés puis ajoute O1 à cette ligne : il faut enlever le tout petit puis on peut mettre dedans et ouvre alors O2 pour y mettre O1. Il poursuit ainsi le reste de l'atelier. Marc réussit l'épreuve, anticipe bien une fois la compréhension de la relation entre les œufs acquise. On note qu'il verbalise ce qu'il fait avant de le faire, il peut donc élaborer en pensée. Toutefois, lorsque Marc dit le tout petit , et non le plus petit , son langage ne marque pas de relation. XLVI 1. 7. 2 Atelier : Parcours de billes Marc est le premier enfant à me signaler qu'il connat ce jeu ; nous en tiendrons compte pour nos observations. Marc juxtapose les premiers éléments sans tenir compte des ouvertures aux extrémités mais il s'ajuste assez rapidement lorsqu'il se rend compte de son erreur : Euh ! . Marc poursuit son parcours et assemble facilement la suite des éléments. Il rencontre quelques difficultés pour les notions de dénivelés et de hauteur mais une chute de son parcours lui permet là encore de s'ajuster et ainsi de mieux gérer certaines pentes nécessaires au passage de la bille. Il marque la fin de sa construction par un voilà . Cependant, le dénivelé de certains éléments n'est pas assez important. Marc le constate après un essai avec une bille : Ca ne marche pas . Il parvient difficilement à s'ajuster à l'aide des tuyaux et il réduit petit à petit son parcours et enlève ainsi les éléments qui le gênent pour la descente de la bille. Marc ne réussit pas à modifier les propriétés physiques de son parcours, il varie essentiellement sa longueur. Il ne verbalise pas les différentes situations et ne signale rien par la mimique de son visage. Marc assemble facilement les éléments pour construire son parcours mais il rencontre des difficultés quant au dénivelé nécessaire au passage de la bille. Ces situations ne sont constatées que lorsqu'il essaie avec une bille, il ne réussit donc pas à anticiper. Cette non-anticipation est certainement due également au fait que Marc ne regarde pas l'ensemble de son parcours, son regard reste fixé au sommet o il assemble petit à petit de nouveaux éléments. Son parcours final68 comporte toujours une pente montante qu'il ne modifiera pas. Il s'adapte une première fois en levant la structure pour que la bille poursuive son chemin. Pourtant, il ne garde pas la structure levée au passage des autres billes, qu'il doit alors pousser. Marc est dans une succession d'assemblages d'éléments mais non dans une organisation 68 Annexes 7, p LXXXVII XLVII d'actions liées par la nécessité d'anticiper le parcours de la bille. 1. 7. 3 Atelier 3 : Objets non-symboliques Marc saisit dès le début de l'atelier un tuyau en carton auquel il juxtapose différents éléments par réitération d'actions simples : enfoncer, envelopper, enrouler, mettre dans, Là encore, Marc n'annonce pas son projet ou ne dénomme pas de lui-même cet objet nouveau. Nous : Est-ce que tu peux m'expliquer ce que tu es en train de faire ? Lui : Euh, moi je fais un pistolet . Marc poursuit la création de ce nouvel objet et passe beaucoup de temps à enfoncer des éléments divers à l'intérieur du tuyau : coton, bâtonnets, pics, chips en polystyrène. Il applique alors une même action à différents objets. Il enfonce ensuite à moitié ce premier tuyau à l'intérieur d'un autre tuyau plus large. Marc enfonce alors des bâtonnets ou des pics à l'une des extrémités du tuyau, qu'il essaie de récupérer de l'autre côté. Il regarde attentivement l'intérieur du tuyau pendant qu'il agit. Avant de conclure l'atelier, nous posons quelques questions à Marc qui n'a pas parlé durant ces trente minutes : Nous : Est-ce que tu peux m'expliquer ce que tu as fait ce matin ? Lui : Euh j'ai j'ai fait un pistolet 69, il remet le premier tuyau à l'intérieur de l'autre Avec le mouchoir là. (le coton ? ) Et . Nous : Qu'est-ce que tu peux dire d'autre ? Il fonctionne comment ton pistolet ? Lui : C'est . et il continue d'enfoncer et de pousser les éléments dans les tuyaux. Marc ne parvient pas à élaborer en dehors de l'action. Il reste dans une réitération d'actions 69 Annexes 8, p XCIII XLVIII simples avec un intérêt marqué pour les actions d' enfoncer et mettre dans . Les analyses langagières sont très réduites car Marc est un jeune garçon qui parle peu. 1. 7. 4 Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Marc s'installe devant la caisse-enregistreuse et me dit : Il y avait des pièces, non ? . Je le laisse alors explorer la caisse. Il passe un long moment à appuyer sur les différents boutons mais ne recherche pas les pièces. Il tourne la manivelle et le tiroir-caisse s'ouvre. Il saisit une pièce rouge, la met dans l'encoche correspondante, appuie sur sale et la récupère dans le tiroir. Il réitère plusieurs fois en appuyant sur sale ou change afin de se créer des certitudes. Nous : Est-ce que tu peux m'expliquer comment ça fonctionne ? Lui : Quand tu tournes (il tourne la manivelle) et après il arrive (le tiroir-caisse s'ouvre) Nous : Oui, il y a le tiroir qui s'ouvre. Lui : Et. , il met une pièce jaune dans l'encoche rouge puis jaune, Et livre (l'encoche jaune correspond à l'image du livre) Et sale , on voit les pièces tomber dans le tiroir-caisse resté ouvert. Nous : Et si on veut que les pièces tombent dans le toboggan, comment on fait ? Lui : Bah changer et appuie sur change puis nous montre avec trois pièces. Marc ne marque pas de relation causale dans ses explications. Ses énoncés sont juxtaposés et montrent qu'il est dans une succession logique d'actions contrainte par le matériel. De plus, Marc se représente difficilement le fonctionnement en dehors de l'action. Suite à l'ajout du matériel symbolique, Marc initie un classement des différents billets et pièces. Il recherche les identiques dans les différents billets et fait des tas distincts. Nous : A quoi ça te fait penser tout ça ? Lui : A je ne sais plus le mot un primeur . Il reconnat ici une situation et il poursuit son classement en triant les fruits et légumes en plastique dans les paniers. Il classe les fruits dans le grand panier bleu et les légumes dans les deux XLIX paniers rouges : voilà . Marc joue ensuite avec les petites pièces qu'il introduit dans la caisse-enregistreuse. Il réessaie également avec les pièces adaptées aux encoches. Marc ne semble plus savoir quoi faire, nous reprenons alors son idée du primeur et lui proposons de jouer. Il accepte et joue alors le caissier. Nous inversons les rôles plusieurs fois mais Marc préfère s'occuper de la caisse car son intérêt porte essentiellement sur les actions de mettre dans , appuyer liées à la caisse- enregistreuse. Marc a reconnu la situation du marchand de fruits et légumes mais ne parvient pas à créer autour de cette situation dans ses actions ou son langage. Il répète les mêmes paquets d'actions et les mêmes énoncés. Il traite le matériel comme des objets en soi sans signification nouvelle. 1. 7. 5 Analyse globale Marc met en relation les œufs gigognes et il annonce oralement ce qu'il va faire avec ce matériel contraint. Il anticipe mais nous ne retrouverons pas cette anticipation dans les ateliers suivants. Bien qu'il connaisse le jeu, Marc ne parvient pas à anticiper le dénivelé nécessaire pour le passage de la bille et éprouve des difficultés à s'ajuster. Il procède par réitération d'assemblages car il fixe facilement les éléments entre eux, mais son parcours n'est pas un objet nouveau dont les propriétés sont identifiables par des liens de causalité. Lors de l'atelier 3, Marc n'annonce pas son projet et symbolise sa construction uniquement après mes questions. Il réside dans une juxtaposition d'actions simples réitérées. Sa préoccupation centrale passe par les actions d' enfoncer et pousser . Marc demeure dans une succession temporelle d'actions avec la caisse-enregistreuse. Il juxtapose ses mots comme il juxtapose ses actions. De plus, Marc ne se représente pas le résultat de L ses actions en dehors de celles-ci et doit alors manipuler. Il reconnat ensuite les propriétés des objets symboliques mais il ne crée pas une situation plus large et inventive autour de ces objets. Il réitère les mêmes paquets dans ses actions et son langage et porte surtout son intérêt sur la caisse et les actions liées à cette dernière. LI 1. 8 Paul, 11 ans Nous rencontrons Paul en décembre 2010 en présence de son orthophoniste. Paul bénéficie d'une prise en charge orthophonique depuis 2008 et suit cette année sa scolarisation au sein d'un IME. Un diagnostic de trouble spécifique du langage oral versant expressif a été posé la même année. Une situation de bilinguisme est là encore présente mais d'après la mère de Paul, il n'y aurait pas de troubles dans son autre langue. Paul est un garçon qui interagit facilement et semble être en confiance lors des séances. Il est intéressé par le parcours de billes mais il semble plus en difficulté avec les objets non-symboliques. Enfin, il montrera une légère réticence face aux objets symboliques. 1. 8. 1 Atelier 1 : Œufs gigognes Suite à ma consigne et avant de manipuler le matériel, Paul nous dit qu'on peut mettre du plus petit au plus grand . Il assemble alors aisément les six œufs et les ordonne devant lui, debout, du plus petit au plus grand. Paul poursuit l'atelier en ouvrant O2 pour y mettre O1. Sourire aux lèvres car il a très bien compris la suite de nos questions, il continue en ouvrant O6 et y cache O5. Puis, il met O3 dans O4. Il a donc trois œufs apparents devant lui, chacun des œufs en contenant un autre. Toujours très habile avec ses mains, il réussit facilement à obtenir deux puis un œuf. Paul comprend la mise en relation spécifique à ce matériel et son niveau de compréhension et d'anticipation est visible par sa facilité à manipuler tout en s'amusant. 1. 8. 2 Atelier 2 : Parcours de billes Paul nous signale qu'il connat ce jeu lorsque nous lui donnons le matériel et lui expliquons LII la consigne. Nous devons donc en tenir compte pour nos observations. Paul commence par une recherche d'identiques et superpose plusieurs tuyaux. Il s'intéresse ensuite à d'autres éléments, mais il n'arrive pas à fixer certains éléments (ceux qui appartiennent à l'autre jeu) : Lui : C'est normal que ça tient pas ? Et il met de côté ces éléments qui ne vont pas avec le reste. Paul essaie pendant de longue minutes d'assembler certains éléments à ses différents tuyaux mais il tâtonne beaucoup. Il ne parvient pas à relier des parties de parcours déjà superposées : Lui : En fait il faut que ça soit tout collé ou pas ? Paul dit connatre le jeu mais il tâtonne beaucoup finalement. Il se représente certainement un ancien parcours et essaie de le reproduire, sans s'approprier le matériel et sa spécificité. Il reproduit toujours le même type de paquets d'objets : un élément de passage de la bille avec une superposition de tuyaux sous chaque extrémité. Paul juxtapose peu un élément droit, arrondi ou escalier à un autre, il utilise le plus souvent les tuyaux comme intermédiaires. Il obtient un premier parcours très en hauteur, qui se casse sous le passage de plusieurs billes. Nous proposons alors à Paul de faire un autre parcours. Paul procède différemment pour son second parcours70 : il change l'ordre des groupes d'actions. Cette fois-ci, il commence par assembler les différents éléments, de façon plus rapide et aisée et il fixe après les tuyaux en-dessous pour obtenir un parcours en hauteur toujours, mais moins haut que le premier. Cependant, Paul rencontre les mêmes soucis de stabilité car il n'utilise pas les bases ou les pieds dans ses deux parcours, mais seulement les tuyaux, même pour la fin du trajet de la bille. Paul varie seulement l'ordre de construction du parcours et non les propriétés de la structure, c'est pourquoi il est face au même résultat. Il ne verbalisera pas cette situation et ne parlera pas plus que ce que nous avons relevé plus haut. 70 Annexes 7, p LXXXVII LIII Après avoir inversé les étapes de construction, Paul ne sait plus comment aborder un nouveau parcours et refuse notre proposition d'en faire un autre. Bien qu'il dise connatre le jeu, Paul réitère les juxtapositions et n'assemble pas les éléments. 1. 8. 3 Atelier 3 : Objets non-symboliques Paul passe d'un objet à un autre et assemble certains de ces objets par différentes actions simples : percer la pâte à modeler avec les bâtonnets en bois, enfiler un fil de fer au travers d'un grillage, accrocher les cartons et un tuyau à l'aide de pinces à linge, etc. Il n'a pas de projet en tête et l'exprime d'ailleurs au bout de quelques minutes : Je n'ai aucune idée ! A partir de dix minutes d'atelier, Paul crée un nouvel objet à partir de tuyaux en carton et d'un morceau en carton auquel il juxtapose d'autres éléments jusqu'à la fin de l'atelier. Il réutilise les boules de pâte à modeler percées de part et d'autre par le bâtonnet en bois et superpose soigneusement d'autres éléments. Paul met fin à sa création et nous lui demandons de nous expliquer ce qu'il a fait : Lui : Et bah au début, j'avais aucune idée et après j'ai fait comme ça bah un panneau 71 Nous : Et qu'est-ce que tu as utilisé ? Comment t'as fait ? Lui : Bah du carton. Et ben ensuite j'ai pris le matériel qu'il y avait dedans (dans la bote) et j'ai fait quelque chose dessus (sur le carton) Son orthophoniste : Tu peux nous expliquer un peu plus ? Lui : Bah, j'ai fait n'importe quoi dessus ! en rigolant J'ai mis n'importe quoi. Et aussi j'ai mis du fil pour que ça tient Paul n'a pas de projet préétabli et il nomme ce nouvel objet par ressemblance à quelque chose qu'il connat seulement lorsque nous lui demandons. Le reste n'est pas signifié, cela reste quelque chose , n'importe quoi . 71 Annexes 8, p XCIV LIV Paul reste dans une juxtaposition d'actions qui l'amène à trouver une ressemblance finale. S'il s'agissait d'une symbolisation, Paul aurait annoncé son idée, comme il a su dire qu'il n'en avait pas, et il aurait aussi symbolisé ce quelque chose . 1. 8. 4 Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Nous propose à Paul de regarder la caisse-enregistreuse et lui demandons, avant qu'il ne manipule, s'il connat : Euh non. ah si, c'est comme dans les casinos ! Tu mets les pièces et ensuite après tu tournes . Par l'emploi du comme , Paul exprime l'idée d'une similitude et met donc en relation l'objet qu'il a devant lui avec ce que cela lui évoque. Paul tourne la manivelle et le tiroir-caisse s'ouvre : Ah oui, j'ai compris ! . Il saisit alors une pièce jaune et la met dans l'encoche correspondante. Il essaie de mettre la seconde pièce jaune dans l'encoche orange puis change pour l'encoche jaune. Il appuie sur sale et entend les pièces tomber dans le tiroir-caisse, il regarde vaguement dans le tiroir resté ouvert : y'a l'argent qu'est sorti . Il recommence avec une pièce orange et appuie cette fois-ci sur change . Après quelques secondes de réflexion : Oula, j'ai pas très bien compris. . Nous lui proposons alors de recommencer. Paul comprend ensuite rapidement le fonctionnement de la caisse-enregistreuse. Après avoir fait un essai avec sale , il nous explique : Ce bouton ( sale ) c'est pour que ça retombe ici (tiroir-caisse), et ce bouton c'est pour que . (me regarde et nous montre le toboggan). Et ce bouton c'est pour ouvrir la machine (le tiroir-caisse) . Paul marque la liaison causale entre les différentes actions. L'organisation logique de la caisse est comprise par Paul et il commence à se détacher de ses actions. Lorsque nous apportons le reste du matériel de cet atelier, Paul nous dit qu'il ne veut pas trop jouer avec des jeux pour bébé . Nous lui soumettons alors l'idée de nous expliquer ce qu'il peut faire avec les objets, sans forcément jouer avec, afin d'obtenir quelques éléments d'observation. Lui : De l'argent et des fruits LV Nous : A quoi ça te fait penser ? Lui : Bah j'pense qu'il y a une personne qui doit acheter, bah la personne elle vend des fruits et l'autre personne elle achète les fruits et les légumes Nous : Est-ce que t'as envie d'y jouer ou ? Lui : Mh. non Nous : Est-ce que t'as envie de faire autre chose avec tout ce qu'il y a là ? Lui : Je sais pas . Il commence un classement. Lui : Un sac. euh non, un grand sac pour les fruits, un sac pour les billets et un autre pour les pièces . Paul reconnat les propriétés symboliques des objets mais nous ne pouvons pas en savoir davantage sur ses conduites ludiques. Suite à l'une de nos demandes, il effectuera un classement par recherches d'identiques. 1. 8. 5 Analyse globale Paul manipule habilement les œufs gigognes et reconnat le critère de taille qui se détache de ce matériel. Il anticipe mes questions et s'en amuse. Paul est moins à l'aise avec le parcours de billes, qu'il dit pourtant connatre. Il demeure dans une recherche d'identiques et une réitération de juxtapositions d'actions qui le mènent aux mêmes organisations d'objets. Il s'est représenté en pensée l'image d'un ancien parcours et il ne réussit pas à s'approprier le matériel présent ici. Il ne peut donc varier les propriétés physiques de son parcours. L'exploration du matériel non-symbolique conduit Paul à des actions simples, des combinaisons d'objets puis la création d'un objet nouveau. Cette création ne s'installe pas dans un projet annoncé et défini, elle fait suite à un enrichissement linéaire par juxtapositions d'actions. En outre, la ressemblance à un objet du réel fait appel à une signification, mais seulement suite à ma demande d'explications. Paul parat plus à l'aise avec la caisse-enregistreuse. Après une rapide exploration, il réussit à LVI m'expliquer verbalement les différentes relations causales du fonctionnement de cet objet. Une dernière vérification lui permet ensuite d'élaborer en dehors de l'action. Un début d'organisation logique d'actions s'installe. Les objets symboliques évoquent principalement un jeu pour les bébés pour Paul. Il reste dans une description succincte de ce matériel et n'invente pas autour de la situation. Il effectue ensuite un classement en trois catégories. Le langage de Paul lui sert comme outil de pensée et de mise en relation lorsqu'il est en situation de réussite et de compréhension. Sinon, Paul parle peu et ses énoncés restent descriptifs, mais il s'adresse le plus souvent en direction de l'adulte et établit ainsi une réelle communication. LVII 1. 9 Brice, 12 ans Nous faisons la connaissance de Brice un peu avant les vacances de Nol 2010, en présence de son orthophoniste. Les deux autres séances se feront de façon duelle sur une même journée en janvier 2011 en raison d'une absence de Brice. Cette double séance, l'une le matin et l'autre l'après-midi, n'a pas semblé perturber le déroulement des ateliers. Un diagnostic de dysphasie phonologique-syntaxique a été posé en juin 2007. Brice suit sa scolarisation en milieu spécialisé. Brice est un jeune pré-adolescent très réservé. Il communique peu et ses réponses sont très concises. Il semble intéressé par les deux premiers ateliers mais l'est peut-être moins pour les deux autres. Toutefois, il se montre coopérant et réalise toujours quelque chose. 1. 9. 1 Atelier 1 : Œufs gigognes Brice réfléchit un moment sans toucher le matériel, puis nous dit on peut les emboter . Il commence alors par mettre O1 dans O2, jusqu'à obtenir un seul œuf contenant les cinq autres. Nous lui proposons la même consigne, il met alors en correspondance terme à terme les deux éléments identiques. Une fois la correspondance terminée, il assemble les deux parties pour former les six œufs. Pour la suite de l'atelier, Brice commence par mettre O5 dans O6, puis O1 dans O2, puis le plus petit œuf dans celui juste plus grand pour les autres. Brice réussit à mettre en relation les objets de cet atelier. Il énonce son projet pour la première consigne, ce qui signe une anticipation. Nous remarquons également que Brice parvient à élaborer à partir du résultat lorsqu'il embote les œufs petit à petit, mais son langage ne notifie pas ce changement de procédure. LVIII 1. 9. 2 Atelier 2 : Parcours de billes Brice reste dans une simple superposition des éléments et ne parvient pas à tenir compte de la spécificité du matériel. Il débute son exploration en cherchant de stricts identiques : des éléments arrondis verts. Il les superpose mais les ouvertures ne coïncident pas. Il poursuit son exploration et superpose les différents éléments sans tenir compte des dénivelés. Ce qui fait sens pour Brice c'est de parvenir à superposer. De plus, il maintient son intérêt pour quelques groupes d'éléments qui s'assemblent entre eux mais pas avec les autres. Il est sans cesse en train d'essayer de superposer différents éléments mais il revient toujours à ceux qui ne vont pas avec le matériel principal, comme si la loi qui découlait de son expérience renouvelée ne pouvait être extraite. Brice semble ne pas comprendre pourquoi certains éléments vont ensemble et d'autres non : Brice essaie de fixer des éléments ensemble mais n'y parvient pas. Il sourit et nous regarde. Son orthophoniste : Qu'est-ce qui se passe Brice ? Lui : Ca ne va pas . Afin de l'aider à poursuivre sans rester bloqué, nous allons mettre en sens les différentes situations comme oh celui-là ça ne va pas, celui-là non plus , ah là ça va lorsqu'il manipule. Brice parvient ensuite à superposer plusieurs éléments mais toujours en tâtonnant. Son premier parcours est composé de l'entonnoir, de trois éléments arrondis ou droits, de tuyaux et d'une base. Brice a l'air content de ce premier essai car il nous regarde et sourit : c'est bon . Il marque ainsi la fin de la construction de son parcours72. Il passe ensuite beaucoup de temps à superposer uniquement des éléments arrondis et des tuyaux73. Mais Brice rencontre des difficultés pour gérer la hauteur de son parcours, qui est alors en déséquilibre. Face à ce problème, il ne parvient pas à composer avec ce matériel, il utilise alors des clics (jeu de construction) présents dans une bote à côté de lui. Il se met alors en conduite d'outil avec un jeu qu'il connat. Toutefois, Brice doit pousser les billes pour qu'elles descendent le 72 Annexes 7, p LXXXVIII 73 Annexes 7, p LXXXVIII LIX long de son parcours. Brice ne parlera pas davantage au cours de cet atelier, les analyses de ses conduites langagières restent donc limitées. 1. 9. 3 Atelier 3 : Objets non-symboliques Brice prend le temps de regarder et de toucher les différents objets contenus dans la bote que je lui présente. Il s'intéresse ensuite plus spécialement à une boule de pâte à modeler rouge qu'il transforme en crêpe entre ses mains dans un premier temps. Il utilisera dans un second temps le carton comme support et un bâtonnet en bois comme outil , dans ce cas précis, comme rouleau pour écraser la pâte à modeler. On parle alors de conduite d'outil. Il étalera pendant un long moment la pâte à modeler. A l'aide d'une paire de ciseaux, il découpe ensuite une forme ovale plutôt allongée au milieu de sa crêpe de pâte à modeler. Brice s'applique à préciser cette forme. Nous : Qu'est-ce que tu es en train de faire alors ? Lui : Une tête de bonhomme Brice ne dénomme pas de lui-même sa création, il le fait seulement lorsque nous lui posons la question. Il en sera de même avec les autres parties du corps du bonhomme. Il affine son bonhomme en utilisant toujours le même choix de matériel : des cheveux, un corps, des bras, des jambes et un chapeau. Brice ne communique pas avec nous. Il répond simplement à nos questions et à nos propositions. En effet, lorsqu'il manque de pâte à modeler rouge, il ne nous demande pas s'il en reste mais il accepte volontiers quand nous lui en proposons après de longues secondes o il cherche comment poursuivre son bonhomme. Brice réitère les mêmes actions simples pour créer son bonhomme en pâte à modeler74 mais il n'annonce pas son projet qui pourtant semble rapidement défini. 74 Annexes 8, p XCIV LX 1. 9. 4 Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Brice passe un long moment à explorer la caisse : appuie sur les différents boutons, tourne la manivelle, tourne la caisse, glisse ses doigts dans l'ouverture sur le côté, regarde par les fentes. Il sort ensuite les pièces du tiroir-caisse. Dans un premier temps, il superpose la pièce orange aux deux boutons orange présents sur la caisse mais cela ne déclenche rien. Brice essaie alors dans un deuxième temps d'introduire les pièces par l'ouverture sur le côté de la caisse enregistreuse, mais celles-ci retombent. Enfin, il utilise les encoches et fait tomber les pièces dans la machine. Brice s'approprie petit à petit le fonctionnement de la caisse et la particularité des encoches. Nous lui demandons alors de nous expliquer : Lui : Bah on appuie là , me montre les boutons sous les encoches puis sale et change On met changer pour tombe ici (me montre le toboggan) et dans le tiroir, on met sale . Brice marque alors la relation causale qu'il a intégrée en utilisant pour mais l'appropriation de l'organisation logique des actions est fragile. Nous dirons plutôt que Brice est dans une succession temporelle d'actions contrainte par le matériel. Nous apportons ensuite le reste du matériel symbolique et lui demandons ce qu'il peut faire avec ou à quoi cela lui fait penser. Lui : Bah manger, . avec de l'argent Brice regarde les objets sans y toucher et reste très silencieux Nous : Même si tu n'as pas envie de jouer, tu peux m'expliquer ce que tu ferais avec ça, sans forcément le faire . Lui : Bah, on prend par exemple un fruit et on le fait passer ici (sur la caisse) . Nous : Ah oui. comme le jeu de la marchande ? Il approuve de la tête Nous : Tu as envie d'y jouer ? Lui : Heu non en grimaçant. LXI Brice ne nous explique pas davantage, ni par des mots, ni par des gestes. Il reconnat l'aspect symbolique du matériel et met en lien la caisse-enregistreuse, les fruits et légumes et l'argent mais il n'installe pas cette situation dans une création. Tout comme avec Paul, nous pensons que ce matériel évoque un jeu pour les plus petits pour Brice. Nous n'insistons donc pas et mettons fin à la séance après ses courtes explications. 1. 9. 5 Analyse globale Brice parvient à réaliser les embotements souhaités avec les œufs gigognes et s'ajuste au cours de l'atelier. Il rencontre certaines difficultés avec le parcours de billes. Brice tâtonne longuement, superpose les éléments mais ne les assemble pas car il ne tient pas toujours compte de sa particularité. Il se situe souvent dans une recherche d'identiques. Les éléments appartenant à un autre jeu semblent le gêner dans son exploration et appropriation du matériel et il réussit difficilement à dépasser cet obstacle. Nos descriptions des différentes situations l'aident à poursuivre. Brice montre alors une certaine satisfaction lorsqu'il réalise son premier parcours. L'exploration du matériel non-symbolique reste très restreinte. Brice utilise seulement la pâte à modeler, un bâtonnet et la paire de ciseaux comme outils et le carton comme support. Il n'annonce pas son projet et dénomme sa création seulement lorsque je lui demande. Face à la caisse-enregistreuse, Brice passe un long temps à explorer cet objet. Après plusieurs essais, il m'explique le fonctionnement mais cela reste fragile. Il se situe dans une succession temporelles d'actions également. Le matériel symbolique est reconnu mais Brice ne souhaite pas jouer avec. Ses énoncés n'apportent pas une fonction créatrice et autour de ce matériel et restent très descriptifs et succincts. L'analyse langagière est très limitée car Brice parle peu et nous regarde rarement. Néanmoins, il sait attirer notre regard sur une situation comme il a su le faire lors de la construction du parcours de billes. LXII Enfin, il élabore très peu en dehors de l'action. Le langage ne semble pas être un outil de pensée pour Brice. LXIII 1. 10 Romaric, 12 ans et 6 mois Nous rencontrons Romaric en janvier 2011 et les trois séances, qui se passeront de façon duelle, auront lieu de façon très rapprochées. Romaric est le seul enfant pour lequel les séances n'ont pu être filmées, d'o des analyses plus réduites. Le diagnostic de trouble spécifique du langage oral du type dysphasie mixte a été posé en septembre 2005. Des difficultés de comportement sont aussi notées. Romaric poursuit sa scolarisation au sein d'un IME. Romaric est un jeune pré-adolescent qui cherche souvent les limites mais avec qui les séances se sont très bien déroulées. Il pouvait se montrer difficile avec ses camarades quand nous allions le chercher dans l'établissement, mais une fois en séance avec nous, son comportement changeait et il se montrait alors coopérant et très intéressé. Romaric parle beaucoup, s'adresse à nous facilement, demande notre aide ou encore nous intègre dans ses jeux et explorations. 1. 10. 1 Atelier 1 : Œufs gigognes Romaric assemble les différents œufs et me dit c'est des œufs et ou des ballons de rugby qu'il lance en l'air. Nous lui proposons alors de se débrouiller pour obtenir cinq œufs : il ouvre O6 dans lequel il met O5 et referme. Il continue à ouvrir d'autres œufs, nous lui rappellons la consigne et il recompte les œufs qu'il a devant lui et s'arrête à cinq. Nous donnons la consigne suivante : Quatre ? C'est fastoche ! . Il embote alors O1 dans O2, O2 dans O3, etc. Il n'est pas gêné par le fait d'avoir déjà mis O5 dans O6 et manipule facilement les différents éléments. Romaric a su mettre en relation les différents éléments de ce matériel. Il manipule aisément les objets et s'ajuste lors de l'embotement des œufs. Cependant, son langage reste descriptif ( des œufs , des ballons ) mais ne montre pas de mise en relation. LXIV 1. 10. 2 Atelier 2 : Parcours de billes Romaric nous dit qu'il connat ce jeu et qu'il y joue souvent quand nous lui proposons le matériel. Nous nous rendons rapidement compte que Romaric manipule et assemble facilement les éléments. Il met en relation les objets et m'explique leur fonction également. Lui : Ca c'est pour ramasser à la fin quand il trouve une base. Il monte deux parcours très similaires qu'il va ensuite relier. Le dénivelé de l'élément qui relie les deux parcours n'est pas assez important pour que la bille roule seule. Romaric s'ajuste à partir du résultat qu'il constate et ajoute alors un tuyau pour monter la structure d'une unité. Lorsqu'il prend des éléments qui ne vont pas avec ses parcours, il n'insiste pas et change : Bon, il ne veut pas rentrer, tant pis . Il met ces éléments à part et les identifie même comme différents plus tard : Y'a pas de barre . Effectivement, le rebord en relief est non présent contrairement aux autres éléments, ce qui permet de les distinguer facilement. Il crée alors un parcours avec ces unités qui vont bien ensemble. Romaric utilise tous les éléments mis à sa disposition et crée alors six parcours différents75 : deux grands ( les adultes ), un avec les éléments différents et trois qui consistent en un assemblage d'une base et de tuyaux ( pour les bébés ). Il joue ensuite avec ses différents parcours et m'intègre dans son jeu. Romaric semble très à l'aise durant cet atelier et communique beaucoup. Le fait qu'il connaisse ce matériel facilite ses constructions. Il assemble facilement les éléments et notifie par son langage ceux qui sont différents. Romaric est le seul enfant diagnostiqué dysphasique à procéder par assemblage et non par juxtaposition pour cet atelier. Cette procédure est certainement à mettre en relation avec le fait qu'il connaisse ce matériel et y joue très souvent. 75 Annexes 7, p LXXXVIII LXV 1. 10. 3 Atelier 3 : Objets non-symboliques Romaric s'intéresse tout de suite au matériel et saisit rapidement un des tuyaux en carton auquel il ajoute petit à petit différents éléments par juxtaposition d'actions simples : enfonce des pics, met du coton dedans, enroule des fils de fer autour, Il reproduit ensuite les mêmes actions sur un autre tuyau et assemble de façon symétrique ces deux éléments. Romaric saisit ensuite le bolduc. Il enroule soigneusement le bolduc argenté autour des tuyaux, puis il déroule complètement l'autre bolduc vert et forme un tas qu'il scotche également aux tuyaux. Après avoir déroulé longuement le bolduc, il enroule un long moment le scotch autour des tuyaux. Il réitère encore cette juxtaposition d'actions avec les autres bolducs. Romaric signifie ses constructions au bout d'un quart d'heure suite à notre question. Lui : Celui-là, je l'ai fini, alors il reste celui-là Nous : Tu fais pareil ? Lui : Non celui-là c'est pas pareil, lui c'est un colonel Nous : Et lui c'était quoi ? Lui : Un sergent Romaric s'adresse souvent à nous pour que nous l'aidions à tenir quelque chose ou pour regarder ce qu'il fait. Le regard de l'adulte semble être important pour lui, nous le félicitons alors souvent. Pour son colonel , Romaric met en place un système afin d'enrouler le bolduc autour du tuyau en carton. Il prend un plateau tournant présent dans la salle, sur lequel il fixe le tuyau à l'aide de pâte à modeler. Il tourne alors le plateau et le bolduc s'enroule petit à petit autour du tuyau. Lui : Tu sais pourquoi j'ai mis de la pâte à modeler ? C'est pour ça tient, regarde là Il poursuit et ajoute des détails au colonel : Lui : Pour de vrai, ça c'est ses cheveux LXVI Il enfonce du bolduc à l'intérieur du tuyau en carton en poussant avec un pic Lui : Ca ce sont le coeur, ses estomacs Il change donc d'idée au cours de son action car le bolduc est complètement enfoncé à l'intérieur du tuyau. Lui : Ses cheveux, je vais les faire moi-même Il souhaite d'abord utiliser du coton puis change et fixe une boule de pâte à modeler en haut du tuyau Lui : En plus ça fait un tabouret (il voulait parler du bâton avec lequel on tape sur un tambour). Boum ! Boum ! Romaric poursuit sa création de colonel même s'il semble surtout intéressé par le fait de dérouler et d'enrouler le bolduc. Il dénomme le résultat de ses actions par ressemblance à ce qu'il connat. Romaric termine la séance en déroulant la ficelle à travers la pièce : Viens on fait une piège ! 1. 10. 4 Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Romaric prend le temps d'explorer la caisse, la regarde sous plusieurs angles, répète certaines actions. Il peut appuyer sur les boutons sale ou change sans avoir fait tomber les pièces dans la caisse au préalable. De plus, il ne peut appuyer individuellement sur les boutons correspondant aux encoches même si celles-ci ne comportent pas de pièce, Romaric appuie sur les trois boutons simultanément comme s'il s'agissait d'un paquet , comme si le résultat était lié à l'actionnement des trois boutons. Il n'individualise pas l'action de chaque bouton. Romaric est donc dans une succession temporelle d'actions contrainte par le matériel Avec le matériel symbolique, Romaric essaie d'introduire une poire, une banane ou encore une carotte dans les encoches de la caisse-enregistreuse mais cela n'est bien sûr pas possible. LXVII Il classe alors les fruits et légumes à l'intérieur du grand panier : les légumes, les qui piquent, les fruits mais il ne joue pas davantage avec. Il effectue ce classement d'une partie du matériel mais il ne reconnat pas plus l'aspect symbolique des objets présents devant lui, par des mots ou des actions. Peu intéressé par les objets symboliques ajoutés, Romaric rejoue alors avec la caisse. Il essaie les yeux fermés, ou souhaite faire tomber les pièces dans le tiroir-caisse et le toboggan en même temps, mais cela n'est pas réalisable. Ce souhait confirme que Romaric ne s'est pas approprié le fonctionnement spécifique de la caisse en général mais surtout des différents boutons. 1. 10. 5 Analyse globale Romaric manipule facilement et avec agilité le matériel des deux premiers ateliers. Les œufs gigognes sont formés puis embotés les uns dans les autres, mais les mots de Romaric décrivent seulement l'aspect physique du matériel et permettent la comparaison avec un objet non présent dans la salle. Romaric procède ensuite par assemblage pour construire ses différents parcours de billes, jeu qu'il connat très bien. Il s'ajuste à partir du résultat, identifie dans son langage les éléments différents et construit rapidement six parcours différents en utilisant tout le matériel. Avec les objets non-symboliques, Romaric réitère souvent les mêmes actions mais il a pour principale préoccupation le couple d'actions renversables dérouler-enrouler . Il n'annonce pas un projet défini mais il crée un objet nouveau qu'il signifie lorsque je le questionne. Le fonctionnement de la caisse-enregistreuse est lié à la succession temporelle d'actions contrainte par le matériel. Romaric agit par paquets d'actions et n'est pas encore dans un lien de causalité. Les objets symboliques ne sont pas différenciés dans un premier temps et sont alors agis comme les pièces. Dans un second temps, Romaric procède à un classement. Il reconnat les fruits et les légumes mais cela ne lui évoque pas davantage. Il revient alors à la caisse et reste centré sur les actions de mettre dans et appuyer sur . LXVIII Romaric parle beaucoup comparé aux autres enfants mais son langage reste essentiellement descriptif. Il dénomme, désigne et commente ce qu'il comprend. Les quelques mises en relation sont relevées dans les différents ateliers. LXIX 2. Les enfants tout-venant 2. 1. Léonie, 7 ans et 3 mois Nous rencontrons Léonie en février 2011 à son domicile. Nous avons pris le temps de faire connaissance en jouant ensemble avant de commencer les ateliers. Léonie est actuellement en classe de CE1 et n'a jamais suivi de prise en charge orthophonique. Léonie est une petite fille qui accepte très rapidement notre présence. Elle parle beaucoup et s'adresse souvent à nous pour attirer notre attention sur ce qu'elle fait. Elle ose parfois peu par peur de mal faire, mais mise en confiance, elle explore ensuite volontiers le matériel. 2. 1. 1 Atelier 1 : Œufs gigognes Léonie forme très rapidement un seul œuf apparent avec les cinq autres œufs cachés à l'intérieur. Nous lui demandons alors si elle a une autre idée : elle assemble alors les six œufs, sans les emboter. Suite à la deuxième consigne, Léonie nous dit je sais, je vais en cacher un dans l'autre . Elle saisit donc O6 puis change tout de suite pour prendre O2, l'ouvrir et mettre O1 dedans. Elle continue ainsi de suite jusqu'à obtenir un seul œuf. Léonie met rapidement en relation les différents éléments. Elle anticipe ce qu'elle va faire dans son langage mais aussi dans ses gestes lorsqu'elle change d'œuf. Elle manipule rapidement les œufs tout au long de l'atelier. 2. 1. 2 Atelier 2 : Parcours de billes Léonie débute l'exploration des éléments du parcours par les quelques éléments qui ne vont LXX pas avec le reste du jeu. Elle parvient à les assembler entre eux mais elle est bloquée pour les assembler avec les autres. Cette situation la gêne dans l'exploration initiale des propriétés du jeu. Elle poursuit et assemble d'autres éléments, teste avec une bille et se crée alors des certitudes quant à la spécificité du matériel. Léonie se lance alors de façon plus assurée dans la construction d'un parcours. La structure s'agrandit petit à petit et elle crée différents parcours sur la même structure. Son langage devient aussi plus informatif, anticipe ses actions et l'effet de ses actions. Elle réussit alors à se détacher de l'action pour élaborer en pensée. Elle : Je vais le faire descendre maintenant, comme ça il va tomber par terre Elle ajoute alors un tuyau sous un élément mais la structure penche sous le poids. Elle : Heu mais ça devient plus lourd ! Nous : Tu veux que je tienne en attendant ? Elle : Non, on va commencer par par terre . Léonie élabore à partir du résultat de ses actions et s'ajuste efficacement. Elle marque dans son langage les changements et met en relation les situations. Plus Léonie avance dans sa construction76, plus elle se situe dans une organisation d'actions car elle a su s'approprier le matériel et ses propriétés. Toutefois, elle semble avoir besoin d'être encouragée et relancée durant l'atelier étant peu sûre d'elle. 2. 1. 3 Atelier 3 : Objets non-symboliques Léonie explore la bote contenant les objets et annonce rapidement son projet symbolique en nous regardant : Elle : Ah je sais je vais faire quoi maintenant avec ça ! , la pâte à modeler rose dans les mains. 76 Annexes 7, p LXXXIX LXXI Nous : T'as une idée ? C'est quoi ton idée ? Elle : Je vais faire un bonhomme de neige ! . [] Elle : Et comme ça, avec ça (pic), je peux faire les yeux et la bouche ! pendant qu'elle roule la pâte à modeler. Léonie crée également une tarte aux fruits et un autre bonhomme 77 dans la suite de l'atelier. Léonie anticipe et se représente sa création en dehors de l'action. Tout au long de l'atelier, elle annonce également ses actions futures et l'effet de ses actions. Lorsqu'elle souhaite fixer une tête au corps de son bonhomme, le tout en pâte à modeler : Elle : Ah sinon je sais ce que je peux faire pour pas qu'il tombe (la tête), je peux mettre un bâton (qui traverse le corps et la tête) et comme ça, ça tient la tête en même temps ! Elle s'ajuste ainsi efficacement. Léonie se situe dans une réelle organisation d'actions dirigées vers la création d'objets nouveaux symbolisés. Par ailleurs, Léonie s'adresse à nous durant tout l'atelier, nous regarde et interagit. Son langage est nettement informatif et lui sert d'outil de pensée. 2. 1. 4 Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Léonie explore rapidement le fonctionnement de la caisse-enregistreuse. Elle annonce son projet ou l'effet de ses actions. Ainsi son langage anticipe ses actions. Aussi, elle expérimente les propriétés de la caisse : Elle : Mais je me demande si on met un jeton là si ça marche aussi. Elle met une pièce jaune dans l'encoche orange puis rouge. 77 Annexes 8, p XCV LXXII Elle : Non, ça ne marche pas, je sais pourquoi Nous : Pourquoi ? Elle : Parce que celles-ci (les jaunes) sont plus petites Léonie parvient à nous expliquer l'organisation logique liée à la caisse sans manipuler. Elle est donc capable d'élaboration en dehors de l'action. Nous apportons ensuite les objets symboliques. Léonie procède dans un premier temps à un rangement de tous les fruits et légumes dans les paniers. Une fois ce rangement terminé : Nous : Qu'est-ce qu'on fait maintenant ? Elle : On va acheter ! . Léonie reconnat les propriétés symboliques du matériel, lient les différents objets et met ainsi en place une scène. Un peu hésitante au début, Léonie s'approprie vite la situation et prend les décisions quant au jeu sans rechercher notre approbation. De plus, elle crée autour de la scène initiale. Elle : Il faut faire semblant que t'en aies, on va dire que c'est ça la bote lorsqu'elle prend une bote quelconque dans la pièce pour créer la bote de crayons de couleurs. [] Elle : Bon j'fais semblant ! Tut ! en passant la bote devant la caisse-enregistreuse. Ca coûte 50 ! . Elle recherche ainsi dans sa chambre ce qui pourrait servir pour symboliser les crayons de couleurs, les livres et la glace représentés sur la caisse-enregistreuse. Elle détourne des objets présents de leur fonction première pour représenter ceux qu'elle souhaite. Léonie se situe donc dans le jeu symbolique, qu'elle complexifie et organise au fil de l'atelier et de ses énoncés. LXXIII 2. 1. 5 Analyse globale Léonie demeure aussi bien dans une organisation d'actions avec un matériel contraint comme dans les ateliers 1 et 4, que dans les autres ateliers o l'expérimentation est plus libre encore. Le temps d'exploration et d'appropriation du matériel est plus long pour le parcours de billes mais Léonie parvient à comprendre les propriétés du matériel et l'assemblage devient plus rapide. Le temps d'exploration sera beaucoup plus court pour tous les autres ateliers. Les objets non-symboliques sont coordonnées et utilisés dans un projet de symbolisation annoncé et anticipé. Léonie se sert des propriétés physiques des objets qu'elle a reconnues afin de mener à bien ses créations d'objets nouveaux. L'organisation logique de la caisse est rapidement comprise et expliquée en dehors de l'action. Léonie rentre ensuite dans un jeu symbolique avec le reste du matériel de l'atelier 4. Elle installe une situation qu'elle enrichit petit à petit par ses gestes et ses énoncés. Le langage sert à Léonie de description mais surtout d'information, d'anticipation, de mise en relation entre ses expériences et ses connaissances. Il est un véritable outil de pensée détaché de l'action. LXXIV 2. 2. Victoire, 9 ans et 8 mois Nous faisons la rencontre de Victoire en février 2011 à son domicile. Les quatre ateliers se feront en une heure et quart, les uns à la suite des autres. Nous ne noterons aucune fatigabilité ni lassitude de la part de Victoire. Par ailleurs, Victoire avait le pied plâtré, ce qui a pu la restreindre pour certaines conduites, notamment avec le parcours de billes. Victoire est en classe de CM1 cette année scolaire et n'a jamais bénéficié d'une prise en charge orthophonique. Victoire est une jeune fille peu timide et très habile de ses mains. Elle se montre très créative au cours des ateliers et joue également avec les mots. Le langage est un réel outil à mettre en sens, organiser et inventer pour Victoire. 2. 2. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Victoire assemble les six œufs en les embotant petit à petit : Je prends et j'embote, après je prends celui qui est juste un peu plus grand et je rembote, etc. Elle obtient ensuite le même résultat mais en embotant les demi-coquilles, et les assemble seulement à la fin pour obtenir un seul œuf visible. Après l'avoir relancée, elle assemble les six œufs de façon séparée. Suite à la deuxième consigne, elle prend rapidement O2 pour y mettre O1 : Disparu, comme par magie ! Ou on peut dire que je l'ai mangé ! . Elle continue de la même façon et nous dit en souriant à la fin : et plus aucun maintenant ? en cachant l'œuf derrière son dos. Victoire exprime la relation entretenue par les différents éléments du matériel. Elle manipule aisément le matériel et joue avec. Elle joue également avec le langage et crée ainsi une situation nouvelle autour de ce matériel. LXXV 2. 2. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Victoire connat ce jeu même si celui qu'elle a n'est pas tout à fait le même . Elle cherche dans un premier temps des bases puis elle assemble rapidement des éléments droits, escaliers ou arrondis entre eux. Elle ajoute seulement à la fin les tuyaux à certains endroits du parcours afin de faire tenir la structure : Maintenant il faut rééquilibrer . Victoire semble avoir un projet et utilise une procédure particulière afin d'y parvenir. Elle réalise très rapidement ce premier parcours, nous lui proposons alors d'en faire un autre si elle le souhaite. Victoire accepte volontiers et construit un second parcours78, très ressemblant au premier, mais elle apporte quelques modifications. Elle installe par exemple un raccourci , c'est-à-dire un tuyau à mi-parcours qui sert de nouveau départ. Tout au long de cet atelier, Victoire anticipe dans son langage son projet ou l'effet de ses actions. Elle procède ainsi par organisation d'actions et l'assemblage des éléments de ses parcours est aisé. 2. 2. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Nous mettons ensuite la bote contenant les objets non-symboliques à disposition de Victoire : Du journal, du carton, c'est un atelier création ? . Nous lui donnons alors la consigne. Victoire prend de suite un carton et du coton, qu'elle forme en boule dans ses mains. Nous : Tu as déjà une idée ? Elle : Oui, je vais faire un peu les nuages Victoire s'installe ainsi dans un projet symbolique qu'elle enrichit petit à petit. Pendant qu'elle coupe des morceaux de fils de fer bleu : Elle : Quoi que n'importe quelle couleur pouvait aller 78 Annexes 7, p LXXXIX LXXVI Nous : C'est pour quoi faire ? Elle : En fait je vais recouvrir, je vais donner une forme, un peu arrondie, et je vais recouvrir encore de coton et je vais faire des flocons de neige qui tombent Elle anticipe dans ses mots ce qu'elle projette de réaliser. Elle élabore ainsi en dehors de son action. Victoire réalise ce premier paysage mais elle a encore beaucoup d'autres idées. Elle poursuit donc l'atelier et crée un paysage avec un arc-en-ciel car le soleil plus la pluie, ça crée l'arc-en-ciel . Elle crée alors ces différents éléments qu'elle scotche sur le carton. Elle termine cet atelier en réalisant un personnage, une crevette à l'aide la pâte à modeler rose. Nous voyons là encore comme Victoire joue avec le langage : Elle prend son personnage crevette Elle : Après, il faut le scotcher au carton, comme ça en mettant debout le personnage en pâte à modeler. Ah il dort pas. ! quand la pâte à modeler tombe Oh bah on va plutôt le faire dormir ! et couche alors le personnage sur le carton. Victoire se situe dans un projet de symbolisation tout au long de l'atelier79. Son langage sert à mettre en sens ses actions mais aussi à l'installer dans une réelle création. 2. 2. 4. Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Victoire assimile très vite le fonctionnement de la caisse-enregistreuse. Son explication donnée, sans qu'elle ne manipule la caisse-enregistreuse, marque qu'elle se situe bien dans une organisation logique des actions : Elle : En fait, à l'intérieur, il y a deux planches je pense. Quand on appuie sur ce bouton (montre le bouton sale ), y'en a une qui se libère et donc ça les fait aller là-dedans (montre le tiroir) et quand on appuie sur l'autre bouton ( change), y'a l'autre qui se libère et ça les fait aller là (montre le toboggan) 79 Annexes 8, p XCV LXXVII Et donc là, il y a un système (montre la manivelle), dès qu'on entend la cloche, ça s'ouvre et on voit les pièces quand on a appuyé sur sale . Victoire imagine ce qu'elle ne voit pas pour expliquer le fonctionnement de la caisse- enregistreuse ; nous notons ainsi une grande décentration par rapport à l'objet et à la situation. Nous introduisons alors le reste du matériel symbolique. Victoire associe ces objets à l'idée du marché . Elle installe la situation en répartissant l'argent entre la caisse et nous-même. Ainsi, elle nous intègre directement dans son jeu et initie l'échange : Alors, qu'est-ce que tu veux acheter ? . Victoire s'approprie la scène qu'elle met en place petit à petit et qu'elle enrichit et organise grâce à ses énoncés. Nous : Qu'est-ce que vous me conseillez ? Elle : Nos bananes sont exquises ! Et elles sont en réduction, 250 la banane Lorsqu'elle répartit sur le plateau les fruits et légumes achetés. Elle : Je vais être généreuse ! Surtout qu'on n'est que quatre dans la famille Elle répartit ensuite l'argent. Elle : En plus de la nourriture, de l'argent ! J'ai trop d'argent, c'est mon banquier qui me l'a dit ! Victoire se situe ainsi dans ce qu'on appelle le jeu symbolique avec une scène, un projet qu'elle construit et imagine au fur et à mesure. 2. 2. 5. Analyse globale Victoire se situe dans une organisation d'actions pour tous les ateliers. Elle anticipe ses projets ou l'effet de ses actions. Elle élabore à partir du résultat et s'ajuste ainsi efficacement. Elle s'appuie sur les propriétés du matériel qu'elle a reconnues pour construire son parcours de billes ou des objets nouveaux symboliques. LXXVIII Victoire utilise le langage dans un but informatif mais aussi créatif. Le langage contribue à ses jeux et les enrichit. Il est aussi un véritable outil de communication. Les temps d'exploration du matériel sont très courts, contrairement aux enfants diagnostiqués dysphasiques. LXXIX 2. 3. Valentine, 10 ans et 9 mois Nous faisons la connaissance de Valentine en février 2011 à son domicile. La totalité des ateliers se fera en moins d'une heure car Valentine sera très rapide. Valentine est scolarisée en classe de CM2 et n'a jamais suivi de prise en charge orthophonique. Valentine est une jeune fille qui se montre très adroite et astucieuse lors des différents ateliers. Quelque peu réservée au début, elle nous parle davantage au cours de la matinée, bien qu'elle reste plus silencieuse que les deux autres enfants tout-venant. 2. 3. 1. Atelier 1 : Œufs gigognes Valentine propose tout d'abord de les poser comme ça et faire des pyramides . Elle retourne toutes les demi-coquilles, met côte à côte des éléments de même taille puis en superpose pour faire une pyramide. Sa deuxième idée consiste à les placer du plus petit au plus grand . Elle réalise alors deux lignes avec les demi-coquilles en correspondance terme à terme. Enfin elle suggère de les assembler et faire des boules : elle assemble les éléments mis en correspondance juste avant et obtient les six œufs. Nous lui donnons la deuxième consigne, elle embote alors O5 dans O6. Lorsque nous lui demandons de se débrouiller pour n'en voir plus que quatre, Valentine nous dit oh j'aurais dû faire le contraire et commencer par le plus petit comme ça je ne suis pas obligée de tout rouvrir . Valentine va alors s'ajuster à partir de ce constat et recommencer à partir du plus petit œuf. Valentine réalise d'abord quelque chose de plus perceptif car les éléments lui font penser à des pyramides, mais elle découvre petit à petit le matériel et se rend compte de sa spécificité. Elle arrive donc à mettre en relation les éléments et à verbaliser cette mise en relation. Dans la suite de l'atelier, Valentine élabore à partir du résultat qu'elle obtient et s'ajuste efficacement. Elle verbalise également la situation. Tout au long de l'atelier, elle anticipe dans son langage en annonçant le LXXX projet ou l'effet attendu. 2. 3. 2. Atelier 2 : Parcours de billes Valentine recherche dans un premier temps les bases pour commencer son parcours. Elle en positionne quatre, puis cinq, et débute l'assemblage des autres éléments. Elle fixe facilement les différents éléments entre eux, tient compte de leur propriété et anticipe les hauteurs nécessaires pour les dénivelés du parcours. La structure comporte plusieurs parcours entremêlés les uns dans les autres. Valentine est très à l'aise avec le matériel et sa manipulation est rapide et habile. Vers la fin de sa construction, Valentine manque de petits tuyaux. Elle s'ajuste alors efficacement et modifie son parcours afin de récupérer des tuyaux pour poursuivre son assemblage. La construction finale comporte trois parcours différents qui se croisent80. Valentine lance une bille dans chaque parcours mais elle n'éprouve pas le besoin de recommencer. Ainsi, Valentine se situe dans une organisation d'actions avec un projet défini dès le départ et elle assemble les divers éléments en vue de réaliser ce projet. Plutôt réservée, Valentine parle très peu durant ce premier atelier. Elle nous demandera à deux reprises C'est quoi ça ? en montrant l'entonnoir puis un pied, mais elle trouvera d'elle- même leur fonction. 2. 3. 3. Atelier 3 : Objets non-symboliques Valentine parle d'activités manuelles lorsque nous lui proposons la bote contenant les objets non-symboliques. Elle regarde et touche quelques objets puis s'intéresse à la pâte à modeler verte et orange. Valentine modèle alors entre ses mains une boule orange à laquelle elle ajoute des morceaux 80 Annexes 7, p XC LXXXI de pâte à modeler verte et des détails à l'aide de la paire de ciseaux. Une fois terminé, elle nous dit en nous montrant ce nouvel objet : Une citrouille ! . Elle symbolise ainsi le résultat final de sa première création. Elle poursuit l'atelier en créant un nouvel objet à partir du coton, de pince à linge, de chips en polystyrène et d'un pic. Elle tourne vers nous sa construction lorsqu'elle termine et nous regarde : Nous : Ah c'est un lapin ? Elle : Oui ! Bien qu'elle n'annonce pas son projet à l'avance ou qu'elle ne symbolise pas d'elle-même cet objet, Valentine se situe toutefois dans la construction d'un projet symbolique81. La préparation et le choix du matériel montre qu'elle anticipe cette création et qu'elle est dans une organisation d'actions. 2. 3. 4. Atelier 4 : Caisse enregistreuse et objets symboliques Nous proposons la caisse-enregistreuse à Valentine qui nous dit qu'elle connat et que c'est pour les bébés . Lorsqu'elle ouvre le tiroir-caisse, elle ajoute ah, c'est un truc pour jouer à la marchande ! Parce qu'il y a des sous dedans . Elle poursuit son exploration et elle comprend rapidement le fonctionnement de cet objet : Nous : Est-ce que tu peux m'expliquer comment ça fonctionne ? Elle : Oui. Ca c'est la caisse, on tourne la manivelle pour que ça s'ouvre. Les gens, ils paient ici (elle met les pièces dans les encoches), avec les pièces qui correspondent Après, on appuie sur le bouton-là (montre change ) pour que ça aille là (toboggan) Et là (bouton sale ) pour que ça vienne là (tiroir-caisse) . Valentine se situe dans une organisation logique des actions et le montre également dans son langage avec les pour que , marqueurs de causalité. Nous notons également la présence importante de verbes dans ses énoncés. 81 Annexes 8, p XCV LXXXII Valentine n'a pas vraiment envie de jouer avec le reste des objets symboliques. Elle reconnat leur propriété symbolique car elle nous reparle du jeu de la marchande mais ce jeu connote, pour elle, un jeu pour les plus petits. Nous n'insistons pas et nous terminons la séance. 2. 3. 5. Analyse globale Comme Léonie et Victoire, Valentine procède également par organisation d'actions dans tous les ateliers que je lui propose. L'ensemble des ateliers a été réalisé dans un temps très court car Valentine se montre très rapide pour l'exploration du matériel puis son utilisation. Elle annonce clairement son projet pour l'atelier 1 mais la manipulation des objets par Valentine nous montre que tous ces autres projets, bien que non annoncés, sont établis en pensée préalablement. Toutes ses actions sont réfléchies et dirigées vers un but prédéfini et qui sera toujours facilement atteint. Valentine parle peu mais son langage est tout à fait informatif. Elle symbolise ses créations, met en relation les objets, marque les changements. LXXXIII Annexes 7 : Les différents parcours de billes des enfants Parcours de Sylvain Parcours de Louis LXXXIV Parcours de Loïc Parcours de Quentin LXXXV Parcours de Léna Parcours d'Arthur LXXXVI Parcours de Marc Parcours de Paul LXXXVII Parcours de Brice Parcours de Romaric LXXXVIII Parcours de Léonie Parcours de Victoire LXXXIX Parcours de Valentine XC Annexes 8 : Les différentes réalisations des enfants avec les objets non-symboliques Vaisseau spatial de Sylvain Bonshommes de Louis XCI Réalisations de Loïc Bonhomme de Quentin Réalisation de Léna XCII Grappin d'Arthur Pistolet de Marc XCIII Panneau de Paul Bonhomme de Brice XCIV Bonhomme de Léonie Nuages , Soleil et arc-en-ciel et Monsieur et Madame Crevette de Victoire Lapin de Valentine XCV GODEL Marion Investigation du rapport aux objets chez dix enfants diagnostiqués dysphasiques Mémoire d'orthophonie Nancy 2011 Résumé : L'objectif de ce travail de recherche est d'observer comment des enfants diagnostiqués dysphasiques se situent dans leur rapport aux objets, soit comment ils signifient dans leurs actions et dans leur langage leur compréhension du monde qui les entoure. La première partie présente les éléments théoriques retenus pour ce mémoire. De nombreux travaux ont fait le lien entre le développement cognitif et le langage, notamment ceux de PIAGET. L'enfant passe par différents stades qui lui permettent d'accéder aux représentations mentales, donc à la symbolisation et par conséquent au langage. Les enfants diagnostiqués dysphasiques sont porteurs de troubles spécifiques, sévères et durables du langage oral mais peu d'études se sont intéressées au développement cognitif de ces enfants, en particulier à leur rapport aux objets. La deuxième partie est consacrée au dispositif expérimental donc à la présentation de la population d'étude et des ateliers qui leur ont été proposés. Nous avons rencontré dix enfants diagnostiqués dysphasiques et trois enfants tout-venant et leur avons proposé différentes situations de jeux, avec consignes minimales. Enfin, la dernière et troisième partie présente les passations et analyses de quatre enfants, puis une analyse globale avec présentation des grilles d'observations et des profils obtenus est proposée, enfin une discussion vient valider nos hypothèses initiales et proposer des pistes de recherche futures. Mots-clés : - Cognition - Dysphasie - Développement - Langage oral Jury : Président : Monsieur le Professeur Bruno LEHEUP, Directrice : Madame Lydie MOREL, Assesseur : Madame Cécile JARNAUD, Généticien pédiatre Orthophoniste Orthophoniste Date de soutenance : 30 juin 2011 | HAL | Scientific |
