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|---|---|---|
Abcès cérébraux néo-nataux (27 cas) : étude électroclinique initiale, évolution | WMT16 | Scientific |
Mise en évidence de lignées cellulaires dans le foie au cours de l'hypertrophie compensatrice après hépatectomie partielle | WMT16 | Scientific |
é La dose de départ recommandée est de 100 UI toutes les 6 à 8 heures, par injection sous-cutanée ou intramusculaire. | EMEA_V3 | Medicinal |
HAUTE AUTORITÉ DE SANTÉ COMMISSION DE LA TRANSPARENCE Mercredi 16 décembre 2020 Commission de Transparence Mercredi 16 décembre 2020 AVERTISSEMENT En application des articles L. 1451-1-1 et R. 1451-6 du code de la santé publique, la HAS réalise un enregistrement des séances de la commission de la transparence (CT), de la Commission d'évaluation des dispositifs médicaux et des technologies de santé (CNEDIMTS) et de la Commission évaluation économique et santé publique (CEESP). Pour en faciliter la communication et la compréhension, la HAS a fait le choix de recourir à une transcription des débats par l'intermédiaire d'une société prestataire Cette prestation associe une saisie directe des débats par sténotypie et une transcription assistée par ordinateur ainsi qu'une relecture médicale. L'objet de cette transcription est de permettre de tracer le déroulé des débats dans un souci de transparence et non de fournir une information scientifique validée. En effet, malgré le professionnalisme de cette prestation, il peut persister dans le texte final des incongruités ou des inexactitudes liées à l'usage d'un vocabulaire hautement spécialisé ou à la nature même des échanges verbaux. La HAS n'effectue aucune validation de ces documents. La HAS rappelle que les seuls documents validés et opposables sont le procès- verbal de la séance et l'avis définitif de la Commission qui sont mis en ligne sur le site de la HAS. Pour la publication des transcriptions, et dans un but de protection du secret industriel et commercial, certains mots peuvent avoir été occultés. Les occultations éventuelles sont de la responsabilité de l'entreprise exploitant le produit évalué. Toute reprise d'un ou plusieurs extraits d'une transcription doit être accompagnée d'une mention en précisant la source et respecter la législation sur la publicité. Les membres des commissions s'expriment à titre personnel dans le cadre de leur mission d'expertise. Les agents de la HAS (chefs de services, adjoints, chefs de projet) représentent l'institution et s'expriment en son nom. La HAS rappelle que la connaissance des propos tenus en séance par les membres des commissions et les agents de la HAS ne peut en aucun cas justifier des contacts directs de quelque nature que ce soit avec ces personnes, lesquelles sont tenues à une obligation de confidentialité conformément à l'article R. 161-85 du code de la sécurité sociale. Commission de Transparence Mercredi 16 décembre 2020 1. TAVLESSE 100 - 150 mg* (fostamatinib disodique hexahydraté) (CT-18722) Audition Mme GATTULLI, pour la HAS. - On fait rentrer le labo et les membres siègent sans lien. Monsieur GODEAU et Mesdames MAHI et LEMMER rejoignent la séance. Mme le Dr DEGOS. - Bonjour. Mme MAHI. - Bonjour, je suis Madame MAHI, Madame LEMMER est chez elle, au bureau. Et je porte un masque parce que je suis dans le même bureau que le Professeur GODEAU. Nous allons partager le même ordinateur. Mme le Dr DEGOS. - Merci. de nous avoir rejoints. On va rapidement présenter les éléments du dossier TAVLESSE et vous laisser ensuite la parole pour un quart d'heure de présentation. Ensuite la commission vous posera des questions pour une durée de dix minutes. Le Chef de projet. - Bonjour, on reçoit aujourd'hui le laboratoire GRIFOLS suite à l'avis adopté par la commission le 4 novembre 2020 relatif à la demande d'inscription de TAVLESSE, fostamatinib, sous forme de comprimés pelliculés qui est indiquée dans le traitement de la thrombocytopénie immunitaire chronique chez les patients adultes réfractaires aux autres traitements. Pour rappel, les données cliniques étaient disponibles et déposées dans le dossier reposaient essentiellement sur deux études cliniques de méthode identique, comparative versus placebo, l'une d'elles ayant fait la démonstration statistique de la supériorité de TAVLESSE en comparaison au placebo en termes de réponse plaquettaire. Suite à l'examen des données, la CT avait conclu au SMR insuffisant de TAVLESSE pour justifier une prise en charge par la solidarité nationale, et notamment à l'absence de place dans la stratégie thérapeutique dans l'indication de l'AMM, en considérant les limites des études cliniques ayant évalué TAVLESSE et notamment l'absence de comparaison aux autres thérapies disponibles ; les incertitudes sur son efficacité en raison de résultats contradictoires, une seule des deux études de phase III étant positive ; et de sa faible quantité d'effets versus placebo ; les données d'efficacité uniquement en termes de réponses plaquettaires stables, et l'absence d'impact démontré sur les scores hémorragiques en comparaison au placebo ; la très grande hétérogénéité de la population incluse en termes de traitements antérieurs du PTI, qui ne permet pas de disposer de données robustes chez les patients ayant épuisé toutes les options thérapeutiques, ni d'identifier une sous-population de patients pour en tirer bénéfice d'un traitement par fostamatinib ; son profil de tolérance à court terme, marqué notamment par la diarrhée, effet indésirable très fréquent, susceptible d'impacter la qualité de vie des patients et l'hypertension ; et enfin, les incertitudes sur sa tolérance à long terme, notamment sur ses effets potentiels sur le remodelage osseux, a fortiori en cas d'utilisation au long cours. Commission de Transparence Mercredi 16 décembre 2020 Voilà pour le rappel. Mme le Dr DEGOS. - Merci, vous avez la parole. Mme MAHI. - Je me présente à nouveau. Je suis Imene MAHI, Responsable affaires médicales GRIFOLS, et nous sommes accompagnés par Madame Nathalie LEMMER, Directrice de la division et par le Professeur Bertrand GODEAU en sa qualité d'expert. Madame la Vice-présidente, Messieurs Dames, je vous remercie de nous écouter aussi tard. J'ai cru comprendre que vous avez déjà eu 11 dossiers. Mme le Dr DEGOS. - Et ce n'est pas fini. Mme MAHI. - Le contexte a déjà été rappelé, donc je ne me rappelle pas l'indication qui vient d'être dite, mais je rappelle qu'un peu d'historique. C'est un développement clinique qui a été réalisé par le laboratoire RIGEL, qui est responsable de la commercialisation aux Etats-Unis. Cette AMM a été obtenue en avril 2018. Au niveau européen, le dossier a été déposé en octobre 2018 et l'AMM date de janvier de cette année, et ce n'est qu'à ce moment-là que RIGEL a pu transférer l'autorisation à GRIFOLS, en avril 2020. Le dossier, comme vous le savez, a été déposé en juin 2020. Vu cette chronologie, le laboratoire RIGEL n'a pas eu la possibilité de demander une ATU avant l'obtention de l'AMM. Je suis à la slide 3. Je rappelle l'objet de la demande d'audition. Nous sollicitons un SMR suffisant pour fostamatinib dans un périmètre correspondant à la pratique clinique, c'est-à-dire le traitement du PTI chronique chez les patients adultes réfractaires aux autres traitements, incluant au moins un traitement de deuxième ligne. Et je passe la parole au professeur GODEAU. Slide 4. M. le Pr GODEAU. - Bonjour à toutes, Madame la Présidente, bonjour à tous. Sur cette diapositive 4, vous avez mes coordonnées, mon CV. J'insisterai juste sur le fait que je coordonne le centre de référence des cytopénies auto-immunes depuis 2006, qui comprend cinq sites constitutifs et 28 centres de compétences. J'ai coordonné la rédaction du PNDS en France en 2009 et 2017, avec l'actualisation. J'ai également été co-auteur du consensus international en 2009 et sa réactualisation en 2019. Diapositive 5, vous avez sur cette diapositive les caractéristiques des modes d'action des différents médicaments au cours du PTI. Je ne vais pas rentrer dans les détails, mais c'est simplement pour souligner le fait qu'il est important d'avoir des médicaments qui ont des modes d'action différents. Par exemple les agonistes du récepteur de la TPO favorisent la production de plaquettes par la moelle osseuse, le rituximab bloque les lymphocytes B, le fostamatinib a un mode de fonctionnement qui est original et qui est finalement assez proche de celui des IGIV, avec ce blocage de la phagocytose des plaquettes. La diapositive 6 est une diapositive qui fait un peu le point sur la stratégie thérapeutique du PTI. Il existe plusieurs traitements de seconde et de troisième ligne, les ARTPO, le rituximab, la dapsone, etc. Les points qu'il faut souligner, c'est que les indications de la splénectomie se réduisent de manière drastique depuis quelques années. Et aujourd'hui, c'est vrai que de moins en moins de patients souhaitent être splénectomisés, et de moins en moins de cliniciens proposent la splénectomie. C'est un phénomène que l'on observe dans tous les pays qui disposent de secondes lignes thérapeutiques. Le point essentiel, c'est que la stratégie thérapeutique au cours du PTI, il n'est pas consensuel et que le traitement doit être personnalisé comme je vais le souligner au cours de cette présentation. Il faut également souligner que tous les traitements de seconde ligne ont leurs limites, avec des échecs ou des arrêts de traitements qui sont fréquents. Et même si l'on prend les ARTPO qui sont pourtant remarquablement efficaces, avec près de 80 % de réponses dans les études pivotales, après un an de traitement par ARTPO, qu'il s'agisse du NPLATE ou du REVOLADE, on a entre 35 et 50 % d'arrêt. Malgré ces multiples lignes thérapeutiques, il reste des patients réfractaires, avec une altération de la qualité de vie et un risque de saignements qui peut être mortel. Il y a actuellement sur les données épidémiologiques dont on dispose 80 patients qui décèdent chaque année par complications hémorragiques. Tout cela pour vous dire que pour nous, spécialistes du PTI, disposer d'une nouvelle ligne thérapeutique avec un mode d'action un peu original est intéressant. Sur la diapositive 7, je ne vais pas la commenter, mais c'est une diapositive qui résume un travail que nous avons fait et qui a abouti aux mêmes conclusions que d'autres équipes étrangères comme les Italiens, et qui montre que la splénectomie, et comme tout le monde le sait, est associée à un risque infectieux, mais également à un risque de thrombose veineuse qui reste augmenter avec le temps et qu'il peut atteindre jusqu'à 10 % des malades après dix ans d'évolution. C'est un élément supplémentaire qui me conforte dans l'idée qu'il faut éviter absolument la splénectomie chez ces patients. Cela reste maintenant un traitement encore utile, mais que l'on réserve vraiment dans les impasses thérapeutiques. La diapositive suivante est une diapositive qui confirme le caractère personnalisé du traitement. Ce sont les recommandations de l'ASH qui ont été publiées dans Blood advensis récemment. Vous voyez que par exemple, si vous êtes sur la partie droite de la diapositive, pour les patients qui ont un PTI qui évolue depuis plus de 12 mois, vous voyez qu'il s'agisse des agonistes du récepteur, de la TPO, du rituximab ou de la splénectomie, on va à chaque fois, en fonction des caractéristiques du patient, de l'existence de comorbidité, de discuter de ces différents traitements. Il n'y a pas un traitement rigide stricte qui doit être administré systématiquement à tous les patients. L'attitude française, c'est exactement similaire. Et sur cette diapositive 9, vous avez le tableau qui est extrait du PNDS que nous avions actualisé en 2017. Et vous voyez sur la partie droite de la diapositive les différents traitements de seconde ligne, splénectomie, rituximab, agoniste du récepteur de la TPO, dapsone, danazol. Et sur la partie gauche, différents critères : l'existence de comorbidité, l'ancienneté du PTI. Je ne rentre pas dans les détails, mais vous voyez qu'en fonction de certains critères, il y a des botes noires qui sont des contre-indications à l'utilisation de cette stratégie thérapeutique et des botes blanches qui sont plutôt un avantage. Le point sur le fait que les patients peuvent être multi-réfractaires, et que malgré toutes ces lignes thérapeutiques, ils restent des patients qui ont besoin d'une voie thérapeutique supplémentaire, c'est ce travail que nous avions fait avec le centre de référence. C'est un travail multicentrique français publié en 2016 et qui s'adressait à des patients multi-réfractaires, c'est-à-dire réfractaires aux agonistes du récepteur de la TPO, au rituximab, et à splénectomie. Ce travail nous a permis de montrer d'une part qu'il y a des formes graves avec des patients qui malheureusement décèdent, et que d'autre part le meilleur moyen chez ces patients d'obtenir une réponse, c'est d'associer différents médicaments agissant à différentes voies thérapeutiques, voies sur la physiopathologie du PTI. Maintenant, si l'on en revient plus spécifiquement au fostamatinib et aux limites à l'interprétation des données disponibles. L'absence de comparateur aux autres thérapies disponibles, je dirais qu'aujourd'hui, la stratégie normale pour développer un médicament, c'est de le comparer à un placebo. Et malgré les multiples lignes thérapeutiques dont nous disposons, il n'y a pas aujourd'hui d'essai face to face. Vous n'avez pas un essai qui permet de comparer les agonistes du récepteur de la TPO par rapport au rituximab, ou le rituximab par rapport à la splénectomie, etc. Le fait que le laboratoire ait décidé de faire un essai fostamatinib versus un standard of care est une attitude qui est assez logique et qui est habituellement adoptée dans le développement d'un médicament dans le PTI. En termes d'efficacité, c'est clair que lorsque l'on a vu de l'étude rapportant une efficacité de 18 % par rapport à un placebo, un certain nombre de cliniciens ont considéré que ces résultats étaient décevants. Je crois qu'il faut analyser les résultats plus en détail. Les patients qui ont été inclus, étaient des patients sévères, avec une durée d'évolution du PTI importante, avec un nombre de lignes thérapeutiques qui était important et avec pour la plupart d'entre eux un échec, soit à la splénectomie, soit aux ARTPO, soit au rituximab, voire à plusieurs de ces lignes thérapeutiques. Il faut donc relativiser ce 18 %, et dire plutôt que de 18 % versus pratiquement 0 % dans le placebo prouve à l'évidence que ce traitement est efficace. Et vous avez sur la partie droite de la diapositive une étude qui a été publiée depuis l'étude princeps, qui a été publiée cette année et qui montre qu'en fonction du nombre de lignes thérapeutiques du PTI reçues antérieurement, vous voyez que les résultats sont d'autant meilleurs que l'on traite des patients ayant eu moins de lignes thérapeutiques. Ce n'est pas une surprise. En gros, plus on a un PTI grave, moins on a de chances de répondre à un traitement. Le fait que l'essai thérapeutique ait choisi le chiffre de plaquettes et non pas un score hémorragique, c'est une critique qui est faite à chaque fois que l'on soumet un papier sur le PTI. Mais l'on répond à cette critique de deux manières. La première manière, c'est qu'il n'y a pas un score hémorragique qui soit validé internationalement. En France, on utilisait le score de KHELLAF Le score de KHELLAF n'est pas reconnu aux Etats-Unis. Aux Etats-Unis, ils veulent l'utiliser un score qui s'appelle le score SMOK qui est très complexe et qui finalement n'est pas encore passé dans les mœurs, dans la littérature. Le deuxième élément sur le score hémorragique, c'est que si vous voulez mettre en évidence un effet d'un médicament en vous basant sur un score hémorragique, vous allez être obligé d'inclure un nombre de patients qui n'est pas compatible avec la rareté de la maladie, le PTI étant une maladie orpheline. Sur le critère d'efficacité, concernant l'hétérogénéité de la population incluse en termes de traitement antérieur, il aurait été peut-être effectivement plus élégant d'avoir des patients qui avaient du fostamatinib, par exemple, en traitement uniquement de deuxième ligne. Mais l'essai thérapeutique a été fait comme cela. Ce n'est pas quelque chose qui condamne l'efficacité du traitement, qui permet malgré cela d'étudier l'efficacité du traitement. Quant à l'idée de pouvoir avoir des facteurs prédictifs de réponse au fostamatinib, il faut souligner qu'aujourd'hui, qu'il s'agisse du rituximab, qu'il s'agisse des ARTPO, nous ne disposons pas, malgré toutes les études qui ont été faites, de facteurs individuels prédictifs de réponses qui nous permettent de sélectionner les malades. Concernant l'évaluation de la réponse en fonction de la ligne de traitement, qui est le dernier point de cette diapositive, cela ramène à l'analyse de la figure qui est sur la partie droite de la diapositive, et que j'ai déjà commentée. Concernant le profil de tolérance, certes, il y a effectivement de la diarrhée, de l'hypertension artérielle et là, il y a manifestement de manière significative une survenue de diarrhées qui est plus importante dans les groupes des patients traités par fostamatinib. C'est une information qui est effectivement conforme à ce qu'observent nos collègues américains, alors que le fostamatinib est déjà commercialisé aux Etats-Unis. Mais j'observe que dans l'étude pivotale, finalement, il y a eu très peu d'arrêts de traitement par la diarrhée et il semble que cette diarrhée soit finalement assez facile à manager. Je n'ai pas l'expérience n'ayant jamais prescrit du fostamatinib, mais je pense qu'il faudra que les cliniciens se fassent leur idée si ce médicament est commercialisé. Sur l'incertitude de la tolérance à long terme, c'est une vraie question, mais c'est une question qui se pose à chaque fois que l'on utilise une voie thérapeutique innovante et une nouvelle. Il me paratrait important, si ce médicament est commercialisé, que l'on puisse avoir des registres prospectifs qui nous permettront de mieux cibler les éventuels effets indésirables inattendus que nous pourrions observer à long terme. Pour conclure, pour nous, spécialiste de PTI et en tant que coordinateur du centre de référence, disposer d'une nouvelle ligne thérapeutique nous parat vraiment quelque chose de très utile. Je suis convaincu, à la lecture de la littérature, que ce traitement a une réelle efficacité. Concernant sa tolérance, je pense que le meilleur moyen de savoir si un médicament est bien toléré, c'est de le tester dans la vraie vie. Et concernant cette tolérance à moyen et à long terme, je pense qu'un registre prospectif serait très utile. C'est ce que nous avons fait avec le centre de référence pour d'autres molécules. C'est ce que nous avions fait avec les ARTPO. C'est en particulier ce que l'on a fait avec le rituximab, puisque nous avons été capables de créer un registre prospectif de 250 malades suivis pendant cinq ans. Ce registre prospectif est le plus grand registre prospectif au monde sur le rituximab dans le PTI, et a fait l'objet déjà de deux publications internationales. Et avec le réseau de référence que nous avons en France, avec les 28 centres de compétences et 5 centres constitutifs, nous avons vraiment la possibilité, au plan méthodologique, de faire un registre qui permettrait de mieux cibler l'efficacité de ce traitement dans la vie réelle et sa tolérance. J'en ai pour ma part terminé et je repasse la parole au laboratoire. Mme MAHI. - Merci Professeur. J'aurai juste un mot de conclusion qui est celui de la page 14, de rappeler notre sollicitation d'un SMR suffisant pour le fostamatinib dans le traitement du PTI chronique, chez le patient réfractaire aux autres traitements, incluant au moins un traitement de deuxième ligne. Je vous remercie pour votre écoute et nous sommes à votre disposition pour toutes questions. Mme le Dr DEGOS. - Merci beaucoup. Je suis tout à fait d'accord, en tant qu'hépatologue, avec votre réflexion sur la splénectomie et les dangers que cela peut comporter. Cela ne fait pas partie des traitements immédiats à prévoir chez ce type de malades. Et, j'ai aussi toute confiance en la capacité de votre centre dans la possibilité de faire un registre exhaustif des malades que vous prendriez en charge. Autre question, je voudrais savoir quand vous dites que vous avez 80 patients qui sont décédés de PTI par an, sur un total de combien par an à peu près, pour que nous ayons une idée de la mortalité ? M. le Pr GODEAU. - Nous avions fait une étude avec les données de registres et avec l'aide du PNSI, on sait qu'en moyenne, en France, chaque année, il y a entre 3 000 et 4 000 malades hospitalisés pour un PTI. Parmi ces malades, il y a environ 80 % d'adultes, et il y a deux tiers de PTI nouvellement diagnostiqués, ou de PTI persistants. On sait que sur ces patients, la mortalité est d'environ 80 cas par an. La mortalité est essentiellement liée à des complications hémorragiques intra-cérébrales, mais il y a également, de manière maintenant moins fréquente, des complications infectieuses qui sont liées à l'utilisation prolongée des corticoïdes. Nous militons contre l'utilisation prolongée des corticoïdes. Mais je pense que les PNDS et les multiples séances de formation font que maintenant les cliniciens ne donnent plus de corticothérapies prolongées. Les complications iatrogènes infectieuses sont moins fréquentes. Il reste les complications hémorragiques. Et il y a une complication qui est un peu surprenante, c'est un risque thrombotique. Le PTI, paradoxalement, est une maladie qui est associée à des complications hémorragiques, mais aussi parfois à des complications thrombotiques. Et là, c'est le risque potentiel des agonistes du récepteur de la TPO sur des terrains à risque. Sur des terrains à risque, j'insiste. Mme le Dr DEGOS. - D'accord. OK. Des questions de la commission ? Etienne LENGLINE, veux-tu poser une question ou un commentaire ? M. le Dr LENGLINE. - Pas spécialement. Merci beaucoup pour cette très belle présentation. Je crois que le point principal qu'on avait énormément discuté lors de l'examen du dossier, c'est qu'en effet, il y a un besoin médical qui est réel chez une sous-population de patients qui est réfractaire aux autres traitements. Après, j'aurais tout de même la question de savoir comment vous voyez la place de ce médicament dans la stratégie. Ce que nous avons trouvé assez compliqué à juger dans les essais présentés, dont un essai sur deux est positif contre placebo chez une population de patients qui ne semblaient pas tous avoir reçu plusieurs lignes thérapeutiques, ou potentiellement utilisables. Il y a à peu près la moitié qui n'avait pas eu d'agoniste du récepteur de la TPO, beaucoup n'avaient pas eu de rituximab, une minorité était splénectomisés. Pour vous, est-ce un traitement que vous utiliseriez si jamais il y avait un SMR suffisant, comme un autre traitement de deuxième ligne ou plutôt après avoir épuisé les autres ressources thérapeutiques ? M. le Pr GODEAU. - Je dirais que dans un premier temps, c'est un médicament que très certainement on va utiliser avant la splénectomie. Parce que je crois vraiment qu'aujourd'hui, si l'on est né avec une rate, c'est pour s'en servir, et on a envie de laisser nos patients avec leur rate intacte. Dans un premier temps, il me paratrait logique d'utiliser ce médicament chez des patients qui sont en échec des ARTPO, en échec du rituximab. Je rajouterai la DISULONE parce que notre groupe utilise largement la DISULONE, même si l'on ne l'a pas de décès en double insu. Chez un patient qui est en échec des ARTPO, en échec du rituximab et en échec de la DISULONE, j'aurais tendance à proposer ce médicament. Mais c'est mon avis. Par exemple, la DISULONE, il y a beaucoup de cliniciens qui refusent de l'utiliser en disant que ce médicament est mal toléré. Après si on s'aperçoit que le médicament est bien toléré, si l'on s'aperçoit que finalement la diarrhée est en effet secondaire qui n'est pas si important si l'on s'aperçoit que l'efficacité du traitement est conforme à ce que les suggèrent les données thérapeutiques dont on dispose, il n'est pas exclu que ce traitement arrive finalement au même niveau que les ARTPO. Et encore une fois, les ARTPO, malgré leur remarquable efficacité, c'est entre 35 et 50 % d'arrêt dans l'année qui suit l'instauration du traitement. Il faut s'approprier un médicament, et il faut que l'on progresse dans la connaissance d'un médicament avec des registres dans la vraie vie. Voilà comment je vois les choses. Clairement, aujourd'hui, on a des médicaments. Par exemple, si je prends le rituximab, il faut savoir que la France est le seul pays o, grâce aux autorités de santé, on a eu une autorisation de prescription et d'un remboursement. Dans la plupart des pays, alors que le rituximab apparat dans toutes les recommandations, c'est une négociation avec les compagnies d'assurance. Pour nous, le rituximab est devenu un traitement de deuxième ou troisième ligne, ce qui n'est pas le cas dans les autres pays. Et pourtant nous n'avons pas de preuve, par un essai prospectif, randomisé et contrôlé, que le rituximab soit efficace. Mais les données dans la vraie vie et les registres montrent qu'aujourd'hui le rituximab, c'est globalement 60 % d'efficacité à court terme et 40 % d'efficacité à 12 à 24 mois. Mme le Dr DEGOS. - Vous dtes quand même que vous ne l'utiliseriez certainement pas sans avoir épuisé au moins deux lignes de traitement. M. le Pr GODEAU. - Je vous dis, je l'utiliserai aujourd'hui, si ce médicament est disponible, pour moi, la priorité, ce sont les patients qui sont réfractaires. C'est-à-dire que nous avons un recrutement qui est bien sûr biaisé puisque l'on nous adresse en priorité des patients qui sont réfractaires. Mais chez des patients réfractaires, là, vraiment le fostamatinib est quelque chose qui va nous apporter quelque chose. Après, je dirais que sur la tolérance à court terme, nous allons rapidement voir. Si les malades ont tous la diarrhée et que le médicament n'est pas supportable, dans la mesure o de toute façon, on a la possibilité de donner des médicaments qui sont bien tolérés, le médicament sera condamné de lui-même. Mais pour les malades réfractaires, pour nous, aujourd'hui, il y a clairement une indication. Après, est-ce que ce médicament, on aura un avenir plus précocement, je ne peux pas vous répondre aujourd'hui. Mme le Dr DEGOS. - Mais pour l'avenir, ce sera une autre étude clinique. M. le Pr GODEAU. - sûrement, mais j'attends du laboratoire qu'il la fasse. Mme le Dr DEGOS. - C'est le message qu'il faut leur passer. M. le Pr GODEAU. - Je pense que le message qu'il faut faire passer, c'est qu'il y a des études à faire chez les malades en première ligne ou en deuxième ligne. Par exemple, que les agonistes du récepteur de l'ARTPO, la question que nous nous posons aujourd'hui, c'est s'il ne faut pas donner des agonistes du récepteur des TPO associés à des corticoïdes dès le diagnostic. Et il y a des essais thérapeutiques en cours dans l'espoir de guérir les malades. Fostamatinib pourrait très bien faire un essai thérapeutique de ce type. Je pense vraiment les essais, les registres prospectifs bien construits donnent plein d'informations. Mme le Dr DEGOS. - Tout à fait. Là, vous avez raison, Serge KOUZAN. M. le Dr KOUZAN. - J'avais surtout une question sur la stratégie qui a déjà été répondue. Je voudrais juste vous demander si, de votre point de vue, il faudrait, au cas o l'on rendrait le médicament disponible, en faire l'apanage de centre ultra spécialisé en termes de prescription ? M. le Pr GODEAU. - Merci beaucoup pour cette question. L'avantage du centre de référence, et je pense que c'est une chance majeure que l'on a en France, les centres de référence maladies rares qui ont été créés en 2005 et en 2006 permettent de couvrir un grand nombre de pathologies et avec le réseau de centres de référence, on a vraiment la possibilité de restreindre cette prescription à des centres de compétences et à des centres de référence. Il y a quelque part l'obligation pour le clinicien d'avoir un suivi, et avec un registre prospectif, je pense que c'est quelque chose qui est tout à fait envisageable. Mme le Dr DEGOS. - Il y a des RCP pour les chromopathies auto-immunes ? M. le Pr GODEAU. - Il y a des RCP. Avec la filière maladies rares MaRIH, le CRCAI fait partie de la filière MaRIH, on a une RCP. A midi, nous avions une RCP. Ces RCP sont tracées, sont enregistrées par la filière MaRIH. Je pense qu'il y a tout à fait la possibilité que ces patients passent obligatoirement par une RCP, et dans le réseau du centre de référence. Encore une fois, l'avantage, c'est qu'avec les centres de compétences, nous couvrons tout le territoire national, y compris La Réunion et y compris à Nouméa. Par contre, malheureusement, nous n'avons pas de centre de compétences aux Antilles. Mme le Dr DEGOS. - Une dernière question, Bernard GUILLOT. M. le Pr GUILLOT. - Merci Monsieur GODEAU pour votre présentation, mais ma question s'adresse plutôt au laboratoire. Vous sollicitez le remboursement aussi bien en ville qu'en collectivité, ou seulement les collectivités ? Mme LEMMER. - Pour la collectivité. M. le Pr GUILLOT. - Ce n'est pas le remboursement en ville, alors. Très bien, merci Mme le Dr DEGOS. - Sarah KONE, une question ? Mme KONE, pour la HAS. - J'avais une question pour le Professeur GODEAU. Vu la place restreinte aux patients réfractaires, je voulais savoir à combien il estimait la population de patients qui pourraient bénéficier de TAVLESSE dans cette indication ? M. le Pr GODEAU. - C'est une question difficile. Je dirais s'il y a 4 000 malades par an, que cela peut représenter peut-être 200 malades par an au début. Si je regarde les agonistes des récepteurs de la TPO, quand ils ont commencé à être commercialisés, ils étaient réservés aux malades réfractaires, on tournait, pour les deux laboratoires, autour de 300 malades par an, peut-être. Je sais que maintenant ce sont des chiffres beaucoup plus élevés. Mme KONE, pour la HAS. - Très bien. J'avais une deuxième question. Vous nous avez expliqué que tous les traitements dans cette indication ont fait des études versus placebo, mais dans l'avis de la commission, nous avons tout de même regretté le fait que le laboratoire aurait pu faire une étude versus la meilleure option disponible pour ces patients qui étaient hétérogènes. Je vous ai entendu le dire. M. le Pr GODEAU. - J'entends cette question et cette question est très complexe. Parce que quand vous dites que le meilleur traitement, il n'y a pas de meilleur traitement. C'est-à-dire qu'en fait, les objectifs des traitements ne sont pas les mêmes. Nous avons été en France les grands défenseurs du rituximab, à tel point qu'on m'appelait Monsieur rituximab dans les congrès. Et la critique, par exemple des Anglo-Saxons, c'était de nous dire : mais vous défendez le rituximab, vous nous montrez un médicament qui a 60 % d'efficacité, 30 % à 24 mois, alors que regardez les agonistes du récepteur de la TPO, vous vous êtes à 80 % de réponses. OK, mais les agonistes du récepteur de la TPO, c'est un médicament qui, dans la majorité des cas, est purement suspensif. Déjà, quand vous allez comparer deux médicaments, quel critère allez- vous ? Allez-vous prendre un chiffre de plaquettes à 24 mois ? Allez-vous prendre un chiffre de plaquettes à 6 mois ? Allez-vous prendre un chiffre de plaquettes alors que le traitement a été interrompu ? Notre défense a été de dire, mais nous faisons du rituximab parce que finalement ce sont deux perfusions à J-1, J-15 et ensuite, on arrête et on voit ce qu'il se passe. Alors que l'agoniste du récepteur de la TPO, vous allez être obligé de garder le traitement tout le temps. Je trouve donc que c'est très compliqué. C'est exactement la même réponse que ce qui se passe actuellement avec les biothérapies dans les maladies auto-immunes. On nous explique qu'il faut donner des anti-L6 à la maladie de HORTON et qu'il faut pilonner de corticoïdes, sauf que quand vous donnez un anti L6, très bien, ça marche. Le jour o vous arrêtez l'anti-L6, votre maladie de HORTON dans les dix jours qui suivent a rechuté. Comparer des médicaments l'un par rapport à l'autre, alors qu'il n'y a pas un gold standard et un médicament qui a parfaitement fait la preuve de son efficacité, c'est complexe. Effectivement, nous pourrions faire des essais face to face, mais à ce moment-là, il faut prendre un critère de réponse qui soit adapté. Je ne sais pas si j'ai répondu à votre question. Mme KONE, pour la HAS. - Très bien. Merci. Françoise, vous avez votre micro coupé. Mme le Dr DEGOS. - Excusez-moi. Mathilde fait une remarque en disant que la demande de remboursement porte sur les deux listes. Mme GRANDE, pour la HAS. - Oui, je suis étonnée par la réponse du laboratoire qui dit aux seules collectivités . Ce n'est pas ce que vous avez demandé. Mme MAHI. - La demande avait été faite en effet sur les deux listes. Mme GRANDE, pour la HAS. - D'accord. Mme le Dr DEGOS. - La prescription ne sera faite que par les centres de référence et de compétences, donc c'est en collectivité. Mme MAHI. - Exactement. Si en effet, cela doit être axé uniquement sur les centres de compétences, on arrive uniquement sur la collectivité, tout à fait. Mme le Dr DEGOS. - Avec renouvellement par le centre de référence et de compétences, là aussi, avec ce que vous nous avez exposé sur la difficulté d'adapter le traitement en fonction de l'évènement. On vous en remercie beaucoup. Vous avez bien éclairé la commission et votre expérience nous a été très utile. Merci. Mme MAHI. - Merci beaucoup et je remercie le Professeur GODEAU. Je remercie la commission pour son écoute. Monsieur GODEAU et Mesdames MAHI et LEMMER quittent la séance. Mme le Dr DEGOS. - C'est vrai que l'on est tombé sur le pape de la chromopathie auto-immune. M. le Pr CLANET. - Il est assez convaincant sur le fait que les comparateurs, ce n'est vraiment pas facile. C'est un réel problème. Mme le Dr DEGOS. - On voit bien qu'on ne peut pas établir un schéma thérapeutique standard pour ce type de patients, et c'est la raison pour laquelle il serait raisonnable de le réserver vraiment aux centres de référence et de compétence, dans le cadre de la RCP. M. le Pr CLANET. - C'est l'élément le plus convaincant. Bernard a un commentaire, je crois. M. le Pr GUILLOT. - Il nous apporte des éléments qui sont intéressants, c'est un sujet qu'il connat tellement bien. Le dossier est très faible, il y a un effet positif et un effet négatif. Si l'on prend ce point de vue, il faut absolument, et c'est pour cela que posez la question au laboratoire, il faut le réserver strictement aux collectivités, avec une inaudible 3. 31. 57 strictement réservée aux centres de référence et de compétence. Il est hors de question de laisser ce produit sur le marché en inaudible 3. 32. 08. En l'entourant vraiment de toutes ces précautions, avec une prescription réservée, remboursement que pour les collectivités, et un SMR minimaliste, pourquoi pas. Mais pas plus loin. Mme le Dr DEGOS. - A mots couverts, sa demande était celle-là. Les centres de référence et de compétence, de registres, il s'est engagé. M. le Pr GUILLOT. - Ils le feront. Mme le Dr DEGOS. - Ils le feront, je pense qu'il n'y a pas de doute à avoir là-dessus. Et effectivement, il demande un SMR suffisant, mais un SMR faible pourrait faire l'affaire. Mme GRANDE, pour la HAS. - Oui, peut-être pour clarifier un peu les choses entre les listes et les prescriptions. Le médicament, aujourd'hui, est de prescription hospitalière et même réservée à certains médecins spécialistes. Et le renouvellement de la prescription est également limité à certains professionnels de santé. La question de la liste de diffusion, c'est plutôt si ce médicament sera accessible en officine, en ville ? C'est-à-dire qu'il peut être prescrit par un centre de référence, mais à être délivré derrière par une pharmacie d'officine et pas par la pharmacie de rétrocession ou la PUI de l'hôpital. M. le Pr GUILLOT. - On a bien compris, c'est bien là qu'il faut être vigilant. Il faut le laisser complètement encadré pendant une durée de deux ou trois ans, je n'en sais rien, et le revoir. Mme le Dr GARNIER. - Si je peux me permettre u petit commentaire. Mme le Dr DEGOS. - Pas tout le monde à la fois. Valérie. Mme le Dr GARNIER. - Merci Françoise. Bernard, je ne comprends pas ta réserve, parce que si chaque mois il y a un contact avec un spécialiste prescripteur, pourquoi pas après faire délivrer le médicament par l'officine. Parce que ce qui se passe en plus actuellement, et ce qu'on voit beaucoup, c'est que ces médicaments qui sont délivrés par les PUI, on a établi un réseau informel entre ces PUI et les pharmacies d'officine, o l'on sert en fait de bote aux lettres uniquement. La PUI nous fait passer les médicaments de la prescription hospitalière par l'intermédiaire des grossistes. Et cela complexifie énormément les choses, je trouve. M. le Pr GUILLOT. - Je comprends, c'est un peu par analogie à ce que l'on a vécu avec les thérapies ciblées par voie orale ou pendant un bon moment, elles ont été uniquement hospitalières, et au bout de deux ou trois ans, c'est passé en délivrance de ville. Mais pour l'instant, ce produit, il faut le laisser sous surveillance, à cause de la fragilité du dossier. Parce que le dossier est très fragile. Plusieurs personnes parlent en même temps. M. le Pr CLANET. - C'est la prescription qui est importante. Mme KONE, pour la HAS. - Bernard, la différence, c'est que les biothérapies par voie orale, c'est que c'est la prescription initiale qui était hospitalière, alors que là, c'est un médicament à prescription hospitalière tout court. Après, c'est pareil, le renouvellement de la prescription, comme vous l'a dit Mathilde est toujours limité au même spécialiste. C'est vraiment très encadré, et c'est différent par rapport aux biothérapies. Mme le Dr DEGOS. - Dans des centres de gens hyper compétents comme ceux qui vont être amenés à prescrire cela, ils renouvellent les prescriptions eux-mêmes et après, la dispensation se fait au plus simple pour le patient. Un intervenant. - Si je peux intervenir, par exemple à Chambéry, on a des gens qui viennent du fin fond de la vallée de la Maurienne, alors que c'est 120 à 130 kilomètres pour venir. Si la prescription est parfaitement contrôlée par le centre de compétences, la délivrance peut se faire par l'intermédiaire de la pharmacie de la localité. Si le circuit est bien balisé. Mme le Dr DEGOS. - Catherine Simonin va dans ce sens, en disant de simplifier les parcours pour aller chercher le médicament. Mme SIMONIN. - Absolument, et je dirais que dès l'instant qu'il est prescrit par quelqu'un qui est dans un centre de référence avec un renouvellement dans le centre de référence, effectivement, le patient peut aller à la pharmacie chercher son médicament. Je ne vois pas o est le problème. M. le Pr GUILLOT. - Ca marche, je voulais que le renouvellement soit bien hospitalier. Mme le Dr DEGOS. - On va l'écrire. M. le Pr GUILLOT. - Il faut l'écrire. Après, la dispensation, OK, à partir du moment o l'on le renouvellement est hospitalier, le patient est venu à l'hôpital. Il passe à la PUI et il va prendre son produit. Mais si cela vous parat plus simple que cela se fasse ainsi, pas de souci. Mais vraiment le renouvellement doit être aussi hospitalier. Mme le Dr DEGOS. - Donc renouvellement centre de référence et de compétences et RCP. M. le Pr CLANET. - Patrick DUFOUR a levé la main, Françoise. Mme le Dr DEGOS. - Je ne vois pas. Excuse-moi Patrick. M. le Pr DUFOUR. - Je suis un peu d'accord avec ce qui vient d'être dit. C'est-à-dire que si le renouvellement, et je suis d'accord là-dessus, est fait par le centre de référence. Il faut bien que le patient se déplace au centre de référence, autant qu'il aille chercher son médicament à la PUI du centre de référence plutôt que de repartir après. Je ne crois pas. Mme SIMONIN. - Etant donné que les téléconsultations se développent énormément, est-ce qu'à chaque prescription, il aurait besoin de revenir à chaque fois physiquement ? Mme le Dr DEGOS. - On ne va pas travailler à leur place. C'est au médecin de prendre ses responsabilités. Mme SIMONIN. - Je trouve que l'on complexifie le parcours patient. C'est simplement pour cela. M. le Pr CLANET. - Je suis bien d'accord avec cela. Une intervenante. - La prescription peut être faite par un spécialiste pour plusieurs mois également. Le renouvellement se fait pour le patient en officine tous les mois. Mme le Dr DEGOS. - Il doit surveiller son patient assez souvent, je pense aussi. Mais c'est au médecin de déterminer le rythme des consultations, et cela, nous n'allons pas le faire à sa place. M. le Pr CLANET. - C'est suffisamment encadré, du moment qu'il y a un renouvellement. Il y a la simplification du parcours du patient qui est nécessaire. Mme le Dr DEGOS. - L'idée, ce serait peut-être d'essayer de mettre à disposition par un SMR faible ? Est-ce que vous êtes d'accord, pour qu'on passe au vote ? M. le Pr CLANET. - C'est ce que l'on avait envisagé en bureau. Mme le Dr DEGOS. - Oui, tout à fait. Peut-on commencer à voter, Elisabeth ? M. le Pr CLANET. - On vote suffisant ou insuffisant. Ensuite, on vote Mme le Dr DEGOS. - Nous pouvons déjà voter faible, oui ou non. Mme GATTULLI, pour la HAS. - Sinon, on peut faire le vote du SMR en mettant faible ou maintient insuffisant ? Mme le Dr DEGOS. - Si vous préférez d'accord. Mme GATTULLI, pour la HAS. - Faible ou autre chose. Mme GRANDE, pour la HAS. - Non, je suis désolé, mais vous risquez d'avoir une dispersion de voix, s'il y en a qui veulent aller sur du modéré important, et on se retrouve dans des situations que l'on veut éviter. C'est pour cela que l'on fait voter d'abord suffisant, insuffisant. Et si c'est suffisant, dans ce cas, on qualifie le niveau de SMR. Excusez-moi, mais ce n'est pas une partie de plaisir non plus pour nous, mais c'est plus propre. Peut-être que le plus facile, c'est le maintien des conclusions de l'avis. Si vous êtes pour, c'est que vous êtes pour le SMRI, si vous êtes contre, cela veut dire que vous êtes pour le remboursement. Après, on verra comment l'on quantifie le remboursement. M. le Pr DUFOUR. - C'est tout de même plus simple de donner le niveau de SMR. Si on dit SMR faible, cela va être cela la conclusion. On le sait bien. Mme GRANDE, pour la HAS. - Le problème, Patrick, nous l'avions déjà évoqué, c'est que quand il va y avoir 6 SMR modérés, 2 SMR faibles et 9 SMR insuffisants. C'est pour cela que l'on fait comme cela. M. le Pr DUFOUR. - C'est peu probable. M. le Pr CLANET. - Si l'on faisait suffisant ou pas suffisant, ce serait plus simple. Mme GRANDE, pour la HAS. - C'est pareil. Un intervenant. - C'est plus clair. Mme GRANDE, pour la HAS. - On refait suffisant ou insuffisant. Je vous invite à bien articuler. (Il est procédé au vote. ) Mme GATTULLI, pour la HAS. - Merci, nous avons 15 voix favorables à un SMR suffisant et une abstention. (La Commission de la transparence adopte à l'unanimité sur les observations faites en séance. ) Mme le Dr DEGOS. - Maintenant, nous allons qualifier le SMR et l'ASMR. Mme GRANDE, pour la HAS. - Important, modéré, faible ou abstention, et ASMR. Ils demandent combien ? Je ne l'ai plus en tête. Mme le Dr DEGOS. - Ils ont juste demandé suffisant. Mme GRANDE, pour la HAS. - D'accord. Ils demandent du V a priori. (Il est procédé au vote. ) Mme GATTULLI, pour la HAS. - Merci, nous avons 16 voix favorables pour un SMR faible, et 16 voix pour une ASMR de niveau V. (La Commission de la transparence adopte à l'unanimité sur les observations faites en séance. ) M. le Pr DUFOUR. - Et dans quel périmètre ? Mme GRANDE, pour la HAS. - Celui de l'AMM, qui était le PTI chronique chez les patients adultes réfractaires aux autres traitements, dernière ligne réfractaires. Mme le Dr DEGOS. - Vous mettrez bien les centres de référence de compétences. Mme KONE, pour la HAS. - Plus le registre. Mme le Dr DEGOS. - Le registre et la RCP. Mme GRANDE, pour la HAS. - Oui, tout à fait. Et pareil pour les arguments. Nous allons reprendre les mêmes arguments, mais en les tapant plus sur la notion de besoin médical pour que la place dans la strate soit définie en échec. Et pour la réévaluation, parce que si l'on met un registre, pour suivre les patients, notamment en termes d'efficacité, sur les critères de saignements, peut-être une réévaluation dans un délai maximal de cinq ans, ce serait pas mal, si vous êtes d'accord avec cela. M. le Pr CLANET. - Cela fait beaucoup V. Mme le Dr DEGOS. - Non, parce qu'il n'en a pas énormément. M. le Pr CLANET. - Oui, c'est vrai. Mme GRANDE, pour la HAS. - Et il faut le temps que cela se mette en place. Cela peut prendre un peu de temps. De toute façon, quand on dit à cinq ans, cela veut dire qu'il faut sortir votre avis dans les cinq ans. Cela fait quatre ans, le dépôt, c'est dans quatre ans. Est-ce que modulo toutes ces évolutions et la relecture par Etienne et le Président, vous validez l'adoption aujourd'hui ? Mme le Dr DEGOS. - Oui. Y a-t-il des objections à la valider ? Mme GRANDE, pour la HAS. - J'ai vu un message à passer tout à l'heure. Mme KONE, pour la HAS. - Elle s'interrogeait sur l'ISP, mais dans le cadre de l'audition, ils n'y sont pas revenus. Mme GRANDE, pour la HAS. - OK, c'est bon, donc pas d'ISP. Mme le Dr DEGOS. - Dans l'audition, on n'en parle pas. Mme GRANDE, pour la HAS. - Non, mais c'était pour dire de checker que l'on ait bien tout vu. Y a- t-il des points pour toi qui nécessitent d'être clarifiés ou c'est bon ? Le Chef de projet. - Oui, par rapport aux observations peut-être pas vraiment un point que je voulais valider avec vous. Il y en a deux. Notamment, ils reviennent vraiment sur le fait que l'on qualifie à l'efficacité de faible. Je voulais voir avec vous, vu les discussions et ce que vous avez entendu du Professeur GODEAU, c'est quelque chose que l'on a mis partout dans l'avis. Faut-il rester factuel, et mettre que c'est une efficacité avec une différence de 18 % ? Ou considérez- vous malgré tout que cela reste faible ? Vous confirmez le fait que c'est faible ? Mme le Dr DEGOS. - Je n'ai pas de chiffres. Mme GRANDE, pour la HAS. - Vous avez mis un SMR faible, c'est vrai que nous allons pouvoir écrire que le rapport efficacité effets désirables au sein du SMR est considéré comme faible et qu'il devra être réévalué dans un délai de cinq ans. Voilà pour le SMR, et on alignera cela pour tout, si cela vous va. M. le Pr CLANET. - Cela me parat logique. Le Chef de projet. - Très bien. Et une autre question, pour les effets indésirables, le professeur GODEAU est revenu dessus, ce n'est pas quelque chose qui les réfute. On avait indiqué que c'était susceptible d'impacter la qualité de vie des patients. Ils souhaiteraient, dans l'avis que l'on mette, que ce sont des choses qui peuvent être gérées en pratique clinique. Nous voulions vous proposer de refuser, mais je voulais voir avec vous, si vous vouliez atténuer un peu cette phrase ou maintenir le fait que c'était susceptible d'impacter la qualité de vie des patients. Mme le Dr DEGOS. - Il ne s'est pas engagé là-dessus. Il a dit qu'il ne savait pas encore. Mme KONE, pour la HAS. - Il a dit qu'il fallait des données, ils ne savent pas. Un intervenant. - Il faut laisser comme c'est écrit. Le Chef de projet. - C'est tout pour moi, merci. Index Nous vous informons que nous n'avons pas pu vérifier l'orthographe ou l'exactitude des noms et termes suivants : chromopathie, 12 pivotale, 6 chromopathies, 10 SMOK, 6 | HAS | Scientific |
Intérêt de la scintigraphie placentaire dans le diagnostic et la surveillance des môles hydatiformes | WMT16 | Scientific |
Description des plaies aigus et de leur prise en charge au circuit ambulatoire dans un service d'urgences Céline Chevobbe To cite this version : Céline Chevobbe. Description des plaies aigus et de leur prise en charge au circuit ambulatoire dans un service d'urgences. Sciences du Vivant [q-bio]. 2019. dumas-02390695 HAL Id : dumas-02390695 Submitted on 3 Dec 2019 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Description des plaies aigus et de leur prise en charge au circuit ambulatoire dans un service d'urgences T H È S E Présentée et publiquement soutenue devant LA FACULTÉ DES SCIENCES MEDICALES ET PARAMEDICALES DE MARSEILLE Le 18 Octobre 2019 Par Madame Céline CHEVOBBE Née le 21 mars 1992 à Clichy (92) Pour obtenir le grade de Docteur en Médecine D. E. S. de MÉDECINE GÉNÉRALE Membres du Jury de la Thèse : Monsieur le Professeur ROCH Antoine Monsieur le Professeur GERBEAUX Patrick Monsieur le Professeur ROCHWERGER Alexandre Monsieur le Professeur BERBIS Philippe Madame le Docteur PILARCZYK Estelle Président Assesseur Assesseur Assesseur Directeur Description des plaies aigus et de leur prise en charge au circuit ambulatoire dans un service d'urgences T H È S E Présentée et publiquement soutenue devant LA FACULTÉ DES SCIENCES MEDICALES ET PARAMEDICALES DE MARSEILLE Le 18 Octobre 2019 Par Madame Céline CHEVOBBE Née le 21 mars 1992 à Clichy (92) Pour obtenir le grade de Docteur en Médecine D. E. S. de MÉDECINE GÉNÉRALE Membres du Jury de la Thèse : Monsieur le Professeur ROCH Antoine Monsieur le Professeur GERBEAUX Patrick Monsieur le Professeur ROCHWERGER Alexandre Monsieur le Professeur BERBIS Philippe Madame le Docteur PILARCZYK Estelle Président Assesseur Assesseur Assesseur Directeur AIX-MARSEILLE UNIVERSITE Président : Yvon BERLAND FACULTE DES SCIENCES MEDICALES ET PARAMEDICALES Administrateur provisoire : Georges LEONETTI Affaires Générales : Patrick DESSI Professions Paramédicales : Philippe BERBIS Assesseurs : aux Etudes : Jean-Michel VITON à la Recherche : Jean-Louis MEGE aux Prospectives Hospitalo-Universitaires : Frédéric COLLART aux Enseignements Hospitaliers : Patrick VILLANI à l'Unité Mixte de Formation Continue en Santé : Fabrice BARLESI pour le Secteur Nord : Stéphane BERDAH aux centres hospitaliers non universitaires : Jean-Nol ARGENSON Chargés de mission : 1er cycle : Jean-Marc DURAND et Marc BARTHET 2ème cycle : Marie-Aleth RICHARD 3eme cycle DES/DESC : Pierre-Edouard FOURNIER Licences-Masters-Doctorat : Pascal ADALIAN DU-DIU : Véronique VITTON Stages Hospitaliers : Franck THUNY Sciences Humaines et Sociales : Pierre LE COZ Préparation à l'ECN : Aurélie DAUMAS Démographie Médicale et Filiarisation : Roland SAMBUC Relations Internationales : Philippe PAROLA Etudiants : Arthur ESQUER Chef des services généraux : Déborah ROCCHICCIOLI Chefs de service : Communication : Laetitia DELOUIS Examens : Caroline MOUTTET Maintenance : Philippe KOCK Scolarité : Christine GAUTHIER Intérieur : Jolle FAVREGA DOYENS HONORAIRES M. Yvon BERLAND M. André ALI CHERIF M. Jean-François PELLISSIER Mis à jour 01/01/2019 PROFESSEURS HONORAIRES MM AGOSTINI Serge MM FAVRE Roger ALDIGHIERI René ALESSANDRINI Pierre ALLIEZ Bernard AQUARON Robert ARGEME Maxime ASSADOURIAN Robert AUFFRAY Jean-Pierre AUTILLO-TOUATI Amapola AZORIN Jean-Michel BAILLE Yves BARDOT Jacques BARDOT André BERARD Pierre BERGOIN Maurice BERNARD Dominique BERNARD Jean-Louis BERNARD Pierre-Marie BERTRAND Edmond BISSET Jean-Pierre BLANC Bernard BLANC Jean-Louis BOLLINI Gérard BONGRAND Pierre BONNEAU Henri BONNOIT Jean BORY Michel BOTTA Alain BOURGEADE Augustin BOUVENOT Gilles BOUYALA Jean-Marie BREMOND Georges BRICOT René BRUNET Christian BUREAU Henri CAMBOULIVES Jean CANNONI Maurice CARTOUZOU Guy CAU Pierre CHABOT Jean-Michel CHAMLIAN Albert CHARREL Michel CHAUVEL Patrick CHOUX Maurice CIANFARANI François CLEMENT Robert COMBALBERT André CONTE-DEVOLX Bernard CORRIOL Jacques COULANGE Christian DALMAS Henri DE MICO Philippe DESSEIN Alain DELARQUE Alain DEVIN Robert DEVRED Philippe DJIANE Pierre DONNET Vincent DUCASSOU Jacques DUFOUR Michel DUMON Henri ENJALBERT Alain FIECHI Marius FARNARIER Georges FIGARELLA Jacques FONTES Michel FRANCOIS Georges FUENTES Pierre GABRIEL Bernard GALINIER Louis GALLAIS Hervé GAMERRE Marc GARCIN Michel GARNIER Jean-Marc GAUTHIER André GERARD Raymond GEROLAMI-SANTANDREA André GIUDICELLI Roger GIUDICELLI Sébastien GOUDARD Alain GOUIN François GRILLO Jean-Marie GRISOLI François GROULIER Pierre HADIDA/SAYAG Jacqueline HASSOUN Jacques HEIM Marc HOUEL Jean HUGUET Jean-François JAQUET Philippe JAMMES Yves JOUVE Paulette JUHAN Claude JUIN Pierre KAPHAN Gérard KASBARIAN Michel KLEISBAUER Jean-Pierre LACHARD Jean LAFFARGUE Pierre LAUGIER René LE TREUT Yves LEVY Samuel LOUCHET Edmond LOUIS René LUCIANI Jean-Marie MAGALON Guy MAGNAN Jacques MALLAN- MANCINI Josette MALMEJAC Claude MARANINCHI Dominique MARTIN Claude MATTEI Jean François MERCIER Claude METGE Paul MICHOTEY Georges MILLET Yves MIRANDA François MONFORT Gérard MONGES André MONGIN Maurice MONTIES Jean-Raoul NAZARIAN Serge NICOLI René MM NOIRCLERC Michel OLMER Michel OREHEK Jean PAPY Jean-Jacques PAULIN Raymond PELOUX Yves PENAUD Antony PENE Pierre PIANA Lucien PICAUD Robert PIGNOL Fernand POGGI Louis POITOUT Dominique PONCET Michel POUGET Jean PRIVAT Yvan QUILICHINI Francis RANQUE Jacques RANQUE Philippe RICHAUD Christian RIDINGS Bernard ROCHAT Hervé ROHNER Jean-Jacques ROUX Hubert ROUX Michel RUFO Marcel SAHEL José SALAMON Georges SALDUCCI Jacques SAN MARCO Jean-Louis SANKALE Marc SARACCO Jacques SASTRE Bernard SCHIANO Alain SCOTTO Jean-Claude SEBAHOUN Gérard SERMENT Gérard SERRATRICE Georges SOULAYROL René STAHL André TAMALET Jacques TARANGER-CHARPIN Colette THOMASSIN Jean-Marc UNAL Daniel VAGUE Philippe VAGUE/JUHAN Irène VANUXEM Paul VERVLOET Daniel VIALETTES Bernard WEILLER Pierre-Jean PROFESSEURS HONORIS CAUSA 1967 MM. les Professeurs DADI (Italie) CID DOS SANTOS (Portugal) 1974 MM. les Professeurs MAC ILWAIN (Grande-Bretagne) T. A. LAMBO (Suisse) 1975 MM. les Professeurs O. SWENSON (U. S. A. ) Lord J. WALTON of DETCHANT (Grande-Bretagne) 1976 MM. les Professeurs P. FRANCHIMONT (Belgique) Z. J. BOWERS (U. S. A. ) 1977 MM. les Professeurs C. GAJDUSEK-Prix Nobel (U. S. A. ) C. GIBBS (U. S. A. ) J. DACIE (Grande-Bretagne) 1978 M. le Président F. HOUPHOUET-BOIGNY (Côte d'Ivoire) 1980 MM. les Professeurs A. MARGULIS (U. S. A. ) R. D. ADAMS (U. S. A. ) 1981 MM. les Professeurs H. RAPPAPORT (U. S. A. ) M. SCHOU (Danemark) M. AMENT (U. S. A. ) Sir A. HUXLEY (Grande-Bretagne) S. REFSUM (Norvège) 1982 M. le Professeur W. H. HENDREN (U. S. A. ) 1985 MM. les Professeurs S. MASSRY (U. S. A. ) KLINSMANN (R. D. A. ) 1986 MM. les Professeurs E. MIHICH (U. S. A. ) T. MUNSAT (U. S. A. ) LIANA BOLIS (Suisse) L. P. ROWLAND (U. S. A. ) 1987 M. le Professeur P. J. DYCK (U. S. A. ) 1988 MM. les Professeurs R. BERGUER (U. S. A. ) W. K. ENGEL (U. S. A. ) V. ASKANAS (U. S. A. ) J. WEHSTER KIRKLIN (U. S. A. ) A. DAVIGNON (Canada) A. BETTARELLO (Brésil) 1989 M. le Professeur P. MUSTACCHI (U. S. A. ) 1990 MM. les Professeurs J. G. MC LEOD (Australie) J. PORTER (U. S. A. ) 1991 MM. les Professeurs J. Edward MC DADE (U. S. A. ) W. BURGDORFER (U. S. A. ) 1992 MM. les Professeurs H. G. SCHWARZACHER (Autriche) D. CARSON (U. S. A. ) T. YAMAMURO (Japon) 1994 MM. les Professeurs G. KARPATI (Canada) W. J. KOLFF (U. S. A. ) 1995 MM. les Professeurs D. WALKER (U. S. A. ) M. MULLER (Suisse) V. BONOMINI (Italie) 1997 MM. les Professeurs C. DINARELLO (U. S. A. ) D. STULBERG (U. S. A. ) A. MEIKLE DAVISON (Grande-Bretagne) P. I. BRANEMARK (Suède) 1998 MM. les Professeurs O. JARDETSKY (U. S. A. ) 1999 MM. les Professeurs J. BOTELLA LLUSIA (Espagne) D. COLLEN (Belgique) S. DIMAURO (U. S. A. ) 2000 MM. les Professeurs D. SPIEGEL (U. S. A. ) C. R. CONTI (U. S. A. ) 2001 MM. les Professeurs P-B. BENNET (U. S. A. ) G. HUGUES (Grande Bretagne) J-J. O'CONNOR (Grande Bretagne) 2002 MM. les Professeurs M. ABEDI (Canada) K. DAI (Chine) 2003 M. le Professeur Sir T. MARRIE (Canada) G. K. RADDA (Grande Bretagne) 2004 M. le Professeur M. DAKE (U. S. A. ) 2005 M. le Professeur L. CAVALLI-SFORZA (U. S. A. ) 2006 M. le Professeur A. R. CASTANEDA (U. S. A. ) 2007 M. le Professeur S. KAUFMANN (Allemagne) PROFESSEURS EMERITE 2008 M. le Professeur Mme le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur LEVY Samuel JUHAN-VAGUE Irène PONCET Michel KASBARIAN Michel ROBERTOUX Pierre 2009 M. le Professeur M. le Professeur DJIANE Pierre VERVLOET Daniel 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2011 31/08/2012 2010 M. le Professeur MAGNAN Jacques 31/12/2014 2011 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2012 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2013 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2014 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2015 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur DI MARINO Vincent MARTIN Pierre METRAS Dominique AUBANIAC Jean-Manuel BOUVENOT Gilles CAMBOULIVES Jean FAVRE Roger MATTEI Jean-François OLIVER Charles VERVLOET Daniel BRANCHEREAU Alain CARAYON Pierre COZZONE Patrick DELMONT Jean HENRY Jean-François LE GUICHAOUA Marie-Roberte RUFO Marcel SEBAHOUN Gérard FUENTES Pierre GAMERRE Marc MAGALON Guy PERAGUT Jean-Claude WEILLER Pierre-Jean COULANGE Christian COURAND François FAVRE Roger MATTEI Jean-François OLIVER Charles VERVLOET Daniel 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2015 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 31/08/2016 2016 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2017 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur 2018 M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur M. le Professeur BONGRAND Pierre BOUVENOT Gilles BRUNET Christian CAU Pierre COZZONE Patrick FAVRE Roger FONTES Michel JAMMES Yves NAZARIAN Serge OLIVER Charles POITOUT Dominique SEBAHOUN Gérard VIALETTES Bernard ALESSANDRINI Pierre BOUVENOT Gilles CHAUVEL Patrick COZZONE Pierre DELMONT Jean FAVRE Roger OLIVER Charles SEBBAHOUN Gérard MARANINCHI Dominique BOUVENOT Gilles COZZONE Pierre DELMONT Jean FAVRE Roger OLIVER Charles 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2017 31/08/2019 31/08/2020 31/08/2018 31/08/2020 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2018 31/08/2021 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2019 31/08/2019 PROFESSEURS DES UNIVERSITES-PRATICIENS HOSPITALIERS CHINOT Olivier CHOSSEGROS Cyrille CLAVERIE Jean-Michel Surnombre GUEDJ Eric COLLART Frédéric COSTELLO Régis COURBIERE Blandine COWEN Didier CRAVELLO Ludovic CUISSET Thomas CURVALE Georges DA FONSECA David DAHAN-ALCARAZ Laetitia DANIEL Laurent DARMON Patrice D'ERCOLE Claude D'JOURNO Xavier DEHARO Jean-Claude DELAPORTE Emmanuel DELPERO Jean-Robert DENIS Danièle DISDIER Patrick DODDOLI Christophe DRANCOURT Michel DUBUS Jean-Christophe DUFFAUD Florence DUFOUR Henry DURAND Jean-Marc DUSSOL Bertrand EUSEBIO Alexandre FAKHRY Nicolas FAUGERE Gérard Surnombre FELICIAN Olvier FENOLLAR Florence FIGARELLA/BRANGER Dominique FLECHER Xavier AGOSTINI FERRANDES Aubert ALBANESE Jacques ALIMI Yves AMABILE Philippe AMBROSI Pierre ANDRE Nicolas ARGENSON Jean-Nol ASTOUL Philippe ATTARIAN Shahram AUDOUIN Bertrand AUQUIER Pascal AVIERINOS Jean-François AZULAY Jean-Philippe BAILLY Daniel BARLESI Fabrice BARLIER-SETTI Anne BARTHET Marc BARTOLI Christophe BARTOLI Jean-Michel BARTOLI Michel BARTOLOMEI Fabrice BASTIDE Cyrille BENSOUSSAN Laurent BERBIS Philippe BERDAH Stéphane BERLAND Yvon Surnombre BERNARD Jean-Paul BEROUD Christophe BERTUCCI François BLAISE Didier BLIN Olivier BLONDEL Benjamin BONIN/GUILLAUME Sylvie BONELLO Laurent BONNET Jean-Louis BOTTA/FRIDLUND Danielle SurnombreFOURNIER Pierre-Edouard FRANCES Yves Surnombre BOUBLI Léon BOUFI Mourad FRANCESCHI Frédéric FUENTES Stéphane BOYER Laurent GABERT Jean BREGEON Fabienne GABORIT Bénédicte BRETELLE Florence BROUQUI Philippe GAINNIER Marc GARCIA Stéphane BRUDER Nicolas GARIBOLDI Vlad BRUE Thierry GAUDART Jean BRUNET Philippe BURTEY Stéphane GAUDY-MARQUESTE Caroline GENTILE Stéphanie CARCOPINO-TUSOLI Xavier GERBEAUX Patrick CASANOVA Dominique GEROLAMI/SANTANDREA René CASTINETTI Frédéric CECCALDI Mathieu GILBERT/ALESSI Marie-Christine MONCLA Anne GIORGI Roch CHAGNAUD Christophe GIOVANNI Antoine CHAMBOST Hervé GIRARD Nadine CHAMPSAUR Pierre CHANEZ Pascal GIRAUD/CHABROL Brigitte CHARAFFE-JAUFFRET Emmanuelle GONCALVES Anthony CHARREL Rémi CHARPIN Denis Surnombre CHAUMOITRE Kathia CHIARONI Jacques GORINCOUR Guillaume GRANEL/REY Brigitte GRANVAL Philippe GREILLIER Laurent GRIMAUD Jean-Charles GROB Jean-Jacques GUIEU Régis GUIS Sandrine GUYE Maxime GUYOT Laurent GUYS Jean-Michel HABIB Gilbert HARDWIGSEN Jean HARLE Jean-Robert HOFFART Louis Disponibilité HOUVENAEGHEL Gilles JACQUIER Alexis JOURDE-CHICHE Noémie JOUVE Jean-Luc KAPLANSKI Gilles KARSENTY Gilles KERBAUL François KRAHN Martin LAFFORGUE Pierre LAGIER Jean-Christophe LAMBAUDIE Eric LANCON Christophe LA SCOLA Bernard LAUNAY Franck LAVIEILLE Jean-Pierre LE CORROLLER Thomas LECHEVALLIER Eric LEGRE Régis LEHUCHER-MICHEL Marie-Pascale LEONE Marc LEONETTI Georges LEPIDI Hubert LEVY Nicolas MACE Loïc MAGNAN Pierre-Edouard MATONTI Frédéric Disponibilité MEGE Jean-Louis MERROT Thierry METZLER/GUILLEMAIN Catherine MEYER/DUTOUR Anne MICCALEF/ROLL Jolle MICHEL Fabrice MICHEL Gérard MICHEL Justin MICHELET Pierre MILH Mathieu MOAL Valérie MORANGE Pierre-Emmanuel MOULIN Guy MOUTARDIER Vincent MUNDLER Olivier Surnombre NAUDIN Jean NICOLAS DE LAMBALLERIE Xavier NICOLLAS Richard OLIVE Daniel OUAFIK L'Houcine ROCHE Pierre-Hugues ROCH Antoine ROCHWERGER Richard ROLL Patrice ROSSI Pascal ROUDIER Jean SALAS Sébastien SAMBUC Roland Surnombre SARLES Jacques PAGANELLI Franck PANUEL Michel PAPAZIAN Laurent PAROLA Philippe PARRATTE Sébastien Disponibilité ROSSI Dominique PELISSIER-ALICOT Anne-Laure PELLETIER Jean PERRIN Jeanne PETIT Philippe PHAM Thao PIERCECCHI/MARTI Marie-DominiqueSARLES/PHILIP Nicole PIQUET Philippe PIRRO Nicolas POINSO François RACCAH Denis RANQUE Stéphane RAOULT Didier REGIS Jean REYNAUD/GAUBERT Martine REYNAUD Rachel RICHARD/LALLEMAND Marie-Aleth THIRION Xavier SARLON-BARTOLI Gabrielle SCAVARDA Didier SCHLEINITZ Nicolas SEBAG Frédéric SEITZ Jean-François SIELEZNEFF Igor SIMON Nicolas STEIN Andréas TAIEB David THOMAS Pascal THUNY Franck TREBUCHON-DA FONSECA Agnès TRIGLIA Jean-Michel TROPIANO Patrick TSIMARATOS Michel TURRINI Olivier VALERO René VAROQUAUX Arthur Damien VELLY Lionel VEY Norbert VIDAL Vincent VIENS Patrice VILLANI Patrick VITON Jean-Michel VITTON Véronique VIEHWEGER Heide Elke VIVIER Eric XERRI Luc PROFESSEUR DES UNIVERSITES ADALIAN Pascal AGHABABIAN Valérie BELIN Pascal CHABANNON Christian CHABRIERE Eric FERON François LE COZ Pierre LEVASSEUR Anthony RANJEVA Jean-Philippe SOBOL Hagay PROFESSEUR CERTIFIE BRANDENBURGER Chantal PRAG TANTI-HARDOUIN Nicolas PROFESSEUR ASSOCIE DE MEDECINE GENERALE A MI-TEMPS ADNOT Sébastien FILIPPI Simon MAITRE DE CONFERENCES DES UNIVERSITES - PRATICIEN HOSPITALIER EBBO Mikal FABRE Alexandre ACHARD Vincent (disponibilité) AHERFI Sarah ANGELAKIS Emmanouil (dispo oct 2018) FAURE Alice ATLAN Catherine (disponibilité) BARTHELEMY Pierre BEGE Thierry BELIARD Sophie BERBIS Julie BERGE-LEFRANC Jean-Louis BERTRAND Baptiste BEYER-BERJOT Laura BIRNBAUM David BONINI Francesca BOUCRAUT Joseph BOULAMERY Audrey BOULLU/CIOCCA Sandrine BUFFAT Christophe CAMILLERI Serge CARRON Romain CASSAGNE Carole CHAUDET Hervé CHRETIEN Anne-Sophie COZE Carole CUNY Thomas DADOUN Frédéric (disponibilité) DALES Jean-Philippe DAUMAS Aurélie DEGEORGES/VITTE Jolle DELLIAUX Stéphane DESPLAT/JEGO Sophie DEVILLIER Raynier DUBOURG Grégory DUFOUR Jean-Charles FOLETTI Jean- Marc FOUILLOUX Virginie FROMONOT Julien GASTALDI Marguerite GELSI/BOYER Véronique GIUSIANO Bernard GIUSIANO COURCAMBECK Sophie GONZALEZ Jean-Michel GOURIET Frédérique GRAILLON Thomas GRISOLI Dominique GUERIN Carole GUENOUN MEYSSIGNAC Daphné GUIDON Catherine HAUTIER/KRAHN Aurélie HRAIECH Sami KASPI-PEZZOLI Elise L'OLLIVIER Coralie LABIT-BOUVIER Corinne LAFAGE/POCHITALOFF-HUVALE Marina LAGIER Aude (disponibilité) LAGOUANELLE/SIMEONI Marie-Claude LEVY/MOZZICONACCI Annie LOOSVELD Marie MANCINI Julien MARY Charles MASCAUX Céline MAUES DE PAULA André MILLION Matthieu MOTTOLA GHIGO Giovanna NGUYEN PHONG Karine NINOVE Laetitia NOUGAIREDE Antoine OLLIVIER Matthieu OVAERT Caroline PAULMYER/LACROIX Odile PESENTI Sébastien RESSEGUIER Noémie REY Marc ROBERT Philippe SABATIER Renaud SARI-MINODIER Irène SAVEANU Alexandru SECQ Véronique SUCHON Pierre TABOURET Emeline TOGA Caroline TOGA Isabelle TOMASINI Pascale TOSELLO Barthélémy TROUSSE Delphine TUCHTAN-TORRENTS Lucile VELY Frédéric VION-DURY Jean ZATTARA/CANNONI Hélène MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES ABU ZAINEH Mohammad BARBACARU/PERLES T. A. BERLAND/BENHAIM Caroline BOUCAULT/GARROUSTE Françoise BOYER Sylvie COLSON Sébastien (mono-appartenants) DEGIOANNI/SALLE Anna DESNUES Benot MARANINCHI Marie MERHEJ/CHAUVEAU Vicky MINVIELLE/DEVICTOR Bénédicte POGGI Marjorie RUEL Jérôme THOLLON Lionel THIRION Sylvie VERNA Emeline MAITRE DE CONFERENCES DES UNIVERSITES DE MEDECINE GENERALE CASANOVA Ludovic GENTILE Gatan MAITRES DE CONFERENCES ASSOCIES DE MEDECINE GENERALE à MI-TEMPS BARGIER Jacques BONNET Pierre-André CALVET-MONTREDON Céline GUIDA Pierre JANCZEWSKI Aurélie MAITRE DE CONFERENCES ASSOCIE à MI-TEMPS MATHIEU Marion REVIS Joana PROFESSEURS DES UNIVERSITES et MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES - PRATICIENS HOSPITALIERS PROFESSEURS ASSOCIES, MAITRES DE CONFERENCES DES UNIVERSITES mono-appartenants ANATOMIE 4201 ANTHROPOLOGIE 20 CHAMPSAUR Pierre (PU-PH) LE CORROLLER Thomas (PU-PH) PIRRO Nicolas (PU-PH) GUENOUN-MEYSSIGNAC Daphné (MCU-PH) LAGIER Aude (MCU-PH) disponibilité THOLLON Lionel (MCF) (60ème section) ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES 4203 CHARAFE/JAUFFRET Emmanuelle (PU-PH) DANIEL Laurent (PU-PH) FIGARELLA/BRANGER Dominique (PU-PH) GARCIA Stéphane (PU-PH) XERRI Luc (PU-PH) DALES Jean-Philippe (MCU-PH) GIUSIANO COURCAMBECK Sophie (MCU PH) LABIT/BOUVIER Corinne (MCU-PH) MAUES DE PAULA André (MCU-PH) SECQ Véronique (MCU-PH) ANESTHESIOLOGIE ET REANIMATION CHIRURGICALE ; MEDECINE URGENCE 4801 ALBANESE Jacques (PU-PH) BRUDER Nicolas (PU-PH) LEONE Marc (PU-PH) MICHEL Fabrice (PU-PH) VELLY Lionel (PU-PH) GUIDON Catherine (MCU-PH) ADALIAN Pascal (PR) DEGIOANNI/SALLE Anna (MCF) VERNA Emeline (MCF) BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE ; HYGIENE HOSPITALIERE 4501 CHARREL Rémi (PU PH) DRANCOURT Michel (PU-PH) FENOLLAR Florence (PU-PH) FOURNIER Pierre-Edouard (PU-PH) NICOLAS DE LAMBALLERIE Xavier (PU-PH) LA SCOLA Bernard (PU-PH) RAOULT Didier (PU-PH) AHERFI Sarah (MCU-PH) ANGELAKIS Emmanouil (MCU-PH) disponibilité octobre 2018 DUBOURG Grégory (MCU-PH) GOURIET Frédérique (MCU-PH) NOUGAIREDE Antoine (MCU-PH) NINOVE Laetitia (MCU-PH) CHABRIERE Eric (PR) (64ème section) LEVASSEUR Anthony (PR) (64ème section) DESNUES Benoit (MCF) ( 65ème section ) MERHEJ/CHAUVEAU Vicky (MCF) (87ème section) BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE 4401 BARLIER/SETTI Anne (PU-PH) GABERT Jean (PU-PH) GUIEU Régis (PU-PH) OUAFIK L'Houcine (PU-PH) BUFFAT Christophe (MCU-PH) FROMONOT Julien (MCU-PH) MOTTOLA GHIGO Giovanna (MCU-PH) SAVEANU Alexandru (MCU-PH) BRANDENBURGER Chantal (PRCE) ROLL Patrice (PU-PH) ANGLAIS 11 BIOLOGIE CELLULAIRE 4403 GASTALDI Marguerite (MCU-PH) KASPI-PEZZOLI Elise (MCU-PH) LEVY-MOZZICONNACCI Annie (MCU-PH) BIOLOGIE ET MEDECINE DU DEVELOPPEMENT ET DE LA REPRODUCTION ; GYNECOLOGIE MEDICALE 5405 METZLER/GUILLEMAIN Catherine (PU-PH) PERRIN Jeanne (PU-PH) BIOPHYSIQUE ET MEDECINE NUCLEAIRE 4301 CARDIOLOGIE 5102 GUEDJ Eric (PU-PH) GUYE Maxime (PU-PH) MUNDLER Olivier (PU-PH) Surnombre TAIEB David (PU-PH) BELIN Pascal (PR) (69ème section) RANJEVA Jean-Philippe (PR) (69ème section) CAMMILLERI Serge (MCU-PH) VION-DURY Jean (MCU-PH) AVIERINOS Jean-François (PU-PH) BONELLO Laurent (PU PH) BONNET Jean-Louis (PU-PH) CUISSET Thomas (PU-PH) DEHARO Jean-Claude (PU-PH) FRANCESCHI Frédéric (PU-PH) HABIB Gilbert (PU-PH) PAGANELLI Franck (PU-PH) THUNY Franck (PU-PH) BARBACARU/PERLES Téodora Adriana (MCF) (69ème section) CHIRURGIE DIGESTIVE 5202 BIOSTATISTIQUES, INFORMATIQUE MEDICALE ET TECHNOLOGIES DE COMMUNICATION 4604 CLAVERIE Jean-Michel (PU-PH) Surnombre GAUDART Jean (PU-PH) GIORGI Roch (PU-PH) CHAUDET Hervé (MCU-PH) DUFOUR Jean-Charles (MCU-PH) GIUSIANO Bernard (MCU-PH) MANCINI Julien (MCU-PH) ABU ZAINEH Mohammad (MCF) (5ème section) BOYER Sylvie (MCF) (5ème section) BERDAH Stéphane (PU-PH) HARDWIGSEN Jean (PU-PH) SIELEZNEFF Igor (PU-PH) BEYER-BERJOT Laura (MCU-PH) CHIRURGIE GENERALE 5302 DELPERO Jean-Robert (PU-PH) MOUTARDIER Vincent (PU-PH) SEBAG Frédéric (PU-PH) TURRINI Olivier (PU-PH) BEGE Thierry (MCU-PH) BIRNBAUM David (MCU-PH) CHIRURGIE ORTHOPEDIQUE ET TRAUMATOLOGIQUE 5002 GUERIN Carole (MCU PH) ARGENSON Jean-Nol (PU-PH) BLONDEL Benjamin (PU-PH) CURVALE Georges (PU-PH) FLECHER Xavier (PU PH) PARRATTE Sébastien (PU-PH) Disponibilité ROCHWERGER Richard (PU-PH) TROPIANO Patrick (PU-PH) OLLIVIER Matthieu (MCU-PH) CANCEROLOGIE ; RADIOTHERAPIE 4702 BERTUCCI François (PU-PH) CHINOT Olivier (PU-PH) COWEN Didier (PU-PH) DUFFAUD Florence (PU-PH) GONCALVES Anthony PU-PH) HOUVENAEGHEL Gilles (PU-PH) LAMBAUDIE Eric (PU-PH) SALAS Sébastien (PU-PH) VIENS Patrice (PU-PH) SABATIER Renaud (MCU-PH) TABOURET Emeline (MCU-PH) CHIRURGIE INFANTILE 5402 GUYS Jean-Michel (PU-PH) JOUVE Jean-Luc (PU-PH) LAUNAY Franck (PU-PH) MERROT Thierry (PU-PH) VIEHWEGER Heide Elke (PU-PH) FAURE Alice (MCU PH) PESENTI Sébastien (MCU-PH) CHIRURGIE MAXILLO-FACIALE ET STOMATOLOGIE 5503 CHOSSEGROS Cyrille (PU-PH) GUYOT Laurent (PU-PH) FOLETTI Jean-Marc (MCU-PH) CHIRURGIE THORACIQUE ET CARDIOVASCULAIRE 5103 CHIRURGIE PLASTIQUE, RECONSTRUCTRICE ET ESTHETIQUE ; BRLOLOGIE 5004 COLLART Frédéric (PU-PH) D'JOURNO Xavier (PU-PH) DODDOLI Christophe (PU-PH) GARIBOLDI Vlad (PU-PH) MACE Loïc (PU-PH) THOMAS Pascal (PU-PH) FOUILLOUX Virginie (MCU-PH) GRISOLI Dominique (MCU-PH) TROUSSE Delphine (MCU-PH) CASANOVA Dominique (PU-PH) LEGRE Régis (PU-PH) BERTRAND Baptiste (MCU-PH) HAUTIER/KRAHN Aurélie (MCU-PH) CHIRURGIE VASCULAIRE ; MEDECINE VASCULAIRE 5104 GASTROENTEROLOGIE ; HEPATOLOGIE ; ADDICTOLOGIE 5201 ALIMI Yves (PU-PH) AMABILE Philippe (PU-PH) BARTOLI Michel (PU-PH) BOUFI Mourad (PU-PH) MAGNAN Pierre-Edouard (PU-PH) PIQUET Philippe (PU-PH) SARLON-BARTOLI Gabrielle (PU PH) HISTOLOGIE, EMBRYOLOGIE ET CYTOGENETIQUE 4202 LEPIDI Hubert (PU-PH) ACHARD Vincent (MCU-PH) disponibilité PAULMYER/LACROIX Odile (MCU-PH) DERMATOLOGIE - VENEREOLOGIE 5003 BERBIS Philippe (PU-PH) GAUDY/MARQUESTE Caroline (PU-PH) GROB Jean-Jacques (PU-PH) RICHARD/LALLEMAND Marie-Aleth (PU-PH) DUSI COLSON Sébastien (MCF) ENDOCRINOLOGIE , DIABETE ET MALADIES METABOLIQUES ; GYNECOLOGIE MEDICALE 5404 BRUE Thierry (PU-PH) CASTINETTI Frédéric (PU-PH) CUNY Thomas (MCU PH) EPIDEMIOLOGIE, ECONOMIE DE LA SANTE ET PREVENTION 4601 AUQUIER Pascal (PU-PH) BOYER Laurent (PU-PH) GENTILE Stéphanie (PU-PH) SAMBUC Roland (PU-PH) Surnombre THIRION Xavier (PU-PH) BERBIS Julie (MCU-PH) LAGOUANELLE/SIMEONI Marie-Claude (MCU-PH) RESSEGUIER Noémie (MCU-PH) MINVIELLE/DEVICTOR Bénédicte (MCF)(06ème section) TANTI-HARDOUIN Nicolas (PRAG) BARTHET Marc (PU-PH) BERNARD Jean-Paul (PU-PH) BOTTA-FRIDLUND Danielle (PU-PH) Surnombre DAHAN-ALCARAZ Laetitia (PU-PH) GEROLAMI-SANTANDREA René (PU-PH) GRANDVAL Philippe (PU-PH) GRIMAUD Jean-Charles (PU-PH) SEITZ Jean-François (PU-PH) VITTON Véronique (PU-PH) GONZALEZ Jean-Michel ( MCU-PH) GENETIQUE 4704 BEROUD Christophe (PU-PH) KRAHN Martin (PU-PH) LEVY Nicolas (PU-PH) MONCLA Anne (PU-PH) SARLES/PHILIP Nicole (PU-PH) NGYUEN Karine (MCU-PH) TOGA Caroline (MCU-PH) ZATTARA/CANNONI Hélène (MCU-PH) GYNECOLOGIE-OBSTETRIQUE ; GYNECOLOGIE MEDICALE 5403 AGOSTINI Aubert (PU-PH) BOUBLI Léon (PU-PH) BRETELLE Florence (PU-PH) CARCOPINO-TUSOLI Xavier (PU-PH) COURBIERE Blandine (PU-PH) CRAVELLO Ludovic (PU-PH) D'ERCOLE Claude (PU-PH) IMMUNOLOGIE 4703 HEMATOLOGIE ; TRANSFUSION 4701 KAPLANSKI Gilles (PU-PH) MEGE Jean-Louis (PU-PH) OLIVE Daniel (PU-PH) VIVIER Eric (PU-PH) FERON François (PR) (69ème section) BOUCRAUT Joseph (MCU-PH) CHRETIEN Anne-Sophie (MCU PH) DEGEORGES/VITTE Jolle (MCU-PH) DESPLAT/JEGO Sophie (MCU-PH) ROBERT Philippe (MCU-PH) VELY Frédéric (MCU-PH) BLAISE Didier (PU-PH) COSTELLO Régis (PU-PH) CHIARONI Jacques (PU-PH) GILBERT/ALESSI Marie-Christine (PU-PH) MORANGE Pierre-Emmanuel (PU-PH) VEY Norbert (PU-PH) DEVILLIER Raynier (MCU PH) GELSI/BOYER Véronique (MCU-PH) LAFAGE/POCHITALOFF-HUVALE Marina (MCU-PH) LOOSVELD Marie (MCU-PH) SUCHON Pierre (MCU-PH) POGGI Marjorie (MCF) (64ème section) BOUCAULT/GARROUSTE Françoise (MCF) 65ème section) MEDECINE LEGALE ET DROIT DE LA SANTE 4603 MALADIES INFECTIEUSES ; MALADIES TROPICALES 4503 BROUQUI Philippe (PU-PH) LAGIER Jean-Christophe (PU-PH) PAROLA Philippe (PU-PH) STEIN Andréas (PU-PH) MILLION Matthieu (MCU-PH) MEDECINE D'URGENCE 4805 KERBAUL François (PU-PH) MICHELET Pierre (PU-PH) BARTOLI Christophe (PU-PH) LEONETTI Georges (PU-PH) PELISSIER-ALICOT Anne-Laure (PU-PH) PIERCECCHI-MARTI Marie-Dominique (PU-PH) TUCHTAN-TORRENTS Lucile (MCU-PH) BERLAND/BENHAIM Caroline (MCF) (1ère section) MEDECINE INTERNE ; GERIATRIE ET BIOLOGIE DU VIEILLISSEMENT ; MEDECINE GENERALE ; ADDICTOLOGIE 5301 BENSOUSSAN Laurent (PU-PH) VITON Jean-Michel (PU-PH) MEDECINE PHYSIQUE ET DE READAPTATION 4905 BONIN/GUILLAUME Sylvie (PU-PH) DISDIER Patrick (PU-PH) DURAND Jean-Marc (PU-PH) FRANCES Yves (PU-PH) Surnombre GRANEL/REY Brigitte (PU-PH) HARLE Jean-Robert (PU-PH) ROSSI Pascal (PU-PH) SCHLEINITZ Nicolas (PU-PH) EBBO Mikael (MCU-PH) MEDECINE ET SANTE AU TRAVAIL 4602 LEHUCHER/MICHEL Marie-Pascale (PU-PH) BERGE-LEFRANC Jean-Louis (MCU-PH) SARI/MINODIER Irène (MCU-PH) GENTILE Gatan (MCF Méd. Gén. Temps plein) NEPHROLOGIE 5203 ADNOT Sébastien (PR associé Méd. Gén. à mi-temps) FILIPPI Simon (PR associé Méd. Gén. à mi-temps) BARGIER Jacques (MCF associé Méd. Gén. À mi-temps) BONNET Pierre-André (MCF associé Méd. Gén à mi-temps) CALVET-MONTREDON Céline (MCF associé Méd. Gén. à temps plein) GUIDA Pierre (MCF associé Méd. Gén. à mi-temps) JANCZEWSKI Aurélie (MCF associé Méd. Gén. À mi-temps) BERLAND Yvon (PU-PH) Surnombre BRUNET Philippe (PU-PH) BURTEY Stépahne (PU-PH) DUSSOL Bertrand (PU-PH) JOURDE CHICHE Noémie (PU PH) MOAL Valérie (PU-PH) NUTRITION 4404 NEUROCHIRURGIE 4902 DARMON Patrice (PU-PH) RACCAH Denis (PU-PH) VALERO René (PU-PH) ATLAN Catherine (MCU-PH) disponibilité BELIARD Sophie (MCU-PH) MARANINCHI Marie (MCF) (66ème section) ONCOLOGIE 65 (BIOLOGIE CELLULAIRE) CHABANNON Christian (PR) (66ème section) SOBOL Hagay (PR) (65ème section) DUFOUR Henry (PU-PH) FUENTES Stéphane (PU-PH) REGIS Jean (PU-PH) ROCHE Pierre-Hugues (PU-PH) SCAVARDA Didier (PU-PH) CARRON Romain (MCU PH) GRAILLON Thomas (MCU PH) NEUROLOGIE 4901 ATTARIAN Sharham (PU PH) AUDOIN Bertrand (PU-PH) AZULAY Jean-Philippe (PU-PH) CECCALDI Mathieu (PU-PH) EUSEBIO Alexandre (PU-PH) FELICIAN Olivier (PU-PH) PELLETIER Jean (PU-PH) OPHTALMOLOGIE 5502 PEDOPSYCHIATRIE ; ADDICTOLOGIE 4904 DENIS Danièle (PU-PH) HOFFART Louis (PU-PH) Disponibilité MATONTI Frédéric (PU-PH) Disponibilité OTO-RHINO-LARYNGOLOGIE 5501 DESSI Patrick (PU-PH) FAKHRY Nicolas (PU-PH) GIOVANNI Antoine (PU-PH) LAVIEILLE Jean-Pierre (PU-PH) MICHEL Justin (PU-PH) NICOLLAS Richard (PU-PH) TRIGLIA Jean-Michel (PU-PH) DEVEZE Arnaud (MCU-PH) Disponibilité REVIS Joana (MAST) (Orthophonie) (7ème Section) PARASITOLOGIE ET MYCOLOGIE 4502 RANQUE Stéphane (PU-PH) CASSAGNE Carole (MCU-PH) L'OLLIVIER Coralie (MCU-PH) MARY Charles (MCU-PH) TOGA Isabelle (MCU-PH) PEDIATRIE 5401 ANDRE Nicolas (PU-PH) CHAMBOST Hervé (PU-PH) DUBUS Jean-Christophe (PU-PH) GIRAUD/CHABROL Brigitte (PU-PH) MICHEL Gérard (PU-PH) MILH Mathieu (PU-PH) REYNAUD Rachel (PU-PH) SARLES Jacques (PU-PH) TSIMARATOS Michel (PU-PH) COZE Carole (MCU-PH) FABRE Alexandre (MCU-PH) OVAERT Caroline (MCU-PH) TOSELLO Barthélémy (MCU-PH) PSYCHIATRIE D'ADULTES ; ADDICTOLOGIE 4903 BAILLY Daniel (PU-PH) LANCON Christophe (PU-PH) NAUDIN Jean (PU-PH) PSYCHOLOGIE - PSYCHOLOGIE CLINIQUE, PCYCHOLOGIE SOCIALE 16 AGHABABIAN Valérie (PR) RADIOLOGIE ET IMAGERIE MEDICALE 4302 BARTOLI Jean-Michel (PU-PH) CHAGNAUD Christophe (PU-PH) CHAUMOITRE Kathia (PU-PH) GIRARD Nadine (PU-PH) GORINCOUR Guillaume (PU-PH) JACQUIER Alexis (PU-PH) MOULIN Guy (PU-PH) PANUEL Michel (PU-PH) PETIT Philippe (PU-PH) VAROQUAUX Arthur Damien (PU-PH) VIDAL Vincent (PU-PH) DA FONSECA David (PU-PH) POINSO François (PU-PH) PHARMACOLOGIE FONDAMENTALE - PHARMACOLOGIE CLINIQUE ; ADDICTOLOGIE 4803 BLIN Olivier (PU-PH) FAUGERE Gérard (PU-PH) Surnombre MICALLEF/ROLL Jolle (PU-PH) SIMON Nicolas (PU-PH) BOULAMERY Audrey (MCU-PH) PHILOSPHIE 17 LE COZ Pierre (PR) (17ème section) MATHIEU Marion (MAST) PHYSIOLOGIE 4402 BARTOLOMEI Fabrice (PU-PH) BREGEON Fabienne (PU-PH) GABORIT Bénédicte (PU-PH) MEYER/DUTOUR Anne (PU-PH) TREBUCHON/DA FONSECA Agnès (PU-PH) BARTHELEMY Pierre (MCU-PH) BONINI Francesca (MCU-PH) BOULLU/CIOCCA Sandrine (MCU-PH) DADOUN Frédéric (MCU-PH) (disponibilité) DELLIAUX Stéphane (MCU-PH) REY Marc (MCU-PH) RUEL Jérôme (MCF) (69ème section) THIRION Sylvie (MCF) (66ème section) PNEUMOLOGIE ; ADDICTOLOGIE 5101 ASTOUL Philippe (PU-PH) BARLESI Fabrice (PU-PH) CHANEZ Pascal (PU-PH) CHARPIN Denis (PU-PH) Surnombre GREILLIER Laurent (PU PH) REYNAUD/GAUBERT Martine (PU-PH) MASCAUX Céline (MCU-PH) TOMASINI Pascale (MCU-PH) REANIMATION MEDICALE ; MEDECINE URGENCE 4802 THERAPEUTIQUE ; MEDECINE D'URGENCE ; ADDICTOLOGIE 4804 GAINNIER Marc (PU-PH) GERBEAUX Patrick (PU-PH) PAPAZIAN Laurent (PU-PH) ROCH Antoine (PU-PH) HRAIECH Sami (MCU-PH) GUIS Sandrine (PU-PH) LAFFORGUE Pierre (PU-PH) PHAM Thao (PU-PH) ROUDIER Jean (PU-PH) AMBROSI Pierre (PU-PH) VILLANI Patrick (PU-PH) DAUMAS Aurélie (MCU-PH) RHUMATOLOGIE 5001 UROLOGIE 5204 BASTIDE Cyrille (PU-PH) KARSENTY Gilles (PU-PH) LECHEVALLIER Eric (PU-PH) ROSSI Dominique (PU-PH) Remerciements : A Monsieur le Professeur Roch Antoine, d'avoir accepté d'être le président de cette thèse et m'avoir permis de réaliser cette étude dans votre service. A Messieurs les Professeurs Berbis, Gerbeaux et Rochwerger d'avoir accepté d'être les jurés dans cette thèse. A Madame la Docteur Pilarczyk Estelle pour m'avoir encouragée et permis de réaliser mon projet de thèse. D'avoir dirigé ce projet, écouté mes incertitudes et mes moments de panique. A Isabelle et Martine pour avoir participé activement à ce projet au circuit ambulatoire. A Camille, pour tes précieux conseils, arrivant toujours à point nommés. A mes parents, pour m'avoir toujours soutenue, aidé dans mes choix avec discernement et justesse. A mon grand-frère pour tes précieux conseils et ton affection. Au duplex, pour m'avoir supportée pendant ces longs mois d'été, ces débriefs du soir en rentrant, ces footings et séances de yoga qui font que chaque journée se finit toujours bien qu'elle que soit la façon dont elle s'est déroulée. A ma bande de caca papillon, pour ces longues années d'études partagées, ces balades parisiennes et ailleurs. Je n'ai jamais aussi bien préparé un week-end qu'en conf. A Jess, Alice et Vanessa, pour cette première année que je n'aurais pas dépassée sans vous. A ma Trecya, on a passé plus de temps à se connatre qu'à ne pas se connatre ! Si t'avais fait pianiste, j'aurais peut-être fait flûtiste. Pour tous ces moments partagés et à partager. A tous les soignants qui m'ont transmis leurs connaissances, qui m'ont appris à prendre en charge les patients. 16 Table des matières Introduction . 18 A. Définitions . 18 B. Prise en charge d'une plaie aigu selon les recommandations . 19 Les complications des plaies aigus . 22 C. L'infection . 23 1. 2. La toxi-infection par le tétanos . 23 3. Dysfonction de cicatrisation . 24 D. Prise en charge des plaies au CHU Nord. . 24 E. Objectif de l'étude . 25 Matériels et méthode . 26 A. Population étudiée . 26 B. Méthode de recueil des données . 26 C. Variables étudiées . 27 D. Analyse statistique . 28 Résultats . 29 A. Diagramme de flux, nombre de patients inclus et analysés . 29 Caractéristiques de la population. . 30 B. C. Caractéristiques des plaies . 31 Prise en charge de la plaie au SAU . 33 D. Consignes de sortie . 34 E. F. Respect des consignes de sortie et évolution de la plaie . 35 G. Facteurs associés avec une complication aigu . 36 Discussion . 38 Forces et limites de l'étude . 38 A. Analyse des résultats . 39 B. Prise en charge de la plaie par les patients . 39 Caractéristiques des plaies . 39 Prise en charge de la plaie au SAU et prescriptions de sortie . 40 Complications des plaies . 42 Facteurs de risque de complication . 43 C. Perspectives . 44 Conclusion . 46 Bibliographie . 47 Annexes . 50 1. 2. 3. 4. 5. 17 Introduction La prise en charge des plaies aigus est une urgence. Selon la gravité de la plaie, elle doit être prise en charge plus ou moins rapidement par une unité mobile pré hospitalière ou adressée vers une structure hospitalière, un cabinet de médecine générale ou un centre de consultations spécialisées (1). Les plaies sont un motif fréquent de consultation aux urgences. Elles représentent environ 13% des admissions, les situant dans les premiers rangs des motifs de recours. Les plaies aigues ont fait l'objet de recommandations par la Société Française de Médecine d'Urgences (SFMU) en 2017 qui ont apporté de nouveaux éléments de prise en charge encore peu appliqués et mal connus par les professionnels de santé. A. Définitions La conférence de consensus de 2005 (2) définit les plaies comme une effraction de la barrière cutanée par un agent vulnérant, survenant par coupure, écrasement ou abrasion. Une plaie cutanée est dite superficielle quand elle est limitée à l'épiderme ou au derme (3). Lazarus et al. (4) ont défini les blessures dans un contexte aigu et chronique dans le but d'élaborer des recommandations sur leur prise en charge et leur spécificité de cicatrisation. Une plaie aigu évolue dans le temps, jusqu'à sa cicatrisation qui permet de rétablir la structure normale de la peau. Une plaie chronique est une plaie qui a échoué dans son processus de cicatrisation, son intégrité anatomique et fonctionnelle n'est pas rétablie. Figure 1 : Une plaie aigu 18 Le processus de cicatrisation normale comprend trois grandes phases qui se chevauchent : une phase vasculaire et inflammatoire, une phase de réparation tissulaire puis une phase de maturation. Le remodelage matriciel au cours de la dernière phase va permettre d'accrotre la résistance de la cicatrice jusqu'à 80-90% de sa force finale à la 6ème semaine. Il est suivi d'une phase de régression qui va durer jusqu'à deux ans. (5) B. Prise en charge d'une plaie aigu selon les recommandations La SFMU en partenariat avec la société française et francophone des plaies et cicatrisations et la société française de chirurgie plastique, reconstructrice et esthétique ont édité des recommandations en 2017 qui définissent les éléments importants de l'anamnèse, l'antalgie à l'arrivée aux urgences, l'évaluation initiale de la plaie, la prise en charge thérapeutique de la plaie et les situations particulières. Evaluation initiale de la plaie topiques peuvent être associées, ainsi que d'autres L'anamnèse doit recueillir l'heure du traumatisme, l'agent vulnérant et le statut vaccinal antitétanique. La délivrance d'analgésiques dès l'infirmier d'orientation et d'accueil (IOA) par prescription anticipée ou après avis médical est recommandée. Puis, l'anesthésie permet un lavage et une exploration confortable de la plaie. Plusieurs techniques anesthésiques, locales (AL), locorégionales (ALR), inhalées ou par techniques non médicamenteuses. La lidocaïne non adrénalinée à 1 et 2 % est la solution de référence pour l'AL ou l'ALR dans une structure d'urgences. L'évaluation initiale de la plaie s'effectue après friction hydro alcoolique des mains propres et éléments de protection individuels non nécessairement stériles. Il est possible de couper les cheveux si nécessaire, mais le rasage n'est pas indiqué (6). Les poils peuvent être écartés avec un lubrifiant de type vaseline. 19 Un lavage abondant permet de débarrasser la plaie des corps étrangers, du sang coagulé, des tissus nécrosés non adhérents afin de créer des conditions optimales à la cicatrisation de la plaie et limiter ainsi au maximum le risque infectieux (7). Il est réalisé à pression constante et contrôlée. Il n'y a pas de différence entre l'eau du robinet et le sérum salé isotonique. Entre chaque étape de la prise en charge, la plaie doit être maintenue en milieu humide avec une compresse imbibée d'eau. La plaie doit ensuite être explorée et faire l'objet d'un parage si nécessaire. Il consiste en l'excision économique et la plus complète possible des tissus contus, morts ou voués à la nécrose ainsi qu'à l'évacuation des corps étrangers. Il fait partie du processus de cicatrisation. La place des antiseptiques et des antibiotiques Face à une plaie franche vue précocement, les antiseptiques n'ont pas montré de bénéfice. Néanmoins, l'usage des antiseptiques reste recommandé sur les plaies à risque infectieux élevé et sur accord médical au-delà des 24h. On différencie l'antisepsie de l'asepsie de la peau saine avant un geste invasif pour laquelle les antiseptiques restent recommandés. Il n'existe aucune indication à l'antibiothérapie locale dans les plaies. L'antibiothérapie est systématique pour les plaies résultantes d'une morsure. Ses modalités sont décrites dans l'annexe 1. Dans les autres cas, elle n'est pas systématique et est envisagée dans les situations suivantes : - Signes cliniques d'infection régionale ou systémique. - Prise en charge tardive (au-delà de 24h) Inoculum bactérien important ou profond - - Difficulté d'accès à un lavage efficace : orifice d'entrée de petite taille, mécanisme vulnérant profond, trajet projectilaire, injection avec ou sans pression - Localisation particulière - Terrain à risque - Parage non satisfaisant 20 Indications, contre-indications et alternatives à la suture La fermeture d'une plaie que ce soit par suture ou une autre technique a un but anti-infectieux, fonctionnel et esthétique (8). Il n'existe pas de délai standardisé au-delà duquel une plaie simple ne peut être fermée en cicatrisation de première intention. La suture cutanée s'adresse aux plaies qui ont franchi le derme. La règle est la suture en deux plans. Un plan dermique à points inversés sous-cutanés résorbables, complété par des points cutanés simples, des sutures adhésives, de la colle, ou un surjet intra-dermique. Figure 2 : Point cutané superficiel Certaines plaies n'ont pas de bénéfice à être suturées, telles que les abrasions, les lacérations ou les déchirures cutanées. Les plaies très contaminées, les plaies infectées ou les plaies pour lesquelles un lavage correct n'a pas été possible ne doivent pas être suturées. Pour celles-ci, une fermeture immédiate majore le risque d'infection (9). Enfin, les morsures ne doivent pas faire l'objet d'une suture sauf dans certains cas particuliers. En dehors de la suture, il existe d'autres techniques de fermeture d'une plaie. Les agrafes peuvent être utilisées, en dehors de la face, des mains, des pieds ou du cou. Cette technique réduit le temps de prise en charge. La colle cutanée est indiquée uniquement pour les plaies cutanées, franches, mineures, peu profondes et non souillées. La suture cutanée adhésive stérile est limitée à des zones de faible tension sur des plaies superficielles linéaires ou après une suture. Elle expose à un risque de désunion. 21 Particularités de prise en charge selon la localisation Certaines plaies, du fait de leur localisation particulière doivent faire appel à un spécialiste. Les plaies de la main avec rupture du derme (visualisation des structures sous-jacentes) doivent être explorées avec attention et bénéficier d'un avis spécialisé dans les meilleurs délais. Les plaies des organes génitaux externes délabrantes, étendues, pénétrantes, ou avec une suspicion d'atteinte d'éléments nobles sous-jacents (corps caverneux, voies urinaires, éléments vasculaires ou nerveux) doivent être adressées à un urologue idéalement ou un chirurgien viscéral. Les plaies du pelvis et du périnée résultant d'une cinétique importante doivent être prises en charge dans une structure spécialisée. En pratique, toute plaie atteignant les structures sous- jacentes fera l'objet d'un avis spécialisé. Consignes de sorties A la sortie du SAU, les plaies nécessitent un lavage simple et quotidien à l'eau puis une protection par un pansement adhésif stérile avec compresse intégrée. Il n'y a pas d'indication à la prescription d'antiseptique. Les plaies majeures, notamment à risque infectieux, doivent être revues à 48 -72 h. Des consignes sont à remettre au patient concernant les signes d'infection nécessitant une consultation. Quelle que soit la méthode employée, le délai avant retrait des points de suture ou agrafes est fonction de la localisation et des contraintes fonctionnelles. Il est détaillé dans le tableau en annexe 2. Une alternative consiste à pratiquer un retrait des points de suture ou agrafes plus précoce avec un relai par des sutures cutanées adhésives stériles. C. Les complications des plaies aigus Un certain nombre de facteurs favorisent ces complications. On peut les diviser en deux groupes : les facteurs liés au patient et les facteurs liés à la plaie. Ces facteurs seront abordés de façon plus approfondie dans la discussion et détaillés dans l'annexe 3. 22 1. L'infection fait d'une plaie, L'exposition des tissus sous cutanés du fournit un environnement chaud, humide et nutritif qui conduit à la colonisation et prolifération microbienne (10). Il y a entre 2 et 5% de risque d'infection d'une plaie aigu prise en charge aux urgences (11). L'infection en pratique chirurgicale se définit comme la conséquence physiopathologique du développement d'un micro-organisme dans les tissus d'un patient. La présence d'un micro-organisme dans une plaie peut être responsable d'une contamination, d'une colonisation ou d'une infection. En cas de contamination, le nombre de bactéries n'augmente pas et n'entrane pas de problème clinique. En cas de colonisation, les bactéries se multiplient mais les tissus ne sont pas endommagés. En cas d'infection clinique, les bactéries se multiplient, la cicatrisation est interrompue et les tissus de la plaie sont endommagés. (12) Elle est le résultat d'un déséquilibre entre les mécanismes de défense de l'hôte et l'augmentation de l'inoculum bactérien (13). Cliniquement, une infection locale de la plaie se traduit par des signes d'inflammation : douleur, chaleur, tuméfaction et érythème. 2. La toxi-infection par le tétanos Le tétanos est une toxi-infection aigu grave, non contagieuse, due à une neuro- toxine produite par un bacille anaérobie à Gram positif le Clostridium tetani. Cette bactérie est ubiquitaire, commensale du tube digestif des animaux. Elle persiste dans les déjections animales et dans le sol sous forme sporulée et est extrêmement résistante (14). L'infection causée par la bactérie elle-même reste strictement localisée. Après une période d'incubation de quatre à vingt et un jours, la tétanosplasmine, endotoxine neurotrope, empêche la synchronisation des groupes musculaires agonistes et antagonistes entranant un trismus, une rigidité musculaire et des manifestations dysautonomiques. Les effets de la toxine tétanique s'épuisent d'eux même et sont entièrement réversibles (15). La toxi-infection par le tétanos est actuellement très rare en France, les cas résiduels (8 cas en 2009) affectent le plus souvent des personnes âgées non à jour de leur vaccination. (16) 23 3. Dysfonction de cicatrisation La survenue d'un dysfonctionnement au cours du processus de cicatrisation aboutit, soit à un retard de cicatrisation pouvant être responsable d'une plaie chronique, soit à une cicatrisation pathologique (cicatrisation excessive, cicatrice rétractile) (5). Les étiologies des retards à la cicatrisation sont nombreuses liées à des facteurs locaux ou généraux. La cicatrisation excessive s'exprime par une cicatrice hypertrophique et parfois une chéloïde. Les chéloïdes sont des pseudotumeurs cutanées intradermiques fibreuses exubérantes avec des extensions en pattes de crabe . Elles présentent d'abord l'aspect de cicatrices hypertrophiques mais elles continuent d'évoluer après le 6e mois. Les chéloïdes sont plus fréquentes dans la population à peau noire (5). Les cicatrices hypertrophiques sont limitées à la zone traumatisée, ne présentent pas d'extension et ont tendance à la régression spontanée. Le traitement par compression mécanique des cicatrices hypertrophiques pourrait interagir avec la phase de maturation de la cicatrisation pendant laquelle les tissus se raréfient en fibroblastes par apoptose et que la structure collagénique se densifie. Les rétractions excessives sont souvent le résultat d'une plaie mal orientée par rapport aux lignes de tractions physiologique de la région. D. Prise en charge des plaies au CHU Nord. Les plaies ont représenté 7, 97 % des motifs d'admissions principaux (36 463 consultations) aux urgences en région PACA en 2017 (17). Elles sont localisées principalement à la tête, au membre supérieur et au membre inférieur. Les patients consultent moins à l'hôpital Nord pour un motif relevant de la traumatologie (29, 9% en 2017) que dans le reste de la région PACA (35% en 2017). Le temps d'accès moyen aux urgences à Marseille est de 3 à 9 minutes. De mai à octobre, le nombre moyen de passages par jour aux urgences de l'hôpital Nord dépasse la moyenne annuelle de 141 passages par jour (en 2017) 24 E. Objectif de l'étude Il existe peu de travaux concernant l'évaluation des sutures et leur évolution aux urgences. Les facteurs de risque de complications des plaies sont bien connus mais l'attitude des patients face à leur plaie n'a pas été étudiée. Bien qu'il s'agisse d'un événement la plupart du temps bénin, la mauvaise prise en charge d'une suture peut avoir des conséquences sur la cicatrisation et l'apparition de complications. L'objectif principal de cette étude était de décrire les caractéristiques des patients consultant pour une plaie, la prise en charge de leur plaie en amont et aux urgences ainsi que l'évolution de cette plaie. L'objectif secondaire était d'étudier les facteurs influençant la cicatrisation dans notre centre. 25 Matériels et méthode : Il s'agit d'une étude prospective, observationnelle de cohorte, monocentrique, réalisée dans le service d'accueil des urgences de l'Hôpital Nord à Marseille A. Population étudiée Les patients qui se sont présentés entre le 13 mars 2019 et le 5 août 2019 au circuit ambulatoire des urgences de l'hôpital Nord ayant comme motif de consultation principal une plaie aigu suturable ont été inclus, de jour et en semaine, de façon consécutive. Les patients exclus sont ceux qui avaient moins de 18 ans, et ceux porteurs d'une plaie non suturée. Ainsi les patients porteurs d'une plaie chronique, d'une plaie aigu nécessitant de la cicatrisation dirigée seule ou d'une brûlure n'ont pas été inclus dans l'étude. B. Méthode de recueil des données Tous les patients consultant aux urgences de l'hôpital Nord sont accueillis par un infirmier d'accueil et d'orientation (IAO). Selon le motif de consultation et la gravité du patient celui-ci oriente le patient vers le circuit ambulatoire, le circuit long ou la SAUV. Lorsque le motif de consultation principal est une suture, les patients sont pris en charge au circuit ambulatoire. La suture se fait dans un box dédié. Il en existe deux : un au circuit ambulatoire, l'autre au circuit long. En général, les plaies sont désinfectées par l'infirmière qui réalise une première évaluation puis elles sont suturées par l'interne, le sénior ou par l'étudiant sous délégation supervisée selon la disponibilité ou la difficulté de la suture. Une fois la plaie suturée, les consignes et les prescriptions de sorties standardisées sont remises au patient. Il existe des ordonnances types pour l'ablation des points, les soins de la plaie, les soins par un ou une infirmière (IDE) diplômée d'état, rédigées à partir du logiciel terminal urgences (TU) et détaillées dans l'annexe 3 et 4. En cas de doute ou de vaccination anti tétanique non à jour, les patients sont systématiquement revaccinés. Le médecin ou un 26 étudiant en médecine rempli par ailleurs le dossier médical informatisé dans le logiciel Axigate. Les données utiles à l'étude sont obtenues prospectivement à partir d'un questionnaire, détaillé dans l'annexe 5 et d'un appel téléphonique. Elles sont complétées rétrospectivement avec les données recueillies dans le logiciel Axigate et le logiciel TU. A la fin de la période de cicatrisation, entre 15 jours et 45 jours après la suture, nous avons rappelé les patients afin de connatre le respect des consignes de sortie et l'évolution de la plaie. C. Variables étudiées Nous avons recueilli les facteurs de risque de complication des patients en lien avec leur mode de vie et leurs antécédents selon les facteurs de risque de complications des plaies retrouvés dans la littérature. Nous avons donc choisi les variables suivantes : âge, alcool, tabac, crack ou cocaïne, diabète, VIH, cancer, traitement anti- inflammatoire, traitement immunosuppresseur. Nous avons également recueilli les informations relatives au mode de survenue de la plaie : agent responsable, localisation, prise en charge avant l'arrivée aux urgences, délai avant la suture. Ensuite, nous avons recueilli les informations relatives à la prise en charge aux urgences : délai de prise en charge aux urgences, désinfection, anesthésie locale, suture (nombre de points, fil), la réalisation d'un parage, demande d'avis chirurgical. Nous avons également recueilli les informations relatives aux soins à réaliser à domicile : prescription d'antiseptique, de vaseline, d'un suivi par une IDE. Afin de se rendre compte de l'évolution de la plaie, nous avons recueilli les informations relatives au respect des consignes de sorties concernant la désinfection, la protection par un pansement, l'application de vaseline, les risques de souillure de la plaie, l'ablation réelle des points. Nous avons également recherché la survenue d'une complication à savoir la présence d'une infection évaluée par la reconsultation d'un professionnel de santé, d'une désunion de cicatrice, d'un retard de cicatrisation recherché par un délai d'ablation des points augmenté par rapport à la date prévue à la demande de l'IDE. Si ce délai était différent de celui préconisé, nous leur avons demandé le motif de cette différence de délai. 27 D. Analyse statistique Une analyse descriptive de l'ensemble des données récoltées a été réalisée, à la fois des caractéristiques initiales des patients et de la plaie jusqu'à la sortie des urgences, puis de l'évolution de la plaie. Une analyse comparative de la variable complication avec les autres variables a été réalisée. Des tests de comparaison de variables ont été utilisés avec une analyse univariée. Pour les variables qualitatives, lorsque les conditions d'application du test du Chi2 n'étaient pas respectées, un test exact de Fisher a été réalisé. Pour les variables quantitatives, les effectifs comparés étant faibles, un test non paramétrique a été réalisé (test de Mann-Whitney). Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs lorsque p < 0, 05. Ces tests ont été réalisés à l'aide d'Excel et d'un logiciel statistique en ligne. Toutes les données ont été anonymisées pour l'analyse. Afin de s'assurer du respect des patients et de l'éthique médicale, nous avons demandé son accord au service du portail d'accès aux données de santé de l'Assistance Publique des Hôpitaux de Marseille dont le numéro de déclaration est PADS 2019-66. Le critère de jugement principal concerne la description de la prise en charge des sutures à l'hôpital Nord et de leur évolution. Le critère de jugement secondaire vise à rechercher un lien entre l'apparition d'une complication et les facteurs influençant la cicatrisation. 28 Résultats A. Diagramme de flux, nombre de patients inclus et analysés 416 patients ont consulté aux urgences de l'hôpital Nord pendant nos horaires d'inclusion pour une plaie entre le 13 mars 2019 et le 5 aout 2019, et 106 patients ont finalement été inclus. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au suivi des patients. Parmi ces 106 patients inclus seuls 71 ont répondu à l'appel permettant d'évaluer l'évolution de la plaie et le respect des consignes de sortie. Patients éligibles n 416 Patients inclus n 106 Suivi téléphonique n 71 Perdus de vue n 35 Figure 3 : Diagramme de flux d'inclusion des patients 29 B. Caractéristiques de la population. L'âge moyen des patients inclus était de 41 ans avec un écart type de 16, 4. Ils étaient âgés de plus de 65 ans dans 8, 5% des cas. Les patients étaient majoritairement de sexe masculin, seul 21, 7% sont des femmes. (tableau 1). Les patients suturés pour une plaie aigu aux urgences étaient tabagiques actifs à 45, 3%, consommateurs d'alcool quotidien à 11, 3%. Ils avaient un travail dans 71, 7% des cas et la couverture vaccinale contre le tétanos n'était pas à jour pour 38, 9% des patients. Sexe masculin, % (n) Age moyen, années (écart-type) Age supérieur à 65 ans, % (n) Tabac, % (n) Tabac actif Tabac sevré Pas de tabac NC Alcool, % (n) Alcool quotidien . Alcool occasionnel . Pas d'alcool . NC Crack ou cocaïne, % (n) Travail actif, % (n) Diabète, % (n) VIH, % (n) Médicament à risque, % (n) Vaccination anti-tétanique non à jour, % (n) Total (n 106) 78, 3 (83) 41 (16, 4) 8, 5 (9) 45, 3 (48) 7, 5 (8) 45, 3 (48) 1, 8 (2) 11, 3 (12) 38, 7 (41) 47, 2 (50) 2, 8 (3) 1, 9 (2) 71, 7 (76) 3, 8 (4) 0 (0) 0 (0) 38, 7 (41) Tableau 1 : caractéristiques de la population NC non connu ; VIH Virus de l'immunodéficience humain ; Médicaments à risque : anti-inflammatoire, chimiothérapies, immunomodulateurs ou immunosuppresseurs 30 C. Caractéristiques des plaies Concernant les caractéristiques des plaies, la majorité était localisée au niveau des extrémités, soit 51. 9%. Elles survenaient au niveau des membres supérieurs dans 12, 3% et des membres inférieurs dans 14, 2% des cas, au niveau du visage dans 13, 2% des cas, au niveau du scalp dans 7, 5% des cas. Une plaie est survenue au niveau du thorax. Dans le sous-groupe des plaies localisées au niveau des extrémités (N 55), 89, 1% étaient au niveau des poignets et des mains et 10, 9% au niveau des chevilles et pieds. Figure 2 : Localisation des plaies (N 106) 7, 5% 13, 2% 0, 9% 26, 4% 51, 9% Extrémités Membres Tronc Face Scalp 31 Une lame en métal, que ce soit un couteau ou un outil de travail était responsable de la plaie dans 43, 4% des cas, du verre dans 20, 8% des cas (figure 3). Figure 3 : Agent responsable de la plaie Agent responsable de la plaie (%) 9, 4% 7, 5% 43, 4% 10, 4% 3, 8% 4, 7% 20, 8% Lame en métal Verre Céramique Plastique Pierre / Béton Ecrasement NC La taille des plaies est assez variable entre 5 et 130 mm sur la population étudiée avec une moyenne de 33, 6 mm. (tableau 2). Les plaies sont profondes dans 8, 5% des cas et sales dans 5, 7% des cas. Dans 56, 6% des cas, les patients ont nettoyé la plaie immédiatement. Dans 20, 8% des cas, les patients n'ont rien réalisé avant la prise en charge aux urgences. Dans 33% des cas, les plaies surviennent dans le cadre de l'activité professionnelle. 32 N 94 104 106 106 106 106 106 106 106 106 106 106 106 106 106 106 (23) (3, 3) (79) (6) (8) (13) (9) (5) (6) (6) (4) (0) (60) (57) (22) (35) 33, 6 4, 7 74, 5 5, 7 7, 5 12, 3 8, 5 4, 7 5, 7 5, 7 3, 8 0 56, 6 53, 8 20, 8 33 Taille de la plaie en mm, moyenne (écart-type) Nombre de point, moyenne (écart type) Forme de la plaie, % (nombre) Droite Irrégulière En V NC Plaie profonde, % (nombre) Atteinte des structures sous-jacentes, % (nombre) Plaie souillée ou sale, % (nombre) Berges délabrées, % (nombre) Perte de substance empêchant la suture, % (nombre) Peau sous-jacente pathologique, % (nombre) Nettoyage immédiat lors de l'effraction, % (nombre) Protection de la plaie par un pansement lors de l'effraction, % (nombre) Aucune PEC lors de l'effraction, % (nombre) Survenue au travail, % (nombre) Tableau 2 : Caractéristiques de la plaie D. Prise en charge de la plaie au SAU Le lavage et la désinfection des plaies à l'arrivée au SAU ont été réalisés dans 99% des cas avec de la bétadine en quatre temps. Dans 62, 3% des cas, les plaies nécessitaient entre 2 et 5 points épidermiques. Une anesthésie locale a été réalisée chez 91, 5% des patients. Les 8, 5% des patients n'ayant pas bénéficié d'une anesthésie locale avaient une plaie inférieure ou égale à 30 mm. Un parage a été réalisé pour 4, 7% des plaies. Un avis chirurgical a été demandé pour 4, 7% des plaies. (tableau 3). 33 Désinfection : bétadine 4 temps / bétadine dermique Désinfection : chlorexidine Anesthésie SC : berges de la plaie Parage réalisé Avis chirurgical demandé Tableau 3 : prise en charge des plaies au SAU SC sous cutané % 99 0, 9 91, 5 4, 7 4, 7 n 105 1 97 5 5 E. Consignes de sortie Les ordonnances de sortie des patients étaient composées de pansements dans 72, 6% des cas et de biseptine dans 96, 2% des cas. Un suivi par une infirmière a été prescrit dans 18, 9% des cas. Un arrêt de travail a été prescrit dans 10, 4% des cas. Aucun suivi spécialisé de la plaie n'a été proposé. Une antibioprophylaxie a été prescrite dans 9, 4% des cas. Pour ces 10 patients, les motifs de prescription étaient variés : deux l'ont eu devant une suspicion de fracture des os propres du nez, deux car la plaie était profonde, une a été initiée avant la consultation au SAU par le médecin traitant devant le délai de prise en charge > 24h, une car le patient était diabétique, cinq car la plaie était sale avant l'arrivée au SAU ou avait eu lieu au travail dans des circonstances à risque infectieux (Tableau 4). Pansement, % (nombre) Biseptine, % (nombre) Eau, % (nombre) Vaseline, % (nombre) Suivi IDE, % (nombre) Arrêt de travail, % (nombre) Antibiothérapie initiale, % (nombre) Mauvaise compréhension des consignes de sortie, % (nombre) % 72, 6 96, 2 43, 4 82, 1 18, 9 10, 4 9, 4 0, 9 n 77 102 46 87 20 11 10 1 Tableau 4 : consignes de sortie (N 106) 34 F. Respect des consignes de sortie et évolution de la plaie Le respect des consignes de sortie et l'évaluation de la plaie ont été étudiés dans le sous-groupe soumis au rappel (N 71). Le nettoyage des plaies est réalisé par les patients ou un(e) IDE dans 100% des cas. L'application de vaseline est réalisée dans 89% des cas. La plaie est protégée par un pansement dans 71% des cas. Les patients respectent strictement le délai d'ablation des points dans 54, 9% des cas. Ils rencontrent une situation à risque de salir la plaie dans 7% des cas. (Tableau 5) Nettoyage de la plaie (bispetine ou eau) Vaseline Protection de la plaie par un pansement Non respect du délai d'ablation des points Délai supérieur Délai inférieur Situations à risque rencontrée 1 % 100 88, 7 71, 8 45, 1 32, 4 12, 7 7, 0 N 71 63 51 32 23 9 5 Tableau 5 : Respect des consignes de sortie (N 71) 1 Plaie laissée humide, plaie souillée par des matières végétales ou autre. Le taux global de complication, c'est-à-dire l'apparition d'au moins une complication parmi l'infection, la désunion et le retard de cicatrisation est de 15, 5%. Un retard de cicatrisation apparat dans 12, 7% des cas. Une infection ou une désunion dans 2, 8% des cas. 9, 9% des cicatrices restent indurées dans les premiers temps de la cicatrisation, l'évaluation des patients est faite entre 15 jours à 2 mois après la suture. (Tableau 6) 35 Infection Désunion Retard de cicatrisation Nécrose Cicatrice indurée Hématome sous cutané Consultation d'un médecin1 Soins complémentaires après ablation des points nécessaire % 2, 8 2, 8 12, 7 0 9, 9 1, 4 5, 7 8, 5 N 2 2 9 0 7 1 4 6 Tableau 6 : Détail des complications chez les patients ayant présenté au moins une complication aigu (N 71) 1 Consultation par le patient d'un médecin, quelque soit sa spécialité, avec pour motif principal la plaie aigue suturée. G. Facteurs associés avec une complication aigu Dans le sous-groupe des patients avec suivi (N 71), le nombre de points était significativement associé à la survenue d'une complication (p 0, 027). L'absence de prise en charge par le patient lors de l'effraction était significativement associée à la survenue d'une complication (p 0, 034). La localisation était significativement associée à la survenue d'une complication (p 0, 031). Une plaie souillée ou salie pendant la phase de cicatrisation était significativement associée à la survenue d'une complication (p 0, 024). La profondeur de la plaie était significativement associée à la survenue d'une complication (p 0, 044). Les résultats non significatifs sont présentés en annexe 36 Nombre de points épidermique, moyenne (écart-type) Aucune PEC lors de l'effraction, % (n) Localisation : cheville et pied, % (n) Plaie profonde, % (n) Situations à risque rencontrée, % (n) Pas de complication (N 60) 4. 00 (2. 51) Complication (N 11) 5. 18 (1. 89) p 0. 027 test 1 15 (9) 45 (5) 0. 034 60 (100) 5 (3) 3. 3 (2) 3 (27) 27 (3) 27 (3) 0. 044 0. 024 3 3 3 3 Tableau 7 : analyse univariée de dépendance des variables complications avec les différentes variables de l'étude Test de Mann Whitney 1 Test de chi 2 2 Test de Fischer 3 Figure 4 : Plaie profonde et plaie superficielle 37 Discussion A. Forces et limites de l'étude Nombre de patients inclus et mode de recueil des données Parmi les patients consultant aux urgences de l'hôpital Nord pour une plaie durant la période, 25, 5% ont été inclus. Nous avions choisi d'inclure 100 patients en jours ouvrables, nous nous sommes donc arrêtés à 106 patients. Parmi les patients inclus 67% ont pu être contacté pour s'enquérir d'évolution de leur plaie. Les difficultés d'inclusion des patients sont inhérentes au fonctionnement des urgences. Le taux moyen de passage par jour aux urgences de l'hôpital Nord est de 146 (17). En journée, avec une équipe informée de l'étude, il a été possible de recueillir les données auprès des patients, notamment grâce aux infirmières du circuit ambulatoire. Bien que les patients aient été informés de l'étude, certains n'ont pas répondu après 3 appels, ou le numéro de téléphone donné n'était pas attribué. Tout ceci donne des résultats de faible puissance. Les données sont recueillies de manière prospective, ce qui représente l'un des points forts de la méthodologie de cette étude. Les données recueillies par téléphone, notamment concernant les complications sont sujettes à un biais de recueil important. Ces complications ont été évaluées d'après les propos des patients. Même si les questions posées étaient standardisées et protocolisées, il a pu exister une mauvaise compréhension des questions posées au téléphone ou une mauvaise interprétation des complications. Sélection des patients inclus et représentativité de l'échantillon étudié Il existe un biais de sélection des patients, lié au mode de questionnement des patients. En effet, seuls les patients susceptibles de répondre à un appel et au questionnaire ont été inclus. Ce mode de sélection n'est pas représentatif de l'ensemble de la population et exclu les patients les plus à risque, ceux avec des difficultés de communication, les migrants, les personnes âgées, les patients porteurs de maladie psychiatrique. 38 De plus, cette étude est unicentrique. Il n'existe pas de données concernant les caractéristiques de la population se présentant au circuit ambulatoire des urgences de l'Hôpital Nord pour une plaie. L'étude de comparaison de la population de l'échantillon a été réalisée avec la population consultant aux urgences de l'Hôpital Nord en général. La population de l'échantillon est significativement différente de la population consultant aux urgences de l'hôpital Nord. B. Analyse des résultats Toutes les données incluses ont été analysées. Les données pour lesquelles les informations étaient manquantes ont été considérées comme négatives lorsque la variable était binaire ou comme non connue lorsque la variable était continue. 1. Prise en charge de la plaie par les patients Les patients semblent être mal informés de la conduite à tenir en cas de plaie. Seulement 57% des patients interrogés ont nettoyé la plaie immédiatement. Or, il est recommandé de nettoyer la plaie à l'eau et au savon dès que possible. Cela permet de laver l'inoculum bactérien et de réduire le risque d'infection. D'autant que les patients n'ayant réalisé aucune prise en charge de leur plaie avant l'arrivée aux urgences présenteront plus de complications (p 0, 034). Les patients sont sensibles aux consignes de sortie qui leur sont expliquées, 100% d'entre eux nettoient la plaie quotidiennement. Toutefois, 7% se retrouvent dans une situation o leur plaie est salie. Cette situation les expose à plus de complication (p 0, 024). 2. Caractéristiques des plaies Dans cette étude, les plaies surviennent au niveau des extrémités dans 51, 9% des cas, 5, 7% sont sales à l'arrivée aux urgences, 4, 7% bénéficieront d'un parage. Elles sont en moyenne de petite taille : 29, 8 mm avec un nombre de point moyen de 4, 7 points. Pour les patients ayant des plaies multiples, nous n'avons pris en compte dans l'analyse que la plaie la plus grande. 39 L'analyse univariée de ces variables avec la variable complication met en évidence un lien pour les plaies profondes, la localisation au niveau de la cheville et du pied et le nombre de point épidermique. Plusieurs études ont évalué le risque d'infection des plaies selon les caractéristiques de la plaie. Les plaies avec un mécanisme d'écrasement, du fait d'une diminution du flux sanguin présentent une plus grande susceptibilité aux infections. (18). Les plaies localisées au niveau du tronc et du cou sont moins susceptibles de s'infecter que les plaies localisées au niveau des extrémités, notamment au niveau des extrémités du membre inférieur pour lesquelles le taux d'infection peut atteindre 7, 8% des plaies (11). Le risque d'infection augmente avec la taille de plaie, pour les plaies de plus de 5cm, le risque d'infection est 2, 9 fois plus important. (11) . Enfin, la contamination et la nécessité d'un parage sont associées à un risque augmenté d'infection (11). A l'inverse, il n'y a pas de lien entre la suture d'une plaie après 12h et le risque d'infection de la plaie, même si pendant longtemps un délai variable de 3 à 24h était défini comme délai limite de fermeture d'une plaie selon la localisation et le degré de contamination. (19). On peut supposer que le lien mis en évidence entre le risque de complication et le nombre de point moyen est lié au fait que plus la plaie est grande plus le nombre de point moyen est élevé. Une étude avec un nombre plus élevé de patients aurait pu mettre en évidence ces facteurs de risque. 3. Prise en charge de la plaie au SAU et prescriptions de sortie A l'appel, les patients interrogés étaient satisfaits de la prise en charge. Bien qu'il n'y ait pas eu de question spécifique à ce sujet, plusieurs patients ont spontanément félicité l'étudiant ayant réalisé la suture ou encore l'accueil aux urgences. De plus, la plupart étaient satisfait de l'appel concernant l'évolution de leur plaie. Nos pratiques en matière de prise en charge des plaies aigus aux urgences dérivent des études menées sur les modèles animaux et sur une extrapolation des pratiques en post-opératoire (8). La désinfection des plaies aux urgences est encore faite avec de la bétadine (99, 1% des plaies). Or les dernières recommandations préconisent un lavage abondant à l'eau à pression constante et contrôlé. 40 Les antiseptiques gardent encore leur place pour les plaies à risque infectieux élevé ou au-delà de 24h. Ils ont un large spectre d'action sur toutes les formes végétatives des micro-organismes incluant les spores et sont toxiques pour de nombreux composants des bactéries. Or les bactéries jouent un rôle essentiel dans le contrôle de l'infection d'une plaie (20). De plus, la chlorexidine et la bétadine sont responsables de douleurs et d'irritation des tissus. Elles sont responsables d'eczéma et de dermite de contact. (21, 22). Malgré ces effets néfastes, les antiseptiques utilisés dans certaines circonstances et aux bonnes concentrations permettent de mener la cicatrisation dans la bonne direction. Une question spécifique concernant le lavage à l'eau aurait pu être posée pour évaluer la place du lavage à l'eau en plus de la désinfection à la bétadine dans les pratiques. Il est difficile d'évaluer si la technique du lavage n'est pas encore rentrée dans les pratiques ou si la désinfection à la bétadine n'a pas encore été abandonnée. Les anesthésiques locaux ne sont pas associés à un moins grand nombre de complication des plaies dans notre étude. Toutefois, de récentes études ont démontré que les anesthésiques locaux ont un large spectre antimicrobien sans que le mécanisme n'ait été bien identifié. Kesici et al. ont réalisé une étude comparative des diamètres des zones d'inhibition des anesthésiques locaux avec un groupe contrôle sans anesthésique locaux vis-à-vis de différentes bactéries (S. aureus, P. aeruginosa, E. Coli). Dans cette étude, le diamètre de la zone d'inhibition des anesthésiques locaux testés est plus grand que celui du groupe contrôle (sérum salé) devant S. aureus, P. aeruginosa et E. Coli. Les plaies doivent être lavées quotidiennement à l'eau, or 96, 2% des ordonnances de sortie contiennent de la biseptine. Les antiseptiques gardent leur place en cas de plaie vue à plus de 24h du traumatisme ou à risque infectieux élevé. Cette sur prescription d'antiseptique peut être liée à la méconnaissance de cette nouvelle recommandation, mais aussi à la peur du médecin que la plaie, une fois suturée ne s'infecte ; même si les études réalisées montrent qu'il n'y a pas de bénéfice à l'utilisation des antiseptiques par rapport à l'eau pour le nettoyage des plaies (20). Par ailleurs, les ordonnances de pansements ont été refaites juste avant notre étude. 41 4. Complications des plaies Le taux de complication après suture est de 15, 5%, il prend en compte les infections, le retard de cicatrisation et la désunion. Il s'agit de complications modérées, n'ayant pas conduit à une hospitalisation, une chirurgie ou encore un décès. Une infection de plaie est survenue chez 2, 8% des patients. Si un professionnel de santé avait expliqué au patient que sa plaie était infectée, il a été considéré comme tel dans les résultats. Ce risque est probablement surévalué puisqu'aucun d'eux ne s'est vu prescrire d'antibiothérapie après la prise en charge initiale. Par ailleurs, le taux d'infection faible peut être lié à une prescription adaptée d'antibiothérapie chez les 9, 4% des patients qui ont bénéficié d'une antibiothérapie à la sortie des urgences. Les motifs de prescription d'une antibioprophylaxie étaient larges et probablement excessifs. Le retard de cicatrisation est la complication la plus fréquente retrouvée dans cette étude avec 12, 1% des patients. Lors du rappel, le retard de cicatrisation a été une question indépendante de celle du délai réel d'ablation des points. Les patients n'ont pas respecté le délai prescrit d'ablation des points dans 45, 1% des cas. Diverses raisons étaient avancées : ce jour correspondait à un jour non ouvré, eux même n'étaient pas disponibles ou encore ils ont préféré laisser les points le plus longtemps possible. Chez ces patients, il peut être intéressant de leur proposer une suture avec des points résorbables. En effet, la suture d'une plaie aigue avec du fil résorbable apporte le même résultat qu'avec du fil non résorbable, sans être responsable de plus de complications. (23, 24). Dans ce cas, le bénéfice de réévaluation par un professionnel permettant d'évaluer l'apparition d'une complication est perdu. Il peut également être intéressant de discuter avec eux d'une fourchette de délai d'ablation des points. Enfin, un certain nombre de patients refusent l'arrêt de travail proposé lorsque la plaie est localisée sur une zone de tension et sollicitée lors de l'activité professionnelle. Par exemple, un patient a présenté un retard de cicatrisation de sa plaie de la main du fait d'une utilisation lors de son activité professionnelle. Pour pallier cela, au bout de 13 jours, son médecin traitant lui a prescrit une attelle et lui a retiré les points. 42 5. Facteurs de risque de complication La plupart des facteurs de risque de complication d'une plaie sont présents avant l'intervention médicale et concernent les caractéristiques des patients. Ces facteurs ont été beaucoup étudiés dans la littérature mais n'ont pas été retrouvé dans cette étude. Les patients âgés de plus de 65 ans, représentent 8, 5% de la population de l'étude. Certains ont signalé que leur peau était plus fragile pendant quelques temps après la cicatrisation avant de retrouver son état normal. La peau se modifie avec l'âge, cliniquement, cela se manifeste par une xérose. Sa fréquence est estimée entre 55 et 75% chez les sujets de plus de 65 ans (25). De plus, l'âge diminue la réponse inflammatoire locale, le renouvellement kératinocytaire et est responsable d'une diminution du collagène. Tous ces mécanismes altèrent la cicatrisation (26). La prévalence du tabagisme dans la population des 18-75 ans est de 31, 9% en France (27). Dans notre population, ce taux est plus élevé, 45, 28%. Le tabac altère les différentes phases de la cicatrisation (28), il diminue la migration des cellules immunitaires sur le site de la plaie et la migration des fibroblastes. Le délai de cicatrisation est augmenté, ainsi que les complications telles que l'infection, la désunion, la rupture d'anastomose, la nécrose, et une diminution de l'élasticité de la cicatrice (29, 30). Il existe un bénéfice à l'arrêt du tabac qui permet une amélioration de la cicatrisation et diminue les infections de la plaie (29). Il n'a pas eu pour autant plus de complication chez les patients tabagiques. La prévalence de la prise d'alcool quotidienne par la population de l'étude est de 11, 3%. Comme tous les autres organes, la peau est atteinte par les effets de l'alcool. La prise chronique d'alcool est associée à un taux augmenté d'infection des plaies notamment à Staphyloccoccus aureus et certains résistant à la méthicilline, à une augmentation du délai de cicatrisation et à une diminution de la résistance des plaies jusqu'à 40% (31) (32). L'éthanol altère l'épithélialisation de la plaie, la prolifération et la fonction des fibroblastes(33). 43 La prévalence du diabète dans la population étudiée est de 3, 8%. Le diabète est responsable d'une mauvaise cicatrisation des plaies aigus (30) et d'un risque augmenté d'infection de la plaie avec un risque relatif (RR) de 2, 70 (11). Dans notre population seulement 3, 77% des patients sont diabétiques. Beaucoup de médicaments, comme ceux qui interfèrent avec la formation des caillots ou la fonction plaquettaire, la réponse inflammatoire et la prolifération des cellules ont la capacité d'altérer la cicatrisation. (30) (34). (35). La population de patients interrogée ne prenait pas de tels médicaments. Ces données ont donc été recueillies mais non analysées. C. Perspectives L'enjeu concernant la prise en charge des plaies est d'éviter l'apparition d'une complication et la chronicisation des plaies. Cette étude nous a montré qu'un taux non négligeable de plaie se complique (15, 5%), mais un faible taux (2, 8%) s'infecte, ce qui est comparable à la littérature (11). Devant le faible de taux d'infection des plaies aigus retrouvé dans cette étude, il apparat peu intéressant d'ouvrir une consultation post urgence destinée aux plaies. Quin et al. (11) proposent de considérer les patients diabétiques, avec une plaie contaminée, d'une longueur > 5cm ou localisée au niveau des extrémités du membre inférieur comme à haut risque d'infection. Ces facteurs doivent mener selon eux à une antibiothérapie prophylactique ou un suivi de la plaie. En considérant la suggestion de la recommandation de 2017 de la SFMU de revoir les plaies majeures, notamment à risque infectieux à 48 -72 h, il semble intéressant d'établir des critères de reconsultation soit vers le médecin traitant soit vers une consultation d'interne. D'autant que les patients ne consultent pas spontanément leur médecin traitant en cas de complication. Seulement un patient a consulté son médecin traitant pour ce motif. Mais il n'y a pas assez de patients dans cette étude pour pouvoir mettre en évidence ces critères. 44 La prise en charge des plaies par les patients a été peu étudiée, il pourrait être intéressant d'étudier l'impact d'une information spécifique des patients sur l'attention à porter à leur plaie sur l'apparition des complications. A l'appel des patients, les termes les mieux compris pour évaluer l'infection de la plaie étaient : y a-t-il du pus ou du liquide jaunâtre qui sort de la plaie ? Votre plaie a-t-elle une mauvaise odeur ? Ces questions pourraient être explicites sur la feuille de conseil remise aux patients pour leur permettre d'identifier l'apparition d'une complication et s'orienter vers leur médecin traitant ou les urgences. Par ailleurs, il pourrait être intéressant de rappeler au patient qu'en cas de plaie, il est nécessaire de nettoyer abondamment la plaie à l'eau et au savon si possible et de protéger la plaie par un pansement. 45 Conclusion Cette étude propose une description des caractéristiques des patients se présentant pour une plaie au circuit ambulatoire des urgences de l'hôpital Nord, de leur prise en charge et de leur évolution. Les plaies aigus sont un motif de recours fréquent aux urgences, un acte banal dans la pratique des médecins hospitaliers travaillant aux urgences. Elles se compliquent rarement, mais au vu de leur fréquence, le nombre de complications n'est pas négligeable. Peu d'études évaluent la prise en charge des plaies par les patients et les soignants. L'étude réalisée dans ce travail de thèse montre que tous les patients n'ont pas les bons réflexes face à une plaie. Un peu moins d'un quart des patients consultent aux urgences sans avoir nettoyé ou mis un pansement sur leur plaie. Cela les expose à un risque de complication augmenté (p 0, 034). Les patients sont à l'écoute des consignes données aux urgences puisque tous les patients nettoient leur plaie quotidiennement. Du côté des soignants, les antiseptiques sont encore largement utilisés. Les résultats obtenus nous permettent d'envisager une meilleure information des patients. Rappeler aux patients la conduite à tenir lorsqu'ils se blessent et insister sur la nécessité de protéger leur plaie suturée tout au long de la cicatrisation pourrait diminuer le nombre de complication. Informer les soignants de l'évolution des recommandations qui proposent désormais un lavage simple à l'eau des plaies pourrait améliorer son application, d'autant qu'il y a peu d'infections de plaie. 46 Bibliographie : 1. Lefort H, Zanker C, Fromantin I, Claret P-G, Douay B, Ganansia O, et al. Prise en charge des plaies en structure d'urgence. Revue Francophone de Cicatrisation. 11 mars 2018 ; Vol. 2(N 1) : 4761. 2. Carpentier F, Ficarelli A, Jehle E, Joye F, Lebrin P, Lestavel P, et al. Conférence de consensus : Prise en charge des plaies aux urgences. SFMU. 2005 ; 22. 3. Plaie cutanée superficielle récente. Agression cutanée. mai 2019 ; 12. 4. Lazarus GS, Cooper DM, Knighton DR, Margolis DJ, Pecoraro RE, Rodeheaver G, et al. Definitions and Guidelines for Assessment of Wounds and Evaluation of Healing. Arch Dermatol. 1 avr 1994 ; 130(4) : 48993. 5. Senet P. Physiologie de la cicatrisation cutanée. 2019 ; 10. 6. 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Retards de cicatrisation de plaies : parfois dus à des médicaments. Prescrire. déc 2012 ; (350) : 9116. 49 Annexes Annexe 1 : Antibiothérapie probabiliste en cas de plaie traumatique à risque d'infection, recommandation SFMU 2017 50 Annexe 2 : Délai d'ablation des points après suture d'une plaie. 51 Annexe 3 : recherches bibliographiques concernant les facteurs de risque de complications extrinsèque à la plaie, inhérent au patient Facteur de risque Etude Autres informations pertinentes Age > 65 ans Colboc H, Meaume S. Âge et cicatrisation Sgonc R, Gruber J. Age-related aspects of cutaneous wound healing Tabac Guo et al. , 2010 : Factors affecting wound healing Ahn et al. , 2008 Sorensen et al. , 2003 Diabète Guo et al. , 2010 Hollander et al. , 2001 Quinn JV et al. , 2014 Alcool Trevejo-Nunez et al. , 2015 Radek et al. , 2005 Ranzer et al. , 2011 Médicaments Yasir et al. , 2019 Guo et al. , 2010 : Factors affecting wound healing est Les différentes phases de cicatrisation sont altérées chez le sujet âgé. Risque de déchirure accrue par la dermatoporose Les différentes phases de cicatrisation sont altérées chez le sujet âgé. Retard de cicatrisation de 20 à 60% en cas d'interruption d'une des phases de cicatrisation Le responsable d'une tabac mauvaise cicatrisation et augmente le risque d'infection de la plaie. ? Etude randomisée. 228 plaies. Groupe fumeur : 12% d'infection. Groupe non fumeur : 2% d'infection Diabète est un facteur de mauvaise cicatrisation. Le diabète est associé à l'infection d'une plaie avec OR 6, 74 [1, 7 26, 4], p 0, 006 Diabète est un facteur de risque d'infection. RR 2. 70, 95% CI 1. 1 to 6. 5 La prise chronique d'alcool est associée à un risque augmenté d'infection des plaies. Modèle murin : J2, plaie moins épithélialisée chez des souris exposées à l'alcool L'exposition d'alcool responsale d'une diminution de résistance de la plaie de 40%. Les corticoïdes cicatrisation Les AINS ont un effet anti-prolifératif sur la cicatrisation Les chimiothérapies inhibent certains mécanismes de la cicatrisation interfèrent avec est la in vivo la 52 Recherches bibliographiques concernant les facteurs de risque liés à la plaie Facteur de risque Etude Type de plaie Localisation, taille de la plaie et délai de fermeture de la plaie Edlich et al. , 2010 Quinn et al. , 2014 Anesthésiques locaux Kesici U, Demirci M, Kesici S. Antimicrobial effects of local anaesthetics, 2019 Autres informations pertinentes extrémités, Mécanisme d'écrasement, augmente le risque d'infection. Plaies des à fortiori du MI s'infectent plus. Plaies > 5cm ont un RR 2, 9 d'infection. Pas de sur risque d'infection pour les plaies suturées après 12h. Le diamètre de zone d'inhibition des anesthésiques locaux testés est plus grand que celui du groupe contrôle (serum salé) devant S. aureus, P. aeruginosa et E. Coli. la 53 Annexe 4 : Ordonnance type de sortie à la suite d'une plaie aigue. Extraite à partir du logiciel terminal urgences. Les items sont à sélectionner sur le logiciel. 54 Annexe 5 : Conseils donnés aux patients à la suite d'une plaie suturée aux urgences. 55 Annexe 6 : Questionnaire concernant les caractéristiques des patients et de la plaie (matériel et méthode) Questionnaire : risque de complication des plaies prises en charge aux urgences TOUTES LES PLAIES SUTURABLES A REMPLIR PAR LES EXTERNES Etiquette Vérifier un numéro de téléphone fiable : . Mesure de la taille de la plaie avec un mètre (à votre disposition) - Le patient : - Délai entre le traumatisme et la suture (délai en heure) : . H Situation sociale : SDF en foyer domicile EPHAD Situation économique : Travail Pas de travail Tabac : actif sevré < 5 ans sevré > 5 ans tabagisme passif non fumeur Alcool : quotidien occasionnel abstinent Consommation de drogue : cocaïne crack drogues intra-veineuse Initiative du patient lors de l'effraction : nettoyage immédiat protection de la plaie par un pansement aucune prise en charge - La plaie : - Plaie souillée / sale (gravier, terre, végétal. ) : oui non Analgésie donnée : Doliprane PO*1 Palier 2 PO Autre palier 1, 2 ou 3 MEOPA Anesthésie réalisée : Anesthésie sous-cutanée (berges de la plaie) anesthésie locale au spray anesthésie loco- régionale Atteinte de structure nobles : Non artère / artériole nerf muscle articulation contact osseux*2 Taille de la plaie : . cm Berges de la plaie : nettes délabrées Forme de la plaie : linéaire en V irrégulière Perte de substance empêchant la suture d'une partie de la plaie : Oui Non État cutané avant suture : maladie de peau sous-jacente ancienne cicatrice bon Protocole de désinfection réalisé aux urgences : eau stérile chlorexidine bétadine dermique bétadine 4 temps Parage*3 réalisé : oui non Avis chirurgical demandé : oui non Pensez-vous que le patient ai compris les consignes de sortie ? oui non 56 Annexe 7 : Tableau d'analyse univariée entre la variable complication, les variables quantitatives et les variables qualitatives classé par ordre alphabétique de A à E, résultats non significatifs lame en métal verre pierre / béton céramique ecrasement plastique 1 1 Délai d'ablation des points réel (jour), moyenne. Délai de PEC (plaie suture (min), moyenne. Délai de PEC au SAU (min), moyenne Taille de la plaie (mm, ) moyenne Agent, n Alcool, n Anesthésie SC : berges de la plaie, n Localisation membres, n 1 Localisation poignet et main, n 1 Localisation tête, n 1 1 Localisation tronc, n 1 Avis chirurgical demandé, n Berges délabrées, n 1 1 Biseptine prescrite, n Consultation d'un médecin 1 plaie, n Crack ou cocaïne, n Désinfection réalisée, n Eau prescrite, n 1 1 1 Pas de complication Complication (n 60) (n 11) 11. 6 (3. 88) 15. 1 (6. 69) n 71 p 0. 065 test 1 226 (421) 209 (201) 70 0. 53 39. 9 (31. 6) 37. 7 (35. 8) 71 0. 62 30. 0 (21. 0) 29. 0 (4. 18) 60 0. 4 27 (49%) 11 (20%) 7 (13%) 4 (7. 3%) 4 (7. 3%) 2 (3. 6%) 30 (50%) 56 (93. 3%) 16 (27%) 27 (45%) 16 (27%) 1 (1. 7%) 1 (1. 7%) 5 (8. 3%) 57 (95%) 3 (5%) 2 (3. 3%) 59 (98. 3%) 27 (45%) 4 (40%) 3 (30%) 1 (10%) 1 (10%) 0 (0%) 1 (10%) 7 (64%) 10 (90. 9%) 3 (27%) 4 (36%) 1 (9. 1%) 0 (0%) 1 (9. 1%) 0 (0%) 11 (100%) 1 (9. 1%) 0 (0%) 10 (90. 9%) 4 (36%) 31 14 8 5 4 3 37 66 19 31 17 1 2 5 68 4 2 69 31 0. 78 - - - - - 0. 61 0. 58 1 0. 75 0. 2 1 0. 29 1 1 0. 5 1 0. 29 0. 75 1 1 1 3 - - - - - 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 57 Tableau d'analyse univariée entre la variable complication et les variables qualitatives classé par ordre alphabétique de F à Z, résultats non significatifs Forme de la plaie, n Nettoyage immédiat lors de l'effraction, n Nombre de points endodermique, n Pansement prescrit, n Parage réalisé, n Perte de substance empêchant la suture, n Plaie souillée ou sale, n Protection de la plaie par un pansement, n Protection de la plaie par un pansement, n Travail actif, n Soins complémentaires après ablation , n Suivi IDE, n Survenue au travail, n Tabac actif, n Vaccination anti-tétanique non à jour, n Vaseline, n droite en v irrégulière 1 0 2 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pas de complication Complication (n 60) (n 11) 45 (83%) 6 (11%) 3 (5. 6%) 35 (58%) 7 (88%) 1 (12%) 0 (0%) 4 (36%) n 52 7 3 39 58 (96. 7%) 11 (100%) 69 1 (1. 7%) 1 (1. 7%) 42 (70%) 2 (3. 3%) 2 (3. 3%) 3 (5%) 44 (73%) 0 (0%) 0 (0%) 10 (90. 9%) 0 (0%) 1 (9. 1%) 2 (18%) 7 (64%) 1 1 52 2 3 66 51 p 1 - - 0. 2 1 - - 0. 27 1 0. 4 0. 17 0. 49 34 (57%) 4 (36%) 38 0. 36 42 (70%) 4 (6. 7%) 11 (18%) 21 (35%) 26 (43%) 24 (40%) 8 (73%) 2 (18%) 4 (36%) 3 (27%) 3 (27%) 4 (36%) 50 6 15 24 29 28 1 0. 23 0. 23 0. 74 0. 51 1 50 (83%) 8 (73%) 58 0. 41 test 3 - - 3 3 - - 3 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 58 SERMENT D'HIPPOCRATE Au moment d'être admis(e) à exercer la médecine, je promets et je jure d'être fidèle aux lois de l'honneur et de la probité. Mon premier souci sera de rétablir, de préserver ou de promouvoir la santé dans tous ses éléments, physiques et mentaux, individuels et sociaux. Je respecterai toutes les personnes, leur autonomie et leur volonté, sans aucune discrimination selon leur état ou leurs convictions. J'interviendrai pour les protéger si elles sont affaiblies, vulnérables ou menacées dans leur intégrité ou leur dignité. Même sous la contrainte, je ne ferai pas usage de mes connaissances contre les lois de l'humanité. J'informerai les patients des décisions envisagées, de leurs raisons et de leurs conséquences. Je ne tromperai jamais leur confiance et n'exploiterai pas le pouvoir hérité des circonstances pour forcer les consciences. Je donnerai mes soins à l'indigent et à quiconque me les demandera. Je ne me laisserai pas influencer par la soif du gain ou la recherche de la gloire. Admis(e) dans l'intimité des personnes, je tairai les secrets qui me seront confiés. Reçu(e) à l'intérieur des maisons, je respecterai les secrets des foyers et ma conduite ne servira pas à corrompre les moeurs. Je ferai tout pour soulager les souffrances. Je ne prolongerai pas abusivement les agonies. Je ne provoquerai jamais la mort délibérément. Je préserverai l'indépendance nécessaire à l'accomplissement de ma mission. Je n'entreprendrai rien qui dépasse mes compétences. Je les entretiendrai et les perfectionnerai pour assurer au mieux les services qui me seront demandés. J'apporterai mon aide à mes confrères ainsi qu'à leurs familles dans l'adversité. Que les hommes et mes confrères m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses ; que je sois déshonoré(e) et méprisé(e) si j'y manque. Résumé Introduction : Les plaies représentent 7, 97 % des motifs d'admissions principaux aux urgences en région PACA. Elles se compliquent dans 2 à 5% des cas d'infection. Elles peuvent également se compliquer d'une dysfonction de cicatrisation comme un retard ou un excès ou encore d'une toxi-infection par le Clostridium tetanii. Leur prise en charge est standardisée, encadrée par de nouvelles recommandations éditées en 2017. L'objectif de ce travail est de réaliser un état des lieux des plaies suturées dans un service d'urgences et d'observer leur évolution. Matériel et méthode : Il s'agit d'une étude observationnelle de cohorte. Les variables étudiées ont été recueillies auprès des patients le jour de leur consultation aux urgences et par un appel téléphonique à distance ainsi que dans le dossier médical informatisé du patient. Résultats : 106 patients ont été inclus entre le 13 Mars et le 5 Août 2019. L'âge moyen des patients est de 41 ans, 38, 9% ne sont pas à jour de leur vaccination antitétanique. Dans 20, 8% des cas, les patients n'ont rien réalisé avant la prise en charge aux urgences. La taille moyenne des plaies est de 29, 7 mm, 8, 5% sont profondes, 33% surviennent dans le cadre d'une activité professionnelle. 71 patients ont répondu au rappel. Dans ce groupe le taux d'infection est de 2, 8%, le retard de cicatrisation est de 12, 7%. Le nombre de points moyen, l'absence de prise en charge lors de l'effraction, la localisation au niveau de la cheville et du pied, les plaies profondes, une situation à risque d'infection rencontrée lors de la cicatrisation sont significativement associés à un risque de complication. Conclusion : Les patients n'ont pas tous les bons réflexes face à une plaie. Une information des patients concernant les pratiques à avoir en cas de plaie aigue pourrait diminuer le risque de complication. Mots-clés : plaie aigu, urgences, complications des plaies. | HAL | Scientific |
