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On observe une augmentation significative de l' incidence des anomalies externes, des tissus mous et du squelette chez le lapin à la dose de 1 mg/ kg/ j, dose qui se révèle également toxique pour les mères.	EMEA_V3	Medicinal
Les immuno-dépresseurs. 3. Les immuno-dépresseurs en hématologie	WMT16	Scientific
Forme vésicale isolée d'un épendymome de la queue de cheval	WMT16	Scientific
Etude de l'activité antibactérienne in vitro de dix quinolones sur vingt souches de Legionella pneumophila	WMT16	Scientific
Quelles sont les conséquences des horaires postés, au cours des stages, sur le sommeil et le mode de vie des étudiants sages-femmes ? Laura Goubet To cite this version : Laura Goubet. Quelles sont les conséquences des horaires postés, au cours des stages, sur le sommeil et le mode de vie des étudiants sages-femmes ? . Médecine humaine et pathologie. 2014. hal-01844632 HAL Id : hal-01844632 Submitted on 19 Jul 2018 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. AVERTISSEMENT l'ensemble de Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l'utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact : ddoc-memoires-contact@univ-lorraine. fr LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335. 2- L 335. 10 Université de Lorraine École de Sages-femmes de Metz Quelles sont les conséquences des horaires postés, au cours des stages, sur le sommeil et le mode de vie des étudiants sages-femmes ? Mémoire présenté et soutenu par GOUBET Laura Née le 24 Septembre 1991 Promotion 2010-2014 Université de Lorraine École de Sages-femmes de Metz Quelles sont les conséquences des horaires postés, au cours des stages, sur le sommeil et le mode de vie des étudiants sages-femmes ? Mémoire présenté et soutenu par GOUBET Laura Née le 24 Septembre 1991 Promotion 2010-2014 Cet écrit n'engage que la responsabilité de son auteur Remerciements J'adresse mes remerciements aux personnes qui m'ont aidée et soutenue dans la réalisation de ce mémoire : À M. Wissler, pneumologue spécialisé dans les pathologies du sommeil et de la vigilance. En tant que Directeur de mémoire, il m'a apporté son aide, sa gentillesse et sa disponibilité. À Mme Spyckerelle, sage-femme enseignante à l'école de sage-femme de Metz, pour son aide et ses conseils. Aux écoles de Metz, Nancy, Reims et Strasbourg, pour leur participation. À ma famille et mes amis, pour leurs encouragements. Huile sur toile Le Sommeil , Salvator Dal, 1937. Salvator Dal : J'ai souvent imaginé et représenté le monstre du sommeil comme une lourde tête géante avec un corps filiforme soutenu en équilibre par les béquilles de la réalité. Lorsque ces béquilles se brisent, nous avons la sensation de tomber. La plupart de mes lecteurs ont expérimenté cette sensation de tomber brusquement dans le vide, juste à la minute o le sommeil va les gagner complètement. Réveillés en sursaut, le cœur agité par un tremblement convulsif, vous ne vous doutez pas l'expulsion de l'accouchement . toujours que cette sensation est une réminiscence de Sommaire INTRODUCTION . 1 PARTIE 1 : LE CADRE DE REFERENCE . 2 1. LE SOMMEIL . 3 1. 1 Les fonctions du sommeil . 3 1. 2 Le sommeil des français : un enjeu de santé publique ? . 3 1. 3 Architecture du sommeil . 5 1. 4 Régulation de la veille et du sommeil . 11 1. 5 Troubles du sommeil . 16 2. LE TRAVAIL POSTÉ ET TRAVAIL DE NUIT . 17 2. 1 Définitions et réglementation . 17 2. 2 Données démographiques . 18 2. 3 Les troubles associés au travail posté et/ou de nuit . 18 2. 4 Mesures de prévention face aux risques d'accidents et presque-accidents liés à la somnolence . 26 PARTIE 2 : LA DEMARCHE DE RECHERCHE . 29 1. MÉTHODOLOGIE DE LA RECHERCHE . 30 1. 1 Problématique . 30 1. 2 Hypothèses . 30 1. 3 Objectifs . 30 1. 4 Présentation de l'enquête . 30 1. 5 Biais et difficultés rencontrées . 31 2. PRÉSENTATION DES RÉSULTATS DE L'ÉTUDE . 32 2. 1 Caractéristiques de la population interrogée . 32 2. 2 Pendant la période de stage. 34 2. 3 Typologie circadienne, chronotype . 34 2. 4 Le sommeil des étudiants sages-femmes . 35 2. 5 Évolution de la fréquence des troubles pendant toute la durée du stage jusqu'à une semaine après . 38 2. 6 Mode de vie des étudiants sages-femmes . 40 2. 7 Conduite automobile . 43 PARTIE 3 : ANALYSE ET DISCUSSION . 45 1. PRÉSENTATION DE LA POPULATION . 46 2. DETTE DE SOMMEIL . 48 3. TROUBLES LIÉS À LA PRIVATION DE SOMMEIL ET À LA DÉSYNCHRONISATION DES RYTHMES BIOLOGIQUES . 52 3. 1 Troubles liés à une restriction de sommeil . 52 3. 2 Troubles liés à une restriction de sommeil et à une désynchronisation des rythmes biologiques . 56 4. MODIFICATIONS DU MODE DE VIE DES ÉTUDIANTS . 59 4. 1 Alimentation. 59 4. 2 Face à la somnolence . 59 4. 3 Face aux troubles du sommeil . 61 5. PROPOSITIONS FAITES AUX ÉTUDIANTS SAGES-FEMMES . 62 5. 1 Avant une garde de jour . 62 5. 2 Avant une garde de nuit . 63 5. 3 Au cours d'une garde de nuit . 64 5. 4 En sortant de garde . 65 5. 5 Pendant les repos ou à l'école . 66 CONCLUSION . 69 BIBLIOGRAPHIE . 70 ANNEXES . 76 Introduction Le sommeil est indispensable à l'intégrité physique et psychique de l'Homme. Il y consacre près d'un tiers de sa vie. Cependant, ses fonctions restent encore un mystère en biologie. Ces dernières années, les pouvoirs publics considèrent le sommeil comme un problème de santé public insuffisamment pris en compte en termes d'éducation et de prévention. En effet, la diminution du temps total de sommeil des français, la prévalence des troubles du sommeil et le taux de consommation de psychotropes les interpellent. Par ailleurs, nous savons que les jeunes adultes et les travailleurs postés sont les plus touchés par cette problématique. Actuellement, malgré son caractère dérogatoire, le travail posté concerne presque 20 % de la population française. Or, il est prouvé que ce type de travail entrane à plus ou moins long terme des conséquences sur la santé des employés. Au cours de leur formation, les étudiants sages-femmes effectuent des stages, le plus souvent en milieu hospitalier et selon des horaires postés. Lors de ces derniers, les étudiants rapportent des difficultés d'endormissement, un sommeil non récupérateur ou raccourci, des troubles de concentration, une prise ou une perte de poids, des accidents routiers, etc. Ces constats nous amènent à nous demander quelles conséquences les horaires postés peuvent avoir sur le sommeil et le mode de vie des étudiants au cours des stages. La première partie de ce mémoire est une revue de la littérature rapportant des données générales sur le thème du sommeil. Elle comporte aussi les principales informations concernant le travail posté et ses conséquences sur les employés. Ensuite, la deuxième partie de ce document est consacrée à la présentation de l'enquête réalisée, de l'outil utilisé et des résultats obtenus à son issue. Enfin, la troisième partie est une analyse et une discussion des résultats de l'enquête. Elle permet, au terme du travail de recherche, de faire des propositions destinées aux étudiants sages-femmes, qu'ils pourraient appliquer au cours de leur formation et tout au long de leur carrière professionnelle. 1 Partie 1 : Le cadre de référence 2 1. LE SOMMEIL 1. 1 Les fonctions du sommeil [9], [16], [19], [23], [25], [36], [41], [52] Depuis l'antiquité, le sommeil a toujours été incriminé, au moins partiellement, dans l'émergence ou dans l'aggravation de certaines maladies. Or, ce n'est qu'après 1950 que la médecine du sommeil a vu le jour. Actuellement, les fonctions du sommeil restent encore un mystère en biologie. D'ailleurs, même si plusieurs théories ont été proposées, aucune ne fait l'objet d'un consensus à ce sujet. Le sommeil n'est pas seulement un temps de repos ou de détente, il est un besoin vital, rythmique et adaptatif. Il est indispensable à la vie tant au plan physique que psychique. Pour preuve, nous consacrons près d'un tiers de notre vie à dormir. Pour étayer ces propos, il est possible de citer plusieurs théories, dont l'énumération n'est pas exhaustive, concernant les fonctions du sommeil. - Les processus neurocognitifs dont la mémorisation, l'apprentissage, la concentration et la vigilance - La performance physique - Les secrétions hormonales de mélatonine, de cortisol ou d'hormone de croissance entre autres - La récupération de la fatigue physique au cours du sommeil lent - La plasticité cérébrale et la consolidation de la mémoire au cours du sommeil paradoxal - La contribution à renforcer les défenses immunitaires - Le rôle dans la régénération cellulaire 1. 2 Le sommeil des français : un enjeu de santé publique ? [2], [21], [22], [23], [24], [31], [33], [35], [48], [49] Comme évoqué précédemment, nous passons près d'un tiers de notre existence à dormir. Néanmoins, ces dernières années, différentes études épidémiologiques ont montré une réduction du temps total de sommeil des français. En effet, en un siècle, la durée moyenne de sommeil par nuit a été amputée d'un cycle, soit environ 90 minutes. Les populations les plus touchées par la privation de sommeil, qu'elle soit aige ou chronique, sont les jeunes adultes, les parents d'enfants en bas âge, les voyageurs fréquents et les travailleurs postés et/ou de nuit. 3 la En effet, malgré son caractère dérogatoire, tendance actuelle est au développement des emplois en horaires atypiques. En France, le travail posté et/ou de nuit concernerait aujourd'hui un employé sur cinq. Il est prouvé que ce type de travail peut entraner à court, à moyen ou à long terme des conséquences de divers ordres. Les risques accidentels, les troubles neurocognitifs, les troubles de l'humeur, du sommeil, digestifs, nutritionnels, métaboliques, cardiovasculaires et risques spécifiques chez la femme en sont quelques exemples. L'Institut National du Sommeil et de la Vigilance (INSV) a mené en 2013 une enquête sur un échantillon de 1008 personnes âgées de 18 ans et plus. Les premières conclusions montrent que 30% des personnes interrogées dorment moins de 6 heures, que 69% des individus se réveillent au moins une fois par nuit et que 4 personnes sur 10 déclarent souffrir d'au moins un trouble du sommeil, en particulier d'insomnie. De plus, environ un français sur deux ne considère pas ses nuits comme satisfaisantes. [33] Les pathologies du sommeil sont très fréquentes dans la population mondiale. En France, près de 20% sont insomniaques, 10% se plaignent de somnolence diurne et près de 1 français sur 3 déclare souffrir d'un trouble récurrent du sommeil et de la vigilance. [16] De plus, selon l'Observatoire Français des Drogues et des Toxicomanies (OFDT), en France, en 2010, 18 % des 18-75 ans déclarent avoir pris au moins un médicament psychotrope au cours des 12 derniers mois. En hausse de 3 points par rapport à 2005. L'usage est nettement plus important chez les femmes . [48] Cette constatation est confirmée en janvier 2012 par l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé (Afssaps) : 20 % de la population Française a consommé au moins une fois une benzodiazépine ou apparentée et 60% des consommateurs de benzodiazépines ou apparentées sont des femmes . De plus, en 2010, selon les données de production et de vente déclarées par les États, la France arriverait en deuxième position après la Belgique pour les hypnotiques, tandis que, pour les anxiolytiques, elle serait en sixième position des pays européens [49]. Pour rappel, les psychotropes rassemblent les neuroleptiques, les antidépresseurs, les anxiolytiques et les hypnotiques. Ces deux dernières classes étant majoritairement représentées par les benzodiazépines. En ce qui concerne les étudiants sages- femmes, une étude sur le bien-être étudiant a été menée en 2012 par l'Association Nationale des étudiants sages-femmes (ANESF) auprès de 937 étudiants sages-femmes de 20 écoles différentes. Elle montre une consommation de somnifères de 8, 54 % et pour la moitié d'entre eux, la formation est la cause de cette consommation . Elle montre aussi que 77, 49 % des étudiants se sont 4 sentis plus stressés depuis leur entrée dans la formation . Les étudiants sages-femmes sont d'avantage touchés par les problèmes de sommeil depuis leur entrée à l'école . [5] Pour résumer, les données épidémiologiques concernant le temps total de sommeil, la prévalence des pathologies du sommeil, la tendance actuelle au développement des emplois à horaires postés et/ou de nuit et les chiffres sur la consommation de psychotropes des français posent question. Ces dernières années, les pouvoirs publics s'intéressent de plus en plus au sommeil, à ses pathologies et aux répercussions collectives humaines et sociales qui en découlent, apparaissant insuffisamment pris en compte en termes d'éducation et de prévention 1. 3 Architecture du sommeil 2. 3. 1 Les cycles du sommeil [34], [35], [36], [39], [41], [43], [52] Au cours d'une nuit de sommeil, il est possible de différencier plusieurs stades. Leur identification est rendue possible dès 1950 grâce à la polysomnographie. C'est une technique associant l'enregistrement simultané de l'électroencéphalogramme (EEG), l'électromyogramme du menton (EMG) et l'électro-oculogramme (EOG). Figure 1 : Polysomnographie - L'éveil Il est caractérisé par de nombreux mouvements oculaires, une respiration rapide et irrégulière, une fréquence cardiaque élevée et un seuil de réponse aux stimuli très bas. - L'endormissement et le sommeil lent L'endormissement et le sommeil lent sont caractérisés par la fermeture des paupières, l'absence de mouvements corporels, une respiration calme et régulière, une fréquence cardiaque, un tonus musculaire et une température centrale diminués. 5 Il est possible de distinguer deux stades de sommeil lent : Le sommeil lent léger (stade 1 et 2) : Il peut occuper 40 à 50 % du temps total de sommeil chez l'adulte. Il est caractérisé par : o un affaiblissement du tonus musculaire o o o la disparition de la conscience de l'environnement extérieur le ralentissement de l'activité cérébrale la diminution de la fréquence respiratoire Le sommeil lent profond (SLP) ou sommeil à ondes lentes (stade 3) : Il peut occuper 20 à 25% d'une nuit d'un adulte. Le SLP est abondant au cours des deux premiers cycles puis diminue au cours des cycles suivants. Il est généralement reconnu pour favoriser la récupération physique. En effet, il permettrait la reconstitution de l'intégrité physique par augmentation nocturne de la synthèse de protéines et des divisions cellulaires. En cas de privation de sommeil, la quantité de SLP est augmentée par un effet rebond. En cas de sommeil diurne, la quantité de SLP diminue du fait de la consommation diurne de la mélatonine. - Le sommeil paradoxal (SP) ou le sommeil du rêve Le sommeil paradoxal peut occuper 25% d'une nuit d'un adulte. Il survient toujours après une phase de sommeil lent. C'est un sommeil profond que seul un stimulus important peut interrompre. Les épisodes de SP sont toujours interrompus par un éveil très court pendant la nuit, appelé micro-éveil, et par un éveil définitif le matin. Réveiller un individu en sommeil paradoxal lui permet de se souvenir plus facilement de ses rêves. Le SP contribue à l'apprentissage, à la consolidation de la mémoire et à l'équilibre psychologique. Un individu privé de sommeil paradoxal risque par ailleurs de souffrir de troubles de l'humeur de type dépressif. 2. 3. 2 Distribution des stades au cours du sommeil [34], [35], [36], [39], [41], [43], [52] Le sommeil lent profond prédomine en début de nuit alors que le sommeil paradoxal et le sommeil lent léger sont majoritaires en fin de nuit. 6 L'alternance du sommeil lent, du sommeil paradoxal et des micro-éveils constitue un cycle de sommeil. Chez l'Homme, un cycle dure environ 90 minutes et chaque nuit de sommeil peut en contenir entre 3 et 5, en fonction que le sujet est un court, un moyen ou un long dormeur. Figure 2 : Hypnogramme d'un sujet normal 2. 3. 3 Facteurs influençant la durée et l'architecture du sommeil [4], [8], [10], [14], [23], [24], [26], [27], [32], [33], [34], [36], [37], [39], [42], [43], [44], [47], [50], [53], [55], [56] - Sexe, poids et âge Il est régulièrement rapporté dans la littérature que : o o o o les troubles du sommeil sont plus fréquents chez les femmes que chez les hommes l'obésité diminue la durée et altère la qualité du sommeil la durée et l'architecture du sommeil diffèrent en fonction que le sujet est un nourrisson, un enfant, un adolescent, un adulte ou une personne âgée. l'horloge biologique deviendrait moins souple avec l'âge - Typologie circadienne ou chronotype Le test de Horne et Ostberg (Annexe III) permet de définir la typologie circadienne et de classer les individus dans les catégories suivantes : 7 Court , moyen ou long dormeur : La durée moyenne de sommeil d'un adulte se situe entre 7h00 et 8h00. Or, il existe une grande variabilité interindividuelle. Les individus, dont la durée de sommeil est inférieure à 6h00, sont dits courts dormeurs . Ceux dont la durée de sommeil est supérieure à 9h00 sont dits longs dormeurs . La quantité de sommeil lent profond est identique chez les courts et les longs dormeurs. C'est la quantité de sommeil lent léger et de sommeil paradoxal qui diffère. tout à fait du matin , modérément du matin , neutre , modérément du soir et tout à fait du soir : Certains individus sont dits du soir : ils ont une tendance à se coucher tard et à se réveiller tard. Ils voient leurs performances au maximum le soir, se réveillent fatigués et trouvent qu'il est difficile de rester éveillé le matin. D'autres sont dits du matin : ils ont une tendance à se coucher tôt et à se réveiller tôt. Ils sont fatigués le soir, se réveillent en forme et alertes et trouvent qu'il est difficile de rester éveillé la nuit. Le syndrome d'avance de phase : Ce trouble du rythme circadien se caractérise par une tendance à s'endormir et à se réveiller selon un horaire précoce. Il s'observe plus fréquemment chez les personnes âgées. Le syndrome de retard de phase : Il ne s'agit pas d'une insomnie vraie mais d'un retard de la période principale de sommeil et une tendance à s'endormir ou se réveiller à des horaires tardifs. Ce trouble du rythme circadien concerne surtout les adolescents et les jeunes adultes. - Environnement Si les influences de l'environnement physique et social, telles que les conditions thermo hygrométriques, la luminosité, l'environnement sonore et les habitudes de vie, sont reconnues comme pouvant modifier la durée et l'architecture du sommeil, elles n'expliquent pas toutes les variabilités inter et intra-individuelles observées. 8 - Sommeil diurne L'horaire de sommeil présente une influence évidente sur sa durée et son architecture. Le sommeil diurne est de moins bonne qualité et en quantité moindre que le sommeil nocturne. Tout d'abord, le sommeil lent profond est présent en faible quantité car la mélatonine à sécrétion nocturne a été consommée. Ensuite, plusieurs études ont montré que les durées de sommeil les plus longues sont enregistrées après des couchers entre 19 h et 23 h, correspondant à la courbe descendante de la température centrale. A l'inverse, les durées de sommeil les plus courtes sont enregistrées après des couchers entre 7 h et 11 h, correspondant à la phase ascendante de la température centrale. Et enfin, lorsque l'on dort, l'organisme est au repos mais il continue à recevoir des stimuli de l'environnement. La lumière, les conditions thermo-hygrométriques et le volume sonore sont responsables d'une diminution du temps et de qualité du sommeil par allongement du délai d'endormissement, par augmentation du nombre de micro éveils ou par induction d'un réveil prématuré de l'individu. - Privation de sommeil Une privation de sommeil, qu'elle soit aige ou chronique, a pour conséquence la création d'une dette de sommeil. L'architecture du sommeil de récupération venant à la suite d'une dette de sommeil est modifiée. Ainsi, au cours des premières nuits de récupération : o o o la latence d'endormissement est raccourcie la durée totale de sommeil est augmentée la quantité de sommeil lent profond et de sommeil paradoxal est augmentée - Consommation de tabac/nicotine, de caféine ou d'alcool Tabac et Nicotine Les troubles du sommeil observés chez le fumeur sont des difficultés d'endormissement, des difficultés de maintien de sommeil, une somnolence diurne excessive. De plus, le tabagisme favorise les ronflements et les apnées obstructives du sommeil. Plus le sujet est gros fumeur, plus la durée du sommeil lent profond est réduite. 9 Caféine Il est possible de retrouver cette substance psychostimulante dans le café, le thé, les boissons gazeuses type cola, les boissons énergisantes, le chocolat, les friandises et dans certaines préparations pharmaceutiques. La caféine agit au bout de 30 à 75 minutes, ses effets sont dose dépendants et sa demi-vie d'élimination est d'environ 4 à 6 heures. Chez les femmes prenant des contraceptifs oraux, la demi-vie est d'environ 5 à 10 heures. A l'inverse, le fait de fumer diminue la demi-vie de la caféine. Elle induit une augmentation de la latence d'endormissement, du nombre et de la durée des réveils intra sommeil et réduit la quantité de sommeil lent profond au cours du de la nuit. Au long cours, sa consommation est associée à une réduction de la durée moyenne de sommeil. Alcool La prise d'alcool près de l'heure du coucher favorise l'endormissement mais occasionne un sommeil plus fragmenté en deuxième partie de nuit et des réveils matinaux prématurés. - Comportements La sieste Eviter de faire la sieste renforce l'homéostasie du sommeil et minimise les difficultés de sommeil la nuit suivante. Le processus homéostasique est expliqué au chapitre 1. 4 Régulation de la veille et du sommeil. La composition et l'organisation des différents stades de sommeil au cours de la sieste dépend à la fois de la plage horaire dans laquelle elle se situe et de sa durée. Activité physique La pratique d'une activité sportive régulière améliore la qualité et la durée du sommeil. En effet, la latence d'endormissement est réduite, les réveils intra-sommeil sont moins fréquents, la durée de sommeil lent profond est augmentée et la vigilance diurne est améliorée. A l'inverse, l'exercice physique pratiqué de manière intensive ou trop tardivement peut retarder l'endormissement. 10 1. 4 Régulation de la veille et du sommeil Le sommeil est un processus physiologique dynamique dont la subtile régulation est régie par l'interaction permanente entre deux grands processus : le processus homéostasique (S) et le processus circadien (C). L'horaire, la quantité et la qualité du sommeil dépendent directement de ces deux processus. 1. 4. 1 Processus homéostasique ou processus S [43] Le processus homéostasique reflète la propension au sommeil ou, autrement dit, le besoin en sommeil. C'est un processus accumulatif qui augmente pendant la veille et se dissipe pendant le sommeil. Figure 3 : Évolution de la pression homéostasique du sommeil au cours du temps. La pression augmente durant l'éveil entre 7 heures et 23 heures et diminue durant le sommeil entre 23 heures et 7 heures (d'après BORBELY 2001) Le caractère vital du sommeil pousse l'organisme à s'endormir qu'elles que soient les circonstances, y compris au décours d'activités intenses, si la dette de sommeil est trop grande. Le processus homéostasique est la propension à s'endormir au cours du nycthémère en fonction de ses besoins en sommeil. Ce phénomène s'appelle la pression de sommeil. D'ailleurs, la somnolence diurne est le signe d'une pression de sommeil importante. Ce processus permet de contrôler les besoins journaliers de sommeil. [424] 1. 4. 2 Processus circadien ou processus C [43], [35], [19] Le terme circadien signifie rythme d'environ 24 heures . Il est important de différencier les rythmes circadiens des rythmes nycthéméraux ou diurnes. En effet, ces derniers ne sont qu'une réponse à l'environnement. A l'inverse, les rythmes biologiques dits circadiens sont générés par l'horloge biologique centrale autrement appelée horloge biologique interne ou encore horloge circadienne endogène. 11 L'horloge biologique circadienne se situe dans l'hypothalamus, au sein des noyaux supra chiasmatiques. Elle est caractérisée par deux propriétés fondamentales : - Son activité est endogène et elle impose la position du sommeil et de l'éveil sur environ 24 heures. Elle est indépendante de la quantité de veille ou de sommeil préalables. - Elle doit être en permanence synchronisée, c'est-à-dire remise à l'heure : o par des synchroniseurs exogènes comme la lumière et les zeitgebers principalement o par des synchroniseurs endogènes tels que la température corporelle, le cortisol et la mélatonine Figure 4 : Propension circadienne au sommeil au cours des 24 heures. La propension la plus faible est au cours de l'après-midi. A l'opposé, la propension la plus forte au sommeil est au milieu de la nuit (d'après BORBELY 2001) Elle est responsable de l'organisation de nombreux rythmes et fonctions vitales tels que : - - la température interne la sécrétion de différentes hormones comme la mélatonine, l'hormone de croissance, le cortisol, les hormones sexuelles, les hormones thyroïdiennes. - variations du rythme cardiaque, de la tension artérielle, de la fréquence respiratoire - La fonction rénale - La vigilance - Les performances cognitives - La mémoire - L'efficacité musculaire - Les activités gastro-intestinales 12 De nombreuses autres fonctions ou activités biologiques circadiennes sont régulièrement découvertes. Par exemple, le système circadien vient d'être récemment impliqué dans le contrôle de la division cellulaire, de l'apoptose dans le cancer et dans la réparation de l'ADN. Interactions entre processus homéostasique et processus 1. 4. 3 circadien[43] Les processus homéostasique et circadien sont interdépendants. En effet, la pression de sommeil augmente au cours de la période de veille grâce au processus homéostasique. L'accumulation de cette pression est contrecarrée par l'augmentation de la pression d'éveil, grâce au processus circadien, qui atteint des niveaux maximum en fin de journée. Au début de la sécrétion de mélatonine, à l'arrivée de l'obscurité, la pression d'éveil chute brutalement. Comme la pression de sommeil est élevée, l'endormissement est possible. En fin de nuit, lorsque la pression de sommeil est au plus bas, et lorsque la pression d'éveil remonte, le réveil intervient. 1. 4. 4 Synchronisation de la composante circadienne [1], [7], [8], [10], [19], [27], [34], [35], [39], [43], [52], [53] o Synchroniseurs externes La lumière Même si l'horloge possède une activité endogène, elle n'est pas complètement indépendante de l'environnement. Chez les mammifères, la lumière est le plus puissant synchroniseur de l'horloge circadienne. La lumière est un synchroniseur cinq à dix fois plus puissant que le rythme social. Elle agit depuis la rétine vers les noyaux supra chiasmatiques par l'intermédiaire du tractus rétinohypothalamique. L'alternance jour/nuit permet la resynchronisation quotidienne de l'horloge sur 24 heures. Cependant, la sensibilité de l'horloge biologique à la lumière dépend de l'intensité de celle-ci, de la durée d'exposition, du mode d'exposition, de l'horaire d'exposition et de sa longueur d'onde. C'est en fin de journée, vers 18 heures, que l'horloge y est la moins sensible et c'est peu après le lever qu'elle y est le plus. La lumière inhibe la sécrétion de mélatonine. C'est la raison pour laquelle, la Haute Autorité de Santé (HAS) recommande aux travailleurs postés et/ou de nuit de limiter l'exposition à la lumière en fin de poste et de dormir dans l'obscurité complète pour faciliter le sommeil (Grade C). 13 Les Zeitgebers ou l'horloge sociale L'horloge sociale est un synchroniseur puissant qui permet d'organiser notre vie en société. Elle inclut la vie familiale (enfants, conjoint, parents), la vie sociale et associative, la vie professionnelle, les loisirs, les activités sportives et les moments de détente. Figure 5 : Schéma récapitulatif des synchroniseurs externes o Synchroniseurs internes La mélatonine ou hormone du sommeil La mélatonine a été identifiée en 1958. C'est l'hormone centrale de régulation des rythmes chronobiologiques. Elle est le métabolite de la sérotonine et du tryptophane. Elle est secrétée par l'épiphyse (ou glande pinéale) selon un rythme circadien directement contrôlé par l'horloge biologique. Sa sécrétion est contrôlée par l'hypothalamus qui reçoit l'information lumineuse par la rétine via le tractus rétinohypothalamique. Figure 5 : Schéma simplifié de la sécrétion de mélatonine Ce rythme endogène est entrainé par le rythme nycthéméral (alternance jour/nuit) et met en permanence l'organisme en phase avec l'environnement. 14 Sa sécrétion nycthémérale est faible voire indétectable en diurne (en présence de lumière). A l'inverse, sa sécrétion est activée dès l'approche de la nuit (en l'absence de lumière) avec une concentration plasmatique maximum atteinte en général vers 3 heures du matin mais variant en fonction du chronotype de l'individu. Ce pic plasmatique explique le moment de somnolence intense des travailleurs postés survenant à cet horaire. De plus, elle est secrétée selon un rythme circannuel. Ces rythmes, chez l'Homme, se traduisent par les variations saisonnières de la sécrétion de cette hormone induisant soit un syndrome d'avance de phase en hiver, soit un retard de phase en été. Elle explique, par le manque d'ensoleillement, l'augmentation de la fatigue et de la tristesse durant l'automne et l'hiver aussi nommée dépression saisonnière . Le rôle de la mélatonine est difficile à étudier chez l'Homme. La mélatonine constitue un synchroniseur endogène s'affirmant dans la régulation de grandes fonctions physiologiques telles que : - - - - la température corporelle la pression sanguine l'immunité les propriétés oncostatiques Cependant, la connaissance du rôle de la mélatonine reste incomplète. Chez les travailleurs postés : La baisse nocturne de la température corporelle facilite l'installation du sommeil. Chez les longs dormeurs, la durée de sécrétion de mélatonine est allongée et leur température corporelle reste ainsi abaissée plus longtemps. A l'inverse, lors du sommeil diurne des travailleurs postés, la sécrétion de mélatonine est faible voire indétectable. La température corporelle n'est pas au plus bas et explique que l'endormissement n'est pas favorisé et que le sommeil lent profond est de moins bonne qualité. o Un point sur la luminothérapie Le travail posté est une bonne indication à l'utilisation de la luminothérapie. Tout dabord, la lumière, même artificielle, selon les conditions d'exposition supprime ou décale la sécrétion de mélatonine. Lorsque l'éclairement est administré le soir, le pic de mélatonine est retardé et un retard de phase est obtenu (le pic de somnolence habituellement ressenti vers 3 heures du matin chez les travailleurs postés est retardé). À l'inverse, si la lumière est administrée le matin, le pic de mélatonine est 15 avancé et une avance de phase est obtenue (le pic de somnolence est avancé et l'endormissement est plus précoce). 1. 5 Troubles du sommeil [3], [11], [43], [44], [55] Les principaux troubles de sommeil sont résumés et classés dans le schéma ci-dessous. Figure 6 : Schéma des principaux troubles du sommeil - Le décalage horaire ou syndrome du jet-lag : C'est le syndrome de franchissement des fuseaux horaires. Il se manifeste par de l'insomnie, de la somnolence diurne et une réduction des performances lors du franchissement induit une désynchronisation entre le nouveau cycle veille/sommeil et les rythmes physiologiques de l'individu. - Le TTP ou trouble du rythme circadien du sommeil lié au travail rapide de plusieurs fuseaux horaires. Il posté est expliqué au chapitre (2. 3. 2 Adaptation au travail posté) 16 2. LE TRAVAIL POSTÉ ET TRAVAIL DE NUIT 2. 1 Définitions et réglementation Les notions de travail posté et de nuit ne font pas l'objet de définitions parfaitement consensuelles sur le plan réglementaire. 2. 1. 1 Le travail posté [6], [19], [28], [29], [40] La directive européenne 93/104/CE du conseil du 23 novembre 1993 précise qu' [] on appelle travail posté tout mode d'organisation du travail en équipe selon lequel des travailleurs sont occupés successivement sur les mêmes postes de travail, selon un certain rythme, y compris rotatif, et qui peut être de type continu ou discontinu, entranant pour les travailleurs la nécessité d'accomplir un travail à des heures différentes sur une période donnée de jours ou de semaines . C'est donc un travail par poste aux horaires successifs et alternants comme par exemple les 38 ou les 212. Le rythme de rotation est considéré comme long quand la durée passée sur le même poste dépasse cinq jours et comme court quand la durée est comprise entre un et trois jours. Les étudiants sages-femmes, au cours de leur formation, alternent entre un enseignement théorique, un enseignement clinique et des stages, le plus souvent en milieu hospitalier. Ils effectuent des stages en horaires postés dès le niveau L3. En effet, ils assurent des gardes en 12 heures de jour comme de nuit, la plupart du temps selon un rythme de rotation court. Chaque école impose, en fonction de ses possibilités et de son organisation, le nombre d'heures de stage et le type de roulement que les étudiants effectueront. Néanmoins, certaines conditions doivent être respectées : - Accorder un repos hebdomadaire de 48 heures consécutives par roulement sauf cas exceptionnel - Ne pas excéder 48 heures de stage sur une période de 7 jours - Respecter un repos quotidien de 12 heures consécutives - Imposer une pause d'au moins 20 minutes au cours de la garde 2. 1. 2 Le travail de nuit [28], [29], [40] Selon le Code du travail, le travail de nuit est défini comme tout travail entre 21 heures et 6 heures . Le salarié qui effectue au minimum 3 heures de travail pendant 17 cette période et ce, au moins deux fois par semaine, ou qui assure 270 heures de nuit pendant 12 mois consécutifs doit être considéré comme travailleur de nuit. Selon l'article L3122-32 du Code du travail, Le recours au travail de nuit est exceptionnel. Il prend en compte les impératifs de protection de la santé et de la sécurité des travailleurs et est justifié par la nécessité d'assurer la continuité de l'activité économique ou des services d'utilité sociale . 2. 2 Données démographiques [3], [8], [13], [19], [20], [21], [22], [28], [34] Les données démographiques sont basées sur une définition du travail posté et/ou de nuit plus restrictive que celle retenue au plan juridique. Selon ces données, en France, le travail posté et/ou de nuit concernerait aujourd'hui un employé sur cinq soit près de cinq millions de travailleurs. [3] De plus, parmi ces travailleurs et plus précisément dans le secteur de la santé, il existe une majorité de femmes. Prenons l'exemple des sages-femmes. Actuellement, selon les données du Conseil National de l'ordre des sages-femmes, il existe en France, 23365 Sages-femmes. Parmi elles, 64% travaillent en milieu hospitalier (49% dans le secteur public hospitalier, 3% en établissement de santé participant à l'intérêt collectif (ESPIC) et 12% en clinique privée). Ainsi, pour la plupart, elles travaillent selon des horaires postés. Le travail posté et/ou de nuit a d'abord été réservé aux activités qui ne pouvaient cesser pendant la nuit comme les activités de service et de sécurité (l'armée, la police, la santé, les transports) et les activités industrielles permanentes (les hauts-fourneaux, la métallurgie, les centrales électriques). Cependant, malgré son caractère dérogatoire défini par la loi du 9 mai 2001, la tendance actuelle est encore à l'extension des horaires décalés. 2. 3 Les troubles associés au travail posté et/ou de nuit [2], [13], [17], [19], [28], [29], [30], [31], [35], [39], [43], [44], [45], [46], [47], [50], [54], [58], [60], [61] 2. 3. 1 Désynchronisation Un adulte pratiquant une activité professionnelle diurne voit survenir, entre 2 et 5 heures du matin, pendant sa nuit biologique : - son minimum de : température corporelle o o de performances cognitives et de la mémoire à court terme 18 - son maximum de : o sécrétion de mélatonine o somnolence o pression de sommeil A l'inverse, la journée biologique est caractérisée par - une température corporelle élevée - une sécrétion de mélatonine indétectable - une vigilance et des performances cognitives maximum. cortisol, température interne, circadiens (mélatonine, Le travail posté et/ou de nuit induit chez le travailleur une désynchronisation entre rythmes rythme ses veille/sommeil, secrétions hormonales) et les horaires atypiques qui lui sont imposés. En effet, le salarié est éveillé pendant sa nuit biologique et dort pendant sa journée biologique . Suite aux changements fréquents d'horaires et en dépit du repos compensateur rendu obligatoire par le législateur, l'horloge biologique ne se remet pas à l'heure suffisamment rapidement, perd ses repaires et devient insensible aux synchroniseurs. De plus, tous les rythmes circadiens ne vont pas s'adapter à la même vitesse au nouvel horaire. Ce phénomène est appelé désynchronisation et contribue à l'apparition de troubles de divers ordres que nous détaillerons plus tard. 2. 3. 2 Adaptation au travail posté L'adaptation au travail posté est liée à l'équilibre entre trois facteurs : le facteur chronobiologique , le facteur sommeil et le facteur socio-économique . Il existe une grande variation interindividuelle face à la tolérance au travail posté et/ou de nuit. Seulement une minorité des travailleurs montre une adaptation complète de leurs rythmes biologiques à ces horaires atypiques. 19 L'organisme met entre 3 et 8 jours, selon les individus, pour s'adapter à un nouveau rythme veille/sommeil survenant de manière brutale, comme dans le travail posté ou lors de voyages transméridiens par exemple. o Le facteur chronobiologique : Plusieurs facteurs chronobiologiques semblent être prédictifs d'une bonne adaptation aux horaires décalés : - - - - le sens horaire de rotation des postes le chronotype du soir le sujet jeune le sexe masculin. Plusieurs facteurs chronobiologiques semblent être prédictifs d'une désadaptation au travail posté : - - - l'âge supérieur à 50 ans le travail domestique lourd le chronotype du matin les antécédents de troubles du sommeil et/ou psychiatriques. - - Le rythme de rotation court o Le facteur sommeil : Il est classique d'observer chez les travailleurs postés une diminution du temps total de sommeil de 1 à 2 heures par 24 heures et d'une altération de la qualité de ce dernier. L'explication est multifactorielle. Tout d'abord, les conditions environnementales sont non satisfaisantes et inadaptées au sommeil diurne (lumière, conditions thermo- hygrométriques, volume sonore). Ensuite, l'augmentation normale de la température corporelle survient dès 5 heures du matin. Puis, comme il a été décrit dans le chapitre variations de la durée et de l'architecture du sommeil , le sommeil diurne induit une modification de son architecture (augmentation de la latence d'endormissement, diminution de la quantité de sommeil paradoxal, réveils multiples et réveil précoce) d'o la sensation d'un sommeil non récupérateur et d'une somnolence diurne excessive. Cette restriction quotidienne et répétée de sommeil est responsable de la création d'une dette chronique de sommeil. 20 o Les facteurs domestique socio-économique ou personnel et La tolérance au travail posté impose un environnement domestique favorable. Des perturbations sociales et familiales sont souvent présentes, en relation avec les horaires alternants. Ces difficultés domestiques touchent particulièrement les femmes ayant des enfants en bas âge. 2. 3. 3 Conséquences directes de la restriction chronique ou aige de sommeil La dette de sommeil est définie comme le fait de dormir moins que ses besoins habituels. Elle peut être aigue ou chronique et produit des effets sur la majeure partie des fonctions du corps humain. Une dette cumulative et chronique de sommeil est responsable de somnolence, de fatigue et d'une altération des performances neuro-comportementales que nous détaillons ci-après. Il existe toutefois une différence interindividuelle en termes de sensibilité à la privation de sommeil. o La somnolence La somnolence est la propension plus ou moins irrésistible à s'endormir si l'on n'est pas stimulé, selon le principe de régulation homéostasique. En d'autres termes, c'est la difficulté à se maintenir éveillé. C'est un état intermédiaire entre le sommeil et l'éveil. Elle est à distinguer de la sensation de fatigue. Le niveau de somnolence d'un individu peut être évalué de manière : - subjective par l'échelle d'évaluation de somnolence d'Epworth. Les sujets évaluent leur risque de s'assoupir dans différentes situations de la vie courante (Annexe IV) - objective par le test de maintien d'éveil (TME) Après une nuit normale de sommeil, la somnolence présente une distribution bimodale nette avec un pic diurne vers 15 heures et un pic nocturne vers 3 heures. Comme nous l'avons déjà expliqué, la concentration plasmatique maximale de mélatonine est atteinte en général vers 3 heures du matin et explique la somnolence intense des travailleurs postés survenant à cet horaire. D'ailleurs, selon une enquête menée par l'INSV en 2009, la majorité des accidents mortels dus à la somnolence surviennent d'une part, entre 2H00 et 7H00 et d'autre part, entre 14H00 et 16H00. Chez 21 les travailleurs postés et/ou de nuit, la somnolence diurne excessive (SDE) est une plainte récurrente. En effet, elle toucherait 20% des travailleurs. o La fatigue C'est une notion subjective qui est le plus souvent sous-estimée. C'est une sensation d'affaiblissement physique ou psychique qui survient normalement à la suite d'un effort soutenu et qui impose la mise au repos. On parle de fatigue pathologique lorsque la personne se sent handicapée par rapport à son niveau de forme habituel pour effectuer ses activités quotidiennes. La fatigue chronique est un problème récurrent chez les travailleurs postés et/ou de nuit. Elle entraine une baisse de la vigilance, une diminution de la performance, une baisse de motivation, de l'irritabilité et une altération du jugement de la somnolence. o Les troubles de la vigilance et les difficultés de concentration La vigilance est l'état de réactivité à l'environnement dans lequel on se trouve quand on est éveillé. La vigilance varie selon le moment de la journée, la stimulation de l'individu, la motivation personnelle et selon l'importance de la dette de sommeil accumulée. Ainsi, une dette de sommeil est responsable d'une hypovigilance. De plus, la privation de sommeil induit un manque de concentration, des périodes d'inattention, une lenteur à la réalisation d'une action et des erreurs d'interprétation. En effet, une dette de sommeil allonge les temps de réaction de l'individu. Certains comparent même les difficultés de concentration d'un sujet à un taux d'alcoolémie selon l'équivalence suivante : o 17 heures d'éveil consécutives correspondraient à la quantité de 0, 5 gramme d'alcool dans le sang o 24 heures d'éveil à 1 gramme d'alcool dans le sang. o Les troubles de la mémorisation La privation de sommeil altère la mémoire à court terme. o Les troubles de l'humeur Les effets sur l'humeur sont une sensation de fatigue, un état dépressif ou anxieux, une irritabilité, une perte d'intérêt pour l'entourage et les évènements ainsi qu'une envie croissante et irrésistible de dormir. 22 o Le risque accidentel On attribue à plusieurs reprises la privation de sommeil comme principal facteur causal dans différentes catastrophes spectaculaires du XXème siècle comme la catastrophe de Bhopal survenue en 1984, la navette spatiale challenger en 1986 ou la catastrophe nucléaire de Tchernobyl également survenue en 1986. l'explosion de La somnolence et la baisse de la vigilance sont responsables d'une augmentation du risque d'accidents au travail et lors de la conduite automobile. En effet, la somnolence au volant est le premier facteur d'accident. Elle serait responsable d'un accident sur trois[31]. Selon, le Professeur P. Philip du centre du sommeil de Bordeaux, la somnolence au volant augmente le risque d'accident routier par 8. En France, en 2010, elle est intervenue dans 10 à 30% des accidents de la circulation et en 2011, elle est à l'origine de 85% des accidents mortels[34]. De plus, les périodes de travail prolongées, au-delà de 8 heures consécutives, et la durée de sommeil inférieure à 6 heures, augmentent le risque d'accidents ou de presque- accidents de la route dus à la somnolence. 2. 3. 4 Conséquences liées à une dette de sommeil et une désynchronisation des rythmes biologiques Les effets à long terme du travail posté et/ou de nuit sont plus difficiles à prouver que ceux à court terme, du fait de biais dans les études épidémiologiques. En effet, de nombreux facteurs confondants comme les conditions de travail, la tâche effectuée, le mode de vie, l'âge, l'ancienneté, la consommation de tabac, le niveau socio- économique, les antécédents personnels tels que le surpoids, la dyslipidémie et l'hypertension vont aggraver ou atténuer les conséquences de l'exposition aux horaires décalés. C'est pourquoi, nous ne détaillerons pas les conséquences du travail posté à long terme dans ce chapitre. o Les troubles du sommeil travail posté. En effet, comme expliqué précédemment, Il est dit dans plusieurs ouvrages que le sommeil est un bon indicateur de la tolérance au la désynchronisation des rythmes circadiens chez les travailleurs postés et/ou de nuit est à l'origine de nombreux troubles et notamment de troubles du sommeil. 23 L'insomnie L'insomnie est une plainte subjective et récurrente chez les 25-34 ans et chez les travailleurs postés et/ou de nuit. D'ailleurs, les conditions de travail sont souvent rapportées par les insomniaques comme étant à l'origine de leurs troubles. Elle désigne une durée et une qualité insuffisante de sommeil. Le diagnostic de l'insomnie et évoqué lorsque les troubles persistent depuis plus de trois mois. Elle est le plus fréquent des troubles du sommeil et atteint d'avantage les femmes que les hommes. De plus, sa fréquence augmente avec l'âge. Troubles du rythme circadien du sommeil lié au travail posté (TTP) De manière générale, les troubles du rythme circadien sont des troubles du sommeil et de l'éveil liés à une inadéquation entre les horaires réels de sommeil et les horaires souhaités. Le diagnostic repose sur la présence de symptômes sévères de somnolence et d'insomnie depuis au moins un mois et doivent être associés aux horaires atypiques de travail. o Les troubles digestifs L'équilibre nutritionnel est soumis à rude épreuve. D'après l'analyse de la littérature, le travail posté et/ou de nuit peut être associé à une augmentation modérée du risque d'ulcère gastrique et de symptômes digestifs tels que des troubles de l'appétit, des problèmes intestinaux avec une tendance à la constipation, aux nausées, au pyrosis, à la dyspepsie, aux brûlures d'estomac, aux douleurs abdominales, aux borborygmes et aux flatulences. Le facteur comportemental : alimentation à heures irrégulières, pauvre en fibres, consommation de plats industriels, consommation excessive d'excitants comme le café, le thé ou la nicotine. Le facteur chronobiologique : les sécrétions digestives (pepsine et gastrine) suivent une variation circadienne qui peut être perturbée chez les travailleurs postés. o Les troubles nutritionnels Il existe une corrélation entre diminution du temps total de sommeil et prise de poids ou obésité . En effet, lorsqu'un sujet dort 4 heures en moyenne, il mange 550 kcals de plus qu'un sujet qui a dormi pendant 8 ou 9 heures. Le manque de sommeil encourage la consommation d'aliments gras et sucrés. Ce phénomène s'explique par un 24 déséquilibre de la balance leptine/ghréline . La leptine et la ghréline sont deux hormones de la régulation de l'appétit. La leptine est anorexigène et la ghréline est orexigène. Le manque de sommeil stimule la sécrétion de ghréline et inhibe celle de la leptine ce qui conduit à une augmentation de l'appétit. Le schéma qui suit permet une visualisation synthétique de ce mécanisme. Figure 7 : Schéma simplifié de la régulation de l'appétit o Conséquences à long terme : Les troubles métaboliques et cardiovasculaires Sans entrer dans les détails de la physiopathologie, il existe un lien entre durée de sommeil et : o Altération du métabolisme glucidique favorisant à long terme l'apparition de diabète de type 2 o Pathologies cardiovasculaires comme l'hypertension artérielle. Pour reprendre le cas du travailleur posté et/ou de nuit, il est important de comprendre qu'il cumule plusieurs facteurs de risque favorisant l'augmentation de la prévalence des troubles nutritionnels, métaboliques et cardiovasculaires. En plus d'une dette cumulative et chronique de sommeil, le travailleur se voit modifier ses habitudes comme par exemple un régime alimentaire déséquilibré, des horaires de repas irréguliers, une prise alimentaire au cours de la nuit et une augmentation de la consommation de boissons caféinées ou de tabac. Le risque de cancers Le système circadien vient d'être récemment impliqué dans le contrôle de la division cellulaire, de l'apoptose et dans la réparation de l'ADN. Ainsi, sa désynchronisation pourrait être responsable de la prévalence accrue de certains cancers. De plus, le travail posté a été classé en 2007 par le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC) comme cancérogène probable pour l'être humain[29]. 25 Risques spécifiques chez la femme o Augmentation de la prévalence du cancer du sein (Annexe I) o Risques liés à la grossesse : augmentation modérée de la prévalence de restriction de croissance intra-utérine, de prématurité et de risque de fausses couches 2. 3. 5 Perturbations de la vie sociale et familiale Les travailleurs postés et/ou de nuit peuvent rencontrer des difficultés à gérer l'alternance entre vie professionnelle, vie personnelle et familiale. En effet, le plus souvent, le travail posté implique un service continu et contraint les employés à venir le samedi, le dimanche et les jours fériés. Ces difficultés sont considérées par les travailleurs et leurs familles comme les plus gênantes. L'employé de nuit se voit obligé, soit de se soumettre aux habitudes de la famille, aux horaires de ses loisirs (au détriment de sa récupération en sommeil), soit de soumettre sa famille à ses propres horaires, soit de suivre un rythme partiellement indépendant de celle-ci. A long terme, les discordances des emplois du temps tendent à s'accompagner d'une altération de la qualité des relations sociales et d'un isolement. 2. 4 Mesures de prévention face aux risques d'accidents et presque-accidents liés à la somnolence [28], [34], [35], [39], [42], [43], [54], [61] 2. 5. 1 La sieste La sieste est une mesure de grande valeur en termes de prévention des risques d'accidents automobiles ou d'accidents au travail. Elle est recommandée par la Haute Autorité de Santé (HAS) (Grade B) chez les travailleurs postés et/ou de nuit. En effet, elle permet d'améliorer la vigilance et la performance, de lutter contre la fatigue et la somnolence et favorise l'apprentissage. De plus, associer la sieste à la consommation de caféine potentialise son efficacité. Cependant, il existe des limites à la pratique de la sieste comme l'organisation durant le poste de travail ou la variabilité inter-individuelle. Les siestes peuvent être utilisées : - avant la prise d'un poste de nuit et surtout avant la première nuit - pour faire face à un besoin immédiat afin de diminuer rapidement la pression homéostasique de sommeil. La durée préconisée de sieste est de 30 minutes maximum. En effet, au-delà de cette durée, du sommeil lent profond apparait. 26 Il en existe différents types : - Le sommeil flash ou la micro-sieste : o d'une durée inférieure à cinq minutes o à pratiquer dans les transports ou au travail o son association à des techniques de relaxation et de respiration est intéressante (sophrologie, yoga, acupuncture) il s'agit plus d'une période de relaxation que d'un véritable sommeil o - La sieste parking o D'une durée de 15 à 20 minutes o A pratiquer dans un endroit calme et sûr o Mettre un réveil ou se faire réveiller o Vrai effet ressourçant o N'est constitué que de sommeil lent léger 2. 5. 2 La caféine La caféine est fréquemment consommée pour ses propriétés psychostimulantes. Elle agit comme stimulant du système nerveux central, modifie l'EEG de veille, neutralise la somnolence subjective, améliore la vigilance et les performances neurocognitives. L'association de la prise de caféine et d'une sieste avant de prendre son poste de nuit améliorerait les performances au travail et limiterait le risque accidentel. La caféine est présente dans de nombreux produits de consommation : - Café instantané : 76 à 106 mg - Café expresso : 75 mg - Thé en feuille ou sachet : 50 mg - Boisson cola en canette : 40 à 50 mg - Chocolat pâtissier : 25 à 50 mg 2. 5. 3 L'activité physique Les travaux récents montrent que la pratique régulière d'activité physique est un moyen très efficace pour lutter contre les méfaits du travail posté et/ou de nuit. En effet, la désynchronisation des rythmes circadiens se fait plus lentement, le travail et le sommeil sont de meilleure qualité, la resynchronisation pendant les jours de repos est plus rapide. 27 L'activité physique préconisée est de l'ordre de l'endurance, en séances de 30 minutes au rythme de 3 à 4 fois par semaine. L'exercice physique aurait des effets comparables à la lumière de haute intensité sur les décalages de phase type jet-lag ou travail posté mais cette théorie est encore à l'étude. 2. 5. 4 La lumière Selon l'HAS, l'exposition à la lumière avant chaque poste est recommandée pour faciliter l'adaptation au travail posté et/ou de nuit (Grade C). En effet, les études réalisées en conditions expérimentales montrent que la lumière artificielle de haute intensité peut être une contre-mesure efficace aux troubles du sommeil et de la vigilance des travailleurs postés et/ou de nuit. L'utilisation d'une lumière blanche est conseillée en début de poste de nuit sans ultraviolets ni infrarouges et d'intensité supérieure à 2500 lux. En effet, comme nous l'avons déjà expliqué, une exposition à la lumière le soir a pour effet d'obtenir un retard de phase. 28 Partie 2 : La démarche de recherche 29 1. MÉTHODOLOGIE DE LA RECHERCHE 1. 1 Problématique Notre réflexion nous a amené à la problématique suivante : Quelles sont les conséquences des horaires postés, au cours des stages, sur le sommeil et le mode de vie des étudiants sages-femmes ? 1. 2 Hypothèses De cette problématique découlent les hypothèses suivantes : Au cours des stages postés, - - - les étudiants sages-femmes présentent une dette de sommeil. les étudiants sages-femmes présentent des troubles liés d'une part, à une privation de sommeil et d'autre part, à une désynchronisation des rythmes biologiques le mode de vie des étudiants sages-femmes est modifié 1. 3 Objectifs De ces hypothèses, nous pouvons mettre en exergue plusieurs objectifs : - Mettre en évidence une dette de sommeil chez les étudiants sages-femmes au cours des stages postés - Rechercher les troubles neurocognitifs et somatiques survenant chez les les étudiants sages-femmes au cours des stages postés et évaluer conséquences liées à la somnolence Identifier les modifications du mode de vie des étudiants sages-femmes au cours de leurs stages postés - - Proposer aux étudiants des solutions afin de minimiser les troubles liés au travail posté 1. 