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S. de MÉDECINE DU TRAVAIL Membres du Jury de la Thèse : Madame le Professeur LEHUCHER-MICHEL Marie-Pascale Monsieur le Professeur SIMON Nicolas Madame le Docteur (MCU-PH) BOULAMERY Audrey Madame le Docteur LAGATHU Galle Président Assesseur Assesseur Assesseur Consommation de cannabis et son impact en milieu professionnel : enquête chez les travailleurs consultant en cabinet de Médecine Générale dans le Var T H È S E A R T I C L E Présentée et publiquement soutenue devant LA FACULTÉ DE MÉDECINE DE MARSEILLE Le 30 Octobre 2018 Par Monsieur Matthieu PETIT Né le 23 juin 1989 à La Seyne-Sur-Mer (83) Pour obtenir le grade de Docteur en Médecine D. E. 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Yvon BERLAND M. André ALI CHERIF M. Jean-François PELLISSIER Mis à jour 18/07/2017 PROFESSEURS HONORAIRES MM AGOSTINI Serge ALDIGHIERI René ALESSANDRINI Pierre ALLIEZ Bernard AQUARON Robert ARGEME Maxime ASSADOURIAN Robert AUFFRAY Jean-Pierre AUTILLO-TOUATI Amapola AZORIN Jean-Michel BAILLE Yves BARDOT Jacques BARDOT André BERARD Pierre BERGOIN Maurice BERNARD Dominique BERNARD Jean-Louis BERNARD Pierre-Marie BERTRAND Edmond BISSET Jean-Pierre BLANC Bernard BLANC Jean-Louis BOLLINI Gérard BONGRAND Pierre BONNEAU Henri BONNOIT Jean BORY Michel BOTTA Alain BOURGEADE Augustin BOUVENOT Gilles BOUYALA Jean-Marie BREMOND Georges BRICOT René BRUNET Christian BUREAU Henri CAMBOULIVES Jean CANNONI Maurice CARTOUZOU Guy CHAMLIAN Albert CHARREL Michel CHAUVEL Patrick CHOUX Maurice CIANFARANI François CLEMENT Robert COMBALBERT André CONTE-DEVOLX Bernard CORRIOL Jacques COULANGE Christian DALMAS Henri DE MICO Philippe DELARQUE Alain DEVIN Robert DEVRED Philippe DJIANE Pierre DONNET Vincent DUCASSOU Jacques DUFOUR Michel DUMON Henri FARNARIER Georges FAVRE Roger FIECHI Marius MM FIGARELLA Jacques FONTES Michel FRANCOIS Georges FUENTES Pierre GABRIEL Bernard GALINIER Louis GALLAIS Hervé GAMERRE Marc GARCIN Michel GARNIER Jean-Marc GAUTHIER André GERARD Raymond GEROLAMI-SANTANDREA André GIUDICELLI Roger GIUDICELLI Sébastien GOUDARD Alain GOUIN François GRISOLI François GROULIER Pierre HADIDA/SAYAG Jacqueline HASSOUN Jacques HEIM Marc HOUEL Jean HUGUET Jean-François JAQUET Philippe JAMMES Yves JOUVE Paulette JUHAN Claude JUIN Pierre KAPHAN Gérard KASBARIAN Michel KLEISBAUER Jean-Pierre LACHARD Jean LAFFARGUE Pierre LAUGIER René LEVY Samuel LOUCHET Edmond LOUIS René LUCIANI Jean-Marie MAGALON Guy MAGNAN Jacques MALLAN- MANCINI Josette MALMEJAC Claude MATTEI Jean François MERCIER Claude METGE Paul MICHOTEY Georges MILLET Yves MIRANDA François MONFORT Gérard MONGES André MONGIN Maurice MONTIES Jean-Raoul NAZARIAN Serge NICOLI René NOIRCLERC Michel OLMER Michel OREHEK Jean PAPY Jean-Jacques PAULIN Raymond PELOUX Yves PENAUD Antony 30/11/2017 MM PENE Pierre PIANA Lucien PICAUD Robert PIGNOL Fernand POGGI Louis POITOUT Dominique PONCET Michel POUGET Jean PRIVAT Yvan QUILICHINI Francis RANQUE Jacques RANQUE Philippe RICHAUD Christian ROCHAT Hervé ROHNER Jean-Jacques ROUX Hubert ROUX Michel RUFO Marcel SAHEL José SALAMON Georges SALDUCCI Jacques SAN MARCO Jean-Louis SANKALE Marc SARACCO Jacques SARLES Jean-Claude SASTRE Bernard SCHIANO Alain SCOTTO Jean-Claude SEBAHOUN Gérard SERMENT Gérard SERRATRICE Georges SOULAYROL René STAHL André TAMALET Jacques TARANGER-CHARPIN Colette THOMASSIN Jean-Marc UNAL Daniel VAGUE Philippe VAGUE/JUHAN Irène VANUXEM Paul VERVLOET Daniel VIALETTES Bernard WEILLER Pierre-Jean 30/11/2017 PROFESSEURS HONORIS CAUSA MM. les Professeurs 1967 MM. les Professeurs 1974 MM. les Professeurs 1975 MM. les Professeurs 1976 MM. les Professeurs 1977 M. le Président 1978 MM. les Professeurs 1980 MM. les Professeurs 1981 M. le Professeur 1982 MM. les Professeurs 1985 MM. les Professeurs 1986 M. le Professeur 1987 MM. les Professeurs 1988 DADI (Italie) CID DOS SANTOS (Portugal) MAC ILWAIN (Grande-Bretagne) T. A. LAMBO (Suisse) O. SWENSON (U. S. A. ) Lord J. WALTON of DETCHANT (Grande-Bretagne) P. FRANCHIMONT (Belgique) Z. J. BOWERS (U. S. A. ) C. GAJDUSEK-Prix Nobel (U. S. A. ) C. GIBBS (U. S. A. ) J. DACIE (Grande-Bretagne) F. HOUPHOUET-BOIGNY (Côte d'Ivoire) A. MARGULIS (U. S. A. ) R. D. ADAMS (U. S. A. ) H. RAPPAPORT (U. S. A. ) M. SCHOU (Danemark) M. AMENT (U. S. A. ) Sir A. HUXLEY (Grande-Bretagne) S. REFSUM (Norvège) W. H. HENDREN (U. S. A. ) S. MASSRY (U. S. A. ) KLINSMANN (R. D. A. ) E. MIHICH (U. S. A. ) T. MUNSAT (U. S. A. ) LIANA BOLIS (Suisse) L. P. ROWLAND (U. S. A. ) P. J. DYCK (U. S. A. ) R. BERGUER (U. S. A. ) W. K. ENGEL (U. S. A. ) V. ASKANAS (U. S. A. ) J. WEHSTER KIRKLIN (U. S. A. ) A. DAVIGNON (Canada) A. BETTARELLO (Brésil) M. le Professeur 1989 P. MUSTACCHI (U. S. A. ) 30/11/2017 MM. les Professeurs 1990 MM. les Professeurs 1991 MM. les Professeurs 1992 MM. les Professeurs 1994 MM. les Professeurs 1995 MM. les Professeurs 1997 MM. les Professeurs 1998 MM. les Professeurs 1999 MM. les Professeurs 2000 2001 MM. les Professeurs MM. les Professeurs 2002 2003 M. le Professeur Sir M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2004 2005 2006 2007 J. G. MC LEOD (Australie) J. PORTER (U. S. A. ) J. Edward MC DADE (U. S. A. ) W. BURGDORFER (U. S. A. ) H. G. SCHWARZACHER (Autriche) D. CARSON (U. S. A. ) T. YAMAMURO (Japon) G. KARPATI (Canada) W. J. KOLFF (U. S. A. ) D. WALKER (U. S. A. ) M. MULLER (Suisse) V. BONOMINI (Italie) C. DINARELLO (U. S. A. ) D. STULBERG (U. S. A. ) A. MEIKLE DAVISON (Grande-Bretagne) P. I. BRANEMARK (Suède) O. JARDETSKY (U. S. A. ) J. BOTELLA LLUSIA (Espagne) D. COLLEN (Belgique) S. DIMAURO (U. S. A. ) D. SPIEGEL (U. S. A. ) C. R. CONTI (U. S. A. ) P-B. BENNET (U. S. A. ) G. HUGUES (Grande Bretagne) J-J. O'CONNOR (Grande Bretagne) M. ABEDI (Canada) K. DAI (Chine) T. MARRIE (Canada) G. K. RADDA (Grande Bretagne) M. DAKE (U. S. A. ) L. CAVALLI-SFORZA (U. S. A. ) A. R. CASTANEDA (U. S. A. ) S. KAUFMANN (Allemagne) 30/11/2017 2008 M. le Professeur Mme le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2009 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2010 2011 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2012 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2013 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2014 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2015 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur EMERITAT LEVY Samuel JUHAN-VAGUE Irène PONCET Michel KASBARIAN Michel ROBERTOUX Pierre DJIANE Pierre VERVLOET Daniel MAGNAN Jacques DI MARINO Vincent MARTIN Pierre METRAS Dominique AUBANIAC Jean-Manuel BOUVENOT Gilles CAMBOULIVES Jean FAVRE Roger MATTEI Jean-François OLIVER Charles VERVLOET Daniel BRANCHEREAU Alain CARAYON Pierre COZZONE Patrick DELMONT Jean HENRY Jean-François LE GUICHAOUA Marie-Roberte RUFO Marcel SEBAHOUN Gérard FUENTES Pierre GAMERRE Marc MAGALON Guy PERAGUT Jean-Claude WEILLER Pierre-Jean COULANGE Christian COURAND François FAVRE Roger MATTEI Jean-François OLIVER Charles VERVLOET Daniel 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2012 31/12/2014 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 30/11/2017 2016 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2017 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur BONGRAND Pierre BOUVENOT Gilles BRUNET Christian CAU Pierre COZZONE Patrick FAVRE Roger FONTES Michel JAMMES Yves NAZARIAN Serge OLIVER Charles POITOUT Dominique SEBAHOUN Gérard VIALETTES Bernard ALESSANDRINI Pierre BOUVENOT Gilles CHAUVEL Patrick COZZONE Pierre DELMONT Jean FAVRE Roger OLIVER Charles SEBBAHOUN Gérard 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2020 31/08/2018 31/08/2020 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2018 30/11/2017 PROFESSEURS DES UNIVERSITES - PRATICIENS HOSPITALIERS AGOSTINI FERRANDES Aubert ALBANESE Jacques ALIMI Yves AMABILE Philippe AMBROSI Pierre ANDRE Nicolas ARGENSON Jean-Nol ASTOUL Philippe ATTARIAN Shahram AUDOUIN Bertrand AUQUIER Pascal AVIERINOS Jean-François AZULAY Jean-Philippe BAILLY Daniel BARLESI Fabrice BARLIER-SETTI Anne BARTHET Marc BARTOLI Jean-Michel BARTOLI Michel BARTOLIN Robert Surnombre BARTOLOMEI Fabrice BASTIDE Cyrille BENSOUSSAN Laurent BERBIS Philippe BERDAH Stéphane BERLAND Yvon Surnombre BERNARD Jean-Paul BEROUD Christophe BERTUCCI François BLAISE Didier BLIN Olivier BLONDEL Benjamin BONIN/GUILLAUME Sylvie BONELLO Laurent BONNET Jean-Louis BOTTA/FRIDLUND Danielle BOUBLI Léon BOYER Laurent BREGEON Fabienne BRETELLE Florence BROUQUI Philippe BRUDER Nicolas BRUE Thierry BRUNET Philippe BURTEY Stéphane CARCOPINO-TUSOLI Xavier CASANOVA Dominique CASTINETTI Frédéric CECCALDI Mathieu CHABOT Jean-Michel CHAGNAUD Christophe CHAMBOST Hervé CHAMPSAUR Pierre CHANEZ Pascal CHARAFFE-JAUFFRET Emmanuelle CHARREL Rémi CHARPIN Denis Surnombre CHAUMOITRE Kathia CHIARONI Jacques CHINOT Olivier CHOSSEGROS Cyrille CLAVERIE Jean-Michel Surnombre COLLART Frédéric COSTELLO Régis COURBIERE Blandine COWEN Didier CRAVELLO Ludovic CUISSET Thomas CURVALE Georges DA FONSECA David DAHAN-ALCARAZ Laetitia DANIEL Laurent DARMON Patrice D'ERCOLE Claude D'JOURNO Xavier DEHARO Jean-Claude DELPERO Jean-Robert DENIS Danièle DESSEIN Alain Surnombre DESSI Patrick DISDIER Patrick DODDOLI Christophe DRANCOURT Michel DUBUS Jean-Christophe DUFFAUD Florence DUFOUR Henry DURAND Jean-Marc DUSSOL Bertrand ENJALBERT Alain Surnombre EUSEBIO Alexandre FAKHRY Nicolas FAUGERE Gérard Surnombre FELICIAN Olvier FENOLLAR Florence FIGARELLA/BRANGER Dominique FLECHER Xavier FOURNIER Pierre-Edouard FRANCES Yves Surnombre FUENTES Stéphane GABERT Jean GAINNIER Marc GARCIA Stéphane GARIBOLDI Vlad GAUDART Jean GAUDY-MARQUESTE Caroline GENTILE Stéphanie GERBEAUX Patrick GEROLAMI/SANTANDREA René GILBERT/ALESSI Marie-Christine GIORGI Roch GIOVANNI Antoine GIRARD Nadine GIRAUD/CHABROL Brigitte GONCALVES Anthony GORINCOUR Guillaume GRANEL/REY Brigitte GRANVAL Philippe GREILLIER Laurent GRILLO Jean-Marie Surnombre GRIMAUD Jean-Charles GROB Jean-Jacques GUEDJ Eric GUIEU Régis GUIS Sandrine GUYE Maxime GUYOT Laurent GUYS Jean-Michel HABIB Gilbert HARDWIGSEN Jean HARLE Jean-Robert HOFFART Louis HOUVENAEGHEL Gilles JACQUIER Alexis JOURDE-CHICHE Noémie JOUVE Jean-Luc KAPLANSKI Gilles KARSENTY Gilles KERBAUL François KRAHN Martin LAFFORGUE Pierre LAGIER Jean-Christophe LAMBAUDIE Eric LANCON Christophe LA SCOLA Bernard LAUNAY Franck LAVIEILLE Jean-Pierre LE CORROLLER Thomas LE TREUT Yves-Patrice Surnombre LECHEVALLIER Eric LEGRE Régis LEHUCHER-MICHEL Marie-Pascale LEONE Marc LEONETTI Georges LEPIDI Hubert LEVY Nicolas MACE Loïc MAGNAN Pierre-Edouard MARANINCHI Dominique Surnombre MARTIN Claude Surnombre MATONTI Frédéric MEGE Jean-Louis MERROT Thierry METZLER/GUILLEMAIN Catherine MEYER/DUTOUR Anne MICCALEF/ROLL Jolle MICHEL Fabrice MICHEL Gérard MICHELET Pierre MILH Mathieu MOAL Valérie MONCLA Anne MORANGE Pierre-Emmanuel MOULIN Guy MOUTARDIER Vincent MUNDLER Olivier Surnombre NAUDIN Jean NICOLAS DE LAMBALLERIE Xavier NICOLLAS Richard OLIVE Daniel 30/11/2017 OUAFIK L'Houcine PAGANELLI Franck PANUEL Michel PAPAZIAN Laurent PAROLA Philippe PARRATTE Sébastien PELISSIER-ALICOT Anne-Laure PELLETIER Jean PETIT Philippe PHAM Thao PIERCECCHI/MARTI Marie-Dominique PIQUET Philippe PIRRO Nicolas POINSO François RACCAH Denis RAOULT Didier REGIS Jean REYNAUD/GAUBERT Martine REYNAUD Rachel RICHARD/LALLEMAND Marie-Aleth RIDINGS Bernard Surnombre ROCHE Pierre-Hugues ROCH Antoine ROCHWERGER Richard ROLL Patrice ROSSI Dominique ROSSI Pascal ROUDIER Jean SALAS Sébastien SAMBUC Roland Surnombre SARLES Jacques SARLES/PHILIP Nicole SCAVARDA Didier SCHLEINITZ Nicolas SEBAG Frédéric SEITZ Jean-François SIELEZNEFF Igor SIMON Nicolas STEIN Andréas TAIEB David THIRION Xavier THOMAS Pascal THUNY Franck TREBUCHON-DA FONSECA Agnès TRIGLIA Jean-Michel TROPIANO Patrick TSIMARATOS Michel TURRINI Olivier VALERO René VAROQUAUX Arthur Damien VELLY Lionel VEY Norbert VIDAL Vincent VIENS Patrice VILLANI Patrick VITON Jean-Michel VITTON Véronique VIEHWEGER Heide Elke VIVIER Eric XERRI Luc PROFESSEUR DES UNIVERSITES ADALIAN Pascal AGHABABIAN Valérie BELIN Pascal LEVASSEUR Anthony RANJEVA Jean-Philippe SOBOL Hagay CHABANNON Christian CHABRIERE Eric FERON François LE COZ Pierre PROFESSEUR CERTIFIE BRANDENBURGER Chantal PRAG TANTI-HARDOUIN Nicolas PROFESSEUR ASSOCIE DE MEDECINE GENERALE A MI-TEMPS ADNOT Sébastien FILIPPI Simon PROFESSEUR ASSOCIE A TEMPS PARTIEL BURKHART Gary 30/11/2017 MAITRE DE CONFERENCES DES UNIVERSITES - PRATICIENS HOSPITALIERS ACHARD Vincent (disponibilité) ANGELAKIS Emmanouil ATLAN Catherine (disponibilité) BARTHELEMY Pierre BARTOLI Christophe BEGE Thierry BELIARD Sophie BERBIS Julie BERGE-LEFRANC Jean-Louis BEYER-BERJOT Laura BIRNBAUM David BONINI Francesca BOUCRAUT Joseph BOULAMERY Audrey BOULLU/CIOCCA Sandrine BUFFAT Christophe CAMILLERI Serge CARRON Romain CASSAGNE Carole CHAUDET Hervé COZE Carole DADOUN Frédéric (disponibilité) DALES Jean-Philippe DAUMAS Aurélie DEGEORGES/VITTE Jolle DEL VOLGO/GORI Marie-José DELLIAUX Stéphane DESPLAT/JEGO Sophie DEVEZE Arnaud Disponibilité DUBOURG Grégory DUFOUR Jean-Charles EBBO Mikal FABRE Alexandre FOLETTI Jean- Marc FOUILLOUX Virginie FROMONOT Julien GABORIT Bénédicte GASTALDI Marguerite GELSI/BOYER Véronique GIUSIANO Bernard GIUSIANO COURCAMBECK Sophie GONZALEZ Jean-Michel GOURIET Frédérique GRAILLON Thomas GRISOLI Dominique GUENOUN MEYSSIGNAC Daphné GUIDON Catherine HAUTIER/KRAHN Aurélie HRAIECH Sami KASPI-PEZZOLI Elise L'OLLIVIER Coralie LABIT-BOUVIER Corinne LAFAGE/POCHITALOFF-HUVALE Marina LAGIER Aude (disponibilité) LAGOUANELLE/SIMEONI Marie-Claude LEVY/MOZZICONACCI Annie LOOSVELD Marie MANCINI Julien MARY Charles MASCAUX Céline MAUES DE PAULA André MILLION Matthieu MOTTOLA GHIGO Giovanna NGUYEN PHONG Karine NINOVE Laetitia NOUGAIREDE Antoine OLLIVIER Matthieu OUDIN Claire OVAERT Caroline PAULMYER/LACROIX Odile PERRIN Jeanne RANQUE Stéphane REY Marc ROBERT Philippe SABATIER Renaud SARI-MINODIER Irène SARLON-BARTOLI Gabrielle SAVEANU Alexandru SECQ Véronique TOGA Caroline TOGA Isabelle TROUSSE Delphine TUCHTAN-TORRENTS Lucile VALLI Marc VELY Frédéric VION-DURY Jean ZATTARA/CANNONI Hélène MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES (mono-appartenants) ABU ZAINEH Mohammad BARBACARU/PERLES T. A. BERLAND/BENHAIM Caroline BOUCAULT/GARROUSTE Françoise BOYER Sylvie COLSON Sébastien DEGIOANNI/SALLE Anna DESNUES Benot MARANINCHI Marie MERHEJ/CHAUVEAU Vicky MINVIELLE/DEVICTOR Bénédicte POGGI Marjorie RUEL Jérôme STEINBERG Jean-Guillaume THOLLON Lionel THIRION Sylvie VERNA Emeline MAITRE DE CONFERENCES DES UNIVERSITES DE MEDECINE GENERALE GENTILE Gatan MAITRES DE CONFERENCES ASSOCIES DE MEDECINE GENERALE à MI-TEMPS BARGIER Jacques BONNET Pierre-André CALVET-MONTREDON Céline GUIDA Pierre JANCZEWSKI Aurélie MAITRE DE CONFERENCES ASSOCIE à MI-TEMPS REVIS Joana MAITRE DE CONFERENCES ASSOCIE à TEMPS-PLEIN TOMASINI Pascale 30/11/2017 PROFESSEURS DES UNIVERSITES et MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES - PRATICIENS HOSPITALIERS PROFESSEURS ASSOCIES, MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES mono-appartenants ANATOMIE 4201 ANTHROPOLOGIE 20 CHAMPSAUR Pierre (PU-PH) LE CORROLLER Thomas (PU-PH) PIRRO Nicolas (PU-PH) GUENOUN-MEYSSIGNAC Daphné (MCU-PH) LAGIER Aude (MCU-PH) disponibilité THOLLON Lionel (MCF) (60ème section) ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES 4203 CHARAFE/JAUFFRET Emmanuelle (PU-PH) DANIEL Laurent (PU-PH) FIGARELLA/BRANGER Dominique (PU-PH) GARCIA Stéphane (PU-PH) XERRI Luc (PU-PH) DALES Jean-Philippe (MCU-PH) GIUSIANO COURCAMBECK Sophie (MCU PH) LABIT/BOUVIER Corinne (MCU-PH) MAUES DE PAULA André (MCU-PH) SECQ Véronique (MCU-PH) ANESTHESIOLOGIE ET REANIMATION CHIRURGICALE ; MEDECINE URGENCE 4801 ALBANESE Jacques (PU-PH) BRUDER Nicolas (PU-PH) KERBAUL François (PU-PH) LEONE Marc (PU-PH) MARTIN Claude (PU-PH) Surnombre MICHEL Fabrice (PU-PH) MICHELET Pierre (PU-PH) VELLY Lionel (PU-PH) GUIDON Catherine (MCU-PH) ADALIAN Pascal (PR) DEGIOANNI/SALLE Anna (MCF) VERNA Emeline (MCF) BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE ; HYGIENE HOSPITALIERE 4501 CHARREL Rémi (PU PH) DRANCOURT Michel (PU-PH) FENOLLAR Florence (PU-PH) FOURNIER Pierre-Edouard (PU-PH) NICOLAS DE LAMBALLERIE Xavier (PU-PH) LA SCOLA Bernard (PU-PH) RAOULT Didier (PU-PH) ANGELAKIS Emmanouil (MCU-PH) DUBOURG Grégory (MCU-PH) GOURIET Frédérique (MCU-PH) NOUGAIREDE Antoine (MCU-PH) NINOVE Laetitia (MCU-PH) CHABRIERE Eric (PR) (64ème section) LEVASSEUR Anthony (PR) (64ème section) DESNUES Benoit (MCF) ( 65ème section ) MERHEJ/CHAUVEAU Vicky (MCF) (87ème section) BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE 4401 BARLIER/SETTI Anne (PU-PH) ENJALBERT Alain (PU-PH) Surnombre GABERT Jean (PU-PH) GUIEU Régis (PU-PH) OUAFIK L'Houcine (PU-PH) BUFFAT Christophe (MCU-PH) FROMONOT Julien (MCU-PH) MOTTOLA GHIGO Giovanna (MCU-PH) SAVEANU Alexandru (MCU-PH) ANGLAIS 11 BIOLOGIE CELLULAIRE 4403 BRANDENBURGER Chantal (PRCE) BURKHART Gary (PAST) BIOLOGIE ET MEDECINE DU DEVELOPPEMENT ET DE LA REPRODUCTION ; GYNECOLOGIE MEDICALE 5405 METZLER/GUILLEMAIN Catherine (PU-PH) PERRIN Jeanne (MCU-PH) ROLL Patrice (PU-PH) GASTALDI Marguerite (MCU-PH) KASPI-PEZZOLI Elise (MCU-PH) LEVY-MOZZICONNACCI Annie (MCU-PH) BIOPHYSIQUE ET MEDECINE NUCLEAIRE 4301 CARDIOLOGIE 5102 GUEDJ Eric (PU-PH) GUYE Maxime (PU-PH) MUNDLER Olivier (PU-PH) Surnombre TAIEB David (PU-PH) BELIN Pascal (PR) (69ème section) RANJEVA Jean-Philippe (PR) (69ème section) CAMMILLERI Serge (MCU-PH) VION-DURY Jean (MCU-PH) AVIERINOS Jean-François (PU-PH) BONELLO Laurent (PU PH) BONNET Jean-Louis (PU-PH) CUISSET Thomas (PU-PH) DEHARO Jean-Claude (PU-PH) FRANCESCHI Frédéric (PU-PH) HABIB Gilbert (PU-PH) PAGANELLI Franck (PU-PH) THUNY Franck (PU-PH) BARBACARU/PERLES Téodora Adriana (MCF) (69ème section) CHIRURGIE DIGESTIVE 5202 BIOSTATISTIQUES, INFORMATIQUE MEDICALE ET TECHNOLOGIES DE COMMUNICATION 4604 CLAVERIE Jean-Michel (PU-PH) Surnombre GAUDART Jean (PU-PH) GIORGI Roch (PU-PH) CHAUDET Hervé (MCU-PH) DUFOUR Jean-Charles (MCU-PH) BERDAH Stéphane (PU-PH) HARDWIGSEN Jean (PU-PH) LE TREUT Yves-Patrice (PU-PH) Surnombre SIELEZNEFF Igor (PU-PH) BEYER-BERJOT Laura (MCU-PH) CHIRURGIE GENERALE 5302 30/11/2017 GIUSIANO Bernard (MCU-PH) MANCINI Julien (MCU-PH) ABU ZAINEH Mohammad (MCF) (5ème section) BOYER Sylvie (MCF) (5ème section) CHIRURGIE ORTHOPEDIQUE ET TRAUMATOLOGIQUE 5002 DELPERO Jean-Robert (PU-PH) MOUTARDIER Vincent (PU-PH) SEBAG Frédéric (PU-PH) TURRINI Olivier (PU-PH) BEGE Thierry (MCU-PH) BIRNBAUM David (MCU-PH) ARGENSON Jean-Nol (PU-PH) BLONDEL Benjamin (PU-PH) CURVALE Georges (PU-PH) FLECHER Xavier (PU PH) PARRATTE Sébastien (PU-PH) ROCHWERGER Richard (PU-PH) TROPIANO Patrick (PU-PH) OLLIVIER Matthieu (MCU-PH) CANCEROLOGIE ; RADIOTHERAPIE 4702 BERTUCCI François (PU-PH) CHINOT Olivier (PU-PH) COWEN Didier (PU-PH) DUFFAUD Florence (PU-PH) GONCALVES Anthony PU-PH) HOUVENAEGHEL Gilles (PU-PH) LAMBAUDIE Eric (PU-PH) MARANINCHI Dominique (PU-PH) Surnombre SALAS Sébastien (PU-PH) VIENS Patrice (PU-PH) SABATIER Renaud (MCU-PH) CHIRURGIE THORACIQUE ET CARDIOVASCULAIRE 5103 COLLART Frédéric (PU-PH) D'JOURNO Xavier (PU-PH) DODDOLI Christophe (PU-PH) GARIBOLDI Vlad (PU-PH) MACE Loïc (PU-PH) THOMAS Pascal (PU-PH) FOUILLOUX Virginie (MCU-PH) GRISOLI Dominique (MCU-PH) TROUSSE Delphine (MCU-PH) CHIRURGIE VASCULAIRE ; MEDECINE VASCULAIRE 5104 ALIMI Yves (PU-PH) AMABILE Philippe (PU-PH) BARTOLI Michel (PU-PH) MAGNAN Pierre-Edouard (PU-PH) PIQUET Philippe (PU-PH) SARLON-BARTOLI Gabrielle (MCU PH) HISTOLOGIE, EMBRYOLOGIE ET CYTOGENETIQUE 4202 GRILLO Jean-Marie (PU-PH) Surnombre LEPIDI Hubert (PU-PH) ACHARD Vincent (MCU-PH) disponibilité PAULMYER/LACROIX Odile (MCU-PH) DERMATOLOGIE - VENEREOLOGIE 5003 BERBIS Philippe (PU-PH) GAUDY/MARQUESTE Caroline (PU-PH) GROB Jean-Jacques (PU-PH) RICHARD/LALLEMAND Marie-Aleth (PU-PH) COLSON Sébastien (MCF) DUSI ENDOCRINOLOGIE , DIABETE ET MALADIES METABOLIQUES ; GYNECOLOGIE MEDICALE 5404 BRUE Thierry (PU-PH) CASTINETTI Frédéric (PU-PH) EPIDEMIOLOGIE, ECONOMIE DE LA SANTE ET PREVENTION 4601 AUQUIER Pascal (PU-PH) BOYER Laurent (PU-PH) CHABOT Jean-Michel (PU-PH) GENTILE Stéphanie (PU-PH) SAMBUC Roland (PU-PH) Surnombre THIRION Xavier (PU-PH) CHIRURGIE INFANTILE 5402 GUYS Jean-Michel (PU-PH) JOUVE Jean-Luc (PU-PH) LAUNAY Franck (PU-PH) MERROT Thierry (PU-PH) VIEHWEGER Heide Elke (PU-PH) CHIRURGIE MAXILLO-FACIALE ET STOMATOLOGIE 5503 CHOSSEGROS Cyrille (PU-PH) GUYOT Laurent (PU-PH) FOLETTI Jean-Marc (MCU-PH) CHIRURGIE PLASTIQUE, RECONSTRUCTRICE ET ESTHETIQUE ; BRLOLOGIE 5004 CASANOVA Dominique (PU-PH) LEGRE Régis (PU-PH) HAUTIER/KRAHN Aurélie (MCU-PH) GASTROENTEROLOGIE ; HEPATOLOGIE ; ADDICTOLOGIE 5201 BARTHET Marc (PU-PH) BERNARD Jean-Paul (PU-PH) BOTTA-FRIDLUND Danielle (PU-PH) DAHAN-ALCARAZ Laetitia (PU-PH) GEROLAMI-SANTANDREA René (PU-PH) GRANDVAL Philippe (PU-PH) GRIMAUD Jean-Charles (PU-PH) SEITZ Jean-François (PU-PH) VITTON Véronique (PU-PH) GONZALEZ Jean-Michel ( MCU-PH) GENETIQUE 4704 BEROUD Christophe (PU-PH) KRAHN Martin (PU-PH) LEVY Nicolas (PU-PH) MONCLA Anne (PU-PH) SARLES/PHILIP Nicole (PU-PH) NGYUEN Karine (MCU-PH) TOGA Caroline (MCU-PH) ZATTARA/CANNONI Hélène (MCU-PH) GYNECOLOGIE-OBSTETRIQUE ; GYNECOLOGIE MEDICALE 5403 AGOSTINI Aubert (PU-PH) BOUBLI Léon (PU-PH) BRETELLE Florence (PU-PH) CARCOPINO-TUSOLI Xavier (PU-PH) COURBIERE Blandine (PU-PH) CRAVELLO Ludovic (PU-PH) D'ERCOLE Claude (PU-PH) 30/11/2017 BERBIS Julie (MCU-PH) LAGOUANELLE/SIMEONI Marie-Claude (MCU-PH) MINVIELLE/DEVICTOR Bénédicte (MCF)(06ème section) TANTI-HARDOUIN Nicolas (PRAG) IMMUNOLOGIE 4703 KAPLANSKI Gilles (PU-PH) MEGE Jean-Louis (PU-PH) OLIVE Daniel (PU-PH) VIVIER Eric (PU-PH) FERON François (PR) (69ème section) BOUCRAUT Joseph (MCU-PH) DEGEORGES/VITTE Jolle (MCU-PH) DESPLAT/JEGO Sophie (MCU-PH) ROBERT Philippe (MCU-PH) VELY Frédéric (MCU-PH) HEMATOLOGIE ; TRANSFUSION 4701 BLAISE Didier (PU-PH) COSTELLO Régis (PU-PH) CHIARONI Jacques (PU-PH) GILBERT/ALESSI Marie-Christine (PU-PH) MORANGE Pierre-Emmanuel (PU-PH) VEY Norbert (PU-PH) GELSI/BOYER Véronique (MCU-PH) LAFAGE/POCHITALOFF-HUVALE Marina (MCU-PH) LOOSVELD Marie (MCU-PH) POGGI Marjorie (MCF) (64ème section) BOUCAULT/GARROUSTE Françoise (MCF) 65ème section) MEDECINE LEGALE ET DROIT DE LA SANTE 4603 MALADIES INFECTIEUSES ; MALADIES TROPICALES 4503 BROUQUI Philippe (PU-PH) LAGIER Jean-Christophe (PU-PH) PAROLA Philippe (PU-PH) STEIN Andréas (PU-PH) MILLION Matthieu (MCU-PH) MEDECINE INTERNE ; GERIATRIE ET BIOLOGIE DU VIEILLISSEMENT ; MEDECINE GENERALE ; ADDICTOLOGIE 5301 BONIN/GUILLAUME Sylvie (PU-PH) DISDIER Patrick (PU-PH) DURAND Jean-Marc (PU-PH) FRANCES Yves (PU-PH) Surnombre GRANEL/REY Brigitte (PU-PH) HARLE Jean-Robert (PU-PH) ROSSI Pascal (PU-PH) SCHLEINITZ Nicolas (PU-PH) EBBO Mikael (MCU-PH) LEONETTI Georges (PU-PH) PELISSIER/ALICOT Anne-Laure (PU-PH) PIERCECCHI/MARTI Marie-Dominique (PU-PH) BARTOLI Christophe (MCU-PH) TUCHTAN-TORRENTS Lucile (MCU-PH) BERLAND/BENHAIM Caroline (MCF) (1ère section) MEDECINE PHYSIQUE ET DE READAPTATION 4905 BENSOUSSAN Laurent (PU-PH) VITON Jean-Michel (PU-PH) MEDECINE ET SANTE AU TRAVAIL 4602 LEHUCHER/MICHEL Marie-Pascale (PU-PH) BERGE-LEFRANC Jean-Louis (MCU-PH) SARI/MINODIER Irène (MCU-PH) GENTILE Gatan (MCF Méd. Gén. Temps plein) ADNOT Sébastien (PR associé Méd. Gén. à mi-temps) FILIPPI Simon (PR associé Méd. Gén. à mi-temps) BARGIER Jacques (MCF associé Méd. Gén. À mi-temps) BONNET Pierre-André (MCF associé Méd. Gén à mi-temps) CALVET-MONTREDON Céline (MCF associé Méd. Gén. à temps plein) GUIDA Pierre (MCF associé Méd. Gén. à mi-temps) JANCZEWSKI Aurélie (MCF associé Méd. Gén. À mi-temps) NEPHROLOGIE 5203 BERLAND Yvon (PU-PH) Surnombre BRUNET Philippe (PU-PH) BURTEY Stépahne (PU-PH) DUSSOL Bertrand (PU-PH) JOURDE CHICHE Noémie (PU PH) MOAL Valérie (PU-PH) NUTRITION 4404 NEUROCHIRURGIE 4902 DARMON Patrice (PU-PH) RACCAH Denis (PU-PH) VALERO René (PU-PH) ATLAN Catherine (MCU-PH) disponibilité BELIARD Sophie (MCU-PH) MARANINCHI Marie (MCF) (66ème section) ONCOLOGIE 65 (BIOLOGIE CELLULAIRE) CHABANNON Christian (PR) (66ème section) SOBOL Hagay (PR) (65ème section) OPHTALMOLOGIE 5502 DENIS Danièle (PU-PH) HOFFART Louis (PU-PH) MATONTI Frédéric (PU-PH) RIDINGS Bernard (PU-PH) Surnombre DUFOUR Henry (PU-PH) FUENTES Stéphane (PU-PH) REGIS Jean (PU-PH) ROCHE Pierre-Hugues (PU-PH) SCAVARDA Didier (PU-PH) CARRON Romain (MCU PH) GRAILLON Thomas (MCU PH) NEUROLOGIE 4901 ATTARIAN Sharham (PU PH) AUDOIN Bertrand (PU-PH) AZULAY Jean-Philippe (PU-PH) CECCALDI Mathieu (PU-PH) EUSEBIO Alexandre (PU-PH) FELICIAN Olivier (PU-PH) PELLETIER Jean (PU-PH) PEDOPSYCHIATRIE ; ADDICTOLOGIE 4904 DA FONSECA David (PU-PH) POINSO François (PU-PH) 30/11/2017 OTO-RHINO-LARYNGOLOGIE 5501 DESSI Patrick (PU-PH) FAKHRY Nicolas (PU-PH) GIOVANNI Antoine (PU-PH) LAVIEILLE Jean-Pierre (PU-PH) NICOLLAS Richard (PU-PH) TRIGLIA Jean-Michel (PU-PH) DEVEZE Arnaud (MCU-PH) Disponibilité REVIS Joana (MAST) (Orthophonie) (7ème Section) PARASITOLOGIE ET MYCOLOGIE 4502 DESSEIN Alain (PU-PH) Surnombre CASSAGNE Carole (MCU-PH) L'OLLIVIER Coralie (MCU-PH) MARY Charles (MCU-PH) RANQUE Stéphane (MCU-PH) TOGA Isabelle (MCU-PH) PHARMACOLOGIE FONDAMENTALE - PHARMACOLOGIE CLINIQUE ; ADDICTOLOGIE 4803 BLIN Olivier (PU-PH) FAUGERE Gérard (PU-PH) Surnombre MICALLEF/ROLL Jolle (PU-PH) SIMON Nicolas (PU-PH) BOULAMERY Audrey (MCU-PH) VALLI Marc (MCU-PH) LE COZ Pierre (PR) (17ème section) PHILOSPHIE 17 PEDIATRIE 5401 PHYSIOLOGIE 4402 ANDRE Nicolas (PU-PH) CHAMBOST Hervé (PU-PH) DUBUS Jean-Christophe (PU-PH) GIRAUD/CHABROL Brigitte (PU-PH) MICHEL Gérard (PU-PH) MILH Mathieu (PU-PH) REYNAUD Rachel (PU-PH) SARLES Jacques (PU-PH) TSIMARATOS Michel (PU-PH) COZE Carole (MCU-PH) FABRE Alexandre (MCU-PH) OUDIN Claire (MCU-PH) OVAERT Caroline (MCU-PH) BARTOLOMEI Fabrice (PU-PH) BREGEON Fabienne (PU-PH) MEYER/DUTOUR Anne (PU-PH) TREBUCHON/DA FONSECA Agnès (PU-PH) BARTHELEMY Pierre (MCU-PH) BONINI Francesca (MCU-PH) BOULLU/CIOCCA Sandrine (MCU-PH) DADOUN Frédéric (MCU-PH) (disponibilité) DEL VOLGO/GORI Marie-José (MCU-PH) DELLIAUX Stéphane (MCU-PH) GABORIT Bénédicte (MCU-PH) REY Marc (MCU-PH) PSYCHIATRIE D'ADULTES ; ADDICTOLOGIE 4903 BAILLY Daniel (PU-PH) LANCON Christophe (PU-PH) NAUDIN Jean (PU-PH) LIMERAT/BOUDOURESQUE Françoise (MCF) (40ème section) Retraite 1/5/2018 RUEL Jérôme (MCF) (69ème section) STEINBERG Jean-Guillaume (MCF) (66ème section) THIRION Sylvie (MCF) (66ème section) PSYCHOLOGIE - PSYCHOLOGIE CLINIQUE, PCYCHOLOGIE SOCIALE 16 AGHABABIAN Valérie (PR) RADIOLOGIE ET IMAGERIE MEDICALE 4302 BARTOLI Jean-Michel (PU-PH) CHAGNAUD Christophe (PU-PH) CHAUMOITRE Kathia (PU-PH) GIRARD Nadine (PU-PH) GORINCOUR Guillaume (PU-PH) JACQUIER Alexis (PU-PH) MOULIN Guy (PU-PH) PANUEL Michel (PU-PH) PETIT Philippe (PU-PH) VAROQUAUX Arthur Damien (PU-PH) VIDAL Vincent (PU-PH) PNEUMOLOGIE ; ADDICTOLOGIE 5101 ASTOUL Philippe (PU-PH) BARLESI Fabrice (PU-PH) CHANEZ Pascal (PU-PH) CHARPIN Denis (PU-PH) Surnombre GREILLIER Laurent (PU PH) REYNAUD/GAUBERT Martine (PU-PH) MASCAUX Céline (MCU-PH) TOMASINI Pascale (Maitre de conférences associé des universités) THERAPEUTIQUE ; MEDECINE D'URGENCE ; ADDICTOLOGIE 4804 REANIMATION MEDICALE ; MEDECINE URGENCE 4802 GAINNIER Marc (PU-PH) GERBEAUX Patrick (PU-PH) PAPAZIAN Laurent (PU-PH) ROCH Antoine (PU-PH) HRAIECH Sami (MCU-PH) RHUMATOLOGIE 5001 GUIS Sandrine (PU-PH) LAFFORGUE Pierre (PU-PH) PHAM Thao (PU-PH) ROUDIER Jean (PU-PH) AMBROSI Pierre (PU-PH) BARTOLIN Robert (PU-PH) Surnombre VILLANI Patrick (PU-PH) DAUMAS Aurélie (MCU-PH) UROLOGIE 5204 BASTIDE Cyrille (PU-PH) KARSENTY Gilles (PU-PH) LECHEVALLIER Eric (PU-PH) ROSSI Dominique (PU-PH) 30/11/2017 Remerciements : A Madame le Professeur LEHUCHER-MICHEL, chef de service de Médecine du Travail : Je vous remercie de l'honneur que vous me faites d'avoir accepté de présider le jury de cette thèse. Merci également de tout ce que vous m'avez apporté au long de mon parcours d'interne. Mon stage dans votre service de consultation de pathologies professionnelles a su m'éclairer sur d'autres aspects de la médecine du travail, notamment celui de la recherche, indispensable à notre spécialité, pour lequel vous vous investissez chaque jour. A Monsieur le Professeur SIMON, chef de service du Centre AntiPoison-Toxicovigilance : Je tenais à vous remercier grandement de l'opportunité que vous m'offrez d'être assistant hospitalo-universitaire dans votre service. C'est également un honneur de vous compter parmi les membres de mon jury. Votre regard en tant qu'addictologue sera précieux pour juger ce travail A Madame le Docteur BOULAMERY, MCU-PH au Centre AntiPoison-Toxicovigilance : Merci d'avoir accepté d'être membre du jury de cette thèse. Lors de mon stage et de mes gardes au Centre Antipoison, vous avez toujours su être à l'écoute et bienveillante. Je suis impatient de travailler à nouveau avec vous. A Madame le Docteur LAGATHU, médecin généraliste : Merci pour ton investissement dans cette thèse qui sans toi n'aurait jamais pu voir le jour. C'est grâce à toi seule que nous avons pu recueillir autant de questionnaires. Tu as su apporter de bons conseils pour améliorer ce travail. Merci également d'avoir finalement accepté de siéger dans mon jury. Contrairement à ce que tu penses tu es parfaitement légitime. Même si tu n'as pas un statut universitaire, c'est toi qui a été en première ligne lors du recueil de données, et qui a pu mesurer l'intérêt que le sujet de la thèse suscité auprès de ta patientèle. TABLE DES ABREVIATIONS Par ordre alphabétique CAST : Cannabis abuse screening test CBD : Cannabidiol CNIL : Commission nationale de l'informatique et des libertés DAST -10 : Drug Abuse Screening Test HAS : Haute autorité de santé INPES : Institut national de prévention et d'éducation pour la santé INRS : Institut national de recherche et de sécurité INSEE : Institut national de la statistique et des études économiques MILDECA : Mission interministérielle de lutte contre les drogues et les conduites addictives OFDT : Observatoire français des drogues et des toxicomanies PACA : Provence Alpes Côte d'Azur SFMT : Société française de médecine du travail SPA : Substance psychoactive THC : delta-9-tétrahydrocannabinol Table des matières I- INTRODUCTION . 2 II- MATERIELS ET METHODES . 4 III- RESULTATS . 6 a) Caractéristiques socioprofessionnelles de l'échantillon . 6 b) Caractéristiques socioprofessionnelles des consommateurs de cannabis . 7 c) Consommation de cannabis et travail . 10 d) Perception de la consommation de cannabis en milieu professionnel . 12 IV- DISCUSSION . 13 a) Limites méthodologiques . 13 b) Fréquence de l'usage de cannabis chez les travailleurs et répartition par secteur d'activité . 14 c) Usage régulier et usage problématique . 16 d) Consommation de cannabis au travail . 16 e) Liens entre consommation de cannabis et travail . 16 f) Effets négatifs d'un usage de cannabis sur le travail . 17 g) Cannabis et accidentologie . 18 h) Cannabis et encadrement hiérarchique . 19 i) Perception par les travailleurs de l'usage de cannabis en milieu professionnel . 19 V- CONCLUSION . 20 VI- BIBLIOGRAPHIE . 23 VII- ANNEXE . 30 a) Questionnaire (incluant le CAST) . 30 b) Liste des catégories socioprofessionnelles . 34 c) Résumé en anglais . 35 1 I- INTRODUCTION Le cannabis est la troisième substance psychoactive (SPA) la plus consommée en France, en Europe, et dans le monde, après l'alcool et le tabac. (1) (2) En France, l'usage de cannabis dans la population générale est resté stable entre 2014 et 2016 (11% d'usagers actuels parmi la population adulte âgée de 18 à 64 ans) après une nette augmentation entre 2010 et 2014 (de 8% à 11%). (3) Le milieu professionnel bien que moins exposé, n'échappe pas à ce phénomène, avec une prévalence de l'usage de cannabis évaluée à 9, 0% en population active en 2014, contre 6, 8% en 2010. (4) En 2005 en région Provence Alpes Côte d'Azur (PACA) 10% des 15-64 ans avaient consommé du cannabis dans l'année, soit 1, 4% de plus que la moyenne nationale de l'époque (8, 6%). La seule région o l'on retrouvait un pourcentage supérieur était l'Ile-De- France (12%). (5) Le cannabis est composé principalement de Delta-9-Tétrahydrocannabinol (THC) et de cannabidiol (CBD). Il est le plus souvent consommé par voie inhalée. (6) Les effets de sa consommation ont été largement décrits. Le THC est responsable des effets physiques et psychologiques rapportés par les consommateurs de cannabis, le CBD pouvant moduler ses effets. (7) Ces dernières années la teneur en THC a augmenté entrainant une hausse de ses effets psychodysleptiques. (2) Les employeurs ou leurs représentants sont confrontés à cette problématique de consommation de cannabis dans le milieu professionnel. Selon une enquête de 2014 commandée par la Mission interministérielle de lutte contre les drogues et les conduites addictives (MILDECA), 10% des chefs d'entreprise et des responsables des ressources humaines ont recensé des usagers de cannabis chez leurs salariés et parmi eux, sept sur dix déclaraient au moins un problème lié à cette consommation. Ils citaient principalement une baisse de la productivité et la qualité du travail fourni, suivies de problèmes d'absentéisme et de retards fréquents. (8) Dans une enquête menée en 2009 auprès de 750 médecins du travail, 29 % d'entre eux avaient été sollicités dans les douze derniers mois par des directeurs des ressources humaines pour un problème de cannabis. (9) 2 La consommation de cannabis en milieu professionnel peut être abordée selon deux angles différents : d'une part sur les risques que cela peut engendrer en terme de performances des organisations et de sécurité au travail (ces préoccupations restent importantes, notamment pour certains secteurs d'activité comme les transports o les questions de sécurité se posent de façon aigu), et d'autre part sur les liens éventuels de causalité entre travail et consommation de cannabis. La prévention collective des conduites addictives en milieu du travail est un axe prioritaire du plan gouvernemental 2013-2017 de lutte contre les drogues et les conduites addictives. De manière générale la prévention de l'usage de SPA chez le travailleur nécessite une approche pluridisciplinaire, coordonnée par le médecin traitant. Peu d'études se sont intéressées à la perception des travailleurs sur la consommation de cannabis en milieu professionnel. De plus, elles se focalisaient sur les fumeurs. Or dans la population générale, 67 % des français estiment que les usagers de cannabis sont dangereux pour leur entourage. (10) Par ailleurs la plupart des études françaises évaluant la prévalence et l'impact de la consommation de SPA en milieu professionnel se basent sur des enquêtes par questionnaire en service de médecine du travail o la peur de l'inaptitude et la difficulté de parler des addictions en entreprise peuvent être un frein pour le salarié malgré la garantie de l'anonymat. (11) L'objectif principal était d'étudier la perception des travailleurs fumeurs et non-fumeurs de cannabis consultant en cabinet de médecine générale sur l'impact du cannabis dans leurs milieux professionnels à l'aide d'un auto-questionnaire anonyme. Les objectifs secondaires étaient d'évaluer la fréquence des fumeurs de cannabis parmi les travailleurs reçus en consultation de médecine générale dans l'aire toulonnaise, ainsi que l'influence de leur travail sur leur consommation et de leur consommation sur leur travail. 3 II- MATERIELS ET METHODES Il s'agit d'une enquête descriptive multicentrique par auto-questionnaire anonyme en population active occupée varoise dans le cadre d'une visite en cabinet de médecine générale, entre le 1er aout et le 31 octobre 2017. Les sujets inclus étaient les travailleurs âgés de 18 à 65 ans consultant ou accompagnant un patient en consultation dans 5 cabinets de médecine générale de l'aire toulonnaise. Les critères d'exclusion étaient une absence d'activité professionnelle (depuis au moins un an si arrêt maladie ou congé longue durée), les sujets ne travaillant pas dans le Var et les questionnaires incomplets. Une affiche d'information était placée en salle d'attente. Elle présentait les motivations, les objectifs et les modalités de l'étude en précisant la population cible. L'auto-questionnaire était proposé en fin de consultation systématiquement par le médecin généraliste aux personnes correspondant aux critères d'inclusion de l'enquête, en cherchant leur consentement. En cas de refus le médecin notait les motifs exprimés. Les personnes qui acceptaient de participer à l'étude étaient placées dans un endroit isolé pour remplir le questionnaire puis le mettre dans une enveloppe scellée à glisser dans une boite aux lettres dédiée. Ainsi le médecin consulté n'avait pas accès aux réponses des participants. A noter que le médecin généraliste, remplaçant, était le même dans les 5 cabinets. Le questionnaire, anonyme, était divisé en 4 thèmes principaux : la première partie cherchait à nouveau le consentement du sujet, ainsi que certains critères d'exclusion (absence d'activité professionnelle, travail non principalement dans le Var). La deuxième partie était consacrée aux données socioprofessionnelles. La troisième partie, destinée aux fumeurs de cannabis, s'intéressait à leur consommation et son rapport au travail, en incluant le Cannabis abuse screening test (CAST) qui est un questionnaire validé pour dépister un risque élevé d'usage problématique de cannabis. (12) Enfin la dernière partie questionnait les participants (fumeur ou non) sur leur perception du cannabis en milieu de travail. Le questionnaire est présenté en annexe. 4 Le critère de jugement principal était le taux de préoccupation des travailleurs, fumeurs et non- fumeurs de cannabis, face à la problématique de la consommation de cannabis en milieu professionnel. Sur le plan éthique une déclaration auprès de la Commission nationale de l'informatique et des libertés (CNIL) a été effectuée le 31 juillet 2017. La saisie informatisée des questionnaires ainsi que l'analyse statistique des données ont été réalisées à l'aide du logiciel Epi Info 7. Les données qualitatives ont été comparées avec le test de Chi et les données quantitatives avec le test t de Student. Le seuil de précision était fixé à 5%. 5 III- RESULTATS Au total 334 questionnaires ont été recueillis, dont 10 refus (3, 0%) et 12 questionnaires incomplets donc exclus (3, 6%). Les motifs de refus étaient principalement une absence de consommation de cannabis et un statut professionnel d'indépendant. Au final, 312 questionnaires ont été analysés. a) Caractéristiques socioprofessionnelles de l'échantillon Les caractéristiques démographiques sont exposées dans le tableau 1. Les femmes représentent 60, 6 % de l'effectif, contre 39, 4% pour les hommes. L'âge moyen est de 39, 5 ans, avec une médiane à 39 ans, un âge minimal à 19 ans et maximal à 64 ans. Tableau 1 : Caractéristiques sociodémographiques de l'effectif global N 312 Nombre 123 189 Moyenne 39, 5 Min-max [19-64] Médiane 39 43 79 72 77 41 71 153 60 23 5 Sexe : - Homme - Femme Age : Répartition par tranche d'âge : - 19-25 ans - 25-35 ans - 35-45 ans - 45-55 ans - 55-65 ans Situation familiale : - Célibataire - En couple avec enfant - En couple sans enfant - Divorcé(e) - Veuf(ve) % 39, 4 60, 6 13, 8 25, 3 23, 1 24, 7 13, 1 22, 8 49, 0 19, 2 7, 4 1, 6 6 Le tableau 2 expose les caractéristiques professionnelles de l'effectif global de l'étude. Les participants sont principalement des salariés du secteur privé (59%), la catégorie socio professionnelle la plus représentée est celle des employés (33, 7%). Les secteurs d'activité les plus représentés sont ceux du commerce (13, 5%) et de la santé (8, 0%). Tableau 2 : Caractéristiques professionnelles de l'effectif global Catégorie socioprofessionnelle (N 312) - CSP 1 - CSP 2 - CSP 3 - CSP 4 - CSP 5 - CSP 6 Salarié secteur privé Agent de la Fonction Publique Non salarié Type de contrat : (N 288) - CDI - CDD - - Apprentissage Intérimaire Secteur d'activité : (N 312) - Administration - Arts et spectacles - Commerce - Construction - Enseignement - Restauration - Santé - Sécurité - Transports - Autres Nombre 1 18 39 88 105 62 185 103 24 220 49 14 5 17 4 42 13 19 14 25 12 13 153 % 0, 3 5, 8 12, 5 28, 2 33, 7 19, 9 59, 3 33, 0 7, 7 76, 4 17, 0 4, 9 1, 7555 5, 4 1, 3 13, 5 4, 2 6, 1 4, 5 8, 0 3, 8 4, 2 49, 0 b) Caractéristiques socioprofessionnelles des consommateurs de cannabis Quarante-quatre participants (14, 1%, de l'effectif global) déclaraient avoir fumé du cannabis au cours des douze derniers mois, dont 19 (6, 1% de l'effectif global, 43, 2% des consommateurs de cannabis) de façon quotidienne. Leurs caractéristiques socioprofessionnelles sont exposées 7 dans les tableaux 3 et 4. La moyenne d'âge est de 33 ans, avec une médiane à 31 ans. Elle est significativement plus faible que dans l'effectif global (p Les hommes sont ici majoritaires (54, 5% contre 39, 4% dans l'effectif global, p Les salariés du secteur privé sont plus nombreux à consommer du cannabis par rapport aux agents de la Fonction Publique (18, 4% contre 5, 8%, p Il n'a pas été trouvé pour les autres données socioprofessionnelles de différence significative entre fumeurs et non-fumeurs de cannabis. Tableau 3 : Caractéristiques sociodémographiques des consommateurs de cannabis N 44 Nombre Sexe : - Homme - Femme Age : Répartition par tranche d'âge : - 19-25 ans - 25-35 ans - 35-45 ans - 45-55 ans - 55-65 ans Situation familiale : - Célibataire - En couple avec enfant - En couple sans enfant - Divorcé(e) - Veuf(ve) 24 20 Moyenne 33 Min-max [19-54] Médiane 31 12 16 8 8 0 14 18 11 1 0 % 54, 5 45, 5 27, 3 36, 3 18, 2 18, 2 0 31, 8 41, 0 25, 0 2, 2 0 8 Tableau 4 : Caractéristiques professionnelles des consommateurs de cannabis Catégorie socioprofessionnelle : (N 44) - CSP 1 - CSP 2 - CSP 3 - CSP 4 - CSP 5 - CSP 6 Salarié secteur privé Agent de la Fonction Publique Non salarié Type de contrat : (N 40) - CDI - CDD - - Apprentissage Intérimaire Secteur d'activité : (N 44) - Administration - Arts et spectacles - Commerce - Construction - Enseignement - Restauration - Santé - Sécurité - Transports - Autres Nombre 0 4 4 8 17 11 34 6 4 27 9 2 1 0 2 8 4 1 3 2 1 3 20 % 0 9, 1 9, 1 18, 2 38, 6 25 77, 3 13, 6 9, 1 67, 5 22, 5 5 2, 5 0 4, 5 18, 2 9, 1 2, 3 6, 8 4, 5 2, 3 6, 8 45, 5 Les secteurs d'activité o la fréquence d'usage actuel de cannabis est la plus élevée sont les secteurs des arts et spectacles, de la construction et du transport. A contrario la fréquence est plus basse dans les secteurs de l'administration et de l'enseignement, sans que de différence significative n'ait pu être mise en évidence. (Figure 1) 9 Figure 1 : Fréquence des usagers actuels de cannabis par secteur d'activité (en %) Autres Transports Sécurité 13, 1 23, 1 8, 3 Santé 4, 6 6, 8 5, 3 Restauration Enseignement Construction Commerce Arts et spectacle Administratif 0 30, 8 19 50 0 10 20 30 40 50 60 Usagers actuels (en %) c) Consommation de cannabis et travail Parmi les consommateurs, 12 (27%) déclaraient fumer au travail. 21 (48, 8%) présentaient un risque élevé d'usage problématique selon le questionnaire CAST. Parmi les 12 personnes déclarant fumer au travail, 10 avaient un questionnaire CAST positif (83, 3%). Douze usagers de cannabis (27%) affirmaient que leur consommation était principalement due ou augmentée par leur travail. La raison principalement exprimée était le stress pour 6 d'entre eux. La pression et un ennui au travail étaient également mentionnés respectivement par 3 et 2 personnes. Le manque de temps de repos, des horaires atypiques, des relations conflictuelles avec les clients et une augmentation des responsabilités étaient également évoqués par les participants. Les principaux effets recherchés étaient la relaxation, une aide pour le sommeil et un effet déstressant. (Figure 2) Parmi ces 12 usagers 9 déclaraient ne jamais fumer au travail (soit 75%). 10 Figure 2 : Fréquence des effets recherchés par l'usage de cannabis chez les sujets déclarant un lien entre leur consommation et leur travail (N 12) 12 10 8 6 4 2 0 Treize sujets (29, 5%) estimaient que leur consommation avait des effets négatifs par rapport à leur travail, principalement un manque de motivation et des difficultés de concentration et de mémorisation. (Figure 3) Parmi ces 13 sujets 6 déclaraient ne jamais fumer au travail (soit 46, 2%). Figure 3 : Fréquence des effets négatifs déclarés (N 13) de la consommation de cannabis sur le travail 7 6 5 4 3 2 1 0 11 Huit des consommateurs (18, 2%) signalaient avoir arrêté ou tenté d'arrêter le cannabis au cours des douze derniers mois principalement à cause de leur travail. Aucun ne mentionnait de remarques de leurs collègues ou de sanction au sein de leur entreprise, ainsi que d'accident du travail en lien avec leur consommation. 1 participant déclarait avoir eu au cours des douze derniers mois des remarques d'un supérieur hiérarchique vis-à-vis de sa consommation. Dans le cadre de leur travail, 6 participants (13, 6%) pensaient pouvoir se mettre en danger à cause de leur consommation, et 4 (9, 3%) mettre en danger autrui. d) Perception de la consommation de cannabis en milieu professionnel Parmi les non-fumeurs, 39, 2% des participants déclaraient être préoccupés par le cannabis dans leur milieu professionnel. D'autre part, 32, 3% affirmaient se sentir en danger dans le cadre de leur travail à cause de la consommation de cannabis d'un ou plusieurs de leurs collègues. Rappelons que seul 9, 3% de fumeurs de cannabis pensaient pouvoir mettre en danger autrui dans le cadre de leur travail. A noter que 24, 6% des sujets non-fumeurs désiraient une intervention de leur médecin du travail ou d'un spécialiste du sujet au sein de leur entreprise. Parmi les professionnels des secteurs de la construction, du transport, et de la sécurité impliquant le port d'arme (n 33), 60, 6% se disaient préoccupés, 51, 5 % se sentaient en danger et 33, 3% désiraient une intervention. A noter une différence significative (p sur ces 3 derniers items avec les consommateurs de cannabis qui ne sont que 20, 5% à être préoccupés par le cannabis dans leur milieu professionnel, 16, 7% à penser pouvoir être mis en danger, et 9, 1% à souhaiter une intervention en entreprise sur ce sujet. (Figure 4) Figure 4 : Histogramme comparatif des perceptions de la consommation de cannabis en milieu professionnel entre fumeurs et non-fumeurs (en %). 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Préoccupés Se sentant en danger Désirant une intervention en 12 entreprise Non Fumeurs Fumeurs IV- DISCUSSION a) Limites méthodologiques Le questionnaire volontairement court, avec un temps de passation évalué entre 1 à 5 minutes, explique probablement le faible nombre de questionnaires incomplets, et peut justifier en partie le très bon taux de participation (97%). D'autre part selon le médecin généraliste ayant participé au recueil des données, la majorité des participants semblait très intéressé par le sujet de l'étude. La plupart des items du questionnaire étaient des questions à choix fermé ou des questions à choix multiples (cases à cocher). Cela participe également du faible nombre de questionnaires incomplets, mais peut entrainer des réponses induites. Le questionnaire étant auto-administré, il pouvait y avoir un problème de compréhension des questions. La technique de passation était identique pour les 5 cabinets médicaux. Il n'a pas été mis en place de randomisation car l'inclusion était systématique, ce qui limitait le biais de sélection. L'enquête a été effectuée sur une période restreinte, d'août à octobre 2017, comprenant une période d'un mois de vacances scolaires, dans seulement 5 cabinets de médecine générale de l'aire toulonnaise. Du fait, l'échantillon n'est probablement pas représentatif de l'ensemble des travailleurs consultant en cabinet de médecine générale de l'aire toulonnaise. Lorsque l'on observe les données sociodémographiques de l'échantillon, on remarque une forte prédominance féminine (60, 6% contre 30, 4% d'hommes), ce qui est concordant avec les données bibliographiques sur la répartition par genre de la patientèle des médecins généralistes en France. (13) En 2012, les statistiques de l'Institut national de la statistique et des études économiques (INSEE) chez la population active varoise âgée de 15 à 64 ans montraient une légère prédominance masculine (226 378 actifs hommes contre 210 502 actives). (14) Les salariés représentaient 84, 1% des actifs (contre 93, 3% dans notre étude). Concernant les catégories socioprofessionnelles, on observe une répartition semblable par rapport à notre étude. (Figure 5) 13 Figure 5 : Histogramme comparant la répartition de la population active varoise par CSP entre les statistiques de l'INSEE de 2012 et les données de l'échantillon (en %). 40 35 30 25 20 15 10 5 0 33, 4 33, 7 28, 2 25, 1 19, 9 17, 6 10, 7 12, 2 12, 5 1, 1 0, 3 5, 8 CSP 1 CSP 2 CSP 3 CSP 4 CSP 5 CSP 6 INSEE 2012 Etude Le faible effectif de fumeur de cannabis (N 44) n'a pas permis d'observer de différences significatives sur la plupart des données à cause d'un manque de puissance. Le but en passant par la médecine générale était de limiter le plus possible la sous-déclaration qui est un biais inhérent aux enquêtes o les personnes sont interrogées sur leur consommation de SPA. Selon une étude française publiée en 2008 le médecin généraliste est l'interlocuteur privilégié pour évoquer une consommation de SPA, loin devant le médecin du travail, les collègues ou la famille. (15) Dans une étude française réalisée en 2007 auprès de 1900 marins civils, 14% avaient un test urinaire positif au cannabis, alors que seulement 4% avaient déclaré en avoir consommé. (16) Une autre étude menée en Norvège chez des travailleurs de différents secteurs d'activité montrait un test salivaire positif chez 1, 4% des travailleurs alors que seul 0, 4% avaient déclaré en avoir consommé dans les deux derniers jours. (17) b) Fréquence de l'usage de cannabis chez les travailleurs et répartition par secteur d'activité Dans notre étude, nous trouvions parmi les actifs occupés 14, 1% de consommateurs de cannabis au cours des douze derniers mois, avec une prédominance masculine significative (19, 5% contre 10, 6% de femmes) et un âge moyen significativement plus faible, ce qui est retrouvé dans les différentes études épidémiologiques. (18) Dans la population générale en 2016 la consommation dans l'année s'élevait à 15% chez les hommes et 7% chez les femmes. (3) Une 14 étude menée en 2006 auprès de 1046 salariés dans différents services de santé au travail du Limousin montrait une prévalence de la consommation de cannabis au moment de l'enquête à 3, 5%. (15) Dans une étude réalisée en 2005 dans le département de la Loire à laquelle 43 médecins du travail ont participé, 10, 2% des 1406 salariés inclus déclaraient avoir consommé du cannabis dans l'année. Parmi eux 25, 9% étaient à risque de dépendance selon le Drug Abuse Screening Test (DAST-10). La répartition par contrat de travail montrait une prédominance des intérimaires. (19) Selon l'enquête Mode de vie et travail réalisée en 2006 auprès de 2213 salariés dans des services de santé au travail de la région toulousaine, 9, 4 % des participants ont déclaré consommer du cannabis avant ou après une journée de travail. Le profil des consommateurs était principalement des hommes avec un emploi créatif, des prises de décision, des responsabilités satisfaisantes, sans pression temporelle, ni tension mais avec une insécurité d'emploi. (20) Le Baromètre Santé 2014 évaluait à 9% la prévalence de la consommation de cannabis des actifs occupés au cours des douze derniers mois. Chez les hommes, les catégories socioprofessionnelles (CSP) o les niveaux de consommation étaient les plus élevés étaient les employés (16, 6%), les professions intermédiaires (13, 9%) et les ouvriers (13, 1%). Chez les femmes, les niveaux de consommation étaient bien moindres par rapport aux hommes, mais les plus élevés étaient chez les cadres (6, 7%), les professions intermédiaires (6, 1%) et les artisans, commerçants, chefs d'entreprise (4, 8%), contre 0, 2% chez les ouvrières et 4, 5% chez les employées. Les secteurs d'activé o les niveaux de consommation de cannabis étaient les plus élevés sont ceux des arts et spectacle (16, 6%), de la restauration (12, 9%) et de la construction (13%). Les niveaux les plus faibles étaient trouvés dans les secteurs de l'administration, de l'enseignement, le milieu de la santé humaine et de l'action sociale et les activités de service aux ménages. A noter que les métiers de la construction sont majoritairement masculins, à contrario des secteurs de la restauration et des arts et spectacles o la répartition est équilibrée entre sexes. (4) Les études réalisées spécifiquement dans le secteur de la santé sur le plan national (21) et international (22) (23) montraient des niveaux plus faibles de consommation. Une étude menée en Australie dans le secteur de la construction montrait également des niveaux élevés de consommation. (24) Concernant le secteur du transport, une étude française réalisée dans les années 2000 montrait un niveau de consommation significativement plus élevé par rapport au reste de la population. (25) Une revue de la littérature sur la consommation de SPA chez les conducteurs de camion montrait des niveaux de consommation de cannabis très variables en fonction des études, entre 0, 2 et 29, 9%. Un niveau plus élevé de consommation 15 était souvent associé à de mauvaises conditions de travail (conduite de nuit, long trajet, faible temps de repos). (26) D'autres études s'intéressant aux travailleurs occupant des postes de sûreté ou de sécurité faisaient apparatre des niveaux de consommation supérieurs à la moyenne. (28) (29) Les métiers présentant une pénibilité physique importante, comme la construction et la restauration, semblent associés à des hauts niveaux de consommation. Une étude espagnole réalisée en 2011 montrait des niveaux de consommation plus élevés chez les travailleurs ayant des horaires atypiques. (29) Pour le secteur des arts et spectacles une culture inhérente à ce domaine peut être évoquée. (4) Au final, les niveaux d'usage de cannabis par secteur d'activité trouvés dans notre échantillon sont globalement similaires aux données de la littérature. c) Usage régulier et usage problématique Dans notre échantillon, 6, 1% des travailleurs fumaient du cannabis de manière quotidienne, et 6, 7% présentaient un risque élevé d'usage problématique. En 2014 l'usage régulier concernait 3 % de la population générale. (30) Selon l'Observatoire Français des Drogues et des Toxicomanies (OFDT) parmi les usagers actuels de cannabis, 21 % sont identifiés comme des usagers à risque faible, et 20 % à risque élevé d'abus ou de dépendance. Ramené à l'ensemble de la population, 1, 7 % des 15-64 ans présenteraient ainsi un risque élevé d'usage problématique (2, 7 % des hommes et 0, 8 % des femmes). (10) d) Consommation de cannabis au travail Peu d'études se sont intéressées à la consommation de cannabis durant le temps de travail. La plupart des études abordant les SPA en milieu professionnel se concentrent sur la consommation d'alcool au travail. (4) Parmi les participants à notre étude, 3, 8% déclaraient fumer du cannabis au travail. Une étude américaine réalisée par enquête téléphonique auprès de 2900 travailleurs montrait que 11, 3% des participants déclaraient avoir consommé du cannabis au cours des 12 derniers mois, dont 1, 6% au travail. (31) e) Liens entre consommation de cannabis et travail Dans notre échantillon, plus d'un quart des fumeurs de cannabis établissaient un lien entre leur consommation et leur travail, la plupart évoquant le stress comme raison principale. 16 En 2010, 13% des consommateurs de cannabis déclaraient augmenter leur consommation du fait de problèmes liés à leur travail ou à leur situation professionnelle au cours des douze derniers mois. (32) Dans de nombreuses études le stress, pouvant avoir de nombreux facteurs (charge de travail élevée, manque d'autonomie, emploi précaire, tâches répétitives, ambiance au travail, ) est très souvent cité comme ayant un impact négatif sur le bien-être au travail. (33) Différentes études ont voulu s'intéresser à la relation entre stress au travail et consommation de SPA, avec pour postulat que cette dernière pouvait aider à surmonter le mal-être engendré, ou à prévenir son apparition, avec des résultats variables. (34) Certaines ne mettaient pas en évidence une relation entre stress au travail et consommation de SPA. Cependant ces études ne s'intéressaient pas spécifiquement à la consommation de SPA durant les journées de travail, et prenaient donc en compte l'ensemble des personnes ayant une consommation festive, lors des jours de repos. Une étude américaine réalisée entre 2002 et 2003 et s'intéressant aux sujets ayant une consommation de SPA durant la journée de travail montrait un lien significatif entre consommation de cannabis et deux facteurs de stress : la surcharge de travail et l'insécurité de l'emploi. (35) Une autre étude prospective s'intéressant à la dépendance à une SPA chez les jeunes adultes trouvait un lien significatif entre l'exposition à des facteurs de stress professionnel et la dépendance à une SPA. (36) Comme trouvé dans notre enquête à propos du cannabis, l'ennui est également évoqué dans certaines études comme pouvant influer sur la consommation d'alcool et de tabac. Au Canada, une étude longitudinale ayant inclus 6000 personnes sur 8 ans trouvait une augmentation de la consommation d'alcool lorsque le travail était considéré comme ennuyeux et monotone. (37) En France, le baromètre santé 2005 montrait un lien entre consommation abusive d'alcool et de tabac et insatisfaction au travail. (38) f) Effets négatifs d'un usage de cannabis sur le travail Peu d'études se sont intéressées aux effets recherchés ou aux effets négatifs ressentis par les actifs consommateurs de cannabis. Les données que nous avons trouvées dans notre échantillon sont similaires aux effets décrits par les consommateurs de cannabis en population générale. (7) Dans une étude française de 2006, 8, 1% des actifs usagers actuels de cannabis déclaraient avoir ressenti au travail des problèmes d'attention et/ou de concentration qu'ils mettaient en relation 17 avec leur consommation de cannabis. (15) En Norvège, une étude prospective incluant 2000 participants montrait que la consommation de cannabis chez l'adulte était associée à une diminution de l'engagement au travail. (39) g) Cannabis et accidentologie Dans notre étude aucun participant ne déclarait avoir été victime d'un accident de travail au cours des douze derniers mois en lien avec sa consommation de cannabis. Différentes études ont essayé de quantifier l'impact de la consommation de SPA, principalement l'alcool, sur la survenue d'accidents du travail (hors accident de la route). Les données du Baromètre santé 2010 ne montraient pas de lien significatif entre accident du travail et consommation de SPA. En 2014, une étude cas-témoin américaine ne trouvait pas de différence significative de risque d'accident de travail entre les travailleurs ayant un test urinaire positif au cannabis et un échantillon aléatoire de travailleurs. (40) Lors d'une enquête française menée en 2012 auprès d'employés du secteur de la construction, seuls 2, 7% des participants déclaraient avoir été témoins d'un accident du travail en lien avec une consommation d'alcool ou de drogues illicites. (11) En 2006, une étude américaine basée sur le résultat de tests de dépistage urinaire de drogues illicites montrait que 5, 8% des tests suite à un accident étaient positifs. (31) Cependant, même si l'analyse des tests toxicologiques réalisés après accident peut apporter un certain éclairage, il manque dans la littérature actuelle des études démontrant le lien de causalité et la part attribuable aux SPA. (4) Concernant l'impact d'une consommation de cannabis sur les accidents de la route, des études expérimentales ont montré une diminution des performances de conduite en situation d'urgence. (41) (42) D'autres études ont trouvé que les conducteurs avec un test sanguin positif au THC avaient 3 à 6 fois plus de probabilité d'être impliqués dans un accident. (43) Dans une méta-analyse d'études observationnelles de 1982 à 2015, une intoxication au THC détectée par des analyses de sang, de salive ou d'urine était associée à une augmentation faible à moyenne du risque d'accident de la route. (44) En France, une analyse des défaillances de conduite sous l'influence du cannabis ayant entrainé un accident mortel confirmait les précédents résultats et montrait un risque accru en cas de consommation d'alcool associée. (45) Une revue de la littérature publiée en 2016 montrait une altération de la performance de conduite induite par le cannabis, avec une augmentation du franchissement des lignes et de la distance moyenne par 18 rapport au véhicule précédent. Des altérations aigus et à long terme, dépendantes de la dose, des fonctions cognitives spécifiques et des capacités psychomotrices ont également été notées, s'étendant au-delà de quelques semaines après l'arrêt de la consommation. (46) h) Cannabis et encadrement hiérarchique 1 seul des participants à notre étude mentionnait des remarques d'un supérieur hiérarchique vis- à-vis de sa consommation de cannabis, sans qu'il y ait eu sanction. Or l'encadrement semble avoir un rôle à jouer dans la prévention de la consommation de SPA en milieu professionnel. Une étude réalisée en 2012 montrait que les salariés ayant un encadrement susceptible de repérer et de réagir face à un usage de SPA au travail avaient des niveaux de consommation plus faibles (47) i) Perception par les travailleurs de l'usage de cannabis en milieu professionnel Alors que l'on trouve dans notre enquête que plus d'un tiers des actifs occupés considèrent le cannabis comme un sujet de préoccupation dans leur milieu de travail, peu d'études se sont penchées sur la perception par les travailleurs de la consommation de cannabis en milieu professionnel. La plupart des enquêtes réalisées auprès des travailleurs les questionnant sur les conduites addictives de leurs collègues et leur répercussion (en terme d'absentéisme, de retard, de problèmes relationnels, de baisse de qualité du travail) concernaient l'alcool. (11) (23) Une enquête américaine auprès de 2400 actifs occupés trouvait que 13% d'entre eux déclaraient avoir été au cours des douze derniers mois au contact d'un collègue de travail qui était sous l'influence de drogues illicites. (48) Dans l'étude précédemment citée réalisée en 2006 dans le Limousin, 72, 2% des usagers de cannabis déclaraient se rendre compte que leur consommation avait une répercussion néfaste sur leur activité professionnelle. (15) 19 V- CONCLUSION Comme le montre notre étude, la consommation de cannabis en milieu professionnel est une problématique qui ne concerne pas uniquement les fumeurs de cannabis. De nombreux travailleurs non-fumeurs sont préoccupés par la consommation de cannabis de leurs collègues et se sentent en danger, ce qui peut être entre autres source de risques psycho-sociaux (conflits entre collègues, sentiment d'insécurité, ). Il convient donc de ne pas les oublier lors de la mise en place de mesures de prévention. L'élaboration d'actions d'informations collectives concernant l'ensemble des travailleurs est à promouvoir, en particulier pour ceux occupant des postes dits à risque. Il n'y a pas de définition juridique précise et exhaustive de ces postes dits à risque ou dits de sûreté et de sécurité. On peut considérer que cela concerne les postes nécessitant un haut degré de vigilance, principalement représentés par la conduite ou la manipulation d'engins à moteur, et ceux dont l'exécution peut mettre en danger la sécurité individuelle ou collective, avec une notion de risque d'atteinte grave à l'intégrité physique ou mentale du salarié ou de tiers. (49) En dehors des effets sur l'activité professionnelle présentés précédemment (manque de motivation, baisse de la concentration, ), l'usage du cannabis peut également avoir un impact sur la vie professionnelle du consommateur. Une étude américaine publiée en 2007 montrait que les adultes ayant consommé du cannabis dans l'année risquaient plus de quitter leur emploi, d'avoir des périodes d'inactivité plus prolongées et d'avoir une employabilité plus faible que le reste de la population. (50) Chez les jeunes adultes, une consommation chronique de cannabis est associée à un plus faible niveau d'étude, à de plus faibles revenus et à des emplois moins prestigieux. (51) Il semble nécessaire d'améliorer nos connaissances actuelles sur les liens entre consommation de cannabis et risques psycho-sociaux afin d'optimiser la prise en charge des travailleurs consommateurs de cannabis. Celle-ci doit être pluri disciplinaire, impliquant le médecin du travail, le médecin traitant, le spécialiste, mais également les acteurs de l'entreprise. L'article L4121-1 du Code du Travail précise que l'employeur a une obligation de sécurité à l'égard des salariés, en mettant en place des actions de prévention des risques professionnels, des actions d'information et de formation, ainsi qu'une organisation et des moyens adaptés. Cependant 20 aucune disposition spécifique sur la répression de l'usage de cannabis en milieu professionnel n'est prévue par le Code du Travail, les principales mesures visant à sanctionner l'usage de SPA étant présentées dans le Code Pénal, le Code de la Santé publique ou encore le Code de la Route. L'article L4622-2 du Code du Travail indique que les services de santé au travail ont un rôle de conseiller auprès des employeurs, des travailleurs et leurs représentants sur les dispositions et mesures nécessaires afin de prévenir la consommation d'alcool et de drogue sur le lieu de travail. Le médecin du travail a l'obligation lorsqu'il est saisi par l'employeur de faire des préconisations par écrit (article L4624-9 du Code du Travail). Depuis la décision du Conseil d'Etat du 5 décembre 2016 les employeurs peuvent procéder eux- mêmes à des tests salivaires aléatoires de dépistage de consommation de SPA, sans la présence du médecin du travail. Cependant les modalités du dépistage de SPA doivent être précisées dans le règlement intérieur et ne peut concerner que les postes à risque dont la liste est établie avec les partenaires sociaux de l'entreprise, et avec l'avis du médecin du travail, non obligatoire. Différents textes publiés ces dernières années peuvent éclairer le médecin du travail confronté à une problématique de consommation de cannabis chez un salarié. La Haute Autorité de Santé (HAS) a émis en 2014 un outil d'aide au repérage précoce d'usage problématique de cannabis et d'intervention brève (52). La Société Française de Médecine du travail (SFMT) a établi en 2013 une liste de recommandations pour le dépistage et la gestion du mésusage de SPA susceptibles de générer des troubles du comportement en milieu professionnel. (53) L'académie de médecine a émis en 2017 un rapport sur le sujet des addictions en milieu professionnel qui rappelle le rôle majeur du médecin du travail. Elle recommande la réalisation d'actions collectives d'information et de sensibilisation en milieu professionnel qui doivent s'appuyer sur les résultats d'enquête de prévalence à partir de dépistage anonyme et aléatoire des consommations dans l'entreprise, et également des actions individuelles auprès des personnels occupant un poste mettant en jeu la sécurité individuelle et collective, avec un contrôle réalisé par le médecin du travail garantissant l'absence de consommation de SPA. (54) Il convient de garder à l'esprit pour le médecin du travail de bien distinguer une conduite addictive, et le fait d'être sous l'influence du cannabis au travail, qui n'indique pas forcément une dépendance à la substance, mais qui implique pour le salarié des effets neurosensoriels liés à sa consommation. D'après les résultats de notre enquête le questionnaire CAST pourrait être un outil intéressant pour aider le médecin du travail à dépister une consommation de cannabis au travail, mais cela reste à confirmer par des études plus spécifiques. Les modalités 21 d'intervention devront être alors adaptées au cas par cas, en fonction du poste de travail, de la nature de l'usage de cannabis du salarié, et de l'éventuelle consommation d'autres SPA, toujours à rechercher. (55) Augmenter les synergies entre médecine du travail et médecine générale parait primordial pour améliorer la prévention chez les consommateurs de cannabis. Le médecin traitant est en première ligne dans le dépistage précoce des usages à risques. (56) Des modèles de conduite à tenir dans le cadre de la prise en charge d'une consommation de cannabis en médecine générale ont été proposés afin d'aider les médecins traitants confrontés à ces situations, mais ils ne tiennent pas forcément compte de l'activité professionnelle du salarié. (57) Le sujet du cannabis est d'autant plus d'actualité que la légalisation de sa vente à visée médicale voire à visée récréative est régulièrement évoqué dans la presse généraliste. (58) Aux Etats- Unis, la légalisation récente du cannabis à des fins médicales et récréatives dans de nombreux États a entrané une diminution de la stigmatisation et du risque perçu de consommation de cannabis, ainsi qu'une utilisation et une dépendance plus fréquente au cannabis. (59) Elle a également donné lieu à des recommandations de conduite à tenir tant pour les employeurs que pour les médecins spécialisés dans la santé au travail. (60) Cependant chez les jeunes français de 17 ans, qui seront les travailleurs de demain, la consommation régulière de cannabis diminue (7, 2% en 2017 contre 9, 2% en 2014), les niveaux de consommation régulière chez les jeunes de la région PACA (7, 9%) ne se démarquant pas du reste du pays. (61) 22 VI- BIBLIOGRAPHIE 1. United Nations Office of Drugs and Crime. World Drug Report 2011. United Nations Publication, 2011 : 272p. 2. Observatoire européen des drogues et des toxicomanies. Rapport européen sur les drogues Tendances et évolutions, [en ligne]. 2016. Disponible sur : (consulté le 28. 09. 2018). 3. édition, [en Observatoire Français des Drogues et des Toxicomanies. Drogues, Chiffres clés 7ème : Disponible 2017. ligne]. Juin sur (consulté le 28. 09. 2018). 4. Palle C. 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Benard V, Rolland B, Messaadi N, Petit A, Cottencin O, Karila L. Consommation de cannabis : conduite à tenir en médecine générale. Presse Med. 2015 ; 44 : 707-715. 58. Joahny S. Pourquoi il faut légaliser le cannabis en France, [en ligne]. Le Parisien, . 5 mai 2016. Disponible sur : france-3644381 (consulté le 08/05/2018). 59. Bowles NP, Herzig MX, Shea SA. Recent legalization of cannabis use : effects on sleep, health, and workplace safety. Nat Sci Sleep. 2017 Oct 19 ; 9 : 249-251. 60. Phillips JA, Holland MG, Baldwin DD, Gifford-Meuleveld L, Mueller KL, Perkison B, et al. Marijuana in the Workplace : Guidance for Occupational Health Professionals and Employers : Joint Guidance Statement of the American Association of Occupational Health Nurses and the American College of Occupational and Environmental Medicine. Workplace Health Saf. 2015 Apr ; 63(4) : 139-64. 61. Spilka S, Le Nezet O, Janssen E, Brissot A, Philippon A. Les drogues à 17 ans : analyse régionale Enquête ESCAPAD 2017. Observatoire Français des Drogues et des Toxicomanies, : [en Disponible 2018. ligne]. Sept sur (consulté le 28. 09. 2018). 29 VII- ANNEXE a) Questionnaire (incluant le CAST) Auto-questionnaire anonyme d'évaluation de la consommation de cannabis et de son impact en milieu professionnel dans le département du Var. I- Généralités 1-Souhaitez-vous participer à cette enquête ? : Oui Non Si non pourquoi ? . (Si non voir page 3, fin du questionnaire) 2-Etes-vous actuellement en activité ? : Oui Non (Si non voir page 3, fin du questionnaire) 3-Etes-vous actuellement en arrêt maladie ou en congé (parental, sans solde, ) depuis plus d'un an ? : Oui Non (Si oui voir page 3, fin du questionnaire) 4-Travaillez-vous principalement dans le Var ou votre poste de travail est-il rattaché dans le Var ? : Oui Non (Si non voir page 3, fin du questionnaire) II- Données sociodémographiques 1-Vous êtes : Une femme Un homme 2-Votre âge : ans 3-Votre situation familiale actuelle : Célibataire Veuf/veuve Divorcé(e) En couple avec enfant(s) En couple sans enfant 4-Votre secteur d'activité principale : Salarié Fonction publique Militaire Salarié secteur privé Salarié agricole Chef d'entreprise Commerçant Agriculteur exploitant Intermittent du spectacle Indépendant 30 Autres, précisez : 5-Si vous êtes sous contrat, vous êtes actuellement : Intérimaire Apprenti/stagiaire En CDI ou Titulaire de la Fonction Publique En contrat à durée déterminée 6-Précisez votre activité professionnelle principale actuelle ou l'intitulé de votre poste de travail actuel : III- Evaluation de votre consommation de cannabis 1-Avez-vous fumé du cannabis au cours des douze derniers mois ? : Oui Non Si non passez directement à la partie IV-b 2-Vous fumez : Moins d'une fois par mois 1/mois 1/semaine Entre 2 et 6/semaine Tous les jours Plusieurs fois par jour 3- Au cours des douze derniers mois vous est-il arrivé de fumer du cannabis pendant votre travail ? : Jamais Parfois Souvent Tous les jours Au cours des 12 derniers mois Jamais (1 seul choix par ligne) Avez-vous fumé du cannabis avant midi ? Avez-vous fume du cannabis lorsque vous étiez seul(e) ? Avez-vous eu des problèmes de mémoire quand vous fumiez du cannabis ? Des amis ou des membres de votre famille vous ont-ils dit que vous devriez réduire votre consommation de cannabis ? Avez-vous essayé de réduire ou d'arrêter votre consommation de cannabis sans y arriver ? Avez-vous eu des problèmes à cause de votre consommation de cannabis (dispute, bagarre, accident, ? ) Rarement De temps en temps Assez souvent Très souvent 31 IV- Impact de la consommation de cannabis au travail IV-a : Votre consommation de cannabis et le travail 1-Selon vous votre consommation de cannabis est-elle due principalement à votre travail ? : Oui Non Ou alors est-elle augmentée à cause de votre travail ? : Oui Non Si oui pour quelle(s) raison(s) ? : . . . Quel est ou quels sont alors le ou les effet(s) recherché(s) ? : Plaisir Rire Convivialité Effet déstressant Oublier les problèmes Ivresse Effet antidouleur Euphorie Exaltation Relaxation Bien-être Diminuer l'ennui Aider à dormir Diminuer les inhibitions Rester éveillé Aide pour se concentrer, pour travailler Autres : . 2-Pensez-vous que votre consommation de cannabis a un ou des effet(s) négatif(s) par rapport à votre travail ? : Oui Non Si oui le(s)quel(s) : Difficulté de concentration Baisse de la vigilance Difficulté de prise de décision Manque de motivation Baisse des réflexes Trouble de la mémoire Trouble des perceptions (vue, audition, ) Fatigue Autres : 3-Avez-vous tenté d'arrêter le cannabis par rapport principalement à votre travail au cours des 12 derniers mois ? : Oui Non 4-Un collègue de travail vous at-il déjà fait des remarques sur votre consommation de cannabis au cours des 12 derniers mois ? : Oui Non Sans objet 5-Votre employeur ou votre supérieur hiérarchique vous at-il déjà fait des remarques sur votre consommation de cannabis au cours des 12 derniers mois ? : Oui Non Sans objet 6-Au travail avez-vous déjà été sanctionné directement ou indirectement selon vous (absentéisme, retards, production insuffisante, erreurs, ) par rapport à votre consommation de cannabis au cours des 12 derniers mois ? : Oui Non Sans objet 7-Avez-vous été victime d'un accident du travail lié selon vous à votre consommation de cannabis au cours des 12 derniers mois ? : Oui Non 32 Si non, dans le cadre du travail, pensez-vous pouvoir vous mettre en danger à cause de votre consommation de cannabis ? : Oui Non 8-Dans le cadre du travail, pensez-vous pouvoir mettre en danger vos collègues ou du public à cause de votre consommation de cannabis ? : Oui Non Sans objet IV-b Consommation de cannabis et travail : votre point de vue 1-Pensez-vous que le cannabis soit un sujet de préoccupation dans votre milieu de travail ? : Oui Non 2-Pensez-vous pouvoir être mis en danger dans le cadre de votre travail à cause de la consommation de cannabis d'un ou de plusieurs de vos collègues ? : Oui Non Sans objet 3-Seriez-vous intéressé par une intervention (concernant le cannabis) au sein de votre entreprise (ou lieu de travail) par votre médecin du travail ou un intervenant spécialisé dans ce sujet ? : Oui Non FIN DU QUESTIONNAIRE Une fois rempli, merci de mettre le questionnaire dans une des enveloppes à votre disposition, et de donner le tout au médecin que vous allez voir en consultation. Je vous remercie grandement de votre participation. Celle-ci me sera d'une aide précieuse pour mon travail de thèse, qui j'espère permettra entre autres d'améliorer les connaissances sur la consommation de cannabis au travail. Encore merci, Matthieu PETIT, interne en 9ème année de médecine 33 b) Liste des catégories socioprofessionnelles CSP 1 : Agriculteurs exploitants CSP 2 : Artisans, commerçants et chefs d'entreprise CSP 3 : Cadres et professions intellectuelles supérieures CSP 4 : Professions intermédiaires CSP 5 : Employés CSP 6 : Ouvriers CSP 7 : Retraités CSP 8 : Autres personnes sans activité professionnelle 34 c) Résumé en anglais Title : Cannabis use and its impact in the workplace : survey of workers consulting in general practice in the department of Var France Abstract : Introduction : Cannabis is the third psychoactive substance (PPS) consumed in France. Its use has increased in recent years in France among workers, and questions about the risks that this may cause in terms of performance of organizations and workplace safety, but also on the possible links of causality between work and cannabis use. On the other hand, few studies have focused on the perception of cannabis workers in the workplace. It seemed relevant to study the perception of users and non-users of the impact of cannabis on their workplaces. Materials and methods : This is a descriptive multicenter survey by anonymous self-questionnaires arranged in 5 general practice in the department Var France practices from August to October 2017 including workers aged 18 to 65 consulting in a general practice. Results : The study included 312 participants, with a participation rate of 97%. Nearly one-third of participants reported being concerned about cannabis in their workplaces and feeling at risk, with significantly greater concern among non-smokers. More than a quarter of all cannabis users attributed all or part of their consumption to their work, stress being the most cited reason. The main effects sought were then relaxation, a help for sleep and a de-stressing effect. Cannabis use had negative effects on work for 29. 5% of consumers. The main effects described were lack of motivation and difficulties of concentration and memorization. Conclusion : Cannabis use in the workplace is a problem that does not concern only cannabis smokers, and can be a source of psychosocial risk. The development of collective information actions for all workers is to be promoted, especially for those in safety-sensitive positions. Improved knowledge of the link between cannabis use and work would lead to better individual management of cannabis smokers. Keywords : Cannabis, workplace, impact, perception 35 SERMENT D'HIPPOCRATE Au moment d'être admis(e) à exercer la médecine, je promets et je jure d'être fidèle aux lois de l'honneur et de la probité. Mon premier souci sera de rétablir, de préserver ou de promouvoir la santé dans tous ses éléments, physiques et mentaux, individuels et sociaux. Je respecterai toutes les personnes, leur autonomie et leur volonté, sans aucune discrimination selon leur état ou leurs convictions. J'interviendrai pour les protéger si elles sont affaiblies, vulnérables ou menacées dans leur intégrité ou leur dignité. Même sous la contrainte, je ne ferai pas usage de mes connaissances contre les lois de l'humanité. J'informerai les patients des décisions envisagées, de leurs raisons et de leurs conséquences. Je ne tromperai jamais leur confiance et n'exploiterai pas le pouvoir hérité des circonstances pour forcer les consciences. Je donnerai mes soins à l'indigent et à quiconque me les demandera. Je ne me laisserai pas influencer par la soif du gain ou la recherche de la gloire. Admis(e) dans l'intimité des personnes, je tairai les secrets qui me seront confiés. Reçu(e) à l'intérieur des maisons, je respecterai les secrets des foyers et ma conduite ne servira pas à corrompre les moeurs. Je ferai tout pour soulager les souffrances. Je ne prolongerai pas abusivement les agonies. Je ne provoquerai jamais la mort délibérément. Je préserverai l'indépendance nécessaire à l'accomplissement de ma mission. Je n'entreprendrai rien qui dépasse mes compétences. Je les entretiendrai et les perfectionnerai pour assurer au mieux les services qui me seront demandés. J'apporterai mon aide à mes confrères ainsi qu'à leurs familles dans l'adversité. Que les hommes et mes confrères m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses ; que je sois déshonoré(e) et méprisé(e) si j'y manque. Résumé Introduction Le cannabis est la troisième substance psychoactive (SPA) consommée en France. Son usage augmente ces dernières années en France chez les travailleurs, et questionne sur les risques que cela peut engendrer en terme de performances des organisations et de sécurité au travail, mais également sur les liens éventuels de causalité entre travail et consommation de cannabis. D'autre part peu d'études se sont intéressées à la perception des travailleurs du cannabis en milieu professionnel. Il nous a paru pertinent d'étudier la perception des travailleurs usagers et non usagers de l'impact du cannabis sur leurs milieux de travail. Matériels et méthodes Il s'agit d'une enquête descriptive multicentrique par auto-questionnaires anonymes disposés dans 5 cabinets de médecine générale du Var d'aout à octobre 2017 incluant les travailleurs âgés de 18 à 65 ans consultant en cabinet de médecine générale. Résultats L'étude a inclus 312 participants, avec un taux de participation à 97%. Près d'un tiers des participants déclarait être préoccupé par le cannabis dans leurs milieux de travail et se sentir en danger, avec une inquiétude significativement supérieure chez les non-fumeurs de cannabis. Plus d'un quart des actifs usagers de cannabis attribuaient tout ou partie de leur consommation à leur travail, le stress étant la raison la plus citée. Les principaux effets recherchés étaient alors la relaxation, une aide pour le sommeil et un effet déstressant. L'usage de cannabis avait des effets négatifs sur le travail pour 29, 5% des consommateurs. Les principaux effets décrits étaient le manque de motivation et les difficultés de concentration et de mémorisation. Conclusion La consommation de cannabis en milieu professionnel est une problématique qui ne concerne pas uniquement les fumeurs de cannabis, et qui peut être une source de risque psychosocial. L'élaboration d'actions d'informations collectives concernant l'ensemble des travailleurs est à promouvoir, en particulier pour ceux occupant des postes à risque. Une amélioration des connaissances sur le lien entre consommation de cannabis et travail permettrait une meilleure prise en charge individuelle des travailleurs fumeurs de cannabis. Mot clés Cannabis, travail, impact, perception | HAL | Scientific |