Cardiopathie ischémique avérée, artériopathie périphérique et/ ou antécédent d'accident vasculaire cérébral (y compris l' accident ischémique transitoire). | EMEA_V3 | Medicinal |
Tumeurs malignes de l'ovaire chez l'enfant | WMT16 | Scientific |
Introduction Les malades atteints de mucoviscidose constituent un groupe fi risque d'infection communautaire ~ mycobactEries atypiques ou non tuberculeuses (MNT) La prdvalence varie de 5 ~ 15 % selon les centres En France, Mycobacterium abscessus (M abscessus) est prEpondErante alors que les 6tudes nord-amEricaines, r6alisEes chez des malades plus ~g~s, rEv~lent la prEpondErance de Mycobacterium aviumintracellulare (MAC) Ces infections posent des problbmes thErapeutiques non rEsolus Analyse 6pid6miologique des infections h MNT dans la mucoviscidose Jusque vers les anndes 1990, les infections ~ MNT au cours de la mucoviscidose semblaient rares et n'dtaient l'objet que de cas cliniques rapportEs dans la littErature L'amElioration des techniques bact6riologiques d'isolement et d'identification par biologic molEculaire de ces agents pathog~nes (notamment la raise au point d'une mEthode de ddcontamination efficace sur Pseudomonas aeruginosa utilisant l'acide oxalique) a permis de mieux 6valuer leur rEelle prEvalence (Tableau 1) La prdvalence des MNT retrouvEes au cours de la mucoviscidose varie suivant le pays (fr6quence plus importante de M abscessus en France et de Mac aux t~tats-Unis) et suivant l'~ge (absence d'infection MAC chez les plus jeunes enfants) I1 n'y a pas, pour 1'instant, d'explication 6pidEmiologique ou physiopathologique ces disparitEs En 2000, une Etude de prevalence effectuEe dans 3 centres parisiens (Necker-Enfants-Malades, Armand-Trousseau, Robert-Debr6) sur pr6s de 400 patients ~gds de 6 mois 32 ans (fige moyen : 11, 3 ans) a montrE que la prdvalence des MNT augmente avec l'~ge (-15 % ~ parfir de 15 ans vs 5 % avant 15 arts) et que M abscessus est capable d'infecter les patients dbs les premibres anndes de vie, alors que MAC n'appara~t qu'~ partir de 15 ans Diff6rentes 6tudes, aussi bien nord-am6ricaines qu'europ6ennes, ont pu montrer que l'augmentation apparente de la pr6valence des infections ~ MNT dans la mucoviscidose n'6tait ni d'origine nosocomiale ni iatrogbne Malgr6 l'aptitude des MNT ~ contaminer les r6seaux d'eau sanitaire et fi r6sister ~ de nombreux ddsinfectants , la contamination de patients atteints de mucoviscidose par les a6rosols ou les r6seaux d'eau hospitaliers n'a pas ~tE dEmontrEe Des Etudes de typage de souches par biologic moldculaire ont montr6 l'absence de transmission croisEe entre patients La dilatation des bronches de ces malades constitue un facteur pr6disposant local au dEveloppement d'une infection pulmonaire h MNT mais l'existence de formes familiales ou rEcidivantes d'infections pulmonaires fi MNT chez les patients atteints de mucoviscidose sugg~re l'existence d'autres facteurs de susceptibilitE non encore 61ucid6s Crit~res d'infection h MNT au cours de la mucoviscidose Ils sont de 3 ordres cliniques, radiologiques et bact6rio-logiques, ces derniers 6tant, en raison de la difficult6 diagnostique lide ~ la maladie sous-jacente, essentiels Les crit~res cliniques sont peu sp~cifiques Toux, expectoration, amaigrissement, fatigue sont peu sp6cifiques La fibvre (pics f6briles inexpliqu6s) est plus 6vocatrice Chez ces malades, on s'inquibtera surtout de la persistance ou de la non am61ioration de sympt6mes malgr6 un traitement antibiotique adapt6 aux germes habituellement observds Les critkres radiologiques L'examen tomodensitomdtrique thoracique avec coupes fines et injection permet une meilleure analyse des 16sions I1 peut s'agir d'opacit6s apicales fibronodulaires, de macronodules, de cavitation ~ parois fines (frdquence variable suivant l'esp~ce : 80 ~ 95 % en cas de MAC, moins fr6quent avec M abscessus) avec 6ventuellement un 6paississement pleural en regard, de petits nodules (& ; lt ; 2 cm) de mame taille group6s ~t distance de la 16sion initiale, de dilatations bronchiques Les addnopathies mddiastinales et l'6panchement pleural sont moins fr6quents que dans l'infection fi Mycobacterium tuberculosis Ces anomalies radiologiques sont souvent trbs difficiles dissocier de ldsions prdexistantes lides ~ la mucoviscidose m~me si certains ont pu montrer des anomalies diff6rentes suivant la MNT La tomodensitom6trie thoracique a un int6r~t pour le suivi 6volutif Les critkres bactdriologiques Ils sont essentiels C'est dire l'importance d'un laboratoire bact6riologique habitu6 aux techniques de ddtection des MNT La recherche de MNT est g6n6ralement effectu6e ~ partir de simples expectorations Les tubages gastriques ou le lavage bronchoalv6olaire ne sont utiles qu'en cas d'aggravation clinique malgr6 un traitement antibiotique habituel si les ECBC ne sont pas contributifs La recherche de bacilles acidoalcoolordsistants (BAAR) ~ l'examen direct est peu sensible mais un examen direct positif signe pratiquement le diagnostic d'infection active eta donc une valeur pronostique L'am61ioration des techniques bact6riologiques d'isolement de ces agents pathogbnes (notamment la mise au point d'une m6thode de d6contamination efficace sur P aeruginosa utilisant l'acide oxalique) a augment6 le rendement des cultures mycobact6riennes Cependant, il faut noter que les nouvelles techniques de culture des mycobact6ries en milieu liquide sont real adapt6es ~ la recherche de M abscessus L'dtape d'identification est essentielle Un certain nombre de tests simples sont effectuds de fa~on, en particulier, ~ permettre de ddterminer s'il s'agit d'une mycobact6rie ~ croissauce rapide tel 3/i abscessus (& ; lt ; 7jours aprbs repiquage mais souvent plus en primoculture du fait notamment de l'action des d6contaminants) ou lente tel le MAC Afin d'dviter toute erreur, l'identification d'espbce doit absolument b6n6-ficier d'une technique gdndtique Le s6quengage partiel du gbne hsp65 a l'int6r~t de permettre un diagnostic d'esp~ce pr6cis dans le groupe des mycobact6ries ~ croissance rapide et de d6terminer le sequovar en cause dans le cas de M abscessus Le test Elisa Anda A60 (ddtection d'anticorps dirig6s contre un complexe macromol6culaire -l'antigbne A60-produit ~t partir de M boris BCG, mais qui est pr6sent chez toutes les mycobact~ries) peut ~tre un compl6ment diagnostique int6ressant darts les infections ~ M abscessus dans la mucoviscidose Dans une 6tude r6cente, nous avons pu montrer que le test A60 IgG offrait une excellente sp6cificit6 et une trbs bonne sensibilit6 dans les infections ~ M abscessus survenant au cours de cette affection et pouvait ainsi ~tre un signe d'alerte La s6rologie A60 parait ~tre 6galement un marqueur int6ressant pour le suivi sous traitement des patients infect~s par M abscessus En revanche, ce test n'a pas d'int6r~t pour le s6rodiagnostic des infections dues aux autres MNT, notamment le complexe aviaire Selon les recommandations de l'American Thoracic Society, le diagnostic d'infection est port6 sur l'un ou l'autre des crit6res microbiologiques suivants : Pour distinguer les v6ritables infections des simples colonisations transitoires (& ; lt ; 3 pr61~vements positifs sans anomalie radiologique 6vocatrice), la positivit6 de 3 pr616vements diff6rents doit survenir sur un d61ai minimum de 3 mois En raison de la fr6quence importante des faux n6gatifs en d6but d'infection (probablement h cause d'une action partiellement bact6ricide de la d6contamination sur les mycobact6ries), s'il y a eu un isolement de MNT, un recul d'au moins un an de pr61~vements n6gatifs r6p6t6s est n6cessaire pour 61iminer une infection Une fois le diagnostic d'infection ~ MNT pos6, il faut appr6cier l'activit6 de cette infection (infection-maladie ? ) afin de juger de la raise sous traitement antibiotique en se basant sur rexistence de signes cliniques, fonctionnels respiratoires et scannographiques associ6s En l'absence d'616ments 6vocateurs cliniques (amaigrissement, asth6nie, fi~vre) et radiologiques, si l'enfant est stable, une surveillance clinique, fonctionnelle et bact6riologique est institu6e sans raise en route d'un traitement sp6cifique et, de toute fa~on, un contr6-le scannographique est r6alis6 apr~s 12 mois de suivi Bien stir, l'apparition de signes cliniques ou radiologiques, chez un enfant dont les cultures d'expectoration restent positives pour la MNT, entra~nera la raise sous traitement antibiotique adapt6 Cependant, les critbres bact6riologiques de rATS sereblent ~tre de bons marqueurs de l'activit6 de la maladie En effet, les 6tudes nord-am6ricaines sur le suivi de cohortes de patients ftgds de plus de 10 ans, principalement infect6s ~t MAC, montrent une aggravation fonctionnelle respiratoire et clinique si les critbres d'infection d6finis par I'ATS sont rencontrds Par ailleurs, les diff6rences de gravit6 des infections ? ~ MNT tiennent probablement ~ des facteurs lids h l'h6te ainsi qu'~t la variabilit6 du pouvoir pathog6ne des souches Ainsi, S 120 3/1 Le Bourgeois et al. /Archives de pddiatrie 12 (2005) S1 ! 7-S121 le pouvoir pathogbne de M abscessus est d6sormais reconnu Ainsi, des infections diss6min6es ~ MNT rapidement mortelles ont 6t6 d6crites aprbs transplantation pulmonaire Quand rechercher les MNT ? I1 n'existe aucun consensus h ce sujet Cependant, il semble justifi6 de les rechercher : en cas de ddgradation clinique et/ou radiologique inexpliqu6e ; en cas de fi6vre persistante et/ou d'un amaigrissement anormal ; en cas d'images pulmonaires 6vocatrices ~ la radiographie ou au scanner, ne rdgressant pas sous traitement antibiotique antibact6rien habituel (non-antimycobact6rien) Le bdndfice individuel d'une politique de d6pistage annuel syst6matique reste ? ~ ddmontrer En revanche, il para~t essentiel que chaque centre de rdfdrence et de comp6-tence rdalise des enqu~tes de pr6valence rdguli~res afin de connaitre r6pid6miologie locale Strat6gies th6rapeutiques La strat6gie antibiotique varie suivant la MNT en cause Les particularit6s pharmacocindtiques (volume de distribution, clairance) rencontr6es chez les patients atteints de mucoviscidose invitent fi la rdalisation de dosages des antibiotiques Traitement de MAC I1 est assez standardis6 I1 doit comporter de la clarithromycine (ou azithromycine) qui ne doit jamais 6tre prescrite en monoth6rapie (induction syst6matique de rdsistances) Le traitement doit atre prolong6, 12 mois aprbs la n6ga-tivation bact6riologique Une association de rifampicine ou rifabutine, clarithromycine et 6thambutol est propos6e La rifabutine a l'avantage de ne pas diminuer la concentration s6rique de la clarithromycine mais a une plus grande toxicit6 que la rifampicine On a pu proposer une introduction sdquentielle sur une semaine de chaque antibiotique pour 6valuer une 6ventuelle toxicit6 En cas de rdsistance 5 la clarithromycirte (qui est un facteur de mauvais pronostic), on peut tester d'autres mol6cules : quinolones (moxifloxacine), clofazimine, aminoglycosides Traitement de M abscessus M abscessus est une bactdrie particulibrement r6sistante I1 n'existe aucun consensus th6rapeutique Le choix des antibiotiques est guid6 par l'antibiogramme ou, mieux, la d6termination des concentrations minimales inhibitrices (CMIs) en milieu liquide La phase initiale comporte au moins 4 semaines de bith6-rapie intraveineuse (imip6n6me ou c6foxitine et amikacine) associ6e h 2 antibiotiques oraux (clarithromycine ou azittu'omycine et 6thambutol) Le relais est pris par une association d'au moins 2 antibiotiques oraux (clarithromycine, 6thambutol) Darts notre exp6rience, l'adjonction de ndbulisation d'amikacine ne semble pas apporter de bdndfice La r6sistance ~ la clarithromycine rend l'efficacit6 thdrapeutique trbs improbable Le sch6ma classique est celui d'un traitement prolong6 de 12 mois apr~s ndgativation bact6riologique De nouvelles mo16cules sont en cours d'dtude notamment la glycylcycline tigecycline La ndgativation est difficilement obtenue et parfois seulemerit de fagon transitoire Certaines 6quipes, devant la fr6-quence des rechutes apr~s rarr6t du traitement, ont propos6 des sch6mas thdrapeutiques plus courts de 4 ~t 12 semaines qui peuvent atre r6p6tds en cas de rechute (cures s6quentiel-les ~ l'instar de l'infection ~ P aeruginosa) Traitement chirurgical En cas de 16sions localis6es, un traitement chirurgical peut ~tre envisag6 associ6 au traitement m6dical ~ condition que la fonction respiratoire ne soit pas trop alt6r6e (Veins & ; gt ; 30 %) Dans l'6tude de Griffith et al. , 7 malades, sur les 10 qui avaient eu une 6radication de la MNT, avaient eu une exdr~se chirurgicale associde La surveillance La surveillance des effets ind6sirables sera adapt6e aux moldcules utilis6es (Tableau 2) La surveillance systdmatique des ECBC apr~s la fin du traitement permettra de d6tecter une 6ventuelle rechute Conclusion Un certain nombre d'avanc6es techniques r6centes ont permis une meilleure connaissance de rimpact des MNT chez les malades atteints de mucoviscidose Leur pathog6ni- De nombreuses questions subsistent Le traitement des infections ~ MNT n'est pas encore bien codifi6 ni dans ses modalitds ni dans le temps de sa mise en route Faut-il traiter trbs t6t, au risque de traiter par exc6s, ou ne traiter qu'au stade & ; lt ; ~ maladie mycobact6rienne ~, avec le risque de ne plus ~tre efficace ? Comment renforcer l'efficacit6 de traitements aujourd'hui tr6s ddcevants ? | ISTEX | Scientific |
COMMISSION NATIONALE D'EVALUATION DES DISPOSITIFS MÉDICAUX ET DES TECHNOLOGIES DE SANTE AVIS DE LA CNEDiMTS 17 Septembre 2013 CONCLUSIONS MACROPLASTIQUE, Implant urétéral de polydiméthylsiloxane Demandeur : Laboratoires Coloplast (France) Fabricant : Uroplasty BV (Pays Bas) Les modèles et références retenus sont ceux proposés par le demandeur (cf. page 4) Indications Traitement du reflux vésico-rénal chez l'enfant, avec pyélonéphrite récidivante retenues : sous antibioprophylaxie Traitement du reflux vésico-rénal chez l'adulte Service Rendu (SR) : Suffisant, en raison de : - l'intérêt thérapeutique de l'injection endoscopique dans le traitement du reflux vésico-rénal de l'enfant et de l'adulte - l'intérêt de santé publique compte tenu du caractère de gravité de cette pathologie Comparateurs Chez l'enfant : l'implant urétéral de copolymère DEFLUX retenus : Chez l'adulte : la chirurgie ouverte Amélioration du SR : ASR niveau V chez l'enfant par rapport à DEFLUX ASR niveau V chez l'adulte par rapport à la chirurgie ouverte Type d'inscription : Nom de marque Durée d'inscription : 5 ans -1- Données Etude Kim et Al. , 2011 (réalisée chez l'enfant), étude mono centrique analysées : prospective randomisée ayant pour objectif la comparaison de l'efficacité et de la sécurité de deux agents de comblement (DEFLUX versus MACROPLASTIQUE) dans le traitement du reflux vésico-rénal chez l'enfant. Cette étude a inclus au total 85 patients atteints d'un reflux persistant de grade II à V selon la classification internationale des reflux et des infections urinaires récidivantes (âge moyen de 34, 5 mois, min. 2 ans, max. 15 ans, sex ratio : / 41/32). La durée de suivi était de 3 mois. 12 patients ont été perdus de vue au cours de l'étude soit un effectif final analysé de 73 patients (106 uretères affectés). Etude Moore et Bolduc, 2011 (réalisée chez des sujets de plus de 12 ans), étude mono centrique prospective non randomisée, ayant inclus 27 patients post pubertaires (âge médian de 23 ans [12-65], sex ratio / 0, 12) totalisant 41 uretères affectés de reflux vésico-rénal, dont 33 (80%) de grade I à II et 8 de grade III à V (20%). Les critères d'inclusion étaient un reflux vésico-rénal diagnostiqué par utétérocystographie, âge > 12 ans, pyélonéphrite récurrente, historique de reflux vésico-rénal. La durée de suivi était de 3 mois. Éléments conditionnant le SR : Spécifications Aucune exigence supplémentaire par rapport aux spécifications techniques techniques : proposées par le fabricant Modalités de L'injection doit être réalisée par un urologue doté de matériel endoscopique prescription et pédiatrique adapté lors de l'utilisation chez l'enfant. d'utilisation : Conditions du Actualisation des données conformément aux recommandations du guide renouvellement : pratique pour l'inscription au remboursement Population cible : La population cible de MACROPLASTIQUE ne peut être estimée précisément mais elle ne devrait pas être supérieure à 3600 patients par an chez l'enfant. Aucune donnée épidémiologique ne permet d'estimer la population cible chez l'adulte. A titre informatif, la population rejointe globale est estimée au maximum à 1600 cas par an. Avis 2 définitif -2- ARGUMENTAIRE 01 NATURE DE LA DEMANDE Demande de renouvellement d'inscription sur la liste des produits et prestations mentionnés à l'article L 165-1 du code de la sécurité sociale (LPPR dans la suite du document). 01. 1. MODÈLES ET RÉFÉRENCES NP1500, seringue pré-remplie de 1, 5 ml (conditionnement enfant) NP2500, seringue pré remplie de 2, 5 ml (conditionnement adulte) 01. 2. CONDITIONNEMENT Seringues stériles, sans latex, embout luer adaptées à l'aiguille endoscopique. Conditionnement unitaire stérile. 01. 3. INDICATIONS REVENDIQUÉES o Traitement du Reflux Vésico-Rénal (RVR) chez l'enfant, avec pyélonéphrite récidivante sous antibioprophylaxie . o Traitement du RVR chez l'adulte 01. 4. COMPARATEURS REVENDIQUÉ La chirurgie de réimplantation urétérale 02 HISTORIQUE DU REMBOURSEMENT MACROPLASTIQUE est pris en charge par l'assurance maladie sous nom de marque suite à l'arrêté du 27 juillet 19991 (Journal officiel du 27 août 1999), faisant suite à 2 évaluations antérieures par la commission, respectivement en 20032 et en 20083. 03 CARACTÉRISTIQUES DU PRODUIT 03. 1. MARQUAGE CE Classe IIb, notification par AMTAC MEDIQA (n0473), Royaume-Uni. Arrêté du 27 juillet 1999 modifiant le titre III du tarif interministériel des prestations sanitaires et relatif aux implants urogénitaux macroplastiques, publié au Journal Officiel de la République Française le 27 août 1999. Avis de la Commission du 21 Mai 2003 relatif à MACROPLASTIQUE, suspension injectable stérile de particules solides d'élastomère de silicone. HAS ; 2003 Avis de la Commission du 14 octobre 2008 relatif à MACROPLASTIQUE, implant urétéral de polydiméthylsiloxane. HAS ; 2008. -3- 03. 2. DESCRIPTION MACROPLASTIQUE est un implant constitué de particules solides et irrégulièrement texturées (120-264 m, taille moyenne 209 m) d'élastomère de silicone médical (polydiméthylsiloxane) en suspension dans une solution d'hydrogel (polyvinylpyrrolidone). 03. 3. FONCTIONS ASSURÉES MACROPLASTIQUE est implanté, par injection endoscopique, sous le méat pathologique de l'abouchement de l'uretère dans la vessie, généralement au niveau du plan sous-muqueux et sous-méatique. Il permet de produire un soulèvement de la paroi urétérale empêchant un flux urinaire rétrograde et ainsi de recréer un système mécanique de valve anti-reflux des uretères. 03. 4. ACTE ASSOCIÉ Dans la Classification Commune des Actes Médicaux, l'acte associé à l'injection de DEFLUX correspond au code de la CCAM : JCLE004 Injection sous-muqueuse intra-urétérale de matériel hétérologue, par endoscopie. 04 SERVICE RENDU 04. 1. INTÉRÊT DU PRODUIT 04. 1. 1. ANALYSE DES DONNÉES : ÉVALUATION DE L'EFFET THÉRAPEUTIQUE / EFFETS INDÉSIRABLES, RISQUES LIES A L'UTILISATION 04. 1. 1. 1. RAPPEL DES AVIS PRÉCÉDEMMENT ÉMIS PAR LA COMMISSION En mai 2003 , la Commission d'évaluation des produits et prestations avait donné un SR suffisant à MACROPLASTIQUE dans l'indication traitement du reflux vésico-rénal primitif avec une amélioration du service rendu modérée (ASR de niveau III) par rapport à la chirurgie. Cet avis était étayé par une étude, non publiée, multicentrique, rétrospective non contrôlée, d'effectif 464 patients, évaluant l'efficacité et la tolérance au traitement endoscopique du RVR, dans l'indication du traitement du reflux vésico-rénal en première et en deuxième intention. Dans son avis du 14 Octobre 20083, la CEPP s'est prononcée pour un service rendu suffisant, avec une ASR modéré (niveau III) dans la stratégie thérapeutique, sur la base de 15 études fournies dans le dossier : Un essai comparatif randomisé comparant l'efficacité de DEFLUX et de MACROPLASTIQUE, chez 72 enfants suivis pendant 12 mois4. Trois essais comparatifs rétrospectifs : - Un essai comparant MACROPLASTIQUE au TEFLON et au collagène sur 101 enfants évalués à trois mois postopératoires5. Oswald J. Riccabona M, Lusuardi L, Bartsch G, Radmayr C. Prospective comparison and 1-year follow-up of a single endoscopic subureteral polydimethylsiloxane versus dextranomer/hyaluronic acid copolymer injection for treatment of vesicoureteral reflux in children. Urology. 2002 ; 60(5) : 894-897 Pelletier AK, Anderson PA, Schwarz RD. Comparison of different substances for subureteric injection in the management of vesicoureteric reflux in children. Can J Urol. 2005 ; 12(4) : 2774-2777 -4- - Un essai comparant MACROPLASTIQUE à la réimplantation urétérale chez 180 enfants souffrant de reflux vésico-rénal (RVR) de faible grade (I à III), suivis durant 1 an6. - Un essai comparant MACROPLASTIQUE à la réimplantation urétérale chez 49 enfants souffrant de RVR de faible grade sur des systèmes dupliqués, suivis durant 1 an7. Onze études observationnelles : - 6 études sur l'efficacité de MACROPLASTIQUE chez l'enfant. Celles-ci ont inclus entre 32 et 477 patients, avec un suivi moyen variant entre 14 mois et 5 ans. - 3 études sur l'efficacité de MACROPLASTIQUE chez l'adulte : 30 femmes en âge de procréer suivies durant 26 mois, 19 insuffisants rénaux chroniques suivis durant 7 mois et 15 adultes souffrant de vessie neurologique suivis durant 28 mois. - Une étude analysant les échecs de MACROPLASTIQUE chez 60 enfants8 - Une étude analysant les facteurs pronostiques du succès du traitement endoscopique chez 232 enfants consécutifs9. 04. 1. 1. 2. NOUVELLES DONNÉES SPÉCIFIQUES Sept études spécifiques ont été fournies dans le dossier : o Deux études prospectives comparatives DEFLUX contre MACROPLASTIQUE (1 réalisée chez l'enfant, 1 réalisée chez l'adulte). o Trois études rétrospectives n'ont pas été retenues pour leur faible qualité méthodologique10, 11, 12. o Deux études rétrospectives, n'ont pas été retenues car elles ne renseignaient pas sur l'intérêt spécifique du dispositif MACROPLASTIQUE13, 14. L'étude Kim 15 et Al. , 2011 (réalisée chez l'enfant), étude mono centrique prospective randomisée ayant pour objectif la comparaison de l'efficacité et de la sécurité de deux Aboutaleb H, Bolduc S, Upadhyay J, farhat W, Bgli DJ, Khoury AE. Subureteral polydimethylsiloxane injection versus extravesical reimplantation for primary low grade vesicoureteral reflux in children : a comparative study. J Urol 2003 ; 169 : 313-6 Aboutaleb A. , Bolduc S. , Khoury AE. , Upadhyay J, Bgli DJ, Farhat W. Polydimethylsiloxane injection versus open surgery for the treatment of vesicoureteral reflux in complete duplex systems. J Urol. 2003 ; 170 : 1563-1585 Kouamé BD, Szwarc C, Lardy H, Lacombe A, Robert M. [Failures of endoscopic treatment of vesico-ureteric reflux in children using Macroplastique]. Prog Urol. 2005 ; 15(2) : 291-295 Lorenzo AJ, Pippi Salle JL, Barroso U, Cook A, Grober E, Wallis MC, et al. What are the most powerful determinants of endoscopic vesicoureteral reflux correction ? Multivariate analysis of a single institution experience during 6 years. J Urol. 2006 ; 176(4 Pt 2) : 1851-1855 Dirim A, Hasirci E, Turunc T, Aygun C, Ozkardes H. Single injection results of endoscopic treatment of vesicoureteric reflux with different tissue-bulking substances in patients with end stage renal failure. J Endourol. 2011 ; 25(5) : 831-5 Bae YD, Park MG, Oh MM, Moon du G. Endoscopic Subureteral Injection for the Treatment of Vesicoureteral Reflux in Children : Polydimethylsiloxane (Macroplastique(R) versus Dextranomer/Hyaluronic Acid Copolymer (Deflux(R). Korean J Urol. 2010 ; 51(2) : 128-31 Stredele RJ, Dietz HG, Stehr M. Long-term results of endoscopic treatment of vesicoureteral reflux in children : comparison of different bulking agents. J Pediatr Urol. 2013 ; 9(1) : 71-6. Bartoli F, Niglio F, Pastore V, Campanella V, Leggio S, Aceto G et Al. Polydimethylsiloxane (macroplastique) injection for vesicoureteral reflux in duplex ureters : a comparison with single renal systems. J Pediatr Urol. 2011 ; 7(5) : 516-9 Basok EK, Yildirim A, Atsu N, Gocer S, Tokuc R. Endoscopic treatment of vesicoureteral reflux with polydimethylsiloxane in adults : do location and appearance of the ureteric orifice have a role in the success rates ? Urol Int. 2008 ; 80(3) : 279-82 Kim SO, Shin BS, Hwang IS, Hwang EC, Oh KJ, Jung SI. Clinical efficacy and safety in children with vesicoureteral reflux of a single injection of two different bulking agents-polydimethylsiloxane (Macroplastique) or dextranomer/hyaluronic acid copolymer (Deflux) : a short-term prospective comparative study. Urol Int. 2011 ; 87(3) : 299-303 -5- agents de comblement (DEFLUX versus MACROPLASTIQUE) dans le traitement du RVR chez l'enfant. Cette étude a inclus au total 85 patients atteints d'un reflux persistant de grade II à V selon la classification internationale des reflux et des infections urinaires récidivantes La durée de suivi était de 3 mois. 12 patients ont été perdus de vue au cours de l'étude soit un effectif final analysé de 73 patients (106 uretères affectés). Les patients étaient âgés de 2 à 15 ans (avec un âge moyen de 34, 5 mois et sex ratio : Garçon/Fille 41/32). L'intervention était considérée comme un succès lors de la disparition du reflux ou par un retour à un RVR de grade I. Le taux de succès rapporté était de 48/55 uretères traités dans le groupe MACROPLASTIQUE et 43/51 uretères traités dans le groupe DEFLUX, sans différence significative entre les deux groupes. Les effets indésirables graves rapportés dans cette étude sont 5 cas d'infections urinaires (3 cas avec MACROPLASTIQUE et 2 cas avec DEFLUX) accompagnées pour 2 cas de RVR persistants de grade élevé. Les résultats de cette étude sont détaillés en annexe. L'étude Moore et Bolduc16, 2011 (réalisée chez des sujets de plus de 12 ans), étude mono centrique prospective non randomisée, ayant inclus 27 patients post pubertaires (âge médian de 23 ans [12-65], sex ratio / 0, 12) totalisant 41 uretères affectés de RVR, dont 33 (80%) de grade I à II et 8 de grade III à V (20%). 13 patients (totalisant 18 uretères dont 11 de grade I à II et 7 de grade III à IV) ont été traités par MACROPLASTIQUE. Les critères d'inclusion étaient un RVR diagnostiqué par utétérocystographie, âge > 12 ans, pyélonéphrite récurrente, historique de RVR. La durée de suivi était de 3 mois. L'objectif de cette étude était l'évaluation de l'efficacité de l'injection urétéro-vésicale dans le traitement du RVR. Les deux dispositifs différents injectés étaient DEFLUX et MACROPLASTIQUE. Le critère primaire était le taux de succès chirurgical de l'intervention (disparition du RVR) évalué par utétérocystographie à 3 mois post-opératoire, le critère secondaire l'étude des effets indésirables de cette technique. Les résultats cliniques ont fait état d'un traitement efficace à trois mois pour 24 patients/27 (38 uretères /41) à la première injection, pour les deux dispositifs étudiés. Le groupe traité par MACROPLASTIQUE ayant eu un traitement efficace à 100% dès la première injection. Le groupe traité par DEFLUX a totalisé trois échecs de traitement à la première injection. L'effet curatif désiré a été obtenu chez ces trois patients par une seconde injection endoscopique du même produit. Le faible nombre de patients inclus, la faible représentativité des reflux vésico-rénaux de grade > 3, le caractère non randomisé de l'étude (allocation du traitement selon le choix du chirurgien au moment de l'implantation), l'hétérogénéité des causes ayant conduit au RVR limitent l'interprétation de cette étude. 04. 1. 1. 3. ÉVÉNEMENTS INDÉSIRABLES Au total, 11 incidents de matériovigilance, dont 8 ayant nécessité un traitement chirurgical, ont été signalés sur les cinq dernières années en Europe : o 1 ulcération au niveau de l'implant ayant entrané sa résection par voie endoscopique Moore K, Bolduc S. Treatment of vesicoureteral reflux in adults by endoscopic injection. Urology. 2011 ; 77(6) : 1284-7 -6- o 9 obstructions urétérales au niveau de l'implant dont 7 ont conduit à une intervention chirurgicale et 2 ont récupéré spontanément ou sous traitement médical. o 1 calcification au niveau de l'implant, 7 ans après implantation ayant conduit à un retrait chirurgical. Au total, par rapport à la précédente évaluation, 2 nouvelles études relatives à MACROPLASTIQUE ont été fournies. Au final, la Commission a considéré que ces données complémentaires ne remettaient pas en cause son précédent avis. 04. 1. 2. PLACE DANS LA STRATÉGIE THÉRAPEUTIQUE Chez l'enfant : L'antibioprophylaxie a pour objectif de prévenir les complications infectieuses du reflux et leurs éventuelles conséquences parenchymateuses jusqu'à ce que le reflux disparaisse (spontanément ou après chirurgie) ou jusqu'à ce que l'enfant ait atteint l'âge suffisant pour que les éventuelles infections urinaires n'aient plus de conséquences néfastes, même si le reflux persiste. En terme de traitement du reflux vésico-rénal, la réimplantation urétérovésicale est une option. Cependant, ce traitement chirurgical reste invasif avec une durée moyenne d'hospitalisation de l'ordre d'une semaine (données PMSI). En raison de son caractère moins invasif, le traitement par injection endoscopique peut être considéré comme une alternative à la chirurgie ouverte. Ce type de traitement ne compromet pas les résultats si une chirurgie ouverte s'avère nécessaire. Les recommandations actualisées de l'American Urological Association (AUA) en 201017 et l'European Association of Urology (EAU) en 201218 sont disponibles. Celles-ci préconisent l'injection endoscopique chez l'enfant pour le traitement du reflux vésico-rénal (RVR) dans certaines situations, en fonction des facteurs de risque tels que l'âge, les antécédents d'infections urinaires fébriles ou la sévérité du reflux. Les recommandations américaines recommandent notamment l'injection endoscopique chez les enfants de plus de 1 an sous antibioprophylaxie et ayant des infections urinaires fébriles récidivantes17. Par ailleurs, dans les recommandations européennes18 il est précisé que le traitement du RVR reste controversé sur le choix du traitement chirurgical (endoscopie ou chirurgie ouverte). Il est cependant précisé que en fonction du grade du reflux et de la présence de lésions rénales, tous les patients diagnostiqués dans la première année de vie devraient être traités initialement par antibioprohylaxie. Durant la petite enfance le risque de déveloper de nouvelles lésions rénales est elevé. Un traitement antibiotique devra être rapidement initié en cas d'infection fébrile récidivante. Chez les patients avec de fréquentes récidives d'infection urinaire fébrile, ne correction définitive du reflux par chirurgie ou par injection endoscopique est le traitement à privilégier. Chez l'adulte : L'antibioprophylaxie permet de limiter les risques d'infection urinaire et rénale liés au RVR. Néanmoins, il ne traite pas le reflux lui-même, et contrairement à ce qui peut être observé chez l'enfant avec la croissance, il n'y a pas de disparition spontanée du reflux à attendre chez l'adulte. American Urological Association. Management and Screening of Primary Vesicuoureteral Reflux in Children : AUA Guideline. 2010. American Urological Association. Management and Screening of Primary Vesicuoureteral Reflux in Children : AUA Guideline. 2010. reports/vur2010/AuthorsAndSummaryReport. pdf European Association of Urology. EAU Guideline on vesicoureteral reflux in children. Eur Urol 2012 ; 62 : 534-42. -7- En matière de traitement du reflux vésico-rénal, la réimplantation urétérovésicale reste le traitement de référence avec un taux de succès de l'ordre de 98%. Cependant, ce traitement chirurgical reste invasif avec une durée moyenne d'hospitalisation de l'ordre d'une semaine (données PMSI). Malgré un taux de succès moindre, mais en raison de son caractère moins invasif et de sa faible morbidité comparée au traitement chirurgical, le traitement par injection endoscopique peut être considéré comme une alternative à la chirurgie ouverte et être proposée avant celle-ci. La Commission considère que l'injection endoscopique sous muqueuse et sous-méatique d'agents de comblements, a un intérêt thérapeutique dans le traitement du RVR chez l'enfant avec pyélonéphrite récidivante sous antibioprophylaxie et dans le traitement du RVR chez l'adulte 04. 1. 3. CONCLUSION SUR L'INTERÊT DU PRODUIT Au final, la Commission estime que MACROPLASTIQUE a un intérêt thérapeutique dans le traitement du RVR chez l'enfant avec pyélonéphrite récidivante sous antibioprophylaxie et dans le traitement du RVR chez l'adulte 04. 2. INTÉRÊT DE SANTE PUBLIQUE 04. 2. 1. GRAVITÉ DE LA PATHOLOGIE Le RVR est une anomalie fréquente chez l'enfant entranant des complications à court, moyen et long terme : o A court terme : infections urinaires non fébriles, infections urinaires fébriles nécessitant des hospitalisations itératives de l'enfant, un traitement antibiotique par voie parentérale, un absentéisme scolaire répété. o A moyen terme : cicatrices rénales, séquelles des infections ascendantes. o A long terme : développement d'une néphropathie de reflux qui surajoute des cicatrices post-infectieuses acquises aux lésions dysplasiques préexistantes, pouvant aboutir à une hypertension artérielle et une insuffisance rénale en raison d'une réduction du capital néphronique et pouvant entraner à terme dialyse et greffe rénale. Beaucoup moins fréquent chez l'adulte, le RVR est également mieux toléré. Son traitement est recommandé chez des patients symptomatiques (douleur à la miction, infections urinaires fébriles récidivantes et rapprochées), notamment chez : o la femme jeune en âge de procréer afin d'éviter des pyélonéphrites susceptible d'avoir avec des conséquences sur le développement du fœtus, durant une grossesse. o les patients insuffisants rénaux chroniques en prétransplantation o les patients avec une dysfonction vésicale neuropathique Le reflux vésico-rénal est susceptible d'entraner des complications graves. 04. 2. 2. ÉPIDÉMIOLOGIE DE LA PATHOLOGIE La fréquence du reflux vésico-rénal évolue en fonction de l'âge19 du patient. Averous M, Biserte J, Dore B. Le reflux vésico-rénal primitif de l'enfant et de l'adulte. Prog Urol. 1998 ; 8 : 663 - 941. -8- Son incidence est estimée à 70% chez l'enfant de moins de 1 an, entre 25 et 30% chez les enfants de 1 à 4 ans et à 15% chez l'enfant de 5 à 12 ans. Chez l'adulte, l'incidence est de 5, 2%. Le reflux primitif peut disparatre spontanément. Le taux annuel de disparition spontanée est de 30% (tous grades confondus). Les chances de disparition sont maximales au cours des deux premières années après le diagnostic. Le grade du reflux est le principal facteur pronostique d'une disparition du reflux. A 5 ans, les chances de disparition spontanée sont de : - 80 à 90 % pour les grades I et II, - 40 à 50% pour le grade III, - 20 à 40% pour le grade IV. - Le taux de disparition des reflux de grade V a été rarement étudié car dans la plupart des séries un tel reflux est une indication chirurgicale. La présence d'une néphropathie de reflux diminue les chances de disparition. De manière globale, l'incidence du RVR primitif est estimée à 1% chez l'enfant. 04. 2. 3. IMPACT MACROPLASTIQUE répond à un besoin thérapeutique déjà couvert. 04. 2. 4. CONCLUSION SUR L'INTÉRÊT DE SANTÉ PUBLIQUE Le traitement du RVR a un intérêt de santé publique compte tenu de la fréquence et de la gravité des complications de cette pathologie. En conclusion, la Commission Nationale d'Évaluation des Dispositifs Médicaux et des Technologies de Santé estime que le Service Rendu de MACROPLASTIQUE est suffisant pour le renouvellement d'inscription sur la liste des Produits et Prestations et prévue à l'article L. 165-1 du code de la sécurité sociale dans les indications suivantes : - traitement du reflux vésico-rénal de l'enfant avec pyélonéphrite récidivante sous antibioprophylaxie - traitement du reflux vésico-rénal chez l'adulte 05 ÉLÉMENTS CONDITIONNANT LE SERVICE RENDU 05. 1. SPÉCIFICATIONS TECHNIQUES MINIMALES Aucune exigence supplémentaire par rapport aux spécifications techniques proposées par l'industriel. 05. 2. MODALITÉS D'UTILISATION ET DE PRESCRIPTION L'injection doit être réalisée par un urologue doté de matériel endoscopique pédiatrique adapté lors de l'utilisation chez l'enfant. -9- 06 AMÉLIORATION DU SERVICE RENDU 06. 1. COMPARATEURS RETENUS Chez l'enfant : l'implant urétéral de copolymère DEFLUX Chez l'adulte : la chirurgie ouverte 06. 2. NIVEAUX D'ASR Les données cliniques fournies ne permettent pas d'établir une supériorité de MACROPLASTIQUE par rapport à DEFLUX chez l'enfant. Aucune étude clinique n'est disponible pour comparer MACROPLASTIQUE à la chirurgie ouverte. La Commission s'est prononcée pour : - une absence d'Amélioration du Service Rendu (ASR V) par rapport à DEFLUX chez l'enfant - une absence d'Amélioration du Service Rendu (ASR V) par rapport à la chirurgie ouverte chez l'adulte en l'absence de données cliniques. 07 CONDITIONS DE RENOUVELLEMENT ET DURÉE D'INSCRIPTION 07. 1. CONDITIONS DE RENOUVELLEMENT Actualisation des données conformément aux recommandations du guide pratique pour l'inscription au remboursement des produits et prestations. 07. 2. DURÉE D'INSCRIPTION PROPOSÉE 5 ans. 08 POPULATION CIBLE En l'absence de données épidémiologiques, la population cible du traitement du reflux vésico-rénal par injection endoscopique chez des enfants avec pyélonéphrite récidivante sous antibioprophylaxie est difficile à estimer. D'après les données du PMSI, 6545 reflux ont été diagnostiqués en 2012, tous âges confondus. Il faut prendre en compte que cette incidence concerne les adultes et les enfants. L'incidence du reflux chez l'adulte étant de l'ordre de 5% (cf. 04. 2. 2 épidémiologie) on peut considérer que les données du PMSI concernent essentiellement l'enfant. Le reflux vésico-rénal peut disparatre spontanément. Dans son rapport, l'Association Française d'Urologie précise que les chances de disparition spontanée sont maximales dans les deux premières années qui suivent le diagnostic et recense un pourcentage global de disparition sur le long terme (> 4 ans) de l'ordre de 45%. Le nombre d'enfants candidats à la chirurgie endoscopique ou ouverte est estimé à environ 3600 patients par an. Le nombre d'adultes candidats à la chirurgie endoscopique ou ouverte ne peut être estimé. A titre d'information, les ventes de MACROPLASTIQUE dans les indications de la LPPR, pour le conditionnement adulte (2, 5 ml) ont été de 594 unités en 2011. - 10 - A titre informatif, pour le traitement du RVR (endoscopie et chirurgie ouverte), le nombre d'actes réalisés en 2012, sans distinction de l'âge des patient, dans les bases de données des établissements publics et du privés est : Nombre d'actes JCLE004 Injection Total traitement sousmuqueuse intra- endoscopique : urétérale de matériel 1594 hétérologue, par 1594 endoscopie JCEA 002 Réimplantation urétérovésicale unilatérale avec création de montage antireflux, par abord Total Chirurgie direct ouverte : JCEA001 Réimplantation urétérovésicale 958 bilatérale avec création de montage antireflux, par abord direct Il faut tenir compte du fait qu'un même patient peut se voir proposer une deuxième voire une troisième injection endoscopique en cas d'échec de la précédente et avant un recours à la chirurgie ouverte. La population cible de MACROPLASTIQUE ne peut être estimée précisément mais elle ne devrait pas être supérieure à 3600 patients par an chez l'enfant. Aucune donnée épidémiologique ne permet d'estimer la population cible chez l'adulte. A titre informatif, la population rejointe globale est estimée au maximum à 1600 cas par an. - 11 - ANNEXE Données cliniques Etude monocentrique contrôlée randomisée KIM et al. Clinical Efficacy and Safety in children with vesicoureteral reflux of Référence a single injection of two different bulking agents- polydimethylsiloxane (Macroplastique) or Dextranomer/Hyaluronic Acid Copolymer (Deflux) : A short-term Prospective Comparative Study, Urologia Internationalis, 2011 ; 87 : 299-303 Type de l'étude Etude monocentrique contrôlée randomisée ouverte Date et durée de Entre janvier 2007 et décembre 2009 l'étude Comparer à 3 mois l'efficacité et la sécurité de l'utilisation d'une injection unique Objectif de d'agents de comblement (DEFLUX et MACROPLASTIQUE) chez des enfants atteints l'étude de reflux vésico-rénal (RVR) METHODE Critères d'inclusion : - Présence d'un reflux persistant de grade II à V - Infections urinaires récidivantes Critères de Critères de non inclusion : sélection - Reflux secondaire, - Infection urinaire au moment de l'injection, - Antécédent de réimplantation chirurgicale, - Vessie neurogène. Cadre et lieu de Corée du sud l'étude MACROPLASTIQUE (implant urétéral de polydiméthylsiloxane) Produits étudiés DEFLUX Le critère principal de jugement n'est pas clairement défini dans la publication. Les Critère de résultats sont rapportés en termes de guérison (absence de reflux) et de succès. jugement Le taux de succès étant définit par l'absence de RVR ou un RVR de grade I, Taille de 85 patients l'échantillon Méthode de Randomisation simple selon un ratio 1 : 1 randomisation Méthode de randomisation non précisée Méthode d'analyse des Test du Chi2 résultats RESULTATS 73 enfants analysés (32 filles et 41 garçons)/106 uretères - injection de MACROPLASTIQUE : 37 patients (55 uretères) Nombre de - injection de DEFLUX : 36 patients (51 uretères) sujets analysés Au total, 12 enfants ont été perdus de vue (5 dans le groupe MACROPLASTIQUE et 7 dans le groupe DEFLUX) Durée du suivi La durée moyenne de suivi était de 16, 2 [4-19] mois - 12 - MACROPLASTIQUE DEFLUX (n 37 patients/55 (n 36 patients/51 uretères) uretères) ans 10 12 Age > 2 ans 27 24 garçon 17 24 sexe 20 12 fille Caractéristiques unilatér 19 21 des patients et ale comparabilité latéralité bilatéral 18 15 des groupes e I 18 16 Grade du II 13 10 reflux III 14 17 IV 10 8 Les deux groupes étaient comparables à l'inclusion Résultats par grade de sévérité : Comparaison à 3 mois de suivi L'unité statistique prise en compte pour les résultats est l'uretère et non le patient, soit 106 uretères. Le critère principal de jugement n'est pas clairement défini dans la publication. MACROPLASTIQUE DEFLUX Diminu Guérison Taux de Diminution Guérison Taux de Grade tion au (absence succès au Grade I (absence de succès RVR Grade I de RVR) (absence de RVR) (absence Résultats RVR et de RVR et inhérents au grade I) grade I) critère de II 3 14 17 1 14 15 jugement III 3 9 12 2 7 9 IV 2 10 12 8 5 13 V 2 5 7 4 2 6 Une différence significative entre les deux groupes est rapportée en termes de taux de guérison. Le taux de succès après injection de MACROPLASTIQUE et de DEFLUX était de 48/55 versus 43/51 respectivement. Ce taux de succès se définit par l'absence de RVR ou un RVR de Grade I. La différence entre les deux groupes n'était pas significative. Trois cas d'infections urinaires postopératoires avec MACROPLASTIQUE et deux cas Effets avec DEFLUX étaient rapportés. Parmi ces cas, deux avaient un RVR persistant de indésirables grade élevé. Critère principal de jugement non défini. Pas de calcul du nombre de sujets nécessaires Commentaires réalisé a priori et résultats à court terme (trois mois). - 13 - | HAS | Scientific |
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La parthénogenèse (des mots grecs , parthénos, vierge, et , génesis, naissance) est la division à partir d'un gamète femelle non fécondé. C'est un mode de reproduction monoparental comme l'autofécondation qui nécessite quant à elle l'intervention des deux gamètes, mâles et femelles, apportés par le même individu hermaphrodite. Elle appartient aux modes de reproduction sexuée car elle nécessite l'intervention d'un gamète, mais étant donné l'absence d'apport de matériel génétique d'un autre individu, le résultat s'apparente à la reproduction asexuée. Ce phénomène s'observe naturellement chez certaines espèces végétales et animales, mais peut également être provoqué artificiellement.
Dans le règne végétal, la parthénogenèse (on parle alors d'apomixie) est assez commune, avec ou sans autre mode de reproduction, sauf parmi les plantes à fleurs (angiospermes), la fleur enveloppant l'organe de reproduction sexuée femelle (mais l'un n'empêche pas l'autre)[pas clair]. Dans le règne animal, la parthénogenèse se rencontre dans de nombreux taxons comme les nématodes, les polychètes, les oligochètes, les némertiens, les arthropodes (dont les insectes comme l'abeille et les pucerons), les gastrotriches et chez les vertébrés, certains reptiles (dragon de Komodo), oiseaux (Dinde) et poissons.
Au niveau de la cellule
La formation de l'ovule par la méiose, ou ontogenèse, sans l'intervention de la fécondation avec un gamète mâle aboutit théoriquement à une cellule œuf haploïde.
En l'absence d'amphimixie et de fécondation, le développement d'un individu issu de la parthénogenèse ne suivra pas tout à fait le même développement qu'un individu issu d'une fécondation. Plusieurs cas de figure sont possibles selon le type d'individu produit par la parthénogenèse.
Individu haploïde
Dans ce cas de figure, les individus produits sont haploïdes et généralement des mâles. Ces individus, afin de produire des gamètes mâles suivront une spermatogenèse un peu particulière. En effet, l'haploïdie de ces individus ne permettra pas l'appariement des paires de chromosomes homologues lors de la prophase I. De ce fait, on aura lors de la première division l'émission d'un globule polaire anucléé, suivi de la deuxième division qui produira un globule polaire haploïde (qui va dégénérer) et d'une spermatide également haploïde qui se différenciera ensuite en spermatozoïde.
Individu diploïde
La parthénogenèse se produisant à partir d'un gamète haploïde, il y a nécessité d'un retour à l'état diploïde pour que l'individu produit soit viable. Pour cela, plusieurs mécanismes sont possibles :
Durant la gamétogenèse
Retour à la diploïdie lors de la gamétogenèse (modification de la méiose).
Au cours de l'ovogenèse, le second globule polaire n'est pas émis. Son noyau va fusionner avec celui de l'ovotide et former ainsi un parthénote diploïde, mais issu d'un seul gamète.
On peut aussi avoir un retour à la diploïdie par la suppression pure et simple de la méiose (simple mitose). L'ovocyte sera alors activé au moment de la ponte (par un stimulus mécanique par exemple) ou par simple développement, sans facteurs d'induction particuliers.
Après la gamétogenèse
La diploïdie est restaurée après la formation du parthénote (la méiose se déroule normalement).
À la fin de l'ontogenèse, après l'émission des deux globules polaires, l'ovotide haploïde va se segmenter :
les deux premiers noyaux fils (des blastomères) vont fusionner et rétablir ainsi la diploïdie ;
à mesure de la segmentation, les noyaux fils vont bloquer leur cycle mitotique après la duplication de leurs chromosomes, ce qui va rétablir cellule par cellule la diploïdie du parthénote.
Phénomène d'endomitose : on peut avoir une duplication des chromatides, mais qui ne sera pas suivie d'une division cellulaire. Ce phénomène conduit à la polyploïdie.
Sexe de la descendance
Parthénogenèse thélytoque
La parthénogenèse thélytoque est une forme qui aboutit à une descendance uniquement composée de femelles. C'est la plus fréquemment rencontrée dans la nature, elle est obligatoire et constante.
Les femelles sont diploïdes. Il peut même y avoir absence totale de mâles dans l'espèce, comme chez les Cnemidophorus ou lézards à queue en fouet.
Arrhénotoque
La parthénogenèse arrhénotoque est une forme qui donne des mâles si les ovocytes ne sont pas fécondés, et à des femelles si les ovocytes sont fécondés. C'est donc une parthénogenèse facultative et l'espèce possède des individus des deux sexes. Elle se retrouve par exemple chez les insectes (hyménoptères, thrips), chez les acariens mais aussi chez certains oiseaux comme le condor de Californie et chez le dragon de Komodo. Les œufs non fécondés des fourmis et des abeilles produisent des mâles (haploïdes), par contre les femelles sont issues d'œufs fécondés.
Deutérotoque
Dans le cas de la parthénogenèse deutérotoque, il y a parfois apparition de mâles de manière cyclique à une période de l'année, elle devient alors deutérotoque. Il y a production de mâles et de femelles. Elle se retrouve par exemple chez les crustacés, les amphibiens ou encore les rotifères. Certaines espèces de pucerons utilisent ce mode de reproduction pour produire des mâles et des femelles à l'approche de l'hiver.
Types de parthénogenèse
Il existe différents types de parthénogenèse, qu'elle soit régulière, accidentelle, rudimentaire, géographique ou que ce soit de la pédogenèse, il y a des particularités dans chacune d'elles.
La parthénogenèse se fait lorsqu'il y a développement d'un œuf vierge de façon spontanée et sans intervention de gamètes mâles.
Régulière
Obligatoire
On parle de parthénogenèse régulière obligatoire lorsque l'ovule est non fécondable. Dans ce cas, elle peut être constante ou indéfinie, c'est-à-dire que toutes les générations seront parthénogénétiques, dans ce cas il est possible de n'avoir que des femelles. On parle de parthénogenèse thélytoque lorsque les mâles sont absents. Les phasmes sont des individus qui réalisent la parthénogenèse obligatoire. Dans ce cas la reproduction par parthénogenèse a lieu toute l'année.
Mais il existe aussi une parthénogenèse régulière cyclique, dans cette situation le cycle biologique est constitué d'une alternance de générations parthénogénétiques thélytoques et deutérotoques. Les générations parthénogénétiques alternent avec des générations à reproduction sexuée, comme chez certains insectes ou chez les daphnies (crustacé). Dans le cas de la parthénogenèse cyclique, les saisons peuvent déterminer l'alternance reproduction sexuée et reproduction asexuée. Elle permet, lors de la mauvaise saison, à deux individus de donner naissance à plusieurs générations d'individus parthénogénétiques.
Facultative
Lorsqu'on parle de parthénogenèse régulière facultative on parle de la possibilité d'un ovule d'être fécondé ou non. Dans le cas de la parthénogénèse arrhénotoque, les œufs donneront des mâles ; cependant lors de la fécondation les zygotes produits donneront des femelles. L'ovule non fécondé donnera systématiquement un zygote haploïde qui se développera en individu mâle tandis que l'ovule fécondé donnera un zygote diploïde donnant un individu femelle. On retrouve ce type de parthénogenèse notamment chez les abeilles.
Les nématodes du genre Mesorhabditis (famille des Rhabditidae) présentent un cas très particulier, : les mâles producteurs de sperme s'accouplent avec les femelles, mais les spermatozoïdes ne fusionnent généralement pas avec l'ovule. Le contact avec le sperme est néanmoins essentiel parce que le spermatozoïde apporte un centrosome, nécessaire à la formation des microtubules impliqués dans la division cellulaire, et parce que c'est lui qui déclenche la dernière étape de la méiose, sauf que l'ovule reste diploïde au lieu de se scinder en deux et de recevoir l'ADN du spermatozoïde. Dans moins d'un cas sur dix il se produit une vraie fécondation, qui produit alors un mâle, porteur du chromosome Y. Les mâles constituent 9 % de la population, proportion qu'un modèle de théorie des jeux démontre comme étant une stratégie stable du point de vue du développement de la population.
Polyploïde
Il existe des espèces polyploïdes parthénogénétiques et des espèces présentant une forme diploïde à reproduction sexuée et une forme polyploïde parthénogénétique.
La forme polyploïde possède plus de deux versions du même chromosome. Il y a ainsi des espèces triploïdes, tétraploïdes, hexaploïdes, etc. Les espèces possédant un nombre impair de chromosomes, comme les triploïdes, sont assez souvent stériles du fait de l'impossibilité de séparer équitablement chaque lot de chromosomes homologues lors de la méiose. Ainsi, la parthénogenèse constitue un recours qui permet à ces espèces de continuer à se perpétuer.
On peut remarquer que la polyploïdie présente un certain intérêt adaptatif pour les espèces qui la possèdent. En effet, pour un même gène, l'individu a, ainsi, un plus grand nombre d'allèles et augmente ses chances d'adaptations et de colonisation du milieu.
Exemple : l'espèce Trichoniscus provisorius (elle possède des populations diploïdes 2n=16 et des populations triploïdes 3n=24 ) ; le phasme Clonopsis gallica (avec des populations triploïdes).
Accidentelle
La parthénogenèse accidentelle concerne les espèces o le zygote est obtenu, normalement, après une fécondation par le gamète mâle. Lors d'un développement issu d'un œuf parthénogénétique on a alors, selon les espèces, uniquement des femelles (thélytoque), uniquement des mâles (arrhénotoque) ou les deux (deutérotoque). On peut noter que, chez ces espèces, on a généralement un pourcentage très limité d'ovules.
Rudimentaire
Dans ce cas de parthénogenèse, le développement parthénogénétique commence, mais ne termine jamais comme chez les mammifères, ou très rarement comme chez certains oiseaux ou invertébrés.
Géographique
La parthénogenèse géographique se rencontre de manière irrégulière, et dans de nombreux groupes représente la reproduction exclusive. Chez certaines espèces on observe une reproduction différente selon la localisation géographique. Le papillon Siederia alpicolella, par exemple, est diploïde et bisexué en Suisse mais tétraploïde et parthénogénétique en Europe du Nord. [réf. nécessaire]
Pédogenèse
La pédogenèse est une parthénogenèse qui se produit chez la forme larvaire, elle est assez proche de la parthénogenèse cyclique. Ce type de parthénogenèse s'accompagne généralement de viviparité puisque la larve est dépourvue d'orifice de ponte. On rencontre le phénomène de pédogenèse en période d'abondance alimentaire puisque les larves se nourrissent activement. Les Cécidomyidés, par exemple, réalisent la pédogenèse.
Artificielle
La parthénogenèse artificielle (provoquée par la science chez l'animal, en laboratoire) a été réalisée par exemple chez l'oursin, dans les années 1910, par Jacques Loeb ; par Eugène Bataillon, qui réussit à provoquer une réaction de développement d'œufs non fécondés de grenouille. Et par Pincus chez la lapine, avec un succès mitigé, comme indiqué plus bas.
Intérêt écologique
Avantages et inconvénients
Avantages
La parthénogenèse thélytoque, chez les espèces chez lesquelles elle a lieu, évitent de recourir au sexe, qui est couteux d'un point de vue énergétique la production d'individus mâles par rapport à celle d'individus femelles constitue une perte énergétique importante. En effet, les femelles en règle générale fournissent la plus grande partie de l'énergie nécessaire à la reproduction sexuée. Or cette énergie fournie pour le développement d'un nouvel individu participe en partie à engendrer des mâles qui eux-mêmes ne seront pas capables de produire directement de nouveaux individus. Ainsi, un système de reproduction parthénogénétique engendrant des femelles permet une production d'individus plus grande sur un faible nombre de générations qu'un système de reproduction sexuée. Grâce à cette efficacité démographique, l'inclusion dans un cycle de reproduction d'une phase parthénogénétique, en permettant de réduire le nombre des mâles, peut avoir un intérêt écologique certain (par exemple une conquête plus efficace du milieu dans le cas des daphnies). Si la reproduction sexuée permet la formation d'une plus grande diversité au sein des générations, et est donc utile à long terme en permettant aux espèces de s'adapter aux modifications de leur environnement, à court terme elle peut représenter un coût énergétique important. Elle peut alors être défavorable au cours du processus de sélection lorsque les conditions du milieu restent plutôt constantes et favorables à la prolifération des populations. Ainsi, la parthénogenèse peut constituer un atout d'importance pour les espèces dans la course à la conquête d'un habitat.
Inconvénients
La parthénogenèse limite la diversité génétique des descendants, ce qui rend les espèces concernées vulnérables aux changements environnementaux. Bien que les descendants ne soient pas strictement des clones, les variations génétiques restent faibles, augmentant le risque de cul-de-sac évolutif, particulièrement pour les espèces à parthénogenèse obligatoire.
Par exemple, chez le lézard Aspidoscelis neomexicana, constitué uniquement de femelles, la reproduction repose entièrement sur des individus presque identiques aux parents. De même, chez Trichoniscus, les femelles parthénogénétiques ne peuvent pas se reproduire sexuellement avec des mâles, limitant leur capacité d'adaptation. Si l'environnement venait à changer brusquement, ces espèces risqueraient de disparatre faute de pouvoir évoluer rapidement.
Chez différents groupes
Angiospermes
Chez les Angiospermes, la parthénogenèse peut prendre deux aspects différents :
elle peut être méiotique, et induite in situ par un croisement interspécifique qui échoue : un grain d'allopollen (pollen d'une autre espèce angiospermienne proche) atteint le stigmate et provoque l'émission de signaux biochimiques qui induisent un développement méiotique de l'oosphère non fécondée. On obtient alors un embryon dont le niveau de ploïdie est divisé par deux par rapport à l'organisme de départ, et dont le génotype a subi des recombinaisons homologues (crossings-over). Malgré tout, ce mode de reproduction permet de fixer des génotypes s'ils sont homozygotes pour un très grand nombre de couples d'allèles ;
elle peut être améiotique, on parle alors d'apomixie. Lors de certains échecs de la méiose femelle, une cellule 2n = 2x du nucelle subit des mitoses et conduit à un embryon au même niveau de ploïdie que celui de l'organisme de départ. Cette reproduction est alors clonale.
Reptiles
Parmi les reptiles, environ quinze espèces de lézards whiptails (lézards à queue en fouet, genre Cnemidophorus) se reproduisent exclusivement par parthénogenèse. Ces lézards vivent dans le climat sec et quelquefois rude du sud-ouest des États-Unis et du nord du Mexique. Toutes ces espèces qui se multiplient par voie asexuée semblent être nées par croisement entre deux ou trois des espèces sexuées, ce qui aurait conduit à des individus polyploïdes. Le mécanisme par lequel le mélange de chromosomes de deux ou trois espèces peut être cause de reproduction parthénogénétique est inconnu. Puisque les événements d'hybridation multiple peuvent se produire, les différentes espèces parthénogénétiques de whiptails peuvent remonter à de multiples lignées asexuées, indépendantes les unes des autres. Dans chaque lignée, la diversité génétique est très faible, mais différentes lignées peuvent avoir des génotypes tout à fait différents.
Un aspect intéressant dans la reproduction chez ces lézards est qu'on observe toujours un comportement d'accouplement, même si les populations sont entièrement femelles. Une femelle joue le rôle autrefois dévolu au lézard mâle et monte celle qui est sur le point de pondre. La raison qu'ont ces animaux d'agir ainsi est due à leurs cycles hormonaux, qui font agir certains comme des mâles lorsque leurs niveaux d'œstrogène sont bas tandis que d'autres jouent le rôle de femelle quand leurs niveaux d'œstrogène sont élevés. Les lézards qui suivent ce rite de parade ont une fécondité plus grande que ceux que l'on garde dans l'isolement en raison de l'augmentation d'hormones qui accompagne la ponte. Ainsi même si ces populations n'ont pas de mâles, elles exigent toujours des stimuli sexuels pour assurer un maximum de succès dans la reproduction.
Les Lepidodactylus lugubris (petits geckos d'une dizaine de centimètres) ainsi que les Heteronotia utilisent également la parthénogenèse comme mode de reproduction.
On sait depuis la naissance en 2006, dans les zoo de Londres et de Chester au Royaume-Uni, de plusieurs dragons de Komodo sans pères, que ce gigantesque lézard long de 2 à 3 m, présente une spécificité rare : les femelles peuvent assurer leur descendance par parthénogenèse. S'il n'y a pas de mâle reproducteur dans les environs, elles peuvent elles-mêmes en enfanter, pour ensuite s'accoupler avec eux et donner naissance à une nouvelle génération de mâles et de femelles (suivant le système ZW de détermination sexuelle). Ce processus est néanmoins préjudiciable à la diversité génétique de l'espèce.
La parthénogenèse est observée pour la première fois chez une espèce de crocodiles en 2023. Cependant, aucun des œufs de cette femelle Crocodylus acutus, vivant en captivité au Costa Rica, n'a éclos, .
Poissons
Plusieurs cas de parthénogenèse ont été observés chez des requins en captivité. Un premier cas chez une femelle requin-marteau, au zoo Henry Doorly au Nebraska selon le journal Biology Letters (en) publié par la Royal Society à la suite d'une étude de l'université Queen's de Belfast (Irlande du Nord), de l'Institut de recherches Guy Harvey (en) de la Nova Southeastern University en Floride et du zoo Henry Doorly sur le cas d'une grossesse d'une femelle qui n'a pas été en présence d'un requin mâle depuis trois ans. Une autre observation a été faite à l'aquarium Reef HQ de Townsville (Queensland, Australie), ou une femelle requin zèbre, a donné naissance à plusieurs petits alors qu'elle avait été séparée de son compagnon depuis des années. Les recherches ont ensuite montré que ces petits étaient parthénogénétique, . Enfin, un autre requin zèbre, a aussi donné plusieurs portées parthénogénétique, pendant quatre ans. Cette observation a été faite au Dubai Aquarium & Underwater Zoo.
Un autre cas certain semble être celui d'un petit poisson, le killi des mangroves (Kryptolebias marmoratus) en Floride.
Insectes
Il y a également des cas de parthénogenèse chez les insectes. Un exemple classique est celui des abeilles. En effet, les mâles des abeilles naissent d'œufs non fécondés ; ils sont par conséquent haploïdes. Les œufs fécondés donnent naissance à des abeilles femelles : les futures ouvrières, ou, très exceptionnellement, des reines lorsque les ouvrières nourrissent les larves uniquement avec de la gelée royale pendant les 9 jours qui précèdent l'operculation des cellules royales. La seule fonction des mâles est de féconder une jeune reine lors du vol nuptial qu'elle réalise environ une semaine après sa naissance et au cours duquel elle sera fécondée par sept à quinze mâles différents.
Dans la situation extrême o la reine meurt sans laisser de couvain à partir duquel les ouvrières peuvent élever une jeune reine, il est fréquent de voir des ouvrières commencer à pondre : elles en étaient jusqu'alors empêchées par des phéromones émises par la reine. Puisque ces femelles sont incapables de s'accoupler, leurs œufs non fécondés ne produisent que des mâles, et l'extinction de la ruche est inévitable. On a conjecturé qu'autrefois les ouvrières étaient moins spécialisées et auraient été capables, dans ces circonstances, de s'accoupler avec les mâles, permettant ainsi de rendre vie à la colonie ; mais ce n'est qu'une supposition.
Les fourmis mâles sont également issus d'une reproduction par parthénogenèse ; ce n'est par contre pas le cas chez les termites. On a découvert deux cas de parthénogenèse chez les fourmis. Le premier cas, chez Wasmannia auropunctata ne concerne que les sexués, mâles et femelles fécondes. Les ouvrières sont, par contre, issues d'une reproduction sexuée. Le second, chez Mycocepurus smithii, espèce de fourmis champignonnistes, est à cent pour cent parthénogénétique. Aucun mâle n'existe chez cette espèce et tous les individus sont femelles. Il reste encore à découvrir l'intérêt pour celles-ci de ce mode de reproduction.
Lorsque les jours sont longs (printemps et été), les pucerons se reproduisent par parthénogenèse ; tous les individus produits par cette reproduction parthénogénétique sont des femelles, contrairement au cas des abeilles.
Chez d'autres insectes, enfin, comme le cynips du rosier (une guêpe à galle) et certaines espèces de phasmes, la reproduction est presque exclusivement parthénogénétique.
Mammifères
Chez les mammifères, la parthénogenèse est difficile, et sans doute impossible dans la nature, en raison notamment du phénomène d'empreinte, qui fait que la chromatine de l'ovule et celle du spermatozoïde sont différentes.
Dès 1939, Gregory Pincus réussit la parthénogenèse de la lapine, avec un succès pour 200 tentatives, .
Après enquête, il apparut que Hwang Woo-suk, qui avait annoncé avoir réussi le clonage humain, avait en fait observé la première parthénogenèse humaine (limitée aux premiers stades embryonnaires) - si l'on suppose l'expérience authentique car les travaux de ce scientifique à ce sujet sont aujourd'hui considérés comme truqués.
Gynogenèse
La gynogenèse est une forme de multiplication asexuée rattachée à la parthénogenèse. Dans la gynogenèse, c'est le même mécanisme qui opère que dans la parthénogenèse, mais il faut que l'œuf soit stimulé par la présence de sperme pour qu'il se développe, sans toutefois que le spermatozoïde participe de façon active. Puisque dans les espèces gynogenétiques il n'y a pas de mâles, l'activation de l'œuf exige que la femelle s'accouple avec un mâle d'une espèce voisine. Quelques salamandres du genre Ambystoma sont gynogenétiques et semblent l'être depuis plus d'un million d'années. On croit que la réussite de ces salamandres repose sur le fait que dans des cas très rares (peut-être une fois sur un million) le mâle féconde réellement les œufs, ce qui renouvelle le matériel génétique. [réf. nécessaire]
Hybridogenèse
L'hybridogenèse correspond à un accouplement fertile entre deux parents de lignées génétiques ou d'espèces différentes qui permet le développement des œufs femelles chez qui les cellules somatiques sont hybrides et les cellules germinales ne contiennent que le génome maternel. De cette manière, les individus obtenus sont des hybrides fertiles qui ne transmettent que le génome maternel. Ce phénomène se retrouve chez certains poissons, reptiles, grenouilles et insectes sociaux.
Notes et références
Notes
Références
Voir aussi
Bibliographie
Biologie et physiologie animales, WEHNER et GEHRING
La reproduction des invertébrés, P. CASSIER/R. LAFONT/M. DESCHAMPS/M. PORCHET/D. SOYEZ, édition MASSON
Physiologie das animaux, construction de l'organisme homéostasie et fonctions de relations(tome 2), Daniel Richard, Édition Nathan 1998
Imaginaire
Dans la série télévisée Dr. House (saison 5 épisode 11), Gregory House découvre une parthénogenèse chez une femme venue faire un test ADN. On découvre plus tard dans l'épisode que c'est en fait une invention du docteur House pour éviter à une patiente de devoir avouer à son conjoint qu'elle l'a trompé.
Dans la série télévisée Les Shadoks, les protagonistes susnommés se reproduisent par parthénogenèse.
Dans la série de bandes dessinées Blake et Mortimer, dans Les 3 Formules du professeur Sat (tome 1 et 2), les androïdes sont créés par parthénogenèse électronique .
Dans la saga vidéoludique Mass Effect, la race extraterrestre Asari se reproduit par parthénogenèse.
Religion
Conception virginale ;
Théogonie, lors de laquelle des déesses engendrent seules d'autres dieux.