4 Présentation de l'enquête Nous avons réalisé une enquête prospective, monocentrique, transversale et quantitative auprès des étudiants sages-femmes à l'aide d'un questionnaire (Annexe II) transmis via internet. L'enquête s'est déroulée du 27 novembre 2013 au 29 janvier 2014. 30 Elle concernait tous les étudiants sages-femmes des écoles de Metz, Nancy, Strasbourg et Reims ayant déjà effectué au moins un stage posté. Les étudiants L2 sont donc exclus de l'enquête. Nous n'avons pas utilisé d'autres critères d'inclusion ou d'exclusion. Le choix géographique du Nord-est de la France repose sur un critère de proximité et d'ensoleillement. En effet, nous savons que la durée et l'intensité d'ensoleillement intervient directement sur nos habitudes, nos humeurs et nos envies. Ainsi, limiter l'enquête à cette zone géographique minimise potentiellement certains biais. Le questionnaire a été transmis aux étudiants via l'application google drive par l'intermédiaire des différentes écoles. Les résultats ont directement été intégrés dans une feuille de calcul Excel. De plus, ce logiciel a permis l'analyse de toutes les données de l'enquête. 1. 5 Biais et difficultés rencontrées Premièrement, les étudiants répondent au questionnaire électronique selon des lieux et des moments différents. A ce titre, leurs réponses peuvent être influencées en fonction de ces derniers. Ensuite, la subjectivité de certaines réponses peut constituer un biais dans l'analyse des résultats. Et enfin, un questionnaire composé de questions fermées ou à choix multiples constitue en lui-même une limite de l'étude. En effet, les réponses obtenues ne permettent pas d'approfondir certains renseignements de la même façon qu'un entretien. 31 2. PRÉSENTATION DES RÉSULTATS DE L'ÉTUDE Nous avons recueilli pour les quatre écoles 206 réponses sur un total de 323 étudiants, soit un taux de réponses de 63, 8 %. 2. 1 Caractéristiques de la population interrogée Les caractéristiques de la population interrogée concernant le sexe, l'âge, l'indice de masse corporelle (IMC), l'activité physique, le fait de vivre seul ou pas et d'avoir un ou des enfants à charge sont résumés dans le tableau suivant : Sexe Age (années) IMC Activité physique Vit enfant(s) à charge Niveau de formation Caractéristiques Féminin Masculin [20-25] [26-30] [31-35] [36-40] Maigreur Norme pondérale Surcharge pondérale Obésité modérée Non Rarement Régulièrement De manière intensive seul pas seul Non Oui L3 M1 5ème Année % 96, 6 3, 4 96, 1 2, 4 0, 5 1 13, 6 71, 4 13, 1 1, 9 14, 1 42, 2 42, 7 0, 97 44, 7 55, 3 96, 1 3, 9 31, 1 35, 4 33, 5 Figure 8 : Caractéristiques de la population interrogée (N 206) - Tabagisme Sur la population interrogée (N 206), 16, 5 % sont fumeurs. Sur la population des fumeurs (n 34) : o 41, 2 % sont des petits fumeurs (moins de 5 cigarettes par jour) o 55, 9 % sont des moyens fumeurs (entre 5 et 15 cigarettes) o 2, 9 % sont des gros fumeurs (plus de 15 cigarettes). 32 - Antécédents familiaux de syndrome métabolique ANTECEDENTS FAMILIAUX Aucun antécédent Un antécédent Cumul de deux antécédents Cumul des trois antécédents (HTA, Hypercholestérolémie et Diabète) % 62, 1 25, 2 11, 2 1, 5 Figure 9 : Antécédents familiaux de syndrome métabolique (N 206) - Antécédents personnels de syndrome métabolique Sur les 206 personnes interrogées, 94, 2 % ne présentent aucun antécédent personnel de syndrome métabolique. Sur les 5, 8 % restants (n 12), 6 étudiants présentent une hypercholestérolémie, 4 présentent une hypertension artérielle et 2 présentent un diabète. - Traitement médicamenteux en cours 5, 8 % des étudiants interrogés prennent un traitement. concernés TRAITEMENTS Béta bloquants Nombre d'étudiants Les traitements pris par ces étudiants (n 12) sont répertoriés dans le tableau suivant : Triptans et Anti-inflammatoires non stéroïdiens Aérius, Bricanyl et Symbicort 3 2 1 1 1 1 1 1 1 Roaccutane Valaciclovir Vitamine Aérius Homéopathie Androcur Figure 10 : Répartition des traitements pris par les étudiants sages-femmes (n 12) 33 2. 2 Pendant la période de stage - Type de roulement N Nuit / J Jour / - Repos Figure 11 : Types de roulements effectués par les étudiants (N 206) - Durée des gardes La durée d'une garde est de 12 heures pour l'ensemble des étudiants interrogés (N 206). - Durée des stages postés Figure 12 : Durée des stages postés (N 206) 2. 3 Typologie circadienne, chronotype - Du matin ou du soir Figure 13 : Typologie circadienne des étudiants sages-femmes (N 206) - Court ou long dormeur Figure 14 : Chronotype de la population interrogée (N 206) 34 2. 4 Le sommeil des étudiants sages-femmes - Nombre d'heures de sommeil Médiane du nombre d'heures dormies En dehors de toute activité professionnelle Avant une garde de jour Avant une garde de nuit Le lendemain d'une garde de nuit 9 H 25 7 H 00 9 H 00 5 H 30 Pendant les repos entre les gardes Figure 15 : Tableau répertoriant le nombre d'heures dormies à différents moments (N 206) 9 H 55 - Latence d'endormissement professionnelle En dehors de toute activité Médiane de la latence d'endormissement Figure 16 : Tableau répertoriant la latence d'endormissement à différents moments (N 206) Pendant les repos entre les gardes Le lendemain d'une garde de nuit 0 H 30 0 H 10 0 H 30 - Avant une garde de nuit o Horaire de lever Figure 17 : Répartition de l'horaire de lever des étudiants juste avant une garde de nuit (N 206) 35 o Pratique de la sieste Dans la journée précédant une garde de nuit, 67, 5 % des étudiants utilisent la sieste. o Horaire de la sieste Figure 18 : Répartition de l'horaire de sieste des étudiants juste avant une garde de nuit (n 139) o Durée de la sieste La durée médiane de la sieste est de 2 heures. Figure 19 : Durée de la sieste (n 139) - Après une garde de nuit o Horaire de coucher après une garde de nuit Après une garde de nuit, 85 % des étudiants sages-femmes se couchent entre 8H00 et 14H00 et 15 % entre 21H00 et 2H00. Figure 20 : Répartition de l'horaire de coucher après la garde de nuit (N 206) 36 o Le réveil Figure 21 : Circonstances de réveil après une garde de nuit (N 206) - Troubles du sommeil avant et depuis l'entrée à l'école de sages-femmes Figure 22 : Pourcentage des étudiants déclarant présenter des troubles du sommeil (N 206) - Qualité du sommeil Figure 23 : Qualité du sommeil des étudiants (N 206) - Réveils intra-sommeil Figure 24 : Fréquence des réveils intra-sommeil (N 206) 37 2. 5 Évolution de la fréquence des troubles pendant toute la durée du stage jusqu'à une semaine après - La somnolence subjective Figure 25 : Évolution de la fréquence de la somnolence subjective pendant toute la durée du stage jusqu'à une semaine après (N 206) - La fatigue physique Figure 26 : Évolution de la fréquence de la fatigue physique pendant toute la durée du stage jusqu'à une semaine après (N 206) 38 - Les troubles de concentration ou de mémoire Figure 27 : Évolution de la fréquence des troubles de concentration et de mémorisation (difficultés à rassembler ses idées, diminution de la vigilance, augmentation des temps de réaction) pendant toute la durée du stage jusqu'à une semaine après (N 206) - Modifications de l'humeur Figure 28 : Évolution de la fréquence des modifications de l'humeur (sentiment de tristesse, de pessimisme, d'anxiété, d'irritabilité, de fatigue psychique) pendant toute la durée du stage jusqu'à une semaine après (N 206) - Céphalées et/ou migraines Figure 29 : Fréquence des céphalées et/ou migraines pendant et/ou juste après une garde de nuit (N 206) 39 - Troubles digestifs Figure 30 : Fréquence des troubles digestifs pendant et/ou juste après une garde de nuit (N 206) Les troubles digestifs signalés par les étudiants sages-femmes ayant répondu de temps en temps et souvent (n 82), sont répertoriés dans l'histogramme ci-dessous. Un étudiant peut présenter plusieurs symptômes. Figure 31 : Répartition des troubles digestifs signalés pendant et/ou juste après une garde de nuit par les étudiants sages-femmes (n 82) 2. 6 Mode de vie des étudiants sages-femmes - Consommation de psychotropes 11, 2 % des étudiants sages-femmes ayant répondu à l'enquête déclarent avoir déjà consommé des psychotropes (anxiolytiques et somnifères), qu'ils soient prescrits par un médecin ou délivrés sans ordonnance. Figure 32 : Détail de la consommation des psychotropes. Toutes les spécialités citées entre parenthèses sont citées par les étudiants (n 23) 40 Figure 33 : Fréquence de consommation des psychotropes (n 23) - Consommation de produits stimulants 61, 2 % des étudiants sages-femmes déclarent consommer des produits stimulants pendant leurs stages pour éviter ou diminuer la somnolence. Les produits stimulants consommés sont répertoriés dans l'histogramme ci-dessous. Les étudiants peuvent consommer plusieurs types de produits. Figure 34 : Détails de la consommation en produits stimulants des étudiants sages-femmes pour éviter ou diminuer la somnolence pendant les stages (n 126) Les spécialités utilisées par les cinq étudiants ayant déclaré consommer des médicaments stimulants sont o Guronsan : contient de la vitamine C et de la caféine o Actiflash : contient différentes vitamines, du zinc, du ginseng et du guarana Figure 35 : Moment du stage o les étudiants sages-femmes consomment des produits stimulants (n 126) 41 - Alimentation : o Poids Figure 36 : Evolution moyenne du poids des étudiants sages-femmes au cours d'un stage posté (N 206) o Nombre des repas Figure 37 : Evolution du nombre de repas au cours d'un stage posté (N 206) o Rythme des repas Figure 38 : Modifications du rythme des repas des étudiants sages-femmes au cours d'un stage posté (N 206) De plus, 28, 6 % des étudiants sages-femmes grignotent au cours d'une garde. 42 - Contre-mesures à la somnolence : Figure 39 : Contre-mesures utilisées par les étudiants sages-femmes afin de diminuer la somnolence pendant la garde de nuit (N 206) 2. 7 Conduite automobile - Moyens de locomotion 82 % des étudiants interrogés se déplacent en voiture (n 169). - Somnolence au volant Figure 40 : Evolution de la somnolence au volant pendant toute la durée du stage jusqu'à une semaine après (n 169) 43 - Méthodes utilisées au volant face aux signes précurseurs de l'endormissement Figure 41 : Méthodes utilisées au volant face aux signes précurseurs de l'endormissement. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées par les étudiants sages-femmes (n 169) - Accidents de la circulation et presque-accidents o Chiffres 30, 2 % des étudiants motorisés ont déjà eu un accident ou presque-accident pendant une période de stage et jusqu'à une semaine après. o Horaire de survenue Figure 42 : Horaires de survenue des accidents et presque-accidents des étudiants pendant une période de stage et jusqu'à une semaine après (n 51) o Causes de survenue Figure 43 : Causes de survenue des accidents ou presque-accidents de la route (n 51) 44 Partie 3 : Analyse et discussion 45 1. PRÉSENTATION DE LA POPULATION Questions 1 à 18 : - Caractéristiques générales La population interrogée est composée de 206 étudiants sages-femmes. Ces derniers sont, en très grande majorité, de sexe féminin, âgés de 20 à 25 ans, se situent pour plus des deux tiers dans la norme pondérale et pratiquent plus ou moins régulièrement une activité physique. Les étudiants vivant seuls et ceux ne vivant pas seuls (chez leurs parents, en couple ou en colocation) sont répartis de manière égale. La plupart des étudiants ayant répondu n'ont pas d'enfants à leur charge. Concernant le niveau de formation, nous avons un taux de réponse équivalent entre les L3, les M1 et les étudiants en 5ème année. - Comportement La majorité des étudiants sages-femmes interrogés sont non fumeurs. Dans la population des fumeurs, la plupart sont petits ou moyens fumeurs. - Antécédents de syndrome métabolique Très peu d'étudiants présentent un antécédent familial de syndrome métabolique. Et, aucun antécédent personnel n'est retrouvé parmi la population interrogée. - Traitement Nous constatons que très peu d'étudiants sous soumis à un traitement médicamenteux. - Modalités de stage Tous les étudiants interrogés effectuent des gardes d'une durée de 12 heures. Cependant, les types de roulement diffèrent. La plupart des étudiants travaillent une garde de jour puis une garde de nuit suivie de 2 ou 3 repos ou alors, ne connaissent pas de roulements fixes. Ainsi, ils assurent des rythmes de rotation courts, c'est-à-dire d'une durée inférieure à trois jours. La disparité des types de roulements vient du fait 46 que les possibilités en matière de stage pour chaque école ne permettent pas la même organisation. Cependant, comme nous l'avons évoqué en première partie, les rythmes de rotation courts semblent être prédictifs d'une désadaptation au travail posté. La durée moyenne des stages est comprise en 3 et 6 semaines pour la majorité des étudiants. Néanmoins, 8, 7 % ont déclaré effectuer des stages d'une durée moyenne de 20 semaines. Nous pouvons nous demander si la question a été comprise correctement. En effet, 20 semaines est la durée totale de stage au cours d'une année de formation. - Typologie circadienne et chronotype Les questions 17 et 18 ont été inspirées par le questionnaire de typologie circadienne de Horne et Ostberg (Annexe 3). Nous avons analysé la question 17 selon un score personnel. À chaque affirmation nous attribuons la note de 1 lorsque l'affirmation tend vers les sujets dits du soir et -1 lorsqu'elle tend vers les sujets dits du matin . Ainsi, les sujets tout à fait du soir obtiennent un score de 3 ou 4, les sujets modérément du soir un score de 2 ou 1, les sujets ni du matin, ni du soir un score de 0 ou -1, les sujets modérément du matin un score de -2 ou -3 et les sujets tout à fait du matin , un score de -4 ou - 5. À cette question, nous constatons que la typologie circadienne des étudiants est pour moitié du soir , pour un cinquième ni du matin, ni du soir et pour un tiers du matin . La question 18 montre que les étudiants sages-femmes interrogés sont des longs ou des moyens dormeurs et qu'il n'y a que très peu de courts dormeurs. La prévalence des sujets du soir ou des longs dormeurs peut s'expliquer par le fait que la population interrogée est une population jeune. Il nous parait important de rappeler ici que l'adaptation aux horaires décalés est meilleure lorsque le sujet est jeune et de typologie circadienne du soir . 47 2. DETTE DE SOMMEIL Temps total de sommeil des étudiants habituel 9 H 25 En dehors de toute activité professionnelle temps de sommeil Médiane du nombre d'heures dormies le nombre d'heures dormies en dehors de Les questions 19, 20, 21, 22 et 24 ont permis de calculer le temps total de sommeil des étudiants à différents moments du stage posté. Ce critère est comparé en prenant comme référence toute activité professionnelle. Pendant les repos entre les gardes Le lendemain d'une garde de nuit 5 H 30 soit moins 3 H 55 Avant une garde de jour 7 H 00 soit moins 2 H 25 Avant une garde de nuit 9 H 00 soit moins 0 H 25 9 H 55 soit plus 0 H 30 Figure 44 : Tableau analysant les différences de temps total de sommeil des étudiants à différents moments du stage posté (N 206) Si nous comparons le temps de sommeil des étudiants sages-femmes en dehors de toute activité professionnelle et le temps de sommeil avant une garde de jour, nous constatons une réduction de 2 heures et 25 minutes. Or, nous avons déjà constaté que la moitié des étudiants interrogés sont dits du soir . Les sujets dits du soir ont une tendance à s'endormir tard. Ainsi, leur nuit est écourtée lorsque le réveil survient tôt la matinée suivante. Cependant, un cinquième des étudiants ne sont ni du matin, ni du soir et un tiers sont du matin . Nous pouvons alors nous questionner sur la présence d'autres facteurs pouvant stress, l'hyperstimulation intellectuelle, l'activité physique et la prise de produits stimulants proche de l'heure de coucher peuvent retarder l'endormissement. l'heure de coucher. Par exemple, influencer le Si nous comparons le temps de sommeil des étudiants en dehors de toute activité professionnelle et le temps de sommeil la nuit précédant une garde de nuit, nous constatons une diminution de 25 minutes. 48 La différence est moins nette que celle notée précédemment et peut être expliquée, au moins en partie, par la pratique de la grasse matinée et de la sieste vespérale. L'analyse de ces deux pratiques sera détaillée dans le chapitre 4 (modifications du mode de vie des étudiants). Si nous comparons le temps habituel de sommeil des étudiants et leur temps de sommeil le lendemain d'une garde de nuit, nous constatons une diminution de 3 heures et 55 minutes. Cette différence est notable et peut s'expliquer par deux mécanismes : - En journée, l'environnement peut altérer ou raccourcir le sommeil d'un individu en modifiant les stades de sommeil, en le fragmentant ou en réveillant l'individu de manière définitive. Cette théorie est bien illustrée dans notre étude. En effet, 63 % des étudiants interrogés qualifient leur sommeil de mauvais ou assez bon juste après une garde de nuit et seulement 31, 1 % des étudiants se réveillent naturellement. 55, 3 % des étudiants programment un radio réveil et les 13, 6 % restants sont réveillés par un stimulus non souhaité comme la lumière, le bruit ou un animal de compagnie par exemple. Il aurait été intéressant de connatre la raison pour laquelle ces étudiants programment un radioréveil. - Lors du sommeil diurne, du fait de la consommation de la mélatonine, la quantité de sommeil lent profond diminue et la quantité de sommeil lent léger augmente. Or, au cours du sommeil lent léger, l'individu est plus sensible aux stimuli extérieurs et se réveille donc plus facilement. À la question 22, 15 % des étudiants affirment se coucher, après la fin d'une garde de nuit, entre 21 heures et 2 heures du matin. Ce phénomène, que nous appellerons la double journée , alourdi la dette de sommeil de l'étudiant déjà préexistante et favorise les risques de somnolence et d'endormissement, notamment au volant. Si nous nous intéressons maintenant au temps de sommeil pendant les repos entre les gardes, nous constatons que les étudiants dorment 30 minutes de plus qu'à leur habitude. Ce résultat parait logique lorsque nous savons qu'au cours des premières nuits de récupération faisant suite à une privation de sommeil, la quantité de sommeil lent profond et la durée totale de sommeil sont augmentées par un effet rebond. 49 Cependant, il est légitime de se demander si le temps de repos accordé aux étudiants leur permet de récupérer la dette de sommeil précédemment accumulée. Latence d'endormissement Les questions 19, 21, 22 et 24 ont permis de calculer la latence d'endormissement des étudiants sages-femmes à différents moments du stage. En dehors de toute activité professionnelle, la latence d'endormissement des étudiants est de 30 minutes. Cette durée peut paraitre excessive et s'expliquer par le fait que les étudiants, après s'être couchés, poursuivent leurs activités dans leur lit (lecture, ordinateur, alimentation, etc. ). Le lendemain d'une garde de nuit, la latence d'endormissement se réduit à 10 minutes. Cette diminution s'explique par une accumulation de pression de sommeil au cours de la garde de nuit, pression engendrée par la régulation homéostasique du sommeil. C'est pourquoi, au sortir d'une garde de nuit, les étudiants risquent de s'endormir plus facilement et notamment au volant de leur véhicule. Pendant les repos entre les gardes, la latence d'endormissement est de nouveau égale à 30 minutes. Même si ce résultat n'est qu'une médiane, nous pouvons penser que les étudiants n'ont pas plus de difficultés d'endormissement pendant les repos entre les gardes qu'à leur habitude. Fréquence des réveils intra-sommeil Les questions 27 et 29 nous ont permis d'évaluer la fréquence des réveils intra- sommeil des étudiants pendant toute la durée d'un stage posté. En dehors du cadre des stages, nous constatons que 58 % des étudiants interrogés se réveillent au moins une fois par nuit dont 6 % qui se réveillent au moins trois fois. En sachant que la population interrogée est jeune, ce chiffre parait excessif. Plusieurs facteurs, déjà cités plus tôt, peuvent favoriser les réveils intra-sommeil comme par exemple une hyperstimulation intellectuelle, un stress, une activité physique trop proche de l'heure du coucher, une consommation excessive de tabac ou de caféine etc. 50 Cependant, juste après une garde de nuit, 41 % des étudiants se réveillent au moins une fois par nuit dont 9 % qui se réveillent au moins 3 fois. La diminution de la fréquence des réveils intra-sommeil peu nombreux (un ou deux réveils) peut s'expliquer par une pression de sommeil importante qui empêche l'étudiant de se réveiller. À l'inverse, nous constatons une légère augmentation de la fréquence des réveils intra-sommeil plus nombreux (plus de 3 réveils). Elle peut s'expliquer du fait que lors du sommeil diurne la mélatonine de sécrétion nocturne a été consommée et que la température corporelle de l'individu n'est pas au plus bas. Ainsi, s'en suit une diminution de la quantité de sommeil lent profond et une augmentation des réveils intra-sommeil. Tout au long de la période de stage, 79 % des étudiants se réveillent au moins une fois par nuit dont 19 % qui se réveillent au moins 3 fois. Nous pouvons expliquer cette augmentation par plusieurs raisons : - Les facteurs favorisants les réveils intra-sommeil cités précédemment - Le sommeil diurne favorisant les réveils intra-sommeil - La désynchronisation entre le système circadien de l'étudiant et les horaires atypiques qui lui sont imposés. - La pratique de la sieste Une sieste de plus de 30 minutes consomme du sommeil lent profond et entame le sommeil de la nuit suivante. Ainsi, l'utilisation excessive de la sieste peut favoriser les réveils intra-sommeil au cours de la nuit. D'ailleurs, la médiane de la durée de sieste avant une garde de nuit chez les étudiants sages-femmes est de 2 heures. De plus, 9, 4 % des étudiants dorment, pendant une sieste, entre 3 et 6 heures. Cette durée excessive évoque un besoin de compenser une dette de sommeil. Néanmoins, une semaine après la fin du stage, seulement 41 % des étudiants se réveillent au moins une fois par nuit dont seulement 4 % qui se réveillent au moins trois fois. Ainsi, les étudiants sages-femmes, une semaine après la fin du stage, se réveillent autant, voire moins, au cours de la nuit qu'à leur habitude. 51 En conclusion, nous pouvons dire que les étudiants sages-femmes accumulent une dette de sommeil tout au long de leur stage. En effet, le nombre d'heures dormies est bien inférieur aux besoins habituels des étudiants. Cette réduction de temps de sommeil est induite par des réveils intra-sommeil excessifs, par un environnement diurne peu favorable ou par la programmation d'un radioréveil par exemple. Certains même alourdissent leur dette de sommeil en pratiquant la double journée . Cette privation chronique et cumulative de sommeil se manifeste par une diminution de la latence d'endormissement au sortir d'une garde de nuit, par un rebond de sommeil pendant les repos entre les gardes et par l'utilisation de longues durées de siestes. 3. TROUBLES LIÉS À LA PRIVATION DE SOMMEIL ET À LA DÉSYNCHRONISATION DES RYTHMES BIOLOGIQUES Nous allons, dans un premier temps, rechercher les troubles uniquement liés à une restriction de sommeil et dans un deuxième temps, rechercher ceux liés en même temps à une restriction de sommeil et à une désynchronisation des rythmes biologiques. 3. 1 Troubles liés à une restriction de sommeil 3. 1. 1 Somnolence Le niveau de somnolence d'un individu est évalué de manière subjective par l'échelle de somnolence d'Epworth (Annexe IV). Nous nous sommes inspirés de cette échelle dans la question 30. Pour faciliter et alléger le questionnaire nous avons choisi de résumer les huit propositions en une seule. C'est pourquoi nous serons prudents dans l'analyse des résultats obtenus. De plus, il aurait été intéressant d'évaluer la somnolence des étudiants, de manière objective, par les tests de maintien d'éveil. En effet, la somnolence subjective est souvent sous-estimée. Cependant, dans les limites de temps et de moyens à notre disposition pour la réalisation de ce mémoire, nous n'avons pu envisager ce test. Pendant et/ou juste après une garde de nuit, 50 % des étudiants sages-femmes somnolent souvent dans les situations suivantes : en train de lire un document, devant 52 la télévision, inactif dans un lieu public, dans les transports en commun, etc. La somnolence s'explique par la pression de sommeil accumulée au cours de la nuit. Tout au long de la période de stage, 23 % des étudiants somnolent souvent, soit, moitié moins que précédemment. Ce chiffre nous rappelle les résultats obtenus par l'INSV en 2009. En effet, dans cette étude, 20 % des travailleurs postés sont sujets à une somnolence diurne excessive (SDE). Une semaine après la fin du stage, seulement 9 % des étudiants somnolent souvent. Ces chiffres montrent que la somnolence, chez les étudiants sages-femmes, est fréquente au cours d'un stage posté mais qu'elle diminue rapidement après la fin de celui-ci. De plus, la superposition de nos chiffres avec les résultats obtenus par l'INSV permet de suggérer que la somnolence, perçue par les étudiants sages-femmes interrogés, n'est pas excessive en comparaison de la population générale des travailleurs postés. 3. 1. 2 Fatigue La fatigue est également évaluée de manière subjective. La question 31 nous a permis d'évaluer la fatigue physique des étudiants sages- femmes tout au long d'un stage posté. À la lecture des résultats, il apparait clairement un parallélisme entre somnolence et fatigue physique. En effet, la fréquence de la fatigue physique évolue au cours du stage de la même manière que celle de la somnolence. 77 % des étudiants sages-femmes sont souvent fatigués pendant et/ou juste après une garde de nuit, 55% tout au long de la période de stage et seulement 15 % une semaine après la fin de celui-ci. Ces données montrent que la fatigue est fréquente au cours d'un stage posté mais qu'elle diminue rapidement après la fin de celui-ci. De plus, il est important de rappeler que la fatigue est responsable d'une baisse de vigilance et d'une altération du jugement de la somnolence. 53 3. 1. 3 Troubles de concentration ou de mémoire La figure 26 montre que 50 % des étudiants sages-femmes interrogés présentent souvent des troubles de concentration ou de mémoire pendant et/ou juste après une garde de nuit, 19 % tout au long du stage et seulement 4 % une semaine après la fin de celui-ci. Ces résultats confirment la corrélation entre dette de sommeil et troubles de concentration ou de mémoire. En effet, la dette de sommeil est aige au sortir d'une garde de nuit, s'atténue progressivement pendant les repos entre les gardes et tend à disparatre une semaine après la fin du stage. Les troubles de mémorisation, dont la fréquence n'est pas négligeable, peuvent d'une part, perturber l'apprentissage de l'enseignement clinique au cours du stage et d'autre part, rendre plus difficile l'apprentissage de l'enseignement théorique au cours des repos. Si nous prenons 16H30 comme dernier créneau de sieste juste avant une garde de nuit (fig. 18) et 9H00 comme heure de coucher après une garde de nuit (fig. 20), la durée d'éveil de l'étudiant est de 16 heures et 30 minutes consécutives. Or, rappelons que les difficultés de concentration d'un sujet, après 17 heures d'éveil consécutives, sont équivalentes à un taux d'alcoolémie de 0, 5 gramme. Rappelons aussi que 15 % des étudiants pratiquent la double journée et que les difficultés de concentration d'un sujet, après 24 heures d'éveil consécutives, sont équivalentes à un taux d'alcoolémie de 1 gramme. Cette comparaison n'est pas faite au hasard. En effet, nous pensons qu'il est important de faire prendre conscience aux étudiants de l'importance des conséquences liées à dette de sommeil. 3. 1. 4 Accidents de la route et presque-accidents La restriction de sommeil, au cours des stages postés, est responsable de l'apparition de différents troubles chez les étudiants sages-femmes tels que la somnolence, la fatigue et les difficultés de concentration. Or, ces trois conséquences liées. Elles sont responsables d'une hypovigilance, d'une sont étroitement augmentation du temps de réaction et d'une altération du jugement de la somnolence. Si elles peuvent augmenter le risque d'erreurs au travail, elles peuvent aussi accrotre celui des accidents routiers. 54 Le risque d'endormissement et d'hypovigilance au volant est très important au sortir d'une garde de nuit. Pour preuve, seulement 12 % des étudiants motorisés ne somnolent jamais au volant de leur véhicule en sortant d'une garde de nuit. Ce chiffre passe à 46 % tout au long du stage et à 90 % une semaine après la fin de celui-ci. Ainsi, le risque de somnolence au volant est fréquent tout au long du stage mais diminue nettement une semaine après la fin de celui-ci. De plus, 30, 2 % des étudiants motorisés ont déjà eu un accident ou presque- accident de la route au cours d'un stage ou une semaine après. 80, 3 % de ces accidents sont survenus entre 8 heures et 13 heures, horaire correspondant au retour à domicile des étudiants. La fatigue, l'hypovigilance, l'inattention et la somnolence sont responsables de 98 % de ces accidents ou presque-accidents. La perte d'adhérence du véhicule est responsable des 2 % des accidents restants. Cependant, selon la figure 41, très peu d'étudiants arrêtent leurs véhicules devant les signes précurseurs de l'endormissement. Certains allument la radio et d'autres ouvrent la fenêtre ou fument une cigarette. Il est surprenant que si peu d'étudiants s'arrêtent pour dormir quelques instants, marcher quelques minutes, prendre un produit stimulant ou encore fumer une cigarette. La somnolence au volant n'est pas rare au cours d'un stage posté. Pour preuve, le taux d'accidents ou presque-accidents recensé n'est pas négligeable. Or, le fait que la plupart des étudiants sages-femmes ne s'arrêtent pas face au signes précurseurs de l'endormissement nous invite à penser qu'il est très important de sensibiliser les étudiants aux risques accidentels liés à la dette de sommeil au cours des stages postés. Nous y reviendrons au chapitre 5. 3. 1. 5 Troubles de l'humeur Les troubles de l'humeur (sentiment de tristesse, de pessimisme, d'anxiété, d'irritabilité, de fatigue psychique, etc. ) sont récurrents au cours d'un stage posté chez les étudiants sages-femmes. En effet, selon la figure 28, les troubles de l'humeur sont fréquents, pendant et/ou juste après une garde de nuit chez 41 % des étudiants, tout au long du stage chez 42 % et une semaine après la fin du stage chez seulement 10 %. 55 Ces modifications de l'humeur sont évaluées de manière subjective. Cependant, nous pouvons constater que ces troubles sont constants au cours du stage et qu'ils ne régressent qu'à la fin de celui-ci. 3. 2 Troubles liés à une restriction de sommeil et à une désynchronisation des rythmes biologiques Nous nous intéressons maintenant aux conséquences à court terme engendrées par les stages postés chez les étudiants sages-femmes. Il est important de se souvenir que de nombreux facteurs favorisants tels que le tabagisme, la consommation de produits stimulants, les antécédents personnels et familiaux et l'hygiène de vie peuvent influencer ces conséquences. 3. 2. 1 Troubles du sommeil Avant d'entrer à l'école de sages-femmes, 5, 8 % des étudiants présentaient déjà des troubles du sommeil. Depuis l'entrée à l'école, 40, 3 % des étudiants sont concernés par ces troubles. Plusieurs facteurs peuvent être responsables de cette augmentation : les stages postés, le stress, l'arrêt de l'activité physique, des activités scolaires ou personnelles empiétant sur le temps de sommeil de l'étudiant, etc. Nous rappelons que le sommeil est un bon indicateur de la tolérance au travail posté et que l'organisme met entre 3 et 8 jours, selon les individus, pour s'adapter à un nouveau rythme veille/sommeil survenant de manière brutale. 8 % des étudiants qualifient leur sommeil de mauvais en dehors de toute activité professionnelle, 27 % juste après une garde de nuit, 29 % tout au long du stage et 4 % une semaine après la fin de celui-ci. Juste après une garde de nuit et tout au long de la période de stage, presque un tiers des étudiants se plaignent d'une mauvaise qualité de leur sommeil. Or, comme nous l'avons expliqué dans le cadre de référence, l'adaptation au travail posté est lié à l'équilibre entre trois facteurs : le facteur chronobiologique, le facteur sommeil et le facteur socio-économique. - Facteur chronobiologique : la majorité des étudiants effectuent leurs gardes dans le sens horaire , sont de chronotype du soir ou ni l'un, ni l'autre , sont jeunes et remplissent donc 3 conditions sur quatre qui 56 prédisent une bonne adaptation aux horaires décalés, la 4ème étant le sexe masculin. Néanmoins, les rythmes de rotation courts effectués par les étudiants induisent une désynchronisation entre leurs rythmes circadiens et les horaires qui leurs sont imposés. En effet, les étudiants sages-femmes ont au maximum 3 jours de repos entre chaque roulement (fig. 11). Or, c'est le temps minimum nécessaire à rythme veille/sommeil. l'adaptation à un nouveau - Facteur sommeil : Comme nous l'avons déjà évoqué, les étudiants sages- femmes accumulent une dette chronique de sommeil au cours de leur stage. - Facteurs socio-économique, personnel et domestique : les étudiants sages-femmes, en dehors de leurs heures de stage, doivent gérer leur temps de repos, d'apprentissage, d'activité sportive et pour une minorité s'occuper de leur(s) enfant(s). L'intrication des ces trois facteurs est responsable de la plus ou moins bonne tolérance des étudiants aux horaires postés et des troubles du sommeil associés. À l'inverse, très peu d'étudiants se plaignent d'un mauvais sommeil une semaine après la fin du stage, ce qui montre que la dette de sommeil peut être récupérée assez rapidement. Aux vues des résultats obtenus, nous pouvons penser que presque un tiers des étudiants sages-femmes s'adaptent moins bien au travail posté. Cependant, le diagnostic de troubles du rythme circadien lié au travail posté (TTP) repose sur la présence de symptômes sévères de somnolence et d'insomnie depuis au moins un mois et doivent être associés aux horaires atypiques de travail. Or, même si la somnolence est très présente au cours des stages chez les étudiants sages-femmes, nous ne pouvons nous appuyer sur les résultats du questionnaire pour dépister des éventuelles insomnies. D'une part, nous ne pouvons pas généraliser car tous les étudiants sages-femmes de Metz, Nancy, Strasbourg et Reims n'effectuent pas des stages d'une même durée. D'autre part, l'insomnie se définit par une difficulté d'endormissement, des réveils intra-sommeils ou un réveil précoce survenant au moins 3 fois par semaine, pendant au moins un mois, associée à une altération du fonctionnement diurne. Nous ne disposons pas de l'ensemble de ces renseignements pour pouvoir conclure. 57 Cependant, à notre niveau, il serait intéressant de proposer aux étudiants différents moyens à mettre en place afin de limiter les troubles liés aux stages postés. 3. 2. 2 Troubles digestifs Selon la figure 30, 16 % des étudiants sages-femmes présentent souvent des troubles digestifs et 24 % en présentent de temps en temps. La dyspepsie (c'est un ensemble de symptômes de douleur ou de malaise épigastrique), la constipation, les diarrhées et les ballonnements sont les troubles les plus fréquemment signalés par les étudiants. Ils sont liés d'une part, à une désynchronisation des rythmes biologiques et notamment des sécrétions gastriques (la pepsine et la gastrine) et d'autre part, à une modification du comportement alimentaire. Nous reviendrons sur ce point dans le chapitre suivant. 3. 2. 3 Migraines et céphalées Selon la figure 29, au cours d'une garde de nuit et/ou juste après, 23 % des étudiants sages-femmes présentent souvent des migraines et/ou des céphalées et 47 % en présentent de temps en temps. Ces résultats nous interpellent car ils concernent presque trois quarts des étudiants. Comme expliqué dans la première partie, ces troubles surviennent en général autour de 3 heures de matin, horaire à laquelle la concentration plasmatique de mélatonine est maximale. Cependant, la consommation excessive de produits stimulants ou de tabac peut également être à l'origine de céphalées ou migraines. 58 4. MODIFICATIONS DU MODE DE VIE DES ÉTUDIANTS 4. 1 Alimentation Nous savons que les temps de sommeil courts sont directement corrélés à une prise de poids par un déséquilibre de la balance leptine/ghréline. Cependant, dans notre étude, la plupart des étudiants interrogés perdent ou gardent un poids stable au cours d'un stage posté et presque un cinquième des étudiants prennent du poids. 57 % des étudiants déclarent manger moins souvent et 22 % manger plus souvent au cours d'un stage. D'ailleurs, 28, 6 % des étudiants affirment grignoter pendant une garde. De plus, pour 75 % des personnes interrogées, les rythmes de repas sont fortement décalés. L'irrégularité des prises alimentaires, l'augmentation ou la diminution du nombre de repas et le grignotage sont à l'origine de variations de poids. De plus, le rythme soutenu de travail en stage ne permet pas forcément une prise alimentaire d'une durée convenable dans des conditions normales de pauses. Au contraire, le plus souvent et pour de nombreuses raisons, les prises alimentaires sont rapides et les repas déséquilibrés. De plus, la consommation de tabac et de produits stimulants sont parfois à l'origine de troubles digestifs et d'une diminution de l'appétit. Nous pouvons dire que le comportement alimentaire des étudiants sages- femmes est nettement modifié au cours d'un stage. Une des raisons pour laquelle la majorité d'entre eux perdent du poids. Néanmoins, la part des étudiants qui en prennent n'est pas négligeable. 4. 2 Face à la somnolence Comme nous l'avons vu précédemment, au cours des stages, la somnolence prend une place importante auprès des étudiants sages-femmes. Afin de pallier à la somnolence, ils se servent de la grasse matinée , la sieste, consomment des produits stimulants et utilisent d'autres contre-mesures. 4. 2. 1 La grasse matinée Pour exploiter les résultats obtenus, nous définissons la grasse matinée comme un réveil survenant entre 9H30 et 13H00. Selon cette définition, 55, 3 % des étudiants se servent de la grasse matinée avant une garde de nuit. 59 4. 2. 2 La sieste Dans la journée précédant une garde de nuit, 67, 5 % des étudiants utilisent la sieste. La médiane de la durée de la sieste est de 2 heures. Cependant, très peu d'étudiants dorment moins de 30 minutes et à l'inverse, une part non négligeable des étudiants dorment entre 3 et 6 heures avant de se rendre en garde de nuit. Ces données nous amènent à penser que les étudiants font la sieste d'une part, afin de limiter la somnolence en garde et d'autre part, afin de compenser une dette de sommeil préexistante. Il aurait été intéressant de savoir si, lorsque la charge de travail le permet, les étudiants utilisent la sieste pendant une garde. 4. 2. 3 Consommation de produits stimulants 61, 2 % des étudiants déclarent consommer des produits stimulants pendant leur stage dans le but de diminuer ou d'éviter la somnolence. Selon la figure 35, les produits stimulants sont consommés en majorité pendant les gardes de nuit et de jour. Une part non négligeable de produits sont consommés pendant les repos. À l'inverse, la consommation de stimulants juste avant une garde de nuit est anecdotique. Les produits stimulants les plus fréquemment consommés sont le café, le thé et les vitamines. La caféine est présente dans la majorité des produits stimulants utilisés par les étudiants : café, thé, boissons énergisantes et médicaments de type guronsan ou actiflash. De plus, rappelons que sa demi-vie d'élimination est d'environ 4 à 6 heures, voire 5 à 10 heures chez les femmes sous contraception orale. 4. 2. 4 Utilisation de contre-mesures En dehors de la sieste, très peu de contre-mesures sont utilisées par les étudiants sages-femmes afin de diminuer la somnolence pendant une garde de nuit (fig. 39). Parmi les contre-mesures très peu utilisées nous retrouvons la luminothérapie, les activités de détente et l'activité physique. Cependant, les résultats obtenus à la figure 39 ne concordent pas avec les précédentes analyses. 60 En effet, 55, 3 % des étudiants utilisent la grasse matinée avant une garde de nuit (fig. 17) alors que seulement 2, 9 % des étudiants utilisent simultanément grasse matinée et longue nuit de sommeil (fig. 39). De plus, la figure 39 montre que : - seuls 3, 4 % des étudiants consomment des produits stimulants afin de diminuer la somnolence pendant une garde de nuit (seuls ou en association avec la sieste) - Alors que nous avons précédemment constaté que 61, 2 % des étudiants consomment des produits stimulants pendant un stage (dont la grande majorité pendant une garde de nuit) Ces deux incohérences, s'expliquant sans doute par une mauvaise compréhension de la question. 4. 3 Face aux troubles du sommeil Face aux troubles du sommeil qu'ils rencontrent, 11, 2 % des étudiants déclarent avoir déjà consommé des psychotropes (anxiolytiques et/ou somnifères), qu'ils soient prescrits par leur médecin ou délivrés sans ordonnance. Parmi eux, la majorité en consomme de temps en temps et seulement une minorité en consomme souvent. Selon la figure 32, les psychotropes les plus fréquemment consommés sont l'hydroxyzine antihistaminique H1 (Atarax), les benzodiazépines (Lexomil) et la phytothérapie (euphytose). Il serait intéressant de savoir quel effet, anxiolytique ou hypnotique, est majoritairement recherché par les étudiants lors de la prise de ces psychotropes. Rappelons qu'en 2010, dans la population française, 18 % des 18-75 ans déclarent avoir pris au moins un médicament psychotrope au cours des 12 derniers mois. Néanmoins, il n'est pas précisé si les traitements non allopathiques sont inclus dans l'étude comme l'homéopathie ou la phytothérapie par exemple. Rappelons aussi que selon l'enquête menée en 2012 par l'ANESF sur le bien-être des étudiants sages- femmes, 8, 54 % des étudiants consomment des somnifères. Même si nous ne pouvons pas comparer ces trois populations, nous constatons que, face aux troubles du sommeil, la consommation en psychotropes allopathiques des étudiants sages-femmes n'est pas négligeable. 61 Sachant que les troubles du sommeil sont plus fréquents au cours des stages postés, il aurait été intéressant de pouvoir comparer la consommation de psychotropes en dehors et au cours des stages postés. Aux vues des troubles rencontrés chez les étudiants sages-femmes interrogés, nous souhaitons faire des propositions afin d'améliorer leur quotidien, de limiter les troubles liés au travail posté et leur donner des bases hygiéno-diététiques simples dont ils pourraient se servir pour leur future carrière professionnelle. Comme nous l'avons vu dans le cadre de référence, 64 % des sages-femmes en France travaillent en milieu hospitalier, milieu dans lequel le service rendu est continu. Ainsi, la plupart des étudiants travailleront certainement selon des horaires postés. 5. PROPOSITIONS FAITES AUX ÉTUDIANTS SAGES- FEMMES Il semble essentiel de sensibiliser les étudiants à l'importance du sommeil, de leur permettre de comprendre sa composition et ses principes de régulation. Travailler en posté implique une nouvelle philosophie de vie. En effet, respecter une bonne hygiène de vie et de sommeil permet un bénéfice immédiat mais aussi à long terme sur la santé, la vie professionnelle et familiale des travailleurs. La compréhension du fonctionnement du sommeil permet une meilleure adaptation aux horaires postés. L'objectif de ce mémoire est de proposer une brochure à chaque étudiant sage- femme résumant tous les conseils hygiéno-diététiques développés ci-après. 5. 1 Avant une garde de jour 5. 1. 1 Réveil Faire des exercices d'étirement, prendre une douche et s'exposer à une lumière forte 5. 1. 2 Petit-déjeuner Il est important de prendre un petit déjeuner complet composé de glucides, de protéines, de laitages et de fruits. 62 5. 1. 3 Luminothérapie La luminothérapie doit émettre une lumière blanche sans ultra-violet ni infrarouge d'une intensité de 10000 lux à 50 cm du visage. L'exposition lumineuse doit durer 30 minutes et peut avoir lieu au moment du petit-déjeuner. Elle permet d'améliorer le tonus au cours de la matinée. 5. 2 Avant une garde de nuit 5. 2. 1 Sieste Surtout avant la première garde de nuit, il est important de faire une sieste de moins de 30 minutes. La sieste d'une heure ou une heure et demie est réservée aux gens en situation de dette chronique de sommeil. De plus, compte tenu de son délai d'action, boire un café (ou une boisson en contenant) avant la sieste permet d'optimiser les effets sur la vigilance. Le café possède des propriétés stimulantes mais ne permet pas de combler une dette de sommeil. De plus, son effet est variable d'une personne à l'autre. 5. 2. 2 Luminothérapie Une exposition de 30 minutes avant un poste de nuit permet de créer un retard de phase en décalant le pic de mélatonine et donc de retarder la somnolence. 5. 2. 3 Alimentation L'alimentation est un repère fondamental dans le maintien des mécanismes synchronisateurs et dans le maintien des relations sociales et familiales. Essayez de conserver 3 repas par jour, selon un rythme adapté aux horaires de travail (pour limiter la prise de poids ou les troubles digestifs). Il est important d'éviter les grignotages. Avant une prise de poste, mangez un repas complet et équilibré. Privilégiez des aliments à index glycémique bas, les protéines (viande, poisson), des légumes et des glucides (en quantité raisonnable). Evitez le double repas (au domicile et sur le lieu de travail). 63 5. 3 Au cours d'une garde de nuit Pour améliorer la vigilance au cours d'un poste de nuit, travailler dans un milieu bien éclairé. 5. 3. 1 Hydratation S'hydrater tout au long de la garde. Evitez de consommer tout produit stimulant contenant de la caféine après 23 heures ou minuit. De plus, une consommation excessive de caféine entraine des effets indésirables tels que des palpitations et une sensation d'anxiété. 5. 3. 2 Pause et sieste Prenez au cours de la garde, si possible, une pause d'au moins 30 minutes réservée à la collation. En effet, les repas pris sur le pouce favorisent les troubles digestifs. Trouvez un endroit calme, éloigné du bruit et de la lumière vive afin de vous reposer sans chercher obligatoirement à s'endormir. Des techniques de relaxation et de respiration peuvent être utiles. Nous savons cependant qu'il est difficile au cours d'une garde en salle de naissances de trouver un moment pour se reposer. Si elle a lieu, la sieste doit être courte (moins de 20 minutes). En effet, une sieste de plus de 30 minutes risque de contenir du sommeil lent profond, il sera donc plus difficile de se réveiller et une inertie peut survenir. Il est important de ne pas oublier de programmer un réveil et de prévenir ses collègues. Après la sieste il est intéressant de se masser le visage, de faire des exercices d'étirement et de s'exposer à la lumière vive. En effet, ces techniques permettent de limiter l'inertie après une période de sommeil. 5. 3. 3 Collation entre 1h00 et 3h00 Prenez une collation entre 1 et 3 heures du matin pour maintenir un niveau de vigilance correct. Rappelons que la somnolence est importante vers 3 heures du matin. En effet, le pic de mélatonine et le minima de la température corporelle surviennent à ce moment. Entre minuit et 7 heures du matin, la digestion est ralentie. C'est pourquoi il faut éviter le grignotage afin de limiter les troubles digestifs. 64 La collation doit être protido-glucidique et à index glycémique bas : poulet, jambon, céréales, fruits, pain, etc. Evitez les aliments glucido-lipidique et à index glycémique élevé : charcuterie, fromage, confiseries, gâteaux, sodas, etc. Les aliments sucrés consommés pendant une période d'activité physique freinent l'endormissement en limitant la production de sérotonine indispensable à la sécrétion de mélatonine. Mais attention, consommés pendant une période de repos, ils favorisent l'endormissement. 5. 4 En sortant de garde 5. 4. 1 Trajet du retour Si possible, privilégiez les transports en commun. Avant de prendre la voiture, prenez le temps de l'aérer. Ne surchauffez pas le véhicule et allumez la radio. Il est primordial de savoir reconnaitre les signes précurseurs de l'endormissement : bâillement, paupières lourdes ou qui se ferment seules, tête lourde, irritabilité, regard fixe, lenteur de réaction, conduite automatique, désir fréquent de changer de position, etc. Dès l'apparition d'un ou plusieurs de ces signes, arrêtez-vous, dormez quelques minutes ou marchez quelques instants. 5. 4. 2 A éviter Evitez la caféine ou le tabac car ils rendent l'endormissement plus difficile, augmentent les réveils intra-sommeil et modifient l'architecture du sommeil. Limitez au maximum l'exposition à la lumière en fin de poste afin de préparer votre organisme au sommeil. 5. 4. 3 Alimentation Le petit-déjeuner doit être plus léger qu'un petit-déjeuner traditionnel. Il doit être riche en glucides pour favoriser le sommeil. Conservez une boisson chaude (café décaféiné, tisane, lait) Au réveil, conservez un déjeuner traditionnel équilibré, digeste et riche en protéines. 65 5. 4. 4 Sommeil Pour limiter la somnolence, dormir au moins 7 heures par 24 heures. Couchez-vous dès les premiers signaux de sommeil. Sinon, l'envie de dormir passe et il vous faudra attendre le cycle prochain, 90 minutes plus tard. - Environnement : il doit être favorable au sommeil Prévenez l'entourage que vous dormez et demandez à ne pas être dérangé. Pensez à éteindre votre téléphone et évitez toute source sonore ou appareil électronique avant de vous coucher. Si vous les supportez, les bouchons d'oreilles peuvent être très utiles. Réservez le lit uniquement au sommeil. Dormez dans un endroit calme, frais (entre 18 et 20 degrés), bien aéré, sombre (l'obscurité favorise le sommeil lent profond). 5. 5 Pendant les repos ou à l'école Essayez de garder des horaires de coucher et de lever réguliers afin d'éviter l'apparition d'un trouble du rythme circadien de type retard de phase . 5. 5. 1 Alimentation Adaptez votre alimentation : La composition des repas et le moment auquel ils sont pris peuvent influencer la durée et la composition du sommeil. Limitez les aliments à index glycémique élevé en dehors des repas et en dehors d'activité physique. L'état de satiété facilite la survenue du sommeil en faisant baisser le niveau de vigilance de l'individu. Mangez plus de glucides que de protides le soir avant de se coucher. En effet, consommés pendant une période de repos, les glucides favorisent l'endormissement. Plus le repas est lourd et riche en protéines plus la température corporelle augmente et plus l'endormissement est plus difficile. 5. 5. 2 Exercice physique Pratiquez un exercice physique régulièrement. Evitez cependant l'exercice physique tardif. 66 5. 5. 3 Evitez Même s'il existe une grande variabilité interindividuelle en termes de réponse à la caféine, évitez les excitants après 15 ou 16 heures. Evitez le tabac le soir avant de vous coucher. Evitez les psychotropes. En effet, il existe un risque de dépendance et ils doivent être utilisés avec beaucoup de prudence. Demandez un avis médical. La médecine non allopathique permet d'éviter les phénomènes de dépendance vis-à-vis des psychotropes. 5. 5. 4 Alternatives L'anxiété et le stress sont souvent à l'origine de troubles du sommeil. Il n'est pas chose facile de rester serein entre les gardes, les cliniques, les révisions, les examens ou les petits boulots. Cependant, il existe différents moyens d'améliorer votre sommeil. Au moins 30 minutes avant de vous coucher, accordez-vous une période calme et pourquoi pas un moment de relaxation. Evitez les surcharges de travail, l'hyperstimulation intellectuelle, les révisions ou les écrans lumineux trop près de l'heure du coucher et apprenez à réguler cette anxiété : À l'école Il serait intéressant de mettre une salle de repos à disposition des étudiants sages- femmes. Salle dans laquelle les étudiants pourraient avoir accès à des tapis, des coussins, de la musique et une cafetière ou une bouilloire. Ce temps de pause, de sieste et de relaxation après le repas du midi permettrait une amélioration de la vigilance et de la concentration au cours de l'enseignement dispensé l'après-midi. A la maison Il existe de nombreuses techniques pouvant être utilisées. L'important est de trouver celle qui vous convient le mieux : - Instaurer un rituel : Une boisson chaude par exemple. Certaines tisanes possèdent des vertus apaisantes et favorisant l'endormissement (valériane, passiflore, verveine, fleur d'aubépines, mélisse, tilleul, etc. ). De plus, une boisson chaude favorise la baisse de la température interne et donc l'endormissement 67 - Luminothérapie Elle permet de pallier au trouble affectif saisonnier autrement connu sous le nom de dépression saisonnière . Ce trouble est fréquent dans les régions peu ensoleillées. - La phytothérapie et l'homéothérapie - Toutes les techniques de relaxation et de respiration (sophrologie, acupuncture, hypnose) 68 Conclusion Les différentes plaintes des étudiants sages-femmes rapportées au cours des stages nous ont amené à nous demander quelles conséquences les horaires postés pouvaient avoir sur leur sommeil et leur mode de vie. Sans méconnatre les limites inhérentes à cette étude, nous retenons de ce mémoire que les étudiants présentent une dette de sommeil tout au long d'un stage posté. Elle se manifeste, chez les étudiants interrogés, par une diminution du temps et une altération de la qualité de leur sommeil, dont l'origine, rappelons-le, est multifactorielle. Néanmoins, cette dette a tendance à s'estomper une semaine après la fin du stage. De plus, les horaires postés induisent, chez la plupart des étudiants, des troubles somatiques et neurocognitifs. Ils sont relativement fréquents au cours du stage mais se raréfient rapidement après la fin de celui-ci. Trois d'entre eux, la somnolence, la fatigue physique et les troubles de concentration, sont intimement liés et responsables d'une augmentation du risque accidentel au volant. 30, 2 % des étudiants ont déjà été victimes d'un accident ou presque accident de la route, dont la majorité en sortant d'une garde de nuit. Cependant, malgré les signes précurseurs de l'endormissement, peu d'étudiants arrêtent leur véhicule. 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Biomarqueurs de la fonction ventriculaire après un infarctus du myocarde : différences hommes-femmes Torkia Lalem To cite this version : Torkia Lalem. Biomarqueurs de la fonction ventriculaire après un infarctus du myocarde : différences hommes-femmes. Médecine humaine et pathologie. Université de Lorraine, 2018. Français. NNT : 2018LORR0173. tel-01963817 HAL Id : tel-01963817 Submitted on 2 Sep 2019 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. AVERTISSEMENT l'ensemble de Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l'utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact : ddoc-theses-contact@univ-lorraine. fr LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335. 2- L 335. 