L'application des radio-isotopes à l'étude du métabolisme des mollusques d'eau douce (Gasteropoda pulmonata) | WMT16 | Scientific |
Fréquence des effets indésirables du thalidomide co-administré avec du melphalan et de la prednisone | EMEA_V3 | Medicinal |
Une amélioration survient habituellement en une à deux semaines, et dans certains cas, la disparition complète des symptômes peut prendre jusqu' à 4 semaines voire plus. | EMEA_V3 | Medicinal |
LA CHIRURGIE du rein polykystique | WMT16 | Scientific |
Pharmacocinétique des antibiotiques dans les voies respiratoires | WMT16 | Scientific |
Les séquelles de la poliomyélite ; traitements physiques et quelques aspects de la réadaptation | WMT16 | Scientific |
Asthme professionnel : stratégie diagnostique et prise en charge | WMT16 | Scientific |
Syndrome métabolique et syndrome des ovaires polykystiques | WMT16 | Scientific |
30 La dernière date à laquelle cette notice a été approuvée est : | EMEA_V3 | Medicinal |
Syndrome de Usher : Outils innovants pour une exploration moléculaire exhaustive Thomas Besnard To cite this version : Thomas Besnard. Syndrome de Usher : Outils innovants pour une exploration moléculaire exhaustive. Génétique humaine. Université Montpellier 1, 2012. Français. tel-01991183 HAL Id : tel-01991183 Submitted on 23 Jan 2019 HAL is a multi-disciplinary open access L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d'enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. UNIVERSITÉ MONTPELLIER I U. F. R. de PHARMACIE Année 2012 THÈSE de DOCTORAT pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ MONTPELLIER I Discipline : Génétique Moléculaire Formation doctorale : Biologie Santé École Doctorale : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé Syndrome de Usher : Outils innovants pour une exploration moléculaire exhaustive présentée et soutenue publiquement par Thomas BESNARD Le 5 décembre 2012 à Montpellier, Université Montpellier I, devant la commission d'examen composée de : Pr Mireille Claustres PU-PH, Université de Montpellier I Présidente du jury Pr Patrick Calvas PU-PH, Université Paul Sabatier, Toulouse Rapporteur Dr Jean-Michel Rozet DR, Inserm U781, Paris Rapporteur Dr Sue Malcolm Professeur, University College of London Examinateur Dr Anne-Françoise Roux PH, CHU de Montpellier Directeur de thèse Remerciements Je remercie : Le Professeur Patrick Calvas et le Docteur Jean-Michel Rozet, pour avoir accepté d'être rapporteurs de cette thèse, ainsi que le Professeur Sue Malcolm, pour avoir examiné ce travail. Le Professeur Mireille Claustres, qui m'a accueilli, soutenu et aiguillé lors de chacune des étapes qui ont ponctué mes années au sein de son laboratoire. Je suis pleinement conscient de la chance que j'ai eue de pouvoir travailler chaque jour à l'interface entre le diagnostic moléculaire et la recherche. Merci de m'avoir permis de réaliser cette expérience si bénéfique. Le Dr Anne-Françoise Roux, pour m'avoir offert la possibilité d'effectuer ma thèse sous sa direction. Mes années au sein du groupe neurosensoriel ont été extrêmement enrichissantes. Grâce à ton encadrement, j'ai pu à la fois bénéficier de l'autonomie nécessaire à un travail constructif, et de ton soutien dès que cela s'est avéré nécessaire, c'est à dire, fréquemment. Merci ! L'Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels, pour avoir financé une partie de ce travail de thèse. Je tiens à remercier l'ensemble des membres du laboratoire pour les cinq années que j'ai passées auprès de vous, et particulièrement : Le groupe neurosensoriel au complet. Gema avec qui j'ai partagé de nombreuses heures de travail, à la paillasse, devant les séquenceurs, devant Excel ! Etre ton voisin de bureau a été un vrai plaisir, enrichissant qui plus est. Je te suis aussi très reconnaissant du soutien que tu m'as apporté tout au long de la rédaction de ce manuscrit. Christel et David pour leurs corrections et leur relecture du manuscrit, mais aussi pour tout le reste. Christel, pour m'avoir initié à la joie et aux aléas des transcrits ainsi qu'à toutes les perspectives dont découlent leurs études. Merci pour l'ensemble des techniques moléculaires auxquelles tu m'as formé. David, pour tout ce que tu as pu m'apporter au sein Remerciements du laboratoire, d'avoir bien voulu essayer de répondre à chacun de mes pourquoi , qu'ils aient été biologiques, informatiques, sportifs, politiques, ! Et puis merci pour tous les à- côtés, les promenades de mi-journée à destination du RU, les footings avec ou sans escaliers, en passant par le volley et les discussions Francisiennes. Lise pour m'avoir initié à l'étude des gènes USH2 et Val pour m'avoir formé durant de longues semaines. Votre expérience du secteur diagnostic m'a été extrêmement profitable et a très certainement forgé ma façon de travailler. Susana, pour l'attention particulière que tu m'as apportée et pour ne jamais m'avoir doublé à vélo, pourtant à vive allure ! Vanessa, pour ne jamais avoir râlé sur mon organisation et pour avoir réussi à égayer la Qualité. Enfin, merci à Caroline A et les stagiaires du groupe, particulièrement Alan, Alexandre, Pauline et Claire. Les responsables des autres équipes du laboratoire : Sylvie, Anne G, Albertina, Magali, Marie, Marie-Claire et Mireille. Merci pour votre disponibilité et votre aide offertes dès que cela s'est avéré nécessaire. Corinne B, pour tes pauses et ton café, mais aussi pour tes bises et ta bonne humeur. Victoria, merci d'avoir été ma collègue de bureau durant tes dernières années de thèse. Je te suis très reconnaissant de ton soutien et de ta façon d'offrir ton aide presque avant même qu'elle te soit demandée. Enfin, merci pour la relecture de ce manuscrit. Aliya, pour m'avoir fait une place près de toi durant la rédaction du manuscrit. Corinne T, pour avoir partagé ces années d'études et de labo avec moi et surtout pour ta façon de toujours prendre les choses par leur bon côté. Julie et Caroline R, pour vos conseils avisés. Le bureau des étudiants. Jessica pour avoir partagé les joies et aléas du NGS, Anne B, pour ton naturel et ton dynamisme et Alessandro pour avoir apporté, une touche de résultats sportifs au sein du bureau étudiant. Bonne continuation à tous ! A Naima, pour l'énergie que tu émets chaque matin. A Claude, Karine et Marie C pour leur gentillesse et leur efficacité. Remerciements Je souhaite exprimer mes remerciements à mes amis pour tout ce qu'ils m'apportent : A Guillaume (Morelski), avec qui je me suis initié à la biologie sur les bancs du lycée. A mes collègues de l'IUT : particulièrement Antoine, Anthony, François, Julien et Willy. C'est bon, on est sur nos rails ! Aux montpelliérains : les collègues de l'IUP ; Christophe, pour m'avoir accepté à votre table du RU et pour ne jamais avoir refusé un match de bad ; Seb pour ta capacité à organiser ; Gaspard, pour m'avoir orienté tout au long de ma thèse grâce à tes années d'avance. Un merci tout particulier à Amine, pour m'avoir ouvert les portes de Montpellier. A mes amis kayakistes : l'ensemble de la kermesse yaouank, en particulier à mon Leroux. Paul, je tiens à te remercier pour la curiosité et l'enthousiasme dont tu as fait part vis à vis de mes études, durant toutes ces années. De plus, je tiens à adresser mes plus forts sentiments à l'ensemble de la famille Zoungrana pour qui une partie de mes pensées vont chaque jour. Merci Jean, d'avoir aiguillé mon orientation, me menant à ce travail de thèse. Je tiens à remercier toute ma famille pour m'avoir soutenu durant ces études : Mes grands-parents, pour leur ouverture à mon cursus scolaire. A mes parents que je ne remercierai sans doute jamais assez : Papa, merci de n'y être pour rien mais finalement d'être quand même un peu à l'origine de tout ! Maman, merci de m'avoir fait confiance et de m'avoir permis de suivre mon petit chemin, souvent loin de la maison. A mes sœurs, Marion et Alice, pour être des frangines idéales ! Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à ta famille et tes amis, pour l'accueil et le soutien qu'ils m'ont accordés. Enfin, je te remercie, Marie, pour m'avoir maintenu enraciné. Avant propos Le syndrome de Usher est une maladie génétique associant surdité congénitale et rétinopathie pigmentaire (RP), auxquelles peuvent s'ajouter des troubles vestibulaires. Les différences exprimées entre ces manifestations définissent une classification en 3 types. Jusqu'au milieu des années 1990, le diagnostic reposait essentiellement sur des bases cliniques. Entre 1995 et 2007, neuf gènes responsables du syndrome de Usher ont été identifiés. Il s'agit des gènes MYO7A, USH1C, CDH23, PCDH15, USH1G impliqués dans le syndrome de Usher de type I, USH2A, GPR98, DFNB31 dans le type II, et CLRN1 dans le type III. L'assignation de gènes ouvrant de nouvelles perspectives de diagnostic moléculaire, le laboratoire de génétique moléculaire du Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier a développé des analyses spécifiques permettant de confirmer et d'affiner le diagnostic du syndrome de Usher. A ce jour, plus de 450 familles ont été étudiées dans notre laboratoire. Le diagnostic moléculaire est un paramètre important pour une meilleure prise en charge des patients, motivant par exemple la mise en place d'une implantation cochléaire précoce ou l'apprentissage de moyens de communication adéquats dès le plus jeune âge. Ce type de diagnostic offre aussi la possibilité d'un conseil génétique adapté en cas de projet parental. A ce jour, même si une correction du déficit auditif peut être apportée, il n'existe pas de possibilité d'amélioration significative du phénotype rétinien. Identifier précisément les causes moléculaires grâce aux outils d'analyses génétiques permet d'améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques à l'origine des symptômes du syndrome de Usher. Cette connaissance permettra aussi de susciter de nouvelles pistes thérapeutiques. Résumé Le syndrome de Usher est une maladie génétique associant surdité congénitale et rétinopathie pigmentaire (RP), auxquelles peuvent s'ajouter des troubles vestibulaires. Les différences phénotypiques, distinguées en 3 types cliniques, s'accompagnent d'une hétérogénéité génétique impliquant au moins 10 gènes. Identifier et caractériser les causes moléculaires permet d'améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques à l'origine des symptômes du syndrome de Usher. Dans ce cadre, nous nous sommes inscrits dans une recherche d'exhaustivité des études moléculaires. Dans un premier temps, nous avons ainsi mis en place l'analyse et défini le spectre mutationnel des gènes minoritairement impliqués dans le type II (GPR98 et DFNB31). Nous avons également développé différents outils, notamment pour l'analyse de variants altérant le mécanisme d'épissage ou touchant les régions promotrices des gènes USH2. Ces travaux permettent d'obtenir un taux de détection des altérations conduisant au syndrome de Usher type II de 90%. Ce taux est maintenant similaire à celui observé pour le type I, qui constituait jusqu'ici la référence. Nous avons, dans un second temps, développé le séquençage nouvelle génération (NGS) appliqué à l'exome Usher. L'objectif de cette analyse était de tester la faisabilité et l'efficacité de cette approche, en vue de son éventuelle utilisation en diagnostic moléculaire. La définition des critères de qualité et la mise en place de la priorisation des variants ont été réalisées sur un groupe contrôle. L'étude a ensuite été étendue sur une cohorte de patients de génotype inconnu. Les résultats obtenus montrent qu'une utilisation en diagnostic est possible mais restera dépendante de l'amélioration de la technique du séquençage, de son analyse et des outils bioinformatiques pour interpréter le volume de données ainsi généré. Mots clés : Syndrome de Usher, génétique, hétérogénéité, analyse moléculaire, séquençage nouvelle génération. Abstract Usher syndrome is a genetic disorder combining sensorineural hearing loss (HL) and retinitis pigmentosa (RP). Some patients will also exhibit vestibular areflexia (VA). Clinical and genetic heterogeneity is recognized as the 3 clinical subgroups, defined mainly on the degree of HL and VA, can be caused by mutations in one of the 10 known genes. It is important to use all accessible genetic tools to identify and characterize molecular origin in order to improve the knowledge of the physiopathological mechanisms causing Usher Syndrome. In this context, we have developed an exhaustive approach. In a first step, we have implemented the analysis and established the mutational spectrum of the 2 minor USH2 genes (GPR98 and DFNB31). In addition, we have developed several tools, in particular to study variants susceptible to alter splicing or lying in the promoter regions of the USH2 genes. Thanks to this work, the USH2 mutation detection rate has now been raised to 90%, similar to that of USH1. We have then designed a targeted exome of the Usher genes to be sequenced using the GS Junior system (Roche 454). The aim of the study was to test the feasibility of this new technics for a possible transfer to diagnostic facilities. Quality criteria and variant priorization were set up on a control cohort (previously studied in one of the USH gene). The study has then been extended on a patient cohort. Our results indicate that NGS Usher-exome can be used in molecular diagnostics but improvement of the reliability of the sequencing technology, bioinformatics tools and dedicated databases is essential. Keywords : Usher Syndrome, genetics, heterogeneity, molecular analysis, next generation sequencing. Sommaire Remerciements . 2 ! Avant propos . 5 ! Résumé . 6 ! Abstract . 7 ! Sommaire . 8 ! Liste des figures 10 ! Liste des tableaux 12 ! Liste des annexes 12 ! Liste des abréviations 13 ! URLs des sites Internet cités 14 ! Partie I : Etat des lieux . 15 ! I. ! Généralités : les déficits sensoriels . 16 ! A. ! L'organe de l'audition 16 ! 1. ! Les cellules ciliées 17 ! 2. ! La touffe ciliaire 18 ! 3. ! La mécanotransduction 20 ! B. ! L'organe de la vision 20 ! 1. ! Anatomie de la rétine 20 ! 2. ! Les photorécepteurs 21 ! 3. ! La phototransduction 21 ! II. ! Le syndrome de Usher . 23 ! A. ! Hétérogénéité clinique et génétique 24 ! 1. ! Gènes et protéines USH1 29 ! 2. ! Gènes et protéines USH2 33 ! 3. ! Gène USH3 : CLRN1 36 ! 4. ! Les autres gènes 36 ! 5. ! Gènes Usher et phénotypes non syndromiques 36 ! B. ! Les modèles animaux 37 ! C. ! Le rôle des protéines Usher 39 ! 1. ! Les interactions entre les protéines Usher 39 ! 2. ! Les autres interactions 42 ! 3. ! Localisation des protéines Usher 43 ! 4. ! Protéines Usher dans les cellules ciliées de l'oreille interne 44 ! 5. ! Protéines Usher dans les photorécepteurs 45 ! D. ! Spectre mutationnel des gènes Usher 46 ! 1. ! Hétérogénéité 46 ! 2. ! Effets fondateurs des mutations 47 ! 3. ! Digénisme et oligogénisme 48 ! E. ! Perspectives thérapeutiques 50 ! 1. ! Thérapies symptomatiques 51 ! 2. ! Thérapies causales 52 ! F. ! Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher 54 ! 1. ! Les stratégies disponibles 54 ! 2. ! La stratégie du laboratoire 54 ! 3. ! Evaluation de l'effet pathogène des VSCIs 57 ! Partie II : Implication des gènes USH2 . 63 ! I. ! Introduction . 64 ! A. ! Contexte 64 ! B. ! Particularités techniques 65 ! II. ! Article : non-USH2A mutations in USH2 patients . 66 ! A. ! Résumé de l'article 66 ! B. ! Article 66 ! III. ! Analyses complémentaires. 79 ! A. ! Analyse moléculaire de GPR98 79 ! B. ! Analyse de GPR98 dans une cohorte espagnole 81 ! C. ! Bilan des altérations du gène GPR98 96 ! 1. ! Répartition des altérations 96 ! 2. ! Implication des gènes USH2 98 ! D. ! Mutations localisées en dehors des zones criblées en routine 99 ! 1. ! Mutations ponctuelles introniques profondes 99 ! 2. ! Altérations localisées dans les régions promotrices 100 ! IV. ! Bilan, discussion et perspectives . 104 ! Partie III : Le NGS comme nouvel outil d'analyse des pathologies neurosensorielles . 106 ! I. ! Le séquençage nouvelle génération (NGS) . 107 ! A. ! Historique 107 ! B. ! Définir les besoins 108 ! C. ! Les plateformes disponibles 109 ! D. ! Applications cliniques : exomes ciblés et WES 111 ! II. ! Etude de l'exome ciblé . 113 ! A. ! Choix des régions capturées 113 ! B. ! Capture des séquences 117 ! C. ! Séquençage 454 : protocole 117 ! 1. ! Capture des séquences (phase I) 118 ! 2. ! PCR en émulsion (Phase II) 120 ! 3. ! Run de séquençage (Phase III) 120 ! D. ! Récupération des données 122 ! 1. ! Extraction des données d'intérêt par GSdot 122 ! 2. ! Critères de conservation des variants 124 ! E. ! Cohortes étudiées 126 ! 1. ! Groupe contrôle 126 ! 2. ! Groupe patients Usher 128 ! 3. ! Groupe patients surdités 128 ! III. ! Résultats . 129 ! A. ! Groupe contrôle 129 ! 1. ! Données brutes et critères de qualité 129 ! 2. ! Identification des variants 135 ! B. ! Groupe patients Usher 144 ! C. ! Groupe patients surdités : étude pilote 146 ! IV. ! Discussion et perspectives. 148 ! Conclusion . 154 ! Références . 157 ! Annexes . 173 ! Liste des figures Figure 1 : Organe de l'audition 17 ! Figure 2 : Rangées de cellules ciliées d'un organe de Corti humain 17 ! Figure 3 : Liens des stéréocils 19 ! Figure 4 : Coupe transversale d'un œil et détail des couches rétiniennes 21 ! Figure 5 : Photoexcitation des photorécepteurs 22 ! Figure 6 : Chronologie d'identification des loci et des gènes Usher 26 ! Figure 7 : Répartition clinique des patients mutés dans un des gènes USH1 28 ! Figure 8 : Répartition clinique des patients mutés dans un des gènes USH2 28 ! Figure 9 : Principales isoformes des protéines USH1 31 ! Figure 10 : Pourcentage d'implication des gènes chez les patients USH1 32 ! Figure 11 : Principales isoformes des protéines USH2 et USH3 35 ! Figure 12 : Interactions entre les différentes protéines USH 39 ! Figure 13 : Représentation des interactions entre les protéines USH et harmonine 40 ! Figure 14 : Représentation des interactions entre les protéines USH et whirline 41 ! Figure 15 : Localisation spatiale des protéines Usher dans les cellules cibles 43 ! Figure 16 : Représentation des interactomes Usher situés au niveau des stéréocils des cellules ciliées de l'oreille interne 44 ! Figure 17 : Interactome Usher situé au niveau du cil connecteur des photorécepteurs 45 ! Figure 18 : Implant cochléaire 51 ! Figure 19 : Logigramme de la stratégie de diagnostic moléculaire du laboratoire 55 ! Figure 20 : Diagramme de classification des variants non décrits (VSCIs) 57 ! Figure 21 : Diagramme de Venn des propriétés des acides aminés 60 ! Figure 22 : Représentation schématique d'une étude en minigène 61 ! Figure 23 : Répartition de l'ensemble des variants GPR98 considérés comme pathogènes 97 ! Figure 24 : Pourcentage d'implication des gènes chez les patients USH2 98 ! Figure 25 : Grandes classes de promoteurs chez les mammifères 100 ! Figure 26 : Identification des lots CpG dans GPR98 et USH2A 101 ! Figure 27 : Activité luciférase des régions promotrices de USH2A et GPR98 102 ! Figure 28 : Etude de la boite TATA identifiée dans la région d'intérêt USH2A 103 ! Figure 29 : Tableau récapitulatif des promoteurs USH2A et GPR98 103 ! Figure 30 : Variables du NGS 108 ! Figure 31 : Techniques d'amplification et d'isolement des séquences des 3 séquenceurs dédiés au diagnostic 110 ! Figure 32 : Représentation des sondes de capture pour un exon donné 117 ! Figure 33 : Diagramme du séquençage de l'exome NS. 119 ! Figure 34 : Représentation du pyroséquençage 454 GS 121 ! Figure 35 : Diagrammes générés par GSdot 123 ! Figure 36 : répartition des patients du groupe contrôle 126 ! Figure 37 : Données brutes moyennes par run de séquençage 130 ! Figure 38 : Illustration schématique du pourcentage moyen de séquences par run pour une région d'intérêt 131 ! Figure 39 : Profondeur moyenne de couverture par gène 132 ! Figure 40 : Dispersion des régions en fonction de leur profondeur de couverture à l'issue du séquençage et de leur teneur en GC 133 ! Figure 41 : Dispersion des régions en fonction de leur profondeur de couverture à l'issue du séquençage et du nombre moyen de sondes par nucléotide capturé 134 ! Figure 42 : Ratio profondeur moyenne autosomes / profondeur moyenne Chr X 135 ! Figure 43 : Nombre de variations selon filtration 136 ! Figure 44 : Répartition des variants précédemment identifiés en Sanger 137 ! Figure 45 : Filtre de priorisation des variants issus du groupe contrôle 138 ! Figure 46 : Electrophérogramme de confirmation de la variation c. 166 167insC dans PDZD7 pour U329 par séquençage Sanger 141 ! Figure 47 : Priorisation de l'analyse dans le groupe de patients Usher 144 ! Figure 48 : Filtre de priorisation des variants du groupe patients surdité 146 ! Figure 49 : Intégration du NGS dans la stratégie diagnostique 152 ! Liste des tableaux Tableau 1 : Prévalence du syndrome de Usher 23 ! Tableau 2 : Loci et gènes impliqués dans le syndrome de Usher 26 ! Tableau 3 : Références des gènes Usher 29 ! Tableau 4 : Pathologies non-syndromiques impliquant les gènes Usher 37 ! Tableau 5 : Les modèles animaux 38 ! Tableau 6 : Génotypes des familles rapportées dans l'étude de Zheng et al, 2005 49 ! Tableau 7 : Analyse des gènes USH2 80 ! Tableau 8 : Répartition des variants GPR98 par type et par classe de pathogénicité 81 ! Tableau 9 : Publications des mutations GPR98 96 ! Tableau 10 : Comparatif des principales caractéristiques des séquenceurs nouvelle génération dédiés au diagnostic. Adapté de (Loman et al. , 2012) 109 ! Tableau 11 : Références NCBI des gènes Usher capturés 115 ! Tableau 12 : Références NCBI des autres gènes capturés 116 ! Tableau 13 : Patients du groupe contrôle et gènes analysés 127 ! Tableau 14 : Nombre moyen de séquences obtenues par run 130 ! Tableau 15 : Répartition des régions par gène, en fonction de leur couverture 132 ! Tableau 16 : Patients du groupe contrôle porteurs de 1 ou 2 mutations 139 ! Tableau 17 : Variants d'intérêt du groupe Patients Usher 145 ! Tableau 18 : Variants d'intérêt du groupe surdité 147 ! Liste des annexes Annexe 1 : Répartition des patients recensés dans LOVD USHBases 174 ! Annexe 2 : Usher syndrome type II caused by activation of an USH2A pseudoexon : implications for diagnosis and therapy. Vaché et al. , 2012 176 ! Annexe 3 : Nasal epithelial cells are a reliable source to study splicing variants in Usher syndrome. Vaché et al. , 2010 184 ! Annexe 4 : Représentation graphique des profondeurs de couverture 196 ! Liste des abréviations 7TM : Domaine transmembranaire à 7 hélices aCGH : array comparative genomic hybridization BBS : Syndrome de Bardet-Biedl CCE OHC : Cellules ciliées externes CCI IHC : Cellules ciliées internes DFNA : Surdité non syndromique à transmission autosomique dominante DFNB : Surdité non syndromique à transmission autosomique récessive EAR : Epilepsy associated repeat (c)GMP : (cyclic) Guanosine monophosphate GDP : Guanosine diphosphate GTP : Guanosine triphosphate kb : Kilobase LSF : Langue des signes française PBM : PDZ-binding motif PDZ : Post synaptic density protein (PSD95), Drosophila disc large tumor suppressor (Dlg1), Zonula occludens-1 protein (zo-1) PST-rich region : Proline serine threonine rich region RCPG : Récepteurs couplés aux protéines G RP : Rétinite pigmentaire RPNS : Rétinite pigmentaire non syndromique TBP : Tata Binding Protein TSS : Site d'initiation de la transcription SFF : Standard Flowgram Format USH : Usher USMA : Usher Syndrome Missense Analysis UTR : Région non traduite VSCI : Variation de Signification Clinique Inconnue WES : Whole Exome Sequencing WGS : Whole Genome Sequencing URLs des sites Internet cités 1000Genomes : ConSite : CpG island Searcher : Deafness Variation Database : Ensembl : Exome Variant Server : Galaxy : GSdot : HSF : Jaspar : Mutalyzer : primer3plus : Seq Answers : TFSearch : UniProt : UCSC : USMA : USHBases : Partie I : Etat des lieux Généralités : les déficits sensoriels L'organe de l'audition Le syndrome de Usher a été décrit pour la première fois par l'ophtalmologiste allemand Albrecht Von Graefe en 1858. Le caractère héréditaire sera mise en évidence, en 1914, par l'ophtalmologiste britannique Charles Usher, suite à l'étude de 69 patients atteints de RP (Usher, 1914). A ce jour, plus d'une cinquantaine de syndromes associent des pertes visuelles et auditives. Le syndrome de Usher est le plus commun d'entre eux et est impliqué pour la moitié des patients adultes atteints de surdi-cécité (Saihan et al. , 2009). Ces troubles sensoriels résultent de l'atteinte simultanée des organes auditifs et visuels. Dans certaines formes du syndrome, l'atteinte de l'organe auditif conduit aussi à des troubles vestibulaires. I. Généralités : les déficits sensoriels A. L'organe de l'audition L'oreille des mammifères est organisée en trois compartiments : l'oreille externe, moyenne et interne (Figure 1-a, page 17). L'oreille externe, constituée du pavillon et du conduit auditif externe, capte les ondes sonores, qui font vibrer le tympan et sont transmises à l'oreille interne par l'intermédiaire des trois osselets de l'oreille moyenne (marteau, enclume, étrier). L'oreille interne transforme le message sonore en influx électrique (processus de transduction mécano-électrique) conduit par le nerf auditif jusqu'au cerveau o l'information sonore est décodée. Au sein de la cochlée (Figure 1-b, page 17), se situe l'organe de Corti, qui contient les cellules ciliées responsables de la transformation du signal sonore en signal électrique interprétable par le cerveau. La cochlée humaine permet la perception de fréquences sonores comprises entre 20 Hz et 20 kHz (pour revue El-Amraoui et al. 2010). Chez l'homme, l'atteinte auditive est l'un des troubles neurosensoriels les plus répandus et peut être engendrée par de nombreux facteurs extrinsèques tels que la surexposition au bruit ou la prise de molécules ototoxiques (comme les aminoglycosides), mais peut aussi avoir une origine génétique (pour revue Smith et al. , 2012). On estime d'ailleurs que l'implication génétique est supérieure à 50% pour les troubles auditifs congénitaux ou pré- linguaux. Parmi les causes génétiques, on compte 77% de troubles transmis sur le mode autosomique récessif, 22% sur le mode autosomique dominant et 1% lié à l'X (Petit and Richardson, 2009). Récemment, l'équipe de Lin a étudié en séquençage nouvelle génération, plus de 150 gènes impliqués dans les surdités génétiques englobant les formes syndromiques et non syndromiques (Lin et al. , 2012), démontrant l'importante hétérogénéité génétique de ces affections. Généralités : les déficits sensoriels L'organe de l'audition Figure 1 : Organe de l'audition Adaptée de (Frolenkov et al. , 2004). a- Représentation schématique de l'oreille et de ses trois parties distinctes (externe, moyenne et interne). b- Schéma d'une coupe horizontale de cochlée. c- Schéma de la partie mécanosensible de la cochlée : l'organe de Corti. 1. Les cellules ciliées Les cellules ciliées de l'oreille interne sont présentes chez tous les mammifères. Leur nombre est fixe puisque les mammifères ont perdu la capacité à régénérer ces cellules (pour revue El-Amraoui et al. 2010). Chaque cochlée contient entre 15000 et 30000 cellules ciliées. Elles sont organisées en quatre rangées (Figure 2, page 17) : trois alignements de cellules ciliées externes (CCEOHC : outer hair cells) responsables de l'amplification du signal sonore, et une rangée de cellules ciliées internes (CCIIHC : inner hair cells), actrices de la transduction mécano-électrique du signal sonore et de sa transmission (Figure 1-c, page 17). Il existe un gradient morphologique des CCE entre la base et l'apex de la cochlée. Les cellules ciliées externes à la base, plus petites et rigides sont spécialisées dans l'amplification des fréquences élevées tandis que les cellules à l'apex de la cochlée, plus longues et plus souples, sont spécialisées dans l'analyse des fréquences basses (Legendre et al. , 2009). Sur leur face apicale, chacune de ces cellules (CCE et CCI) possède une touffe ciliaire composée de stéréocils. Figure 2 : Rangées de cellules ciliées d'un organe de Corti humain Microscopie électronique à balayage, après ablation de la membrane tectorielle. CCI : cellules ciliées internes, CCE : cellules ciliées externes. Adaptée de (Schwander et al. , 2010). Généralités : les déficits sensoriels L'organe de l'audition Des cellules ciliées sont aussi présentes dans le vestibule. Leur organisation est très semblable à celle des cellules ciliées de la cochlée. Elles possèdent sur leur face apicale, une touffe ciliaire ayant aussi un rôle de mécano-transduction sensible aux mouvements. Cet organe participe notamment à la fonction de l'équilibre en agissant comme un accéléromètre sensible aux déplacements angulaires (mouvements de rotation de la tête) et linéaires (Purves et al. , 2001). 2. La touffe ciliaire La touffe ciliaire est extrêmement bien organisée et forme un V sur la face apicale des cellules ciliées externes tandis que leur organisation est plus longiligne sur la face apicale des cellules ciliées internes. (Figure 2, page 17). En réalité, les stéréocils la composant sont des microvillosités de la paroi des cellules maintenues par une structure filamenteuse d'actine. Ils sont alignés en rang de taille décroissante, les plus grands faisant partie des rangées dont le nombre de stéréocils est le plus faible. Ils constituent les organites de la mécano-transduction. Seul un véritable cil, le kinocil, est présent sur la face apicale de ces cellules ciliées durant leur maturation (Nayak et al. , 2007). Il est à l'origine de l'organisation très caractéristique de cet assemblage. Nayak décrit le développement de la touffe ciliaire en 3 étapes : lors de la première phase, des microvillosités se forment autour du kinocil. Chez la souris, cette apparition de microvillosités semble se réaliser entre E13 et E16 (13 à 16 jours de vie embryonnaire) (Lefèvre et al. , 2008). Durant cette période, des liens latéraux transitoires sont présents entre les stéréocils mais aussi entre les stéréocils et le kinocil central. Ensuite, entre E17, 5 et E18, 5, le kinocil migre vers la périphérie. Sa position déterminera l'orientation de la touffe ciliaire. Les stéréocils les plus proches du kinocil initient alors leur étape d'élongation, qui sera suivie successivement par l'élongation des autres stéréocils, dans les rangées de plus en plus éloignées. La seconde phase de maturation consiste en l'élargissement des stéréocils avant la dernière phase terminant leur élongation et aboutissant à cette structure en escalier. L'élongation se déroule chez la souris, en post- natal, entre P1 et P5. Au cours de la mise en place de la touffe ciliaire, différents liens apparaissent. Certains d'entre eux sont transitoires car ils ne semblent pas être présents au niveau des stéréocils des touffes ciliaires arrivées à maturation. Sans compter les liens latéraux transitoires présents au moment de l'élongation des microvillosités en stéréocils, les liens inter-stéréocils chez la souris sont au nombre de 4 : le lien apical (en anglais : tip-links), 2 types de liens latéraux (en anglais : top-links et shaft connectors) et le lien d'ancrage (en anglais : ankle links). La Figure 3 (page 19) représente ces différents liens ainsi que leur stade d'apparition et de disparition durant la maturation des stéréocils et du développement Généralités : les déficits sensoriels L'organe de l'audition de la touffe ciliaire. Les tip-links et les top-links sont les seuls liens qui semblent persister au niveau des stéréocils des cellules ciliées matures chez la souris (Goodyear et al. , 2005). Les liens apicaux et les shaft connectors sont les premiers à être mis en place entre les stéréocils. Le composant principal des shaft connectors est la protéine codée par le gène PTPRQ. Celle-ci est requise pour la maturation des stéréocils mais sa fonction précise est actuellement inconnue (Goodyear et al. , 2012). En ce qui concerne le lien apical, il établit une jonction entre un stéréocil et les stéréocils adjacents des rangées inférieures. Il est formé par l'interaction entre la cadhérine 23 (partie haute du lien apical, sur le stéréocil le plus grand) et la protocadhérine 15 sur le stéréocil le plus petit (Kazmierczak et al. , 2007). Ce lien joue un rôle majeur dans la mécano- transduction. Le lien d'ancrage semble se mettre en place plus tardivement. Goodyear a uniquement pu l'identifier en post-natal, par microscopie électronique (Goodyear et al. , 2005). Ce lien est issu de l'interaction entre les protéines codées notamment par les gènes USH2 : usherine, GPR98 et whirline (Michalski et al. , 2007). Les parties extracellulaires de usherine et GPR98 interagissent et permettent le maintien des stéréocils en touffe, à la surface des cellules ciliées. Figure 3 : Liens des stéréocils Adaptée de (Nayak et al. , 2007) et de (Goodyear et al. , 2005). Généralités : les déficits sensoriels L'organe de la vision 3. La mécanotransduction La mécanotransduction permet la transformation du signal sonore en signal électrique. Ce dernier est ensuite interprété par le système nerveux central. Cette transformation s'effectue au niveau des cellules ciliées internes de l'organe de Corti situées au sein de la cochlée. Les stéréocils réagissent aux ondes sonores en s'inclinant en fonction de l'intensité de ces ondes. La sensibilité de ce mécanisme est extrêmement élevée puisque l'inclinaison maximale des stéréocils avoisine une angulation de l'ordre du degré (Corey and Hudspeth, 1983). Elle suffit pourtant à déclencher la mécanotransduction du signal initial. Cette inclinaison des stéréocils entrane alors un étirement du lien apical créant une tension suffisante pour permettre l'ouverture d'un canal encore non défini au niveau du stéréocil le plus petit du lien, sur son extrémité apicale. C'est ce canal qui permet le passage des cations, particulièrement les ions Ca2 , entranant alors une dépolarisation de la cellule ciliée et activant l'émission de neurotransmetteurs au niveau de la base de ces cellules en direction du système nerveux central. Le temps de réaction, de l'ordre de la microseconde, conforte l'hypothèse de l'absence d'intermédiaire enzymatique qui ralentirait considérablement ce temps de réponse (Corey and Hudspeth, 1983). B. L'organe de la vision 1. Anatomie de la rétine Avec la sclérotique et la cornée, la rétine est l'une des trois couches composant le globe oculaire (Figure 4, page 21). La rétine est en quelque sorte le capteur photosensible de l'œil et le foyer de la phototransduction qui convertit une source lumineuse en signal électrique. Elle recouvre environ 75% du globe oculaire. La rétine est composée de 8 sous-couches présentées dans la Figure 4 (page 21). Les sous-couches 6 et 7 forment la couche des photorécepteurs. Cette couche est reliée à la couche granuleuse interne (4) par une zone d'articulation interneuronale, la couche plexiforme externe (5) (Rozet and Kaplan, 2005). La couche granuleuse interne contient 3 types de neurones, les cellules amacrines (D), les cellules horizontales (F) et les cellules bipolaires (E). Enfin la couche granuleuse interne est reliée à la couche des cellules ganglionnaires par une seconde zone d'articulation interneuronale, la couche plexiforme interne (3). La couche ganglionnaire (1 et 2) est composée de cellules ganglionnaires dont le faisceau d'axones forme le nerf optique. La couche 8 représente l'épithélium pigmentaire. Celui-ci couvre la totalité de la surface rétinienne. A sa surface, chaque cellule épithéliale est constituée de microvillosités en Généralités : les déficits sensoriels L'organe de la vision contact avec les photorécepteurs. Dans la rétine périphérique chaque cellule est ainsi en contact avec 22 segments externes de bâtonnets et dans la région maculaire avec 30 segments externes de cônes (Rozet and Kaplan, 2005). Figure 4 : Coupe transversale d'un œil et détail des couches rétiniennes Adaptée de (Livesey and Cepko, 2001). 2. Les photorécepteurs Deux types de photorécepteurs se distinguent : les cônes et les bâtonnets. Ces derniers, nettement plus nombreux (120 millions contre 6, 5 millions de cônes) sont hautement sensibles à l'intensité lumineuse et permettent de ce fait, la vision en condition d'obscurité. Le pigment visuel des bâtonnets est la rhodopsine. Les cônes sont responsables de la vision en couleurs et en condition lumineuse. On distingue alors trois types de pigments visuels appelés photopsines (ou iodopsines), chacun étant excité par des plages de longueurs d'ondes différentes. 3. La phototransduction La phototransduction rassemble l'ensemble des réactions enzymatiques qui se déroulent au niveau du segment externe de chaque photorécepteur (Kennan et al. , 2005). La Figure 5 (page 22) illustre cette cascade au niveau des bâtonnets. En absence de lumière, le GMPc (Guanosine-3'-5'-monophosphate cyclique) est fixé aux canaux à ions Ca2 /Na . Cette fixation se traduit par un influx ionique à l'origine de la dépolarisation des photorécepteurs. Généralités : les déficits sensoriels L'organe de la vision La photoexcitation permet la conversion de la rhodopsine en meta-II-rhodopsine (Rho*) en présence d'une source lumineuse. Rho* catalyse alors l'activation par le GTP de centaines de molécules de transducine (T) qui, à leur tour, activent, ou plutôt désinhibent, en se liant à leur inhibiteur, les sous-unités catalytiques des phosphodiestérases (PDE). Ces enzymes hydrolytiques extrêmement efficaces peuvent alors en quelques dixièmes de secondes éliminer du cytoplasme environnant des centaines de milliers de molécules de GMPc, ce qui stoppe l'influx ionique (Kennan et al. , 2005 ; Yau and Hardie, 2009). Le changement de polarité consécutif est à l'origine du signal électrique qui sera alors acheminé vers le cerveau via le nerf optique. Figure 5 : Photoexcitation des photorécepteurs Adaptée de (Kennan et al. , 2005). Le syndrome de Usher II. Le syndrome de Usher Ce syndrome est hétérogène d'un point de vue clinique et génétique. Alors que les gènes n'étaient pas encore connus, des études épidémiologiques ont permis d'estimer une prévalence moyenne en Europe et en Amérique à 5 cas pour 100 000 naissances (Tableau 1, page 23). En France, la fréquence est de l'ordre de 3 à 5/100 000. Certaines études à l'échelle de villes comme à Birmingham en Angleterre ou Heidelberg et Mannheim en Allemagne établissent une prévalence un peu supérieure avec 6, 2 cas pour 100000 individus. D'autres publications ciblées sur des populations d'Oregon et d'Iowa aux Etats- Unis, ou encore de la péninsule de Macano au Venezuela, font état de prévalences respectivement de 17 et de 76 pour 100000 mais elles ne reflètent probablement pas la prévalence globale. Tableau 1 : Prévalence du syndrome de Usher Prévalence Auteur Année Pays Région / Province 3 / 100 000 (Hallgren, 1959) Suède et Norvège 4, 4 / 100 000 (Boughman et al. , 1983) Etats Unis 3, 6 / 100 000 (Grndahl, 1987) Norvège 3, 2 / 100 000 (Tamayo et al. , 1991) Colombie 5 / 100 000 (Rosenberg et al. , 1997) Danemark 6, 2 / 100 000 (Hope et al. , 1997) Angleterre Birmingham 4, 2 / 100 000 (Espins et al. , 1998) Espagne Valencia 6, 2 / 100 000 (Spandau and Rohrschneider, 2002) Allemagne Heidelberg, Mannheim Péninsule de Macano 76 / 100 000 (Keogh et al. , 2004) Venezuela (pop Latino-Américaine) 1 / 6000 (Kimberling et al. , 2010) Etats-Unis Oregon et Iowa (17 / 100 000) 3 / 100 000 Wittich et al. , 2012 Canada Montréal (20% surdi-cécités) 3, 5 / 100 000 (Vstinsalo et al. , 2012) Finlande Globalement, on admet une prévalence de 1 sur 25000 à 30000, mais ce chiffre pourrait être affiné par des analyses moléculaires sur des recrutements exhaustifs à plus grande échelle. Le syndrome de Usher Hétérogénéité clinique et génétique A. Hétérogénéité clinique et génétique Le syndrome de Usher associe une surdité congénitale et une rétinite pigmentaire, auxquelles peuvent s'adjoindre des troubles vestibulaires. Il existe 3 types cliniques distincts de syndrome de Usher : type I (USH1), type II (USH2) et type III (USH3). Ils se différencient selon le degré de sévérité de l'atteinte auditive, son évolution, ainsi que la présence ou non de troubles vestibulaires. La surdité se définit en fonction de la perte auditive d'après la norme ISO389 (ISO/TC, 1996) : Moyenne : 26-40 dB Modérée : 41-55 dB Modérément sévère : 56-70 dB Sévère : 71-90 dB Profonde : 91-120 dB Il s'agit de surdité neurosensorielle, due à une altération de l'oreille interne (à opposer aux surdités de conduction engendrées par des troubles de l'acheminement de l'onde sonore au niveau de l'oreille externe, du tympan ou de l'oreille moyenne). L'atteinte vestibulaire entrane notamment des troubles de l'équilibre. Ils peuvent être à l'origine d'un retard d'acquisition de la marche. La rétinite pigmentaire (RP) est à l'origine de la déficience visuelle des patients Usher. Que la RP soit syndromique ou non, son évolution est lente chez la plupart des patients et peut se dérouler sur plusieurs décennies. L'âge d'apparition est très variable entre les individus atteints. Les RP se caractérisent par un dépôt de pigment rétinien, initialement à la périphérie de la rétine, ainsi que par une dégénérescence initiale des bâtonnets suivie de celle des cônes (Hamel, 2006). Le terme anglais est rod-cone dystrophy. L'héméralopie (perte de la capacité à voir dans la pénombre) est d'ailleurs très souvent le premier signe clinique diagnostiqué chez les patients atteints de RP. Au fur et à mesure que les dépôts pigmentaires gagnent du terrain vers le centre de la rétine, le champ visuel poursuit son rétrécissement. La rétinite conduit à une perte totale de la vision, mais en général, les patients ont encore la capacité de percevoir la lumière, notamment au niveau périphérique (Hamel, 2006). Le syndrome de Usher Hétérogénéité clinique et génétique Le syndrome de Usher de type I est le plus sévère. Il associe une surdité congénitale profonde et des troubles vestibulaires à une RP progressive pouvant apparatre dès l'enfance (Kimberling et al. , 1991). Il peut persister toutefois une audition résiduelle dans les basses fréquences. Le syndrome de Usher de type II est le plus fréquent. Il se caractérise par une surdité pré- linguale modérée à sévère, des fonctions vestibulaires normales (Abadie et al. , 2011) ainsi qu'une RP variable d'apparition généralement plus tardive (Kimberling et al. , 1991). Enfin, le syndrome de Usher de type III est le plus rare avec une implication de moins de 5% sur l'ensemble des patients Usher. En revanche, il est plus fréquent dans les populations finlandaises et juives Ashkénazes, et représente 40% des cas dans ces populations pour lesquelles un effet fondateur est reconnu. Cet aspect sera détaillé dans le chapitre II. D. 2 (page 47). Une importante hétérogénéité génétique caractérise le syndrome de Usher. La découverte des gènes impliqués est récente puisque le premier locus, USH2A, a été identifié en 1990 et le clonage du gène correspondant publié en 1998 (Figure 6, page 26). Sur les 17 loci initialement candidats (Tableau 2, page 26), l'implication de deux d'entre eux, USH1A et USH2B, a été réfutée. Par ailleurs, aucun gène n'a pu être encore localisé dans les régions USH1E, USH1H et USH1K. Au total, neuf gènes sont reconnus par de nombreux travaux comme étant impliqués dans le syndrome de Usher : MYO7A, USH1C, CDH23, PCDH15 et SANS dans le type I, USH2A, GPR98 et DFNB31 dans le type II, et CLRN dans le type III (Tableau 2, page 26). Récemment, l'implication de trois autres gènes a été suggérée. Ebermann montre un effet possible du gène PDZD7, soit en digénisme avec GPR98 dans une famille, soit en tant que modificateur aggravant le phénotype rétinien dans une fratrie (Ebermann et al. , 2010). Une variation faux-sens à l'état homozygote dans le gène HARS serait à l'origine d'un syndrome de Usher de type IIIB chez deux patients issus de la communauté Amish (Puffenberger et al. , 2012). Enfin, le gène CIB2 a été impliqué dans les surdités non syndromiques (DFNB48) et dans le syndrome de Usher de type IJ. A priori, dans une famille pakistanaise, le syndrome de Usher de type I coségrège avec la variation CIB2 c. C (p. Glu64Asp) à l'état homozygote (Riazuddin et al. , 2012). Le syndrome de Usher Hétérogénéité clinique et génétique Figure 6 : Chronologie d'identification des loci et des gènes Usher Chaque rectangle correspond à l'intervalle entre la description du locus et la publication du gène responsable. Tableau 2 : Loci et gènes impliqués dans le syndrome de Usher Locus Auteur identification Gène Auteur identification USH1A (Chr14q) (Kaplan et al. , 1992) Réfuté (Gerber et al. , 2006) USH1B (Chr11q) (Kimberling et al. , 1992) MYO7A (Weil et al. , 1995) (Verpy et al. , 2000 ; Bitner-Glindzicz USH1C (Chr11p) (Smith et al. , 1992) USH1C et al. , 2000) USH1D (Chr10q) (Gerber et al. , 1996 ; Wayne et al. , 1996) CDH23 (Bolz et al. , 2001 ; Bork et al. , 2001) USH1E (Chr21q) (Chaïb et al. , 1997) (Alagramam et al. , 2001 ; Ahmed et USH1F (Chr10q) (Wayne, 1997. abstract ASHG) PCDH15 al. , 2001) USH1G (Chr17q) (Mustapha et al. , 2002a) SANS (Weil et al. , 2003) USH1H (Chr15q) (Ahmed et al. , 2009) USH1J (Chr15q) (Riazuddin et al. , 2012) CIB2 (Riazuddin et al. , 2012) USH1K (Chr10p) (Jaworek et al. , 2012) USH2A (Chr1q) (Kimberling et al. , 1990) USH2A (Eudy et al. , 1998) USH2B (Chr3p) (Hmani et al. , 1999) Réfuté USH2C (Chr5q) (Pieke-Dahl et al. , 2000) GPR98 (Weston et al. , 2004) USH2D (Chr9q) (Mustapha et al. , 2002b) DFNB31 (Ebermann et al. , 2007b) (Chr10q) PDZD7 (Ebermann et al. , 2010) USH3A (Chr3q) (Sankila et al. , 1995) CLRN1 (Joensuu et al. , 2001) USH3B (Chr5q) (Puffenberger et al. , 2012) HARS (Puffenberger et al. , 2012) Le syndrome de Usher Hétérogénéité clinique et génétique De plus, il existe aussi, au sein d'un même type clinique, une hétérogénéité des symptômes et de leur évolution. Il est donc difficile d'établir des corrélations fines entre les génotypes et les phénotypes. Une étude visant à définir de façon précise l'atteinte auditive a été conduite sur 100 patients USH2 dont les génotypes étaient connus (Abadie et al. , 2011). Nous avons observé une tendance à une perte auditive plus sévère chez les patients mutés dans le gène GPR98 par rapport aux patients mutés dans le gène USH2A. En revanche, cette étude n'a pas établi de corrélation entre les différents types de mutations et la nature de l'atteinte auditive. Il est probable que les facteurs environnementaux soient trop influents pour permettre ce type d'analyse. Malgré cette hétérogénéité, la caractérisation clinique des patients permet, dans la majorité des cas, de les classer dans l'un des trois types cliniques. Et très généralement, lorsque le diagnostic moléculaire peut être établi, le gène impliqué corrèle avec ce type. Dans les rares cas contraires, on parle de patients Usher atypiques. A ce niveau, il est important de noter que sont également considérés comme des patients Usher dits atypiques , des patients dont le génotype est encore inconnu, et dont le phénotype ne permet pas de les classer dans l'un des trois types définis. En utilisant LOVD USHbases, banque de données de type locus spécifique dédiée aux variations génomiques des gènes responsables du syndrome de Usher publiées dans la littérature, nous avons pu étudier le phénotype des patients publiés en fonction de leur génotype pathogène. A ce jour, on observe que 85% des patients mutés dans un des gènes USH1, ont bien un phénotype USH1 (Figure 7, page 28). Parmi les 15% restants, 2/3 des patients présentent une surdité non syndromique (voir chapitre II. A. 5, page 36) et 1/3 ont un phénotype Usher différent de celui attendu (donc, définis comme Usher atypiques ; 2% classés en USH2 ou USH3 et 3% autres). De même, 85% des patients mutés dans un des gènes USH2 ont un phénotype USH2 (Figure 8, page 28). Parmi les autres 15%, 33% n'ont pas de phénotype associé et 47% présentent une forme non syndromique de RP (voir chapitre II. A. 5, page 36). Finalement, 20% des patients mutés dans un gène USH2 ont un phénotype différent de celui attendu (2% associés à un autre phénotype Usher, USH1 ou USH3 et 1% autre). Le syndrome de Usher Hétérogénéité clinique et génétique Figure 7 : Répartition clinique des patients mutés dans un des gènes USH1 Basée sur les informations relatives aux 852 patients mutés dans un des gènes USH1 et répertoriés dans LOVD USHBases. USH1, 2 ou 3 : Phénotype Usher respectivement de type I, II ou III ; DFNA/B : surdité non syndromique de transmission autosomique dominante/récessive ; ARRP : Rétinite pigmentaire non syndromique à transmission autosomique récessive ; Autres : Phénotype différent des précédents ; NC : phénotype non communiqué Figure 8 : Répartition clinique des patients mutés dans un des gènes USH2 Basée sur les informations relatives aux 1000 patients mutés dans un des gènes USH2 et répertoriés dans LOVD USHBases. USH1, 2 ou 3 : Phénotype Usher respectivement de type I, II ou III ; DFNA/B : surdité non syndromique de transmission autosomique dominante/récessive ; ARRP : Rétinite pigmentaire non syndromique à transmission autosomique récessive ; Autres : Phénotype différent des précédents ; NC : phénotype non communiqué Ces chiffres, représentant une méta-analyse de la littérature internationale sur le syndrome de Usher, indiquent clairement que la classification clinique en trois types reste pertinente en 2012. Hétérogénéité clinique et génétique Gènes et protéines USH1 1. Gènes et protéines USH1 A ce jour, 6 gènes ont été identifiés comme responsables du syndrome de Usher de type I (Tableau 3, page 29). Ils codent pour des protéines dont les fonctions sont hétérogènes (Figure 9, page 31) Le sixième gène, CIB2, a été caractérisé par Riazuddin et al. 2012 durant la rédaction de ce manuscrit. De ce fait, il n'a pas été étudié durant ce travail de thèse. Tableau 3 : Références des gènes Usher Symbole HGNC Gene Phenotype Entrez NCBI Locus Ensembl Gene ID HGNC ID MIM MIM ID RefSeqGene USH1 11q13 MYO7A 7606 *276903 #276900 4647 NG 009086. 1 ENSG00000137474 11p14 USH1C 12597 *605242 #276904 10083 NG 011883. 1 ENSG00000006611 10q22 CDH23 13733 *605516 #601067 64072 NG 008835. 1 ENSG00000107736 10q21 PCDH15 14674 *605514 #602083 65217 NG 009191. 1 ENSG00000150275 17q25 USH1G 16356 *607696 #606943 124590 NG 007882. 1 ENSG00000182040 15q24 CIB2 10518 *605564 - 24579 - ENSG00000136425 USH2 1q41 USH2A 12601 *608400 #276901 7399 NG 009497. 1 ENSG00000042781 5q13 GPR98 17416 *602851 #605472 84059 NG 007083. 1 ENSG00000164199 9q32 DFNB31 16361 *607928 #611383 25861 NG 016700. 1 ENSG00000095397 USH3 3q25 CLRN1 12605 *606397 #276902 7401 NG 009168. 1 ENSG00000163646 HGNC : Human Genome Organisation (HUGO) Gene Nomenclature Committee ; HGNC ID : identifiant HGNC ; MIM : Mendelian Inheritance in Man ; Entrez ID : numéro d'identification du gène au NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) ; NCBI RefSeqGene : Numero d'accession de la séquence du gène au NCBI ; Ensembl Gene ID : Identifiant dans la base de données Ensembl. a. MYO7A C'est en 1992 qu'a pu être identifié le locus USH1B sur le chromosome 11q (Kimberling et al. , 1992). Le gène MYO7A fut mis en évidence en 1995 (Weil et al. , 1995). Il code pour la myosine VIIa (Figure 9-A, page 31). Considérée comme une myosine non-conventionnelle, myo7a possède les caractéristiques des protéines à tête motrice. L'isoforme majeure contient 2215 acides aminés (NP 000251. 3 ; ENSP00000386331) codée par la transcription de 49 exons (NM 000260. 3 ; ENST00000409709). La large extrémité C-terminale jouerait un rôle dans le transport de différentes protéines notamment au sein des stéréocils, de leur partie basale vers leur apex. Hétérogénéité clinique et génétique Gènes et protéines USH1 b. USH1C En 1992, Smith cartographie un autre locus, USH1C, sur le bras court du chromosome 11 (Smith et al. , 1992) dans une famille acadienne (région francophone nord-américaine entourant le Nouveau-Brunswick). En 2000, deux équipes identifient le gène USH1C comme responsable du syndrome de Usher de type I dans plusieurs familles (Bitner-Glindzicz et al. , 2000 ; Verpy et al. , 2000). Verpy et al. , montrèrent également que ce gène peut être impliqué dans les surdités non syndromiques à transmission autosomique récessive (Verpy et al. , 2000). USH1C code pour l'harmonine (Figure 9-B, page 31), une protéine d'échafaudage ( scaffold protein ) dont les nombreuses isoformes peuvent être classées en 3 sous-types (a, b et c). Le transcrit codant pour la plus grande isoforme (NP 710142. 1 ; ENSP00000005226) est issu de 27 exons (NM 153676. 3 ; ENST00000005226). c. CDH23 Le locus USH1D fut identifié en 1996 (Gerber et al. , 1996 ; Wayne et al. , 1996) sur le bras long du chromosome 10. En 2001, Bolz et Bork identifièrent indépendamment le gène codant pour la cadhérine 23 (Figure 9-C, page 31) en étudiant son isoforme de 3354 acides aminés (Bolz et al. 2001 ; Bork et al. 2001). Il occupe une région chromosomique d'environ 420 Kb. L'isoforme A (la plus grande) de la cadhérine 23 (NP 071407. 4 ; ENSP00000224721) est le produit d'un transcrit de 69 exons (NM 022124. 5 ; ENST00000224721) d. PCDH15 En 1997, le locus USH1F situé sur le bras long du chromosome 10q fit l'objet d'une communication à l'ASHG (Wayne, 1997. abstract ASHG) et le gène PCDH15 fut identifié en 2001 par 2 équipes en parallèle (Alagramam et al. 2001 ; Ahmed et al. 2001). Le gène s'étend sur près de 1 Mb en 10q21. De nombreux transcrits ont été observés pour ce gène (Ahmed et al. , 2008), regroupés en trois classes principales dénommées CD-1, 2 ou 3. Ces classes diffèrent essentiellement par la partie 3' des transcrits, et notamment par la nature de l'exon final qui encode entre 184 et 500 acides aminés. Le transcrit historiquement le plus étudié (NM 033056. 3 ; ENST00000320301) est composé de 33 exons codant une protéine de 1955 acides aminés (NP 001136236. 1 ; ENSP00000354950), la protocadhérine 15 (Figure 9-D, page 31) Hétérogénéité clinique et génétique Gènes et protéines USH1 e. USH1G Le locus USH1G fut identifié en 2002 (Mustapha et al. , 2002a), puis le gène SANS, d'environ 7 kb fut décrit l'année suivante (Weil et al. , 2003, 200). Seul un transcrit, issu de 3 exons et composé de 3561 nucléotides est actuellement connu (NM 173477. 2 ; ENST00000319642). Il code pour une protéine de 461 acides aminés (NP 775748. 2. ; ENSP00000320076), SANS (Figure 9-E, page 31). Figure 9 : Principales isoformes des protéines USH1 Adaptée de (Kremer et al. , 2006). A- Myosine VIIa se compose d'un domaine moteur de myosine (myosin motorhead), de 5 motifs de fixation de calmoduline (IQ motifs, pour isoleucine (I), glutamine (Q), 2 répétitions d'un domaine Myosin Tail Homology 4 (MyTH4) suivi d'un domaine FERM séparées par un domaine Src homology 3 (SH3). B- Les différentes isoformes d'harmonine sont composées de 2 ou 3 domaines PDZ (post synaptic density protein (PSD95), Drosophila disc large tumor suppressor (Dlg1), and zonula occludens-1 protein (zo-1), d'1 ou 2 domaines coiled-coil (CC) et potentiellement d'un motif PBM (PDZ binding motif) et/ou d'une région riche en proline, sérine et thréonine (PST). C- Cadhérine 23 est composée d'un motif PBM et potentiellement, d'un domaine transmembranaire (TM) et de répétitions de domaines extracellulaires de cadhérine (jusqu'à 27 domaines) permettant la fixation des ions Ca2 . D- Protocadhérine 15 présente une organisation similaire à cadhérine 23 avec jusqu'à 11 domaines EC. E- Sans est constituée de 2 domaines ankyrines (ANK), d'une région centrale (CENT), d'un motif stérile alpha (SAM) ainsi que d'un motif PBM. Hétérogénéité clinique et génétique Gènes et protéines USH1 f. Implication des gènes USH1 Récemment, deux études sur de grandes cohortes de patients USH1 ont été réalisées. Pour la première, les patients sont majoritairement français (Roux et al. , 2011) tandis que la seconde étude recense en grande majorité des patients USH du Royaume-Uni (Le Quesne Stabej et al. , 2012). L'implication des différents gènes USH1 dans ces études est représentée par la Figure 10 (page 32). Pour chaque gène, la variation d'implication n'excède pas 13 points entre les deux études. 70 63, 3 61, 0 Pourcentage d'implication 40 Roux et al. 2011 30 Le Quesne et al. 2012 17, 1 12, 2 12, 2 9, 7 10 4, 5 0 0, 0 MYO7A CDH23 PCDH15 USH1C USH1G Figure 10 : Pourcentage d'implication des gènes chez les patients USH1 Cette analyse prend uniquement en compte les patients pour lesquels un génotype pathogène a été identifié. Comme l'avait mis en évidence une précédente étude (Weil et al. , 1995), MYO7A est le gène le plus impliqué dans le syndrome de Usher de type I et représente entre plus de 60% des cas. La Figure 10 montre une nette différence en ce qui concerne l'implication du gène USH1C, beaucoup plus présent au Royaume-Uni. Cette différence peut s'expliquer par la présence d'une mutation fréquente dans cette population (c. 496 A), jamais retrouvée jusqu'ici, en France (données issues de LOVD USHBases). Les deux populations diffèrent beaucoup moins concernant les gènes CDH23 et PCDH15. Enfin, aucun patient porteur de mutations dans USH1G n'a été décrit au cours de ces deux études. Cependant, notre équipe a identifié depuis, des mutations dans ce gène chez deux patients (données non publiées). Hétérogénéité clinique et génétique Gènes et protéines USH2 2. Gènes et protéines USH2 Trois gènes ont été identifiés comme responsables du syndrome de Usher de type II (Tableau 3, page 29). Les protéines codées par ces gènes sont représentées Figure 11 (page 35). a. USH2A En 1990, suite à l'étude de marqueurs ADN chez huit familles atteintes d'un syndrome de Usher de type II, Kimberling a cartographié le locus USH2A sur le chromosome 1q (Kimberling et al. , 1990). Il affina la position en 1995 en le situant en 1q41 (Kimberling et al. , 1995). En 1998, une partie du gène fut cloné. Elle représentait 21 exons (NM 007123. 5 ; ENST00000366942) codant pour la petite isoforme usherine (NP 009054. 5 ; ENSP00000355909) et couvrant 250 kb (Eudy et al. , 1998). En criblant ces exons, seulement 63% des mutations attendues dans USH2A étaient identifiées et il fallut attendre 2004 et les travaux de van Wijk pour que 51 nouveaux exons soient identifiés (van Wijk et al. , 2004). Le gène USH2A couvre une région chromosomique d'environ 800 kb. Il est composé de 72 exons (NM 206933. 