Articles connexes
Reproduction dans le règne animal
Pédogenèse
Apomixie
Parthénocarpie
Liens externes
Parthénogénèse chez les Copépodes planctoniques marins
Parthénogénèse chez les phasmes
Nico8386. free. fr/cours/BA/parthenogenese. pdf
forums. futura-sciences. com/biologie/316519-parthenogenese. html
Portail de la biologie | WIKIPEDIA | Wiki |
Conséquences éventuelles d'un mauvais état bucco-dentaire au niveau cérébral : à propos de 5 cas Maxime Hatchuel To cite this version : Maxime Hatchuel. Conséquences éventuelles d'un mauvais état bucco-dentaire au niveau cérébral : à propos de 5 cas . Médecine humaine et pathologie. 2016. dumas-01400291 HAL Id : dumas-01400291 Submitted on 21 Nov 2016 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. UNIVERSITÉ NICE-SOPHIA ANTIPOLIS FACULTÉ DE CHIRURGIE DENTAIRE 24 Avenue des Diables Bleus, 06357 Nice Cedex 04 - Les germes les plus fréquemment rencontrés dans le cas d'abcès cérébral sont - - - - - Figure 1 : Les différentes bactéries retrouvées dans les abcès cérébraux - - Tableau IV : Différentes options de traitements envisagées Serment d'Hippocrate En présence des Matres de cette Faculté, de mes chers condisciples, devant l'effigie d'Hippocrate, Je promets et je jure, au nom de l'Etre Suprême, d'être fidèle aux lois de l'Honneur et de la probité dans l'exercice de La Médecine Dentaire. Je donnerai mes soins gratuits à l'indigent et n'exigerai jamais un salaire au-dessus de mon travail, je ne participerai à aucun partage clandestin d'honoraires. Admis dans l'intérieur des maisons, mes yeux ne verront pas ce qui se passe, ma langue taira les secrets qui me seront confiés et mon état ne servira pas à corrompre les mœurs ni à favoriser le crime. Je ne permettrai pas que des considérations de religion, de nation, de race, de parti ou de classe sociale viennent s'interposer entre mon Devoir et mon patient. Je garderai le respect absolu de la vie humaine dès sa conception. Même sous la menace, je n'admettrai pas de faire usage de mes connaissances médicales contre les lois de l'Humanité. Respectueux et reconnaissant envers les Matres, je rendrai à leurs enfants l'instruction que j'ai reçue de leurs pères. Que les hommes m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses, Que je sois couvert d'opprobre et méprisé de mes confrères si j'y manque. | HAL | Scientific |
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FLUCONAZOLE ARROW LAB 150 mg, gélule - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 09/03/2021 FLUCONAZOLE ARROW LAB 150 mg, gélule Fluconazole. 150 mg Pour une gélule. Excipient à effet notoire : lactose. Chaque gélule contient 151, 68 mg de lactose. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. FLUCONAZOLE ARROW LAB 150 mg, gélule est indiqué chez l'adulte dans le traitement de : Candidoses vaginales, aigus ou récidivantes ; lorsqu'un traitement local n'est pas possible. Balanites candidosiques lorsqu'un traitement local n'est pas possible. FLUCONAZOLE ARROW LAB 150 mg, gélule est indiqué chez l'adulte dans la prophylaxie de : Récidive de candidose vaginale (4 épisodes ou plus par an). Le traitement peut être instauré avant de connatre les résultats des cultures et des autres examens biologiques ; cependant, une fois ces résultats disponibles, le traitement anti-infectieux doit être ajusté en conséquence. Il convient de tenir compte des recommandations officielles concernant l'utilisation appropriée des antifongiques. Adultes Populations particulières Le fluconazole est principalement éliminé dans les urines sous forme inchangée. Lors du traitement à dose unique, aucun ajustement de la posologie n'est nécessaire. Chez les patients (y compris les enfants) présentant une altération de la fonction rénale qui recevront des doses répétées de fluconazole, une dose initiale de 50 mg à 400 mg doit être administrée, en fonction de la posologie normale recommandée dans l'indication concernée. Après cette dose de charge initiale, la dose quotidienne (selon l'indication) doit être ajustée selon le tableau suivant : Les patients en hémodialyse doivent recevoir 100 % de la dose recommandée après chaque hémodialyse ; les jours de non-dialyse, les patients doivent recevoir une dose réduite en fonction de leur clairance de la créatinine. Les données disponibles chez les patients présentant une insuffisance hépatique sont limitées, le fluconazole doit donc être administré avec prudence chez les patients présentant une altération de la fonction hépatique (voir rubriques 4. 4 et 4. 8). Population pédiatrique La sécurité et l'efficacité dans la population pédiatrique pour l'indication candidoses génitales n'ont pas été établies. Les données actuellement disponibles pour d'autres indications pédiatriques sont décrites dans la rubrique 4. 8. Si le traitement est impératif chez l'adolescent (de 12 à 17 ans), la posologie doit être la même que celle recommandée chez l'adulte. Mode d'administration Le médecin doit prescrire la forme pharmaceutique et le dosage les plus appropriés en fonction de l'âge, du poids et de la posologie. La forme gélule n'est pas adaptée à un usage chez les nourrissons et les jeunes enfants. Des formes liquides buvables de fluconazole sont disponibles et sont mieux adaptées à cette population. La co-administration avec la terfénadine est contre-indiquée chez les patients traités par FLUCONAZOLE ARROW LAB à doses répétées supérieures ou égales à 400 mg par jour sur la base des résultats d'une étude d'interaction à doses répétées. La co-administration avec d'autres médicaments connus pour prolonger l'intervalle QT et métabolisés par les cytochromes P450 (CYP) 3A4 tels que cisapride, astémizole, pimozide, quinidine et érythromycine est contre-indiquée chez les patients traités par le fluconazole (voir rubriques 4. 4 et 4. 5). FLUCONAZOLE ARROW LAB doit être administré avec prudence chez les patients présentant une altération de la fonction rénale (voir rubrique 4. 2). Insuffisance surrénale Le kétoconazole est connu pour provoquer une insuffisance surrénale qui peut également s'observer avec le fluconazole, même si les cas sont rares. Iinsuffisance surrénale liée à un traitement concomitant par prednisone : voir rubrique 4. 5 Effet du fluconazole sur d'autres médicaments . FLUCONAZOLE ARROW LAB doit être administré avec prudence chez les patients présentant une altération de la fonction hépatique. FLUCONAZOLE ARROW LAB est associé à de rares cas de toxicité hépatique grave parfois mortelle, principalement chez des patients présentant des pathologies sous-jacentes graves. Dans les cas d'hépatotoxicité associée au fluconazole, aucune relation avec la dose totale quotidienne, la durée du traitement, le sexe ou l'âge des patients n'a été mise en évidence. L'hépatotoxicité associée au fluconazole est généralement réversible à l'arrêt du traitement. Les patients qui présentent des anomalies des tests de la fonction hépatique pendant le traitement par fluconazole doivent être étroitement surveillés pour éviter la survenue d'une atteinte hépatique plus grave. Le patient doit être informé des symptômes suggérant des effets hépatiques graves (asthénie importante, anorexie, nausées persistantes, vomissements et ictère). Le traitement par le fluconazole doit être immédiatement interrompu et le patient doit consulter un médecin. Système cardiovasculaire Certains dérivés azolés, y compris le fluconazole, sont associés à l'allongement de l'intervalle QT sur l'électrocardiogramme. Depuis la commercialisation, de très rares cas d'allongement de l'intervalle QT et de torsades de pointes ont été observés chez des patients traités par fluconazole. Ces cas incluent des patients gravement malades avec des facteurs de risque confondants multiples, comme une cardiopathie structurelle, des anomalies électrolytiques et des associations médicamenteuses susceptibles d'y contribuer. FLUCONAZOLE ARROW LAB doit être administré avec prudence chez les patients présentant des conditions proarythmogènes potentielles. La co-administration avec d'autres médicaments connus pour prolonger l'intervalle QT et métabolisés par les cytochromes P450 (CYP) 3A4 est contre-indiquée (voir rubriques 4. 3 et 4. 5). Halofantrine Il a été démontré que l'halofantrine allonge l'intervalle QTc à la dose thérapeutique recommandée et est un substrat du CYP3A4. L'utilisation concomitante du fluconazole et de l'halofantrine est donc déconseillée (voir rubrique 4. 5). Réactions dermatologiques De rares cas de réactions cutanées exfoliatives, comme le syndrome de Stevens-Johnson et la nécrolyse épidermique toxique (syndrome de Lyell), ont été rapportés pendant le traitement avec le fluconazole. Les patients atteints du SIDA sont plus à risque de développer des réactions cutanées sévères avec de nombreux médicaments. Si une éruption cutanée, que l'on considère imputable au fluconazole, apparat chez un patient traité pour une infection fongique superficielle, le traitement devra être arrêté. Si des patients avec des infections fongiques invasives ou systémiques développent une éruption cutanée, ils devront être étroitement surveillés et le fluconazole devra être interrompu si des lésions bulleuses ou si un érythème multiforme apparaissent. Hypersensibilité Dans de rares cas une réaction anaphylactique a été rapportée (voir rubrique 4. 3). Cytochrome P450 Le fluconazole est un inhibiteur modéré des CYP2C9 et CYP3A4. Le fluconazole est également un inhibiteur puissant du CYP2C19. Les patients traités simultanément par FLUCONAZOLE ARROW LAB et par des médicaments ayant une marge thérapeutique étroite, métabolisés par les CYP2C9, CYP2C19 et CYP3A4, doivent être surveillés (voir rubrique 4. 5). Terfénadine La co-administration de fluconazole à des doses inférieures à 400 mg par jour avec la terfénadine doit être étroitement surveillée (voir rubriques 4. 3 et 4. 5). Candidose Des études ont montré une prévalence croissante des infections par des espèces de autres que . Celles-ci sont souvent intrinsèquement résistantes (par exemple, ) ou présentent une sensibilité réduite au fluconazole ( ). Ces infections peuvent nécessiter un traitement antifongique alternatif en cas d'échec du traitement. Il est donc conseillé aux prescripteurs de tenir compte de la prévalence de la résistance au fluconazole chez diverses espèces de . Excipients Ce médicament contient du lactose. Les patients présentant une intolérance au galactose, un déficit total en lactase ou un syndrome de malabsorption du glucose et du galactose (maladies héréditaires rares) ne doivent pas prendre ce médicament. Ce médicament contient moins de 1 mmol (23 mg) de sodium par gélule, c'est-à-dire qu'il est essentiellement sans sodium . des événements cardiaques ont été rapportés, notamment des torsades de pointes, chez des patients ayant reçu simultanément du fluconazole et du cisapride. Une étude contrôlée a démontré que l'administration concomitante de fluconazole 200 mg une fois par jour et de cisapride 20 mg quatre fois par jour entranait une augmentation significative des taux plasmatiques de cisapride et un allongement de l'intervalle QTc. L'administration concomitante de fluconazole et de cisapride est contre-indiquée (voir rubrique 4. 3). en raison de l'apparition de dysrythmies cardiaques graves dues à un allongement de l'intervalle QTc chez les patients traités à la fois par des antifongiques azolés et de la terfénadine, des études d'interaction ont été conduites. Une étude a montré que l'administration de 200 mg de fluconazole par jour n'a pas conduit à un allongement de l'intervalle QTc. Une autre étude avec 400 mg et 800 mg de fluconazole par jour a montré qu'une dose quotidienne supérieure ou égale à 400 mg de fluconazole augmente de façon significative la concentration plasmatique de la terfénadine si les deux médicaments sont pris de manière concomitante. L'association de la terfénadine et du fluconazole à des doses supérieures ou égales à 400 mg est contre-indiquée (voir rubrique 4. 3). Pour des doses de fluconazole inférieures à 400 mg par jour, le patient devra être étroitement surveillé. l'administration concomitante de fluconazole et d'astémizole peut diminuer la clairance de l'astémizole. L'augmentation des concentrations plasmatiques d'astémizole qui en résulte peut entraner un allongement du QT et, dans de rares cas, la survenue de torsades de pointes. La co-administration de fluconazole et d'astémizole est contre-indiquée (voir rubrique 4. 3). bien qu'elle n'ait pas été étudiée ou , l'administration concomitante de fluconazole et de pimozide peut entraner une inhibition du métabolisme du pimozide. L'augmentation des concentrations plasmatiques de pimozide peut entraner un allongement du QT et, dans de rares cas, la survenue de torsades de pointes. La co-administration de fluconazole et de pimozide est contre-indiquée (voir rubrique 4. 3). bien qu'elle n'ait pas été étudiée ou , l'administration concomitante de fluconazole et de quinidine peut entraner une inhibition du métabolisme de la quinidine. L'utilisation de quinidine a été associée à un allongement du QT et, dans de rares cas, à la survenue de torsades de pointes. La co-administration de fluconazole et de quinidine est contre-indiquée (voir rubrique 4. 3). l'utilisation concomitante de fluconazole et d'érythromycine peut potentiellement majorer le risque de cardiotoxicité (allongement de l'intervalle QT, torsades de pointes) et, par conséquent, de mort subite cardiaque. La co-administration de fluconazole et d'érythromycine est contre-indiquée (voir rubrique 4. 3). le fluconazole peut augmenter les concentrations plasmatiques d'halofantrine en raison d'un effet inhibiteur sur le CYP3A4. L'utilisation concomitante de fluconazole et d'halofantrine peut potentiellement majorer le risque de cardiotoxicité (allongement de l'intervalle QT, torsades de pointes) et, par conséquent, de mort subite cardiaque. Cette co-administration doit être évitée (voir rubrique 4. 4). Associations nécessitant une précaution d'emploi l'administration concomitante du fluconazole et de l'amiodarone peut entraner un allongement du QT. Par conséquent, la prudence est recommandée si l'utilisation concomitante de ces 2 produits est nécessaire, notamment en cas de forte dose de fluconazole (800 mg). faisant l'objet de précautions d'emploi et nécessitant un ajustement de dose Effet d'autres médicaments sur le fluconazole : la prise concomitante de fluconazole et de rifampicine résulte en une baisse de l'ASC de 25 % et une réduction de 20 % de la demi-vie du fluconazole. Une augmentation de la posologie du fluconazole doit être envisagée en cas d'utilisation concomitante avec la rifampicine. Les études d'interaction ont montré que lorsque le fluconazole est administré par voie orale avec de la nourriture, de la cimétidine, des antiacides ou à la suite de l'irradiation corporelle totale pour greffe de moelle osseuse, aucune altération cliniquement significative de l'absorption du fluconazole n'a été observée. dans une étude d'interaction pharmacocinétique, la co-administration de doses répétées d'hydrochlorothiazide à des volontaires sains recevant du fluconazole a augmenté de 40% la concentration plasmatique du fluconazole. Un effet de cette ampleur ne devrait pas nécessiter d'ajustement de la posologie du fluconazole chez les sujets recevant simultanément des diurétiques. Effet du fluconazole sur d'autres médicaments Le fluconazole est un inhibiteur modéré des isoenzymes 2C9 et 3A4 du CYP450. Le fluconazole est également un inhibiteur puissant de l'isoenzyme CYP2C19. Outre les interactions observées/documentées citées ci-dessous, il existe un risque d'augmentation des concentrations plasmatiques d'autres médicaments métabolisés par le CYP2C9, le CYP2C19 et le CYP3A4 en cas d'administration concomitante avec le fluconazole. Par conséquent, ces associations doivent être administrées avec prudence et le patient doit être étroitement surveillé. L'effet inhibiteur du fluconazole sur les enzymes peut persister 4 à 5 jours après la fin du traitement par le fluconazole, en raison de la longue demi-vie (t ) du fluconazole (voir rubrique 4. 3). : durant un traitement concomitant de fluconazole (400 mg) et d'alfentanil en administration intraveineuse (20 g/kg) chez des volontaires sains, l'ASC de l'alfentanil est multipliée par 2, probablement par inhibition du CYP3A4. Un ajustement de la posologie de l'alfentanil peut être nécessaire. : le fluconazole majore l'effet de l'amitriptyline et de la nortriptyline. La 5nortriptyline et/ou la Samitriptyline peuvent être mesurées lors de l'instauration des traitements et après une semaine de traitement concomitant. Il pourra être nécessaire d'ajuster la posologie d'amitriptyline/nortriptyline. : l'administration concomitante de fluconazole et d'amphotéricine B chez des souris infectées normales et immunodéprimées a montré les résultats suivants : un léger effet antifongique additif dans les infections systémiques à , l'absence d'interaction dans les infections intracrâniennes à et un antagonisme des deux médicaments dans les infections systémiques à . La signification clinique des résultats obtenus dans ces études n'est pas connue. : depuis la commercialisation, comme avec d'autres antifongiques azolés, des événements hémorragiques (ecchymoses, épistaxis, saignements gastro-intestinaux, hématurie et méléna) associés à des diminutions du taux de prothrombine ont été rapportés chez des patients recevant de façon concomitante du fluconazole et de la warfarine. Durant un traitement concomitant par le fluconazole et la warfarine, le taux de prothrombine a été diminué jusqu'à 2 fois, ce qui est probablement dû à une inhibition du métabolisme de la warfarine par le CYP2C9. Le taux de prothrombine doit être étroitement surveillé chez les patients recevant des anticoagulants de type coumarinique ou indanedione de façon concomitante au fluconazole. Un ajustement de la posologie de l'anticoagulant peut être nécessaire. : après l'administration orale de midazolam, le fluconazole a entrané des augmentations substantielles des concentrations de midazolam et des effets psychomoteurs. La prise concomitante de 200 mg de fluconazole et de 7, 5 mg de midazolam par voie orale a augmenté l'ASC et la demi-vie du midazolam de respectivement 3, 7 fois et 2, 2 fois. La prise concomitante de 200 mg de fluconazole par jour et de 0, 25 mg de triazolam par voie orale a augmenté l'ASC et la demi-vie du triazolam de respectivement 4, 4 fois et 2, 3 fois. Des effets renforcés et prolongés du triazolam ont été observés à l'association du traitement avec le fluconazole. Si le traitement concomitant par une benzodiazépine est nécessaire chez les patients traités par le fluconazole, il est nécessaire d'envisager une baisse de la dose de benzodiazépine et une surveillance étroite du patient. : le fluconazole inhibe le métabolisme de la carbamazépine et une augmentation de 30 % de la carbamazépine sérique a été observée. Il existe un risque de toxicité de la carbamazépine. Un ajustement de la posologie de la carbamazépine peut être nécessaire en fonction des mesures de sa concentration/de son effet. : certains inhibiteurs calciques (nifédipine, isradipine, amlodipine, vérapamil et félodipine) sont métabolisés par le CYP3A4. Le fluconazole peut potentiellement augmenter l'exposition systémique aux antagonistes des canaux calciques. Une surveillance fréquente des événements indésirables est recommandée. : lors d'un traitement concomitant de fluconazole (200 mg par jour) et de célécoxib (200 mg), la C et l'ASC du célécoxib ont augmenté de respectivement 68 % et 134 %. Une réduction de 50 % de la posologie du célécoxib peut être nécessaire chez les patients recevant de façon concomitante du fluconazole. : le traitement associant le cyclophosphamide et le fluconazole entrane une augmentation des taux sériques de bilirubine et de créatinine. Cette association peut être utilisée en tenant compte du risque d'augmentation de la bilirubinémie et de la créatininémie. : un cas mortel d'intoxication au fentanyl due à une interaction possible entre le fentanyl et le fluconazole a été rapporté. Par ailleurs, il a été montré chez des volontaires sains, que le fluconazole retardait de manière significative l'élimination du fentanyl. L'augmentation des concentrations de fentanyl peut entraner une dépression respiratoire. Les patients doivent être étroitement surveillés pour le risque potentiel de dépression respiratoire. Un ajustement posologique du fentanyl peut être nécessaire. : le risque de myopathie et de rhabdomyolyse est augmenté en cas de prise concomitante de fluconazole et d'inhibiteurs de l'HMG-CoA réductase métabolisés par le CYP3A4, tels que l'atorvastatine et la simvastatine, ou par le CYP2C9, tels que la fluvastatine. Si un traitement concomitant est nécessaire, les symptômes de myopathie et de rhabdomyolyse ainsi que les concentrations de créatine kinase doivent être surveillés. Le traitement par inhibiteurs de l'HMG-CoA réductase doit être interrompu si les concentrations de créatine kinase augmentent significativement ou en cas de diagnostic ou de suspicion de myopathie/rhabdomyolyse. : les inhibiteurs modérés du CYP3A4 tels que le fluconazole augmentent les concentrations plasmatiques de l'ibrutinib et peuvent augmenter le risque de toxicité. Si l'association ne peut être évitée, réduire la dose d'ibrutinib à 280 mg une fois par jour (deux gélules) pendant la durée de l'utilisation de l'inhibiteur et assurer une surveillance clinique étroite. : la co-administration avec l'ivacaftor, un potentialisateur du régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR), a augmenté de 3 fois l'exposition à l'ivacaftor et a augmenté de 1, 9 fois l'exposition à l'hydroxyméthyl-ivacaftor (M1). Une réduction de la dose d'ivacaftor à 150 mg une fois par jour est recommandée chez les patients prenant de façon concomitante des inhibiteurs modérés du CYP3A, tels que le fluconazole et l'érythromycine. : les inhibiteurs modérés du CYP3A4 comme le fluconazole, augmentent les concentrations plasmatiques de l'olaparib ; l'utilisation concomitante n'est pas recommandée. Si l'association ne peut pas être évitée, limiter la dose d'olaparib à 200 mg, deux fois par jour. : le fluconazole augmente de manière significative la concentration et l'ASC de la ciclosporine. Un traitement concomitant de 200 mg par jour de fluconazole et de ciclosporine (2, 7 mg / kg / jour) entrane une augmentation de 1, 8 fois l'ASC de la ciclosporine. Cette association peut être utilisée en diminuant la posologie de ciclosporine en fonction de la concentration en ciclosporine. : bien que non étudié ou , le fluconazole peut augmenter les concentrations sériques de l'évérolimus par inhibition du CYP3A4. : le fluconazole augmente les concentrations plasmatiques de sirolimus, vraisemblablement par inhibition du métabolisme du sirolimus par le CYP3A4 et par inhibition de la glycoprotéine P. Cette association peut être utilisée avec un ajustement de la posologie du sirolimus en fonction de son effet et de sa concentration. : le fluconazole peut augmenter jusqu'à 5 fois les concentrations sériques du tacrolimus administré par voie orale par inhibition du métabolisme du tacrolimus par le CYP3A4 dans les intestins. Aucune modification pharmacocinétique significative n'a été observée lorsque le tacrolimus est administré par voie intraveineuse. L'augmentation des taux de tacrolimus a été associée à une néphrotoxicité. La posologie du tacrolimus administré par voie orale doit être diminuée en fonction de la concentration de tacrolimus. : le fluconazole inhibe la conversion du losartan en son métabolite actif (E31 74), responsable en grande partie de l'inhibition du récepteur de l'angiotensine II qui a lieu au cours d'un traitement par le losartan. Un contrôle continu de la tension artérielle chez les patients recevant cette association doit être effectué. : le fluconazole peut augmenter les concentrations sériques de méthadone. Un ajustement de la posologie de méthadone peut être nécessaire. : la C et l'ASC du flurbiprofène ont augmenté de 23 % et 81 % respectivement lors d'une co-administration avec le fluconazole une administration de flurbiprofène seul. De même, la C et l'ASC de l'isomère pharmacologiquement actif [S( )ibuprofène] ont augmenté de respectivement 15 % et 82 % lors d'une co-administration de fluconazole et d'ibuprofène racémique (400 mg) une administration de l'ibuprofène racémique seul. Bien qu'aucune étude spécifique n'ait été conduite, le fluconazole peut potentiellement augmenter l'exposition systémique aux autres AINS qui sont métabolisés par le CYP2C9 (exemple naproxène, lornoxicam, méloxicam, diclofénac). Une surveillance fréquente des événements indésirables et de la toxicité liés aux AINS est recommandée. Un ajustement de la posologie des AINS peut être nécessaire. : le fluconazole inhibe le métabolisme hépatique de la phénytoïne. L'administration concomitante et répétée de 200 mg de fluconazole et de 250 mg de phénytoïne par voie intraveineuse a conduit à une augmentation de l'ASC de la phénytoïne de 75% et de la C de 128%. En cas de co-administration, les concentrations sériques de phénytoïne doivent être surveillées afin d'éviter une toxicité de la phénytoïne. : un transplanté hépatique recevant de la prednisone a développé une maladie d'Addison suite à l'arrêt d'un traitement de 3 mois par fluconazole. L'arrêt du fluconazole a probablement entrané une augmentation de l'activité du CYP3A4, ayant pour conséquence une augmentation du métabolisme de la prednisone. Les patients recevant un traitement prolongé associant le fluconazole à la prednisone doivent être étroitement surveillés avec recherche des signes d'insuffisance surrénale à l'arrêt du fluconazole. : le fluconazole augmente les concentrations sériques de rifabutine, entranant une augmentation de l'ASC de la rifabutine pouvant atteindre 80 %. Des cas d'uvéites ont été observés chez des patients traités par cette association. Chez les patients recevant de façon concomitante du fluconazole et de la rifabutine, les symptômes de la toxicité de la rifabutine doivent faire l'objet d'une surveillance. : le fluconazole augmente l'ASC et la C du saquinavir d'environ 50 % et de 55 % respectivement, suite à l'inhibition du métabolisme hépatique du saquinavir par le CYP3A4 et par inhibition de la glycoprotéine- P. L'interaction avec le saquinavir / ritonavir n'a pas été étudiée et pourrait être plus marquée. Un ajustement de la posologie du saquinavir peut être nécessaire. : le fluconazole prolonge la demi-vie sérique des sulfamides hypoglycémiants oraux administrés de façon concomitante (exemple, chlorpropamide, glibenclamide, glipizide, tolbutamide) chez des volontaires sains. Une surveillance étroite de la glycémie et une réduction appropriée de la posologie des sulfamides hypoglycémiants sont recommandées en cas de traitement concomitant. : dans une étude d'interaction contrôlée placebo, l'administration de fluconazole à 200 mg pendant 14 jours a entrané une baisse de 18 % de la clairance plasmatique moyenne de la théophylline. Les patients recevant de fortes doses de théophylline, ou présentant par ailleurs un risque accru de toxicité à la théophylline, doivent être étroitement surveillés afin de détecter tout signe de toxicité de la théophylline pendant le traitement par le fluconazole. Le traitement doit être modifié en cas de survenue de signes de toxicité. : l'exposition au tofacitinib est accrue lorsque le tofacitinib est administré en association avec des médicaments entranant à la fois une inhibition modérée du CYP3A4 et une puissante inhibition du CYP2C19 (par exemple le fluconazole). Par conséquent, il est recommandé de réduire la dose de tofacitinib à 5 mg une fois par jour en cas d'association avec ces médicaments. : l'exposition au tolvaptan est considérablement augmentée (200 % pour l'ASC ; 80 % pour la C ) lorsque le tolvaptan, un substrat du CYP3A4, est co-administré avec le fluconazole, un inhibiteur modéré du CYP3A4, avec un risque d'augmentation significative des effets indésirables, notamment la diurèse, la déshydratation et l'insuffisance rénale aigu. En cas d'utilisation concomitante, la dose de tolvaptan doit être réduite conformément aux informations relatives à la prescription du tolvaptan et le patient doit être fréquemment surveillé pour détecter tout effet indésirable associé au tolvaptan. : bien qu'aucune étude n'ait été conduite, le fluconazole peut augmenter les taux plasmatiques des vinca-alcaloïdes (exemple vincristine et vinblastine) et entraner une neurotoxicité, qui est peut être due à un effet inhibiteur sur le CYP3A4. : d'après une observation chez un patient recevant de façon concomitante de l'acide alltransrétinoïque (forme acide de la vitamine A) et du fluconazole, des effets indésirables neurologiques sont apparus sous forme d'une pseudotumeur cérébrale, qui a disparu à l'arrêt du traitement par le fluconazole. Cette association peut être utilisée mais un risque de survenue d'effets indésirables neurologiques doit être pris en compte. : (Inhibiteurs de CYP2C9, CYP2C19 et CYP3A4) : l'administration concomitante de voriconazole par voie orale (400 mg toutes les 12 heures le 1 jour, puis 200 mg toutes les 12 heures pendant 2, 5 jours) et de fluconazole par voie orale (400 mg le 1 jour, puis 200 mg toutes les 24 h pendant 4 jours) à 8 sujets mâles sains a conduit à une augmentation de la C et ASC du voriconazole en moyenne de respectivement 57 % (90 % CI : 20 %, 107 %) et 79 % (90 % CI : 40 %, 128 %). La réduction de la dose et / ou de la fréquence de voriconazole et de fluconazole qui aurait éliminé cet effet n'a pas été établie. Une surveillance des événements indésirables associés au voriconazole est recommandée si le voriconazole est utilisé de manière séquentielle après le fluconazole. : le fluconazole augmente la C et l'ASC de la zidovudine de 84 % et 74 % respectivement en raison d'une diminution d'environ 45 % de la clairance de la zidovudine orale. La demi-vie de la zidovudine a de même été prolongée d'environ 128 % après administration concomitante de fluconazole. Les patients recevant cette association doivent être surveillés afin de détecter l'apparition d'effets indésirables liés à la zidovudine. Une réduction de la posologie de zidovudine peut être nécessaire. : une étude croisée randomisée, ouverte, en cross-over à trois séquences, conduite chez 18 sujets sains, a évalué l'effet d'une dose orale unique de 1 200 mg d'azithromycine sur la pharmacocinétique d'une dose orale unique de 800 mg de fluconazole ainsi que les effets du fluconazole sur la pharmacocinétique de l'azithromycine. Aucune interaction pharmacocinétique significative n'a été observée entre le fluconazole et l'azithromycine. : deux études pharmacocinétiques ont été menées avec des contraceptifs oraux combinés et des doses répétées de fluconazole. Aucun effet particulier sur les taux hormonaux n'a été constaté avec l'administration de 50 mg de fluconazole. Cependant la prise journalière de 200 mg de fluconazole a entrané une hausse de l'ASC de l'éthinylestradiol et du lévonorgestrel de 40 % et 24 % respectivement. Par conséquent, il est peu probable que des doses multiples de fluconazole à ces posologies aient une influence sur l'efficacité des contraceptifs oraux combinés. Grossesse Une étude d'observation a suggéré un risque accru d'avortement spontané chez les femmes traitées par fluconazole au cours du premier trimestre. Des cas d'anomalies congénitales multiples (bradycéphalies, dysplasies auriculaires, fontanelles antérieures géantes, fémurs arqués, synostoses radio-humérales) ont été signalés chez des nourrissons dont les mères avaient été traitées par fortes doses de fluconazole (400-800 mg par jour) pendant 3 mois ou plus, dans le traitement des coccidioidomycoses. La relation entre l'administration de fluconazole et ces effets n'est pas prouvée. Les données sur quelques milliers de femmes enceintes traitées avec une dose cumulée 150 mg de fluconazole, administrée au cours du premier trimestre, n'ont montré aucune augmentation du risque global de malformations chez le fœtus. Au cours d'une vaste étude de cohorte observationnelle, l'exposition au fluconazole par voie orale au cours du premier trimestre a été associée à une légère augmentation du risque de malformations musculo-squelettiques, correspondant à environ 1 cas supplémentaire pour 1 000 femmes traitées avec des doses cumulées 450 mg par rapport aux femmes traitées avec des azolés topiques et à environ 4 cas supplémentaires pour 1 000 femmes traitées avec des doses cumulées supérieures à 450 mg. Le risque relatif ajusté était de 1, 29 (IC à 95 % 1, 05 à 1, 58) pour 150 mg de fluconazole par voie orale et de 1, 98 (IC à 95 % 1, 23 à 3, 17) pour les doses supérieures à 450 mg de fluconazole. Les études effectuées chez l'animal ont mis en évidence une toxicité sur la reproduction (voir rubrique 5. 3). Le fluconazole administré à des doses standard et les traitements à court terme ne doivent pas être utilisés pendant la grossesse sauf nécessité absolue. L'administration de fluconazole à fortes doses et/ou en traitement prolongé doit être réservée, au cours de la grossesse, aux cas mettant potentiellement en jeu le pronostic vital. Le fluconazole est excrété dans le lait à des concentrations similaires à celles du plasma (voir rubrique 5. 2). L'allaitement peut être maintenu après une dose unique de 150 mg de fluconazole. L'allaitement est déconseillé après administration répétée ou de fortes doses de fluconazole. Fertilité Le fluconazole n'affecte pas la fertilité chez les rats mâles ou femelles (voir rubrique 5. 3). FLUCONAZOLE ARROW LAB et il doit leur être recommandé de ne pas conduire ou d'utiliser des machines si ces symptômes apparaissent Résumé du profil de sécurité : Une réaction médicamenteuse avec éosinophilie et symptômes systémiques (syndrome DRESS) a été rapportée en association avec un traitement par fluconazole (voir rubrique 4. 4). Les effets indésirables les plus fréquemment rapportés ( < 1/10) sont les céphalées, douleurs abdominales, diarrhées, nausées, vomissements, augmentation de l'alanine aminotransférase, augmentation de l'aspartate aminotransférase, augmentation de la phosphatase alcaline sanguine et éruption cutanée. Les effets indésirables suivants ont été observés et rapportés durant le traitement par fluconazole avec les fréquences suivantes : très fréquent (1/10), fréquent (1/100 à peu fréquent (1/1, 000 à rare (1/10, 000 à 000), très rare ( 000), fréquence indéterminée (ne peut pas être estimée sur la base des données disponibles). *y compris éruption fixe d'origine médicamenteuse. Population pédiatrique La nature et l'incidence des effets indésirables et des anomalies biologiques observés pendant les essais cliniques pédiatriques, excluant l'indication dans la candidose génitale, sont comparables à celles observées chez l'adulte. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . Des cas de surdosage avec le fluconazole ont été rapportés. Des cas d'hallucinations et de comportement paranoïaque ont été rapportés de façon concomitante. En cas de surdosage, une prise en charge (avec traitement symptomatique et lavage gastrique si nécessaire) peut être adéquate. Le fluconazole est largement éliminé dans les urines ; une diurèse forcée augmenterait probablement le taux d'élimination. Une séance de trois heures d'hémodialyse diminue les taux plasmatiques d'environ 50%. . Absorption Après administration orale, le fluconazole est bien absorbé et les taux plasmatiques (et la biodisponibilité systémique) représentent plus de 90 % des taux atteints après l'administration intraveineuse. L'absorption orale n'est pas affectée par la prise alimentaire simultanée. Les concentrations plasmatiques maximales à jeun sont atteintes 30 minutes à 1 heure et demie après la prise. Les concentrations plasmatiques sont proportionnelles à la dose. Quatre-vingt-dix pour cent des taux à l'état d'équilibre sont atteints 45 jours après l'administration de doses quotidiennes uniques répétées. L'administration d'une dose de charge (au jour 1) égale au double de la dose habituelle permet aux taux plasmatiques d'approcher de 90 % des taux à l'état d'équilibre au jour 2. Distribution Le volume de distribution apparent est proche du volume d'eau corporelle totale. La liaison aux protéines plasmatiques est faible (1112 %). Le fluconazole pénètre bien dans tous les liquides corporels étudiés. Les taux de fluconazole dans la salive et dans l'expectoration sont comparables aux taux plasmatiques. Chez les patients atteints de méningite fongique, les taux de fluconazole dans le LCR représentent environ 80% des taux plasmatiques correspondants. Des concentrations élevées de fluconazole, supérieures aux concentrations sériques, sont atteintes dans la couche cornée, l'épiderme et le derme et les glandes sudoripares eccrines. Le fluconazole s'accumule dans la couche cornée. A la dose de 50 mg une fois par jour, la concentration de fluconazole après 12 jours a été de 73 g/g et, 7 jours après l'arrêt du traitement, la concentration était encore de 5, 8 g/g. A la dose de 150 mg une fois par semaine, la concentration de fluconazole dans la couche cornée au jour 7 était de 23, 4 g/g et 7 jours après la seconde dose, elle était encore de 7, 1 g/g. La concentration de fluconazole dans les ongles après 4 mois de traitement par 150 mg une fois par semaine a été de 4, 05 g/g dans les ongles sains et de 1, 8 g/g dans les ongles malades ; et le fluconazole était toujours mesurable dans les ongles 6 mois après la fin du traitement. Biotransformation Le fluconazole n'est que faiblement métabolisé. Seulement 11 % d'une dose radioactive sont éliminés dans l'urine sous forme de métabolites. Le fluconazole est un inhibiteur modéré des isoenzymes CYP2C9 et CYP3A4 (voir rubrique 4. 5). Le fluconazole est également un inhibiteur puissant de l'isoenzyme CYP2C19. Elimination La demi-vie d'élimination plasmatique du fluconazole est d'environ 30 heures. La principale voie d'élimination est rénale, environ 80 % de la dose administrée étant éliminés dans l'urine sous forme inchangée. La clairance du fluconazole est proportionnelle à la clairance de la créatinine. Aucun métabolite circulant n'a été mis en évidence. La longue demi-vie d'élimination plasmatique permet l'administration de doses uniques pour le traitement de la candidose vaginale, de doses uniques quotidiennes et de doses uniques hebdomadaires dans les autres indications. Pharmacocinétique chez l'insuffisant rénal Chez les patients présentant une insuffisance rénale sévère (avec un débit de filtration glomérulaire DFG < 20 ml/min), la demi-vie est passée de 30 à 98 heures. Une réduction de la dose est donc nécessaire. Le fluconazole est éliminé par hémodialyse et, dans une moindre mesure, par dialyse péritonéale. Après une séance d'hémodialyse de 3 heures, environ 50 % du fluconazole sont éliminés du sang. Pharmacocinétique durant l'allaitement Une étude pharmacocinétique chez dix femmes allaitantes, ayant arrêté partiellement ou totalement l'allaitement de leur nourrisson, a évalué les concentrations de fluconazole dans le plasma et dans le lait maternel, pendant 48 heures, après l'administration d'une dose unique de 150 mg de fluconazole. Le fluconazole a été détecté dans le lait maternel à une concentration moyenne d'environ 98 % de celle du plasma de la mère. La concentration maximale moyenne dans le lait était de 2, 61 mg/l, 5, 2 heures après administration. L'ingestion quotidienne moyenne, estimée, de fluconazole par le nourrisson lors de l'allaitement (consommation moyenne de lait supposée de 150 ml/kg/j) basée sur la concentration maximale moyenne dans le lait, est de 0, 39 mg/kg/j, soit environ 40 % de la dose néonatale recommandée (nourrisson < 2 semaines) ou 13 % de la dose recommandée chez le nourrisson pour une candidose des muqueuses. Pharmacocinétique chez l'enfant Les données pharmacocinétiques ont été évaluées chez 113 enfants ayant participé à 5 études ; 2 études à doses uniques, 2 études à doses répétées et 1 étude chez des prématurés. Les données d'une étude n'étaient pas interprétables en raison de modifications de la formulation au cours de l'étude. Des données supplémentaires étaient disponibles, provenant d'une étude en usage compassionnel. Après l'administration de 28 mg/kg de fluconazole à des enfants âgés de 9 mois à 15 ans, une ASC d'environ 38 g. h/ml a été trouvée par unités de dose de 1 mg/kg. La demi-vie d'élimination plasmatique moyenne du fluconazole a été comprise entre 15 et 18 heures et le volume de distribution a été d'environ 880 ml/kg après l'administration de doses répétées. Une demi-vie d'élimination plasmatique du fluconazole plus élevée, d'environ 24 heures, a été retrouvée après l'administration d'une dose unique. Cela est comparable à la demi-vie d'élimination plasmatique du fluconazole après l'administration d'une dose unique de 3 mg/kg IV à des enfants âgés de 11 jours à 11 mois. Le volume de distribution dans ce groupe d'âge a été d'environ 950 ml/kg. L'expérience du fluconazole chez le nouveau-né se limite à des études pharmacocinétiques chez des prématurés. L'âge moyen au moment de l'administration de la première dose était de 24 heures (extrêmes 936 heures) et le poids de naissance moyen était de 0, 9 kg (extrêmes 0, 751, 10 kg) pour 12 prématurés d'âge gestationnel moyen d'environ 28 semaines. Sept patients ont terminé l'étude ; 5 perfusions intraveineuses de 6 mg/kg de fluconazole au maximum ont été administrées toutes les 72 heures. La demi-vie moyenne (heures) a été de 74 (extrêmes 44-185) au jour 1 et elle a diminué, avec le temps, à 53 (extrêmes 30131) au jour 7 et à 47 (extrêmes 2768) au jour 13. L'aire sous la courbe (g. h/ml) a été de 271 (extrêmes 173385) au jour 1 et elle a augmenté à 490 (extrêmes 292734) au jour 7 et diminué à 360 (extrêmes 167-566) au jour 13. Le volume de distribution (ml/kg) a été de 1183 (extrêmes 10701470) au jour 1 et il a augmenté, avec le temps, à 1184 (extrêmes 5102130) au jour 7 et à 1328 (extrêmes 10401680) au jour 13. Pharmacocinétique chez le sujet âgé Une étude pharmacocinétique a été conduite chez 22 sujets, âgés de 65 ans et plus, traités par une dose orale unique de 50 mg de fluconazole. Dix de ces patients recevaient simultanément des diurétiques. La Cmax a été de 1, 54 g/ml et elle a été atteinte 1, 3 heure après la prise. L'ASC moyenne a été de 76, 4 20, 3 g. h/ml et la demi-vie d'élimination terminale moyenne a été de 46, 2 heures. Ces valeurs des paramètres pharmacocinétiques sont plus élevées que les valeurs correspondantes rapportées chez des volontaires sains jeunes de sexe masculin. La co-administration de diurétiques n'a modifié de manière significative ni l'ASC ni la C . De plus, les valeurs de la clairance de la créatinine (74 ml/min), du pourcentage de médicament retrouvé dans l'urine sous forme inchangée (024 h, 22 %) et de la clairance rénale du fluconazole (0, 124 ml/min/kg) ont généralement été plus faibles chez les sujets âgés que chez les volontaires plus jeunes. L'altération de l'élimination du fluconazole chez les sujets âgés semble donc être liée à la réduction de la fonction rénale caractéristique de ce groupe. Cancérogenèse Le fluconazole n'a pas montré de potentiel cancérogène chez des souris et des rats traités par voie orale pendant 24 mois à des doses de 2, 5, 5 ou 10 mg/kg/jour (environ 27 fois la dose recommandée chez l'homme). Les rats mâles traités par 5 et 10 mg/kg/jour ont présenté une augmentation de l'incidence en adénomes hépatocellulaires. Mutagenèse Le fluconazole, avec ou sans activation métabolique, était négatif au test de mutagénicité effectué sur 4 souches de et sur le système lymphatique L5178Y de la souris. Les études cytogénétiques (cellules de moelle osseuse de souris après l'administration orale de fluconazole) et (lymphocytes humains exposés au fluconazole à 1000 g/ml) n'ont montré aucune preuve de mutation chromosomique. Toxicité sur la reproduction Le fluconazole n'a pas affecté la fertilité de rats mâles ou femelles traités par voie orale à des doses quotidiennes de 5, 10 ou 20 mg/kg ou à des doses parentérales de 5, 25 ou 75 mg/kg. Aucun effet sur le fœtus n'a été observé à 5 ou 10 mg/kg ; des augmentations des anomalies anatomiques fœtales (côtes surnuméraires, dilatation du bassinet rénal) et des retards d'ossification ont été observés aux doses de 25 et 50 mg/kg et plus. Aux doses comprises entre 80 mg/kg et 320 mg/kg, il y a eu une augmentation de la mortalité embryonnaire chez les rats et des anomalies fœtales à type de côtes déformées, fente palatine et ossification crânio-faciale anormale. Le début de la parturition a été légèrement retardé à 20 mg/kg par voie orale et une dystocie ainsi qu'un prolongement de la parturition ont été observés chez quelques mères à 20 mg/kg et 40 mg/kg par voie intraveineuse. Les troubles de la parturition se sont traduits par une légère augmentation du nombre de petits mort-nés et une diminution de la survie des nouveau-nés à ces doses. Ces effets sur la parturition sont cohérents avec la propriété, spécifique de l'espèce, de diminuer le taux d'œstrogènes en cas de fortes doses de fluconazole. Ces effets hormonaux n'ont pas été observés chez les femmes traitées par le fluconazole (voir rubrique 5. 1). : dioxyde de titane (E171), laurilsulfate de sodium, gélatine. gomme-laque, oxyde de fer jaune (E172). 3 ans. 1 gélule sous plaquettes (PVC/PVdC-Aluminium). 4 gélules sous plaquettes (PVC/PVdC-Aluminium). Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées. 34009 302 058 0 8 : 1 gélule sous plaquette (PVC/PVDC/Aluminium). 34009 302 058 2 2 : 4 gélules sous plaquette (PVC/PVDC/Aluminium). Sans objet. Liste I. | BDPM | Medicinal |
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Fascicule rouge Rubrique : Revue générale Les épanchements pleuraux parapneumoniques : épidémiologie, diagnostic, classification, traitement Julien Letheulle1, Mallorie Kerjouan2, François Benezit2, Bertrand De Latour 3, Pierre Tattevin1, Caroline Piau4, Hervé Léna2, Benot Desrues2, Yves Le Tulzo1 et Stéphane Jouneau2, 5. 1 Service de maladies infectieuses et réanimation médicale, Université de Rennes 1, hôpital Pontchaillou, 2 rue Henri le Guilloux, 35033 Rennes Cedex 9, France 2 Service de pneumologie, Université de Rennes 1, hôpital Pontchaillou, 2 rue Henri le Guilloux, 35033 Rennes Cedex 9, France 3 Service de chirurgie thoracique, Université de Rennes 1, hôpital Pontchaillou, 2 rue Henri le Guilloux, 35033 Rennes Cedex 9, France 4 Laboratoire de bactériologie, Université de Rennes 1, hôpital Pontchaillou, 2 rue Henri le Guilloux, 35033 Rennes Cedex 9, France 5 IRSET UMR 1085, Université de Rennes 1, 2 avenue du Professeur Léon Bernard, 35043 Rennes Cedex 9, France Titre court : Épanchements parapneumoniques Auteur-correspondant : Dr Julien Letheulle Service de maladies infectieuses et réanimation médicale, Hôpital Pontchaillou, 2 rue Henri Le Guilloux, 35033 Rennes cedex 9. Tel : 02. 99. 28. 42. 48 / Fax : 02. 99. 28. 41. 64 Julien. LETHEULLE@chu-rennes. fr Intérêts en lien avec le thème du manuscrit : aucun RESUME l'étape diagnostique centrale qui permet de distinguer Les épanchements pleuraux parapneumoniques représentent la principale étiologie des pleurésies infectieuses. Leur incidence est en constante augmentation. Bien qu'ils soient qualifiés de parapneumoniques , l'épidémiologie microbienne est différente de celle des pneumonies avec notamment une plus grande fréquence des germes anaérobies. La ponction pleurale exploratrice représente les épanchements parapneumoniques compliqués et non compliqués. Seuls les épanchements parapneumoniques compliqués doivent faire l'objet d'un traitement évacuateur reposant sur la mise en œuvre de ponctions pleurales répétées, d'un drainage thoracique ou d'une prise en charge chirurgicale. Le choix de la technique évacuatrice première reste débattu car il existe peu d'études prospectives comparatives. L'utilisation d'agents fibrinolytiques n'a pas fait la preuve de son efficacité sauf lorsqu'ils sont utilisés en association à la DNAse. L'antibiothérapie doit être systématique, précoce et couvrir les germes anaérobies, sauf en cas d'infection à pneumocoque. Il existe peu de données sur la place de la kinésithérapie qui reste largement utilisée. La mortalité est élevée et directement influencée par les comorbidités sous-jacentes. Mots clés : épanchement pleural parapneumonique, empyème pleural, infection pleurale, drainage thoracique, ponction pleurale, chirurgie thoracique. Parapneumonic pleural effusions : Epidemiology, diagnosis, classification and management Abstract : Parapneumonic pleural effusions represent the main cause of pleural infections. Their incidence is constantly increasing. Although considered as parapneumonic, their microbial epidemiology is different from pneumonia with higher prevalence of anaerobic bacteria. The first thoracentesis is the most important diagnostic stage because it allows distinguishing complicated from not complicated parapneumonic effusions. Only complicated parapneumonic effusions need to be evacuated. Therapeutic evacuation modalities include repeated therapeutic thoracentesis, chest tube drainage or thoracic surgery. The choice of the first-line evacuation treatment is still controversial and there are few prospective controlled studies. The efficiency of the use of fibrinolytics agents is not established except when they are combined with DNase. Antibiotics are mandatory ; have to be initiated as fast as possible and active against anaerobic bacteria except for pneumococcal infections. There are few data on the use of chest physiotherapy which remains widely used. Mortality is still high and is influenced by underlying comorbidities. Key-words : Parapneumonic pleural effusion, pleural empyema, pleural infection, chest tube drainage, thoracentesis, thoracic surgery. Introduction Le terme pleurésie infectieuse (PI) correspond à l'apparition entre les deux feuillets pleuraux d'un liquide soit macroscopiquement purulent, alors appelé empyème (Figure 1), soit macroscopiquement non purulent mais présentant des caractéristiques bactériologiques ou biochimiques témoignant d'une invasion microbienne [1]. Les étiologies des PI sont multiples et correspondent à des mécanismes physiopathologiques distincts. Il est classique de distinguer les étiologies des PI en fonction de leur porte d'entrée. Les PI d'origine pulmonaire représentent 55 à 73 % des étiologies [2-6]. Dans la grande majorité des cas, elles font suite à l'invasion par des agents pathogènes de l'espace pleural à partir d'un foyer parenchymateux contigu et sont alors appelées épanchements pleuraux parapneumoniques (EPP) [4]. Les autres étiologies de PI, moins fréquentes, ne seront pas abordées dans cet article. Elles correspondent aux PI par inoculation directe (postopératoires, post-traumatiques ou iatrogènes) ou font suite à processus infectieux médiastinal ou sous-diaphragmatique. Les PI hématogènes sont exceptionnelles [3]. Épidémiologie et facteurs de risque Plusieurs études épidémiologiques récentes ont montré une augmentation de l'incidence des EPP et des empyèmes au cours des deux dernières décennies, y compris après ajustement sur l'âge [7, 8]. Cette augmentation concerne principalement les empyèmes pleuraux médicaux (principalement parapneumoniques) alors que l'incidence des empyèmes pleuraux chirurgicaux est relativement stable [8]. Les EPP représentent la cause la plus fréquente d'épanchement pleural exsudatif [9]. Un EPP est mis en évidence dans 36 % à 57 % des cas de pneumopathies bactériennes [10-12] et dans 20 % des cas de pneumonies virales ou à mycoplasme [13]. La survenue d'un empyème est plus rare et complique une pneumonie dans moins de 5 % des cas [14, 15]. Les empyèmes ne représentent que 5 à 10 % des EPP [4]. Les EPP sont plus fréquents aux deux extrêmes de la vie [8, 16, 17]. L'existence d'une ou plusieurs comorbidités sous-jacentes est retrouvée chez plus de deux tiers des malades [6]. Ces comorbidités sont principalement représentées par les pathologies à l'origine de pneumopathies d'inhalation, expliquant la fréquence des germes anaérobies et des germes commensaux de la sphère oropharyngée : maladies neurologiques centrales, états grabataires, troubles psychiatriques graves, alcoolisme, reflux gastro-œsophagien [18]. La présence d'un mauvais état dentaire est rarement précisée dans les études : 10 % dans une étude prospective portant sur 119 patients atteints d'empyème [19]. Les autres comorbidités sont constituées par les pathologies responsables d'un état d'immunosuppression telles que les pathologies néoplasiques, le diabète, l'alcoolisme et les hépatopathies [6, 17, 19-22]. Enfin, la prise de traitements immunosuppresseurs et d'anti-inflammatoires non stéroïdiens peut favoriser la survenue des PI par l'intermédiaire d'une immunodépression mais également en rendant la symptomatologie initiale moins bruyante et en favorisant donc l'invasion pleurale [18, 23]. Données microbiologiques terrain. Les la flore microbienne dépend principalement du Bien qu'il s'agisse d'infections parapneumoniques, l'épidémiologie bactérienne des pleurésies infectieuses est différente de celle des pneumopathies infectieuses [19, 24]. Ceci pourrait être en partie expliqué par l'acidité et l'hypoxie du liquide pleural infecté favorisant le développement des germes à métabolisme anaérobie [25] et par le fait que certaines bactéries (streptocoques et staphylocoques en particulier) possèdent un tropisme particulier pour la surface pleurale [26]. Les étiologies microbiennes des EPP ont évolué au cours du temps [27, 28]. La pleurésie à pneumocoque qui représentait 60 à 70 % des cas avant l'ère de l'antibiothérapie [29] est devenue plus rare depuis la systématisation de l'antibiothérapie et n'est retrouvée actuellement que dans 10 % des cas [30]. À l'inverse, les infections à bactéries à Gram négatif et à germes anaérobies ont vu leur incidence augmenter [6, 31]. Par ailleurs, infections polymicrobiennes et à germes anaérobies sont davantage rencontrées en cas de pneumopathie d'inhalation, les cultures bactériennes retrouvant jusqu'à 86 % de germes anaérobies lorsque l'on considère uniquement les pneumopathies d'inhalation [32]. Les infections à bacilles à Gram négatif sont plus fréquentes chez les patients atteints de comorbidités [20]. Klebsiella pneumoniae est plus fréquemment identifié chez les sujets diabétiques [20] et Haemophilus influenzae est plus souvent rencontré chez l'enfant [33]. Tous les germes responsables de pneumopathies infectieuses sont susceptibles de donner un EPP [9] mais le risque relatif de développer un EPP et d'évoluer vers l'empyème varie selon le germe en cause. Les EPP compliquant une légionellose [34, 35] ou une infection à Mycoplasma pneumoniae [13] sont rares, peu abondants et évoluent rarement vers l'empyème [24, 36]. Environ 50 % des pneumonies à Streptococcus pneumoniae s'accompagnent d'épanchements mais moins de 5 % deviennent purulents [37, 38]. À l'inverse, 40 % des pneumopathies à Staphylococcus aureus s'accompagnent d'épanchements, dont 20 % deviennent purulents. Enfin 50 % des pneumopathies à bacilles à Gram négatif et 35 % des pneumopathies à germes anaérobies se compliquent d'épanchements, dont 90 % deviennent purulents [14] Dans la série de Maskell et coll. concernant 434 patients [22, 24], la culture pleurale était positive chez 250 sujets (58 %). Les streptocoques du groupe milleri étaient les germes les plus fréquemment identifiés (21 %), suivis de Streptococcus pneumoniae (19 %), des bactéries anaérobies (18 %), de Staphylococcus aureus (14 %) et des bacilles à Gram négatif (11 %). En cas d'infection nosocomiale, Staphylococcus aureus est le premier cocci à Gram positif retrouvé et présente une résistance à la méticilline dans deux tiers des cas [24]. Les infections à bacilles à Gram négatif sont également plus fréquentes, notamment dans les services de réanimation et de soins intensifs [31]. Les empyèmes d'origine fongique sont beaucoup plus rares [28]. Ils surviennent essentiellement en contexte nosocomial, chez des patients immunodéprimés ayant reçu une antibiothérapie à large spectre. Les infections à Candida sont les plus souvent rencontrées, devant les infections à Aspergillus. La mortalité est dans ce cas supérieure à 70 % [39]. Enfin, la culture pleurale peut être négative dans environ 40 % des cas [24]. Cependant, l'utilisation de techniques d'identification par PCR est plus sensible que la culture standard [40, 41] et permet l'identification des infections décapitées par une antibiothérapie préalable (pneumocoque) ou des germes difficiles à cultiver (anaérobies) [24]. Dans la série de Maskell et coll. [24], la PCR, associée à la culture standard, permettait une identification de l'agent causal dans 75 % des cas. L'incidence des EPP est en augmentation. Les EPP surviennent principalement chez les patients présentant des comorbidités sous- jacentes. Les germes les plus fréquemment rencontrés sont les germes anaérobies : streptocoques du groupe milleri et bacilles à Gram négatif. La pleurésie à pneumocoque est devenue moins fréquente. Staphylococcus aureus est le premier germe rencontré en cas d'EPP nosocomial. Physiopathologie des épanchements parapneumoniques Le développement d'un empyème à partir d'un foyer pneumonique sous-pleural représente un processus continu comportant plusieurs stades (Figure 2) [42]. Le premier stade, dit exsudatif, est lié à une augmentation de la perméabilité capillaire secondaire à l'atteinte des cellules endothéliales par les cellules inflammatoires au sein du foyer pneumonique. L'accumulation de liquide dans l'interstitium pulmonaire est responsable d'une augmentation du gradient de pression entre le secteur interstitiel et l'espace pleural, à l'origine de mouvements liquidiens vers la cavité pleurale entre les cellules mésothéliales de la plèvre viscérale [16]. Si la formation de liquide dépasse les capacités de résorption des vaisseaux lymphatiques de la plèvre et du poumon, un épanchement pleural apparat. Il en résulte la formation d'un exsudat stérile avec liquide non visqueux. Le pH et la glycopleurie sont normaux et le taux de LDH est peu augmenté [10]. L'épanchement parapneumonique est alors qualifié de non compliqué [10]. Au cours de la seconde phase, dite fibrinopurulente, les bactéries vont adhérer aux cellules mésothéliales puis pénétrer dans le liquide pleural après desquamation de ces dernières ou par rupture de micro-abcès sous-pleuraux [1]. Les bactéries sécrètent des facteurs chémotactiques (IL-8, TNF) attirant les cellules inflammatoires dans l'espace pleural et induisent une activation de la cascade de la coagulation et une inhibition de l'activité fibrinolytique aboutissant à une accumulation de fibrine dans l'espace pleural [43]. Le liquide prend alors un aspect plus épais et visqueux et peut devenir macroscopiquement purulent (empyème). Le pH pleural diminue par production de lactates et de CO2, de même que la glycopleurie en rapport avec la glycolyse bactérienne et des cellules inflammatoires [44]. Le taux de LDH devient élevé. L'examen bactériologique est positif à l'absence d'antibiothérapie préalable). L'épanchement parapneumonique est alors qualifié de compliqué [10]. La troisième phase, dite d'organisation, correspond à la prolifération des fibroblastes au sein de la cavité pleurale. L'accumulation de fibrine et de collagène est responsable de la formation de loculations au sein de l'épanchement pleural qui devient cloisonné (Figure 3) et de l'épaississement des feuillets pleuraux (pachypleurite) empêchant la ré-expansion pulmonaire, à l'origine de séquelles restrictives [1, 42]. En l'absence de traitement, l'empyème évolue classiquement vers la fistulisation bronchique ou l'examen direct ou en culture (en pariétale (empyema necessitatis) [1]. Diagnostic des EPP et empyèmes Place de la ponction pleurale exploratrice Les données cliniques et biologiques ne permettent pas de discriminer les EPP compliqués des EPP non compliqués [9, 10]. La ponction pleurale exploratrice constitue donc une étape essentielle dans le diagnostic des EPP. Elle permet en effet d'établir le diagnostic positif, d'identifier le ou les germes en cause et de classer l'épanchement pleural en différents stades guidant la prise en charge thérapeutique : EPP non compliqué, EPP compliqué ou empyème. Un retard à la réalisation de la ponction pleurale exploratrice est par ailleurs associé à une durée d'hospitalisation plus longue [12]. Les hémocultures permettent l'identification du germe en cause dans seulement 10 % des cas [45], alors que les autres examens microbiologiques sont le plus souvent négatifs, ce qui témoigne de [22]. L'examen cytobactériologique des crachats ou les prélèvements fibroscopiques peuvent également être positifs et concorder avec la bactériologie pleurale [1, 15, 18]. la ponction pleurale diagnostique l'importance de Diagnostic des empyèmes La présence de liquide macroscopiquement purulent est suffisante pour porter le diagnostic d'empyème, l'unique diagnostic différentiel visuel étant le chylothorax ou pseudochylothorax [1]. Seul l'examen bactériologique est alors nécessaire en vue d'identifier le ou les germes en cause. Cependant, même en présence de pus franc, l'examen bactériologique peut être négatif dans 18 à 30 % des cas [27]. Une odeur nauséabonde oriente vers la présence de germes anaérobies [18]. Diagnostic des EPP En cas de liquide non purulent (trouble ou clair), l'analyse du liquide pleural doit comporter le dosage des protides, LDH, glucose et pH, une numération cellulaire et un examen bactériologique (examen direct et culture sur milieux aérobie et anaérobie avec recherche de BK). Les épanchements parapneumoniques sont des exsudats. La présence d'un transsudat exclut le diagnostic d'épanchement pleural parapneumonique [2]. Il faut toutefois préciser qu'un exsudat peut coaguler dans la seringue de prélèvement avec formation d'un surnageant présentant les caractéristiques d'un transsudat. Leur cytologie est marquée par une prédominance de polynucléaires neutrophiles qui peuvent être altérés. La prédominance d'un autre type cellulaire (lymphocytes) est en défaveur d'une étiologie bactérienne [2]. Cependant, la cytologie ne permet pas de distinguer les EPP non compliqués des EPP compliqués [9]. L'examen bactériologique de tout épanchement pleural doit être systématique. La mise en évidence de germes dans le diagnostic d'EPP compliqué. L'ensemencement du liquide pleural dans des flacons d'hémoculture permet d'augmenter la rentabilité diagnostique [46]. liquide pleural affirme le Les paramètres biochimiques permettant de définir l'épanchement compliqué et de prédire l'évolution défavorable en l'absence de drainage sont le taux de LDH, le pH et la glycopleurie. La supériorité de la mesure du pH a été démontrée par une méta-analyse regroupant sept études et retrouvant une valeur seuil de 7, 28 au-dessous de laquelle l'évolution semble défavorable en l'absence de traitement évacuateur [47]. Toutefois, l'acidose pleurale nécessite en théorie d'être interprétée en fonction d'une acidose systémique éventuelle [48] et peut être mise en défaut en cas d'infection à Proteus mirabilis qui peut induire une alcalose pleurale par sécrétion d'ammoniac [49]. La glycopleurie est directement corrélée à la valeur du pH et peut donc être utilisée en l'absence de possibilité de mesure du pH [50]. Enfin, il faut garder à l'esprit la possibilité de variations significatives des paramètres biochimiques (pH et LDH) entre les différentes loculations au sein d'un même épanchement pleural [51]. Ainsi la valeur du pH pleural peut varier selon les différentes loculations [52]. La ponction pleurale constitue l'étape diagnostique indispensable. L'examen du liquide pleural doit être macroscopique (aspect purulent ou non), biochimique (pH, glycopleurie, LDH), cytologique (recherche de polynucléaires altérés) et bactériologique (examen direct et culture bactérienne). Définitions et classifications La classification la plus détaillée est celle établie par Light en 1995 qui distingue sept stades de sévérité croissante [36]. Il s'agit toutefois d'une classification complexe, difficile à appliquer dans la pratique quotidienne (Tableau I). En 2000, l'American College of Chest Physicians (ACCP) a proposé une classification plus simple [53], reposant à la fois sur les données de l'imagerie et de l'analyse du liquide pleural, permettant la stratification des EPP en quatre catégories en fonction du risque d'évolution défavorable (Tableau II). Plus récemment, la British Thoracic Society (BTS) a proposé une classification [54] séparant les EPP en trois catégories : EPP simple, EPP compliqué et empyème. Cette classification reprend en grande partie les items de l'ACCP en y intégrant le taux de LDH. En revanche, elle n'inclut pas les données relatives au volume de l'épanchement (Tableau III). En France, le collège des enseignants de Pneumologie [55] distingue les épanchements les épanchements parapneumoniques simples des épanchements parapneumoniques compliqués selon l'abondance de l'épanchement, son cloisonnement, l'aspect macroscopique, le pH et l'examen bactériologique. La glycopleurie et le taux de LDH ne sont pas mentionnés (Tableau IV). Prise en charge Antibiothérapie L'antibiothérapie doit être débutée précocement, au mieux dès le stade de pneumopathie. Elle permet en effet d'éviter le développement d'un épanchement pleural en cas de pneumonie et prévient l'évolution vers la purulence en cas d'EPP [16]. Elle est par ailleurs suffisante pour la prise en charge des EPP non compliqués vus précocement, ne nécessitant pas d'évacuation pleurale [56]. L'antibiothérapie est initialement empirique. Elle doit à la fois tenir compte des germes habituellement rencontrés et avoir une bonne diffusion dans le liquide pleural infecté [1]. Les -lactamines constituent les antibiotiques de référence pour le traitement des infections à pneumocoque et streptocoques du groupe milleri [57, 58]. Leur bonne diffusion intrapleurale a été démontrée à partir de modèles animaux [59]. Ces molécules restent actives en milieu acide (purulent) mais sont inactivées par les germes sécréteurs de -lactamase [60], fréquemment rencontrés dans les EPP compliqués (Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, germes anaérobies). L'association amoxicilline-acide clavulanique constitue donc un bon choix antibiotique initial compte tenu de la bonne diffusion de l'acide clavulanique dans le liquide pleural [61]. Les autres options sont l'association d'une céphalosporine de troisième génération associée au métronidazole ou à la clindamycine, qui possèdent également une bonne diffusion pleurale [59]. L'utilisation d'aminosides n'est pas justifiée en raison de leur diffusion médiocre dans l'empyème expérimental et de leur inactivité en milieu acide [62]. Enfin, les nouvelles fluoroquinolones avec activité anti-pneumococcique (lévofloxacine, moxifloxacine) peuvent être utilisées en cas d'allergie aux -lactamines mais des résistances ont été rapportées avec Bacteroides fragilis [1]. La voie intraveineuse est habituellement utilisée initialement. Le relais oral peut être effectué après résolution du sepsis [54]. La durée du traitement n'est pas codifiée, en l'absence d'essai randomisé, mais devrait être d'au moins 3 à 6 semaines [1, 18, 54]. L'antibiothérapie doit être réévaluée en fonction des résultats des prélèvements mais compte tenu de la difficulté d'identification des germes anaérobies, le maintien d'un inhibiteur des -lactamases est recommandé les germes intracellulaires (Legionella et Mycoplasma pneumoniae principalement) n'est pas recommandée en première intention en raison de la rareté des EPP qui leurs sont attribués [13, 24, 54]. Il n'y a aucune étude ou recommandation validant l'utilisation d'une antibiothérapie à double dose dans cette pathologie. En cas d'infection nosocomiale, le spectre de l'antibiothérapie initiale doit être élargi et comporter une activité contre les anaérobies, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus résistant à la méticilline [24, 54, 63]. Enfin, le recours aux antibiotiques intrapleuraux n'a pas montré son efficacité [12]. l'utilisation d'antibiotiques actifs contre L'antibiothérapie de référence repose sur l'association amoxicillineacide clavulanique, [54]. À l'inverse, notamment en l'absence de germe retrouvé. En cas d'allergie aux pénicillines, l'association céphalosporine de troisième génération et métronidazole peut être utilisée. La durée de l'antibiothérapie est de 3 à 6 semaines. Traitement évacuateur Une évacuation la plus complète du liquide pleural est nécessaire pour le contrôle de l'infection. Cette évacuation est rendue difficile par la viscosité du liquide et l'éventuelle existence de loculations. Les principales options thérapeutiques sont représentées par les ponctions pleurales évacuatrices répétées, le drainage thoracique et la thoracoscopie de débridement. La thoracoscopie médicale a été décrite dans le traitement des EPP, notamment en cas d'épanchements multiloculés. Néanmoins, il n'y a pas d'étude randomisée évaluant cette modalité thérapeutique [64, 65]. Un repérage échographique avant tout geste invasif pleural (ponction, drainage) est préconisé [66-68]. Ponctions pleurales répétées (PPR) Certains auteurs recommandent de profiter de la ponction pleurale diagnostique pour évacuer l'épanchement pleural [69, 70]. Quelques équipes préconisent la répétition des ponctions évacuatrices, éventuellement associées à la réalisation de lavages pleuraux [72, 73]. Un repérage échographique préalable est conseillé. [73, 74]. Réalisées de façon itérative, les PPR présentent l'avantage d'être peu invasives et permettent d'éviter les complications du drainage thoracique ou de la chirurgie (hémothorax, risque infectieux, complications postopératoires). Elles permettent également une meilleure mobilité des patients, voire la gestion de certains malades en ambulatoire. Chez l'homme, l'efficacité de cette technique a seulement été évaluée par des petites séries, le plus souvent rétrospectives, toutes antérieures à l'année 2000 et comportant parfois des PI d'étiologies diverses (Tableau V). Il n'existe aucune étude comparant les ponctions répétées au drainage thoracique chez l'adulte [63]. Les taux de succès sont très variables, allant de à 2, 4 % à 100 %, et la mortalité comprise entre 0 et 25 % [72, 73]. L'efficacité de cette technique semble meilleure chez l'enfant [75]. Les principales complications des ponctions répétées sont la douleur, la toux, les réactions vasovagales et les pneumothorax iatrogènes. Le risque de saignement et d'œdème de ré- expansion est plus rare [74]. Par ailleurs, cette stratégie thérapeutique peut nécessiter un nombre important de ponctions pleurales, à l'origine d'une durée d'hospitalisation plus longue : dans la série de Simmers et coll. [73], les patients avaient bénéficié de 7, 7 ponctions en moyenne pour une durée moyenne d'hospitalisation de 31 jours. Dans notre expérience personnelle, à propos de 79 patients traités par ponctions répétées, le nombre médian de ponctions était de 3 et la durée moyenne d'hospitalisation de 21 jours. Le pourcentage de recours à la chirurgie n'était que de 4 %. Le taux de pneumothorax iatrogène était de 6 % mais aucun n'a nécessité de drainage thoracique [70]. Drainage thoracique à thorax fermé L'insertion d'un drain thoracique au sein du liquide pleural infecté constitue l'attitude classique du traitement évacuateur de première intention [76]. Les drains utilisés sont soit de gros calibre (24 à 36F), soit de petit calibre (8 à 24F). L'insertion du drain s'effectue par incision intercostale, par l'intermédiaire d'un trocart, ou selon la technique de Seldinger (drains de petit calibre) [63, 76, 77]. La définition du succès du drainage thoracique n'est pas consensuelle mais la plus utilisée est représentée par la régression des signes cliniques et biologiques d'infection, associée à une ré- expansion pulmonaire complète sans recours à un traitement chirurgical complémentaire [42, 76]. Drainage thoracique sans repérage ( à l'aveugle ) Classiquement, la mise en place d'un drain thoracique est effectuée au lit du malade, sous anesthésie locale, sans repérage radiologique préalable. L'utilisation de drains de gros calibre (> 28F), plus douloureux, ne semble pas préférable malgré la viscosité du liquide car leur supériorité par rapport aux drains de petit calibre n'a pas été démontrée [18, 22, 78]. De même, la supériorité de la mise en aspiration du drain par rapport au drainage passif n'a pas été mise en évidence [79]. Les taux de succès habituellement observés en l'absence de repérage radiologique sont inférieurs à 50 %, y compris en cas d'utilisation de drains de gros calibre [27]. Drainage thoracique guidé par l'imagerie La mise en place de drains thoraciques peut également être guidée par l'échographie ou la tomodensitométrie [80, 81]. Cette technique permet la mise en place de drains de plus petit calibre, directement au sein des poches pleurales délimitées par les cloisons de fibrine [82]. Les taux de succès sont supérieurs à ceux obtenus en l'absence de repérage radiologique et varient entre 70 et 94 % [80, 83, 84], y compris en seconde intention après échec du drainage conventionnel [84, 85]. La majorité de ces études préconisent la réalisation de rinçages au sérum physiologique afin de prévenir l'occlusion des drains et l'utilisation d'agents fibrinolytiques pour favoriser le drainage pleural. Les résultats sont inférieurs en cas d'empyèmes [83] et en présence de loculations [84]. L'utilisation de drains plus petits (10 à 14F) permet, tout en gardant la même efficacité, d'améliorer leur tolérance et de réduire le risque de complication [80, 81, 86, 87]. Dans l'étude MIST 2, les drains étaient de taille inférieure à 15F dans plus de 86 % des cas [88]. Traitement chirurgical Le traitement chirurgical comporte la thoracoscopie de débridement (médicale et vidéo- thoracoscopie) et la chirurgie de décortication pleurale. Thoracoscopie de débridement La pleuroscopie médicale, réalisée par les pneumologues, a été développée dans les années 1910 pour le débridement des pleurésies tuberculeuses [89]. En dehors des patients fragiles présentant un haut risque chirurgical, cette technique a été abandonnée au profit de la vidéo-thoracoscopie (VATS) [78]. La VATS nécessite une anesthésie générale et une intubation sélective permettant la ventilation unipulmonaire. Elle permet d'évacuer les débris fibrinopurulents, d'effondrer les cloisonnements (débridement), de réaliser une toilette de la cavité pleurale et de mettre en place un ou plusieurs drains thoraciques sous contrôle de la vue [1, 90]. Certaines équipes préconisent de recourir à une thoracotomie de conversion pour décortication pleurale en l'absence de ré-expansion pulmonaire peropératoire après débridement [91, 92]. La VATS offre cependant la possibilité de réaliser un débridement pleural avec des taux de succès identiques à la chirurgie ouverte et une morbidité postopératoire plus faible [93]. Plusieurs études non contrôlées ont évalué les résultats de la prise en charge par VATS, le plus souvent après échec du drainage thoracique, avec des taux de succès compris entre 71 et 93 % [9, 94, 95]. Seules deux études randomisées ont comparé le drainage médical avec la chirurgie par VATS. Wait et coll. [96], en 1997, ont randomisé 20 patients (11 patients traités par VATS en première intention, 9 patients traités par drainage thoracique avec instillation de streptokinase pendant 3 jours). La mortalité était identique dans les deux groupes. En revanche, les patients traités par chirurgie avaient un taux de succès plus important (10/11) que les patients traités médicalement (4/9) ainsi qu'une durée de drainage et une durée d'hospitalisation plus faibles. Tous les échecs du traitement médical ont été récupérés efficacement par VATS, sans aucun recours à la thoracotomie. Bilgin et coll. [97] ont rapporté en 2006 une série de 70 patients traités par VATS (n 35) ou drainage thoracique (n 35). Le taux de succès, défini par l'absence de nécessité de thoracotomie pour décortication pleurale ultérieure, était de 83 % dans le groupe VATS contre 63 % dans le groupe drainage médical. La durée d'hospitalisation était significativement plus