10 Ecole Doctorale BioSE (Biologie-Santé-Environnement) Thèse Présentée et soutenue publiquement pour l'obtention du titre de DOCTEUR DE l'UNIVERSITE DE LORRAINE Mention : Sciences de la Vie et de la Santé par Torkia LALEM Biomarqueurs de la fonction ventriculaire après un infarctus du myocarde : différences hommes-femmes Membres du jury : Le 16 novembre 2018 Rapporteurs : Mme. Céline GALES Mr. Christophe BAUTERS Examinateurs : Mme. Catherine LARUE PhD, DR INSERM UMR 1048, Université Paul Sabatier, Institut des maladies métaboliques et cardiovasculaires, Toulouse MD, PhD, PU-PH, INSERM U1167, CHRU de Lille, Université de Lille, Lille PhD, Directrice de Luxembourg (IBBL), Luxembourg la Biobanque Intégrée du Mme. Marie-France SERONDE MD, PhD, CHRU de Besançon, Besançon Mr. Yvan DEVAUX Mr. Michel OVIZE Mr. Athanase VISVIKIS PhD, Luxembourg Institute of Health, Luxembourg Directeur de thèse MD, PhD, PU-PH, INSERM U1060, Hospices Civils de Lyon, Lyon PhD, UMR7365, Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire (IMoPA), Nancy - - Unité de Recherche Cardiovasculaire, Luxembourg Institute of Health (LIH) 1 A-B Rue Thomas Edison, 1445 Strassen Remerciements Je tiens tout d'abord et particulièrement à remercier Docteur Yvan Devaux de m'avoir accueillie dans son laboratoire, de m'avoir fait confiance et encadrée pendant ces trois années de thèse. Je le remercie également pour son temps, pour sa disponibilité, pour sa compréhension et sa patience. Je tiens fortement à remercier le regretté Docteur Daniel Wagner de m'avoir accueillie dans son laboratoire pendant mon stage de master et le début de ma thèse. Je tiens également à remercier tous les membres de l'unité de recherche cardiovasculaire, pour leur soutien, leurs conseils, leur sympathie et la bonne ambiance dans laquelle j'ai pu mener à bien ce projet de thèse. Merci à tous les membres du LIH qui ont contribué de près ou de loin à ce travail. Mes sincères remerciements vont également au Professeur Michel Ovize et Docteur Athanase Visvikis qui ont accepté de faire partie de mon comité de suivi de thèse, à tous les membres de mon jury de thèse, en particulier, mes rapporteurs Professeur Christophe Bauters et Docteur Céline Galès. Je tiens également à remercier le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche du Luxembourg ainsi que la Société Luxembourgeoise pour la Recherche sur les Maladies Cardiovasculaire pour avoir financé ces trois années de thèse. Je remercie particulièrement Docteur Charles Delagardelle de m'avoir fait confiance et pour m'avoir accordée un financement de thèse. Mes remerciements vont également à ma grande famille et à mon cher mari pour m'avoir soutenue et portée dans les moments difficiles. 1 Ma revendication en tant que femme c'est que ma différence soit prise en compte, que je ne sois pas contrainte de m'adapter au modèle masculin Simone Veil 2 Liste des publications présentées dans ce manuscrit : A 3-gene Panel Improves the Prediction of Left Ventricular Dysfunction After Acute Myocardial Infarction. Adeline Boileau MSc, Torkia Lalem MSc, Melanie Vausort MSc, Lu Zhang MSc, and Yvan Devaux PhD. International Journal of Cardiology. 2018 ; 254 : 28-35. Sex-Differences in Biomarkers of Outcome After Acute Myocardial Infarction Torkia Lalem MSc, Yvan Devaux PhD. Submitted. Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1 C is a Female-Specific Marker of Left Ventricular Function After Acute Myocardial Infarction Torkia Lalem MSc, Lu Zhang MSc, Markus Scholz PhD, Ralph Burkhardt MD, Victoria Saccheti MSc, Andrej Teren MD, Joachim Thierry MD, and Yvan Devaux PhD. International Journal of Cardiology. 2018 Jul 10 [Epub ahead of print]. Publications non présentées dans ce manuscrit : Long non-coding RNAs in the atherosclerotic plaque Serdal Arslan, cal Berkan, Torkia Lalem, Nil zbilm, Sabahattin Gksel, zge Korkmaz, Nilgn Çetin, Yvan Devaux. Atherosclerosis. 2017 ; 266 : 176-81. Sex-specific microRNA biomarkers of left ventricular remodelling after acute myocardial infarction Torkia Lalem MSc and Yvan Devaux PhD. In preparation. MicroRNAs in the atherosclerotic plaque Serdal Arslan, Torkia Lalem, cal Berkan , Nil zbilm, Sabahattin Gksel, zge Korkmaz, Nilgn Çetin, Yvan Devaux. Submitted. 3 Posters : Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1 C is a Female-Specific Marker of Left Ventricular Function After Acute Myocardial Infarction Torkia Lalem MSc, Lu Zhang MSc, Markus Scholz PhD, Ralph Burkhardt MD, Victoria Saccheti MSc, Andrej Teren MD, Joachim Thierry MD, and Yvan Devaux PhD - European Council of Cardiovascular Research Meeting, Lac de Garde, Octobre 2017 - Heart Failure Congress from the European Society of Cardiology, Vienne, Mai 2018. - International Society of Heart Research Meeting, Amsterdam, Juillet 2018. - European Society of Cardiology Congress, Munich, Août 2018 4 Liste des abréviations : ADNc AIC ANP ADN complémentaire Akaike information criterion atrial natriuretic peptide AUC area under a curve AVC accident vasculaire cérébral BNP brain natriuretic peptide CDKN1C cyclin dependent kinase inhibitor 1 C CHL CK Centre Hospitalier du Luxembourg créatine kinase CK-MB creatine kinase muscle/brain CML cellule musculaire lisse CRP C-reactive protein CT cycle threshold cTn CV DCM troponine cardiaque cardiovasculaire dysfonction coronaire microvasculaire dNTPs nucleoside triphosphate DSAC E2 ECG EDTA ER FE FEinter FEp FEr FV GWAS dissection spontanée de l'artère coronaire estradiol électrocardiogramme éthylènediaminetétraacétique estrogen receptor fraction d'éjection fraction d'éjection intermédiaire fraction d'éjection préservée fraction d'éjection réduite fonction ventriculaire Genome Wide Association Studies HDL high density lioprotein HR hazard ratio 5 Hs-Tn IC ICP troponine hypersensible insuffisance cardiaque intervention coronaire percutanée IDI integrated discrimination index IDM infarctus aigu du myocarde IL Interleukine IMC indice de masse corporelle IVC intervalle de confiance KCNQ1OT1 KCNQ1 Opposite Strand/Antisense Transcript 1 LDL low density lioprotein LMNB1 lamin B1 lncARN LTBP4 MCV MEC long ARN non codant latent transforming growth factor beta binding protein 4 maladie cardiovasculaire matrice extracellulaire MIAT myocardial infarction associated transcript MICRA Myocardial Infarction associated circular RNA miR MMP microARN Matrix metallopeptidase MYHEART myosin heavy-chainassociated RNA transcript NRI net reclassification index NSTEMI non ST segment elevation myocardial infarction NT-proBNP N terminal brain natriuretic peptide NYHA OR PBMC PBS qPCR New York Heart Association odds ratio peripheral blood mononuclear cells phosphate-buffered saline quantitative polymerase chain reaction RAAS Renin-Angiotensin-Aldosterone System RVG remodelage ventriculaire gauche SNS système nerveux sympathique STEMI ST segment elevation myocardial infarction 6 SVF TB4 sérum de veau fœtal thymosine -4 TGFBR1 transforming growth factor beta receptor 1 TGF TIMP TNF- TNXB transforming growth factor beta metallopeptidase inhibitor tumor necrosis factor alpha tenascin XB UCA1 urothelial carcinoma-associated 1 VES volume d'éjection systolique VG ventricule gauche VTD volume télédiastolique VTS volume télésystolique 7 Figures : Liste des illustrations : Figure 1. Le cœur humain Figure 2. La circulation sanguine Figure 3. Les artères coronaires Figure 4. Les tuniques de la paroi cardiaque Figure 5. Les catégories des MCV Figure 6. Les causes de mortalité en Europe chez les hommes et les femmes Figure 7. Différences hommes-femmes au niveau des facteurs de risque CV Figure 8. L'incidence de l'IDM chez les femmes et les hommes en fonction de l'âge Figure 9. Les types 1 et 2 de l'IDM Figure 10. Les étapes de formation d'une plaque d'athérosclérose Figure 11. Pathophysiologie de l'IDM sans obstruction Figure 12. Diagnostic de l'IDM Figure 13. Les biomarqueurs de la nécrose myocrdiaque Figure 14. La pathophysiologie de la cicatrisation post-IDM Figure 15. Modifications morphologiques du cœur lors du remodelage délétère Figure 16. Rôle du système nerveux sympathique et du système Rénine-Angiotensine-Aldostérone dans le remodelage délétère post-IDM Figure 17. Différence hommes-femmes au niveau du RVG post-IDM Figure 18. Dysfonction ventriculaire gauche lors d'une IC Figure 19. Effets protecteurs des estrogènes contre le remodelage délétère après un IDM Figure 20. Les étapes de l'étude LUCKY Figure 21. Les étapes de l'étude LIFE-Heart 8 Tableaux : Tableau 1. Comparaison des caractéristiques cliniques et démographiques entre les femmes et hommes de la cohorte LUCKY Tableau 2. Comparaison des caractéristiques cliniques et démographiques entre les femmes et hommes de la cohorte LIFE-Heart Tableau 3. Séquences des amorces utilisées au cours de la qPCR 9 Table des matières : Remerciements . 1 Liste des publications présentées dans ce manuscrit : . 3 Liste des abréviations : . 5 Liste des illustrations : . 8 Table des matières : . 10 Introduction . 13 Hypothèse et organisation du travail . 15 Présentation générale du manuscrit . 17 Etude Bibliographique. 18 1. Cœur : . 19 2. Maladies cardiovasculaires : . 24 3. Facteurs de risque cardiovasculaires : . 27 4. Infarctus du myocarde : . 33 4. 1. Définition universelle de l'IDM : . 33 4. 2. Classification de l'IDM : . 33 4. 3. Pathophysiologie de l'IDM : . 35 4. 4. Diagnostic de l'IDM : . 39 4. 5. Prise en charge de l'IDM : . 44 4. 6. Mortalité post-IDM : . 45 5. Remodelage ventriculaire post-IDM : . 46 5. 1. Pathophysiologie de la cicatrisation myocardique : . 46 5. 2. Remodelage délétère : . 48 5. 3. Différences hommes-femmes au niveau du remodelage post-IDM : . 50 6. Insuffisance cardiaque : . 54 7. Mécanismes responsables des différences hommes-femmes dans les MCV : . 57 7. 1. Mécanismes génétiques : . 57 7. 2. Mécanismes épigénétiques : . 58 7. 3. Hormones sexuelles : . 59 8. Biomarqueurs du remodelage ventriculaire post-IDM : . 63 8. 1. Marqueurs de la tension mécanique : . 63 10 8. 2. Marqueurs de la nécrose myocardique : . 66 8. 3. Marqueurs de l'inflammation : . 66 8. 4. Marqueurs de la fibrose : . 69 8. 5. Biomarqueurs transcriptomiques : . 71 8. 5. 1. ARNs codants : . 71 8. 5. 2. ARNs non-codants : . 72 9. Biomarqueurs cardiovasculaires spécifiques des femmes : . 76 Matériels & Méthodes . 78 1. Cohortes : . 79 1. 1. Cohorte LUCKY : . 79 1. 2. Etude LIFE-Heart : . 81 2. Quantification des biomarqueurs cardiaques : . 84 2. 1. NT-proBNP : . 84 2. 2. cTnT et CK : . 85 3. Isolation des cellules sanguines humaines : . 86 3. 1. Isolation des neutrophiles humains primaires : . 86 3. 2. Isolation des monocytes et des lymphocytes humains primaires : . 86 4. Mesure de l'expression génique : . 89 4. 1. Extraction d'ARN : . 89 4. 2. Transcription inverse et PCR quantitative : . 90 5. Analyses statistiques : . 92 5. 1. Analyses standards : . 92 5. 2. Analyses de prédiction : . 92 Résultats . 96 Etude N1 : Identification d'une combinaison de trois gènes capables d'améliorer la prédiction de la fonction ventriculaire après un IDM . 97 Etude N2 : Différences hommes-femmes au niveau de la valeur prédictive post-IDM des biomarqueurs cardiaques . 99 Etude N3 : Identification du gène CDKN1C comme un biomarqueur de la fonction ventriculaire après un IDM spécifiquement chez les femmes . 102 Discussion. 105 11 Etude N1 : Identification d'une combinaison de trois gènes capables d'améliorer la prédiction de la fonction ventriculaire après un IDM . 106 Etude N2 : Différences hommes-femmes au niveau de la valeur prédictive post-IDM des biomarqueurs cardiaques . 110 Etude N3 : Identification du gène CDKN1C comme un biomarqueur de la fonction ventriculaire après un IDM spécifiquement chez les femmes . 113 Conclusions & Perspectives . 116 Bibliographie . 120 12 Introduction Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la première cause de mortalité dans le monde, aussi bien parmi les hommes que les femmes [1]. Les maladies coronariennes représentées principalement par l'infarctus de myocarde (IDM) sont responsables de plus de la moitié des décès causés par les MCV [1]. L'IDM se produit suite à l'obstruction d'une ou de plusieurs artères coronaires privant ainsi les cellules cardiaques d'oxygène et de nutriment. La partie du muscle cardiaque atteinte par l'ischémie rentre dans une phase de mort cellulaire et perd sa fonction contractile. L'IDM démarre d'abord par des douleurs thoraciques qui nécessitent une hospitalisation urgente. Une fois arrivé aux urgences, le patient doit être pris en charge rapidement et des tests sont effectués afin de diagnostiquer l'origine de ces douleurs. Des biomarqueurs sécrétés par les cellules cardiaques en état de stress ischémique sont alors mesurés. L'IDM représente une urgence cardiologique qui nécessite une reperfusion rapide du muscle cardiaque, afin d'éviter le décès et toute autre complication associée au rythme. Un remodelage ventriculaire gauche (RVG) est ensuite mis en place par le cœur afin de palier sa défaillance contractile et retrouver son intégrité fonctionnelle. Ce processus implique des évènements cellulaires et moléculaires entrainant des changements au niveau de la morphologie, de la structure et la fonction du cœur. Si ce processus est dérégulé, il devient délétère et entraine, à long terme, une insuffisance cardiaque (IC). L'IC est définie comme étant l'incapacité du cœur à éjecter assez de sang pour subvenir aux besoins énergétiques de l'organisme. Une fois l'IC installée, il apparait difficilement envisageable de retrouver une fonction cardiaque normale. NT-proBNP (N terminal pro Brain Natriuretic Peptide) représente le biomarqueur préférentiel pour prédire le risque du RVG et d'IC après un IDM. Néanmoins, ce biomarqueur fluctue considérablement après un IDM et le moment idéal pour le mesurer reste à déterminer [2]. D'un autre côté, NT-proBNP est affecté par plusieurs facteurs tels que l'âge, le sexe et l'obésité ce qui nuit à la précision prédictive de ce biomarqueur [3, 4]. La 13 découverte de nouveaux biomarqueurs d'une spécificité et de sensibilité suffisante pourrait offrir une prise en charge personnalisée et permettrait un meilleur suivi des patients. Le sexe est l'un des facteurs majeurs qui affectent la symptomatologie, le traitement et la progression des MCV, y compris l'IDM. Les femmes atteinte d'IDM sont plus âgées présentent plus de comorbidités, particulièrement le diabète et l'hypertension [5]. En outre, la physiopathologie de l'IDM ne semble pas être la même entre les deux sexes. Bien que la rupture de plaque soit à l'origine de l'IDM chez les hommes, l'érosion semble être la cause la plus répondue chez les femmes [6]. De plus, l'IDM en absence d'obstruction coronaire est plus observée chez les femmes [7, 8]. Le processus du remodelage en réponse à l'IDM diffère entre les deux sexes [9] et le risque de développer une IC après un IDM est plus élevé chez les femmes [5]. Des différences ont également été observées au niveau des biomarqueurs cardiaques entre les femmes et les hommes, avec les femmes ayant des taux plus élevés de NT-proBNP [10] et plus bas de créatine kinase (CK) et de troponines cardiaques (cTns) [11]. L'interaction entre le sexe et la capacité de ces biomarqueurs à prédire le RVG après un IDM n'a pas encore été étudiée. D'un autre côté, étant donné que le processus de remodelage diffère entre les deux sexes, la découverte de biomarqueurs spécifiques à chaque sexe fournirait une prédiction plus précise. 14 Hypothèse et organisation du travail L'objectif principal de ce travail de thèse est d'identifier de nouveaux biomarqueurs capables de prédire le risque de développer une dysfonction ventriculaire gauche après un IDM. Etant donné que de nombreuses différences existent entre les femmes et les hommes au niveau de la pathophysiologie de l'IDM et les biomarqueurs cardiaques, ainsi qu'au niveau de l'adaptation à l'ischémie myocardique, nous nous sommes intéressés à des biomarqueurs capables de prédire la dysfonction ventriculaire de manière spécifique à chaque sexe. Tout d'abord, nous nous sommes proposé de valider un groupe de gènes dont l'association avec la dysfonction ventriculaire a été préalablement observée dans un petit groupe de patients. La validation de ces gènes a été effectuée chez 449 patients avec IDM appartenant à notre cohorte nationale LUCKY. Cette étude a donné naissance à la publication suivante : A 3-gene Panel Improves the Prediction of Left Ventricular Dysfunction After Acute Myocardial Infarction. Adeline Boileau MSc, Torkia Lalem MSc, Melanie Vausort MSc, Lu Zhang MSc, and Yvan Devaux PhD. International Journal of Cardiology. 2018 ; 254 : 28-35. Ma contribution à cette étude s'est principalement portée sur la partie technique, c'est-à-dire la mesure des différents gènes par PCR quantitative ainsi que l'analyse des résultats. Ensuite, nous avons émis l'hypothèse que les biomarqueurs cardiaques pourraient être associés avec la dysfonction ventriculaire et la mortalité post-IDM différemment chez les femmes et les hommes. Pour ce faire, nous avons comparé la capacité prédictive des trois biomarqueurs cardiaques cTnT, CK et NT-proBNP entre les femmes et les hommes de notre cohorte de patients LUCKY. Ma contribution à ce travail a consisté aux analyses statistiques ainsi qu'à la rédaction de l'article. Cette étude a généré la publication suivante : Sex-Differences in Biomarkers of Outcome After Acute Myocardial Infarction. Torkia Lalem MSc, Yvan Devaux PhD (soumise). Dans la troisième étude présentée dans ce manuscrit, nous avons découvert un nouveau biomarqueur capable de prédire la dysfonction ventriculaire post-IDM de manière spécifique aux femmes. La capacité prédictive de ce biomarqueur a été mesurée dans deux 15 cohortes indépendantes, la cohorte nationale LUCKY et la cohorte d'IDM de l'étude allemande LIFE-Heart. Ce travail a permis la génération de la publication suivante : Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1 C is a Female-Specific Marker of Left Ventricular Function After Acute Myocardial Infarction. Torkia Lalem MSc, Lu Zhang MSc, Markus Scholz PhD, Ralph Burkhardt MD, Victoria Saccheti MSc, Andrej Teren MD, Joachim Thierry MD, and Yvan Devaux PhD. International Journal of Cardiology. 2018 Jul 10 [Epub ahead of print]. Ma contribution a concerné les différentes étapes de cette étude, depuis la mesure du biomarqueur d'intérêt, jusqu'à l'analyse des résultats, les analyses statistiques ainsi que la rédaction de l'article. Je tiens à préciser que j'ai bénéficié pour cette étude des aides précieuses de ma collègue Lu Zhang pour les analyses statistiques et de ma stagiaire en master Victoria Saccheti pour la partie technique. 16 Présentation générale du manuscrit Ce manuscrit s'articule en 5 parties : - La première partie est consacrée à une revue de l'état de l'art. Elle commence par une description du cœur, des MCV ainsi que des données épidémiologiques relatives aux MCV. Elle présente également les différences hommes-femmes connues au niveau de l'IDM, du RVG et de l'IC ainsi que les mécanismes qui seraient à l'origine de ces différences. Cette partie traite également de l'avancement de l'état de connaissance des biomarqueurs du RVG. - La deuxième partie couvre les techniques qui ont été utilisées pour réaliser les trois études de ce manuscrit. - La troisième partie présente les résultats obtenus lors des trois études. - La quatrième partie porte sur une discussion des résultats obtenus lors des trois études. - La dernière partie est consacrée aux conclusions et perspectives de ce travail de thèse. 17 Etude Bibliographique 18 1. Cœur : Le cœur est l'organe vital logé au niveau du médiastin antérieur. Il est responsable de la distribution d'oxygène et de nutriments et de l'élimination des déchets de l'organisme grâce à ses contractions régulières. Le cœur est divisé en 4 cavités par deux cloisons verticale et horizontale : deux cavités supérieures appelées oreillettes et deux cavités inférieures appelées ventricules (Figure 1). Les deux ventricules sont séparés par le septum interventriculaire et les deux oreillettes sont séparées par le septum interauriculaire. Le cœur est divisé alors en deux parties ; le cœur gauche et le cœur droit ou les oreillettes communiquent avec les ventricules à travers les orifices auriculo-ventriculaires. L'oreillette gauche communique avec le ventricule gauche (VG) à travers l'orifice mitral et l'oreillette droite communique avec le ventricule droit à travers l'orifice tricuspide. Le cœur possède également des valves cardiaques qui permettent au sang de circuler dans le même sens et ne pas refluer. Figure 1. Le cœur humain cardiologique/enseignement/cardiologie/site/html/1. html Le cœur est à l'origine de la petite et de la grande circulation (Figure 2). Le cœur droit permet la circulation pulmonaire ou petite circulation. Il recueille le sang veineux 19 déssaturé en oxygène en provenance de l'ensemble des tissus de l'organisme à l'exception des poumons. Le sang est ensuite éjecté vers les poumons via l'artère pulmonaire. Au niveau des capillaires pulmonaires, le sang s'enrichit en oxygène et se débarrasse du gaz carbonique. La circulation systémique ou la grande circulation est assurée par le cœur gauche, qui va recueillir le sang riche en oxygène sortant des poumons par les veines pulmonaires pour l'acheminer vers tous les autres organes par l'intermédiaire de l'aorte, première artère à la sortie du VG. Figure 2. La circulation sanguine Cette circulation est possible grâce aux mouvements cycliques du cœur qui alternent des phases de contraction et de relâchement. La contraction est appelée systole et le relâchement est appelé diastole. Le cycle cardiaque correspond à un battement cardiaque et est appelé révolution cardiaque. Cette dernière est décomposée en trois phases : systole 20 auriculaire, systole ventriculaire et diastole. Dans un premier temps, les ventricules se remplissent grâce à la systole auriculaire. Ensuite, la systole ventriculaire qui est décomposée en contraction isovolumétrique permettant de mettre le sang sous pression et une contraction isotonique permettant l'éjection du sang vers les artères. La dernière phase est celle de la diastole ou de la relaxation du myocarde permettant à nouveau le remplissage des oreillettes. Le cœur possède son propre système nerveux végétatif appelé tissu nodal. Ce dernier se trouve à l'intérieur dans l'épaisseur du myocarde. Il donne naissance et conduit les impulsions électriques engendrant les contractions cardiaques. Le cœur possède également sa propre circulation artérielle et veineuse appelée circulation coronaire. La circulation artérielle est assurée par les artères coronaires qui sont au nombre de deux : artère coronaire gauche et droite (Figure 3). Ces deux artères sont ramifiées en grand nombre de vaisseaux sanguins irriguant tout le cœur. L'artère coronaire gauche par exemple bifurque en artère interventriculaire antérieure et artère circonflexe. Figure 3. Les artères coronaires Image d'après F. Netter, Atlas d'anatomie humaine [12] La paroi cardiaque est constituée de 3 tuniques de l'intérieur vers l'extérieur : l'endocarde, le myocarde et le péricarde (Figure 4). 21 L'endocarde correspond à une membrane endothéliale tapissant la face interne du cœur et se prolongeant par l'intima des gros vaisseaux. L'un de ses rôles est d'éviter la coagulation du sang au contact des parois. Le myocarde est le muscle cardiaque, c'est un muscle strié autonome régulé par le système nerveux sympathique (SNS) et parasympathique. Il est constitué de plusieurs types cellulaires dont majoritairement les cardiomyocytes qui permettent la contraction, mais aussi les fibroblastes qui constituent la matrice extracellulaire (MEC) et les cellules endothéliales qui forment les vaisseaux sanguins et les cellules nerveuses sensitives. Le péricarde est un sac à double paroi enveloppant le cœur. Il est composé de plusieurs feuillets : le feuillet fibreux, le feuillet pariétal, qui est séparé du feuillet viscéral grâce à l'espace péricardique. Ce dernier est rempli de liquide interstitiel qui permet les mouvements du cœur. Figure 4. Les tuniques de la paroi cardiaque 22 Le volume éjecté par le ventricule gauche, appelé volume d'éjection systolique (VES), dépend de la force de contraction du cœur. Le VES est proche de 100ml chez un homme adulte sain. Ce volume peut être calculé en soustrayant le volume de sang dans le VG en fin de systole (volume télésystolique VTS) du volume en fin de diastole (volume télédiastolique VTD). La division du VES par le VTD permet le calcul de la fraction d'éjection (FE), qui représente un indice du bon fonctionnement du cœur. Les valeurs normales d'une FE normale sont 67 8% [13]. Des différences existent entre les femmes et les hommes au niveau de la taille des artères coronaires ainsi que les dimensions et la fonction ventriculaire (FV). La taille des artères coronaires chez les femmes sont plus petites que celles chez les hommes [14]. En outre, La taille de la cavité ventriculaire gauche est plus petite chez les femmes ce qui engendre des VES plus petits [15]. Néanmoins, le débit cardiaque est comparable entre les deux sexes étant donné que le rythme cardiaque est plus rapide chez les femmes compensant ainsi la différence au niveau du VES [16]. La FE augmente avec l'âge chez les deux genres mais cette augmentation est plus importante chez les femmes [15]. Au niveau histologique, les femmes et les hommes possèdent le même nombre de cardiomyocytes à la naissance [15]. Avec l'âge, les femmes perdent relativement moins de cardiomyocytes que les hommes. 23 2. Maladies cardiovasculaires : Les MCV correspondent aux désordres affectant le cœur et les vaisseaux sanguins. Ils en existe plusieurs types (Figure 5) : les cardiopathies coronariennes (problème d'irrigation du muscle cardiaque), les maladies cérébrovasculaires (problème de circulation des vaisseaux du cerveau), les artériopathies périphériques (problème de circulation sanguine dans les bras et les jambes), les cardiopathies rhumatismales (dommages au niveau des articulations et de valvules cardiaques causés par une infection bactérienne), les cardiopathies congénitales, les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires (l'obstruction de l'artère pulmonaire par un caillot de sang). Figure 5. Les catégories des MCV vasculaires En Europe, comme à travers le monde [17], les MCV représentent la première cause de mortalité. Elles tuent tous les ans 4 millions de personnes à travers le continent, ce qui compte pour 45% de la mortalité totale [1]. Les maladies coronariennes ainsi que les maladies ischémiques cérébrales sont au premier rang, causant respectivement la mort de 1, 8 24 millions et d'un millions de personnes. Bien que la mortalité causée par les MCV continue à baisser à travers l'Europe, leur incidence ne cesse pas d'augmenter, reflétant le vieillissement de la population européenne [18]. Les MCV tuent plus de femmes (2, 2 millions) que d'hommes (1, 8 millions), ce qui compte pour 49% et 40% de la mortalité globale chez les femmes et les hommes [1] respectivement (Figure 6). De plus, les maladies coronariennes tuent autant de femmes (19%) que d'hommes (20%) [1]. Les causes de la mortalité cardiovasculaire (CV) globale plus accrue chez les femmes sont les accidents vasculaires cérébraux (AVC) et les autres MCV qui sont plus fatals pour les femmes (Figure 6) [18]. La majorité des décès causés par les MCV (60%) surviennent chez les personnes âgées de 75 ans et plus. La mortalité prématurée (avant l'âge de 75 ans) est plus répondue parmi les hommes. Avant l'âge de 65 ans, les MCV tuent 2 fois plus d'hommes que de femmes [18]. Cette différence au niveau de la mortalité prématurée entre les deux sexes est majoritairement observée dans les maladies coronariennes. 25 Figure 6. Les causes de mortalité en Europe chez les hommes et les femmes (Traduite depuis la version originale) [1]. 26 3. Facteurs de risque cardiovasculaires : Le développement des MCV est influencé par différents facteurs de risque qui sont regroupés en facteurs de risques dits modifiables engendrés par le mode de vie, et d'autres dits non modifiables tels que l'âge, le sexe, l'hérédité et l'historique médical. L'association entre les facteurs de risque modifiables et les maladies coronariennes a été analysée dans l'étude INTERHEART incluant 15000 cas d'IDM et le même nombre de contrôles à travers le monde [19]. L'étude a déterminé 9 facteurs de risque responsables de 90% d'IDM : tabac, lipides, diabète, hypertension, consommation modérée d'alcool, obésité, régime diététique, activité physique et facteurs psychosociaux. [19]. L'association de ces différents facteurs de risque avec les MCV est différente entre les deux sexes (Figure 7). Diabète : Figure 7. Différence hommes-femmes au niveau des facteurs de risque CV Le risque de mortalité CV est trois fois plus élevé chez les diabétiques par rapport aux non-diabétiques [20]. Comparées aux hommes, les femmes diagnostiquées pour un diabète de type II ont plus de risque de développer des MCV [21-23]. En outre, chez les patients atteints 27 de maladies coronariennes, l'association du diabète de type II avec un mauvais pronostic est plus puissante chez les femmes [22]. Une méta-analyse incluant 37 études à travers le monde (447 064 patients dont 45% des femmes) a montré que les femmes diabétiques avaient plus de risque d'avoir une maladie coronarienne fatale que les hommes diabétiques (7, 7% pour les femmes versus 4, 5% pour les hommes) [24]. Les dérégulations lipidiques qui sont plus importantes chez les femmes diabétiques semblent être à l'origine de ces différences [23, 25, 26]. Hypertension : L'IDM et les AVC constituent les MCV les plus associés avec l'hypertension [27]. L'étude INTERHEART a montré que 22% d'IDM en Europe était associé à l'hypertension, ce qui attribue aux hypertendus deux fois plus de risque d'avoir un IDM [19]. L'incidence de l'hypertension est plus élevée chez les jeunes hommes ( ans) par rapport aux femmes du même âge [28]. Néanmoins, la différence homme-femme dans la prévalence d'hypertension disparait entre l'âge de 45 à 60 ans. Après l'âge de 60 ans, le nombre de femmes hypertendues dépasse celui des hommes [28]. Une pression artérielle élevée est associée à un risque CV plus élevé chez les femmes [29]. Les femmes hypertendues ont 3 fois plus de risque de développer une IC et un AVC par rapport à leurs homologues masculins [6, 30]. Hyperlipidémie : L'hyperlipidémie est l'un des principaux facteurs de risque CV, en particulier celui associé avec les maladies coronariennes [31]. Après l'âge de 20 ans, les taux du cholestérol LDL (pour low density lioprotein), qualifié du mauvais cholestérol, augmente progressivement chez les deux sexes, sauf que cette augmentation est plus accélérée chez les hommes. [32]. Quant aux taux de HDL (pour high density lipoprotein), qualifié du bon cholestérol, sont moindres chez les hommes par rapport aux femmes, et ce à tous les âges [33]. La capacité du cholestérol total et du LDL à prédire le risque de maladies coronariennes est comparable chez les deux sexes [34]. Des taux réduits de HDL prédisent le risque de maladies coronariennes équitablement chez les deux sexes de jeune âge. Chez les personnes 28 âgées, ce facteur est associé avec un risque élevé de maladies coronariennes chez les femmes mais pas les hommes [34]. Obésité L'étude Framingham a montré que les personnes en surpoids ont deux fois plus de risque de développer une IC [35]. L'obésité est plus fréquente parmi les femmes et ce à n'importe quel statut socio-économique [36]. La distribution de l'adiposité à travers le corps est différente entre les hommes et les femmes [37]. L'obésité masculine est caractérisée par une localisation abdominale ou autrement appelée viscérale qui est associée avec un risque cardio-métabolique élevé. Chez les femmes, l'obésité est plutôt de localisation sous-cutanée périphérique. Après la ménopause, la distribution de la graisse devient plutôt semblable à celle des hommes, de localisation majoritairement viscérale. La mortalité CV a été comparée entre 22000 femmes et 23000 hommes appartenant à 11 cohortes de plusieurs pays européens. La mortalité CV était plus élevée parmi les hommes et ce dans les différentes catégories d'indice de masse corporelle (IMC) [38]. Tabagisme : Les fumeurs ont 3 à 8 fois plus de risque de subir un IDM par rapport aux non- fumeurs [6]. La caractérisation clinique de 4 registres français d'IDM (de 1995 à 2010), a montré que l'âge moyen des patients ayant subi un IDM a baissé de 66, 2 à 63, 3 [39]. Cela est expliqué en partie par l'augmentation des taux d'obésité (14% à 20%) et du tabagisme (32% à 41%) comme facteurs de risque. Malgré que la proportion globale des femmes n'ait pas changé pendant les 15 ans, celle des femmes de moins de 60 ans a augmenté de 12% à 25%. Cette augmentation a été accompagnée par une augmentation dans la prévalence des patients, notamment des femmes, qui présentent l'obésité ou le tabagisme comme leur seul facteur de risque [39]. Le risque d'IDM associé au tabagisme était comparable entre les deux sexes de l'étude INTERHEART [19]. Néanmoins, chez les ex-fumeurs, le risque était plus élevé chez les hommes. Facteurs psychosociaux : 29 L'association américaine du cœur souligne que la majorité de jeunes femmes souffrant de maladies coronariennes appartiennent à un milieu défavorisé et ont une lourde charge de facteurs psychosociaux tels que la dépression, les troubles de stress post- traumatique, et les traumatismes subis pendant l'enfance [40]. Les facteurs psychosociaux étaient plus associés avec le risque d'IDM chez les femmes que les hommes dans l'étude INTERHEART [19]. Facteurs de risque spécifiques aux femmes : Aux facteurs de risque CV communs entre les deux sexes, s'ajoutent des facteurs de risque CV qui sont spécifiques aux femmes. Ces facteurs de risque sont liés à la gestation, au rôle reproducteur et aux hormones sexuelles, tels que les troubles hypertensifs lors de la grossesse, le diabète gestationnel et la ménarche/ménopause. Dans les pays industrialisés, les complications CV surviennent dans 0. 2-4% des grossesses [41]. Le risque de complications CV lors de la grossesse ne cesse d'augmenter, justifié par l'augmentation de l'âge des femmes primigestes ainsi que la prévalence de facteurs de risque tels que le diabète, l'hypertension et l'obésité chez les femmes enceintes. En outre, comme le traitement des maladies cardiaques congénitales est devenu plus efficace, beaucoup de femmes souffrant de ces maladies atteignent l'âge de procréation [41]. Dans les pays occidentaux, les maladies cardiaques constituent la première cause de décès maternel lors de la grossesse [42]. Les troubles hypertensifs survenant lors de la grossesse sont répartis en : hypertension gestationnelle et pré-éclampsie (définie comme étant une augmentation de la pression artérielle accompagnée de protéinurie). Ils surviennent dans 6-8% des grossesses [41], et sont considérés comme des facteurs de risque majeurs. Les femmes atteintes d'hypertension gestationnelle ont un risque élevé de développer l'hypertension plus tard dans leur vie [43]. Le diabète gestationnel est défini comme étant une intolérance au glucose diagnostiquée pour la première fois lors de la grossesse. Rapidement après l'accouchement, 30 l'homéostasie glycémique est restaurée mais le risque de développer un diabète de type II reste élevé chez ces femmes. Dans une méta-analyse incluant 20 cohortes à travers le monde, les auteurs ont montré que les femmes ayant développé le diabète pendant leur grossesse, ont 7 fois plus de risque de développer le diabète de type II plus tard dans leur vie, et ce comparées aux femmes restées normo-glycémiques lors de leurs grossesses [44]. La ménopause n'est pas un simple marqueur de la fin de la reproduction mais représente un indicateur de l'état de santé globale des femmes. Cette association entre la ménopause et la santé des femmes est due à l'effet des estrogènes sur la fonction des différents organes. Une ménopause précoce, avant l'âge de 45 ans, est associée avec un risque CV plus élevé par rapport à la ménopause survenant après cet âge [45]. Figure 8. L'incidence de l'IDM chez les femmes et les hommes en fonction de l'âge [46] Chez les femmes, il est difficile de distinguer entre l'effet de l'âge et de la ménopause sur le risque CV. Dans une cohorte de population norvégienne de 33 997 participants (dont 51% de femmes) [46], le risque d'avoir un IDM a été comparé entre les deux sexes. L'incidence d'IDM était plus élevée chez les hommes et cette différence diminuait avec l'âge, tout en persistant (Figure 8). Dans cette étude, le facteur de risque le plus associé avec 31 le sexe féminin était les taux de HDL. Les taux de HDL plus élevés chez les femmes seraient responsables de moins d'incidence d'IDM. Le risque de développer un IDM augmente avec l'âge chez les deux sexes. Cette augmentation est lente avant l'âge de 65 ans et devient abrupte après cet âge (Figure 8). Cette diminution au niveau de l'écart entre les deux sexes ne semble pas être expliquée par la ménopause, étant donné que la ménopause n'induit pas une augmentation soudaine dans le risque d'IDM chez les femmes. L'incapacité de la thérapie de remplacement hormonal à réduire le risque CV chez les femmes ménopausées pourrait également suggérer que la ménopause n'est pas à l'origine des différences du risque CV entre les deux sexes [6]. 32 4. Infarctus du myocarde : Les cardiopathies ischémiques, dont l'IDM, sont la première cause de mortalité dans le monde [1]. Elles sont définies comme étant une diminution dans la perfusion sanguine du muscle cardiaque, réduisant ainsi les apports en oxygène et en nutriments. Elles sont causées le plus souvent par la rupture d'une plaque d'athérosclérose. Elles représentent une urgence cardiologique, étant donné que des troubles de rythme peuvent les compliquer à tout moment et de manière imprévisible. 4. 1. Définition universelle de l'IDM : L'IDM est défini comme étant une nécrose myocardique dans un contexte clinique d'ischémie myocardique aigue [47]. Le diagnostic de l'IDM est basé sur une modification au niveau de cTns avec au moins un des deux critères suivants : présence de symptôme ischémique ou une évidence de nécrose myocardique observée par électrocardiogramme (ECG) ou par une technique d'imagerie. 4. 2. Classification de l'IDM : Il existe cinq types différents d'IDM, classifiés selon les différences pathologiques, cliniques, diagnostiques et même l'approche thérapeutique suivie pour la prise en charge des patients. Les types 1 et 2 sont les principaux types d'IDM (Figure 9). IDM type 1 (spontané) : Cette classe d'IDM est souvent le résultat d'une coronaropathie. Il survient suite à une rupture, fissuration, ulcération, érosion ou dissection d'une plaque d'athérome, entrainant un thrombus au niveau d'une ou de plusieurs artères coronaires. Cette occlusion entraine une diminution du flux sanguin ou une embolie plaquettaire aboutissant ainsi à une nécrose myocardique. En outre, l'absence de coronaropathies significatives, ou d'obstruction à l'angiographie peut également être observée. Cette catégorie non obstructive peut être 33 observée dans 5-20% des cas présentant un syndrome coronarien [48-50], ce qui est le plus souvent le cas chez les femmes. Figure 9. Les types 1 et 2 de l'IDM (traduite à partir de la version originale) [47] IDM type 2 (secondaire) : Cette deuxième catégorie est due à un déséquilibre en oxygène entre l'apport et la demande résultant d'une condition autre qu'une coronaropathie sous-jacente. Spasme et dysfonctions endothéliales jouent un rôle majeur dans le développement de ce type d'IDM [51-53]. IDM type 3 : Décès d'origine cardiaque suite à des symptômes suggérant une ischémie myocardique et des modifications au niveau de l'ECG (nouvelles ou présumées nouvelles) ou l'apparition d'un nouveau bloc de branche gauche [47]. Le décès est survenu avant le prélèvement sanguin ou avant l'augmentation des biomarqueurs cardiaques. 34 IDM type 4 et 5 Un IDM peut survenir lors d'une intervention coronaire percutanée (ICP) (type 4) ou d'un pontage coronaire (type 5) [47]. Une élévation des cTns est observée à la fin de l'intervention. 4. 3. Pathophysiologie de l'IDM : La pathophysiologie de l'IDM, définie comme étant une formation de thrombus suite à une rupture de plaque d'athérosclérose, a significativement évolué lors des deux dernières décennies. L'étude VIRGO (Variation in Recovery : Role of Gender on Outcomes of Young Acute Myocardial Infarction Patients) a montré qu'une femme sur 8 se présentant avec un syndrome coronarien aigu ne peut pas être classée selon la définition universelle de l'IDM [54]. A l'instar des hommes qui se présentent le plus souvent avec des coronaropathies occlusives, les coronaropathies non occlusives sont plus répondues chez les femmes [55]. IDM avec obstruction : L'IDM avec obstruction est engendré principalement par une rupture ou une érosion d'une plaque d'athérosclérose. Cette dernière est définie comme étant une réaction inflammatoire en réponse à l'accumulation des lipides au niveau de la paroi artérielle (Figure 10) [56]. L'hypercholestérolémie, en particulier l'augmentation des LDL, est considérée comme un facteur principal favorisant la formation d'une plaque d'athérosclérose. La première étape dans la formation d'une plaque consiste à la pénétration des LDL dans l'espace sous-endothélial favorisée par l'augmentation de la perméabilité endothéliale. Ces LDL sont alors piégés dans l'espace intimal en interagissant avec la matrice extracellulaire (MEC) [56]. Ces molécules de LDL vont ensuite subir une série de modifications, principalement l'oxydation, qui est responsable de l'initiation de la réponse inflammatoire qui s'intensifie par l'infiltration des monocytes et des lymphocytes T et la sécrétion d'un cocktail de cytokines [56]. Des métalloprotéinases (MMPs) capables de dégrader la MEC sont également libérées par les cellules de la plaque. 35 La deuxième conséquence de l'oxydation des LDL est la formation des cellules spumeuses qui sont des macrophages gorgées de LDL oxydés. Quant aux LDL extracellulaires, ils se regroupent au centre de la plaque pour former un amas appelé noyau graisseux. D'un autre côté, des cellules musculaires lisses (CML) migrent à partir de la média vers l'intima o ils prolifèrent. Les CML acquièrent ensuite un phénotype sécrétoire produisant de la MEC. L'accumulation de la MEC aboutit à la formation de la chape fibreuse. Figure 10. Les étapes de formation d'une plaque d'athérosclérose Ce qui fait le danger d'une plaque n'est pas tant sa taille mais les complications possibles issues de la rupture ou de l'érosion de l'endothélium revêtant la chape fibreuse (Figure 10) [56]. Une plaque est considérée vulnérable, si elle contient un grand centre lipidique et une chape fibreuse fine. La rupture de la chape fibreuse met en contact le sang 36 avec les éléments thrombogènes de la plaque. Cela induit l'agrégation plaquettaire et la cascade de coagulation aboutissant à un phénomène de thrombose. Dans 20-40% des cas d'IDM [57], il n'existe pas une rupture de la plaque mais une érosion superficielle mettant en contact le sang avec l'espace sous-endothélial, mais les conséquences en matière de thrombose sont similaires. La formation de thrombus peut entrainer un rétrécissement de la lumière sans toutefois entrainer une occlusion complète, le syndrome résultant est alors l'angor instable. En cas d'une occlusion complète, le patient souffre alors d'un IDM. Les femmes présentent plus souvent que les hommes une coronaropathie non- obstructive (15% versus 8%) [6]. Les données d'angiographie et d'échographie intravasculaire de l'étude PROSPECT (The Providing Regional Observations to Study Predictors of Events in the Coronary Tree), ont montré que les femmes avec syndrome coronarien aigu présentaient une coronaropathie moins extensive [58]. En outre, elles présentent moins de rupture de plaque que les hommes (6, 6% versus 16, 3% p 0, 002) [58]. Ces observations ont ultérieurement été confirmées dans l'étude ADAPT-DES (the assessment of dual antiplatelet therapy with drug-eluting stents) o les femmes avaient une chape fibreuse moins fine par rapport aux hommes et moins de rupture de plaque. Cette différence atténuait avec l'âge en étant significative seulement chez les patients de moins de 65 ans [6]. Les facteurs protégeant les femmes contre une coronaropathie lourde avant la ménopause semblent être plus liés à leur profil lipidique favorable que les hormones sexuelles [55]. De plus, le sexe féminin et le tabagisme sont les facteurs de risque les plus associées avec l'érosion de la plaque d'athérosclérose [59]. IDM sans obstruction : L'ischémie myocardique peut également se présenter sans coronaropathie obstructive (Figure 11). Malgré le risque de développer des complications CV, ces patients sont faussement rassurés et reçoivent moins de thérapies que ceux avec obstruction [14]. L'étude WISE (Women's Ischemia Syndrome Evaluation) a montré que la moitié des femmes s'étant présenté pour une ischémie myocardique n'avaient pas de coronaropathie obstructive (définie comme 50% de sténose au niveau d'au moins une artère coronaire) [7, 8]. 37 Figure 11. Pathophysiologie de l'IDM sans obstruction (Traduite depuis la version originale) [60] Le spasme coronaire est une vasoconstriction intense conduisant à l'obstruction partielle ou complète de l'artère coronaire (Figure 11) [61]. Il survient souvent au repos, particulièrement pendant la nuit. Sur l'ECG, le spasme coronaire est souvent associé à une dépression du segment ST. Le mécanisme pathogénique semble inclure plusieurs facteurs, plus particulièrement l'hyperréactivité des CML, le système nerveux autonome et les cellules endothéliales [6, 61]. La dissection spontanée d'une artère coronaire (DSAC) est définie comme étant une déchirure au niveau de la paroi artérielle qui n'est pas d'origine iatrogénique ou traumatique (Figure 11). Le progrès dans l'utilisation des techniques d'imagerie coronaire a amélioré le diagnostic de cette manifestation. La DSAC serait à l'origine d'environ 1, 7-4% des syndromes coronariens aigues [62, 63]. De plus, il est bien plus présent chez les femmes (92- 95%) notamment d'âge jeune (entre 44 et 55 ans) [6]. La dissection peut avoir lieu entre n'importe laquelle des 3 couches de la paroi artérielle (adventice, media ou intima). Plusieurs facteurs semblent être responsables de ce phénomène. Dans la majorité des cas, les patients 38 souffrent d'une artériopathie fragilisant la paroi artérielle [6]. Des cas associés à des dysplasies fibromusculaires ont également été rapportés [6]. Le syndrome de Takotsubo, également appelé le syndrome des cœurs brisés est caractérisé par un apex en forme de ballon (Figure 11). Il se présente avec des symptômes très similaires à un syndrome coronarien aigu, avec une douleur thoracique et des modifications ischémiques au niveau de l'ECG [64]. Une cardiotoxicité aux catécholamines suite à un stress physique ou émotionnel a été désignée comme une des principales causes de ce syndrome [64]. 1-2% des patients se présentant pour un syndrome coronarien aigu sont diagnostiqués pour avoir le syndrome de Takotsubo dont 90% sont des femmes ménopausées [64-66]. Parmi les caractéristiques cliniques de ce syndrome : des anomalies au niveau de la mobilité de la paroi ventriculaire, augmentation importante des peptides natriurétiques, augmentation légère des cTns, récupération de la FV systolique dans les 3 à 6 mois [6]. La dysfonction coronaire microvasculaire (DCM) contribue également aux signes et aux symptômes d'ischémie non-obstructive. Elle correspond à une altération au niveau de la régulation des vaisseaux de résistance myocardiques également appelés artérioles coronaires [67]. La prévalence de cette dysfonction microvasculaire est plus élevée chez les femmes, qui représentent 70% des patients [68]. Une altération au niveau de la fonction endothéliale des artérioles coronaires est considérée comme l'un des principaux mécanismes responsables de DCM. Cette dysfonction endothéliale entraine une réponse exagérée aux stimuli vasoconstricteurs et une incapacité de produire du monoxyde d'azote en réponse à ces stimuli [67]. Un déséquilibre au niveau du système nerveux autonome induisant une vasoconstriction exagérée a également été suggéré [67]. 4. 4. Diagnostic de l'IDM : Le diagnostic de l'IDM se base sur l'élévation des biomarqueurs cardiaques, préférentiellement les cTns, accompagnée d'une évidence de l'ischémie myocardique aigue : symptômes ischémiques, des modifications au niveau de l'ECG ou toute autre évidence de nécrose myocardique (Figure 12). 39 Figure 12. Diagnostic de l'IDM [69] Les caractéristiques cliniques de l'ischémie myocardique : Les symptômes ischémiques sont une combinaison de douleur thoracique, qui peut s'étendre au niveau des membres supérieurs, de la mâchoire inférieure, du coup, et de l'épigastre (Figure 12), et ce à l'effort comme au repos et ne disparait pas avec le mouvement de la région douloureuse. Fatigues, dyspnée, nausées, hypersudation et palpitations peuvent également être observées [70]. Les différentes études montrent que la douleur thoracique est le symptôme le plus répandu chez les deux sexes [71-73]. Dans le registre GRACE (Global Registry of Acute Coronary Events) incluant plus de 19000 hommes et femmes, la proportion des patients ayant présenté une douleur thoracique était comparable entre les femmes (92%) et les hommes 40 (94%) [71]. Dans le même registre, les femmes présentaient plus souvent des symptômes atypiques (douleurs maxillaires, nausées et vomissements) en absence de douleur thoracique. Dans une autre cohorte incluant des patients de plus jeune âge (55 ans), la douleur thoracique était le symptôme le plus répandu chez les deux sexes (86% chez les hommes et 81% chez les femmes) [72]. En absence de douleur thoracique chez ces patients, les mêmes symptômes atypiques ont été observés chez les deux sexes (fatigue, sensation de chaleur, dyspnée, hypersudation, douleur au niveau de l'épaule et du bras gauche). Néanmoins, les femmes se présentaient avec un nombre plus élevé de ces symptômes [72]. Dans le registre américain NRMI (National Registry of Myocardial Infarction) incluant plus d'un million de patients, une interaction entre le sexe, l'âge et la douleur thoracique a été observée [73]. Dans cette cohorte, les patients ne présentant pas une douleur thoracique étaient le plus souvent des NSTEMI (Non ST-segment elevation myocardial infarction) et recevant moins de thérapie de reperfusion, et ce indépendamment du sexe. L'absence de douleur thoracique a été observée chez 35% de patients et était plus répandue chez les femmes (45%) par rapport aux hommes (30%). Cette différence était plus importante chez les jeunes patients et rétrécissait avec l'âge [73]. Les femmes tendent à se présenter plus tard que les hommes après le début de la douleur [74, 75] particulièrement les femmes âgées de moins de 60 ans [75]. Cette observation impose des compagnes de sensibilisation du risque de maladies ischémiques chez les femmes et notamment des symptômes qualifiés d'atypiques. ECG : L'ECG constitue le premier test diagnostic chez les patients soupçonnés d'avoir un IDM. Il doit être promptement enregistré et interprété, idéalement dans les 10 minutes suivant la présentation du patient [76]. Afin de pouvoir détecter toute modification, l'enregistrement de plusieurs ECG est requis, particulièrement si le premier ECG n'est pas évocateur d'IDM. Des modifications au niveau du segment ST, des ondes T et Q permettent aux cliniciens de déterminer l'artère responsable de l'IDM, estimer la taille du myocarde en ischémie, et de 41 déterminer l'approche thérapeutique à suivre. Les manifestations les plus précoces de l'ischémie myocardique sont bien le segment ST et l'onde T. Un sus-décalage prolongé du segment ST (>20 minutes) est un indicateur d'une occlusion coronaire aigue et d'une nécrose myocardique. L'IDM est qualifié de STEMI (ST segment elevation myocardia infarction), ou NSTEMI en fonction respectivement de la présence ou de l'absence de cette modification (Figure 12). Le temps de référence (10min) entre la présentation du patient et le premier ECG est moins respecté chez les femmes par rapport aux hommes [77]. Des différences sont également observées au niveau du diagnostic final des femmes et des hommes. Dans l'étude GUSTO IIb incluant plus de 12000 patients, STEMI était beaucoup moins fréquent chez les femmes par rapport aux hommes (27% versus 37%). De plus, parmi les patients avec NSTEMI et angor instable, les femmes étaient plus diagnostiquées pour angor instable [78]. La faible prévalence de STEMI chez les femmes a ultérieurement été confirmée dans l'étude GWTG-CAD (Get With the Guidelines-Coronary Artery Disease) incluant 78254 patients (28, 2% versus 35, 1% ; p [79]. Mesure des cTns : Les Tns sont des protéines structurelles des muscles striées, squelettiques et cardiaques. Leur rôle principal est de réguler la contraction en fonction du calcium intracellulaire. Parmi les 3 sous-unités (I, T et C), les isoformes I et T sont spécifiques du muscle cardiaque. Les cTns représentent les biomarqueurs préférentiels pour le diagnostic de l'IDM, et ce grâce à leur haute spécificité et sensibilité par rapport à d'autres biomarqueurs tels que la CK, la fraction MB de la CK ou la myoglobine (Figure 13) [76]. Les cTns représentent le marqueur de référence pour la détection de la nécrose myocardique, que ce soit d'origine ischémique ou pas. La moitié des patients se présentant avec une douleur thoracique, ont un niveau élevé de cTns [80]. La définition universelle de l'IDM a fixé la limite de référence supérieure de cTns au 99ème percentile d'une population de référence. Les techniques de dosage dites hypersensibles se caractérisent par des valeurs du 99ème percentile très basses et une précision analytique de 42 10% pour des valeurs proches voir inférieures au 99ème percentile. La commercialisation de ces techniques ont permis la détection de la cTn dans la population saine [81]. De plus, l'utilisation de ces techniques a augmenté le diagnostic de l'IDM et a permis une meilleure identification des patients à risque d'une récidive d'IDM ou de mortalité [82, 83]. Figure 13. Les biomarqueurs de la nécrose myocrdiaque. Traduite depuis la version originale [81] Les concentrations de cTns sont inférieures chez les femmes par rapport aux hommes [84, 85]. Cette différence pourrait être justifiée par la faible masse du VG chez les femmes [86]. Néanmoins, il a récemment été montré que les valeurs supérieures de cTns chez les hommes persistaient même après ajustement avec la masse ventriculaire [87]. Le diagnostic de l'IDM était plus souvent manqué chez les femmes, notamment celles âgées de moins de 60 ans [88, 89]. Comme la limite de référence supérieure de cTns est 1, 2- 2, 4 fois plus élevée chez les hommes par rapport aux femmes [85], l'utilisation d'un seuil de cTns spécifique de chaque sexe s'est imposée. Shah et ses collègues ont comparé l'utilisation d'un seul seuil générique de cTn versus l'utilisation de deux seuils spécifiques à chaque sexe, 43 chez 1126 patients suspectés d'avoir un syndrome coronarien aigu [86]. L'utilisation du seuil spécifique à chaque sexe a permis une augmentation importante dans le nombre de femmes diagnostiquées (16% versus 22%, p Cette augmentation était moins importante chez les hommes (19% versus 21%, p L'utilisation du seuil spécifique a également permis une meilleure stratification des femmes à risque de récidives ou de mortalité que le seuil générique [86]. 4. 