2 ; ENST00000307340) codant pour une protéine de 5202 acides aminés qui comporte notamment une large partie extracellulaire (NP 775748. 2 ; ENSP00000320076). D'après UniProt ( usherine comporte 3 parties : une partie cytoplasmique possédant en son extrémité C-terminale un motif PDZ-binding (PBM), un domaine transmembranaire et une imposante partie extracellulaire (Figure 11-A, page 35). Celle-ci possède un domaine Laminin N-terminal, 10 domaines Laminin EGF-like, 2 domaines Laminin G-like ainsi que 35 domaines Fibronectine type-III (van Wijk et al. , 2004). b. GPR98 En 2000, soit 10 ans après l'identification du locus USH2A, Pieke-Dahl et al. ont mis en évidence un nouveau locus, USH2C, situé sur le chromosome 5q entre 5q14. 3 et 5q21. 1 (Pieke-Dahl et al. , 2000). Un gène se distingua rapidement comme probablement responsable du syndrome de Usher, de par son expression chez le fœtus humain, au niveau de la cochlée et de la rétine (Weston et al. , 2004) : il s'agissait du gène GPR98, codant the very large G-coupled receptor ou VLGR1, désormais connue sous le nom de G protein- coupled receptor 98 (GPR98) (Figure 11-B, page 35). Comme les autres protéines transmembranaires, elle est composée de 3 régions distinctes. C'est sa structure en sept hélices hydrophobes transmembranaires (7TM) séparant son domaine cytoplasmique de son large domaine extracellulaire, qui est à l'origine de sa classification dans la grande famille Hétérogénéité clinique et génétique Gènes et protéines USH2 des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Ce gène s'étend sur plus de 600 kb, se compose de 90 exons pour l'isoforme la plus longue, GPR98 (NM 032119. 3 ; ENST00000405460), et code pour l'une des plus grandes protéines décrites (6306 acides aminés ; NP 115495. 3 ; ENSP00000384582). Trois isoformes (initialement VLGR1a, b et c) générées par épissage alternatif ont été mises en évidence (McMillan et al. , 2002). La partie cytoplasmique des isoformes GPR98 A et B (Figure 11-B, page 35) possède en C-terminal et au même titre que usherine, un motif PBM, tandis que sa large partie extracellulaire contient un domaine GPS (G-proteolytic site) proche du domaine 7TM, 35 domaines Calx- (homologues aux domaines spécifiques des protéines régulant les échanges NA /Ca2 ), ainsi que 7 domaines EAR (epilepsy associated repeat) (Weston et al. , 2004). Ces derniers doivent leur nom à l'association initiale d'une partie de ce gène (à l'époque appelé MASS1) à une pathologie autosomique dominante dont les symptômes sont des crises convulsives hyperthermiques. Mais en 2006, cette association fut rejetée par les travaux de Deprez associant ces troubles au locus FEB4 situé entre 5q14. 3 et 5q23. 1 (Deprez et al. , 2006). Aujourd'hui encore GPR98 fait partie de la famille des récepteurs couplés au protéines G, dits orphelins car le ligand reste inconnu et la fonction n'est pas véritablement établie (Foord et al. , 2005). Toutefois, elle semble être impliquée dans le maintien de l'intégrité de la touffe ciliaire des cellules ciliées de l'oreille interne (McGee et al. , 2006 ; Michalski et al. , 2007), le développement du système nerveux central et la fonction des photorécepteurs (McMillan et al. , 2002 ; Schwartz et al. , 2005). c. DFNB31 Le locus DNFB31 a été mis en évidence en 2002 dans la région 9q32-9q34, chez une famille atteinte de surdité congénitale (Mustapha et al. , 2002b). Bien que les premières mutations aient été identifiées chez des patients souffrant de surdité non syndromique (Mburu et al. , 2003), son implication dans le syndrome de Usher de type II fut démontrée en 2007 (Ebermann et al. , 2007b). D'après Uniprot, l'isoforme la plus longue (Figure 11-C, page 35) composée de 907 acides aminés (NP 056219. 3 ; ENSP00000354623) est issue d'un transcrit composé de 12 exons (NM 015404. 3 ; ENST00000362057). Trois domaines PDZ sont présents et font de la whirline une protéine d'échafaudage. Hétérogénéité clinique et génétique Gènes et protéines USH2 Figure 11 : Principales isoformes des protéines USH2 et USH3 Adaptée de (Kremer et al. , 2006). A- L'isoforme A d'usherine contient un domaine thrombospondin/pentaxin/laminin G-like (LamG/TspN/PTX), un domain Laminin-N-terminal (LamNT), 10 domaines laminine EGF-like (EGF Lam) et 4 domaines fibronectine 3 (FN3) tandis que l'isoforme B possède en plus, 2 domaines laminine G (LamG), 23 domaines FN3, un domaine transmembranaire (TM) ainsi qu'un motif PDZ binding motif (PBM). B- L'isoforme la plus grande de GPR98 (isoforme B) contient 35 domaines Calx- beta entre lesquels s'intercalent un domaine LamG/TspN/PTX ainsi qu'une région composée de 7 domaines EAR (epilepsy associated repeat), une région à 7 TM et un motif PBM. C- l'isoforme A de la whirline contient 3 domaines PDZ, une région riche en proline (P) ainsi qu'un domaine PBM. D- PDZD7 contient 3 domaines PDZ et un motif PBM. E- Clarine contient seulement 4 domaines TP dans son isoforme la plus grande. d. Implication des gènes USH2 Fin 2008, date à laquelle j'ai débuté mon travail de thèse, seul le gène USH2A était analysé dans les laboratoires et représentait 80% des cas USH2 (Baux et al. , 2007). L'implication des autres gènes USH2 a été définie au cours des 4 dernières années. Ce travail faisant l'objet de la première partie de ma thèse, il sera développé dans la Partie II. Hétérogénéité clinique et génétique Gène USH3 : CLRN1 3. Gène USH3 : CLRN1 Le locus USH3A a été identifié par Sankila et ses collaborateurs en 1995 (Sankila et al. , 1995) sur le bras long du chromosome 3. En 2001, la même équipe identifia le gène dans la population finlandaise (Joensuu et al. , 2001). Le transcrit le plus long comporte 2359 nucléotides répartis sur 3 exons (NM 174878. 2 ; ENST00000327047), et code pour une isoforme de 232 acides aminés, la clarine. (NP 777367. 1 ; ENSP00000322280) (Figure 11- E, page 35). Seul gène véritablement reconnu comme responsable du syndrome de Usher de type III, USH3A est impliqué d'une façon extrêmement minoritaire. En revanche certaines populations sont plus fréquemment touchées (voir chapitre II. D. 2, page 47). 4. Les autres gènes a. PDZD7 L'implication du gène PDZD7 dans le syndrome de Usher a été mise en évidence en 2010 par Ebermann (Ebermann et al. , 2010). Le transcrit le plus long composé de 4013 nucléotides pour 18 exons (NM 001195263. 1 ; ENST00000393462) code pour une isoforme protéique de 1033 acides aminés, PDZ domain-containing protein 7 (PDZD7) (NP 001182192. 1 ; ENSP00000377106). Ce gène n'a pour l'instant jamais été identifié comme seul responsable du syndrome de Usher. Son implication est développée dans le chapitre II. D. 3 (page 48). b. HARS Des mutations du gène HARS ont été récemment décrites chez des patients présentant des similarités cliniques avec le type III, caractérisées notamment par une perte progressive de la vue et de l'audition durant l'enfance (Puffenberger et al. , 2012). Le transcrit le plus long, composé de 3334 nucléotides pour 13 exons (NM 002109. 4 ; ENST00000504156) code pour une isoforme protéique de 509 acides aminés, Histidine-tRNA ligase, cytoplasmic (HARS) (NP 002100. 2 ; ENSP00000425634). 5. Gènes Usher et phénotypes non syndromiques Le syndrome de Usher associe une surdité congénitale à une rétinite pigmentaire quel que soit son type clinique. Dans de rares cas, les gènes impliqués dans ce syndrome mènent à des surdités non syndromiques à transmission autosomique dominante (DFNA) et récessive (DFNB), ou peuvent aussi entraner des RP non syndromiques (RPNS) à transmission Les modèles animaux Gènes Usher et phénotypes non syndromiques autosomique récessive (ARRP). Le tableau ci-dessous (Tableau 4, page 37) récapitule ces différents troubles isolés. Les gènes USH1 hormis USH1G ont tous été identifiés comme pouvant être responsables de surdités non syndromiques. Actuellement, seulement 2 gènes, USH2A et CLRN1, ont été associés à des rétinites pigmentaires non syndromiques. Tableau 4 : Pathologies non-syndromiques impliquant les gènes Usher Gène Type Auteurs DFNA11 (Tamagawa et al. , 1996) MYO7A DFNB2 (Liu et al. , 1997) USH1C DFNB18 (Jain et al. , 1998) CDH23 DFNB12 (Chaib et al. , 1996) PCDH15 DFNB23 (Ahmed et al. 2003) USH1G - USH2A RP39 (Rivolta et al. , 2000) GPR98 - WHRN DFNB31 (Mustapha et al. , 2002b) CLRN1 RP61 (Khan et al. , 2011) Le détail des symptômes des patients en fonction des gènes impliqués est disponible en Annexe 1 (page 174). Certaines mutations engendrent une importante variabilité phénotypique. C'est le cas de la mutation c. T (p. Cys759Phe) dans USH2A (Dreyer et al. , 2000). Elle est désormais connue pour être impliquée dans le syndrome de Usher, mais a aussi été précédemment retrouvée chez de nombreux patients présentant une RP autosomique récessive non syndromique ainsi que chez quelques individus asymptomatiques (Dreyer et al. , 2008). Il a alors été supposé que ce variant était en déséquilibre de liaison avec une mutation en cis, mais aucune variation pathogène n'a pu être mise en évidence dans les régions codantes (et introniques flanquantes) du même allèle. Depuis, son caractère pathogène est avéré mais il reste encore à élucider les causes d'une telle variabilité phénotypique (Baux et al. , 2007). B. Les modèles animaux L'utilisation de modèles animaux est essentielle aux études moléculaires et physiologiques, notamment lorsque ces recherches ont des objectifs d'approches thérapeutiques pour l'homme. Les qualités fondamentales de tels modèles sont l'adéquation du phénotype avec les symptômes humains et la facilité de manipulation des animaux. Deux espèces sont particulièrement utilisées pour étudier le syndrome de Usher : Mus musculus (souris grise) et Danio rerio (poisson zèbre connu sous son nom anglais, zebrafish) (Yang, 2012). Il existe un Les modèles animaux Gènes Usher et phénotypes non syndromiques modèle murin pour chaque gène Usher : l'orthologue murin est alors porteur d'une mutation spontanée, induite ou générée par knock-out (Tableau 5, page 38). Les modèles de souris USH1 présentent des troubles comportementaux (déplacement en cercle ou hochements de tête) provoqués par l'atteinte vestibulaire. Les modèles USH présentent une surdité congénitale. Le phénotype rétinien est plus difficile à identifier chez ces mutants. En fonction des mutations, certains modèles présentent des électrorétinogrammes anormaux mais aucune dégénération rétinienne n'a pu être mise en évidence (Yang, 2012). La littérature fait tout de même état de 3 modèles avec dégénérescence rétinienne : Ush1c knock-in (c. A), Ush2a knock-out et Whrn knock-out (Lentz et al. , 2010 ; Liu et al. , 2007 ; Yang et al. , 2010). Les raisons de l'absence de dégénérescence rétinienne chez les modèles murins n'étaient pas élucidées jusqu'ici. On invoquait une redondance fonctionnelle des protéines chez la souris ou bien une apparition trop tardive par rapport à la vie de ce rongeur qui est de 2 à 3 ans en condition sauvage. Pour une autre espèce, Rattus rattus (rat domestique), dont l'espérance de vie est équivalente à celle de Mus musculus, il existe un modèle muté dans l'orthologue de MYO7A, mais aucun trouble visuel n'a été observé (Yang, 2012). Tableau 5 : Les modèles animaux Mus Musculus Nombre Danio rerio sh1 MYO7A Shaker-1 (Myo7a ) 11 Mariner dfcr USH1C Deaf circler (Ush1c ) 6 Ush1c CDH23 Waltzer (Cdh23 ) 15 sputnik av PCDH15 Ames Waltzer (Pcdh15 ) 7 orbiter js USH1G Jackson shaker (Sans ) 3 USH2A Knockout 1 morphant del7TM GPR98 Vlgr1 4 morphant wi DFNB31 Whirler (DFNB31 ) 2 ko CLRN1 Clrn1 1 Adapté de la revue de (Yang, 2012). L'équipe de Christine Petit vient de découvrir (8 octobre 2012) l'origine de la rétinite pigmentaire chez les patients atteints du syndrome de Usher de type I (Sahly et al. , 2012). Il s'agit d'un défaut dans l'organisation d'édifices cellulaires indispensables au maintien de la vision, les processus caliciels. Ce défaut est causé par le dysfonctionnement d'une ou de plusieurs protéines qui assurent la cohésion des processus caliciels. Contrairement aux primates, les cellules photoréceptrices des rongeurs ne possèdent pas ces structures. C'est la raison pour laquelle on n'observe pas de RP lorsque les gènes responsables du syndrome de Usher chez l'homme sont mutés chez la souris. A ce jour, 4 modèles de zebrafish sont décrits (Yang, 2012). Le modèle Ush1c a des troubles auditifs, vestibulaires et rétiniens. Le gène PCDH15 impliqué dans le syndrome de Usher de Le rôle des protéines Usher Les interactions entre les protéines Usher type I a deux orthologues chez le zebrafish. Il est intéressant de noter qu'en fonction de l'orthologue muté, les modèles n'ont pas le même phénotype : un des orthologues affecte les systèmes auditifs et vestibulaires tandis que le second engendre des défauts rétiniens. Enfin, des modèles zebrafish morphants (knock-out par injection de morpholinos à l'état embryonnaire) ont été utilisés dans différentes études dont une impliquant notamment GPR98 et USH2A (Ebermann et al. , 2010). C. Le rôle des protéines Usher 1. Les interactions entre les protéines Usher La Figure 12 représente les différentes interactions possibles entre les protéines Usher. Myosine VIIa 1 SANS (USH1G) 2 3 Protocadhérine 15 4 5 6 Cadhérine 23 7 8 9 10 Harmonine (USH1C) 11 12 13 14 15 Usherine 26 27 28 29 30 16 GPR98 31 32 33 34 35 17 18 Whirline 36 37 38 39 40 19 20 21 Pdzd7 41 42 43 44 45 22 23 24 25 Cadhérine 23 Proto- Myosine VIIa Harmonine Usherine SANS GPR98 Whirline Pdzd7 Protéines (USH1G) (USH1C) cadhérine 15 Figure 12 : Interactions entre les différentes protéines USH Les cases foncées rendent compte d'interactions mises en évidence in vitro (techniques de double hybride ou pull down pour la plupart). Les cases claires indiquent que des interactions entre ces protéines sont suggérées et concevables mais non démontrées. Les cases grises indiquent que des études ont été réalisées mais que les interactions n'ont pas pu être mises en évidence. Cases blanches : aucune évidence d'interaction à ce jour. Les interactions entre protéines USH1 sont indiquées en bordeaux, les protéines USH2 en vert, et les interactions mixtes USH1/USH2 en violet. Il existe, parmi les protéines Usher, deux protéines d'échafaudage : l'harmonine et la whirline autour desquelles s'organisent des complexes protéiques. Les plus grandes isoformes (harmonine isoforme b et whirline isoforme a) possèdent chacune 3 domaines PDZ et un motif PBM. Les domaines PDZ interagissent avec les motifs PBM des autres protéines Le rôle des protéines Usher Les interactions entre les protéines Usher Usher. La plupart des interactions discutées ont été identifiées in vitro, soit par précipitation de complexes protéiques (technique du pull down ), soit par technique de double hybride en levure. L'harmonine interagit via son domaine PDZ1, avec la partie C-terminale de la myosine VIIa (Boda et al. , 2002) (11). Ce domaine PDZ1 interagit aussi avec le domaine SAM de SANS (12) (et non pas par son motif PBM comme la plupart des interactions avec les domaines PDZ) (Adato et al. , 2005a). Le domaine PDZ1 de l'harmonine interagit aussi avec la partie cytoplasmique de la cadhérine 23 (14) (Siemens et al. , 2002) ainsi qu'avec la partie cytoplasmique d'usherine (30) et de GPR98 (35) (Adato et al. , 2005b ; Reiners et al. , 2005). Enfin, c'est aussi par son domaine PDZ1 que l'harmonine forme des homomères avec les régions PBM d'autres harmonines (15) (Siemens et al. , 2002). Le domaine PDZ2 de l'harmonine interagit avec les extrémités cytoplasmiques de la cadhérine 23 (14) (Boda et al. , 2002) et de la protocadhérine 15 (13) (Adato et al. , 2005a). SANS, toujours par son domaine SAM (12), semble être pour l'instant la seule protéine Usher identifiée comme interagissant avec l'harmonine par le biais de son domaine PDZ3 (Adato et al. , 2005a). Enfin, il a aussi été démontré que l'harmonine interagissait avec PDZD7 (45) (Schneider et al. , 2009). La Figure 13 (page 40) représente schématiquement les interactions décrites ci-dessus. Figure 13 : Représentation des interactions entre les protéines USH et harmonine Schémas des protéines adaptés de (Kremer et al. , 2006), les chiffres et les couleurs se rapportent à la Figure 12 (page 39), la description de chaque domaine est disponible Figure 9 (page 31) et Figure 11 (page 35). Le rôle des protéines Usher Les interactions entre les protéines Usher En ce qui concerne la wirline (Figure 14, page 41) il a été démontré qu'elle interagissait avec quasiment toutes les protéines Usher mais les domaines impliqués n'ont pas encore été identifiés. C'est le cas notamment pour les interactions de whirline avec la queue de la myosine VIIa (36) (Delprat et al. , 2005), avec la protocadhérine 15 (38) et la cadhérine 23 (39) (Kremer et al. , 2006). Pour ces deux dernières, on peut tout de même supposer que l'interaction a lieu avec les parties cytoplasmiques de ces protéines transmembranaires. Il est aussi démontré que les isoformes de la whirline peuvent respectivement interagir entre elles, mais aucune information sur les domaines d'interaction n'est disponible (Delprat et al. , 2005) (21). Les autres interactions sont définies de façon plus précise et mettent en jeu les domaines PDZ de la whirline et les motifs PBM des autres protéines Usher. PDZ1 fixe le motif PBM de SANS (37) (Maerker et al. , 2008 ; van Wijk et al. , 2006), de usherine (19) (van Wijk et al. , 2006) et de GPR98 (20) (van Wijk et al. , 2006) tandis que PDZ2 interagit avec SANS (37) et usherine (20) uniquement. Figure 14 : Représentation des interactions entre les protéines USH et whirline Schémas des protéines adaptés de (Kremer et al. , 2006), les chiffres et les couleurs se rapportent à la Figure 12 (page 39), la description de chaque domaine est disponible Figure 9 (page 31) et Figure 11 (page 35). Seize des 26 interactions actuellement connues entre les protéines Usher (plus de 60%) font donc interagir whirline ou harmonine, avec une autre protéine Usher. Parmi les autres interactions, celles entre protocadhérine 15 et cadhérine 23 (9) qui font intervenir leur large Le rôle des protéines Usher Les autres interactions domaine extracellulaire (Kazmierczak et al. , 2007) ainsi que leurs homomères respectifs (6 et 10) (identifiés en microscopie électronique à transmission (Kazmierczak et al. , 2007) sont particulièrement bien décrites. En effet, cette interaction constitue le lien apical des stéréocils des cellules ciliées et est donc l'acteur essentiel de la mécanotransduction du signal sonore. La protocadhérine 15 peut aussi interagir par sa partie cytoplasmique avec le domaine SH3 de la myosine VIIa (4) (Senften et al. , 2006). Cette dernière a la possibilité d'interagir par son extrémité MyTH4-Ferm-SH3 avec le domaine Cen de SANS (2) (Wu et al. , 2011) qui, elle, est capable de former des homomères par cette même région centrale (3) (Adato et al. , 2005a). La myosine VIIa est aussi identifiée comme fixant, par son extrémité C-terminale, les régions cytoplasmiques de usherine (26) et de GPR98 (31), sans que l'on sache quels sont plus précisément les domaines impliqués (Michalski et al. , 2007). La protéine PDZD7 est un homologue de whirline et d'harmonine. La grande isoforme contient aussi 3 domaines PDZ. PDZD7 a été décrite comme pouvant interagir avec les motifs PBM de usherine (22), de GPR98 (23) (Ebermann et al. , 2010), et de SANS (42) (Schneider et al. , 2009). Parmi les interactions suggérées, le débat reste entier concernant l'homodimérisation de la myosine VIIa (probable car la mobilité des myosines nécessite leur dimérisation) (Sakai et al. , 2011 ; Kremer et al. , 2006). De même, les homodimérisations de GPR98 et de la whirline semblent concevables (Maerker et al. , 2008). Certaines études évoquent aussi la possibilité d'hétérodimérisation entre GPR98 et usherine, mais cela n'a pas été démontré in vitro (Adato et al. , 2005b ; Maerker et al. , 2008). Il est intéressant aussi d'observer que certaines interactions recherchées n'ont pas été démontrées, comme entre SANS et les domaines cytoplasmiques de cadhérine 23 et de protocadhérine 15 (Adato et al. 2005a), ou entre la cadhérine 23 et la queue de la myosine VIIa (Boda et al. , 2002). 2. Les autres interactions Les complexes Usher ne sont pas des complexes isolés et de nombreuses interactions avec d'autres protéines ont été décrites. Certaines sont impliquées dans des pathologies présentant des phénotypes proches de celui du syndrome de Usher. C'est notamment le cas de la myosine XVa, responsable de surdité non syndromique et pour laquelle un modèle de mutants naturels de rat développe des symptômes du syndrome de Usher (Held et al. , 2011). Il s'avère que la myosine XVa interagit avec les domaines PDZ 1 et 2 de la whirline (Delprat et al. , 2005). Malgré son motif PBM connu chez les autres protéines pour interagir avec les domaines PDZ, il est intéressant de voir que la myosine XVa n'interagit pas par ce motif avec la whirline, mais par le domaine MyTH4. Le rôle des protéines Usher Localisation des protéines Usher Parmi les autres interactions identifiées, on peut citer la calmoduline et la vézatine avec la myosine VIIa (Udovichenko et al. , 2002 ; Kssel-Andermann et al. 2000). De plus, la vézatine est aussi capable d'interagir avec l'usherine (Michalski et al. , 2007). Plusieurs isoformes de la whirline ont récemment été identifiées comme interagissant avec l'isoforme RPGRorf15 (Wright et al. , 2012) codée par le gène RPGR, connu pour être fréquemment impliqué dans les RP liées à l'X. Ces 2 protéines colocalisent au niveau du cil connecteur des photorécepteurs. Par sa fonction de protéine motrice, la myosine VIIa participe aux interactions du complexe Usher avec d'autres protéines, notamment par son rôle dans le transport des opsines (Liu et al. , 1999) ou encore par son interaction avec RPE65 impliquée dans l'amaurose congénitale de Leber (Lopes et al. , 2011). 3. Localisation des protéines Usher La Figure 15 (page 43) représente la localisation des différentes protéines Usher dans les cellules cibles de la pathologie, mais ne rend pas compte de l'échelle temporelle en fonction du développement de ces cellules. Figure 15 : Localisation spatiale des protéines Usher dans les cellules cibles A- Représentation d'une cellule ciliée de l'oreille interne. B- Représentation d'un photorécepteur de type bâtonnet. (Adaptée de Ferry et Al, chapitre 5 de Usher Syndrome Satpal Ahuja Editor, 2011). Upper tip link density : point d'ancrage du lien apical sur le stéréocil supérieur, tip link : lien apical, stereocilia : stéréocil ; pericuticular neckplace : partie apicale de la cellule entourant la plaque cuticulaire ; nucleus : noyau de la cellule ; basal body : corps basal ; ankle link : lien d'ancrage ; kinocilium : kinocil ; periciliary region : région périciliaire ; inner segment : segment interne du photorécepteur ; outer segment : segment externe ; connecting cilium : cil connecteur. Le rôle des protéines Usher Protéines Usher dans les cellules ciliées de l'oreille interne 4. Protéines Usher dans les cellules ciliées de l'oreille interne Deux interactomes Usher sont désormais bien caractérisés au niveau des stéréocils des cellules ciliées de l'oreille interne. Chacun semble avoir une fonction particulière : le premier, transitoire (Figure 16-1, page 44), a un rôle dans le développement et le maintien de la touffe ciliaire, le second, permanent (Figure 16-3, page 44), participe au maintien du lien apical. Figure 16 : Représentation des interactomes Usher situés au niveau des stéréocils des cellules ciliées de l'oreille interne 1- Complexe protéique transitoire du lien d'ancrage d'après (Michalski et al. , 2007). 2- Représentation schématique de stéréocils organisés en touffe ciliaire sur la surface apicale d'une cellule ciliée. 3- complexe protéique du lien apical des stéréocils d'après (Kazmierczak and Mller, 2012). a. Le lien d'ancrage Le complexe protéique Usher au niveau du lien d'ancrage (Figure 16-1, page 44) est composé de 5 protéines (Michalski et al. , 2007). Quatre de ces protéines sont impliquées dans le syndrome de Usher, les 3 protéines du type II et la myosine VIIa. En 2005, Adato a montré que la localisation de usherine dans la touffe ciliaire était différente entre le jour P5 (détectée à la base des stéréocils) et P15 (détectée à la surface apicale des cellules ciliées) suggérant une migration du lien d'ancrage (Adato et al. 2005b). McGee a montré, chez la souris, que la protéine GPR98 était aussi exprimée de façon différentielle durant la maturation de la touffe ciliaire (McGee et al. , 2006). Au jour P2, la protéine GPR98 a été localisée par immunofluorescence à la base de la touffe ciliaire. Par microscopie électronique à transmission, McGee a également montré que GPR98 est un constituant du lien d'ancrage qui relie deux stéréocils entre eux à cette période de maturation de la touffe ciliaire. Comme précédemment démontré par Goodyear, ce lien d'ancrage, absent en phase embryonnaire, prédominant dans les premiers jours post-nataux, et moins visible à P9, n'est plus présent chez la souris à P14 ni par la suite (Goodyear et al. , 2005). Il se pourrait que ce lien ne soit plus visible suite à sa migration au niveau de la surface apicale des cellules ciliées, en concordance avec les hypothèses d'Adato (Adato et al. 2005b). Le rôle des protéines Usher Protéines Usher dans les photorécepteurs b. Le lien apical Le complexe protéique du lien apical fait intervenir les 5 protéines USH1. La cadhérine 23 et la protocadhérine 15 constituent plus spécifiquement le lien apical responsable de la mécanotransduction (Kazmierczak et al. , 2007). La colocalisation de plusieurs autres protéines a été démontrée in vivo : chez la souris, au stade embryonnaire E18 ainsi qu'au stade post-natal P4, la whirline a été identifiée par immunofluorescence dans les stéréocils des cellules ciliées de l'oreille interne ainsi que dans les cellules ciliées vestibulaires (Mburu et al. , 2003). Finalement, whirline et myosine XVa colocalisent au sommet des stéréocils chez la souris tout au long de la maturation de la touffe ciliaire (Delprat et al. , 2005). 5. Protéines Usher dans les photorécepteurs Un complexe protéique faisant intervenir plusieurs protéines Usher a été bien décrit au niveau du cil connecteur des photorécepteurs (Michalski et al. , 2007). Il semble avoir un rôle dans le maintien de l'ancrage du segment externe dans le segment interne des photorécepteurs. Ce lien fait intervenir 5 protéines USH, les 3 protéines USH2 ainsi que la myosine VIIa et SANS (Figure 17, page 45). Concernant les protéines USH2 et les photorécepteurs des mammifères, plusieurs études (Reiners et al. , 2005 ; van Wijk et al. , 2006 ; Maerker et al. , 2008) ont permis de localiser la whirline au niveau du segment interne, du cil connecteur et de la synapse des photorécepteurs (van Wijk et al. , 2006), et l'usherine et GPR98 au niveau de la synapse et du cil connecteur (Reiners et al. , 2005). Figure 17 : Interactome Usher situé au niveau du cil connecteur des photorécepteurs Adaptée de (Michalski et al. , 2007). 1- Schéma d'un photorécepteur de type bâtonnet. OS : segment externe ; CC : cil connecteur ; IS : segment interne ; N : noyau ; S : synapse 2- complexe protéique Usher au niveau du cil connecteur. Spectre mutationnel des gènes Usher Hétérogénéité L'étude de Maerker en 2008 a permis de localiser les protéines Usher au sein de photorécepteurs de souris et de xénope (Xenopus laevis) (Maerker et al. , 2008). Chez ces deux modèles, SANS et whirline sont localisées principalement à la base du cil connecteur et dans le segment interne. La whirline semble prédominer dans la région péri-ciliaire chez le xénope par rapport aux autres localisations. Les isoformes B de usherine et GPR98 (Figure 11, page 35) sont localisées dans les mêmes régions que SANS et whirline chez les deux espèces. En revanche le marquage de la partie extracellulaire de GPR98 chez la souris, montre aussi sa localisation dans la région entre le collier péri-ciliaire et le cil connecteur. Maerker a aussi mis en évidence, par la technique de double hybride, les interactions entre les domaines PDZ 1 et 2 de la whirline et le motif PBM de SANS. Par immunofluorescence, cette équipe a également confirmé la présence de la whirline et SANS dans les photorécepteurs murins au niveau du cil connecteur, du segment interne et de l'extrémité synaptique (Maerker et al. , 2008). Enfin, très récemment, Sahly et al. ont montré chez le macaque l'existence d'un complexe protéique USH1 au niveau des processus caliciels impliqués dans la mise en place et l'intégrité du segment externe (Sahly et al. , 2012). D. Spectre mutationnel des gènes Usher 1. Hétérogénéité Les mutations retrouvées dans les gènes responsables du syndrome de Usher sont réparties sur l'ensemble des séquences codantes de ces gènes et sont, pour la plupart privées. En effet, seulement quelques variations pathogènes pour lesquelles un effet fondateur a pu être mis en évidence ont été identifiées (voir chapitre suivant, page 47). Sur les 720 allèles pathogènes identifiés au laboratoire (tous gènes Usher confondus) et recensés dans la base de données interne (USHVaM, voir page 58), la mutation la plus fréquente, c. 2299delG (p. Glu767fs) du gène USH2A a été retrouvée dans seulement 8% d'entre eux (54 allèles) démontrant le caractère privé des mutations des gènes Usher. En effet, ce chiffre est à comparer à la mutation majoritaire c. 1521 1523delCTT (p. Phe508del) dans le gène CFTR responsable de 67% des allèles pathogènes impliqués dans la mucoviscidose chez les patients français (Claustres et al. , 2000), ou à la mutation c. 35delG (p. Gly12fs) dans le gène GJB2 (locus DFNB1) décrite dans 40-60% des surdités non syndromiques autosomiques récessives neurosensorielles dans les populations caucasiennes (Gasparini et al. , 2000, 2 ; Estivill et al. , 1998). Spectre mutationnel des gènes Usher Effets fondateurs des mutations Les mutations responsables du syndrome de Usher sont très hétérogènes. Au total, plus de 360 variations différentes, probablement pathogènes, sont actuellement identifiées dans USHVaM. Et ce sont près de 1000 variations différentes qui ont pu être recensées comme pathogène dans les bases de données locus spécifiques regroupés sous le nom de LOVD USHBases (ces bases, gérées au laboratoire de Montpellier, répertorient l'ensemble des variations publiées identifiées dans les gènes USH). Parmi celles-ci 66% sont des substitutions et 34% sont des délétions et/ou insertions. Environ 47% de ces variations prédisent un codon stop prématuré (PTC), 12% sont considérées comme altérant l'épissage, 3% sont des grands réarrangements et près de 38% entranent des variants faux-sens susceptibles d'altérer la structure, donc la fonction des protéines impliquées. 2. Effets fondateurs des mutations Le premier effet fondateur à être évoqué pour le syndrome de Usher, a été décrit dans la population acadienne (région proche du Québec) par l'étude des marqueurs USH1C et l'identification d'un haplotpye commun (Keats et al. , 1994). Cet effet a été confirmé par la suite en identifiant la mutation pathogène portée par cet haplotype, c. A (Ouyang et al. , 2003). L'effet fondateur dans la population acadienne a été par la suite, élargi à la population québécoise (Ebermann et al. , 2007a). En 1996, un effet fondateur a été mis en évidence au niveau du locus USH3A dans la population finlandaise (Joensuu et al. , 1996). En 2001, Joensuu confirma dans cette population la présence d'une mutation ayant pour origine un évènement ancestral commun (c. G ; p. Tyr100* aussi nommée Finmajor) (Joensuu et al. , 2001). Dans la même publication, Joensuu suppose un second effet fondateur pour une 2ème mutation appelée Finminor (c. A, p. Met44Lys). En 1998, l'étude des haplotypes de patients libanais atteints du syndrome de Usher de type II a permis de faire l'hypothèse d'un effet fondateur au niveau du locus USH2A (Saouda et al. , 1998). Par la suite, le premier effet fondateur USH2A dans une population hétérogène fut décrit pour la mutation c. 2299delG (Dreyer et al. , 2001). Des études complémentaires ont été menées, depuis, sur la population Sud-européenne et ont permis d'estimer l'apparition de cette mutation il y a environ 6500 ans (Aller et al. , 2010). Une autre mutation, c. T (p. Cys759Phe) est fréquemment observée dans le gène USH2A. Elle a initialement été décrite comme étant responsable de phénotype RPNS (voir Spectre mutationnel des gènes Usher Digénisme et oligogénisme chapitre II. A. 5, page 36). L'hypothèse d'un effet fondateur a été émise pour cette variation avec l'identification d'un haplotype commun chez 8 familles (Bernal et al. , 2003). Un troisième effet fondateur dans le gène USH2A a été mis en évidence dans la population hollandaise pour la mutation faux-sens c. T (p. Cys419Phe). Ce variant est retrouvé sur 16% des allèles pathogènes dans cette population (Pennings et al. , 2004). Un autre variant délétère dans le gène USH2A (c. 4338 4339delCT) semble issu d'un événement unique, car retrouvé majoritairement chez les patients d'origine québécoise et acadienne (Ebermann et al. , 2009). L'implication d'un effet fondateur pour la mutation c. 238-239insC dans USH1C a été suggérée en 2001 sur les bases d'un haplotype commun (Zwaenepoel et al. , 2001). Cet effet fut difficile à confirmer. En effet, les marqueurs microsatellites manquaient d'informativité dans cette région puisqu'une seconde mutation (c. 36 T) fut retrouvée sur ce même haplotype. La présence d'effets fondateurs dans la population suédoise pour des mutations du gène CDH23 fut également suggérée pour 2 mutations : c. T (p. Arg1502*) et c. 336 A retrouvées dans plusieurs familles (Astuto et al. , 2002). Chez les Juifs Ashkénazes, une mutation (p. Arg245*) résultant a priori d'un événement unique, fut identifiée dans PCDH15 (Ben-Yosef et al. , 2003). Elle serait apparue 14 générations auparavant, soit environ 350 ans. 3. Digénisme et oligogénisme A ce jour, deux études font référence à des patients atteints du syndrome de Usher par transmission sur un mode de digénisme (Zheng et al. , 2005 ; Ebermann et al. , 2010) et quatre mettent en évidence un oligogénisme (Adato et al. , 1999 ; Ebermann et al. , 2010 ; Roux et al. , 2011 ; Bonnet et al. , 2011). Un digénisme est d'abord rapporté par Zheng et al. en 2005, dans 3 familles USH1, portant une variation considérée alors comme pathogène dans chacun des gènes CDH23 et PCDH15. Zheng et al. ont également démontré que les souris mutantes doubles hétérozygotes Cdh23v-2j/Pcdh15av-3j (porteuses des mutations c. 4104 A dans CDH23 et p. Glu1373fs dans PCDH15) ont une perte auditive progressive significative ainsi qu'une désorganisation de la touffe ciliaire des cellules ciliées. Ces résultats suggèrent un phénotype altéré issu d'un digénisme entre PCDH15 et CDH23. Spectre mutationnel des gènes Usher Digénisme et oligogénisme Tableau 6 : Génotypes des familles rapportées dans l'étude de Zheng et al, 2005 LOVD LOVD PCDH15 CDH23 USHBases USHBases c. 5601delAAC c. 193delC Famille 1 UV3 Mutation p. (Thr1867del) p. (Leu65fs) c. 16delT c. T Famille 2 Mutation UV3 p. (Tyr6fs) p. (Arg3189Trp) c. G c. 5601delAAC Famille 3 UV3 (homozygote) UV2 p. (Thr1867del) p. (Thr1209Ala) UV3 indique que le variant est potentiellement pathogène tandis que UV2 indique que le variant ne l'est potentiellement pas (voir chapitre II. F. 2. c. , page 56). Le second cas de digénisme a été suggéré par Ebermann pour les gènes GPR98 et PDZD7. En effet, ils démontrèrent chez un patient la présence d'une mutation GPR98 (p. Ala5713fs) et d'une mutation PDZD7 (p. Cys732fs), transmises chacune par un des parents (Ebermann et al. , 2010). Le même groupe a également fait l'hypothèse du rôle de PDZD7 comme acteur d'oligogénisme, entranant une aggravation du phénotype RP ainsi qu'un début des signes cliniques plus précoce. En effet, ils ont décrit dans une famille, deux sœurs atteintes d'un syndrome de Usher de type II, et porteuses d'une mutation USH2A à l'état homozygote (c. 4338 4339del, p. Cys1447fs). La sœur présentant un phénotype rétinien aggravé porte également une altération prédisant un PTC dans PDZD7 (c. 166 167ins, p. Arg56fs). Les auteurs de cette étude ont aussi généré un modèle mutant de zebrafish (Danio rerio) par extinction de PDZD7 (pdzd7 knockdown) montrant une similarité avec le phénotype Usher. L'hypothèse d'oligogénisme modulant le phénotype Usher a été faite dès 1999 par Adato et al. , à propos de deux frères, porteurs d'un même haplotype homozygote au niveau du locus USH3A mais présentant des phénotypes Usher différents (Adato et al. , 1999). La mutation du gène CLRN1 présente à l'état homozygote a été identifiée par la suite (Adato et al. , 2002). Le premier patient était atteint d'une surdité pré-linguale associée à des troubles vestibulaires congénitaux caractéristiques du syndrome de Usher de type I tandis que le second présentait un phénotype USH3 avec notamment une surdité progressive post- linguale. L'atteinte rétinienne des 2 frères était similaire, avec une RP apparue au début de l'adolescence. Le frère présentant les symptômes les plus sévères était également porteur de la mutation c. 3265delG (p. Ala1089fs) du gène MYO7A. C'est sur ces données qu'Adato et al. suggérèrent un oligogénisme entre CLRN1 et MYO7A (Adato et al. , 1999). Perspectives thérapeutiques Digénisme et oligogénisme Nous avons nous-mêmes évoqué un effet oligogénique pour expliquer le phénotype d'un patient chez qui nous avons identifié deux mutations en trans dans CDH23 (Roux et al. , 2011). Il s'avère aussi porteur de la mutation c. 2299delG dans USH2A. On ne peut pas exclure que le caractère précoce de l'atteinte rétinienne chez ce patient comparé à l'atteinte typique des patients USH1 soit dû à la présence de cette mutation additionnelle. Un autre cas d'oligogénisme concerne un patient USH1 pour lequel 3 variations faux sens rares ont pu être mises en évidence : p. Leu2186Pro dans MYO7A, p. Leu16Val dans USH1G et p. Cys3307Trp dans USH2A (Bonnet et al. , 2011). Le variant MYO7A p. Leu2186Pro (c. C) avait précédemment été décrit en trans d'une mutation délétère dans une autre étude (cf LOVD USHBases). Dans l'étude de Bonnet et al. , le variant MYO7A est transmis par le même parent que le variant USH2A p. Cys3307Trp. Enfin, dans une étude récente regroupant l'analyse de tous les gènes Usher dans une cohorte du Royaume-Uni de 172 patients USH, aucun cas convaincant de digénisme n'a pu être mis en évidence, de sorte que les auteurs concluent que, si un tel mode de transmission existe, son implication est suffisamment faible pour ne pas être prise en compte en conseil génétique (Le Quesne Stabej et al. , 2012). E. Perspectives thérapeutiques Le syndrome de Usher affecte particulièrement deux organes sensoriels distincts : l'oreille interne et la rétine. Il n'existe pas, à ce jour, d'approches thérapeutiques capables de corriger simultanément les déficits de ces deux organes, mais certaines avancées sont très prometteuses. On peut considérer qu'il existe deux grandes approches thérapeutiques distinctes : la thérapie symptomatique visant à corriger directement le phénotype et la thérapie causale consistant à corriger l'altération elle-même. Quelle que soit l'approche, celle-ci est généralement spécifique d'un organe sensoriel. La surdité associée au syndrome de Usher est congénitale. Les cellules ciliées semblent s'altérer dès le début de leur développement. De plus, les mammifères ayant perdu la capacité de renouveler ce type de cellules, il semble difficile d'imaginer une approche traitant la cause de la surdité dans ce cadre. C'est sans doute pourquoi les approches actuelles semblent privilégier le traitement symptomatique de l'audition dans le syndrome de Usher bien que d'autres pistes semblent très intéressantes. Perspectives thérapeutiques Thérapies symptomatiques Les perspectives pour le traitement de la RP sont différentes. Puisque l'œil bénéficie d'une tolérance immune, en plus de sa transparence et de sa facilité d'accès (Schmid et al. , 2011), il représente un excellent modèle pour les innovations thérapeutiques. Dans la plupart des cas de RP, la dégénérescence des photorécepteurs est lente et progressive et dans le cas du syndrome de Usher, les signes cliniques auditifs précèdent ceux de la RP bien que la dégradation rétinienne soit déjà initiée. Cela s'avère un avantage supplémentaire comparé aux RP non syndromiques. 1. Thérapies symptomatiques a. Les implants cochléaires Les patients présentant une surdité profonde peuvent bénéficier d'implant cochléaire. Cet implant peut être proposé avant l'âge de un an. Il permet le traitement du signal auditif afin de le transmettre directement en signal électrique au nerf auditif, via des électrodes, en se substituant à la cochlée (Figure 18, page 51). La mise en place de l'implant nécessite une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et une réhabilitation effective et suivie est indispensable. Pour les enfants USH1, l'implantation de prothèses cochléaires précoces et bilatérales améliore nettement les possibilités d'apprentissage et les capacités de communication (Pennings et al. , 2006). Dans la majorité des cas, les patients USH2 ont recours à des prothèses auditives externes. Figure 18 : Implant cochléaire Adaptée de 1- le son est capté, converti et dirigé vers un transmetteur placé sur le cuir chevelu. 2- le transmetteur convertit le signal électrique en ondes radio à destination du récepteur. 3- Les ondes sont décodées en signal électrique transmis aux électrodes intra-cochléaires remplaçant les cellules ciliées altérées (4). 5- Le signal est alors émis aux fibres nerveuses auditives Perspectives thérapeutiques Thérapies causales b. Les implants rétiniens Les approches de thérapie symptomatique consistant à corriger le phénotype par un moyen technologique sont possibles par le biais d'implants rétiniens (implantés chirurgicalement dans la rétine des patients). Ils permettent la restauration partielle de la vue. Il s'agit de puces électroniques insérées dans la couche contenant des micro-cellules capables de convertir la lumière en impulsions électriques. Certains de ces implants sont en phase d'essais cliniques et les progrès s'avèrent rapides. 2. Thérapies causales a. Thérapies géniques Plusieurs stratégies ont été envisagées, et certaines sont d'ailleurs en phase clinique dans le cadre de RP non liées au syndrome de Usher. C'est le cas notamment de la thérapie génique sur le gène RPE65 impliqué dans l'amaurose congénitale de Leber (pour revue (Cao et al. , 2011). Le syndrome de Usher se caractérise par une hétérogénéité génétique mais aussi allélique. Les mutations étant réparties sur l'ensemble des gènes ne permettant pas de mettre en évidence de points chauds mutationnels significatifs. De ce fait, il semble théoriquement plus pertinent d'envisager un remplacement complet de l'information génétique. Une des limites dans l'utilisation de la thérapie génique est la taille (en pb) d'information pouvant être délivrée par les vecteurs actuels. Plusieurs études basées sur la thérapie génique de remplacement ont été réalisées sur le syndrome de Usher. Cette stratégie peut principalement être utilisée lorsque les mutations sont à l'origine d'une perte de fonction, ce qui semble être le cas pour tous les gènes Usher actuellement connus. Le remplacement du cDNA issu du gène MYO7A chez un mutant murin shaker (homozygote p. Q720*), a pu être réalisé à l'aide d'un vecteur lentiviral (Hashimoto et al. , 2007). Le phénotype rétinien étant normal chez les mutant shaker, le rétablissement d'une fonction visuelle n'a pas pu être testé mais l'étude a montré une relocalisation de l'opsine ayant tendance à s'accumuler au niveau du cil connecteur des photorécepteurs en l'absence de myosine VIIa fonctionnelle. Plus récemment, une étude associée au gène DFNB31 a utilisé comme vecteur de transfert, un virus adéno-associé (AAV) (Zou et al. , 2011). En réalisant l'insertion rétinienne du cDNA murin codant pour la whirline, on a observé chez le mutant whirlin knockout la relocalisation des protéines qui sont connues pour leur interaction avec la whirline : usherine et GPR98. Perspectives thérapeutiques Thérapies causales b. Transplantation cellulaire La transplantation cellulaire de cellules progénitrices humaines au niveau de l'interstice entre les photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien a précédemment permis de démontrer un ralentissement de la dégradation visuelle chez le rat (Gamm et al. , 2007). Cette stratégie a donc été testée sur des souris USH2A knock-out (Lu et al. , 2010), et la détérioration rétinienne serait retardée. c. Thérapie antisens L'identification de mutations particulières ouvre aussi de nouvelles perspectives thérapeutiques. C'est le cas du pseudoexon identifié chez plusieurs patients dans le gène USH2A (Vaché et al. , 2012). Son exclusion par l'utilisation d'un oligonucléotide antisens (AON) pourrait rétablir un transcrit normal, comme cela a pu être le cas dans d'autres pathologies (Pérez et al. , 2010). d. Translecture de PTC La translecture des codons stop prématurés ouvre d'importantes perspectives thérapeutiques en permettant de synthétiser une protéine complète. Les aminoglycosides ont une capacité de translecture mais engendrent de sévères effets secondaires aux doses efficaces. Un autre type de molécule, le PTC24, synthétisé par PTC Therapeutics, semble être mieux toléré, plus efficace et ne pas induire de translecture du codon stop normal (Welch et al. , 2007 ; Du et al. , 2009). Une étude a mis en évidence son efficacité sur la mutation c. T (p. Arg31*) codée dans le gène USH1C en culture cellulaire, en explant rétinien et in vivo chez la souris (Goldmann et al. , 2011). Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher Les stratégies disponibles F. Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher 1. Les stratégies disponibles A ce jour, il n'existe aucune stratégie simple permettant un diagnostic moléculaire exhaustif du syndrome de Usher. L'hétérogénéité génétique ainsi que la faible prévalence n'en font certainement pas un modèle économiquement intéressant pour les sociétés réalisant la mise au point de trousses commerciales certifiées pour le diagnostic. Cependant, la société ASPER biotech commercialise une aide au diagnostic sous forme de puce ADN, basée sur la technologie d'extension de primers APEX. Cette puce (Asper ophtalmics Usher Syndrome) permet de tester simultanément la présence de 651 variations. Si la majorité de ces variations correspondent à des mutations pathogènes, certaines d'entre elles sont controversées quant à leur effet pathogène. Elles peuvent alors rendre le diagnostic imprécis, voire erroné. Ce test, mis à jour régulièrement (298 variants en 2007, 651 actuellement), est économiquement bon marché (environ 200 euros par test). Bien que cette puce permette d'identifier un allèle muté dans 25% des cas seulement, elle peut cependant rendre possible la priorisation du gène à séquencer en cas d'identification d'une mutation (Cremers et al. , 2007). La stratégie du laboratoire de génétique des maladies rares de Montpellier s'est orientée différemment dans le but de pouvoir rendre un diagnostic plus complet. 2. La stratégie du laboratoire Le recrutement des patients au sein du laboratoire est en grande majorité national, mais il reçoit également des échantillons de Norvège, Angleterre, Italie grâce à de solides collaborations avec divers cliniciens. Dans un premier temps, le diagnostic a été mis en place sous forme d'un protocole hospitalier de recherche clinique (PHRC) National obtenu en 2004, qui incluait 17 centres collaboratifs. Ce PHRC avait pour but de tester la faisabilité du diagnostic moléculaire rendu complexe par l'hétérogénéité génétique et la taille des gènes à analyser. Depuis sa mise en place, un arbre décisionnel a été optimisé et de nombreux outils d'analyse, notamment in silico, ont été créés, dédiés spécifiquement à la pathologie (Roux et al. , 2011) (Figure 19, page 55 et Figure 20, page 57). Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher La stratégie du laboratoire Figure 19 : Logigramme de la stratégie de diagnostic moléculaire du laboratoire *l'étude des marqueurs microsatellites USH1 est réalisée pour chaque patient (même si seul le cas index est disponible). Cette stratégie permet de réduire le nombre de gènes à analyser dans plus de 40% des cas. *variants pathogènes ou susceptibles de l'être (UV3, UV4 ou mutations). Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher La stratégie du laboratoire a. Séquençage type Sanger Chez 40% des patients USH1, l'étude des marqueurs microsatellites aux différents loci Usher permet l'identification d'un locus probable ou l'exclusion de certains d'entre eux. Elle est donc réalisée chez chaque patient USH1 reçu au laboratoire. Si un gène est identifié, il sera prioritairement séquencé, sinon, le choix a été fait de séquencer prioritairement les exons les plus fréquemment mutés des différents gènes impliqués sur une plaque dite multi-gènes . Pour le syndrome de Usher de type II, l'étude des marqueurs microsatellites est réalisée uniquement lorsque les échantillons d'ADN d'une fratrie sont disponibles ou bien lorsque le dossier évoque la probable consanguinité au sein de la famille. Dans le cas contraire, le gène majoritairement impliqué, USH2A, est séquencé en priorité. Si son implication n'est pas mise en évidence, les autres gènes seront alors séquencés. b. Les grands réarrangements Les grands réarrangements sont étudiés (essentiellement par aCGH, hybridation génomique comparative sur puce) lorsque les deux variants pathogènes n'ont pas pu être mis en évidence chez un patient. Cette technique consiste à comparer l'hybridation de fragments issus d'un ADN test par rapport à un ADN témoin. L'intérêt majeur de cette stratégie, outre sa sensibilité, est le nombre de gènes et de patients pouvant être étudiés simultanément lors d'une même expérience. Nous utilisons une puce à façon spécifique au groupe Usher, contenant l'ensemble des gènes responsables du syndrome de Usher et permettant l'analyse simultanée de 12 patients. c. Validation des mutations et variants inconnus identifiés Lorsque la pathogénicité ou la neutralité d'un variant identifié par séquençage n'est pas avérée, on considère celui-ci comme un Variant de Signification Clinique Inconnue (VSCI ou UV pour Unclassified Variant). Les mutations menant à l'apparition d'un PTC ou touchant les sites canoniques d'épissage AG/GT sont considérées comme a priori pathogènes et n'entrent donc pas dans cette catégorie. Les altérations VSCI sont soit localisées dans les exons (variations faux-sens ou silencieuses) soit introniques, en dehors des sites AG/GT. Les VSCIs sont donc susceptibles d'altérer l'épissage ou de modifier la structure et/ou la fonction de la protéine correspondante (Baux et al. , 2012, sous presse). A ce jour, plus de 37% des variations identifiées au laboratoire correspondent à des VSCIs (UV3 ou UV4). Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher Evaluation de l'effet pathogène des VSCIs Pour toute identification d'un variant inconnu ou pathogène dans le cadre du diagnostic, une validation est réalisée selon les bonnes pratiques de diagnostic mises en place au laboratoire, consistant notamment à reproduire l'identification sur une nouvelle dilution d'ADN, ainsi que par l'utilisation d'une seconde méthode parmi les suivantes : Mini- séquençage SnapShot, dHPLC, digestion enzymatique, PCR-séquençage avec un nouveau couple d'amorces (liste non exhaustive). Figure 20 : Diagramme de classification des variants non décrits (VSCIs) Adaptée de (Roux et al. , 2011). 3. Evaluation de l'effet pathogène des VSCIs La plupart de ces études ne permettent pas de statuer pleinement sur le caractère pathogène ou neutre des variations mais orientent néanmoins une classification en faveur d'un effet pathogène (UV3, UV4) ou non délétère (UV1, UV2). Nous avons mis en place une batterie de techniques in vitro et in silico. La Figure 20 (page 57), représente le diagramme de classification des variants utilisé au laboratoire, progressivement amélioré depuis 6 années. Le rectangle rouge représente les analyses systématiquement réalisées lorsqu'un nouveau variant est identifié. Les autres analyses sont, quant à elles, réalisées en fonction du type de variation. Si les outils présentés ne constituent pas la liste exhaustive des moyens utilisés pour orienter la classification des variants, ils en représentent les principaux. Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher Evaluation de l'effet pathogène des VSCIs a. Analyses systématiques 1. Etude épidémiologique L'étude épidémiologique pour les variants inconnus est l'un des premiers critères observés. Si l'absence d'identification d'un variant de l'un des gènes Usher au sein de la population générale ne permet pas de le classer comme un variant pathogène, sa présence dans cette population suggère très fortement le caractère bénin de ce variant. Auparavant, toutes les études épidémiologiques étaient réalisées au laboratoire par séquençage Sanger, sur une population témoin d'environ une centaine d'individus. Désormais, de récentes bases de données fiables sont disponibles sur Internet. On peut les classer en deux catégories : Base de données interne o USHVaM Base regroupant toutes les données moléculaires des patients Usher analysés au laboratoire avec accès restreint au groupe Usher du laboratoire, permettant de nombreuses recherches croisées entre variants et patients dans l'ensemble des gènes Usher. Un nombre conséquent de statistiques découlant de ces analyses sont disponibles, en temps réel. Bases de données locus-spécifiques dédiées au syndrome de Usher o LOVD USHbases : LSDB Base de données répertoriant les génotypes associés aux gènes Usher publiés dans la littérature internationale, gérée par le laboratoire, accessible librement sur internet. Près de 1000 variants pathogènes y sont actuellement répertoriés. Bases de données généralistes o EVS (Exome Variant Server) Base de données issues de l'ESP (NHLBI Exome Sequencing Project). Mise à disposition des données issues du séquençage de l'exome complet chez désormais 6500 individus, soit 13000 chromosomes. Contient uniquement des substitutions exoniques ou proches des exons, aucune petite insertion ou délétion n'est recensée dans cette base. o 1000Genomes Catalogue des variations identifiées par séquençage du génome entier de 1092 individus à ce jour. Elle permet de connatre la fréquence de variants introniques éloignés des sites d'épissage ainsi que celle des variations entrainant l'insertion ou la délétion d'un ou plusieurs nucléotides (appelés Indels). Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher Evaluation de l'effet pathogène des VSCIs o dbSNP Utilisée uniquement de manière indirecte par le biais des autres bases de données. Pour être interprétable, l'enregistrement du variant d'intérêt doit contenir certaines informations comme la fréquence ou le type d'analyse ayant mené à l'identification. 2. Ségrégation familiale L'étude de ségrégation familiale étant irremplaçable pour valider le positionnement en trans de deux variants pathogènes ou supposés, elle est systématiquement réalisée lorsque des échantillons d'ADN de membres de la famille sont disponibles. b. Analyses spécifiques 1. Analyses structurales in silico Pour certains de ces gènes, il est établi que les faux-sens sont à l'origine de plus de 30% des allèles pathogènes, notamment pour USH2A et MYO7A. USMA (Usher Syndrome Missense Analysis) est un outil web initié et développé depuis plusieurs années au laboratoire, permettant l'analyse automatique in silico des variants faux-sens identifiés dans les gènes Usher. USMA permet l'étude simultanée de plusieurs paramètres en fonction du variant : la conservation orthologue Elle permet d'identifier la conservation d'un acide aminé dans une même protéine, dans différentes espèces. La conservation d'un acide aminé peut marquer une contrainte évolutive fonctionnelle. USMA analyse cet alignement orthologue et représente l'alignement sous diverses formes, notamment par l'intermédiaire d'un diagramme de Venn des propriétés de chaque acide aminé (Figure 21, page 60). la conservation inter-domaines Disponible uniquement lorsque le variant se situe dans un domaine protéique décrit et pour lequel on dispose d'un alignement. Cette analyse permet d'identifier la conservation entre les domaines considérés comme similaires dans différentes espèces. Cette analyse de domaines orthologues, paralogues et répétés nécessite un alignement de nombreuses séquences (jusqu'à 2000 pour les domaines présents dans les protéines Usher) et apporte une informativité importante concernant les résidus clés de ces domaines. Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher Evaluation de l'effet pathogène des VSCIs la structure secondaire USMA permet aussi l'analyse de la structure secondaire en associant, pour chaque variant, sa position dans une structure organisée (hélices, feuillets) à des données de fréquences d'observation des différents résidus dans ces structures. la modélisation 3D. USMA intègre sa propre base de données de structures tridimensionnelles, qu'elles soient issues de données expérimentales (RMN, cristallographie) ou de modélisation par homologie. Celle-ci, associée à un moteur original d'analyse 3D, permet l'étude de l'impact de la variation. L'analyse structurale consiste à prédire un rôle potentiel du résidu sauvage aboli ou atténué par le mutant, ou, au contraire, une atteinte directement due à l'introduction du résidu mutant dans le cas d'une position sauvage structurellement neutre ou sans rôle particulier identifié. Figure 21 : Diagramme de Venn des propriétés des acides aminés Adaptée de 2. Prédictions d'altération d'épissage in silico L'analyse in silico d'une altération de l'épissage permet d'orienter le choix vers la mise en place nécessaire ou non d'analyses in vitro supplémentaires (Houdayer, 2011). Elle peut être utilisée pour tous types de variants, et particulièrement les variants introniques ainsi que les substitutions exoniques. Les principales prédictions sont effectuées à partir de l'outil web HSF (Human Splicing Finder) qui utilise deux algorithmes distincts (Desmet et al. , 2009) : l'un utilisant un dérivé de la matrice de Shapiro et Senapathy (Shapiro and Senapathy, 1987) et le second issu du script de MaxEnt (Yeo and Burge, 2004). Ce sont les variations entre les scores du variant sauvage et ceux du variant muté qui indiquent un possible effet du variant muté. Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher Evaluation de l'effet pathogène des VSCIs 3. Analyse en minigènes Lorsque les transcrits des patients ne sont pas disponibles (expression non-ubiquitaire, tissus difficiles à prélever), les analyses en minigènes représentent un très bon outil de validation in vitro du caractère délétère d'un variant sur l'épissage. La technique (voir article : non-USH2A mutations in USH2 patients) consiste à transfecter un vecteur d'expression dans lequel a été insérée une région d'intérêt (dans nos études, généralement un ou plusieurs exons et leurs régions introniques flanquantes) dans une lignée cellulaire. Après extraction des ARNs totaux des cellules, le produit issu de la transcription de la partie d'intérêt mutée est comparé avec le produit issu de la construction sauvage équivalente. Si aucune variation n'est perceptible entre la construction sauvage et mutante, on estimera que la variation n'a pas d'effet sur l'épissage. En revanche toute différence entre les deux constructions supposera un rôle défavorable vis-à-vis de l'épissage normal (Figure 22, page 61). Figure 22 : Représentation schématique d'une étude en minigène Adaptée des travaux de thèse de Sandie Le Guédard-Méreuze, 2009. La région étudiée en condition sauvage ou mutée (dans cette exemple, amplicon d'un exon et ses régions introniques flanquantes) est insérée entre 2 exons du vecteur d'expression pSPL3. La croix rouge représente un exemple de variation dans la région d'intérêt en condition mutée. La flèche noire indique la localisation schématique du promoteur. Après transfection en lignée cellulaire HeLa, les ARN sont extraits et les différents profils d'épissage sont analysés par RT-PCR. a- pas d'effet sur l'épissage. b- saut d'exon. c- délétion partielle de l'exon. d-rétention partielle de l'intron. Le diagnostic moléculaire du syndrome de Usher Evaluation de l'effet pathogène des VSCIs 4. Analyse de transcrits Usher de cellules nasales L'expression des transcrits des gènes Usher dans les lymphocytes ne permet pas leur analyse de manière reproductible, à partir d'échantillon sanguin. L'accessibilité des tissus cibles (cochlée et rétine) de la pathologie étant limitée, l'étude des transcrits Usher des cellules nasales est particulièrement intéressante puisqu'elle permet de confirmer ou d'infirmer l'impact d'un variant directement sur les transcrits du patient (Vaché et al. , 2010). L'étude de ces cellules s'avère performante pour plusieurs points : Les transcrits majoritaires des gènes USH1 et USH2 sont retrouvés. Les cellules sont accessibles et leur prélèvement par frottis ne nécessite qu'une anesthésie locale. La majorité des patients Usher suivis au centre de référence des affections sensorielles rares du CHRU de Montpellier sont prélevés. Partie II : Implication des gènes USH2 Introduction Contexte I. Introduction A. Contexte Lorsque ce travail a été initié en 2008, l'étude de la littérature rapportait un nombre conséquent d'études moléculaires concernant les patients atteints de syndrome de Usher de type II. Cependant, ces travaux étaient essentiellement focalisés sur l'analyse du gène USH2A, alors que deux autres gènes avaient déjà été décrits (GPR98 et DFNB31). L'analyse de USH2A permettait de résoudre 70 à 80% des génotypes pathogènes (van Wijk et al. , 2004 ; Baux et al. , 2007 ; Dreyer et al. , 2008). L'absence de détection des mutations dans 20-30% des cas pourrait s'expliquer par plusieurs hypothèses : La présence de mutations non détectées par l'analyse des exons et régions introniques flanquantes du gène USH2A o Mutations introniques profondes o Mutations des régions régulatrices qui ne sont pas recherchées en priorité car leur détection et caractérisation nécessite l'utilisation de techniques particulières et/ou impliquent une connaissance des régions régulatrices. L'implication d'autres gènes o Parmi les gènes USH2 connus (DFNB31, GPR98) o Parmi des gènes dont la causalité est encore inconnue ! Ex : PDZD7 rapporté en 2010 (Ebermann et al. , 2010) Afin d'obtenir une meilleure exhaustivité dans l'analyse moléculaire des patients USH2 nous avons choisi d'aborder ces différentes hypothèses, en deux temps : Tester l'implication des autres gènes USH2 et développer les outils nécessaires pour rechercher les mutations complexes . L'analyse du gène DFNB31, composé de 12 exons, a été mise en place dans le secteur diagnostique. Je me suis chargé du développement de l'analyse moléculaire de GPR98, composé de 90 exons. L'implication de GPR98 dans le syndrome de Usher était connue depuis 2004 (Weston et al. , 2004). Lorsque j'ai commencé la mise au point du séquençage des 90 exons de ce gène, seules 6 familles USH2 avaient été étudiées et 6 mutations distinctes avaient été identifiées (Weston et al. , 2004 ; Schwartz et al. , 2005). Introduction Particularités techniques Le gène GPR98 présente les caractéristiques suivantes : Région chromosomique 5q o Taille 612 kb o Locus USH2C o Référence NCBI : NG 007083. 1 o 90 exons Transcrit de 19 kb dont 18921 pb codantes o Référence NCBI : NM 032119. 3 o Composé de l'ensemble des 90 exons connus Isoforme codée par le transcrit NM 032119. 3 de 6306 acides aminés GPR98 fait partie des plus grandes protéines humaines connues. Elle est classée 10ème sur 20225 protéines validées dans Uniprot. o Référence NCBI : NP 115495. 3 o Nom protéique G-protein coupled receptor 98 (GPR98) ! Famille des récepteurs couplés aux protéines G 7 domaines transmembranaires 7TM Sous-famille dite orphelins (ligand inconnu) o Référence UNIPROT : Q8WXG9-1 B. Particularités techniques Le séquençage de type Sanger a été réalisé pour les cas index de chacune des familles étudiées. Le grand nombre d'amplicons a demandé une mise au point rigoureuse avec pour objectif d'amplifier les 90 exons en conditions uniques sur plaque de 96 puits. Le choix des amorces d'amplification a été réalisé grâce à l'outil web primer3plus. Pour 3 exons, cet objectif n'a pu être atteint et des conditions spécifiques d'amplification ont été appliquées. Pour les étapes de post-amplifications les produits de PCR alors obtenus ont été rajoutés à la plaque 96 puits. A ce stade la totalité des puits était utilisée car la taille de certains exons imposait une amplification en plusieurs fragments. Article : non-USH2A mutations in USH2 patients Résumé de l'article II. Article : non-USH2A mutations in USH2 patients L'ensemble des résultats de séquençage, d'interprétation des variants identifiés, les conséquences de ce travail sur les connaissances moléculaires ainsi que les implications pour le diagnostic moléculaire des patients USH2 a été publié dans un article intitulé : Non- UH2A mutation in USH2 patients dans Human Mutation (Besnard et al. , 2012). A. Résumé de l'article Les 2 gènes minoritairement impliqués dans le syndrome de Usher, DFNB31 et GPR98, ont été analysés dans une cohorte de 31 patients pour lesquels l'étude du gène USH2A n'avait pas permis l'identification de mutations causales. Un autre gène lié au syndrome de Usher de type II, PDZD7, a aussi été analysé chez certains patients. Nous avons mis en évidence la contribution significative de GPR98 dans le syndrome de Usher de type II. Dix-sept mutations chez 10 patients ont pu être identifiées dans ce gène doublant ainsi le nombre de mutations connues. Les variations menant à un codon stop prématuré prédominent dans le spectre mutationnel de GPR98. Néanmoins, d'autres mutations ont été identifiées, parmi lesquelles, des mutations d'épissage. La validation de leur effet a été réalisée par analyse minigène. Seules 2 mutations semblent correspondre à des altérations faux-sens. L'implication de DFNB31 a été confirmée chez 2 patients. Ce nombre restreint de patients confirme la très faible contribution de ce gène au syndrome de Usher de type II. Un examen approfondi du phénotype clinique a été réalisé chez les patients sans mutation identifiée. Pour la plupart de ces patients, des caractéristiques atypiques ont été mises en évidence. Au final, les mutations dans ces trois gènes représentent la cause majoritaire chez les patients USH2 et leur analyse permet d'obtenir un diagnostic moléculaire fiable et efficace. B. Article RESEARCH ARTICLE OFFICIAL JOURNAL Non-USH2A Mutations in USH2 Patients Thomas Besnard, 13 Christel Vaché, 1 David Baux, 1 Lise Larrieu, 1 Caroline Abadie, 1 Catherine Blanchet, 4 Sylvie Odent, 5 Patricia Blanchet, 6 Patrick Calvas, 7 Christian Hamel, 4 Hélène Dollfus, 8 Geneviève Lina-Granade, 9 James Lespinasse, 10 Albert David, 11 Bertrand Isidor, 11 Gilles Morin, 12 Sue Malcolm, 13 Sylvie Tuffery-Giraud, 2, 3 Mireille Claustres, 13 and Anne-Françoise Roux1, 2 CHU Montpellier, Laboratoire de Génétique Moléculaire, Montpellier, France ; 2 INSERM U827, Montpellier, France ; 3 Univ, Montpellier I, Montpellier, France ; 4 CHU Montpellier, Centre National de Référence maladies rares Affections Sensorielles Génétiques, Montpellier, France ; CHU Hôpital Sud, Service de Génétique Médicale, Rennes, France ; 6 CHU Montpellier, Service de Génétique Médicale, Montpellier, France ; Hôpital Purpan, Service de Génétique Médicale, Toulouse, France ; 8 Centre de Référence pour les Affections Rares en Génétique Ophtalmologique (CARGO), Hôpitaux Universitaires de Strasbourg, Strasbourg, France ; 9 CHU Edouard Herriot, Service d'ORL, Lyon, France ; 10 CH Chambéry, Génétique Médicale, Chambery, France ; 11 CHU de Nantes, Service de Génétique Médicale, Nantes, France ; 12 CHU Amiens, Service de Génétique Clinique, Amiens, France ; 13 Clinical and Molecular Genetics, Institute of Child Health, University College London, United Kingdom Communicated by Andreas Gal Received 16 September 2011 ; accepted revised manuscript 28 November 2011. Published online 2 December 2011 in Wiley Online Library ( 10. 