faible dans le groupe VATS. Bien que randomisées, ces études comportaient plusieurs limites. Les drains médicaux étaient placés sans repérage préalable expliquant les faibles taux de succès du traitement médical (respectivement de 45 % et de 63 %) par rapport aux données de la littérature. L'appréciation de l'échec était laissée à l'initiative des cliniciens. Enfin, le nombre de patients était limité. Chirurgie de décortication pleurale (Open decortication) La chirurgie de décortication est une intervention lourde, non réalisable en cas de comorbidités importantes, qui consiste en l'ablation de la pachypleurite viscérale pour permettre la ré- expansion du poumon dans la cavité pleurale [42, 98]. Elle repose sur la thoracotomie, éventuellement complétée par la réalisation d'une fenestration par résection costale (thoracostomie) permettant un drainage continu de la cavité pleurale [63]. La mortalité est comprise entre 3 et 10 % [76]. Elle peut être réalisée précocement, le plus souvent en seconde intention, soit dans un but de contrôle du sepsis, soit après échec d'une autre technique (drainage ou thoracoscopie) [99]. Elle peut aussi être proposée en cas de contre-indication à la thoracoscopie [2]. Cependant, une revue de la littérature récente comparant la chirurgie par thoracotomie à la thoracoscopie (VATS) fait état de plus mauvais résultats postopératoires par rapport à la VATS, avec une durée d'hospitalisation plus longue, une augmentation de la douleur et du risque infectieux postopératoires et une mortalité à 30 jours plus importante [100]. La thoracotomie doit donc être évitée à la phase aigu au profit de la chirurgie mini-invasive (VATS) qui semble offrir de meilleurs résultats. La décortication pleurale peut également être proposée plus tardivement, à la phase organisée, en cas de syndrome restrictif symptomatique sévère dans un but de récupération fonctionnelle [2]. Un délai d'au moins 6 mois doit cependant être respecté du fait de la possibilité de résorption de la pachypleurite pariétale après une longue période d'évolution [18]. Recommandations concernant le traitement évacuateur Recommandations de la BTS [54] Dans ses recommandations, la BTS préconise le recours au drainage thoracique en première intention en cas d'EPP compliqué et d'empyème. Les critères définis comme imposant le drainage thoracique sont les suivants : liquide pleural purulent ou trouble (grade B) ; examen bactériologique positif (examen direct ou culture) (grade B) ; pH pleural inférieur à 7, 2 (grade B) ; présence de loculations ou épanchement pleural abondant (grade C). En cas de persistance du sepsis associé à une persistance de la collection pleurale malgré le drainage thoracique, la BTS recommande le recours à la chirurgie dans un délai de 5 à 7 jours. Recommandations de l'ACCP [53] Les recommandations de l'ACCP reposent sur une analyse de la littérature concernant les différents traitements évacuateurs de première intention (ponctions évacuatrices, drainage thoracique avec ou sans fibrinolyse, VATS et chirurgie ouverte). Les conclusions sont les suivantes : les EPP de catégorie 1 et 2 ne requièrent pas de traitement évacuateur (grade D) ; les EPP de catégorie 3 et 4 ne doivent pas être évacués par ponctions pleurales évacuatrices ou drainage thoracique sans fibrinolytiques (grade C) ; les EPP de catégorie 3 et 4 doivent être évacués soit par drainage thoracique avec fibrinolytiques, soit par VATS, soit par chirurgie ouverte (grade C). L'ACCP positionne donc la chirurgie comme premier traitement évacuateur à mettre en œuvre en cas d'EPP compliqué, au même titre que le drainage thoracique avec fibrinolyse. Il s'agit du principal point de divergence par rapport aux recommandations de la BTS qui placent la chirurgie comme une option de seconde intention. Les ponctions pleurales répétées ne sont préconisées, en première intention, ni par la BTS, ni par l'ACCP. Le traitement évacuateur de première intention repose soit sur la réalisation de ponctions pleurales répétées, soit sur le drainage thoracique, soit sur la chirurgie (VATS). Les ponctions pleurales et le drainage thoracique doivent être guidés par l'échographie pleurale. L'indication du traitement doit tenir compte des comorbidités, notamment lorsqu'une chirurgie est envisagée. La mise en place d'un drain thoracique repose sur l'utilisation de drains de petite taille (< 15F). La chirurgie de décortication pleurale ne doit être envisagée qu'à distance en vue de réduire les séquelles restrictives. Place de la fibrinolyse intrapleurale L'injection intrapleurale d'agents fibrinolytiques, utilisée pour la première fois en 1949 [101], a pour objectif d'améliorer l'efficacité du drainage en lysant les structures fibreuses responsables de loculations au cours de la phase d'enkystement [1]. La fibrinolyse intrapleurale peut être utilisée aussi bien lors des ponctions pleurales répétée que lors du drainage thoracique. En cas de PPR, l'agent fibrinolytique est laissé dans la cavité pleurale jusqu'à la ponction suivante. En cas de drain thoracique, l'agent fibrinolytique est injecté directement dans le drain qui est clampé pendant 2 heures. Les agents fibrinolytiques utilisés sont la streptokinase, l'urokinase et le tissue- plasminogen activator (t-PA). Ces enzymes sont de puissants activateurs du plasminogène, conduisant à la formation de plasmine qui dégrade la fibrine, le fibrinogène et d'autres molécules apparentées [102]. La durée de vie intrapleurale de 45 min plaide en faveur d'une utilisation pluriquotidienne. Plusieurs études contrôlées randomisées ont comparé le drainage associé à la fibrinolyse intrapleurale au drainage seul. Ces études ont montré un bénéfice de la fibrinolyse intrapleurale, cette dernière permettant une amélioration de la quantité totale de liquide pleural drainé [103, 104], une diminution du recours à la chirurgie [104-106] , une réduction de la durée de la fièvre et de la durée d'hospitalisation [104] et une meilleure régression des anomalies radiologiques [106]. Elles n'ont pas retrouvé en revanche d'effet sur la mortalité. En 2005, la publication de l'essai MIST-1 (Multicenter Intrapleural Sepsis Trial) évaluant l'utilisation de streptokinase contre placebo est l'essai le plus important avec un total de 430 patients [22], alors que les études précédentes concernaient de petits effectifs. Les résultats ne montraient pas de différence en termes de recours à la chirurgie (Figure 10), de durée d'hospitalisation ou d'amélioration radiologique et confirmaient l'absence d'impact du traitement fibrinolytique sur la mortalité. De plus, les effets secondaires (douleur thoracique, fièvre, allergie) étaient davantage observés dans le groupe streptokinase avec une tendance non significative (p 0, 08). Il est à noter toutefois que le drainage n'était pas guidé par l'imagerie, que les drains utilisés étaient de petit calibre (12F en moyenne) et que la décision de recours au traitement chirurgical était laissée à l'appréciation des praticiens. Par ailleurs, une fibrinolyse intrapleurale avait été administrée quel que soit le stade et le bénéfice de la fibrinolyse n'avait pas été évalué spécifiquement dans le sous-groupe de patients présentant un épanchement cloisonné. Ces résultats, en défaveur de la fibrinolyse intrapleurale, ont été confirmés par deux méta- analyses [107, 108] ne retrouvant pas de réduction significative de la mortalité ou du recours à la chirurgie en cas de fibrinolyse intrapleurale. Les effets secondaires systémiques des fibrinolytiques sont exceptionnels, y compris avec la streptokinase [109]. Il n'y a pas de modification des paramètres de coagulation ou de fibrinolyse systémique [110] ni d'augmentation du risque d'hémorragie intrapleurale [22]. L'effet secondaire le plus fréquent est l'apparition d'une réaction fébrile [18]. Des réactions allergiques sont également possibles, aussi bien avec la streptokinase que l'urokinase [109]. Enfin l'utilisation de streptokinase induit la synthèse d'anticorps anti-streptokinase susceptibles de réduire l'efficacité de la streptokinase en cas d'injection systémique ultérieure [22]. Les agents fibrinolytiques n'ont aucun effet sur la réduction de la viscosité du pus qui est principalement attribuable à l'accumulation de débris cellulaires et d'ADN bactérien (aboutissant à la formation de biofilm). L'adjonction de désoxyribonucléase recombinante (DNase) permettant la dépolymérisation de l'ADN bactérien a donc été proposée par certains auteurs qui rapportent une amélioration du drainage pleural suite à l'utilisation de DNase [111, 112]. Ces données préliminaires ont été confirmées en 2011 par l'étude MIST-2 [88] qui regroupait 210 patients randomisés en quatre groupes : t-PA seul, DNase seule, t-PA associé à la DNase et double placebo. Le drainage comportait la mise en place de drains de petite taille (< 15F) dans plus de 80 % des cas. Les résultats mettaient en évidence une réduction plus importante du volume de l'épanchement pleural sur la radiographie thoracique, une diminution de la fièvre et de l'hyperleucocytose au 7e jour, une diminution de la durée d'hospitalisation et une diminution du recours à la chirurgie uniquement chez les patients traités par l'association t-PA et DNase (Figure 11), sans effet sur la mortalité. En revanche, ces bénéfices n'étaient pas retrouvés dans les groupes t-PA et DNase seuls, confirmant ainsi les résultats de l'étude MIST-1 [22]. Enfin, il n'y avait pas de différence concernant la survenue d'effets indésirables entre les groupes. Il semble donc que l'association t-PA et DNase présente un intérêt dans la prise en charge des EPP compliqués, mais ceci ne figure pas encore dans les recommandations et nécessite des études complémentaires de confirmation. La fibrinolyse intrapleurale n'a pas fait la preuve de son efficacité lorsqu'elle est utilisée seule. En association avec la DNAse, la fibrinolyse pourrait permettre un meilleur drainage de l'épanchement pleural, une réduction de la durée d'hospitalisation et une réduction du recours à la chirurgie sans impact sur la mortalité. Les effets secondaires de la fibrinolyse intrapleurale sont exceptionnels. Kinésithérapie respiratoire Bien que non recommandée par la BTS et l'ACCP, la kinésithérapie pleurale est largement réalisée en pratique en France et est recommandée dans les manuels de pneumologie pour les étudiants en médecine [55]. Elle a pour but de réduire les séquelles fonctionnelles et doit donc être pratiquée de façon prolongée [18]. Le collège des universitaires de maladies infectieuses et tropicales recommande la réalisation d'une kinésithérapie respiratoire pendant 3 à 6 mois [113]. Cependant, il n'existe pas d'étude randomisée évaluant l'efficacité de la kinésithérapie respiratoire dans cette pathologie. Pronostic La morbidité et la mortalité des pneumopathies infectieuses sont augmentées lorsqu'un EPP est mis en évidence, cette situation correspondant en fait à un retard de prise en charge de la pneumopathie initiale [9]. Par ailleurs, le risque d'échec du traitement d'une pneumonie communautaire est multiplié par 2, 7 en cas d'EPP [114]. La mortalité en cas d'empyème est estimée entre 5 et 30 % [19, 115]. Dans une étude prospective portant sur 85 patients atteints de pleurésie parapneumonique, la mortalité hospitalière était de 4, 7 % alors que la mortalité globale (incluant un suivi de 400 jours après drainage thoracique) s'élevait à 14 % [115]. Un retard à l'initiation de l'évacuation pleurale est responsable d'une augmentation de la mortalité [116]. La mortalité est par ailleurs directement influencée par les comorbidités sous-jacentes et peut atteindre jusqu'à 40 % en cas d'immunosuppression [9]. Les autres facteurs de mauvais pronostic identifiés sont un âge élevé, la dénutrition, l'hypo-albuminémie, le diabète, les maladies néoplasiques et les cardiopathies [19, 115, 116]. La mortalité varie également en fonction de l'étiologie microbienne. L'analyse des données bactériologiques de l'étude MIST-1 [24] fait apparatre une mortalité plus élevée pour les infections à bacilles à Gram négatif, à staphylocoque doré ou polymicrobiennes à germes aérobies. À l'inverse, les infections à streptocoque et à anaérobies ont un meilleur pronostic. Cette différence avait déjà été rapportée par Jerng [58] qui retrouvait un meilleur pronostic en cas d'infection à Streptococcus milleri et par Chen [20] qui avait mis en évidence un pronostic plus sombre en cas d'infection à bacilles à Gram négatif qui seraient également plus fréquemment retrouvés chez les patients porteurs de comorbidités. Les séquelles pleurales à long terme des EPP sont principalement représentées par l'apparition d'une pachypleurite qui est mise en évidence chez plus de 13 % des patients [117]. Mise en forme : Puces et numéros CONCLUSION Les épanchements parapneumoniques représentent un problème épidémiologique croissant imposant leur diagnostic à un stade précoce compte tenu du mauvais pronostic en l'absence de traitement. L'antibiothérapie doit être instaurée rapidement et être active sur les germes anaérobies. Les posologies et la durée des traitements sont mal codifiées. Le traitement évacuateur doit lui aussi être précoce. Cependant, ses modalités restent controversées. Les recommandations internationales préconisent le recours au drainage thoracique ou à la chirurgie en première intention mais le niveau de preuve de ces recommandations reste faible. Quelques études suggèrent la possibilité de réaliser des ponctions pleurales évacuatrices répétées. La fibrinolyse intrapleurale seule n'a pas fait la preuve de son efficacité. En revanche lorsqu'elle est associée à l'administration de DNase, il semble qu'elle améliore le pronostic. Points forts Les épanchements parapneumoniques représentent l'étiologie la plus importante des pleurésies infectieuses, avec une incidence en augmentation. La mortalité attribuable aux épanchements parapneumoniques est élevée. Les germes les plus fréquemment rencontrés sont les streptocoques du groupe milleri et les bacilles à Gram négatif. La ponction pleurale exploratrice doit être réalisée précocement. Elle permet de classer les EPP en plusieurs stades de sévérité croissante (Cf tableaux 1, 2, 3, 4). Les critères permettant de définir les épanchements parapneumoniques compliqués sont l'aspect macroscopique purulent, le dosage du pH pleural inférieur à 7. 2, la positivité de l'examen direct ou de la culture bactérienne ou la présence de loculations. Seuls les épanchements parapneumoniques compliqués doivent être évacués. L'antibiothérapie doit être précoce et comporter une activité anti-anaérobies, sauf en cas de pleurésie à pneumocoque. L'antibiothérapie de l'association amoxicilline-acide clavulanique. référence est Les modalités du traitement évacuateur sont débattues et reposent soit sur la réalisation de ponctions pleurales évacuatrices répétées, soit sur le drainage thoracique, soit sur la chirurgie (VATS). Un repérage échographique est recommandé avant réalisation des ponctions pleurales répétées ou insertion d'un drain thoracique La taille des drains thoraciques utilisés doit être inférieure à 15 french. Deux grands essais ont retrouvé une absence de rôle bénéfique de la fibrinolyse intrapleurale, sauf lorsqu'elle est associée à l'adjonction de DNase intrapleurale. Questions A Répondre par vrai ou faux 1. L'épidémiologie microbienne est parapneumoniques et les pneumonies. identique entre les épanchements pleuraux 2. Les pleurésies infectieuses (PI) sont en majorité d'origine pulmonaire. 3. L'incidence des épanchements pleuraux parapneumoniques (EPP) et des empyèmes a diminué au cours des deux dernières décennies. 4. De 5 à 10 % des EPP correspondent à des empyèmes. 5. Dans plus de deux tiers des cas d'EPP, on retrouve une comorbidité sous-jacente, souvent responsable d'une pneumopathie d'inhalation. 6. En pratique, les PI sont rarement associées à une immunodépression. 7. Les bactéries à Gram négatif et les germes anaérobies sont de nos jours plus souvent en cause que les pneumocoques dans les EPP. 8. Les pneumopathies d'inhalation sont plus volontiers responsables d'infections polymicrobiennes et à germes anaérobies. 9. Les EPP compliquant une légionellose sont rares mais se compliquent fréquemment d'empyème. 10. Les épanchements secondaires à des pneumopathies à bacilles à Gram négatif et à germes anaérobies sont purulents dans 90 % des cas. 11. Le principal germe en cause en cas d'infection nosocomiale est Staphylococcus aureus. 12. La culture pleurale est négative dans environ 40 % des cas. 13. Le premier stade d'un épanchement est exsudatif et lié à une augmentation de la perméabilité capillaire et il est initialement stérile. 14. Dès le stade exsudatif, un épanchement active la cascade de la coagulation et inhibe l'activité fibrinolytique. 15. On peut distinguer cliniquement un EPP compliqué d'un EPP non compliqué par l'existence d'une fièvre et d'une altération de l'état général. 16. La ponction pleurale exploratrice, étape essentielle dans le diagnostic des EPP, doit être précoce. 17. Les hémocultures ne retrouvent le germe responsable que dans 10 % des cas. 18. Les épanchements parapneumoniques sont des transsudats. 19. Sur le plan cellulaire, une prédominance lymphocytaire dans le liquide pleural est en défaveur d'une étiologie bactérienne. 20. Dans le liquide de ponction pleurale, il faut doser la LDH, le pH et la glycopleurie pour détecter les épanchements compliqués. 21. Une antibiothérapie précoce, au stade de pneumopathie, permet d'éviter l'installation d'un épanchement pleural en cas de pneumonie et sa surinfection. 22. Les antibiotiques de référence pour le traitement des infections à pneumocoque et streptocoques du groupe milleri sont les -lactamines, éventuellement associées à l'acide clavulanique, puis les aminosides en cas d'allergie. 23. Le contrôle de l'infection impose une évacuation la plus complète possible du liquide pleural par ponctions pleurales répétées ou, plus classiquement, par drainage thoracique à thorax fermé. 24. Le guidage échographique ou tomodensitométrique améliore le taux de succès des drainages thoraciques. 25. Le traitement évacuateur des EPP compliqués doit être chirurgical. 26. En général, la fibrinolyse intrapleurale ne permet pas d'augmenter le volume d'évacuation de l'épanchement. 27. Les agents fibrinolytiques, en diminuant la viscosité du pus, facilitent l'évacuation pleurale. 28. La mortalité de l'empyème est estimée entre 5 et 30 % et peut atteindre 40 % en cas d'immunosuppression. Réponses A Vrai ou faux 1. Faux, 2. vrai, 3. faux, 4. vrai, 5. vrai, 6. faux, 7. vrai, 8. vrai, 9. faux, 10. vrai, 11. vrai, 12. vrai, 13. vrai, 14. faux, 15. faux, 16. vrai, 17. vrai, 18. faux, 19. vrai, 20. vrai, 21. vrai, 22. faux, 23. vrai, 24. vrai, 25. faux, 25. faux, 25. faux, 26. vrai Remerciements : Jean-Sébastien Poineuf pour le premier travail rennais sur les épanchements parapneumoniques compliqués. REFERENCES [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] Foulon G, Debray MP, Crestani B. Pleurésies purulentes. Dans : Aubier M, Crestani B, Fournier M, Mal H. Traité de pneumologie. 2e éd. Medecine-Sciences Flammarion ; 2009. p. 415-20. Hamm H, Light RW. Parapneumonic effusion and empyema. European Respiratory Journal 1997 ; 10 : 11506. Snider GL, Saleh SS. Empyema of the Thorax in Adults : Review of 105 Cases. Chest 1968 ; 54 : 4105. Strange C, Sahn SA. 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Présence de loculations Aucun Aucun Ponctions pleurales évacuatrices Drainage thoracique Drainage thoracique fibrinolyse intrapleurale /- thoracoscopie ou décortication Drainage thoracique /- décortication chirurgicale Drainage thoracique fibrinolyse intrapleurale Thoracoscopie ou décortication souvent requises Classe Empyème simple Pus franc 6 Classe 7 Empyème complexe Une seule poche enkystée Pus franc Poches multiples Tableau I : Classification de Light (1995) [36] EPP : épanchement parapneumonique, ED : examen direct Tableau II : Classification de l'American College of Chest Physicians (2000) [53] Catégorie Taille de Biochimie Bactériologie Risque Drainage l'épanchement pleural Minime ( mm) Faible à modéré (>10 mm, Important (>hémithorax) Loculations Épaississement pleural Empyème 1 2 3 4 (*) et et Inconnu pH >7, 20 et et (ED ou culture) Inconnu d'évolution défavorable Très faible Négatif Faible Non Non ou pH ou Positif Modéré Oui - Pus Élevé Oui (*) En l'absence de valeur de pH, les valeurs de glycopleurie peuvent être utilisées avec une valeur seuil de 0, 6 g/L. ED : examen direct. Tableau III : Classification de la British Thoracic Society (2010) [54] Épanchement parapneumonique simple Aspect macroscopique pH LDH (UI/L) Glycopleurie (g/L) Bactériologie (Examen direct ou culture) Clair >7, 2 >0, 4 Négatif Épanchement parapneumonique compliqué Empyème Clair ou trouble Pus >1000 Positif - - - Positif Drainage thoracique Non Oui Oui Tableau IV : Classification du collège des enseignants de pneumologie (2013) [55] Abondance Cloisonnement Aspect macroscopique pH (discuté) Bactériologie (examen direct ou culture) Évacuation liquide infecté Épanchement parapneumonique simple Épanchement parapneumonique compliqué ( empyème ou pleurésie Faible Absent Clair > 7, 2 Négatif purulente) Grande Présent Trouble ou purulent < 7, 2 Positif Optionnel Obligatoire Tableau V : Publications rapportant des séries de pleurésies infectieuses traitées par ponctions pleurales répétées Auteur Caractéristiques Nombre de Catégorie Succès Mortalité patients Viana [118] Monocentrique 1964 1968 Benfield Monocentrique 1968 1978 [119] Lemmer Monocentrique 1978 1982 [120] Mandal [121] Monocentrique 1972 1984 Wehr [122] Monocentrique 1974 1984 Monocentrique 1984 1989 Storm [72] Ferguson [19] Simmers [73] Monocentrique Prospective 1986 - 1990 1999 Letheulle [70] Monocentrique 2013 41 24 4 28 27 51 46 29 79 NC NC NC 50 % EPP compliqués NC 100 % EPP compliqués et empyèmes 1 (2, 4%) 8 (33, 3%) 3 (75%) 8 (19, 5%) 3 (12, 5%) 1 (25%) 28 (100%) 0 (0%) 6 (22, 2%) 2 (7, 4%) 48 (94, 1%) 4 (7, 8%) 100 % empyèmes 19 (41%) 3 (6, 5%) EPP compliqués et empyèmes EPP compliqués et empyèmes 25 (86%) 4 (14%) 64 (81%) 4 (12%) Figures : Figure 1 : Exemple de liquide pleural macroscopiquement purulent (empyème). Figure 2 : Physiopathologie de la formation d'un épanchement parapneumonique (EPP) Figure 3 : Aspect scannographique de pleurésie purulente cloisonnée droite. On notera ici la présence de 3 poches pleurales enkystées. | HAL | Scientific |
Les types morpho-psychologiques dans la vie quotidienne et dans la littérature | WMT16 | Scientific |
6 mg/ kg une fois par | EMEA_V3 | Medicinal |
La pharmacocinétique de Kaletra n' a pas été étudiée chez les sujets présentant une insuffisance rénale, toutefois, comme la clairance rénale de lopinavir est négligeable, une diminution de la clairance totale est improbable chez les patients insuffisants rénaux. | EMEA_V3 | Medicinal |
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Ces données ont conduit au retrait mondial de Vioxx (rofécoxib) du marché le 30 septembre 2004 par le titulaire de l'Autorisation de Mise sur le Marché et ont soulevé des questions quant à la sécurité cardiovasculaire des autres inhibiteurs de la COX-2. | EMEA_V3 | Medicinal |
COMMISSION DE LA TRANSPARENCE Avis 21 novembre 2018 chloroquine (phosphate de) proguanil (chlorhydrate de) SAVARINE, comprimé pelliculé B/28 (CIP : 34009 341 279 5 3) Laboratoire CENTRE SPECIALITES PHARMACEUTIQUES Code ATC P01BA01 (Antipaludéens) Motif de l'examen Renouvellement de l'inscription Listes concernées Sécurité Sociale (CSS L. 162-17) Chimioprophylaxie du paludisme chez les voyageurs se rendant dans Indications les zones d'endémie o l'association de la chloroquine et du proguanil concernées est recommandée. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 1/5 Avis2 01 INFORMATIONS ADMINISTRATIVES ET REGLEMENTAIRES Date initiale (procédure par reconnaissance mutuelle) : 08/07/1996 Rectificatif d'AMM du 09/04/2015 : modification des rubriques 4. 4 Mises en garde spéciales et AMM précautions particulières d'emploi , 4. 8 Effets indésirables et 4. 9 Surdosage du RCP, actualisation de la rubrique 4. 5 Interactions avec d'autres médicaments et autres formes d'interactions du RCP conformément au thésaurus des interactions médicamenteuses. Conditions de prescription et de Liste II délivrance / statut particulier P Antiparasitaires, insecticides P01 Antiprotozoaires Classement ATC P01B Antipaludéens P01BA Aminoquinoléines P01BA01 Chloroquine 02 CONTEXTE Examen de la spécialité réinscrite sur la liste des spécialités remboursables aux assurés sociaux de Guyane non résidents des zones impaludées effectuant un séjour unique ou occasionnel de moins de 3 mois en zone d'endémie palustre guyanaise, pour une durée de 5 ans à compter du 25/07/2013. Pour rappel, suite à une saisine du Ministre de la Santé et des Solidarités, la Commission avait réévalué en 2008 le SMR des spécialités indiquées dans le traitement prophylactique du paludisme, afin de juger de l'opportunité d'une éventuelle admission au remboursement, en particulier pour les assurés sociaux de Guyane et de Mayotte. Dans son avis du 19/03/2008, les conclusions de la Commission concernant la spécialité SAVARINE 100 mg ont été les suivantes : Le service médical rendu par cette spécialité est important. , Avis favorable à l'inscription sur la liste des spécialités remboursables aux assurés sociaux de Guyane non résidents des zones impaludées effectuant un séjour unique ou occasionnel de moins de 3 mois en zone d'endémie palustre. et Avis défavorable à l'inscription sur la liste des spécialités remboursables aux assurés sociaux de Mayotte. Dans son dernier avis de renouvellement du 10/07/2013, la Commission a considéré que le SMR de SAVARINE restait important dans l'indication de l'AMM. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 2/5 Avis2 03 CARACTERISTIQUES DU MEDICAMENT 03. 1 Indications thérapeutiques Chimioprophylaxie du paludisme chez les voyageurs se rendant dans les zones d'endémie o l'association de la chloroquine et du proguanil est recommandée. 03. 2 Posologie Cf. RCP 04 ANALYSE DES NOUVELLES DONNEES DISPONIBLES 04. 1 Efficacité Le laboratoire n'a fourni aucune nouvelle donnée clinique d'efficacité. 04. 2 Tolérance/Effets indésirables Le laboratoire a fourni des nouvelles données de tolérance (PSUR couvrant la période du 1er août 2012 au 15 novembre 2013 et du 16 novembre 2013 au 15 novembre 2016). Depuis la dernière soumission à la Commission, des modifications de RCP ont été réalisées : modification des rubriques 4. 4 Mises en garde spéciales et précautions particulières d'emploi , 4. 8 Effets indésirables et 4. 9 Surdosage du RCP, actualisation de la rubrique 4. 5 Interactions avec d'autres médicaments et autres formes d'interactions du RCP conformément au thésaurus des interactions médicamenteuses. Ces données ne sont pas de nature à modifier le profil de tolérance connu pour cette spécialité. 04. 3 Données d'utilisation/de prescription Selon l'Etude Permanente sur la Prescription Médicale (EPPM) réalisée par IMS auprès d'un panel de médecins libéraux en France métropolitaine (hors Corse) et après extrapolation des données recueillies (cumul mobile annuel Hiver 2017), le nombre de prescriptions de la spécialité SAVARINE est estimé à 3 361. Le faible nombre de prescriptions de cette spécialité ne permet pas l'analyse qualitative des données. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 3/5 Avis2 04. 4 Stratégie thérapeutique Les données acquises de la science sur le paludisme et ses modalités de prise en charge ont également été prises en compte1, 2, 3. 4 La place de la spécialité SAVARINE dans la stratégie thérapeutique n'a pas été modifiée depuis l'avis précédent de la Commission, en date du 10 juillet 2013. Conformément à son avis précédent, la Commission rappelle que compte tenu du classement de la Guyane parmi les pays du groupe 3 (zone de prévalence élevée de chloroquinorésistance et de multirésistance), les seuls antipaludéens théoriquement utilisables en prophylaxie sont la méfloquine, l'association atovaquone-proguanil ou la doxycycline. Cependant, la doxycycline est contre-indiquée chez la femme enceinte et la femme allaitant. L'association chloroquine-proguanil (SAVARINE), en dépit de sa moindre efficacité, pourrait ainsi représenter dans de très rares cas une alternative thérapeutique aux antipaludéens recommandés en première intention (méfloquine, association atovaquone-proguanil ou doxycycline), en cas de contre-indication ou de mauvaise tolérance. Il conviendra alors de renforcer les mesures de protection contre les piqûres de moustiques. Il est à noter que le dosage des principes actifs de SAVARINE n'est pas adapté aux enfants de moins de 15 ans et aux adultes ou adolescents pesant moins de 50 kg. 05 CONCLUSIONS DE LA COMMISSION Considérant l'ensemble de ces informations et après débat et vote, la Commission estime que les conclusions de son avis précédent du 10/07/2013 n'ont pas à être modifiées. 05. 1 Service Médical Rendu Le paludisme est une pathologie grave pouvant engager le pronostic vital du patient, notamment lorsque Plasmodium falciparum en est la cause. La spécialité SAVARINE constitue un traitement prophylactique du paludisme. Le rapport efficacité/effet indésirables est important. L'association chloroquine-proguanil (SAVARINE), en dépit de sa moindre efficacité, pourrait représenter dans de très rares cas une alternative thérapeutique aux antipaludéens recommandés en première intention (méfloquine, association atovaquone-proguanil ou doxycycline), en cas de contre-indication ou de mauvaise tolérance. Il conviendra alors de renforcer les mesures de protection contre les piqûres de moustiques. Compte tenu de ces éléments, la Commission considère que le service médical rendu par SAVARINE reste important dans l'indication de l'AMM. La Commission donne un avis favorable au maintien de l'inscription SAVARINE sur la liste des spécialités remboursables aux assurés sociaux de Guyane non-résidents des zones impaludées effectuant un séjour unique ou occasionnel de moins de 3 mois en zone d'endémie palustre dans l'indication et aux posologies de l'AMM. Taux de remboursement proposé : 65 % OMS. Paludisme : Informations aux voyageurs. Dernière mise à jour : 29 novembre 2017. BEH. Recommandations sanitaires pour les voyageurs, 2017. Hors-série. 6 juin 2017. SPILF. Prise en charge et prévention du paludisme d'importation. Mise à jour 2017 des RPC 2007. OMS. International travel and health. Chapter 7 : Malaria. Update 2017. chapter7. pdf ? ua 1 HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 4/5 Avis2 05. 2 Recommandations de la Commission Conditionnement Il est adapté aux conditions de prescription selon l'indication, la posologie et la durée de traitement. HAS - Direction de l'Evaluation Médicale, Economique et de Santé Publique 5/5 Avis2 | HAS | Scientific |
Le scellement des prothèses fémorales aux silicones. Etude macroscopique. Essais d'usure. Aspects microscopiques | WMT16 | Scientific |
Convulsions, avec ou sans fièvre, se produisant dans les 3 jours. | EMEA_V3 | Medicinal |
Pour ou contre le déclenchement systématique à 41(+0) semaines d'aménorrhée ? | WMT16 | Scientific |
Prévention primaire Réduction de la morbidité cardiovasculaire chez les hommes présentant une augmentation du cholestérol non-HDL, ainsi qu' un risque élevé de premier événement cardiovasculaire, en particulier lorsque l' utilisation d' une statine n' est pas appropriée ou n' est pas tolérée (voir section 5. 1). | EMEA_V3 | Medicinal |
Rôle de la chaperonne HSP 70 dans l'éythropoïèse ineicace des béta-thalassémies majeures Jean-Benot Arlet To cite this version : Jean-Benot Arlet. Rôle de la chaperonne HSP 70 dans l'éythropoïèse ineicace des béta-thalassémies majeures. Hématologie. Université Paris Sud - Paris XI, 2013. Français. NNT : 2013PA11T040. tel-01078878 HAL Id : tel-01078878 Submitted on 30 Oct 2014 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. UNIVERSITÉ PARIS XI FACULTÉ DE MÉDECINE PARIS SUD Laboratoire CNRS UMR 8147 Hôpital Necker-Enfants Malades Paris Année universitaire 2012 - 2013 N attribué par la bibliothèque THÈSE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ PARIS XI École doctorale de Cancérologie Présentée et soutenue publiquement par Jean-Benot ARLET Né le 24 octobre 1975 à Toulouse (31) Le 1er juillet 2013 RÔLE DE LA CHAPERONNE HSP70 DANS L'ÉRYTHROPOÏÈSE INEFFICACE DES -THALASSÉMIES MAJEURES JURY Président : Examinateurs : Monsieur le Professeur William VAINCHENKER Monsieur le Professeur Bruno VARET Monsieur le Professeur Yves BEUZARD Rapporteurs : Directeurs de thèse : Monsieur le Professeur Olivier HERMINE Madame le Professeur Jeanne AMIEL Monsieur le Docteur Stany CHRÉTIEN Docteur Geneviève COURTOIS À ma femme Hélène, Pour l'amour quotidien que l'on partage Pour l'aide et le soutien indéfectibles que tu m'as apportés durant ces quatre années de thèse 2 À mon fils Eliot, Petit blond aux yeux bleus qui éclaire ma vie Fais de ta vie un rêve, et d'un rêve, une réalité. Le Petit Prince d'Antoine de Saint-Exupery 3 La chance ne sourit qu'aux esprits bien préparés Louis Pasteur 4 La confiance en soi constitue le fondement de toute motivation et toute réussite. Je dois beaucoup à Olivier Hermine, directeur de cette thèse. C'est lui qui a su malicieusement préparer mon esprit à la recherche fondamentale et m'a donné la confiance nécessaire à l'aboutissement, je l'espère honorable, de ces années de thèse de sciences. Je réalise la chance qui m'est encore donnée de travailler avec lui et de le compter parmi mes amis. Tu m'as permis de croire en ce que je voyais et de saisir la chance quand elle se présentait. Je suis maintenant habité (un peu, soyons modeste) par l'esprit Herminien de trouver une explication physiopathologique à toute chose, dérivée d'une observation méticuleuse. Ce n'était pas gagné d'avance car j'étais bêtement réticent à laisser tomber mes patients pour passer mes journées à siffloter des airs de Jazz à mes érythroblastes en culture, week-end et jours fériés inclus. Tu possèdes le grand talent et l'humble intelligence de tirer le meilleur de tes élèves aussi différents soient-ils, car tu as faite tienne la devise de St Exupéry : Si tu veux construire un bateau, ne rassemble pas tes hommes et femmes pour leur donner des ordres, pour expliquer chaque détail, pour leur dire o trouver chaque chose. Si tu veux construire un bateau, fais natre dans le cœur de tes hommes et femmes le désir de la mer. Je dois associer ici à ces remerciements le professeur Bruno Varet qui est la deuxième personne (ou plutôt la première, mais mon esprit n'était à l'époque pas encore bien prêt) à m'avoir fait entrevoir l'intérêt d'une recherche fondamentale accolée à l'exercice clinique. Je me souviens parfaitement de notre première rencontre dans votre bureau de l'hôpital Necker avant de prendre mes fonctions d'interne. Vous êtes le seul patron à m'avoir demandé mon classement à l'internat et si je comptais faire un DEA ! Votre rigueur intellectuelle et l'attention que vous portez à l'enseignement, aux patients et aux personnes me serviront encore longtemps de modèle. 5 La rencontre avec Geneviève Courtois, la co-directrice de ce travail, a été une grande chance. C'est avec beaucoup de talent, d'efficacité et de simplicité que tu as conduit au jour le jour ce travail de thèse. Tu as toujours été disponible dès les premières manip jusqu'à l'écriture du papier , la relecture de la thèse et encore maintenant pour finir les dernières expériences nécessaires à la finalisation de ce travail. Tu as une vision perspicace des directions à prendre lorsque les problèmes se posent. Ce fut un réel plaisir de partager ces quelques années avec toi. Encore désolé d'avoir si souvent subrepticement échangé ton confortable fauteuil bleu avec mon moche fauteuil vert, mais c'était tellement tentant vu la proximité géographique de nos bureaux ne dépassant pas 50 cm ! Jean-Antoine Ribeil a une place spéciale dans ces remerciements car c'est lui qui m'a entrané sur ce sujet et aurait dû figurer dans le jury. Ce travail est en effet la conséquence d'une idée qui a germé dans son esprit au cours de sa thèse de science dans le laboratoire. Cette collaboration scientifique arrive après déjà quelques années d'un travail clinique riche, fructueux et amical construit sur l'envie de développer et d'enrichir les soins aux patients drépanocytaires adultes et thalassémiques. Nous sommes un peu les Laurel et Hardy du monde des hémoglobinopathies ! Sache que j'apprécie particulièrement ton humour et notre numéro de duettiste. Merci pour ton aide et ton soutien au cours de ces années. 6 Monsieur le Professeur William VAINCHENKER Vous nous avez fait plaisir de suivre ce travail de thèse depuis plusieurs mois et de nous encourager. Je tiens à vous remercier sincèrement pour l'honneur que vous nous faites de présider ce jury de thèse. Vous êtes pour moi l'étoile du petit prince, star scientifique incontestable de l'érythropoïèse et de la thrombopoïèse. 7 Madame le Professeur Jeanne AMIEL Vous avez accepté d'être rapporteur de ce travail de thèse avec beaucoup de gentillesse et d'enthousiasme bien que la thématique de ce travail soit relativement éloignée de vos sujets habituels de prédilection. Soyez-en ici remerciée. Je n'ai pas oublié la réunion que nous avons eue avec Olivier Hermine, il y a quelques années, pour discuter du rôle d'Hsp70 dans la maladie d'Ondine. Cela a bien alimenté la discussion de cette thèse. Votre regard critique de généticienne de haut niveau nous sera utile et nous espérons lancer sur cette thématique une collaboration au sein de l'IHU Imagine. 8 Monsieur le Docteur Stany Chrétien C'est un véritable plaisir d'avoir dans ce jury un grand spécialiste de l'érythropoïèse et de GATA-1. Je vous suis reconnaissant d'avoir accepté de jeter votre œil expert et avisé sur ce travail de thèse. 9 Monsieur le Professeur Yves Beuzard Vous faites partie des sages que l'on écoute avec toujours beaucoup de plaisir. Vous êtes la mémoire française vive de tant d'années d'études sur les hémoglobinopathies ! J'ai été ravi de faire votre connaissance et de profiter de votre érudition durant ces années de thèse. 10 Je tiens à remercier le Dr Michel Dy, toujours bienveillant, de m'avoir accueilli à deux reprises (pour mon DEA puis pour la thèse) dans son unité de recherche CNRS (UMR 8147). On ne peut commencer à lire ces pages rébarbatives de thèse (enfin je l'espère pas trop quand même) sans remercier tous mes collègues de la Hermine's Team . Je ne peux les citer tous sans en oublier quelques-uns, je m'excuse d'avance auprès de ceux qui ne seraient pas dans cette liste : Amédée Renand (mon binôme de DEA qui m'a appris le Ficoll et le verlan), Marie Bouillié (l'âme sensuelle du bureau, qui achète tout le monde à coup de nougats), Sophie Georgin-Lavialle (avec qui j'ai eu le double plaisir de travailler au labo et à l'HEGP, toujours prête à donner un coup de main efficace), Marie- Thérèse Rubio (ma co-interne et amie d'hémato), Zakia Bellaïd (la main sur le cœur), Michal Dussiot (un chercheur gentil, compétent et acharné), Yvan Moura, Flavia Guillem, Julie Bruneau, David Sitbon, Francine Côté, Pascal Amireault, Tereza Coman, Maud Daveni, Julien Rossignol et enfin mon ami hématologue adulte de Necker, le Dr Richard Delarue. Je tiens également à remercier ceux qui m'ont poussé à rentrer dans l'eau froide de les professeurs Loïc Capron et Jacques Pouchot. Merci aussi d'avoir permis mon retour dans le service comme praticien hospitalier et pour la confiance dont vous me gratifiez d'être votre élève. Merci à Amélie Passeron et Brigitte Ranque et tous les chefs de clinique et internes qui ont assuré la prise en charge des patients dans le service de médecine interne de l'HEGP pendant mon absence. Enfin, je ne peux oublier ici toute ma famille qui m'entoure avec tant d'amour : mes parents qui m'ont transmis le goût pour la médecine clinique et humaniste, mais aussi le goût et le sens des choses simples ; mon frère, Jérôme, avec qui je partage tant de bons moments musicaux ; ma sœur, Caroline, et mon beau-frère Xavier ainsi que leurs trois enfants, Chloé, Ninon et Juliette ; mes grands-parents modèles de réussite familiale, humaine et professionnelle ; et toute la tribu Arlet et Suau. Une mention spéciale à Daniel André, mon beau-père qui a relu le manuscrit avec la grande gentillesse et le sens du travail bien fait qui le caractérisent. Merci pour cela, mais aussi pour cette excellente entente que nous partageons et pour m'avoir donné la main de ta fille. fondamentale, mes matres de médecine la recherche interne 11 RÉSUMÉ (stade d'une le cytoplasme des érythroblastes matures La séquestration cytoplasmique d'Hsp70 par les chanes d'-globine libres est un mécanisme clé de l'érythropoïèse inefficace des -thalassémies majeures (-TM). L'érythropoïèse inefficace joue un rôle central dans la physiopathologie de l'anémie des -TM. Ses caractéristiques sont triple : accélération de la différenciation érythroïde, arrêt de maturation au stade d'érythroblaste polychromatophile et mort par apoptose à ce stade de différenciation. Les mécanismes précis de cette apoptose et de l'arrêt de la maturation n'ont pas encore été élucidés. Il a été montré, au cours de l'érythropoïèse physiologique, que la protéine chaperonne Hsp70, en se localisant dans le noyau des érythroblastes en cours de différenciation, protège GATA-1 (facteur de transcription érythroïde majeur) de sa destruction par la caspase-3. Cette enzyme clé de l'apoptose est en effet activée physiologiquement au cours de la différenciation érythroïde et peut cliver GATA-1. Notre travail se base sur l'hypothèse suivante : Hsp70 pourrait, au cours de l'érythropoïèse des -TM, être séquestrée dans intense hémoglobinisation) afin d'exercer son rôle de chaperonne des chanes d'-globine libres. Cela aurait comme conséquence néfaste l'absence de localisation nucléaire d'Hsp70 et, en conséquence, la destruction de GATA-1 à l'origine de l'arrêt de maturation et de la mort cellulaire. Nous avons montré dans ce travail qu'Hsp70 était localisée principalement dans le cytoplasme des érythroblastes matures dans la moelle de patients -TM, avec un défaut d'expression nucléaire. Par ailleurs, GATA-1 n'est plus exprimé dans ces cellules. Nous avons confirmé ces résultats dans un système de culture cellulaire érythroïde humaine en milieu liquide reproduisant les étapes de la différenciation érythroïde terminale. Une intéraction physique directe entre Hsp70 et l'-globine a été identifiée par techniques de microscopie confocale, d'immunoprécipitation et de double hybride. Enfin, la transduction dans les érythroblastes de -TM d'un mutant d'Hsp70-S400A, principalement nucléaire, ou d'un mutant de GATA-1 non clivable par la caspase-3 corrige l'érythropoïèse inefficace. Une modélisation mathématique du complexe Hsp70/-globine nous a permis de préciser les domaines impliqués dans l'intéraction, ce qui ouvre la voie à une possibilité de criblage de petites molécules permettant la rupture de ce complexe afin de ramener Hsp70 dans le noyau avec un espoir thérapeutique pour améliorer l'érythropoïèse inefficace des -TM. Mots clés : érythropoïèse inefficace, -thalassémie majeure, Hsp70, GATA-1 Cytoplasmic sequestration of Hsp70 by excess of free -globin promotes ineffective erythropoiesis in -Thalassemia major (-TM) -TM is an inherited haemoglobinopathy caused by a quantitative defect in the synthesis of the - globin chains of haemoglobin, leading to the accumulation of free -globin chains that form toxic aggregates. Despite extensive knowledge on the molecular defects causing -TM, little is known about the mechanisms responsible for ineffective erythropoiesis (IE), which is characterised by accelerated erythroid differentiation, maturation arrest and apoptosis at the polychromatophilic stage. We have previously demonstrated that normal human erythroid cell maturation requires a transient activation of caspase-3. Although GATA-1, the master transcriptional factor of erythropoiesis, is a caspase-3 target, we have shown that during human erythroid differentiation, it is protected from cleavage through its association with the chaperone Hsp70 in the nucleus. Hsp70 is constitutively highly expressed in normal human erythroid cells. The best-known role of this ubiquitous chaperone is to participate in proteins folding and refolding of proteins denatured by cytoplasmic stress, thus preventing their aggregation. In this study, we have evidenced that during the maturation of human -TM erythroblasts, Hsp70 is sequestrated in the cytoplasm by the excess of free -globin chains, resulting in nuclear GATA-1 cleavage and, in turn, end-stage maturation arrest and apoptosis. A molecular modeling shows that - globin binds to a highly electronegative cavity formed by all Hsp70 domains. Additionally, the transduction of a nuclear-targeted Hsp70 mutant (Hsp70-S400A) or caspase-3 uncleavable GATA-1 mutant (GATA-1) corrects -TM ineffective erythropoiesis in human cultured -TM cells. Our data indicate that cytosolic Hsp70 sequestration by -globin chains prevents its nuclear localization and is a key mechanism of the -TM IE. In order to increase nuclear Hsp70 translocation, developing small molecules that could increase Hsp70 expression or disrupt the Hsp70/-globin complex could be a novel approach of targeted therapies to improve erythropoiesis in -TM. Keywords : ineffective erythropoïesis, -thalassemia major, Hsp70, GATA-1 12 Liste des abréviations ABD : ATPase binding domain of Hsp70 aussi denommé NBD Nucleotide Binding Domain AIF : apoptosis inducing factor AHSP : -Hemoglobinstabilizing protein Bcl-XL : B cell lymphoma-XL BFU-E : burst forming unit-erythroid CAD : caspase activated DNase CD34, 36 : cluster of differentiation 34 ou 36 CFU-E : colony-forming unit-erythroid CFU-GEMM : colony-forming unit-granulocyte erythroid macrophage mixed CFU-GM : colony-forming unit-granulocyte-macrophage CFU-M : colony-forming unit-macrophage CFU-MK : colony-forming unit-megakaryocyte DISC : death-inducing signalling complex Epo : érythropoïétine Epo-R : récepteur à l'érythropoïétine FOG-1 : friend of GATA-1 GATA-1 : aussi appelé Eryf-1, NF-E1, NF-1 et GF-1 : GATA binding factor 1 ou erythroid transcription factor GDF15 : growth differentiation factor 15 GM-CSF : granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GPA : glycophorine A Hb : hémoglobine HbF : hémoglobine fœtale HDAC : histones déacétylases HIF-1 : hypoxia inducible factor-1 HSF : heat shock factors HSE : heat shock element Hsp : heat shock protein HRI : heme regulated inhibitor of translation IL-3, IL-6 : interleukine-3, -6 IPOD : insoluble protein deposits JUNQ : juxtanuclear quality control compartment LAM : leucémie aigue myéloïde NBD : Nucleotide Binding Domain of Hsp70 appelé aussi ABD : ATPase binding domain PBD : peptide binding domain aussi dénommé SBD Substrate Binding Domain ROS : reactiv oxygen species SBD : Substrate Binding Domain of Hsp70 aussi dénommé PBD (peptide-binding domain) SCF : stem cell factor SLA : sclérose latérale amyotrophique TGF- : transforming growth factor TNF-R : tumor necrosis factor receptor death-inducing signalling complex DISC TRAIL : TNF-related apoptosis induced ligand Tpo : thrombopoïétine TWSG1 : twisted gastrulation protein homolog 13 Lexique La sémantique ou terminologie concernant la différenciation érythroïde terminale, sujet au centre de cette thèse, est parfois confuse, de même que la dénomination des différentes sous-unités composant l'hémoglobine. Nous proposons donc ici quelques définitions qui peuvent contribuer à mieux comprendre le sujet. Érythropoïèse Différenciation érythroïde terminale ou érythropoïèse tardive : stades de différenciation médullaire de la lignée rouge allant du proérythroblaste au réticulocyte. Maturation terminale ou finale : derniers stades de cette phase. Passage de l'érythroblaste polychromatophile à l'érythroblaste acidophile puis au réticulocyte. Stades o les cellules ne prolifèrent plus. Nous avons donc, pour nos travaux, défini un index de maturation terminale (IMT ou terminal maturation index TMI) : % de cellules hyper-matures (acidophiles réticulocytes) 100 % de polychromatophiles Hémoglobine Ontogénie des chanes de globine permutation ou switch des chanes de globine au cours de la vie fœtale et ex-utero. Nous conserverons ce terme Anglais de switch . Hème : molécule constituée de protoporphyrine IX et de son dérivé ferreux Fe2 ( fer réduit) Hémine ou hématine : molécule constituée de protoporphyrine IX et de son dérivé ferrique Fe3 ( fer oxydé) Hémoglobine : constituée de 4 molécules d'hèmes et 2 paires de chanes de globine Méthémoglobine : hémoglobine constituée de fer oxydé. La méthémoglobine, en l'absence de réduction du fer par la méthémoglobine réductase, va se dénaturer en hémichromes qui peuvent ensuite former des agrégats. Sous unité de l'hémoglobine : exemple des chanes apo -globine : -globine libre sans hème holo -globine : -hémoglobine, deux sous-formes o o fer forme réduite avec fer ferreux Fe2 ( vraie -hémoglobine) forme oxydée avec (qu'on pourrait appeler - méthémoglobine). Cette forme peut aboutir à des hémichromes (hémoglobine oxydée et dénaturée) ferrique Fe3 Hémichromes : hémoglobines sous forme de tétramère (entières) ou de sous-unité de chanes de globine avec hème oxydé sous forme ferrique (Fe3 ), et ayant subi une dénaturation Sigles utilisés pour dénommer les -thalassémies : 0 absence totale de production de chanes production présente mais diminuée de chanes (le pourcentage de production est très variable en fonction des mutations ou autres polymorphismes génétiques) E mutation E : substitution d'un acide glutamique par une lysine sur la chane . Les patients EE ( E/ E) ou AE (/ E) sont asymptomatiques. L'association à une mutation - thalassémique 0 ( 0/ E) est responsable d'une -thalassémie intermédiaire ou majeure. 14 SOMMAIRE RESUME . 12 LISTE DES ABREVIATIONS . 13 LEXIQUE . 14 AVANT PROPOS . 17 INTRODUCTION . 18 1. Hsp70 et son rôle au cours de l'érythropoïèse physiologique . 18 Les protéines de choc thermique (Hsp) . 18 1. 1. 1. 2. Hsp70 : structure et fonction . 19 1. 2. 1. Expression et structure d'Hsp70 . 19 1. 2. 1. 1. Expression tissulaire d'Hsp70 . 19 1. 2. 1. 2. Structure . 21 1. 2. 2. Rôle cellulaire d'Hsp70 . 23 1. 3. Rôle d'Hsp70 au cours de l'érythropoïèse physiologique . 25 1. 3. 1. Rappel sur l'érythropoïèse physiologique . 25 1. 3. 2. GATA-1 et son rôle majeur dans la différenciation érythroïde terminale . 30 1. 3. 3. Régulation de l'érythropoïèse physiologique par les caspases . 34 1. 3. 4. Induction et prévention de l'apoptose dans les cellules érythroïdes : Fas/Fas-ligand et d'Hsp70 . 37 1. 3. 4. 1. Fas/Fas-ligand dans la différenciation érythroïde . 37 1. 3. 4. 2. Rôle d'Hsp70 dans l'érythropoïèse physiologique . 39 1. 3. 4. 2. 1. Protection de GATA-1 et autres facteurs . 39 1. 3. 4. 2. 2. Régulation de la localisation cyto-nucléaire d'Hsp70 . 40 1. 4. Hsp70 au cours de l'érythropoïèse pathologique . 41 1. 4. 1. Excès de sortie nucléaire : la myélodysplasie . 41 1. 4. 2. Défaut d'entrée nucléaire : la -thalassémie majeure . 42 1. 4. 3. Rôle d'Hsp70 et de Bag-1 au cours de l'anémie de Blackfan- Diamond. . 42 1. 5. Résumé de la régulation de l'érythropoïèse terminale humaine . 43 2. Synthèse de l'hémoglobine, ontogénie de l'hémoglobine . 45 Intérêt de l'hémoglobine dans les globules rouges . 45 2. 1. Structure générale de l'hémoglobine . 46 2. 2. Différents types d'hémoglobine humaine . 47 2. 3. Les chanes de globines : ontogénèse, régulation génique des chanes . 49 2. 4. 2. 4. 1. Différents types de chanes de globines . 49 2. 4. 2. Ontogénèse de l'hémoglobine et régulation des gènes de la globine . 50 2. 4. 3. Régulation des gènes de globine : LCR et HS40 . 51 2. 4. 4. Régulation de la commutation entre hémoglobine fœtale et adulte . 52 2. 4. 4. 1. Intérêt thérapeutique du switch des chanes de globines . 52 2. 4. 4. 2. Régulation du switch : BCL11A et GATA-1 . 53 2. 4. 4. 3. Rôle des facteurs de croissance sur l'expression des chanes de globine . 55 3. L'érythropoïèse inefficace des -thalassémies majeures . 56 Les -thalassémies . 56 3. 1. 3. 2. Anémie des -thalassémies . 59 Dysérythropoïèse des -thalassémies . 61 3. 3. 3. 3. 1. Caractéristiques de la dysérythropoïèse des -thalassémies . 61 3. 3. 1. 1. Historique . 61 3. 3. 1. 2. Caractéristiques de la dysérythropoïèse . 63 3. 3. 2. Mécanisme de mort cellulaire des érythroblastes -thalassémiques : l'apoptose . 64 3. 3. 3. Voies d'apoptose impliquées dans les -thalassémies . 65 3. 3. 4. Rôle des dérivés oxydants (ROS) dans la physiopathologie de la thalassémie . 66 15 3. 3. 5. L'anomalie de structure membranaire pourrait-elle expliquer la mortalité cellulaire au stade polychromatophile ? . 68 3. 3. 6. Rôle de la chaperonne AHSP (-Hemoglobinstabilizing protein) . 71 3. 3. 7. Rôle de l'hème et des inhibiteurs de l'hème . 75 3. 3. 8. Rôle des cytokines inflammatoires (TNF- ; TGF-) . 77 3. 3. 9. Autres voies physiopathologiques impliquées dans l'érythropoïèse inefficace . 79 3. 3. 9. 1. Augmentation du nombre de macrophages et de leur activation . 79 3. 3. 9. 2. Réponse à l'érythropoïètine altérée . 79 3. 3. 9. 3. Surcharge martiale . 80 3. 3. 9. 4. Déficit en acide folique . 81 HYPOTHESES ET OBJECTIF . 83 RESULTATS . 86 DISCUSSION ET PERSPECTIVES . 117 1. Analyse critique des résultats. 117 2. Hypothèses pour de nouvelles recherches découlant de ce travail. 122 2. 1. Hsp70 joue-t-elle un rôle physiologique dans l'assemblage de l'hémoglobine ? . 122 2. 2. La séquestration cytoplasmique d'Hsp70 avec absence de localisation nucléaire : un modèle dans les maladies neurodégénératives ? . 126 2. 3. Rôle d'autres chaperonnes, notamment Hsp90. 132 2. 4. Accélération de la différenciation érythroïde des -thalassémies : une caractéristique non expliquée par Hsp70. 132 2. 5. Tableau récapitulatif des perspectives de travail. 136 CONCLUSION . 138 ANNEXES . 139 ANNEXE 1 : Revue générale sur la dysérythropoïèse -thalassémique . 140 ANNEXE 2 : Autres articles sur le sujet . 151 ANNEXE 3 : Présentation à des congrès. Prix . 151 BIBLIOGRAPHIE . 152 16 AVANT PROPOS Les -thalassémies font partie, avec la drépanocytose, des maladies génétiques les plus répandues au monde. Au cours des -thalassémies majeures, il n'y a plus ou très peu de production de chanes de -globine ce qui entrane un excès de chanes d'-globine libres, qui normalement s'associent aux chanes de -globine pour former le tétramère d'hémoglobine. La synthèse d'hémoglobine (hémoglobinisation) a lieu dans la moelle osseuse, au cours de la différenciation érythroïde terminale. L'excès de chanes d'-globine dans les érythroblastes matures entrane leur précipitation, toxique pour la cellule, et est associé à l'arrêt de maturation et la mort par apoptose de ces cellules. Il en résulte une anémie profonde des patients, qu'il est nécessaire de transfuser mensuellement tout au long de leur vie. Les mécanismes de toxicité des chanes d'-globine pour les érythroblastes matures ne sont pas précisément connus. Pourtant de nombreuses revues de la littérature ont été publiées sur l'érythropoïèse inefficace des - thalassémies ces quinze dernières années, mais ces écrits confondent très souvent des mécanismes physiopathologiques de toxicité de l'-globine sur les globules rouges (travaux les plus nombreux) avec la toxicité sur les érythroblastes, peu étudiée. Cela mérite une présentation critique des données de la littérature qui sera faite en introduction. Notre travail s'est centré sur le rôle de la chaperonne Hsp70 au cours de l'érythropoïèse inefficace des -thalassémies majeures. Le rôle ubiquitaire de cette chaperonne est d'éviter que des protéines mal formées ne soient toxiques pour les cellules. Hsp70 étant exprimée constitutivement à forte concentration au cours de l'érythropoïèse, il était logique d'étudier son implication dans une maladie o des peptides toxiques s'accumulent dans les érythroblastes. Nous avons souhaité, dans la première partie de cette thèse, planter le décor en présentant les caractéristiques de la protéine Hsp70, dont notre équipe est, à ce jour, la seule au monde à étudier son rôle dans l'érythropoïèse humaine. Nous résumerons donc 10 ans d'études de cette protéine dans notre laboratoire en pointant les données bien établies et les zones d'ombre qui persistent. Nous présenterons ensuite les grandes phases de l'érythropoïèse physiologique en axant le propos sur la synthèse d'hémoglobine au cours de la maturation érythroïde et sur le facteur de transcription fondamental de l'érythropoïèse GATA-1, protégé dans le noyau par Hsp70. Nous terminerons cette introduction par une analyse critique de la littérature sur l'érythropoïèse inefficace des -thalassémies qui a fait aussi l'objet d'une publication proposée en annexe. La méthodologie et les résultats de ce travail de thèse seront proposés sous forme du manuscrit en cours de révision dans la revue Nature. 17 INTRODUCTION 1. Hsp70 et son rôle au cours de l'érythropoïèse physiologique 1. 1. Les protéines de choc thermique (Hsp) Les protéines de choc thermique (Heat shock proteins-Hsp) ont été découvertes au début des années 60. (Ritossa, Exp. Cell Res. 1964) Elles sont constitutives de certaines cellules et/ou inductibles par un stress cellulaire afin de protéger ces cellules des lésions engendrées par ce stress. (Garrido, Cell Cycle 2006 ; Mjahed, Exp. Cell Res. 2012 ; Ellis, Biochem. Soc. Symp. 1989) Les stress peuvent être physique (température), métabolique (l'hypoxie, l'altération de l'ADN, l'accumulation de protéines mal repliées) ou chimique (l'oxydation cellulaire par les ROS, les drogues cytotoxiques, la variation de pH cellulaire). On distingue : - les Hsp de haut poids moléculaire (Hsp100, 90, 70, 60, le chiffre indiquant le poids moléculaire en kilo Daltons) qui sont dépendantes de l'ATP et nécessitent des co-chaperonnes pour leur fonction et, - les Hsp de bas poids moléculaire, variant entre 15 et 30 kDa (dont Hsp27), ATP indépendantes. (Garrido, Cell Cycle 2006 ; Mjahed, Exp. Cell Res. 2012) Lors d'un stress, des facteurs de transcription cytosolique sous forme monomérique à l'état basal, les HSF (Heat Shock Factors) 1 ou 2 (suivant le type de stress), s'oligomérisent (trimérisation) sous l'effet de phosphorylations, ce qui leur permet d'être transférés dans le noyau et de se fixer à des séquences consensus spécifiques, les HSE (Heat Shock Element). Les HSE sont localisés dans les régions régulatrices des gènes heat shock situées sur le bras court du chromosome 6 (6p21. 3), dans la région III du Complexe Majeur d'Histocompatibilité. Il semble que les facteurs HSF 1 et 2 régulent aussi l'expression de nombreux autres gènes. Un rétrocontrôle négatif existe : des concentrations élevées d'Hsp70 empêchent la trimérisation des HSF. 18 1. 2. Hsp70 : structure et fonction 1. 2. 1. Expression et structure d'Hsp70 Il faudrait plutôt parler de la famille des Hsp70 qui sont des protéines de poids moléculaires variant entre 66 et 78 kDa, hautement conservées tout au long de l'évolution, dans toutes les cellules, des bactéries aux plus grands eucaryotes. Il a été décrit 17 gènes et 30 pseudogènes pour Hsp70 dans le monde animal et végétal. Chez l'homme, il existerait 6 gènes et 27 pseudogènes (Brocchieri, BMC Evol. Biol. 2008), mais de nouveaux gènes sont régulièrement identifiés. 1. 2. 1. 1. Expression tissulaire d'Hsp70 Hsp70 dont nous parlons dans ce travail est aussi nommée Hsp72 ou HspA1. C'est une protéine chaperonne ubiquitaire pas ou peu exprimée chez l'homme, à l'état physiologique, dans les cellules de l'organisme si elle n'est pas induite par un stress. Toutes les cellules peuvent cependant l'exprimer. Hsp70 est par contre fortement et constitutivement exprimée, en pathologie, dans des cellules cancéreuses (cancers solides et maladies hématologiques malignes, leucémies aigus ou chroniques, lymphomes) (Mjahed, Exp. Cell Res. 2012) et dans les neurones au cours de maladies neurologiques dégénératives parfois appelées maladie des protéines mal-repliées ou protein misfolding diseases or disorders . Dans ces pathologies (maladie de Parkinson, d'Alzheimer, d'Huntington, sclérose latérale amyotrophique, maladies à prions), les protéines défectueuses forment des agrégats cytoplasmiques qu'Hsp70 va tenter d'éliminer ou, au moins, contribuer à réduire leur toxicité potentielle. (Aridon, Neurodegener Dis. 2011, Broadley, FEBS Letters 2009 ; Sharma, Curr. Protein Pept. Sci. 2009) Il a été montré, notamment par notre laboratoire, qu'Hsp70 était exprimée constitutivement, ce qui est une exception pour cette chaperonne, dans le cytoplasme et le noyau des érythroblastes humains normaux. Son expression s'accrot au cours de la différenciation (Ribeil, Nature 2007 ; Frisan, Blood 2012 ; Singh, Nature 1984), jusqu'au stade réticulocyte o son expression diminue très notablement (données personnelles), pour être très faible dans les globules rouges. 19 (Singh, Nature 1984 et données personnelles) L'expression constitutive d'Hsp70 dans la lignée rouge avait en réalité été montrée pour la première fois en 1982 sur des lignées érythroïdes humaines K562 mais aussi dans de la moelle humaine. (Singh, Nature 1984) Elle a été également démontrée dans diverses espèces animales, particulièrement étudiée chez le poulet (Morimoto, J. Cell Biol. 1984 ; Banerji, Genes Dev. 1987 ; Winning, Dev. Biol. 1988) o l'expression augmente au cours de la maturation pour être maximale au stade d'érythroblaste polychromatophile, puis décline progressivement avec la maturation des réticulocytes et des globules rouges. (Banerji, Genes Dev. 1987) Notons qu'il a été aussi montré dans notre laboratoire que les chaperonnes Hsp27 et Hsp90 étaient exprimées constitutivement dans le cytoplasme d'érythroblastes humains, mais pas dans leur noyau. (Ribeil, Nature 2007) Hsp60 serait aussi exprimée dans les érythroblastes humains. (Hristoskova, Exp. Cell Res. 2007) Il n'existe par contre, à ce jour, aucune donnée sur l'expression d'Hsp70 dans les érythroblastes de souris. Concernant les co-chaperonnes d'Hsp70, une seule étude très récente s'est intéressée à l'expression de la co-chaperonne Bag-1, présente dans les érythroblastes humains et murins. (Horos, Blood 2012) Enfin, l'expression des Heat Shock Factors 1 et 2 facteurs de transcription des Hsp au cours de l'érythropoïèse n'a pas été encore étudiée. 20 1. 2. 1. 2. Structure (figure 1) Hsp70 est formée de deux domaines : le domaine N terminal de liaison nucléotidique à l'ATP (Nucleotide Binding Domain-NBD, aussi dénommé NH2-terminal ATP- binding domain-ABD) de 45 kDa et le domaine fixant son substrat, Substrate Binding Domain (SBD), de 25 kDa, comportant une partie C-terminale hélicoïdale de 10 kDa formant un sous-domaine en forme de couvercle, lid en anglais (Figure 1). Le SBD est aussi parfois appelé le COOH-terminal peptide-binding domain (PBD) . Par rapport aux autres chaperonnes qui agissent en dimères (Hsp90) ou oligomères (Hsp27), Hsp70 joue son rôle physiologique sous forme de monomère. (Mjahed, Exp. Cell Res. 2012) Le substrat se fixe classiquement par ses régions hydrophobes exposées, à la partie SBD d'Hsp70 qui, en conformation ouverte (ATP-Hsp70), est peu affine pour son substrat. Cette fixation peut alors entraner l'hydrolyse de l'ATP en ADP de la partie NBD, grâce à l'action de co-chaperonnes (notamment Hsp40). Cela va modifier la structure d'Hsp70 qui referme son couvercle permettant d'augmenter alors l'affinité avec son substrat (ADP-Hsp70). (Broadley, FEBS Letter 2009) Inversement, la transformation d'ADP en ATP par d'autres co-chaperonnes (comme Bag-1) va rouvrir Hsp70 et libérer le substrat. La structure 3D cristallographique totale d'Hsp701-701 (701 résidus) humaine n'est pas parfaitement déterminée. En effet, la structure cristallographique de la partie NBD est décrite chez l'homme depuis le début des années 2000 (Wisniewska, PLoS ONE 2010 ; Osipiuk, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 1999), mais il reste à déterminer, chez l'homme, la structure du SBD et de la protéine totale que ce soit dans sa forme ouverte (ATP) ou fermée (ADP). La structure cristallographique entière d'Hsp110 Saccharomyces cerevisiae, un homologue très proche d'Hsp70, qui est d'ailleurs une co-chaperonne d'Hsp70, a été récemment découverte et sert jusqu'à présent de modèle pour les études de la structure d'Hsp70 humain. (Liu, Cell 2007) Ce sont ces différents modèles de structure décrits dans la littérature qui nous permettront d'étudier dans cette thèse l'intéraction entre Hsp70 et l'-globine par des modèles mathématiques basés sur les homologies de structures et les descriptions structurales partielles de cette protéine (domaine NBD humain, SBD du rat ou d'E. Coli) ou de la protéine entière humaine homologue (Hsp110). 21 Figure 1 : Structure d'Hsp70 et ses 2 domaines : NBD et SBD qui comprend la partie lid hélicoïdale (couvercle) (d'après le site Hsp information resources 22 1. 2. 2. Rôle cellulaire d'Hsp70 Le rôle ubiquitaire d'Hsp70 dans le monde animal est triple (Hartl, Nature 2011) : 1. Aide à la synthèse peptidique et au transport transmembranaire de protéine. Hsp70 permet à des protéines nouvellement formées de se replier correctement, dès leur sortie du ribosome, afin de se présenter dans une conformation structurelle tridimensionnelle (forme native) leur permettant la fonction, la liaison à d'autres protéines ou le transport transmembranaire ; 2. Cytoprotection cellulaire contre des protéines malformées ou dénaturées : o Hsp70 prend en charge des protéines mal formées, dénaturées ( misfolding proteins ) afin de tenter de les remettre dans une conformation physiologique, native, pour éviter qu'elles ne forment des agrégats potentiellement toxiques pour la cellule o Hsp70 participe à l'élimination d'agrégats qui n'auraient pas pu être évités par la phase précédente par la voie du protéasome, avec l'aide d'autres co-chaperonnes (notamment Hsp40, 110, et les protéines HIP, HOP, BAG-1 et BAG-3. (Hartl, Nature 2011 ; Mjahed, Exp. Cell Res. 2012) De plus, il a bien été démontré, dans divers types cellulaires, depuis 15 ans que toutes les Hsp et particulièrement Hsp70 avaient des fonctions anti-apoptotiques, de survie, de prolifération et de différenciation cellulaire. (Lanneau, J Cell Mol Med 2008 ; Mjahed, Exp. Cell. Res. 2012 ; Ribeil, Nature 2007) Divers stimulus pro- apoptotiques peuvent induire une forte expression d'Hsp70. (Gorman, FEBS Lett. 1999) Par ailleurs, Hsp70 protège les cellules de l'apoptose en agissant à la fois en amont (Park, EMBO J. 2001 ; Stankiewicz, J. Biol. Chem. 2005) et en aval (Buzzard, J. Biol. Chem. 1998) de l'activation de la cascade des caspases par diverses intéractions avec des protéines de l'apoptose. Par exemple, Hsp70 bloque la translocation de Bax dans la membrane mitochondriale (Stankiewicz, J. Biol. Chem. 2005), inhibe Apaf-1 (Apoptotic Protease Activating Factor-1), ce qui empêche la formation de l'apoptosome et l'activation de la caspase-9. (Beere, Nat. Cell Biol. 2000 ; Saleh, Nat. Cell Biol. 2000) Enfin Hsp70 peut s'associer directement à AIF (Apoptosis Inducing Factor) relargué dans le cytoplasme cellulaire lors de la dépolarisation mitochondriale ; ce qui inhibe la translocation nucléaire d'AIF, 23 pourvoyeur d'une condensation de la chromatine lorsqu'il atteint sa cible nucléaire. (Ravagnan, Nat. Cell Biol. 2001) Ces fonctions anti-apoptotiques cytoplasmiques d'Hsp70 n'ont pratiquement pas été étudiées à ce jour au cours de l'érythropoïèse si ce n'est une seule étude qui montre qu'Hsp70 séquestre AIF dans le cytoplasme de lignées érythroïdes humaines TF-1. (Lui, FEBS Lett. 2007) Les modulations de l'apoptose par Hsp70 par d'autres mécanismes anti- apoptotiques que nous ne détaillerons pas ici ont été essentiellement démontrées dans les cellules cancéreuses et non dans les cellules érythroïdes. Ils sont schématisés dans la figure 2 Figure 2 : Cibles moléculaires d'Hsp-70 expliquant son rôle anti-apoptotique dans les cellules cancéreuses (d'après Brierley-Hobson, Bioscience Horizons 2008) 24 1. 3. Rôle d'Hsp70 au cours de l'érythropoïèse physiologique 1. 3. 1. Rappel sur l'érythropoïèse physiologique La production des érythrocytes représente le plus haut rendement du système hématopoïétique, avec une production d'environ 200 milliards de globules rouges par jour (2 millions par seconde) qui compensent les pertes quotidiennes et la destruction des globules rouges vieillis (hémolyse physiologique). Cela nécessite donc un contrôle très fin pour éviter un déficit de production (aboutissant à une anémie) ou l'excès de production conduisant à une polyglobulie. En cas de besoins accrus, l'érythropoïèse peut s'adapter et produire 7 à 8 fois plus d'érythrocytes. L'érythropoïèse est un processus de maturation cellulaire continue dérivant des cellules souches hématopoïétiques (HSC, Hematopoietic Stem Cells), progéniteurs les plus précoces de l'hématopoïèse. Ces cellules sont quantitativement peu nombreuses : environ 0, 05% des cellules de la moelle osseuse et 1% des cellules du sang placentaire. Elles sont caractérisées par un fort taux d'auto-renouvellement (Ema, Curr. Opin. Genet. Dev. 2003), le marquage CD34 et leur caractère pluripotent (pouvant donner naissance à toutes les cellules hématopoïétiques). (Szilvassy, Exp. Hematol. 2003) L'érythropoïèse peut être schématiquement divisée en deux étapes (figure 3) : 1. 3. 1. 1. L'érythropoïèse précoce C'est la phase pendant laquelle une cellule souche hématopoïétique médullaire restreint sa multipotence et s'engage dans la voie de la lignée rouge. Cette érythropoïèse précoce a été analysée grâce à la capacité des progéniteurs érythroïdes de former en caillot de plasma de bœuf (Arthur A. AXELRAD, 1974), puis en culture semi-solide de methyl-cellulose, in vitro, des colonies d'érythroblastes matures (Gregory, Blood 1978). Elle est très dépendante du facteur de croissance Stem cell facteur (SCF) dont le récepteur cellulaire, c-kit est exprimé à la surface de ces cellules. 25 Elle comprend : - les CFU-GEMM ( Colony Forming Unit Granulocyte-Erythroid-Megakaryocyte- Macrophage ), progéniteurs myéloïdes multipotents à l'origine de colonies mégacaryocytaires, granulo-monocytaires et érythroïdes. - les BFU-E/Mk ( Burst Forming Unit-Erythroid and Megakaryocyte ), progéniteurs possédant la double potentialité érythroïde et mégacaryocytaire. - les BFU-E immatures ( Burst Forming Unit-Erythroid ), premiers progéniteurs engagés irréversiblement dans la lignée érythroïde. Ces précurseurs génèrent de grosses colonies érythroïdes contenant des globules rouges après 15 jours de in vitro en milieu semi-solide (chez culture l'homme). Les marqueurs de différenciation de ces progéniteurs sont CD34 , CD33 , HLA-DR , c-kit et GpA-. Ils sont dépendants du SCF et d'autres facteurs de croissance hématopoïétiques pour leur prolifération et leur différenciation, mais n'expriment pas ou peu le récepteur à l'Epo : Epo-R. - Les BFU-E matures forment des colonies érythroïdes matures in vitro chez l'homme après 10 jours de culture en présence d'IL-3, de SCF et d'Epo. À ce stade, les cellules n'expriment plus le CD33 et l'Epo-R apparat à leur surface. (Broudy, Blood 1991) - Les CFU-E ( Colony Forming Unit Erythroid ), progéniteurs les plus matures de cette phase qui, en 7 jours de culture en méthylcellulose en présence d'Epo, vont produire de petites colonies ( cellules) d'érythroblastes matures contenant des globules rouges. Ces progéniteurs expriment à leur surface Epo-R, le CD36, le récepteur à la transferrine CD71 et c-kit mais sont négatives pour la GpA. (Broudy, Blood 1991) Sur un frottis médullaire, ces différents précurseurs ne représentent qu'un faible pourcentage des cellules nucléées (1% environ), et ne possèdent aucun caractère cytologique propre qui permette de les différencier à la coloration en May Grnwald- Giemsa (MGG) (cellules de taille moyenne à haut rapport nucléo-cytoplasmique contenant une chromatine fine). 26 Figure 3 : Deux phases de l'érythropoïèse. Érythropoïèse précoce et tardive (ou différenciation érythroïde terminale) avec l'expression des marqueurs principaux de différenciation. CD cluster of differentiation ; Hb hémoglobine ; ProE proérythroblaste ; Baso basophile ; Poly polychromatophile ; Acido acidophile ; Ret réticulocyte ; GR globule rouge ou érythrocyte. 1. 3. 1. 2. L'érythropoïèse tardive 1. 3. 1. 2. 1. Stade des érythroblastes morphologiquement identifiables L'érythropoïèse tardive ou différenciation érythroïde terminale correspond à la phase de différenciation finale des progéniteurs CFU-E sous la dépendance essentielle de l'érythropoïétine (Epo). Cette phase est marquée à la fois par l'acquisition des caractéristiques cytologiques et phénotypiques spécifiques de la lignée rouge mais aussi par une expansion massive initiale. C'est le stade de différenciation en cellules morphologiquement identifiables de la lignée érythroblastique : les proérythroblastes (dérivant directement des progéniteurs CFU- E) se différencient successivement en érythroblastes basophiles, polychromatophiles et acidophiles (appelés aussi, par les Anglo-Saxons, orthochromatiques) (Figure 3). 27 L'énucléation de l'érythroblaste acidophile donne naissance au réticulocyte qui migre dans la circulation sanguine o il mature, en 2 à 3 jours, en globule rouge. L'ensemble de ces cellules (du proérythroblaste au réticulocyte) constitue la lignée érythroblastique morphologiquement identifiable sur la moelle osseuse humaine par coloration MGG et représente 20 à 30% des cellules nucléées d'un myélogramme. 1. 3. 1. 2. 2. Cinétique et durée de l'érythropoïèse terminale Du stade proérythroblaste au stade d'érythroblaste basophile, les précurseurs prolifèrent, on considère que ce sont des érythroblastes immatures. À partir du stade polychromatophile, les érythroblastes continuent leur maturation, mais la prolifération s'arrête. On parlera à partir de ce stade, dans cette thèse, de maturation terminale (cf lexique). Du stade pro-érythroblaste à l'acidophile il existe 16 divisions (8 à 32). La durée de l'érythropoïèse normale du proérythroblaste au réticulocyte est de 7 jours, mais peut être raccourcie en cas de besoin. Les globules rouges ont une durée de vie moyenne de 120 4 jours ( vie moyenne de 28 jours). 1. 3. 1. 2. 3. Hémoglobinisation, changement tinctorial et de pH Les érythroblastes subissent des transformations morphologiques comprenant une réduction du volume cellulaire et celui du noyau avec condensation de la chromatine. Le changement de pH du cytoplasme explique son changement de couleur à la coloration MGG. Ce changement tinctorial s'explique par la perte progressive, au cours de la différenciation, d'acides ribonucléiques (ARN) (responsables initialement de la basophilie) mais aussi par l'augmentation progressive de la concentration de l'hémoglobine, dont la synthèse débute au stade proérythroblaste (très faible concentration à ce stade, puis augmente à partir du basophile). (Thorell, Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1948 ; Borsook, Nature 1962) L'hémoglobine donne au cytoplasme devenu basique son affinité pour l'éosine (qui est un composant acide), donnant donc une couleur rose pâle-orangée aux érythroblastes acidophiles, stade o l'hémoglobine a atteint sa concentration cytoplasmique maximale (environ 95% de la synthèse d'hémoglobine est acquise à ce stade). (Sondhaus, Blood 1960) Le 28 polychromatophile est la cellule de transition entre le basophile et l'acidophile. C'est la cellule dans laquelle augmente le plus fortement la concentration en hémoglobine, ce qui est un fait déterminant pour la suite de notre travail. Ces travaux sur la synthèse de l'hémoglobine selon les stades de maturation érythroïde sont très anciens et un peu oubliés, étalés entre les années 1940 et la fin des années 1960. 1. 3. 1. 2. 4. Marqueurs de surfaces des érythroblastes Le proérythroblaste exprime des antigènes de différenciation comme le récepteur à la transferrine (CD71), le CD36, le c-Kit et l'Epo-R. C'est la cellule exprimant le plus fortement l'Epo-R, la concentration baissant dans les stades suivant pour être nulle sur les réticulocytes. (Broudy, Blood 1991) Les cellules vont acquérir ensuite la glycophorine A (GPA), dont l'expression augmente au fur et à mesure de la maturation érythroïde terminale tandis que celle de c-kit diminue au stade basophile pour disparatre totalement aux stades polychromatophile et ultérieurs. (Uoshima, Br. J. Haematol. 