5. Prise en charge de l'IDM : ICP est la stratégie préférentielle pour traiter les patients avec un STEMI dans les 12 heures suivant le début de symptômes ou dans les 3 heures suivant le diagnostic confirmé de STEMI [70]. L'utilisation de l'ICP prime sur celle des thérapies fibrinolytiques. Une réduction plus importante au niveau de la mortalité, de l'incidence de l'AVC et d'IDM a été observée avec l'ICP primaire par rapport à la fibrinolyse [70]. L'ICP améliore la survie aussi bien chez les hommes que les femmes avec STEMI [6]. Dans le cas o l'ICP n'est pas disponible, la fibrinolyse peut être promptement administrée. Chez les patients NSTEMI, la décision de l'utilisation d'une stratégie invasive (ICP ou pontage coronaire) est basée sur l'estimation des risques ischémique et hémorragique [76]. Des médicaments sont également administrés afin de soulager la douleur ischémique tels les nitrates, les bétabloquants et les opioïdes. Afin de minimiser la formation et la propagation du thrombus, des antiplaquettaires et anticoagulants peuvent également être administrés. Les femmes reçoivent moins de traitements médicamenteux et de thérapies invasives [6] et accèdent plus tardivement au traitement par rapport aux hommes [74, 75, 79]. Dans l'étude GWTG-CAD [79], les femmes recevaient moins d'aspirine et de bétabloquant dans les 24 heures suivant leur présentation à l'hôpital (91% versus 93, 3% et 84, 7% versus 87, 2% ; p pour chaque comparaison). Parmi les patients STEMI ayant reçu une reperfusion (fibrinolyse ou ICP), les femmes étaient moins souvent traitées (56, 3% versus 73%, P D'un autre côté, le risque hémorragique suite à une ICP est supérieur chez les femmes [90]. Malgré que l'approche radiale semble réduire le risque d'hémorragie, elle est plus difficile chez les femmes étant donné la petite taille de leurs artères radiales [6]. 44 4. 6. Mortalité post-IDM : Malgré le grand progrès au niveau de la prise en charge de l'IDM, la mortalité intra- hospitalière suite à un STEMI reste importante. Elle varie entre 4 et 15% dans les différents registres européens [70]. Dans les cinq ans suivant l'IDM, le risque de mortalité et d'évènement CV est 30% plus élevé chez les patients atteints d'IDM par rapport à la population générale [91]. De nombreuses études ont montré que les taux de mortalités supérieures chez les femmes étaient justifiées par l'âge plus avancé et l'accumulation des comorbidités notamment l'hypertension, le diabète et l'IC chez ces femmes [78, 92-94]. Néanmoins, la différence dans le risque de mortalité entre les deux sexes semble être affectée par l'âge ainsi que par le type d'IDM. Dans une étude incluant 78254 patients, l'analyse univariée a révélé une mortalité intra-hospitalière plus accrue chez les femmes aussi bien dans la cohorte globale que dans le groupe STEMI. Dans le modèle multivariable, cette différence a disparu dans la cohorte globale mais a persisté chez les STEMI (OR (intervalle de confiance (IVC) 95%), 1, 12 (1, 02-1, 23) ; p 0, 015) [79]. Cette différence a été expliquée par une mortalité accrue chez les femmes STEMI lors des premières 24h d'hospitalisation comme elles recevaient moins de thérapies pendant cette période. Les études ISAR-RISK et ART, o 1604 hommes et femmes ont été appariés pour l'âge (67 ans) et les facteurs de risque, ont révélé une mortalité à long terme (5 ans) comparable entre les deux sexes. La mortalité à court terme (1 an) dans ce groupe de patients était plus accrue chez les femmes [95]. Similairement, dans une cohorte canadienne de 70628 patients, la mortalité dans les 30 jours suivant un IDM était plus accrue chez les femmes, particulièrement celles âgées de moins de 55 ans [96]. 45 5. Remodelage ventriculaire post-IDM : Après un IDM, une série d'évènements moléculaires et cellulaires sont déclenchés afin de préserver le reste du myocarde et de remplacer les cardiomyocytes nécrosés. Comme les cardiomyocytes perdent leur capacité proliférative après la naissance [97], le remplacement de la région myocardique nécrosée par un tissu fibrotique représente la seule alternative pour conserver l'intégrité structurale du cœur, éviter la rupture de sa paroi et maintenir sa fonction contractile. S'il est excessif, ce processus de réparation peut devenir délétère, favorisant le remodelage du cœur et l'IC. 5. 1. Pathophysiologie de la cicatrisation myocardique : Ce processus a été divisé en 4 étapes (Figure 14) : la phase de mort des cardiomyocytes, la phase d'inflammation aige, la formation du tissu de granulation et la formation du tissu fibrotique [98]. Dans les 30 minutes suivant l'ischémie, les cardiomyocytes subissent une mort cellulaire irréversible aboutissant à l'activation de la réponse inflammatoire [99]. Suite à cette mort cellulaire, des signaux endogènes sont libérés par les cellules nécrosées afin d'informer les cellules immunitaires de la présence d'une nécrose [100]. Dans les quelques heures suivant l'IDM, les neutrophiles et les monocytes sont rapidement infiltrés dans la zone nécrosée afin de nettoyer les débris cellulaires. Pour pénétrer dans le tissu, ces cellules inflammatoires sécrètent des MMPs qui dégradent la MEC [99]. Après la phagocytose de débris cellulaires, les neutrophiles et les monocytes cèdent la place à d'autres populations cellulaires, notamment les fibroblastes et les cellules endothéliales, qui prolifèrent et migrent vers la zone infarcie [101]. L'activation du TGF (transforming growth factor beta) représente un lien moléculaire essentiel entre la phase d'inflammation et celle de granulation [102]. Lors de la phase de granulation, le tissu nécrosé est remplacé progressivement par un tissu cicatriciel. Pour ce faire, les fibroblastes deviennent les cellules majoritaires de la zone infarcie et adoptent un phénotype sécrétoire et prolifératif connu sous le nom des myofibroblastes [103]. Les myofibroblastes jouent un rôle primordial dans le processus de cicatrisation à travers la sécrétion de la MEC [104]. Le dépôt de collagène de type III est essentiel pour augmenter la résistance de la paroi ventriculaire et la protéger contre la rupture [103]. D'un autre côté, les 46 cellules endothéliales forment des vaisseaux sanguins afin d'assurer un apport suffisant en oxygène et en nutriment aux myofibroblastes. De plus, les cardiomyocytes de la zone bordante et des zones non-infarcies deviennent hypertrophiques afin de compenser la baisse de contractilité [105]. Figure 14. La pathophysiologie de la cicatrisation post-IDM (Traduite à partir de la version originale [98]). La dernière phase de réparation est caractérisée par la maturation du collagène. Le collagène de type III est remplacé par celui du type I [106] et ce grâce aux lysyls oxydases (LOX), qui sont exprimés par les myofibroblastes résiduels. L'expression des LOX augmente pendant les 3-7 jours suivant l'IDM au niveau de la zone bordante [106]. La maturation des fibres de collagène donne au tissu cicatriciel plus de résistance mécanique et élastique [103]. Cette phase est également caractérisée par la mort des myofibroblastes. Contrairement à la peau et aux autres organes, o les myofibroblastes survivent peu après la cicatrisation, dans le 47 cœur, ces cellules peuvent persister des décennies après l'IDM [104]. Les myofibroblastes sont requis pour maintenir la MEC qui est constamment exposée au stress mécanique engendré par la contraction cardiaque [107]. 5. 2. Remodelage délétère : Le remodelage délétère se développe dans environ 30% des patients ayant subi un IDM [108]. La taille de l'infarctus représente l'un des facteurs principaux qui déterminent la sévérité du remodelage et l'altération de la fonction systolique [109]. Le remodelage délétère modifie la morphologie du cœur qui passe d'une forme elliptique à une forme sphérique [110] et est associé avec un risque élevé d'IC (Figure 15). Figure 15. Modifications morphologiques du cœur lors du remodelage délétère. Dorsey Une des caractéristiques principales du remodelage délétère est le dépôt excessif de MEC, appelée fibrose. La fibrose peut également s'étendre au niveau de la zone non-infarcie et est alors appelée fibrose réactive [103]. Le remodelage délétère est également caractérisé par une hypertrophie des cardiomyocytes, en réponse à l'augmentation de la tension mécanique du myocarde et la baisse de contractilité [111]. La rigidité issue de la fibrose ainsi que l'épaississement de la paroi ventriculaire suite à l'hypertrophie des cardiomyocytes 48 altèrent la fonction diastolique du cœur. La fibrose est également associée avec des troubles du rythme [112] et corrèle avec l'incidence d'arythmies et d'arrêts cardiaques après un IDM [113]. Le mécanisme derrière la fibrose réactive reste à élucider. Un des facteurs qui pourrait être à l'origine, est le stress mécanique au niveau du myocarde sain qui augmente l'activation de TGF [114], qui induit à son tour les voies associées à la fibrose et à la sécrétion de la MEC. Un autre facteur est les myofibroblastes résiduels. Ces derniers continuent à sécréter des facteurs pro-fibrotiques qui migrent vers les zones saines et stimulent la sécrétion de la MEC par les fibroblastes (fibrose interstitielle), ainsi que par l'adventice des artères coronaires (fibrose péri-vasculaire) [103]. La fibrose interstitielle est responsable d'une altération au niveau de la fonction systolique, quant à la fibrose péri-vasculaire est associée à une réduction du flux sanguin, prédisposant les cardiomyocytes à une mort ischémique [103]. Le SNS et le système Rénine-Angiotensine-Aldostérone (RAAS pour Renin- Angiotensin-Aldosterone System) constituent deux régulateurs critiques du remodelage délétère après un IDM (Figure 16). Ils représentent les deux principales cibles de la thérapie préventive contre le remodelage délétère. Dans le cœur, le SNS agit via les neurotransmetteurs adrénaline et noradrénaline en interagissant notamment avec le récepteur adrénergique 1. L'activation du SNS après un IDM est nécessaire afin d'augmenter le rythme cardiaque et maintenir un débit cardiaque suffisant [115]. Si cette activation persiste, elle engendre des effets délétères sur la structure et la FV. La surexpression du récepteur 1 dans les cardiomyocytes de souris a montré une augmentation du débit cardiaque, à court terme, et une hypertrophie ventriculaire et un dépôt excessif de MEC à long terme [115]. De plus, la suractivité du SNS favorise l'apoptose des cardiomyocytes [116]. Le SNS est également responsable de l'activation du système RAAS. Une augmentation significative dans l'expression de l'angiotensinogène, le précurseur de l'angiotensine, a été observée dans les segments myocardiques non-infarcis 5 jours après un IDM, et a montré une corrélation significative avec la taille de l'infarctus [117]. Le RAAS exècre son effet délétère notamment à travers l'angiotensine II. Une perfusion prolongée (14 jours) de l'angiotensine II chez le rat a engendré un dépôt fibrotique excessif aussi bien péri- 49 vasculaire qu'interstitiel [118]. De plus, l'angiotensine exerce un effet cytotoxique direct sur les cardiomyocytes, en favorisant leur hypertrophie et accélérant leur apoptose [119]. L'effet délétère de l'angiotensine passe à travers son interaction avec les récepteurs de type 1 (AT- 1R) [120], alors que l'interaction de l'angiotensine II avec le récepteur de type 2 est plus tôt contre-régulatrice et aboutit à des effets cardioprotecteurs. Figure 16. Rôle du système nerveux sympathique et du système Rénine-Angiotensine- Aldostérone dans le remodelage délétère post-IDM. Image éditée et traduite à partir l'image originale [121]. Le RVG est caractérisé par une augmentation progressive dans les VTD et VTS [122]. Les méthodes d'imageries les plus utilisées sont l'échographie et l'IRM (imagerie par résonance magnétique) cardiaque. Afin d'éviter des variances interindividuelles en matière de taille ventriculaire, notamment entre les femmes et les hommes, les volumes cardiaques sont exprimés sous forme d'indices corporels en divisant le volume par la surface corporelle [122, 123]. Une diminution dans la FE du VG est également observée après un IDM. 5. 3. Différences hommes-femmes au niveau du remodelage post-IDM : 50 L'incidence du remodelage délétère après un IDM est comparable entre les deux sexes [124]. Néanmoins, les cœurs des femmes et des hommes ne répondent pas de la même façon à ce stress (Figure 17) [125, 126]. Dans les modèles animaux : Les études chez les rongeurs ont révélé d'importantes différences entre les deux sexes en réponse à l'ischémie myocardique. Les femelles avaient des infarctus de taille plus petite, moins de nécrose au niveau de la zone infarcie et une meilleure récupération de la FV [55, 127-129]. Après une occlusion coronaire chez des rats hypertensifs, les femelles avaient développé une hypertrophie concentrique sans dilatation et sans amincissement de la zone infarcie alors que les mâles présentaient une hypertrophie excentrique avec dilatation de la cavité ventriculaire et l'amincissement de la zone infarcie (Figure 17) [130]. Figure 17. Différence hommes-femmes au niveau du RVG post-IDM. Editée et traduite à partir de l'image originale [55]. D'un autre côté, les cœurs féminins semblent réagir mieux à la revascularisation après un épisode ischémique. Dans un modèle d'ischémie/reperfusion, les femelles avaient une meilleure récupération de la contractilité et de la compliance cardiaque et avaient moins 51 d'apoptose [131, 132]. En outre, la survie lors des premiers jours post-IDM était plus élevée chez les femelles [55]. Cette différence semble être attribuée à la taille de l'infarctus, qui est plus petit chez les femelles. De plus, les mâles avaient un processus de cicatrisation plus tardif aboutissant à une rupture cardiaque précoce et à un remodelage délétère plus prononcé à long terme [133]. En outre, la pression au niveau de la paroi ventriculaire était plus importante chez les mâles, ce qui est justifié en partie par la réponse inflammatoire exagérée et la dégradation accrue de la MEC dans ce groupe [134, 135]. La testostérone joue un rôle aggravant du remodelage excentrique en phase aige aboutissant à la rupture ventriculaire et l'altération de la FV alors que les estrogènes ne semblent pas exercer un effet protecteur [133]. Chez l'homme : Dans une étude de population générale, l'obésité et l'hypertension étaient plus associées avec l'hypertrophie concentrique chez les femmes, alors que chez les hommes, l'hypertrophie excentrique dominait [136]. Après un IDM, une étude post-mortem a montré que l'apoptose au niveau de la zone bordante de l'infarctus était 10 fois plus élevée chez les hommes que les femmes [137]. Ces résultats suggèrent que les hommes modulent différemment les voies apoptotiques au niveau de la zone bordante et que les femmes sont partiellement protégées contre l'ischémie myocardique. Néanmoins, aucune corrélation entre le sexe, le remodelage et l'apoptose n'a été analysée dans cette étude [137]. L'association du sexe avec la reperfusion et le RVG a été évaluée dans une cohorte de 283 patients avec STEMI [126]. L'angioplastie semblait être plus efficace chez les femmes par rapport aux hommes. Les femmes avaient une meilleure récupération myocardique après la reperfusion, des infarctus plus petits et moins de détérioration microvasculaire par rapport aux hommes aussi bien à la phase aige qu'à 4 mois [126]. De plus, le remodelage cardiaque a été comparé entre 28 femmes et 72 hommes en stade final d'IC [9]. Les différences entre les deux sexes semblent dépendre de l'étiologie. Les caractéristiques morphologiques et cellulaires étaient comparables entres les hommes et les femmes avec cardiomyopathie idiopathique. Chez les patients avec cardiomyopathie ischémique, les hommes avaient des masses cardiaques et ventriculaires plus élevées alors que les femmes avaient une paroi 52 ventriculaire plus épaisse. La différence au niveau de la masse ventriculaire était justifiée par une hypertrophie des cardiomyocytes qui était 2 fois plus importante chez les hommes. Aucune différence n'a été observée au niveau de la fonction cardiaque [9]. 53 6. Insuffisance cardiaque : La société européenne de cardiologie définit l'IC comme étant un syndrome clinique caractérisé par des symptômes typiques (tels que l'essoufflement, la fatigue et le gonflement des chevilles) qui pourraient être accompagnés par des signes (une pression veineuse jugulaire élevée, un craquement dans les poumons et un œdème périphérique) issue d'une défaillance structurelle et/ou fonctionnelle du cœur [138]. Cette défaillance aboutit à une réduction du débit cardiaque et/ou une augmentation de la pression intracardiaque et ce à l'effort comme au repos. Les étiologies de l'IC sont diverses et incluent, entre autres, l'hypertension, les coronaropathies et les valvulopathies [139]. L'hypertension est le facteur de risque le plus associé avec l'IC chez les femmes [6]. Dans les pays développés, l'incidence de l'IC représente 1-2% de la population adulte et excède les 10% chez les individus âgés de plus de 70 ans [140-143]. L'étude Rotterdam a montré que l'incidence de l'IC augmente avec l'âge et passe de 0, 9% chez la catégorie d'âge 55-64 ans, à 17, 4% chez les individus âgés de plus de 85 ans [142]. La terminologie utilisée pour la classification de l'IC est basée sur la mesure de la FE du VG [138]. Les patients avec IC peuvent être classés comme ayant une FE préservée (FE 50%), intermédiaire (FE 40-49%) ou réduite (FE < 40%) [138]. Des différences au niveau de l'étiologie, des comorbidités, et même de la réponse aux traitements existent entre ces groupes [138]. Les patients présentant une FE réduite sans symptômes sont diagnostiqués comme ayant une dysfonction systolique asymptomatique. Les patients avec une FE réduite présentent principalement une dysfonction systolique due à une dilatation ventriculaire, alors que les patients avec une FE préservée, sont plus caractérisés par une dysfonction diastolique, due notamment à un épaississement de la paroi ventriculaire (Figure 18). Comparés aux patients avec une FE réduite, les patients ayant une FE préservée sont plus âgés, plus souvent des femmes, ayant un historique d'hypertension et de fibrillation atriale et moins souvent un historique d'IDM [144, 145]. Dans l'étude Framingham, les femmes représentaient 40% des patients avec une FE réduite et 65% de ceux ayant une FE préservée [139]. 54 Figure 18. Dysfonction ventriculaire gauche lors d'une IC. (Traduite à partir de la version originale). heart-failure. L'IC avec une FE réduite peut être qualifiée, selon son étiologie, d'ischémique ou non-ischémique. L'IC ischémique est principalement induite par l'IDM, la coronaropathie et les dysfonctions microvasculaires [6]. L'étude VALIANT (VALsartan In Acute myocardial iNfarcTion trial) comprenant plus de 10000 patients avec IDM ayant développé une IC ou une dysfonction systolique asymptomatique, a comparé le risque d'IC entre les femmes et les hommes [5]. Les femmes avaient plus de risque de développer une IC par rapport aux hommes et le risque d'hospitalisation à cause d'IC était supérieur chez les femmes (21% chez les femmes versus 13% chez les hommes). Le diagnostic de l'IC ainsi que les stratégies thérapeutiques sont les mêmes chez les hommes et les femmes. Le diagnostic est basé sur la caractérisation clinique ainsi que l'échocardiographie. Les thérapies médicamenteuses principales de l'IC sont les bétabloquants et les inhibiteurs de l'enzyme de conversion. Ces thérapies réduisent la morbidité et la mortalité uniquement chez les patients ayant une FE réduite [138]. L'efficacité de ses traitements semble être comparable entre les deux sexes [6] sauf que les femmes sont souvent sous-représentées dans ces essais cliniques. Néanmoins, des différences existent entre les deux sexes au niveau de l'effet de la digoxine et des thérapies de resynchronisation 55 cardiaques. La digoxine est plus toxique chez les femmes chez lesquelles elle cause plus de mortalité [146]. Au contraire, l'utilisation des thérapies de resynchronisation cardiaque semblent plus réduire la mortalité chez les femmes que les hommes [6]. 56 7. Mécanismes responsables des différences hommes-femmes dans les MCV : Les mécanismes épigénétiques associés aux chromosomes sexuels ainsi que les hormones sexuelles jouent un rôle primordial dans les différences CV observées entre les deux sexes. 7. 1. Mécanismes génétiques : Le chromosome Y porte des gènes qui sont non seulement impliqués dans la détermination du sexe mais également dans d'autres fonctions biologiques y comprises CV. Des loci présents au niveau du chromosome Y sont associés avec le risque d'hypertension et d'hypercholestérolémie, et même de coronaropathie [147-149]. Chez les femelles, les gènes échappant à l'inactivation du chromosome X semblent également être à l'origine de certaines des différences CV observées entre les deux sexes. Un des deux chromosomes X passe à l'état inactif chez la femelle entrainant l'extinction transcriptionnelle de plusieurs milliers de gènes afin de compenser la dose entre les deux sexes. Certains de ces gènes échappent à cette inactivation, ils sont de l'ordre de 15% chez l'humain et de 3% chez la souris [150]. La contribution des gènes du chromosome X au MCV reste à élucider étant donné que les études GWAS (pour Genome Wide Association Studies) ont rarement inclus ce chromosome dans leurs analyses [55]. De plus, des variants génétiques localisés au niveau des autosomes peuvent agir différemment chez les femmes et les hommes. Dans une étude GWAS incluant 224459 participants, 49 loci associé avec la distribution corporelle des graisses ont été identifiées, parmi lesquels, 19 avaient un effet plus puissant chez les femmes [151]. Ces loci étaient associés avec des processus affectant la distribution de graisse tels que l'adipogenèse, l'angiogenèse et la résistance à l'insuline. De plus, des polymorphismes au niveau du gène chymase 1, impliqué dans l'hypertrophie et la fibrose, étaient associés avec la masse ventriculaire chez les hommes mais pas les femmes souffrant de sténose aortique [152]. Des polymorphismes au niveau du gène codant pour le récepteur de la bradykinine type 1, impliqué dans le système rénine-angiotensine, semblent avoir un effet différent au niveau de la stimulation de ce récepteur chez les hommes et les femmes [153]. 57 Des gènes localisés au niveau des chromosomes X ou les autosomes peuvent être différentiellement exprimés entre les deux sexes. Parmi ces gènes, ceux codant pour des cytochromes, des anhydrases carboniques et des peptides natiuretiques [55]. Chez les insuffisants cardiaques, les femmes ont généralement une expression plus élevée des gènes associés avec le métabolisme d'énergie que les hommes, suggérant que les femmes seraient capables de maintenir leur fonction métabolique dans des conditions pathologiques [55]. Chez les patients souffrant de sténose aortique, des différences au niveau de l'expression des gènes associés à l'inflammation et à la fibrose, ont été observées et ce en faveur de la répression de ces processus chez les femmes [154]. 7. 2. Mécanismes épigénétiques : Les modifications épigénétiques regroupent la méthylation d'ADN et des histones ainsi que l'acétylation des histones. Les facteurs environnementaux peuvent induire des modifications épigénétiques différemment chez les hommes et les femmes, induisant ainsi des différences au niveau du phénotype CV. De plus, des modifications acquises lors de la vie in utéro peuvent affecter le phénotype à l'âge adulte. L'étude de la méthylation de 15 loci chez des femmes et hommes exposés avant leur naissance à la famine de 1944 aux Pays-Bas a révélé des différences au niveau de certains loci entre les deux sexes [155]. La prévalence d'hypertension était supérieure chez ces hommes et femmes par rapport aux contrôles qui n'étaient pas exposés suggérant que la malnutrition lors de la gestation prédispose à l'hypertension [156]. D'autre part, les hormones sexuelles sont capables d'induire des modifications au niveau des histones. Les estrogènes et les androgènes se fixent sur des éléments de réponse aux hormones (HRE pour hormone response elements) au niveau de l'ADN et attirent des cofacteurs capables de modifier l'acétylation des histones [55]. Les ARNs non codants sont également des régulateurs épigénétiques. Dans le modèle in vivo de surcharge de pression, la fibrose cardiaque était plus accrue chez les mâles [157]. La comparaison du profil transcriptomique a révélé une induction dans l'expression des gènes 58 de la fibrose et une répression dans les gènes mitochondriaux comparés aux femelles. Cette différence serait attribuée à l'estradiol (E2) qui atténue le développement de la fibrose chez les femelles à travers la modulation des microARNs (miRs) 21, 24, -27a/b, et 106a/b [157]. 7. 3. Hormones sexuelles : Les hormones sexuelles sont synthétisées principalement au niveau des gonades (testicules et ovaires) mais peuvent également être synthétisées par d'autres types cellulaires tels que les cardiomyocytes. De plus, la testostérone peut être métabolisée en estrogène favorisant la contribution de cette dernière dans la pathophysiologie CV chez les mâles. La majorité des études se sont concentrées sur les effets CV de l'estrogène et de ses dérivés. L'E2 est l'estrogène la plus abondante dans la circulation [55]. Elle est principalement produite par les ovaires et peut être localement produite à travers la conversion de la testostérone. Chez les deux sexes, cette conversion peut avoir lieu dans plusieurs tissus extra- gonadaux, y compris le tissu adipeux, le cœur et les vaisseaux [55]. La production de l'E2 augmente remarquablement chez les hommes obèses [158]. De plus, les hommes âgés semblent avoir des concentrations plus élevées d'E2 comparés aux femmes du même âge [159]. L'association des polymorphismes au niveau des récepteurs à l'estrogène ER et (ER pour estrogen receptor) avec les MCV a préalablement été rapportée. En particulier, un polymorphisme au niveau du récepteur ER est associé avec un risque élevé d'IDM [160], alors que le polymorphisme d'ER est associé avec une augmentation au niveau de la masse ventriculaire ainsi qu'un épaississement de la paroi ventriculaire [161]. Ces récepteurs ont été identifiés au niveau de l'endothélium vasculaire, des CML vasculaires, des cardiomyocytes et des fibroblastes cardiaques, chez les deux sexes [55]. L'expression cardiaque du récepteur ER semble être comparable entre les deux sexes alors que celle de l'ER est plus élevée chez les hommes [162]. Les deux récepteurs sont surexprimés dans le myocarde des hommes et des femmes souffrant de sténose aortique ce qui suggère leur rôle dans la pathophysiologie de la maladie [162]. L'expression génique et protéique du récepteur ER est augmentée dans les cœurs de patients en stade final d'IC [163]. 59 Les estrogènes jouent un rôle dans les différents processus associés avec l'IDM allant de la mort cellulaire jusqu'à la réponse inflammatoire et la fibrose (Figure 19). Figure 19. Effets protecteurs des estrogènes contre le remodelage délétère après un IDM. Mort cellulaire : La perte des cardiomyocytes augmente avec l'âge chez les hommes mais pas chez les femmes [164]. D'un autre côté, la mort cellulaire est plus importante dans le cœur insuffisant des hommes par rapport aux femmes [165]. Les cœurs des femmes sont également mieux protégés de l'apoptose induite par l'ischémie. La zone périphérique de l'infarctus contient 10 fois plus d'apoptose chez les hommes par rapport aux femmes [137]. Des observations similaires ont été rapportées chez des modèles in vivo d'ischémie/reperfusion [55]. Cette mort cellulaire accrue chez les mâles suite à l'ischémie/reperfusion semble être due à la réduction de la protéine pro-apoptotique Bcl2 chez les mâles et une augmentation de la protéine anti- apoptotique Bax chez les femelles [166]. L'E2 joue un rôle primordial dans la protection des cardiomyocytes contre l'apoptose à travers la modulation de PI3K/PKB, TNF, p38 ( et ) et p53 [55]. De plus, l'E2 favorise la néovascularisation du tissu ischémique en augmentant la mobilisation et l'incorporation des cellules progénitrices endothéliales [167]. D'un autre côté, 60 la testostérone semble aggraver la lésion cardiaque en réduisant la protéine anti-apoptotique Bcl-xL [168] et en induisant les protéines pro-inflammatoires TNF-, IL-1 et IL-6 [169]. Inflammation : Dans les modèles in vivo d'ischémie myocardique, les cœurs des femelles sont plus protégés, et ce en produisant moins de cytokines pro-inflammatoires telles que TNF-, IL-1 et IL-6 [135, 170]. L'estrogène joue un rôle primordial dans cette réponse inflammatoire en régulant l'expression de ces cytokines à travers la régulation des monocytes et des macrophages [171]. L'E2 protège contre l'ischémie en réduisant l'infiltration des neutrophiles, la production du stress oxydant et la nécrose [172]. En réponse à un stimulus inflammatoire, le facteur de transcription NF-B, qui est le régulateur clé de la réponse inflammatoire, est capable de réduire la transcription du récepteur de l'estrogène au niveau des cardiomyocytes [173]. Stimulé par l'E2 ; l'ER à son tour est capable d'inhiber NF-B. Hypertrophie et fibrose : L'administration de l'E2 , dans des modèles d'ischémie myocardique, a permis de réduire la taille de l'infarctus et d'améliorer la fonction cardiaque [55]. L'E2 joue un rôle anti-hypertrophique à travers la régulation du facteur natriueritique atrial (ANF) et la chaine lourde de myosine (MHC) [174]. Ces effets protecteurs semblent être exercés à travers le récepteur ER. Dans le modèle de surcharge de pression, le traitement par l'agoniste spécifique de ce récepteur a ralenti la progression de l'hypertrophie ventriculaire aboutissant à une meilleure fonction systolique et moins de fibrose [175]. En outre, l'E2 régule le profil transcriptomique cardiaque différemment chez les hommes et les femmes [176, 177]. L'E2 induit par exemple l'expression du récepteur d'une autre hormone qui est la progestérone spécifiquement chez les femmes, les protégeant ainsi contre le remodelage délétère [176]. D'un autre côté, l'E2 induit l'expression du gène codant pour MYLIP (myosin regulatory light chain interacting protein) et ce spécifiquement chez les mâles entrainant une altération de la fonction contractile [177]. 61 La comparaison du profil transcriptomique du VG des patients atteints de sténose aortique a révélé une induction des voies de signalisation associées à la fibrose chez les hommes [154]. Chez les femmes, une répression au niveau des voies de signalisation associées à l'inflammation et la MEC a été observée [154]. En outre, l'estrogène atténue le développement de la fibrose au niveau du cœur, en inhibant directement la synthèse du collagène, et en régulant les taux du collagène du type I et III [55]. De plus l'E2 inhibe l'expression des MMPs par les fibroblastes cardiaques et ce à travers l'activation du récepteur ER et la voie de signalisation de MAPK-ERK1/2 [178]. 62 8. Biomarqueurs du remodelage ventriculaire post-IDM : Les biomarqueurs les plus constamment associés avec le RVG sont impliqués dans le stress cardiaque, la nécrose des cardiomyocytes, ainsi que l'inflammation et le turnover de la MEC. Malgré les nombreux biomarqueurs ayant montré leur association avec le RVG post- IDM, le biomarqueur idéal n'a pas encore été découvert. Afin d'atteindre cet objectif, des études plus larges avec des critères d'évaluation standardisés, et des validations indépendantes sont requises. 8. 1. Marqueurs de la tension mécanique : Les peptides natriurétiques, BNP (Brain Natriuretic Peptide) et sa fraction terminale NT-proBNP sont les deux biomarqueurs les plus reconnus pour le diagnostic de l'IC et de la dysfonction ventriculaire gauche. Ils sont principalement synthétisés par les cardiomyocytes ventriculaires lorsque la tension exercée sur ces derniers augmente. Le BNP (le peptide actif) et le NT-proBNP (le peptide inactif) sont libérés en quantités équimolaires dans la circulation sanguine. Rôle du BNP : La délétion du BNP a généré des souris normotensives présentant une fibrose ventriculaire sans aucun signe d'hypertrophie [179]. Il est intéressant de noter que cette fibrose cardiaque était moins importante chez les femelles comparées aux males [179]. Le BNP représente alors un facteur anti-fibrotique qui régule localement le RVG. Le BNP semble prévenir le développement de la fibrose à travers l'inhibition du TGF et de l'enzyme de conversion de l'angiotensine [179]. En revanche, une hypotension a été observée chez les souris sur-exprimant BNP ce qui suggère que le BNP régule la pression artérielle en favorisant la vasodilatation des vaisseaux sanguins lorsqu'il circule en grandes quantités lors des maladies cardiaques [180]. Un variant génétique au niveau du locus NPPA-NPPB codant pour les peptides natriurétiques ANP (pour Atrial Natriuretic Peptide) et BNP, entrainant une augmentation 63 dans l'expression de ces peptides, était associé avec moins de susceptibilité à l'hypertrophie cardiaque renforçant le rôle cardioprotecteur de ces derniers [181]. Prédiction du remodelage : Plusieurs études ont analysé la capacité du BNP et du NT-proBNP à prédire la FV et le RVG après un IDM [2]. La majorité de ces études incluaient moins de 100 patients. De plus, ces peptides ont été mesurés à des temps différents et la FV étaient évaluées par différentes techniques. Aucune de ces études n'a analysé la capacité de ces peptides à prédire le RVG séparément chez les femmes et les hommes. Malgré que ce peptide semble prédire la FV indépendamment du temps, le moment du dosage avec la meilleure valeur prédictive reste à déterminer [2]. Les taux de NT-proBNP mesurés à l'admission [182], au moment de la revascularisation [183] et à la sortie de l'hôpital étaient associés avec le risque de dysfonction ou du RVG [184]. Dans une étude comparant plusieurs temps de mesure (quelques jours à 6 semaines), le temps optimal était entre le 3ème et le 4ème jour post-IDM [185]. Contrairement, dans la cohorte REVE-2 (Remodelage Ventriculaire2) la meilleure valeur prédictive du BNP a été observée lors du suivi (1 mois, 3 mois et 1 an) et aucune association n'a été observée pour les mesures précoces (entre le 3ème et le 7ème jour post-IDM). La comparaison de la valeur prédictive des marqueurs cardiaques NT-proBNP, CK et cTnT a montré que le NT-proBNP était le meilleur prédicteur du RVG global et qu'il était le seul à pouvoir prédire le remodelage du myocarde sain [182]. Différence entre les hommes et les femmes : Le sexe et l'âge représentent deux principaux déterminants de la concentration du BNP et du Nt-proBNP. Plusieurs grandes études de populations ont montré que les concentrations de ces peptides augmentent avec l'âge et que les femmes ont des taux supérieurs par rapport aux hommes [186-188]. De plus, cette différence entre les deux sexes semble persister avec l'âge [189]. 64 Les taux de BNP ont été comparés chez des femmes saines post-ménopausées avant et après la thérapie de remplacement hormonal [190]. Après 3 mois de thérapie, les taux du BNP et d'ANP ont significativement augmenté chez ces femmes suggérant l'effet stimulateur des estrogènes sur les peptides natriurétiques et leur effet cardioprotecteur chez les femmes. Cette différence pourrait également être attribuée à l'effet inhibiteur des androgènes sur les peptides natriurétiques [191]. Les taux des peptides natriurétiques ont significativement augmenté chez les rats castrés et cette augmentation a été rectifiée après administration de la testostérone [191]. L'influence du sexe et des hormones sur les concentrations plasmatiques des peptides natriurétiques a plus largement été étudiée chez 4056 hommes et femmes [3]. Ces dernières ont été divisées en 4 groupes selon leur statut hormonal : femmes pré- ménopausées sans ou avec contraception et des femmes post-ménopausées recevant ou pas une thérapie de remplacement hormonal. Les concentrations les plus faibles du NT-proBNP ont été mesurées chez les hommes alors que les plus élevées ont été observées chez les femmes pré-ménopausées recevant la contraception hormonale. Une autre explication des taux de peptides natriurétiques supérieurs chez les femmes serait la différence dans les taux d'hémoglobine entre les deux sexes. Une corrélation négative a été observée entre les taux du BNP, d'ANP et la concentration d'hémoglobine [189]. Les taux inférieurs d'hémoglobine chez les femmes seraient responsables d'une ischémie myocardique et que cette dernière augmenterait l'expression des peptides natriurétiques. L'ischémie myocardique a été montrée capable d'induire l'expression du BNP indépendamment de la tension mécanique [192]. Des mutations au niveau du gène NPPB ont été trouvées associées avec des niveaux élevés de BNP et NT-proBNP, chez des patients présentant des coronaropathies [193]. De plus, ces patients avaient une FV meilleure et étaient protégés contre le remodelage délétère. Particulièrement le génotype rs198389 AA était associé avec un risque élevé de coronaropathies obstructives et une athérosclérose sévère, chez les femmes, mais pas chez les hommes, ce qui pourrait suggérer que le BNP serait plus impliqué dans la pathophysiologie des coronaropathies chez les femmes [194]. 65 8. 2. Marqueurs de la nécrose myocardique : De nombreuses études ont montré que les biomarqueurs de la nécrose myocardique notamment CK et cTns étaient associées avec la FV post-IDM, ce qui suggère que le degré d'endommagement myocardique lors de l'IDM conditionne la FV plus tard. Les taux des deux marqueurs sont inférieurs chez les femmes par rapport aux hommes [11]. Néanmoins, l'association de ces marqueurs avec le RVG n'a pas encore été étudiée séparément chez les femmes et les hommes. Les concentrations des deux biomarqueurs mesurées à différents temps post-IDM corrèlent avec la taille de l'infarctus [195]. Les taux des cTns et de la CK mesurés quelques jours post-IDM, ainsi que leurs valeurs maximales étaient prédicteurs de la dysfonction ventriculaire [182, 195-197]. Dans l'étude PROTECTION AMI incluant 1066 patients traités par angioplastie coronaire primaire, la cTnI a été mesurée à plusieurs temps (de l'admission à 80 heures). L'association de la cTnI avec la FV a été observée à tous les temps. La plus forte association a été observée pour les valeurs obtenues entre 30 et 40 heures post-IDM [198] . De même que le BNP, l'association de la cTnI avec le RVG était absente pour les valeurs de base dans la cohorte REVE-2 [199]. Chez les patients pour lesquels la cTnI était encore détectable pendant le suivi (1 mois, 3 mois et 1 an) avaient un risque élevé du RVG. Dans cette étude, la cTnI était encore détectable chez 19% des patients à 1 mois et a diminué à 13% et 7% à 3 mois et 1 an, respectivement [199]. 8. 3. Marqueurs de l'inflammation : La réponse inflammatoire induite par la nécrose des cardiomyocytes joue un rôle primordial dans la pathogenèse du RVG. Une réponse inflammatoire excessive aboutit à une dilatation exagérée au niveau du VG. De nombreuses études ont mis en évidence l'association entre les concentrations des facteurs inflammatoires à la phase aige et le risque de développer un RVG délétère. Des différences au niveau de la réponse inflammatoire existent en général entre les femmes et les hommes aussi bien au niveau de la réponse innée ou acquise [200]. Suite à un IDM, les mâles montrent une réponse inflammatoire plus excessive [133, 134]. Dans un 66 modèle in vivo d'ischémie/reperfusion, la production de cytokines pro-inflammatoires (TNF, IL-1, et IL-6) était supérieure chez les mâles [170]. Ces différences entre les deux sexes suggèrent d'étudier, séparément chez les femmes et les hommes, la valeur prédictive des marqueurs inflammatoires. Cellules inflammatoires : L'association des différents types cellulaires avec le RVG a été investiguée. Le taux de PBMC (peripheral blood mononuclear cells) déterminés dans les 24 heures suivant un IDM étaient associés avec le RVG délétère 6 mois plus tard [201]. Néanmoins, la capacité des PBMC à prédire le RVG est faible et a complètement été abolie en présence du BNP [202]. L'association des différents sous-types cellulaires a également été observée. Les taux élevés de neutrophiles, mesurés à l'admission, étaient associé avec le risque de développer un remodelage délétère dans la phase chronique [203]. D'un autre côté, l'augmentation des taux de monocytes (monocytose) observée lors des premiers jours post-IDM corrélait négativement avec la FE et était associée avec le risque de rupture ventriculaire [204]. Plus particulièrement, les valeurs maximales de la sous-population des monocytes CD14( ) CD16(-) étaient prédictives d'une dysfonction ventriculaire [205]. De plus, un taux faible de lymphocytes à l'admission était associé avec une dysfonction ventriculaire [206]. Le ratio neutrophiles : lymphocytes est aussi capable de prédire le RVG [207]. CRP : La CRP (pour C reactive protein) est un marqueur de l'inflammation sécrété par les hépatocytes. L'association de la CRP avec le RVG post-IDM est controverse. Les taux de la CRP mesurés à l'admission ainsi que les valeurs maximales corrélaient positivement avec le RVG délétère [208]. Des données de l'étude REVE-2 ont montré que la CRP aussi bien mesurée à la phase aige que pendant le suivi n'était pas un prédicteur du RVG [199]. Les taux de CRP sont affectés par le sexe avec les femmes ayant des niveaux plus élevés [209]. Cette différence impose l'ajustement par le sexe dans les études analysant la capacité prédictive de ce marqueur. 67 Cytokines et chimiokines : Les taux de ces médiateurs inflammatoires sont affectés après un IDM et sont également capables de prédire son évolution. L'IL-1 joue un rôle clé dans l'amplification de la réponse inflammatoire post-IDM. Une augmentation dans les taux plasmatiques de l'isoforme IL-1 est observée dans les 2 heures suivant l'IDM [210]. En outre, les concentrations de l'IL-1 mesurée 2 mois post-IDM avaient une forte valeur prédictive de la FV évaluée à 1 an [211]. IL-10 quant à lui, est une cytokine antiinflammatoire. Les concentrations sériques de cette cytokine mesurées 7 jours post-IDM étaient positivement corrélées avec la FE [212]. Une autre cytokine a également montré son association avec le RVG, il s'agit de l'IL-21. Cette cytokine mesurée quelques jours post-IDM (moyenne 2 jours) étaient un prédicteur indépendant du risque du remodelage délétère à 6 mois [213]. Le récepteur de l'IL-33 connu sous le nom de ST2 (suppression of tumorigenicity 2) est sécrété par les cardiomyocytes et les fibroblastes suite à un stress mécanique [214]. Des taux élevé de ST2 sont associés avec une fibrose myocardique excessive et un remodelage délétère [214]. La valeur pronostique de ST2 chez les insuffisants cardiaques a été confirmée dans plusieurs études afin de prédire le risque de mortalité et d'hospitalisation [214]. Dans une cohorte de patients avec IDM, les taux sériques de ST2 mesurés à l'admission corrélaient inversement avec la FV à 6 mois [215]. De plus, ce biomarqueur est capable de prédire le risque de mortalité et d'IC après un IDM [215]. Des taux inférieurs de ST2 chez les femmes ont été observés dans une étude de population générale incluant 3450 participants [216]. Cette différence semble être attribuée aux hormones sexuelles, étant donné que les femmes sous thérapie hormonale avaient les concentrations les plus faibles de ST2 [216]. Les taux de chimiokines augmentent rapidement dans le cœur après un IDM afin de recruter les cellules inflammatoires au niveau de la zone infarcie [208]. Une augmentation est également observée dans la circulation dans les 3 heures suivant un IDM ce qui confère aux chimiokines un potentiel de biomarqueurs. Le MIF (pour macrophage migration inhibitory factor) est une chimiokine/cytokine pro-inflammatoire sécrétée par les cardiomyocytes nécrosés et les PBMC [217]. Cette chimiokine est dotée de propriétés cardio-protectrices mais en cas d'augmentation prolongée, elle est associée avec un remodelage délétère. Les 68 taux élevés de MIF, mesurés à l'admission, sont associés avec une taille d'infarctus plus importante et une dysfonction ventriculaire à 3 jours et à 3 mois post-IDM [218]. En outre, d'autres chimiokines telles que MIP-1 (Macrophage inflammatory protein-1 alpha) et RANTES (Regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted) mesurées à une phase très aigue post-IDM (3 heures) corrélaient positivement avec la FV [219, 220]. 8. 4. Marqueurs de la fibrose : La dérégulation de la MEC après un IDM contribue fortement au développement du remodelage délétère. Cette dérégulation engendre soit un dépôt excessif de collagène aboutissant à une fibrose, soit une dégradation accrue/dépôt insuffisant de collagène aboutissant à une dilatation du VG [221]. Le turnover de la MEC après un IDM peut être analysé à travers la mesure des marqueurs reflétant sa synthèse et sa dégradation. Les régulateurs de la dégradation de la MEC les MMPs et leurs inhibiteurs TIMPs peuvent également être mesurés. Les collagènes de type I et III sont les constituants majeurs de la MEC dans le cœur [221]. Les études in vivo ont montré que les mâles produisaient plus de MMPs suite à un IDM ce qui conduisait à une dégradation plus importante de collagène au niveau de la zone infarcie et un risque élevé de rupture ventriculaire [135]. L'utilité des marqueurs de fibrose à prédire le remodelage a été observée à la phase aige. Collagène : Manhenke et ses collègues ont étudié la modulation des différents marqueurs de la synthèse et de la dégradation de collagène après un IDM [222]. Ils ont observé une dégradation accrue dans le collagène de type I à la phase aige post-IDM compensée par une augmentation dans la synthèse du collagène de type III à la même phase. La synthèse des deux types de collagène persistait dans le temps (jusqu'à un 1 an post-IDM) suggérant une persistance dans l'état fibrotique même à la phase chronique du remodelage. L'augmentation post-IDM du N terminal du procollagène de type III (marqueur de la synthèse du collagène de type III) et du C terminal du télopeptide du collagène de type I (marqueur de la dégradation du collagène de type I), étaient montrées associées avec le risque du RVG 69 délétère [199]. De plus, le ratio de ces deux marqueurs 1, mesuré à un mois post-IDM, était un prédicteur indépendant du RVG à 1 an [223]. MMPs et TIMPs : Parmi tous les biomarqueurs associés avec le remodelage, les plus grandes associations ont été observées avec les régulateurs de la MEC : les MMPs et les TIMPs [2]. L'étude la plus exhaustive de l'association de ces biomarqueurs avec le remodelage a été conduite dans la cohorte REVE-2 incluant 245 patients avec IDM [224]. Les taux sériques de MMPs (1, 2, 3, 8, 9 et 13) et des TIMPs (1, 2, 3 et 4) ont été mesurés au moment de la sortie de l'hôpital et 1 mois, 3 mois et 1 an plus tard. Les taux de MMP-1 étaient comparables entre les différents temps. Les taux de MMP-2, MMP-3, TIMP-2, et TIMP-4 étaient bas à la phase aige et augmentaient avec le temps. Alors que MMP-8, MMP-9 et TIMP-1 étaient élevés à la phase aige et diminuaient avec le temps. Parmi ces biomarqueurs, seuls les valeurs de MMPs 8 et 9 mesurées à la phase aige, corrélaient avec le RVG à 1 an. Dans l'analyse multivariée, MMP8 mais pas MMP9 était un prédicteur indépendant du RVG [224]. De plus MMP8 était le seul associé avec le risque de mortalité CV et de ré-hospitalisation pour une IC. Galectine 3 : La Galectine 3 appartient à la famille des lectines. Sécrétée principalement par les macrophages activés et les fibroblastes en prolifération, elle est impliquée dans les processus d'inflammation et de fibrose [208]. La capacité pronostique de la galectine 3 a été montrée dans l'IC [225]. Des taux élevés de cette protéine sont associés avec la progression de l'IC et un mauvais pronostic. L'association de cette protéine avec le RVG a également été étudiée chez des patients avec IDM. Les taux sériques de la galectine 3 mesurée quelques jours post- IDM étaient un prédicteur de la diffusion de la fibrose au niveau des zones non-infarcies du myocarde [226]. De plus, les taux sériques de galectine 3 mesurés 2 jours post-IDM étaient un prédicteur indépendant du RVG [227]. Des études en population ont montré des taux plus élevés de cette protéine chez les femmes [228, 229], ce qui a imposé l'utilisation des seuils spécifiques à chaque sexe pour l'analyse. 70 8. 5. Biomarqueurs transcriptomiques : En fonction de leur potentiel codant pour les protéines, les ARNs sont classés en deux grandes familles : les ARNs codants et les ARNs non codants. Parmi les ARNs non-codants, les miRs (19-25 nucléotides) et les longs ARNs non-codants (lncARNs, >200 nucléotides) sont les plus étudiés en pathophysiologie CV. L'utilisation des puces à ARN et du séquençage a significativement contribué à la découverte de nouveaux biomarqueurs transcriptomiques. 8. 5. 1. ARNs codants : La capacité des PBMC à prédire le RVG est faible et a complètement été abolie en présence du BNP [202], ce qui attire l'attention vers le transcriptome de ces cellules et sa capacité prédictive. Dans un modèle d'hypertension, les cellules immunitaires subissaient les mêmes modifications transcriptomiques que les cardiomyocytes ce qui suggère que les cellules immunitaires pourraient refléter ce qui se passe dans le cœur [230]. De plus, Wingrove et ses collègues ont montré que l'expression génique des PBMC corrélait avec la sévérité de la coronaropathie [231]. La signature transcriptomique de la dysfonction ventriculaire a été déterminée grâce à l'utilisation des puces à ARN effectuées sur les échantillons sanguins de patients avec IDM. Ces analyses ont permis de déterminer les voies de signalisation perturbées lors du processus du RVG et d'identifier de nouveaux biomarqueurs, et ce en se basant sur le réseau d'interaction protéines-protéines [232]. Le métabolisme de collagène, la prolifération cellulaire et la croissance représentent les processus les plus perturbés chez les patients ayant développé une dysfonction ventriculaire [233]. Dans une autre étude, l'expression des gènes associés à l'angiogenèse au niveau des cellules sanguines étaient significativement affectée chez les patients avec une faible FE [234]. La combinaison de trois gènes (VEGF-B, PGF et THBS1) impliqués dans ce processus avait une capacité prédictive de la dysfonction ventriculaire qui était supérieure à celle du NT-proBNP. [234]. Une autre combinaison incluant 4 gènes (VEGF-B, DAXX, TNXB et LTBP4) impliqués dans l'angiogenèse, la fibrose et l'apoptose a également été identifiée [233]. L'analyse du transcriptome associé 71 avec l'inflammation a révélé d'autres gènes (TRAF2, SHKBP1 et UBC) avec une valeur prédictive qui était plus élevée que celle des biomarqueurs cardiaques [235]. En outre, l'expression de TGFBR1 mesurée dans le sang de 115 patients avec IDM augmente significativement chez les patients avec une dysfonction ventriculaire et avait une valeur prédictive ajoutée aux biomarqueurs cardiaques [236]. L'ensemble de ces études montrent le potentiel de la perturbation transcriptomique au niveau des cellules sanguines à prédire le RVG post-IDM. Ces études ont été effectuées sur un nombre limité de patients ce qui justifie l'absence de l'effet du sexe sur l'expression et le potentiel prédicteur de ces gènes. Il serait intéressant de déterminer au niveau des cellules sanguines les voies de signalisation associées avec le RVG, distinctement chez les femmes et les hommes. Cela permettrait une mise en évidence de nouveaux biomarqueurs transcriptomiques capables de prédire le RVG de manière spécifique à chaque sexe. 8. 5. 2. ARNs non-codants : Les miRs : Les miRs sont exprimés de manière ubiquitaire dans le système CV et sont impliqués dans plusieurs processus : développement, apoptose, fibrose, néo-angiogenèse et hypertrophie des cardiomyocytes [237]. La capacité des miRs à réguler plusieurs processus pathophysiologiques est justifiée par la multiplicité des gènes cibles. Les miRs détectés dans le sang sont connus sous le nom de miRs circulants. Ces miRs proviennent des cellules mortes suite à une apoptose ou sont activement sécrétés par des cellules vivantes [237]. Ces miRs circulants peuvent être associés à des protéines ou même présents dans des microvésicules, des exosmoses ou des corps apoptotiques. Ces entités d'ARNs sont très stables ce qui en fait des biomarqueurs très attractifs. La capacité des miRs à prédire le risque d'IDM a été investigué dans une cohorte prospective de 840 participants. Parmi les 19 miRs mesurés dans le plasma, trois miRs (126, 223 et 197) étaient associé avec le risque d'avoir un IDM pendant 10 ans [238]. Une association positive a été observée pour le miR-126 alors que les miRs 223 et 197 avaient une 72 association négative avec le risque d'IDM [238]. Dans une étude similaire de 212 participants, l'association de 179 miRs avec le risque d'IDM fatal pendant 10 ans a été analysée [239]. Dix miRs ont été différentiellement exprimés entre le groupe contrôle et le groupe ayant subi un IDM. Des études in vivo ont montré que l'expression des miRs est rapidement et dynamiquement régulée au niveau cardiaque suite un IDM [237]. De plus, le profil plasmatique des miRs change après un IDM, notamment ceux enrichis au niveau cardiaque (1, 133, 499, 208) [237], conférant à ces miRs le potentiel de diagnostiquer l'IDM. L'utilisation de ces miRs pour le diagnostic de l'IDM est limitée par la technique de mesure (qPCR) longue et fastidieuse. Ces miRs peuvent également être utilisés pour prédire le risque de dysfonction ventriculaire post-IDM. Dans une cohorte de 500 patients avec IDM, les miRs 208 et 499 corrélaient inversement avec la FE [240]. Quant aux miR-1 [241] et miR-133 [242], ils n'ont pas montré d'association avec la dysfonction et le RVG. Même les miRs non-enrichis au niveau cardiaque peuvent prédire le RVG. L'augmentation des miRs 194 et 34a après un IDM prédisait l'IC ischémique et corrélait avec la dimension télé-diastolique du VG [243]. La capacité du miR-150 à prédire la variation au niveau du VTD a été validée dans deux cohortes indépendantes [244]. De plus, la capacité prédictive de ce miR a dépassé celle du NT-proBNP et il était capable de reclasser 50% des patients qui étaient mal-classés avec le biomarqueur cardiaque. Une combinaison incluant les miRs 146-a et 21, mesurés 5 jours post ICP, prédisait le risque du RVG à 1 an [245]. Le potentiel des miRs 222-3p ; 21-5p et 23a-3p et leur gène cible SOD2 (superoxide dismutase 2) comme biomarqueurs du RVG a été montré chez 256 patients de l'étude REVE- 2 [246]. L'association de ces molécules avec le remodelage délétère semble être affectée par le sexe. L'augmentation de la SOD-2 à 3 mois et 1 an dans le groupe avec RVG délétère était observée spécifiquement chez les femmes [246]. De plus, la dérégulation du miR-222-3p était spécifique aux hommes (diminution à la sortie de l'hôpital, augmentation à 1 an). Cette différence est justifiée par l'effet stimulateur des estrogènes sur l'expression de la SOD2. Cette étude attire l'attention vers l'utilité des miRs comme biomarqueurs spécifiques à chaque sexe. 73 Les lncARNs : Les lncARNs constituent la vaste majorité des ARNs non codants [247]. Par rapport aux ARNs messagers, les lncARNs sont caractérisés par une haute spécificité au niveau du type cellulaire, du tissu, du stade de développement et même de l'état pathologique [247]. La fonction des lncARNs dépend de leur localisation cellulaire. Les lncARNs de localisation nucléaire sont impliqués dans la régulation transcriptionnelle et épigénétique [247]. Ceux de localisation cytoplasmique, jouent un rôle dans la traduction, la stabilité et la dégradation des ARNs messagers [247]. Certains peuvent également agir comme des éponges contre les miRs et les facteurs protéiques. Malgré le grand nombre d'études montrant la valeur diagnostique et pronostique des miRs avec le RVG, peu est connu sur les lncARNs. Une étude GWAS a révélé une association entre des polymorphismes au niveau du locus du lncARN MIAT (myocardial infarction associated transcript) et le risque d'IDM [248]. Dans le cœur, l'IDM induit des modifications importantes au niveau de l'expression des lncARNs [249]. Les lncARNs peuvent également être mesurés dans le sang ce qui leur confère un potentiel de biomarqueurs. La majorité des lncARNs présents dans le plasma après un IDM sont d'origine mitochondriale [250]. LIPCAR, un de ces lncARNs mitochondriaux, était augmenté lors de la phase chronique post-IDM (3 mois et 1 an) [250]. Chez les patients souffrant d'IC systolique, l'augmentation de LIPCAR était plus importante et capable de prédire la mortalité CV [250]. Un autre lncARN appelé MYHEART (myosin heavy-chain associated RNA transcript), est exprimé spécifiquement au niveau du tissu cardiaque et exerce un rôle protecteur contre le remodelage hypertrophique [251]. De plus, MYHEART augmente significativement dans le plasma 1 heure après un IDM et corrèle avec les taux sériques de cTnT [252]. L'expression plasmatique du lncARN UCA1 (urothelial carcinoma- associated 1), le marqueur du cancer de la vessie et du poumon, était diminuée à la phase aige post-IDM et augmentée 3 jours plus tard [253]. L'IDM affecte également l'expression des lncARNs au niveau des cellules sanguines. Les lncARNs aHIF, ANRIL, KCNQ1OT1 et MALAT1 sont régulés dans les cellules sanguines des patients avec IDM par rapport aux 74 contrôles [254]. De plus la combinaison KCNQ1OT1-ANRIL permettait la reclassification de 40% des patients mal-classés avec le modèle clinique seul. Les ARNs circulaires : La communauté scientifique s'est récemment intéressée à une autre classe d'ARN non-codants appelés ARN circulaires et à leurs rôles pathophysiologiques dans les MCV [255]. Ces ARNs doivent leurs noms à leur frome originale en cercle. Ils sont très abondants dans notre organisme et phylogénétiquement conservés [255]. De plus, ils sont stables à la dégradation par les endonucléases ce qui leur confère un potentiel de biomarqueurs. L'ARN circulaire MICRA (Myocardial Infarction associated circular RNA) a récemment été identifié dans les cellules sanguines des patients avec IDM [256]. Les patients avec une faible expression de MICRA avaient un risque élevé de dysfonction ventriculaire. Cette observation a été validée dans deux cohortes indépendantes. 