1002/humu. 22004 Introduction ABSTRACT : We have systematically analyzed the two Usher syndrome is the most common form of hereditary syn- known minor genes involved in Usher syndrome type 2, drome associating sensorineural hearing loss (HL) and retinitis pig- DFNB31 and GPR98, for mutations in a cohort of 31 pa- mentosa (RP). The prevalence has long been estimated to be 1 of tients not linked to USH2A. PDZD7, an Usher syndrome 17, 000 to 1 of 33, 000 but recent studies suggest a much higher fre- type 2 (USH2) related gene, was analyzed when indicated. quency of 1 of 6, 000 [Kimberling et al. , 2010]. This group of recessive We found that mutations in GPR98 contribute signifi- disorders is divided into three clinical subtypes defined according to cantly to USH2. We report 17 mutations in 10 individu- the degree of HL and the presence or not of vestibular dysfunction. als, doubling the number of GPR98 mutations reported to To date, nine causative genes have been identified (for review see date. In contrast to mutations in usherin, the mutational Saihan et al. , [2009]). spectrum of GPR98 predominantly results in a truncated Usher syndrome type 2 (USH2) is the most frequent form and protein product. This is true even when the mutation af- accounts for more than half of the cases (for review see [Petit, fects splicing, and we have incorporated a splicing reporter 2001]). Patients present with congenital moderate to severe HL minigene assay to show this, where appropriate. Only two and normal vestibular function [Abadie et al. , 2011]. RP usually mutations were found which we believe to be genuine mis- develops from the second decade on. Currently, three genes are sense changes. Discrepancy in the mutational spectrum known to be responsible for USH2 : USH2A (MIM# 608400), GPR98 between GPR98 and USH2A is discussed. Only two pa- (MIM# 602851), and DFNB31/WHRN (MIM# 607928). Although tients were found with mutations in DFNB31, showing USH2A has been extensively studied in terms of mutational screen- that mutations of this gene contribute to only a very small ing over the last 6 years, data on GPR98 and DFNB31 remain scarce extent to USH2. Close examination of the clinical details, (see LOVD-USHbases : where available, for patients in whom no mutation was montpellier/). USH2A is by far the most frequently implicated gene found in USH2A, GPR98, or DFNB31, showed that most and pathogenic mutations are identified in approximately 7580% of them had atypical features. In effect, these three genes of cases [Baux et al. , 2007]. The prevalence of mutations in each account for the vast majority of USH2 patients and their of the GPR98 and DFNB31 genes is as yet unknown. GPR98 (also analysis provide a robust pathway for routine molecular known as VLGR1) was first described as implicated in USH2 in diagnosis. 2004 [Weston et al. , 2004] with the identification of four causative Hum Mutat 33 : 504510, 2012. C 2011 Wiley Periodicals, Inc. mutations in five unrelated female patients. However, only a limited KEY WORDS : Usher syndrome ; GPR98 ; DFNB31 ; func- number of USH2-related deleterious mutations (n 17) is known to tional analysis ; molecular analysis date (see USHbases), possibly because molecular testing of this gene, which contains 90 exons remains challenging and cannot be offered routinely. The DFNB31 gene was first identified as being respon- sible for nonsyndromic deafness in two separate families [Mburu et al. , 2003]. Its involvement in Usher syndrome was demonstrated Additional Supporting Information may be found in the online version of this article. by Ebermann et al. [2007], in a family presenting with typical USH2 Correspondence to : Anne-Françoise Roux, Laboratoire de Génétique Moléculaire, syndrome. Because both identified mutations altered the N termi- CHU Montpellier, INSERM U827, IURC, 641 Avenue du Doyen Gaston Giraud, F-34093 nal portion of the whirlin long isoform, the authors suggest that Montpellier Cedex 5, France. E-mail : anne-francoise. roux@inserm. fr two PDZ(Post-synaptic density protien 95, Drosophila disk-large C 2011 WILEY PERIODICALS, INC. tumor supressor, Zona occludens-1 protien) domains, PDZ1 and tion was carried out with Agencourt CleanSeq on a Biomek 3000 PDZ2, involved with binding to other USH2 proteins (usherin and Laboratory Automation Workstation (Beckman Coulter, Villepinte, G protein-coupled receptor 98) are not only critical for auditory but France), following the manufacturer's recommendations or by us- also for retinal function. ing sephadex (Sephadex G-50 S, GE Healthcare, Vélizy, France). The three USH2 proteins belong to an Usher interactome. PDZ Sequences were run on an Applied Biosystems 3130xl Genetic Ana- domains of whirlin interact with the PDZ-binding motif of both lyzer (Applied Biosystems, Courtaboeuf, France) and analyzed with USH2 transmembrane (TM) proteins (G protein-coupled receptor the ABI Prism SeqScape V2. 5 software. 98 and usherin). These proteins are major components of the ankle- Nomenclature of the variants follows the HGVS ( link of the hair bundle of the hair cells cochlea [Michalski et al. , 2007] hgvs. org/rec. html) recommendations with nucleotide 1 corre- and play an anchoring role in the connecting cilium with the inner sponding to the A of the ATG initiation codon. Genotypes are given segment of the photoreceptors [Maerker et al. , 2008 ; van Wijk et al. , according to HGVS nomenclature. 2006]. About 20% of the patients referred to our laboratory are not linked to USH2A [(Baux et al. , 2007] and unpublished results), Large Rearrangement Identification which represents a significant proportion of unresolved cases. To Detection of large genomic rearrangements was performed on improve our diagnostic service we have tested the involvement of a custom designed CGH-microarray chip (12 135 k), as already GPR98 and DFNB31 genes and established the mutational spec- described [Roux et al. , 2011]. trum of these two genes. We show that similarly to USH2A, the whole GPR98 gene needs to be screened. We also confirm that, integrity of the N-terminal region (PDZ1 and PDZ2 domains) of In Silico Analysis the whirlin long isoform is crucial. We performed functional analy- sis to determine the outcome of the predicted aberrant pre-mRNA The pathogenic effect of missense variants was predicted as pre- splicing alterations. viously described [Baux et al. , 2007] following a multistep anal- Finally, because PDZD7 has been described as a contributor to ysis [Roux et al. , 2011] and is available in Usher Syndrome Mis- digenism in Usher syndrome and as a modifier of the retinal phe- sense Analysis (USMA) ( notype [Ebermann et al. , 2010], its involvement was tested where bin/USMA/USMA. fcgi). In addition, alignments of orthologs are applicable. accessible in USMA. Prediction of a splice effect was tested using the Human Splicing Finder (HSF) tool which gives a position Weight matrices-derived Patients and Methods scores (HSF) for potential splice sites, and also integrates the results from the MaxEnt program [Desmet et al. , 2009 ; Yeo and Burge, Patients 2004]. Patients were recruited from all over France. All patients were referred with a clinical diagnosis of Usher type 2 based on the degree Splicing Variant Analysis of HL and RP. In most cases, audiograms and electroretinograms The potential impact upon splicing of missense and intronic un- were provided. known variants was functionally established as previously described When possible, blood samples of relatives were collected and used [Le Guédard-Mereuze et al. , 2010] and using the pSPL3 exon- for linkage and segregation analysis. trapping vector [Bottillo et al. , 2007]. Briefly, patients' genomic This study was approved by the local Ethical Committee and DNA was used as a template to generate wild type and mutated in- consent to genetic testing was obtained from adult probands or serts with the Phusion R High fidelity DNA polymerase (Finzymes, parents in the case of minors. Espoo, Finlande). Amplified products were cloned between the NheI and XhoI restriction sites of pSPL3 vector. Ligation was obtained with In-Fusion R Dry-Down PCR cloning kit according to manu- Haplotype Analyses of the USH2 Genes facturer's instructions (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, France). Microsatellites markers were developed at the three different Constructs were transiently transfected into HeLa cells and total USH2 loci : USH2A (USH2A gene), USH2C (GPR98 gene), and RNA was extracted 48 hr after transfection ; Reverse Transcription- USH2D (DFNB31 gene) (see Supp. Fig. S1). Most of the markers PCR(RT-PCR) and vizualization of splicing alterations were per- correspond to Genethon markers. However, some additional intra- formed as already published [Le Guédard-Mereuze et al. , 2010]. genic markers were identified in the laboratory at the USH2A locus in introns 13, 52, and 70 of the gene, which proved to be more informative. Their primer sequences are listed in Supp. Figure S1. GenBank Numbers GenBank reference sequences : GPR98 : NM 32119. 3 ; DFNB31 : NM 015404. 2 ; PDZD7 : NM 001195263. 1. PCR Sequencing of the Genes UNIPROT : G-protein coupled receptor 98 : Q8WXG9 ; Whirlin : Primers were designed to amplify all the coding exons and their Q9P202. flanking intronic sequences of the GPR98 (90), DFNB31 (12), and PDZD7 (16) genes. They are listed in Supp. Table S1. Most of them Results amplified with a uniform PCR condition on a single 96-well plate (adapted from [Roux et al. , 2006]). The same primers were used Among the 31 patients analyzed, a likely pathogenic genotype for sequencing, except in a few cases, for which new design of in- was identified in 12 of them, 10 in GPR98 and 2 in DFNB31 ternal primers improved the sequence quality. Sequencing purifica- (Table 1). HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 3, 504510, 2012 505 Table 1. Pathogenic GPR98 and DFNB31 Genotypes and Clinical Findings in USH2 Patients Patient Degree of HL Onset of RP (years) Ophthalmologic findings Genotype GPR98 U229 Moderate 17 Typical RP c. [T] ; [3635-G] U347 Severe 20 ND c. [7770delC( ; )17204 4 17204 7del] U361 Severe 47 Rod-cone dystrophy c. [3945dupA] ; [G] U380 Moderate 35 Typical RP c. [10935 10938del( ; )C] U416 Moderate 13 Typical RP c. [17668 17669del( ; )17020- ? 17856 ? dup] U457 Severe 30 ND c. [13320dupC( ; )16940delT] U734 Severe 40 Typical RP c. [T] ; [13232-G] U787 Moderate 35 Typical RP c. [T( ; ) ? ] U831 Moderate 20 Typical RP c. [2984 2988del( ; )2984 2988del] U919 Moderate 35 ND c. [G] ; [G] DFNB31 U797 Moderate 30 Typical RP c. [680dupG] ; [737delC] U922 Moderate 30 Typical RP c. [737delC] ; [737delC] HL, hearing loss ; RP, retinitis pigmentosa ; ND, not documented. Sequencing was performed in the three USH2 genes for all the listed patients with the exception of U734, U831, U797, and U922. For these four patients preliminary haplotypes analyses were performed for the three USH2 loci. Exclusion of USH2A and USH2D loci. Exclusion of USH2A and USH2C loci. Homozygosity identified for the targeted locus. GenBank accession numbers : GPR98 : NM 32119. 3 ; DFNB31 : NM 015404. 2. Clinical findings are indicated for each patient. Patients were mainly Caucasians ; U831 and U922 were of Turkish and Portuguese origin, respectively. Table 2. List of Likely Pathogenic Variants Identified in the GPR98 and DFNB31 Genes Exon/intron Nucleotide exchange Predicted translation effect Classification Prediction of splice effect Allelic frequency GPR98 16 c. 2984 2988del p. (Leu995fs) Pathogenic No Intron 19 c. 3635-G p. ( ? ) UV4 Yes 20 c. 3945dupA p. (Gln1316fs) Pathogenic No 28 c. T p. (Arg1891 ) Pathogenic No 32 c. G p. (Leu2334 ) Pathogenic No 33 c. 7770delC p. (Glu2591fs) Pathogenic No 41 c. C p. (Met3014Ile)# UV4 Yes 52 c. 10935 10938del p. (Ser3646fs) Pathogenic No Intron 65 c. 13232-G p. ( ? ) UV4 Yes 66 c. 13320dupC p. (Ser4441fs) Pathogenic No 70 c. T p. (Arg4789Trp) UV3 No 0/176 78 c. 16940delT p. (Val5647fs) Pathogenic No 79 c. T p. (Arg5688 ) Pathogenic No Intron 79 c. 17204 4 17204 7del p. ( ? ) UV4 Yes 82 c. 17668 17669del p. (Met5890fs)# Pathogenic No 84 c. G p. (His5978Arg) UV3 No 0/170 7983 c. 17020- ? 17856 ? dup p. (Ile5674 Gln5952dup) UV4 ? DFNB31 2 c. 680dupG p. (Tyr228fs) Pathogenic No 2 c. 737delC p. (Pro246fs)# Pathogenic No For missense variants, allelic frequency was estimated in control chromosomes. Splicing alteration as demonstrated by further ex vivo splicing assays. # Already described (see USHbases). In 4 of these 12 families because consanguinity was documented GPR98 (U831, U922) or as several affected siblings were available (U734, U797), haplotype analyses had previously been performed at the Ten variants were considered a priori deleterious in GPR98 three USH2 loci to prioritize which gene to sequence (Table 1). as they predict a premature termination codon (PTC) leading to a Thus, GPR98 sequencing was prioritized in family U734 as USH2A truncated G protein-coupled receptor 98 (three nonsenses, five small and USH2D loci had been excluded in the three affected siblings, deletions, and two small duplications [Tables 1 and 2]). Three sub- while DFNB31 sequencing was performed directly for family U797 stitutions predicting so-called missense alterations were classified after exclusion in the three affected siblings of USH2A and USH2C as likely pathogenic after the multistep analysis already described loci. In the two consanguineous families U831 and U922, GPR98 and [Roux et al. , 2011] ; however, one of them lying at the last nucleotide DFNB31 were sequenced due to homozygosity revealed by haplotype of exon 41 (c. C) was eventually classified as a splicing alter- analyses at the USH2C and USH2D locus, respectively. ation (see below). 506 HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 3, 504510, 2012 Article 1 : Non-USH2A mutations in USH2 patients L'étude moléculaire de GPR98 In order to confirm these splicing predictions, minigene assays for 12 patients. For two patients, the clinical presentation may in- were carried out for the four variants and the results are presented dicate the possibility of another syndrome because of additional in Figure 1. clinical findings such as renal impairment (U583) or the presence In accordance with predictions, the presence of each variant re- of dysmorphic features (U607). sulted in an aberrant splicing pattern, and in all cases to the skipping of the corresponding exon (Fig. 1-1 to 1-4). For the two constructs affecting 3 ss, the use of either the de novo (c. 13232-G) or the exonic cryptic (c. 3235-G) acceptor sites was not detected Discussion (Fig. 1-3 ; 1-4). We have confirmed in this study that mutations in GPR98 account for a small but significant proportion of mutations in USH2, that is, In Silico Studies of the Missense Variants 6. 4%. On the other hand, mutations in DFNB31 account for a very small proportion (1. 3%). This is to our knowledge the largest study Two missense variants suspected to be disease causing have been offering exhaustive molecular analysis of USH2 patients. identified. c. T (p. (Arg4789Trp) has been shown to lie Mutations in GPR98 are of all types, including large gene rear- in trans to c. 3635-G and has not been found in 176 control rangements, and are spread throughout the gene, which additionally chromosomes. USMA analysis [Roux et al. , 2011] shows a global contains numerous polymorphisms, but in almost all cases lead to conservation in 19 of 20 orthologs (95%). The single di- a truncated protein product. As the gene contains 90 exons, this vergent protein sequence belongs to Anolis carolinensis (EN- represents a considerable diagnostic challenge. SACAP00000013363), which strongly differs from all others in this Although two patients were found in whom USH2 was caused by particular region. mutations in DFNB31, only two mutant alleles were identified as one The c. G (p. (His5978Arg) variation has been identified patient was homozygous for c. 737delC and the other patient was a in two unrelated patients, U361 and U919, in trans to c. 3945dupA compound heterozygote for the same allele plus c. 680dupG. It is, (p. (Gln1316fs) and to c. G (p. (Leu2334 ), respectively. It therefore, impossible to draw any conclusions about the mutational has not been found in 170 control chromosomes. USMA analysis spectrum in DFNB31. shows that the residue His is found in 16 of 17 ortholog sequences (including Homo sapiens). The presence of a divergent residue Glu is noted in Bos Taurus and includes a totally divergent alignment in this region. The mutated residue Arg at position 5978 lies in the first extracellular loop of the 7-TM domain of G-protein coupled Analysis and Outcome of the Likely Pathogenic Mutations receptor 98, the third TM region being predicted to begin at position (UV3 and 4) Identified in this Study 5980. Alignment of 237 sequences of 7-TM proteins shows that His Many of the predicted mutations in GPR98 could be deduced with is the major residue at this position (97 sequences, 40. 93%). Mutant some confidence as they predicted premature chain termination due residue Arg is found only once (0. 42%) in this alignment. to small frameshifts or single changes, but several alterations needed more care to analyze the predicted effect. This includes the large DFNB31 rearrangement, the splicing, and the missense alterations. The large rearrangement consists of a duplication of exons 79 Two patients were identified who carried an unambiguous to 83, identified by means of a CGH array, and predicts an in- pathogenic DFNB31 genotype. The two identified alterations frame duplication of 837 coding nucleotides, resulting in a protein were frameshift mutations predicting a truncated whirlin protein enlarged by 279 amino acids, from position 5, 674 to 5, 952. This (Tables 1 and 2). protein would contain a duplication of the entire G protein-coupled receptors (GPCR) Proteolysis Site (GPS), the first TMdomain, and part of the second. It is very likely that the extracellular structure of Polymorphisms the resulting protein would be strongly affected. Ex vivo splicing assays have shown that, in fact, the four tested In addition, among all patients, 87 (68 in GPR98 and 19 in alterations result in exon skipping. They all predict an out of frame DFNB31) variants were identified during this study, which could sequence and a PTC with the exception of c. 3635-G, which re- be neutral. Fifty-eight additional changes were classified as UV1 or sults in an in-frame deletion, predicting a protein lacking 248 amino UV2 (unclassified variants likely to be nonpathogenic) in GPR98 acids (positions 1213 to 1460). This deletion removed the region be- (55) and DFNB31 (3). They are all listed in USHbases. tween Calx-beta domains 9 and 10. It is difficult to speculate on the resulting changes, but the local structure is likely to be altered. Patients with no Mutation Unfortunately, in silico analysis of the two missense p. (Arg4789Trp) and p. (His5978Arg) is not complete due to the lack After exhaustive analysis of USH2A, GPR98, and DFNB31 or of appropriate three-dimensional models. Both missense show per- exclusion of their involvement by linkage, 19 patients remained with fect alignments with ortholog sequences with the exception of one no identified mutation. The coding exons of PDZD7 (considered to species in each case (Anolis carolinensis in the first and Bos Taurus be a potential candidate gene for Usher syndrome) were sequenced in the second case). Because the surrounding sequences diverge in but no pathogenic mutations were identified. both species, the misalignment could be the result of an error in the A further assessment of the phenotype was performed (Supp. translation. In addition, p. (His5978Arg) arises in a well-conserved Table S3) and several atypical findings were highlighted in most position in the 7-TM domain. The fact that both missense lie in of these USH2 geno-negative patients, although lack of sufficient trans to deleterious changes, are absent from a control population, clinical detail was inconclusive for two patients (U767 and U603). and are conserved among orthologs is in favor of their involvement Atypical audiological and/or ophthalmologic impairment was noted in the disease. 508 HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 3, 504510, 2012 Article 1 : Non-USH2A mutations in USH2 patients L'étude moléculaire de GPR98 Usher gene is not to be excluded but is likely to either constitute Ebermann I, Phillips JB, Liebau MC, Koenekoop RK, Schermer B, Lopez I, Schafer a small minority or be the result of genotype/phenotype variation. E, Roux AF, Dafinger C, Bernd A, Zrenner E, Claustres M, Blanco B, Nurnberg G, Nurnberg P, Ruland R, Westerfield M, Benzing T, Bolz HJ. 2010. PDZD7 is a For example, mutation in the Myo15 gene (whose human ortholog modifier of retinal disease and a contributor to digenic Usher syndrome. J Clin is MYO15A) is known to be involved in mainly profound deafness, Invest 120 : 18121823. but has recently been shown to cause an Usher-like phenotype in Ebermann I, Scholl HP, Charbel Issa P, Becirovic E, Lamprecht J, Jurklies B, Millan rats [Held et al. , 2011]. JM, Aller E, Mitter D, Bolz H. 2007. A novel gene for Usher syndrome type 2 : mutations in the long isoform of whirlin are associated with retinitis pigmentosa Next-generation sequencing (NGS) of whole genome, exome, or and sensorineural hearing loss. Hum Genet 121 : 203211. targeted regions is becoming more cost effective [Choi et al. , 2009 ; Held N, Smits BM, Gockeln R, Schubert S, Nave H, Northrup E, Cuppen E, Hedrich Lim et al. , 2011]. More mutations will be found, categorized and HJ, Wedekind D. 2011. A mutation in Myo15 leads to Usher-like symptoms in put into the databases and indeed NGS will have a role in solving LEW/Ztm-ci2 rats. PLoS One 6 : e15669. these atypical Usher cases efficiently. Sequence capture of Usher Kimberling WJ, Hildebrand MS, Shearer AE, Jensen ML, Halder JA, Trzupek K, Cohn ES, Weleber RG, Stone EM, Smith RJ. 2010. Frequency of Usher syndrome in exome is currently being developed and could be implemented in two pediatric populations : implications for genetic screening of deaf and hard of routine diagnostics for any Usher patient in the future. As well, hearing children. Genet Med 12 : 512516. whole exome sequencing will make a contribution to identify as yet Le Guédard-Mereuze S, Vaché C, Baux D, Faugère V, Larrieu L, Abadie C, Janecke A, uncharacterized Usher genes. Claustres M, Roux AF, Tuffery-Giraud S. 2010. Ex vivo splicing assays of mutations at non-canonical positions of splice sites in USHER genes. Hum Mutat 31 : 347355. Overall, a total of 176 USH2 patients has been investigated in our Lim BC, Lee S, Shin JY, Kim JI, Hwang H, Kim KJ, Hwang YS, Seo JS, Chae JH. laboratory, in either USH2A [Baux et al. , 2007] and unpublished 2011. Genetic diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy using next- data, or in the other USH2 genes (this study). The USH2 mutation generation sequencing technology : comprehensive mutational search in a single detection rate has now been raised to 89. 2% (157/176) in clinically platform. J Med Genet 48 : 731736. diagnosed USH2 patients, which is quite similar to that of USH1 Maerker T, van Wijk E, Overlack N, Kersten FF, McGee J, Goldmann T, Sehn E, Roepman R, Walsh EJ, Kremer H, Wolfrum U. 2008. A novel Usher protein network patients [Roux et al. , 2011]. Interestingly, most patients remaining at the periciliary reloading point between molecular transport machineries in with an uncharacterized pathogenic genotype, present with a ques- vertebrate photoreceptor cells. Hum Mol Genet 17 : 7186. tionable clinical Usher diagnosis. These observations could only be Mburu P, Mustapha M, Varela A, Weil D, El-Amraoui A, Holme RH, Rump A, Hardisty done a posteriori and in these terms, we believe that our work is very RE, Blanchard S, Coimbra RS, Perfettini I, Parkinson N, Mallon AM, Glenister P, Rogers MJ, Paige AJ, Moir L, Clay J, Rosenthal A, Liu XZ, Blanco G, Steel KP, helpful to clinicians and diagnostic laboratories in their practice. Petit C, Brown SD. 2003. Defects in whirlin, a PDZ domain molecule involved in stereocilia elongation, cause deafness in the whirler mouse and families with DFNB31. Nat Genet 29 : 29. Acknowledgments Michalski N, Michel V, Bahloul A, Lefevre G, Barral J, Yagi H, Chardenoux S, Weil D, Martin P, Hardelin JP, Sato M, Petit C. 2007. Molecular characterization of the This work has been supported in part by le Ministère de la Recherche PHRC ankle-link complex in cochlear hair cells and its role in the hair bundle functioning. National 2004, PROM 7802. The authors are grateful to UNADEV and J Neurosci 27 : 64786488. Petit C. 2001. Usher syndrome : from genetics to pathogenesis. Annu Rev Genomics SOS Rétinite foundations for their support. Hum Genet 2 : 271297. Roux AF, Faugere V, Le Guedard S, Pallares-Ruiz N, Vielle A, Chambert S, Marlin S, Hamel C, Gilbert B, Malcolm S, Claustres M. 2006. Survey of the frequency References of USH1 gene mutations in a cohort of Usher patients shows the importance of cadherin 23 and protocadherin 15 genes and establishes a detection rate of above Abadie C, Blanchet C, Baux D, Larrieu L, Besnard T, Ravel P, Biboulet R, Hamel C, 90%. J Med Genet 43 : 763768. Malcolm S, Mondain M, Claustres M, Roux AF. 2011. Audiological findings in Roux AF, Faugere V, Vache C, Baux D, Besnard T, Leonard S, Blanchet C, Hamel C, 100 USH2 patients. Clin Genet Mondain M, Gilbert-Dussardier B, Edery P, Lacombe D, Bonneau D, Holder- Baux D, Larrieu L, Blanchet C, Hamel C, Ben Salah S, Vielle A, Gilbert-Dussardier B, Espinasse M, Ambrosetti U, Journel H, David A, Lina-Granade G, Malcolm S, Holder M, Calvas P, Philip N, Edery P, Bonneau D, Claustres M, Malcolm S, Roux Claustres M. 2011. Four year follow-up of diagnostic service in USH1 patients. AF. 2007. Molecular and in silico analyses of the full-length isoform of usherin Invest Ophthalmol Vis Sci 52 : 40634071. identify new pathogenic alleles in Usher type II patients. Hum Mutat 28 : 781 Saihan Z, Webster AR, Luxon L, Bitner-Glindzicz M. 2009. Update on Usher syndrome. 789. Curr Opin Neurol 22 : 1927. Bottillo I, De Luca A, Schirinzi A, Guida V, Torrente I, Calvieri S, Gervasini C, Larizza van Wijk E, van der Zwaag B, Peters T, Zimmermann U, Te Brinke H, Kersten FF, L, Pizzuti A, Dallapiccola B. 2007. Functional analysis of splicing mutations in Marker T, Aller E, Hoefsloot LH, Cremers CW, Cremers FP, Wolfrum U, Knipper exon 7 of NF1 gene. BMC Med Genet 8 : 4. M, Roepman R, Kremer H. 2006. The DFNB31 gene product whirlin connects Choi M, Scholl UI, Ji W, Liu T, Tikhonova IR, Zumbo P, Nayir A, Bakkaloglu A, Ozen S, to the Usher protein network in the cochlea and retina by direct association with Sanjad S, Nelson-Williams C, Farhi A, Mane S, Lifton RP. 2009. Genetic diagnosis USH2A and VLGR1. Hum Mol Genet 15 : 751765. by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. Proc Natl Acad Weston MD, Luijendijk MW, Humphrey KD, Moller C, Kimberling WJ. 2004. Mu- Sci U S A 106 : 1909619101. tations in the VLGR1 gene implicate G-protein signaling in the pathogenesis of Desmet FO, Hamroun D, Lalande M, Collod-Beroud G, Claustres M, Beroud C. 2009. Usher syndrome Type II. Am J Hum Genet 74 : 357366. Human Splicing Finder : an online bioinformatics tool to predict splicing signals. Yeo G, Burge CB. 2004. Maximum entropy modeling of short sequence motifs with Nucleic Acids Res 37 : e67. applications to RNA splicing signals. J Comput Biol 11 : 377394. 510 HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 3, 504510, 2012 Besnard et al. , Human Mutation 1 Supp. Figure S1. Schematic representation of microsatellite markers at each USH2 Locus Asterisks indicate new markers. *1 CAGGAATTAGAATGCTTCC / CTGGTGGTAGAATTATAAAC ; *2 GTCCCTACAAAATGTGTTC / GGATTCTATTGAATCAAGATG ; *3 CCGCACCCGGCCTCACTATG / GGCAGCATCAGTCCATGTTTGG Scale is not conserved between the different loci Besnard et al. , Human Mutation 2 Supp. Table S1. List of PCR and Sequencing primers GPR98 Exon Primers PCR Forward Primers PCR Reverse Primers SEQ Forward Primers SEQ Reverse E01 CATGGGTCCTATTGGAGCAG CAGCTATGCCCCATTACCC E02 CGTCACATATTTGAGTTTGATGG AAAATGGAATAGCATTATCTGCAA GAAACGTCATATCTATTTCAG E03 CTGGCCTGGAATCATTTGTT CCACCACCAGTTATCTGAATTG E04 GTTCCAGTACCTTCAATAGCATAGG CAAGCGTCCTCAATTCACAA E05 TGGATTGATGTGTCTGTGGAA AGCTACTCGGGACTCTGAGG E06 GAAGGGCAGAATGATGTATGG TATAGCTGAGGTGCGACTGG E07-A GCCTTTCTATTTGCTCCCTCA GCAATCTCCGGTATGGTGTC GTTTTGGCTGTTGATGTTTTGC E07-B CCCGTGAGATTCCTTCAGAG CAACACCACAAAACTTAAATCTGG E08 GGACAACTTGACATTGGGAAA AGCCAGTGTTTTTCCTGTCC E09 TGTTTTTGGTTCATCTTTTGCT TGACGGCAAAATAACAAGGTC E10 GGGATGGTGAATGAGAGAGG GAAGGCTTCTTGTACATGCTGA E11 AATGCATTTAATAGTTCGCTTCTC CAGAAAAGTCTGAAGGCCAGT CAAAGTTATTGAAGAGAACTC E12 ATTGCCTTAAAAGCCTGCAA CCTGTCTCTTTGCCAATATTCAA E13 E14 CCACCTCTTTTGTCCTTTCAG AGGCAGGGTGAGCAACTAGA E15 CAGAGGGAGGAACAGGCTAA TGCTCTTCTGGTTTATGGTCAG E16 AAGTTCTGCCTCCGAAAAGG GCATCAATTGTGCTTTATTGAAA E17 CAGTACAAGGCTTCTCTCTTGGA TGTAGTTAGGCCCTACTTGTCCT E18 CCTTCAGTGAGGAAATTCTTGC CCACTCATTCAGACTGCCAAC E19 CATAGTTTGCCTCGTAGAACCA CACCAATTGCATTTTGTATATGG E20-A GCCACATGGTGACACTACTTTTC GGGCATTACCCAAGCTGAG E20-B CAGTGGAACGGATGCTTTG GGACAGAATTTCTCATTATCTTGG E21 TTGTCTTACTTTCTGAATCACACG CCAAATGAAAGAAAGCCGAGT E22 GAATGCAGAGGCCTCGTTAG AATGGGAAGCGACACTTCAA E23 TGCAGAAATAAGTCGTAAGTGGT GAAGGCATTCTACTTCCGTCA E24 CAGAATTTTGGCCTGGTGAT CCAGGTACAGTGTATATCCCTTCC E25 TTTGGGATATAACAAACATTCTGA CTTTCAGGCTGCTCTCTTCAA E26 TTTCCTCTTTGCTTGATATGTTTT GGTGACTACAACATGAAGGAAATC E27 TCAATGAATGGAAGGACTCTTTT TCATTCCCCTCAGCCTACAC GTTGGAACTTGTTCATGCAG E28-A TGCCTGCAGCAGTCTTGTAG TGTTGCATATGAGACAAGGACTTT E28-B TGATCCATATGGGATATTCATTTT TGTGTCTGGCTTCCAGTTACC E29 TCTTGCTGAGGTTTCTTGATGA TGCAACTTTGAGAGGCTGTG E30 GGCATAAAAGTCTTCTTGCTTAGA TCAGATCAATTCTGAGTCTCCAA E31 CCACTATAGGATGGTGCTTGG ATTTATTTGACATCCTCTCCAAAA E32 CATTCCATTTTGTTCTTGTACTTG GCAATGCATTTCTGGGGTTA E33-A GACCACAGTCAGCATTCCTCT TGCGAATTCATCACCTTCCT E33-B TCTTTTTAGTGGTCAGGCTGTG TGATGACTTTACTGGGGCAAC E34 CATAGAAATTATTTTGGGCCTTTC AAAGCCTTCTCCCAAAGAAGTT E35 GCTGTAATAGTTGCATGCTTGG TCAAGGCAGAGGGTAATATTGG E36 CTGTCTGCTTGGAGCTTAGGTT AAAACGTTTCAGGGCTTCTTTC E37 AGGCTATGTTTCCAGCGATT TTAGCAATGGCTTTCATCCA E38 GGTGCTTTTAGGAAAGGCAAA GACTCTTCCATCAATTTCTACCTTC GAGTTTTACCTCAAGAATGG E39 AGTGGTTTCATGTGGGTCAAC AGCACAATGATCACTTCTGATTC E40 TCAAAGGGACTGTCTTTAAATCCT GGGACCTAAATCACTGTAATTCTC E41 E42 CCAGCCCCCTCTTAATTTTT GCACAGAAAACCACCAAGACT E43 GGCCTAGTTTTCAATTAGACATCC AATTTTTCCAGTTGCGCTTTATAC E44 ACCTGAAACAGATGTAACCATCAC CCCAGTTAGGAGAGTAACTGGTCT E45 CTTATCATCTCATCTTGGATTGTG GCCCAGCCTCAACACATATT E46 TCCCACTTGTGTCTTTTCACAC AACCAATATTAAAGGCCTCACAAG E47 CAGGGGATTTTTATTCCAGTTG CCCCGGATTAAGATACTTTGC E48 TGACACTTAGTTATGTGTAGCTTGG CAGCAGACCATACCTTTGGTAA CCACTTCATTTTAAAAGAATC E49 TAAGGGAGAGAGCAGCAAGG CTCAAAAATCCATTTACAGCTGAC E50 TGGACTAAATGGATTCTGAGGAA CCAGTGTCTGGCAATGTGAT Besnard et al. , Human Mutation 3 GPR98 Exon Primers PCR Forward Primers PCR Reverse Primers SEQ Forward Primers SEQ Reverse E51 ATTTTGCTTTGGAACCGATG GGTTTGGAAGAATCACAACATTTC E52 GAAATGTTGTGATTCTTCCAAACC AGGGAGAGAGGCTGATGACA E53 CCACAAAGTTTGCAAATCCA GGTCAAACTCAAACACTTCATCC E54 TCCTTTTTCCTAACAATCTTCCA TGACCTGCCAAACTGAAAAA E55 TGATCCTTGGGAGTATACATTGTC TGGGTGGCAACAGTAGAATACTTA TCACATTCTTTGCAGCCTTG E56 GCCCATTCCTGTGAACAAAG TGGTCTAGCCCAAAGAGACC CAGGATGACCTTCCTGAATTG E57 AGAGTTCAGAAGACCTTTTATGCAT GGGTTCAGAAAAGGGTAAGATTG E58 ACTGTGATTACATTATTTCTTTCCTC CTGGCCAAGACTTCCAAAAC CTTTCATAGGTTACTGCAATG E59 CTAGGAATAGAAAGTGGGATTTGG ACTACTTGAGGCAGCAGGGTA GTTTGGCCTTACTGAATTTTC E60 AGCTGCAACTCGTAATTCTAGTGA CCTGTCCATTTTTGTAACTACGG E61 TCAATGTGCTTCAGAGTCATAGG CCCAAATTTGTTCTCCTCTCC E62 TTGGAACTTTAAGACTTCCTTTGG TCTCCCCAATCTCCATTGTC E63 GAGTGGGAATGAGGAGGAGA AAACGTTCTATTTACCAGGATTGTG E64 AACACAATCCTGGTAAATAGAACG GGAAAGAACTGCTTTAGAGCTCAG CGTTTAGTTACAGACAGTATTGTCTGG E65 TCATTGGGAGCAACACAGAA CAGGCTTGTTCCTAACATTGC E66 CAGGGAGAATGCCAATGC TATGCAACCACATCGTCTCC E67 GACCAATTTGGAAAATGACTGG CTGGCTCAAAAGCTGCTGTA E68 CACACCCAGCTGCAAATATC ACCAAAAAGTTTGACCCTTCAG CTTAATACTAGATACCCTGAAATAG TTCTGATAAATCCATGAAATCCAC E69 CTTTCATTTCCTCAGCTTCTCTG AGAACATGCAGTTTCCCTGTC E70-A GTTTGGCTTTGAATATAGTGATGC ACAGGGCAAATACTCCATGTG GGTGCAATATACTGAATTATATAAC E70-B GTAGAGGGAGGAGCCGAACT CTAAACATTTTCGAGGGCATTT E71 GGCATTATGCTAATGGCTCAA AAGAGTCTCCGTCCTTCCTGT E72 GGGAAAGTTTACGTTTAACCCATT TCCAGAATAAGGATAACCCAAGA GAGAGAAATAAAATACTCTAAGCATG E73 GTAAACAGGGACCGAAAGCA TAAGAGCCACCTCCCTCTCC E74-A TGAAATGGCACGTCATTGTT GTTGTCTCGGGGAAGGAAAT E74-B TCCAAACTGAGGTTGATTTTGA CCGAAAGTTTTAACTGTTATGCTG E74-C TTGGGCCATCCATTGTTTAT TCATGGGTCCATGCTACAGA E75 CCATCTGAGCTGGCAAGATT GCCCTCCACCATTGTATGAA E76 AAGAAAACCACATAAGCCCTGA CCTGTTGTCGGCAAAGAGAT E77 GAAGCTCGCCCAGAGAAAG AAAGTGAATTACGATGTTATCCTCAG E78 TTTAGGACAAGATCAGAGGTGTCA AGAATGTGATTTTGGTTTTACTTGG E79 TGATTACTTATGCCTTTTCAACTGC CAACTTTCCAAGTGGTACAATGC E80 CTGCTTCTGGGTTTGTTGTG TCACCATGTGTAGCACTTACCA E81 AACCAATCAGATGTCCTGCAT GGCCACCATCTATGCTCAGT E82 TGGACAAGATGTTCCCTTCA CGGTATGTTTGCATCTTGCAT E83 GGCAGACCTGACATGCCTA CTGTCCCCATTCTCTTCCAC CCAAAGATTCTTGCTATGATGC E84 CAGTTTGGGCAAGAAGTCAAC TCCTGAGAATGCAGTGATGG E85 TTGTTGGTCGGTAACATTGC TCCTGGTACTTATTCAATCACAGC E86 TTGCCAGCATCTGGATACAA GAGCCGAACTTCCCTCTTTT E87 TGTTCTCTCAAAATGGGCACT TTCACCTGTGTGTGGATGCT CTAGAAATTCCACTGATTTTATATC E88 CCATGTTTATTCTTCAGCTACGG AGGTGGAGAGCCTGTCAATG TGCAGGGACTTTATGTTTTC GACAGAGAATGAAAGGGCAAG E89 GAGGCAGAGATCAATTGTCC TCAGGATGTGCTAAGGGTGA E90-A AGCAGTGAATTTTCAGGTCACA GAGAACCCAAATGTGTGTCTTTAG CACAGGGTGCTTGTCATCAT E90-B ACCATTCGACTGAGCACACTT DFNB31 Exon Primers PCR Forward Primers PCR Reverse Primers SEQ Forward Primers SEQ Reverse E01-A GTCTCTCAGGAACCCGCCGACG CCAGACGAAGCATGGGCAGCAG E01-B GCCTGAACGCTTACCACGCGCG GGACACACAGCATGGAGTTAC E02 GGTCTGGGCCAGGGGAGGGTG GCTCTGCTGTTCTGGGTTCGG E03 GCCTGCTGTCCCCGGAAGG GGTGGAGTGCTGATTGCTCTGC E04 GGCTGTGAAGTCCCTAGTGTG GGCGGTGGAGGGATGGGAGGC E05 GCCACGATGCATGGTTCTCTTG GGCTGCCCAGTTGGAATGAGG E06 GACAGGATGGAAGGGCAGAGG GGTTCTCAGCAAAGGAGCGGG Besnard et al. , Human Mutation 4 DFNB31 Exon Primers PCR Forward Primers PCR Reverse Primers SEQ Forward Primers SEQ Reverse E07 GCCAGTCCTTTGGGGGTAGCAG CGAACTCAGGCTGGTCTCACTCC E08 CCTCAATTTTGGTGTGCTGGAG CTGTGCCCTTTCTCCGTGGCTG E09-A GCACCACTCAGCTGCTCGGCC CCTTCACTGTGTCATCAGGTAG CTTGGAGCTGGGGTTGGCAGG E09-B GCACCACTCAGCTGCTCGGCC CCTTCACTGTGTCATCAGGTAG CCTGCCAACCCCAGCTCCAAG E10 GCCTCCATCTCCGTCACTGCC GGTCACTTGCCAAGCTGAGCC E11 CCCGACACAGGGCTGGAGCC GGAGTCGCAAAACCCTGGAG E12 GCCTGCTTGGCAGTGTTGGGAC CTGCCACCCTGGCCATGCAGCC PDZD7 Exon Primers PCR Forward Primers PCR Reverse Primers SEQ Forward Primers SEQ Reverse E01 GGAGCTCACACTTCTGAGAGGC* CCTGCCACCTCCCTGTGACTC* E02 CTTAGAAATGGGCTGACCTGC* GTCCCTGACAGCAGCATCC* E03 TGATTGAGAAGCTCAGTTTGACC TGGGAGAGCAGAGCTATTGG E04 AAGGCAACCCCCACTTTC GCCTCACTTGCTGACCATC E05 AACTGAGAATGGGGTCTG CTACCTTCTAGTGGCTGTG* E06 GAAGTTGAAAGTTTACTCCCATCC CTGGCCCTTTTCTTCTTCAG E07-A CAGCATTTCGGAGCAGCGGG* GTCTTGGGAGACTCAGAGAG E07-B GGTGGAGACCTGGTGCAG GTCTGAGCAGCCTGGAGCTTG E08 GGAAGAGGAACCGCACTCTCAC* CTCATGAGGAAACTGAGGCTC* E09 CCTCAGGGCCAGGCCTCTTG* CATACCATTCTAGCTGCCTG* E10 TAGGATTCTGCCCCAGGTAC CACTAGCCTCCTGGTGTCAAG* E11-12 GGAGAGATGAACAGGTCAG GGCTGGATAGGTCCCTACATGC GTGGACAAGAGCTTTCCTTC* E12-13 CTCCGGAACTGAAATCC E14-A CCTGGAGACTTGCCTTGAC* ACTGCAGTGGTGCCTGAAC TTCCTAGGCCCAGGCTTC E14-B CTGGCTGCTGACAGAACCC* E15 AAACATGTCTGGCTGGAAGC TTGGGGATGGGATTCTAGG GAGCCTTAATGACAGCTGAGG E16 GGGAGGAGTGTCCTCATGG List of primers used to amplify and sequence each exon with intronic flanking sequences. The two primers SEQ column list primers used to sequence the amplicon when they differ from the PCR primers. *indicates primers already described by Eberman et al. (2010) to sequence PDZD7. Each primer couple was checked with SNPcheck web tools GenBank accession numbers : GPR98 : NM 32119. 3 ; DFNB31 : NM 015404. 2 ; PDZD7 : NM 001195263. 1 Besnard et al. , Human Mutation 5 Supp. Table S2. in silico prediction of the splicing effect of the variants HSF MaxEnt Site Wt Mut Variation Wt Mut Variation Wt 94. 86 65. 91 -30. 52% 9. 45 1. 49 -84. 23% Intron 19 Acceptor c. 3635-G 3'SS Cryptic ( 12 nts) 86. 74 86. 74 - 3, 21 6, 12 90, 65% Exon 41 Donor Wt 84. 8 73. 78 -12. 99% 6. 6. 18 2. 21 -64. 24% c. C 5'SS Wt 89. 43 79. 14 -11. 51% 3 3. 78 -409. 52% Intron 65 Acceptor 11. 7 c. 13232-G 3'SS de novo (-2 nts) 48. 42 77. 36 59. 79% - - - Intron 79 Donor Wt 88. 47 67. 65 -23. 53% 9. 72 1. 3 -86. 63% c. 17204 4 17204 7del 5'SS SS : splice site ; Wt : Wild Type ; Mut : Mutated ; nts : nucleotides Supp. Table S3. Clinical findings in the 19 patients with no identified mutation in any of USH2 genes Onset of Ophthalmologic Degree of HL Additional findings Patient RP findings U277 Moderate 41 y Typical RP U377 Mild 15 y Rod-cone dystrophy Recordable ERG U436 Profound 43 y Macular degeneration Rod-cone dystrophy U452 Severe 4y Bulky cystoid macular edema U496 Moderate 16 y Typical RP Asymmetric U577 8y Macular impairment (profound /severe) U583 Moderate 40 y Arteriolar renal lesions (37y) U585 Moderate 17 y Typical RP Facial dysmorphy U607 Severe 3y Flat ERG at 3 years Strabism U654 Moderate 29 y Typical RP Moderate to U767 12 y ND severe Predominant central U785 Severe 6y visual impairment U838 Moderate 14 m Flat ERG at 14 months Progressive HL U855 Severe 9y Delay in walking age Balance disorders U670 Mild 28 y Typical RP U728 Mild 44 y Albescent RP Unilateral hyporeflexia U498 Mild 56 y Typical RP (neurovascular conflict in acoustico-facial bundle) U603 Moderate 40 y ND U391 Moderate 28 y Typical RP HL : hearing loss ; RP : retinitis pigmentosa ; ERG : electroretinogram ; ND : not documented. ; y : years ; m : months. Most of patients are Caucasians, U585 is of Moroccan origin. Analyses complémentaires Analyse moléculaire de GPR98 III. Analyses complémentaires A. Analyse moléculaire de GPR98 Le Figure 7 (page 28) reprend l'analyse des patients présentés dans l'article. Il inclut également 4 patients supplémentaires, analysés dans GPR98 et DFNB31. Des altérations dans USH2A avaient été identifiées préalablement chez trois d'entre eux, U655, U692 et U654. U655 et U692 étaient porteurs, dans USH2A, d'une mutation délétère (PTC ou grand réarrangement) et d'un VSCI qui n'avait pas permis de conclure de façon certaine à l'implication du gène. Si l'analyse de GPR98 et de DFNB31 n'a pas détecté de mutations délétères, elle a pu néanmoins conforter l'hypothèse de l'implication du gène USH2A. U654 présentait quant à lui, un seul variant faux-sens après analyse USH2A. Aucun variant susceptible d'être pathogène n'avait pu être mis en évidence lors de l'analyse des gènes GPR98 et DFNB31. En revanche la mise en place du NGS (développée dans la partie III) a permis l'identification d'une mutation troncative USH2A c. A (p. W3955*) en trans de l'altération initialement identifiée. Enfin, bien qu'initialement référé avec des signes cliniques compatibles avec un USH2, U806 était exempt de toute variation pathogène dans l'ensemble des gènes USH2 (PDZD7 inclus). Une évaluation plus approfondie du phénotype et des audiogrammes a montré chez ce patient une perte d'audition particulièrement importante dans les fréquences aiges (>100dB pouvant être également retrouvée chez des patients USH1 atypiques. De ce fait, l'analyse a été étendue aux gènes USH1, et a permis d'identifier deux mutations délétères dans le gène USH1C (c. 238dup, p. R80fs et c. T, p. E801*). Analyses complémentaires Analyse moléculaire de GPR98 Tableau 7 : Analyse des gènes USH2 Famille USH2A GPR98 DFNB31 PDZD7 1 mutation hétéro U380 - - na 1 UV4 hétéro sans ség 1 mutation hétéro U361 - - na 1 UV3 hétéro en trans 1 UV4 hétéro U229 - - na 1 UV3 hétéro en trans 1 mutation hétéro U416 - - na 1 dup79-83 hétéro sans ség U457 - 2 mutations hétéro sans ség - na 1 mutation hétéro U347 - - na 1 UV4 hétéro sans ség U831 - 1 mutation homo - - 1 mutation hétéro U734 na na na 1 UV4 hétéro en trans 1 mutation hétéro U919 - - na 1 UV3 hétéro en trans 1 mutation hétéro U787 - - - 1 UV2 hétéro en cis 2 mutations hétéro U797 na na na sans ség U922 na na 1 mutation homo na 1 UV3 hétéro U496 - - - 1 UV2 hétéro en trans U466 1 mutation hétéro 1 UV2 hétéro na - U391 - 1 UV3 hétéro - - U583 - - - - U452 - - - - U436 - - - - U607 - - - - U767 - - - - U470 - - - - U785 - - - - 1 INC hétéro U377 - - - p. Ser556Ile U577 - 2 UV2 hétéro sans ség - - U838* 1 UV2 hétéro 4 UV2 hétéro sans ség - - 1 INC hétéro U585 - - - p. Lys451Lys U855 - - - - U603 - - - - U498 na - - - U728 - - - - U670 1 UV2 hétéro - - - Autres patients 1 mutation hétéro U655 - - na 1 VSCI hétéro en trans 1 del5-10 hétéro U692 - - na 1 VSCI hétéro en trans 1 mutation hétéro U654 - - - 1 VSCI hétéro en trans U806* - - - - Seuls les variants non considérés comme polymorphismes ou UV1 sont répertoriés dans ce tableau : ség : ségrégation familiale ; homo : homozygote ; hétéro : hétérozygote ; - : aucune variation susceptible d'être pathogène n'a été mise en évidence ; na : non analysé Analyses complémentaires Analyse de GPR98 dans une cohorte espagnole Spectre mutationnel de GPR98 Cent vingt-neuf variations différentes ont été mises en évidence sur l'ensemble des patients séquencés dans GPR98, soit une moyenne de 35 variations par patient (Tableau 8, page 81). Selon notre arbre décisionnel de classification de variants, 77 ont été directement considérés comme neutres, 35 ont été classés comme potentiellement ou probablement non pathogènes (respectivement UV1 et UV2) et 17 comme probablement pathogènes (UV3, UV4 et mutations) (cf classification développée dans la publication). Le pourcentage de variants faux-sens susceptibles d'être pathogènes par rapport au nombre total de faux-sens identifié dans le gène est de 12% (4/34) pour GPR98 alors qu'il est de 50% (65/129) pour USH2A. De plus, lorsque l'on étudie le rapport des variants faux-sens non pathogènes par rapport à l'ensemble des variants non pathogènes, le pourcentage est de 27% pour GPR98 (30/112) contre 39% pour USH2A (65/167). Bien que la taille des cohortes soit très différente, la comparaison de ces proportions laisse d'ors et déjà supposer une moins grande tolérance à un changement d'acide aminé dans USH2A par rapport à GPR98. Tableau 8 : Répartition des variants GPR98 par type et par classe de pathogénicité Faux-sens Isosémantiques Introniques Autre Total Polymorphisme 21 13 43 0 77 UV1 8 4 9 1* 22 UV2 1 3 9 0 13 UV3 3 0 0 0 3 UV4 1 0 3 0 4 Mutation 0 0 0 10* 10 Total 34 20 64 11 129 *variation dans la région 3'non traduite ; * variations exoniques menant à un PTC B. Analyse de GPR98 dans une cohorte espagnole Au cours de l'année 2011, Gema Garcia-Garcia étudiante effectuant ses travaux de thèse au laboratoire de génétique de Valencia (Espagne) sous la direction du Dr José Mara Millán, a rejoint le laboratoire pour analyser le gène GPR98 dans une cohorte de patients USH2A- négatifs d'origine espagnole. La sélection de cette cohorte était basée sur des critères similaires aux nôtres, à savoir une classification phénotypique USH2 couplée à une étude non concluante du gène USH2A. L'analyse de 19 patients a mis en évidence l'implication de GPR98 chez 7 d'entre eux. Cette étude a aussi confirmé la répartition du spectre mutationnel du gène GPR98, puisque seules des altérations conduisant à des PTC ont été identifiées. Ces résultats auxquels j'ai contribué sont en cours de révision dans Molecular Vision : The contribution of GPR98 and DFNB31 genes to a Spanish Usher syndrome type II cohort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A ce jour, 11 études ont décrit des mutations pathogènes ou des variations probablement pathogènes, impliquées dans un syndrome de Usher ou une pathologie associée. Au total 51 altérations distinctes ont été identifiées (Tableau 9, page 96). Les études que nous avons menées sur des cohortes françaises et espagnoles ont permis la mise en évidence de plus de 40% des mutations actuellement connues pour ce gène. Tableau 9 : Publications des mutations GPR98 Nombres de nouvelles Auteurs Pathologies altérations pathogènes Weston et al. 2004 4 USH2 (Schwartz et al. , 2005) - USH2 (Hmani-Aifa et al. , 2009) 1 USH2 (Hilgert et al. , 2009) 1 USH2 (Ebermann et al. , 2009) 4 USH2 (Ebermann et al. , 2010) 1 USH2 (Bonnet et al. , 2011) 7 USH2 1USH3 (Le Quesne Stabej et al. , 2012) 10 USH2 (Besnard et al. , 2012) 16 USH2 (Neveling et al. , 2012) 1 RPNS (Garcia-Garcia et al. en révision) 6 USH2 Total 53 1. Répartition des altérations Dans l'ensemble des études publiées (incluant Garcia-Garcia et al, en révision), parmi les 51 variations pathogènes différentes décrites dans GPR98 on identifie 23 substitutions, 26 petites indels (20 délétions, 5 duplications, 1 insertion-délétion) et 2 grands réarrangements (1 duplication et 1 délétion). La Figure 23 (page 97) permet d'observer que 35 de ces variations entranent l'apparition d'un PTC, 6 autres variants sont suspectés d'altérer l'épissage et 8 correspondent à des altérations faux-sens. Il a souvent été noté un nombre élevé de faux-sens pathogènes dans certains des gènes Usher. En revanche, dans GPR98, le taux de variations faux-sens par rapport à l'ensemble des mutations décrites est d'environ 16% (8/51) contre 37% pour USH2A et 38% si on Analyses complémentaires Bilan des altérations du gène GPR98 considère l'ensemble des gènes Usher (issus de LOVD USHBases). Combiné avec l'aspect privé ou peu fréquent de ces mutations, ainsi qu'avec la taille des gènes étudiés, ces particularités rendent compte de la difficulté de l'analyse moléculaire chez ces patients. La faible proportion de faux-sens pathogènes retrouvés dans GPR98 permet toutefois une interprétation plus simple des variants inconnus identifiés. Figure 23 : Répartition de l'ensemble des variants GPR98 considérés comme pathogènes Si on considère la répartition intragénique de ces variants, on observe que 44 variants sont exoniques (86%), 5 sont introniques (10%) et 2 correspondent à des grands réarrangements (4%). Cette répartition est très similaire à celle calculée sur l'ensemble des bases de données LOVD USHBases tous gènes confondus. A ce jour, très peu de récurrences mutationnelles ont été rapportées pour ce gène. En effet selon les données LOVD USHBases, aucune mutation n'a été identifiée dans plus de 4 familles distinctes (c. T, p. Gln2301*). Cela constitue une différence supplémentaire avec le gène USH2A, dans lequel la mutation c. 2299delG (p. Glu767fs) est connue pour avoir un effet fondateur et est présente chez 10 à 20% des allèles mutés (15% des allèles mutés USH2A de notre cohorte). Analyses complémentaires Bilan des altérations du gène GPR98 2. Implication des gènes USH2 Plusieurs études sur des cohortes de taille variable ont permis de calculer l'implication de chacun des gènes USH2 (Figure 24, page 98). Figure 24 : Pourcentage d'implication des gènes chez les patients USH2 * représente l'ensemble des patients USH2 du laboratoire : Besnard et al. 2012 données non publiées ; n : nombre de patients inclus dans l'étude. Les résultats sont globalement similaires entre les différentes études : l'implication moyenne de USH2A est de 79, 3%, GPR98 de 6, 4% et DFNB31 est très faiblement impliqué (moyenne de 0, 6%). On observe une implication plus importante de GPR98 et DFNB31 dans l'étude menée par Bonnet et al. Cette différence peut être due à un biais introduit par la taille réduite de leur cohorte. Si l'on considère l'ensemble des cohortes, 14% des cas restent non résolus. Notre laboratoire est doté du taux le plus faible. Ceci peut s'expliquer par une analyse plus exhaustive que dans les autres laboratoires, notamment grâce à l'étude des grands réarrangements et/ou par un recrutement plus ciblé des patients. Analyses complémentaires Mutations ponctuelles introniques profondes D. Mutations localisées en dehors des zones criblées en routine Si l'analyse d'un gène chez un patient Usher ne permet pas l'identification d'une mutation pathogène, alors l'implication de ce gène est remise en question. Si, en revanche, une mutation est identifiée, la probabilité que ce gène soit effectivement impliqué dans la pathologie devient élevée. Dans ce cas, la recherche de mutations peut donc être élargie aux mutations introniques profondes voire à l'étude des régions régulatrices. La recherche de ces mutations implique la mise en place d'outils spécifiques qui ne sont pas utilisés en routine. 1. Mutations ponctuelles introniques profondes Ce travail a été mené par le Dr. Christel Vaché, ingénieur au laboratoire. Initialement, l'analyse du gène USH2A chez une famille dans laquelle un syndrome de Usher de type II ségrégeait sur 2 générations avait permis d'identifier une mutation délétère chez deux sœurs (III-1 et III-4) différente de celle retrouvée chez leur tante (II-7) (Voir figure 1 de l'article, disponible en Annexe 2, page 176). Ces données, confirmées par l'analyse des haplotypes au locus USH2A suggéraient la présence d'un haplotype commun aux trois patientes, porteur d'une mutation non identifiée. Christel Vaché a alors analysé les transcrits USH2A issus des cellules nasales de la patiente II-7 par une stratégie de séquençage de RT-PCR chevauchantes (transcrit de près de 19kb). Elle a ainsi pu mettre en évidence un profil électrophorétique anormal correspondant à l'insertion d'une séquence de 152 pb entre les exons 40 et 41. L'étude génomique des régions avoisinant ce pseudoexon chez les trois patientes, révéla la présence d'une substitution G localisée en 1 (c. 7595-G). Celle-ci, en augmentant la force d'un site donneur cryptique, permet l'insertion hors phase du pseudoexon et prédit l'apparition d'un codon stop prématuré dans l'exon 41. Mon travail a consisté à rechercher cette mutation chez tous les patients USH2 analysés au laboratoire, porteurs d'une seule mutation dans le gène USH2A. Par cette étude, la présence de cette variation intronique profonde a pu être démontrée chez 8 patients d'origine française et espagnole. L'ensemble de ces résultats a été publié dans Human Mutation (Vaché et al. , 2012), disponible en Annexe 2). Cette altération est désormais recherchée de manière systématique lors de l'étude du gène USH2A. Depuis, elle a pu être identifiée dans 2 nouvelles familles. Par ailleurs, cette mutation a aussi été retrouvée chez plusieurs patients d'origine hollandaise (communication personnelle Dr. L. Hoefsloot, Nijmegen). Analyses complémentaires Altérations localisées dans les régions promotrices 2. Altérations localisées dans les régions promotrices Il est désormais bien établi que des mutations situées dans les régions non codantes de gènes, notamment dans les régions promotrices, peuvent altérer la transcription (Cheung and Spielman, 2009). Par exemple, il a été démontré que des variations au niveau des régions promotrices du gène CFTR pouvaient impacter le taux de transcription du gène et moduler le phénotype des patients (Romey et al. , 1999). Avant de pouvoir évaluer l'effet de telles variations sur la transcription il est tout d'abord nécessaire d'obtenir une caractérisation des régions promotrices. Deux grandes classes de promoteurs chez les mammifères sont décrites dans la littérature, selon la distribution des sites d'initiation de la transcription (TSS) (Sandelin et al. , 2007) : les promoteurs concentrés et les promoteurs dispersés, respectivement nommés sharp et broad. Les promoteurs concentrés (Figure 25-a, page 100) utilisent un TSS unique. En amont de ce TSS, à une trentaine de nucléotides, une boite TATA (motif nucléotidique de type 5'-TATAAA-3') peut parfois être identifiée. Cette boite TATA est reconnue par TBP (TATA binding protein), l'une des principales protéines du complexe général d'initiation de la transcription chez les eucaryotes (Goodrich and Tjian, 2010). Cette classe de promoteur est associée aux gènes ayant une expression spécifique (Sandelin et al. , 2007). Les promoteurs dispersés (Figure 25-b, page 100) présentent généralement un lot CpG dans lequel peuvent être identifiés plusieurs TSS menant à la transcription de transcrits de tailles différentes. Cette classe de promoteur est associée aux gènes ayant une expression ubiquitaire (Sandelin et al. , 2007). Figure 25 : Grandes classes de promoteurs chez les mammifères Adaptée de (Sandelin et al. , 2007). a- promoteur concentré contenant un seul TSS et une boite TATA dans 10 à 20% des cas ; b- promoteur dispersé sans boite TATA et généralement associé à un lot CpG (possédant plusieurs TSS). Analyses complémentaires Altérations localisées dans les régions promotrices A l'heure actuelle, peu de données sont disponibles pour les gènes Usher. Une étude récente a montré qu'une substitution localisée en -4128 du gène MYO7A pouvait réduire de 50% sa transcription in vitro (Street et al. , 2011). A notre connaissance, aucune étude n'a été réalisée pour caractériser les régions 5'UTR des gènes USH2A et GPR98, majoritairement impliqués dans le syndrome de Usher de type II. C'est pourquoi nous avons initié ce travail en collaboration avec le Dr. Victoria Viart (alors étudiante en thèse au laboratoire et travaillant sur la régulation transcriptionnelle du gène CFTR). Pour cela, j'ai recherché la présence d'lots riches en guanine et cytosine (lots CpG) et étudié l'activité promotrice des régions 5' des gènes. Cette analyse est basée sur l'utilisation d'outils bio-informatiques et de tests fonctionnels réalisés à l'aide d'un vecteur rapporteur contenant le gène luciférase (pGL3basic). Recherche d'lots CpG La recherche d'lots a été réalisée avec les outils CpG Island Searcher (outil web d'identification d'lots CpG) et UCSC. Les résultats obtenus sont similaires : ils mettent en évidence la présence d'un lot CpG dans la région 5'UTR de GPR98 (Figure 26-A, page 101) et n'en identifient pas dans la région 5'UTR de USH2A (Figure 26-B, page 101). A- B- Figure 26 : Identification des lots CpG dans GPR98 et USH2A Captures d'écran extraites de l'outil UCSC ( A- Représentation de la région 5'UTR de GPR98 et localisation de l'lot CpG. B- Représentation de la région 5'UTR de USH2A En se basant sur les 2 grandes classes de promoteurs précédemment décrites, cette première analyse permet de suggérer que GPR98 est soumis à une régulation par un promoteur de type dispersé, tandis que le promoteur de USH2A serait de type concentré. Nous avons ensuite testé l'activité promotrice des régions en 5' de l'ATG de ces gènes afin de mettre en évidence la région minimale nécessaire à induire une activité transcriptionnelle. Activité promotrice Pour réaliser cette étude, nous avons utilisé le principe du gène rapporteur. Cette technique repose sur l'insertion d'une région d'intérêt dans un vecteur plasmidique (pGL3 basic dans notre étude), en 5' du gène codant pour la luciférase. Ces constructions sont alors transfectées dans des lignées cellulaires humaines (HeLa et ARPE-19 dans notre étude). Analyses complémentaires Altérations localisées dans les régions promotrices Après récupération des cellules et ajout de luciférine, la luminescence produite par la réaction avec la luciférase est mesurée. Celle-ci étant proportionnelle à l'activité promotrice de la séquence insérée, il est alors possible de définir l'efficacité de la transcription. Nous avons donc intégré dans le vecteur pGL3 basic, des régions de différentes tailles correspondant aux régions en 5' du site d'initiation de la traduction (ATG) de GPR98 et USH2A. Dans le cas de l'analyse du gène USH2A, le codon ATG étant situé dans le deuxième exon, nous nous sommes essentiellement intéressés à la région en 5' de l'exon 1, après avoir montré que la région entre l'exon 1 et l'ATG de l'exon 2 n'avait pas d'effet majeur observé sur l'activité promotrice. Pour USH2A, nous avons pu montrer que la construction contenant 200 nucléotides en 5' de l'exon 1 (P200) permet d'augmenter significativement l'activité transcriptionnelle (Figure 27- A, page 102). Cette région contient donc le promoteur minimal du gène. La diminution de l'activité luciférase observée pour des constructions plus larges (de 400 à 2000 nucléotides) suggère la présence de motifs cis-régulateurs en 5' de ce promoteur minimal. Pour GPR98, la présence d'un promoteur minimal dans les 400 premiers nucléotides en amont de l'ATG (P400) a pu être également démontrée. Pour ce gène aucune altération significative de l'activité transcriptionnelle n'a été observée lors de l'utilisation de constructions plus larges (jusqu'à 1500 nucléotides insérés) (Figure 27-B, page 102). Figure 27 : Activité luciférase des régions promotrices de USH2A et GPR98 er A- Analyse des régions comprises entre 50 (P50) et 2000 (P2000) nucléotides en amont du 1 nucléotide de l'exon 1 de USH2A. B- Analyse des régions comprises entre 50 (P50) et 1500 (P1500) nucléotides en amont de l'ATG de GPR98. Les activités luciférase des régions testées sont rapportées à l'activité luciférase du vecteur pGL3 basic sans insert. A partir de ces résultats nous avons affiné l'analyse des régions promotrices de USH2A et GPR98 à l'aide d'outils de prédiction in silico, en recherchant spécifiquement les boites TATA (ConSite ; Jaspar et TFSearch). Ces logiciels n'identifient pas de motif dans la région d'intérêt de GPR98. En revanche tous prédisent une boite TATA dans la région promotrice minimale de USH2A (Figure 28, page 103). L'activité luciférase de cette région a alors été testée après dégénérescence du site par mutagénèse dirigée. Lors de cette étude nous Analyses complémentaires Altérations localisées dans les régions promotrices avons observé une diminution drastique de cette activité pour la construction possédant le site muté, confirmant ainsi le rôle majeur de cette boite TATA dans l'activité transcriptionnelle d'USH2A (Figure 28, page 103). Figure 28 : Etude de la boite TATA identifiée dans la région d'intérêt USH2A A- Prédictions in silico d'un motif TBP commun aux 3 outils de prédiction utilisés entre -121 et -129 nucléotides en 5' de l'exon 1 de USH2A. En rouge, nucléotide modifié par mutagénèse dirigée. B- Analyse de l'activité luciférase des régions entre 130 (P130) et 140 (P140) nucléotides en amont er du 1 nucléotide de l'exon 1 de USH2A, et de la région P140 après mutagénèse dirigée (P140 Mut). Ce résultat conforte l'hypothèse que nous avions précédemment posée, selon laquelle USH2A serait soumis à une régulation par un promoteur de type concentré. Pour GPR98, l'absence d'identification de boite TATA par les outils in silico utilisés est un argument supplémentaire d'une régulation par un promoteur de type dispersé (Figure 29, page 103). USH2A GPR98 200 nucléotides en 5' 400 nucléotides en 5' Promoteur minimal de l'exon 1 de l'ATG lot CpG non oui Boite TATA oui non Type de promoteur suggéré Concentré Dispersé Figure 29 : Tableau récapitulatif des promoteurs USH2A et GPR98 A ce jour, chez les patients USH2 porteurs d'une seule mutation, le séquençage de ces régions, n'a pas permis d'identifier d'altération susceptible d'avoir un impact sur la régulation transcriptionnelle. Cependant, ce travail qui a permis de caractériser pour la première fois les régions 5' des 2 gènes majoritairement impliqués dans le syndrome de Usher de type II pourra servir de support pour l'étude de variants identifiés lors d'analyses NGS (voir partie III). Bilan, discussion et perspectives IV. Bilan, discussion et perspectives Les travaux présentés dans cette seconde partie ont permis non seulement d'élucider les génotypes pathogènes d'un nombre conséquent de patients atteints du syndrome de Usher de type II, mais aussi d'améliorer les connaissances moléculaires et d'ouvrir la discussion sur la classification clinique. L'étude du gène GPR98 que j'ai menée a montré que ce gène, à l'instar de nombreux gènes impliqués dans le syndrome de Usher, présente un panel varié de mutations privées. Celui-ci comprend tout type d'altération au niveau protéique résultant de tout type de mutation au niveau nucléotidique. De plus, j'ai montré que GPR98, bien que codant pour une protéine d'organisation et de taille similaire à usherine, a un spectre mutationnel légèrement différent et semble plus propice à tolérer les simples changements d'acides aminés (faux-sens). Cette étude a aussi confirmé les résultats d'Ebermann et al. concernant le rôle et la fréquence mineure d'implication de DFNB31 dans le syndrome de Usher de type II (Ebermann et al. , 2007b). J'ai aussi pu montrer que le gène modificateur et responsable de digénisme PDZD7 ne contribuait pas au phénotype dans notre cohorte. A l'image de DNFB31, l'implication de PDZD7 restera minoritaire. L'étude de cette cohorte, notamment la recherche du deuxième allèle pathogène chez les patients pour qui le génotype restait incomplet, a permis la découverte de la première mutation intronique profonde dans un gène responsable du syndrome de Usher. Enfin, cette même recherche m'a permis d'initier la caractérisation des promoteurs des gènes USH2A et GPR98, et de créer des modèles fiables, d'analyse in vitro de ces régions. Ces résultats pourront être notamment utilisés pour approfondir l'étude de variants identifiés lors d'analyses NGS. Malgré le développement d'analyses exhaustives, 10% des patients restent sans diagnostic moléculaire précis. Pour expliquer ces résultats, plusieurs hypothèses peuvent être avancées : Bilan, discussion et perspectives présence d'une mutation altérant l'expression ? L'identification du premier pseudoexon dans le gène USH2A laisse suggérer l'existence d'autres mutations introniques profondes altérant l'épissage. Puisque nous avons mis en place l'analyse des transcrits issus de cellules nasales pour la majorité des gène Usher (Vaché et al. , 2010), disponible en Annexe 3, page 184), nous disposons d'ors et déjà des outils adéquats pour étendre, si nécessaire, cette recherche à tout nouveau patient. Pertinence des données cliniques : o S'agit-il vraiment d'un patient Usher ? Des travaux ont récemment montré que l'addition de symptômes engendrés par plusieurs pathologies non syndromiques pouvaient simuler une pathologie syndromique. C'est le cas d'une étude dans laquelle certains membres d'une même famille avaient été diagnostiqués USH1 (Fakin et al. , 2012). Or, l'analyse moléculaire de cette famille a montré que les membres atteints étaient en réalité mutés dans deux gènes distincts : GJB2, connu pour être responsable de surdité non syndromique et PRPH2, impliqué dans 6% des RP non syndromique à transmission autosomique dominante. Par ailleurs, Eisenberger et al. ont analysé au niveau moléculaire une famille consanguine présentant des symptômes compatibles avec un syndrome Usher de type III (Eisenberger et al. , 2012). Par analyse de liaison, ils ont alors ciblé spécifiquement les gènes présents dans les régions homozygotes ségrégeant avec la pathologie dans cette famille puis ont capturé ces régions pour les analyser en NGS. Sur les 365 gènes étudiés, une mutation homozygote a pu être identifiée dans le gène ABHD12 (c. T, p. Arg65*), gène connu pour être responsable du syndrome PHARC (polyneuropathie, perte auditive, ataxie, rétinite pigmentaire, cataracte précoce). Ainsi, ces travaux montrent la puissance du NGS pour résoudre une errance diagnostique voire de poser un diagnostic différentiel notamment chez les patients présentant des signes cliniques atypiques. o S'agit-il d'un patient Usher atypique ? Il a déjà été rapporté dans la littérature que des patients cliniquement USH2 pouvaient être mutés dans des gènes USH1 (partie I, Figure 7, page 28). Nous l'avons également démontré pour U806 (porteur de mutations dans le gène USH1C). Ainsi, il est important d'envisager une analyse exhaustive sur l'ensemble des gènes pour certains patients. C'est pourquoi nous avons décidé, dans la deuxième partie de mon travail de thèse, de développer le séquençage nouvelle génération appliqué au syndrome de Usher afin d'en évaluer sa faisabilité, son efficacité et son transfert éventuel au secteur diagnostic. Partie III : Le NGS comme nouvel outil d'analyse des pathologies neurosensorielles Le séquençage nouvelle génération (NGS) : Historique Altérations localisées dans les régions promotrices I. Le séquençage nouvelle génération (NGS) Les stratégies de séquençage nouvelle génération sont nombreuses et permettent la mise en place d'études diverses. Après une présentation de l'approche, nous avons choisi de nous focaliser sur deux aspects : Le premier, technique, dans lequel nous présenterons les approches similaires à celle utilisée dans le cadre de notre étude sur exome ciblé (NGS de régions spécifiquement capturées sur séquenceur moyen débit). Le second, présentant plusieurs études effectuées sur les maladies neurosensorielles (associant surdité et/ou rétinite pigmentaire). A. Historique Récemment, Lin et al. ont repris l'historique des grandes avancées de la biologie moléculaire, jusqu'à l'utilisation du séquençage nouvelle génération (Lin et al. , 2012). Le séquençage de l'ADN selon la méthode décrite par Sanger fut mis au point à la fin des années 70 (Sanger et al. , 1977). Cette technique d'identification et de caractérisation de nucléotides polymérisés précéda la découverte de l'amplification par PCR (réaction de polymérisation en chane, en anglais Polymerase Chain Reaction) (Inoue and Orgel, 1983). L'association de ces deux techniques révolutionna la biologie moléculaire. Elle est de nos jours quotidiennement utilisée dans les laboratoires de diagnostic des pathologies génétiques. Cette association a aussi permis non seulement d'imaginer le séquençage du génome humain entier, mais aussi de le réaliser. Les projets pour ce dernier ont débuté dans les années 90 et ont abouti au séquençage complet du premier génome en 2001 (Human Genome Issue, Nature, Vol 409, 2001). On estime que cette gigantesque entreprise d'une dizaine d'années a coûté environ 3 milliards de dollars (2, 4 milliards d'euros). Depuis, de nouvelles technologies dites de haut-débit ont vu le jour, regroupées sous le terme de NGS (Séquençage nouvelle génération, en anglais, Next Generation Sequencing). Ces stratégies ont permis une baisse exponentielle du coût de ce WGS (Whole Genome Sequencing ou séquençage du génome entier). Désormais, de grands instituts comme le BGI (Beijing Genome Institute), annoncent la possibilité prochaine de séquencer l'intégralité d'un génome humain pour moins de 1000 dollars (environ 800 euros). Si le séquençage nouvelle génération est en train de révolutionner le secteur de la recherche, son application en diagnostic moléculaire en est encore aux balbutiements. La quantité de données créées par le WGS n'est, pour le moment, pas compatible avec les Le séquençage nouvelle génération (NGS) : Définir les besoins Altérations localisées dans les régions promotrices outils informatiques de stockage disponibles dans les laboratoires. De plus, l'information générée peut dépasser la prescription initiale et une organisation et une réflexion sur la gestion de ces données sont indispensables. Une démarche plus accessible est proposée par le séquençage de séquences spécifiques par capture ciblée. On distingue à ce jour deux principales approches : exome entier ou régions spécifiquement choisies. B. Définir les besoins Le nombre de séquences pouvant être lues par les technologies de NGS est corrélé, dans le cadre de la génétique humaine, à trois variables : la taille totale en paire de bases des différentes régions chromosomiques que l'on souhaite étudier par patient, la qualité de lecture que l'on désire obtenir pour chacune de ces séquences (paramètre directement corrélé à la profondeur de lecture, correspondant au nombre de fois que chaque nucléotide sera lu), le nombre de patients que l'on veut pouvoir analyser simultanément. Le produit de ces 3 variables indique le nombre de paires de bases à séquencer. Par exemple, si on souhaite séquencer l'exome (estimé à 1% du génome (Ng et al. , 2009), soit 3. 