1995 ; Testa, Blood 1996) (figure 3) 1. 3. 1. 2. 5. Environnement cytokinique et érythropoïèse Comme nous l'avons vu ci-dessus, diverses cytokines jouent un rôle crucial dans la régulation positive de l'érythropoïèse. Elles sont principalement produites par les cellules du stroma médullaire, fibroblastes, adipocytes, cellules endothéliales, mais aussi par les cellules hématopoïétiques, notamment les macrophages de l'lot érythroblastique, entourant, dans la moelle les érythroblastes en différenciation, ou encore les lymphocytes. D'autres organes que la moelle osseuse peuvent aussi produire des facteurs de croissance, particulièrement le foie et les reins pour la Tpo et l'Epo, respectivement. Ces cytokines peuvent exercer un contrôle positif sur l'érythropoïèse en activant des signaux de prolifération ou de survie (comme l'Epo), ou au contraire accélérer la maturation érythroïde terminale. C'est le cas du TGF- Transforming Growth Factor ). (Zermati, Exp. Hematol. 2000 ; Krystal, J. Exp. Med. 1994) In vitro, le TGF- inhibe l'érythropoïèse précoce en diminuant le nombre de BFU-E. (Hino, Br. J. Haematol. 1988 ; Krystal, J. Exp. Med. 1994) Par ailleurs, le 29 TGF- ne provoque pas l'apoptose mais inhibe l'érythropoïèse tardive (1) en bloquant la prolifération cellulaire, en ralentissant le cycle des cellules érythroïdes immatures (proérythroblastes) et (2) en accélérant la différenciation des progéniteurs érythroïdes jusqu'aux acidophiles et réticulocytes. (Zermati, Exp. Hematol. 2000) Enfin, cette phase de différenciation érythroïde terminale nécessite la présence de micronutriments : fer et vitamine B6 pour la synthèse d'hémoglobine, vitamines B9 (folates) et B12 pour la synthèse d'ADN, alors que des stades plus précoces (érythropoïèse primitive) nécessitent un environnement hormonal androgénique. Toute cette phase de différenciation terminale est sous la dépendance du facteur de transcription GATA-1 dont nous allons maintenant résumer les principales caractéristiques car c'est un des acteurs dont nous discuterons beaucoup dans ce travail de thèse. 1. 3. 2. GATA-1 et son rôle majeur dans la différenciation érythroïde terminale : survie, différenciation et maturation GATA-1, aussi appelé Eryf-1, NF-E1, NF-1 et GF-1, est un facteur de transcription majeur de l'érythropoïèse et de la mégacaryopoïèse présent dans les cellules érythroïdes mais également dans les mégacaryocytes, les cellules mastocytaires, les éosinophiles (Ferreira, Mol. Cell Biol. 2005), et les cellules dendritiques. (Gobel, Blood 2009) Il a été découvert à la fin des années 1980, comme un facteur régulateur des chanes de globine. (Wall, Genes Dev. 1988 ; Evans, Proc. Natl. Acad. Sci USA 1988) (voir chapitre 2. 4. 4. 2) GATA-1 est indispensable à la différenciation et maturation érythroïde terminale mais aussi à la survie et l'expansion des proérythroblastes et érythroblastes basophiles alors qu'un autre membre de la famille GATA, GATA-2, joue un rôle plus en amont dans la différenciation érythroïde précoce (figure 4). 30 Figure 4 : Modulation dynamique de GATA-1 et 2 au cours de l'érythropoïèse. GATA-2 est exprimé dans les progéniteurs précoces. Lorsque GATA-1 est activé, l'expression de GATA-2 décline. Durant la différenciation érythroïde terminale, GATA-1 a une expression maximale au stade proérythroblaste qui décline ensuite, même si son expression reste présente, et indispensable à la maturation terminale. GATA-1 joue son rôle de facteur de transcription en se fixant à une séquence d'ADN consensus 5' A/T GATA A/G, appelée motif GATA, dans le promoteur de nombreux gènes érythroïdes pour moduler leur expression, mais aussi en se fixant à des cofacteurs dont l'indispensable et bien nommé Friend of GATA-1 (FOG-1). (Kim, Oncogene 2007) GATA-1 est ainsi responsable de l'expression des gènes principaux nécessaires à cette différenciation comme l'Epo-R, la glycophorine A (GpA), les chanes de globines (voir aussi chapitre 2. 4. 4. ) et la protéine anti-apoptotique Bcl-XL (membre de la famille Bcl-2). (Gregory, Blood 1999 ; Ferreira Mol. Cell Biol. 2005) Les cellules érythroïdes de souris déficientes pour GATA-1 (Weiss, Genes Dev. 1994 ; Pevny, Development 1995) ou des cellules souches embryonnaires (ES) invalidées pour le gène GATA-1 (Weiss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995) subissent in vitro un arrêt de différenciation au stade proérythroblaste et meurent par apoptose. (Weiss, Proc. Natl. Acad. Sci U S A 1995) Pour découpler l'arrêt de différenciation de 31 l'apoptose, la lignée G1E a été créée par insertion du gène Bcl2 dans les cellules ES GATA-1- qui a permis leur survie sans rétablir leur différenciation. (Weiss, Mol. Cell. Biol. 1997) La délétion de GATA-1 chez la souris induit in vivo une létalité embryonnaire entre le 10, 5 et 11, 5ème jour causée par une anémie sévère et un blocage au stade proérythroblaste. (Fujiwara, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996) GATA-1 permet donc la survie, la différenciation et la maturation des précurseurs érythroïdes et semble prévenir de l'apoptose. (Weiss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995) Le rôle supposé anti-apoptotique de GATA-1 au cours de la différenciation érythroïde terminale pose cependant question. En effet, l'étude de l'apoptose, dans ces expériences des années 1990, peut être critiquée car elle est basée sur des techniques anciennes et peu précises : aspect cytologique et technique de marquage par TUNEL, dont la spécificité pour l'étude de l'apoptose a été contestée. (Hristoskova, Clin. Chem. 2001 et 2003, Exp. Cell Res. 2007) Ces travaux ne comportaient pas d'étude d'expression d'Annexine-V, ni de statistiques précises d'augmentation d'apoptose. (Weiss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995) Dans une étude publiée dans Nature, datant de 1999, étudiant le rôle de GATA-1 dans la différenciation érythroïde terminale, De Maria et col. démontrent que le clivage de GATA-1 par la caspase-3 après stimulation des récepteurs de mort est à l'origine de l'arrêt de maturation des érythroblastes et altère leur survie à long terme (voir aussi chapitre 1. 3. 3). En effet, GATA-1 possède, chez l'homme, trois sites de clivage par les caspases : deux sites mineurs et un site majeur qui est clivé par les caspase-3, - 7, -8, -9 et -10 ce qui aboutit à des fragments de 30 kDa et 16 kDa. (De Maria, Nature 1999) Les auteurs suggèrent un rôle anti-apoptotique de GATA-1 uniquement sur la baisse de la prolifération cellulaire et sur l'augmentation de cellules mortes comptées au microscope optique par coloration au bleu trypan dans des érythroblastes cultivés in vitro, n'exprimant plus GATA-1. (De Maria, Nature 1999) (aucune étude de l'Annexine-V ou TUNEL dans cet article). Si le clivage de GATA-1 par la caspase-3 est bien établi, la fonction anti-apoptotique de GATA-1 est donc, comme nous l'avons vu, mal étayée. Cette hypothèse s'est construite en spéculant que GATA-1 pourrait jouer un rôle anti-apoptotique en régulant positivement l'expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL (De Maria, Nature 1999). Si le rôle de GATA-1 sur l'expression de cette protéine parat bien établi (Gregory, Blood 1999), aucune étude n'a encore prouvé que le rôle anti-apoptotique présumé de GATA-1 résultait de l'induction de ce gène. L'effet de GATA-1 sur la survie et la 32 prolifération cellulaire pourrait résulter d'une action sur le cycle cellulaire et non d'un mécanisme anti-apoptotique. (Rylski, Mol Cell Biol 2003) En effet GATA-1 induit des modifications d'expression de gènes impliqués dans le cycle cellulaire. Il active notamment directement la transcription du gène p21 qui inhibe les cyclines dépendant des kinases (Papetti, Cell Cycle 2010), augmente l'expression du gène CDC6, régulateur de la phase S (Fernández-Morales, Cell Cycle 2012). En fait, il semble que GATA-1 pourrait agir comme un activateur ou répresseur du cycle cellulaire selon son expression, le moment de la différenciation et peut être selon le micro-environnement cellulaire. (Rylski, Mol. Cell Biol. 2003) On ne peut exclure aussi que GATA-1 puisse avoir un rôle anti-apoptotique uniquement dans certaines phases de la différenciation terminale (aux stades précoces notamment). Bien que la plupart des souris exprimant faiblement GATA-1 meurent d'une différenciation érythroïde inefficace, quelques-unes naissent et survivent jusqu'à l'âge adulte. L'analyse de ces différents types de souris montre une relation directe entre le niveau d'expression de GATA-1 et la maturation érythroïde. (McDevitt, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997) Enfin, la régulation de l'expression de GATA-1 doit être fine car on a vu que l'hypoexpression va affecter la maturation érythroïde et provoquer l'arrêt de prolifération mais l'hyperexpression est aussi délétère, aboutissant, chez la souris, à la mortalité embryonnaire et à une anémie par inhibition de la différenciation terminale. (Whyatt, Nature 2000) Cette inhibition de la différenciation érythroïde terminale par l'hyperexpression de GATA-1 a aussi été démontrée in vitro dans des cellules érythroleucémiques murines. (Whyatt, Genes Funct. 1997) En dehors du clivage de GATA-1 par la caspase 3, d'autres mécanismes de dégradation de GATA-1 sont aussi impliqués et certainement pas tous connus. Il a été par exemple montré récemment, dans le laboratoire, qu'Hsp27 jouait un rôle de dégradation de GATA-1 par le protéasome. (De Tonnel, Blood 2010) Nous n'aborderons pas dans cette introduction la régulation propre de l'expression génique de GATA-1 dont le gène se situe sur le chromosome X et de la commutation ( switch en Anglais) entre GATA-2 et GATA-1, qui dépasse le sujet de la thèse. De plus, cette régulation est très complexe car de nombreux facteurs de transcription interviennent comprenant, entre autres, des hormones (oestrogènes) et les produits GATA-1 et GATA-2 eux-mêmes. (Revue dans Kaneko H Curr. Opin. Hematol. 2010) 33 1. 3. 3. Régulation de l'érythropoïèse physiologique par les caspases 1. 3. 3. 1. Rôle différentiant des caspases au cours de l'érythropoïèse Il existe deux voies majeures d'activation des caspases : (1) la voie des récepteurs membranaires de mort (voie extrinsèque) qui va activer la caspase-8 ; (2) la voie mitochondriale (voie intrinsèque), liée à la dépolarisation de la mitochondrie par divers stimulus intra-cytoplasmiques, qui aboutit à la formation de l'apoptosome, qui comprend des molécules relarguées lors de la dépolarisation de la mitochondrie : le cytochrome c, Apaf-1 et la pro-caspase-9. L'apoptosome, cytoplasmique, active la pro-caspase-9. Les caspases-8 (voie extrinsèque) et -9 (voie intrinsèque) activées ont pour cible finale commune la caspase-3, qui est, dans sa forme active, la caspase exécutrice la plus importante car elle clive la majorité des substrats. (Porter, Cell Death Differ. 1999) Les caspases sont les actrices bien connues du mécanisme de mort cellulaire, appelée apoptose. Cependant, elles peuvent avoir, comme on va le souligner une action de différenciation/maturation cellulaire. Il est bien établi depuis la fin des années 1990 que de nombreuses protéines de la voie des caspases sont augmentées dans les érythroblastes. (Gregoli, J. Cell Physiol. 1999) Dans le laboratoire, il a été démontré qu'il existait une dépolarisation de la membrane mitochondriale lors de la transition stade basophile/polychromatophile avec activation de la caspase -9, -7 et -3. (Zermati, J. Exp. Med. 2001 ; Hristoskova, Exp. Cell Res. , 2007) De plus, l'inhibition des caspases par le z-VAD (Zermati, J. Exp. Med. 2001), ou par ARN interférence (siRNA) spécifique de la caspase-3 (Carlile, Blood 2004), entrane l'arrêt de maturation des progéniteurs érythroïdes au stade basophile chez l'homme (Zermati, J. Exp. Med. 2001 ; Carlile, Blood 2004) et chez la souris. (Kolbus, J. Exp. Med. 2002) L'activation des caspases semble être associée aux changements morphologiques observés au cours de la maturation terminale qui ressemblent à ceux d'un processus apoptotique. En effet, l'activation de la caspase-3 provoque le 34 clivage de la Lamine B. (Zermati, J. Exp. Med. 2001 ; Morioka, Exp. Cell Res. 1998) Ce clivage de Lamine B pourrait induire la condensation nucléaire comme cela a été montré au cours de l'apoptose dans d'autres modèles cellulaires. (Broerls, Eur. J. Cell Biol. 2002) Par ailleurs, la protéine Acinus, qui permet la condensation de la chromatine (mais pas la fragmentation du DNA) lors de l'apoptose (Sahara, Nature 1999), est aussi clivée par la caspase-3 activée au cours de l'érythropoïèse. (Zermati, J. Exp. Med 2001) Ce clivage est nécessaire à l'activité d'Acinus dans d'autres modèles cellulaires. On peut donc là aussi spéculer que le clivage d'Acinus puisse aussi participer à la condensation de la chromatine au cours de la différenciation érythroïde. Il a enfin été démontré dans notre laboratoire que la kinase Rock-1 activée principalement par le SCF était impliquée dans la différenciation terminale en intervenant au niveau des remaniements du cytosquelette. Son clivage par la caspase-3 lui permet de maintenir son activation dans les érythroblastes les plus matures qui ont perdu l'expression du récepteur c-kit. (Gabet, Cell Death Differ. 2011) La présence d'autres molécules cytoplasmiques impliquées dans l'apoptose a aussi été identifiée au cours de la différenciation érythroïde chez l'homme, notamment Apaf-1, AIF et le cytochrome c. (Hristoskova, Exp. Cell Res. 2007) Le rôle et la régulation de ces protéines pro-apoptotiques n'ont pas encore été correctement étudiés à ce jour dans la différenciation érythroïde. Il y a donc clairement au cours de l'érythropoïèse physiologique une activation transitoire des caspases par la voie mitochondriale (Zermati, J. Exp. Med 2001) qui participent à la différenciation érythroïde sans induction d'apoptose. (Rubiolo, Blood 2006 ; De Maria, Nature 1999). Si l'implication des récepteurs de mort dans la régulation négative de l'érythropoïèse est bien établie (De Maria, Nature 1999 ; Koulnis, PloS ONE 2011), son rôle dans la régulation positive est moins clair. Les travaux de Carlile et col. suggèrent que la voie Fas/FasL pourrait intervenir dans la maturation des progéniteurs érythroïdes précoces. (Carlile, FEBS Lett 2009) Les mécanismes précis de l'activation des caspases au cours de l'érythropoïèse, particulièrement les stimulus provoquant la dépolarisation de la mitochondrie, ne sont pas connus à ce jour, de même que beaucoup de protéines cibles de l'activation transitoire de ces caspases dans les érythroblastes. 35 1. 3. 3. 2. Apoptose et mécanismes de protection de l'apoptose au cours de l'érythropoïèse Les preuves de l'absence d'apoptose chez l'homme, au cours de l'érythropoïèse, dans des conditions physiologiques avec dose optimale d'Epo, sont, en dehors de l'aspect morphologique caractéristique des cellules : - une expression membranaire faible des phosphatidylsérines (marqueur d'apoptose) sur des érythroblastes humains cultivés in vitro (Zermati, J. Exp. Med 2001 ; Ribeil, Nature 2007 ; Hristoskova, Exp. Cell Res. 2007) ou sur des érythroblastes fœtaux, présents dans la circulation maternelle lors de la gestation, alors même que ces érythroblastes expriment le marquage TUNEL (marqueur mettant en évidence des fragments d'ADN, utilisé comme marqueur d'apoptose, mais possiblement pris en défaut au cours de la différenciation érythroïde). (Hristoskova, Clin. Chem. 2003) - l'absence de translocation d'AIF dans le noyau dans des lignées érythroïdes humaines TF-1 (Lui, FEBS Lett. 2007) et - l'absence du clivage d'ICAD, Inhibitor of Caspase Activated DNase, en CAD (Caspase Activated DNase, nucléase responsable du clivage du DNA). (Lui, FEBS Lett. 2006) Cela pourrait expliquer l'absence de fragmentation de l'ADN dans des lignées érythroïdes TF-1. (Lui, FEBS Lett. 2006) Cette absence d'apoptose est doublement paradoxale car il y a bien, comme nous l'avons écrit, en présence d'Epo, une activation des caspases exécutrices au cours de la différenciation érythroïde, mais aussi car GATA-1, facteur de transcription nécessaire à la survie et à la différenciation cellulaire érythroïde, n'est pas dégradé en présence d'Epo, alors même que GATA-1 présente, chez l'homme, un site de clivage pour la caspase-3 activée. Cela devrait donc aboutir à sa dégradation et l'arrêt de la maturation et de la prolifération cellulaire. (De Maria, Nature 1999) 36 1. 3. 4. Induction et prévention de l'apoptose dans les cellules érythroïdes : rôle physiologique de Fas/Fas-ligand et d'Hsp70 L'apoptose et l'inhibition de la maturation cellulaire sont des mécanismes très utiles pour réguler la production aussi énorme que celle de l'érythropoïèse. Ce sont d'ailleurs les mécanismes par lesquels l'Epo module la synthèse de la lignée rouge. Lors de la déprivation des cellules en Epo l'apoptose augmente et la maturation érythroïde ralentit (régulation négative de l'érythropoïèse). En cas d'anémie ou d'hypoxie, l'augmentation rapide de synthèse d'Epo par le rein va, au contraire, favoriser l'inhibition des phénomènes d'apoptose et de maturation. Inversement, en cas de carence en Epo, l'arrêt de maturation et d'apoptose érythroïde vont s'enclencher pour limiter très rapidement la production d'érythrocytes. Nous allons voir maintenant l'explication moléculaire de cette régulation de l'apoptose, intimement liée à celle de la différenciation/maturation, au cours de l'érythropoïèse. Deux mécanismes non exclusifs concourent, selon les connaissances actuelles, à la régulation de la prolifération cellulaire et de la maturation érythroïde. Le socle commun de ces deux mécanismes est la protection ou destruction de GATA-1. 1. L'activation de la voie Fas/Fas-Ligand (De Maria, Nature 1999) qui va aboutir à la destruction de GATA-1 et à la mort de précurseurs immatures ; 2. La protection ou non de GATA-1 du clivage par la caspase-3 selon la localisation nucléaire d'Hsp70. (Ribeil, Nature 2007) 1. 3. 4. 1. Fas/Fas-ligand dans la différenciation érythroïde Fas appartient aux récepteurs membranaires de mort cellulaire de la voie extrinsèque de l'apoptose. Les récepteurs de mort les mieux caractérisés sont, en dehors de Fas (ou CD95) activé par son ligand FasL, le récepteur TNF-R1 qui lie le TNF-, TRAIL-R1 (DR4) et TRAIL-R2 (DR-5), qui sont les récepteurs de TRAIL (TNF-related apoptosis induced ligand), et DR3 dont le ligand est Apo3L. (Peter, 37 Curr. Opin. Immunol. 1998) Les érythroblastes immatures expriment Fas, TNF-R1, TRAIL-R1, TRAIL-R2. (De Maria, Nature 1999) L'expression de Fas est faible dans les progéniteurs érythroïdes plus immatures (Dai, Blood 1998) et augmente dès les phases précoces de l'érythropoïèse entre le stade CFU-E et le stade proérythroblaste. (De Maria, Nature 1999) Inversement, l'expression membranaire de Fas-L augmente tardivement au cours de l'érythropoïèse (De Maria, Nature 1999 ; De Maria, Blood 1999), de même que l'expression de TRAIL (Zamai, Blood 2000 ; De Maria, Nature 1999), à partir du stade polychromatophile et peut donc induire, par contact cellulaire, l'apoptose et l'arrêt de maturation des précurseurs plus immatures, au stade d'érythroblaste basophile, qui expriment fortement le récepteur Fas. (De Maria, Blood. 1999) L'intéraction de Fas/Fas-L déclenche alors l'activation des caspases par la voie extrinsèque dans les précurseurs immatures. La caspase-3 activée va cliver GATA-1, entranant ainsi l'apoptose, l'arrêt de prolifération et l'arrêt de maturation des érythroblastes immatures, selon la concentration d'Epo. En effet, en présence de faible concentration en Epo, Fas-L est très exprimé ce qui induit l'arrêt de maturation des érythroblastes basophiles et une apoptose élevée de ces précurseurs immatures alors qu'en présence de forte concentration d'Epo, Fas-L est peu exprimé sur les polychromatophiles ce qui induit peu d'apoptose des érythroblastes immatures. (De Maria, Nature 1999, Blood 1999) In vitro, des concentrations élevées d'Epo protègent aussi de la mort induite par l'activation de Fas. (De Maria, Blood 1999) Par ailleurs, la même équipe a montré dans des cultures in vitro humaines, qu'un autre facteur de transcription, SCL/Tal-1, était détruit très précocement lors de la différenciation érythroïde terminale par l'activation des caspases après stimulation de la voie Fas/Fas-L et que la transduction d'une forme non clivable de SCL/Tal-1 protégeait GATA-1 du clivage des caspases et restaurait une différenciation et prolifération érythroïde malgré de faibles concentrations en Epo. (Zeuner, Cell Death Differ. 2003) Nous avons cependant déjà émis des doutes sur l'étude de l'apoptose dans ces travaux (cf chapitre 1. 3. 2. ), ce qui ne retire rien au mécanisme de régulation par cette voie Fas/Fas-L même si elle ne passe peut-être pas par une augmentation d'apoptose mais seulement par un arrêt du cycle cellulaire et un arrêt de différenciation induit par la dégradation de GATA-1. Cette régulation négative de l'érythropoïèse par la voie Fas/Fas-L a été également démontrée chez la souris. (Koulnis, PLoS ONE 2011) 38 1. 3. 4. 2. Rôle d'Hsp70 dans l'érythropoïèse physiologique 1. 3. 4. 2. 1. Protection de GATA-1 et autres facteurs Nous avons vu qu'un point énigmatique qui restait à expliquer, au cours de la différenciation érythroïde terminale, était l'absence de clivage de GATA-1 par la caspase-3 activée, en présence de concentration optimale d'Epo, et l'absence de mise en évidence de marqueurs d'apoptose sur des précurseurs érythroïdes tardifs. Ce paradoxe a été expliqué, au moins en partie, par le travail de thèse de Jean- Antoine Ribeil, dans le laboratoire, qui a montré qu'Hsp70 était la pièce manquante du puzzle. En effet, en présence d'Epo, Hsp70 se concentre dans le noyau, au cours de la différenciation érythroïde, pour protéger GATA-1 du clivage par la caspase-3 activée physiologiquement. (Ribeil, Nature 2007 ; Frisan, Blood 2012) Hsp70 co- localise avec GATA-1 dans le noyau des érythroblastes et intéragit avec GATA-1 directement par sa partie SBD, comme l'ont montré des expériences d'immunoprécipitation avec des mutants d'Hsp70 n'exprimant que l'un ou l'autre des deux domaines d'Hsp70. (Ribeil, Nature 2007) Ceci a été démontré in vitro dans un modèle de différenciation érythroïde en deux phases à partir de cellules humaines (cellules de sang de cordon mais aussi cellules souches adultes provenant de moelles osseuses de donneurs sains ou cellules souches circulantes après stimulation par G-CSF). C'est le même modèle de culture que nous avons utilisé dans cette thèse. En l'absence d'Epo, Hsp70 est délocalisé du noyau vers le cytoplasme et GATA-1 est alors clivé ce qui aboutit à une baisse de prolifération, un arrêt de différenciation/maturation. Un excès d'apoptose est aussi observé. L'inhibition de l'expression d'Hsp70 par siRNA induit aussi le clivage de GATA-1, l'apoptose et arrêt de maturation des érythroblastes. La transduction d'un mutant de GATA-1 (GATA-1) non clivable par la caspase-3 réverse le phénotype induit par de faibles concentrations d'Epo. (Ribeil, Nature 2007) La présence d'Hsp70 et sa co- localisation avec GATA-1 a été également démontrée in vivo dans des érythroblastes issus de la moelle humaine. (Ribeil, Nature 2007) Le mécanisme putatif de la protection de l'apoptose dans ce modèle passerait par le mécanisme suivant : Hsp70 en protégeant GATA-1 permettrait son rôle de facteur de transcription de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Cependant, cette hypothèse n'a pas été parfaitement 39 démontrée : l'expression de Bcl-XL baisse quand on inhibe l'expression d'Hsp70 par siRNA (Ribeil, Nature 2007), mais cela pourrait aussi passer par une action protectrice cytoplasmique directe ou indirecte d'Hsp70 sur Bcl-XL, sans lien avec GATA-1. Il a été montré récemment dans un modèle d'érythropoïèse pathologique, la myélodysplasie de bas grade, que GATA-1 était clivé du fait d'un défaut de localisation nucléaire d'Hsp70. Dans cette pathologie, l'expression de Bcl-XL n'était cependant pas modifiée dans ces cellules alors même que l'expression cytoplasmique d'Hsp70 était augmentée et GATA-1 absent. (Frisan, Blood 2012) L'effet anti-apoptotique d'Hsp70 pourrait donc aussi passer par d'autre voies, en se liant à d'autres protéines soit cytoplasmiques, soit nucléaires. Il a été ainsi montré dans un modèle de différenciation érythroïde in vitro avec les lignées érythroleucémiques humaines TF-1 que l'Epo induisait une dépolarisation mitochondriale. De façon concomitante, Hsp70 était surexprimée dans le cytoplasme et se liait à un facteur mitochondrial libéré lors de la dépolarisation de la mitochondrie, l'AIF (apoptosis-inducing factor) empêchant de jouer son rôle destructeur de DNA dans le noyau, et permet ainsi une différenciation érythroblastique normale. (Lui, FEBS Lett. 2007) Il est à noter que, dans ce modèle de culture de lignée cellulaire, Hsp70 n'était pas ou peu exprimée dans le noyau. La protection de GATA-1 par Hsp70 nucléaire est donc un autre mécanisme de régulation de la production érythroïde qui se place probablement à un niveau plus tardif de la différenciation (après l'activation physiologique des caspases) par rapport au système Fas/Fas-L qui contrôle les précurseurs très précoces (proérythroblastes et basophiles). 1. 3. 4. 2. 2. Régulation de la localisation cyto-nucléaire d'Hsp70 Le(s) mécanisme(s) d'entrée et de sortie d'Hsp70 du noyau n'est (ne sont) pas totalement élucidé(s). La sortie nucléaire d'Hsp70 est un phénomène actif. En effet, le blocage de molécules d'export nucléaire par la leptomycine B permet de maintenir Hsp70 dans le noyau de cellules déprivées en Epo. Il a été montré que la phosphorylation d'Hsp70 sur la sérine 400 (S400), était impliquée dans l'export nucléaire d'Hsp70 (travail de thèse du laboratoire de Julie Vandekerckhove, non encore publié). Cette particularité nous a permis de transduire dans ce travail les 40 érythroblastes par infection lentivirale avec un mutant d'Hsp70 dans lequel ce résidu S400 est muté en alanine, non phosphorylable (Hsp70-S400A), et ayant donc la particularité de forcer l'expression nucléaire d'Hsp70 en empêchant sa sortie active du noyau. Il a été élaboré par Emilie Frisan du laboratoire du Pr Michala Fontenay (Hôpital Cochin). (Frisan, Blood 2012) Le mécanisme précis de l'entrée d'Hsp70 dans le noyau n'est par contre pas connu. Une protéine d'import nucléaire d'Hsp70, ne faisant pas partie de la famille des importines, vient d'être découverte, nommée Hikeshi. (Kose, Cell 2012) Il serait intéressant de l'étudier au cours de l'érythropoïèse. Ces divers travaux de notre laboratoire ont aussi pointé une particularité de l'expression d'Hsp70, qui comme on l'a vu dans le chapitre 1. 2. 1. , est normalement inductible dans toutes les cellules humaines mais exceptionnellement présente à d'aussi fortes concentrations à l'état physiologique dans les érythroblastes. 1. 4. Hsp70 au cours de l'érythropoïèse pathologique 1. 4. 1. Excès de sortie nucléaire : la myélodysplasie Un des modèles d'érythropoïèse pathologique o il semblait important d'étudier le rôle d'Hsp70 est la dysmyélopoïèse. En effet, cette pathologie est caractérisée par une augmentation importante de l'apoptose des érythroblastes et un défaut de maturation cellulaire. (Frisan, Blood 2012) Il a été démontré, en collaboration entre notre laboratoire et celui du Pr Michala Fontenay à l'institut Cochin, qu'Hsp70 était surexprimée au cours des myélodysplasies de bas grade, mais que sa concentration nucléaire dans les érythroblastes diminuait avec la différenciation au lieu d'augmenter. Il en résultait le clivage de GATA-1. La cause de cette absence de concentration d'Hsp70 dans le noyau alors que la quantité globale d'Hsp70 cytoplasmique était augmentée n'est pas totalement élucidée. Les travaux de thèse de Julie Vandekerckhove, dans le laboratoire, ont montré que le SCF induit l'export nucléaire d'Hsp70 par la voie Pi3K/AKT, alors que l'Epo inhibe cet export (travaux déjà évoqués, non encore publiés). Notre hypothèse est qu'il pourrait exister dans les myélodysplasies un excès d'export, possiblement lié à un maintien anormal de l'expression du récepteur c-kit tardivement dans ces érythroblastes (Fontenay, 41 résultats non publiés). On ne peut cependant pas totalement éliminer un problème dans l'import nucléaire. Étonnamment, dans ce modèle, la restauration de la localisation nucléaire d'Hsp70 grâce au mutant Hsp-S400A constitutivement nucléaire ou la transduction des érythroblastes par un mutant non clivable de GATA- 1 (GATA-1) améliore la maturation des cellules (ce qui était attendu) mais ne permet pas de restaurer l'apoptose. (Frisan, Blood 2012) Cet exemple pathologique démontre, tout comme ce qui avait été mis en évidence en physiologie par JA Ribeil, que c'est avant tout la localisation cyto/nucléaire qui est importante au cours de l'érythropoïèse. 1. 4. 2. Défaut d'entrée nucléaire : la -thalassémie majeure Nous allons voir dans cette thèse un autre modèle de Hsp pathie lié à un défaut d'entrée, la -thalassémie. Nous avons posé comme hypothèse de travail que l'excès de chanes d'-globine libres, dont la synthèse augmente exponentiellement au stade d'érythroblaste polychromatophile, pouvait séquestrer Hsp70 dans le cytoplasme et ainsi l'empêcher d'entrer dans le noyau afin de jouer son rôle protecteur de GATA-1. Cela pourrait expliquer l'excès de mort par apoptose et un arrêt de maturation à ce stade de différenciation, définissant l'érythropoïèse inefficace. 1. 4. 3. Rôle d'Hsp70 et d'une co-chaperonne d'Hsp70, Bag-1, au cours de l'anémie de Blackfan-Diamond. Bag-1 est impliquée dans la libération d'Hsp70 de son substrat. Il a été très récemment démontré que l'expression de cette protéine était diminuée dans les érythroblastes de patients atteints d'anémie de Blackfan-Diamond, érythroblastopénie congénitale caractérisée par un défaut de biosynthèse ribosomale ayant pour conséquence une baisse de synthèse de certaines protéines (mutations des gènes de la famille RPS, notamment RPS19). L'inhibition Bag-1 par shRNA ne modifie pas la prolifération cellulaire d'érythroblastes murins en culture, mais diminue la différenciation érythroïde. Enfin, les souris déficientes en Bag-1-/- meurent d'un défaut de développement cérébral et d'une anémie à J13, 5 embryonnaire. Ces souris présentent une baisse des précurseurs érythroïdes fœtaux hépatiques et un 42 déficit de différenciation érythroïde terminale. (Horos, Blood 2012) Le lien entre le défaut de Bag-1 et Hsp70 n'a pas été étudié dans ces expériences. Nous pouvons poser l'hypothèse, à la lumière de ces données récentes, que la mobilité intracellulaire Hsp70 soit perturbée par la diminution de Bag-1, car celle-ci devrait logiquement perturber la libération des substrats et par conséquent séquestrer Hsp70 dans certains sous-compartiments cellulaires, ce qui pourrait la détourner de son rôle protecteur nucléaire de GATA-1. On peut aussi envisager que le déficit en Bag-1 conduise à une élimination précoce d'Hsp70, lié irréversiblement à des protéines mal formées, par le protéasome. En effet, nous avons pu observer dans cette maladie, dans des expériences préliminaires, un déficit d'expression d'Hsp70 dans les érythroblastes en cultures. Enfin, ce défaut d'expression pourrait aussi être dû à un défaut de synthèse d'Hsp70 secondaire à l'anomalie ribosomale. Des études sont en cours pour préciser le rôle d'Hsp70 dans cette maladie (Lydie Da Costa). 1. 5. Résumé de la régulation de l'érythropoïèse terminale humaine Il est bien démontré que GATA-1 est le facteur permettant la prolifération, la survie et la différenciation des stades précoces de l'érythropoïèse terminale (proérythroblaste et basophile) et la survie et la maturation des stades plus tardifs. En cas d'activation de la voie extrinsèque de l'apoptose (Fas-Fas-L) dans les cellules immatures (proérythroblastes, basophile 1), la caspase-3 activée par cette voie lors de certaines conditions (diminution de la concentration en Epo notamment) va cliver GATA-1, peu protégé à ces stades par Hsp70 (car Hsp70 se concentre dans le noyau des cellules plus matures, son expression nucléaire augmente avec la différenciation). Cela entrane l'arrêt de prolifération et de différenciation. L'existence d'une véritable mort par apoptose de ces cellules érythroïdes à ces stades précoces reste à être démontrée, comme nous l'avons déjà écrit, avec plus de précision. Cette voie semble être déclenchée avant l'activation physiologique des caspases qui se situe entre le basophile et le polychromatophile. Un autre mécanisme, plus tardif, va donc être nécessaire pour protéger les cellules de l'activation physiologique des caspases. C'est la concentration nucléaire d'Hsp70 qui va alors protéger GATA-1 de la caspase-3 activée et permettre alors la survie et surtout une différenciation et une maturation cellulaire optimale. La protection de l'apoptose, qui devrait découler de l'activation physiologique des caspases, est plus compliquée. Elle pourrait être liée directement à l'expression de GATA-1, protégé par 43 Hsp70, qui permettrait l'expression de protéines anti-apoptotiques comme Bcl-XL. Ce rôle anti-apoptotique de GATA-1 passant par Bcl-XL n'a cependant, comme nous l'avons vu, pas été démontré. Hsp70 pourrait aussi avoir un rôle direct en inhibant diverses protéines anti-apoptotiques cytoplasmiques ou nucléaires comme cela a été montré dans d'autres modèles cellulaires (notamment cellules cancéreuses). 44 2. Synthèse de l'hémoglobine, ontogénie de l'hémoglobine 2. 1. Intérêt de l'hémoglobine dans les globules rouges L'hémoglobine est une petite protéine (64, 4 kDa) dont le rôle principal est le transport de l'oxygène au sein des globules rouges (GR). Dans les conditions normales, chez l'homme, chaque GR (l'organisme en fabrique 200 milliards par jour) contient 300 millions de molécules d'hémoglobine (concentration de 32%). A cette concentration, si l'hémoglobine était diluée dans le plasma, cela provoquerait une hyperosmolarité tellement élevée (350 g d'hémoglobine/L ! ) que l'oxygénation normale aux tissus ne pourrait correctement se faire et des phénomènes de thrombose surviendraient. Le GR est donc devenu le mode de transport de l'oxygène chez tous les vertébrés, à l'exception de certains poissons (Channichthyidae), vivant dans des eaux froides et riches en oxygène, qui transportent l'oxygène dissout dans le sang. (Ruud, Nature 1954) Chez les mammifères, la disparition du noyau (et donc de l'ADN) et de l'ARN des GR matures ont amélioré la déformabilité cellulaire rendue nécessaire par la petite taille des capillaires. Elle a permis aussi aux GR d'adopter leur forme biconcave, caractéristique qui augmente les surfaces de contact et d'échanges avec l'endothélium. Enfin les GR de mammifères ne contiennent plus de mitochondries et ne peuvent donc plus consommer l'oxygène qu'ils transportent. Les GR d'oiseaux et de la plupart des reptiles ont conservé noyau, ADN et ARN. 45 2. 2. Structure générale de l'hémoglobine Chaque molécule d'hémoglobine est un tétramère constitué de 4 chanes polypeptidiques (chanes de globine), identiques deux à deux, qui intéragissent dans l'espace pour former une structure quaternaire. Les acides aminés hydrophobes sont protégés à l'intérieur de la structure globulaire alors que les motifs hydrophiles sont à la surface de la molécule. Chaque chane de globine contient une molécule, appelée protoporphyrine IX, associée à un atome de fer. Le dérivé ferreux (Fe2 ) de la protoporphyrine IX constitue l'hème qui, maintenu dans l'hémoglobine sous sa forme réduite (Fe2 ) grâce à la methionine réductase, permet de lier l'oxygène de façon réversible. Lorsque les mécanismes de réduction sont débordés, il y a une apparition ferrique (Fe3 ), oxydé, de de dérivé l'hémine/hématine (Fe3 ). (Schechter, Blood 2008) Une hémoglobine oxydée contenant de l'hème Fe3 s'appelle méthémoglobine et ne la protoporphyrine IX, qui constitue peut plus libérer correctement l'oxygène aux tissus. Cette méthémoglobine sera ensuite dénaturée en hémichromes (cf infra). Cette forme méthémoglobine ne représente qu' 1 à 2% de l'hémoglobine totale. Parmi les facteurs importants de la réduction, la méthémoglobine reductase est responsable de la conversion de la méthémoglobine en oxyhémoglobine. Des toxiques (médicaments) peuvent affecter cette enzyme et provoquer une méthémoglobinémie parfois mortelle du fait d'une mauvaise oxygénation tissulaire (patients bleus, cyanosés). La structure tridimensionnelle de l'hémoglobine a été pour la première fois identifiée en 1960 par cristallographie aux rayons X par Max Perutz (Perutz, Nature 1960), très peu de temps après celle de la myoglobine par John Kendrew. (Kendrew, Nature 1958) En 1962, ces deux biochimistes Anglais recevaient conjointement le prix Nobel de chimie pour leurs études des structures des protéines globulaires. Myoglobine et hémoglobine 46 sont donc les premières protéines dont on a caractérisé la structure spatiale. Cela a consacré les chanes de globine comme un modèle d'étude de la structure quaternaire des protéines en biochimie depuis presque 50 ans. Leur structure protéique sert de modèle dans l'enseignement secondaire, et bien sûr dans l'enseignement supérieur. Ce fut ensuite et c'est toujours un modèle en génétique d'étude de la modulation de l'expression des gènes (inhibition ou expression) des différentes chanes de globine et les maladies génétiques touchant ces gènes, appelées hémoglobinopathies Figure 5 : Structure spatiale de l'hémoglobine : en bleu : chanes , en rouge chanes , en vert hème (source Wikipedia) 2. 3. Différents types d'hémoglobine humaine Excepté dans les toutes premières semaines de l'embryogenèse (o des chanes zeta sont produites), deux de ces chanes sont obligatoirement les chanes d'- globine. Elles s'associent à 2 autres chanes dites non- suivant l'âge de développement de l'être humain. Ainsi, le type d'hémoglobine prédominant chez l'homme sain dès l'âge de 6 mois après la naissance, est appelé hémoglobine adulte (HbA) (98%). Celle-ci est formée de 2 chanes et de 2 chanes (22 HbA) ; par ailleurs un type mineur (2%) est formé de 2 chanes et 2 (22 HbA2). L'hémoglobine fœtale (22 HbF) est essentiellement concentrée dans un sous-type d'érythrocytes appelés cellules F. (Boyer, Science 1975) La concentration en HbF représente chez l'adulte sain moins de 1% (médiane autour de 0, 4% chez des adultes sains Anglais). (Zago, Blood 1979) (tableau 1 et figure 7) Les cellules F, 47 dérivant des réticulocytes F, représentent 1 à 7% des globules rouges totaux d'un individu après 1 an (variable selon les individus mais stable, génétiquement déterminé, au cours de la vie, pour un même individu). Chaque cellule F contient une quantité importante d'HbF mais co-exprime aussi une proportion variable d'HbA. La distribution d'HbF est très hétérogène au sein de ces cellules F, ce qui explique le pourcentage plus important de cellules par rapport au pourcentage global d'HbF. (Maier-Redelsperger, Hématologie 1996 ; Merghoub, Blood 1996) Une augmentation d'HbF que l'on observe dans certaines conditions pathologiques dont la -thalassémie peut donc être due à une augmentation du nombre de cellules F et/ou de la concentration en HbF par cellules F. C'est ce que l'on observe aussi lors d'une expansion érythroïde aigu induite par des injections Epo (équivalent d'érythropoïèse de stress chez l'animal). (Blau, Blood 1993) La stimulation chronique d'Epo n'induit par contre pas d'augmentation d'HbF. Dans ces hémoglobinopathies majeures (drépanocytose, -thalassémie), o existe une composante hémolytique, le taux d'HbF dépend également d'un troisième facteur de survie sélective des cellules F par rapport aux cellules non-F. (Maier-Redelsperger, Hématologie 1996) Tableau 1. Hémoglobine adulte : pourcentage respectif des différents types Hémoglobine Composition en chanes Concentration chez l'adulte* HbA HbA2 HbF de globine 22 22 22 96-98% 2. 3-3. 5% *Cette concentration adulte est habituellement atteinte à l'âge 6-8 mois 48 2. 4. Les chanes de globine : ontogénèse, régulation génique des chanes 2. 4. 1. Différents types de chanes de globine Les différentes chanes de globine dérivent toutes d'une même chane ancestrale commune, divergeant il y a environ 500 millions d'années entre et . Elles ont, de ce fait, des homologies de séquence très importante entre elles (par exemple environ 50% d'homologie sur les acides aminés entre les chanes et ) (figure 6) (Wajcman, EMC Hématologie 2005 ; Schechter, Blood 2008). Elles sont dénommées par les lettres de l'alphabet grec : chanes alpha-, beta-, gamma-, delta-, zeta-, et epsilon-. Chaque chane est composée d'environ 140 acides aminés (142 exactement pour la chane ) connectés entre eux par des ponts peptidiques. Figure 6 : Généalogie, structure et localisation chromosomique des gènes de globine chez l'homme. NGB, neuroglobine ; CYGB, cytoglobine ; MB, myoglobine (D'après AN Schechter Blood 2008 et Peschle et al EMBO Rep. 2002 ; 3 : 1146-1151 49 2. 4. 2. Ontogénèse de l'hémoglobine et régulation des gènes de la globine Pendant la vie fœtale, l'hémoglobine dite fœtale est essentiellement composée de 2 chanes et 2 chanes (22 HbF). Elle a une affinité plus importante pour l'oxygène ce qui permet d'extraire plus efficacement l'oxygène du sang maternel. Dans les 6-7 premières semaines après la conception, l'embryon contient d'autres types de chanes composant l'hémoglobine embryonnaire (22). La transition de l'hémoglobine embryonnaire à l'hémoglobine fœtale et de l'HbF à l'hémoglobine adulte (HbA) (réalisée dans les 6 premiers mois après la naissance chez l'homme) s'appelle ontogénèse de l'hémoglobine, ou switch de l'hémoglobine. (Figure 7) Cette commutation d'expression des différentes chanes de globine est due à l'activation séquentielle puis à la désactivation des différents gènes -like situés sur le chromosome 11. En effet, les gènes des chanes de globine sont portés par deux chromosomes : 16 et 11. Les gènes de type (2 gènes -globine, 1 et 2, et 2 gènes zeta, ) sont sur le chromosome 16 ; les gènes dit -like, sur le chromosome 11. Les gènes -like sont organisés de 5' en 3' sur l'ADN selon leur ordre d'expression au cours du développement : gène embryonnaire, G et A fœtaux, (minoritaire) et adultes ( -G-A-, 2 gènes ). Figure 7 : Ontogénie (switch) de l'hémoglobine au cours du développement 50 2. 4. 3. Régulation des gènes de globine : LCR et HS40 En amont du locus -globine, sur le chromosome 11, cinq sites hypersensibles à la DNase1 (HS5 1, numérotés de 5' en 3') constituent une région régulant l'expression des chanes de type appelée LCR (Locus Control Region) ; un autre site, a été identifié en aval (3'HS1). Sur le chromosome 16, un site unique, HS-40 contrôle l'expression des gènes de type (Figure 8). Les gènes des chanes de globine sont donc sous le contrôle de locus régulateurs situés à très grande distance (environ 40-50000 paires de base) en amont de la partie 5' des gènes de globine. Ces régulateurs permettent l'activation de la transcription de gènes en venant à proximité du promoteur des gènes de globine par un repliement de la chromatine qui forme des boucles. (Schechter, Blood 2008) La liaison entre le régulateur et le promoteur des gènes de globine permet ensuite de recruter et d'activer l'ARN polymérase II afin de transcrire l'ARNm nécessaire à la synthèse des chanes de globine. Par ailleurs, tout un groupe de protéines viennent intéragir avec le LCR et les séquences d'ADN des gènes de globine pour moduler l'expression des gènes de la famille ce qui complique encore plus la compréhension de cette régulation. Figure 8 : Organisation des gènes de globine et des régions régulatrices de l'expression de ces gènes, sur leurs chromosomes respectifs. LCR Locus Control Region, HS major upstream regulatory element (d'après Labie EMC hematol 2005) 51 2. 4. 4. Régulation de la commutation entre hémoglobine fœtale et adulte 2. 4. 4. 1. Intérêt thérapeutique du switch des chanes de globine La régulation de l'expression de certaines chanes de globine notamment celles situées sur le chromosome 11 (type ), expliquant la présence ou non d'une hémoglobine adulte ou fœtale, est l'objet d'une intense recherche depuis 30 ans. (Schechter, Blood 2008) Ces cinq dernières années, des publications majeures ont notamment porté sur la répression (silencing, en Anglais) des chanes (Sankaran, Science 2008, Nature 2009). Cette recherche peut avoir des répercussions thérapeutiques directes. En effet, les deux grandes maladies génétiques les plus fréquentes au monde (drépanocytose et -thalassémie) sont dues à des mutations très limitées sur le gène de la chane de globine : mutation ponctuelle remplaçant un seul nucléotide (A pour T) responsable de la modification d'un acide glutamique par de la valine en position 6 pour les formes les plus répandues de la drépanocytose, anomalies génétiques plus hétérogènes pour les -thalassémies (plus de 200 mutations décrites). La réexpression de la chane (dont le gène n'est pas touché par cette/ces mutations) pour compenser le déficit qualitatif (pour la drépanocytose) ou quantitatif (pour la thalassémie) en chane est donc une thérapie logique mais surtout bio logique. La physiologie humaine montre en effet que la compensation d'un déficit par une ré-expression fonctionne puisque les patients drépanocytaires ne deviennent malades que vers l'âge de 6 mois lorsque toute leur hémoglobine fœtale a été remplacée par de l'hémoglobine adulte mutée. C'est la même chose pour les patients thalassémiques majeurs qui ne sont transfusés qu'au bout de quelques mois de vie. Enfin, des phénotypes particuliers de malades ayant constitutivement des concentrations élevées d'hémoglobine fœtale ou des malades traités par des molécules augmentant cette concentration (tel l'hydroxycarbamide ou le butyrate chez les patients drépanocytaires) améliorent considérablement la morbidité et mortalité de la maladie. (Higgs, Lancet 2012) 52 2. 4. 4. 2. Régulation du switch : BCL11A et GATA-1 Comme on l'a souligné, les recherches et les progrès sont nombreux sur ce sujet, mais la régulation semble très complexe entre agents activateurs géniques et les répresseurs. Cela est d'autant plus compliqué qu'un répresseur des chanes de globine, par exemple, peut lui-même être réprimé par une autre molécule, cette dernière augmentera donc, en cascade, l'expression de ces chanes . Il est donc très difficile de rendre ce sujet synthétique, certainement car de nombreuses pièces du puzzle de cette régulation sont encore manquantes. Le but de ce chapitre n'est pas d'être exhaustif sur les mécanismes de régulation génétique de ce switch , nous allons seulement mettre en avant le rôle de deux protéines majeures : - BCL11A découvert en 2009 comme répresseur des chanes par Sankaran (Sankaran, Nature 2009), - et GATA-1, dont on reparlera largement dans cette thèse, car c'est le facteur de transcription majeur de l'érythropoïèse, protégé, comme nous l'avons vu, de l'activation des caspases par la chaperonne Hsp70 au cours de l'érythropoïèse. (Ribeil, Nature 2007) GATA-1 joue également un rôle fondamental dans la transcription des chanes de globine. Cette fonction va être ici résumée. Cela a son importance pour mettre en perspective les résultats de ce travail de thèse. BCL11A est le médiateur principal de l'inhibition d'expression des chanes (Sankaran, Science 2008, Nature 2009). Cette protéine (dont le gène est sur le chromosome 2) était jusque-là connue pour réprimer la transcription dans la lignée lymphocytaire B. BCL11A est exprimé dans les érythroblastes sous deux isoformes. La plus longue est associée à une inhibition de l'HbF. (Sankaran, Science 2008) BCL11A se lie au LCR, au gène des chanes de globine , et à la région située entre les gènes des chanes et . Il fait partie d'un complexe formé par SOX6, GATA-1, FOG-1 (co-facteur transcriptionnel de GATA-1) et le complexe remodelage nucléosomal/histone deacétylase (NuRD). L'ensemble du complexe est nécessaire pour exercer son action répressive de la transcription des gènes de globine (figure 9). D'autres protéines semblent avoir aussi un rôle dans cette régulation et il est probable que d'autres acteurs restent encore à découvrir. 53 Figure 9 : Silencing des chanes de globine par le complexe BCL11A, Sox6, GATA-1, FOG1 (ovale violet : zones de liaison de BCL11A sur le chromosome 11) (d'après Xu, Genes Dev. 2010) GATA-1, facteur de transcription de l'érythropoïèse dont nous avons vu, dans le premier chapitre, le rôle majeur dans la survie et la différenciation/maturation érythroïde, a été initialement identifié à la fin des années 1980 pour sa liaison spécifique au promoteur de la -globine humaine sur des séquences GATA de l'ADN. (Wall, Genes Dev. 1988) Il fut, dans la même période, démontré que GATA-1 se fixait à une séquence régulatrice de tous les gènes des différentes chanes de globine du poulet (Evans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988), ce qui fut ensuite aussi prouvé chez l'homme. (Martin, Nature 1989 ; Watts, Nucleic Acids Res 1990, Gong, Mol. Cell Biol. 1991 ; Orkin, Blood 1992) Des sites de liaison de GATA-1 sont aussi présents dans les régions régulatrices (LCR) des gènes de globine. (Orkin, Blood 1992) Par ailleurs, plusieurs gènes codant pour les enzymes impliquées dans la biosynthèse de l'hème (porphobilinogen desaminase, acide aminolevulinique synthase 2) sont des cibles de GATA-1. (Orkin, Blood 1992 ; Rylski, Mol. Cell Biol. 2003) Même si GATA-1 apparat comme un facteur de transcription fondamental des chanes de globine, les études portant sur le rôle de GATA-1 dans l'ontogénie des chanes de globine, notamment sur l'expression des chanes , sont contradictoires. 54 GATA-1 est décrit le plus souvent comme répresseur (il prend place dans le complexe répresseur formé avec BCL11A (cf figure 9) (Sankaran, Cold Spring Harb Perspect Med 2013), mais aussi comme activateur des chanes . (Yao, Exp. Hematol. 2009 ; Woon, Nucleic Acids Res. 2011 ; Zhu, Blood 2011) Il est donc probable que GATA-1 puisse avoir des actions différentes sur l'expression des chanes de globines en fonction d'autres co-facteurs, du niveau de son expression et de l'environnement cytokinique. 2. 4. 4. 3. Rôle des facteurs de croissance sur l'expression des chanes de globine : Epo, SCF et TGF- L'Epo est un facteur qui, en permettant la maturation érythroïde, augmente considérablement la production d'hémoglobine. Cependant, l'Epo ne semble pas jouer directement sur l'expression des gènes de globine in vitro ni sur leur contrôle développemental (Schechter, Blood 2008), sauf en cas de sécrétion aigu (pic d'Epo) o elle semble augmenter in vivo l'hémoglobine F (injection à des Babouins). (Blau, Blood 1993) L'injection chronique d'Epo à ces animaux ne semble pas avoir d'effet sur l'HbF. Chez l'homme sain, l'effet des injections d'Epo sur le pourcentage d'HbF n'a pas été, à notre connaissance, étudié alors que l'Epo semble y avoir un effet inducteur (modeste cependant) au cours des hémoglobinopathies. Le SCF et le TGF- semblent par contre avoir chacun un effet positif sur l'expression de l'HbF au cours de la différenciation d'érythroblastes humains normaux, in vitro, en milieu liquide ou semi-liquide ( 15-20% pour le SCF). (Peschle, Blood 1993 ; Whojda, Blood 2003 ; Bhanu, Blood 2005 ; Revue dans Gabbianelli, Mediterr. J. Hematol. Infect. Dis. 2009) Par ailleurs, ils exercent ensemble un effet synergique potentialisant l'expression de l'HbF. (Bhanu, Blood 2005) Cet effet du SCF a aussi été démontré dans des cultures d'érythroblastes humains -thalassémiques intermédiaires ou majeurs en milieu liquide. L'addition du SCF (10 à 100 ng/L) à l'Epo permettait de stimuler la prolifération cellulaire, diminuer l'apoptose, ralentir la différenciation érythroïde terminale et de tripler la synthèse de chanes de -globine (Gabbianelli, Blood 2008). Les mécanismes d'action du SCF ou TGF- sur l'augmentation de l'HbF ne sont pas connus. 55 3. L'érythropoïèse inefficace des -thalassémies majeures 3. 1. Les -thalassémies Les thalassémies constituent avec la drépanocytose et la persistance héréditaire d'hémoglobine fœtale un groupe de maladies génétiques appelées hémoglobinopathies. Thalassémies et drépanocytoses sont les maladies héréditaires autosomiques récessives les plus fréquentes au monde. (Cao, Genet. Med. 2010 ; Higgs, Lancet 2012) Si au cours de la drépanocytose, les mutations en cause aboutissent à un déficit qualitatif (anomalie de structure) des chanes de - globine, les mutations des thalassémies ont pour conséquence un déficit quantitatif de production en chanes (-thalassémie) ou de globine (-thalassémie). Ces déficits sont à l'origine de l'anémie qui caractérise ces maladies. Nous ne nous intéresserons ici qu'aux -thalassémies. La première description de la -thalassémie a été faite par le Dr Thomas Cooley en 1925. Plus de 200 mutations (le plus souvent des mutations ponctuelles) ayant un impact sur la transcription de l'ADN en ARN, de l'épissage de l'ARN messager ou la traduction de l'ARN messager (codon non-sens, décalage du cadre de lecture) de la -globine peuvent être à l'origine de -thalassémies. (Cao, Genet. Med. 2010) Des mutations sur la région régulatrice (LCR) des gènes de globine ont aussi été décrites. (Higgs, Lancet 2012) (Figure 10) 56 Figure 10 : Mutations responsables de -thalassémies. Dans la partie supérieure de la figure sont représentés les grands types de défauts moléculaires responsables d'une -thalassémie, et dans la partie inférieure ceux qui entranent une 0- thalassémie (d'après Labie, EMC hematol 2005) Ces nombreuses mutations expliquent une très grande hétérogénéité phénotypique. En effet, selon le type de mutation, un individu peut présenter trois types de maladie : - les -thalassémies mineures (hétérozygotes /0 ou / ), dont la découverte est le plus souvent fortuite lors d'un bilan d'une anémie minime et/ou une microcytose isolée avec hypochromie. Malgré une hémoglobine légérement abaissée, les globules rouges sont augmentés ce qui a fait autrefois utiliser le terme de fausse polyglobulie microcytaire pour décrire cette maladie. Ces patients ont un déficit de 50% de chanes , mais cela n'a pas de conséquence clinique pour eux. Ils sont par contre porteurs d'une mutation potentiellement dangereuse pour leur descendance. les -thalassémies intermédiaires (0/ , / ou 0/E) sont caractérisées - par une anémie modérée (7-11 g/L), hypochrome (16-24 pg), microcytaire (VGM entre 50 et 80 fl) pouvant nécessiter de temps à autre des transfusions pour pallier à une aggravation brutale de l'anémie. Un facteur déclenchant est 57 alors souvent retrouvé (infection, grossesse, age). Le risque principal chez ces patients est l'hémochromatose et ses conséquences graves (déficits endocriniens divers, diabète insulino-requérant, cirrhose, insuffisance cardiaque et troubles du rythme). La surcharge en fer chez des patients pas ou peu transfusés est liée à la dysérythropoïèse. Celle-ci inhibe la synthèse d'hepcidine ce qui entrane une hyperabsorption intestinale de fer (cf chapitre 3. 3. 9. ). La prise en charge de cette surcharge martiale est le plus grand défi thérapeutique chez ces patients. Cette thérapeutique est coûteuse et non dénuée d'effets secondaires potentiellement graves, ce qui pose un problème dans les pays en voie de développement ou soumis à la crise économique. les -thalassémies majeures (0/0, / ou 0/E) nécessitent pour vivre - des transfusions régulières (environ toutes les 3 à 6 semaines pour maintenir une hémoglobinémie > 9, 5 g/dL). En plus des complications potentielles liées aux transfusions répétées (infections, allo-immunisation, retentissement sur la qualité de vie), ils sont très exposés aux complications de la surcharge martiale que nous venons d'évoquer. En l'absence de transfusion, les enfants meurent le plus souvent dans la première décade de vie. (Higgs, Lancet 2012) Avec ces transfusions bien menées et une chélation optimale en fer, la plupart des patients arrivent, dans les pays développés, à l'âge adulte et ont une espérance de vie qui se rapproche de la population générale. Notons que les réticulocytes de ces patients -thalassémiques majeurs et intermédiaires sont augmentés, mais à moindre niveau que d'autres anémies hémolytiques. (Nathan, Am J Med 1966) La définition du type de thalassémie est donc clinique. Certains patients présentant une thalassémie intermédiaire peuvent, au cours de leur vie, changer de phénotype, nécessiter des transfusions régulières et devenir donc majeure (augmentation de la sévérité avec l'âge). Cependant, les patients avec -thalassémie majeure typique appelée 0-thalassemie ou maladie de Cooley (le 0 signifie absence de production des chanes , on utilise l'appellation lorsque des chanes -globine normales sont produites mais en quantité réduite) sont anémiques dès quelques mois de vie. Cela nécessite des transfusions régulières qui débutent dans les deux premières années de vie. (Cao, Genet Med 2010) 58 3. 2. Anémie des -thalassémies La conséquence des mutations sur le chromosome 16 est le déséquilibre du ratio de production des chanes / de globine (normalement presque équilibré à 1 à 1, 05 ; en physiologie, léger excès physiologique de chanes ). (Weiss, Blood 2009) Cela aboutit à un excès de chanes libres (appelée aussi apo -globine), instables pouvant former des précipités hautement toxiques pour les cellules, que ce soit les érythroblastes de la moelle osseuse (thalassémie intermédiaire et majeure), ou dans les globules rouges du sang (thalassémie mineure et intermédiaire essentiellement). (Khandros, J. Biol. Chem. 2012) Les chanes d'-globine libres sont plus instables que les chanes de -globine libres, notamment car les chanes -globine libres ont une tendance plus marquée à s'associer entre elles en homo tétramères, structure plus stable. (Weiss, Blood 2009) Notons aussi que les chanes des globines libres sont stabilisées par la fixation de l'hème. (Weiss, Blood 2009) Les chanes l'- hémoglobine (holo- -globine) vont aussi s'oxyder (Fe3 ) et précipiter. Les précipités sont donc formés d'apo- globine (prédominante) et d'holo- globine. L'exès de chane est bien corrélé avec la sévérité des -thalassémies, beaucoup plus que le type de mutation en cause. (Weatherall, Nat Rev Genet 2001 ; Khandros Hematol Oncol Clin N A 2010 ; Cao, Genet. Med. 2010) De très nombreuses études se sont focalisées depuis les années 1970 sur la régulation des gènes des chanes de globine et sur les facteurs moléculaires et génétiques modulant le phénotype de la maladie. En effet, pour une même mutation, des phénotypes plus o moins sévères peuvent être observés, ce qui suggère que des modificateurs ou polymorphismes génétiques interviennent. (Weatherall, Nat. Rev. Genet. 2001) On peut trouver ainsi dans la même famille, pour la même mutation, des patients avec -thalassémie intermédiaire peu transfusés et d'autres avec -thalassémie majeure. Parmi les facteurs améliorant le phénotype des - thalassémies, citons le génotype des chanes d'-globine (l'association à une - thalassémie réduit la quantité de chanes libres dans les érythroblastes et érythrocytes) et le niveau d'expression de l'hémoglobine F. (Higgs, Lancet 2012) Nous n'aborderons pas dans ce travail tous ces nombreux travaux de génétique très axés sur la régulation des chanes de globine dont nous avons brossé auparavant 59 quelques grandes caractéristiques. (Revue dans Cao, Genet. Med. 2010) Notons simplement qu'historiquement, 10 ans après la découverte de la structure cristallographique des chanes de globine dans les années 1960 qui fut un tournant de la biochimie humaine, la biologie moléculaire a fait de grands progrès à ses débuts, dans les années 1970, grâce à ces études dans la thalassémie. (Higgs Lancet 2012) Nous allons axer maintenant notre propos sur le sujet de cette thèse qui est de mieux comprendre la physiopathologie de l'érythropoïèse inefficace des patients - thalassémiques. En effet, il est bien admis que c'est cette dysérythropoïèse qui est la source principale de l'anémie des patients. C'est particulièrement vrai pour les thalassémies majeures ( 0) que nous étudierons dans ce travail puisque, chez ces patients, la majorité des érythroblastes contenant des chanes libres meurent d'apoptose lorsque l'hémoglobinisation dans les érythroblastes devient maximale. Les seuls réticulocytes qui quittent la moelle osseuse (et donc les seuls globules rouges) sont dont presque essentiellement (97-98%) des cellules dites F (F cells) contenant de l'hémoglobine fœtale (pour les formes 0 thal). Au cours des -thalassémies intermédiaires (et certaines -thalassémies majeures) o une certaine production de chanes existe ( ) o au moins une chane alternative ( E), l'anémie (moins marquée) est la résultante de l'érythropoïèse inefficace (moins sévère qu'au cours des formes majeures) mais aussi de l'hémolyse périphérique des globules rouges ayant un excès de chanes cytoplasmiques cohabitant avec des complexes d'hémoglobine A normale (22). Le pourcentage d'hémoglobine fœtale totale et le pourcentage de cellules F chez ces patients - thalassémiques intermédiaires est variable (10-50%, parfois plus). La distribution de l'hémoglobine F par cellule est très hétérogène, variant d'une cellule à l'autre. (Nathan, Am J Med 1966 ; Boyer, Science 1975) 60 3. 3. Dysérythropoièse des -thalassémies Comme nous l'avons vu, à côté du problème du type de mutation génétique et des nombreux facteurs génétiques additionnels modifiant le phénotype, la physiopathologie commune des -thalassémies est marquée par une dysérythropoïèse. Les études sur le sujet sont peu nombreuses par rapport aux travaux de génétique ou des travaux sur le métabolisme des globules rouges de ces patients et sont très souvent descriptives. Les mécanismes moléculaires précis expliquant les anomalies de l'érythropoïèse par l'excès relatif de chanes d'-globine libre, ne sont pas déterminés précisément. Nous allons donc maintenant faire une revue de la littérature sur cette dysérythropoïèse. 3. 3. 1. Caractéristiques de la dysérythropoïèse des -thalassémies 3. 3. 1. 1. Historique Cette dysérythropoïèse est suspectée depuis les années 1950 car il avait été bien observé que les patients -thalassémiques majeurs, peu ou mal transfusés présentaient une expansion médullaire pouvant aboutir à de véritables tumeurs médullaires, des déformations osseuses, une érythropoïèse extraosseuse et une splénomégalie. (cf photo illustrant de multiples expansions de moelle osseuse à travers le trou de conjugaison des vertèbres du rachis dorsal) 61 Des études cinétique du fer radioactif des années 1950 montraient déjà que l'hémolyse périphérique ne pouvait à elle seule rendre compte de l'anémie des patients. (Finch, Blood 1957) Dans les années 1970, la même équipe montrait, par des études ferrocinétiques étudiant l'incorporation du 59Fe dans les globules rouges nouvellement synthétisés, qu'environ 60 à 80% des précurseurs érythroblastiques avaient arrêté de proliférer et/ou mourraient. (Finch, Medicine 1970) Plus tard, il fut démontré une hyperplasie érythroïde. La moelle des patients - thalassémiques contient cinq à six fois plus de précurseurs érythroïdes que des contrôles sains (Centis, Blood 2000), avec une augmentation des érythroblastes basophiles et polychromatophiles ainsi qu'une diminution des acidophiles. (Yuan, Blood 1993 ; Centis, Blood 2000 ; Mathias, Experimental Hematology 2000 ; revue dans Schrier, Curr Opin Haematol 1997) De plus, il a été montré, dans les années 1970, par microscopie électronique, que la moelle osseuse contient, dès les premières cellules du stade polychromatophile, des érythroblastes avec des inclusions denses. Ces inclusions augmentent en taille et fréquence dans les stades ultérieurs de différenciation et sont localisées en position juxta-nucléaire en association avec les centrioles. (Wickramasinghe, Br. J. Haematol. 1975 et 1982) (figure 11) Figure 11 : Inclusions de chanes dans un érythroblaste polychromatophile en microscopie électronique (d'après Higgs, Lancet 2012). 62 3. 3. 1. 2. Caractéristiques de la dysérythropoïèse Ces différentes études résument les caractéristiques de la dysérythropoïèse des - thalassémies chez l'homme (schématisés sur la figure 12) : - expansion des progéniteurs précoces (en amont du proérythroblaste), - érythropoïèse inefficace lors de l'érythropoïèse terminale qui elle-même comprend trois anomalies distinctes : accélération de la différenciation érythroïde jusqu'au stade polychromatophile, arrêt de maturation au stade polychromatophile, et mort par apoptose. (Mathias, Experimental Hematology 2000 ; Yuan, Blood 1993 ; Centis, Blood 2000 ; Leecharoenkiat, Blood Cells Mol. Dis. 2011 ; De Franceschi, Haematologica 2011) L'érythropoïèse inefficace se définit comme une production sub-optimale d'érythrocytes matures à partir d'un pool de cellules immatures proliférantes. Figure 12 : Dysérythropoïèse des -thalassémies majeures. Expansion des progéniteurs précoces puis érythropoïèse inefficace (Pro-E : proérythroblastes)- schéma publié par Ribeil JA et Arlet JB et col. ScientificWorldJournal 2013 adapté de Y. Beuzard 63 L'expansion des progéniteurs est attribuée à la synthèse accrue d'Epo chez ces patients avec anémie chronique. (Lacombe, J. Clin. Invest. 1988, et chapitre 3. 3. 9) Les mécanismes expliquant l'accélération de la différenciation jusqu'au stade polychromatophile, puis l'arrêt de maturation à ce stade de différenciation ne sont, à ce jour, absolument pas connus. Nous allons proposer dans ce travail de thèse une explication pour la deuxième composante (arrêt de maturation). L'induction d'une mort cellulaire au stade polychromatophile, o la concentration en hémoglobine augmente le plus fortement, est plus facilement compréhensible par l'excès de chanes d'-globine libres. Cependant, le mécanisme précis de la toxicité induite par les chanes d'-globine libres dans les érythroblastes est assez spéculatif comme nous allons maintenant le voir. 3. 3. 2. Mécanisme de mort cellulaire des érythroblastes -thalassémiques : l'apoptose Le mécanisme de mort des précurseurs érythroblastiques -thalassémiques a été identifié dans les années 1990. Il a été montré, chez l'homme, que ces cellules présentaient une apoptose augmentée (environ 3 à 4 fois comparé à des contrôles sains) ce qui n'était pas le cas des précurseurs lymphoïdes et myéloïdes. Cela a été bien identifié dans la moelle osseuse de patients -thalassémiques mais aussi dans des modèles de souris par une augmentation de la fragmentation de l'ADN (DNA laddering, signe d'un clivage de l'ADN nucléosomal augmenté), et confirmé plus tard par technique de marquage TUNEL et, de manière plus précise, par marquage membranaire érythroblastique par Annexine V par analyse FACS. (Yuan, Blood 1993 ; Mathias, Experimental Hematology 2000 ; Centis, Blood 2000 ; Pootrakul, Blood 2000) L'étude de cultures in vitro de cellules -thalassémiques humaines par Mathias et col. en 2000 a été déterminante pour bien préciser les caractéristiques de cette érythropoïèse inefficace. Ces auteurs ont bien démontré que l'expansion cellulaire était diminuée au cours de l'érythropoïèse terminale et que cela est dû à une accélération de différenciation, puis un arrêt de maturation associé à une apoptose augmentée au stade polychromatophile. (Mathias, Experimental Hematology 2000) 64 Par ailleurs, cette apoptose est associée à une augmentation en nombre et une activation des macrophages médullaires dont on connat bien le rôle de phagocytose des globules rouges et des érythroblastes exprimant la phosphatidyl-sérine membranaire (marqueur d'apoptose). Cette phagocytose est environ deux fois plus importante que chez des sujets sains. (Centis, Blood 2000 ; Angelucci, Haematologica 2002 ; Kuypers, Cell Mol. Biol. 2004) 3. 3. 3. Voies d'apoptose impliquées dans les -thalassémies Celles-ci ont été très peu étudiées. Aucune étude n'existe chez l'homme et une seule est disponible chez la souris -thalassémique intermédiaire. Dans ce modèle, Fas et FasL sont co-exprimés précocement à tous les stades de la différenciation terminale. (Liu, Blood 2006) Les deux protéines sont cependant sous-exprimées dans les proérythroblastes et les basophiles de la moelle et de la rate de ces souris comparées à des contrôles, in vivo. Il ne semble pas exister de différence d'expression statistiquement significative dans les érythroblastes plus matures comparé à des contrôles (souris saines). Cette régulation négative de Fas/FasL pourrait être un marqueur d'érythropoïèse de stress chez la souris. (Liu, Blood 2006) Il n'est donc pas du tout certain, sur la base de données actuelles, que la voie extrinsèque de l'apoptose soit activée pour expliquer l'apoptose des polychromatophiles. La voie mitochondriale de l'apoptose devrait être plus logiquement activée puisqu'elle est sensible à des stimulus toxiques comme les réactifs oxydants (ROS). (Circu, Free Radic Biol Med 2010 ; Schrier, Redox Rep 2003) Cependant, cette voie n'a pas été précisément étudiée. Nous avons pu montrer cependant au cours de nos expériences de thèse, par cytométrie de flux (données non montrées dans la suite de ce manuscrit), que la voie mitochondriale était activée précocement au cours de la différenciation terminale (dépolarisation de la mitochondrie dès J3 de nos cultures CD36). 65 3. 3. 4. Rôle des dérivés oxydants (ROS) dans la physiopathologie de la thalassémie L'excès de chanes -hémoglobines génère des espèces oxydantes (ROS) Le stade de différenciation o apparat une apoptose importante au cours des - thalassémies est le stade polychromatophile. C'est, comme nous l'avons vu, le stade de différenciation o la concentration en chanes de globine augmente le plus fortement. Ainsi la mortalité cellulaire à ce stade semble particulièrement liée à l'accumulation des chanes d'-globine libres (appelé aussi apo -globine) qui, non associées avec en tétramères, sont très instables et vont précipiter et former des agrégats toxiques pour la cellule. Ceux-ci, que l'on peut identifier sous la forme de corps de Heinz, peuvent être plus o moins importants en taille et en nombre suivant la concentration des chanes libres. (Nathan, Am. J. Med. 1966 ; Wickramasinghe, Br. J. Haematol. 1975) Les mécanismes précis de toxicité de ces agrégats ne sont pas connus. Les corps de Heinz correspondent à des inclusions détectées dans les globules rouges, accolés à la membrane cytoplasmique, par une coloration d'un frotti sanguin au bleu de crésyl brillant ou au cristal violet (dénommé aussi méthyl-violet). Ils portent aussi le nom de corps de Ehrlich-Heinz, d' inclusion bodies et ne sont pas du tout spécifiques des -thalassémies puisqu'ils peuvent se voir également dans les globules rouges d'-thalassémies, de drépanocytose, d'autres anémies hémolytiques (déficit en G6PD) et après prise de nombreux toxiques. (Webster, Blood 1949) À côté des chanes libres, les chanes d'-hémoglobine appelées aussi holo - globines (-globines liées à l'hème qui contient du fer ferreux Fe2 ), ont tendance à s'auto-oxyder ce qui va les dénaturer et donner in fine des hémichromes (- hémoglobine oxydée et dénaturée avec Fer sous forme ferrique Fe3 ). Ces hémichromes, précurseurs également de corps de Heinz, sont un terme générique qui désigne de l'hémoglobine oxydée et dénaturée (cela peut être aussi l'hémoglobine entière HbA). Ils peuvent être mis en évidence par spectométrie et, indirectement, par les colorations sur frotti permettant d'identifier les corps de Heinz. On a longtemps cru qu'ils n'étaient présents qu'en pathologie mais une faible 66 proportion est aussi présente en physiologie dans des globules rouges vieillis. (Rifkind, Methods Enzymol. 1994) Ces hémichromes génèrent, au moins dans les érythrocytes, des ROS qui endommagent les protéines cellulaires, lipides et acides nucléiques. (Kong, J. Clin. Invest. 2004) Les études s'intéressant à la production de ROS au cours de la différenciation érythroïde terminale dans les -thalassémies sont rares. (Shinar, Semin. Hematol. 1990) Il a été montré une augmentation significative de la production de ROS dans les précurseurs érythroïdes précoces et tardifs comparée à des érythroblastes normaux dans la -thalassémie intermédiaire (De Franceschi, Haematologica 2011) ou -thalassémie/HbE. (Leecharoenkiat, Blood Cell Mol. Dis. 2011) S'il est facile de comprendre que l'excès de ROS, en endommageant les composants cellulaires des globules rouges puisse diminuer la durée de vie de ces cellules et induire une clairance prématurée par hémolyse (un phénomène passif) (Kong, J. Clin. Invest. 2004), il n'y a pas de preuve solide que la production de ROS soit la cause de l'apoptose dans les précurseurs érythroblastiques -thalassémiques (un processus programmé et actif de mort cellulaire (Schrier, Curr. Opin. Hematol. 2002). Il faut insister sur le fait que dans les quelques études (peu nombreuses) effectuées chez l'homme sur la cinétique de production de ROS au cours de la différenciation érythroïde terminale, il est observé soit aucune différence (De Franceschi, Haematologica 2011), soit une baisse importante (Leecharoenkiat, Blood Cell Mol. Dis. 2011) des niveaux de ROS au cours de la différenciation. Ces observations plaident donc contre un lien direct entre ROS et apoptose puisque l'apoptose survient en fin de différenciation o les niveaux de ROS ne sont pas plus élevés qu'au début de la différenciation, voire plus bas. Le lien entre ROS et apoptose dans les cellules érythroïdes humaines n'a donc jamais été démontré même si c'est l'explication souvent avancée pour expliquer l'érythropoïèse inefficace, par extrapolation des études sur la toxicité des hémichromes et des ROS sur la membranes des globules rouges. L'activation des ROS (dont la concentration est comme on l'a vu augmentée au cours de l'érythropoïèse thalassémique) peut, dans d'autres modèles cellulaires, activer les voies extrinsèque (Fujisawa, Mol. Biotechnol. 2007) mais aussi intrinsèque des caspases via l'intéraction avec des protéines de perméabilité 67 mitochondriale. (Circu, Free Radic Biol. Med 2010) Cela pourrait donc rendre compte de l'activation précoce de la voie mitochondriale de l'apoptose (hypothèse et données personnelles), mais pas de la mort importante et brutale au stade polychromatophile, alors même que la production de ROS est augmentée déjà depuis des stades érythroblastiques précoces et ne semble pas augmenter ensuite. D'un autre côté, le rôle des ROS dans l'accélération érythroïde, une autre caractéristique de l'érythropoïèse inefficace, est à envisager (Leecharoenkiat, Blood Cell Mol. Dis. 2011) d'autant que l'utilisation d'anti-oxydants inhibe la différenciation in vitro de progéniteurs érythroïdes dérivés de foie fœtal de souris de type sauvage. (Nagata, Cell Biol. Int. 2007) Le rôle des ROS dans l'induction de la maturation érythroïde physiologique induite par l'Epo est posé par ces expériences chez la souris. Il serait intéressant à étudier en physiologie humaine et au cours des - thalassémies. 3. 3. 5. L'anomalie de structure membranaire pourrait-elle expliquer la mortalité cellulaire au stade polychromatophile ? Il a été démontré dans les globules rouges de thalassémies intermédiaires que les précipités de chanes d'-globine associées à l'hème libre, au fer oxydé et aux protoporphyrines (constituant comme on l'a vu, les hémichromes) se liaient à la membrane des érythrocytes et à d'autres organites cellulaires, ce qui altérait la stabilité, l'hydratation et la déformabilité de la membrane du globule rouge et désorganisait le cytosquelette. De plus, cela augmente la propagation de la production de ROS toxiques pour les organites intracellulaires (cf supra). (Shinar, Semin Hematol 1990) Cela pourrait donc expliquer l'hémolyse périphérique de ces patients en fragilisant la membrane et le cytosquelette des érythrocytes. (Schrier, Blood 1989 ; Yuan, Blood 1992) De plus, les hémichromes co-polymérisent avec les molécules de bande-3 sur la membrane des globules rouges ce qui les regroupe et crée un néoantigène qui peut lier des IgG et le complément. (Yuan, Blood 1992 ; Schrier, Curr. Opin. Hematol. 