75 9. Biomarqueurs cardiovasculaires spécifiques des femmes : Les biomarqueurs de la pathophysiologie CV : Dans une étude de population incluant 3439 participants, trente biomarqueurs impliqués dans les pathophysiologies des MCV ont été comparés entre les femmes et les hommes [87]. En général, les femmes avaient des taux plus élevés de biomarqueurs lipidiques (plus de HDL et moins de LDL) et moins de biomarqueurs associés avec la dysfonction endothéliale, le recrutement des cellules inflammatoires et l'inflammation vasculaire. L'association de ces biomarqueurs avec le sexe était affectée par la composition corporelle, la distribution des graisses et la ménopause [87]. La proneurotensine : La neurotensine est l'hormone de satiété et est impliquée dans le métabolisme des lipides. La capacité de N terminal précurseur de cette hormone, la proneurotensine à prédire la mortalité et la morbidité CV a été étudiée dans une population générale de 4632 participants [257]. Les taux de proneurotensine, mesurés à jeun, étaient plus élevés chez les femmes par rapport aux hommes et étaient prédictifs du risque du diabète, de MCV et de mortalité CV, spécifiquement chez les femmes. L'interaction entre la proneurotensine et le sexe au niveau de la prédiction des MCV était significative (p [257]. La valeur pronostique de la proneurotensine a été analysée dans la cohorte Framingham Heart incluant 3439 participants [258]. La capacité de la proneurotensine à prédire l'incidence de MCV était comparable entre les deux sexes. Dans une autre cohorte américaine de 1697 participants, la capacité de proneurotensine à prédire la mortalité de toutes causes était supérieure chez les femmes [259]. De plus, la proneurotensine prédisait la mortalité CV spécifiquement chez les femmes. La thymosine -4 : La thymosine -4 (TB4) est une protéine codée par un gène localisé sur le chromosome X et est dotée de propriétés cardioprotectrices. Les taux de TB4 ont été mesurés 76 dans le plasma de 657 patients contrôles ou souffrant d'IC avec FE préservée ou réduite [260]. La TB4 était augmentée dans le groupe d'IC avec FE préservée comparée aux contrôles, et ce spécifiquement chez les femmes. L'analyse de la capacité diagnostique de cette protéine a révélé un potentiel discriminatoire entre les contrôles et le groupe d'IC avec FE préservée spécifiquement chez les femmes. Du point de vue pronostique, la TB4 prédisait le risque de mortalité à 2 ans spécifiquement chez les femmes, et ce indépendamment du NT- proBNP. Les biomarqueurs du pronostic suite à un IDM non-occlusif : Les femmes présentant un syndrome coronarien aigu sans obstruction coronaire ont un risque élevé d'évènements CV adverses et d'IC [261]. La valeur pronostique des marqueurs de l'inflammation (IL-6, hs-CRP et sérum amyloide A) a été étudiée chez 390 femmes présentant des symptômes ischémiques sans signe d'obstruction [261]. Les taux élevés d'IL-6 et du sérum amyloide A étaient associés avec une mortalité accrue. Parmi ces trois marqueurs, l'IL-6 était un prédicteur indépendant du risque de mortalité et d'hospitalisation pendant les 6 ans suivant l'accident ischémique. 77 Matériels & Méthodes 78 1. Cohortes : Les patients des cohortes présentées dans ce manuscrit ont rempli un consentement écrit, conformément à la déclaration d'Helsinki et en accord avec les comités d'éthique locaux. Au Luxembourg, il s'agit du Comité National d'Ethique et de la Recherche (CNER). 1. 1. Cohorte LUCKY : Il s'agit d'un registre national de patients diagnostiqués avec un IDM aigu et traités avec une angioplastie coronaire. Le registre a été créé par l'institut national de chirurgie cardiaque et de cardiologie interventionnelle Luxembourgeois (INCCI) et le département de cardiologie du Centre Hospitalier du Luxembourg (CHL). Les patients ont été consécutivement recrutés entre 2006 et 2012. Les données cliniques des patients ont été collectées au moment de l'admission. Des informations relatives à l'état de santé des patients jusqu'à un an après l'IDM sont disponibles dans le registre. Le diagnostic de l'IDM était basé sur les symptômes cliniques et les modifications au niveau des enzymes cardiaques, à savoir la cTnT et la CK, ainsi que l'ECG. Les patients ont été classés en deux groupes en fonction de leur profil ECG. Les patients STEMI qui sont caractérisés par une élévation significative du segment ST, une artère coronaire majeure complètement occluse (artère coronaire gauche descendante, circonflexe, ou droite) ainsi qu'une activité de la CK supérieure à 600U/L. Quant aux patients NSTEMI, ils sont caractérisés par une dépression significative du segment ST, des lésions partielles importantes voir une obstruction d'une artère coronaire majeure nécessitant une angioplastie coronaire, ainsi qu'un taux de cTnT positif (supérieur à 0, 03g/L) après 24 heures. La reperfusion a été effectuée dans les 12 heures suivant le début de la douleur thoracique par angioplastie coronaire. Les échantillons sanguins ont été obtenus au moment de la reperfusion et également deux fois par jour par la suite afin de mesurer les taux de biomarqueurs cardiaques. Ces prélèvements ont été effectués par le laboratoire de biologie médicale du CHL. Les plasmas ont été séparés et conservés à -80C dans des tubes citratés. 79 Tableau 1. Comparaison des caractéristiques cliniques et démographiques entre les femmes et hommes de la cohorte LUCKY. Tous les patients Femmes Hommes Valeur de p (N 608) (N 138, 23%) (N 470, 77%) (Femmes versus Age, médiane (rang), année 60 (30-91) 17 (2, 8) 70 (33-91) 17 (12, 3) 57 (30-88) - cTnT, g/L 3, 9 (0, 01-31, 64) 3, 73 (0, 01-26, 93) 3, 96 (0, 03-31, 64) 27 (18-51) 26 (18-47) 27 (18-51) 10, 75 (1, 11-7250) 10, 27 (4, 96-7250) 10, 92 (1, 11-6350) 1497, 6 (34-13038) 1353 (57-9233) 1639 (34-13038) 205, 2 (5-35000) 481, 1 (45, 26-15679) 160, 2 (5-35000) 3, 12 (0, 6-12) 3, 12 (0, 6-12) 3, 36 (0, 8-12) 50 (15-89) 50 (20-86) 50 (15-89) Femmes préménopausées (âge 50), n (%) IMC (rang) Leucocytes, médiane (rang), 109/L Marqueurs plasmatiques, valeurs maximales, médiane (rang) CK, U/L NT-proBNP à la reperfusion, médiane (rang), pg/mL Temps ischémique, médiane (rang), heures FE à 4 mois, médiane (rang), % FEr (FE40%), n(%) Antécédents CV, n (%) IDM Diabète Hypertension Hypercholestérolémie Tabac Type d'IDM (STEMI), n (%) Classification NYHA (> II), n (%) Médicaments préadmission, n (%) Statines Aspirine -Bloquants Inhibiteurs de l'angiotensine Inhibiteurs de l'enzyme de conversion Clopidogrel Nitrates Antagonistes du calcium Diurétiques Hommes) - 0, 003 0, 357 0, 246 0, 939 0, 46 0, 903 0, 92 0, 034 0, 406 0, 286 0, 557 0, 068 0, 473 120 (19) 59 (10) 126 (21) 279 (46) 255 (42) 273 (45) 483 (79) 120 (20) 113 (19) 120 (20) 124 (20) 70 (12) 70 (12) 40 (7) 25 (4) 17 (3) 18 (3) 28 (20) 7 (5) 32 (23) 69 (50) 61 (44) 54 (39) 113 (82) 92 (19) 52 (11) 94 (20) 210 (45) 194 (41) 219 (47) 370 (79) 45 (33) 75 (16) 25 (18) 27 (20) 35 (25) 16 (12) 19 (14) 9 (7) 7 (5) 3 (2) 9 (7) 88 (18) 93 (20) 89 (19) 54 (11) 51 (11) 31 (7) 18 (4) 14 (3) 9 (2) 1 1 0, 117 1 0, 363 1 0, 474 0, 774 0, 009 80 Le suivi a eu lieu 4 mois après la survenue de l'IDM par ECG. Une échocardiographie a également était effectuée afin d'évaluer la FV. En fonction de leur FE, les patients ont été divisés, selon l'étude, en deux ou trois groupes. Tableau 1 présente les caractéristiques démographiques et cliniques des patients, ainsi que la comparaison de ces caractéristiques entre les femmes et les hommes. Les différentes étapes de cette étude sont présentées dans la Figure 20. Figure 20. Les étapes de l'étude LUCKY 1. 2. Etude LIFE-Heart : Une validation indépendante a été effectuée chez 294 patients de la cohorte N2 de l'étude LIFE-Heart pour la troisième étude présentée dans ce manuscrit. L'étude LIFE-Heart a été établie afin d'étudier les facteurs de risque génétiques et non génétiques de l'athérosclérose. Les patients de cette étude appartiennent aux différents stades de coronaropathies et ont été répartis en trois cohortes différentes. Les patients de la cohorte 2 ont été diagnostiqués pour un IDM comme première manifestation de coronaropathies. 70% des patients étaient diagnostiqués avec un STEMI (CK 3634 U/L) et le reste avec un NSTEMI (CK 1514 U/L). Tous les patients ont été traités par angioplastie coronaire. Le sang veineux des patients a été obtenu entre 6 et 36 heures (moyenne 20 8 heures) après l'angioplastie coronaire dans des tubes PAXgene (BD Biosciences) afin de conserver la stabilité d'ARN. Les biomarqueurs cardiaques, inflammatoires, et métaboliques ont été mesurés le jour du prélèvement sanguin par le système MODULAR ANALYTICS (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). 81 Le suivi des patients a eu lieu en médiane 99 jours post-IDM. Le recrutement des patients s'est effectué consécutivement entre juillet 2008 et octobre 2012. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de la faculté de médecine de l'université de Leipzig (Reg. No 276-2005) et inscrite sur le site ClinicalTrials. gov sous la référence NCT00497887. L'expression de notre gène d'intérêt (CDKN1C) a été analysée dans les données de puce à ARN. L'ARN total a été extrait des PBMC en utilisant TRIzol reagent (Invitrogen) et quantifié par Nanodrop (Thermofisher). 500ng d'ARN a été précipité par éthanol à l'aide du Glyco-Blue (Invitrogen) et ensuite dissout à une concentration de 50-300ng/l. La puce à ARN Illumina HT-12 v4 Expression BeadChips (Illumina, San Diego, CA, USA) a été utilisée pour l'hybridation de l'ARN. Le traitement des données et le control-qualité ont été expliqués en détail dans [262, 263]. Les différentes étapes de cette étude sont présentées dans la Figure 21. La comparaison des caractéristiques démographiques et cliniques entre les femmes et les hommes de cette cohorte est présentée dans le tableau 2. Figure 21. Les étapes de l'étude LIFE-Heart 82 Tableau 2. Comparaison des caractéristiques cliniques et démographiques entre les femmes et hommes de la cohorte LIFE-Heart. Age, médiane (rang), année Tous les patients Femmes Hommes P value (N 294) 60 (26-84) (N 82, 28%) (N 212, 72%) (Femmes vs, hommes) 67 (40-84) 57 (26-84) 6, 6x10-4 IMC (rang) 27, 8 (20-50, 6) 27, 3 (20, 4-50, 6) 27, 8 (20-48) Cellules sanguines à l'admission, médiane (rang) Leucocytes, 109/L Neutrophiles, % Lymphocytes, % Monocytes, % Plaquettes, 109/L Biomarqueurs, médiane (rang) CK, U/L cTnT, g/L hsCRP, mg/L NT-proBNP, pg/mL FE, médiane (rang) Antécédents CV, n (%) IDM Diabète Hypertension Hypercholestérolémie Tabagisme 10 (4, 7-22, 9) 10, 1 (5, 9-22, 9) 10 (4, 7-22, 5) 72, 7 (48, 3-92, 9) 73, 2 (56, 2-92, 9) 72, 4 (48, 3-90, 4) 17, 2 (4-37) 8, 7 (2, 5-16) 226 (3-542) 17, 2 (4-33, 6) 17, 2 (4, 3-37) 8, 2 (3, 1-12, 6) 256 (86-542) 9, 1 (2, 5-16) 221 (3-538) 640 (37, 7-16900 614 (47, 2-4030) 640 (37, 7-16900) 1, 95 (0, 007-17, 8) 1, 56 (0, 007-6, 08) 2, 39 (0, 02-17, 8) 22, 5 (0, 63-422) 19, 7 (0, 97-203) 23, 6 (0, 63-422) 1710 (36, 8-33700) 2390 (41, 3-22700) 1380 (36, 8- 55 (18-71) 55, 5 (20-71) 8 (2, 7%) 63 (21%) 153 (52%) 40 (14%) 202 (69%) 1 (1, 2%) 24 (29%) 46 (56%) 11 (13%) 39 (48%) 33700) 54 (18-70) 7 (3, 3%) 39 (18%) 107 (50%) 29 (14%) 163 (77%) 0, 51 0, 67 0, 086 0, 63 9, 2x10-5 6, 2x10-4 0, 27 0, 054 0, 48 4, 3x10-4 0, 083 0, 45 0, 056 0, 44 1, 00 2, 6x10-6 83 1. Quantification des biomarqueurs cardiaques : 1. 1. NT-proBNP : Le NT-proBNP a été mesuré dans les sérums des patients de la cohorte LUCKY obtenus à partir du sang veineux récupéré au moment de la revascularisation. Les sérums ont été conservés à -80C jusqu'au dosage du NT-proBNP par les laboratoires de biologie médicale luxembourgeois Laboratoires Réunis. Ce dosage s'est fait par électrochimiluminescence (ECLIA) qui utilise l'analyseur Elecsys 2010 (Roche Diagnostics). Le dosage se fait au moyen de deux anticorps monoclonaux reconnaissant deux épitopes localisés au niveau de la partie N-terminale du proBNP. Le cycle analytique dure 18 minutes et comprend deux étapes d'incubation. La première incubation consiste à incuber 15l du sérum ou du plasma avec deux anticorps monoclonaux anti-NT-proBNP dont un biotinylé et l'autre marqué au ruthénium qui forment un complexe en sandwich en présence du NT-proBNP. La deuxième incubation consiste à l'addition de microparticules tapissées de streptavidine dans la cuvette réactionnelle. Le complexe immun se lie à la phase solide par l'interaction biotine-streptavidine. Le mélange réactionnel est ensuite transféré dans la cellule de mesure o les microparticules sont capturées magnétiquement au niveau de la surface de l'électrode et la fraction libre est éliminée. L'application d'un voltage génère une chimiluminescence qui est mesurée par un photomultiplicateur. Les résultats sont obtenus à l'aide d'une courbe de calibration. Celle-ci est générée, par l'analyseur utilisé, par une calibration en 2 points et une courbe de référence mémorisée dans le code-barres du réactif. La méthode permet le dosage du NT-proBNP aussi bien sur les échantillons sériques que plasmatiques présentant un domaine de mesure analytique de 5-35 000pg/ml ou 0, 6-4130 pmol/L. Le taux de réaction croisée avec les autres peptides est très faible. La variabilité liée à la méthode est de moins de 5%. La sensibilité fonctionnelle est de 50pg/ml étant la concentration en analyte la plus basse, mesurable de manière reproductible et donnant un coefficient de variation inter-séries de 20 %. 84 1. 2. cTnT et CK : Le sang veineux périphérique des patients de la cohorte LUCKY a été récupéré au moment de l'admission et deux fois par jours, par la suite afin de déterminer les valeurs maximales des biomarqueurs de la nécrose myocardique, à savoir la cTnT et la CK. Le Troponin T STAT (Short Turn Around Time), CARDIAC T de chez Roche a été utilisé pour le dosage de la cTnT. La méthode est basée sur l'utilisation de deux anticorps monoclonaux spécifiques de la cTnT dont un biotinylé et l'autre marqué au ruthénium. Le dosage se fait par ECLIA et utilise l'analyseur Cobas e601 (Roche Diagnostics). La durée du cycle analytique est de 9 minutes comprenant une seule étape d'incubation du plasma ou du sérum avec les anticorps monoclonaux et les microparticules tapissées de streptavidine. Les différents composants forment un sandwich qui se fixe à la phase solide. Les microparticules sont ensuite maintenues au niveau de l'électrode de la cellule de mesure et une chimiluminescence est générée après l'application d'une différence de potentiel. La lecture se fait par un photomultiplicateur. Les limites de détection de l'essai sont comprises entre 0, 01- 25g/L. La sensibilité fonctionnelle de l'essai est de 0, 03g/L, qui est mesurable d'une manière reproductible avec un coefficient de variation de 10%. La CK est mesurée par la méthode recommandée par la Fédération Internationale de Chimie Clinique (IFCC) qui est basée sur l'activation par la N-acétylcystéine. Le dosage a été effectué dans le Cobas c501 (Roche Diagnostics). La cTnT hypersensible (hs-TnT) a été mesuré dans le plasma de 315 patients au moment de la revascularisation (Roche diagnostics) en utilisant l'analyseur Cobas e601. La limite de détection est 0, 003g/L. Le seuil au 99eme percentile est 0, 014 g/L avec une imprécision de 10% à 0, 013g/L. 85 2. Isolation des cellules sanguines humaines : 2. 1. Isolation des neutrophiles humains primaires : Les neutrophiles primaires ont été isolés à partir du sang total de volontaires sains prélevé dans des tubes héparinés. La technique d'isolation classique basée sur le Dextran/Ficoll a été utilisée. Le gradient de Ficoll (Lymphoprep de MP Biomedicals, Illkirch, France) permet la séparation des neutrophiles des PBMC. Le sang frais est dilué dans du tampon salin phosphate (PBS pour phosphate buffered saline) contenant du Ca2 et du Mg2 . Le Ficoll est ensuite ajouté et l'ensemble est centrifugé à 400xg pendant 30 minutes à température ambiante. Après élimination du plasma, de l'anneau cellulaire de PBMC et des résidus du Ficoll, le culot sanguin contenant les globules rouges et les neutrophiles est alors gardé et traité par une solution à 1 % de Dextran 500 (Amersham Biosciences Diegem, Belgique) et 0, 85 % de NaCl, dilué dans du milieu de culture RPMI. La sédimentation des cellules est ensuite effectuée à 4C pendant une heure. Après l'avoir récupéré et dilué dans du milieu RPMI, le surnageant est centrifugé à 4C, 200xg pendant 10 minutes. Afin de lyser les globules rouges, le culot est resuspendu dans l'eau stérile à 4C pendant 10 secondes et la suspension est transvasée dans une solution de NaCl (0, 43M). L'ensemble est centrifugé à 4C, 200xg pendant 10 minutes. Les neutrophiles obtenus sont quantifiés en présence du bleu de trypan. Le nombre de cellules souhaité est lysé dans 1ml du TriReagent (Sigma, Bornem, Belgium), qui protège aussi les ARN contre la dégradation, et conservé à -80C jusqu'à extraction d'ARN. La pureté de la population cellulaire a ensuite été déterminée en utilisant l'anticorps anti-CD16 pour les neutrophiles (Immunotools, Friesoythe, Allemagne) avec le cytomètre BD FACSCantoTM (BD Biosciences). La pureté était supérieure à 93 %. 2. 2. Isolation des monocytes et des lymphocytes humains primaires : L'isolation des monocytes a été effectuée à partir du sang provenant des patients atteints d'hémochromatose. La poche du sang (250-500ml) a été obtenue après la saignée du 86 patient au département d'Hématologie/Hémato-Oncologie/Cancérologie du CHL. Tous les patients ont signé un consentement éclairé. La première étape de cette expérience consiste à l'isolation des PBMC en utilisant le gradient Ficoll et les tubes Leucosep (Greiner, Wemmel, Belgique). Ces derniers contiennent une membrane poreuse permettant la séparation du plasma, des PBMC et des globules rouges. Le Ficoll est centrifugé 1 minute à 200xg. Un volume de 30ml de sang total est distribué dans les tubes qui sont centrifugés de nouveau 30 minutes à 400xg. Le plasma est éliminé et l'anneau cellulaire représentant les PBMC est récupéré, lavé avec du PBS contenant du Ca2 et du Mg2 et centrifugé 15 minutes à 200xg à 15C. Le culot est ensuite resuspendu dans du PBS sans Ca2 ni Mg2 contenant 2mM d'EDTA (Éthylènediaminetétraacétique) et centrifugé 15 minutes à 200xg à 10C. Le culot est ensuite resuspendu dans du PBS sans Ca2 ni Mg2 contenant 2mM d'EDTA et 0, 5% de sérum de veau fœtal (SVF). Les PBMC présents dans cette suspension sont quantifiés par le bleu de trypan. La suspension est ensuite centrifugée 15 minutes à 200xg à 10C. Les cellules sont ensuite reprises dans du PBS sans Ca2 ni Mg2 contenant 2mM d'EDTA et 0, 5% de SVF afin de procéder à la séparation des monocytes. L'isolation des monocytes des PBMC se fait par sélection négative grâce au kit Monocyte Isolation kit II (Miltenyi, Royaume-Uni). Tout d'abord, les PBMC sont incubés avec un Fc Blocking Reagent permet la saturation des récepteurs Fc présents sur la surface des cellules et inhibe la fixation non-spécifique des anticorps biotinylés ajoutés par la suite (anti-CD3 et anti-CD7 marqueurs des lymphocytes T, anti-CD16 marqueur des neutrophiles, anti-CD19 marqueur des lymphocytes B, anti-CD56 marqueur des cellules NK, anti-CD123 marqueur des cellules progénitrices, granulocytes et mégacaryocytes et la glycophorine qui permet de retenir les globules rouges). La deuxième étape consiste à l'incubation des PBMC avec un anticorps anti-biotine couplé à des microbilles magnétiques. Le mélange est ensuite déposé sur une colonne magnétique placée sur un aimant. Trois lavages successifs avec du PBS sans Ca2 ni Mg2 contenant 2mM d'EDTA et 0, 5% de SVF sont réalisés afin de récupérer les monocytes non marqués. L'effluant est centrifugé à 4C pendant 10 minutes à 300xg. Le culot est resuspendu dans du milieu RPMI contenant du SVF et les cellules sont 87 énumérées. Le nombre de cellules souhaité est lysé dans 1ml du TriReagent (Sigma, Bornem, Belgium) et conservé à -80C jusqu'à extraction d'ARN. La pureté des cellules était supérieure à 90 % et a été déterminée par l'utilisation d'anticorps anti-CD14 pour monocytes (BD Biosciences) avec le cytomètre BD FACSCantoTM (BD Biosciences). 88 3. Mesure de l'expression génique : 3. 1. Extraction d'ARN : A partir du sang total : Le kit PAXgeneTM blood RNA (Qiagen, Venlo, Netherlands) a été utilisé pour l'extraction des ARN totaux à partir des tubes PAXgeneTM. Il permet la purification de l'ARN intracellulaire à partir d'un volume initial de 2, 5ml du sang total humain. Les échantillons sanguins ont été conservés à -20C depuis le prélèvement. La purification d'ARN commence par une étape de centrifugation dans des tubes PAXgene Blood RNA (BRT) afin de sédimenter les acides nucléiques. Après avoir lavé et resuspendu le culot, l'étape suivante consiste à la digestion des protéines à l'aide des tampons optimisés par la Protéinase K (PK). Afin de favoriser l'homogénéisation du lysat cellulaire, une étape de centrifugation additionnelle est réalisée à travers les colonnes PAXgene Shredder (PSC). Le surnageant est ensuite transféré dans un nouveau tube de microcentrifugation. De l'éthanol est ajouté pour ajuster les conditions de fixation et le lysat est déposé dans une colonne PAXgene RNA (PRC). Au cours d'une courte étape de centrifugation, l'ARN se fixe sur la membrane de la colonne à base de gel de silice et les contaminants résiduels passent à travers cette membrane. Plusieurs étapes de lavages sont réalisées afin d'éliminer les résidus des contaminants. Lors de ces lavages, la membrane est traitée à la DNAse I afin d'éliminer toute trace d'ADN génomique. L'ARN est finalement élué dans le tampon d'élution (BR5). Le rendement d'ARN à partir de 2, 5ml de sang dépend fortement du donneur, ça varie entre 4 et 10g. L'ARN est ensuite purifié et concentré au moyen du kit RNeasy MinEluteTM (Qiagen). L'ARN a été quantifié à l'aide du spectrophotomètre ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). La dégradation d'ARN a été vérifiée grâce au 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Massy, France) en utilisant des lames RNA 6000 Nano chips. A partir des cellules sanguines isolées : Les différents sous-types de leucocytes ont été lysés dans du TriReagent (Sigma, Bornem, Belgium). L'ARN a été purifié au moyen du kit RNeasy Microkit (Qiagen). Après décongélation des lysats cellulaires sur glace, un volume en chloroforme, équivalent au 1/5ème 89 du volume initial du lysat est ajouté. Une étape de centrifugation est réalisée afin de séparer la phase aqueuse riche en acide nucléique et la phase organique riche en protéines. La phase aqueuse est ainsi récupérée et mélangée avec de l'éthanol 70%. L'ensemble est déposé sur une colonne RNeasy MinElute (Qiagen) afin de favoriser la fixation de l'ARN sur la membrane de la colonne. Une série de lavages par des tampons et de l'éthanol 80% est effectuée afin d'éliminer les contaminants résiduels. Une digestion à la DNase I est également réalisée afin d'éliminer l'ADN génomique qui peut être copurifié avec l'ARN. L'ARN est finalement élué dans de l'eau exempte de nucléases et quantifié à l'aide du spectrophotomètre ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). 3. 2. Transcription inverse et PCR quantitative : L'ARN purifié a été rétro-transcrit en ADN complémentaire (ADNc) grâce à la l'enzyme SuperScript II (Invitrogen) dans un mélange réactionnel contenant également : RT Buffer 5X, des amorces aléatoires, des dNTPs 2, 5mM (Invitrogen) et du dithiothreitol (DTT) 100mM (Invitrogen). Le programme PCR pour la SuperScript II est : 50 min à 42C puis 15 min à 70C. Deux contrôles ont été réalisés lors de la transcription inverse : un contrôle sans enzyme permettant de vérifier la présence de l'ADN génomique et un contrôle sans ARN pour vérifier la dimérisation des amorces lors de la réaction qPCR ou une éventuelle contamination du mélange réactionnel. Les amorces utilisées pour la mesure des différents gènes ont été conçues à l'aide du logiciel Beacon Designer 8 (Palo Alto, Etats Unis). Les amorces amplifient tous les isoformes du gène si ce dernier en possède. Afin d'éviter toute amplification de l'ADN génomique, les séquences des amorces ont été placées de part et d'autre des jonctions exon- exon. La mise au point des amorces a permis la détermination de la température d'hybridation optimale ainsi que l'efficacité de PCR. Les séquences des amorces utilisées ainsi que leurs températures d'hybridation et leurs efficacités sont présentées dans le tableau 3. Les ADNc obtenus ont été ensuite dilué 10 fois et mis en présence de amorces complémentaires et du SYBR Green Master Mix (Biorad, Hercules, Etats-Unis) pour 90 mesurer l'expression génique par qPCR. Le SYBR Green Master Mix contient de l'ADN polymérase (Taq polymérase), des nucléotides, du Sybr green I, un tampon de PCR et du MgCl2. Ces différents éléments sont chauffés à 95C pendant 2 minutes afin de dénaturer l'ADN, activer la polymérase et homogénéiser le milieu réactionnel. Le mélange subit 40 cycles de PCR. Chaque cycle est constitué de trois étapes : une première qui consiste en la dénaturation de l'ADN à 95C pendant 30 secondes, une seconde qui permet l'hybridation des amorces sur les brins d'ADNc suivie d'une étape de synthèse et d'élongation d'un nouveau brin par la Taq polymérase. La spécificité des amplicons a été vérifiée par l'analyse de la courbe de fusion, et le Sybr green qui est un agent intercalant fluorescent a permis la mesure de la quantité d'ADN amplifiée par la mesure de la fluorescence. La qPCR a été effectuée dans un thermocycleur Biorad CFX 96. Les résultats ont été normalisés par le SF3A1, et les valeurs d'expression ont été calculées par la méthode du delta delta CT (Cycle threshold) avec le logiciel Biorad CFX Manager. Tableau 3. Séquences des amorces utilisées au cours de la qPCR Séquence sens (5'3') Séquence anti-sens (5'3') Température d'hybridation Efficacité de PCR GCTGCCTCCCCGCTGTGC GGTGCGTGGGTGCGAATCC AAGCCGCATGAGAATTGAGAG TTGATCCCTTATTTCCGCCATC AACTACGACACCGACGAC CAGGCGGAGTAGGATTGG GTGGACCATCAGGGAGTGAG CTGGGGAGCGAAAGTTTCTT Gène LTBP4 LMNB1 MMP9 TNXB GGCATACCAACATTCTCT GCTGCTACATGAACGGTCC TGCGGAGACAACTGTAGTACG TGFBR1 CTTATTATGATCTTGTACCTTCTG CDKN1C CAAGAGGCTGCGGTGAG GATTGGCCCCAGCAAGCC SF3A1 (C) 58 60 62 56 58 60 60 (%) 100 96. 7 107 96 98. 7 100. 4 96. 6 91 4. Analyses statistiques : Une valeur de p < 0, 05 était considérée comme statistiquement significative dans l'ensemble des travaux présentés dans ce manuscrit. 4. 1. Analyses standards : La normalité de distribution des variables a été d'abord vérifiée par le test Shapiro Wilk. Le logiciel SigmaPlot version 12. 0 a été utilisé pour réaliser les tests statistiques à 2 voies. Le test t de Student ou Mann Whitney ont été utilisés pour comparer deux groupes de variables continues respectivement de distribution gaussienne ou non. La comparaison de trois groupes a été réalisé par le test ANOVA pour les données gaussiennes et Kruskal-Wallis one-way ANOVA on ranks pour les données non gaussiennes. Les tests Chi-square ou Fisher's exact ont permis la comparaison de deux ou trois groupes de variables catégorielles. 4. 2. Analyses de prédiction : La version 3. 3. 1 de la plateforme statistique R a été utilisée pour les analyses de prédiction. Les packages Hmisc, PredictABEL, lmtest, rms, bootStepAIC, survival et survminer ont été utilisés pour ces analyses. Traitement des données : L'imputation multiple à 100 itérations a été utilisée pour remplacer les données manquantes. Cette méthode est utilisée lorsqu'il y a plusieurs variables qui comportent des données manquantes. Elle consiste à imputer successivement plusieurs valeurs à chaque donnée manquante. Le mécanisme d'imputation est basé sur la définition d'un modèle réaliste de la distribution des données manquantes conditionnellement aux données observées. Chaque copie de données générée correspond à une distribution plausible des données manquantes. Le but de l'imputation est de réaliser des analyses statistiques valides tout en tenant compte de l'incertitude des données manquantes et tout en conservant les caractéristiques importantes et la structure des données (moyennes, variances, covariance 92 entre les variables en particulier). Les analyses statistiques réalisées sont menées sur chaque copie de données générées, puis les résultats sont combinés pour fournir un résultat global. Des transformations sont exigées en cas d'utilisation de la régression logistique ou ordinale afin d'estimer un modèle prédictif optimal. Ces transformations ont pour objectif de rendre les données les plus conformes à la loi normale et de réduire l'intra-variabilité. Les données ont subi une transformation logarithmique de base 2 et une standardisation des données qui réduit la moyenne de la distribution à 0 et l'écart type à 1. Prédiction de la dysfonction ventriculaire : Nous avons utilisé la régression logistique (binaire) et ordinale pour caractériser la relation entre la FV évaluée 4 mois post-IDM, qui est une variable qualitative dépendante, et une ou plusieurs variables explicatives (facteurs de risque et biomarqueurs). Elle permet d'estimer l'odds ratio (OR, rapport des cotes) assortis de leur IVC (95%). L'OR donne une information sur la force et le sens de relation entre la variable dépendante et la variable explicative. Il est toujours positif, compris entre 0 et . Un OR égale à 1 est interprété comme une absence de relation entre les deux variables dépendante et explicative. Les variables explicatives introduites dans cette analyse sont connues pour être associées avec le risque d'IDM et du RVG. Une analyse univariée a été d'abord réalisée o la relation entre chaque variable et la FV a été séparément analysée. L'analyse univariée génère des OR qui sont dits bruts ou non ajustés . Une analyse multivariée a ensuite été réalisée incluant toutes les variables explicatives et qui estime pour chaque variable un OR ajusté aux autres variables de ce modèle. La régression logistique a été utilisée pour étudier l'association entre la FV et les biomarqueurs d'intérêt dans les études o les patients ont été divisés en deux groupes selon leur FE. Quant à la régression ordinale, elle a été utilisée dans les analyses comprenant trois groupes de patients. 93 Afin de déterminer la valeur prédictive ajoutée du biomarqueur d'intérêt, le critère d'Akaike (AIC pour Akaike Information Criterion) a été calculé pour le modèle clinique seul et après l'addition du biomarqueur. AIC permet d'analyser la robustesse des modèles en pénalisant ceux ayant trop de variables. Ce critère représente un compromis entre le biais qui diminue avec le nombre de variables et la parcimonie qui nécessite de décrire les données avec le nombre le plus petit de variables. Le meilleur modèle est celui possédant l'AIC la plus faible autrement dit celui apportant le maximum d'information sur la variable à expliquer avec le minimum de variables explicatives possible. Le Wald Chi test a été utilisé pour analyser la robustesse et la stabilité de chaque modèle séparément et le test du rapport des vraisemblances (Likelihood ratio test) pour comparer les modèles deux à deux. Une diminution significative dans l'AIC après l'addition du biomarqueur est interprétée comme une amélioration dans la robustesse et la valeur prédictive du modèle. La capacité des biomarqueurs à améliorer la valeur prédictive du modèle clinique a également été évaluée par les analyses de reclassification utilisant le NRI (net reclassification index) et l'IDI (integrated discrimination improvement). Ces indicateurs permettent de déterminer si le biomarqueur d'intérêt est capable de reclasser les patients non ou mal-classés par le modèle clinique seul. Le NRI est interprété comme étant le net changement dans la proportion des patients ayant été correctement classés sous le nouveau modèle. Quant à l'IDI, il est interprété comme étant le pourcentage d'amélioration du pouvoir discriminatif du modèle après l'addition du biomarqueur d'intérêt. Afin d'évaluer la robustesse du modèle, une validation interne à partir des mêmes données a été effectuée par bootstrap. Cette méthode est basée sur le ré-échantillonnage en créant plusieurs copies différentes des données originales et ce en supprimant certaines données et les remplaçant par d'autres données appartenant au même jeu de données. Dans nos analyses, cette opération a été répétée 150 fois et à chaque nouvelle copie de données la performance du modèle est testée par le calcul de l'AIC. Les résultats sont exprimés en pourcentage de copies de données permettant la génération du modèle le plus robuste, comme attesté par l'AIC le plus faible. Prédiction de la mortalité : 94 Les courbes de survie Kaplan Meier ont été utilisées pour comparer entre les femmes et les hommes le risque de mortalité (de toute cause) pendant les 6 moins post-IDM. Cette méthode permet d'analyser la probabilité de survie sur un intervalle de temps. Cette probabilité est calculée en divisant le nombre de patients décédés sur celui des patients exposés au risque de décès pendant cet intervalle. La méthode Kaplan Meier réalise une estimation de la probabilité à chaque fois que le décès se produit d'o le profil en escalier de ces courbes. Le test de LogRank a été utilisé pour comparer les deux courbes. La capacité des biomarqueurs à prédire la mortalité à 6 mois chez les femmes et les hommes a été analysée en utilisant le modèle à risques proportionnels de Cox. Ce modèle se rapproche des modèles de régression classique, dans le sens o on veut relier un évènement à des variables explicatives. Il permet d'exprimer le risque de survenue d'un évènement en fonction du temps et des variables explicatives, en calculant le rapport de hasard (hazard ratio, HR) qui exprime le risque estimé sur toute la durée de l'étude. L'association des biomarqueurs avec la mortalité a été évaluée aussi bien dans une analyse univariée que multivariée. Cette dernière incluait les mêmes variables que la régression logistique ou ordinale. 95 Résultats 96 Etude N1 : Identification d'une combinaison de trois gènes capables d'améliorer la prédiction de la fonction ventriculaire après un IDM Des études réalisées par notre équipe ont analysé l'association du profil transcriptomique des cellules sanguines avec la dysfonction ventriculaire post-IDM [232-236, 264]. Néanmoins, ces études ont été réalisées sur un faible nombre de patients. Parmi les gènes différentiellement exprimés entre les patients présentant ou non une dysfonction ventriculaire, cinq ont été sélectionnés pour une validation incluant un plus grand nombre de patients : LMNB1, MMP9, TXNB, LTBP4 et TGFBR1. La sélection de ces cinq gènes a été basée sur les critères suivant : 1) une valeur prédictive élevée comme attestée par un AUC (area under the receiver operating characteristic curve) > 0, 7 - 2) un niveau d'expression élevé à modéré qui rend la détection de ces gènes par qPCR reproductible et fiable - 3) l'expression de ces gènes au niveau du cœur insuffisant (résultats non publiés) ce qui est en accord avec l'infiltration des cellules immunitaires sanguines dans le cœur après un IDM. Pour cette validation, 449 patients du registre LUCKY ont été inclus. L'expression des cinq gènes a été mesurée par qPCR dans le sang total récupéré au moment de la revascularisation. En fonction de la FE, déterminée à 4 mois par échocardiographie, les patients ont été répartis dans deux groupes : FE réduite (FEr, FE40%) et FE préservée (FEp, 40%). Les patients avec une FEr représentaient 18% de la cohorte. Ils étaient plus âgés que les patients du groupe avec FEp, avaient des niveaux plus élevés de leucocytes, de CK, cTnT, et de NT-proBNP et ils étaient plus souvent diabétiques. La comparaison des valeurs d'expression des cinq gènes entre les deux groupes de patients a révélé une surexpression de LMNB1, TGFBR1 et MMP9, et une sous-expression du LTBP4 dans le groupe avec une dysfonction ventriculaire (FEr). Le niveau de TXNB était comparable entre les deux groupes FEr et FEp. Nous avons ensuite souhaité déterminer le(s) type(s) de cellules immunitaires qui expriment ces gènes. Pour ce faire, nous avons mesuré leur expression dans les trois types cellulaires qui jouent un rôle clé dans la réponse inflammatoire post-IDM : les neutrophiles, 97 les monocytes et les lymphocytes. LMNB1 et MMP9 étaient principalement exprimés par les neutrophiles. Les gènes TXNB et LTBP4 quant à eux étaient plutôt exprimés par les monocytes et les lymphocytes. Le gène TGFBR1 était exprimé de façon comparable par les trois sous-types cellulaires. La capacité de ces gènes à prédire la dysfonction ventriculaire a ensuite été analysée par régression logistique. L'analyse univariée a révélé l'association des cinq gènes avec la dysfonction ventriculaire. Dans un modèle multivarié incluant les paramètres connus pour être associés avec l'IDM et le RVG (âge, sexe, IMC, diabète, hypertension, hypercholestérolémie, tabac, antécédent d'IDM, temps ischémique, type d'IDM et nombre de leucocytes), trois parmi les cinq gènes prédisaient indépendamment la dysfonction ventriculaire. LTBP4 était négativement associé avec la dysfonction ventriculaire (OR [IVC 95%] 0, 66 [0, 470, 93]) alors que TGFBR1 et TNXB avaient une association positive (1, 68 [1, 112, 53] et 1, 41 [1, 041, 90], respectivement). Afin de déterminer la combinaison de gènes permettant la meilleure valeur prédictive, l'AIC a été calculée pour le modèle clinique seul et après l'inclusion des différentes combinaisons de gènes. Une diminution significative dans l'AIC (comme attestée par le likelihood ratio test) est interprétée comme une amélioration de la capacité prédictive du modèle. L'addition des trois gènes TNXB, TGFBR1 et LTBP4 était à l'origine de la meilleure prédiction, comme attestée par une diminution significative de l'AIC (383 versus 398 pour le modèle clinique, p 8. 3 x10-5). La validation interne par bootstrap a été utilisée pour confirmer la valeur prédictive ajoutée des trois gènes. Parmi les 150 itérations réalisées, 61% (91) incluant les trois gènes étaient sélectionnés pour générer le modèle avec l'AIC le plus faible. De plus, la combinaison des trois gènes était capable de reclasser 45% des patients mal-classés avec le modèle clinique. En conclusion, cette étude a permis l'identification d'une combinaison de trois gènes, exprimés par les cellules sanguines, capables d'améliorer la prédiction de la FV après un IDM. 98 International Journal of Cardiology 254 (2018) 2835 Contents lists available at ScienceDirect International Journal of Cardiology j o u rn a l h o m e p a g e : w w w. e l s e vi e r . c o m/ l o c a t e / i j c a r d A 3-gene panel improves the prediction of left ventricular dysfunction after acute myocardial infarction Adeline Boileau, Torkia Lalem, Melanie Vausort, Lu Zhang, Yvan Devaux , On behalf of the Cardiolinc network ( Cardiovascular Research Unit, Luxembourg Institute of Health, Luxembourg a r t i c l e i n f o a b s t r a c t Article history : Received 27 July 2017 Received in revised form 16 October 2017 Accepted 31 October 2017 Keywords : Myocardial infarction Left ventricular dysfunction Prognosis Biomarker Gene expression Background : Identication of patients at risk of poor outcome after acute myocardial infarction (MI) would allow tailoring healthcare to each individual. However, lack of prognostication tools renders this task challenging. Pre- vious investigations suggested that blood transcriptome analysis may inform about prognosis after MI. We aim to independently conrm the value of gene expression proles in the blood to predict left ventricular (LV) dysfunc- tion after MI. Methods and results : Five genes (LMNB1, MMP9, TGFBR1, LTBP4 and TNXB) selected from previous studies were measured in peripheral blood samples obtained at reperfusion in 449 MI patients. 79 patients had LV dysfunction as attested by an ejection fraction (EF) 40% at 4-month follow-up and 370 patients had a preserved LV function (EF N 40%). LMNB1, MMP9 and TGFBR1 were up-regulated in patients with LV dysfunction and LTBP4 was down-regulated, as compared with patients with preserved LV function. The 5 genes were signicant univariate predictors of LV dysfunction. In multivariable analyses adjusted with traditional risk factors and corrected for model overtting, a panel of 3 genes TNXB, TGFBR1 and LTBP4 improved the prediction of a clinical model (p 0. 00008) and provided a net reclassication index of 0. 45 [0. 230. 69], p 0. 0002 and an integrated discrimination improvement of 0. 05 [0. 020. 09], p 0. 001. Bootstrap internal validation conrmed the incremen- tal predictive value of the 3-gene panel. Conclusion : A 3-gene panel can aid to predict LV dysfunction after MI. Further independent validation is required before considering these ndings for molecular diagnostic assay development. 2017 Elsevier B. V. All rights reserved. 1. Introduction Left ventricular (LV) remodeling after acute myocardial infarction (MI) is a complex process which, when adequately regulated, restores the functional capacity of the infarcted heart. However, LV remodeling can become maladaptive, leading to LV dysfunction and ultimately Abbreviations : MI, myocardial infarction ; LV, left ventricle ; EF, ejection fraction ; HF, heart failure ; STEMI, ST-segmentelevation myocardial infarction ; NSTEMI, non-ST- segmentelevation myocardial infarction ; PCI, percutaneous coronary intervention ; BMI, body mass index ; TIMI, thrombolysis in MI ; BNP, brain natriuretic peptides ; Nt-proBNP, N-terminal proBNP ; cTnT, cardiac troponin T ; CPK, creatine phospho kinase ; WBC, white blood cells ; AIC, Akaike Information Criteria ; IDI, integrated discrimination improvement ; NRI, net reclassication index ; CI, condence intervals ; OR, Odds ratios ; Ct, relative quantication method ; TGFBR1, transforming growth factor beta receptor I ; TNXB, tenascin XB ; LTBP4, latent transforming growth factor beta binding protein 4 ; LMNB1, lamin B1 ; MMP9, matrix metalloproteinase 9. The authors take responsibility for all aspects of the reliability and freedom from bias of the data presented and their discussed interpretation. Corresponding author at : Cardiovascular Research Unit, Luxembourg Health Institute, L1526, Luxembourg. E-mail address : yvan. devaux@lih. lu (Y. Devaux). 0167-5273/ 2017 Elsevier B. V. All rights reserved. heart failure (HF). Heart failure is a grave condition with an ever in- creasing prevalence [1]. Prediction of the development of maladaptive LV remodeling after MI is challenging and would be a major break- through. A plethora of cardiovascular disease biomarkers have been identied [2], but there is still a need for novel biomarkers to identify patients at risk of developing LV remodeling and dysfunction after MI. While current guidelines recommend the use of brain natriuretic pep- tides (BNP)-monitoring to guide diagnosis and treatment of patients with acute or chronic HF [3], such biomarker-guided practice is not rec- ommended in the post-MI setting. In past studies [49], we examined whether gene expression proles of blood cells may be used to predict LV remodeling and dysfunction after MI. The hypothesis of an association between blood cells transcriptome and outcome after MI was supported by the capacity of immune circulating cells to inform about some features of the inam- matory and healing processes that occur after MI [10]. It is now well established that immune cells play a major role in ischemic heart dis- ease [11]. They link systemic to cardiac inammation [12] and regulate LV remodeling [13]. Interestingly, gene expression proles of blood cells are associated with LV remodeling in rats with aldosteronism and hypertensive heart disease [14]. Furthermore, gene expression proles A. Boileau et al. / International Journal of Cardiology 254 (2018) 2835 29 of blood cells correlate with the presence and extent of coronary artery disease in patients undergoing angiography [15] and are used for the di- agnosis of obstructive coronary artery disease in symptomatic non- diabetic patients [16]. In past investigations, microarray- and system-based approaches for biomarker discovery allowed the identication of several genes whose expression levels in peripheral blood cells may inform about prognosis after MI [49]. However, these studies were limited by small sample size. Here, we aimed to conrm in a large cohort of MI patients the asso- ciation between the expression levels in the blood of 5 genes and LV dysfunction after MI. The rationale beyond the selection of these 5 genes is three-fold. Firstly, the 5 genes predicted LV dysfunction with areas under the receiver operating characteristic curve above 0. 70 in discovery studies [5, 6, 8]. Secondly, their expression levels in blood cells were moderate to high and could reliably be detected using quan- titative PCR. Lastly, they were expressed in biopsies from failing hearts (unpublished data), consistently with the recruitment of peripheral blood cells to the injured heart [11]. The selected 5 genes are : transforming growth factor beta receptor I (TGFBR1), tenascin XB (TNXB), latent transforming growth factor beta binding protein 4 (LTBP4), lamin B1 (LMNB1), and matrix metalloproteinase 9 (MMP9). 2. Methods 2. 1. Patients and blood samples From a total of 960 consecutive patients of the Luxembourg Acute Myocardial Infarc- tion Registry completed at the Institut National de Chirurgie Cardiaque et de Cardiologie Interventionnelle and the Department of Cardiology of the Centre Hospitalier de Luxembourg [17], we enrolled 449 patients for which blood samples and follow-up data were available. All patients had acute MI and were treated with primary percutaneous cor- onary intervention (PCI). Acute ST-segmentelevation MI (STEMI) was the nal diagnosis for 352 patients and 97 patients had non-ST-segmentelevation MI (NSTEMI). STEMI was dened by (1) clinically signicant ST elevation (N1 mm) ; (2) occluded major coronary ar- tery : thrombolysis in MI (TIMI) 0 ow in the left anterior descending, circumex, or right coronary artery ; and (3) peak creatine phospho kinase (CPK) activity N600 U/L (3 times above the upper limit of the reference interval). NSTEMI was dened by (1) no signicant ST-elevation but signicant ST depression (N1 mm) ; (2) signicant lesion in a major cor- onary artery requiring PCI ; and (3) positive cardiac troponin T (cTnT) concentration after 24 h (N0. 03 g/L). Most NSTEMI patients had a severe or sub-occlusive lesion in the left an- terior descending, circumex, or right coronary artery. Blood samples were withdrawn at the time of reperfusion via an arterial catheter into PAXgene RNA tubes (BD Biosciences, Erembodegem, Belgium). Left ventricular (LV) ejection fraction (EF) was determined after 4 months using echocardiography. This time-point was chosen to ensure the completion of LV remodeling which dictates whether the heart will recover properly or show signs of dysfunction. The protocol has been approved by the ethics committee and the national committee for data protection of Luxembourg. All patients signed an informed consent. Consecutive patients were enrolled in the present study. 2. 2. Measurement of gene expression 2. 2. 1. RNA extraction Total RNA was extracted from PAXgene tubes with the PAXgene blood RNA kit (Qiagen, Venlo, Netherlands) as described by the manufacturer. Extracted RNA was puri- ed and concentrated using the RNeasy MinElute kit (Qiagen). On-column DNase I treatment (Qiagen) was undertaken to digest potential contaminating genomic DNA. After extraction, RNA was quantied with the ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, USA). RNA quality was evaluated with the 2100 Bioanalyzer apparatus (Agilent Technologies, Massy, France) and the RNA 6000 Nano chips. 2. 2. 2. Reverse-transcription and quantitative PCR 1 g of total RNA was reverse-transcribed using the Superscript II RT kit (Life technol- ogies, Belgium). Absence of contaminating genomic DNA was checked using controls with RNA but lacking reverse transcriptase. PCR was performed in a CFX96 thermocycler with the IQ SYBR Green Supermix (BioRad, Nazareth, Belgium). PCR primers were de- signed with the Beacon Designer software (Premier Biosoft, USA). The housekeeping gene SF3A1 was used for normalization purposes. The choice of SF3A1 has been previously ratio- nalized [18]. For each gene measurement, a melting curve analysis and the sequencing of PCR products allowed attesting for the specicity of the amplication. An inter-run calibra- tor was used to normalize the variations between PCR plates. Gene expression levels were calculated by the relative quantication method (Ct) using the CFX Manager 2. 1 soft- ware which takes into account primer efcacy (Bio-Rad). Primer sequences, hybridization temperatures and PCR efciencies are provided in Table 3 (Supplementary data). 2. 3. Statistical analyses All statistical analyses started with a Shapiro-Wilk test to assess data normality. t-Test and MannWhitney test were used to compare two groups of continuous variables follow- ing a Gaussian or non-Gaussian distribution, respectively. The Chi-square test was used for qualitative data. The SigmaPlot v12. 0 software was used for statistical analyses. All tests were two-tailed and a P value b0. 05 was considered signicant. For prediction analyses, missing values were replaced using 100-fold multiple imputa- tion. Continuous variables were scaled to mean 0 and standard deviation 1. Expression of genes was log10-transformed. Univariate and multivariable analyses with logistic regres- sion were conducted to evaluate the ability of genes to predict LV dysfunction, either alone or in combination with various demographic and clinical parameters. Odds ratios (OR) with 95% condence intervals (CI) were calculated. The Wald chi-square test was used to measure the statistical signicance of the models. The Likelihood ratio test was used to compare 2 models. Bootstrap internal validation was used to test the robustness of the models. For each bootstrap sample, the whole model selection was performed to select the best model according to the Akaike Information Criteria (AIC). Computation of the net reclassication index (NRI) and the integrated discrimination improvement (IDI) was used for reclassica- tion analyses. All prediction analyses were performed on the R version 2. 14. 2 statistical plat- form using the packages Hmisc, PredictABEL, lmtest and bootStepAIC. 3. Results 3. 1. Study population Characteristics of the 449 MI patients enrolled in this study are presented in Table 1 (Supplementary data). Median age was 61 and 75% were males. All patients had a successful revascularization. LV func- tion was evaluated 4 months after MI and patients with an EF 40% were considered as having LV dysfunction. Of the 449 MI patients en- rolled in the study, 79 (18%) had LV dysfunction and 370 (82%) had a preserved LV function at 4-month follow-up. As compared to patients without LV dysfunction, patients with LV dysfunction were older, had higher white blood cell counts at admission, higher peak levels of CPK and cTnT, higher admission levels of NT-proBNP, and had more often type 2 diabetes. 3. 2. Gene expression levels according to LV function Expression levels of LMNB1, MMP9, TGFBR1, TNXB and LTBP4 were assessed using quantitative PCR in whole blood samples obtained at re- perfusion in 449 MI patients. Levels of LMNB1, MMP9 and TGFBR1 were up-regulated in patients with LV dysfunction (4-month EF 40%) as compared to patients with preserved LV function (4-month EF N40%). LTBP4 showed the opposite trend, being down-regulated in patients with LV dysfunction, and TNXB displayed comparable expression levels between patients with LV dysfunction and patients with preserved LV function (Fig. 1). 3. 3. Gene expression in leukocyte subsets To investigate the cellular origin of the 5 genes, neutrophils, mono- cytes and lymphocytes were isolated from the peripheral blood of healthy donors. LMNB1 and MMP9 were mostly expressed in neutro- phils, TNXB and LTBP4 were predominant in monocytes and lympho- cytes, and TGFBR1 was expressed at a similar level in all cell types (Fig. 1 in the Online Supplement). 3. 4. Univariate analyses We rst determined the ability of the 5 genes individually to predict LV dysfunction (4-month EF 40%) using univariate logistic regression. The 5 genes were signicant univariate predictors of LV dysfunction with odds ratios (OR) [95% condence intervals (CI)] of 1. 40 [1. 12 1. 74], 0. 75 [0. 570. 98], 1. 35 [1. 071. 69], 1. 43 [1. 151. 79] and 1. 26 [1. 021. 57] for LMNB1, LTBP4, MMP9, TGFBR1 and TNXB, respectively (Fig. 2). 