107 pb) de 5 patients avec une profondeur de 40 lectures par nucléotides (40X, correspondant au seuil de profondeur minimum généralement défini pour les études sur les maladies monogéniques héréditaires), il faudra alors un séquenceur ayant la capacité de séquencer 6, 4 gb. Aujourd'hui les derniers séquenceurs NGS mis sur le marché permettent de séquencer plus de 600 gb soit près de 100 fois plus. Quantité de séquences analysées Reproductibilité / Nombre de patients Qualité des étudiés séquences analysées Figure 30 : Variables du NGS Le produit de ces 3 variables correspond à la capacité du séquenceur (en pb). Le séquençage nouvelle génération (NGS) : Les plateformes disponibles Altérations localisées dans les régions promotrices C. Les plateformes disponibles Aujourd'hui, il existe 3 séquenceurs dits de moyen débit (afin de les distinguer des séquenceurs pouvant séquencer un génome entier en un run ), commercialisés par 3 sociétés différentes. Leur taille dite de paillasse , leur coût ainsi que la quantité de données qu'ils génèrent (capacité), les rendent compatibles pour une utilisation à des fins de diagnostic. Il s'agit du 454 GS Junior (Roche), du MiSeq (Illumina) ainsi que du Ion Torrent PGM (Life technologies). Dans une étude comparative, la plateforme MiSeq semble devancer ses concurrents sur de nombreux points, notamment de par son coût et sa capacité. De plus, MiSeq est moins soumis aux erreurs de lecture car sa technologie engendre moins d'artéfacts au niveau des homopolymères ; lesquels représentent un problème majeur du pyroséquençage et de la mesure de pH respectivement utilisés par le 454 GS Junior et le Ion Torrent PGM (Loman et al. , 2012). Le Tableau 10 (page 109) répertorie la comparaison de différentes caractéristiques de ces séquenceurs. On observe que la capacité en terme de nucléotides séquencés est variable entre ces appareils bien qu'ils soient tous considérés comme moyen débit par leur constructeurs respectifs. On peut noter également que le séquenceur haut débit de chez Roche 454 (GS FLX ) permet le séquençage de 700 Mb, ce qui est 2 fois moins que le MiSeq, séquenceur moyen débit d'Illumina, chez qui le séquenceur haut débit peut séquencer jusqu'à 600 Gb. Il convient de bien distinguer les appellations commerciales des capacités réelles des différentes machines. Tableau 10 : Comparatif des principales caractéristiques des séquenceurs nouvelle génération dédiés au diagnostic. Adapté de (Loman et al. , 2012) 454 GS Junior Ion Torrent PGM MiSeq Fournisseur Roche Life Technology Illumina Commercialisation Début 2010 Début 2011 Fin 2011 Coût machine 85 000 65 000 100 000 Issu de 454 GS Flx - Solexa Illumina emPCR emPCR Génération de clusters Technologies Séquençage par synthèse Séquençage par synthèse Séquençage par synthèse Capacité / run 80 Mb 100 Mb 1 Gb 1, 5 Gb Coût / run 900 400 600 Temps / run 8h 3h 27 h Bp / séquence 400 100 2 X 150 Indels 0, 38% 1, 5% EmPCR : PCR en émulsion (technique développée dans le protocole technique, page 120) ; Indels représente le nombre de petites insertions ou délétions identifiées pour 100 pb lues (la plupart étant des biais causés par l'environnement nucléotidique). Le séquençage nouvelle génération (NGS) : Les plateformes disponibles Altérations localisées dans les régions promotrices Préparation de l'ADN Comme nous l'avons souligné, le NGS permet différentes approches. On peut se baser sur le séquençage d'amplicons (séquençage de produits de PCR) ou sur celui de fragments d'ADN. Le séquençage d'amplicons de longs fragments (PCR long-range) nécessite lui aussi, au même titre que le séquençage de l'ADN, une fragmentation en segments de quelques centaines de paires de bases. Pour cela, trois techniques sont principalement utilisées : la nébulisation, la sonication ou bien la digestion enzymatique aléatoire (Knierim et al. , 2011). Afin de distinguer les différentes séquences, celles-ci doivent être physiquement éloignées les unes des autres durant l'étape de séquençage. L'emPCR permet d'isoler les séquences dans des émulsions aqueuses au sein d'une phase lipidique qui seront déposées, par la suite, dans les puits de microplaques pouvant recevoir le produit d'amplification d'une seule de ces émulsions (Figure 31-a, page 110). Cette technique est utilisée par Roche et Life technologie tandis que Illumina a choisi pour isoler ces séquences de générer des groupes (clusters) de séquences amplifiées sur microplaque de séquençage (Figure 31-b, page 110). Figure 31 : Techniques d'amplification et d'isolement des séquences des 3 séquenceurs dédiés au diagnostic Adaptée de (Metzker, 2010). a- emPCR, stratégie utilisée par Roche et Life technology : isolement des séquences amplifiées sur billes ; b- génération sur plaque de clusters de séquences amplifiées : stratégie utilisée pas Illumina. Les stratégies de séquençage NGS appliquées aux maladies génétiquement hétérogènes utilisent généralement la capture de séquences par hybridation (aussi appelée enrichissement ciblé ou capture ciblée). Très majoritairement, ces captures sont spécifiques de l'exome entier ou de régions cibles choisies par l'utilisateur. La capture de séquences par hybridation s'effectue soit en phase solide soit en solution (Lin et al. , 2012) Le séquençage nouvelle génération (NGS) : Applications cliniques : exomes ciblés et WES Altérations localisées dans les régions promotrices D. Applications cliniques : exomes ciblés et WES Les applications suivantes ne sont pas exhaustives. Nous nous sommes essentiellement focalisés sur les études intéressantes pour la mise en place du NGS de l'exome Usher , défini par l'analyse de toutes les régions exoniques et introniques flanquantes des gènes connus comme responsables du syndrome de Usher. L'équipe de Rehman en 2010 réalisa l'une des premières études associant le NGS précédé de la capture de séquences chez une famille consanguine d'origine pakistanaise présentant une surdité non syndromique autosomique récessive liée au locus DFNB79 (Rehman et al. , 2010). Ils ciblèrent 108 gènes, soit près de 3 Mb, situés sur ce locus DFNB79. En se focalisant sur l'identification de variants non décrits, exoniques et homozygotes, ils purent alors identifier une mutation prédisant un PTC dans le gène TPRN codant pour la taperine. L'implication de ce gène fut par la suite validée dans d'autres familles, par l'identification d'autres variations délétères dans ses régions exoniques. La première analyse associant le séquençage de l'exome entier (WES) au NGS chez des patients atteints de surdité non syndromique fut également publiée en 2010 (Walsh et al. , 2010). Bien que l'exome complet ait été capturé puis séquencé, l'équipe de Walsh cibla son travail sur une région homozygote (locus DFNB82) identifiée dans une famille consanguine palestinienne par analyse de liaison. L'élimination des polymorphismes orienta l'équipe vers une mutation entranant l'apparition d'un PTC dans GPSM2, qui code pour une protéine jouant un rôle dans la régulation de la polarité cellulaire, base de la mécanotransduction du signal sonore au niveau des cellules ciliées de l'oreille interne. En 2012, Sirmaci confirma à nouveau que le WES permettait l'identification de mutations dans de nouveaux gènes. La cartographie par autozygotie précédemment réalisée sur sa cohorte a particulièrement facilité le travail, car seules ces régions ont été finement exploitées (Sirmaci et al. , 2012). L'une des premières grandes études utilisant le NGS pour analyser des patients atteints RP a été réalisée très récemment (Neveling et al. , 2012). Par la capture des 111 gènes connus au moment de l'étude comme étant impliqués dans des pathologies rétiniennes, (incluant les 52 gènes responsables de RP), Neveling a réalisé le séquençage de ces régions chez 100 patients pour lesquels le diagnostic moléculaire n'avait pas été établi. Des variants probablement pathogènes et donc les gènes responsables ont été mis en évidence chez Le séquençage nouvelle génération (NGS) : Applications cliniques : exomes ciblés et WES Altérations localisées dans les régions promotrices plus d'1/3 des patients (n 36), démontrant la faisabilité de la stratégie. En revanche l'absence de résultats pour près de 2/3 de la cohorte laisse supposer que de nombreux autres gènes n'ont pas été encore identifiés, confirmant l'hétérogénéité génétique des RP. La technique de priorisation d'études des variants a été développée dans cet article et répond aux critères suivants : exoniques non-isosémantiques ou proches des sites d'épissage inconnus dans dbSNP (sauf si décrits comme pathogènes dans HGMD (Human Gene Mutation Database) fréquence inférieure à 5% dans la base de données contrôle de leur laboratoire (86 exomes) fréquence inférieure à 15% dans la base de données patients de leur laboratoire (100 patients) couverture > 10X et fréquence > 20% ou > 5X et fréquence > 80% en accord avec le modèle de transmission classique du gène impliqué Une deuxième étude s'est également focalisée sur l'analyse de patients présentant des pathologies rétiniennes par capture et séquençage de plus de 250 gènes connus ou candidats pour être impliqués dans les dysfonctionnements de la rétine (Audo et al. , 2012). Les auteurs ont utilisé les services de la société IntegraGen. Leurs résultats confirment la faisabilité de la méthode (taux de détection des mutations de près de 60%), ainsi que les gains de temps et économiques. De plus, ils ont pu souligner par cette technique la possibilité de réaliser des associations précédemment inconnues, entre gènes et phénotypes (Audo et al. , 2012). Enfin, une analyse portant sur le syndrome de Bardet-Biedl (BBS) a été récemment publiée. Trente gènes ont été capturés : les 16 gènes connus pour être impliqués dans BBS ainsi que 14 autres gènes associés à des pathologies présentant des similarités cliniques. La stratégie utilisée a permis d'identifier les 2 mutations chez près de 70% (26/38) des patients qui n'avaient jamais été analysés auparavant (Redin et al. , 2012). Etude de l'exome ciblé : Choix des régions capturées Altérations localisées dans les régions promotrices II. Etude de l'exome ciblé L'approche classique de PCR et séquençage par la méthode de Sanger appliquée à des pathologies hétérogènes telles que le syndrome de Usher est maintenant bien matrisée mais reste longue et coûteuse. L'arrivée de nouvelles technologies de séquençage performantes en terme de quantité de séquences analysées constitue une promesse d'amélioration de l'étude de ces pathologies, et ainsi, une meilleure prise en charge des patients. Dans le cadre du syndrome de Usher, une étude très récente a comparé le séquençage NGS de l'exome Usher selon deux stratégies : les amplifications long range sur les gènes Usher et la capture d'exome entier (Licastro et al. , 2012). Mais à ce jour, aucune étude n'a été réalisée sur la faisabilité du NGS de l'exome ciblé gènes Usher dans des conditions compatibles avec le diagnostic moléculaire. La seconde partie de ma thèse étudie la faisabilité de l'approche NGS de l'analyse moléculaire du syndrome de Usher. Ce projet a été mené conjointement avec Gema Garcia Garcia. Les premiers résultats issus de son utilisation dans le secteur de diagnostic moléculaire du syndrome de Usher de notre laboratoire seront aussi développés. Enfin, nous avons étendu l'analyse NGS à une étude pilote centrée sur certains gènes impliqués dans des surdités non syndromiques. A. Choix des régions capturées Afin de séquencer les régions d'intérêt, nous avons fait le choix d'associer la capture de séquences en solution grâce à un kit à façon SeqCap EZ Choice de Nimblegen et le pyroséquençage 454. Le séquenceur, un 454 GS junior de chez Roche, a une capacité de séquençage d'environ 80 Mb par run. En estimant que 50% de ces séquences sont analysables (du fait des nombreuses séquences inutilisables inhérentes à la technologie), il est possible d'analyser 40 Mb de séquences. Enfin, dans le cadre d'une application diagnostique, nous avons souhaité une couverture de lecture minimale de 40X, qui nous assure une confiance raisonnable quant aux résultats, ce qui nous permet de cibler une quantité de séquences d'environ 600 Kb. Dix-neuf gènes ont été sélectionnés pour cette capture : les 10 gènes responsables du syndrome de Usher connus au moment de la mise au point (Tableau 11, page 115), 8 gènes Etude de l'exome ciblé : Choix des régions capturées Altérations localisées dans les régions promotrices candidats et/ou responsables de surdité non syndromique (Tableau 12, page 116). Par ailleurs le gène CHM, impliqué dans la choroidérémie, et également étudié au laboratoire (Tableau 12, page 116) a été intégré au design. Ce dernier est situé sur le chromosome X tandis que les 18 autres sont autosomiques. Ces 19 gènes représentent 634 régions. Il s'agit des 570 exons, ainsi que leurs régions introniques flanquantes (100 pb), codant pour les plus grandes isoformes de chacun des gènes d'intérêt, ainsi que 2 kb de régions non traduites (UTR) en 5' et en 3' (soit 38 régions UTR). Les 25 exons présents dans les transcrits alternatifs issus de ces gènes ont été ajoutés ainsi que la région génomique de USH2A englobant le pseudoexon décrit par Vaché et al. , (2012). La proximité de certains exons entrainent la définition pour la conception de la capture de 535 régions distinctes soit 326342 pb. Au cours des prochaines pages, nous appellerons Exome NS (Tableau 11, page 115 et Tableau 12, page 116), l'ensemble des régions du design et Exome Usher , les régions spécifiques des gènes connus pour être impliqués dans syndrome de Usher (Tableau 11, page 115). Etude de l'exome ciblé : Choix des régions capturées Altérations localisées dans les régions promotrices Tableau 11 : Références NCBI des gènes Usher capturés NM Ref : transcrit NCBI considéré comme référence ; NP Ref : protéine NCBI considérée comme référence ; pb : nombre de paires de bases ; aa : nombre d'acide aminés ; Alt : Alternatif ; ex diff : nombre d'exon capturé, issu du transcrit alternatif. Etude de l'exome ciblé : Choix des régions capturées Altérations localisées dans les régions promotrices Tableau 12 : Références NCBI des autres gènes capturés NM Ref : transcrit NCBI considéré comme référence ; NP Ref : protéine NCBI considérée comme référence ; pb : nombre de paires de bases ; aa : nombre d'acide aminés ; Alt : Alternatif ; ex diff : nombre d'exon capturé, issu du transcrit alternatif. Etude de l'exome ciblé : Capture des séquences Altérations localisées dans les régions promotrices B. Capture des séquences Lors de la commande du kit de capture SeqCap EZ Choice, Roche-Nimblegen se charge de la définition et de la fabrication des sondes selon les régions d'intérêt souhaitées. Afin d'obtenir une couverture la plus homogène possible sur la région, le fabricant doit développer des sondes aux bordures de ces zones ce qui augmente la taille du design (Figure 32, page 117). Selon les régions chromosomiques d'intérêt, le fabricant choisit et synthétise les sondes biotinylées servant à la capture. Le nombre de paires de bases contenu dans les sondes de capture représente 363966 nucléotides. L'augmentation de la taille du design est d'environ 10%. Figure 32 : Représentation des sondes de capture pour un exon donné Image réalisée à partir de l'outil web Galaxy. Les sondes biotinylées, représentées en orange, sont alignées sur la région souhaitée matérialisée en vert-pomme. Initialement, la société avait fourni uniquement les coordonnées chromosomiques des régions globales capturées. Afin de nous permettre d'étudier au mieux nos données, nous avons obtenu le détail de chacune des sondes synthétisées. Plus de 32000 sondes chevauchantes différentes (de 75 nucléotides en moyenne) recouvrent les régions cibles, soit environ de 2, 4 millions de nucléotides. Etant donné que ces sondes ont été choisies pour couvrir près de 364 kb, on estime que chaque nucléotide du design est en moyenne capturé par environ 7 sondes différentes. C. Séquençage 454 : protocole Le séquençage des appareils NGS de la gamme GS de chez Roche utilise la technique de l'amplification en émulsion associée à celle du pyroséquençage développée dans le chapitre II. C. 3 (page 120). Le séquençage de l'exome NS est réalisé en 3 phases principales divisées en 24 étapes (Figure 33, page 119). Les phases consistent en la capture de séquences (Phase I en 8 Etude de l'exome ciblé : Séquençage 454 : protocole Capture des séquences (phase I) étapes), l'emPCR (Phase II en 7 étapes) et le run de séquençage (Phase III en 9 étapes). Les protocoles fournis pour chacune des phases étant particulièrement précis, seules les étapes critiques seront détaillées. 1. Capture des séquences (phase I) Une librairie de fragments d'ADN d'intérêt est obtenue à partir de 500ng d'ADN génomique. Pour cela l'ADN subit 3 modifications. La première est la préparation de la librairie génomique. Celle-ci est obtenue par fragmentation de l'ADN par nébulisation à l'azote (étape I. 1). La durée et la pression sont choisies dans le but de fragmenter l'ADN en segments d'environ 700 pb. Après fragmentation, l'ADN est immédiatement purifié. A l'issue de la purification, le produit récupéré est dosé. Le rendement moyen obtenu est de 0, 75. (ADNfragmenté/ADNtotal) La nébulisation fragmente l'ADN en segments dont les extrémités sont non franches, il est donc nécessaire de réaliser une étape de réparation de l'ADN (étape I. 2). Celle-ci est immédiatement suivie par la ligation des adaptateurs (étape I. 3). La séquence de ces adaptateurs contient la séquence complémentaire des amorces utilisées pour les différentes étapes (I. 4, I. 7, II. 5, II. 7) ainsi qu'une courte séquence identifiant le fragment lors du run de séquençage. Le bon déroulement de la ligation est essentiel pour la suite du protocole étant donné le nombre d'étapes qui dépendent de celle-ci. La ligation est immédiatement suivie d'une étape de PCR (étape I. 4) du produit afin d'amplifier préférentiellement les fragments liés aux adaptateurs. Après purification et dosage de cette LMPCR1, on obtient un produit appelé pré-capture. Les sondes biotinylées spécifiques des régions d'intérêt du design sont alors hybridées sur le produit de pré-capture, pendant 72 heures à 47C (étape I. 5). La pré-capture comprend l'ensemble du génome fragmenté et amplifié. L'hybridation aux sondes va permettre de sélectionner les régions d'intérêt. Après incubation, plusieurs étapes de lavage sont nécessaires afin de conserver uniquement les fragments de pré-capture ayant été fixés par les sondes biotinylées. A cette étape, aucun dosage n'est possible car les billes de streptavidine restent dans la solution de récupération et empêchent toute technique de dosage. Ce produit post-capture est immédiatement amplifié (LMPCR2) pour éviter une dégradation de l'ADN (étape I. 7). Après purification du produit PCR, on obtient la librairie spécifique des régions d'intérêt. La dernière étape de la capture de séquences consiste alors à estimer le nombre de molécules par dosage en fluorimétrie afin de réaliser la PCR en émulsion (emPCR, Partie II). Etude de l'exome ciblé : Séquençage 454 : protocole Capture des séquences (phase I) Figure 33 : Diagramme du séquençage de l'exome NS. Rectangles gris : étapes ; rectangles bleus : produit intermédiaire obtenu. Etude de l'exome ciblé : Séquençage 454 : protocole PCR en émulsion (Phase II) 2. PCR en émulsion (Phase II) La PCR en émulsion (emPCR) consiste en l'amplification clonale de fragments d'ADN (Figure 31-a, page 110). Pour cela, des microbilles sont utilisées, sur lesquelles ont été hybridées des amorces complémentaires aux adaptateurs présents sur les fragments d'intérêts à amplifier. Le ratio fragments/billes est choisi de sorte que seul un fragment soit en contact avec chaque bille. L'ensemble des réactifs est alors mis en émulsion créant des microréacteurs au sein d'une phase lipidique. Chacun de ces réacteurs contiendra donc une bille, un fragment d'ADN et l'ensemble des réactifs nécessaires à l'amplification clonale du fragment. Il est impératif que sur chaque bille soit uniquement hybridé le produit d'amplification d'un seul fragment d'ADN. En effet, si jamais plusieurs fragments sont amplifiés dans la même micelle, le séquenceur ne pourra pas distinguer les différentes séquences. L'emPCR est donc une partie critique du protocole car il est nécessaire d'estimer la quantité de molécules à utiliser pour ne pas entrainer la présence de plusieurs séquences dans la même micelle. On prépare l'émulsion par agitation (étape II. 1). Le mélange d'amplification avec le ratio de molécules / billes est réalisé (étape II. 2) puis ajouté à la pré-émulsion (étape II. 3). Les fragments d'ADN sont précédemment dénaturés pour qu'un seul brin soit incorporé dans chaque micelle. Le mélange est ensuite réparti dans une plaque de 96 puits (étape II. 4), afin de réaliser l'amplification en thermocycleur (étape II. 5). Après 6 heures d'amplification, les produits sont extraits de l'émulsion, et purifiés. Le culot de billes est estimé afin de vérifier la quantité de billes conservées. La dernière étape de cette partie consiste à hybrider les amorces du séquençage aux produits amplifiés fixés sur les billes. 3. Run de séquençage (Phase III) A la suite de l'étape de purification de l'emPCR, 5. 105 à 2. 106 billes sont prêtes à être séquencées. La plaque de séquences ne contenant que 3. 105 puits, seulement 5. 105 billes seront déposées. Les premières étapes consistent à préparer les réactifs nécessaires (étape III. 1) puis à initialiser le séquenceur GS Junior par un pré-lavage (étape III. 2). En parallèle des deux précédentes étapes, la microplaque de dépôt (PTP) est installée dans son support (étape III. 3). Cette plaque est constituée de 300 000 puits destinés à recevoir, par centrifugations successives, les différentes couches de billes nécessaires à la réaction de pyroséquençage Etude de l'exome ciblé : Séquençage 454 : protocole Run de séquençage (Phase III) (étapes III. 4, III. 5, III. 6 et III. 7). Parallèlement, l'initialisation du séquenceur est réalisée (étape III. 6). La plaque est ensuite installée dans l'appareil (étape III. 9). Un run dure environ 8 heures. Le pyroséquençage est une méthode de séquençage indirect (Figure 34, page 121). A chaque insertion d'un nucléotide complémentaire à la séquence de référence précédemment fixée sur la bille, un pyrophosphate inorganique est libéré. Celui-ci, en présence d'adénosine phosphosulphate (APS), est catalysé par la sulfurylase présente sur les billes d'enzymes pour donner de l'adénosine tri-phosphate (ATP). Cet ATP réagit avec la luciférine en présence de luciférase présente elle aussi sur les billes d'enzymes pour former de l'oxy- luciférine et une émission lumineuse. Cette émission est captée par la caméra. Si plusieurs nucléotides sont simultanément insérés, l'émission de lumière sera proportionnellement plus intense. Si plus de 6 nucléotides sont simultanément insérés, la caméra ne fait plus la distinction d'intensité lumineuse par rapport au nombre de nucléotides insérés. C'est d'ailleurs cette limitation technologique qui entrane la source majeure d'erreur du pyroséquençage des appareils de la gamme 454 GS de chez Roche. Figure 34 : Représentation du pyroséquençage 454 GS Etude de l'exome ciblé : Récupération des données Extraction des données d'intérêt par GSdot D. Récupération des données A l'issu du séquençage, le logiciel pilotant le 454 GS Junior génère un fichier SFF (standard de sortie des séquenceurs de la gamme Roche 454) contenant la séquence nucléotidique identifiée dans chacun des puits de la picotiterplate (PTP). Plusieurs critères de qualité sont immédiatement disponibles comme le nombre de puits de la picotiterplate contenant une séquence nucléotidique, le nombre de puits dans lesquels cette séquence contient les clefs de lecture correspondant aux fragments de séquences de l'échantillon ou aux fragments de séquences contrôles. Les critères de taille et de qualité de chacune de ces séquences sont aussi disponibles. Enfin, un récapitulatif indiquant le pourcentage d'exactitude des séquences issues des billes contrôles est disponible et permet d'estimer le taux d'erreur du séquençage. Après étude de ces critères, l'analyse de séquences est initiée. Nous avons choisi d'utiliser le logiciel GS Reference Mapper (fourni par Roche). Les séquences issues du fichier SFF sont alors alignées sur les 11 chromosomes porteurs de gènes étudiés (build hg19). Par la suite, seuls les variants identifiés dans les régions du design seront répertoriés. Le logiciel réalise lui même une distinction entre les variants en sélectionnant les variants qu'il considère fiables (High Confidence). En utilisant le fichier reprenant ces variations fiables, nous nous sommes aperçus que la mutation majoritaire du gène USH2A (c. 2299delG) n'était pas identifiée pour un patient connu pour être porteur. En conséquence, nous utilisons désormais le fichier répertoriant toutes les variations identifiées et réalisons nous même le tri entre ceux que nous considérons fiables et les autres. Nous avons alors défini des paramètres filtrant les variants, et afin d'automatiser cette sélection, un outil web appelé GSdot a été développé au laboratoire par David Baux, ingénieur en bio-informatique. 1. Extraction des données d'intérêt par GSdot Après l'alignement du fichier SFF par le logiciel GS Reference Mapper, 4 fichiers de sortie sont récupérés afin de réaliser les analyses fines du run de séquençage : - 454MappingQC. xls Ce fichier contient les données globales de qualité du run de séquençage, notamment les nombres : de séquences totales du run ; de paires de bases totales du run ; de séquences alignées sur les chromosomes d'intérêt et de paires de bases alignées sur les chromosomes d'intérêt. - 454ReadStatus. txt Les données de ce fichier permettent de connatre le nombre de séquences (partielles ou complètes) alignées sur les régions d'intérêt ainsi que le nombre de nucléotides associés. Etude de l'exome ciblé : Récupération des données Extraction des données d'intérêt par GSdot - 454AlignmentInfo. tsv Ce fichier indique pour chaque position chromosomique pour laquelle au moins un nucléotide est aligné, les paramètres d'alignement, notamment la profondeur de lecture, le score de qualité, mais aussi si la position fait partie d'une région d'intérêt. - 454AllDiffs. txt Ce dernier fichier contient l'ensemble des variations identifiées lors du séquençage et les détails nécessaires à une analyse ultérieure de priorisation, notamment : o la position chromosomique de la variation o la profondeur de lecture totale et détaillée sur chaque brin ! du nucléotide de référence ! de la variation Dans le cas d'une analyse de l'exome NS par GSdot, s'ajoute à ces 4 fichiers, celui des régions chromosomiques d'intérêt. Il permet le calcul exact de la moyenne de profondeur de couverture pour chacune de ces régions. En cas d'absence de ce fichier, le logiciel détermine seul les régions, par simple extrapolation des positions chromosomiques. La moyenne de profondeur sera calculée sur les régions couvertes. La Figure 35, page 123 représente les diagrammes indiquant les chiffres clés obtenus à la suite du traitement des données brutes par le logiciel GSdot. Le diagramme de gauche correspond aux données d'alignement du run tandis que le diagramme de droite indique le détail du nombre de variants conservés en fonction des paramètres d'analyse choisis. Les différents paramètres de conservation des variants à analyser sont détaillés dans le point suivant. Figure 35 : Diagrammes générés par GSdot Le diagramme de gauche représente les données brutes, en nombre de séquences (reads) et en nombre de paire de bases (bp). Le diagramme de droite récapitule la filtration des variants, à partir du nombre initial détecté, jusqu'au nombre de variants à analyser. Etude de l'exome ciblé : Récupération des données Critères de conservation des variants 2. Critères de conservation des variants Cette première étape assure la sélection des variations considérées comme fiables pour la suite des analyses. La priorisation dans le but d'identifier les variants susceptibles d'être pathogènes sera réalisé, manuellement, dans une seconde étape (Partie III, III. A. 2. c, page 137). La suppression de variations du fichier initial entraine inévitablement le risque d'éliminer une variation réelle susceptible d'être impliquée dans la pathologie. Le choix des critères amenant à conserver ou non une variation est donc primordial. Il n'existe actuellement pas, à notre connaissance, d'étude publiée associant capture de séquences en solution et séquençage nouvelle génération par pyroséquençage 454, c'est pourquoi nous avons créé une démarche personnalisée, spécifique à notre étude. Les critères étudiés incluent la profondeur de couverture, le pourcentage d'hétérozygotie et le déséquilibre de couverture. Pour chacun de ces critères, plusieurs seuils ont été testés. - Profondeur de couverture Nous avons considéré que la couverture moyenne d'une région devait au minimum être de 40X. Dans le cas contraire, dans le cadre du diagnostic moléculaire et en l'absence d'identification de 2 mutations délétères, les régions du gène candidat présentant une couverture inférieure à ce seuil sont alors étudiées en séquençage Sanger. L'analyse en Sanger de ces régions est généralement réalisée en même temps que la confirmation des variants susceptibles d'être pathogènes identifiés chez le patient. Même si aucune valeur diagnostique n'est attachée aux régions dont la couverture est inférieure à 40X, celles-ci permettent néanmoins d'identifier des variations. L'exemple du patient U1093 en est la preuve : chez celui-ci, la mutation a été identifiée alors que seulement 4 séquences couvraient la région. Dans ce cas fortuit, la détection de l'altération a probablement été rendue possible parce qu'elle était à l'état homozygote et consistait en une insertion de 7 nucléotides. - Hétérozygotie Une fréquence d'hétérozygotie supérieure à 20% a été choisie pour que le variant soit conservé. A ce jour, la très grande majorité des variants testés dont la profondeur de couverture était supérieure à 40X et dont l'hétérozygotie était comprise entre 20 et 30% se sont avérés être des artefacts. L'expérience aidant, ce seuil sera sans doute affiné à l'avenir. Etude de l'exome ciblé : Récupération des données Critères de conservation des variants - Déséquilibre de couverture Certains variants sont identifiés préférentiellement sur un des deux brins (brin de référence, Fwd ou brin complémentaire, Rvs). Il s'agit très majoritairement de petites indels (insertions ou délétions d'un nucléotide) au niveau d'homopolymères nucléotidiques. Comme tous les utilisateurs de la technologie de pyroséquençage 454, nous avons été confrontés au problème des homopolymères, régions de plus de 3 nucléotides identiques à la suite. Cela a particulièrement bien été soulevé par Luo et al, en 2012, qui ont pu montrer lors d'une comparaison de cette technologie avec celle d'Illumina, que plus de 3% des homopolymères (14000 sur les 400000 identifiés en commun par les 2 technologies) différaient dans l'estimation de leur taille (Luo et al. , 2012). Si Illumina ne semble pas parfait, 454 est à l'origine d'un plus grand nombre d'erreurs. Les homopolymères constitués de nucléotides A ou T entrainent plus d'erreurs (environ 35% chacun) que ceux constitués de C ou G (environ 15% chacun). Afin d'éviter ces artefacts nous avons choisi d'éliminer toutes les indels avec une profondeur de couverture supérieure à 20X (profondeur suffisante pour considérer que le déséquilibre n'est pas lié à une faible couverture) et une fréquence inférieure à 10% sur un des 2 brins. - Variations non-interprétables A ce jour nous avons considéré comme non-interprétables, les petites indels dans les régions introniques éloignées de plus de 20 paires de bases d'un exon. La grande majorité de ces variants suggèrent qu'il s'agit d'artefacts causés par la technologie du pyroséquençage. De la même manière, les variants présentant un déséquilibre Fwd/Rvs sont masqués et n'apparaissent pas dans la liste des variants d'intérêt. Ce filtre laisse la possibilité de revenir sur les données notamment chez les patients pour lesquels un seul variant susceptible d'être pathogène a été identifié. L'ensemble de ces critères permet d'obtenir une sélection conduisant à un nombre raisonnable de variants à étudier tout en prenant le moins de risque possible d'éliminer une variation potentiellement existante. Ces filtres ont été testés sur les patients pour lesquels certains gènes avaient précédemment été séquencés par la technique du séquençage Sanger. Les résultats seront développés par la suite. Après la mise au point et la validation de ces règles, celles-ci ont été implémentées dans l'outil GSdot. Par le traitement des données issues de GS Reference Mapper, l'outil génère une liste annotée des variants identifiés pour chaque patient. Cette liste alimente un fichier global, qui constitue à ce jour la base de données des patients analysés en haut-débit dans notre équipe, et qui permet notamment d'évaluer la récurrence des variants. Cette Etude de l'exome ciblé : Cohortes étudiées Groupe contrôle récurrence est donc incrémentée à chaque nouveau patient et constitue un critère de priorisation supplémentaire. En effet, l'allèle pathogène le plus fréquemment retrouvé dans notre cohorte (USH2A, c. 2299delG) représente environ 8% des allèles pathogènes. En estimant que les variants récurrents des gènes Usher sont désormais connus, nous considérons comme non prioritaires, l'ensemble des variants identifiés, inconnus ou non caractérisés et dont la récurrence dans notre population contrôle était supérieure ou égale à 4. E. Cohortes étudiées Depuis le début de l'année 2012, plus de 70 patients ont été séquencés au laboratoire par cette approche. Nous les avons séparés en 3 groupes. 1. Groupe contrôle Ce groupe est composé de 47 patients. Pour chaque patient, au moins un gène Usher a été séquencé soit dans notre laboratoire (Montpellier), soit dans le laboratoire de Valencia (Espagne) (Figure 36, page 17). Sept ont un phénotype USH1, 34 ont un phénotype USH2, et 2 un phénotype USH3. Se rajoutent 4 patients IND , pour qui l'absence de caractéristiques cliniques a empêché leur classification. L'analyse moléculaire par séquençage Sanger a mis en évidence 1 variant pathogène ou susceptible de l'être chez 20 individus. Chez les 27 autres, aucun variant n'a pu être identifié comme pouvant contribuer à la pathologie. #$% ! #$2 ! & ! '()* , - ! 14 ! '()* , - ! % ! . /, ()0 ! 3 ! . /, ()0 ! % ! . /, ()0 ! 3 ! . /, ()0 ! 1 ! '()* , - ! 4 ! '()* , - ! %& ! '()* , - ! %& ! '()* , - ! ! #$%&' ()* , ' -. $/, ' 0 ! 123' ! #4# ' 2 ! '()* , - ! % ! '()* , ! %1 ! '()* , - ! 1 ! '()* , - ! % ! '()* , ! #$1 ! #$ ! 567 ! 2 ! '()* , - ! 4 ! '()* , - ! % ! . /, ()0 ! 3 ! . /, ()0 ! % ! . /, ()0 ! 3 ! . /, ()0 ! 3 ! 2 ! '()* , - ! 2 ! '()* , - ! 2 ! '()* , - ! ()* , ' #$/5' % ! '()* , ! % ! '()* , ! Figure 36 : répartition des patients du groupe contrôle Le gène et le nombre de patients impliqués sont indiqués lorsqu'une mutation a été mise en évidence. Au total, la cohorte espagnole représente 20 individus, 18 USH2 et les 2 patients USH3. Les 27 autres individus font partie de la cohorte française. Etude de l'exome ciblé : Cohortes étudiées Groupe contrôle Le Tableau 13 (page 127) représente pour chaque patient, le type clinique ainsi que les gènes qui avaient précédemment été étudiés chez eux. Tableau 13 : Patients du groupe contrôle et gènes analysés Colonne patient : U, patients issus de la cohorte française RP de la cohorte espagnole ; U1, 2 , 3 et IND correspondent au type clinique du patient. X : gène séquencé chez ce patient ; : patient étudié en aCGH ; APP : apparenté du patient étudié en a CGH. Etude de l'exome ciblé : Cohortes étudiées Groupe patients Usher 2. Groupe patients Usher Les treize patients inclus dans ce groupe ont été analysés directement par NGS, sans aucune analyse haplotypique ni séquençage Sanger préalables. 3. Groupe patients surdités L'activité du secteur diagnostic neurosensoriel du laboratoire inclut également la recherche de mutations chez des patients atteints de surdité non syndromique. Cette stratégie a donc été également testée chez 11 patients préalablement analysés au locus DFNB1 (dont les mutations constituent la cause la plus fréquente de surdité d'origine génétique). Ces patients ont été sélectionnés pour l'analyse NGS sur les critères suivants : Surdité familiale (consanguinité probable chez 7 d'entre eux selon le dossier clinique) 0 ou 1 mutation identifiée au locus DFNB1 (un seul patient avait précédemment été identifié comme porteur de la mutation majoritaire c. 35delG (p. G12fs). Résultats : Groupe contrôle Données brutes et critères de qualité III. Résultats A. Groupe contrôle 1. Données brutes et critères de qualité Les analyses quantitatives et qualitatives des données brutes obtenues par l'approche NGS sont issues du groupe contrôle . On a pu montrer une nette amélioration du nombre de séquences utilisables pour l'alignement obtenu entre les premiers et les derniers patients séquencés. En effet, comme toute technique, cette nouvelle stratégie nécessite une phase d'adaptation et de prise en main. Après le séquençage, le premier tri consiste à sélectionner les séquences analysables. En moyenne, environ 130 000 séquences par run (donc par patient) s'avèrent analysables par les logiciels d'alignement de séquences et d'identification de variants. Certaines séquences peuvent être éliminées de toute analyse pour plusieurs raisons : - l'absence de la séquence tag . Cette séquence fait partie des adaptateurs utilisés lors de la ligation. Elle permet de dissocier les séquences d'intérêt et les séquences contrôles ou inconnues. - la présence de plusieurs séquences dans un même puits de la microplaque. Lorsque plusieurs produits sont fixés et amplifiés sur une même bille lors de l'emPCR, le séquençage ne permet pas de distinguer la séquence de l'une par rapport à la séquence de l'autre. - une séquence trop courte et/ou une qualité de séquence trop faible. a. Analyse des séquences Les 130 000 séquences obtenues (Figure 37-A, page 130) représentent environ 53, 2 millions de nucléotides (Figure 37-B, page 130). Chaque séquence fait en moyenne 410 pb ce qui est en accord avec les spécifications attendues sur un 454 GS Junior (Roche). Plus de 99% de ces séquences sont alignées sur le génome humain, utilisé comme séquence de référence (Figure 38, page 131). Parmi ces 130 000 séquences, 99 000 en moyenne sont alignées sur les régions chromosomiques d'intérêt précédemment détaillées (Partie III, II. A, page 113), soit environ 76% (Tableau 14, page 130). En termes de paires de bases, sur les 53, 2 Mb obtenues, environ 42, 6 Mb sont alignées, soit 80% (Figure 38, page 131). Ce pourcentage devrait être Résultats : Groupe contrôle Données brutes et critères de qualité identique à celui obtenu avec le calcul précèdent (76%), cependant il apparat supérieur car il existe une différence de taille nucléotidique entre les séquences totales et les séquences alignées. En effet, lorsque l'on réalise le calcul de la taille moyenne sur les séquences alignées, on obtient une moyenne de 430 paires de bases alors que la taille des moyennes des séquences non alignées est d'environ 340 pb. Figure 37 : Données brutes moyennes par run de séquençage A- nombre de séquences totales et alignées par run, sur l'ensemble du groupe contrôle (47 patients) ; B- nombre moyen de paires de bases totales, nombre de paires de bases alignées et nombre de paires de bases alignées dans les régions d'intérêt par run, sur l'ensemble du groupe contrôle. La qualité globale du séquençage se basera donc, de ce fait, sur le nombre de paires de bases et non sur le nombre de séquences. Celui-ci est plus rigoureux et apporte des informations supplémentaires, comme le nombre de nucléotides alignés dans les régions chromosomiques d'intérêt. La moyenne observée dans la cohorte étudiée est de 28, 1Mb (Figure 37-B, page 130). Le pourcentage de nucléotides alignés dans la région d'intérêt est donc d'environ 53% par rapport au nombre total de nucléotides séquencés par run (Figure 38, page 131), et d'environ 66% par rapport au nombre de nucléotides alignés globalement. Par soustraction, on conclut que 13% des nucléotides séquencés et alignés sont situés en bordure des régions d'intérêt, ce qui est en accord avec les chiffres obtenus théoriquement lors de la définition de la méthode (voir chapitre II. B, page 117). Tableau 14 : Nombre moyen de séquences obtenues par run Taille moyenne Séquences Nombre Mb / séquence (pb) Alignées 42, 6 99000 (76%) 430 (pourcentage du total) (80%) Non alignées 31000 10, 6 340 Total 130000 53, 2 410 Résultats : Groupe contrôle Données brutes et critères de qualité La profondeur de couverture correspond au nombre de séquences alignées par rapport à une séquence de référence. En se référant à des résultats présentés lors de séminaires sur l'application du NGS en diagnostic (Réunion ANPGM des généticiens moléculaires, Paris, mars 2011), nous avons défini qu'une profondeur minimale de 40X pouvait être considérée comme acceptable pour une validation diagnostique. L'ensemble des régions d'intérêt est constitué d'environ 325 kb et le nombre moyen de nucléotides alignés dans ces régions par run est de 28, 1 Mb. Si on considère une répartition homogène et totale, on obtient une profondeur moyenne de 85X. Figure 38 : Illustration schématique du pourcentage moyen de séquences par run pour une région d'intérêt Adaptée d'une représentation obtenue avec l'outil web Galaxy. Cependant, la couverture n'est pas homogène sur l'ensemble de nos régions d'intérêt. En effet, il existe une variabilité d'un gène à l'autre (Figure 39, page 132), avec des moyennes de profondeur de couverture par gène allant de 55, 8X (USH1G) à 106, 9X (TECTA), et une variabilité intragénique (Annexe 4, page 196). Au total, seulement 37 régions sur les 634 capturées ont une profondeur de couverture moyenne inférieure à 40X sur la moyenne des 47 patients, soit une profondeur insuffisante dans 5, 8% des régions (Tableau 15, page 132). Résultats : Groupe contrôle Données brutes et critères de qualité Figure 39 : Profondeur moyenne de couverture par gène Bilan effectué sur les 47 patients du groupe contrôle. Tableau 15 : Répartition des régions par gène, en fonction de leur couverture Gènes Régions Régions Gènes Régions Régions USH > 40X < 40X USH > 40X < 40X MYO7A 52 3 GJB2 4 1 USH1C 30 3 GJB6 8 2 PCDH15 42 3 GJB3 5 1 CDH23 76 2 TMC1 26 2 USH1G 5 1 TECTA 25 0 USH2A 76 1 VEZT 15 0 GPR98 92 7 MYO15A 67 1 DFNB31 15 1 OTOF 50 5 PDZD7 20 2 CHM 18 2 CLRN1 8 0 Total 634 37 Nous avons alors réalisé une analyse fine des régions présentant un taux faible de couverture par le biais de 2 paramètres : le pourcentage de GC des régions impliquées ainsi que le nombre de sondes biotinylées permettant leur capture. b. Analyse des régions de faible profondeur de couverture Nous avons testé le rapport entre le pourcentage de GC de chacune des régions et leur profondeur de couverture (Figure 40, page 133), ce qui a permis d'identifier 3 groupes : - Profondeur > 40X et teneur en GC < 50% (vert) - Profondeur > 40X et teneur en GC > 50% (bleu) - Profondeur < 40X (orange) Résultats : Groupe contrôle Données brutes et critères de qualité Le premier groupe (vert) contient 283 régions sur les 634 régions capturées avec une moyenne de 38% de GC ; la profondeur est de 90X. On observe dans cette région une tendance à l'augmentation de la profondeur avec l'augmentation du pourcentage de GC bien que sa distribution soit éparse. Le second groupe (bleu), présente une dispersion plus homogène. Le point à 80X de profondeur de couverture pour un pourcentage de GC de 60% représente la moyenne des 314 régions. Même si cette valeur globale est plus faible en termes de couverture, l'homogénéité de celle-ci suggère qu'il est préférable de séquencer une région ayant un pourcentage de GC de 60% qu'une région proche de 40%. Enfin, le troisième groupe (orange) rassemble 37 régions qui présentent une profondeur inférieure à 40X. La moitié d'entre elles présentent un pourcentage en GC supérieure à 60%. Il est aussi intéressant de noter qu'aucune des régions dont le pourcentage de GC excède 70% (cercle rouge) n'a pu atteindre la profondeur de couverture attendue de 40X. La seconde moitié des régions avec une profondeur inférieure à 40X a une composition en GC comprise entre 25 et 60%. Pour celles-ci, la teneur en GC n'est pas le facteur explicatif de la faible couverture de ces régions. Figure 40 : Dispersion des régions en fonction de leur profondeur de couverture à l'issue du séquençage et de leur teneur en GC Nous avons ensuite étudié la corrélation entre le nombre de sondes biotinylées permettant la capture d'une région et la profondeur de couverture résultant de celle-ci après séquençage Résultats : Groupe contrôle Données brutes et critères de qualité (Figure 41, page 134). La moyenne pour l'ensemble des régions capturées est de 7, 1 sondes par nucléotide. En revanche, on observe une moyenne de 6, 2 sondes par nucléotide dans les régions pour lesquelles la profondeur est inférieure à 40X. Parmi elles, les régions à haute teneur en GC (>60%) ont une moyenne similaire à la moyenne globale. Par contre, il est intéressant de remarquer que les régions mal couvertes et dont le pourcentage de GC est inférieur à 60% ont une moyenne inférieure avec 5, 3 sondes par nucléotide suggérant alors que ce nombre de sondes inférieur peut avoir un effet final négatif sur la profondeur de couverture. Figure 41 : Dispersion des régions en fonction de leur profondeur de couverture à l'issue du séquençage et du nombre moyen de sondes par nucléotide capturé En conclusion, la très grande majorité des régions atteint la profondeur de couverture attendue de 40X. Pour les 5% restants, la haute teneur en GC de ces régions et le faible nombre de sondes biotinylées synthétisées pour capturer ces régions semblent être deux facteurs indépendants pouvant entrer en jeu dans la mauvaise couverture. c. Ratio profondeur/dose chromosomique Nous avons testé ce paramètre en se basant sur les données obtenues pour le gène CHM, localisé sur le chromosome X et en calculant le ratio entre les profondeurs de couverture des régions situées sur les autosomes et les profondeurs de couverture des régions du gène CHM (Figure 42, page 135). Le rapport moyen pour les 22 femmes est de 1, 1 (allant de 0, 77 à 1, 42) tandis qu'il est de 2, 1 pour les 25 hommes (de 1, 54 à 2, 68). Aucun chevauchement Résultats : Groupe contrôle Identification des variants n'a eu lieu entre les ratios des hommes et des femmes. Nous avons donc pu conclure qu'il existe effectivement un rapport entre la dose chromosomique et la profondeur de couverture des régions. Ces données laissent donc supposer que la mise en évidence de grands réarrangements (délétion ou duplication de 1 ou plusieurs exons) sera possible. Figure 42 : Ratio profondeur moyenne autosomes / profondeur moyenne Chr X La boite à moustaches rouge correspond au ratio des femmes. A droite de celle-ci, est représenté le ratio pour chacune des femmes séquencées. La boite à moustaches bleue correspond au ratio des hommes avec à sa droite, chaque valeur individuelle. 2. Identification des variants a. Nombre de variants Le logiciel GS Reference Mapper, utilisé pour réaliser l'alignement de séquences, permet aussi l'identification des variations nucléotidiques. Deux fichiers sont créés par le logiciel : le premier contient l'intégralité des variants identifiés, tandis que le second, utilisé par l'interface graphique du logiciel, répertorie uniquement les variants que le logiciel considère comme fiables. Le choix s'est orienté vers l'utilisation du fichier total puis d'un tri des variants d'intérêt en fonction de nos critères (voir II. D, page 122). Ce fichier est ensuite traité par GSdot (II. D. 1, page 122). La Figure 43 (page 136) représente le nombre de variations moyen pour l'ensemble du groupe contrôle, à chaque étape de l'analyse. Initialement, GS Reference identifie pour chaque patient 4700 variations (boite à moustache totales , Figure 43). Parmi elles, la grande majorité ne remplit pas le critère d'hétérozygotie. En effet, environ 4300 variations n'excèdent pas la fréquence de 20% et sont immédiatement éliminées. Il reste alors 420 variations en moyenne à l'issue de cette première étape (boite à moustache > 20% d'hétérozygotie , Figure 43). Parmi ces variations, une vingtaine seront finalement considérées comme des artefacts technologiques (la différence d'hétérozygotie Fwd/Rvs suggère que ces variations sont localisées au niveau de régions contenant des Résultats : Groupe contrôle Identification des variants homopolymères). Puis, environ quarante variations (par patient) seront éliminées car situées en dehors des régions d'intérêt. Il s'agit des petites indels introniques éloignées de plus de 20 pb des exons. Au final, on obtient environ 360 variants par patient pour 19 gènes étudiés. Ces variants seront analysés plus en détail. Figure 43 : Nombre de variations selon filtration Représentation du nombre de variations selon les critères choisis (réalisé sur l'ensemble du groupe contrôle). b. Estimation de la sensibilité analytique Il est essentiel d'établir la sensibilité de notre stratégie NGS en vue d'un transfert au secteur diagnostic. Pour cela, nous avons vérifié que les variants, précédemment identifiés en séquençage Sanger chez les patients du groupe contrôle, étaient aussi identifiés par NGS. En considérant donc le séquençage Sanger comme méthode de référence, le pourcentage de variants non identifiés en NGS correspond alors au taux de faux-négatifs. Nous avons utilisé les données issues de l'analyse des 24 patients du groupe contrôle analysés au laboratoire par séquençage Sanger pour au moins un des gènes Usher (patient dont l'identifiant commence par un U, Tableau 13, page 127). Un total de 689 variants était recensé après l'analyse Sanger. Parmi eux, 674 (97, 8%) ont été retrouvés en NGS avec des résultats exacts quant à la position nucléotidique et le statut homozygote ou hétérozygote. Résultats : Groupe contrôle Identification des variants Une analyse fine des 15 variants non détectés en NGS a été effectuée (Figure 44, page 137). Six d'entre eux sont situés dans des régions homopolymériques ; 4 résultent d'erreurs d'alignement du logiciel GS Reference mapper (utilisé par défaut). L'utilisation du second logiciel, SeqNext (JSI Medical Systems), a permis de les identifier sans ambiguïté. Trois variants n'ont pas été retrouvés du fait de leur situation dans des régions mal couvertes de la capture de séquences. Enfin, deux sont encore en cours de vérification car l'absence de corrélation des résultats obtenus par NGS/Sanger n'est pas expliquée (présence à l'état homozygote en NGS et à l'état hétérozygote en Sanger). -. /. 0. 12/34#) *) ! #$%&'() 5 ; 84#) 5167$#/#$8) * , ) @A) , ) 94. : . $ # ; 4) $)>. ; 4() ? ) Figure 44 : Répartition des variants précédemment identifiés en Sanger La stratégie de sélection et de conservation des variants permet donc une identification des variants avec une sensibilité >97%. Les faux négatifs ont principalement pour origine une mauvaise couverture de la région et/ou la présence d'homopolymères proches de la variation. En ce qui concerne les homopolymères, l'utilisation d'autres outils d'alignement peut réduire le nombre de faux négatifs. Nous reviendrons sur ces outils par la suite. c. Priorisation des variants d'intérêt Dans la suite de ce manuscrit nous utiliserons le terme de priorisation pour toute étape de hiérarchisation des variants dans le but d'établir un ordre de priorité des analyses supplémentaires à réaliser. 1. Stratégie de priorisation La dernière étape d'analyse du groupe contrôle a consisté à mettre au point un filtre de priorisation des variations pathogènes ou susceptibles de l'être. Pour cela nous avons utilisé le fichier global des variants identifiés par NGS, incrémenté par chaque nouvelle analyse. A ce jour, ce fichier global contient les 2200 variations différentes identifiées chez les Résultats : Groupe contrôle Identification des variants 70 individus ayant été séquencés, dont 1735 variations identifiées chez les 47 individus du groupe contrôle. La Figure 45 (page 138) répertorie les étapes successives de la priorisation, l'objectif étant de conserver les variations connues chez les patients de ce groupe contrôle comme étant probablement impliquées dans la pathologie. Parmi les 1735 variations identifiées chez les 47 patients contrôles, 642 ont été masquées car elles étaient récurrentes et non recensées comme pathogènes. La récurrence de ces variations est calculée sur l'ensemble des patients incrémentés au fichier global. Dans l'étape suivante, nous avons choisi de masquer les variants introniques, éloignés de plus de 20 pb des jonctions introns/exons. En effet, parmi les variants actuellement répertoriés dans LOVD USHBases, le nombre de variations pathogènes localisées dans ces régions est extrêmement faible par rapport au nombre de variations neutres identifiées (par exemple, à notre connaissance, seule une variation pathogène répond à ces critères pour USH2A, ainsi que pour MYO7A). Nombre de variants (groupe contrôle) %&18 ! - 642 variants récurrents non pathogènes %391 ! - 683 variants hors exons et introns < /-20 bp 4%3 ! UEX : Variants Exome Usher 292 ! % ? ! DEX : Variants Autres : ; ! 7 : ; ! < 2 ! > ! 2 8 ! > ! '()* , ! '()* , ! Figure 45 : Filtre de priorisation des variants issus du groupe contrôle Le choix de masquer et non d'éliminer ces variants permettra de revenir sur chacun d'entre eux si nécessaire. Il reste donc 410 variants, parmi lesquels 292 localisés dans les 10 gènes Usher, et 118 dans les autres gènes. Les filtres appliqués définissent 9 variants à étudier prioritairement pour chaque patient parmi l'ensemble des gènes Usher. A la suite de cette priorisation, les variants restants seront comparés aux différentes bases de données telles que USHVaM et LOVD USHBases. Les variants non encore décrits seront soumis à la batterie d'analyses, développée dans le chapitre : Validation des mutations et variants inconnus identifiés (Partie I - II. F. 2. c, page 56). Résultats : Groupe contrôle Identification des variants 2. Etude de l'efficacité de la priorisation L'efficacité de la priorisation peut être définie comme la capacité du filtre à réduire l'analyse, à un nombre limité de variants et ce, sans masquer ceux d'intérêt. Afin d'étudier cette efficacité, nous nous sommes basés sur les variants pathogènes connus chez les individus de notre groupe contrôle. Nous avons alors observé si la stratégie de priorisation mise en place les conservait. Le Tableau 16, page 139 reprend en détail, les résultats obtenus en Sanger et par NGS. Tableau 16 : Patients du groupe contrôle porteurs de 1 ou 2 mutations Sanger NGS Sanger NGS Patient Gène Variation 1 Variation 2 Mutations non détectées par NGS U331 PCDH15 Del E18 E26 - - c. 6116 6119del U283 USH2A /- p. G2039fs c. 166 167insC U329 PDZD7 - p. R56fs ème 2 mutation identifiée par NGS c. T RP98 USH2A - c. C p. Ser2639Pro p. Arg4935* c. 2299delG RP1578 USH2A c. 13811 G - p. Glu767fs c. T c. A U654 USH2A - p. Pro1843Leu p. Trp3955* 2 mutations identifiées par NGS c. A c. A RP1616 USH2A - - p. Trp3955* p. Trp3955* c. A c. A RP1604 CDH23 na na p. Tyr2407* p. Tyr2407* c. T c. T RP1611 CLRN1 na na p. Gly23* p. Gly23* c. A c. T U1080 USH1C na na p. Gly104Asp p. Gln76* c. A c. 3764delA RP1024 MYO7A na na p. Pro1204Thr p. Lys1255fs c. 2299delG c. C U996 USH2A na na p. Glu767fs p. Cys726Arg c. 13535 13536delCT c. 13535 13536delCT U277 GPR98 na /- na /- p. Pro4513fs p. Pro4513fs 1 mutation identifiée par NGS U585 MYO7A c. 2283-T na 2 mutations dans 2 gènes c. 2299delG GPR98 : c. A p. U286 USH2A na p. Glu767fs Trp3486* Résultats : Groupe contrôle Identification des variants Tableau 16 (suite) Sanger NGS Sanger NGS Patient Gène Variation 1 Variation 2 Mutations identifiées : résultats identiques Sanger/NGS c. 917 918insCAGC RP1617 USH2A c. C p. Ser2639Pro p. Ser307fs c. T RP1360 USH2A p. Cys759Phe c. T U466 USH2A p. Cys759Phe c. T RP963 USH2A p. Cys759Phe c. T RP1635 USH2A p. Cys759Phe c. G U932 USH2A p. Cys717Gly c. T U496 USH2A p. Arg1777Trp c. 1211delA RP1485 USH2A p. Glu404fs c. A U391 GPR98 p. Gly2045Arg c. T RP1634 GPR98 p. Gln5796* c. T U787 GPR98 p. Arg5688* c. A U838 MYO7A p. Cys31* c. T U461 CDH23 p. Asp1130Tyr U810 PCDH15 c. 1441-A Patients U : cohorte française ; Patients RP cohorte espagnole ; : identifiée par l'approche utilisée ; - : non identifiée ; /- : identifiée en fonction du logiciel d'alignement utilisé ; na : gène non analysé en Sanger. Mutations non détectées par NGS Parmi les 3 variations manquantes, l'une correspond à un grand réarrangement (délétion des exons 18 à 26 de PCDH15 chez U331), ne pouvant donc pas être identifié dans le cadre de cette étude. Les deux autres altérations sont des indels : c. 6116 6119delGCTG dans USH2A (U283) et c. 166 167insC dans PDZD7 (U329). Il s'avère que ces deux altérations ne sont pas non plus retrouvées dans le fichier initial des variants, généré par GS Reference Mapper suite à l'alignement des séquences. Notre filtration n'est donc pas mise en défaut par ces faux négatifs. Nous avons alors analysé les données brutes de séquençage avec un autre logiciel commercial d'alignement et d'analyse, SeqNext (JSI Medical Systems). Chez U329, l'utilisation de SeqNext, n'a pas non plus permis d'identifier la mutation c. 166 167insC du gène PDZD7. Cette variation se situe dans une région homopolymérique de 7 nucléotides (Figure 46, page 141). Il semble donc que la technologie de pyroséquençage 454 ne soit pas Résultats : Groupe contrôle Identification des variants efficace dans cette région, ce qui a déjà été rapporté de façon générale pour les régions homopolymériques. Figure 46 : Electrophérogramme de confirmation de la variation c. 166 167insC dans PDZD7 pour U329 par séquençage Sanger En revanche, la deuxième altération c. 6116 6119delGCTG dans USH2A a pu être détectée par le logiciel SeqNext (au travers de nombreux faux-positifs). En étudiant les données brutes extraites de GS Reference Mapper, on observe la délétion, mais les critères de qualité du logiciel ne la considèrent pas comme une variation. Son absence est donc due à un défaut d'interprétation du logiciel utilisé et ne met pas en défaut la technologie de pyroséquençage en elle-même. Par ailleurs, il apparat que la version précédente du logiciel GS Reference Mapper (2. 6, actuellement 2. 7) avait permis son identification chez ce même patient. Il semble donc que les logiciels fournis par Roche ne soient pas encore totalement adaptés à l'utilisation souhaitée. En conclusion, toute variation pathogène identifiée par le logiciel GS Reference Mapper a été sélectionnée par notre stratégie de priorisation. Cette approche a également mis en évidence de nouvelles variations au sein du groupe contrôle, comme détaillé par la suite. 2ème mutation identifiée par NGS Le NGS a permis de révéler une seconde mutation dans USH2A, chez 3 individus. Pour RP98 et RP1578, la cause est une erreur de lecture puisqu'en reprenant les données obtenues par la technique Sanger, les mutations ont pu être identifiées : il s'agit de c. T (p. Arg4935*) chez RP98 et d'une mutation à l'état homozygote d'un site d'épissage (c. 13811 G) chez RP1578. Chez le patient, U654, seul un variant rare avait précédemment été mis en évidence (c. T, p. Pro1843Leu). Le NGS a validé son identification et mis en évidence la variation c. A (p. Trp3955*). Cette variation était masquée par une amorce de marquage en séquençage Sanger. Résultats : Groupe contrôle Identification des variants 2 mutations identifiées par NGS Le NGS a permis d'identifier 2 mutations chez 7 patients du groupe contrôle . Pour l'un d'entre eux, RP1616, le gène impliqué, USH2A avait été analysé mais la mutation à l'état homozygote (c. A, p. Trp3955*) n'était pas visible car masquée par l'amorce de marquage (cas similaire à U654). Pour les 6 autres individus, le séquençage Sanger du gène impliqué n'avait pas été effectué. Deux patients, RP1604 et RP1611, cliniquement diagnostiqué USH2, portent des mutations non-sens homozygotes dans les gènes CDH23 (c. A, p. Tyr2407*) et CLRN1 (c. T, p. Gly23*). Ces deux gènes sont impliqués dans les syndromes de type I et de type III. RP1024 était cliniquement considéré comme USH3. L'analyse de CLRN1 et des gènes USH2, s'était révélée négative par séquençage Sanger. Le NGS a permis d'identifier une hétérozygotie composite c. A (p. Pro1204Thr) et c. 3764delA (p. Lys1255fs) dans le gène MYO7A. Pour le patient U1080, un variant rare identifié dans MYO7A avait engendré une poursuite des efforts dans l'étude de ce gène. Il s'est avéré que celui-ci était hétérozygote composite dans USH1C pour une substitution menant à un PTC (c. T, p. Gln76*) et un variant rare, potentiellement pathogène (c. A, p. Gly104Asp). Pour le patient U996, les données cliniques ne permettaient pas de le classer dans un type défini. Les 3 exons de CLRN1 ont été séquencés sans identification d'implication probable ; ce patient porte en fait 2 mutations dans USH2A (c. 2299delG, p. Glu767fs et c. C, p. Cys726Arg). En ce qui concerne U277, cliniquement diagnostiqué comme USH2, une analyse microsatellites aux différents loci USH2 avait été effectuée (une consanguinité était documentée) et avait exclu le locus USH2C sur la base d'une homozygotie retrouvée pour le cas index, l'un des membres sains de la fratrie et la mère. La mutation (c. 13535 13536delCT, p. Pro4513fs) du gène GPR98 a finalement été retrouvée à l'état homozygote chez le cas index. Ces résultats suggèrent que nos marqueurs n'étaient pas informatifs pour cette famille. De plus, on peut noter que cette mutation a été détectée avec GS Reference Mapper en version 2. 6 et non en 2. 7. 1 mutation identifiée par NGS Le patient U585, présentant un phénotype USH2, a été analysé dans les 3 gènes potentiels sans mise en évidence de mutation. Une mutation (c. 2283-T) du gène MYO7A a été identifiée. Résultats : Groupe contrôle Identification des variants 2 mutations dans 2 gènes : digénisme ? La mutation c. 2299delG (p. Glu767fs) avait été identifiée comme seule altération dans USH2A chez U286. Ce patient, est également porteur à l'état hétérozygote de la mutation c. A (p. Trp3486*) dans le gène GPR98. Ce patient présente donc deux altérations pathogènes dans deux gènes différents. Plusieurs hypothèses se posent alors. Soit une mutation n'a pas été identifiée dans l'un des deux gènes, soit nous pouvons être en présence d'un cas de digénisme. Mutations identifiées : résultats identiques Sanger/NGS Pour 14 individus, l'approche NGS n'a pas amélioré le taux de détection puisque la 2ème mutation (si présente) n'a toujours pas été identifiée. Par ailleurs, 18 autres patients (non représentés dans le tableau) restent sans mutation après l'utilisation de ces 2 approches. Résultats : Groupe patients Usher Identification des variants B. Groupe patients Usher Treize patients Usher ont été inclus dans ce groupe : 5 patients USH1, 7 patients USH2 et 1 patient USH3. Puisque la stratégie de priorisation n'a pas engendré de perte d'information pour les variants pathogènes, nous avons utilisé cette même approche pour ces patients. Plus de 1000 variants ont été identifiés dans ce groupe (Figure 47, page 144). La priorisation a permis la sélection de 6 variants en moyenne par patient, à analyser de façon prioritaire. Ces variants sont ensuite étudiés manuellement et recherchés dans les bases de données listées. Plusieurs variants ont été par la suite éliminés car décrits comme non pathogènes dans USHVaM et/ou LOVD USHBases. Variants du groupe patients %32& ! - 683 variants récurrents non pathogènes 144 ! - 216 variants hors exons et introns < /-20 bp %2 ? ! UEX : Variants Exome Usher DEX : Variants Autres ? % ! : ; ! 4& ! 7 : ; ! < 2 ! > ! 