2002) Le complexe IgG/complément pourra être ensuite reconnu par les macrophages qui élimineront ces globules rouges ainsi ciblés. (Figure 13) 68 Figure 13 : Toxicité des hémichromes vis à vis de la bande-3 sur les globules rouges (d'après Pantaleo, Autoimmun. Rev. 2008) Cette toxicité plus ou moins directe de l'accumulation d'-globine sur la membrane des érythroblastes est-elle en cause dans la dysérythropoïèse des -thalassémies ? Quelques éléments plaident pour un possible rôle de ces altérations même si les arguments et travaux dans l'érythropoïèse sont beaucoup moins étoffés que pour l'hémolyse périphérique et emportent peu la conviction. L'implication de ce mécanisme dans le processus d'érythropoïèse inefficace parat mineur. Il semble exister, dans l'érythropoïèse précoce des -thalassémies majeures, un déficit d'assemblage de la protéine transmembranaire bande-3 aux stades de proérythroblastes et d'érythroblastes basophiles, non lié dans l'espace aux dépôts de chanes d'-globine. Ce déficit en bande-3 semble disparatre dans les stades d'érythroblastes polychromatophiles et acidophiles o son expression membranaire est diffuse, non liée aux agrégats d'-globine. (Aljurf, Blood 1996) La cinétique d'aquisition de la bande-3 membranaire reste celle d'une augmentation constante avec la différenciation mais semble, sur ces travaux de microscopie confocale, moins intense (au moins avant le stade acidophile) que celle de cellules contrôles. Le rôle potentiel de la bande-3 dans l'érythropoïèse inefficace des -thalassémies majeures 69 apparat donc beaucoup moins central que ce qui a été démontré dans les globules rouges de -thalassémies intermédiaires. La protéine 4. 1 est une composante importante du cytosquelette membranaire, qui lie la partie intracytoplasmique de la bande-3. Elle est partiellement oxydée dans les érythroblastes matures des souris -thalassémiques. (Advani, Blood 1992) Les dépôts d'-globine semblent également co-localiser avec cette protéine 4. 1. dans les érythroblastes humains -thalassémiques majeurs et modifient de façon importante sa distribution cytoplasmique. (Aljurf, Blood 1996 ; Schrier, Curr. Opin. Hematol. 1997) La spectrine, autre protéine du cytosquelette, co-localise aussi avec l'- globine. Ces études descriptives, même peu nombreuses, semblent montrer qu'il existe, dans les érythroblastes -thalassémiques, des anomalies sur des protéines importantes pour l'intégrité membranaire. Cela explique l'hypothèse, très répandue dans la littérature, que l'accumulation des chanes d'-globine déstabilise la membrane des érythroblastes et participe à l'érythropoïèse inefficace. Cela pourrait expliquer une mort par nécrose ou par un processus auto-immun contre la bande-3 (cependant jamais démontré dans les érythroblastes), associé à une élimination macrophagique. Mais cela ne peut pas être l'explication mécanistique de l'augmentation importante d'apoptose, phénomène de mort cellulaire actif, observé dans des modèles de cultures de cellules -thalassémiques humaines en dehors de toute présence de macrophages. (Yuan, Blood 1993 ; Schrier, Curr. Opin. Hematol. 1997) Enfin, contrairement aux globules rouges, il a été montré que les agrégats de chanes d'- globine ( inclusion bodies ) étaient localisés près du noyau dans les centrioles des érythroblastes à partir du stade polychromatophile et non accolés à la membrane cytoplasmique, ce que nous avons aussi observé dans nos expériences. (Wickramasinghe, Br. J. Haematol. 1975 et 1982) Cette localisation juxtanucléaire des agrégats protéiques est d'ailleurs assez générale en biologie, formant une structure cytoplasmique récemment dénomé agrégasome . (Weisberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012) On ne peut exclure cependant que des foyers de chanes d'- globine libres, éventuellement oxydées, non encore regroupées en agrégats de grande taille visualisables, puissent intéragir avec des protéines de la membrane érythroblastique comme ce qui a été montré avec la protéine 4. 1 (cf supra). 70 3. 3. 6. Rôle de la chaperonne AHSP (-Hemoglobinstabilizing protein) L'-hemoglobin-stabilizing protein (AHSP) appelée aussi ERAF (erythroid-associated factor) est une protéine chaperonne spécifique des chanes d'-globine découverte il y a 10 ans par l'équipe de Mitchell Weiss aux Etat-Unis (2002). (Kihm, Nature 2002) Des études d'intéraction protéique ont démontré qu'elle se liait spécifiquement aux chanes d'-globine libres (sans hème apo -globine) (Yu, J Clin Invest. 2007) mais aussi à l'-hémoglobine dans sa forme réduite (Fe2 ) (holo -globine réduite) ou oxydée Fe3 (holo -globine oxydée), mais ni aux chanes , ni aux dimères , ni au tétramère d'HbA. (Gell, J Biol. Chem. 2002 ; Kihm, Nature 2002 ; Weiss, Blood 2009 ; Mollan, J Biol Chem 2012) Elle se lie à l'-globine ferrique (oxydée) avec 100 fois plus d'affinité qu'avec l'-globine ferreux. (Gell, J Biol Chem 2002 ; Khandros, J Biol Chem. 2012) L'AHSP stabilise les chanes d'-globine (Kihm, Nature 2002 ; Zhou, J Biol. Chem. 2006) et diminue la production de ROS induite par les chanes d'holo-globine. (Kong, J. Clin. Invest. 2004) L'AHSP est une petite protéine globulaire de 11, 8 kilodalton, monomérique en solution, formée de 102 acides amines dont l'expression est sous la dépendance du facteur de transcription GATA-1. (Kihm, Nature 2002 ; Gell, J Biol. Chem. 2002) Elle forme une structure formée de 3 hélices qui se lient à l'-globine sur sa partie opposée à la poche contenant l'hème pour former un hétérodimère. Une protéine d'AHSP se lie à une protéine d'-globine. (Gell, J Biol. Chem. 2002) L'AHSP se lie aux hélices G et H de l'-globine, surface d'intéraction en partie commune avec celle de la -globine. (Mollan, J Biol. Chem. 2012) Cependant, la -globine lie l'-globine avec plus d'affinité et sur une plus large surface que l'AHSP. (Kihm, Nature 2002 ; Weiss, Blood 2009 ; Mollan, J Biol. Chem. 2012) La constante de dissociation (Kd) entre l'AHSP et l'-globine est de 0, 5 M (Kihm, Nature 2002), la constante d'association (KA) de 1 X 107 M-1. (Gell, J Biol. Chem. 2002) L'AHSP a essentiellement été étudiée dans les globules rouges circulants et les réticulocytes (chez l'homme ou dans des modèles murins) bien que la fonction qu'on lui prête semble se situer à deux niveaux : 71 (1) l'assemblage des chanes de globine pour former l'hémoglobine : l'AHSP se lierait à l'apo-globine libre naissante, la stabiliserait, dans une conformation native pour être ensuite déplacée par la chane pour former le tétramère d'Hb (Yu, J. Clin. Invest. 2007 ; Weiss, Blood 2009). (2) contrer l'effet potentiellement néfaste de l'excès physiologique (même infime) des chanes -globine libres, potentiellement toxiques (ratio / globine légèrement supérieur à 1 en physiologie (cf supra) (Kong, J. Clin. Invest. 2004 ; Weiss, Blood 2009). Dans ce deuxième rôle, l'AHSP pourrait être utile en pathologie pour chaperonner les chanes d'-globine libres en excès dans les -thalassémies et éviter leur précipitation que ce soit dans les cellules érythroblastiques ou dans les globules rouges. Les expériences princeps décrivant cette chaperonne, publiées dans Nature, ont portées uniquement sur des études dans les globules rouges et sur l'intéraction entre les deux protéines. De façon surprenante, l'expression de l'AHSP au cours de la différenciation érythroblastique a été très peu étudiée alors même que l'on attribue un rôle fondamental de cette protéine dans les érythroblastes puisqu'un rôle dans l'assemblage de l'hémoglobine est mis en avant. Une seule étude s'est intéressée à l'expression génique de l'AHSP par PCR au cours de la différenciation érythroïde terminale humaine normale in vitro dans une culture en milieu liquide. L'expression génique semble augmenter dans les érythroblastes proportionnellement avec la différenciation érythroblastique et semble plus abondante aux stades d'érythroblastes polychromatophiles et acidophiles. (Dos Santos, 2004) Une autre équipe a étudié l'expression de l'ARNm des chanes de globine et de l'AHSP au cours de l'érythropoïèse humaine in vitro. Ces auteurs ont montré une augmentation également continue mais avec une expression d'ARNm de l'AHSP plus de 100 fois plus faible que celle de l'-globine. L'augmentation de l'AHSP avec la différenciation érythroïde dans cette étude semble très modérée et non significative. (Varricchio, Transfusion 2010) Aucune publication n'étudie précisément, à notre connaissance, l'expression protéique de l'AHSP suivant les stades de différenciation érythroïde chez l'homme. L'étude initiale de Kihm nous révèle qu'il y aurait 107 molécules de l'AHSP par progéniteurs érythroïdes dans des lignées érythroïdes (environ 0, 1 mM dans des proérythroblastes contre 5- 72 10 mM pour l'HbA- les concentrations des chanes et libres ne sont pas connues), mais ces données ne sont pas montrées ni dans cet article ni dans aucun des très nombreux articles publiés par cette équipe sur le sujet (Kihm Nature 2002 ; Gell, J Biol Chem 2002). La même équipe de M. Weiss, dans une excellente revue sur le rôle des chaperonnes dans l'érythropoïèse publiée en 2009 dans Blood, prétend que des études biochimiques montreraient que l'AHSP aurait un rôle dans l'assemblage de l'HbA (aucune référence n'est apportée, probables données personnelles), mais ils admettent qu'il est difficile de purifier de grande quantité de complexes AHSP/-globine dans les cellules érythroïdes. Ils avancent comme explication que cela pourrait être dû à une concentration faible (alors qu'ils parlent dans leur article initial dans Nature d'une protéine abondante dans l'érythropoïèse) et de sa fonction transitoire. La faible expression de l'AHSP, si elle est confirmée, est un peu surprenante dans l'hypothèse d'un rôle important de l'AHSP pour l'assemblage de l'hémoglobine car cette dernière est une protéine produite en grande quantité dès le stade d'érythroblastes basophiles/polychromatophiles ce qui nécessiterait, a priori, des concentrations importantes de chaperonne à ces stades de différenciation. Il faudrait sinon considérer que son rôle dans l'assemblage de l'HbA soit si transitoire qu'une molécule de l'AHSP pourrait servir de nombreuses fois à chaperonner des chanes d'-globine naissantes. Dans ce cas, pourquoi l'expression génique serait maximale au stade polychromatophile/acidophile, alors même qu'à ces stades le tétramère d'hémoglobine est déjà en grande partie formé ? Une chaperonne spécifique des chanes naissantes devrait plus logiquement être impliquée à un stade antérieur, au tout début de production des chanes de globine (proérythroblaste ou plutôt basophile). Enfin, il est étonnant que l'équipe de M Weiss n'ait pas étudié l'expression protéique de l'AHSP ou du complexe AHSP/-globine dans les érythroblastes de patients -thalassémiques majeurs. Celle-ci devrait être élevée puisque ne sont présentes, dans une majorité des cellules de ces patients, que des chanes d'-globine, sans chanes pouvant entrer en compétition avec l'AHSP pour la liaison avec les chanes . Une équipe Italienne a d'ailleurs montré dans 2 études différentes (cependant très discutables méthodologiquement) que l'ARNm de l'AHSP était significativement augmenté dans les érythroblastes humains matures de patients -thalassémiques majeurs cultivés in vitro par rapport à des sujets sains. (Varricchio, Transfusion 2010 ; Mai, Mol. Pharmacol. 2007) Les études 73 protéiques ne sont, à notre connaissance, toujours pas disponibles. Le rôle de l'AHSP dans l'assemblage des chanes de globine n'est donc qu'hypothétique et non démontré à ce jour dans des modèles d'érythropoïèse humaine. Le rôle de l'AHSP pourrait en fait se situer plus tardivement, dans des érythroblastes très matures ou les érythrocytes les protégeant de l'hémolyse périphérique. Les données sur le rôle protecteur de l'AHSP dans les globules rouges sont en effet beaucoup plus convaincantes. Dans les souris -thalassémiques intermédiaires, la perte de l'AHSP aggrave l'anémie des souris. (Kong, J. Clin. Invest. 2004) Les souris déficientes pour l'AHSP (AHSP/) présentent une anémie hémolytique modérée et une précipitation de l'hémoglobine dans les globules, mais aussi une proportion élevée de précurseurs érythroïdes, une maturation érythroïde légèrement déficiente et une apoptose augmentée. Ces données phénotypiques ressemblent à ce que l'on observe dans l'érythropoïèse inefficace des -thalassémies. (Kong, J. Clin. Invest. 2004) L'effet de l'invalidation de l'AHSP sur la maturation terminale ne semble pas significative sur une autre étude. (Yu, J. Clin. Invest. 2007) À noter toutefois que l'apoptose dans l'étude de Kong et al a été réalisée uniquement par marquage immunohistochimique TUNEL sur la rate de souris. Aucune autre méthode d'étude d'apoptose n'a été utilisée. Ces éléments semblent être, pour les auteurs, un argument pour un rôle joué par l'AHSP dans l'érythropoïèse. (Kong, J. Clin. Invest. 2004) Cependant, il faut souligner que, dans ce modèle de souris totalement invalidées pour AHSP, l'anémie est modérée (Hb 14, 5 vs 16, 9 g/dl) et que celle-ci est due en grande part à de l'hémolyse périphérique. Cela peut être considéré comme un argument négatif pour un rôle majeur de l'AHSP dans l'érythropoïèse physiologique. Enfin, le rôle de l'AHSP dans la pathologie humaine est une question ouverte. Des mutations naturelles qui invalident l'expression de l'AHSP ou altèrent sa structure protéique sont rares (Dos Santos, Am. J. Hematol. 2008 ; Viprakasit, Blood 2004). Les variations d'expression d'ASHP chez l'homme sont fréquentes (Dos Santos, Am. J. Hematol. 2008 ). Une relation de causalité entre baisse de l'AHSP et la sévérité des -thalassémies n'a pas été, à ce jour, démontrée. Les données sont en effet divergentes (Weiss, Blood 2009). 74 3. 3. 7. Rôle de l'hème et des inhibiteurs de l'hème L'hème a un rôle dans la stabilisation et solubilisation des chanes d'-globine (apo- globine) qui, sans hème, sont beaucoup plus instables et ont tendance à précipiter et former des agrégats. C'est, en soi, un système de chaperonne des chanes . (Weiss, Blood 2009) Il existe au cours de la -thalassémie une augmentation de production d'hème dans les érythroblastes précoces, mais l'hème est par contre significativement réduit dans des érythroblastes matures par rapport à des érythroblastes de contrôles sains. (De Franceschi, Haematologica 2011) Cela est un argument supplémentaire contre la théorie de l'oxydation cellulaire pour expliquer l'apoptose des érythroblastes polychromatophiles puisque l'hème et, comme nous l'avons vu, les ROS sont diminués par rapports aux stades plus précoces et non augmentés comme le voudrait cette théorie. Cette réduction de synthèse d'hème peut être paradoxalement un mécanisme protecteur dans une situation o l'hème cellulaire est limité (Weiss, Blood 2009) (1) en diminuant les effets cytotoxiques d'un excès d'hème libre cellulaire ayant un potentiel oxydant (peut se transformer en hémine délétère pour la cellule), (2) en modifiant deux protéines qui répriment l'expression des chanes de globine. En effet, l'hème inhibe le facteur de transcription Bach I et HRI (Heme regulated inhibitor of translation). Ces deux protéines répriment la transcription des chanes et . (Tahara, J Biol. Chem. 2004 ; Tahara, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004 ; Weiss, Blood 2009 ; Chen, Blood 2007) Un déficit en hème va donc rendre actives ces protéines ce qui, en cascade, va diminuer la synthèse des chanes d'-globine libres (apo-globine), ce qui est un avantage évident dans le cas de la - thalassémie. (Weiss, Blood 2009 ; Chen, Blood 2007) De façon intéressante, les chaperonnes Hsc70 et Hsp90 augmentent l'expression/activité de HRI. (Uma, J Biol. Chem. 1997 ; Uma, Mol. Cell Biol. 1999) D'autres moyens cytoprotecteurs ont probablement été développés par les érythroblastes -thalassémiques comme la protéine PRDX2, exprimée abondamment au cours de l'érythropoïèse - thalassémique. Cette protéine se lie à l'hème dans les précurseurs érythroïdes et pourrait jouer un rôle additionnel pour protéger les précurseurs érythroïdes matures de l'hème libre et permettre indirectement comme on l'a vu, une diminution des 75 chanes d'-globine libres. (De Franceschi, Haematologica 2011) Enfin, de nombreux travaux ont montré à partir de la fin des années 1970, un rôle important de l'hémine (hème dans sa forme oxydée) comme accélérateur de la différenciation érythroïde. (Bonanou-Tzedaki, Cell Different 1981 ; Theodorakis, Mol Cell Biol. 1989 ; Bensaude, Nature 1983) Cette propriété est utilisée pour accélérer la différenciation des lignées érythroïdes K562. Ce rôle de l'hème oxydé dans l'accélération de la différenciation érythroïde des -thalassémies n'a pas été à notre connaissance étudié. Pourtant, l'utilisation d'anti-oxydants inhibe la différenciation in vitro de progéniteurs érythroïdes dérivés de foie fœtal de souris de type sauvage. (Nagata, Cell Biol. Int. 2007) Cela pourrait passer non seulement par le blocage des ROS mais, pourquoi pas, par l'inhibition de l'oxydation de l'hème en hémine. 76 3. 3. 8. Rôle des cytokines inflammatoires (TNF- ; TGF-) Des cytokines inflammatoires (TNF- ; TGF-) sont augmentées chez les patients - thalassémiques ce qui traduit un état inflammatoire chronique (systémique et/ou intra-osseux). Suivant les études, il semble que ces concentrations soient plus élevées uniquement chez des patients -thalassémiques splénectomisés par rapport aux non-splénectomisés et à des contrôles sains. Cependant, comme on va le voir, les données de la littérature sont parfois contradictoires sur le sujet. Le rôle de la splénectomie dans l'augmentation de ces cytokines n'est pas univoque. Ces cytokines pourraient jouer un rôle négatif sur l'érythropoïèse des -thalassémies par analogie avec ce qui est décrit dans les anémies inflammatoires chroniques. Plusieurs travaux montrent une augmentation de la concentration sérique de Tumor Necrosis Factor (TNF-) chez des patients -thalassémiques majeurs. Cette augmentation serait, selon les études, associée (Chuncharunee, J. Med Assoc Thai 1997 ; Del Vecchio, Acta Haematol 2002 ; Gharagozloo, Ann. Hematol. 2009) ou non (Lombardi, Haematologica 1994 ; Meliconi, J. Clin. Pathol. 1992) aux antécédents de splénectomie. L'étude de Wanachiwanawin et col. effectuée chez des patients -E thalassémiques ne précise pas le statut splénectomisé. Elle retrouve une concentration de TNF- supérieure à la normale chez 33% des patients. (Wanachiwanawin, J Interferon Cytokine Res. 1999) Ces auteurs suggèrent que la cause principale d'augmentation du TNF- pourrait être l'activation macrophagique chronique, secondaire à la surcharge en fer et aux stimulations antigéniques, conséquences des transfusions régulières. Le TNF- inhibe l'érythropoïèse physiologique in vitro et in vivo. (Li, Exp. Hematol. 1989 ; Fukaya, Exp. Hematol. 2004 ; Xiao, Exp. Hematol. 2002) Cependant, le mécanisme précis de l'inhibition des progéniteurs érythroïdes n'est pas connu. Le TNF- induit une augmentation d'apoptose des érythroblastes immatures. Il inhibe directement la pousse de colonies BFU-E (Li, Exp. Hematol. 1989 ; Fukaya, Exp. Hematol. 2004 ; Xiao, Exp. Hematol. 2002), alors que l'inhibition des colonies CFU-E est indirecte. Elle passe par l'induction de production d'Interféron- (INF-) par les cellules accessoires. (Means, J. Clin. Invest. 1993) Le TNF- pourrait agir directement sur son récepteur (TNF-Récepteur) exprimé sur les érythroblastes immatures (cf chapitre 3. 3. 3. voies d'apoptose) ou par l'induction, via l'INF-, de la 77 synthèse de céramide (lipide qui inhibe les colonies CFU-E). (Dallalio, Exp. Hematol. 1999) L'action inhibitrice du TNF- sur la maturation érythroïde pourrait aussi passer par l'induction de NF-B (Xiao, Exp. Hematol. 2002) et par l'inhibition de l'expression du complexe GATA-1/FOG-1. (Buck, Int. J. Oncol. 2009) Deux études se sont intéressées à la concentration plasmatique de Transforming Growth Factor-1 (TGF-1) au cours de la -thalassémie, chez l'enfant. Dans la première chez des enfants (a priori -thalassémie intermédiaire mais le phénotype n'est pas renseigné dans l'article), les concentrations sont augmentées uniquement chez les splénectomisés par rapport aux non splénectomisés et à des enfants sains. (Moshtaghi-Kashanian, Cytokine 2006) Une autre étude chez des -thalassémiques majeurs montre une concentration très diminuée par rapport à des enfants contrôles mais l'analyse selon le statut splénectomisé ou non n'a pas été faite. (Stritippayawan, Asian Pac. J. Allergy Immunol. 2005) Une dernière étude sur faible effectif ne semble pas non plus montrer d'augmentation sérique de TGF-. (Pratelli, J. Pediatric Endocrinol. Metab. 2006) Comme nous allons le voir dans le paragraphe suivant, la concentration de GDF15, autre cytokine de la superfamille du TGF-, est aussi très augmentée chez les patients -thalassémiques. (Tanno, Nat. Med. 2007 ; Tanno, Blood 2009) Michal Dussiot dans notre laboratoire a montré qu'il existait chez des patients -thalassémiques majeurs une élévation sérique du GDF-11, faisant également partie de cette famille du TGF-. Or, nous avons vu que le TGF-1 est un inhibiteur de l'érythropoïèse car il agit en accélérant la différenciation ce qui se solde par une diminution de l'expansion cellulaire (puisqu'on laisse moins de temps à des cellules immatures de proliférer). (Zermati, Exp. Hematol. 2000) Le rôle physiopathologique de la famille du TGF- dans la dysérythropoïèse des - thalassémiques n'avait pas été étudié jusqu'aux travaux de thèse de Michal Dussiot chez la souris (article en révision). Nous verrons dans la partie discussion de cette thèse que nous avons aussi réalisé des expériences préliminaires dans l'érythropoïèse in vitro de patients -thalassémiques majeurs qui semblent impliquer le TGF-1 dans l'accélération de la différenciation. Le rôle de cette cytokine pourrait expliquer l'accélération de la différenciation érythroïde chez les patients. Les résultats des études concernant d'autres cytokines inflammatoires dont le rôle physiopathologique est reconnu dans les anémies inflammatoires, (par exemple l'Interleukine-6) sont contradictoires avec parfois des augmentations de 78 concentration, (Chuncharunee, J. Med. Assoc. Thai. 1997 ; Aggelli, Int. J. Cardiol. 2005) parfois aucune différence par rapport aux contrôles. (Lombardi, Haematologica 1994) 3. 3. 9. Autres voies physiopathologiques impliquées dans l'érythropoïèse inefficace 3. 3. 9. 1. Augmentation du nombre de macrophages et de leur activation Comme nous l'avons vu, le nombre et l'activité des macrophages sont augmentés dans la moelle de patients -thalassémiques. (Centis, Blood 2000 ; Angelucci, Haematologica 2002) Ces macrophages activés phagocytent sélectivement les érythroblastes apoptotiques qui expriment un signal de phagocytose (notamment par l'expression membranaire, sur les érythroblastes, de l'exposition à la surface de phosphatidyl sérine). (Angelucci, Haematologica 2002 ; Kuypers, Cell Mol. Biol. 2004 ; Knyszynski, Br. J. Haematol. 1979) Ainsi, des macrophages murins sains phagocytent deux fois plus d'érythroblastes provenant de la moelle de patients - thalassémiques majeurs par rapport à ceux de moelles contrôles. (Angelucci, Haematologica 2002) Cette activation et cet excès macrophagique semblent donc contribuer à l'érythropoïèse inefficace comme vient de le démontrer Ramos et col. qui ont montré que le clodronate (bisphosphonate), en diminuant les macrophages modulait la prolifération et différenciation érythroïde dans des modèles de souris - thalassémiques et sur des cultures cellulaires -thalassémiques humaines in vitro. (Ramos, Nat Med 2013) 3. 3. 9. 2. Réponse à l'érythropoïétine altérée L'Epo est très augmentée en réponse à l'anémie chez les patients -thalassémiques. (Ginzbourg, Blood 2011 ; Chen, J. Pediatr. Hematol. Oncol. 1998 ; Camaschella, Haematologica 1996) C'est d'ailleurs probablement la cause principale de l'expansion érythroblastique observée chez ces patients. (Ginzbourg, Blood 2011) JAK-2 est d'ailleurs fortement exprimé dans des érythroblastes murins et son blocage diminue l'expansion érythroblastique des souris -thalassémiques. (Libani, Blood 2008) Cependant, cette augmentation réactionnelle d'Epo est altérée chez les 79 patients -thalassémiques si on la compare, à concentration d'hémoglobine égale, aux concentrations d'Epo chez des patients avec aplasie médullaire (Manor, Scand. J. Haematol. 1986 ; Cazzola, Blood 1998) ou carencés en fer. (Chen, J Pediatr Hematol Oncol 1998) Les mécanismes de cette plus faible concentration d'Epo que ne le voudrait le degré d'anémie, chez les patients thalassémiques, sont multiples : - clairance accrue de l'Epo secondaire à l'hyperplasie érythroïde. L'augmentation du nombre d'érythroblastes est responsable d'une augmentation de récepteurs à l'Epo qui vont internaliser l'Epo, avec pour conséquence une consommation accrue d'Epo (Camaschella, Haematologica 1996 ; Cazzola, Blood 1998), - inhibition de la synthèse rénale d'Epo par des cytokines inflammatoires (IL-1, IL- 1, TGF- ou TNF-) (Faquin, Blood 1992) comme ce qui est décrit dans les anémies inflammatoires chroniques (Miller, N. Engl. J. Med. 1990), ou par une altération rénale à minima induite par l'hémoglobinopathie. En effet, des altérations néphrologiques, essentiellement tubulaires, sont décrites chez ces patients. (Aldudak, Pediatr. Nephrol. 2000 ; Smolkin, Pediatr. Nephrol. 2008) 3. 3. 9. 3. Surcharge martiale La surcharge martiale est la complication majeure des -thalassémies. (Olivieri, N. Engl. J. Med. 1999) Les transfusions répétées expliquent facilement la surcharge en fer. Cependant des -thalassémies intermédiaires peuvent aussi présenter une surcharge en dehors de toute transfusion. (Olivieri, N. Engl. J. Med. 1999 ; Pippard, Lancet 1979 ; Pootrakul, Blood 1988) Cela s'explique par une baisse de la sécrétion d'hepcidine. Cette hormone essentielle du métabolisme du fer bloque le relargage du fer par les macrophages et inhibe son absorption digestive. La synthèse hépatique d'hepcidine augmente en cas de stimulus inflammatoires et en réponse à la surcharge en fer. (Papanikolaou, Blood 2005) L'hepcidine devrait donc augmenter dans les -thalassémies afin d'empêcher l'absorption digestive. C'est en fait l'inverse qui est observé chez les patients. (Papanikolaou, Blood 2005 ; Kattamis, Haematologica 2006) En effet, deux protéines de la famille du TGF-, nommées growth differentiation factor 15 (GDF15) et twisted gastrulation protein homolog 1 (TWSG) (Tanno, Nat Med 2007 ; Tanno, Blood 2009) répriment la synthèse hépatique d'hepcidine. Les concentrations de ces deux protéines sont très élevées 80 dans le sérum de patients -thalassémiques comparées à celles de contrôles sains. La répression de la synthèse d'hepcidine est due à la dysérythropoïèse. En effet, le GDF-15 est sécrété, au cours de la différenciation érythroïde terminale par les érythroblastes apoptotiques bien différenciés. Son expression est faible mais présente au cours de l'érythropoïèse physiologique. (Tanno, Curr. Opin. Hematol. 2010) De façon opposée, la synthèse de TWSG1 se fait dans les stades précoces de différenciation érythroblastique, avant l'hémoglobinisation. (Tanno, Blood 2009) L'excès de fer libre dans l'organisme est toxique pour la membrane des globules rouges des patients -thalassémiques par l'oxydation qui en découle. Cela participe à la production de ROS. Dans des modèles murins de -thalassémie intermédiaire, Li et col. ont montré qu'en diminuant l'accès au fer des érythroblastes par des perfusions de transferrine, on limitait la formation d'agrégats de chanes toxiques ce qui améliorait l'érythropoïèse inefficace et l'anémie. (Li, Nat. Med. 2010) L'effet néfaste du fer sur les membranes des globules rouges et peut-être sur l'oxydation dans les érythroblastes au cours de l'érythropoïèse inefficace pourrait être amélioré par l'utilisation de chélateur de fer pénétrant dans les érythrocytes comme la deferiprone (Shalev, Blood 1995) ou le deferasirox. (Forni, Haematologica 2013) Plusieurs communications au dernier congrès de l'ASH de 2012 faisaient état d'une amélioration de l'anémie chez des patients traités par ces chélateurs du fer. Un autre mécanisme pourrait faire un lien entre surcharge martiale et érythropoïèse inefficace. En effet, la surcharge en fer chez les patients -thalassémiques majeurs induit de nombreux problèmes endocriniens. Parmi eux, l'hypogonadisme, l'insuffisance corticotrope, l'hypothyroïdie pourraient contribuer à l'anémie centrale des patients. Cependant, ces troubles endocriniens sont le plus souvent correctement substitués, ce qui limite en pratique beaucoup la part de ces complications dans l'anémie des patients. (Tiosano, J. Endocrinol. Invest. 2001) 3. 3. 9. 4. Déficit en acide folique Un déficit en acide folique (et parfois même en vitamine B12) peut être observé chez les patients -thalassémiques du fait d'une surutilisation des folates par l'hyperérythropoïèse. De ce fait, une supplémentation quotidienne en folate est recommandée. (Mazzone, Am. J. Hematol. 2001) 81 Travail expérimental 82 HYPOTHESES ET OBJECTIF Hsp70 est une chaperonne ubiquitaire dont le rôle principal est d'éviter que des protéines mal formées ou dénaturées ne s'agrègent et deviennent toxiques pour les cellules. Nous avons envisagé qu'Hsp70 pourrait jouer cette fonction au cours de l'érythropoïèse des -thalassémies majeures en tentant de détoxifier les chanes d'- globine libres qui sont présentes en grand excès dans le cytoplasme des érythroblastes matures. Cette séquestration cytoplasmique d'Hsp70 par les chanes d'-globine aurait pour effet délétère l'absence de localisation nucléaire d'Hsp70 et en conséquence, la destruction de GATA-1 par la caspase-3 activée. Cela pourrait expliquer l'arrêt de maturation et la mort cellulaire au stade polychromatophile, deux caractéristiques de l'érythropoïèse inefficace des -thalassémies majeures. Cette hypothèse est résumée sur le schéma : en haut la physiopathologie telle qu'elle est considérée à ce jour, en bas, notre hypothèse passant par la séquestration cytoplasmique d'Hsp70. 83 RESULTATS Nous présentons ici l'article soumis à Nature le 1er mars 2013. Critiques des référés reçues le 20 mars 2013. Réponse attendue par l'éditeur dans les 6 mois. Expériences pour la révision, en cours 84 Cytoplasmic sequestration of Hsp70 by excess of free -globin promotes ineffective erythropoiesis in -Thalassemia Jean-Benot Arlet1, 2, 4, 5*, Jean-Antoine Ribeil1, 3, 4, 5*, Adonis Hazoume6, 7, Samuel Demarest8, Isaure Chauvot de Beauchêne8, 9, Olivier Negre10, 11, Michal Dussiot1, 12, Ivan Cruz Moura1, 4, 5, 12, 13, Margaux Sevin6, 7, Thiago Trovati Maciel12, Christian Auclair8, 9, Zakia Belaid-Choucair1, Philippe Leboulch10, 11, Yves Beuzard10, 11, Véronique Baudin-Creuza5, 14, Michaela Fontenay15, Luba Tchertanov8, 9, Carmen Garrido6, 7, 16, Olivier Hermine1, 2, 4, 5, 17*, Geneviève Courtois1, 4, 5* Full institutional mailing addresses : 1 Laboratoire CNRS UMR 8147, Equipe labellisée Ligue contre le Cancer , Hôpital Necker, Paris, France 2 Service de Médecine Interne, Faculté de médecine Paris Descartes, Sorbonne Paris-Cité et Assistance publique-Hôpitaux de Paris, Hôpital européen Georges Pompidou, Paris, France 3 Département de Biothérapie, Faculté de médecine Paris Descartes, Sorbonne Paris-Cité et Assistance publique hôpitaux de Paris, Hôpital Necker, Paris, France 4 Institut Imagine, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris-Cité et Assistance publique- Hôpitaux de Paris, Hôpital Necker, Paris, France 5 Laboratoire d'Excellence des Globules Rouges (GR-ex), Paris, France 6 INSERM, UMR 866, Equipe labellisée Ligue contre le Cancer and Laboratoire d'Excellence LipSTIC, 7 boulevard Jeanne d'Arc, 21000 Dijon, France ; 7 University of Burgundy, Faculty of Medicine and Pharmacy, 21000 Dijon, France. 85 8 CNRS, UMR8113, Ecole Normale Supérieure de Cachan, 61 avenue du Président Wilson, 94235 CEDEX Cachan, France 9 Laboratoire d'Excellence en Recherche sur le Médicament et l'Innovation Thérapeutique (LERMIT), Campus Paris Saclay, France 10 CEA, Institute of Emerging Diseases and Innovative Therapies (iMETI), Fontenay-aux- Roses, France 11 Bluebird bio France, Fontenay-aux-Roses, France 12 INSERM U 699, Hôpital Bichat, Paris, France 13 Faculté de Médecine and Université Denis Diderot Paris VII, Paris, France 14 INSERM U779, Université Paris XI, Le Kremlin-Bicêtre, France 15 Institut Cochin, INSERM U1016, CNRS UMR8104, Université Paris Descartes, and Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, Hôpitaux Universitaires Paris Centre, Hôpital Cochin, Service d'hématologie biologique, 27 rue du Faubourg Saint-Jacques, Paris, France 16 CHU de Dijon, France 17 Service d'hématologie, Faculté de médecine Paris Descartes, Sorbonne Paris-Cité et Assistance publique-Hôpitaux de Paris Hôpital Necker, Paris, France * These authors co-directed this work and contributed equally to this work Address correspondence to : Dr Geneviève Courtois PhD, Centre National de la Recherche Scientifique-Unité Mixte de Recherche 8147, Université Paris V. René Descartes, Hôpital Necker, 161 rue de Sèvres, 75743 Paris, France. Phone : 33-1-44490675 ; Fax : 33-1-4449-0676 ; e-mail : genevieve. courtois@parisdescartes. fr or to : Pr Olivier Hermine, M. D. , Ph. D. , Centre National de la Recherche Scientifique-Unité Mixte de Recherche 8147, Université Paris V. René Descartes, Hôpital Necker, 161 rue de Sèvres, 75743 Paris, France. Phone : 33-1-44490675 ; Fax : 33-1-4449-0676 ; e-mail : ohermine@gmail. com 86 -Thalassemia major (-TM) is an inherited haemoglobinopathy caused by a quantitative defect in the synthesis of the -globin chains of haemoglobin, leading to the accumulation of free -globin chains that form toxic aggregates1, 2. Despite extensive knowledge on the molecular defects causing -TM, little is known about the mechanisms responsible for ineffective erythropoiesis (IE), which is characterised by accelerated erythroid differentiation, maturation arrest and apoptosis at the polychromatophilic stage3-5. We have previously demonstrated that normal human erythroid cell maturation requires a transient activation of caspase-36. Although GATA-1, the master transcriptional factor of erythropoiesis, is a caspase-3 target, we have shown that during human erythroid differentiation, it is protected from cleavage through its association with the chaperone heat shock protein 70 (Hsp70) in the nucleus7. Hsp70 is constitutively highly expressed in normal human erythroid cells7. The best-known role of this ubiquitous chaperone is to participate in proteins folding and refolding of proteins denatured by cytoplasmic stress, thus preventing their aggregation8. Here, we show that during the maturation of human -TM erythroblasts, Hsp70 is sequestrated in the cytoplasm by the excess of free -globin chains, resulting in nuclear GATA-1 cleavage and, in turn, end-stage maturation arrest and apoptosis. A molecular modelling shows that -globin binds to a highly electronegative cavity formed by all Hsp70 domains. Additionally, the transduction of a nuclear-targeted Hsp70 mutant (Hsp70- S400A) or caspase-3 uncleavable GATA-1 mutant (GATA-1) corrects -thalassemia major IE in human cultured -TM cells. 87 To investigate the hypothesis that Hsp70 can be sequestrated in the cytoplasm of mature - TM erythroblasts by binding to free -globin chains of haemoglobin or aggregates, we analysed its subcellular localisation in fresh bone marrow samples from adult TM patients (n 3) and healthy donors (n 3) by confocal microscopy. Erythroid maturation was evaluated by cell size and by -globin staining intensity. We found that Hsp70 was mainly localised in the cytoplasm and that GATA-1 was poorly expressed in the nucleus of mature haemoglobinised erythroblasts from -TM patients, in contrast to controls (Figure 1). Figure 1 : Hsp70 and GATA-1 expression in fresh bone marrow of -thalassemia major patients (-TM). (A) Representative confocal microscopy analysis of -globin, Hsp70 and GATA-1 expression in fresh bone marrow (BM) from 3 adult -TM patients and 3 healthy donors. Scale bar, 5 m. Blue arrows indicate Hsp70 cytoplasmic sequestration into mature -TM cell, and the white arrow shows immature cell. (B) Hsp70 cytoplasmic/nuclear mean fluorescence intensity (MFI) ratio (top) and GATA-1 nuclear MFI (bottom) of -TM and controls. Bars indicate the median (IQR). p values were calculated using the Mann-Whitney U-test. *p 88 Next, to decipher the role of Hsp70 in ineffective erythropoiesis in -TM, we performed an in vitro two-phase amplification liquid culture, allowing the proliferation, survival and erythroid differentiation of -TM (n 16) or control CD34 (n 8) progenitors towards the formation of acidophilic erythroblasts and reticulocytes. During the first phase of amplification, cell proliferation did not differ between thalassemic and control cells. In contrast, during the second phase, corresponding to erythroid terminal differentiation and maturation, at day 8, we observed, in -TM, an accelerated differentiation characterised by a higher percentage of polychromatophilic cells (26. 2% 8. 4 vs. 9. 0% 2. 7 ; p 0, 003) (Figure 2A), an accelerated down regulation of the early erythroid marker KIT/CD117 (mean fluorescence intensity (MFI) 25. 7 17 vs. 115. 1 47. 1 ; p 0. 0001) and an up regulation of GPA (MFI 243. 8 87. 8 vs. 178. 9 56, p 0. 04) (Supplemental Figure 1). 89 Supplemental Figure 1. The kinetics of differentiation of -TM and control progenitors. CD36 cells derived from CD34 -TM peripheral blood cells (n 16 independent experiments, 7 patients) or healthy peripheral blood cells (controls, n 8) were cultured with a two-phase amplification liquid culture system, as described. Day 0 of differentiation is the start of CD36 cell culture, which represents the differentiation phase of our culture system. Differentiation staining was assessed daily by flow cytometry. (A) Upper : differentiation curves assessed by Glycophorin A (GpA) mean fluorescence intensity (MFI). Lower : differentiation curves assessed by c-KIT/CD117 staining mean fluorescence intensity (MFI). The results are means (SEM). p values compare -TM and control-derived cells differentiated at day 8 and were calculated using t-tests. *p *p (B) One representative flow cytometry image of the stage of erythroid differentiation at day 8 of culture is shown for -TM (upper panel) and control-derived cells (lower panel). GpA /CD117- cells represent mature erythroid cells. 90 At the time of intense haemoglobinisation (d8-d10), in -TM cells, apoptosis was increased (at d10, 38. 2% 15. 1 vs 18. 5% 8. 7 ; p 0. 01) (Figure 2B) and terminal maturation was arrested at the polychromatophilic stage. To quantify this maturation arrest, we defined an index of terminal maturation as the number of (acidophilic cells reticulocytes per slide) 100 / number of polychromatophilic cells per slide. At day 8, this index was significantly decreased in -TM cells, to 16% (IQR 8. 8-27. 8) compared to 37. 6% in control cells (IQR 24. 4-70. 7 ; p 0. 009) (Figure 2A). Taken together, our system of cell culture reproduced the characteristics of IE observed in -TM, namely accelerated differentiation, maturation arrest and the death of mature haemoglobinised cells3-5. Next, we analysed the subcellular localisation of Hsp70 at several time intervals in -TM patients (n 7) and healthy donors (n 7) by confocal microscopy. In agreement with what we observed in fresh primary bone marrow erythroblasts, Hsp70 was detected in the nucleus of control cells but was absent or only weakly expressed in mature haemoglobinised -TM cells. Thus, at day 8, the ratio of cytosoplasmic/nuclear Hsp70 MFI in -TM erythroblast cells was significantly increased, with a median ratio of 2. 3 (IQR 1. 6-3) compared to 1. 1 in control cells (IQR 0. 7-1. 6 ; p (Figure 2C). As a result, GATA-1 was poorly expressed in the nucleus of mature haemoglobinised -TM erythroblasts (Figure 2C), thus supporting our hypothesis. To further analyse and understand the link between haemoglobinisation, Hsp70 localisation and the decrease in GATA-1 expression, we studied the changes in the expression of these proteins during differentiation and maturation. We observed that in -TM derived cells, the intensity of nuclear Hsp70 and GATA-1 staining decreased with erythroid differentiation and maturation, while these increased in controls (Figure 2D). 91 Figure 2 92 Figure 2 : The characteristics of ineffective erythropoiesis in -TM and the kinetics of Hsp70 and GATA-1 expression during in vitro erythroid differentiation. CD36 cells derived from CD34 adult -TM peripheral blood cells (n 16 independent experiments, 7 patients) or healthy peripheral blood cells (controls, n 8) were cultured with a two-phase amplification liquid culture system, as described in Methods section. Day 0 of differentiation is the start of CD36 cell culture and represents the differentiation phase of our culture system. (A) May-Grnwald-Giemsa staining at day 8. Left panel. A representative morphological analysis (40) of erythroid differentiation is shown. Solid black arrows indicate reticulocytes, dashed blue arrows represent acidophilic cells, and dotted red arrows represent polychromatophilics cells. Upper middle panel : graph represents proportion of each erythroid stage in -TM or control-derived cells. Proeryhtroblast (ProE) basophilic (baso), polychromatophilics (Poly) cells and very mature cells-acidophilic cells (Acido) reticulocytes (Retic) are expressed as a percentage of the total erythroid cells. Bars indicate the mean SEM for 14 independent experiments. p values were calculated using t-tests. *p *p Lower middle panel : graph represents the terminal maturation index of -TM and control-derived cells, as calculated by (acidophilic cells reticulocytes per slide) 100/ polychromatophilic cells per slide. The box and whiskers indicate the median- extremes. *p (B) Upper : apoptosis curves assessed daily by flow cytometry analysis of Annexin-V (AV) staining (mean percentage SEM of AV positive, Propidium Iodide (PI) negative cells). Lower : differentiation curves assessed by benzidine staining. The results are the means of 17 independent experiments (mean percentage SEM of positive cells). (C) Left : representative confocal microscopy analysis of Hsp70, GATA-1 and -globin at day 8. Right : Hsp70 cytoplasmic/nuclear MFI ratio and nuclear GATA-1 MFI of -TM and control-derived cells. Bars indicate the median (IQR) of 15 independent experiments. p values were calculated using the Mann-Whitney U-test. *p The merged panel shows Hsp70 and -globin co-localisation in the cytoplasm (yellow). (D) Kinetics of Hsp70 and GATA-1 expression in vitro. Hsp70 cytoplasmic/nuclear MFI ratio and GATA-1 nuclear MFI were analysed at days 3, 5 and 8 of culture in 3 -TM patients and 3 controls. Bars indicate the median (IQR). p values were calculated using the Mann-Whitney U-test. *p *p *p 93 To demonstrate that Hsp70 could act as a molecular chaperone of free -globin chains, we first analysed the subcellular localisation of both proteins by co-immunofluorescence experiments (n 7). From day 6 of culture, Hsp70 and -globin were co-localised in the cytoplam of -TM erythroblasts. Features of aggregates were sometimes observed in differentiated, haemoglobinised cells, with one typical picture shown in Figure 2C. Co- localisation was assessed using the average Pearson's correlation coefficient (PCC). At day 8, an apparent high level of co-localisation between Hsp70 and -globin was detected, both in - TM (PCC 0. 4 0. 13) and in controls (PCC 0. 31 0. 09). This finding was confirmed by Van Steensel's approach (data not shown). Similar findings were observed in fresh bone marrow experiments from patients and healthy donors (data not shown). To further characterise this co-localisation, we used a close in situ proximity ligation assay (Duolink), which allows the identification of interacting proteins by fluorescent spots. At day 8, we detected spots in -TM mature haemoglobinised cells (n 3) but much less so in controls. Additionally, cells containing abundant Hsp70/-globin complexes were apoptotic (Figure 3A). Next, using a yeast two-hybrid system, we sought to provide additional evidence for the biochemical interaction of Hsp70 with the human -globin chains. In our assays, the entire coding sequence of human Hsp70 was used as bait. Blue diploid transformants could be detected on a high stringency minimal medium, indicating a direct interaction between Hsp70 and the -globin chains. Similar results were obtained when the -globin coding sequence was used as prey, indicating that both the - and -globin chains could interact with Hsp70 (Figure 3B). To identify the Hsp70 domains involved in this interaction, we tested the binding of -globin chains to deletion mutants of Hsp70 that expressed either the Nucleotide Binding Domain (NBD) or the Substrate Binding Domain (SBD) of Hsp70 (Figure 3B). Interestingly, neither of these two deletion mutants interacted with the -globin chain, suggesting that the 94 entire structure of Hsp70 is required for the recognition of -globin. To better characterise this interaction, we performed an in silico study involving molecular modelling, docking and molecular dynamics simulations. The -globin was docked onto a homology-generated model of Hsp701-701. We found that -globin binds to a highly electronegative cavity formed by the NBD, SBD and lid (a C-terminal 10 kDa helical subdomain of the SBD) (Figure 3C). The resulting Hsp701-701/-globin complex is stabilised by extensive protein-protein interactions mediated mainly by multiple hydrogen bonds engaging the three structural domains of Hsp70 (data not shown). Thus, the binding of -globin to Hsp70 crucially modulates the chaperone structure and the interdomains interaction between NBD-lid and NBD-SBD. Finally Hsp70/-globin complex was also evidenced by immunoprecipitation assays (supplemental Figure 3). 95 Figure 3 96 Figure 3 legend : Hsp70 and -globin interaction. (A) Duolink in situ proximity ligation assay (PLA). Interactions were analysed at day 8 in CD36 -TM or control-derived cell cultures by PLA, according to the manufacturer's instructions using Hsp70 (1 : 200) and -globin (1 : 200) antibodies. A FITC-conjugated Annexin-V antibody (1 : 200) was added at the end of the Duolink assay. The red spots indicate close proximity ( nm) between cellular bound antibodies. A representative experiment is shown (n 3). Nuclei are stained with DAPI (blue), and Annexin-V staining is shown in green. Scale bar, 5 m. (B) Yeast two-hybrid assay detected, in upper panel, a direct interaction of - and -globin chains with Hsp70 (blue diploid yeast cells), but not, in lower panel, with the Hsp70 deletion mutants, Hsp70-Nucleotide Binding Domain (NBD) or Hsp70-Substrate Binding Domain (SBD). Each section contains diploid yeast cells resulting from an independent yeast mating experience with the corresponding bait protein and prey protein. The empty vectors, pGADT7 and pGBKT7, are used as negative controls. SV40 and p53 coding sequences are used as positive controls. (C) Structural modelling of Hsp70 and the Hsp701-701/-globin complex. In the upper panel, from left to right, are the molecular surface and cartoon representation of the generated models of Hsp70, the Hsp70/-globin complex and their superimposition. The different Hsp70 domains are labelled and highlighted in colour. The lid is shown in red, the SBD is shown in green, the NBD is shown in blue, the hinge region between the NBD and the SBD is shown in violet, and -globin is shown in yellow. The superimposed models are presented in transparent (Hsp70) and contrast (Hsp70/-globin complex) modes. The lid and SBD movements are shown by arrows. The haem group and ADP are shown by space-filling models. In the lower panel, from left to right, are the electrostatic potential of the molecular surfaces of the Hsp701-701/-globin complex, where Hsp70 and -globin are shown in colour, from red (electronegative) through white (neutral) to blue (electropositive). The -globin in the Hsp701-701/-globin complex is shown in yellow for clarity. -globin is rotated 180 respectively to its position in the Hsp701-701/-globin complex, and its image is flipped horizontally to show the charge distribution on the surface interacting with Hsp70. 97 Altogether, our findings indicate that, in addition to Alpha Haemoglobin Stabilising Protein (AHSP), which stabilises the -globin chains9, Hsp70 could act as a novel chaperone of - globin chains. However, this apparent cytoprotective function of Hsp70 might be detrimental during stages of high haemoglobinisation and globin chain imbalance in -TM by preventing the nuclear localisation of Hsp70 and, consequently, its function in protecting GATA-1 from cleavage by caspase-3. To investigate the contribution of Hsp70 cytoplasmic sequestration to the pathophysiology of -TM IE, we used lentiviral transduction to restore Hsp70 expression in the nucleus of -TM erythroblasts. For this purpose, -TM CD34 cells (n 3) were transduced with lentiviruses expressing a nuclear-targeted Hsp70 mutant (Hsp70-S400A)10, wtHsp70, or an empty lentivector. As expected, at day 7 of the differentiation phase of culture, Hsp70-S400A (Figure 4A) and wtHsp70 (not shown) lentivectors increased nuclear Hsp70 localisation and rescued GATA-1 expression in -TM erythroid cells. The restoration of nuclear Hsp70 localisation efficiently improved the terminal maturation of -TM erythroblasts. At day 7, in Hsp70-S400A transduced -TM erythroblasts, the percentage of mature cells (acidophilic cells and reticulocytes) was increased when compared to the empty vector control (10. 6 3. 2% vs 1. 1 0. 7%, p 0. 01 Figure 4B). Similarly, the terminal maturation index was increased (28. 1% (IQR 28. 1-51. 3) vs 4. 6% (IQR 1. 7-6. 7) ; p 0. 01). In addition, rescuing nuclear Hsp70 localisation induced a dramatic two-fold decrease in apoptosis (9. 9 2. 8% vs 20. 7 5. 6% ; p (Figure 4C). Next, to analyse the consequences of GATA-1 cleavage on the maturation arrest and apoptosis observed in cultured -TM erythroblasts, we transduced -TM CD34 cells with a GATA-1 mutant that was uncleavable by caspase-3 (GATA-1)11 or a GFP empty vector. The GATA-1 mutant had a positive effect on erythroid terminal maturation that was similar to that of Hsp70-S400A (Figure 4A-D). Conversely, apoptosis was not corrected indicating that cleavage of GATA-1 contributes to 98 impair the erythroid maturation but to a less extent to apoptosis of -TM cells, as previously reported in low grade myelodysplastic syndromes10. Foetal haemoglobin (HbF, 22), which is replaced after birth by the adult haemoglobin (HbA, 22), is concentrated in a few F cells and represents less than 1% of the haemoglobin content in healthy adults12. In -TM patients, there is an elevation in the proportion of F cells to compensate for the lack of -chain synthesis, and the only surviving mature erythroblasts are F cells. GATA-1 has a major role in regulating the haemoglobin gene expression ; it is sometimes described as a transcription repressor or activator of the human -globin chains gene14-16. As such, we studied the effect of GATA-1 nuclear restoration on HbF expression by flow cytometry. At day 7, we observed that while the number of F cells decreased with maturation (data not shown and 17), the percentage of HbFhigh cells, as assessed by flow cytometry, was significantly increased concomitantly with the protection of GATA-1 by Hsp70-S400A (54. 8% 12 vs 45. 9% 10. 5 ; p (n 3) and in GATA-1 transduced erythroblasts (51. 48. 2% vs 40. 59. 4 % ; p (n 3) (Figure 4D). 99 Figure 4 100 Figure 4 legend : The transduction of a nuclear Hsp70 mutant (Hsp70-S400A) or a caspase-resistant GATA-1 mutant (GATA-1) rescues cell terminal maturation and cell survival in -thalassemia major (-TM). -TM CD34 cells were transduced with a nuclear-targeted Hsp70 lentiviral mutant (Hsp70- S400A), a retroviral mutant of GATA-1 uncleavable by activated caspase-3 (GATA-1), and their appropriate empty vectors as controls and were cultured as described in the methods. CD36 /GFP cells were then purified, cultured, and differentiated in Epo-containing medium. All data presented here were analysed at day 7 of the CD36 culture. (A) A confocal microscopy image of Hsp70 and GATA-1 is shown in the left panel. The image is representative of three experiments. Graphs in the right panel represent the nuclear mean fluorescence intensity (MFI) of Hsp70 and GATA-1 ( 95% CI) in transduced and control cells (top panel : Hsp70-S400A transduced cells ; bottom panel : GATA-1 transducted cells) (20 cells were analysed in three different fields/slide, n 3 patients). Scale bar, 5 m. p values were calculated using Mann-Whitney U-test. *p (B) May-Grnwald-Giemsa (MGG) staining at day 7. Left panel : Graphs represent proportion of each erythroid stage in transduced and control -TM cells (upper panel, Hsp70-S400A ; lower panel, GATA-1). Proeryhtroblast (ProE) basophilic (baso), polychromatophilics (Poly) cells and very mature cells-acidophilic cells (Acido) reticulocytes (Retic) are expressed as a percentage of the total erythroid cells. Bars indicate the mean SEM for 3 independent experiments. p values were calculated using t-tests. Right panel : one representative morphological analysis of the erythroid differentiation for each transduction (n 3) is shown (100). Solid black arrows indicate reticulocytes, dashed blue arrows indicate acidophilic cells, and dotted red arrows indicate polychromatophilic cells. (C) Apoptosis in the GFP /propidium iodide- cell population was assessed by Annexin V binding by flow cytometry. A representative experiment of each transduction is shown (n 3 patients/transduction). (D) The percentage of HbFhigh cells was assessed by flow cytometry on mature cells (GFP and low forward light scatter-FSC). A representative experiment of each transduction is shown (n 3 patients/infection). 101 Finally, to ensure the specificity of our findings, we lentivirally transduced -TM CD34 cells with the -globin gene and found that this led to Hsp70 nuclear re-localisation, GATA-1 protection (Suppl Figure 2), and the restoration of normal erythroid maturation (not shown). Supplemental Figure 2. The lentiviral transduction of -TM CD34 cells with the -globin gene rescues Hsp70 nuclear localisation and GATA-1 protection. -TM CD34 cells derived from peripheral blood cells were infected with a lentivirus encoding the -globin gene or a control virus. They were then cultured with a two-phase amplification liquid culture system, as described. Confocal microscopy analysis at day 8 of the CD36 cell culture shows Hsp70 nuclear localisation and GATA-1 expression in -globin gene transduced cells (top) and control transduced cells (bottom). Scale bar, 10 m. 102 Conclusion : Taken together, our data demonstrate that the cytoplasmic sequestration of -globin chains by Hsp70 prevents their nuclear localisation. This is a key mechanism inducing the IE observed in -TM patients. Our modelling studies suggest that Hsp70 could have been selected during evolution to serve as a specific chaperone of globin chains to protect early erythroblasts during erythroid differentiation. Our structural model of the Hsp701-701/-globin complex provides a new rationale for a targeted therapy in -thalassemia major IE. Small compounds disrupting the Hsp70/-globin complex in the cytoplasm may increase the nuclear localisation of Hsp70 and may thus reduce maturation arrest and increase the number of F cells. Ultimately, these outcomes may decrease the patients' requirement for a blood transfusion and the associated complications, including iron overload. 103 Methods Summary Erythroid cells were generated in vitro from the peripheral blood circulating CD34 cells from 7 adult patients with 0-TM or 8 healthy donors. Fresh normal bone marrow cell smears were obtained from 3 adult patients with 0-TM who had undergone cholecystectomy or splenectomy, or 3 healthy controls (allogenic bone marrow donors), after they had given written informed consent. This study was performed according to the Helsinki Declaration with the approval from the ethics committee of our institution. Erythroid cells in culture were generated as previously described6, 7. Details of the reagents and protocols for cell proliferation and differentiation analysis, confocal fluorescence microscopy analysis, molecular modelling, docking and molecular simulations, yeast-two hybrid assays, the production of lentiviral particles and the transduction of haematopoietic progenitors, and the generation of Hsp70 and GATA-1 mutants are provided in the Supplementary Methods. Statistical analyses were performed using GraphPad PrismTM software. Data are expressed as the mean standard deviation (SD) or median (interquartile range-IQR), unless noted otherwise. Student's paired t-test or Mann-Whitney U-test was used as appropriate. * p value * p value * p value REFERENCES 1. Khandros, E. & Weiss, M. J. Protein Quality Control During Erythropoiesis and Hemoglobin Synthesis. Hematology/Oncology Clinics of North America 24, 1071 1088 (2010). 2. Ginzburg, Y. & Rivella, S. -thalassemia : a model for elucidating the dynamic regulation of ineffective erythropoiesis and iron metabolism. Blood 118, 43214330 (2011). 3. Yuan, J. et al. Accelerated programmed cell death (apoptosis) in erythroid precursors of patients with severe beta-thalassemia (Cooley's anemia). Blood 82, 374377 (1993). 104 4. Mathias, L. A. et al. Ineffective erythropoiesis in -thalassemia major is due to apoptosis at the polychromatophilic normoblast stage. Experimental Hematology 28, 13431353 (2000). 5. Centis, F. et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with -thalassemia major. Blood 96, 36243629 (2000). 6. Zermati, Y. et al. Caspase Activation Is Required for Terminal Erythroid Differentiation. J Exp Med 193, 247254 (2001). 7. Ribeil, J. -A. et al. Hsp70 regulates erythropoiesis by preventing caspase-3-mediated cleavage of GATA-1. Nature 445, 102105 (2007). 8. Hartl, F. U. , Bracher, A. & Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature 475, 324332 (2011). 9. Kihm, A. J. et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free alpha- haemoglobin. Nature 417, 758763 (2002). 10. Frisan, E. et al. Defective nuclear localization of Hsp70 is associated with dyserythropoiesis and GATA-1 cleavage in myelodysplastic syndromes. Blood 119, 15321542 (2012). 11. De Maria, R. et al. Negative regulation of erythropoiesis by caspase-mediated cleavage of GATA-1. Nature 401, 489493 (1999). 12. Dover, G. J. & Boyer, S. H. Fetal hemoglobin-containing cells have the same mean corpuscular hemoglobin as cells without fetal hemoglobin : a reciprocal relationship between gamma- and beta-globin gene expression in normal subjects and in those with high fetal hemoglobin production. Blood 69, 11091113 (1987). 13. Yao, X. et al. Role of STAT3 and GATA-1 interactions in gamma-globin gene expression. Exp. Hematol. 37, 889900 (2009). 14. Woon Kim, Y. , Kim, S. , Geun Kim, C. & Kim, A. The distinctive roles of erythroid specific activator GATA-1 and NF-E2 in transcription of the human fetal -globin genes. Nucleic Acids Res 39, 69446955 (2011). 15. Zhu, J. et al. Recombinant erythroid Kruppel-like factor fused to GATA1 up- regulates delta- and gamma-globin expression in erythroid cells. Blood 117, 3045 3052 (2011). 16. Sankaran, V. G. & Orkin, S. H. The Switch from Fetal to Adult Hemoglobin. Cold Spring Harb Perspect Med 3, (2013). 17. Bhanu, N. V. et al. A sustained and pancellular reversal of gamma-globin gene silencing in adult human erythroid precursor cells. Blood 105, 387393 (2005). 105 18. Zermati, Y. et al. Transforming growth factor inhibits erythropoiesis by blocking proliferation and accelerating differentiation of erythroid progenitors. Exp. Hematol. 28, 885894 (2000). Acknowledgments Dr Jean-Benot Arlet was a recipient of grants from the Société Nationale Française de Médecine Interne (SNFMI), Société Française d'Hématologie (SFH), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) and Assistance Publique Hôpitaux de Paris (AP-HP) (poste d'accueil APHP-CNRS), and from Groupe Pasteur mutualité. S Demarest was a recipient of funding from Institut FARMAN (ENS de Cachan). I. Chauvot de Beauchêne was a recipient of a PhD scholarship fund from ENS de Cachan. A. Hazoume was a recipient of a post- doctoral grant from the Conseil Régional de Bourgogne and M. Sevin from l'Institut National du Cancer, INCa. This work is supported by Agence Nationale pour la Recherche (ANR), Ligue nationale contre le cancer, Fondation pour la recherche médicale, (FRM), Fondation de France. We would also like to thank N. Goudin and R. Desvaux from the Plateforme d'imagerie cellulaire de l'IFR94, Faculté de Médecine Nécker (Paris, France) for experimental help in image acquisition and analysis on confocal microscopy and the Department of Biotherapy at the Nécker Hospital (Paris, France) for providing blood samples. We thank E. Frisan from the Department of Haematology and INSERM U1016, Hôpital Cochin, Paris for the gift of Hsp- S400A mutant. We thank Dr U. Testa, A. Zeuner, and R. de Maria from the Department of Haematology and Oncology, Instituto Superiore di Santia, Rome, Italy, for the gift of cDNAs of GATA-1. 106 Author contributions J-B. A. designed and performed all experiments, analysed the data and wrote the manuscript. J-A. R. designed the study, supervised the overall project, analysed the data, provided human samples and helped to write the manuscript. A. H. , M. S. , C. G. and V. B-C. performed the yeast two-hybrid assays, analysed the data and helped to write the manuscript. S. D. , I. C. B, L. T. and C. A. performed the molecular modelling, docking and molecular simulations, and helped to write the manuscript. M. D. , I. C. M. and T. T. M. analysed the data and helped to write the manuscript. O. N, P. L. and Y. B. performed the -globin gene lentiviral transduction. O. H. designed the study, supervised the overall project, analysed the data and wrote the manuscript. G. C. performed experiments, supervised the overall project, analysed the data and wrote the manuscript. Author information Information regarding reprints and permissions is available at All authors declare no competing financial interest for this work. Correspondence and requests for materials should be addressed to jean- benoit. arlet@egp. aphp. fr 107 Additional Online Methods Erythroid liquid culture The circulating peripheral blood of -TM patients contains a small number of hematopoietic progenitor cells19. Erythroid cells were also generated in vitro from peripheral blood circulating CD34 cells from adult patients with 0 thalassemia major (-TM), which were collected before routine transfusion, or from control patients who were healthy donors treated with G-CSF to induce hematopoietic stem cell mobilisation. This study was done according to the Helsinki Declaration with the approval from the ethics committee of our institution (Comité de Protection des personnes (CPP) Ile de France II). All patients gave written informed consent. In the first step of culture (cell expansion), isolated CD34 progenitors (Miltenyi CD34 Progenitor Cell Isolation Kit) were grown in the presence of 100 ng/ml IL-6, 10 ng/ml IL-3 and 100 ng/ml SCF for 7 days. At day 7, CD36 erythroid progenitors were isolated by magnetic isolation (Miltenyi Biotec). In the second phase of culture, which allows the differentiation and maturation of erythroblasts, CD36 cells were cultured in the presence of 10 ng/ml IL-3, 100 ng/ml SCF and 2 U/ml Epo in IMDM (Gibco cell culture) supplemented with 15% BIT 9500 (Stem Cell Technologies), as previously described6, 7. Apoptosis assay and cell differentiation Apoptosis was assessed by Annexin V binding and propidium iodide (PI) staining (e- bioscience). Early apoptotic cells were defined as Annexin-V positive and PI negative. Differentiation was assessed by various methods. First, morphological analysis after May- Grnwald-Giemsa (MGG) staining was used. Cells were examined under a Leica DMRB microscope with a PLFluotar 40 oil objective in a blinded fashion. The number of proerythroblasts, basophilic, polychromatic, acidophilic erythroblasts and reticulocytes was 108 assessed in each experiment by counting approximately 300 cells in consecutive oil immersion fields and expressed as a percentage of total cells. Additionally, differentiation was assessed by calculating a terminal maturation index on MGG, defined by the number of acidophils reticulocytes per slide 100/ number of polychromatophilic cells per slide. This allowed us to better characterise the maturation arrest at the polychromatophilic stage, which is known to be a hallmark of ineffective erythropoiesis4, and its modulation. We also measured the haemoglobin content, as assessed by benzidine staining. Flow cytometry analysis was also performed each day after double labelling with a phycoerythrin (PE)- conjugated anti-GPA (BD Pharmingen) antibody and an APC-conjugated anti-CD117 (c-kit) (e-bioscience) antibody. The percentage of GPA /CD117- cells represented mature erythroid cells20. F cells were evidenced by flow cytometry analysis. The cultured cells were fixed and permeabilised, washed with 1X PBS/1% BSA and then stained with PE-conjugated anti- human haemoglobin F (HbF) (BD Pharmingen) for 30 min at room temperature. The cells were then analysed with a FACSCaliburTM (Becton Dickinson). Analysis of the Hsp70/alpha-globin complex Yeast two-hybrid assay The bait vector used was pGBKT7, and the prey vector was pGADT7 (Clontech). The human - and -globin coding sequences were cloned into the EcoRI/BamHI and NdeI/ClaI sites, respectively, of the pGADT7. The coding sequence of the human Heat Shock Protein 70 (Hsp70) was cloned into the EcoRI/BamHI sites of the pGBKT7. An N-terminal nucleotide binding-domain (NBD) (residues 1-380) and a C-terminal substrate binding-domain (SBD) (residues 394-615) were cloned in pGBKT7. The pGBKT7-p53 plasmid was used as a 109 positive bait control. This plasmid encodes the GAL4 DNA-BD fused with murine p53. As a positive control prey plasmid, pGADT7-SV40, which encodes the GAL4 activation domain fused with SV40 large T-antigen, was used. The empty vector, pGADT7, was used as a negative control prey plasmid. All pGADT7- and pGBKT7-derived vectors were transformed into Y187 and Y2HGold yeast strains, respectively (Clontech Yeastmaker Yeast Transformation System 2). After growth at 30C for 3 to 5 days, the transformants were selected on Leu and Trp minimal media plates, respectively. Each prey strain was mated with the bait strain to generate diploid yeast cells (Clontech Matchmaker Gold Yeast 2- Hybrid system). Diploid yeast cells selected on Leu Trp minimal media plates were then patched onto Leu Trp minimal media plates with X-Galactosidase (40 g/mL) and Aureobasidin A (70 ng/mL). Blue diploid cells appeared after 3 to 5 days at 30C, indicating the interaction between the bait and the prey proteins. To confirm these results, the diploid yeast cells were then patched onto higher stringency His Ade Leu Trp minimal media plates supplemented with 40 g/mL X-Galactosidase and 70 ng/mL Aureobasidin A. Confocal analysis Cell permeabilisation and labelling for fluorescence microscopy : The cells were washed, spun onto slides, fixed with acetone, hydrated with cold 1X PBS/1% BSA for 30 minutes, treated with formaldehyde (Sigma) for 15 minutes, and then with methanol (Prolabo) for 10 minutes at room temperature. Next, the cells were permeabilised with 1X PBS/0. 2% Triton X100 (Sigma) for 10 minutes at 4C, washed with 1X PBS/1% BSA and incubated in 3% BSA for 30 min. They were then sequentially incubated with the antibodies as follows : anti-GATA-1 overnight at 4C, anti-rat-Cy3 for 45 minutes at room temperature, rabbit anti-Hsp70 or anti-caspase-3 for 1 hour at room temperature, anti-rabbit Alexa 647 for 45 minutes at room temperature and anti-haemoglobin-FITC (Abcam) for 60 110 minutes at room temperature. All antibodies were diluted in 1X PBS/1% BSA/0. 1% Tween (Sigma). Nuclei were stained with DAPI, and the slides were examined with a confocal laser microscope (LSM 510 Carl Zeiss). Fresh, normal, bone-marrow cell smears were fixed with acetone. Permeabilisation and labelling with anti-GATA-1, anti-Hsp70 and anti- globin antibodies were performed as above. To more precisely analyse the Hsp70/-globin interaction, we used the Duolink II technology (Olink Bioscience), which is an in situ proximity ligation assay technology. In this assay, a pair of secondary antibodies labelled with oligonucleotides (PLA probes) only generates a signal when the two probes are bound in close proximity (< 40 nm). The signal from each detected pair of PLA probes is visualised as an individual fluorescent spot21. Slides were incubated with primary antibodies as described above and with secondary antibodies conjugated with oligonucleotides (PLA probe MINUS anti-mouse and PLA probe PLUS anti- rabbit). Ligation and amplification reactions were performed according to the manufacturer's instructions. Molecular modelling, docking and molecular dynamics (MD) simulations All calculations were carried out on a PC station and on the Meso Center of ENS de Cachan running Linux CentOs 5. 2. Figures were produced with the PyMOL molecular graphics system22, and R was used for statistical computing23. The template structures for homology modelling were retrieved from the Protein Data Bank (PDB)24. Molecular modelling - Hsp70 : The 3D model of the full-length human Hsp701-701 was generated from partial structures (X-ray or RMN) by homology modelling of the separate Hsp70 domains and molecular complex Hsp110Hsp70 (PDB codes : 3C7N 25, 2QWL 26, 3FE1 27 and 2LMG 28). 111 The sequence of Hsp701701 was aligned to the template sequences with ClustalW29 and Modeller30. The interdomain linkers were constructed by ab-initio loop generation using Modeler. - -globin : The initial structural data of -globin was taken from the X-ray structure (PDB code : 3S66 31) and was docked onto the generated model of Hsp701-701 using three algorithms : Zdock32, FlexDock33 and HingeProt34. The minimised structure (CHARMM)35 of the Hsp701-701/-globin complex was analysed for hydrophobic and electrostatic complementarities and H-bond interactions on the interface of the proteins. The ADP-Mg2 and Haem Fe2 were incorporated into proteins. Molecular Dynamics (MD) simulations Molecular Dynamics (MD) simulations were performed using GROMACS 4. 5. 4 36 with CHARMM 27 force field. Each generated model, Hsp70 or the Hsp701-701/-globin complex, was solvated in a TIP3P water box with a minimum distance of 15 from the edge of the box to any protein atom. The charges of the system were neutralised by adding counterions (Na or Cl-). The solvated systems were first minimised for 1, 000 steps with the protein atoms restrained, followed by another 3, 000 steps of minimisation with all atoms allowed to move. The temperature of each system was then increased to 300 K by increments of 0. 001 K during 2 ps. The system was further equilibrated under constant volume and temperature (NRT) conditions for 100 ps constraining protein backbone atoms, followed by 500 ps equilibration without constraints under constant pressure and temperature (NPT) at 300 K and 1 bar. Production simulations were performed for 20 ns in the NPT ensemble. Short-range interactions employed a switch function with a 12 cut-off and a 10 switch distance, and the long-range electrostatic interactions were calculated with the Particle Mesh Ewald 112 protocol37. During production simulations, the time step was 2 fs, with a SHAKE constraint on all bonds containing hydrogen atoms. Viral transduction Lentiviral production The nucleus-targeted Hsp70 mutant (Hsp70-S400A) was cloned in the pTrip U3EF1 lentiviral vector upstream of an IRESECMVGreen Fluorescent Protein (GFP) cassette. Infectious vector particles were produced in 293T cells by cotransfection of the vector with the encapsidation plasmid psPAX2 and the expression plasmid pHCMV-G, using the jetPRIMETM transfection reagent (Polyplus). Supernatants were collected 48 hours and 72 hours after transfection and were pooled and concentrated by ultracentrifugation. Virus stocks were kept frozen at -80C. For the lentivirus production of the -globin gene, vesicular stomatitis virus glycoprotein pseudotyped lentiviral supernatant was produced by transient transfection of HEK293T cells with the 5-plasmid system (LentiGlobin construct, HPV 275-gag-pol plasmid, N 15-vsvG env plasmid, p633-rev plasmid, HPV601-tat plasmid) by calcium phosphate coprecipitation in Dulbecco's modified Eagle's media supplemented with 5% foetal bovine serum (Invitrogen), followed by harvest in CellGro SCGM serum-free media (CellGenix) after 48 h. Concentrated virus was then frozen and stored at -80C. Retroviral production Uncleavable mutant GATA-1 (GATA-1) was cloned in PINCO vector upstream of a CMV promoter-Green Fluorescent Protein (GFP) cassette, which was a generous gift from R. De Maria Rome, Italy. These were used to produce vector particles by cotransfection of 293EBNA cells with the vector plasmid, an encapsidation plasmid (gag-pol) lacking all 113 accessory HIV-1 proteins, and an expression plasmid (pHCMV-G) encoding the vesicular stomatitis virus (VSVg) envelope, using jetPRIME TM transfection reagent. Infection of erythroid cells Hsp70-S400A and GATA-1 transduction : CD34 cells isolated from -TM peripheral blood mononuclear cells were cultured for 5 days, as described above. They were then infected by lentiviruses or retroviruses, in the presence of 4 g/mL protamine sulphate. A second round of infection was performed 24 hours later, upon changing to fresh medium with cytokines. After an additional 24 hours, cells were extensively washed in PBS and stained with the anti- CD36-APC mAb (BD Pharmingen). The CD36 /GFP cell population was purified by cell sorting and cultured for 7 to 10 additional days in serum-free medium in the presence of IL3 SCF EPO, as described above. -globin gene lentivirus transduction : CD34 cells were isolated from -TM peripheral blood mononuclear cells by magnetic sorting (Miltenyi Biotec). Sorted cells were prestimulated for 24 h in CellGro SCGM media supplemented with 100 ng/mL hSCF, 100 ng/mL hTPO, 100 ng/mL hFlt3L and 60 ng/mL hIL-3 at 37C and 5% CO2. Then, prestimulated cells were transduced for 22 h with the LentiGlobin vector at an MOI of 50 in CellGro SCGM media supplemented with 100 ng/mL hSCF, 100 ng/mL hTPO, 100 ng/mL hFlt3L, 60 ng/mL hIL-3 and 4 g/mL protamine sulphate, or mock transduced in the same conditions. Two-phase liquid culture was then performed as described above. Statistical analyses Statistical analyses were performed with GraphPad PrismTM (version 5. 0 ; GraphPad Software). The data are expressed as the mean standard deviation (SD) or median (interquartile range-IQR), unless noted otherwise. Student's paired t-test or Mann-Whitney U- test was used as appropriate. *p value *p value *p value 114 Supplementary references related to additional Methods section 19. De Franceschi, L. et al. K-CL co-transport plays an important role in normal and beta thalassemic erythropoiesis. Haematologica 92, 13191326 (2007). 20. Gabet, A. -S. et al. Caspase-activated ROCK-1 allows erythroblast terminal maturation independently of cytokine-induced Rho signaling. Cell Death Differ. 18, 678689 (2011). 21. Schallmeiner, E. et al. Sensitive protein detection via triple-binder proximity ligation assays. Nat. Methods 4, 135137 (2007). 22. DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System (2002). 23. R Development Core Team R : A language and environment for statistical computing. (2011). 24. Berman, H. M. et al. The Protein Data Bank and the challenge of structural genomics. Nat. 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Journal of chemical physics 115, 40034018 (2001). 