30 A. Boileau et al. / International Journal of Cardiology 254 (2018) 2835 Fig. 1. Expression levels of 5 genes in 449 acute MI patients. Expression levels of LMNB1, MMP9, TGFBR1, TNXB and LTBP4 were assessed using quantitative PCR in whole blood samples obtained at reperfusion in 449 acute MI patients. Box-plots show the expression levels according to the EF at 4-month follow-up, patients with an EF 40% being considered as having LV dysfunction (n 79) and patients with an EF N 40% being considered as having a preserved LV function (n 370). 3. 5. Multivariable analysis We conducted multivariable analysis including the following pa- rameters entered into a clinical model : age, gender, body mass index (BMI), diabetes, hypertension, hypercholesterolemia, white blood cells (WBC), MI type (anterior vs inferior), smoking, previous MI, ischemic time (delay between chest pain onset and reperfusion), troponin T, CPK and N-terminal proBNP (Nt-proBNP). As shown in Fig. 3A, in this clinical model, age and CPK were signicant predictors of LV dysfunc- tion. We then entered the 5 genes into the clinical model and we ob- served that LTBP4, TGFBR1 and TNXB were also signicant predictors of LV dysfunction (Fig. 3B). TGFBR1 and TNXB showed positive associa- tions with the risk of LV dysfunction (OR [95% CI] of 1. 68 [1. 112. 53] and 1. 41 [1. 041. 90], respectively) while LTBP4 showed the opposite relationship (OR [95% CI] of 0. 66 [0. 470. 93]), consistently with the gene expression data displayed in Fig. 1. 3. 6. Selection of the optimal gene panel To isolate the panel of genes necessary and sufcient to provide the optimal incremental predictive value, we calculated the AIC of the clinical model with each combination of 1 to 5 of the 5 genes. The use of the AIC instead of the widespread area under the curve allows for adjusting for the multiplication of variables entered in the predictive model, thus avoiding model overtting. A lower AIC indicates a better model t. As shown in Fig. 4A, a panel containing TNXB, TGFBR1 and LTBP4 provided the lowest AIC (383 vs 398 for the clinical model), and therefore the opti- mal predictive value. The difference between the clinical model only and A. Boileau et al. / International Journal of Cardiology 254 (2018) 2835 31 Fig. 2. Univariate analyses. The ability of 5 genes to predict LV dysfunction (4-month EF 40%) was determined using univariate logistic regression in 449 acute MI patients. Odds ratios with 95% condence intervals are shown. X axis is in log scale. the clinical model with the 3-gene panel was signicant (p 8E5, like- lihood ratio test). Adding the 3 genes to the clinical model resulted in a NRI of 0. 45 [0. 220. 69], p 2E4 and an IDI of 0. 05 [0. 020. 08], p 1E 3. Table 2 (Supplementary data) provides the details of the statistical analyses for the clinical model alone and with each combina- tion of genes. To verify that the 3 genes TNXB, TGFBR1 and LTBP4 were necessary to reach the optimal predictive value, we carried out bootstrap internal val- idation. Through a random resampling of patients, this method allows to evaluate models robustness. Among the 150 sample iterations performed, 91 (61%) containing the 3 genes were selected to generate the prediction model with the lowest AIC, attesting for the necessity to add the 3 genes to the clinical model to reach the highest predictive value (Fig. 4B). 4. Discussion In the present study, we conrmed the potential of gene expression proles in the blood to predict LV dysfunction after MI. We identied a panel of 3 genes able to improve the prediction over traditional risk factors. The 5 genes investigated here were selected from our past studies [5, 6, 8] which aimed at discovering novel biomarkers of LV remodeling after MI through systems-based approaches [9]. The impact of these stud- ies was limited by small sample size and their ndings needed conrma- tion. From the different genes found to be associated with LV remodeling in these studies, 5 genes were selected for the present validation study. The gene LMNB1 encodes the lamin B1 protein. Lamins, dened as type V intermediate lament proteins, are the main structural compo- nents of the nucleus and contribute to the mechanical features of this or- ganelle and of the entire cell [19]. In addition, lamins have been shown to modulate chromatin organization [20], transcription [21], DNA repair [22] and can mediate nucleo-cytoskeletal connections [23]. Although an association of lamins A with dilated cardiomyopathy has been report- ed [24], whether LMNB1 is involved in cardiac disorders is unknown. MMP9 encodes the matrix metalloproteinase 9, a gelatinase which is re- leased in large amounts by neutrophils and macrophages after MI and whose plasma levels are associated with LV remodeling after MI [25, 26]. TGFBR1 is coding for the receptor of TGFB1 and activation of the TGFB1-TGFBR1 axis triggers a switch from inammation to brosis [27], which is consistent with the higher levels of TGFBR1 in patients with LV dysfunction. LTBP4 encodes the latent TGF protein (LTBP) 4 which belongs to LTBP/brillin glycoproteins family [28] and is mainly expressed in the heart, skeletal and smooth muscles. LTBP4 controls TGF signaling by sequestrating TGF in the extracellular matrix under its inactive form [29]. This sequestration prevents its interaction with cell surface receptors. The proteolysis of LTBPs leads to the release of the active form of TGF and subsequently to the induction of the related-cell signaling pathways. In addition, LTBPs contribute to the as- sembly and secretion of TGF [30]. Polymorphisms in LTBP4 have been reported to be associated with several disorders including dilated cardio- myopathy [29]. TNXB encodes the tenascin XB protein, a member of the family of tenascins [31] which are large extracellular matrix proteins. In human, TNXB deciency is associated with Ehlers-Danlos syndrome, a connective tissue disorder characterized by hypermobility, vascular fra- gility and poor wound healing [32]. TNXB deciency regulates collagen metabolism in skin and may be responsible for the reduced number of collagen brils observed in this disease [33]. It is thought that TNXB de- ciency may confer cardiovascular protection by inhibiting aortic stiff- ness and by preventing coronary luminal obstruction [34], a hypothesis consistent with the observation that mice decient for TNXB had a higher ejection fraction after alcohol-induced cardiomyopathy than wild-type mice [35]. 32 A. Boileau et al. / International Journal of Cardiology 254 (2018) 2835 Fig. 3. Multivariable analyses. Multiple logistic regression was conducted to address the association of clinical variables and genes with LV dysfunction (4-month EF 40%). A. Multivariate clinical model including clinical parameters and cardiac biomarkers. B. Multivariate model with clinical parameters and the 5 genes. Odds ratios with 95% condence intervals are shown. X axis is in log scale. Together with the known roles of blood cells in cardiac healing after MI [1113] and with the observation that gene expression proles of blood cells correlate with the extent of coronary artery disease [15] and are linked to LV remodeling in animal models [14], our data suggest that the 3 genes TGFBR1, LTBP4 and TNXB may functionally regulate LV remodeling. However, this speculation requires further mechanistic investigations. From a statistical perspective, we used previously developed methods [36, 37] allowing for the isolation of combinations of biomarkers provid- ing optimal predictive values. As mentioned earlier, the use of the AIC is A. Boileau et al. / International Journal of Cardiology 254 (2018) 2835 33 Fig. 4. Selection of the optimal gene panel. Multiple logistic regression was conducted to address the association of clinical variables and genes with LV dysfunction (4-month EF 40%). A. The Akaike Information Criteria (AIC) was calculated for the clinical model only and after adding each combination of 1 to 5 genes. A lower AIC indicates a better model t. B. Bootstrap internal validation presenting the percentage of times a combination of genes which was selected as providing the best improvement of the prediction of the clinical model over 150 bootstrap iterations. All variables displayed in Fig. 3A were entered in the clinical model. paramount for the analyses conducted in this study since it allows adjusting for the multiplication of variables entered in the predictive models to avoid model overtting. The traditionally used area under the receiver operating characteristic curve is sensitive to the multiplica- tion of input variables and can lead to erroneous results due to overtting. The use of bootstrap internal validation allowed isolation of the smallest panel of genes providing the highest predictive value. This method com- plements the comparison of AIC between different models and adds an- other level of conrmation that the 3 genes TNXB, TGFBR1 and LTBP4 were necessary and sufcient to reach the best predictive value. From a clinical perspective, as the prevalence of HF [1] and the per- centage of patients developing LV remodeling leading to HF after MI is 34 A. Boileau et al. / International Journal of Cardiology 254 (2018) 2835 still high [38], nding novel strategies to accurately identify high risk patients at an early stage after MI would represent a major break- through towards precision healthcare. We [10, 18, 39] and others [14, 15] have shown that gene expression proles of blood cells represent a non-invasive source of novel early biomarkers of cardiac disease. In vitro diagnostic assays based on gene expression proles of blood cells have already been developed for the diagnosis of coronary artery dis- ease [16]. Presuming the 3-gene panel of the present study can be fur- ther validated in independent patient populations, it could constitute the basis for the development and clinical application of a novel assay for outcome prediction after MI. This assay will have to be accurate, au- tomated, and cost-effective. Considering the potential benets of starting treatments to prevent HF development at an early stage after AMI, the assay will allow tailoring healthcare and reducing costs. This study has some limitations. Firstly, the selection of the 5 genes was arbitrary, although based on signicant associations with LV dysfunction after MI in discovery studies, moderate to high expression levels and presence in human cardiac biopsies from fail- ing hearts. It cannot be excluded that other genes may provide a fur- ther incremental predictive value if combined with the 3-gene panel identied in the present study. Secondly, a causal relationship be- tween the 3 genes and LV dysfunction is purely speculative and de- serves further investigation. Furthermore, angiographic indices of coronary microvascular obstruction and data on the use of thrombus aspiration, which are associated with outcome after reperfusion, were not available for the present study. This crucial information has to be considered as a relevant limitation for the interpretation of the study results and its clinical application. Lastly, LV volumes which could have been used as other indices of ventricular remodel- ing were not available for the study. In conclusion, a panel of 3 genes expressed in whole samples after MI has been identied and may aid in risk stratication after MI. The clinical usefulness of this nding remains to be addressed in prospective studies. Funding Sources A. B. is funded by the National Research Fund (grant # AFR 8832104). T. L. is funded by the Ministry of Higher Education and Research and the Society for Research on Cardiovascular Diseases of Luxembourg. L. Z. ; M. V. and Y. D. are supported by the National Research Fund and the Ministry of Higher Education and Research of Luxembourg. Author contributions A. B. , M. V. and T. L. performed the acquisition of the data. A. B. , T. L. and L. Z. performed the analysis and the interpretation of the data. Y. D. drafted and edited the manuscript. All the authors approved the manuscript. Disclosures None. Conicts of interest None. Appendix A. Supplementary data Supplementary data to this article can be found online at org/10. 1016/j. ijcard. 2017. 10. 109. References [1] N. Townsend, L. Wilson, P. Bhatnagar, K. Wickramasinghe, M. Rayner, M. Nichols, Cardiovascular disease in Europe : epidemiological update 2016, Eur. Heart J. 37 (42) (2016) 32323245. [2] C. M. Dewey, K. M. Spitler, J. M. Ponce, D. D. Hall, C. E. 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Neutrophils were isolated by Ficoll gradient (MP Biomedicals, Illkrich, France) followed by dextran sedimentation (Amersham, Rosendaal, The Netherlands) and monocytes were purified from peripheral blood mononuclear cells isolated by Ficoll gradient in LeucoSep tubes (Greiner Bio One, Wemmel, Belgium) by negative selection using the Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Germany). Non-monocyte cells, i. e. T cells, B cells, natural killer cells, dendritic cells and basophils retained on the column by the antibody cocktail were recovered and considered as being predominantly lymphocytes. 1 Supplementary Figure 1 Legend : Gene expression levels in leukocyte subsets. Peripheral blood was obtained from healthy donors (n 2) and different cell populations were isolated as described in Methods. Expression levels were assessed by quantitative PCR using SF3a1 as a reference gene for normalization. 2 Supplementary table 1. Characteristics of the population of MI patients. Age, median (range) Sex, male, n (%) Body mass index, median (range) WBC, median (range), x109/L Biomarkers, median (range) CPK, U/L cTnT, g/L Nt-proBNP, pg/mL Ischemic time, 1 24h, median (range) MI type, 1 anterior, n (%) 4-month EF, median (range) Medical history, n (%) Previous MI Diabetes Hypertension Hypercholesterolemia Smoking Pre-admission medications, n (%) Statins Aspirin -Blockers Angiotensin inhibitors ACE inhibitors Clopidogrel Nitrates Calcium antagonists Diuretics All EF 40% EF > 40% p-value (n 449) (n 79) (n 370) (EF 40% vs. EF > 40%) 61 (30-91) 339 (75) 27 (18-51) 10. 7 (1. 1-29) 65 (37-89) 59 (74) 28 (19-51) 12 (4. 8-29) 60 (30-91) 280 (80) 27 (18-47) 10. 4 (1. 11-29) 3163 (34-12096) 1344 (76-13028) 6. 99 (0. 03-26. 93) 3. 44 (0. 01-25. 66) 169 (10. 55-35000) 676 (5-13977) 0. 15 (0. 04-0. 62) 1484 (34-13038) 3. 82 (0. 01-26. 93) 209 (5-35000) 0. 15 (0. 03-0. 94) 348 (77) 50 (15-89) 66 (83) 39 (15-40) 51 (11) 98 (22) 217 (48) 199 (44) 205 (45) 89 (20) 85 (19) 94 (21) 51 (11) 56 (12) 24 (5) 18 (4) 15 (3) 13 (3) 11 (14) 26 (33) 41 (52) 33 (41) 33 (41) 18 (22) 13 (16) 17 (21) 10 (12) 14 (17) 4 (5) 3 (4) 2 (2) 3 (4) 0. 15 (0. 03-0. 94) 282 (76) 50 (42-89) 40 (11) 72 (20) 176 (50) 166 (47) 172 (49) 71 (20) 72 (20) 77 (22) 41 (11) 42 (12) 20 (5) 15 (4) 13 (3) 10 (3) 0. 011 0. 28 0. 55 0. 58 0. 68 0. 56 0. 025 0. 80 0. 38 0. 26 0, 64 0, 53 1 0, 84 0, 19 1 1 1 0. 7 3 Discharge medications, n (%) Statins Aspirin -Blockers Angiotensin inhibitors ACE inhibitors Clopidogrel Nitrates Calcium antagonists Diuretics NYHA classification, n (%) Class I Class II Class III Class IV 391 (87) 421 (93) 396 (88) 32 (7) 281 (62) 399 (88) 31 (7) 16 (3) 87 (19) 321 (71) 86 (19) 5 (1) 0 61 (77) 64 (81) 66 (83) 6 (7) 47 (59) 59 (74) 3 (4) 1 (1) 27 (34) 46 (58) 19 (24) 3 (4) 0 330 (89) 357 (96) 330 (89) 26 (7) 234 (63) 340 (91) 28 (7) 15 (4) 60 (16) 275 (74) 67 (18) 2 (0. 5) 0 0. 008 0. 178 0. 811 0. 525 0. 32 0. 326 0. 005 0. 269 0. 04 Left ventricular (LV) dysfunction was determined by a 4-month ejection fraction (EF) 40%. White blood cell (WBC) count and N-terminal pro-brain natriuretic peptide (Nt-proBNP) were determined at admission. Creatine phosphokinase (CPK), cardiac troponin T (cTnT) and high-sensitivity C-reactive protein (CRP) are peak values. Ischemic time delay between chest pain onset and reperfusion. MI type anterior vs. inferior. New-York Heart Association (NYHA) classification was determined at the same time than left ventricular dysfunction recording. 4 Supplementary table 2. Incremental prognostic value of 5 genes to a clinical model. Added gene(s) Wald chi AIC square test p-value None LTBP4 TGFBR1 TNXB LMNB1 LTBP4 TGFBR1 TNXB LTBP4 MMP9 TGFBR1 TNXB LMNB1 LTBP4 MMP9 TGFBR1 TNXB LTBP4 TGFBR1 TGFBR1 TNXB LTBP4 MMP9 TGFBR1 MMP9 TGFBR1 TNXB LMNB1 LTBP4 TGFBR1 LMNB1 TGFBR1 TNXB LMNB1 LTBP4 TNXB LTBP4 MMP9 TNXB MMP9 TNXB LMNB1 LTBP4 MMP9 TGFBR1 LTBP4 TNXB LMNB1 LTBP4 MMP9 TNXB LMNB1 MMP9 TGFBR1 TNXB LMNB1 TNXB TGFBR1 LMNB1 MMP9 TNXB TNXB MMP9 TGFBR1 LMNB1 TGFBR1 LMNB1 LTBP4 LMNB1 MMP9 TGFBR1 LMNB1 398 383 385 385 386 387 387 388 389 389 389 389 390 390 390 391 391 391 391 391 391 392 393 393 395 395 396 1. 5E-04 1. 4E-05 2. 3E-05 2. 6E-05 4. 3E-05 2. 2E-05 3. 0E-05 4. 1E-05 4. 5E-05 3. 8E-05 5. 4E-05 5. 4E-05 4. 8E-05 4. 5E-05 7. 1E-05 5. 2E-05 7. 1E-05 7. 7E-05 6. 9E-05 5. 1E-05 7. 2E-05 6. 8E-05 8. 4E-05 9. 1E-05 1. 0E-04 1. 5E-04 1. 3E-04 LRT p-value 8. 3E-05 2. 2E-04 2. 3E-04 5. 4E-04 4. 4E-04 4. 6E-04 1. 2E-03 1. 3E-03 1. 3E-03 1. 5E-03 1. 8E-03 2. 3E-03 2. 3E-03 2. 9E-03 2. 8E-03 3. 4E-03 3. 4E-03 3. 2E-03 2. 6E-03 4. 7E-03 4. 0E-03 1. 0E-02 1. 1E-02 2. 0E-02 2. 7E-02 3. 6E-02 NRI 95% CI 0. 45 0. 45 0. 43 0. 43 0. 48 0. 48 0. 46 0. 41 0. 44 0. 44 0. 36 0. 42 0. 22 0. 48 0. 35 0. 36 0. 36 0. 28 0. 38 0. 25 0. 18 0. 32 0. 38 0. 42 0. 36 0. 28 0. 22-0. 69 0. 21-0. 69 0. 19-0. 67 0. 19-0. 67 0. 24-0. 72 0. 24-0. 72 0. 22-0. 70 0. 17-0. 65 0. 20-0. 68 0. 20-0. 68 0. 12-0. 60 0. 18-0. 66 -0. 02-0. 46 0. 24-0. 71 0. 11-0. 59 0. 12-0. 60 0. 12-0. 60 0. 04-0. 52 0. 14-0. 62 0. 01-0. 49 -0. 06-0. 42 0. 08-0. 56 0. 14-0. 62 0. 18-0. 66 0. 12-0. 60 0. 03-0. 52 NRI p-value 2. 0E-04 2. 3E-04 4. 7E-04 3. 9E-04 7. 0E-05 8. 8E-05 1. 5E-04 7. 8E-04 3. 0E-04 3. 0E-04 3. 5E-03 6. 6E-04 7. 0E-02 8. 5E-05 4. 6E-03 3. 3E-03 3. 4E-03 2. 4E-02 2. 0E-03 3. 9E-02 1. 3E-01 8. 6E-03 2. 0E-03 6. 0E-04 3. 0E-03 2. 5E-02 IDI 95% CI 0. 05 0. 05 0. 05 0. 05 0. 04 0. 04 0. 04 0. 04 0. 04 0. 04 0. 04 0. 04 0. 03 0. 04 0. 03 0. 04 0. 04 0. 03 0. 02 0. 03 0. 02 0. 02 0. 02 0. 02 0. 02 0. 01 0. 02-0. 09 0. 02-0. 09 0. 02-0. 09 0. 02-0. 09 0. 01-0. 06 0. 01-0. 07 0. 01-0. 06 0. 01-0. 07 0. 01-0. 06 0. 01-0. 07 0. 01-0. 07 0. 01-0. 06 0. 01-0. 06 0. 01-0. 06 0. 00-0. 06 0. 01-0. 07 0. 01-0. 07 0. 00-0. 05 0. 00-0. 04 0. 01-0. 06 0. 00-0. 04 0. 00-0. 04 0. 00-0. 04 0. 00-0. 04 0. 00-0. 04 0. 00-0. 02 5 IDI p-value 1. 3E-03 1. 2E-03 1. 2E-03 1. 1E-03 3. 8E-03 6. 6E-03 3. 3E-03 6. 2E-03 3. 4E-03 6. 6E-03 8. 6E-03 8. 9E-03 1. 9E-02 3. 0E-03 2. 2E-02 7. 0E-03 6. 2E-03 2. 2E-02 2. 0E-02 1. 5E-02 6. 8E-02 1. 9E-02 2. 0E-02 5. 5E-02 1. 9E-02 1. 3E-01 LMNB1 LTBP4 MMP9 LTBP4 MMP9 MMP9 LMNB1 MMP9 LTBP4 396 397 397 397 397 1. 5E-04 1. 2E-04 1. 1E-04 1. 5E-04 1. 2E-04 4. 1E-02 5. 4E-02 5. 7E-02 6. 6E-02 7. 2E-02 0. 38 0. 16 0. 29 0. 37 0. 19 0. 14-0. 61 -0. 08-0. 40 0. 05-0. 53 0. 13-0. 61 -0. 05-0. 43 2. 1E-03 1. 9E-01 1. 8E-02 2. 2E-03 1. 3E-01 0. 02 0. 01 0. 01 0. 01 0. 01 0. 00-0. 04 0. 00-0. 03 0. 00-0. 02 0. 00-0. 02 0. 00-0. 02 4. 8E-02 7. 1E-02 1. 2E-01 9. 0E-02 2. 0E-01 The clinical model includes all variables displayed in Figure 3A. The Akaike Information Criteria (AIC) was calculated for each model ; the lower the AIC the better the model fit. The Wald chi-square test addresses the model fit. The likelihood ratio test (LRT) compares the clinical model only to the clinical model with each combination of genes. The net reclassification index (NRI) and the integrated discrimination improvement (IDI) assess the reclassification value of each combination of genes to the clinical model only. 6 Supplementary table 3. PCR primers. Gene NCBI accession number Primer Forward Primer Reverse Hybridization Temperature (C) PCR efficiency (%) LTBP4 NM 001042544. 1 ( 2 variants) LMNB1 NM 001198557. 1 ( 1 variant) GCTGCCTCCCCGCTGTGC GGTGCGTGGGTGCGAATCC 58 AAGCCGCATGAGAATTGAGAG TTGATCCCTTATTTCCGCCATC 60 MMP9 NM 004994. 2 AACTACGACACCGACGAC CAGGCGGAGTAGGATTGG 62 TNXB NM 019105. 6 ( 1 variant) GTGGACCATCAGGGAGTGAG CTGGGGAGCGAAAGTTTCTT 56 TGFBR1 NM 001306210. 1 ( 2 CTTATTATGATCTTGTACCTTCTG GGCATACCAACATTCTCT 58 variants) SF3A1 NM 005877. 5 GATTGGCCCCAGCAAGCC TGCGGAGACAACTGTAGTACG 60 100 96. 7 107 96 98. 7 96. 6 LTBP4 has 3 variants, LMNB1 has 2 variants, TNXB has 2 variants and TGFBR1 has 3 variants. Primers were designed to encompass all transcripts. Accession numbers indicated are those of the longest transcripts. 7 Etude N2 : Différences hommes-femmes au niveau de la valeur prédictive post-IDM des biomarqueurs cardiaques Les biomarqueurs du stress et de l'ischémie myocardique NT-proBNP, cTns et CK ont montré une capacité limitée à prédire le RVG post-IDM [2]. Malgré les différences existant au niveau de ces biomarqueurs entre les femmes et les hommes [3, 10, 11, 85, 189], leur association avec le RVG n'a pas été étudiée chez les femmes et les hommes distinctement. Dans notre cohorte LUCKY, nous avons comparé l'association de ces biomarqueurs avec la dysfonction ventriculaire entre les deux sexes. Pour ce faire, nous avons inclus 608 patients avec IDM de la cohorte LUCKY. Le NT-proBNP a été mesuré dans le sérum prélevé au moment de la revascularisation. Les valeurs maximales plasmatiques de cTnT et de CK ainsi que les concentrations de la hs-TnT, mesurées au moment de la revascularisation, ont été considérées pour cette étude. Les patients ont été répartis en fonction de leur FE mesurée à 4 mois par échocardiographie en 2 groupes : FEr (FE40%) et FEp (40%). Les femmes représentaient 23% de la cohorte et étaient plus âgées que les hommes (70 ans versus 57 ans, p La comparaison de l'historique médical entre les deux sexes n'a pas montré de différences significatives. Néanmoins, les femmes tendent à avoir plus d'hypertension, de diabète et d'hypercholestérolémie. De plus, la proportion des patients ayant un antécédent d'IDM était plus élevée parmi les hommes (11% versus 5%, p 0, 034). 33% de femmes présentaient une IC à 4 mois (NYHA 2) contre seulement 16% d'hommes (p Les niveaux de cTnT et de CK étaient comparables entre les femmes et les hommes alors que le NT-proBNP était plus élevé chez les femmes. Quand cette comparaison a été réalisée séparément dans chaque groupe de FE, la différence au niveau du NT-proBNP n'a persisté que dans le groupe avec FEp. La capacité des biomarqueurs à prédire la FV a été étudiée par régression logistique à l'aide d'un modèle multivarié incluant les variables cliniques et démographiques connues 99 pour être associées avec l'IDM et le RVG (âge, sexe, IMC, diabète, hypertension, hypercholestérolémie, tabac, antécédent d'IDM, temps ischémique, type d'IDM et nombre de leucocytes). NT-proBNP et CK étaient des prédicteurs significatifs de la FV dans la cohorte entière (hommes et femmes ensemble). L'association de ces deux biomarqueurs a été observée uniquement chez les hommes alors que chez les femmes, seule la cTnT était significative. La hs-TnT, mesurée au moment de la revascularisation, n'était pas associée avec la dysfonction ventriculaire aussi bien chez tous les patients que chez les femmes et les hommes séparément. Nous avons également observé que le nombre de leucocytes était un prédicteur indépendant de la dysfonction ventriculaire uniquement chez les hommes, alors que le diabète était associé avec la dysfonction ventriculaire spécifiquement chez les femmes. L'interaction entre le sexe, les biomarqueurs cardiaques et la FV n'était pas significative. Néanmoins, l'association des leucocytes et du diabète avec la dysfonction ventriculaire était significativement influencée par le sexe (p 0, 003 et 5, 7 x 10-5 respectivement). L'AIC a été utilisée pour évaluer la valeur additive des trois biomarqueurs au modèle clinique. L'AIC a été calculé pour le modèle clinique seul et après l'addition des trois biomarqueurs un par un ou simultanément. Dans toute la cohorte ainsi que dans le groupe des hommes, l'addition des trois biomarqueurs permettait la meilleure amélioration de prédiction. Chez les femmes, la meilleure prédiction a été observée par l'addition de la cTnT seule. L'association des biomarqueurs cardiaques avec le risque de mortalité post-IDM a également été étudiée. Tout d'abord, les courbes Kaplan-Meier ont été établies afin de comparer la survie entre les hommes et les femmes pendant les 6 mois suivant un IDM. Cette analyse a montré une mortalité plus élevée parmi les femmes (p 0, 01). Un modèle des risques proportionnels de Cox a été utilisé afin d'analyser l'influence du sexe sur le risque de mortalité. Le sexe féminin était associé à une mortalité plus élevée (HR [IVC 95%] 0, 34 [0, 140, 79], p 0, 012), bien que cette association fut perdue après ajustement avec les mêmes variables que la régression logistique. L'ajustement avec l'âge seul a suffi pour masquer l'association entre le sexe et la mortalité. De façon similaire, l'association des trois biomarqueurs avec la mortalité, significative lors des analyses univariées, a été perdue après ajustement, et ce indépendamment du sexe. 100 En conclusion, cette étude a montré, dans notre cohorte nationale d'IDM, que les biomarqueurs cardiaques NT-proBNP, cTnT et CK ne sont pas équitablement associés avec la FV à 4 mois après un IDM chez les femmes et les hommes. 101 Sex-differences in biomarkers of outcome after acute myocardial infarction Torkia Lalem MSc and Yvan Devaux PhD Cardiovascular Research Unit, Luxembourg Institute of Health, Luxembourg Address correspondence to Yvan Devaux, Cardiovascular Research Unit, Luxembourg Health Institute, L1526 Luxembourg. Tel : 352 26970300. Fax : 352 26970396. Email : yvan. devaux@lih. lu Short title : Sex-specific markers after acute myocardial infarction 1 Abstract Background- Left ventricular (LV) remodeling after acute myocardial infarction (AMI) is an indicator of poor prognosis and heart failure. Cardiac stress markers are associated with LV remodeling, yet whether this association is influenced by sex has been poorly addressed. The present study aimed to evaluate the association between cardiac biomarkers and outcome after AMI in a sex-specific manner. Methods- Six hundred and eight AMI patients from a national registry were included in this study. Reperfusion levels of N terminal-pro brain natriuretic peptide (NT-proBNP), and peak levels of creatine kinase (CK) and cardiac troponin T (cTnT) were measured. The primary end- point was LV dysfunction as assessed by an ejection fraction (EF) 40% at median 4 months. The secondary end-point was all-cause mortality at 6 months. Results- CK and cTnT levels were comparable between women and men, and levels of NT- proBNP were higher in women than men (481. 1pg/ml vs. 160. 2pg/ml, p NT-proBNP, CK and leukocytes were significantly associated with LV dysfunction in men, even after adjustment with clinical and demographic variables. cTnT and diabetes were the only independent predictors of LV dysfunction in women. All-cause mortality at 6 months was higher in women than men (p 0. 01), partly because women were older at the time of AMI. None of the 3 biomarkers were independent predictors of mortality, in both sexes. Conclusion- The association between cardiac biomarkers and LV dysfunction after AMI differs between women and men. These data strengthen the need for sex-specific biomarkers or for a use of cardiac biomarkers in a sex-specific manner. Keywords- myocardial infarction ; left ventricular function ; sex ; cardiac biomarkers 2 Introduction Contrarily to major beliefs, cardiovascular disease (CVD) kills more women than men [1]. A majority of deaths from CVD is attributable to coronary heart disease among which acute myocardial infarction (AMI) plays a predominant role. The old concept of AMI as a typical man's disease has been challenged by the observation that the prevalence of AMI is only slightly higher in men than women [2]. Past studies showed several sex-differences in AMI risk factors and pathophysiology [3, 4]. In terms of outcome after AMI, data from different countries showed higher mortality rates in females than men [5, 6], which might be explained by comorbidities and older age of women. Left ventricular (LV) remodeling occurring after AMI is an indicator of poor prognosis, is associated with the development of heart failure (HF), and eventually leads to death [7]. Sex differences in LV remodeling have been observed in end- stage HF patients with ischemic etiology. LV remodeling results in a higher heart-body index and greater myocyte hypertrophy in men than female [8]. Women who present with acute coronary syndrome are more likely than men to be misdiagnosed [9], which could be explained by sex-specificities in biomarkers used to diagnose AMI. Cardiac troponin (cTn), the cornerstone biomarker of AMI diagnosis, and creatine kinase (CK), are secreted at lower levels in women compared with men [10]. While cTn and CK are generally moderately associated with outcome after AMI, natriuretic peptides including N terminal-pro brain natriuretic peptide (NT-proBNP) show some potential as indicators of LV remodeling and HF development [11]. Lower levels of cTn and CK, and higher levels of BNP, in women compared to men were observed in acute coronary artery syndrome patients enrolled in the Treat Angina with Aggrastat and Determine Cost of Therapy with an Invasive or Conservative Strategy (TACTICS)-TIMI 18 study [12]. Furthermore, in the Get With The Guideline-Heart Failure Registry, women with HF had higher levels of BNP than men [13]. Despite the now well-known sex differences in levels of cTn, CK and BNP, the value of these 3 biomarkers to predict LV dysfunction after AMI has not been addressed in a sex-specific manner. In the present study, we aimed to test whether cTn, CK and NT-proBNP are equally associated with LV dysfunction and mortality after AMI in women and men. 4 Materials and Methods Patients Six hundred and eight patients from a national AMI registry of 962 patients conducted at the Institut National de Chirurgie Cardiaque et de Cardiologie Interventionnelle and the Department of Cardiology of the Centre Hospitalier de Luxembourg between February 2006 and December 2012 were enrolled in this study. The protocol has been approved by the ethics committee and the national committee for data protection of Luxembourg and complies with Helsinki declaration. All patients signed a written informed consent. All patients had an AMI and were treated with percutaneous coronary intervention. Of the 962 patients of the registry, 608 had an ischemic time (i. e. delay between chest pain onset and reperfusion) less than 12h and were included in the analysis. Baseline characteristics of the patients collected at baseline included demographic characteristics, biomarkers, medical history, and drug treatments before the onset of AMI (Table 1). ST-elevation myocardial infarction (STEMI) and non ST-elevation myocardial infarction (NSTEMI) were defined as previously [14]. Patients were followed up at median 4 months after AMI. The primary endpoint of the study was LV dysfunction at 4 months and the secondary endpoint was all cause mortality at 6 months. Echocardiographic examinations were performed at follow-up, and the ejection fraction (EF) was determined using the biplane Simpson's method. Patients were dichotomized in reduced EF (rEF, EF40%) and preserved EF (pEF, 40%) groups. HF was defined by clinical evidence according to New York Heart Association (NYHA) classification. Biomarkers measurement Venous blood samples were drawn at presentation and twice daily thereafter to determine plasma peak values of the cardiac markers CK and cTnT. cTnT was measured using 5 a fourth generation assay from Roche performed on the Cobas e601 system with a detection limit of 0. 01g/L and a concentration of 0. 03g/L reproducibly measured with a CV below 10%. CK activity was measured with a Roche IFCC-recommended method on a Cobas c501 instrument. Serum levels of NT-proBNP were measured at the time of reperfusion using the Elecsys 2010 analyzer that uses an electrochemiluminescence immunoassay (Roche Diagnostics). 1pg/ml was the detection limit of the assay. Plasma levels of high-sensitivity cardiac troponin T (hs-cTnT) were assessed at reperfusion in 315 patients (among which 23% were women) using the Roche high sensitivity assay performed on the Cobas e601 system with a detection limit of 0. 003 g/L, a 99th-percentile cutoff point of 0. 014 g/L, and a CV of at 0. 013 %g/L. Statistical analysis Two groups of data following a normal distribution were compared with the t-test and the Mann-Whitney test was used for not normally-distributed data. Two groups of categorical variables were compared using Fisher's exact test. The SigmaPlot v12. 0 software was used for these analyses. Primary end-point, LV dysfunction. The association between biomarkers and LV dysfunction was assessed using logistic regression. LV dysfunction (1 value in logistic regression) was determined by a 4-month EF 40% (rEF) while patients with a 4-month EF >40% (pEF) were classified as having a preserved LV function (0 value in logistic regression). Missing data were imputed using 100-fold multiple imputation. Continuous variables were log2-transformed and scaled to mean 0 and standard deviation 1. Both univariate and multivariable analyses were conducted. Odds ratios (OR) with 95% confidence intervals (CI) were calculated. To determine the incremental predictive value of biomarkers, we calculated the Akaike information criterion (AIC). Contrarily to the area under the curve, the AIC is 6 adapted to multivariable analyses by avoiding model overfitting due to the multiplication of explanatory variables. A lower AIC indicates a better model fit and an improvement of the predictive value. The likelihood ratio test was used to compare the AIC between models. These analyses were performed on the R version 3. 3. 1 statistical platform using the packages Hmisc, PredictABEL, lmtest and rms. Secondary end-point, survival. Sex-differences in 6-month all-cause mortality were assessed using Kaplan-Meier survival curves and the logRank test. Cox proportional hazards were used to model the effect of sex, age and morbidities on 6-month all-cause mortality and to evaluate the ability of cardiac biomarkers to predict this endpoint. The SigmaPlot v12. 0 software and the R version 3. 3. 1 statistical platform with the packages survival and survminer were used for these analyses. A p value < 0. 05 was considered significant. 7 Results Baseline characteristics of the patients Of the Luxembourg AMI registry accounting 962 patients, we enrolled in this study 608 patients with an ischemic time less than 12 hours and for which follow-up data were available. Baseline characteristics of these patients are shown in Table 1. 138 (23%) patients were women. Women were older than men (median 70 vs 57 year-old, p Comparison of the comorbidities between women and men did not reveal significant differences in the frequency of diabetes, hypertension, hypercholesterolemia and smoking habit. Nevertheless, men had more frequently a previous AMI than women (11% vs 5%, p 0. 034). STEMI frequency was comparable between women and men (82% vs 79%, p 0. 473). Prior to AMI, women were more often on diuretics than men (7% vs 2%, p 0. 009). No other differences in terms of pre- admission medication was observed. At median 4-month follow-up, women had more often HF as attested by a NYHA classification 2 than men (33% vs 16%, p Sex differences in biomarker levels according to LV function Peak levels of CK and cTnT and reperfusion levels of NT-proBNP were determined in 608 AMI patients. Women had comparable levels of CK and cTnT to men but had higher levels of NT-proBNP (p (Figure 1). To highlight potential sex-specific relationships between biomarker levels and LV function, we compared their levels between women and men in the pEF and rEF groups separately. CK and cTnT levels were comparable between women and men in the pEF and rEF groups. NT-proBNP levels were higher in women than men, only in the pEF group (3-fold, p (Figure 1). Sex differences in the prediction of LV dysfunction after AMI Logistic regression was used to evaluate the association between the levels of CK, cTnT and NT-proBNP, and LV dysfunction at median 4 months as assessed by an EF 40%. This 8 association was assessed in all patients and in women and men separately. In addition to biomarkers, the following clinical and demographic variables known or presumed to be associated with LV function were included in the analysis : age, BMI, sex, ischemic time, previous MI, diabetes, hypertension, hypercholesterolemia, MI type (STEMI vs. NSTEMI) and leucocytes count. In univariate analysis, the 3 biomarkers CK, cTnT and NT-proBNP were significant predictors of LV dysfunction in all patients independently of sex, as well as in men and women separately (Figure 2). In addition, age, diabetes, and leucocytes count were associated with LV dysfunction in all patients. The association between age, leucocytes counts and LV dysfunction lost significance in the women group, in which diabetes showed a strong association (OR [95% CI] 5. 11 [2. 09-12. 53] (Figure 2). After adjustment with clinical and demographic variables in multivariable analysis, NT- proBNP and cTnT remained significant predictors of LV dysfunction in all patients (Figure 3A). In women, NT-proBNP and CK lost significance and only cTnT remained significantly associated with LV dysfunction (OR [95% CI] 3. 75 [1. 25-11. 24]) (Figure 3B). In men, NT- proBNP (OR [95% CI] 1. 92[1. 44-2. 57]) and CK (OR [95% CI] 1. 70 [1. 01-2. 87]) remained significantly associated with LV dysfunction (Figure 3C). Interestingly, diabetes remained significant only in women, whereas leucocytes count remained significant only in men (Figure 3). We also assessed the association between LV dysfunction and hs-cTnT, measured at reperfusion in 315 AMI patients. Univariate analysis showed a significant association in all patients, in men and women (Supplemental Table S1). This association lost significance in multivariable analyses including the aforementioned clinical and demographic variables (Supplemental Figure S1). These results show sex differences in the association between cardiac injury markers and LV dysfunction after AMI. Since the clinical usefulness of post-AMI biomarkers relies on their ability to improve prognostication, we evaluated the incremental predictive value of NT-proBNP, cTnT and CK 9 to a clinical model including the demographic and clinical parameters included in multivariable analyses. We calculated the AIC of the clinical model, with and without biomarkers, and we compared models fit with the likelihood ratio test. As shown in Table 2, in all patients, each of the 3 biomarkers provided an incremental predictive value and the best improvement was obtained with a combination of the 3 (lowest AIC). The clinical model with the 3 biomarkers performed better than the clinical model with only NT-proBNP (AIC 564. 2 vs 579. 4, p 6. 8E- 05). In women, only cTnT provided a significant incremental predictive value. In men, the 3 biomarkers were significant and the best effect was obtained after addition of all of them. Indeed, addition of the 3 biomarkers to the clinical model resulted in a lower AIC as compared to a clinical model with NT-proBNP, which is the best single predictor in men (AIC 440. 0 vs 447. 5, p 0. 003). Adding the interaction between each biomarker and sex in the models did not produce a significant effect, for any of the biomarkers (Table 3). Diabetes and leucocytes count showed sex-biased association with LV dysfunction which persisted after adjustment with cofounders. Interaction between sex and diabetes was significant (p value 5. 7 x 10-5), showing that diabetes is associated with the risk of LV dysfunction only in women. Conversely, leucocytes are associated with the risk of LV dysfunction only in men, as attested by a significant interaction with sex (p value 0. 003). These results highlight sex differences in the association between biomarkers and LV dysfunction and support the potential of peak values of cTnT to improve the prediction of LV dysfunction in women while NT-proBNP might be more useful in men. Sex differences in the prediction of all-cause mortality after AMI Six-month mortality rate was 3. 6%. This rate was higher in women than men (7. 2% vs 2. 5%, p 0. 016). Kaplan-Meier curves confirmed that women had a lower survival than men (p 0. 01) (Figure 4A). 10 Using Cox proportional hazards, we observed that sex was a significant predictor of mortality (hazard ratio (HR) [95% CI] 0. 34 [0. 14 0. 79], p 0. 012). However, this significance was lost after adjustment for demographic and clinical variables (HR) [95% CI] 0. 53 [0. 21 1. 29], p 0. 16). Adjustment for age only was sufficient to lose the significance of the association between sex and mortality (HR) [95% CI] 0. 58 [0. 22 1. 35], p 0. 19). The ability of the 3 biomarkers to predict 6-month mortality was then addressed using Cox proportional hazards. In univariate analysis (Figure 4B), all 3 biomarkers predicted mortality in all patients and men. In women, only CK and cTnT were significantly associated with mortality. These associations lost significance after adjustment with the same set of clinical and demographic variables as for the logistic regression analysis, independently of sex. 11 Discussion Several observations regarding the relationships between sex, cardiac biomarkers and outcome after AMI have emerged from the present study. First, while the peak levels of myocyte necrosis biomarkers, cTnT and CK, were comparable between women and men after an AMI, the levels of the cardiac stress marker NT-proBNP measured at the time or reperfusion were higher in women. Second, the ability of these biomarkers to predict LV function at 4 months after AMI appeared to be influenced by sex. Indeed, while NT-proBNP showed an association with LV function only in men, cTnT was the only biomarker predicting LV dysfunction in women. Lastly, these biomarkers did not show strong associations with 6-month mortality, independently of sex. Women with MI are known to be older and present multiple cardiovascular risk factors, hypertension and diabetes mellitus being the most prevalent [4, 15]. In our study, despite that women were older than men, we observed only un-significant trends toward higher prevalence of hypertension, diabetes and hypercholesterolemia among women. This lack of significance might be assigned to the relatively lower number of women in the cohort. Interestingly, diabetes predicted LV dysfunction specifically in women. It has previously been shown that women with diabetes mellitus and coronary heart disease have a worse prognosis than their men counterpart, with higher risk of mortality and heart failure [16-18]. Furthermore, in a study including a small group of patients with metabolic syndrome, it has been shown that metabolic syndrome altered the cardiac morphology and function more in women than men [19]. Even though no difference was observed in the leukocytes between men and women (Table 1), the association of this variable with LV function was observed specifically in men. Leukocytes count has been previously shown to be associated with HF specifically in men from the general population [20]. 12 In our population of AMI patients, comparison of biomarker levels between men and women showed higher levels of NT-proBNP in women, consistently with past reports, some of them also including healthy volunteers [21, 22]. Possible explanations are the lower hemoglobin levels in women which might be related to myocardial ischemia [21], and the stimulatory effect of estrogens on natriuretic peptides [22]. Furthermore, the association of NT- proBNP with age and obesity was found to be more pronounced among women in a Dutch general population study [23]. Abdominal obesity affected more importantly NT-proBNP levels in women. In addition, this effect was more pronounced in post-menopausal women, which could result in a higher cardiovascular risk. Women with HF also have higher levels of BNP than their men counterparts [13]. The clinical use of natriuretic peptides for prognostication after AMI remains an open debate, and whether a biomarker-guided therapy might be more beneficial in women or men in this context is unknown. Several studies addressed the ability of the natriuretic peptides to predict LV remodeling after MI [11, 24-27]. Nevertheless, most of these studies included less than 100 patients and none of them were conducted in a sex-specific manner. We found in our cohort that NT-proBNP, measured at reperfusion, was an independent predictor of LV dysfunction after AMI. Furthermore, we report for the first time that NT- proBNP may be more appropriate to predict LV dysfunction after AMI in men than in women. Interestingly, NT-proBNP provided an incremental predictive value only in men. This finding is important considering the potential use of NT-proBNP for prognostication after AMI. Troponins and CK were reported to be expressed at lower levels in women with coronary disease compared to men [10] [28]. In our cohort, we did not observe significant sex- disparities in peak levels of cTnT and CK. Previous studies revealed associations between CK and cTn and LV function after AMI [29-31]. Here again, none of these studies addressed sex- differences in the predictive value of these markers. We observed that CK was associated with LV function only in men while cTnT was associated with LV function only in women. In a 13 large population study, the value of cTnI to predict cardiovascular death was stronger in women than men [32]. This predictive value could be attributed to an ability of cTnI to predict AMI rather than HF. As LV remodeling is one of the main outcomes of AMI, the stronger predictive value of cTnI in women could partly reflect LV remodeling. Furthermore, TACTICS-TIMI 18 study showed that women with positive troponins were more likely than men to have recurrent MI [12]. In our cohort, reperfusion levels of hs-cTnT were not associated with LV dysfunction. Recently, the prognostic value of hs-cTnT was addressed in a Swedish AMI cohort including 20, 600 patients [33], although its ability to predict LV dysfunction was not reported. In this cohort, hs-cTnT improved the prediction of major cardiovascular events (MACE) independently of the severity of LV dysfunction. Patients with high levels of hs-cTnT were at higher risk of MACE, especially cardiovascular mortality and HF. However, this association was not addressed in a sex-specific fashion. We observed in our cohort a higher 6-month all- cause mortality rate among women ; although this difference was lost after adjustment with age and comorbidities. The influence of sex on the prognosis of AMI patients is not entirely clear. Our results are consistent with previous studies showing that, after adjustment with confounding factors, sex is no longer a significant predictor of mortality [5, 6]. We also observed that adjustment with age was sufficient to induce a loss of significance, suggesting that older age in women was the main responsible factor for higher mortality in women. In another study, a sub-group of women and men with MI matched for age and comorbidities showed a comparable 5-year mortality, albeit the higher 1-year mortality rate in women persisted [15]. Contrarily, female-sex was found to be a protective factor against long-term mortality (20 years), after adjustment with baseline characteristics [34]. These apparently conflicting findings could be explained by the use of different populations with regard to age, type of MI, time of censorship and adjustment with confounding factors. 14 Our study is limited by a low number of women, especially in the reduced EF group. Thus, the sex-disparities in the association between cardiac markers and prognosis after AMI reported here need to be interpreted with caution. In addition, the predictive value of cardiac markers was assessed only at one time point, reperfusion values for NT-proBNP and hs-cTnT, and peak values for cTnT and CK. Baseline values of cTnI were found to be mildly associated with LV function, and patients for whom cTnI was detectable at 1 month and 3 months were at high risk of LV remodeling [35]. NT-proBNP performed best to predict LV remodeling when measured between 73-120 hours after AMI [36]. Hence, further properly-sized studies need to address the sex-specific ability of serial measurements of cardiac markers to predict outcome after AMI. In addition, using CK instead of its cardiac specific fraction MB might weaken the results obtained for this marker. Another limitation of our study is the high proportion of STEMI patients (80%) which makes our study mostly on STEMI. As the frequency of NSTEMI compared to STEMI is higher in women [37], it would be interesting to validate the obtained results in cohorts with higher proportion of NSTEMI patients ; especially among women. Finally, functional explanations of the sex-specific associations between cardiac markers and LV function need to be provided. Conclusion We addressed the relationship between sex and the ability of cardiac biomarkers to predict LV function after AMI. The gold-standard predictor of outcome after AMI, NT- proBNP, was not associated with LV function in women, suggesting a clinical use in men only. On the other hand, our results support further testing of cTnT in women. Although our findings need to be validated in larger cohorts, they stress the need for a sex-specific use of cardiac markers to predict LV function after AMI. 15 Acknowledgements The authors are grateful to Dr Daniel Wagner, head of cardiology at Luxembourg Hospital (LU) and Lausanne Hospital (CH) who initiated the patient cohort used in this study. We thank Loredana Jacobs for sample collection, and Christelle Nicolas and Bernadette Leners for expert technical assistance. Funding This work was supported by the Ministry of Higher Education and Research of Luxembourg and the Society for Research on Cardiovascular Diseases. Disclosure The authors declare no conflict of interest. Supplementary materials Table S1. Univariate association of hs-cTnT with LV dysfunction. Figure S1. Multivariable analysis of the association of hs-cTnT with LV dysfunction. 16 References 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Townsend, N. , L. Wilson, P. Bhatnagar, K. Wickramasinghe, M. Rayner, and M. Nichols. 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Baseline characteristics Age, median (range), y Premenopausal women (age 50y), n (%) Body mass index, median (range) White blood cells, median (range), 109/L Biomarkers, peak values, median (range) CK, U/L cTnT, g/L NT-proBNP at reperfusion, median (range), pg/mL Ischemic time, median (range), hour 4-month EF, median (range), % Medical history, n (%) Previous MI Diabetes mellitus Hypertension Hypercholesterolemia Smoking MI type (STEMI), n (%) 4-month NYHA (> II) classification, n (%) rEF, n (%) Pre-admission medication, n (%) Statins Aspirin -Blockers All (N 608) 60 (30-91) 17 (2. 8) 27 (18-51) Women (N 138, 23%) 70 (33-91) 17 (12. 3) 26 (18-47) 57 (30-88) - 27 (18-51) Men P value (N 470, 77%) (Women vs Men) 10. 75 (1. 11-7250) 10. 27 (4. 96-7250) 10. 92 (1. 11-6350) 1497. 6 (34-13038) 3. 9 (0. 01-31. 64) 205. 2 (5-35000) 1353 (57-9233) 3. 73 (0. 01-26. 93) 481. 1 (45. 26-15679) 3. 12 (0. 6-12) 50 (15-89) 3. 12 (0. 6-12) 50 (20-86) 1639 (34-13038) 3. 96 (0. 03-31. 64) 160. 2 (5-35000) 3. 36 (0. 8-12) 50 (15-89) 59 (10) 126 (21) 279 (46) 255 (42) 273 (45) 483 (79) 120 (20) 120 (19) 113 (19) 120 (20) 124 (20) 7 (5) 32 (23) 69 (50) 61 (44) 54 (39) 113 (82) 45 (33) 28 (20) 25 (18) 27 (20) 35 (25) 52 (11) 94 (20) 210 (45) 194 (41) 219 (47) 370 (79) 75 (16) 92 (19) 88 (18) 93 (20) 89 (19) - 0. 003 0. 357 0. 246 0. 939 0. 46 0, 903 0. 034 0. 406 0. 286 0. 557 0. 068 0. 473 0. 92 1 1 0. 117 20 Angiotensin inhibitors ACE inhibitors Clopidogrel Nitrates Calcium antagonists Diuretics 70 (12) 70 (12) 40 (7) 25 (4) 17 (3) 18 (3) 16 (12) 19 (14) 9 (7) 7 (5) 3 (2) 9 (7) 54 (11) 51 (11) 31 (7) 18 (4) 14 (3) 9 (2) 1 0. 363 1 0. 474 0. 774 0. 009 CK, creatine kinase ; cTnT, cardiac troponin T ; NT-proBNP, N-terminal pro-brain natriuretic peptide ; EF, ejection fraction ; MI, myocardial infarction ; STEMI, ST-elevation myocardial infarction ; NYHA, New York Heart Association ; rEF, reduced EF ; CK and cTnT concentrations are peak levels, NT-proBNP concentration and white blood cell count were determined at the time of reperfusion. 21 Table 2. Incremental value of biomarkers to predict LV dysfunction Model All patients Women Men AIC Likelihood ratio test AIC Likelihood ratio test AIC Likelihood ratio test (p value vs clinical) (p value vs clinical) (p value vs clinical) Clinical 600. 6 140. 1 467. 1 Clinical NT-proBNP Clinical CK Clinical cTnT 579. 4 590. 1 583. 8 Clinical NT-proBNP CK cTnT 564. 2 1. 4x10-6 3. 8x10-4 1. 5 x10-5 3. 2 x10-9 140. 1 138. 8 129. 6 132. 3 0. 164 0. 071 4. 3 x10-4 0. 003 447. 5 459. 3 459. 5 440. 0 3. 4 x10-6 0. 002 0. 002 3. 1 x10-7 AIC, Akaike information criterion, CK, creatine kinase ; cTnT, cardiac troponin T ; NT-proBNP, N-terminal pro brain type natriuretic peptide. The clinical model includes age, sex, BMI, previous MI, diabetes, hypertension, hypercholesterolemia, smoking, MI type (STEMI vs NSTEMI), ischemic time, leucocytes, NT-proBNP, CK and cTnT. 22 Table 3. Interaction test between biomarkers and sex Biomarker Likelihood ratio test (clinical variable vs. clinical variable * sex) NT-proBNP CK cTnT Diabetes Leukocytes count 0. 701 0. 654 0. 073 5. 7 x 10-5 0. 003 CK, creatine kinase ; cTnT, cardiac troponin T ; NT-proBNP, N-terminal pro-brain natriuretic peptide 23 Figure legends Figure 1. Biomarker levels according to sex and LV function. Peak levels of cTnT and CK, and levels of NT-proBNP at reperfusion were determined in 608 AMI patients. Patients were classified according to 4-month EF as having rEF (EF40%) or pEF (40%). Boxplots show the comparisons of CK (A), cTnT (B) and NT-proBNP (C) levels between men and women independently of their EF, or between men and women within the rEF and pEF groups separately. CK, creatine kinase ; cTnT, cardiac troponin T ; NT-proBNP, N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide ; pEF : preserved ejection fraction ; rEF, reduced jection fraction. 24 Figure 2. Univariate predictors of LV dysfunction. The association between demographic and clinical parameters of patients, and levels of cTnT, CK and NT-proBNP, with LV dysfunction at 4 months (EF40%) was assessed with univariate logistic regression in all patients (A), and in women (B) and men (C) separately. Forest plots display odds ratios (OR) with 95% confidence intervals (CI). X axis is in log scale. BMI, body mass index ; CK, creatine kinase ; cTnT, cardiac troponin T ; MI, myocardial infarction ; NT-proBNP, N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide. Age (year), BMI (kg/m2), ischemic time (day fraction), NT-proBNP (pg/mL), cTnT (g/L), CK (U/L). 1 value in the logistic regression was assigned to rEF, male sex and the presence of comorbidity (previous MI, diabetes, hypertension, hypercholesterolemia, smoking and STEMI). 25 Figure 3. Multivariable predictors of LV dysfunction. Logistic regression was used to evaluate the association between cTnT, CK and NT-proBNP and the demographic and clinical parameters of patients with LV dysfunction at 4 months (EF40%), in all patients (A), and in women (B) and men separately (C). Odds ratios (OR) with 95% confidence intervals (CI) are shown. X axis is in log scale. BMI, body mass index ; CK, creatine kinase ; cTnT, cardiac troponin T ; MI, myocardial infarction ; NT-proBNP, N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide. Age (year), BMI (kg/m2), ischemic time (day fraction), NT-proBNP (pg/mL), cTnT (g/L), CK (U/L). 1 value in the logistic regression was assigned to rEF, male sex and the presence of comorbidity (previous MI, diabetes, hypertension, hypercholesterolemia, smoking and STEMI). 26 Figure 4. Survival analyses. (A) All-cause mortality during the 6 months following AMI was compared between women (n 138) and men (n 470) using Kaplan-Meier survival curves with logRank test. (B) The ability of NT-proBNP, CK and cTnT to predict 6-month mortality was evaluated using univariate cox proportional hazards, in all patients and distinctly in men and women. Odds ratios (OR) with 95% confidence intervals (CI) are shown. X axis is in log scale. AMI, acute myocardial infarction ; CK, creatine kinase ; cTnT, cardiac troponin T ; NT-proBNP, N-terminal prohormo	HAL	Scientific