1 '()* , ! '()* , ! : G0. * ! Analyses DEA7 ! A(HI( , ! complémentaires -@A(BC ! #$F(-*-CC ! #*HJ*H ! Figure 47 : Priorisation de l'analyse dans le groupe de patients Usher *répertorie uniquement les variants des gènes Usher ; *répertorie les altérations des gènes Usher publiées et très minoritairement, celles publiées sur les gènes surdités inclus dans la capture Résultats : Groupe patients Usher Identification des variants La stratégie de priorisation a permis d'identifier les mutations chez 10 des 13 patients (Tableau 17, page 145), en accord avec leur phénotype clinique. Pour l'un d'entre eux, U1170, le variant c. A (p. Gly158Arg) n'avait jamais été identifié et a été classé UV3 selon notre arbre décisionnel de classification des VSCI. On peut observer qu'après priorisation, U1170, U1185 (tous deux porteurs de 2 variations probablement pathogènes dans un gène) ainsi que U1067, U1120 et U1084, présentent des altérations qui nécessitent des analyses supplémentaires. Ainsi, on peut noter chez U1185 la présence de la mutation c. 496 T du gène USH1C, fréquemment retrouvée dans la population du Royaume-Uni (Le Quesne Stabej et al. , 2012). De plus, chez U1120, patient cliniquement diagnostiqué USH1, nous avons identifié un variant connu pour être probablement pathogène dans USH2A (c. T, p. Thr4337Met). Tableau 17 : Variants d'intérêt du groupe Patients Usher Nombre variants gènes Usher et candidats Patien Type Gène Variation 1 Variation 2 supplémentaires conservés par la priorisation. t Les variants listés sont en cours d'analyse. c. 8994 8995ins c. 8994 8995ins U1093 USH2 GPR98 4 p. Ala2998fs p. Ala2998fs c. T c. A U1141 USH2 USH2A 14 p. Thr352Ile (UV4) p. Arg317Arg (UV4) c. 14475 14484del c. 14766delG U1148 USH2 USH2A 5 p. Ala4827fs p. Trp4922* U1157 USH1 CDH23 c. 9278 C c. 9278 C 5 c. 2882delA c. T U1167 USH2 USH2A 10 p. His961fs p. Cys419Phe (UV4) c. T 13536 13537delTC U1171 USH2 GPR98 2 p. Arg2377* p. Pro4513fs c. 5015 5016del U1163 USH1 CDH23 c. 6712 A 8 p. Tyr1672fs c. A U1178 USH2 GPR98 c. A p. Ser955* 6 p. Ser955* 9 dont USH1C : c. 496 T c. A c. T U1185 USH2 USH2A VEZT : c. 1831 G Val218Glu (UV3) p. Thr4337Met (UV3) MYO15A : c. T, p. Leu3160Phe 5 dont CDH23 : c. T, p. Gly3107Trp c. A VEZT : c. A, p. Glu466Lys U1170 USH1 MYO7A c. A p. Trp1834* p. Gly158Arg (UV3) MYO15A : c. 4655 A CLRN1 : c. 472 T 10 dont USH2A : c. T, p. Thr4888Ser PDZD7 : c. G, p. Ala639Gly MYO7A : c. T, p. Pro2074Ser c. T U1084 USH1 USH1C - GPR98 : c. A, p. Ile909Ile p. Arg103Cys (UV3) GPR98 : c. C, p. Thr2160Thr GPR98 : c. G, p. Thr3122Thr DFNB31 : c. A, p. Gly19Asp 2 dont USH2A : c. 15287 15288insT, p. Glu5096fs U1067 USH3 - - - GPR98 : c. T, p. Thr992Ile c. T 5 dont CDH23 : c. A, p. Glu3302Lys U1120 USH1 - - p. Thr4337Met (UV3) GPR98 : c. C, p. Val2134Val Variants Usher supplémentaires : nombre de variants issu de la priorisation et dont des études supplémentaires en cours sont nécessaires pour leur caractérisation (dont, pour certains, une validation par séquençage Sanger). Résultats : Groupe patients surdités : étude pilote Identification des variants C. Groupe patients surdités : étude pilote Dans une dernière partie, nous avons étudié la faisabilité de la stratégie NGS, chez 11 patients atteints de surdité non syndromique (voir chapitre II. E. 3, page 128), afin d'estimer les possibilités de mise en place de cette approche dans notre laboratoire. Les mêmes filtres de priorisation ont été appliqués. Compte tenu du nombre de gènes Usher pouvant être également responsables de surdité non syndromique, nous avons choisi de les inclure dans l'étude. Un total de 18 gènes est alors étudié. Cette priorisation a sélectionné 11 variants par patient en moyenne (Figure 48, page 146). Ces variants sont ensuite étudiés manuellement et recherchés dans les bases de données listées. Il apparat que le développement de bases de données dédiées telles que celles utilisées pour le syndrome de Usher (USHVaM et LOVD USHBases) est indispensable. - Variants du groupe surdité %32 - 662 variants récurrents non pathogènes 1 - 238 variants hors exons et introns < /-20 bp %2 % 4 ! > ! Variants priorisés '()* , ! 7*(K *- ! : G0. * ! Analyses J(HI()0 ! J(HI( , ! complémentaires L(, (M(-* ! -*HJ*H ! Figure 48 : Filtre de priorisation des variants du groupe patients surdité Pour les patients chez qui une consanguinité était documentée, nous avons étudié prioritairement les gènes porteurs de variants à l'état homozygote (indiqués en bleu sur le Tableau 18, page 147). Après priorisation, seuls 2 variants ont été retrouvés à l'état homozygote dont un neutre (c. T, p. Thr1566Met) dans le gène MYO7A chez S28. La seconde variation a été retrouvée chez S91. Il s'agit de l'altération c. T, (p. Arg389*) du gène TMC1. Cette mutation a précédemment été rapportée dans la littérature associée à des surdités non syndromiques (Meyer et al. , 2005). Résultats : Groupe patients surdités : étude pilote Identification des variants Comme le montre le Tableau 18 (page 147), de nombreux variants ont été identifiés dans des gènes non étudiés au laboratoire jusqu'ici. Après validation par séquençage Sanger, nous tiendrons compte notamment de la transmission récessive de la pathologie (recherche de 2 altérations par gène) et analyserons la position en trans de ces variants dans un même gène. Nous évaluerons ensuite leur effet pathogène selon l'arbre décisionnel précédemment défini. L'interprétation de ces variants reste délicate car nous ne disposons pas encore de bases de données dédiées internes au laboratoire. (Partie I, Figure 20, page 57). Tableau 18 : Variants d'intérêt du groupe surdité Consanguinité Variants priorisés Autres Patient Détail probable homozygotes USH2A : c. T, p. Arg2859Cys GJB3 : c. T, p. Arg32Trp S4 oui 0 9 PCDH15 : c. C, p. Gly402Ala USH1C : c. 2326 2327insG, p. Ile776fs MYO15A : c. 7509 7510insC, p. Val2503fs MYO15A : c. 7967-T S11 oui 0 6 OTOF : c. G, p. Asn857Asp S25 oui 0 2 MYO7A : c. 849 G MYO7A, c. T, (p. Thr1566Met), homozygote, neutre PDZD7 : c. 1527 1528insCG, p. Met509fs PCDH15 : c. G, p. Pro292Arg PCDH15 : c. A, p. Ser19Thr S28 oui 1 17 TECTA : c. 3825 3826insG, p. Thr1275fs MYO15A : c. 7251 7252insC, p. Lys2417fs OTOF : c. T, p. Asp43Asp GPR98 : c. 5944 5945insA, p. Ser1982fs TMC1, c. T, p. Arg389*, homozygote, mutation S91 oui 1 6 MYO15A : c. T, p. Ala631Val USH2A : c. T, p. Asp4968Asp S634 oui 0 13 USH1C : c. C, p. Gly830Arg MYO15A : c. C, p. Trp872Arg MYO7A : c. T, p. Gly229Gly MYO15A : c. T, p. Pro585Pro S789 oui 0 11 OTOF : c. G, p. Lys493Arg OTOF : c. G, p. Pro490Arg CDH23 : c. 6050-A S334 nd - 13 MYO15A : c. T, p. Ala897Ala MYO15A : c. 7251 7252insC, p. Lys2417fs USH2A : c. G, p. Asn3808Ser PDZD7 : c. T, p. Pro715Leu S385 nd - 10 MYO15A : c. T, p. His552His OTOF : c. T, p. Arg656Trp GJB2 : c. 35delG, p. G12fs, hétérozygote, pathogène # PDZD7 : c. T, p. Gly484Gly CDH23 : c. A, p. Val2411Ile TECTA : c. T, p. Asp1080Val S565 nd - 18 TECTA : c. A, p. Pro1152Pro USH1C : c. T p. Leu153Phe USH1C : c. G p. Glu133Gly MYO15A : c. T, p. Pro269Leu GPR98 : c. 16395delT, p. Phe5465fs CDH23 : c. G, p. Ile1332Ser S660 nd - 8 GPR98 : c. A, p. Met1Ile OTOF, c. 1392 T, hétérozygote, probablement pathogène # non identifié par GS Reference Mapper, mais par SeqNext. DFNB : surdité non syndromique à transmission autosomique récessive (d'après dossier clinique du patient) ; nd : non déterminée Discussion et perspectives IV. Discussion et perspectives Acquisition des données brutes Apres une mise au point rigoureuse, nous avons obtenu une reproductibilité satisfaisante dans l'obtention des données brutes entre patients. De nombreuses étapes du protocole ont nécessité une prise en main spécifique et il apparat indispensable d'envisager une automatisation de certaines étapes. Alignement des séquences et sélection des variants L'analyse de nos données prétraitées par GS Reference Mapper a initialement été mise au point et réalisée manuellement. Après validation de nos paramètres de sélection des variations, la stratégie a été automatisée à l'aide de l'outil GSdot. En plus de l'identification des variants et de leur annotation, GSdot permet de calculer la profondeur moyenne de couverture de chacune des régions d'intérêt. Nous avons donc pu noter, pour ces régions, que seulement 6% (37 sur 634) étaient sous-représentés par rapport à la profondeur de couverture que l'on s'était fixé (>40X). Ces informations sur la profondeur de couverture sont essentielles pour valider les résultats. Nous avons observé que certaines régions difficiles à séquencer en Sanger l'étaient aussi en NGS. Par exemple, le séquençage de l'exon 59 du gène USH2A est délicat en Sanger, et la profondeur de couverture de cet exon par NGS est toujours en dessous du seuil fixé. Très peu de sondes ont pu être synthétisées dans cette région reflétant probablement une complexité particulière environnante puisque le taux de GC (36%) ne semble pas en être la cause. Par ailleurs, nous avons remarqué qu'un taux de GC extrême (>70%), ou bien, le faible nombre de sondes biotinylées synthétisées d'une région, jouait un rôle négatif sur la capture, et donc, sur le séquençage NGS. En revanche la faible couverture de certaines régions ne semble pas être corrélée à ces paramètres. On peut émettre alors l'hypothèse d'une similarité entre certaines sondes et des régions génomiques non ciblées pouvant entrainer une compétition d'hybridation lors de la capture de séquences. Au vu de ces résultats, il apparat nécessaire lors d'une nouvelle commande de surreprésenter ces régions. Définition des critères de qualité Notre stratégie a permis de définir les critères de qualité pour lesquels un seuil minimal doit être dépassé pour poursuivre l'analyse. Nous avons notamment identifié deux paramètres engendrant une analyse finale plus complexe voire irréalisable : d'une part le nombre élevé Discussion et perspectives de régions faiblement couvertes et d'autre part un trop grand nombre de variants identifiés par le logiciel. La qualité de la manipulation elle-même et/ou la qualité du séquençage semblent être des points déterminants. Certaines captures de séquences, par exemple, engendrent la rétention de régions aspécifiques du design, et donc une diminution drastique de la profondeur de couverture dans les régions d'intérêt. D'autre part, pour certains séquençages, il semblerait que la caméra ait été saturée par des intensités lumineuses émises trop élevées, menant à un nombre nettement plus conséquent d'erreurs de lecture. Dans un cadre diagnostic il sera donc essentiel d'établir des seuils de qualité en dessous desquels l'analyse du patient ne sera pas poursuivie. D'après nos premières observations, nous pouvons estimer l'invalidité du séquençage lorsque le nombre de variations totales identifiées par GS Reference Mapper est supérieur à 6000 variations ou lorsque le pourcentage de régions insuffisamment couvertes (profondeur de couverture < 40X) excède les 15% du design. Nous avons estimé une sensibilité analytique d'environ 98% (grâce à la comparaison des variants précédemment identifiés en Sanger et ceux détectés en NGS). Bien que ce taux soit encourageant, des améliorations doivent encore être apportées. En effet, les homopolymères sont la source majeure d'artefacts inhérents au séquençage, empêchant à plusieurs reprises la détection de variations pathogènes. De plus, il semble indispensable de motiver les fournisseurs pour obtenir des améliorations de leurs logiciels. L'utilisation d'un autre logiciel, tel que SeqNext (JSI Medical Systems), permet dans la majorité des cas, d'identifier les variants non identifiés précédemment. Mais ce logiciel souffre d'une spécificité très faible. Il serait intéressant d'obtenir la sensibilité de SeqNext associée à la spécificité de GS Reference Mapper, mais il n'existe pas à ce jour d'outil connu de ce type. En revanche, puisque nous connaissons désormais en détails nos exigences requises pour l'identification de variants, il serait peut-être bénéfique de s'orienter vers les outils informatiques disponibles en libre accès, paramétrables selon nos souhaits. Enfin, le traitement des données et leur interprétation reste long et fastidieux et nécessite l'acquisition de nouvelles compétences par les utilisateurs. Discussion et perspectives Vers un transfert en diagnostic ? Nous avons montré, malgré certaines difficultés techniques et d'analyse, que l'approche d'identification des variations pathogènes s'avérait performante et prometteuse. Bien que la cohorte des patients Usher soit de faible taille, nous observons d'ores et déjà un taux de détection de mutations de 85% et l'identification de 2 mutations causales pour 77% des cas (10/13). De plus, ce taux de sensibilité diagnostique reste plus faible que celui obtenu jusqu'à maintenant au laboratoire et il est évident qu'il ne peut que s'améliorer dans le futur grâce aux progrès technologiques. Récemment, Licastro et al. (2012) ont pointé les limites de l'approche NGS dans un cadre de diagnostic moléculaire des patients Usher. Il est possible de suggérer que les stratégies utilisées n'étaient pas adéquates. En effet, les 2 stratégies pour capturer l'exome Usher (capture de l'exome entier et amplifications long-range) ne permettaient pas d'obtenir une couverture homogène et suffisante telle que celle requise pour une approche diagnostique. La stratégie choisie ici a permis de palier à ces 2 problèmes en capturant spécifiquement l'exome Usher d'une manière uniforme. Grâce au séquençage simultané de tous les gènes Usher, nous nous avons montré l'intérêt de cette approche pour les patients présentant un syndrome de Usher atypique ou mal défini par des critères cliniques insuffisamment documentés. Néanmoins, cette exhaustivité peut conduire, chez un même patient, à l'identification de VSCI, voire de variants pathogènes dans plusieurs gènes. Plusieurs cas (U286, U1170, U1185) ont déjà été identifiés dans cette étude. Il convient alors d'envisager la possibilité d'un oligogénisme, pouvant moduler le phénotype, voire d'un digénisme. L'approche NGS n'a pas permis de résoudre l'errance diagnostique de certains cas. Plus de 15 patients restent porteurs d'une seule mutation. Pour certains d'entre eux il est possible que la présence d'une mutation soit liée au taux d'hétérozygotie de la population générale. En effet, plusieurs patients sont porteurs de mutations récurrentes : 4 patients sont hétérozygotes pour la c. T (p. Cys759Phe) dans USH2A, retrouvée en proportion non négligeable dans la population générale (0, 15% d'après EVS ; 20/13006 allèles testées) ; 2 patients, U585 et U838, sont porteurs de mutations dans MYO7A fréquemment retrouvées dans les populations dont ils sont originaires (Afrique du Nord pour c. 2283-T et Scandinavie pour c. A, p. Cys31* (Janecke et al. , 1999). Néanmoins, pour la majorité d'entre eux, la probabilité d'une 2ème mutation non identifiée est élevée. Pour ces cas là, le NGS n'a pas vraiment amélioré la détection car les régions Discussion et perspectives criblées étaient identiques à celles analysées par séquençage Sanger. Il en résulte qu'un nombre non négligeable de mutations sont localisées dans des régions non criblées. Seules l'analyse des transcrits et/ou le séquençage de gènes entiers peuvent aider à élucider ces cas complexes. Une réflexion avec le secteur diagnostic neurosensoriel a été engagée et un arbre décisionnel a été établi (Figure 49, Page 152). La stratégie actuelle reste adaptée dans la majorité des cas. En effet, Une analyse haplotypique suivie du séquençage en Sanger d'un seul gène reste plus rapide et fiable. Par contre, l'approche NGS devient totalement justifiée si plusieurs gènes doivent être séquencés, par exemple si on exclut l'implication des deux gènes majoritairement impliqués, MYO7A et USH2A, ou si les critères cliniques ne permettent pas d'orienter l'analyse. Cet arbre sera très probablement revu prochainement en regard des améliorations technologiques, de la fiabilité et du coût de l'analyse. Si la détection de deux mutations délétères par NGS permet dès aujourd'hui de rendre un résultat positif au prescripteur et aux patients, il est actuellement impossible de rendre un résultat négatif basé sur la seule utilisation du NGS. Discussion et perspectives Figure 49 : Intégration du NGS dans la stratégie diagnostique *variants pathogènes ou susceptibles de l'être (UV3, UV4 ou mutations) Discussion et perspectives Extension de la stratégie à d'autres pathologies neurosensorielles Grâce à l'étude pilote initiée sur des gènes non encore étudiés au laboratoire, nous avons pu apprécier toute la difficulté d'interprétation et d'analyse fine des variants. Si les résultats préliminaires sont encourageants avec l'identification de mutations délétères, nous devons tenir compte toutefois d'une plus grande hétérogénéité génétique que celle observée pour le syndrome de Usher. La capture ciblée de l'ensemble des exons et régions introniques flanquantes des gènes responsables de surdité non syndromique (environ 60 gènes, (Shearer et al. , 2011 ; De Keulenaer et al. , 2012 ; Brownstein et al. , 2011) est réalisable avec les capacités du 454 GS junior et les critères de qualité définis pour l'exome Usher. Une période de recul sera absolument nécessaire entre l'identification des premiers patients porteurs de mutations et les premiers rendus de résultats. En effet, compte tenu du nombre de gènes, le nombre de VSCIs sera plus important. De plus, la plupart seront identifiés au sein de gènes nouvellement étudiés au laboratoire. Si la base de données Deafness Variation Database s'avère bien documentée et régulièrement mise à jour, les données concernant les spectres mutationnels des différents gènes restent limitées. L'analyse simultanée des gènes Usher et des gènes impliqués dans des surdités non syndromiques doit donner lieu à des discussions préalables dans un contexte pluridisciplinaire (génétique médicale, ORLs et ophtalmologistes). En effet, le conseil génétique peut s'avérer délicat et doit être organisé si deux mutations dans un gène Usher sont identifiées chez un patient présentant une surdité isolée. Aux dépends de l'étude de Licastro et al. , (Licastro et al. , 2012), il parat envisageable de réaliser le WES pour l'analyse des pathologies neurosensorielles en priorisant l'étude d'un panel de gènes. Si une telle approche peut sembler démesurée, elle pourrait être justifiée par une homogénéisation des protocoles quelque soit la pathologie, et à terme, par une réduction des coûts. Par ailleurs, il est bien reconnu que tous les gènes impliqués dans les pathologies neurosensorielles ne sont pas encore identifiés. C'est pourquoi une approche WES est particulièrement attractive car elle permet de revenir a posteriori sur des données patient pour tester l'implication de tout nouveau gène caractérisé. Conclusion Conclusion Le laboratoire de génétique moléculaire du CHU de Montpellier a la particularité d'offrir un diagnostic d'expertise pour les maladies rares et d'héberger une unité de recherche Inserm dédiée à l'exploration de ces pathologies. Cette mixité m'a permis de travailler à l'interface entre ces deux secteurs très complémentaires. Ainsi, au cours de cette thèse, j'ai développé des outils innovants pour une meilleure compréhension des bases moléculaires du syndrome de Usher. Ceux-ci ont pu être directement intégrés à la prise en charge des dossiers patients. En effet, les rendus de résultats des patients atteints d'un syndrome de Usher de type II ont été significativement améliorés. Si certains de ces outils ont des applications immédiates, d'autres, tels que ceux développés pour l'analyse des promoteurs USH2A et GPR98, permettront dans le futur d'améliorer la caractérisation des altérations retrouvées dans ces régions. La recherche d'exhaustivité pour toute analyse de patients permet d'approfondir les connaissances des mécanismes physiopathologiques. Ainsi, j'ai contribué à la mise en évidence, chez plusieurs patients, d'une altération intronique profonde, à l'origine de l'insertion d'un pseudoexon dans le gène USH2A. Cette identification ouvre une nouvelle voie thérapeutique non encore envisagée pour le syndrome de Usher de type II basée sur l'utilisation d'oligonucléotides antisens. Encore à ce jour, malgré une analyse fine (notamment par NGS), la présence d'une deuxième mutation n'a pas pu être démontrée chez un nombre non négligeable de patients atteints du syndrome de Usher. Ces données laissent suggérer la présence d'altérations similaires à celle engendrant le pseudoexon, non seulement dans USH2A, mais aussi dans les autres gènes Usher. A la lumière de ces résultats mon travail de thèse montre toute sa pertinence dans un continuum de prise en charge et d'amélioration du service rendu aux patients. Cette cohérence est résumée dans la figure de la page suivante. Conclusion La mise en place d'outils innovants ne peut se faire sans considérer l'approche NGS qui offre des perspectives attrayantes quant à l exhaustivité, la rapidité et le coût des analyses engagées. J'ai pu montrer que l'analyse NGS sur exome ciblé peut être intégrée, à certaines étapes et dans certains cas, dans l'activité diagnostique du syndrome de Usher. Les avancées constantes de cette technologie, de la gestion des données et des outils d'analyse, laissent présager une place de plus en plus importante du NGS dans un cadre diagnostique dès les prochains mois. Enfin, la mise en place du NGS-Usher ainsi que les données préliminaires obtenues dans l'étude pilote surdités serviront de modèles pour l'application de cette approche à d'autres pathologies neurosensorielles. Références Références Abadie, C, Blanchet, C, Baux, D, Larrieu, L, Besnard, T, Ravel, P, Biboulet, R, Hamel, C, Malcolm, S, Mondain, M, Claustres, M, Roux, A-F. 2011. Audiological findings in 100 USH2 patients. Clinical Genetics. Adato, A, Kalinski, H, Weil, D, Chaib, H, Korostishevsky, M, Bonné-Tamir, B. 1999. Possible interaction between USH1B and USH3 gene products as implied by apparent digenic deafness inheritance. Am J Hum Genet 65 : 261265. 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Annexes Annexe 1 : Répartition des patients recensés dans LOVD USHBases Annexes D'après les données recensées dans LOVD USHBases. 87% des patients mutés dans un gène Usher ont des signes cliniques typique d'un des 3 types de syndrome de Usher. Les 13% restants se répartissent en 4 catégories : Usher atypique (USH ATYP Cli) ; Surdité non syndromique (DFN Cli) ; Rétinite pigmentaire non syndromique (RP Cli) et non communiqué (nc). D'après les données recensées dans LOVD USHBases. NC : non communiqué ; ATYP : Signes clinique d'un syndrome de Usher atypique ; ARRP : rétinite pigmentaire non syndromique à transmission autosomique récessive ; DFNB : Surdité non syndromique à transmission autosomique récessive ; DFNA : Surdité non syndromique à transmission autosomique dominante. Annexes Annexe 2 : Usher syndrome type II caused by activation of an USH2A pseudoexon : implications for diagnosis and therapy. Vaché et al. , 2012 BRIEF REPORT OFFICIAL JOURNAL Usher Syndrome Type 2 Caused by Activation of an USH2A Pseudoexon : Implications for Diagnosis and Therapy Christel Vaché, 1 Thomas Besnard, 13 Pauline le Berre, 1 Gema Garca-Garca, 2, 4 David Baux, 1 Lise Larrieu, 1 Caroline Abadie, 1 Catherine Blanchet, 5 Hanno Jrn Bolz, 6, 7 Jose Millan, 4 Christian Hamel, 5 Sue Malcolm, 8 Mireille Claustres, 13 and Anne-Françoise Roux1, 2 CHU Montpellier, Laboratoire de Génétique Moléculaire, Montpellier, France ; 2 Inserm, U827, Montpellier, France ; 3 Univ, Montpellier I, Montpellier, France ; 4 Grupo de Investigacin en Enfermedades Neurosensoriales, Instituto de Investigacin Sanitaria IIS-La Fe and CIBERER, Valencia, Spain ; 5 CHU Montpellier, Centre National de Référence maladies rares Affections Sensorielles Génétiques, Montpellier, France ; Bioscientia Center for Human Genetics, Ingelheim, Germany ; 7 Institute for Human Genetics, University Hospital of Cologne, Cologne, Germany ; Clinical and Molecular Genetics, Institute of Child Health, University College London, London, United Kingdom Communicated by Mario Tosi Received 27 July 2011 ; accepted revised manuscript 7 October 2011. Published online 13 October 2011 in Wiley Online Library ( 10. 1002/humu. 21634 USH type 1, the most severe form, presents with a severe-to- profound congenital hearing loss, vestibular dysfunction, and pre- ABSTRACT : USH2A sequencing in three affected mem- pubertal progressive RP. In USH type 2, the most frequent form, bers of a large family, referred for the recessive USH2 hearing loss is described as moderate-to-severe, vestibular func- syndrome, identified a single pathogenic alteration in one tion is normal, and onset of RP is around puberty. USH type 3 of them and a different mutation in the two affected nieces. is characterized by a progressive hearing loss, a variable vestibular As the patients carried a common USH2A haplotype, they dysfunction, and RP. likely shared a mutation not found by standard sequencing This clinical heterogeneity is associated with high genetic het- techniques. Analysis of RNA from nasal cells in one af- erogeneity and to date nine genes implicated in the disease have fected individual identified an additional pseudoexon (PE) been identified : MYO7A (MIM# 276903), USH1C (MIM# 605242), resulting from a deep intronic mutation. This was con- CDH23 (MIM# 605516), PCDH15 (MIM# 605514), USH1G firmed by minigene assay. This is the first example in (MIM# 607696) for USH type 1, USH2A (MIM# 608400), GPR98 Usher syndrome (USH) with a mutation causing activa- (MIM# 602851), DFNB31 (MIM# 607928) for type 2, and CLRN1 tion of a PE. The finding of this alteration in eight other (MIM# 606397) for type 3 (Online Mendelian Inheritance in Man individuals of mixed European origin emphasizes the im- [OMIM], In addition, the PDZD7 gene has portance of including RNA analysis in a comprehensive been described as a contributor to digenism and as a modifier of the diagnostic service. Finally, this mutation, which would not retinal phenotype in USH [Ebermann et al. , 2010]. have been found by whole-exome sequencing, could offer, In USH type 2, USH2A is the most commonly mutated gene. for the first time in USH, the possibility of therapeutic There is a recurrent c. 2299delG mutation, for which a founder correction by antisense oligonucleotides (AONs). effect has been described [Aller et al. , 2010 ; Dreyer et al. , 2001] Hum Mutat 33 : 104108, 2012. C 2011 Wiley Periodicals, Inc. but a large proportion of published mutations are private (see KEY WORDS : Usher syndrome ; pseudoexon ; diagnosis ; USHbases USH2A [Roux et al. , 2011]). They are spread throughout the 72 USH2A exons and their flanking intronic sequences, and consist of nonsense and missense mutations, deletions, duplications, large rearrangements, and splicing variants (USHbases and unpublished Usher syndrome (USH) is an autosomal recessive disorder defined results). Classic molecular diagnostic analyses of USH2A are carried by the presence of sensorineural hearing loss together with retinitis out by direct sequencing of the exons and their flanking intronic pigmentosa (RP). USH is the cause of more than 50% of cases of sequences, and by Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments hereditary deaf-blindness and has a prevalence recently reestimated (QMPSF) or array comparative genomic hybridization (CGH) to to be 1/6, 000 [Kimberling et al. , 2010]. Three clinical types USH1, detect large rearrangements. Although this diagnostic approach is, USH2, and USH3, are distinguished on the basis of severity of in most cases, sufficient to identify the causative mutations on both hearing loss and the presence or absence of vestibular dysfunction alleles, some clinically well-defined USH2 patients still present with [Smith et al. , 1994]. no or only a single heterozygote mutation in USH2A. Resolving these cases represents a major advance in complete molecular diagnosis and in understanding the mechanisms involved in the pathology. Presence of uncharacterized mutations in deep intronic Additional Supporting Information may be found in the online version of this article. sequences or in 5 and 3 untranslated regions of the USH2A gene Correspondence to : Anne-Françoise Roux, Laboratoire de Génétique Moléculaire, have then to be considered. CHU Montpellier, INSERM U827, IURC, 641 Avenue du Doyen Gaston Giraud, F-34093 This study concerns family U249 with three of the 13 members Montpellier cedex 5, France. E-mail : anne-francoise. roux@inserm. fr presenting with typical clinical signs of USH type 2 disorder (Fig. 1). Contract grant sponsors : le Ministère de la Recherche PHRC National 2004, PROM Written informed consent to genetic testing was obtained from 7802. ; Spanish Ministry of Science and Innovation (to G. G. -G. ). all participating subjects. C 2011 WILEY PERIODICALS, INC. Figure 1. Pedigree of family U249. Black and white symbols indicated, respectively, affected and unaffected individuals. Patient II-7 is indicated with a black arrow. Colored vertical lines correspond to haplotypes defined by the Genethon microsatellites markers D1S474, AFM248TC1, D1S2827, D1S229, D1S227, and D1S2860. The haplotype with unidentified mutation (red) and the haplotypes carrying the identified mutations (blue and green) are indicated. The three normal haplotypes segregating in the family are identified (black, yellow, and purple). The nomenclature for the variations observed at DNA (cds) and acids. This protein would not be anchored to the membrane due to RNA level follows the recommendations of the Human Genome the absence of the C-terminal transmembrane domain required for Variation Society ( [Horaitis and Cotton, the normal function of usherin. 2004], where nucleotide 1 is the A of the ATG translation initi- To determine the origin of this extra sequence, a Blast analysis ation codon in the USH2A reference sequence NM 206933. 2. (Basic Local Alignment Search Tool ; Molecular diagnostic investigations on USH2A consisting of hap- Blast. cgi) was performed and revealed a perfect alignment lotype analyses, direct sequencing of the 72 USH2A exons and their with an intronic sequence located at 2, 296 bp from exon 41 proximal intronic sequences, and screening for large rearrangements (Fig. 2B). In consequence, the nomenclature of this insertion is identified a c. 8890dupT p. (Trp2964fs) mutation in patients III-1 r. 7594 7595ins7595-2296 7595-2143. and III-4 and a c. 3129dupT p. (Val1044fs) alteration in patient II-7 In silico analysis using the Human Splicing Finder (HSF) tool transmitted by their respective fathers (Fig. 1). As no other po- ( [Desmet et al. , 2009] of the genomic tential pathogenic USH2A variant was found associated with the region encompassing the intronic 152 bp detected in transcripts common allele transmitted by I-2, we hypothesized that the second showed that the inserted sequence was surrounded by 3 and 5 splice mutational event occurred in the USH2A deep intronic sequences. sites (iss for inserted sequence splice site). When compared to the To test this hypothesis, a molecular analysis at the RNA level was Maximum Entropy (MaxEnt ; [Yeo and Burge, 2004]) scores average conducted in patient II-7. Total RNA was isolated from nasal cells for 3 and 5 constitutive USH2A splice sites (3 Ushss and 5 Ushss), of the patient and 12 controls as described previously [Vaché et al. , the 3 iss can be considered a strong site (Max Ent scores : 8. 16 2010], and used as a template in 14 overlapping RT-PCR reactions 2. 28 for 3 Ushss and 10. 11 for the 3 iss) in contrast to the 5 iss that encompassing the total coding region of the USH2A gene. Primers is probably a very weak site due to the presence of an A at position (Supp. Table S1) were designed in order to include at least one 1 (Max Ent scores : 8. 76 1. 58 for 5 Ushss and 2. 39 for the 5 iss). heterozygous single nucleotide polymorphism (SNP), previously In accordance with this result, and the fact that the inserted se- identified in the patient's DNA, in each PCR reaction to verify that quence was absent in 12 controls, we hypothesized that the aberrant both alleles have been amplified. splicing resulted from a pseudoexon (PE) activation due to a muta- Analysis of the 14 RT-PCR amplifications (size from 619 to 2, 737 tional event reinforcing the 5 iss. bp) revealed in patient II-7 an additional larger product obtained To confirm this hypothesis, DNA studies were conducted in pa- by PCR of exons 3944 (Fig. 2A). This abnormal band pattern was tient II-7 and the 12 controls previously analyzed at RNA level. not detected in any of the 12 controls that underwent similar ampli- Primers, Pe40F (5 -CAATTACACCCACGGAGAGC-3 ) and Pe40R fications between these exons. Direct sequencing of these products (5 -TCCCAGAGAAAAGCAAGTACG-3 ), were designed to amplify established that the two alleles were both amplified and confirmed the potential PE and its surrounding genomic sequences. PCR re- the presence of two populations of transcripts in II-7 : normal tran- actions were performed under standard conditions (annealing tem- scripts and aberrant transcripts consisting of an insertion of 152 perature 60 C ; 30 cycles). bp at the junction of exons 40 and 41 (Fig. 2A). This out-of-frame In the patient's DNA, direct sequencing of PCR products (Fig. 2C) inserted sequence leads to a premature stop codon in exon 41 pre- revealed, a heterozygous base change G located at position dicting, if translated, a truncated protein deleted of 2, 671 amino 1 of the inserted sequence (c. 7595-G) increasing the HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 1, 104108, 2012 105 Figure 2. Molecular characterization of the pseudoexon (PE) inclusion in patient II-7. A : Total RNA was isolated from nasal cells of patient II-7 and controls with the Nucleo Spin RNA II isolation kit (MachereyNagel, Dren, Germany) and reverse transcribed using Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Nested PCRs were carried out using primers localized in exons 39 and 44 in first rounds and 40 and 43 in second rounds (expected size of 1, 208 bp) including the heterozygous c. A SNP located in exon 43 (not shown). Agarose gel is shown for one representative RT-PCR from patient II-7 and a control (C). An additional band of 1, 360 bp is observed in II-7. Sequencing of the two products obtained for II-7, using the BigDye Terminator v1. 1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Warrington, UK) is presented for the exonic junctions. B : Schematic localization and sequence of the PE at DNA level. Exons are represented by black boxes, introns by horizontal lines, and PE by a white box. Sequence in uppercase corresponds to PE and lowercase to the intronic flanking sequences. C : Identification of the c. 7595-G mutation in the genomic sequence of patient II-7. The G substitution at position 1 of the PE is boxed and its effect on the donor splice site strength is indicated (MaxEnt score). D : Ex vivo splicing assay. DNA of patient II-7 was used as template to generate a fragment containing the PE encompassed by 208 bp of the 5 and 197 bp of 3 intronic flanking sequences using the PhusionTM High-Fidelity DNA polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland). Wild-type (WT) and mutated (Mut) pSPL3 minigenes were constructed and transfected into ARPE-19 and HeLa cells as previously described [Le Guédard-Mereuze et al. , 2010] ; 48 hr after transfection total RNA was extracted and RT-PCR were performed. Primers sequences and RT-PCR conditions are available upon request. As no difference in splicing effect was observed between the two cell lines, only results from ARPE-19 cells are shown. Schemes of the amplified products are presented on the right of the agarose gel. White boxes represent pSPL3 exons and gray box the 152 bp PE. 106 HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 1, 104108, 2012 5 iss strength from 2. 39 to 10. 57 (MaxEnt scores). This increase similar studies for the eight USH genes expressed in nasal epithelial ( 342. 26%) is the result of the creation of a high-quality donor cells [Vaché et al. , 2010] could be carried out when a single mutation splice site (MaxEnt scores : 8. 761. 58 for 5 Ushss). This variation has been detected in an USH patient. was not observed in the 12 controls. There has been considerable interest as to whether there might The c. 7595-G variant was analyzed in the other U249 fam- be digenic inheritance in USH in view of the large number of genes ily members and segregated perfectly with the phenotype : subjects involved and the large number of polymorphisms in each of them. I-2, II-2, and II-4 were identified as carriers whereas III-1 and III-4 Indeed, PDZD7 has been described as a contributor to digenism were compound heterozygotes c. [7595-G ; 8890dupT]. in USH2 [Ebermann et al. , 2010]. We have found no evidence of The variant was not described in dbSNP and not detected in 338 digenic inheritance in either USH1 [Roux et al. , 2011] or in this study tested alleles. All these results therefore strongly suggest that this of USH2. If identification of only a single mutation is sometimes variant was the second necessary and sufficient mutational event regarded as possible evidence for digenic inheritance, this study responsible for the USH in U249. comprehensively shows that more exhaustive analysis, including of To definitively confirm this hypothesis, we carried out a functional RNA, should be undertaken to identify a likely second mutation. analysis for this PE (Fig. 2D) on HeLa and human retinal pigment This PE identification in nine unrelated USH2A patients not only epithelial cells (ARPE-19) using the exon-trapping vector pSPL3 [Le greatly improves molecular diagnosis, but opens a new therapeutic Guédard-Mereuze et al. , 2010]. Only transcripts obtained from the approach for USH. In this case, where all the native exons are present, mutated c. 7595-G construction included the PE. induction of PE exclusion would result in restoring a complete wild- These results, combined with those obtained on RNA from nasal type RNA with a functional protein and a corrected phenotype. In epithelial cells, show for the first time the involvement of a deep other diseases, this therapeutic approach has already been devel- intronic mutation in USH type 2. oped using antisense oligonucleotide (AON) chemistry to rescue a To establish the prevalence of this mutation, direct sequencing of normal splicing process and promising results have been reported DNA was performed in two groups of our cohort. The first group [Perez et al. , 2010]. Considering the advances in improving the sta- was composed of 20 USH2A patients with no identified mutation bility and the safety of AON by the use of modified molecules and the or only a single pathogenic mutation or likely/probably pathogenic progress in nanotechnologies and controlled drug delivery systems variant (UV3/UV4 according to our classification criteria [Roux [Fattal and Barratt, 2009 ; Perez et al. , 2010], patients carrying the et al. , 2011]). The second group contained 54 USH2A patients car- c. 7595-G mutation could, in the not too distant future, ben- rying a heterozygous mutation plus a variant described as UV3/UV4 efit from antisense-mediated exon skipping therapy. To our knowl- or two variants classified as UV3 or UV4, that is, both likely mu- edge, this approach had not been yet considered for USH. tations had already been identified. Analyses of the 74 amplified sequences showed that the c. 7595-G mutation was present Acknowledgments in four patients of group one at heterozygous state (Supp. Table S2) and was not detected in group two. We acknowledge our colleague Dr. Sylvie Tuffery-Giraud for fruitful advice. Carsten Bergmann and Dr. Christine Neuhaus for referring patients. We are An additional DNA study carried out in a Spanish cohort com- also very grateful to family U249 for their interest in molecular diagnosis posed of 18 patients with incomplete USH2A genotypes identified and their participation to this study. the c. 7595-G mutation in four cases (Supp. Table S2), while an epidemiological study on 180 Spanish alleles was not able to References detect it. Aller E, Jaijo T, Beneyto M, Najera C, Oltra S, Ayuso C, Baiget M, Carballo M, Antinolo For these two European cohorts, when possible, we showed that G, Valverde D, Moreno F, Vilela C, Collado D, Perez-Garrigues H, Navea A, Millan this base change G always segregated with the disease/haplotypes JM. 2006. Identification of 14 novel mutations in the long isoform of USH2A in in each family. Spanish patients with Usher syndrome type II. J Med Genet 43 : e55. Comparison of all the haplotypes (built with intragenic neu- Aller E, Larrieu L, Jaijo T, Baux D, Espinos C, Gonzalez-Candelas F, Najera C, Palau tral variants) carrying the intronic mutation concluded that F, Claustres M, Roux AF, Millan JM. 2010. The USH2A c. 2299delG mutation : dating its common origin in a Southern European population. Eur J Hum Genet c. 7595-G was not linked to a specific haplotype. Neverthe- 18 : 788793. less, four patients (two French and two Spanish, Supp. Table S2) Baux D, Larrieu L, Blanchet C, Hamel C, Ben Salah S, Vielle A, Gilbert-Dussardier B, carry the c. 7595-G mutation and for three of them (segre- Holder M, Calvas P, Philip N, Edery P, Bonneau D, Claustres M, Malcolm S, Roux gation was not available for FRP484) it is in cis to the rare variant AF. 2007. Molecular and in silico analyses of the full-length isoform of usherin identify new pathogenic alleles in Usher type II patients. Hum Mutat 28 : 781789. c. 6049 T (rs55865063) [Aller et al. , 2006] that we have clas- Desmet FO, Hamroun D, Lalande M, Collod-Beroud G, Claustres M, Beroud C. 2009. sified as nonpathogenic by ex vivo splicing assays (unpublished Human Splicing Finder : an online bioinformatics tool to predict splicing signals. results). This association suggests a possible ancestral event. Nucleic Acids Res 37 : e67. Although mid-intronic mutations leading to PE activation have Dhir A, Buratti E. 2010. Alternative splicing : role of pseudoexons in human disease and been already described in several genes [Dhir and Buratti, 2010], potential therapeutic strategies. FEBS J 277 : 841855. Dreyer B, Tranebjaerg L, Brox V, Rosenberg T, Moller C, Beneyto M, Weston MD, this mechanism is, as yet, an infrequently observed phenomenon Kimberling WJ, Cremers CW, Liu XZ, Nilssen O. 2001. A common ancestral mainly because it is indeed a rare event as splicing needs a set of origin of the frequent and widespread 2299delG USH2A mutation. Am J Hum determinants (donor and acceptor splice sites, polypyrimidine tract, Genet 69 : 228234. and lariat branch point) all in the correct position and, second, Dreyer B, Tranebjaerg L, Rosenberg T, Weston MD, Kimberling WJ, Nilssen O. 2000. Identification of novel USH2A mutations : implications for the structure of USH2A because their detection escapes both classic mutational analyses and protein. Eur J Hum Genet 8 : 500506. next-generation exome sequencing. This study shows for the first Ebermann I, Phillips JB, Liebau MC, Koenekoop RK, Schermer B, Lopez I, Schafer time this type of pathogenic mechanism in USH2 syndrome, and E, Roux AF, Dafinger C, Bernd A, Zrenner E, Claustres M, Blanco B, Nurnberg highlights the importance of analyses at both RNA and DNA levels. G, Nurnberg P, Ruland R, Westerfield M, Benzing T, Bolz HJ. 2010. PDZD7 is a In view of the frequency and the presence of the c. 7595-G modifier of retinal disease and a contributor to digenic Usher syndrome. J Clin Invest 120 : 18121823. mutation in both a French and a Spanish population, we suggest Fattal E, Barratt G. 2009. Nanotechnologies and controlled release systems for the that the DNA analysis of the region encompassing the PE should be delivery of antisense oligonucleotides and small interfering RNA. Br J Pharmacol integrated into USH2A molecular diagnostic services. Furthermore, 157 : 179194. HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 1, 104108, 2012 107 Horaitis O, Cotton RG. 2004. The challenge of documenting mutation across the Roux AF, Faugere V, Vache C, Baux D, Besnard T, Leonard S, Blanchet C, Hamel genome : the human genome variation society approach. Hum Mutat 23 : 447 C, Mondain M, Gilbert-Dussardier B, Edery P, Lacombe D, Bonneau D, Holder- 452. Espinasse M, Ambrosetti U, Journel H, David A, Lina-Granade G, Malcolm S, Kimberling WJ, Hildebrand MS, Shearer AE, Jensen ML, Halder JA, Trzupek K, Cohn Claustres M. 2011. Four year follow-up of diagnostic service in USH1 patients. ES, Weleber RG, Stone EM, Smith RJ. 2010. Frequency of Usher syndrome in Invest Ophthalmol Vis Sci 52 : 40634071. two pediatric populations : implications for genetic screening of deaf and hard of Smith RJ, Berlin CI, Hejtmancik JF, Keats BJ, Kimberling WJ, Lewis RA, Moller CG, hearing children. Genet Med 12 : 512516. Pelias MZ, Tranebjaerg L. 1994. Clinical diagnosis of the Usher syndromes. Usher Le Guédard-Mereuze S, Vaché C, Baux D, Faugère V, Larrieu L, Abadie C, Janecke A, Syndrome Consortium. Am J Med Genet 50 : 3238. Claustres M, Roux AF, Tuffery-Giraud S. 2010. Ex vivo splicing assays of mutations Vaché C, Besnard T, Blanchet C, Baux D, Larrieu L, Faugère V, Mondain M, Hamel C, at non-canonical positions of splice sites in USHER genes. Hum Mutat 31 : 347 Malcolm S, Claustres M, Roux AF. 2010. Nasal epithelial cells are a reliable source 355. to study splicing variants in Usher syndrome. Hum Mutat 31 : 734741. Liu XZ, Hope C, Liang CY, Zou JM, Xu LR, Cole T, Mueller RF, Bundey S, Nance W, van Wijk E, Pennings RJ, te Brinke H, Claassen A, Yntema HG, Hoefsloot LH, Cremers Steel KP, Brown SD. 1999. A mutation (2314delG) in the Usher syndrome type FP, Cremers CW, Kremer H. 2004. Identification of 51 novel exons of the Usher IIA gene : high prevalence and phenotypic variation. Am J Hum Genet 64 : 1221 syndrome type 2A (USH2A) gene that encode multiple conserved functional 1225. domains and that are mutated in patients with Usher syndrome type II. Am J Perez B, Rodriguez-Pascau L, Vilageliu L, Grinberg D, Ugarte M, Desviat LR. 2010. Hum Genet 74 : 738744. Present and future of antisense therapy for splicing modulation in inherited Yeo G, Burge CB. 2004. Maximum entropy modeling of short sequence motifs with metabolic disease. J Inherit Metab Dis 33 : 397403. applications to RNA splicing signals. J Comput Biol 11 : 377394. 108 HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 1, 104108, 2012 Vaché et al. , Human Mutation 1 Supp. Table S1. Primers, product sizes and amplification conditions used for the 14 overlapping RT- PCR reactions Expected Annealing N Forward Primer (5'-3') Reverse Primer (5'-3') product size temperature PCR (bp) (C) GCTCTGAGCTTCAGGTAACC GATCTCCAGAGAAGACTTCC 58 GTCTTCCTTCCAGCATTCC GTGCCACTTGGTATAATCG 1189 56 CAATGGCGTGGAGAAGGATC CCCAGTCTTATCACAGTTGC 58 CTCTAAGTGGTTCAATTACAG CAGGTGTCACACTGAAGTCC 1618 58 CCTTGTCAATGCAACAGCC CAAACACACTGACCAGTCAGG 58 CATTACAACATCTCTGTAGACC GATTAACTGCACCAGTTGTATGG 1129 62 GAAGGGAGACAGTGCAATAAATG CCTTCGTAGGAAACACATGG 60 GTGTGTGCCTAATCGTCAAGG GTGTCACAGAGTCTGAGCC 737 60 GCTTACTTACAGTTTACTCAGGG GAGGATGGTATAACTTCGCG 60 CACAACAGAGGATCAATACCC CAGTACTACCATTCAGGATGG 1684 60 CCAAATCACTCTGGATGGG CCAAGGAGCAAATCCGTAAGC 60 GCCATCCTGAATGGTAGTAC CACGATAGCTGAGTTCTGAGG 1984 58 CCTGGGATGAACCTGTTGTC* CGATGGCTGTGTGGTTAAGG 60 CTCTGCCAGTGCTGAATTTG* TTCTCGGCTCGGTGTAAAAC* 2737 58 CAGCTCGTAATAACGCTCC TTCTCGGCTCGGTGTAAAAC 58 TTTCCAATCCTTCTGCATCG TTCATAAAGCCACTGAGTTCC 1208 58 GAGCTGTTCTCTGATACTCC GAATACTCAGTGACAACACC 58 GTAGAAGTTACCACAAGACC GTACTGTTGATGATGACAACC 959 58 GTAAACTCTCATGTCATTGGC GTGCTGTTCATCTGGACAGC 60 GTCCACAGCATCAACAGTGC CTTCACAACAGCGATGTCCAG 619 62 GATCAGAGTGATGAGCTCTGC AGCTGTTCCAGGCAGAAATC 60 CCTGAATCTATCTGTGGAC CACAGTGCAAATGTGGCTGG 756 56 GAGCCAGAAATGCTGTAATGG GATGATGACCAACGGAGAAGG 62 GCTCTGACAAGATTTCAACTGG CATTGAGTAAGACATTGTACTCC 1290 64 CAAACACCTATGTCAACACC CATCAAAGGTGCAATCTCAGG 58 CACCAGAAGAAATCTATCCTCC CACTTGATGCACATCCCAGG 2550 62 CCACCAGCATCACAACTCTG* CCTCTATTAGGAAGGAACAC 58 GTCAGCCCTCCAGATCTTTG* CCTTGATGGCGTTCATCAGG 2482 58 * already published by (van Wijk, et al. , 2004) Vaché et al. , Human Mutation 2 Supp. Table S2. Overview of the USH2A patients carrying the c. 7595-G mutation c. 6049 T nd 2 mutation Originally (Aller, et al. , Segregation Origin Family / Patients referenced in 2006) c. 3129dupT II-7 This study p. (Val1044fs) U249 no in trans c. 8890dupT III-1, III-4 This study p. (Trp2964fs) c. 3680delG (Baux, et al. , U414 II-3, II-4, II-5 yesa in trans p. (Gly1227fs) 2007) France (Baux, et al. , U446 II-1 c. 2168-C no in trans 2007) c. 920 923dup (Dreyer, et al. , U753 II-3 yesa in trans p. (His308fs) 2000) c. 2299delG (Liu, et al. , U835 II-1 no not performed p. (Glu767fs) 1999) c. A FRP389 II-1, II-2 p. (Gly3546Arg) This study yesa in trans UV3 c. 2299delG (Liu, et al. , FRP380 II-1 no not performed p. (Glu767fs) 1999) Spain c. T FRP30 II-1, II-2 This Study no in trans p. (Gln3716X) c. T (Dreyer, et al. , FRP484 II-1 yes not performed p. (Cys759Phe) 2000) The c. 6049 T variant (rs55865063) has not been identified among 174 control chromosomes. in cis to c. 7595-G Annexes Annexe 3 : Nasal epithelial cells are a reliable source to study splicing variants in Usher syndrome. Vaché et al. , 2010 RESEARCH ARTICLE Human Mutation OFFICIAL JOURNAL Nasal Epithelial Cells are a Reliable Source to Study Splicing Variants in Usher Syndrome Christel Vaché, 1 Thomas Besnard, 1, 4, 5 Catherine Blanchet, 2 David Baux, 1 Lise Larrieu, 1 Valérie Faugère, 1 Michel Mondain, 2 Christian Hamel, 2 Sue Malcolm, 3 Mireille Claustres, 1, 4, 5 and Anne-Franc-oise Roux1, 4 CHU Montpellier, Laboratoire de Génétique Moléculaire, Montpellier, France ; 2CHU Montpellier, Centre National de Référence maladies rares Affections Sensorielles Génétiques', Montpellier, France ; 3Clinical and Molecular Genetics, Institute of Child Health, London, United Kingdom ; Inserm, U827, Montpellier, France ; 5University of Montpellier I, Montpellier, France Communicated by Peter K. Rogan Received 17 December 2009 ; accepted revised manuscript 23 March 2010. Published online 6 April 2010 in Wiley InterScience ( DOI 10. 1002/humu. 21255 et al. , 2000] and MYO7A and CDH23 for Usher type 1 [Oshima ABSTRACT : We have shown that nasal ciliated epithelium, et al. , 2008 ; Roux et al. , 2006]. A large number of isoforms, encoded which can be easily biopsied under local anesthetic, by alternatively spliced transcripts of the Usher genes, have been provides a good source of RNA transcripts from eight of described, but the clinical relevance of some of them remains the nine known genes that cause Usher syndrome, imprecise [Ahmed et al. , 2008 ; Bitner-Glindzicz et al. , 2000 ; van namely, MYO7A, USH1C, CDH23, PCDH15, USH1G Wijk et al. , 2004 ; van Wijk et al. , 2006 ; Verpy et al. , 2000]. for Usher type 1, and USH2A, GPR98, WHRN for Mutations in MYO7A, USH2A, and CDH23 frequently include Usher type 2. Furthermore, the known or predicted effect both synonymous and nonsynonymous changes whose signifi- on mRNA splicing of eight variants was faithfully cance is uncertain, in addition to intronic variants located at reproduced in the biopsied sample as measured by nested noncanonical positions [Aller et al. , 2006 ; Baux et al. , 2007 ; RT-PCR. These included changes at the canonical Oshima et al. , 2008 ; Roux et al. , 2006]. Various in silico analyses acceptor site, changes within the noncanonical acceptor have been developed to study the effect on the structure of the site and both synonymous and nonsynonymous amino protein of these UVs [Baux et al. , 2007, 2008], but assessing the acid changes. This shows that mRNA analysis by this potential alteration of pre mRNA splicing is also an essential step method will help in assessing the pathogenic effect of for the determination of the pathogenic effect. Identification of variants, which is a major problem in the molecular abnormal exon skipping, or activation of a new splice site or diagnosis of Usher syndrome. preexisting pseudo splice site that may result in deletion of exonic Hum Mutat 31 : 734741, 2010. & 2010 Wiley-Liss, Inc. bases or retention of intronic bases can provide strong evidence for a pathogenic effect of the variant [Baralle and Baralle, 2005]. KEY WORDS : Usher syndrome ; transcript ; unclassified Spurdle et al. [2008] has reviewed the programs that are currently variant ; nasal cells ; splicing available to predict splicing effect of UVs, and emphasized that, as they all have both strengths and shortcomings, analysis at the mRNA level remains essential to establish the clinical relevance and the consequences on splice site loss. This mRNA analysis also Introduction allows us to assess the presence of ectopic splice sites [Arnold Usher syndrome (USH) is a clinically and genetically hetero- et al. , 2009]. Studies on functional analysis of splicing using geneous autosomal recessive hereditary disorder characterized by reporter minigenes have shown their usefulness when patient RNA both hearing and vision loss [Saihan et al. , 2009]. One of the is not available or to confirm effects detected in patients'samples major challenges in the molecular diagnosis of Usher syndrome [Tournier et al. , 2008] but remain an artificial system with results from the identification of a large number of sequence technical challenges related to the cloning, the transfection variants of unknown clinical significance, so-called Unclassified efficiency, and the basal level of exon recognition [Cooper, 2005 ; Variants or UVs. To date, five genes causing Usher type 1 have Spurdle et al. , 2008]. been identified : MYO7A (MIM] 276903), USH1C (MIM] Recently, we have shown the usefulness of ex vivo splicing assays 605242), CDH23 (MIM] 605516), PCDH15 (MIM] 605514), by identifying the splicing pattern of 21 sequence alterations, and USH1G (MIM] 607696), three genes are known to be providing an attractive alternative or complementary approach to implicated in Usher syndrome type 2 : USH2A (MIM] 608400), mRNA-based assays from Usher patients [Le Guédard-Mereuze GPR98 (MIM] 602851), WHRN (MIM] 607928), and one in et al. , 2010]. Only a few mRNA analyses from Usher patient tissues Usher type 3 : USH3A (MIM] 606397) [Saihan et al. , 2009]. The have been attempted so far. Cohn et al. [2004] measured USH2A most frequently mutated USH genes are USH2A for Usher type 2 transcripts in biopsies from minor salivary glands in the lip, but [Aller et al. , 2006 ; Baux et al. , 2007 ; Dreyer et al. , 2008 ; Weston the drawback to this sampling is that it requires an unacceptably invasive biopsy. RNA extracted from peripheral blood was found Additional Supporting Information may be found in the online version of this article. to be positive for WHRN [Ebermann et al. , 2007] and CDH23 Correspondence to : Anne-Franc- oise Roux, Laboratoire de Génétique Moléculaire, [Becirovic et al. , 2008] but not for MYO7A [Boulouiz et al. , 2007], CHU Montpellier, IURC, 641 Avenue du Doyen Gaston Giraud, F-34093 Montpellier showing that the study of Usher transcripts from RNA extracted cedex 5, France. E-mail : anne-francoise. roux@inserm. fr from lymphocytes is not reliable for all Usher genes. & 2010 WILEY-LISS, INC. The presence of eight Usher proteins has been demonstrated in by the manufacturer, and sequenced in both directions nasal ciliated epithelium using immunochemistry with fluorescent with BigDye Terminator v1. 1 cycle sequencing kit from antibodies [Cohn et al. , 2006]. The purpose of the present work Applied Biosystems (Warrington, UK) using the internal PCR was to determine whether, using a relatively noninvasive biopsy, primers. When necessary, additional primers were used to obtain adequate RNA could be obtained from this tissue for the analysis the whole sequence of interest (Supp. Table S2). Sequence of transcripts for any of the Usher genes. Ideally, nasal cells and reactions were analyzed on a capillary ABI 3130xl Genetic blood sampling can be performed at the same time, prior to the Analyzer (Applied Biosystems) according to the manufacturer's identification of the causative gene. instructions. Primers were designed for this study to detect the major known isoforms encoded by the Usher genes. We show that all the Usher transcripts can be detected from nasal epithelial cells with the Splice-Site Prediction Programs exception of USH3A, which in any case contains a restricted The predicted effect of each variant on RNA splicing was number of mutations that have been well characterized so far studied using three different splice site analysis programs : (1) [Ben-Yosef et al. , 2003 ; Fields et al. , 2002]. Human Splicing Finder (HSF) version 2. 4 ; The second goal of this study was to validate our method by HSF/ [Desmet et al. , 2009], (2) Neural Network SPLICE analyzing the effect of eight variants on splicing. The results (NNSPLICE) [Reese confirm that nasal epithelial cells are reliable, accessible cells to et al. , 1997] and (3) NetGene2 discriminate Usher variants with and without effect on the RNA NetGene2/ [Hebsgaard et al. , 1996]. Exonic and intronic splicing process. sequences of the region of interest were submitted according to the requirements of each program and default parameter settings Materials and Methods were applied in all predictions. Nasal Epithelial Cell Samples from Controls Nomenclature of Variants and Patients The nomenclature system for the description of changes in Patients were diagnosed with Usher syndrome based on DNA (cds) and RNA follows the recommendations of the Human established criteria (reviewed in [Cohen et al. , 2007]). Nasal Genome Variations Society ( [Horaitis and sampling was performed along with blood sampling in the ENT Cotton, 2004]. Nucleotide 11 corresponds to the A of the ATG clinics during a routine clinical diagnosis appointment. Consent translation initiation codon in the respective reference sequences to genetic testing was obtained from controls, adult probands, or (NM 000260. 3 for MYO7A, NM 206933. 2 for USH2A and NM parents in the case of minors. Molecular analysis of Usher 22124. 4 for CDH23). syndrome was approved by the local Ethics Committee. A local anesthetic spray (Xylocane 5% nébuliseur, Astrazeneca, France) was applied to each nostril before collection. Nasal Results specimens were obtained by gentle scraping of the lateral inferior turbinates with Rhino-Probe mucosal curettes (ASI Rhino-pros, Presence of Usher Transcripts in Nasal Epithelial Cells Arlington Scientific INC, Arlington Scientific, Springville, UT). Samples were immediately suspended in a cell lysis buffer As Usher genes are alternatively spliced and encode different (Macherey-Nagel, Dren, Germany) and frozen at 301C until isoforms of the proteins, we have assessed the presence of the RNA extraction. major classes in nasal epithelial cells, by designing primers for specific amplification (Supp. Table S1). Expression of the five genes implicated in Usher type 1 was studied from at least six RNA Analysis different healthy controls. For each gene, products of amplifica- Total RNA was isolated from nasal cells using Nucleo Spins tion from three controls are presented Figure 1A. MYO7A, RNA II isolation kit (Macherey-Nagel) according to the CDH23, and USH1G transcripts were amplified with the manufacturer's instructions. RNA quality and quantity were corresponding expected sizes (Supp. Table S1). Amplification determined with a NanoDrops ND-1000 spectrophotometer of USH1C between exons 13 and 16 revealed the a1 isoform (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Up to 5 mg of RNA corresponding to the largest class a USH1C isoform [Verpy et al. , could be obtained from sampling of both nostrils. For each 2000]. When amplification was performed between exons 1319 sample, 500 ng of total RNA were reverse transcribed using (also known as exon D), several products were observed, and oligodT primers and SuperScriptTMIII transferase (Invitrogen, correspond to alternative forms of class c USH1C isoforms Carlsbad, CA, USA) following the manufacturer's recommenda- [Verpy et al. , 2000]. The PCDH15 CD3 isoform was detected tions. using primers designed to specifically amplify the region cDNA was used as template in nested PCR reactions with encoding the cytoplasmic domain 3 (exons 3236) [Ahmed specific primers (Supp. Tables S1 and S2). PCR products were et al. , 2008]. checked on 1. 5% agarose gel and visualized by ethidium-bromide Expression of the three genes implicated in Usher type 2 was staining. For each analysis at least six control samples were analyzed similarly (Fig. 1B). Expected products were observed for amplified. both USH2A isoforms. PCR was carried out between exons 1921 and 4852 to discriminate USH2Aa (short isoform) and USH2Ab Sequence Analysis (long isoform). The GPR98 transcript was also detected by amplification of the region comprising exons 4951. For WHRN, PCR products were purified by QIAquick PCR purification kit the two classes of isoforms could also be distinguished using (Qiagen, Hilden, Germany) under the conditions recommended primers designed by van Wijk et al. [2006]. HUMAN MUTATION, Vol. 31, No. 6, 734741, 2010 735 Figure 1. Expression of Usher genes in nasal epithelial cells. Agarose gels showing the RT-PCR products obtained for Usher type 1 genes (A) and Usher type 2 genes (B). For each isoform, three controls are shown. Table 1. Genotypes of the Six Usher Patients Presented in this Study Patient Gene Exon/intron Allele 1 Allele 2 Exon/intron 1a CDH23 exon 27 c. 3367C4T (p. Gln1123X) c. 35801G4T intron 29 2 CDH23 intron 45 and exon 46 c. [60509G4A ; c. 6130G4Ac] c. 5985C4A (p. Tyr1995X) exon 45 3 MYO7A exon 29 c. 3719G4A (p. Arg1240Gln) c. 3979G4A (p. Glu1327Lys) exon 31 4b USH2A intron 12 c. 2168-1G4C c. 1000C4T (p. Arg334Trp) exon 6 5 USH2A intron 40 c. 7595-8C4G c. 4576 4579dupGGGT exon 21 6 USH2A exon 41 c. 8167C4T (p. Arg2723X) c. 949C4A exon 6 Variants tested at RNA level are indicated in bold. Patient already reported in Blanchet et al. [2007]. Patient already reported in Baux et al. [2007]. rs10466026. Table 2. Effects of Usher Variants on Splicing : Analysis at the RNA Level Gene Variant Effect on RNA level Variant name (RNA level) CDH23 c. 35801G4T Transcript with a skip of exon 30 1 transcript with a deletion r. [3580 3715del, 3580 3630del] of the 51 first nucleotides of exon 30 c. 60509G4A Normal transcript 1 transcript with an insertion of seven intronic nucleotides r. [ 5 , 60507 6050-1ins] MYO7A c. 3719G4A No effect on splicing r. 3719G4A c. 3979G4A No effect on splicing r. 3979G4A USH2A c. 21681G4C Deletion of the first seven nucleotides of exon 13 r. 2168 2174del c. 75958C4G Insertion of seven intronic nucleotides r. 75957 7595-1ins c. 4576 4579dupGGGT Deletion of the last 50 nucleotides of exon 21 r. 4578 4627del c. 949C4A Normal splicing 1 deletion of the 193 last nucleotides of exon 6 r. [949C4A, 951 1143del] Effect of Variants on Splicing Splicing Effect of USH1 Variants Variants were first identified at the DNA level in six patients CDH23 c. 35801G4T (c. IVS291G4T) using the molecular diagnostic procedure consisting of exhaustive sequencing of the exons and flanking intronic sequences of the In patient 1, primers were designed to amplify a 234-bp Usher genes. Genotypes of the patients are presented Table 1. fragment between exons 29 and 31 (Supp. Table S2). cDNA Transcript analyses revealed different effects on splicing which analysis from RT-PCR (Fig. 2-1) revealed the presence of two are summarized Table 2. transcripts in the patient, a normal transcript (234 bp), and an 736 HUMAN MUTATION, Vol. 31, No. 6, 734741, 2010 Figure 2. Molecular characterization of USH1 variants. 2-1 : CDH23 c. 35801G4T ; 2-2 : CDH23 c. 60509G4A ; 2-3 : MYO7A c. 3719G4A and c. 3979G4A. Left : representation of the genomic sequence surrounding the variant(s) of interest. Black arrows indicate the position of the primers used for RT-PCR and sequencing. Right : agarose gel and sequencing of the RT-PCR products obtained from the patient (P). A control sample (C) was run along on the gel. Premature termination codon (PTC). Mo : mother. For each variant, alleles 1 and 2 are detailed in Table 1. aberrant transcript (98 bp) corresponding to skipping of exon 30 c. [60509G4A ; 6130G4A] (Table 1). Examination of the RT- and predicting the creation of a premature termination codon PCR products in the patient (Fig. 2-2) revealed a fragment (PTC) in exon 31. corresponding to the expected size (333 bp) and a slightly bigger one (340 bp). Sequencing of the 333-bp amplicon showed the presence of both alleles, that is, heterozygosity for c. 6130G4A CDH23 c. 60509G4A (c. IVS459G4A) (allele 1) and c. 5985C4A (allele 2) with normal splicing. The 340-bp fragment corresponded exclusively to the variant tran- The c. 60509G4A variant was analyzed in patient 2 and his script or allele 1 and included the last seven nucleotides of intron mother (Fig. 2-2). Both carried the complex allele 45 predicting the creation of a PTC in exon 46. HUMAN MUTATION, Vol. 31, No. 6, 734741, 2010 737 MYO7A c. 3719G4A (p. Arg1240Gln) and c. 3979G4A not experimentally alter splicing, no false-positive prediction was (p. Glu1327Lys) observed. These two variants have been identified in patient 3 in a compound heterozygous state (Table 1). Primers were designed to Discussion amplify the two variants c. 3719G4A and c. 3979G4A (exons As Usher proteins are expressed in different tissues containing 2733) in a single RT-PCR (Fig. 2-3). No difference in size was ciliary processes or microvillar structures including human observed between the patient and the control amplification. ciliated nasal epithelium [Cohn et al. , 2004, 2006], we hypothe- Sequencing showed the presence of the two alleles with sized these cells could be used as a source to analyze Usher heterozygosity for both variants (Fig. 2-3). No abnormal splicing transcripts in a noninvasive way. was observed. Usher Transcripts Splicing Effect of USH2 Variants We demonstrated that USH1 and USH2 transcripts could be USH2A c. 21681G4C (c. IVS121G4C) amplified from nasal epithelial cells. The presence of several isoforms could be demonstrated for USH2A, WHRN, and USH1C. Examination of the RT-PCR product of patient 4 (Table 1) Class b USH1C isoforms could not be detected in accordance with revealed no additional fragment (Fig. 3-1). However, sequencing the fact that this class seems to be restricted to inner ear [Verpy demonstrated the presence of a normal transcript and an et al. , 2000] and a few other tissues (retina and brain) [Reiners aberrantly spliced product lacking the first seven nucleotides of et al. , 2003]. exon 13 leading to a PTC in exon 14. Despite the combination of numerous primers located in the different exons of USH3A, transcripts could not be detected in nasal cells. These results are surprising considering the broad USH2A c. 75958C4G (c. IVS408C4G) expression pattern of this gene [Fields et al. , 2002] and the Analysis of the RT-PCR amplification in patient 5 (Table 1) did presence of Clarin-1 in the nasal epithelium [Cohn et al. , 2006]. not show additional fragments between patient and control (Fig. As only a few patients have been diagnosed with USH3A 3-2). Again, sequencing of the products revealed the presence of mutations in our cohort (unpublished) and considering the two distinct transcripts, a normal transcript, and an abnormal overall restricted number of mutations identified in this gene, the transcript that included the last seven nucleotides of intron 40 failure to detect USH3A expression in nasal cells should have resulting in a PTC in exon 42. limited consequences in a diagnostic setting. Alteration of Splicing USH2A c. 4576 4579dupGGGT To validate the use of nasal cells for the analysis of aberrant In addition to the c. 75958C4G anomaly, patient 5 carried transcripts, we analyzed four intronic and four exonic variants, the c. 4576 4579dupGGGT (Table 1). Agarose analysis of the RT- mostly predicted to have an impact on splicing. All potential PCR product in the region of the duplication did not detect mutations were analyzed using three prediction programs as multiple fragments. However, sequencing revealed clearly the described in Materials and Methods. The programs had mixed presence of two distinct transcripts : a normal splice transcript and results in predicting the observed changes. In part, this is likely to a product lacking the last 50 nucleotides of exon 21 resulting in a be because of tissue specific variations in splice site efficiency. PTC in exon 22 (Fig. 3-3). Based on their location at the consensus canonic splice sites, the two USH2A c. 21681G4C and CDH23 c. 35801G4T variants USH2A c. 949C4A (p. Arg317Arg) were strongly predicted to affect splicing [Baux et al. , 2007 ; Blanchet et al. , 2007]. For these variants we demonstrated the The c. 949C4A variant was identified in patient 6 in trans to the presence of the two predicted transcripts (USH2A r. 2168 2174del c. 8167C4T mutation (Table 1). Two products of 598 and 405 bp and CDH23 r. 3580 3715del). As there is no SNP located in the were detected. Sequencing showed the presence of three amplified fragment designed to study the USH2A c. 21681G4C transcripts, corresponding to the normal allele, the mutant allele variation, the proportion of the two alleles could not be lacking the last 193 bases of exon 6 leading to a PTC in exon 7 and ascertained. Therefore, the possibility that allele 1 (USH2A a minor product corresponding to the mutant allele with normal c. 21681G4C) also generates some normal transcript could splicing (Fig. 3-4). not be excluded. However, for the CDH23 c. 35801G4T variant, the use of a set of primers encompassing exons 26 to 31 (and In Silico Analysis allowing discrimination between allele 1 and 2 ; Fig. 2-1), confirmed that the allele carrying CDH23 c. 35801G4T was All analyzed variants were run against various in silico leading only to abnormal splicing, that is, skip of exon 30. In predictors, and results are shown in Supp. Table S3. Comparison addition, under these experimental conditions, the use of an in of predictions and experimental results (Table 3) showed that frame cryptic acceptor splice site, located in exon 30, leading to variants with demonstrated effect on splicing were always the loss of the first 51 nucleotides of this exon was also observed in predicted by at least two programs. On the other hand, the allele 2 (data not shown). precise effect of c. 35801G4T on transcripts, that is, the use of The splicing effect of CDH23 c. 60509G4A has been an in frame cryptic site, was not predicted. Only HSF predicted previously shown by exon trapping [von Brederlow et al. , 2002], the creation of the splice site used in the presence of the which characterized the use of a new acceptor site leading to the c. 75958C4G variant. In the two MYO7A variants, which did insertion of seven intronic nucleotides in the transcript. This 738 HUMAN MUTATION, Vol. 31, No. 6, 734741, 2010 Figure 3. Molecular characterization of USH2 variants. 