115 Figure Supplemental 3 : Immunoprecipitation (IP) assay of Hsp70 and -globin from whole cell lysates derived from erythroid cells at day 8 of CD36 cells cultures derived from two adults -TM patients (Thal 1 and 2) and one healthy adult PBSC (peripheral blood stem cells). Hsp70-containing proteins were immunoprecipited with the anti-Hsp70 monoclonal antibody (Hsp70-Ab) or control antibody (Ctl-Ab) and then immunoblotted (IB) using an anti-globin antibody (lower panel). IB with anti-Hsp70 polyclonal antibody (upper panel) was showed as a control. Hsp70 Ab co-precipited -globin in TM erythroid cells, while the control antibody (that does not bind Hsp70) did not. 116 DISCUSSION ET PERSPECTIVES 1. Analyse critique des résultats Dans ce travail, nous avons démontré, grâce à des expériences de double hybride en levure, qu'Hsp70 se liait directement aux chanes d'-globine libres (expression d'-globine sans hème dans ces levures). In vivo, en pathologie, Hsp70 co-localise avec les chanes d'-globine dans le cytoplasme d'érythroblastes matures de moelle osseuse de patients -thalassémiques, ce que nous avons démontré aussi in vitro dans des érythroblastes en culture. Enfin, nous avons montré par immunoprécipitation d'Hsp70 révélée par l'-globine (figure supplémentaire 3) que le contenu cytoplasmique d'érythroblastes matures -thalassémiques en culture contenait les deux protéines complexées. Cette fonction apparemment cytoprotectrice d'Hsp70 devient très délétère lorsque la concentration d'-globine dépasse les capacités du système, ce qui est le cas au stade d'érythroblaste polychromatophile dans les -thalassémies majeures, cellule dans laquelle la concentration en hémoglobine augmente le plus fortement. En effet, la séquestration d'Hsp70 par l'-globine empêche alors sa translocation nucléaire ce qui empêche la protection de GATA-1 du clivage par la caspase-3 activée. Il s'ensuit un arrêt de maturation et une mort par apoptose. Cette séquestration cytoplasmique d'Hsp70 et la dégradation consécutive de GATA- 1 semble donc être le grand mécanisme de deux des trois composantes de l'érythropoïèse inefficace : arrêt de maturation et apoptose. En effet, l'hyperexpression globale d'Hsp70 par le mutant Hsp-WT ou l'hyperexpression nucléaire par le mutant Hsp-S400A dans les érythroblastes corrigent ces deux aspects de l'érythropoïèse inefficace. Le mutant GATA-1 non clivable par la caspase-3 restaure nettement le défaut de maturation, mais pas l'apoptose. L'implication d'Hsp70 dans la thalassémie n'avait jamais été démontrée à ce jour, excepté dans une étude descriptive de protéomique qui s'est intéressée aux protéines liées anormalement aux membranes de globules rouges de HbE/- 117 thalassémie, dans laquelle ressortent les deux chaperonnes Hsp70 et AHSP. (Bhattacharya, Proteomics Clin. Appl. 2010) Au vu de ces résultats, plusieurs questions restent cependant en suspens : 1. Hsp70 intéragit-elle seulement avec l'apo -globine ou également avec l'halo- -globine (dans sa forme héminique réduite, ou oxydée), comme le fait la seule chaperonne connue, spécifique des chanes d'-globine, AHSP ? Quelle est la constante d'association/dissociation de cette protéine et quelle est la différence d'affinité par rapport à AHSP ? Pour répondre à cette question, nous allons réaliser des études d'intéraction protéique par Résonnance Plasmonique de Surface (SPR, Biacore) entre Hsp70 et les différentes sous-unités d'-globine, et entre AHSP et ces mêmes sous- unités. 2. Comment expliquer la différence concernant l'apoptose entre, d'une part, les mutants Hsp70-WT et Hsp70-S400A (qui diminuent l'apoptose) et d'autre part GATA-1 (qui ne modifie pas l'apoptose) alors que les 3 mutants ont la même action positive sur la maturation érythroïde -thalassémique ? Ces résultats suggèrent que GATA-1 aurait un rôle central dans la maturation mais pas dans l'apoptose. Comme nous l'avons vu dans l'introduction de cette thèse, même s'il est attribué à GATA-1 un rôle anti-apoptotique, celui-ci n'est pas du tout prouvé. De plus, dans un modèle pathologique, la myélodysplasie de bas grade, o il existe un défaut de localisation nucléaire d'Hsp70, la restauration de GATA-1 par le mutant GATA aboutissait aux mêmes résultats, à savoir l'amélioration de la maturation cellulaire mais pas de modification de l'apoptose. (Frisan, Blood 2012) Il n'y avait d'ailleurs pas dans les cellules myélodysplasiques de modification d'expression de la protéine Bcl-XL alors que le rôle anti-apoptotique supposé de GATA-1 passerait par l'expression de cette protéine anti-apoptotique. Il serait donc intéressant d'étudier l'expression de Bcl-XL dans les érythroblastes matures de - thalassémies majeures et dans les cellules transduites par les différents mutants. On peut considérer que l'arrêt de maturation érythroïde des -thalassémies majeures passe par le clivage de GATA-1 consécutivement à l'absence de concentration nucléaire d'Hsp70, séquestrée dans le cytoplasme par les chanes d'-globine en 118 excès. Par contre l'apoptose semble passer par un autre mécanisme directement lié à Hsp70. Nous suspectons qu'il existe, à l'intérieur du compartiment cytoplasmique, un autre effet délétère de la séquestration d'Hsp70 par les chanes d'-globine. En effet, Hsp70 est bien identifiée dans la littérature comme une protéine anti-apoptotique. Elle pourrait être détournée, à l'intérieur même du cytoplasme, d'un rôle protecteur de protéines impliquées dans l'apoptose. Son association à AIF (Apoptosis Inducing Factor) retient particulièrement notre attention. AIF est une protéine cytoplasmique qui, lorsqu'elle est transportée dans les noyaux va fragmenter l'ADN et contribuer à induire l'apoptose. Hsp70 retient AIF dans le cytoplasme cellulaire et inhibe sa translocation nucléaire. (Mjahed, Exp. Cell. Research 2012) Comme nous l'avons écrit en introduction, une seule étude montre qu'Hsp70 séquestre AIF dans le cytoplasme d'une lignée érythroïde humaine TF-1 et permet ainsi d'éviter la fragmentation d'ADN. (Lui, FEBS Lett. 2007) Hristoskova et col. ont aussi montré qu'AIF était exprimé dans le cytoplasme d'érythroblastes humains tout comme d'autres protéines impliquées dans l'apoptose et qui sont aussi des partenaires d'Hsp70 : Apaf-1 et le cytochrome c. (Hristoskova, Exp. Cell. Research 2007) Cependant, un lien entre ces protéines pro-apoptotiques et leur éventuel contrôle par Hsp70 n'a jamais été étudié dans des érythroblastes humains. L'absence de séquestration cytoplasmique d'AIF par HSP70 dans des cellules bien hémoglobinisées du fait d'une utilisation d'Hsp70 dans un autre compartiment cytoplasmique serait une hypothèse séduisante pour expliquer l'apoptose. Nous pourrions étudier assez facilement par microscopie confocale et/ou Western Blot les localisations cyto/nucléaires d'AIF dans les érythroblastes des -thalassémies et sa modification par les différents mutants d'Hsp70. Plus généralement, l'association d'Hsp70 à des protéines cytoplasmiques et/ou nucléaires ayant un rôle dans l'apoptose ( immobilisation de protéines impliquées dans l'apoptose ou protection de molécules anti-apoptotiques comme Bcl-XL), pourrait être une nouvelle perspective de travail dans l'érythropoïèse physiologique. Cette action anti-apoptotique propre d'Hsp70 éclaire également les perspectives thérapeutiques de notre travail qui doivent être doubles : diminuer l'intéraction avec les chanes d'-globine augmenter l'expression d'Hsp70 dans ces cellules 119 - Pour la première proposition, nous souhaitons réaliser un criblage de petites molécules in silico grâce à la modélisation 3D informatique. Nous pourrions ensuite tester ces molécules dans notre modèle de culture d'érythroblastes - thalassémiques et observer l'effet sur la maturation, prolifération et apoptose. Nous devons pour cela approfondir l'étude des domaines d'intéraction entre Hsp70 et - globine. - Pour la deuxième assertion, les inhibiteurs des HDAC (histones déacétylases) et parmi eux l'acide valproïque (Dépakine) pourraient être utilisés dans notre modèle de culture car ils augmentent l'expression protéique d'Hsp70 dans de nombreux modèles de cellules neuronales. (Marinova, J. Neurochem. 2009 ; Rao, Adv. Cancer Res. 2012) L'acide valproïque semble aussi induire la production d'hémoglobine fœtale dans des érythroblastes humains -thalassémiques en milieu liquide sans qu'en soit précisé le mécanisme. (Marianna, Haemotologica 2001) Nous faisons l'hypothèse que cette augmentation d'HbF pourrait passer par une induction d'Hsp70 par l'acide valproïque permettant une meilleure disponibilité nucléaire, une protection de GATA-1 et une augmentation d'expression d'HbF. Nous avons réalisé deux expériences qui vont dans ce sens montrant une augmentation de la quantité d'Hsp70 cytoplasmique (intensité triple en microscopie confocale), un ralentissement de la différenciation, mais malheureusement pas d'effet sur la localisation nucléaire d'HSP70 et la protection de GATA-1 nucléaire. Ces expériences méritent d'être renouvelées et approfondies (gamme-dose d'acide valproïque, combinaison avec des molécules pouvant dissocier le complexe Hsp70/-globine etc). 3. Quel est le mécanisme d'augmentation de l'hémoglobine F dans les cellules transduites par les mutants d'Hsp70 ou avec le GATA-1 ? La mise en évidence d'une augmentation de l'HbF (pourcentage de cellules F, mais aussi de la fluorescence moyenne dans ces cellules, c'est-à-dire de la concentration globale en hémoglobine F par cellule) par cytométrie de flux dans les érythroblastes transduits avec ces mutants a été une belle surprise. En effet, la perspective thérapeutique de nos travaux aurait été limitée si le pool de bons réticulocytes (cellules F) dans les -thalassémies majeures n'était pas augmenté après le 120 rétablissement de l'expression de GATA-1 dans les érythroblastes matures. En effet, des globules rouges avec des chanes d'-globine en grande quantité ne sont pas fonctionnels. Nous devons confirmer ce résultat important par une autre technique de dosage par HPLC (qui sera cependant moins précise dans notre système car donnera une image globale de synthèse des chanes mais pas l'information sur le pool de cellules F, réellement efficaces en périphérie). Il conviendrait aussi de tester cette différenciation avec des concentrations plus faibles de SCF dans nos cultures car comme nous l'avons vu, cette cytokine induit in vitro l'HbF (voir introduction), ce qui peut expliquer les concentrations déjà importantes d'HbF dans nos cultures tant thalassémiques que de sujets sains. (Gabbianelli, Blood 2007) Cependant, ce biais est plutôt conservateur car la différence entre pourcentages de cellules F devrait être plus grande entre érythroblastes -thalassémiques transduits par le mutant d'intérêt si les cellules contrôles transduites par le vecteur vide expriment moins d'HbF. L'autre critique que l'on pourrait faire est que l'HbF serait un marqueur de différenciation/maturation érythroïde. Or, ce ne semble pas être le cas car le pourcentage de cellules F semble décrotre avec la différenciation in vitro (Friedman, J. Clin. Invest. 1985), ce que nous avons d'ailleurs observé dans nos cultures d'érythroblastes normaux et pathologiques. Nous avons considéré que cette augmentation de production d'HbF passait par l'expression du facteur de transcription GATA-1, restauré par les transductions virales. GATA-1 semble jouer un rôle fondamental dans le switch des chanes de globine même si son rôle spécifique dans l'expression des chanes reste encore à bien préciser dans la littérature (voir chapitre 2. 4. 4. 2. ). Un rôle de cette protection de GATA-1 sur l'expression de BLC11A, inhibiteur principal des chanes (Sankaran, Science 2008, Nature 2009), serait également intéressant à étudier dans ces expériences des transductions. 121 2. Hypothèses pour de nouvelles recherches découlant de ce travail de thèse 2. 1. Hsp70 joue-t-elle un rôle physiologique dans l'assemblage de l'hémoglobine ? C'est une question importante car les érythroblastes sont des cellules très particulières chez l'homme puisque Hsp70 y est physiologiquement exprimée à forte concentration dès le stade proérythroblaste, c'est-à-dire avant la production des chanes de globine. L'érythropoïèse est donc une exception car, comme nous l'avons écrit dans l'introduction, cette chaperonne est habituellement inductible et non présente à l'état basal dans les cellules humaines non pathologiques. Hsp70 est une protéine hautement conservée tout au long de l'évolution chez différentes espèces, de même que la structure tertiaire des chanes de globines qui remonte à une même protéine ancestrale datant de plus de 600 millions d'années (alors même que les analogies des structures primaires entre chanes de globine sont faibles entre espèces différentes). Cela nous permet de soulever l'hypothèse qu'Hsp70 aurait pu être sélectionnée dans l'évolution pour chaperonner les chanes de globine ; ce qui expliquerait son expression constitutive dans les érythroblastes humains et ceux de nombreux mammifères et autres espèces (xenope, poulet). Les expériences de modélisation informatique en 3D montrant qu'Hsp70 forme une cavité par ses 3 domaines o se fixe parfaitement l'-globine et nos expériences de double hybride qui montrent que les chanes de -globine intéragissent aussi avec Hsp70 sont quelques arguments en faveur de ce rôle évolutif . Il faut ici rappeler que c'est actuellement l'AHSP qui est considérée comme la protéine chaperonne impliquée dans la synthèse de l'hémoglobine. Pourtant, cela n'a absolument pas été prouvé in vitro dans des modèles de culture érythroblastique mais seulement par des expériences d'intéraction protéique calorimétrique entre l'AHSP et l'-globine. Cette hypothèse est basée sur des expériences biochimiques montrant le déplacement de cette intéraction par l'ajout de chanes de -globine dont l'affinité pour les chanes est plus grande (Gell, J. Biol. Chem. 2002) et par des expériences in vivo chez la souris qui sont, comme on l'a vu dans le chapitre 3. 3. 6. , discutables. En effet, les souris invalidées pour l'AHSP (AHSP/) ne présentent qu'une anémie modérée dont une partie importante est liée à de l'hémolyse périphérique, même s'il semble exister 122 des signes (modérés) d'érythropoïèse inefficace. L'autre élément sur lequel s'est basée cette hypothèse est la liaison non seulement avec l'holo-hémoglobine mais aussi avec les chanes d'-globine libres laissant penser qu'AHSP pourrait être impliquée dès la sortie des chanes d'-globine du ribosome. Comme nous l'avons souligné dans l'introduction de cette thèse, l'expression protéique de l'AHSP au cours de la différenciation érythroblastique a été bizarrement très peu étudiée probablement car elle semble excessivement faible. Nous n'avons pas pu mettre en évidence l'AHSP par Western Blot à différents temps de nos cultures cellulaires érythroïdes effectuées à partir de cellules CD34 circulantes de sujets sains. Il semblerait, dans les -thalassémies majeures, que son expression n'apparaisse qu'en fin de différenciation dans notre système de culture (J7, J8 des cultures après tri CD36 ) (résultats préliminaires en cours de vérification). Cela rend incertain un rôle déterminant de l'AHSP dans la synthèse de l'hémoglobine car cette protéine devrait être exprimée dès le stade basophile, au début de la production des chanes de globine (J4-J5 dans notre système de culture). Cela pose donc la question du rôle physiologique d'Hsp70 dans cette synthèse d'hémoglobine. Des expériences d'inhibition d'Hsp70 par SiRNA pourraient être envisagées sur des érythroblastes normaux de sujets adultes exprimant le mutant GATA-1 (pour s'affranchir de l'effet délétère de l'absence d'Hsp70 sur la protection de GATA-1 et donc sur la maturation et l'expression des chanes de globine) en étudiant la formation d'hémoglobine dans ces érythroblastes (formation d'hémichromes, induction de ROS). Ce sont cependant des expériences difficiles à réaliser car les érythroblastes transfectés par GATA-1 sont fragiles. L'étude sur un modèle de souris invalidée totalement ou partiellement pour Hsp70 pourrait aussi être très intéressante. Ce rôle physiologique d'Hsp70 pourrait aussi être étudié dans les -thalassémies mineures. En effet, chez ces patients porteurs du trait -thalassémique, la quantité de chanes est parfois diminuée jusqu'à 50%, ce qui signifie donc que la moitié des chanes -libres sont en excès dans les cellules. (Khandros, Hematol. Oncol. Clin. N. Am. 2010) Cela n'entrane pourtant ni anémie, ni dysérythropoïèse. Nous pouvons suspecter, dans ce modèle, qu'Hsp70 arrive à contrôler l'excès de chanes d'- globine libres (fonction positive) sans être totalement séquestrée dans un compartiment cytoplasmique, ce qui lui permet de jouer son rôle protecteur de GATA-1 et d'éventuelles autres protéines cellulaires. Cette hypothèse est difficile à 123 vérifier car il est plus difficile d'obtenir des moelles osseuses de ces patients et que nous ne sommes pas sûrs qu'ils aient beaucoup de cellules CD34 circulantes, comme chez les patients -thalassémiques majeurs, pour faire de la culture in vitro à partir du sang périphérique. Cependant, cela est réalisable sur du sang périphérique de sujets sains, mais il faut alors des quantités plus importantes de sang. Cette hypothèse est cependant intéressante à vérifier de même que la concentration d'Hsp70 dans les cellules qui devrait être augmentée pour compenser l'excès de chanes . Si Hsp70 était importante pour l'assemblage des chanes de globine, son expression devrait augmenter au cours de la différenciation érythroïde et suivre la concentration des chanes de globine. C'est effectivement ce qui est observé dans la différenciation érythroblastique physiologique. (Ribeil, Nature 2007) Le mécanisme de cette induction d'Hsp70 au cours de l'érythropoïèse physiologique n'a pas été encore étudié. Nous pouvons soulever ici deux hypothèses non exclusives passant par des stress physiques secondaires à la production des chanes de globine : - l'induction d'Hsp70 pourrait passer par le changement de pH cellulaire qui se modifie brutalement sous l'effet de l'acquisition de chanes de globine et de perte d'ARNm acide. La modification de pH est un facteur d'induction d'Hsp70. (Garrido, Cell Cycle 2006 ; Mjahed, Exp. Cell Res. 2012 ; Ellis, Biochem. Soc. Symp. 1989) - l'induction d'Hsp70 pourrait aussi passer par la production de ROS lorsque débute la synthèse des chanes de globine, car les chanes de globine en s'oxydant sont des productrices de ROS. Les ROS à faible concentration ne sont pas toxiques pour les cellules et peuvent même servir positivement dans le métabolisme cellulaire, notamment pour la différenciation. Les ROS sont connus pour induire Hsp70. (Garrido, Cell Cycle 2006 ; Mjahed, Exp. Cell Res. 2012 ; Ellis, Biochem. Soc. Symp. 1989) L'étude des Heat Shock Factor HSF-1 et -2, facteurs de transcription d'Hsp70 en réponse à ces stimulus, pourrait être aussi envisagée. Enfin, la formation ou non d'un complexe entre Hsp70 et les chanes de globine serait très intéressante à étudier (et si complexe il y a, comparer les constantes 124 d'affinité avec les autres chanes). Nous n'avons pas dans ce travail réalisé d'expériences de double hybride avec cette chane car nous n'avions pas facilement à disposition le vecteur d'expression et que ce n'était pas le sujet central de notre thèse. Cette étude pourrait apporter peut être un éclairage sur la variation physiologique de la concentration en hémoglobine entre le nouveau né et un jeune bébé. En effet, la concentration en hémoglobine d'un nouveaux-né est d'environ 15- 17 g/dL en moyenne. Elle va diminuer en quelques mois à 11-13 g/dL, corrélée à la baisse du nombre de globules rouges. Le mécanisme de cette baisse physiologique des globules rouges dans les six premiers mois de vie n'est pas connu bien que régulièrement observé par les pédiatres. Elle semble suivre le switch de l'hémoglobine, c'est-à-dire la perte des chanes remplacées par les chanes de - globine. Or, nous avons observé que le rapport nucléo-cytoplasmique d'Hsp70 était plus élevé dans des érythroblastes en culture issus de cellules souches provenant de sang de cordon par rapport à des cellules souches provenant de moelles adultes. On pourrait donc poser comme hypothèse que l'hémoglobine fœtale ait moins d'affinité pour Hsp70 ce qui permettrait une plus grande disponibilité d'Hsp70 pour la protection nucléaire de GATA-1 au cours de la vie fœtale. Cela expliquerait la production plus importante de réticulocytes et donc de globules rouges dans la vie fœtale qui diminuerait au changement de chanes, si l'on considère qu'Hsp70 ait alors une plus grande affinité cytoplasmique pour l'hémoglobine adulte et, en conséquence, une disponibilité nucléaire plus faible pour GATA-1 dans les érythroblastes adultes . 125 2. 2. La séquestration cytoplasmique d'Hsp70 avec comme conséquence l'absence de localisation nucléaire : un modèle dans les maladies neurodégénératives ? Cet exemple pathologique de la -thalassémie majeure montre, tout comme ce qui avait été mis en évidence en physiologie par JA Ribeil (Ribeil, Nature 2007) et en pathologie sur les myélodysplasies (Frisan, Blood 2012), que c'est avant tout la localisation cyto/nucléaire plus que le contenu cellulaire global d'Hsp70 qui est important au cours de l'érythropoïèse. Ce rôle pathologique d'Hsp70 en fonction de sa compartimentalisation subcellulaire est une voie de recherche assez peu étudiée. En effet, Hsp70 n'est le plus souvent perçue que comme un agent globalement cytoprotecteur car son hyperexpression améliore la survie cellulaire ; un rôle toxique n'est envisagé que si son expression est diminuée. Nous pensons que cette compartimentalisation subcellulaire d'Hsp70 pourrait être un mécanisme plus ubiquitaire, impliqué dans d'autres pathologies o Hsp70 est fortement exprimée et o des protéines cytoplasmiques malformées existent. C'est le cas des maladies neurologiques dégénératives (maladie de Parkinson, d'Alzheimer, d'Huntington, sclérose latérale amyotrophique -SLA-, maladies à prions) regroupées aussi sous le nom de maladies des protéines mal-repliées ou protein misfolding diseases or disorders . (Broadley, FEBS Lett. 2009 ; Muchowski, Nat. Rev. Neurosci. 2005) Au cours de ces maladies, Hsp70 joue un rôle cytoprotecteur en tentant de contrôler la toxicité des protéines malformées (protéine amyloïde Tau pour l'Alzheimer, - synucléine pour la maladie de Parkinson, la superoxyde dismutase 1 pour la SLA) en se liant à elles (voir tableau 2 pour d'autre maladies). 126 Tableau 2 : Exemples de maladies liées à des agrégats de protéines anormales (Khandros, Hematol. Clin. N. Am. 2010) L'hyperexpression d'Hsp70 dans ces divers modèles cellulaires de maladies neuro- dégénératives, inhibe les oligomères de protéines toxiques ce qui permet de protéger la cellule neuronale contre l'apoptose. (Broadley, FEBS Lett. 2009 ; Muchowski, Nat. Rev. Neurosci. 2005) L'hyperexpression d'Hsp70 est de ce fait un axe important de nouvelles stratégies thérapeutiques de ces maladies. (Broadley, FEBS Lett. 2009 ; Hartl, Nature 2011 ; Morimoto, Genes Dev. 2008) Inversement, l'hypoexpression d'Hsp70 induit une cytotoxicité dans ces cellules. Les cellules neuronales les plus touchées par les dépôts de protéines malrepliées, dans les coupes histologiques humaines de ces maladies neuro-dégénératives, expriment d'ailleurs un niveau nettement plus faible d'Hsp70. (Broadley, FEBS Lett. 2009) Enfin, dans certains modèles cellulaires de ces maladies, il existe une hypoexpression d'Hsp70 qui serait due à la séquestration par les protéines malformées des facteurs de transcription d'Hsp70. (Broadley, FEBS Lett. 2009) Il a été cependant envisagé, dans ces maladies neurologiques, que la séquestration d'Hsp70 par les protéines neuronales toxiques, tout en tentant de détoxifier ces protéines anormales, détourne Hsp70 de son rôle protecteur d'autres protéines cytoplasmiques. (Broadley, FEBS Lett. 2009) Il a été envisagé très récemment, dans 127 un modèle cellulaire humain de SLA, qu'Hsp70 pouvait être séquestrée par les agrégats de superoxyde dismutase 1 (protéine anormale dans cette maladie) dans les JUNQ (juxtanuclear quality control compartments) ou les IPOD (insoluble protein deposits), en position juxtanucléaire. Cela rendrait Hsp70 peu disponible pour ses fonctions d'élimination des protéines cellulaires anormales (éventuellement d'autres protéines que l'enzyme anormale) par le protéasome situé dans le même compartiment sub-cellulaire ce qui aggraverait la cytotoxicité. (Weisberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012) Le déséquilibre cyto-nucléaire qui pourrait découler de cette séquestration cytoplasmique et le lien avec l'apoptose de cellules neuronales n'a toutefois, à notre connaissance, pas été spécifiquement étudié dans ces maladies neuro- dégénératives alors qu'il est probable d'Hsp70 joue aussi un rôle protecteur de protéines nucléaires indispensables au bon fonctionnement de ces cellules. Seule une étude de l'équipe de Jeanne Amiel à l'hôpital Necker a montré dans la maladie d'Ondine (pathologie neuro-dégénérative avec dysautonomie entranant des troubles de ventilation pulmonaire), liée à la présence d'une protéine anormale, Phox2B, dans les neurones du tronc cérébral, que cette protéine co-localisait, en microspopie confocale, avec Hsp70 dans le cytoplasme (cf figure issue de l'article par Trochet et al. ). (Trochet, Hum. Mol. Genet. 2005) Cela semble entraner un déficit d'expression nucléaire d'Hsp70, comparé aux cellules contrôles si on s'en réfère à la figure de cette publication reproduite ici. Ce travail n'étant pas centré sur Hsp70, les auteurs n'ont pas précisément étudié l'anomalie de répartition cyto/nucléaire et ne l'ont donc pas précisément quantifiée dans l'article. 128 Figure 14 : Séquestration d'Hsp70 dans le cytoplasme par des protéines anormales avec absence d'expression nucléaire, un modèle plus général de cytotoxicité ? Exemple de la maladie génétique neuro-dégénérative d'Ondine o la protéine anormale Phox-2B co-localise (2 lignes supérieures) avec Hsp70 dans le cytoplasme de neurones ce qui semble entraner un défaut de localisation nucléaire d'Hsp70 (noyau marqué en bleu par le DAPI, Hsp70 en vert). D'après Trochet, Hum. Mol. Genet. 2005 Par un mécanisme a priori différent, Hsp70 semble impliquée dans une autre maladie musculaire dégénérative : la dystrophie musculaire de Duchenne caractérisée par une destruction musculaire par apoptose. Cette maladie génétique est due à l'absence d'une protéine, la dystrophine, qui est fondamentale pour stabiliser la membrane des cellules musculaires. De plus, l'hyperexpression d'Hsp70 dans les cellules réduit, dans des modèles de souris, la dégénérescence musculaire, a priori, en stabilisant une enzyme cytoplasmique (SERCA) importante pour le contrôle du flux cellulaire de calcium, très altérée dans cette maladie. (Gehrig, Nature 2012) 129 Enfin, n'oublions pas que dans les systèmes nerveux et musculaire existent des protéines faisant partie de la famille des globines avec des homologies de structures avec les chanes de globines notamment myoglobine pour le muscle mais aussi, plus récemment décrites, neuroglobine (NGB) et cytoglobine (CYGB) pour les cellules neuronales (Figure 6, rappelée ici). La neuroglobine découverte en 2000 est un monomère qui lie l'oxygène avec beaucoup plus d'affinité que l'hémoglobine ce qui amène aux cellules neuronales une protection en cas d'hypoxie et d'oxydation cellulaire (détoxifie les ROS) pour limiter les dommages cellulaires cérébraux et éviter l'apoptose. (Burmester, J. Exp. Biol. 2009) La neuroglobine est exprimée dans pratiquement toutes les cellules du système nerveux central (qui l'expriment cependant à des concentrations différentes), mais aussi du système nerveux périphérique et dans les cellules de la rétine. La cytoglobine fait aussi partie de la grande famille des globines mais semble limitée à un sous-groupe de neurones et a un rôle de protection neuronale de l'oxydation cellulaire induite par les ROS. (Burmester, J. Exp. Biol. 2009) On pourrait envisager comme pour les chanes et de globine qu'Hsp70 puisse former avec la neuroglobine et la cytoglobine un complexe pour les protéger et les stabiliser, ce qui augmenterait leur rôle protecteur dans les cellules neuronales d'autant plus que ces deux neuroprotéines ne peuvent être induites directement par un stress cellulaire, contrairement à Hsp70. (Burmester, J. Exp. Biol. 2009) On pourrait, à l'inverse, imaginer qu'une altération de liaison avec Hsp70 ou qu'une séquestration d'Hsp70 dans d'autres compartiments subcellulaires, (par des 130 protéines mal formées à détoxifier par exemple) puissent être, en cascade, nocives pour des cellules en situation de stress ne disposant plus assez de neuroglobine et cytoglobine fonctionnelles, protégées par Hsp70. Cette intéraction n'a cependant pas été encore étudiée à ce jour. Cette hypothèse pourrait être testée grâce à une étude de l'intéraction entre Hsp70 et ces protéines par Résonnance Plasmonique de Surface (SPR, Biacore) lorsque nous aurons mis au point ce système pour l'intéraction entre Hsp70 et l'-globine, car cela pourrait avoir des retombées thérapeutiques potentiellement importantes dans le système nerveux. Il faut rappeler ici que, même si ces différents types de globine ont une structure primaire différente, elles ont une structure tertiaire très proche, ce qui pousse à étudier leur intéraction avec Hsp70 au vu des résultats de cette thèse. Dans le système nerveux tout comme dans l'érythropoïèse, Hsp70 pourrait aussi agir indirectement sur la synthèse d'hème car Hsp70 semble agir étroitement avec l'hème oxygénase (HO-1) (aussi appelée Hsp32 car c'est aussi une chaperonne inductible par le stress), qui dégrade l'hème. HO-1 est très impliquée dans les maladies neurodégénératives car cette enzyme a une action anti-oxydante protectrice des cellules neuronales surchargées par des molécules malformées, avec une très dense publication sur ce sujet (particulièrement dans la maladie d'Alzheimer). Enfin, dans la maladie d'Alzheimer, il a été montré que l'hémoglobine mais aussi les chanes et de globine se liaient aux protéines -amyloïdes toxiques dans les neurones ce qui participerait à la toxicité des protéines -amyloïdes du fait d'une oxydation des chanes de globine. (Oyama, Biochim. Biophys. Acta. 2000 ; Chuang, PloS One 2012 ; Perry, Neurobiol. Aging 2008) Une intéraction directe entre la neuroglobine et des agrégats des protéines de prion a également été rapportée. (Lechauve, J. Mol. Biol. 2009) On peut donc imaginer, dans ces maladies neurodégénératives, un ménage à trois entre des protéines mal formées, des chanes de globine (, mais aussi pourquoi pas la neuroglobine) et Hsp70. Il n'a, à notre connaissance, pas été envisagé que la séquestration d'Hsp70 dans ces agrégats puisse être le fait d'un troisième acteur comme les chanes de globine dans leurs grandes diversités. 131 2. 3. Rôle d'autres chaperonnes, notamment Hsp90. Hsp90 est exprimée dans le cytoplasme des érythroblastes humains mais pas dans le noyau. (Ribeil, Nature 2007) Hsp90 est essentiellement impliquée dans la dégradation des protéines par le protéasome. Or, il semble que la dégradation protéique par ce système et par l'ubiquitinilisation soit importante dans les - thalassémies. (Khandros, Hematol. Clin. N. Am. 2010 ; Weiss, Blood 2009 ; Hartl, Nature 2011) Plusieurs études ont montré que les chanes , et de globine étaient ubiquitinilées. (Khandros, Hematol. Clin. N. Am. 2010) De plus, les chaperonnes Hsc70 et Hsp90 augmentent l'expression de HRI (Heme regulated inhibitor of translation) (Uma, J. Biol. Chem 1997) dont un des rôles est d'inhiber la production des chanes de globine libres, ce qui peut donc améliorer le phénotype cellulaire dans les -thalassémies. (Weiss, Blood 2009 ; Chen, Blood 2007) L'étude de l'expression d'Hsp90 et de sa modulation dans la -thalassémie, son rôle dans la dégradation des chanes de globine par le protéasome, pourraient donc être un axe d'étude original. 2. 4. Accélération de la différenciation érythroïde des -thalassémies : une caractéristique non expliquée par Hsp70 Comme nous l'avons vu, la séquestration cytoplasmique d'Hsp70 par les chanes d'-globine permet d'expliquer l'arrêt de maturation et l'apoptose augmentée des érythroblastes polychromatophiles, mais n'explique pas l'accélération de maturation jusqu'au stade polychromatophile, troisième caractéristique de l'érythropoïèse inefficace des -thalassémies. En effet, dans notre travail, ni les mutants surexprimant Hsp70, ni GATA-1 ne modifient la différenciation jusqu'au stade polychromatophile. Nous avançons comme hypothèse que le TGF-1 ou un membre de la famille des TGF- pourraient être impliqués dans cette différenciation. 132 Cette hypothèse est envisagée sur la base des éléments suivants : Il a déjà été démontré dans notre laboratoire et par d'autres équipes que le TGF-1 accélérait la différenciation érythroïde d'érythroblastes normaux (Zermati, Exp. Hematol. 2000) ce qui place cette cytokine comme une cible potentielle. Le TGF-1 semble augmenté dans le sérum de patients -thalassémiques splénectomisés, même si les études, comme nous l'avons vu dans le chapitre 3. 3. 8. , sont peu nombreuses et controversées. (Moshtaghi-Kashanian, Cytokine 2006) Nous avons réalisé des expériences préliminaires (n 3) en rajoutant un anticorps bloquant le TGF-1 à la dose de 10 g/mL (R et D system) ou son isotype contrôle dans nos cultures cellulaires de patients -thalassémiques majeurs dès le tri-CD36 (deuxième phase de nos cultures, reproduisant la différenciation érythroïde terminale). Nous avons observé que l'anticorps bloquant induisait une augmentation franche de la prolifération cellulaire associée à un ralentissement de la différenciation et une baisse de l'apoptose sans modifier l'indice de maturation terminale. Cela soulève deux points : (1) le TGF-1 participerait à l'accélération de la différenciation érythroïde - thalassémique et (2) la synthèse du TGF-1 serait autocrine par les cellules érythroïdes elles-mêmes, puisque notre système de culture en deux temps se fait sans contamination par d'autres cellules hématopoïètiques. Nous n'avons cependant pas encore réalisé les dosages appropriés dans les surnageants des érythroblastes -thalassémiques en culture. Une sécrétion autocrine du TGF- par des précurseurs érythroïdes a déjà été mise en évidence, mais celle-ci semblait limitée, chez l'homme sain à des précurseurs plus immatures (BFU-E ou stades précédents). (Akel, Stem Cells 2003 ; Bhmer, Stem Cells 2004) La finalité d'une sécrétion du TGF- par les érythroblastes -thalassémiques n'est pas évidente, à première vue, car le TGF- ralentit la prolifération en diminuant le nombre de mitoses. Cependant, le TGF- pourrait compenser ce rôle néfaste en induisant la production de chanes de globine et donc augmenter le nombre de cellules F aux dépens de la production cellulaire (qui de toute façon va être arrêtée après le stade polychromatophile dans des 133 cellules contenant une concentration trop importante d'-globine libre). Cette action sur l'HbF a été démontrée dans des cultures in vitro. (cf chapitre 2. 4. 4. 3. de l'introduction et Peschle, Blood 1993 ; Whojda, Blood 2003 ; Bhanu, Blood 2005 ; revue dans Gabbianelli, 2009) Le rôle physiopathologique de cytokines de la famille du TGF- a été étudié avec plus de détail dans un modèle de souris -thalassémiques intermédiaires (travail de thèse de Michal Dussiot dans notre laboratoire, article en révision). Chez ces souris, le blocage du GDF11 (growth differentiation factor 11), un membre de la famille du TGF- améliore l'érythropoïèse inefficace, l'anémie et les marqueurs d'hémolyse des souris. Le GDF11 semble également augmenté dans le sérum de patients - thalassémiques majeurs. Rôle des ROS dans l'érythropoïèse inefficace des -thalassémies De nombreux auteurs suspectent que l'induction des ROS par les chanes d'- globine en excès ait un rôle dans la dysérythropoïèse des patients -thalassémiques (cf chapitre 3. 3. 4 de l'introduction). En effet, les ROS sont augmentés dans les érythroblastes -thalassémiques par rapport à des érythroblastes contrôles mais leur concentration ne semble pas augmenter pendant l'érythropoïèse ; ce qui en fait comme nous l'avons vu en introduction un mauvais client pour expliquer les anomalies observées au stade mature de l'érythroblaste polychromatophile. (De Franceschi, Haematologica 2011 ; Leecharoenkiat, Blood, Cell Mol. Dis. 2011) Par contre, l'induction précoce des ROS au cours de la différenciation pourrait expliquer trois événements dans les érythroblastes thalassémiques : La production du TGF- et donc l'accélération érythroïde (si on confirme bien que cette caractéristique passe par la production autocrine de TGF- par les érythroblastes). Les ROS sont en effet décrits comme des activateurs de sécrétion du TGF-. Une précocité d'activation de la caspase-3. Nous avons en effet mis en évidence par Western Blot (n 1) et par cytométrie de flux (n 6) que les caspases étaient activées plus précocément (J3 au lieu de J5-J6, données non rapportées ici) chez les patients -thalassémiques majeurs. Cela est peut 134 être simplement le reflet de l'accélération de la différenciation érythroïde mais pourrait aussi être un effet des ROS car ils peuvent dans d'autres modèles cellulaires activer les voies extrinsèque (Fujisawa et al, 2007) mais aussi intrinsèque des caspases via l'intéraction avec des protéines de perméabilité mitochondriale. (Circu, 2010) L'augmentation de la concentration cellulaire d'Hsp70. En effet, les ROS peuvent induire la synthèse d'Hsp70. (Gorman, FEBS Lett. 1999) Cela permettrait de contrecarrer le plus longtemps possible l'effet toxique des chanes de globine et de repousser l'effet toxique à des stades de différenciation plus tardifs. Une étude plus précise de l'expression des ROS au cours de la différenciation érythroïde -thalassémique que celles décrites dans la littérature, et son lien avec la sécrétion du TGF-, la synthèse d'Hsp70 et avec l'activation de la voie mitochondriale de l'apoptose mérite d'être développée. Rôle de l'hémine dans la différenciation érythroïde terminale L'hémine est un accélérateur de la différenciation érythroïde. (Bonanou-Tzedaki, Cell Different 1981 ; Theodorakis, Mol Cell Biol. 1989 ; Bensaude, Nature 1983) La place de cet hème oxydé, augmenté dans les érythroblastes -thalassémiques, dans l'accélération de la différenciation érythroïde des -thalassémies n'a pas été, à notre connaissance, étudié. 135 2. 5. Tableau récapitulatif des perspectives de travail Axes de recherche Études de l'affinité d'Hsp70 avec les sous-types de chanes de globine et comparaison avec AHSP Rôle propre d'Hsp70 sur l'apoptose dans l'érythropoïèse normale et pathologique Effet de GATA-1 sur le switch des chanes de globine dans les - thalassémies : augmentation des chanes Criblages de molécules qui empêchent l'interaction - globine/HSP70 Tester ces nouvelles molécules in vitro dans les - TM Tester des molécules, utilisables chez l'homme, qui augmentent l'expression d'Hsp70 dans les érythroblastes Rôle physiologique d'Hsp70 dans la synthèse d'hémoglobine Rôle d'Hsp70 dans l'assemblage de l'hémoglobine Étude d'Hsp70 dans les - thalassémies mineures Technologies utilisées SPR, Biacore - Cultures cellulaire in vitro - Transductions virales mutants Hsp70-WT, Hsp70-S400A, GATA-1 - WB et MC - Cultures cellulaire in vitro - Transductions virales : mutants Hsp70-WT, Hsp70-S400A, GATA-1 - HPLC - WB et MC Expériences à réaliser - Étude d'affinité, constantes d'association et de dissociation - modification de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL - modification de la localisation d'AIF en fonction de la disponibilité d'Hsp70 - confirmer les résultats par dosages des chanes par HPLC - tester des concentrations plus faibles de SCF en culture - modification de BCL11A par les mutants In silico Double hybride en levure Tester une banque de molécules dans notre modélisation mathématique Tester ensuite l'efficacité en double hybride Cultures cellulaires -TM Cultures avec ces molécules. Étude de la maturation, apoptose, prolifération cellulaire Cultures cellulaires -TM Tester des inhibiteurs d'HDAC notamment acide valproïque et SAHA SiRNA Hsp70 dans des érythroblastes normaux transduits par GATA-1 Cultures cellulaires In vivo souris Hsp70-/- MC Cultures cellulaires Étudier l'apparition d'anomalies d'assemblage de l'hémoglobine (hémichromes, ROS, benzidine) Expression d'Hsp70 dans le cytoplasme. Rapport nucléo-cytoplasmique et expression de GATA-1 Collaboration vs labo OH Collaboration Pasteur Labo OH Collaboration CEA Labo OH Labo OH Collaborations ENS Cachan et INSERM Dijon Labo OH Labo OH Labo OH Labo OH 136 La concentration croissante d'Hsp70 au cours de l'érythropoïèse normale est- elle liée à l'acquisition des chanes de globine ? - Cultures cellulaire de CSP et sang de cordon in vitro Rôle physiologique d'Hsp70 dans la baisse physiologique du nombre de globules rouges dans la première année de vie humaine Culture cellulaire de CSP et sang de cordon in vitro WB et MC Double hybride en culture SPR, Biacore Rôle d'Hsp90 dans l'érythropoïèse inefficace des -TM Rôle du TGF- dans l'accélération de la différenciation érythroïde des -TM Culture cellulaire in vitro WB et MC Cultures cellulaires in vitro Dosages ELISA Anticorps bloquants Rôle des ROS dans l'érythropoïèse inefficace des -TM Cultures cellulaires in vitro - modification d'Hsp70 : * en fonction du pH * en fonction de la production des ROS (utilisation d'anti- oxydants) - Rôle des HSF Comparer l'intensité cyto- nucléaire d'Hsp70 entre cellules issues de sang de cordon (HbF majoritaire) et de moelle de sujets sains (HbA majoritaire) Déterminer si Hsp70 forme un complexe avec les chanes par double hybride puis confirmer par intéraction protéique en comparant l'affinité avec les autres chanes de globine. Rôle dans l'ubiquitinilisation ? - Doser les surnageants de culture - Utiliser anti-TGF- bloquant en culture - Étude de la signalisation du TGF- (smad) sur cellules en culture - Utilisation d'anti- oxydants - Effet des ROS sur production du TGF- et sur l'activation précoce des caspases Étudier le rapport cyto- nucléaire d'Hsp70 dans ces maladies Effet des mutants d'Hsp70 sur la viabilité des cellules neuronales - Étude d'affinité, constantes d'association et de dissociation Labo OH Labo OH Collaborations Pasteur et Dijon Labo OH Labo OH Labo OH Cultures cellulaires neuronales MC Utilisation de mutants nucléaires d'Hsp70 Rôle de la séquestration cytoplasmique d'Hsp70 dans l'apoptose neuronale des maladies neurodégénératives avec misfolding proteins Hsp70 : une chaperonne de la neuroglobine et cytoglobine ? AHSP : -hémoglobin stabilizating protein ; SPR : Résonnance Plasmonique de Surface ; WB : Western Blot ; MC : microscopie confocale ; -TM : -thalassémies majeures ; Hb : hémoglobine ; HSF : Heat Shock factor ; Labo OH : laboratoire Olivier Hermine SPR, Biacore Collaboration Pasteur et Bicêtre Collaborations à déterminer 137 CONCLUSION Nous avons montré dans ce travail que la protéine Hsp70 était une chaperonne des chanes d'-globine libres. Dans une condition pathologique comme la -thalassémie majeure, o l'une des deux chanes composant l'hémoglobine (la globine) est absente, l'accumulation de chanes libres, très instables, séquestre Hsp70 dans le cytoplasme des érythroblastes polychromatophiles. Cela entrane alors un déficit d'expression nucléaire d'Hsp70 qui n'est plus capable de protéger GATA-1, le facteur de transcription majeur de l'érythropoïèse. Il s'ensuit une apoptose des cellules et un arrêt de maturation à ce stade cellulaire. Nous suspectons que l'accélération de la différenciation érythroïde jusqu'au stade polychromatophile, qui est la troisième caractéristique de l'érythropoïèse inefficace observée dans cette maladie, est due à une sécrétion autocrine d'un membre de la famille du TGF- par les érythroblastes. Les acteurs de la dysérythropoïèse inefficace des -thalassémies majeures sont ainsi représentés sur le schéma ci-dessous. Ce sont potentiellement des nouvelles cibles thérapeutiques de cette maladie. 138 ANNEXES ANNEXE 1 : Revue générale sur la dysérythropoïèse -thalassémique (co-premier auteur) ANNEXE 2 : Autres articles sur le sujet en tant que co-auteurs ANNEXE 3 : Présentation du travail dans des congrès. Prix 139 ANNEXE 1 : Revue générale sur la dysérythropoïèse - thalassémique : co-premier auteur 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 ANNEXE 2 : Autres articles sur le sujet 1. Frisan E, Vandekerckhove J, De Thonel A, Pierre-Eugène C, Sternberg A, Arlet J-B, et al. Defective nuclear localization of Hsp70 is associated with dyserythropoiesis and GATA-1 cleavage in myelodysplastic syndromes. Blood. 2012 ; 119 : 1532-1542. 2. Michael Dussiot, Thiago Trovati Maciel, Aurélie Fricot, Joel Veiga, Etienne Paubelle, Céline Chartier, Emmanuel Payen, Yves Beuzard, Jean-Antoine Ribeil, Jean-Benoit Arlet, Francine Coté, Geneviève Courtois, Thomas O. Daniel, Rajesh Chopra, Victoria Sung, Olivier Hermine and Ivan Cruz Moura. Inhibition of ActRIIa by sotatercept improves anemia and corrects ineffective erythropoiesis in -thalassemia. Nature Medicine. In Review. 2013. ANNEXE 3 : Présentation à des congrès. Prix Communications orales 1. Arlet JB, JA Ribeil et al. Heat shock protein 70 cytosolic sequestration by excess of free globin chains is a key mechanism of the ineffective eryhtropoiesis in -thalassemia major. 54th annual congress of American society of hematology. Atlanta (USA). 11 décembre 2012. 2. 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Association de leucose et de drépanocytose type AS (à propos de deux cas observés en milieu dakarois) | WMT16 | Scientific |
A propos de l'association isoniazide-eucalyptol par voie rectale dans le traitement de la tuberculose pulmonaire | WMT16 | Scientific |
Il est recommandé de prélever dans le flacon une cuillerée bombée à l' aide de la cuillère-mesure, puis d' araser la surface, par exemple à l' aide de la lame d' un couteau. | EMEA_V3 | Medicinal |
Le parasitisme (du grec ancien : / pará, à côté , et / stos, grain, blé, pain, nourriture , signifiant littéralement qui prend la nourriture à côté de et désignant à l'origine une fonction honorifique, celle de l'officier chargé de l'alimentation au prytanée d'Athènes) est une relation biologique durable entre deux êtres vivants hétérospécifiques o un des protagonistes le parasite tire profit d'un organisme hôte pour se nourrir, s'abriter ou se reproduire. Cette relation aura un effet négatif pour l'hôte. Les organismes qui ne sont pas parasites sont qualifiés de libres .
On trouve des parasites dans l'ensemble du monde vivant. Certains groupes sont composés quasi exclusivement de parasites (exemples : les plathelminthes monogènes), bien que la plupart comportent à la fois des espèces parasites et libres (exemple : les nématodes). Les vertébrés comportent très peu d'espèces parasites : les chauves souris hématophages se nourrissent du sang d'autres espèces, les lamproies rongent la peau de poissons pélagiques, les poissons-vampires (ou candirs) sucent le sang de gros siluridés amazoniens, certains poissons-perles (ou aurins) parasitent des holothuries. De nombreux parasites peuvent modifier le comportement de leur hôte, à l'avantage du parasite, phénomène maintenant classé parmi les interactions durables.
La définition du parasitisme correspond parfaitement aux interactions qui existent entre un virus ou une bactérie pathogène et son hôte, mais on qualifie ces êtres vivants de parasites plus rarement.
Les parasites sont parfois eux-mêmes victimes d'autres parasites, qui sont alors dits hyperparasites. On appelle parasitoïdes les organismes qui, au cours de leur développement, tuent systématiquement leur hôte, ce qui les fait sortir du cadre du parasitisme au sens strict.
Vers une définition plus nuancée
M. Van Beneden, auteur d'un gros ouvrage Commensaux et parasites, publié en 1876, traitant uniquement des parasites des animaux, a une définition parfois nuancée du parasitisme. Il rapporte par exemple que la présence de plusieurs ténias dans les intestins des abyssiniens constitue un état de santé enviable, phrase critiquée par le médecin naturaliste P. Mégnin qui rappelle que le Sarcoptes scabiei, entre autres tue en quelques mois les plus grands et les plus terribles carnassiers . Ce dernier distingue clairement les parasites commensaux, les mutualistes et les parasites vrais (selon la définition du naturaliste Amédée Louis Michel Lepeletier le parasite est celui qui vit aux dépens d'autrui en mangeant son bien et non sa nourrice même . Il distingue aussi les parasites dangereux de ceux qu'il estime inoffensifs, en critiquant Van Beneden sur ce point[source secondaire nécessaire].
Jusqu'au milieu du XXe siècle, en théorie, une espèce était considérée comme parasite uniquement lorsque le bénéfice de la relation était manifestement unilatéral (parasitisme destructeur, voire rapidement mortel) pour l'hôte parasité. Certains parasitismes ont ensuite été considérés comme des cas particuliers de prédation (le parasite se nourrissant aux dépens de son hôte, sans intention de le tuer). Puis des études plus fines, faites dans une perspective plus systémique, ont montré que de nombreuses formes de parasitisme étaient également utiles à l'hôte et/ou à son espèce ou à la biocénose ; par exemple, dans la nature, de nombreux parasites interviennent efficacement dans le rétrocontrôle de la démographie de populations dont les individus sans parasitisme pulluleraient rapidement, jusqu'à faire disparatre leurs ressources alimentaires. On parle d'interactions durables pour décrire les relations complexes qui unissent la plupart des couples hôte-parasite.
Types de parasitismes
Le parasitisme est un mode de vie ou survie, parfois défini par l'exploitation du vivant par le vivant (the conquest of life by life). On considère différents types de parasitisme selon la position du parasite dans l'hôte :
parasitisme obligatoire, facultatif ou accidentel ;
parasitisme de blessure (les parasites ne pénètrent dans l'hôte qu'au niveau d'une plaie) et parasitisme de faiblesse (ou parasites d'équilibre qui ne se développent que si l'hôte présente un affaiblissement de ses défenses naturelles, d'origine physiologique, climatique) ;
ectoparasite : le parasite est présent à l'extérieur de son hôte (parties externes comme la peau ou cavités comme les cavités buccales ou branchiales). Chez les végétaux on peut parler de parasites épiphytes ;
endoparasite : le parasite est présent dans les tissus (intramusculaire par exemple), dans le système sanguin, ou à l'intérieur d'une cellule. Certains parasites cellulaires sont spécialisés : ils ne colonisent qu'un type de cellules, éventuellement chez une seule ou quelques espèces (Plasmodium), d'autres sont plus ubiquistes ;
hémiparasitisme : les hémiparasites possèdent leur propre chlorophylle et ne prélèvent chez leur hôte que de l'eau et des sels minéraux. Ce sont des végétaux comme le gui ;
mésoparasite : le parasite est localisé dans une cavité de l'hôte communiquant avec l'extérieur comme dans le tube digestif (ténia par exemple). La limite entre endo et mésoparasites est parfois floue (comme pour le cas des cavités branchiales).
Le crustacé Cymothoa exigua a été découvert dans les années 1920 au Pérou dans la gueule de poissons capturés au filet. Dans une étude faite de janvier à décembre 1984 ; 236 Cymothoa exigua adultes ont été trouvés parasitant 165 des 691 poissons Lutjanus peru de la famille des Lutjanidae. C'est le seul parasite connu capable de remplacer fonctionnellement un organe de son hôte, en l'occurrence la langue du Lithognathus mormyrus (illustration ci-contre). Son développement est de type marsupial. Selon Nichols et Murphy qui l'ont étudié, ce parasite ne semble que légèrement nocif pour son hôte, mais il augmente probablement le taux de mortalité naturelle, notamment durant les premières années de vie du poisson.
Certains champignons parasitent les fourmis, les transformant en zombies qui abandonnent leur colonie pour mordre une feuille ou une branche près du sol et s'y suspendre. Ce processus permet au champignon de prospérer. Cette forme de parasitisme existe au moins depuis 48 millions d'années. Cette interaction hôte-parasite est très spécifique. Ainsi, une espèce de champignon ne peut induire ce comportement que chez une seule espèce de fourmi qui lui est propre.
D'autres formes de parasitisme sont décrites chez les animaux, par exemple le parasitisme alimentaire appelé cleptoparasitisme, ou le parasitisme de couvée chez les oiseaux.
Il existe également plusieurs types de parasitisme chez les plantes et de champignons parasites.
Évolution et coévolution
La plupart des parasites semblent jouer un rôle important dans la sélection naturelle et l'évolution. On parle même de coévolution à leur égard, car la sélection naturelle favorise l'apparition constante de moyens de défense chez les hôtes ; le parasite évolue afin de posséder des adaptations qui lui permettent de rencontrer son hôte et de survivre sur ou dans l'hôte si la rencontre a eu lieu. Inversement, l'hôte évolue vers des adaptations qui lui permettent de ne pas rencontrer le parasite, de s'en débarrasser ou s'en défendre (y compris via le système immunitaire chez l'animal, ou la production de phytotoxines chez la plante). De là découlent une sorte de courses aux armements défensifs / offensifs, expression qui évoque les pressions de sélection réciproques que l'espèce-parasite et l'espèce-hôte exercent l'une contre l'autre sur de très longues périodes qui peuvent se chiffrer en millions d'années. Si l'hôte est véritablement gagnant (par exemple, en produisant des toxines spécifiques ou en fuyant dans un habitat refuge, à l'abri du stade infestant), le parasite peut disparatre.
La plupart des parasites se sont si spécialisés au cours du temps qu'ils ne peuvent parasiter qu'une ou quelques espèces parmi les millions qui existent. Le parasitisme est un mode de vie néanmoins très courant. Certains auteurs considèrent même qu'il est pratiqué par la majorité des espèces.
Les parasites sont caractérisés par une évolution réductrice des génomes (perte de gènes) qui se traduit par des simplifications morpho-anatomiques (régression d'organes, notamment ceux des appareils locomoteurs en lien avec leur mode de fixation, des appareils digestifs ou végétatifs en lien avec la spécificité parasitaire qui est fonction de leur spécialisation physiologique et de l'ancienneté du parasitisme) ou biochimiques (inactivation/disparition de voies métaboliques, réduction de la biosynthèse d'acides aminés, d'enzymes, d'hormones, de vitamines, autant de métabolites fournis par l'hôte).
Ancienneté du parasitisme
En 2005 on a découvert les fossiles de larves datant d'environ 490 Ma (Cambrien supérieur), qui ressemblent étonnamment au pentastomides actuels, de petits crustacés qui parasitent les voies respiratoires des vertébrés terrestres. Il est plausible que c'étaient aussi des parasites, mais en l'absence d'association avec un hôte précis il est impossible de l'affirmer.
En 2020 l'étude des tubes encroûtant les coquilles de Neobolus wulongqingensis, un brachiopode datant du Cambrien inférieur (étage 4, 514509 Ma), a montré que les animaux (de nature inconnue) ayant construit et habité ces tubes n'étaient pas de simples épibiontes mais bien des cleptoparasites. Les tubes s'ouvraient en effet sur la commissure antérieure des deux valves (et préférentiellement à l'endroit o le flux entrant était maximal), et les brachiopodes porteurs de tubes avaient à âge égal une biomasse inférieure à ceux qui en étaient dépourvus (et le défaut de masse était d'autant plus important que les tubes étaient anciennement implantés, ce qui se mesure par la distance entre le point d'attachement du tube et le bord postérieur de la coquille). Ces animaux détournaient donc à leur profit une partie du flux d'animalcules aspirés par le brachiopode, .
Avantages et inconvénients adaptatifs du parasitisme
Inconvénients du parasitisme
Le parasitisme nécessite une existence cyclique (de reproduction et de développement des parasites). Il en existe deux types :
cycle monoxène (ne faisant intervenir qu'un seul hôte) ;
cycle hétéroxène ou cycle-de-vie complexe (qui implique le passage par un, deux ou plusieurs hôtes intermédiaires).
Le parasite est dépendant de son hôte (ou de ses hôtes), et il doit être capable de le rencontrer. Le surinvestissement des parasites dans la reproduction s'explique par la discontinuité dans l'espace et dans le temps des milieux que représentent leurs hôtes (phénomène de compensation parasitaire).
Si le parasite est trop agressif vis-à-vis de sa population hôte (par exemple s'il tue rapidement et systématiquement son hôte), il fait disparatre ses propres ressources alimentaires et de transport.
Avantages du parasitisme
L'hôte offre un habitat relativement stable, une nourriture et de l'énergie (et un abri contre d'éventuels prédateurs dans le cas du parasitisme interne).
L'hôte contribue involontairement à la mobilité du parasite (par ses déplacements, par sa digestion dans le cas d'un parasite interne). Il contribue aussi à la dissémination des propagules du parasite.
Différentes relations interspécifiques
Ce tableau résume les possibilités d'interactions, en termes d'effets, entre une espèce A et une espèce B.
Neutralisme : symbiote et hôte sont indépendants et n'ont aucune influence l'un envers l'autre.
Compétition : symbiote et hôte agissent défavorablement l'un envers l'autre, il y a compétition au niveau de l'habitat, de la nourriture
Mutualisme : symbiote et hôte vivent en association durable sinon constante, nécessaire et bénéfique aux deux.
Commensalisme : le symbiote se nourrit de matières organiques produites par l'hôte sans dommage pour ce dernier. Lorsque les matières organiques proviennent de matières en décomposition, cela est du saprophytisme.
Coopération : les deux espèces peuvent vivre indépendamment l'une de l'autre, mais tirent profit de l'association. Dans ce cas, chaque espèce est à la fois symbiote et hôte.
Phorésie : l'hôte transporte le symbiote dans un milieu favorable au développement de ce dernier. Il s'agit d'une association libre (les sources de nourriture de l'un et l'autre partenaires étant indépendantes) et non-destructrice (le transport en question n'occasionne pas de dommages physiologiques particuliers).
Inquilinisme : le symbiote trouve auprès de son hôte un habitat, un refuge et une protection sans en tirer de nourriture (parasitisme spatial et non physiologique).
Différence entre parasitisme et prédation
Les interactions liant un prédateur et sa proie, ainsi qu'un parasite et son hôte sont de même nature, avec néanmoins certaines différences :
une différence se situe dans la taille de l'individu tirant profit de l'interaction. Ainsi, on remarque que le parasite est plus petit que son hôte, et qu'un prédateur est généralement plus grand que sa proie. (Dans le cas d'attaque en bande (par exemple dans le cas des lions), l'addition de la taille de la totalité des prédateurs dépasse celle de la proie). Néanmoins, ce critère possède ses limites car il existe des cas o la masse comme le volume des prédateurs peuvent être inférieurs à celui de la proie notamment si l'on considère l'homme (chasse à la baleine par exemple). Il peut être complété par le devenir de l'hôte qui, dans le cas de la prédation, du moins si on en exclut l'alimentation herbivore, est systématiquement tué.
une autre différence se situe dans le temps de l'interaction entre les deux individus. Dans le cadre du parasitisme, l'hôte et le parasite possède une interaction qui dure dans le temps. Cela tient au fait que le parasite n'a aucun bénéfice à tuer son hôte contrairement au prédateur avec sa proie.
Parasitisme en médecine
Par convention, en médecine humaine et vétérinaire, on appelle parasite un métazoaire ou un protozoaire parasitant l'organisme et entranant une parasitose (n'incluant donc ni virus (virose), ni bactérie (infection bactérienne), ni champignon (mycose).
La présence du parasite dans l'organisme est appelée parasitose. Lors de la parasitose, il y a action des leucocytes polynucléaires éosinophiles : l'hyper éosinophilie qui correspond à une augmentation de ces cellules de défense dans le sang.
L'action des cristalloïdes (protéines majeures) sont responsables de cette action antiparasitaire.
Exemples : plasmodiums, tnias, leishmanias, sarcoptes, acanthobdelliformes etc. Voir parasitologie médicale.
Littérature
Parasite, roman américain.
L'Homme est le seul parasite conscient de tuer son hôte, la Terre, mais qui continue car ses faiblesses sont plus fortes que lui, citation de Murray Bookchin dans son récit Notre environnement synthétique.
Notes et références
Voir aussi
Articles connexes
Pathologie végétale
Pathologie animale
Maladie cryptogamique
Maladie virale, Virose
Phytovirus
Maladie bactérienne des plantes, Bactériose
Mycose
Bibliographie
Claude Combes, Interactions durables : écologie et évolution du parasitisme, Masson, 1995, 524 p. (lire en ligne)
Claude Combes, Les Associations du Vivant : l'art d'être parasite, Flammarion, 2001.
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Pierre Kerner, Moi, parasite, Belin, 2018, 187 p. (lire en ligne).
Amira Chaabane et Jean-Lou Justine, À la découverte des parasites des mérous , The Conversation, 16 juin 2020 (DOI 10. 6084/m9. figshare. 12504653. v1, lire en ligne , consulté le 23 juin 2020).
Ismael Zouaoui et all. , Notre dossier Parasites De l'utile au désagréable, le bulletin de la libellule, Genève, janvier 2017.
Liens externes
Ressource relative à la santé : WikiSkripta
Ressource relative à la recherche : JSTOR
Parasitisme
Parasitisme : un des facteurs limitant les populations d'oiseaux
Biodiversité des parasites de poissons
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Ce syndrome a été décrit pour la première fois par Stauffer en 1961.
Notes et références
Article connexe
Syndrome paranéoplasique
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Cardiopathie ischémique En cas de cardiopathie ischémique, une détérioration de la fonction cardiaque et une diminution du débit sanguin coronaire seraient théoriquement provoquées par l' antagonisme du récepteur bradykinine de type 2. | EMEA_V3 | Medicinal |
Biologie Listeria monocytogenes ( L monocytogenes ) est une bactérie ubiquitaire, largement répandue dans l'environnement hydrotellurique (sol, eau, plantes) Elle est détruite par la chaleur mais résiste bien au froid Très présente dans l'environnement humain, elle contamine fréquemment les aliments Bactériologie L monocytogenes est un bacille à Gram positif à tropisme intracellulaire Il possède des flagelles qui lui donnent une mobilité caractéristique quand il est cultivé à 20-25 C, alors que la bactérie est immobile à 37 C monocytogenes est capable de se développer en atmosphère aéro- ou anaérobie Sa culture peut se faire sur milieu ordinaire, sur gélose au sang, ou sur milieux sélectifs Elle donne de petites colonies (1 mm), à bords réguliers, transparentes, irisées bleu-vert en transillumination oblique, entourées d'une zone d'hémolyse bêta sur gélose au sang monocytogenes possède une catalase et produit de l'acide à partir du glucose, essentiellement de l'acide lactique, mais ne possède pas d'oxydase L'espèce L monocytogenes est divisée en 16 souches, caractérisées par des motifs antigéniques spécifiques Les souches les plus pathogènes sont les variétés 4b et 1/2 qui sont responsables de plus de 90 % des cas de listériose Elles présentent un polymorphisme structurel dont l'analyse est indispensable, en cas d'épidémie, pour établir un lien entre la souche des patients et celles isolées des aliments incriminés Résistance au froid et aux agents physicochimiques La température optimale de croissance de L monocytogenes est comprise entre 30 et 37 C, mais la croissance est démontrée entre 2 et 45 C La bactérie est détruite par la cuisson et la pasteurisation : en moins de 30 minutes à 60 C, en moins de 1 minute à 72 C En revanche, la congélation à 15 C arrête sa croissance mais ne la détruit pas monocytogenes adhère facilement aux surfaces inertes De plus, elle est capable de résister à de nombreux agents physiques et chimiques et, entre autres, à des concentrations élevées de sodium et à certains produits nettoyants Ces caractéristiques expliquent la survie de la bactérie dans les environnements de fabrication des aliments et les réfrigérateurs Présence de Listeria monocytogenes dans l'environnement humain La médiatisation des informations concernant l'hygiène alimentaire peut donner l'impression que la présence de L monocytogenes dans l'alimentation humaine est un phénomène rare et anormal En réalité, L monocytogenes est retrouvé dans 2 à 13 % des prélèvements de produits alimentaires à la distribution ! La fréquence de la contamination dépend des produits : elle affecte 16 % des produits carnés et 10 % des produits de la mer, mais moins de 5 % des produits laitiers, pâtisseries et végétaux Dans 90 % des cas, la concentration en Listeria est très faible, inférieure à 100 unités formant colonies (ufc)/g Il y a cependant une différence considérable entre les aliments transformés et non transformés Dans la plupart des études, la contamination des animaux domestiques vivants et du lait cru affecte moins de 5 à 10 % des échantillons testés À l'opposé, la contamination est particulièrement fréquente dans la charcuterie crue hachée (45 %), la viande hachée (36 %), les poissons fumés (16 %) et les fromages au lait cru à croûte fleurie (14 %) ou à croûte lavée (10 %) Ce contraste s'explique en partie par l'adhésion de L monocytogenes sur les surfaces inertes : les enquêtes effectuées dans l'industrie de transformation des viandes ont montré la très grande fréquence de la contamination des sols, machines et matériels de découpe Physiopathologie et épidémiologie La contamination humaine par l'alimentation est fréquente mais habituellement sans conséquence Ce n'est que si l'inoculation est massive, ou le terrain fragile, que se développe une infection clinique Son incidence annuelle est d'environ quatre cas par million d'habitants, dont 22 % de formes périnatales Contamination humaine La contamination est presque toujours d'origine alimentaire Cette hypothèse a été évoquée en 1982, après une épidémie au Canada, liée à la consommation de choux contaminés Mais ce n'est qu'à partir de 1985, après une nouvelle épidémie aux États-Unis, liée à la consommation de fromages à pâte molle, que cette donnée a vraiment été prise en compte par l'industrie agroalimentaire Les aliments incriminés sont le plus souvent des aliments nécessitant une transformation et consommés crus ou peu cuits : charcuteries, fromages à pâte molle, poissons fumés Les aliments incriminés dans les épidémies survenues en France sont résumés dans le D'autres modes de transmission ont été évoqués mais sont exceptionnels : voie respiratoire, transmission par des tiques porteurs de Listeria Cette contamination humaine par L monocytogenes est beaucoup plus fréquente que ne le laissent supposer les cas de listériose L'analyse ponctuelle d'un échantillon de selles est positive chez 1 à 4 % des sujets sains Mais il ne s'agit pas d'un portage chronique La répétition des examens montre que la présence de L monocytogenes dans les selles n'excède pas en général 2 ou 3 jours De plus, certaines études ont rapporté un portage intestinal occasionnel chez 70 % des sujets sains La contamination humaine par L monocytogenes et son portage intestinal intermittent sont donc des phénomènes d'une grande banalité En revanche, le portage vaginal est exceptionnel chez les sujets sains, et est probablement, alors, secondaire au portage intestinal Conséquences de la contamination Après ingestion d'un aliment contaminé, les bactéries traversent la paroi intestinale et gagnent les ganglions mésentériques, puis le foie et la rate La réponse immunitaire fait appel à l'immunité cellulaire, tandis que le rôle de l'immunité humorale parat très secondaire Cette réponse immunitaire est très efficace puisque, dans la plupart des cas, l'intrusion de L monocytogenes n'entrane aucune infection apparente Ce n'est que si l'inoculation est massive, ou, surtout, s'il existe un terrain fragile ou immunodéprimé, que se développe une infection clinique La listériose est exceptionnelle chez les adultes jeunes et en bonne santé En dehors de la grossesse, plus de 70 % des cas concernent des sujets âgés ou fragilisés par un diabète, un alcoolisme, un cancer Ainsi, l'incidence annuelle de la listériose pour 100 000 individus est inférieure à 1 chez les adultes jeunes et en bonne santé, égale à 2 chez les personnes de plus de 70 ans, 5 chez les diabétiques, et jusqu'à 600 en cas de séropositivité au virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et 1 000 en cas de leucémie aigu La femme enceinte fait partie de la population à risque, peut-être à cause de la diminution de son immunité cellulaire Elle a 12 fois plus de malchances de développer une listériose après consommation de produits contaminés qu'un autre adulte jeune en bonne santé Dans cette hypothèse, le fœtus peut être contaminé par voie hématogène à la faveur d'une bactériémie maternelle La possibilité d'une contamination ascendante du liquide amniotique est discutée Épidémiologie de la listériose La surveillance de la listériose est assurée par trois organismes complémentaires : le réseau des laboratoires de microbiologie hospitaliers (réseau EPIBAC), affilié à l'Institut national de veille sanitaire, qui recense les bactériémies et les méningites à L monocytogenes depuis 1987 ; le Centre national de référence (CNR) des Listeria (Institut Pasteur de Paris et centre hospitalier universitaire de Nantes) qui centralise et caractérise les souches de Listeria provenant des laboratoires de biologie médicale ; les Directions départementales de l'action sanitaire et sociale (DDASS) car, depuis 1998, la listériose est une maladie à déclaration obligatoire La déclaration faite par le clinicien est complétée systématiquement par un questionnaire alimentaire établi par le médecin inspecteur de la santé publique, retraçant les aliments consommés par le patient dans les 2 mois précédant les symptômes Le résume les données obtenues par le CNR et le réseau EPIBAC depuis 1987 Malgré certaines discordances, il montre une très forte diminution des cas de listériose, dont l'incidence a été divisée par 2 à 3 en 10 ans Cette diminution porte surtout sur les formes périnatales qui représentaient 51 % des cas en 1987 et seulement 22 % en 2000 Au total, l'incidence actuelle de la listériose en France est d'environ quatre cas par million d'habitants, dont une cinquantaine de cas chez des femmes enceintes Diagnostic et évolution Symptômes La listériose chez la femme enceinte est diagnostiquée deux fois sur trois au troisième trimestre Une fièvre, comprise entre 38 C et 41 C, est présente dans environ 70 % des cas Mais sa présentation clinique est très variable Elle peut réaliser : un syndrome pseudogrippal , avec frissons, céphalées et myalgies Il peut être spontanément résolutif, ou n'être qu'une forme de début ; un tableau de chorioamniotite , avec travail prématuré, diminution des mouvements actifs, altération du rythme cardiaque fœtal, et liquide amniotique méconial C'est la forme réputée la plus fréquente ; un tableau trompeur , simulant une appendicite (douleurs de la fosse iliaque droite), une gastroentérite (diarrhées, douleurs abdominales diffuses), une pyélonéphrite (douleurs lombaires, signes fonctionnels urinaires), une pneumopathie ; la biologie de routine peut montrer une hyperleucocytose et une cytolyse hépatique En revanche, les manifestations neurologiques, hormis les céphalées, sont rares chez la femme enceinte Enfin, dans près de 30 % des cas, il n'existe aucun symptôme maternel significatif et la listériose est révélée a posteriori par ses conséquences fœtales et néonatales Diagnostic La sérologie, bien que souvent demandée, est trompeuse et sans réelle valeur Elle peut rester négative chez des sujets dont la listériose est prouvée, peut-être parce que la défense contre l'infection fait essentiellement appel à l'immunité cellulaire Inversement, les faux positifs sont fréquents en raison de réactions croisées avec d'autres germes à Gram positif, notamment le staphylocoque Cependant, des tests sérologiques encore à l'étude, détectant les anticorps dirigés contre la listériolysine O, semblent avoir une sensibilité et une spécificité intéressantes Le diagnostic est bactériologique par isolement de L monocytogenes d'un site normalement stérile : sang, col utérin et vagin, plus rarement liquide amniotique, liquide céphalorachidien ou urines Les hémocultures sont l'examen de base et doivent être demandées chez toute femme enceinte ou parturiente présentant une fièvre inexpliquée Mais aucun site n'est constamment positif Dans une revue de la littérature incluant 160 cas, le germe a été isolé dans le sang chez 69 femmes (43 %), dans le vagin chez 54 femmes (34 %), le liquide amniotique chez 13 femmes (8 %), les urines chez trois femmes (2 %) et le liquide céphalorachidien chez deux femmes (1 %) L'amniocentèse est parfois le seul prélèvement positif, mais elle a un deuxième intérêt potentiel Pour certains, elle permet de guider le traitement obstétrical car on peut douter de l'intérêt de prolonger la grossesse en cas de chorioamniotite documentée au troisième trimestre Après l'accouchement, le germe sera recherché dans le placenta et chez le nouveau-né (sang, peau, gorge, estomac, liquide céphalorachidien, urines) L'examen anatomique du placenta peut montrer des abcès multiples, très évocateurs Évolution Les formes graves pour la mère sont rares En revanche, le pronostic fœtal reste sombre Dans les séries publiées depuis une dizaine d'années, le taux global de pertes fœtales et néonatales est compris entre 25 et 50 % Sur les 66 cas observés en France en 1999, la mortalité fœtale et néonatale atteint 26 % Le pronostic dépend essentiellement de l'âge gestationnel : la mortalité est supérieure à 60 % aux deux premiers trimestres, passe à 37 % au septième mois et devient inférieure à 5 % au voisinage du terme Traitement Traitement médical L monocytogenes possède une résistance naturelle aux céphalosporines Il est sensible à la plupart des autres classes d'antibiotiques Parmi celles-ci : l'amoxicilline est le traitement de référence, mais son efficacité est lente du fait d'une pénétration intracellulaire limitée et d'une action uniquement bactériostatique ; les aminosides ont un effet synergique avec l'amoxicilline et sont bactéricides ; le triméthoprime-sulfaméthoxazole a une bonne activité mais est contre-indiqué au premier trimestre en raison d'un effet tératogène, et à l'approche du terme du fait d'un risque d'ictère néonatal par libération de la bilirubine fixée à l'albumine ; les macrolides ont une action antagoniste s'ils sont utilisés avec les pénicillines ou les aminosides ; la vancomycine n'est pas adaptée aux localisations neurologiques car elle ne traverse pas la barrière méningée Rappelons que toute fièvre inexpliquée chez une femme enceinte justifie un traitement antibiotique débuté sans attendre les résultats des examens bactériologiques Le traitement recommandé dans ce cas est l'amoxicilline per os, 2 g/j pendant 10 jours En cas de listériose prouvée, le traitement de référence est l'amoxicilline à dose élevée (6 g/j) pendant 3 semaines, associée pour certains à un aminoside pendant 10 à 15 jours afin d'obtenir une action bactéricide Certains prescrivent un traitement d'entretien par l'amoxicilline seule jusqu'au terme, mais l'intérêt de cette mesure n'est pas démontré En cas d'allergie aux pénicillines, on peut utiliser un macrolide, la vancomycine, un aminoside ou le triméthoprime-sulfaméthoxazole, surtout au deuxième trimestre Traitement préventif Il repose sur trois types de mesures : la réduction de la contamination des aliments par des normes d'hygiène et le contrôle des élevages et de l'industrie agroalimentaire Ces mesures ont probablement joué un rôle déterminant dans la réduction spectaculaire de l'incidence de la listériose au cours de la dernière décennie ; la détection précoce des formes épidémiques et l'identification des aliments responsables grâce au réseau EPIBAC, à la déclaration obligatoire et au CNR des Listeria ; l'information des femmes enceintes sur les mesures d'hygiène alimentaire En revanche, selon les recommandations du conseil supérieur d'hygiène publique, la consommation d'un aliment qui s'avérerait a posteriori contaminé n'est pas une indication d'antibioprophylaxie Une information aux consommateurs est dans ce cas impérative mais suffisante, les invitant à consulter sans délai en cas de fièvre survenant dans les 2 mois suivant la consommation de l'aliment contaminé. | ISTEX | Scientific |
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