Less doulers des cancéreux	WMT16	Scientific
Contribution à l'étude des Monorchiidae (T. Odhner, 1911) parasites de poissons du genre Mullus en Méditerranée. Description de Timonia mediterranea n. gen. , n. sp. (Trematoda-Digenea)	WMT16	Scientific
Les taux plasmatiques de ritonavir représentent moins de 7% de ceux obtenus après une dose de ritonavir de 600 mg deux fois/ jour.	EMEA_V3	Medicinal
Hycamtin en perfusion a été étudié chez plus de 480 femmes souffrant d' un cancer de l' ovaire et chez lesquelles un traitement par médicaments anticancéreux à base de platine avait échoué.	EMEA_V3	Medicinal
Cycladol 20 Mg, Suppositoire	EMEA_V3	Medicinal
Pseudo-tumeur inflammatoire pulmonaire compliquant l'évolution d'une pneumopathie communautaire. Une présentation radio-clinique trompeuse	WMT16	Scientific
Quelques données d'application de l'anatomie du pancréas	WMT16	Scientific
Nouveau-nés de très faible poids de naissance. Résultats. Perspectives d'avenir	WMT16	Scientific
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Feuille de route Recommandation vaccinale contre la coqueluche chez la femme enceinte La feuille de route vise à proposer au Collège une orientation méthodologique pour répondre à une demande d'évaluation inscrite au programme de travail de la HAS. Cette proposition est fondée sur une analyse préliminaire (sur la base d'une faisabilité lorsqu'elle a eu lieu : demandes issues des organismes professionnels ou des institutionnels) ; elle est donc établie avant toute recherche documentaire structurée. Cette orientation sera à confirmer lors du démarrage de l'évaluation (phase de cadrage le cas échéant) Commission technique des vaccinations (CTV) : 4 juin 2019 Collège d'orientation et d'information : 18 juillet 2019 Demandeur : Direction générale de la santé Objectif : Evaluer la pertinence d'une vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte et ainsi la pertinence d'une révision de la stratégie vaccinale contre la coqueluche appliquée jusqu'alors en France. 1. Saisine En l'absence de recommandation vaccinale française sur la thématique, la Direction générale de la santé (DGS) a de- mandé à la Haute Autorité de Santé (HAS) le 21 février 2018 d'évaluer la pertinence d'une vaccination contre la coque- luche chez la femme enceinte. Il est attendu que cette évaluation précise la période de la grossesse optimale pour réaliser la vaccination anti- coquelucheuse, le délai à respecter en fonction d'éventuelles vaccinations antérieures ainsi que la nécessité d'une re- vaccination éventuelle au cours d'une grossesse ultérieure et l'impact économique de ce programme de vaccination. La vaccination des nourrissons contre la coqueluche n'est possible qu'à partir de l'âge de 2 mois et ne protège pas avant l'âge de 3 mois, laissant ainsi une fenêtre de contamination possible de 8 semaines. L'objectif de la vaccination contre la coqueluche pendant la grossesse est de prévenir la survenue de la coqueluche chez le nouveau-né et le nourrisson pen- dant les premières semaines de vie, grâce au passage transplacentaire d'anticorps anti-coqueluche et en protégeant la mère vaccinée contre la coqueluche. L'objectif initial du demandeur est de disposer d'une conduite à tenir concernant la vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte, cette vaccination n'étant, jusqu'à présent, pas recommandée en France au cours de la grossesse, sans toutefois être contre-indiquée. Cette analyse fait suite à la recommandation de la HAS publiée en mars 2018 con- cernant la vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte dans un contexte épidémique à Mayotte (1) ; re- commandation basée sur la publication de données rassurantes en termes de sécurité et d'efficacité émanant de pays pratiquant la vaccination contre la coqueluche au cours de la grossesse. La vaccination coqueluche chez la femme enceinte est recommandée sur le plan international par l'Organisation Mon- diale de la Santé (OMS) afin de réduire le risque de coqueluche chez le nouveau-né et le nourrisson. L'OMS indique que Toutes les publications de la HAS sont téléchargeables sur la vaccination de la femme enceinte constitue probablement la stratégie complémentaire la plus rentable pour prévenir la coqueluche chez les nourrissons trop jeunes pour être vaccinés et semble être plus efficace et bénéfique que la stratégie dite du cocooning (2). Une réponse est attendue par la DGS à la saisine relative à la vaccination des femmes contre la coqueluche au cours de la grossesse pour faire l'objet d'une recommandation dans le calendrier vaccinal de 2020. 2. Contexte La coqueluche est une infection bactérienne des voies respiratoires inférieures avec peu ou pas de fièvre mais avec une évolution très contagieuse. Deux bactéries, Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis, sont responsables des syn- dromes de coqueluche chez les humains. La transmission de la bactérie est aérienne et peut se produire au contact d'un sujet malade. L'incidence de la coqueluche en France a considérablement diminué avec l'introduction du vaccin anti-coquelucheux dans les années 1960. Cependant, une résurgence de la maladie a été observée dans les années 1990, en particulier chez les nourrissons âgés de moins de 8 semaines qui sont trop jeunes pour les vaccinations. Les épidémies de coque- luche ont tendance à se manifester périodiquement, avec cinq pics épidémiques les plus récentes en 1997, 2000, 2005, 2009 et 2012-13, touchant les nourrissons de moins de 3 mois et les adolescents et adultes qui ont perdu la protection offerte par le vaccin ou la maladie. La surveillance de la coqueluche se fait en France par un réseau de services hospitaliers (laboratoires et services de pédiatrie), Renacoq, qui fonctionne auprès de 42 établissements depuis 1996. Le réseau est capable de surveiller envi- ron 30 % de tous les patients pédiatriques hospitalisés pour la coqueluche. Épidémiologie de la coqueluche en France La morbidité due à la coqueluche est enjeu majeur de santé publique, avec plus de 3318 cas confirmés chez les nourris- sons de moins de 6 mois déclarés au réseau Renacoq entre 1996 et 2012 (3). Sur un total de 2227 cas hospitalisés pour avec la documentation hospitalière complète, 68% étaient âgés de moins de 3 mois, 18% ont été admis dans une unité de soins intensifs et 37 sont décédés (dont 33 enfants de moins de 3 mois) (3). Les nourrissons restent totalement susceptibles de contracter la coqueluche jusqu'à leur première vaccination à partir de l'âge de 2 mois. Les nourrissons sont souvent infectés par les adultes environnants, et une étude épidémiologique menée aux Pays-Bas entre 2006 et 2009 a conclu que les mères sont les plus susceptibles de transmettre la coqueluche à leur nourrisson (4). Une analyse des sources d'infection en France à partir des données de Renacoq de 1996 à 2012 a mon- tré que 41 à 57 % des cas index étaient des parents et 17 à 24 % des frères et sœurs. Les mères ont été identifiées plus souvent que les pères comme étant la source potentielle d'infection (3). Stratégie vaccinale contre la coqueluche appliquée actuellement en France La stratégie dite du cocooning a été mise en place dès 2004 en France et consiste à vacciner l'entourage proche des nourrissons. Cette stratégie préconise la vaccination anticoquelucheuse de la mère en post-partum immédiat, et au cours de la grossesse du père, de la fratrie et, le cas échéant, de l'adulte chargé de la garde du nourrisson pendant ses six premiers mois de vie. Cette stratégie a été élargie en 2008 aux jeunes adultes avec un rappel à 25 ans et aux personnels de santé du fait des faibles taux de couverture vaccinale obtenus (5). Pour autant, la couverture vaccinale coqueluche en France des femmes en post-partum et de l'entourage du nourrisson reste faible. 1. Couverture vaccinale coqueluche chez les femmes enceintes et entourage en France : Enquête (Vaccinoscopie) menée en France auprès de 300 mères et 200 pères de nourrissons < 12 mois afin d'évaluer leur couverture vaccinale coqueluche et son évolution entre 2009 et 2014 (après la mise en place de la stratégie dite du cocooning) : couverture vaccinale coqueluche des mères est passée de 22 % à 61 % ; celle des pères de 21 % à 42 % (6). Enquête menée en le-de-France parmi des proches d'enfants hospitalisés en pédiatrie, des adultes vi- vant sous le même toit que des enfants scolarisés en petite section de maternelle, et des grands-parents afin d'estimer la couverture vaccinale des adultes éligibles au cocooning, dans les trois populations diffé- rentes : sur 250 adultes ayant un statut vaccinal vérifiable, la couverture vaccinale était respectivement de 59 %, 33% et 31 % (7). Toutes les publications de la HAS sont téléchargeables sur 2. Couverture vaccinale coqueluche chez les personnels de santé en France : Etude transversale nationale menée dans plusieurs établissements hospitaliers français à partir de don- nées recueillies en 2009 afin d'évaluer la couverture vaccinale coqueluche (rappel à jour) des personnels de santé : couverture vaccinale coqueluche de 43 % chez les sages-femmes, 25 % chez les médecins, 12 % chez les aides-soignants et 8% chez les infirmiers (8). La récente épidémie de coqueluche, survenue entre janvier 2017 et juin 2018 à Mayotte, est à l'origine de 27 cas de co- queluche biologiquement confirmés, dont deux décès chez des nourrissons (9). Elle est apparue dans un contexte de couverture vaccinale insuffisante, chez des sujets non ou mal vaccinés contre la coqueluche. Dans ce contexte épidé- mique à Mayotte, la HAS publiait en mars 2018 une recommandation concernant la vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte (1). Vaccins contre la coqueluche Plusieurs vaccins différents sont utilisés pour vacciner les nourrissons, les adolescents et les adultes contre la coque- luche : La primovaccination pour les nourrissons avec un vaccin combiné pentavalent ou hexavalent (Infanrixa Hexa, Hexyon ou Vaxelis) ; Une dose de rappel est recommandée à l'âge de 6 ans avec Tetravac-accellulaire, Infanrixtetra, Boostrix- tetra ou Repevax ; Une autre dose de rappel est recommandée à l'âge de 11-13 ans avec Tetravac-accellulaire, Infanrixtetra, Boostrixtetra ou Repevax ; Il est recommandé aux adultes de 25 ans de recevoir une dose de rappel avec Boostrixtetra ou Repevax dans le cadre de la stratégie dite du cocooning et de vacciner les adultes susceptibles d'être en contact avec des nour- rissons (parents, grands parents, et autres personnes proches) et les professionnels de santé. Les seuls vaccins indiqués à l'heure actuelle pendant la grossesse sont Boostrixtetra et Repevax. ? 3. Étude de faisabilité Une première analyse de la littérature, non systématique et non exhaustive, a permis d'identifier : des éléments concernant l'immunogénicité conférée à la femme enceinte suite à la vaccination contre la coque- luche pendant la grossesse avec : des données démontrant une réponse immunitaire chez les femmes enceintes égale à celle des femmes non enceintes lorsqu'elles sont vaccinées contre le tétanos-diphtérie et la coqueluche acellulaire pendant la grossesse (10) ; des éléments concernant la tolérance et l'efficacité de la vaccination contre la coqueluche chez la femme en- ceinte avec : des données démontrant qu'il n'y a pas d'augmentation significative du risque d'affections mater- nelles reconnues ou d'événements indésirables (y compris des anomalies congénitales) chez les nourrissons nés de mères vaccinées, et qu'il existe de bonnes données indiquant une protection contre la coqueluche chez leur nourrisson (11, 12) ; des éléments concernant l'immunogénicité conférée au nouveau-né et au très jeune nourrisson après immunisa- tion de la femme enceinte avec le vaccin contre la coqueluche avec : des données concernant la réponse immu- nitaire du nourrisson lorsque sa mère est vaccinée pendant la grossesse avec un vaccin contre le tétanos- diphtérie et la coqueluche acellulaire qui présente des taux plus élevés d'anticorps au plus jeune âge et cepen- dant moins élevés après le calendrier de primovaccination (13, 14) ; des éléments concernant l'efficacité chez le nouveau-né et le très jeune nourrisson de la vaccination contre la coqueluche pendant la grossesse avec : des données indiquant que la vaccination maternelle contre la coque- luche protégée le nourrisson, surtout au cours des deux premiers mois de la vie, alors qu'autrement le nourrisson ne serait pas protégé directement (15, 16) ; des recommandations européennes émanant de l'European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) (17) ou du Public Health England (PHE) (18) en Angleterre, ainsi que des recommandations internationales, émanant notamment de l'OMS (2), ou d'un groupe d'experts au Canada qui recommandent la vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte (19) ; Toutes les publications de la HAS sont téléchargeables sur de la recommandation française sur la vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte en période épi- démique à Mayotte émanant de la HAS (1) ; des éléments permettant de définir la période optimale de la grossesse pour réaliser la vaccination contre la co- queluche selon la sécurité, le passage transplacentaire etc. (20, 21) ; des éléments concernant l'éventuelle nécessité d'une revaccination contre la coqueluche au cours d'une gros- sesse ultérieure, étant donné que les anticorps maternels diminuent trop rapidement pour que les nourrissons issus de grossesses futures puissent encore en bénéficier (22) ; des éléments concernant l'acceptabilité par les femmes et les personnels de santé de la vaccination contre la coqueluche pendant la grossesse avec : des données publiées démontrant la bonne acceptabilité de la vaccina- tion contre la coqueluche chez la femme enceinte et les personnels de santé à l'étranger (23, 24). En France, seules deux études non encore publiées (Etudes PREVACOQ 1 et PREVACOQ 2 menées en Loire Atlan- tique/soumission en cours) rapportent une bonne acceptabilité de la vaccination coqueluche au cours de la grossesse à la fois par les femmes et les personnels de santé. Une autre étude (GriCoVax) actuellement en cours en Ile-De-France évaluera l'acceptabilité de la vaccination coqueluche chez les femmes et les personnels de santé. 4. Problématique émergeant de l'étude de faisabilité Après une première analyse de la littérature, la période optimale pour la réalisation de la vaccination contre la coqueluche pendant la grossesse n'est pas clairement établie (deuxième ou troisième trimestre de la grossesse). Dans la recomman- dation française sur la vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte en période épidémique à Mayotte, la HAS préconisait une vaccination contre la coqueluche à partir du deuxième trimestre de grossesse et idéalement avant la ème 39 SA. Définir une période précise de grossesse pour la réalisation de cette vaccination faciliterait la mise en place et l'application d'une nouvelle recommandation sur le sujet par les personnels de santé. Les femmes enceintes comptent sur l'aide, l'expertise et les conseils de nombreux professionnels de santé pendant leur grossesse. Si un nouveau programme de vaccination maternelle était recommandé, une formation spécifique serait à prévoir auprès des personnels de santé concernés pour expliquer en particulier le contexte justifiant la mise en place d'une nouvelle stratégie vaccinale contre la coqueluche et ses objectifs. En France, il est déjà recommandé aux femmes enceintes de se vacciner contre la grippe pendant leur grossesse. La couverture vaccinale contre la grippe dans cette population cible est assez faible, et une autre recommandation de vacci- nation pendant la grossesse pourrait conduire au même résultat. Il est donc important de souligner la différence entre les deux programmes de vaccination (protection contre la grippe pour la femme enceinte par rapport à la protection contre la coqueluche pour la femme enceinte et le nourrisson). Des messages peu clairs à communiquer aux personnels de santé et aux femmes enceintes peuvent entraner une faible couverture vaccinale pour un programme de vaccination contre la coqueluche, similaire au programme de vaccination contre la grippe. Dans une période d'hésitation vaccinale marquée en France (25), avec une couverture vaccinale coqueluche qui reste faible chez les femmes en post-partum et dans l'entourage du nourrisson (26) malgré la stratégie actuellement mise en place dite du cocooning, la vaccination de la femme au cours de la grossesse pourrait être un outil supplémentaire de protection du nouveau-né et du très jeune nourrisson contre la coqueluche, dans les premières semaines de vie. 5. Méthode proposée pour traiter la demande Afin d'établir une recommandation vaccinale contre la coqueluche chez la femme enceinte, les questions d'évaluation suivantes ont été identifiées ? 1. Quelles sont les recommandations internationales actuelles ? 2. Quel est le bilan de la stratégie vaccinale actuellement mise en place en France ? a. Quelles sont les données épidémiologiques concernant la coqueluche en France ? b. Quelles sont les données épidémiologiques concernant la couverture vaccinale des femmes en post- partum et de l'entourage proche du nouveau-né/nourrisson en France ? Toutes les publications de la HAS sont téléchargeables sur 3. Vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte : a. Quelles sont les données d'immunogénicité chez la femme enceinte selon le terme de la grossesse ? b. Quelles sont les données d'efficacité et de tolérance chez la femme enceinte, le nouveau-né et le très jeune nourrisson de la vaccination contre la coqueluche pendant la grossesse ? c. Quelle est la réponse immunitaire du nourrisson aux vaccinations ultérieures notamment vis-à-vis des antidiphtériques et anti-toxine pertussique ? d. Quelle est la durée de protection du nourrisson vis à vis de la coqueluche (conférée par les anticorps maternels) avant le relais par la vaccination du nourrisson selon le calendrier vaccinal en place ? Quelle est la période optimale de la grossesse pour réaliser la vaccination ? e. Quel est le délai à respecter en fonction d'éventuelles vaccinations antérieures ? f. Est-il nécessaire de revacciner contre la coqueluche au cours d'une grossesse ultérieure ? g. En cas de nouvelles recommandations, préciser si la vaccination de la femme pendant la grossesse est un outil supplémentaire de protection du nouveau-né et du nourrisson contre la coqueluche ou remplace la stratégie actuelle dite du cocooning ; h. Evaluer l'impact d'une nouvelle recommandation vaccinale contre la coqueluche sur le calendrier vacci- nal du nourrisson ; 4. Acceptabilité de la vaccination contre la coqueluche ? a. Quelle est l'acceptabilité du programme chez les femmes enceintes et dans l'entourage du nourrisson (père) ? b. Quelle est l'acceptabilité du programme chez les personnels de santé, en particulier les sage femmes, les gynécologues et les personnels des maternités ? c. Le contexte actuel de l'hésitation vaccinale en France concerne t il la vaccination coqueluche chez la femme enceinte ? 5. Disponibilité des vaccins en France ? a. Quelles sont les caractéristiques des vaccins contre la coqueluche disponibles en France ? b. Quels vaccins ont une autorisation de mise sur le marché chez la femme enceinte en France (discuter la place du vaccin trivalent DTCoq qui devrait avoir l'AMM en France en août 2019) ? 6. Personnels de santé et vaccination contre la coqueluche ? a. Quelles sont les données de couverture vaccinale des personnels de santé ? b. Rappels sur la recommandation actuelle de vaccination contre la coqueluche chez les personnels de santé c. Quels sont les freins à vaccination des personnels des maternités et autres professionnels de santé ? 7. Mise en place sur le terrain des nouvelles recommandations ? a. Quels circuits de vaccination pour les femmes enceintes ? b. Quelle formation et outils de communication seraient nécessaires en cas de nouvelles recommandations de vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte ? c. Quelle prise en charge de la vaccination, en particulier dans les établissements de santé d. Relation avec la vaccination contre la grippe ? 8. Quel est le rapport coût-efficacité de la vaccination de la femme enceinte contre la coqueluche ? a. Quel serait l'efficience de la vaccination de la femme enceinte par rapport à la stratégie vaccinale contre la coqueluche actuellement mise en place en France ? b. Quel serait l'impact épidémiologique du programme (incidence, hospitalisations, décès, QALYs) ? 6. Actions envisagées en pratique pour la conduite de l'évaluation Différentes actions serviront de support à l'élaboration de cette recommandation vaccinale : - Une analyse systématique de la littérature : la revue de la littérature portera sur une période s'étendant jusqu'à la mi-2019 et concernera l'ensemble des questions d'évaluation identifiées. Seront pris en compte, selon leur quali- té méthodologique, les recommandations, les revues systématiques et méta-analyses, les essais contrôlés ran- domisés, les études prospectives, les études rétrospectives, les études transversales, les études qualitatives. Toutes les publications de la HAS sont téléchargeables sur - Une évaluation médico-économique du programme de vaccination, modélisant le rapport coût-efficacité de la vaccination des femmes enceintes pour réduire la morbidité et la mortalité des femmes enceintes et de leurs nourrissons, à partir des données françaises sur l'incidence des maladies, les taux de complications et les coûts associés. - La participation d'un groupe de travail à cette évaluation, dont la composition sera établie ultérieurement. Le rapport sera examiné par la commission technique des vaccinations (CTV) puis soumis au Collège pour validation finale. 7. Calendrier Cadrage du sujet, recherche documentaire et analyse de la littérature mai-juin 2019 Constitution du Groupe thématique (GT) avec appel à candidatures juin-juillet 2019 GT avec audition d'experts août 2019 Réunion du GT septembre 2019 Validation CTV et Consultation publique novembre 2019 Validation par les différentes instances de la HAS (CTV, Collège) janvier 2020 La publication de la recommandation janvier 2020 RÉRÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. Haute Autorité de Santé. Vaccination contre la coqueluche chez la femme enceinte dans un contexte épidémique à Mayotte. Saint Denis : HAS ; 2018. 05/recommandations vaccination coqueluche femme enceinte mayotte mars2018 2018-05-15 11-36- 37 267. pdf 2. World health Organization. Pertussis vaccines : WHO position paper August 2015. Geneva : WHO ; 2015. 3. Tubiana S, Belchior E, Guillot S, Guiso N, Levy-Bruhl D, Renacoq P. Monitoring the Impact of Vaccination on Pertussis in Infants Using an Active Hospital-based Pediatric Surveillance Network : Results from 17 Years' Expe- rience, 1996-2012, France. Pediatr Infect Dis J 2015 ; 34(8) : 814-20. 4. De Greeff SC, de Melker HE, Westerhof A, Schellekens JF, Mooi FR, van Boven M. Estimation of household transmission rates of pertussis and the effect of cocooning vaccination strategies on infant pertussis. Epidemiolo- gy 2012 ; 23(6) : 852-60. 5. Haut Conseil de Santé Publique. Recommandations vaccinales contre la coqueluche. Paris : HCSP ; 2008. 6. Cohen R, Gaudelus J, Denis F, Stahl JP, Chevaillier O, Pujol P, et al. Pertussis vaccination coverage among French parents of infants after 10years of cocoon strategy. Med Mal Infect 2016 ; 46(4) : 188-93. 7. Lempereur de Guerny MC, Scauflaire M, Crabot D, Le Cossec C, Partouche H. [Pertussis immunization within three adult populations concerned by cocoon strategy in le-de-France]. 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Larson HJ, de Figueiredo A, Xiahong Z, Schulz WS, Verger P, Johnston IG, et al. EBioMedicine 2016 ; 12 : 295- 301. 26. Randi BA, Sejas ONE, Miyaji KT, Infante V, Lara AN, Ibrahim KY, et al. Vaccine 2019 ; 37(8) : 1030-7. Haute Autorité de santé Juillet 2019 Toutes les publications de la HAS sont téléchargeables sur	HAS	Scientific
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J'ai rencontré un animal chez l'orthophoniste : enquête sur les apports de l'animal dans la prise en charge orthophonique Latitia Marzo To cite this version : Latitia Marzo. J'ai rencontré un animal chez l'orthophoniste : enquête sur les apports de l'animal dans la prise en charge orthophonique. Médecine humaine et pathologie. 2014. dumas-01502936 HAL Id : dumas-01502936 Submitted on 6 Apr 2017 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. * Faculté de Médecine ECOLE D'ORTHOPHONIE MEMOIRE présenté pour l'obtention du CERTIFICAT DE CAPACITE D'ORTHOPHONISTE Par MARZO Latitia Née le 29 janvier 1992 à Meaux Directeur de Mémoire : BELLONE Christian, Orthophoniste Co-directrice de Mémoire : DUMAS Nathalie, Orthophoniste Nice 2014 Université Nice Sophia Antipolis Faculté de Médecine - Ecole d'Orthophonie Université de Nice Sophia Antipolis - Faculté de Médecine Ecole d'orthophonie MEMOIRE présenté pour l'obtention du CERTIFICAT DE CAPACITE D'ORTHOPHONISTE Par MARZO Latitia Née le 29 janvier 1992 à Meaux Directeur de Mémoire : BELLONE Christian, orthophoniste Co-directrice de Mémoire : DUMAS Nathalie, orthophoniste Membre du jury : MARSHALL Chloé, orthophoniste Nice 2014 REMERCIEMENTS Avant de développer le sujet, je tenais à remercier toutes les personnes qui ont permis à ce mémoire de se réaliser, de près comme de loin. Je tiens tout particulièrement à remercier Nathalie Dumas. Pour votre disponibilité et votre soutien. Vous avez su me guider et m'aider tout au long de cette expérience. Votre enthousiasme m'a permis de croire encore plus au bien fondé de cette démarche. Travailler avec vous fut un plaisir. Merci pour votre foi en ce type de démarche, votre envie de la faire découvrir, vos grandes connaissances et votre expérience dans ce domaine, ainsi que votre amour des animaux. J'exprime ma reconnaissance envers Christian Bellone, Qui a accepté de diriger ce mémoire, et sans qui j'aurais été dans l'obligation de choisir un autre sujet plus conventionnel . Je remercie Chloé Marshall, membre du jury, de s'être intéressée à mon sujet et d'avoir pris le temps de me corriger et me conseiller. Je remercie chaleureusement toutes les professionnelles en orthophonie qui ont répondu très sincèrement et avec intérêt à mon questionnaire. J'aimerais remercier tous les patients et leurs parents d'avoir autorisé mes observations sur le terrain. Sans eux ce mémoire n'aurait pas été possible. Mes remerciements les plus grands vont à mes parents. Pour votre amour, votre soutien dans les bons comme les mauvais moments, pour m'avoir permis de mener à bien ce beau projet. Mais aussi pour avoir eu la patience d'écouter mes plaintes et remises en questions, et de les avoir apaisées, à chaque fois. Merci aussi pour les bons petits plats à emporter, pour votre écoute, pour votre patience, pour les bons moments passés ensemble, et surtout pour m'épauler encore chaque jour Un grand merci à Harmony, pour m'avoir changé les idées et m'avoir reboostée quand ça n'allait pas. Merci tout simplement d'être là. Merci aussi à ma cousine Marie, à Justine, à Leticia, à Christelle et aux autres. Un grand merci à Marion, Pour ton soutien, ton écoute et ton réconfort, ainsi que pour ses quatre années de dur travail comme de joies, de rires et de complicité. Je remercie Camille J. de m'avoir soutenue et épaulée ces deux dernières années, en étant une super amie. Sans oublier de remercier Camille S. , Cindy, Catherine, Eva, Dorine, Claire, Natacha, Valérie, Alexandrine, Marie, Laure, Laura, Julie, Emilie, Florise et ma marraine ortho Barbara, tout simplement pour être des amies géniales et avec qui j'ai pu décompresser. Merci à mes amies du centre de formation en orthophonie de Nice qui ont fait de ces quatre années d'étude une aventure inoubliable et riche en bons souvenirs. Merci à tous les membres de ma famille, Pour avoir su me soutenir au cours de ces vingt-deux années passées à vos côtés. Je tiens également à remercier ces formidables animaux médiateurs que j'ai pu rencontrer lors de mes observations cliniques : Louve, Sunny et Dolly, mais surtout Salsa, Lit-Shi, Gemini Crocket et Rose des Sables. Mes dernières pensées vont à Saxo, juste pour avoir été mon formidable chien toutes ces années. SOMMAIRE REMERCIEMENTS . 3 SOMMAIRE . 5 INTRODUCTION . 7 PARTIE THEORIQUE LA COMMUNICATION . 11 I. LES PREMICES DE LA COMMUNICATION . 13 II. LES DIFFERENTS TYPES DE COMMUNICATION . 15 III. LES DIFFERENTS CANAUX DE COMMUNICATION . 16 IV. LA COMMUNICATION NON VERBALE . 17 V. REUSSITE DE LA COMMUNICATION . 19 VI. COMMUNICATION AVEC L'ANIMAL . 19 RELATION HOMME-ANIMAL . 21 I. LA DOMESTICATION . 22 1. Historique . 22 2. Définition de la domestication . 22 3. Transformation de la domestication utilitaire . 23 II. APPORTS DE L'ANIMAL A L'INDIVIDU, A LA FAMILLE, ET SURTOUT A L'ENFANT . 24 1. La famille . 24 2. L'individu . 25 3. L'enfant . 27 III. L'ANIMAL DANS LES ECOLES . 30 IV. L'ANIMAL DANS LA VIE PROFESSIONNELLE, INSTRUMENT DE LA SOCIETE PAR SES SENS DEVELOPPES . 35 LA ZOOTHERAPIE . 37 I. LA ZOOTHERAPIE (LA THERAPIE FACILITEE/ASSISTEE PAR L'ANIMAL) . 38 1. Définition . 38 2. Principes . 43 3. Origines . 46 4. Intérêts . 52 II. AVEC QUELS ANIMAUX, ET DANS QUELS BUTS ? . 72 1. Le chien . 73 2. Le chat . 79 3. Le cheval . 82 4. Le dauphin . 91 5. Le perroquet . 95 6. Autres animaux . 99 7. Profils recherchés . 103 LA THERAPIE FACILITEE PAR L'ANIMAL EN ORTHOPHONIE . 108 I. L'ANIMAL DANS LA PRISE EN CHARGE ORTHOPHONIQUE . 109 II. EXEMPLES DE REEDUCATIONS . 111 1. Pour les troubles de la mémoire, les maladies type Alzheimer . 111 2. Pour les troubles du langage écrit . 114 5 3. Pour les troubles du langage oral . 115 4. Pour la rééducation tubaire, ou le travail du souffle . 116 5. Pour les Troubles Envahissants du Développement . 117 6. Pour les troubles logico-mathématiques . 118 7. Pour tous les troubles . 119 III. CONTRAINTES D'UN ANIMAL, EN THERAPIE, PRE-REQUIS ET CONTRE-INDICATIONS 119 1. Les réticences . 119 2. Les zoonoses . 122 3. Recommandations générales . 123 4. Recommandations supplémentaires pour le milieu hospitalier . 124 5. Contre-indications pour le patient . 126 6. Risques pour l'animal . 126 7. Assurances et responsabilité . 128 IV. LIMITES . 129 PARTIE PRATIQUE GENERALITES . 133 I. ANIMAUX ET TYPES D'EXERCICES . 134 II. MISE EN PLACE DE LA ZOOTHERAPIE . 135 III. FORMATIONS SPECIFIQUES . 137 IV. CONTRAINTES ET DIFFICULTES . 139 1. Orthophoniste salarié, en institut ou hôpital de jour . 139 2. Orthophoniste exerçant en libéral . 140 V. LIMITES . 142 APPORTS DES ANIMAUX EN PRISE EN CHARGE ORTHOPHONIQUE . 144 I. ANALYSE DES QUESTIONNAIRES . 146 1. Apports spontanés, non prévisibles . 146 2. Gestion des émotions et comportement . 152 3. Utilisation instrumentalisée de l'animal par l'orthophoniste . 158 II. CAS CLINIQUES . 165 TEMOIGNAGES DES PATIENTS . 185 I. TEMOIGNAGES DES PARENTS DES PATIENTS . 186 II. TEMOIGNAGES DES PATIENTS . 187 CONCLUSION . 191 CONCLUSION GENERALE . 194 BIBLIOGRAPHIE . 197 ANNEXES . 202 ANNEXE I : LA METHODE PECA . 203 ANNEXE II : QUESTIONNAIRE . 205 TABLE DES ILLUSTRATIONS . 207 6 INTRODUCTION Les animaux ont toujours été de précieux alliés de l'homme, que ce dernier ait simplement observé leur comportement comme signal de danger ou qu'il en ait fait des assistants de chasse, de pêche, ou encore les ait domestiqués en tant que compagnons de vie, de jeux. Les Egyptiens les considéraient comme des incarnations vivantes de principes divins à tel point que les représentations picturales de leurs divinités étaient des êtres à morphologie corporelle humaine mais à face animale : Anubis à tête de chacal, Thot à tête d'ibis sacré, Hathor à tête de vache ou encore Bastet à tête de chat, etc. Aujourd'hui, les animaux continuent de nous apporter une aide primordiale dans de multiples domaines. Leur présence illumine la vie de multiples foyers, réconforte petits et grands, accompagne les enfants dans leur développement et leurs jeux, les personnes vulnérables ou porteuses de handicaps dans leurs besoins quotidiens, ou sont même les confidents privilégiés des secrets les plus intimes. Les animaux semblent savoir écouter et comprendre le moindre de nos maux. Une avancée considérable vient d'être obtenue, en France, relativement à leur statut juridique, par l'amendement du 16 avril 2014 qui confère aux animaux la qualité d'être-vivants doués de sensibilité , les distinguant enfin des biens meubles dans le Code Civil1. L'idée de ce travail de fin d'études nous est venu à la lecture, en février 2012, du mémoire d'orthophonie de Leslie Charbonnier intitulé Thérapie facilitée par l'animal et maladie d'Alzheimer, quels bénéfices pour la communication ? (2010, Nice). Comprendre dans quelle mesure la présence animale aurait des effets bénéfiques physiologiques, psychologiques, ainsi que des effets sur la communication et les interactions sociales des êtres humains, constituerait l'espoir de réaliser un parcours de 1 Le code civil est ainsi modifié : 1 Avant le titre Ier du livre II, il est inséré un article 515-14 ainsi rédigé : Art. 515-14. Les animaux sont des êtres vivants doués de sensibilité. Sous réserve des lois qui les protègent, les animaux sont soumis au régime des biens corporels. nationale. fr/14/ta/ta0324. asp 7 vie épanouissant qui mêlerait avec bonheur le partage d'une passion au métier d'orthophoniste dévouée aux autres, tout en apportant des arguments permettant de justifier le recours avisé à la présence d'animaux dans le cadre des rééducations orthophoniques. Bien que les recherches sur le sujet soient en plein essor et positives, elles apportent encore peu d'informations concernant les prises en charge orthophoniques. Les quelques mémoires traitant de la prise en charge assistée par l'animal ciblent des pathologies spécifiques, ainsi que des espèces animales bien précises. Il nous a paru que le moment était venu de faire une synthèse de l'état actuel des recherches et de la pratique en raison d'une large méconnaissance ainsi que d'une méfiance, voire défiance à l'égard de ce type de prise en charge. Apporter un éclairage nouveau sur notre pratique orthophonique nous semble faire sens. Le meilleur garde-fou pour ne pas tomber dans des travers tels que la méfiance, le rejet, ou la fascination aveugle, réside dans une matrise des principes, des applications, mais aussi des limites de la médiation par l'animal, également appelée zoothérapie ou thérapie facilitée par l'animal. Notre partie théorique s'ouvrira par un premier chapitre destiné à expliquer quels sont les principes des différents modes de communication, qu'elle soit spécifique à une espèce particulière, nous parlerons alors de communication intraspécifique, ou au contraire entre l'homme et l'animal ou encore des espèces animales différentes, nous parlerons ici de communication interspécifique. Nous exposerons, dans le deuxième chapitre, la relation homme-animal sous de nombreux aspects. Nous y verrons ce que les animaux peuvent apporter à l'homme, dans les contextes variés de notre société, sur les plans individuels autant que collectifs. Le troisième chapitre sera consacré à la zoothérapie, ou thérapie facilitée par l'animal ; les définitions, les principes et les origines de la zoothérapie mais aussi les effets positifs pour les patients, dans les pathologies médicales et paramédicales de manière générale (incluant l'orthophonie ou lui étant applicables), ainsi que les apports spécifiques de certains animaux. 8 Enfin, nous mettrons l'accent, dans un quatrième chapitre, sur la thérapie facilitée par l'animal spécifiquement en orthophonie puis nous finirons cette partie théorique en présentant les contraintes et limites de la présence animale dans ce métier. Dans la seconde partie de ce mémoire, consacré à l'aspect clinique de cette pratique, nous exposerons tout d'abord ce que nous avons recueilli comme témoignages, directement et/ou au travers d'un questionnaire que nous avons diffusé à des orthophonistes travaillant avec leur animal et ensuite ce que nous avons observé durant nos stages avec deux orthophonistes qui travaillent avec leurs animaux et sont toutes deux diplômées en éthologie2, l'une qui intervient en institutions et la seconde qui travaille uniquement à son cabinet, sur différentes pratiques de la zoothérapie en orthophonie, afin de montrer concrètement quels avantages nous pouvons retirer de la présence des animaux à nos côtés. 2 Ethologie observation du comportement des espèces animales, y compris les hommes, initialement dans leurs milieux naturels de vie, étendu aujourd'hui à tous leurs différents lieux de vie, qu'ils soient à l'état sauvage ou de domestication et d'élevage. 9 Le Petit Prince : - Qu'est-ce que signifie apprivoiser ? Le Renard : -C'est une chose trop oubliée, dit le renard. Ça signifie créer des liens () si tu m'apprivoises, ma vie sera comme ensoleillée. Le Petit Prince, Antoine de SAINT-EXUPERY pp 69, 70 10 Chapitre I LA COMMUNICATION 11 Dans le Dictionnaire d'Orthophonie, la communication est Tout moyen verbal ou non verbal utilisé par un individu pour échanger des idées, des connaissances, des sentiments, avec un autre individu 3. Dès que deux personnes sont ensemble, ou se croisent simplement, leur comportement est message, les paroles comme les silences, l'action autant que l'inaction On ne peut pas ne pas communiquer (Bateson)4. En effet, lors de nos échanges, nous donnons et captons énormément d'informations, bien plus que ce que nous croyons d'ailleurs. Nous sommes toujours en train de communiquer quelque chose, pas seulement via les mots mais à travers nos attitudes, postures, mimiques, gestes et toute manifestation des émotions. Notre corps parle pour nous, parle de nous. Ainsi, François Beiger précise : L'animal est dans un monde sensoriel, alors que l'homme vit dans un monde de subterfuge verbal. François Beiger5 Nous, les êtres humains, sommes des êtres de communication pour lesquels, être en communication est une nécessité biologique, particulièrement pour les petits de notre espèce. Des enfants sauvages adoptés par une mère animale ne souffrent pas du syndrome d'hospitalisme décrit par René Spitz. L'animal maternant aurait donc en lui cette capacité de communication et d'interaction suffisante pour apporter une vie affective dont le petit humain a besoin pour se développer normalement et être en bonne santé. 6 Or, étant devenus des êtres doués de parole, nous oublions trop souvent que notre communication est d'abord multicanale et permanente, qu'elle ne se réduit pas seulement à un aspect verbal, que le langage ne s'y insère que secondairement 7 8. Le nouveau-né entre en effet dans la communication bien avant l'apparition du langage dont il ne se sert qu'après une période de communication non verbale de plusieurs mois. 3 BRIN-HENRY, COURRIER, LEDERLE, MASY. Dictionnaire d'Orthophonie. 2004. p. 57 4 Cité dans BEATA. La communication, 2005. p. 20 5 BEIGER, L'enfant et l'animal, 2008. p. 12 6 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 7 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 8 SOREAU, Atelier orthophonique associant un chien auprès de deux jeunes autistes déficitaires. 2010. 12 I. Les prémices de la communication Les prémices de la communication seraient : 9 Le regard et l'attention conjointe : Le regard est le moyen de communication privilégié entre la mère et l'enfant. La capacité à établir le contact œil à œil est essentielle dans l'établissement du lien affectif avec la mère. Le Docteur Pierre Rousseau, gynécologue-obstétricien belge a montré, par des films tournés au moment de laccouchement, lors de son intervention au cours du premier congrès mondial de la résilience qui s'est tenu à Paris en juin 2012, comment le traumatisme de la naissance qui déclenche une tension corporelle, des cris du nouveau-né, un ensemble de manifestations symptomatiques d'un trauma , notamment une accélération du rythme cardiaque, était instantanément calmé lorsque le regard du nouveau-né rencontre celui de sa mère. 10 La capacité d'attention visuelle soutenue est également essentielle dans la mise en place de l'attention conjointe. Cette dernière a un rôle primordial dans l'établissement de l'interaction et dans l'émergence des fonctions du langage. Le pointage : A partir de huit mois, en situation d'attention conjointe avec la mère, l'enfant est capable de tendre sa main vers un objet pour lui signaler son intérêt. Ce sont les débuts du pointage et de l'activité référentielle, qui mèneront progressivement l'enfant à dénommer les choses. L'enfant prend progressivement conscience que l'autre a une capacité attentionnelle qu'il est possible de modifier. Le sourire : Présent dès la naissance, c'est un signal à valeur hautement positive, essentiel dans la mise en place de la réciprocité sociale et émotionnelle. Dès deux semaines de vie, lorsque le bébé est éveillé, il sourit, notamment en interaction avec la mère, et en mimétisme. Ces sourires sont de plus en plus déclenchés par la voix humaine, et à partir de six semaines à la vue du visage humain. Plus l'enfant 9 SOREAU, Atelier orthophonique associant un chien auprès de deux jeunes autistes déficitaires. 2010. 10 1er Congrès Mondial sur la Résilience, De la recherche à la pratique, Paris du 7 au 10 juin 2012 ; Intervention de Pierre Rousseau, Collaborateur scientifique à la faculté de psychologie et des sciences de l'éducation, université de Mons, Belgique, Atelier du 9 juin 2012 à 14h30 Résilience et interactions précoces Collection d'enregistrements de Nathalie DUMAS. 13 grandit, plus le sourire est intégré dans l'ensemble des mimiques faciales, permettant l'expression d'une grande variété d'émotions. Progressivement, l'enfant prend conscience des effets de son sourire sur autrui. Les mimiques faciales : Dès la naissance, on observe une grande diversité des expressions faciales du tout-petit. Elles résultent de contractions musculaires réflexes, mais elles sont interprétées par l'adulte qui les renforce et y donne du sens. Vers huit semaines, les capacités de discrimination de stimuli émotionnels visuels (les expressions faciales) et auditifs (les intonations de la parole) apparaissent. En effet, bien avant l'apparition du langage, le bébé est sensible à la tonalité affective et au contenu émotionnel des échanges. L'imitation : C'est un moyen important de communication mis en œuvre aussi bien par le bébé que par l'adulte. Les capacités imitatives se développent essentiellement dans les deux premières années de la vie. Elles permettent au bébé de progresser dans la différenciation moi/autrui, mais aussi dans la reconnaissance de similitudes avec l'autre, du point de vue des actions, puis des phénomènes psychiques. Les vocalisations et babillages : Les productions sonores et vocales du bébé évoluent rapidement au cours de ses deux premières années de vie. Entre deux et sept mois, on parle de vocalisations, la phonation n'étant pas matrisée. Mais ses différentes productions sont reconnues et interprétées par l'adulte. Leurs réponses influencent alors la fréquence et la nature des futures émissions sonores. Quand l'enfant commence à produire des syllabes organisées, vers sept mois, on parle de babillage. Même si les productions de l'enfant ne sont pas porteuses de sens, les échanges avec les adultes sont là, et essentiels dans la mise en place de l'interaction sociale. Ainsi, bien avant d'entrer dans le langage verbal, le jeune enfant acquiert une matrise certaine de la communication, dans laquelle il s'investit pleinement. Il prend ainsi une part entière au monde relationnel et social dans lequel il évolue. 14 II. Les différents types de communication Ferdinand de Saussure distingue, dans son Cours de Linguistique Générale trois types de communication : 11 La communication verbale, qui fait intervenir le langage, la sémantique, et se caractérise par le développement des représentations mentales chez les individus qui l'utilisent. Elle est le contenu, ce que nous verbalisons, de l'information explicite qui devrait être facile à comprendre et à communiquer (excepté dans les pathologies de la communication, lorsque la langue fourche , et lors des lapsus). Car nous avons appris et sommes des experts pour manipuler le contenu, faire attention à ce qu'on dit. La communication paraverbale, qui comprend les différentes modalités de la voix (intonation, hauteur, intensité, rythme, pause, silence, inflexion, débit verbal) et non la sémantique des sons émis. Elle nous renseigne sur l'état affectif du sujet émetteur ainsi que sur la nature des informations transmises. La communication non-verbale, qui comprend la gestuelle, la mimique, les attitudes, les expressions faciales, les regards et les odeurs. Ces informations peuvent être transmises de façon consciente ou non. Les modes de communication chez l'animal sont variés. Ils sont avant tout visuels, olfactifs, sonores et tactiles. Chez les mammifères, tous les sens ont leur utilité, avec des aspects distincts comme la finesse de l'odorat chez le canidé ou la vision et l'ouïe chez le félin, alors que la gestuelle et la mimique faciales sont les points forts des primates. Montaigne disait que les animaux ont un langage. Descartes faisait le même constat, celui que les animaux communiquent entre eux et de manière variée et complexe. 12 11 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 12 ARENSTEIN. La zoothérapie, 2012. 15 III. Les différents canaux de communication La communication serait effective grâce à quatre canaux : 13 Le canal olfactif : Ce sens n'est plus utilisé prioritairement chez les êtres humains, en tout cas pas de manière consciente. Mais c'est le sens le plus développé chez le chien et une grande majorité d'animaux. L'odorat du chien serait en moyenne un million de fois plus sensible que celui de l'homme. Cela leur permettrait de s'orienter, par la reconnaissance d'odeurs familières, entre autres. Mais cela aurait aussi une valeur sociale, en intervenant comme outils de communication : émission et identification de sécrétions organiques (les phéromones, présentes dans les urines, les matières fécales et en région péri- anale). Associées à des signes extérieurs de reconnaissance (comportement d'émission, emplacement), la fonction première de ces sécrétions serait de renseigner sur l'identité (espèce, sexe, période du cycle ovarien), mais aussi sur l'état émotionnel de l'individu. Nos émotions, nos colères, nos joies, nos sentiments, seraient autant de balises que le chien et de manière générale l'animal serait capable de détecter par l'odorat. Le canal auditif : Ce canal concerne la réception de signaux vocaux (parole, cris aigus, aboiements, grognements ) dont les variations ont un sens précis (pour les animaux, on remarque la menace, l'avertissement, l'alerte, la plainte, le jeu et la faim). Le canal visuel : Ce canal concerne ce qui est non-verbal (cf. I. 2. Les différents types de communication : le canal visuel). Pour les animaux, il servirait particulièrement à l'interprétation des situations (menace, soumission, apaisement, jeu), avec l'expression des postures comportementales (port de la tête, de la queue, des oreilles). Pour une grande majorité des animaux, elle ne peut se faire que dans un rayon de faible distance. Le canal tactile : Chez l'homme, ce canal fait partie de ce qui est non-verbal. Chez les animaux, il est surtout utilisé en période néonatale mais pas seulement. Le canal tactile se concentre essentiellement au niveau facial (truffe, museau, 13 VERNAY. Le chien partenaire de vies, 2003. 16 menton, sourcil), et notamment au niveau des vibrisses14, impliquées dans l'exploration d'objets complexes. Ils peuvent acquérir une valeur sociale et hiérarchique, et leur expression apparat souvent associée aux signaux olfactifs. Le tactile serait souvent lié à la communication visuelle. Beaucoup de gens, en présence d'un animal à fourrure, sont systématiquement attirés, avec l'envie de le caresser. L'animal familier autoriserait ce contact, réclamant de la tendresse. Son corps dégage une chaleur qui serait attachante et sécurisante. Cette communication serait une recherche d'échanges affectifs et de moments d'émotion. Les animaux aussi se collent les uns contre les autres, se lèchent réciproquement. IV. La communication non verbale La communication non verbale est le mode de communication privilégié des animaux. Voici ce que cette communication recouvrerait : 15 16 17 La mimique, qui serait le moyen de communication le plus archaïque. Elle serait la capacité élective d'exprimer les affects et les émotions, et de les traduire, parfois involontairement. Le regard, qui jouerait un rôle important dans la réciprocité de la communication, ou justement dans sa rupture. Il serait un régulateur des tours de parole, mais aussi un des signaux les plus puissants de notre répertoire de communication non verbale. Ce serait un élément essentiel de la communication interespèces. Il peut impliquer une sphère de communication intime, sans trop de complication relationnelle. La gestuelle et les postures, qui peuvent indiquer des intentions d'accueil, de rapprochement, de rejet ou de menace. La communication tactile, qui serait omniprésente dans la communication avec l'animal, mais aussi avec le zoothérapeute. Par le toucher, de nombreuses 14 Vibrisses petites moustaches très sensibles des animaux 15 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 16 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 17 BEIGER & JEAN, Autisme et zoothérapie. 2011 17 informations seraient transmises, informations congruentes ou non avec les propos de l'interlocuteur : par exemple des mains moites, chaudes, ou au contraire glacées, sèches, énergiques, molles, ou le refus ou l'oubli de serrer la main véhiculeraient des messages bien différents les uns des autres. Cette communication serait d'autant plus importante chez l'enfant qui ne parle pas : il exprimerait ses affects ou son angoisse à travers un corps à corps affectueux ou agressif. Dans des cliniques vétérinaires, le psychiatre Aaron Katcher a observé une forme de toucher particulière, un jeu distrait de la main (qu'il nomme idle play) dans la fourrure de l'animal. Selon Demaret, ce contact a, chez nous, le même effet apaisant, rassurant et relaxant qu'a le toilettage social chez nos cousins primates. Nous aurions gardé le même besoin de contact et de chaleur qu'eux. Enfin, le toucher serait aussi un indicateur de relation. Il fait l'objet d'interdits et de recommandations socialement codifiés : toucher un inconnu est une violation de l'espace personnel, en même temps qu'accepter de se laisser toucher et accepter qu'un autre entre dans sa sphère intime. Cependant les tabous liés au toucher n'auraient pas lieu lorsqu'il s'agit d'animaux, ceux-ci n'ayant pas le statut de personne sociale compétente dans la pensée de la plupart des hommes : ils se sentiraient donc autorisés à les toucher. Ce que tous les animaux n'acceptent pas forcément. L'utilisation de l'espace : la distance à l'autre ainsi que l'espace occupé ou non peuvent être révélateurs de difficultés. Les manifestations neurovégétatives, par définition non intentionnelles (rougeur, pâleur, rire bref, râle, pleurs impossibles à retenir, etc. ), traduiraient l'intensité des processus psychiques mis en cause. Il en serait de même pour les gestes automatiques souvent inconscients qui seraient les témoins de décharges pulsionnelles non élaborées. 18 V. Réussite de la communication La réussite de la communication implique que l'information véhiculée soit correctement interprétée par le destinataire. L'élaboration d'un message nécessite donc l'utilisation d'un code partagé, compatible avec le canal de communication employé, entre l'émetteur et le récepteur. Le contexte dans lequel l'information est émise est aussi nécessaire à la réussite de la communication. 18 D'après l'école de Palo Alto19, toute interaction entre deux personnes se caractérise par une notion de symétrie et de complémentarité. Une relation symétrique comprend l'égalité et la minimisation des différences, alors qu'une interaction complémentaire se fonde sur la maximalisation de la différence. Dans notre métier, en exercice libéral, nous chercherions souvent à avoir cette notion de symétrie. VI. Communication avec l'animal L'établissement de la communication homme-animal supposerait de prime abord une part d'adaptation, ainsi qu'un apprentissage préalable des modes de communication intraspécifiques20, évoluant vers le partage de codes de communication communs acquis dans le contexte de la vie quotidienne. Si, en tant que porteuse de sens, la communication verbale constitue le mode de communication privilégié de l'espèce humaine, ce ne serait pas le cas des animaux, pour lesquels le verbal (sinon l'apprentissage de quelques mots usuels tels que leur nom) ne correspondrait qu'à un signal sonore. Toutefois, les signaux paraverbaux et non-verbaux qui lui sont associés auraient une extrême importance pour eux. 21 18 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 19 L'École de Palo Alto (du nom d'une petite ville de Californie) désigne un groupe de chercheurs réunis dans les années 1950, autour de Gregory Bateson. Elle a révolutionné le champ des sciences humaines en plaçant la communication et la notion de système au centre de sa théorisation. Ne pas séparer l'individu du contexte culturel et relationnel dans lequel il évolue devient le fondement d'un nouveau modèle qui s'applique aussi bien à la famille qu'à la psychiatrie ou au monde du travail. 20 Qui se passe à l'intérieur d'une même espèce biologique. Larousse. fr 21 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 19 Ainsi, ce que l'animal comprendrait ne serait pas le sens des mots, mais toute la richesse de la communication non verbale dont s'accompagnent les paroles. Et comme il est difficile de mentir dans ce domaine, la relation prend un caractère d'authenticité, la rend fiable. 22 D'après Myers23, un animal ne provoque pas de situation divisée ou de double lien, contrairement aux humains. En effet, il ne proposerait pas de messages verbaux contredisant les messages non verbaux. L'esprit des animaux serait plus simple à lire que celui des humains, car nous pourrions connecter avec plus de certitude son comportement à l'état mental qui lui correspond. Ainsi, notre chien ne va pas gratter à la porte pour nous faire une blague bien qu'il puisse vouloir jouer. Les comportements animaux convoieraient en effet des données authentiques sur les états mentaux, non brouillés par le faire-semblant , la métaphore, la tromperie ou l'ironie. Il en serait de même pour les sentiments et les émotions. 