3-1 : USH2A c. 21681G4C ; 3-2 : USH2A c. 75958C4G ; 3-3 : USH2A c. 4576 4579dupGGGT ; 3-4 : USH2A c. 949C4A. Left : representation of the genomic sequence surrounding the variant(s) of interest. Black arrows indicate the position of the primers used for RT-PCR and sequencing. Right : agarose gel and sequencing of the RT-PCR products obtained from the patient (P). A control sample (C) was run along on the gel. Premature termination codon (PTC). For each variant, alleles 1 and 2 are detailed in Table 1. deleterious effect is confirmed by our method. Nasal epithelium leading to the aberrant r. 75957 7595-1ins transcript [Le studies additionally detect residual normal splicing in the allele Guédard-Méreuze et al. , 2010]. In nasal cells, the presence of this carrying the mutation (see below). aberrant transcript was also observed but without being able to For the USH2A c. 75958C4G variant, a minigene analysis has discriminate between the alleles confirmation of a 100% splicing shown that this variation was responsible for a total misplicing defect, although very likely, is not possible. HUMAN MUTATION, Vol. 31, No. 6, 734741, 2010 739 Table 3. Comparisons of in silico Predictions with Experimental Results Obtained at RNA Level HSF Splice site Usher gene Variant type HSF matrice Max Ent score Fruit fly score NetGene2 confidence CDH23 c. 35801G4T acceptor 1 abolition of the natural splice site use of an in frame cryptic site c. 60509G4A acceptor 1 creation of a new splice site recognition of splice site 1 creation of a new splice site (control and mutant) MYO7A c. 3719G4A acceptor 1 no effect on splicing recognition of splice site 1 no effect on splicing (control and mutant) c. 3979G4A acceptor 1 no effect on splicing USH2A c. 21681G4C acceptor 1 abolition of the natural splice site 1 use of a cryptic site use of a cryptic site c. 75958C4G 1 decrease of the strength of the natural splice site 1 creation of a new splice site creation of a new splice site c. 4576 4579 donor 1 increase of the strength of a no effect on splicing 1 increase of the strength of a dupGGGT cryptic site cryptic site c. 949C4A donor 1 increase of the strength of a cryptic site (oto the strength of the natural splice site) 1, prediction was in accordance with experimental results ; , effect on splicing was not predicted. Four exonic variants were tested, and two of them were shown to there being an effect of splicing but the finding of only normal have effects on splicing. USH2A c. 949C4A predicts a synonymous transcripts suggests that they are truly acting at the protein level. change at Arg317. We considered this variant as pathogenic after using our normal criteria [Baux et al. , 2007], that is, absence in Residual Normal Splicing of Mutant Alleles 110 control alleles, in trans to a deleterious mutation in three different patients, no other likely pathogenic change after exhaustive Two of the variants CDH23 c. 6050-9G4A and USH2A sequencing of the gene and prediction analyses. In this study we c. 949C4A do not lead to a 100% abnormal pattern and definitively show that c. 949C4A alters splicing by activating a estimation of the relative proportion of each transcript was not cryptic donor site leading to loss of 193 nucleotides and creation of possible in either of them. Variable proportions of mutant/normal a PTC and is likely to be deleterious. Contrary to results obtained transcripts have been shown to be tissue dependent and related in with minigene analysis (data not shown), the splicing defect some cases to histopathologic expression of the disease [Chiba-Falek observed in nasal cells was not total, as some residual mutant et al. , 1999]. Usher gene splicing is likely to undergo different transcript with normal splicing was detected (see below) showing regulation in nasal epithelial cells and cochlea or retina, possibly the merit of determining splice variants directly. This mutation has leading to variable ratios of mutant/normal transcripts in these been previously described : Pennings et al. [2004] suggested a tissues. In any case, clinical signs of the two patients carrying these splicing defect based on prediction, and Dreyer et al. [2008] CDH23 and USH2A variants were typical of Usher type 1 and 2, classified it as nonpathogenic based on lack of information. respectively. USH2A c. 4576 4579dupGGGT is a frameshift mutation and would in any case be considered to be deleterious, as this would Nonsense-Mediated Decay (NMD) create a premature stop codon lying in exon 21 at position 1530 of the encoded protein. But the HSF and NetGene2 programs predict mRNA transcripts containing premature termination codons an increase in the strength of a donor cryptic splice site in exon 21 are routinely subjected to NMD [Wagner and Lykke-Andersen, (Supp. Table 3), which would result in the loss of the last 50 2002]. Indeed, loss of heterozygosity revealed by NMD has been nucleotides and a premature stop codon in exon 22, so we decided used as a method to distinguish disease causing loci in tuberous to consider this variant as a potential splicing mutation. The sclerosis [Jeganathan et al. , 2002]. Although several of the finding of altered splicing in all detectable transcripts emphasizes mutations reported in this paper are predicted to result in PTCs, the importance of both in silico and functional analysis for for example, CDH23 c. 35801G4T and CDH23 p. Gln1123X, molecular diagnosis. both alleles were detected after RT-PCR showing that NMD is not Two MYO7A missense variants did not lead to abnormal operating for these transcripts in this tissue. If there were NMD splicing in the patient's transcripts. Both missense variants are resulting in detection of only the trans allele it could give a predicted to have an adverse effect on protein function. misleading result. However, the primers are always designed to p. Arg1240Gln is the most common mutation observed in USH1 check for this possibility either by including a region of patients in Europe [Baux et al. , 2008] and accounts for 6. 4% of heterozygosity within the test region or establishing heterozygosity mutated MYO7A alleles in our cohort (unpublished results). It at the site of the mutation on the other chromosome. alters a highly conserved charged residue in a highly conserved Use of nasal cells was shown to be very effective as a source of region of a domain (MyTH4-1, data not shown), which is known RNA from nearly all Usher genes, although the relatively small to interact with the central domain of SANS [Adato et al. , 2005]. amount of RNA obtained necessitated the use of nested PCR. p. Glu1327Lys was initially reported by Najera et al. [2002]. This Sampling can readily be set up with training in local clinics. It variant, located in the FERM 1 domain, is classified as likely to be provides a useful alternative or complement in Usher syndrome to pathogenic (unpublished results) based on perfect ortholog ex vivo methods such as splicing reporter minigenes [Le Guédard- conservation. Although the effect on the structure is not known, Mereuze et al. , 2010]. Nasal cells represent the simplest available p. Glu1327Lys could also be a residue involved in proteinprotein tissue to study splicing defects of the Usher genes. Although interactions (again with the central domain of SANS) [Adato splicing factors (hnRNP proteins or even core components of the et al. , 2005]. None of these arguments in themselves precludes spliceosome) may differ between cell types and may influence 740 HUMAN MUTATION, Vol. 31, No. 6, 734741, 2010 splicing, the results presented here all suggest that clinically Dreyer B, Brox V, Tranebjaerg L, Rosenberg T, Sadeghi AM, Moller C, Nilssen O. relevant and valuable results will be obtained. 2008. Spectrum of USH2A mutations in Scandinavian patients with Usher syndrome type II. Hum Mutat 29 : 451. Because Usher syndrome can be classified as a retinal ciliopathy, Ebermann I, Scholl HP, Charbel Issa P, Becirovic E, Lamprecht J, Jurklies B, Millan JM, the approach presented here could be useful in analyzing splicing Aller E, Mitter D, Bolz H. 2007. A novel gene for Usher syndrome type 2 : defects in other genes involved in this group of disorders. mutations in the long isoform of whirlin are associated with retinitis pigmentosa and sensorineural hearing loss. Hum Genet 121 : 203211. 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Primers used in RT-PCR and sequencing for the analysis of Usher type 1 and 2 transcripts Amplified Expected product size Transcript Accession nb Forward primer (5'-3') Reverse primer (5'-3') exons (bp) USHER type 1 MYO7A NM 000260. 1 CAGAGGAGGTGACCAAGAGG AGGTCACGAATGTCCTCAGC GAAGCTGCACTTCATCATCG CTTCTGGGCATCAGTTCTCC 27-33 904 USH1C NM 005709. 1 GAAAAGAAATTGCCCAGAAGG AAATCCTGCTCTCCCTGCTC CAGCAGAGGAAAATGAGAGATACC CTCGAGCTCAGGTTCCACTC 13-(15/16) 194 NM153676. 2 GAAAAGAAATTGCCCAGAAGG GGTTGCTCAGTGCTTCTTCC CAGCAGAGGAAAATGAGAGATACC ACATGTCCAAAGGGATGTCG 13-19(D) CDH23 NM 22124. 4 GTTGTGCTAGAGGACATCAACG CACTCAGGTTCTCCGGTAGG TCTGGCCATCCACTACTTCC ACAATGGCCTTGAGCTTCC 59-64 653 PCDH15 EU718482* CTCCAGAGGCAGTGACCAGC CGATTAATTGATAACAATGTG Isoform CD3 CTGAGTGTACAAAGACTGCACG GGCTTCACCGCTGTATTGTCAG 32-36 647 USH1G NM173477. 2 CATGCCTCAGCCCTAATACC TCCCCCAAGTCTACATGTCC CCGAAAGGAGCTGAATGC TCAAGACCCCTCAGAACTGG 1-3 1551 USHER type 2 USH2A Short isoform (a) NM 007123. 5 CCTGGGTCTCAGAAAGAACG ATAGCATGAGGGCATTTTGC CAGTCTTTCCCCTCTCTTCG TCAGGCAAAAGCTATCAAAGG 19-21 662 Long isoform (b) NM 206933. 2 GATCAGAGTGATGAGCTCTGC CACAGTGCAAATGTGGCTGG CCTGAATCTATCTGTGGAC GAGGATCCTGCACTCTTTGG 48-52 678 GPR98 NM 032119. 3 GCATCAAAAACTCCCTGTCC GAATGGCTGGAAATGTAGGC GCTAATGCCAGGCTAAACTCC TGAATGAGCTCCCACTAGAGC 49-51 444 WHRN Short isoform AK022854. 1 CACGATGCATGGTTCTCTTG* TGTTGAGCAGCTTGAACAGG* GCTCAAATGCACAACTGGAG CCAGGTAGTAGGCCATGGTG 5-6 216 Long isoform NM 015404. 2 TGCTCTTCGACCAATACACG* CAGACAGCACCAGCTTCTTG* TGCTCTTCGACCAATACACG* GCTTCTTGGAGCCCTTCAG 1-2 335 * : from van Wijk et al. , (2006) ; * : from Ahmed et al. , (2008). Vaché et al. , Human Mutation 2 Supp. Table S2. Primers used in RT-PCR and sequencing for the analysis of Usher patients Variant Forward primer Reverse primer Amplified exons Expected product size (bp) USHER type 1 CDH23 c. 3580-T AACTTCCGGATCCATGTCAG CGGTGATGATAAGCCCTGTGC CATCCCACGTGCTGATAGTG ACAGGATGCGGTAGTTCACC 29-31 234 c. 6050-A CGCATAGCCAGGAGGGATTATG GCACGCTCACTGTCTGGATGG AACTCTCCCGCTGGCACCC GTTCTCTAGCAGATGGAC 44/45-46 333 GATGCAGACCAAGACATCTACG MYO7A c. A/c. A CAGAGGAGGTGACCAAGAGG AGGTCACGAATGTCCTCAGC GAAGCTGCACTTCATCATCG CTTCTGGGCATCAGTTCTCC 27-33 904 GTGACATTCATGGATGGGACC USHER type 2 USH2A c. 2168-C CTGTAACTGCAATACCTCTGG CAAACACACTGACCAGTCAGG GATGGAGATATTACCTGTCACC GATTAACTGCACCAGTTGTATGG 12-14 775 c. 7595-G TTTCCAATCCTTCTGCATCG CTCATATCTCAAATTAGGTCC TCCATTCATGACCGCAGAGG CACTGCGGAAGTCACATTGG 40-42 754 c. 4576 4579dupGGGT GTTGGTTGTGTGACCAGTGC CCCAGGAACTGTTTGTACAGC* GTGACCAGTGCTTCGGGA CAGTACTACCATTCAGGATGG 20-24 559 c. A CAATGGCGTGGAGAAGGATC GGAGTAAAATTGGAAAGCTG CTCTAAGTGGTTCAATTACAG GAAGACAGTTGACAGAATCAG 4-7 598 CAACTGAAATAGTCACTCC * : primer from van Wijk et al. , (2004). Vaché et al. , Human Mutation 3 Supp. Table S3. Effect of Usher variants on splicing by in silico analysis HSF Fruit Fly NetGene2 splice HSF matrice Max Ent Score Score Confidence Usher gene Variant site type Wild Wild Wild Wild Natural Mutant Natural Mutant Natural Mutant Natural Mutant Type Type Type Type CDH23 c. 3580-T acceptor 88. 76 88. 76 59. 82 8. 92 8. 92 0. 32 0. 91 0. 91 nr 0. 96 0. 96 nr c. 6050-A acceptor 81. 56 54. 41 83. 36 6. 34 (-) 4. 4 3. 54 nr nr nr 0. 18 nr 0. 25 c. A acceptor 87. 19 46. 69 75. 63 1. 86 (-) 6. 56 1. 39 nr nr nr 0. 2 nr nr MYO7A c. A acceptor 91. 68 nr nr 3. 16 nr nr 0. 99 nr nr 1 nr nr 88. 04 88. 04 59. 09 8. 95 8. 95 0. 89 0. 97 0. 97 nr 0. 97 0. 97 nr c. 2168-C acceptor 78. 9 81. 44 1. 8 7. 11 nr 0. 71 91. 26 91. 26 88. 72 7. 95 7. 95 1. 31 0. 93 0. 93 0. 86 0. 48 0. 48 0. 27 USH2A c. 7595-G acceptor 47. 5 76. 45 0. 1 8. 16 c. 4576- donnor 95. 25 70. 11 83. 66 10. 65 2. 85 3. 82 1 nr nr 0. 63 nr 0. 89 4579dupGGGT c. A donnor 85. 75 70. 44 75. 19 9. 43 4. 48 7. 67 0. 94 nr 0. 85 0. 91 nr 0. 54 nr : not recognized. Annexes Annexe 4 : Représentation graphique des profondeurs de couverture Moyenne par région et par gène sur l'ensemble du groupe contrôles Profondeur moyenne / région Profondeur moyenne / région Régions CLRN1 Régions GPR98 0 5 UTR Profondeur moyenne / région 5 UTR 1 Alt 2 0 50 100 150 200 Régions USH2A Alt. 1 6 3 UTR 7 Moyenne 8 9 5 UTR Profondeur moyenne / région 24 15 Régions DFNB31 31 Alt 3 UTR 5 UTR 33 23 Alt 35 25 3 UTR 47 37 Moyenne 48 38 51 Pseudoex Profondeur moyenne / région 63 52 Régions PDZD7 5 UTR 72 61 Alt 82 71 11 84 3 UTR 12 85 Moyenne 3 UTR 3 UTR Moyenne Moyenne Profondeur moyenne / région Profondeur moyenne / région Régions USH1C Régions MYO7A Profondeur moyenne / région 5 UTR 5 UTR Régions CDH23 9 9 5 UTR Alt 15 6 20 21 Alt 23 24 Alt. 1 27 Alt 17 3 UTR 28 18 Moyenne 29 19 36 Alt. 2 Profondeur moyenne / région 29 43 Alt. 3 Régions PCDH15 5 UTR 49 37 1 3 UTR 38 2 Moyenne 39 Alt 40 9 Alt. 4 Alt. 1 49 17 Profondeur moyenne / région 55 Régions USH1G 26 5 UTR Alt. 5 30 3 UTR 67 31 Moyenne 68 32 3 UTR Alt. 2 Moyenne 3 UTR Alt. 3 Alt. 4 Alt. 5 Alt. 6 Moyenne Profondeur moyenne / région Profondeur moyenne / région Profondeur moyenne / région Régions TMC1 Régions GJB2 Régions CHM 5 UTR 5 UTR 5 UTR 3 3 UTR 3 4 Moyenne 4 5 Alt Régions GJB6 15 5 UTR 14 17 2 3 UTR 18 Alt Moyenne 22 3 UTR 23 Moyenne 24 Profondeur moyenne / région 3 UTR Moyenne Régions MYO15A Régions GJB3 5 UTR 5 UTR Alt 1 Profondeur moyenne / région 2 3 3 UTR 4 100 150 200 Moyenne 5 Régions TECTA Profondeur moyenne / région 9 5 UTR 12 Régions OTOF 6 5 UTR 18 3 UTR 18 36 Moyenne Alt 37 Profondeur moyenne / région 26 45 Régions VEZT 5 UTR 35 54 Alt 38 57 11 47 3 UTR 12 3 UTR Moyenne 3 UTR Moyenne Moyenne Syndrome de Usher : Outils innovants pour une exploration moléculaire exhaustive Résumé : Le syndrome de Usher est une maladie génétique associant surdité congénitale et rétinopathie pigmentaire (RP), auxquelles peuvent s'ajouter des troubles vestibulaires. Les différences phénotypiques, distinguées en 3 types cliniques, s'accompagnent d'une hétérogénéité génétique impliquant au moins 10 gènes. Identifier et caractériser les causes moléculaires grâce aux outils d'analyses génétiques disponibles permet d'améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques à l'origine des symptômes du syndrome de Usher. Dans ce cadre, nous nous sommes inscrits dans une recherche d'exhaustivité des études moléculaires. Dans un premier temps, nous avons ainsi mis en place l'analyse et défini le spectre mutationnel des gènes minoritairement impliqués dans le type II (GPR98 et DFNB31). Nous avons également développé différents outils, notamment pour l'analyse de variants altérant le mécanisme d'épissage ou touchant les régions promotrices des gènes USH2. Ces travaux permettent d'obtenir un taux de détection des altérations conduisant au syndrome de Usher type 2 de 90 %. Ce taux est maintenant similaire à celui observé pour le type 1, qui constituait jusqu'ici la référence. Nous avons, dans un second temps, développé le séquençage nouvelle génération (NGS) appliqué à l'exome Usher. L'objectif de cette analyse était de tester la faisabilité et l'efficacité de cette approche, en vue de son éventuelle utilisation en diagnostic moléculaire. La définition des critères de qualité et la mise en place de la priorisation des variants ont été réalisées sur un groupe contrôle. L'étude a ensuite été étendue sur une cohorte de patients. Les résultats obtenus montrent qu'une utilisation en diagnostic est possible mais restera dépendante de l'amélioration de la technique du séquençage, de son analyse et des outils bioinformatiques pour interpréter le volume de données ainsi généré. Mots clés : Syndrome de Usher, Génétique, Hétérogénéité, Analyse moléculaire, Séquençage nouvelle génération Usher syndrome : Advanced tools for a comprehensive molecular exploration Abstract : Usher syndrome is a genetic disorder combining sensorineural hearing loss (HL) and retinitis pigmentosa (RP). Some patients will also exhibit vestibular areflexia (VA). Clinical and genetic heterogeneity is recognized as the 3 clinical subgroups, defined mainly on the degree of HL and VA, can be caused by mutations in one of the 10 known genes. It is important to use all accessible genetic tools to identify and characterize molecular origin in order to improve the knowledge of the physiopathological mechanisms causing Usher Syndrome. In this context, we have developed an exhaustive approach. In a first step, we have implemented the analysis and established the mutational spectrum of the 2 minor USH2 genes (GPR98 and DFNB31). In addition, we have developed several tools, in particular to study variants susceptible to alter splicing or lying in the promoter regions of the USH2 genes. Thanks to this work, the USH2 mutation detection rate has now been raised to 90%, similar to that of USH1. We have then designed a targeted exome of the Usher genes to be sequenced using the GS Junior system (Roche 454). The aim of the study was to test the feasibility of this new technics for a possible transfer to diagnostic facilities. Quality criteria and variant priorization were set up on a control cohort (previously studied in one of the USH gene). The study has then been extended on a patient cohort. Our results indicate that NGS Usher-exome can be used in molecular diagnostics but improvement of the reliability of the sequencing technology, bioinformatics tools and dedicated databases is essential. Key Words : Usher Syndrome, Genetics, Heterogeneity, Molecular analysis, Next generation sequencing DISCIPLINE Génétique Moléculaire INTITULE ET ADRESSE DE L'U. F. R. OU DU LABORATOIRE : U 827 - Laboratoire de Génétique des Maladies Rares. Pathologie moléculaire, études fonctionnelles et banque de données génétiques - IURC | HAL | Scientific |
La chimiothérapie ambulatoire dans la tuberculose pulmonaire ; effets cliniques et épidémiologiques | WMT16 | Scientific |
DIAMOX 250 mg, comprimé sécable - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 28/09/2018 Acétazolamide. 250 mg Pour un comprimé sécable. Excipient à effet notoire : amidon de blé. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Traitement de certaines alcaloses métaboliques, en particulier au cours des décompensations des insuffisances respiratoires chroniques, nécessitant le recours à la ventilation mécanique. Traitement symptomatique du mal des montagnes. la posologie usuelle est de 1 à 2 comprimés par jour. Elle peut être augmentée jusqu'à 4 comprimés par jour. : 5 à 10 mg/kg/jour. Mode d'administration Voie orale. Répartir les prises au cours des repas. RESERVE A L'ADULTE ET A L'ENFANT DE PLUS DE 6 ANS. Hypersensibilité à l'acétazolamide ou à l'un des excipients, Insuffisances hépatique, rénale ou surrénale sévères, Intolérance aux sulfamides, Antécédents de colique néphrétique. Ce médicament est contre-indiqué chez les patients présentant une allergie au blé (autre que la maladie cœliaque). L'acétazolamide est contre-indiqué au 1er trimestre de la grossesse (voir rubriques 4. 4 et 4. 6). Mises en garde spéciales Des cas de glaucome bilatéral aigu par fermeture d'angle et/ou de myopie ont été rapportés chez les patients traités par acétazolamide. Le mécanisme supposé du glaucome aigu par fermeture d'angle et/ou de la myopie est un œdème cilio-choroïdien dû à une réaction allergique ou idiosyncrasique à la composante sulfonamide, également décrite avec d'autres dérivés des sulfamides. Le traitement par DIAMOX doit être arrêté et il convient de demander conseil à un médecin. Des cas d'insuffisance rénale aigu ont été observés (voir rubrique 4. 8). Une évolution favorable a été observée après l'arrêt de DIAMOX et après un traitement correcteur approprié si nécessaire. Chez les patients souffrant d'insuffisance chronique, la fonction rénale doit être surveillée. L'apparition d'un érythème généralisé associé à une fièvre et à la formation de pustules au début du traitement peut être un symptôme d'une pustulose exanthématique aige généralisée (PEAG) (voir la rubrique 4. 8). En cas de diagnostic de PEAG, le traitement par acétazolamide doit être interrompu et toute administration ultérieure d'acétazolamide est contre-indiquée. Cette spécialité contient un principe actif (acétazolamide) pouvant induire une réaction positive des tests pratiqués lors de contrôles antidopage, chez les sportifs. Ce médicament peut être administré en cas de maladie cœliaque. L'amidon de blé peut contenir du gluten, mais seulement à l'état de trace, et est donc considéré comme sans danger pour les sujets atteints d'une maladie cœliaque. Précautions particulières d'emploi Chez certains sujets à risque (sujets âgés, diabétiques ou en état d'acidose), ou en cas d'utilisation au long cours, il est recommandé de surveiller l'ionogramme sanguin, la glycémie, l'uricémie et la formule sanguine. Femmes enceintes L'acétazolamide est contre-indiqué au 1 trimestre de la grossesse et ne doit pas être utilisé au cours des 2 et 3 trimestres, sauf en cas d'absolue nécessité (voir rubriques 4. 3 et 4. 6). Femmes en âge de procréer En raison des effets observés chez les fœtus/nouveau-nés en cas d'exposition au cours de la grossesse, les femmes en âge de procréer doivent être informées du risque et utiliser une contraception efficace pendant le traitement (voir rubrique 4. 6). Acide acétylsalicylique Majoration des effets indésirables, et notamment de l'acidose métabolique, de l'acide acétylsalicylique à des doses élevées et de l'acétazolamide, par diminution de l'élimination de l'acide acétylsalicylique par l'acétazolamide. Associations faisant l'objet de précautions d'emploi Carbamazépine Augmentation des concentrations plasmatiques de carbamazépine avec signes de surdosage. Surveillance clinique et, si besoin, contrôle des concentrations plasmatiques de carbamazépine et réduction éventuelle de sa posologie. Hydroquinidine, quinidine Augmentation des concentrations plasmatiques de l'hydroquinidine ou de la quinidine et risque de surdosage (diminution de l'excrétion de l'hydroquinidine ou de la quinidine par alcalinisation des urines). Surveillance clinique, ECG et éventuellement contrôle de la concentration plasmatique de l'hydroquinidine ou de la quinidine ; si besoin, adaptation de la posologie pendant le traitement alcalinisant et après son arrêt. Lithium Diminution de la lithémie avec risque de baisse de l'efficacité thérapeutique. Surveillance stricte de la lithémie et adaptation éventuelle de la posologie du lithium. Valproïque (acide) et, par extrapolation, valpromide Augmentation de l'hyperammoniémie (voir rubrique 4. 8), avec risque accru d'encéphalopathie. Surveillance clinique et biologique régulière. Femmes en âge de procréer Les femmes en âge de procréer doivent utiliser une contraception efficace pendant le traitement. Grossesse Les études effectuées chez l'animal ont mis en évidence un effet tératogène. En clinique, des cas de malformations concordantes avec celles observées chez l'animal (membres, œil) ainsi que des malformations cranio-maxillo-faciales et cardiaques ont été rapportés après exposition au cours du premier trimestre de grossesse. Des anomalies hydro-électrolytiques (acidose métabolique, hypocalcémie et hypomagnésémie, déshydratation, hypophosphatémie), des anomalies du volume de liquide amniotique (hydroamnios ou oligoamnios voire anamnios) et des retards de croissance ont été rapportés chez le nouveau-né exposé pendant la grossesse. Compte tenu de ces données, l'acétazolamide : est contre-indiqué au 1er trimestre de la grossesse (existence d'alternatives plus sûres) ; ne doit pas être utilisé au cours des 2ème et 3ème trimestres, sauf en cas de nécessité absolue. Les femmes en âge de procréer doivent être informées du risque et utiliser une contraception efficace pendant le traitement. En cas d'exposition au cours de la grossesse, il conviendra de réaliser un suivi prénatal spécialisé orienté sur les malformations décrites ci-dessus ainsi qu'une surveillance du volume du liquide amniotique. En cas d'exposition en fin de grossesse, il conviendra de réaliser un bilan hydro-électrolytique chez le nouveau-né. Allaitement Compte tenu du passage de l'acétazolamide dans le lait, l'allaitement est déconseillé. Fertilité Sans objet. Troubles du métabolisme et de la nutrition Perturbation du métabolisme glucidique, diabète. Hyperuricémie avec crise de goutte aigu. Hypokaliémie avec acidose métabolique. Troubles du métabolisme calcique. Perturbation du métabolisme de l'ammoniaque chez le cirrhotique (voir rubrique 4. 3). Hyperammoniémie chez les patients épileptiques (voir rubrique 4. 5). Affections endocriniennes : dysthyroïdies. Affections du rein et des voies urinaires : lithiase rénale, insuffisance rénale aigu ou aggravation d'une insuffisance rénale chronique sous-jacente (voir rubrique 4. 4). Affections hépatobiliaires : coma hépatique chez le cirrhotique (voir rubrique 4. 3). Troubles généraux et anomalies au site d'administration : asthénie. Affections du système nerveux : somnolence, dysesthésies pouvant être corrigées par adjonction d'un sel de potassium. Affections gastro-intestinales : troubles gastro-intestinaux. Affections du système immunitaire : réactions d'hypersensibilité essentiellement à type de rashs cutanés et de fièvre et quelques cas d'érythrodermie, cas isolés de chocs anaphylactiques pouvant être fatals. Affections hématologiques et du système lymphatique leucopénie, thrombocytopénie. : accidents hématologiques (purpura thrombopénique, agranulocytose, aplasie médullaire), probablement par sensibilisation aux sulfamides. Affections psychiatriques : confusion pouvant être associée à des hallucinations. Affections oculaires : glaucome bilatéral aigu par fermeture d'angle et/ou myopie (voir rubrique 4. 4). Affections de la peau et du tissu sous-cutané : rash, prurit, dermite exfoliative généralisée, pustulose exanthématique aigu généralisée (PEAG). Affection respiratoires, thoraciques et médiastinales Fréquence indéterminée : œdème aigu pulmonaire non-cardiogénique, pouvant être dû à une réaction d'hypersensibilité (voir section 4. 3). Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . Symptômes Un déséquilibre électrolytique, une acidose et des effets sur le système nerveux central peuvent être attendus. Prise en charge En cas de surdosage, l'hospitalisation est nécessaire dans un but de surveillance et de contrôle hydro-électrolytique. Code ATC : S01EC01 L'absorption digestive de l'acétazolamide est très rapide. Au niveau du plasma, il est fortement lié aux protéines plasmatiques (90-95 %). La demi-vie plasmatique est de 5 h et l'excrétion urinaire est totale en 24 h sous forme non métabolisée. 3 ans. PLACE LUCIEN AUVERT 77020 MELUN CEDEX [Tel, fax, e-Mail : à compléter ultérieurement par le titulaire] 34009 303 052 7 0 : 24 comprimés sous plaquettes (PVC/Aluminium). Sans objet. Liste I. | BDPM | Medicinal |
Les enzymes du liquide céphalo-rachidien (Intérêt pratique des connaissances actuelles) | WMT16 | Scientific |
Recherches sur certaines activités antihistaminiques naturelles | WMT16 | Scientific |
Ne pas congeler. 'es En cours d' utilisation ou immédiatement avant usage, les flacons de Monotard ne doivent pas être conservés au réfrigérateur. | EMEA_V3 | Medicinal |
Potentiation, par des cellules hépatiques normales, du développement de l'hépatome de Novikoff dans la poche de granulome de Selye | WMT16 | Scientific |
Homéopathie et acupuncture. Affections buccales et commissures fendillées | WMT16 | Scientific |
Lésions pulmonaires liées aux explosions | WMT16 | Scientific |
Novartis Tiergesundheit GmbH, Tel : 49-(0)89 7877 713 , eská republika, Eesti, Latvija, Lietuva, Magyarország, Polska, România, Slovenija, Slovenská republika : | EMEA_V3 | Medicinal |
COMMISSION DE LA TRANSPARENCE Avis 7 septembre 2016 chloroquine NIVAQUINE 100 mg, comprimé sécable B/20 (CIP : 34009 307 311 7 8) B/100 (CIP : 34009 307 310 0 0) NIVAQUINE 25 mg/5 ml, sirop B/1 flacon de 150 ml (CIP : 34009 325 444 5 5) Laboratoire SANOFI Code ATC P01BA01 (Antipaludéen) Motif de l'examen Renouvellement de l'inscription Listes concernées Sécurité Sociale (CSS L. 162-17) Parasitologie : Traitement curatif et préventif du paludisme. Il est nécessaire, lors de la prescription d'antipaludiques, de prendre en compte les recommandations des autorités sanitaires nationales et internationales concernant l'évolution des chimiorésistances. Indications Rhumatologie : concernées Traitement symptomatique d'action lente de la polyarthrite rhumatoïde. Dermatologie : Lupus érythémateux discoïde. Lupus érythémateux subaigu. Traitement d'appoint ou prévention des rechutes des lupus systémiques. Prévention des lucites. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 1/14 Avis 2 01 INFORMATIONS ADMINISTRATIVES ET REGLEMENTAIRES NIVAQUINE 100 mg, comprimé sécable : 07/03/1974 (procédure AMM nationale) NIVAQUINE 25 mg/5 ml, sirop : 09/01/1974 (procédure nationale) Conditions de prescription et de Liste II délivrance / statut particulier P Antiparasitaires, insecticides P01 Antiprotozoaires Classification ATC P01B Antipaludéens P01BA Aminoquinoléines P01BA01 chloroquine 02 CONTEXTE Examen des spécialités réinscrites sur la liste des spécialités remboursables aux assurés sociaux pour une durée de 5 ans par tacite reconduction à compter du 31/12/2011. Dans son dernier avis de renouvellement du 03/10/2012 et de réevaluation du 23/07/2014, la Commission a considéré que le SMR de NIVAQUINE était important dans les indications de l'AMM. 03 CARACTERISTIQUES DU MEDICAMENT 03. 1 Indications thérapeutiques Parasitologie : Traitement curatif et préventif du paludisme. Il est nécessaire, lors de la prescription d'antipaludiques, de prendre en compte les recommandations des autorités sanitaires nationales et internationales concernant l'évolution des chimiorésistances. Rhumatologie : Traitement symptomatique d'action lente de la polyarthrite rhumatoïde. Dermatologie : Lupus érythémateux discoïde. Lupus érythémateux subaigu. Traitement d'appoint ou prévention des rechutes des lupus systémiques. Prévention des lucites. 03. 2 Posologie Cf. RCP HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 2/14 Avis 2 04 ANALYSE DES NOUVELLES DONNEES DISPONIBLES 04. 1 Efficacité Le laboratoire n'a fourni aucune nouvelle donnée clinique d'efficacité. 04. 2 Tolérance/Effets indésirables Le laboratoire a fourni des nouvelles données de tolérance (données de pharmacovigilance couvrant la période du 22/02/2009 au 01/08/2015). Depuis la dernière soumission à la Commission, des modifications de RCP ont été réalisées concernant les rubriques 4. 3 Contre-indication , 4. 4 Mises en gardes spéciales et précautions d'emploi , 4. 5 Interaction avec d'autres médicaments et autres formes d'interaction , 4. 8 Effets indésirables et 4. 9 Surdosage (Cf. Tableau en annexe). Ces données ne sont pas de nature à modifier le profil de tolérance connu pour ces spécialités. 04. 3 Données d'utilisation/de prescription Selon les données IMS-EPPM (cumul mobile annuel printemps 2016), NIVAQUINE a fait l'objet d'environ 3 700 prescriptions. Le faible nombre de prescriptions de cette spécialité ne permet pas l'analyse qualitative des données. 04. 4 Stratégie thérapeutique Les données acquises de la science sur les pathologies concernées et leurs modalités de prise en charge ont également été prises en compte1, 2, 3, 4, 5, 6. Depuis la dernière évaluation par la Commission du 03/10/2012 et 23/07/2014, la place de NIVAQUINE dans la stratégie thérapeutique n'a pas été modifiée. World Health Organization (WHO). Guidelines for the treatment of malaria. Third edition. 2015 Société de Pathologie Infectieuse de Langue Française (SPILF). Recommandations pour la pratique clinique prise en charge et prévention du paludisme d'importation à Plasmodium falciparum. Révision 2007 de la conférence de consensus 1999. Institut de Veille Sanitaire (InVS). Recommandations sanitaires pour les voyageurs, 2015. Avis du Haut Conseil de la Santé Publique (HCSP) du 24 avril 2015. Bulletin Épidémiologique Hebdomadaire (BEH). 9 juin 2015 / n 21-22 Gaujoux-Viala C et al. Recommendations of the French Society for Rheumatology for managing rheumatoid arthritis. Joint Bone Spine. 2014 ; 81 : 287-97 Tunnicliffe DJ et al. Diagnosis, Monitoring, and Treatment of Systemic Lupus Erythematosus : A Systematic Review of Clinical Practice Guidelines. Arthritis Care Res. 2015 ; 67 : 1440-52 Van Vollenhoven RF et al. Treat-to-target in systemic lupus erythematosus : recommendations from an international task force. Ann Rheum Dis. 2014 ; 73 : 958-67 HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 3/14 Avis 2 05 CONCLUSIONS DE LA COMMISSION Considérant l'ensemble de ces informations et après débat et vote, la Commission estime que les conclusions de ses avis précédents du 03/10/2012 et 23/07/2014 n'ont pas à être modifiées. 05. 1 Service Médical Rendu 5. 1. 1 Paludisme Le paludisme est une maladie grave en raison d'une létalité potentielle lorsque P. falciparum en est la cause. Il s'agit d'un traitement à visée préventive ou curative. La Commission rappelle qu'aucun moyen préventif n'assure à lui seul une protection totale. Il convient donc d'insister sur la nécessité de l'observance simultanée d'une protection contre les piqûres de moustiques associée à la chimioprophylaxie. Selon les zones de résistance, la chloroquine peut être utilisée seule (zone 1) ou en association (zone 2) dans le traitement à visée prophylactique. La chloroquine peut être utilisée dans le traitement à visée curative en cas de paludisme chloroquinosensible (P. vivax, P. ovale, P. malariae et P. knowlesi). La chloroquine n'est pas recommandée dans le traitement curatif du paludisme à P. falciparum. Le rapport efficacité/effets indésirables est important Il existe des alternatives thérapeutiques. Il s'agit d'un traitement de 1ère intention pour la prise en charge des formes non compliquées de paludisme à P. vivax, P. ovale, P. malarie et P. knowlesi, ainsi que pour la prophylaxie dans les zones de résistance 1 (chloroquine seule) et 2 (chloroquine en association au proguanil). 5. 1. 2 Polyarthrite rhumatoïde La polyarthrite rhumatoïde est une maladie chronique grave et invalidante. Il s'agit d'un traitement à visée symptomatique. Le rapport efficacité/effets indésirables est important Il existe de nombreuses alternatives thérapeutiques, notamment d'autres traitements de fond biologiques et non biologiques. Cette spécialité est une alternative à l'hydroxychloroquine dans le traitement des formes bénignes peu actives de polyarthrite rhumatoïde et en association à d'autres traitements de fond. 5. 1. 3 Dermatologie Les affections dermatologiques concernées peuvent être grave, engageant le pronostic vital et/ou entrainant une dégradation de la qualité de vie. Il s'agit d'un traitement à visée préventive et/ou symptomatique, selon les indications. Le rapport efficacité/effets indésirables est important Il existe des alternatives thérapeutiques. Cette spécialité est une alternative à l'hydroxychloroquine dans le traitement de fond du lupus systémique et dans le traitement systémique des manifestations dermatologiques en cas de lupus subaige et discoïde. Cette spécialité garde également une place dans le traitement des lucites polymorphes o le traitement repose sur la radioprotection externe et les antipaludéens de synthèse. Compte tenu de ces éléments, la Commission considère que le service médical rendu par NIVAQUINE reste important dans les indications de l'AMM. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 4/14 Avis 2 05. 2 Recommandations de la Commission La Commission donne un avis favorable au maintien de l'inscription sur la liste des spécialités remboursables aux assurés sociaux dans les indications de l'AMM. Taux de remboursement proposé : 65 % Conditionnements Ils sont adaptés aux conditions de prescription selon l'indication, la posologie et la durée de traitement. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 5/14 Avis 2 Annexe RCP de Juin 2006 RCP du 3 Juillet 2015 (Projet REX du 18/09/2008) 4. 3. Contre-indications 4. 3. Contre-indications Hypersensibilité à la chloroquine, à ses dérivés, ou à l'un des constituants Hypersensibilité à la chloroquine, à ses dérivés, ou à l'un des constituants de ce médicament. de ce médicament. Rétinopathies (sauf en cas de traitement curatif du paludisme et si on ne Rétinopathies (sauf en cas de traitement curatif du paludisme et si on ne dispose dispose pas d'autre traitement antipaludique). pas d'autre traitement antipaludique, ce après avoir mis en balance les bénéfices et les risques éventuels encourus) (voir rubriques 4. 4 et 4. 8). En cas d'association avec le citalopram, l'escitalopram et la dompéridone en raison du risque majoré de troubles du rythme ventriculaire, notamment de torsades de pointe (voir rubriques 4. 4 et 4. 5). En raison de la présence d'amidon de blé (gluten) comme excipient, ce Forme comprimé uniquement médicament est contre-indiqué chez les sujets atteints de maladie En raison de la présence d'amidon de blé (gluten) comme excipient, ce cœliaque. médicament est contre-indiqué chez les sujets atteints de patients présentant une allergie au blé (autre que la maladie cœliaque). 4. 4. Mises en garde spéciales et précautions d'emploi 4. 4. Mises en garde spéciales et précautions d'emploi Mises en garde spéciales Mises en garde spéciales Chez les sujets atteints de porphyrie intermittente, la prise de chloroquine peut Chez les sujets atteints de porphyrie intermittente, la prise de chloroquine peut déclencher la survenue d'une crise aigu. déclencher la survenue d'une crise aigu. Chez les sujets atteints de porphyrie cutanée tardive, la prise de chloroquine Chez les sujets atteints de porphyrie cutanée tardive, la prise de chloroquine peut favoriser la survenue d'une atteinte hépatique et ce de façon dose peut favoriser la survenue d'une atteinte hépatique et ce de façon dose dépendante (voir rubrique 4. 8). dépendante (voir rubrique 4. 8). Chez les sujets atteints de psoriasis, l'administration de chloroquine peut Chez les sujets atteints de psoriasis, l'administration de chloroquine peut entraner une aggravation des lésions. entraner une aggravation des lésions. Chez les patients atteints d'affections rhumatologiques ou dermatologiques Des rétinopathies/ maculopathies, y compris dégénérescence maculaire ont été traités au long cours par des doses élevées de chloroquine, une rétinopathie rapportées chez les patients traités au long cours par la chloroquine peut survenir. (généralement chez des patients atteints d'affections rhumatologiques ou dermatologiques) (voir rubrique 4. 8). Ces atteintes liées à l'accumulation de chloroquine dans la rétine peuvent être irréversibles. La chloroquine ne doit pas être utilisée chez les patients présentant une rétinopathie sauf en cas de traitement curatif du paludisme et si on ne dispose pas d'autre traitement antipaludique (voir rubrique 4. 3) HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 6/14 Avis 2 RCP de Juin 2006 RCP du 3 Juillet 2015 (Projet REX du 18/09/2008) Afin de dépister les complications rétiniennes liées à l'utilisation de la Afin de dépister les complications rétiniennes liées à l'utilisation de la chloroquine, qui peut exceptionnellement mener à une maculopathie irréversible, chloroquine, qui peut exceptionnellement mener à une maculopathie irréversible, il conviendra de rechercher une anomalie ophtalmologique avant le début ou il conviendra de rechercher une anomalie ophtalmologique avant le début ou dans les premières semaines du traitement chez les patients pour lesquels un dans les premières semaines du traitement chez les patients pour lesquels un traitement au long cours est envisagé. traitement au long cours est envisagé. Cette recherche d'une anomalie ophtalmologique peut être effectuée par un Cette recherche d'une anomalie ophtalmologique peut être effectuée par un questionnaire ciblé sur les troubles visuels et une évaluation de l'acuité visuelle questionnaire ciblé sur les troubles visuels et une évaluation de l'acuité visuelle par lecture de textes et de caractères de différentes tailles avec chaque œil par lecture de textes et de caractères de différentes tailles avec chaque œil séparément. séparément. En cours de traitement, les modalités et la fréquence de surveillance En cours de traitement, les modalités et la fréquence de surveillance ophtalmologique sont à définir en fonction de : ophtalmologique sont à définir en fonction de : La dose quotidienne prescrite : les doses de chloroquine inférieures à La dose quotidienne prescrite : les doses de chloroquine inférieures à 4 mg/kg/j sont considérées comme les doses à faible risque. 4 mg/kg/j sont considérées comme les doses à faible risque. La durée du traitement : aux doses inférieures à 4 mg/kg/j, le risque de perte La durée du traitement : aux doses inférieures à 4 mg/kg/j, le risque de perte permanente de l'acuité visuelle est considéré comme faible pendant les 10 permanente de l'acuité visuelle est considéré comme faible pendant les 10 premières années du traitement. premières années du traitement. La présence de facteurs de risque supplémentaires comme l'âge du patient La présence de facteurs de risque supplémentaires comme l'âge du patient supérieur à 65 ans, l'insuffisance rénale chronique, l'existence éventuelle supérieur à 65 ans, l'insuffisance rénale chronique, l'existence éventuelle d'une atteinte oculaire préalable. d'une atteinte oculaire préalable. Chez les patients avec une acuité visuelle normale, traités par les doses de Chez les patients avec une acuité visuelle normale, traités par les doses de chloroquine considérées comme les doses à faible risque et sans autre facteur chloroquine considérées comme les doses à faible risque et sans autre facteur de risque préalable, un suivi clinique simple peut être effectué une fois par an de risque préalable, un suivi clinique simple peut être effectué une fois par an (questionnaire, évaluation de l'acuité visuelle). (questionnaire, évaluation de l'acuité visuelle). Chez les patients ayant une anomalie ophtalmologique préexistante ou un autre Chez les patients ayant une anomalie ophtalmologique préexistante ou un autre facteur de risque, un suivi ophtalmologique adapté plus rapproché peut être facteur de risque, un suivi ophtalmologique adapté plus rapproché peut être effectué. effectué. Si une modification visuelle révélatrice d'une rétinopathie/maculopathie survient pendant le traitement, la chloroquine doit être immédiatement arrêtée, le pronostic visuel semblant meilleur lors de l'arrêt précoce de la chloroquine, et le patient doit être mis sous surveillance. Les changements rétiniens (et troubles visuels) peuvent évoluer même après l'arrêt du traitement. Des troubles extrapyramidaux aigus (voir rubriques 4. 8 et 4. 9) ont été rapportés sous chloroquine disparaissant généralement à l'arrêt du traitement et/ou avec un traitement symptomatique (benzodiazépines et/ou atropiniques). La poursuite du traitement ne doit se faire qu'après évaluation de la balance bénéfice/risque pour le patient et le patient devra être mis sous surveillance. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 7/14 Avis 2 RCP de Juin 2006 RCP du 3 Juillet 2015 (Projet REX du 18/09/2008) La survenue d'un exanthème maculo-papeux fébrile associé à des symptômes systémiques (atteintes hépatique, pulmonaire, rénale, éosinophilie) doit faire craindre une réaction médicamenteuse avec éosinophilie et symptômes systémiques (Syndrome de DRESS) et impose l'arrêt du traitement (voir rubrique 4. 8). Il a été rapporté des cas d'hypoglycémie sévère sous chloroquine, notamment des cas de perte de connaissance ou des mises en jeu du pronostic vital liées à une hypoglycémie chez des patients traités ou non par des médicaments antidiabétiques (voir rubrique 4. 8). Les patients traités par chloroquine doivent être avertis du risque d'hypoglycémie et des signes et symptômes associés. Une surveillance de la glycémie chez les patients présentant une symptomatologie évocatrice est recommandée et leur traitement devra être rediscuté si nécessaire. NIVAQUINE doit être utilisé avec précaution chez les patients présentant des facteurs de risques connus pour allonger l'intervalle QT tels que, par exemple : un syndrome du QT long congénital ou acquis, un déséquilibre électrolytique non corrigé (par exemple, l'hypokaliémie, l'hypomagnésémie), des pathologies cardiaques (telles qu'une insuffisance cardiaque, un infarctus du myocarde ou une bradycardie). Les traitements concomitants avec des médicaments connus pour allonger l'intervalle QT sont déconseillés voire contre-indiqués (voir rubriques 4. 3 et 4. 5). Les patients âgés et les femmes peuvent être plus sensibles aux traitements allongeant l'intervalle QT. Par conséquent, la prudence est recommandée dans ces populations. Des cas de cardiomyopathie pouvant mener à une insuffisance cardiaque d'évolution fatale ont été décrits exceptionnellement après administration de doses cumulées très élevées de chloroquine chez des patients atteints d'une maladie systémique (voir rubriques 4. 8 et 4. 9). Par conséquent il est conseillé que tout signe clinique évocateur d'insuffisance cardiaque soit exploré et que le traitement soit arrêté en cas de cardiomyopathie. Il existe un risque théorique d'inhibition de l'activité intracellulaire alpha- galactosidase quand la chloroquine est administrée concomitamment avec des médicaments à base d'agalsidase. Aucune donnée clinique ne confirme les conséquences potentielles de cette inactivation enzymatique. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 8/14 Avis 2 RCP de Juin 2006 RCP du 3 Juillet 2015 (Projet REX du 18/09/2008) Forme sirop uniquement Forme sirop uniquement En raison de la présence de saccharose, ce médicament est contre-indiqué en En raison de la présence de saccharose, ce médicament est contre-indiqué en cas d'intolérance au fructose, de syndrome de malabsorption du glucose et du cas d'intolérance au fructose, de syndrome de malabsorption du glucose et du galactose ou de déficit en sucrase/isomaltase. galactose ou de déficit en sucrase/isomaltase. Ce médicament contient du saccharose. Son utilisation est déconseillée chez les patients présentant une intolérance au fructose, un syndrome de malabsorption du glucose ou un déficit en sucrase/isomaltase. Des cas isolés d'hémolyse intravasculaire ont été rapportés chez les sujets déficitaires en G6PD recevant le la chloroquine. En conséquence, la chloroquine doit être utilisée avec prudence chez ces patients. Formes comprimés uniquement Ce médicament peut être administré en cas de maladie cœliaque. L'amidon de blé peut contenir du gluten, mais seulement à l'état de trace, et est donc considéré comme sans danger pour les sujets atteints d'une maladie cœliaque. Précautions particulières d'emploi Précautions particulières d'emploi La chloroquine doit être utilisée avec prudence en cas d'insuffisance hépatique La chloroquine doit être utilisée avec prudence en cas d'insuffisance hépatique ou d'insuffisance rénale (prévoir une adaptation de la posologie). ou d'insuffisance rénale (prévoir une adaptation de la posologie). La chloroquine sera utilisée avec prudence en cas d'épilepsie. La chloroquine sera utilisée avec prudence en cas d'épilepsie. Forme sirop uniquement Forme sirop uniquement En cas de diabète ou de régime hypoglucidique, tenir compte de la teneur en En cas de diabète ou de régime hypoglucidique, tenir compte de la teneur en saccharose (4, 15 g par cuillère-mesure). saccharose (4, 15 g par cuillère-mesure). Ce médicament contient 4, 15 g de saccharose par cuillère-mesure, dont il faut tenir compte dans la ration journalière en cas de régime pauvre en sucre ou de diabète. Forme comprimé uniquement Ce médicament contient du saccharose. Son utilisation est déconseillée chez les patients présentant une intolérance au fructose, un syndrome de malabsorption du glucose et du galactose ou un déficit en sucrase/isomaltase. Des cas isolés d'hémolyse intravasculaire ont été rapportés chez les sujets déficitaires en G6PD recevant le la chloroquine. En conséquence, la chloroquine doit être utilisée avec prudence chez ces patients. 4. 5. Interactions avec d'autres médicaments et autres formes d'interaction 4. 5. Interactions avec d'autres médicaments et autres formes d'interaction Association contre-indiquée Citalopram ou escitalopram Risque majoré de troubles du rythme ventriculaire, notamment de torsades de pointe HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 9/14 Avis 2 RCP de Juin 2006 RCP du 3 Juillet 2015 (Projet REX du 18/09/2008) Dompéridone Risque majoré de troubles du rythme ventriculaire, notamment de torsades de pointe Association déconseillée Médicaments susceptibles de donner des torsades de pointes (par exemple, les anti-arythmiques de classe IA et III, les antipsychotiques, l'halofantrine, la luméfantrine, la pentamidine, certains antibiotiques) Risque majoré de troubles du rythme ventriculaire, notamment de torsades de pointe. Si cela est possible, interrompre l'un des deux traitements. Si l'association ne peut être évitée, contrôle préalable du QT et surveillance ECG monitorée Association faisant l'objet de précautions d'emploi Association faisant l'objet de précautions d'emploi Topiques gastro-intestinaux, antiacides et charbon : sels (carbonates, Topiques gastro-intestinaux, antiacides et charbon : sels (carbonates, citrates, gluconates, magaldrates, phosphates, sulfates, silicates), oxydes et citrates, gluconates, magaldrates, phosphates, sulfates, silicates), oxydes et hydroxydes d'aluminium, de calcium et de magnésium : Diminution de hydroxydes d'aluminium, de calcium et de magnésium : Diminution de l'absorption digestive de la chloroquine. l'absorption digestive de la chloroquine. Prendre les topiques gastro-intestinaux à distance de la chloroquine (plus de Prendre les topiques gastro-intestinaux à distance de la chloroquine (plus de 2 heures si possible). 2 heures si possible). Ciclosporine : risque d'augmentation des concentrations sanguines de Ciclosporine : risque d'augmentation des concentrations sanguines de ciclosporine et de la créatininémie. ciclosporine et de la créatininémie. Dosage des concentrations sanguines de la ciclosporine, contrôle de la fonction Dosage des concentrations sanguines de la ciclosporine, contrôle de la fonction rénale et adaptation de la posologie pendant l'association et après l'arrêt de la rénale et adaptation de la posologie pendant l'association et après l'arrêt de la chloroquine. chloroquine. Hormones thyroïdiennes : Risque d'hypothyroïdie clinique chez les patients substitués par hormones thyroïdiennes. Surveillance des concentrations sériques de T3 et de T4 et adaptation, si besoin, de la posologie de l'hormone thyroïdienne pendant le traitement par l'antipaludique et après son arrêt. Association à prendre en compte Association à prendre en compte Cimétidine : ralentissement de l'élimination de la chloroquine et risque de Cimétidine : ralentissement de l'élimination de la chloroquine et risque de surdosage. surdosage. Médicaments abaissant le seuil épileptogène : l'utilisation conjointe de Médicaments abaissant le seuil épileptogène : l'utilisation conjointe de médicaments proconvulsivants, ou abaissant le seuil épileptogène, devra être médicaments proconvulsivants, ou abaissant le seuil épileptogène, devra être soigneusement pesée, en raison de la sévérité du risque encouru. Ces soigneusement pesée, en raison de la sévérité du risque encouru. Ces médicaments sont représentés notamment par la plupart des antidépresseurs médicaments sont représentés notamment par la plupart des antidépresseurs (imipraminiques, inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine), les (imipraminiques, inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine), les neuroleptiques (phénothiazines et butyrophénones), la méfloquine, la neuroleptiques (phénothiazines et butyrophénones), la méfloquine, la chloroquine, le bupropion, le tramadol. chloroquine, le bupropion, le tramadol. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 10/14 Avis 2 RCP de Juin 2006 RCP du 3 Juillet 2015 (Projet REX du 18/09/2008) 4. 8 Effets indésirables 4. 8 Effets indésirables La classification des évènements indésirables en fonction de leur fréquence est la suivante : très fréquent ( 1/10), fréquent ( 1/100 et < 1/10), peu fréquent ( 1/1000 et < 1/100), rare ( 1/10 000 et très rare (< 1/10 000), fréquence indéterminée (ne peut être estimée sur la base des données disponibles). Affections du système immunitaire Fréquent : réactions anaphylactiques ou anaphylactoïdes (incluant angioedème). Troubles digestifs Troubles digestifs Affections gastro-intestinales Fréquemment : possibilité d'intolérance gastro-intestinale modérée incluant Fréquemment : Très fréquent : possibilité d'intolérance gastro-intestinale nausées, vomissements (cédant généralement, lors de la poursuite du modérée incluant nausées, vomissements (cédant généralement, lors de la traitement), diarrhées. poursuite du traitement), diarrhées. Atteintes hépatiques Atteintes hépatiques Affections hépato-biliaires Très rarement : élévation des enzymes hépatiques ou d'hépatite survenant Très rarement rare : élévation des enzymes hépatiques ou d'hépatite survenant notamment chez les patients porteurs d'une porphyrie cutanée tardive (voir notamment chez les patients porteurs d'une porphyrie cutanée tardive (voir rubrique 4. 4). rubrique 4. 4). Atteintes hématologiques Atteintes Affection hématologiques et du système lymphatique Exceptionnellement : modifications de la formule sanguine à type de Exceptionnellement Très rare : modifications de la formule sanguine à type de neutropénie, agranulocytose, thrombopénie. neutropénie, agranulocytose, thrombopénie. Atteintes psychiatriques Atteintes Troubles psychiatriques Rarement troubles psychiatriques : agitation, anxiété, agressivité, troubles du Très fréquent : insomnies sommeil, confusion, hallucination. Exceptionnellement : épisodes psychotiques. Fréquent : dépression Rarement Rare : troubles psychiatriques agitation, anxiété, agressivité, troubles du sommeil, confusion, hallucination, Exceptionnellement : Très rare : épisodes psychotiques Fréquence indéterminée : comportement suicidaire Atteintes du système nerveux Atteintes Troubles du système nerveux Très rarement : convulsions. Fréquemment Très fréquent : céphalées et Fréquent étourdissements. Fréquent : convulsions (voir rubrique 4. 4) Rarement et aux doses élevées : neuropathies (polynévrites) Rarement et aux doses élevées Rare : neuropathies à dose élevée (polynévrites) Fréquemment : céphalées et étourdissements. Très rarement : convulsions. Fréquence indéterminée : Troubles extrapyramidaux aigus (tels que dystonie, dyskinésie, protusion de la langue, torticolis) (voir rubriques 4. 4 et 4. 9). HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 11/14 Avis 2 RCP de Juin 2006 RCP du 3 Juillet 2015 (Projet REX du 18/09/2008) Atteintes visuelles Atteintes visuelles Effets oculaires Fréquemment : troubles de l'accommodation, vision floue. Fréquemment Fréquent : troubles de l'accommodation, vision floue. Rarement Rare : opacités cornéennes lors de traitement prolongé (régressant à Rarement : et lors de traitement prolongé : opacités cornéennes (régressant à l'arrêt du traitement). l'arrêt du traitement). Fréquence indéterminée : Exceptionnellement : rétinopathies A ce jour, d'exceptionnels cas de rétinopathies, liées à l'accumulation de Exceptionnellement : rétinopathie. A ce jour, d'exceptionnels cas de chloroquine et pouvant conduire à des lésions irréversibles de la macula, ont été rétinopathies, liées à l'accumulation de chloroquine et pouvant conduire à des décrits chez des patients présentant une pathologie rhumatologique ou lésions irréversibles de la macula, ont été décrits chez des patients présentant dermatologique et recevant un traitement au long cours et à doses élevées de une pathologie rhumatologique ou dermatologique et recevant un traitement au chloroquine (plus de 4 mg/kg/jour) (voir rubrique 4. 4). long cours et à doses élevées de chloroquine (plus de 4 mg/kg/jour). Des cas de maculopathie et dégénérescence maculaire pouvant être irréversibles ont été rapportées (voir rubrique 4. 4). Les formes pécoces des atteintes rétiniennes semblent être réversibles à l'arrêt de la chloroquine. Atteintes auditives Atteintes auditives de l'oreille et du labyrinthe Très rarement : acouphènes, surdité Très rarement Très rare : acouphènes, hypoacousie et surdité Atteintes de la peau et des annexes Atteintes de la peau et des annexes Effets cutanéo-muqueux Exceptionnellement : dermite exfoliatrice, érythème polymorphe, syndrome de Fréquemment Très fréquent : prurit Stevens-Johnson, photosensibilité. Fréquent : éruption cutanée Rare : troubles de la pigmentation (pigmentation ardoisée des ongles et des muqueuses), alopécie, exacerbation d'un psoriasis (régressant à l'arrêt du traitement). Fréquence indéterminée : ont été exceptionnellement rapportés des cas de dermite exfoliatrice, d'érythème polymorphe, de syndrome de Stevens-Johnson, des cas de photosensibilité. Des réactions médicamenteuses avec éosinophilie et symptômes systémiques (syndrome de DRESS ; voir rubrique 4. 4) ont été exceptionnellement rapportées. Affections respiratoires, thoraciques et médiastinales Des pneumonies à éosinophiles ont été exceptionnellement rapportées. Atteintes musculaires Atteintes musculaires musculo-squelettiques et systémiques Rarement et aux doses élevées : myopathie Rarement et aux doses élevées : myopathie HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 12/14 Avis 2 RCP de Juin 2006 RCP du 3 Juillet 2015 (Projet REX du 18/09/2008) Atteintes cardiovasculaires : Atteintes Affections cardiovasculaires : Exceptionnellement des cardiomyopathies ont été décrites après Fréquence indéterminée : Troubles du rythme cardiaque aux doses élevées administration de doses cumulées très élevées de chloroquine chez des (allongement de l'intervalle QT, torsades de pointe, tachycardie sujets atteints d'une maladie systémique. ventriculaire, fibrillation ventriculaire) ont été rapportés aux doses Troubles du rythme aux doses élevées (voir rubrique 4. 9). thérapeutiques ou lors d'un surdosage en chloroquine. Le risque est majoré si la chloroquine est administrée à doses élevées et l'évolution peut être fatale (voir rubrique 4. 9). Exceptionnellement des D'exceptionnel cas de cardiomyopathies pouvant mener à une insuffisance cardiaque d'évolution fatale dans certains cas (voir rubrique 4. 4) ont été décrites après administration de doses cumulées très élevées de chloroquine chez des sujets atteints d'une maladie systémique. Troubles du métabolisme et de la nutrition Fréquence indéterminée : hypoglycémie (voir rubrique 4. 4) Déclaration des effets indésirables suspectés : La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (Ansm) et réseau des centres régionaux de pharmacovigilance - Site internet : 4. 9 Surdosage 4. 9 Surdosage Dose dangereuse : Dose dangereuse : Adulte : à partir de 2 g de chloroquine en 1 prise (soit plus de 6 comprimés ou 24 Adulte : à partir de 2 g de chloroquine en 1 prise (soit plus de 6 comprimés ou 24 cuillères-mesures en 1 prise). cuillères-mesures en 1 prise). Enfant : à partir de 25 mg/kg de chloroquine en 1 prise, soit pour un poids corporel Enfant : à partir de 25 mg/kg de chloroquine en 1 prise, soit pour un poids corporel de : de : Pour un enfant de 10 kg : à partir de 2 comprimés ou 8 cuillères-mesures. Pour un enfant de 10 kg : à partir de 2 comprimés ou 10 cuillères-mesures. Pour un enfant de 20 kg : à partir de 5 comprimés ou 20 cuillères-mesures. Pour un enfant de 20 kg : à partir de 5 comprimés ou 20 cuillères-mesures. Pour un enfant de 30 kg : à partir de 7 comprimés ou 30 cuillères-mesures. Pour un enfant de 30 kg : à partir de 7 comprimés ou 30 cuillères-mesures. Pour un enfant de 40 kg : à partir de 10 comprimés ou 40 cuillères-mesures. Pour un enfant de 40 kg : à partir de 10 comprimés ou 40 cuillères-mesures. La chloroquine est absorbée rapidement. Elle est hautement toxique lors de La chloroquine est absorbée rapidement. Elle est hautement toxique lors de surdosages, particulièrement chez les enfants. surdosages, particulièrement chez les enfants. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 13/14 Avis 2 RCP de Juin 2006 RCP du 3 Juillet 2015 (Projet REX du 18/09/2008) Symptômes de surdosage en chloroquine : Symptômes de surdosage en chloroquine Céphalées, étourdissements, troubles visuels, nausées, vomissements. Certains Céphalées, étourdissements, troubles visuels, nausées, vomissements. Certains symptômes sont de valeur pronostic très péjorative : hypotension, collapsus symptômes sont de valeur pronostic très péjorative : hypotension, collapsus cardio-vasculaires, signes ECG (aplatissement de l'onde T, allongement de cardio-vasculaires, signes ECG : troubles du rythme et de la conduction, l'espace QT, élargissement du ORS), un arrêt respiratoire et cardiaque peut aplatissement de l'onde T, allongement de l'espace QT, élargissement du QRS, survenir brutalement et précocement. torsades de pointe, tachycardie ventriculaire, fibrillation ventriculaire ; un arrêt Une hypokaliémie peut avoir lieu, probablement due à une entrée de respiratoire et cardiaque peut survenir brutalement et précocement. potassium dans les cellules, augmentant ainsi le risque de dysrythmie Une hypokaliémie peut avoir lieu survenir, probablement due à une entrée cardiaque. L'évolution peut être fatale en cas d'insuffisance cardiaque, de potassium dans les cellules, augmentant ainsi le risque de dysrythmie respiratoire ou de dysrythmie cardiaque. cardiaque. L'évolution peut être fatale en cas d' consécutive à une insuffisance cardiaque ou respiratoire ou de dysrythmie à un trouble du rythme cardiaque. Des cas de troubles extrapyramidaux ont été également rapportés lors de surdosage en chloroquine (voir rubriques 4. 4 et 4. 8). Conduite à tenir : Conduite à tenir : Toute suspicion d'intoxication par la chloroquine Toute suspicion d'intoxication par la chloroquine impose l'hospitalisation. impose l'hospitalisation. Quelque soit la dose supposée ingérée, toute intoxication par la chloroquine Quelque soit la dose supposée ingérée, toute intoxication par la chloroquine impose une prise en charge pré-hospitalière par un service mobile d'urgence. En impose une prise en charge pré-hospitalière par un service mobile d'urgence. En attendant l'ambulance, une perfusion IV avec une solution de remplissage peut attendant l'ambulance, une perfusion IV avec une solution de remplissage peut être posée. être posée. En cas d'intoxication grave (dose supposée ingérée 4 g ou hypotension et/ou En cas d'intoxication grave (dose supposée ingérée 4 g ou hypotension et/ou signes ECG), le schéma thérapeutique d'urgence suivant est préconisé : signes ECG), le schéma thérapeutique d'urgence suivant est préconisé : Adrénaline : 0. 25 g/kg/min. Adrénaline : 0. 25 g/kg/min. Intubation, ventilation assistée. Intubation, ventilation assistée. Diazépam : 2 mg/kg en 30 minutes puis 2 à 4 mg/kg/24 heures. Diazépam : 2 mg/kg en 30 minutes puis 2 à 4 mg/kg/24 heures. L'hémodialyse ne permet pas une élimination rapide de la chloroquine en cas L'hémodialyse ne permet pas une élimination rapide de la chloroquine en cas d'intoxication (la clairance de dialyse représente 15 % de la clairance totale). d'intoxication (la clairance de dialyse représente 15 % de la clairance totale). L'acidification des urines, l'hémodialyse, la dialyse péritonéale et l'exsanguino- L'acidification des urines, l'hémodialyse, la dialyse péritonéale et l'exsanguino- transfusion n'apportent pas de bénéfice en cas de surdosage à la chloroquine. transfusion n'apportent pas de bénéfice en cas de surdosage à la chloroquine. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 14/14 Avis 2 | HAS | Scientific |
Examen moteur d'un groupe de débiles mentaux | WMT16 | Scientific |
L' utilisation d' Emselex n' est pas recommandée chez l'enfant. | EMEA_V3 | Medicinal |
Etude expérimentale de la relation pression-volume ventriculaire droite | WMT16 | Scientific |
En association avec le cisplatine et le 5 fluorouracile Si un épisode de neutropénie compliquée (fébrile, prolongée ou infection neutropénique) survient malgré l' utilisation de G-CSF, la posologie de docétaxel devra être réduite de 75 à 60 mg/ m. | EMEA_V3 | Medicinal |
Urgences chirurgicales chez le patient âgé | WMT16 | Scientific |
Numéro jubilaire du 125e anniversaire de la Société des Sciences Médicales du G. -D. de Luxembourg | WMT16 | Scientific |
Accidents hémorragiques au cours du traitement par cyclosérine | WMT16 | Scientific |
- Dans les 60 jours suivant l' atteinte d' une étape importante (pharmacovigilance ou | EMEA_V3 | Medicinal |
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