24 Mais il a aussi été démontré que certains animaux savent mentir . La communication serait ainsi plus facile et plus évidente avec les animaux. Ils nous incitent à communiquer. Je te regarderai du coin de l'œil et tu ne diras rien. Le langage est source de malentendus . Saint-Exupéry, Le Petit Prince, p. 71, propos du renard 22 GUINOT. L'animal et l'enfant. 1983. 23 MELSON. Les animaux dans la vie des enfants. 2009. 24 MELSON. Les animaux dans la vie des enfants. 2009. 20 Chapitre II RELATION HOMME-ANIMAL 21 I. La domestication 1. Historique De tout temps, et quels que soient les continents, l'homme aurait entretenu avec les animaux des relations complexes, quelles que soient les latitudes. Sur Terre, l'animal a précédé l'humain : en effet, au début, ce dernier se comportait comme tous les animaux, en essayant d'avoir une place parmi les autres espèces. Perdus au milieu d'une nature totalement hostile, nos plus lointains ancêtres, encore bêtes parmi les bêtes, avaient à se méfier des animaux plus puissants, voraces, rapides. Pour assurer leur survie, les humains devaient compter sur des espèces plus faibles, qu'ils arrivaient à dominer. La survie de l'espèce passait par l'animal utilitaire. Ce travail usant pour la vie dura des millénaires, et petit à petit, par l'accumulation d'observations fortuites, l'homme évolua : chassé puis chasseur et enfin éleveur, l'homme a domestiqué l'animal il y a environ 15 000 ans dans des buts alimentaires (viande, lait, œuf, miel, huile), utilitaire (cuir, plume, laine, travail ), de transport (avec la migration des peuples), de traction (par le chameau, l'âne, l'éléphant, le cheval, le renne, les chiens de traneau ) mais également dans l'action de sécurité. La grande majorité des espèces domestiquées l'a été à l'époque du néolithique [chien (loup), mouton (mouflon), chèvre (aegagre), porc (sanglier), bovins (aurochs), cheval et âne]. En effet, dès que l'Homme fut capable de tirer des leçons de ses expériences, il se rendit compte que ses chasses, pêches et cueillettes étaient aléatoires. Il comprit qu'il devait se trouver des alliés : les premiers élevages sont sécurisants. Les animaux domestiques, tous issus d'espèces sauvages, ont joué des rôles déterminants dans l'histoire humaine. 2. Définition de la domestication La domestication réelle a suivi de peu l'agriculture. Le terme domestication est utilisé à partir du moment o il s'agit d'un groupe d'animaux qui sont contrôlés et croisés. La sélection a alors pour objectif d'obtenir une race adaptée à l'élevage et aux besoins des êtres humains. A l'état actuel des connaissances, le loup serait le seul animal qui aurait choisi de s'allier à l'Homme, il y a 170 000 ans, pour sa propre survie, les individus 22 les plus vulnérables et dominés auraient été chassés du clan et auraient suivi puis se seraient rapprochés des humains pour ne pas mourir de faim. 25 3. Transformation de la domestication utilitaire Parallèlement à cette domestication utilitaire (incluant des comportements déterminés et instruits, les hommes ayant toujours quelque chose à faire avec les animaux), d'autres types de rapports se sont créés. En effet, le rapport contemporain à l'animal presque exclusivement de caractère apprivoisé - se présente comme un espace désorienté et informel, sans tâches communes à élaborer, le jeu et la promenade étant éloignés des compétences pratiques véritables. Ainsi, le chien aurait été domestiqué plusieurs milliers d'années avant J-C : pour la chasse et la défense, mais aussi pour le plaisir. Des liens d'interdépendance, nous glissâmes vers des liens d'attachement. Au fil du temps, des complicités se sont nouées de par les remarquables capacités d'adaptation des espèces animales, c'est-à-dire l'ajustement comportemental, émotionnel, et la préservation de leur potentiel reproducteur. Ainsi, au fil des siècles, l'un comme l'autre se sont progressivement adaptés à cette situation, et le chien a obtenu le rôle bien précis de compagnon de l'homme. Les relations homme/animal évoluent. Cette évolution se serait affirmée dans les années 1970, en même temps qu'on assistait à une diversification des espèces concernées. L'animal apparat comme le substitut idéal de tout ce qui manque à l'homme adulte [protection, lien avec le passé, médiateur de contacts humains et facteur de valorisation personnelle, support affectif] 26. 25 BEATA, Colloque Le modèle animal, USTV, 2013 26 BELIN, Animaux au secours du handicap, 2000. p. 17 23 II. Apports de l'animal à l'individu, à la famille, et surtout à l'enfant En France, deux ménages sur trois possèdent au moins un animal de compagnie, soit près de 35 millions d'animaux familiers (chiens, chats, oiseaux en cage, poissons en aquarium, rongeurs, lapins nains, tortues, reptiles )27. La France y apparat comme leader européen, et est au deuxième rang mondial (après les Etats-Unis), de la possession d'un animal. Ces propriétaires appartiennent à toutes les classes sociales. Dans quasiment aucune société humaine, il n'y aurait d'humains seuls : avoir des animaux est important, et on vit très facilement avec eux28. 1. La famille Bien que sa fonction ait changé depuis des années, l'animal garderait une utilité de par sa présence dans les familles. Notamment du point de vue relationnel. En effet, il participerait, la plupart du temps à l'homéostasie du groupe. Grâce à lui, des événements générateurs de crises seraient mieux surmontés, sans que ne soit remis en question l'équilibre de la famille, l'équilibre du système. Tout au long de sa vie, une place bien spécifique serait attribuée à l'animal, par la famille, de manière plus ou moins consciente et intentionnelle. L'animal serait régulateur des relations privées. D'après Jean-Luc Guichet (2011)29, il y aurait trois principales fonctions de l'animal au sein de la famille, et elles se rattacheraient toutes à un rôle de facilitation relationnelle : La fonction affective de médiation circulante : il se trouverait, dans l'animal, un vecteur de transmission affective facilitée, désinhibitrice : les membres d'une famille communiqueraient et extérioriseraient affectivement à travers l'animal, comme un tenant-lieu émotionnel qu'ils se transmettraient. Par son corps manipulable, non inhibiteur, réceptacle et donc transmetteur de 27 ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996 28 PAOLINO. Conférence relative au D. U. d'éthologie. 2013 29 GUICHET. L'animal familier aujourd'hui : la réduction du domestique à l'apprivoisé. 2011 24 manifestations affectives physiques qui ne passent pas par l'extériorité du langage, l'animal serait un intermédiaire commode. Il ne faut pas non plus oublier un rapport plus personnel à l'animal, avec par ailleurs sa fonction de gratification affective. La fonction consensuelle et responsabilisante : à la différence d'un objet inerte, et bien davantage que la plante, l'animal serait un souci commun non discutable : il ne peut pas s'assumer tout seul, et on ne peut pas faire n'importe quoi avec lui. Tous les membres de la famille peuvent alors se rassembler autour d'un bien commun fragile, possédant une forte capacité réconciliatrice. Il offrirait ainsi un ciment consensuel à la famille, auquel elle peut constamment faire retour. La fonction médiatrice : elle servirait aussi à faciliter et modeler les rapports d'autorité, le rapport animal domestique/enfant étant un équivalent analogique de la subordination enfants/parents. L'animal aurait donc une fonction d'identification et de détermination des rôles. Il impulserait un modèle hiérarchique, mais en l'assouplissant, en y ajoutant de la bienveillance, de la patience et de la responsabilité, tout en lui apportant une justification visible et consensuelle d'un rapport d'autorité. 2. L'individu Hubert Montagner a développé le concept de compétences-socles , spécifiquement dans le cadre de l'analyse de la relation de l'enfant à l'animal. Cependant, celle-ci peut être générée à tout individu, la confrontation à l'animal stimulant l'enfant intérieur qui sommeille en chacun de nous. Il y aurait cinq compétences socles : 30 31 32 33 La manifestation d'une attention visuelle soutenue, les yeux dans les yeux ; L'élan à l'interaction. En effet, l'animal se rapproche, réduit la distance ; 30 Dans BEATA. La Communication. 2005 31 Dans VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 32 Dans SOREAU, Atelier orthophonique associant un chien auprès de deux jeunes autistes déficitaires : étude descriptive et apport. 2010. 33 Dans GREFF, Le chien : auxiliaire en logopédie-orthophonie ? . 2010 25 Les comportements affiliatifs (développement de l'empathie), qui induisent sourires, rires et offrandes ; Une organisation structurée et ciblée du corps, du geste ; Les capacités d'imitation. L'animal familier est considéré à la fois comme un ami qui fait partie de la famille, comme un confident qui peut tout voir et entendre. On peut lui accorder une confiance aveugle. L'animal ne parle pas, et donc ne juge pas. Il ne renvoie pas aux difficultés personnelles et familiales. 34 Les animaux sont bien plus que des êtres miniatures dépendants. Ils sont des compagnons de jeux des enfants, leurs amis, et leurs accessoires. Les chiens rapportent inlassablement des bâtons, attrapent des balles, montrent leurs tours, sont des éclaireurs canins au cours d'expéditions dans de nouveaux lieux. Les chats se lovent sur les cahiers des devoirs, s'étirent au bout des lits et viennent se faire câliner Les lapins, hamsters, gerbilles, furets et cochons d'Inde s'installent sur les genoux. Les oiseaux et les poissons animent une pièce sombre. De toutes ces façons, les animaux sont des présences vivantes et chaudes. Ils accompagnent leur matre, qu'il soit petit ou grand, et restent auprès de lui. Leur fonction la plus importante est la présence. 35 Les interactions avec l'animal familier contribuent à façonner le monde émotionnel, affectif, relationnel, social et cognitif. 36 Les apports des animaux de compagnie sont donc nombreux. Dans les foyers, l'animal a d'autres effets, cette fois-ci physiologiques. Les possesseurs d'animaux familiers ont statistiquement un taux de cholestérol et de triglycérides moins élevé que les non-possesseurs (Anderson, Reid, Jemmings, 1992)37. De fait, les 34 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 35 MELSON. Les animaux dans la vie des enfants. 2009. 36 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. p. 16 37 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 26 promenades avec l'animal incitent à rester actif, ce qui renforce le système cardiovasculaire et baisse la pression artérielle ainsi que le taux de cholestérol. De plus, sa présence diminuerait l'insécurité affective, l'anxiété, et les peurs. Elle développerait aussi le bien-être et augmenterait la confiance en soi ainsi que l'auto- estime. Prendre soin d'un animal demande une implication tant physique que psychologique ; ce contact quotidien atténuerait le sentiment de solitude et renforcerait l'estime de soi. Les capacités de communication et de sociabilité seraient également améliorées, et des symptômes psychosomatiques seraient diminués ou supprimés : amélioration du sommeil, de l'appétit ou de la libido, atténuation des allergies, moindre fréquence des maladies, amélioration de la convalescence, etc. D'après plusieurs études, les propriétaires d'animaux auraient moins de problèmes de santé, consulteraient moins souvent le médecin. En outre, la compagnie d'un animal permet de surmonter les événements difficiles de la vie, et de réduire le stress lié au mode de vie contemporain (Bergler, 1992)38. 3. L'enfant Une étude de l'Institut de recherches interdisciplinaires sur la relation entre l'homme et l'animal de Zurich (IEMT) a montré que soixante pour cent des enfants possédant un animal déclarent ne jamais s'ennuyer en compagnie de leur animal, qu'ils considèrent comme un confident, un protecteur, et un compagnon de jeu. Les animaux familiers possèderaient un important pouvoir d'affection, n'interdiraient pas, mais en empêchant parfois, et apprendraient à l'enfant à respecter certains rituels d'interaction : nous ne pouvons pas tout se permettre. Selon Melson (2009), les plages de temps libre avec les animaux contribueraient à stimuler l'imagination et nourrir la créativité. Chaque fois qu'un enfant serait en contact 38 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 27 avec un animal, il sortirait du temps humain si rapide et pressé : il serait dans le temps présent, dans l'ici-et-maintenant. 39 Grâce aux animaux familiers, les enfants seraient mieux préparés aux relations avec autrui. Effectivement, ils leurs apprendraient certaines notions fondamentales de l'humanité, comme par exemple le respect de l'autre et sa liberté. Selon Anne Sadin, orthophoniste40, l'animal est aussi très pratique pour comprendre beaucoup de choses de la réalité : la santé, la nourriture, la sexualité qu'il permet d'expliquer naturellement aux enfants . L'animal permettrait à l'enfant d'observer et de se familiariser avec tout ce qui représente pour lui un mystère : le couple, la grossesse, la mise bas, l'allaitement, la mort, la maladie, les besoins, etc. et peut-être, voire même surtout, le respect de la vie. Cette familiarité avec les événements créerait une motivation suffisante pour poser des questions aux parents ou aux éducateurs. Les acquisitions de l'enfant se feraient dans un cadre et un ordre naturel. Les animaux enseigneraient qu'il ne faut pas faire n'importe quoi n'importe quand. Ils stimuleraient ainsi de nouveaux comportements, des stratégies, des échanges, créant ou facilitant la communication dans la famille, et les interprétations cognitives. 41 De manière générale, les animaux familiers incitent au jeu, jeu très important pour le développement de l'enfant : action, appréhension du corps, imitation sans danger d'actes dangereux, symbolisation, projections, réalisation de pulsions partielles, identifications, sublimations, fantasmes qui s'expriment . L'enfant souhaiterait se rapprocher de l'animal, pour jouer, et pour approfondir une communication avec lui. Selon Ange Condoret, la présence animale déclencherait le processus dynamique et stimulant qui ferait sortir l'enfant de lui-même. Le désir de caresser et celui de jouer mobiliseraient la dynamique de l'enfant. Cette relation exige parfois que l'enfant surmonte une éventuelle peur, mais cette expérience surmontée augmenterait la confiance de l'enfant dans ses capacités à résoudre des problèmes. L'animal serait aussi un moyen de se valoriser. 39 MELSON. Les animaux dans la vie des enfants. 2009. 40 Citée dans GEORGES. L'animal, bien plus qu'une compagnie pour l'enfant. 2012. p. 18 41 GEORGES. L'animal, bien plus qu'une compagnie pour l'enfant. 2012. 28 L'animal familier participe aussi à la sécurité affective de l'enfant. Il stimule son développement affectif et relationnel, et libère les processus d'apprentissage et ses ressources intellectuelles 42. L'enfant apprécierait de retrouver chez l'animal un amour inconditionnel. Il se sentirait accepté tel qu'il est, sans avoir à prouver sa compétence. De plus, de par sa différence absolue avec l'humain, l'animal emmènerait l'enfant aux limites de sa pensée égocentrique43. Des pédiatres constatent que les enfants élevés avec un animal auraient un meilleur niveau psychosocial que les enfants élevés sans. Ils seraient plus sociables et matriseraient davantage leur colère et leur agressivité. Chez l'enfant qui doit aborder un certain nombre de difficultés au cours de son développement, l'animal semblerait être un médiateur indispensable. Il l'aiderait à supporter le détachement affectif maternel, serait un compagnon de jeux fidèle, et lui permettrait d'acquérir certaines potentialités. Il éveillerait à la nature et l'encouragerait à devenir responsable . Par sa présence au sein de la famille, il solliciterait les sens, stimulerait la motricité, et l'enfant pourrait aussi se soustraire à ses émotions en les projetant. Par son système référentiel, l'animal parat être un facteur important de l'équilibre mental de l'enfant. 44 Dès l'âge de trois ans, l'enfant s'identifierait aux animaux. Ce serait au travers de ces identifications que l'enfant construirait petit à petit sa propre personnalité. Comme l'analyse Ange Condoret, ces identifications à l'animal n'en restent pas moins une forme de langage, qui, tout en déchiffrant le comportement animal, aide les enfants à mieux se connatre donc à s'accepter, et à capter pour leur propre compte les forces de l'animal45. Puis, au fur et à mesure que l'enfant grandit, l'animal deviendrait un refuge, un confident, à qui il va confier ses joies, ses peines, et ses doutes. Y étant sensible, il est un interlocuteur qui écoute, sans jamais juger. 46 42 MONTAGNER, cité dans GEORGES. L'animal, bien plus qu'une compagnie pour l'enfant. 2012. p. 16 43 MELSON. Les animaux dans la vie des enfants. 2009. 44 TELLO. A propos de l'animal. 1985 45 Dans ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996 46 ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996 29 Le pédiatre Winnicot écrit : L'enfant a besoin de faire marcher son imagination, de rêver, de vivre dans un monde à lui. Il doit se distancer de ses parents et plus il est jeune plus cela est difficile. La présence d'un chien facilite les choses 47. Nous pouvons conclure, en reprenant Montagner et Rossant, que les animaux de compagnie sont des partenaires privilégiés des enfants, participant pleinement à leur développement et pouvant participer à réguler l'équilibre familial. Selon Montagner, l'interaction avec l'animal peut favoriser chez l'enfant l'apaisement, la sécurité affective, l'élan vers les autres, la communication, la socialisation, mais aussi l'attention, l'intelligence, l'imagination, la créativité, la confiance et l'estime de soi. Enfin, d'aprè s Rossant, l'animal est aussi très bénéfique pour le développement moteur, psychologique et social. De manière générale, l'animal de compagnie porterait en lui en rendant la vie de son matre plus complexe et variée le pouvoir d'améliorer, sinon la santé, du moins la qualité de vie de chacun. Et particulièrement celle des personnes fragiles ou fragilisées, enfants, personnes malades ou handicapées, et les personnes âgées. III. L'animal dans les écoles 48 49 L'introduction des animaux dans les écoles ne date pas d'aujourd'hui, mais de 1770. Johann Pestalozzi (1746-1827), pédagogue suisse, reprend certaines idées de Jean- Jacques Rousseau sur l'intérêt des relations entre les enfants, les plantes, et les animaux. Nous pouvons aussi préciser que, dès le monde primitif, la transmission du savoir aux plus jeunes passait par les adultes, évidemment, mais aussi par les animaux : par leur observation (particulièrement lorsqu'ils sont sauvages), mais aussi par la compagnie régulière des animaux domestiques (le jeu, les confrontations de force, d'adresse, de rapidité, de compréhension du monde, de rapports sociaux). 47 Dans ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996. p. 90 48 ROSSANT & VILLEMIN, L'enfant et les animaux. 1996 49 BEIGER François. L'enfant et la médiation animale. 2008. 30 Plus tard, Montessori (1870-1952) montrait les fabuleux avantages de ces contacts. En effet, l'observation des animaux et des plantes ferait découvrir la vie aux enfants. L'introduction de l'animal dans les écoles, bien que rare du fait des difficultés administratives, apporterait un grand nombre de bienfaits aux élèves. La zoothérapie éducative s'intègre au contenu pédagogique, mais elle se situe au-delà des connaissances : l'accent est mis sur le comportement. Le programme de zoothérapie éducative est un projet pédagogique inédit, qui permet aux enfants d'être actifs dans leur éducation. En effet, il y aurait de nombreux apports pour les élèves : 50 ils pourraient apprendre la vie sans l'intermédiaire de l'adulte ; ils prendraient leurs responsabilités et apprendraient la patience ; ils auraient un meilleur développement affectif et intellectuel ; ils apprendraient à matriser le contrôle de leurs pulsions ; ils affineraient leurs compétences langagières ; leurs préoccupations morales seraient stimulées ; ils apprendraient à observer, aimer et respecter les animaux, avec un éveil à la vie favorisé ; ils structureraient leurs concepts de vie, de temps et d'espace ; ils augmenteraient leur propreté, leur ponctualité, leur sens des responsabilités, ainsi que leur prise de conscience de certaines négligences ; ils auraient une motivation à toute épreuve et une valorisation de l'enseignement. Le Docteur Condoret note également le respect pour la vie, qu'il voyait poindre dans les yeux ébahis . Or ce respect n'est-il pas un point important dans l'évolution de l'enfant ? Il apprend à percevoir l'autre. Il prend conscience de son existence et de ses besoins. Il sait par voie de conséquence qu'il existe lui-même et surtout qu'il existe pour les autres. Il sort de son égocentrisme. L'animal à l'école serait aussi une motivation pour la communication, une incitation, que ce soit avec l'adulte (il lui pose des questions), avec ses camarades (il faut se mettre d'accord, organiser la vie de l'animal), mais aussi avec l'animal lui-même. Même les plus timides entreraient dans cette dynamique. L'animal constituerait un très bon médiateur 50 ROSSANT & VILLEMIN, L'enfant et les animaux. 1996 31 pour renvoyer à l'enfant une image positive de lui-même, et déclencherait sa motivation pour des activités pédagogiques telles que la lecture, l'écriture, la réflexion, l'estime de soi, l'envie de faire, le respect de l'autre. L'animal aurait la capacité de stimuler, de motiver, de réconforter et de distraire. Ainsi, les jeunes se rapprochent, ce qui apporterait encore des points positifs sur la motivation scolaire, l'absentéisme, l'échec scolaire, l'indiscipline, et la violence. La présence de l'animal apporterait aussi une aide plus concrète : l'éducation sensorielle. En effet, sa présence provoquerait une curiosité orientée de la part des élèves. L'animal apparatrait comme un être parlant à toute la sensibilité de l'enfant, à sa sensorialité. L'enfant touche, caresse ou frappe, et par conséquent prendrait conscience de l'impact qu'il a sur l'autre. En effet, l'animal réagit : il se sauve ou reste à se faire caresser, évite l'enfant ou le recherche. Toutes ces réactions toucheraient l'enfant : l'animal serait le censeur, sans pour autant remettre en cause la relation. L'enfant apprendrait alors à adapter son geste. D'après Mion Valloton, l'entrée dans un monde de conventions et de codes, signes et lettres, risque de plonger la plupart des enfants dans un sentiment d'abandon et de solitude, quoi que fasse la matresse. La présence d'animaux à partager soude le groupe, lui donne une chaleur qui comble le fossé maison-école 51. Cette présence permettrait aussi aux élèves, en début d'année ou lorsqu'ils sont nouveaux (et donc ne connaissent personne), une acclimatation plus rapide. Ils retrouveraient dans ce lieu nouveau un point de repère, un refuge. Cela provoquerait aussi un intérêt accru pour l'école. En effet, la présence animale génèrerait une sécurisation apaisante. Enfin, Au-delà d'être un formidable compagnon de jeu, un ami fidèle et une présence apaisante, le chien va offrir à l'enfant, la possibilité de jouer le rôle d'éducateur, et ainsi l'aider à s'ouvrir à la citoyenneté et à la responsabilité en lui faisant prendre conscience que l'acquisition d'un animal implique des devoirs : ce dernier a en effet des droits et des besoins qu'il faut respecter. Apprendre à connatre l'animal, c'est aussi apprendre le 51 Dans ROSSANT & VILLEMIN, L'enfant et les animaux. 1996. p. 104 32 respect du vivant et le respect de l'autre. A cet égard, l'animal constitue un excellent vecteur dans l'apprentissage du respect de la vie et de la citoyenneté responsable. 52 D'après Sylvie Guinot, dans son mémoire d'orthophonie L'animal et l'enfant53, le travail concret en classe avec l'animal pourrait être envisagé sous cinq angles différents : Etude naturaliste : Elle permet de trouver l'origine, l'histoire créative des diverses races, des caractères physiques, [le] comportement [de l'animal]. Des histoires vraies illustrent ces études. Etude anecdotique : A partir du folklore on peut rechercher tout ce que les hommes ont pu traduire de l'influence que les animaux ont eu sur eux et de l'attitude qu'ils ont prise à leur égard. Les dictons, les proverbes, les locutions, les croyances, les formulettes de jeux d'enfants, les fables, les contes traditionnels, classiques, anciens ou actuels permettent d'approfondir la recherche. Puis les enfants pourront à leur tour écrire un conte fait de matériaux authentiques . Etude symbolique : L'aspect de l'animal, ses actes, leur interprétation par les hommes, unis à la projection de leur propre comportement dans le sien aboutissent à donner une signification à la bête. Elle est symbole des vices ou des vertus : fidélité, fausseté, peur Crainte ou utile, donc toute puissante, elle est parfois élevée au rang de divinité comme vouée au démon. Cette étude permettra d'estomper l'image traumatisante. Etude artistique : L'artiste a représenté l'animal ou plutôt l'idée animale du moment. Dans la statuaire, la mosaïque, la tapisserie, toutes les formes iconographiques, l'animal est présent. L'aspect moderne ne sera pas négligé : la carte postale, le timbre poste, la publicité, la photographie. Chaque matre pourra chercher des illustrations dans les musées, les châteaux, les églises Etude pédagogique : Elle peut fournir tout un choix de poèmes, de disques, de chants, de rondes et de danses, de jeux de paroles, de jeux psychomoteurs, de films, de diapositives L'itinéraire pédagogique est donc donné par le thème. 52 ETHOLOGIA. L'enfant et l'animal, une harmonie à construire. 2004. p. 9 53 GUINOT. L'animal et l'enfant. 1983. 33 Etudier les animaux suivant chacun de ces cinq aspects permet de les camper dans leur réalité proche, dans leur relation avec la vie des enfants et des hommes dans leur histoire, dans les rêves et l'imagination de l'humanité, dans leurs représentations artistiques. Cette étude permet le trait d'union entre le monde fermé de l'école et le monde extérieur. L'enseignement désincarné prend vie à la faveur de l'animal. [] La conduite pédagogique parat valable à notre époque. L'éducateur établit sa stratégie d'après les paroles, l'acquis, les activités spontanées de ses élèves qu'il suscite. Il documente les enfants et les oriente vers la création multiforme : graphique, plastique, verbale, gestuelle. A partir de ces bases, chaque matre pourra orienter les exercices vers les différentes acquisitions scolaires nécessaires. La lecture, l'écriture, le calcul, l'histoire, la géographie, bien évidemment les sciences naturelles, etc tout ce qui constitue le programme scolaire pourra avoir comme base l'animal. Le fait important sera donc d'avoir en ce dernier une source d'animation. Dans la mesure o l'enfant est intéressé, le travail parat moins rébarbatif. L'expérience des enseignants montre qu'ils découvriraient des qualités et compétences chez des enfants qui ne les laissaient pas paratre. 54 Les difficultés actuelles, d'emmener un animal à l'école, tiendraient au manque d'intérêt qu'accorderaient les parents, au scepticisme de l'administration qui invoquerait les règles d'hygiène, à l'utilisation de l'animal trop axée sur l'observation et pas assez sur son rôle affectif ainsi qu'à des échanges imparfaits entre le personnel de service et des enfants. 55 De plus, les locaux scolaires sont souvent exigus et ne se prêteraient guère à la cohabitation des élèves et des animaux, les coûts sont relativement élevés, et le problème de la garde des animaux intégrés à la vie de la classe serait souvent difficile à résoudre. La présence de l'animal à l'école poserait par ailleurs des risques pathogènes lorsque le vétérinaire n'est pas consulté. Or, une circulaire de l'Education nationale du 2 août 1977 dit qu'en maternelle, le matre peut contribuer à l'élaboration du concept de vie en exploitant l'attachement naturel des 54 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 55 MONTAGNER 34 enfants pour ce qui se transforme, se déplace, est animé. Bien d'autres lois, depuis 1921, invitent à observer et à tirer parti de l'animal. De plus, comme dit précédemment, l'animal à l'école aurait bien des avantages, comparé aux quelques inconvénients. D'ailleurs, bien que l'école traditionnelle soit encore réticente à l'idée d'ouvrir ses portes à ces nouveaux éducateurs , celles qui se réclament des méthodes nouvelles ont depuis quelque temps déjà donné une place à ce collaborateur qu'est l'animal. Les trois précurseurs sur la présence des animaux à l'école sont Pestalozzi, Montessori et Decroly. IV. L'animal dans la vie professionnelle, instrument de la société par ses sens développés L'animal peut aussi être utilitaire. De par son odorat, ses capacités de tractions, son intelligence, sa taille, etc. , il est un co-acteur exceptionnel dans de multiples métiers et tâches humaines. Ainsi, le chien est un animal pouvant exercer de nombreux métiers : chien de berger, chien policier/soldat (dans le dépistage des drogues, des bombes, de mines, mais aussi de personnes disparues ou ensevelies), les chiens de garde, les chiens de chasse, les chiens agents de sécurité, les chiens d'assistance (guides d'aveugle, pour personnes à mobilité réduite, et même depuis quelques années pour les malentendants), chiens de traneaux, encadrement de troupeaux d'animaux, recherche et découverte de ressources cachées (telles que les truffes) , opérations de sauvetage (avalanche, catastrophe naturelle, nautique ), etc. Bien d'autres animaux ont été ou sont utilisés dans de multiples activités. On remarque ainsi le cheval (mais aussi l'âne, l'éléphant, le dromadaire, le chameau ) pour le labour, les tractions, le transport d'hommes ou de marchandises, la cavalerie, les transports militaires ; anciennement les pigeons voyageurs ; les babouins de garde en Egypte, utilisés depuis l'Antiquité ; les animaux dits acteurs (tels que ceux qui jouent Lassy, Flipper le dauphin, Beethoven, Belle et Sébastien, etc. ), les animaux cosmonautes (la chienne Laïka, singes, souris ). Malheureusement, les animaux sont souvent exploités, et maltraités, dans tous ces domaines. 35 Les animaux de la ferme sont aussi utilitaires. La plupart sont de rente, mais les fermes peuvent aussi être pédagogiques, voire thérapeutiques. Malheureusement, souvent, les animaux sont sacrifiés, au seul bénéfice de l'humain. Il y a ainsi les animaux soldats , les animaux de laboratoire, les animaux utilisés comme kamikazes dans la guerre tels que les dauphins chargés d'explosifs envoyés pour détruire les sous-marins ou bateaux de guerre, etc. 36 Chapitre III LA ZOOTHERAPIE 37 I. La zoothérapie (La thérapie facilitée/assistée par l'animal) 1. Définition Utilisé couramment en Amérique du Nord et au Canada, le mot Zoothérapie provient de la racine grecque zoo qui signifie animal , et de therapeia , qui en grec signifie cure, soin . 56 La zoothérapie, ou thérapie assistée/facilitée par l'animal (T. A. A. et T. F. A. ) est une médiation qui se pratique par un professionnel, en individuel ou en petit groupe de deux ou trois personnes maximum, à l'aide d'un animal familier, soigneusement sélectionné et éduqué. Cette thérapie est particulièrement utilisée avec des personnes chez qui on cherche à susciter des interactions visant à entretenir ou à améliorer leurs capacités de développement cognitif, physique, psychosocial, émotionnel ou affectif. Les mécanismes d'action de la zoothérapie sont aussi bien physiologiques que psychologiques. Son champ d'action est très vaste : à domicile, en cabinet, dans le milieu familial ou dans le milieu institutionnel, et ceci pour des personnes malades somatiques ou mentales, des personnes handicapées mentales ou moteurs ou non-voyantes, des personnes ayant des problèmes de langage ou du comportement, des personnes âgées en pertes d'autonomie, etc. D'après François Beiger57, la zoothérapie est aussi appelée thérapie axée sur le lien entre l'être humain et les animaux de compagnie 58, et peut se définir comme une médiation qui favorise les rapports naturels et bienfaisants entre les humains et les animaux et qui s'applique à toutes les activités impliquant l'utilisation d'un animal familier auprès de personnes fragiles, à des fins thérapeutiques. 59. La zoothérapie 56 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 57 Ethologiste canin, ethnologue, conférencier, auteur de plusieurs ouvrages et psychanalyste en relations thérapeutiques humain/animal. Il a fondé l'Institut Français de Zothérapie 58 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 59 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 38 mise sur la réciprocité dont fait preuve l'animal de compagnie, et sur son potentiel de stimulation, de motivation, et de contact affectif. 60 Dans toute zoothérapie, on retrouve quatre entités différentes qui vont influer les unes sur les autres : 61 L'animal, avec ses caractéristiques et son caractère ; Le patient, avec son histoire, sa problématique, ses angoisses, ses défaillances, ses espérances, ses envies ; Le zoothérapeute, avec ses connaissances, mais qui a lui-même sa propre façon d'être, son vécu personnel, ses usages professionnels et, de ce fait, une compréhension ; Un discernement bien à lui des situations qu'il va rencontrer. Faites confiance à votre animal. Il vous conduit au jeu, n'est-ce pas la meilleure travailler ? Didier Vernay, directeur du GREFTA. 62 façon de Le GREFTA63 64 définit et distingue l'Activité Associant l'Animal (AAA) avec un projet à orientation Thérapeutique (AAA-T), Educatif (AAA-E) et Social (AAA-S). Pour ce groupe, l'AAA est la recherche d'un contexte propice à l'émergence d'interactions positives issues de la mise en relation intentionnelle homme-animal. Chez un même chien par exemple, plusieurs critères sont recherchés : 65 la cohabitation de registres comportementaux complémentaires, la possibilité d'expression de la spontanéité interactive, en alternance ou en association avec les règles sociales, en fonction de situations, des contextes, lieux et attentes de la personne qui anime l'activité. 60 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 61 BEIGER, dans ARENSTEIN et LESSARD, La Zoothérapie. 2012 62 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 63 Groupe de Recherche et d'Etude de la Thérapie Facilitée par l'Animal, né en 1999 grâce à l'AFIRAC, recherche la complémentarité des points de vue dans la thérapie facilitée par l'animal, tant dans le domaine théorique que pratique, tous ses membres ayant été impliqués dans des programmes et/ou des recherches sur la Thérapie Facilitée par l'Animal. Leur ligne directrice est d'être concret, de partir du terrain et de ses préoccupations. 64 Notons que le GREFTA s'est dissous depuis 2009, et a fait place au GERMA : Groupe d'Etude et de Recherche sur la Médiation Animale. 65 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 39 Selon le GREFTA, les critères requis pour la pratique de l'AAA sont : 66 Un intervenant ayant une compétence reconnue dans un domaine d'intervention précis ; Un projet en accord avec les compétences de l'intervenant, afin de permettre l'adéquation de l'AAA avec la population bénéficiaire, et de façon à garantir leur bien-être et leur sécurité, ainsi que ceux de l'animal ; Un référent (l'intervenant, ou une autre personne) responsable du chien et ayant une bonne connaissance de l'animal et des règles cynophiles ; Un suivi vétérinaire de l'animal ; En fonction du contexte de la pratique : souscrire une assurance spécifique et vérifier que l'on est exhaustif dans notre conduite diplomatique des démarches hiérarchiques et administratives adéquates ; une supervision du programme (telle que celle proposée par le GREFTA). De ce fait, le GREFTA (et son partenaire l'AFIRAC) recommande et propose une méthodologie générale, que l'on peut adapter à la problématique personnelle voire la faire évoluer, ainsi que 3 niveaux de formation : 67 Module 1 : Développement d'un projet social, éducatif ou thérapeutique impliquant l'intervention d'un chien ; Module 2 : Accompagnement vers la mise en œuvre d'un projet - social, éducatif ou thérapeutique - impliquant l'intervention d'un chien. Module 3 : Suivi et évaluation d'un projet - social, éducatif ou thérapeutique impliquant l'intervention d'un chien. D'autres moyens d'information sont aussi mis en place : interventions sur le terrain, en établissement, séminaires, publications, mémoires et thèses, stages, forums et sites internet. 66 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 67 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 40 L'Institut Français de Zoothérapie68 (IFZ) est le premier organisme de formation professionnelle. Il forme lui aussi les métiers du paramédical et du social aux pratiques professionnelles de la médiation animale. Mais c'est aussi un lieu d'accueil, sous le nom d'Institut de Médiation Animale (IMA) : de jeunes autistes viennent régulièrement, toutes les semaines, pour des séances de thérapie par médiation animale, dirigées par une psychologue. Des progrès incontestables pour chaque enfant ont été mesurés par des échelles d'évaluation. L'IFZ est aussi une Maison ou Pièce d'Eveil, o chaque enfant a un programme personnalisé lui permettant d'apprendre petit à petit des notions théoriques et pratiques du langage par l'orthophonie, mais aussi des notions telles que l'espace, le temps et l'équilibre par la psychomotricité médiatique par l'animal sous toutes ses formes. Les objectifs de l'IFZ sont : 69 Développer des formations professionnelles et universitaires sur la médiation animale ; Développer un réseau d'intervenants professionnels en Europe et leur apporter un soutien, des informations, de la formation continue, avec la mise en place d'une Charte Professionnelle et un agrément, délivré aux associations, établissements et personnes ayant suivi avec succès la formation, et développant de sérieux projets de zoothérapie ; Mettre en place des échelles d'évaluation, des grilles de sondage et des rapports de travaux scientifiques ; Aborder des initiatives d'informations sur la médiation animale et des rencontres entre les acteurs du social et de la santé par des colloques et conférences, sur le plan international ; Mener une réflexion sur la médiation animale auprès des professionnels de la santé, du social, et de l'enseignement spécialisé ; 68 L'IFZ est dirigé par François Beiger (Fondateur de l'IFZ, Psychanalyste en médiation animale, directeur général), Aurélie Jean (Psychologue clinicienne-zoothérapeute, spécialiste des troubles envahissants du développement) et Anne Lambert (Psychanalyste de la petite enfance, zoothérapeute, enseignante universitaire spécialisée dans l'enseignement auprès des enfants DYS , des enfants déficients sensoriels (langage des signes, LPC, Braille). 69 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 41 Développer les antennes IFZ dans d'autres régions, et à l'étranger ; Développer un Centre de recherches, d'études et d'évaluation sur la zoothérapie : l'OSIDRZ70 pour les différentes populations en besoin (recherches menées en collaboration avec des professionnels de la santé, du social, de la justice et du monde animal, ainsi qu'avec des étudiants en psychologie, en psychiatrie, en éthologie, en biologie, en santé, en social, en comportement animal) ; Informer et sensibiliser les pouvoirs publics et privés sur les bienfaits de la zoothérapie, monter des projets pilotes en collaboration avec les services de santé, hôpitaux, établissements psychiatriques, foyers de vie, maisons de retraite, associations, psychologues, département de justice . L'association Zoopsy regroupe des vétérinaires passionnés par les troubles du comportement humain, déjà diplômés ou en cours de formation. Son but est de susciter des débats transversaux avec toutes les professions en relation avec la pratique de l'art vétérinaire des troubles du comportement, la zoopsychiatrie. De plus, des psychiatres, médecins, éthologues, sociologues, psychologues et même des philosophes prennent part à leurs recherches. Il existe d'autres associations ou fondations, proposant des informations, des formations, et même des lieux de prise en charge, en zoothérapie. Ainsi, de manière non exhaustive, nous remarquons la fondation A&P Sommer, l'Organisme Professionnel d'Enseignement et de Recherche sur les Relations homme/animal (OPERRHA) qui propose une formation de canimédiateur, les formations CEEPHAO (Comportementaliste, Etho-Psycho- Comportementaliste et Educateur Canin), l'institut Agatéa, et le Groupe d'Etude et de Recherche sur la Médiation Animale (GERMA) qui propose aussi des formations, etc. Pour le cheval, nous trouvons, entre autres, l'association HANDICHEVAL, Equit'Aide, la Fédération Nationale des Thérapies avec le Cheval (FENTAC), la Société Française d'Equithérapie (SFE), l'Institut de Formation en Equithérapie (IFEq), etc. 70 OSIDRZ Organisation Scientifique Internationale sur les Développements et les Recherches en Zoothérapie 42 2. Principes Deux types de zoothérapie seraient possibles : la passive, et la zoothérapie active, qui va plus loin et qui requiert certaines habiletés, entre autres de créativité, de la part du zoothérapeute. Toutefois, dans les deux cas, la qualité et la force de la relation humain- animal, en plus de la relation thérapeute-animal, sont mise à contribution. Le bien-être de l'animal doit être respecté, et il faut savoir détecter précocement les signes de déséquilibre. Car seul un individu équilibré d'un point de vue comportemental et affectif peut être réceptif, attentif et élément de vie. 71 L'animal jouerait un rôle de médiateur entre le zoothérapeute et la personne dans le besoin, facilitant ainsi l'instauration d'une alliance thérapeutique entre ces deux personnes. Au cours des séances, le thérapeute utilise l'habileté remarquable de l'animal à susciter une réponse chez les gens. Une des informations primordiales à connatre et à faire savoir est que la zoothérapie n'est pas de l'occupationnel, et n'est pas non plus de la simple animation à l'aide d'un animal. La zoothérapie professionnelle (ou médiation animale) est la rencontre de trois entités différentes : le patient, l'animal, et le zoothérapeute. Savoir observer, écouter, et communiquer avec son animal seraient les bases élémentaires. Respect et complicité entre l'humain et l'animal, qui représentent tous deux des entités vivantes, feraient la force et la réussite d'un travail en zoothérapie. 72 Le zoothérapeute doit être un professionnel de la santé ou du social. En effet, la zoothérapie vient en complément de l'intervention d'orthophonistes, d'ergothérapeutes, de psychomotriciens, de kinésithérapeutes, mais aussi de psychiatres, de pédopsychiatres, d'infirmiers en gérontologie, en pédiatrie, en oncologie, en psychiatrie. Il en est de même pour tous les métiers du secteur social comme éducateur spécialisé, aide médico- psychologique, psychologue, assistant social, animateur social, auxiliaire de vie scolaire 71 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 72 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 43 L'un des intérêts de ce type de prise en charge est de pouvoir être proposé à la plupart des individus, quel que soit leur âge, et de concerner de nombreuses pathologies physiques ou mentales, tout comme des fragilités ponctuelles, ou les types de pathologies que nous pouvons retrouver en orthophonie. Les actes de travail peuvent donc être variés et s'adapter à beaucoup de problématiques. Le non jugement de l'animal envers le patient fragilisé en fait un médiateur idéal. Il est capable de faire comprendre son accord ou son désaccord par des faits, des gestes ou des mimiques, qui provoqueraient alors une réflexion chez la personne, et ce même si elle est dans un état de fragilité ou de déficience ! 73 Être en contact avec l'animal à qui nous demandons quelque chose, serait : 74 L'observer et le comprendre dans ses réactions ; Le comprendre et nous faire comprendre ; Etre constant et cohérent dans nos demandes et nos attitudes ; Apprendre la patience (qui fait trop souvent défaut à l'humain) ; Percevoir, étudier et analyser les codes de communication relationnelle humain- animal, et en créer d'autres tout au long de cette corrélation ; Nous défaire de notre toute-puissance, car l'animal va avant tout répondre à son propre rythme avant d'obéir aux ordres extérieurs. Effectivement, pour travailler avec un animal il faut accepter de dialoguer avec lui, car il demande que l'on soit à l'écoute de ses réactions. Nous devons donc inciter par la confiance, et non par la contrariété et la violence. Ce qui est fondamental. Généralement, les enfants constituent la population la plus ciblée de ce type de médiation, par l'intérêt supposé qu'ils peuvent avoir pour les animaux. L'aspect ludique du dispositif est très apprécié, particulièrement lorsque nous devons redoubler d'ingéniosité et d'imagination pour éveiller et maintenir leur intérêt. Toutefois, la zoothérapie peut être efficace pour tous types de patients, quel que soit leur âge, la nature de leur handicap, etc. 73 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 74 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 44 La zoothérapie ne requiert pas un niveau de langage élaboré, la communication étant essentiellement non-verbale. Cela facilite la relation. Lorsque les mots ne sont pas pertinents, les ressentis corporel et émotionnel représentent un bon moyen pour établir le contact. Cela permettrait au patient d'évoluer selon des possibilités de communication dans lesquelles il serait parfois même plus compétent que le thérapeute. Tout le monde se met au niveau de la communication non verbale (comportement, émotion). Ce serait la base de l'interaction avec l'animal. Ainsi le patient ne serait pas considéré comme déficient, et la communication resterait significative pour chacun. 75 76 En outre, l'animal introduit de l'humour et de la souplesse dans des interactions parfois rigides et sérieuses, voir rébarbatives. 77 78 D'une manière générale, l'animal permettrait, en favorisant la créativité du thérapeute, la construction de nouvelles réalités pour le patient, comme celle o son déficit du langage ne serait pas un obstacle au développement des relations gratifiantes. L'animal apporterait un potentiel de changement important dans les relations thérapeutiques : il ouvrirait de nouvelles perspectives, sur des modalités de communication différentes que celle employée couramment pas les humains. 79 80 Le respect de l'animal médiateur est indispensable : il n'est pas un simple moyen, mais un être vivant, avec des besoins et des attentes qu'il faut savoir reconnatre et auxquels il faut pouvoir répondre de façon adéquate. Les réflexions sur l'analyse relationnelle entre l'animal et l'humain à effet thérapeutique ne seraient pas totalement acceptées par certains corps médicaux. Néanmoins, les preuves scientifiques affluent de plus en plus, particulièrement aux Etats- Unis et au Canada, et les études plus pratiques ne cessent de se développer et de prouver leur utilité, bien que de manière moins scientifique. Enfin, la zoothérapie ne peut pas être une fin en soi : c'est une spécialisation, une complémentarité d'un métier de la santé ou du social, comme orthophoniste, masseur- 75 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 76 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 77 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 78 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 79 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 80 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 45 kinésithérapeute, infirmier, psychologue, psychiatre, aide-soignant, aide médico- psychologique, ergothérapeute, psychomotricien, médecin, éducateur spécialisé, etc. Il est aussi nécessaire d'avoir un minimum de connaissances sur son animal, sur l'animal en général et les comportements qu'il peut avoir. 3. Origines Les exemples de zoothérapie se multiplient sans cesse aujourd'hui. Des recherches nous révèlent que la zoothérapie existe depuis au moins le IXème siècle. Le premier emploi volontaire d'animaux pour aider le psychique de l'homme semble dater du XIème siècle à Gheel, en Belgique, o certains convalescents devaient s'occuper d'oiseaux. Mais déjà, au IXème siècle, en Europe, des animaux étaient laissés avec des malades dans l'espoir de voir leur état général ou mental s'améliorer : c'est de la zoothérapie ou activité assistée par l'animal empirique. 81 82 Dès 1755, Diderot, dans son Encyclopédie, rapporte que l'expérience ayant appris à Thomas Sydenham [médecin anglais (1624-1689)] à faire tant cas de l'équitation, qu'il la croyoit propre à guérir, sans autre recours, non-seulement de petites infirmités, mais encore des maladies désespérées, telles que la consomption, la phtisie même accompagnée de sueurs nocturnes et de diarrhée colliquative . Il reprend cette théorie de l'équitation à son actif, en la développant et en précisant : il en résulte [] des changements si avantageux dans le cas o l'équitation est faite à propos, qu'ils sont presqu'incroyables. . 83 La première trace précise de thérapie facilitée par l'animal date de 1792 avec William Tuke, qui refusait les mesures coercitives et inhumaines des asiles. Dans sa fondation de York Retreat, en Angleterre, on enseigne aux malades mentaux à prendre soin de petits animaux, afin de leur rendre confiance en eux, de les rendre responsables, et de les aider à 81 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 82 GREFF. Le chien, auxiliaire en logopédie orthophonie. 2010 83 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 46 se concentrer. Ils se sentent immédiatement responsables des animaux, mais aussi d'eux- mêmes. Il s'agit des premières expériences connues de psychothérapie par l'animal. 84 85 En 1867, l'institut Bethel, en Allemagne, soignant les épileptiques, explore les mêmes procédés par le contact d'oiseaux, de chiens, de chats et de chevaux. 86 A la fin du XIXème siècle, Florence Nightingale, pionnière des soins infirmiers, est l'instigatrice de la collaboration d'animaux pour améliorer la vie des patients, en Angleterre. 87 Dès 1901, le cheval est utilisé en promenades à l'hôpital orthopédique de Oswestry au Royaume-Uni, et a entre autres été utilisé pour la rééducation des soldats blessés dès la Première Guerre Mondiale. Lors de cette dernière, les chiens sont eux aussi une source d'aide à la thérapie pour les soldats traumatisés. 88 89 En 1937, Freud aurait remarqué l'avantage que nous pouvons tirer de la relation enfant- animal, grâce au fonctionnement de l'identification : Les enfants n'ont aucun scrupule à considérer les animaux comme leurs semblables à part entière. Ils se sentent davantage apparentés aux animaux qu'à leurs parents, qui peuvent bien être une énigme pour eux. Dans un premier temps, la ressemblance est du côté de l'animal, la différence du côté de l'adulte. 90 En 1942, aux Etats-Unis, au centre de convalescence de l'Hôpital militaire de l'Armée de l'Air de Pawling, l'American Red Cross a recours à des chiens pour aider les pilotes blessés de l'US Air Force lors de leur convalescence, accélérer celle-ci et leur remonter le moral. 91 En 1953, Boris Levinson, psychiatre américain, reçoit un coup de fil de parents désespérés : leur enfant autiste doit être interné dans un établissement spécialisé. Il accepte de les recevoir, et oublie que son chien est dans son cabinet (d'ordinaire, cela lui 84 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 85 ARENSTEIN. La zoothérapie. 2012 86 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 87 ARENSTEIN. La zoothérapie. 2012 88 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 89 ARENSTEIN. La zoothérapie. 2012 90 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 91 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 47 est interdit). Le psychiatre sourit aux parents et à l'enfant, muré, qui ne dit rien, ne voit rien, n'entend rien. Et soudain, l'impossible se réalise. Un contact inespéré, imprévu, s'opère sous les yeux même du professeur. L'animal se lève, traverse la pièce en se dirigeant vers l'enfant. L'enfant, d'abord muré, esquisse quelques pas en direction du chien. Vient alors la première ébauche de communication de l'enfant : la caresse. Là o tout avait échoué, une simple présence animale réussissait. Ce double mouvement de l'enfant vers le chien et du chien vers l'enfant contenait, aux yeux du professeur, l'essence d'une thérapie : le prium movers curateur. L'enfant est revenu le lendemain, non pas pour une séance, une analyse, ou toute autre chose dont il ne se serait pas accommodé. Tout simplement pour revoir le chien. Et les progrès furent très rapides, jour après jour, sous le regard éclairé du professeur. Puis ce dernier put enfin s'immiscer dans le couple ainsi formé, en s'adressant tout d'abord au chien. Il put ensuite très rapidement parler à l'enfant. Ce témoignage serait à l'origine de la thérapie facilitée par l'animal. Levinson utilisa alors la présence de l'animal familier comme catalyseur social, chien ou chat selon le tempérament du patient, pendant ses consultations. Levinson communiquera sur le sujet dès les années soixante. Pour lui, l'animal peut servir de co-thérapeute dans la relation thérapeute-patient et sa présence semble même accélérer le processus thérapeutique et l'établissement de la relation entre le patient et son thérapeute. Et malgré les critiques ironiques de ses collègues qui faisaient mine de s'inquiéter s'il partageait ses honoraires avec ses animaux, il développa la théorie de la Pet-oriented child psychotherapy basée sur le fait qu'en psychologie infantile la communication se fait par le jeu, jeu qui est le meilleur moyen pour l'enfant de communiquer. Levinson a démontré à travers ses ouvrages que, sans être directement thérapeutique, la présence animale parvenait à détendre les patients qui s'exprimaient plus volontiers que lors d'un simple face à face avec le soignant. Pour lui, les animaux familiers sont bénéfiques sur l'atténuation de traumatismes émotionnels, la régulation des émotions, et le développement de la bonne santé mentale. 92 93 94 95 96 97 98 92 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 93 ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996 94 ARENSTEIN. La zoothérapie. 2012 95 GUINOT. L'animal et l'enfant. 1983 96 CHARBONNIER. Thérapie facilitée par l'animal et maladie d'Alzheimer. 2010 97 HERADE. Le chien, auxiliaire en logopédie orthophonie. 2010 98 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 48 En 1952, une cavalière danoise finit médaille d'argent aux Jeux Olympiques, à l'épreuve de dressage. C'est un exploit car elle a été frappée très jeune par la poliomyélite. Ce fut à l'origine de la naissance de nombreux programmes d'équithérapie pour personnes handicapées physiques ou mentales. 99 En 1953, un centre équestre spécialisé pour enfants handicapés fut agréé aux Pays-Bas, et cette expérience fut étendue dans pratiquement tous les pays d'Europe et aux Etats- Unis. 100 En 1958, Samuel et Elisabeth Corson, psychiatres américains de l'Ohio, sont les premiers à utiliser l'animal de compagnie comme moyen de thérapie des malades mentaux, notamment dans le traitement de la schizophrénie, et pour les personnes réfractaires aux thérapies conventionnelles. Ils constatent une diminution de la prise de médicaments psychotropes. 101 102 En 1960, en France, Ange Condoret, docteur vétérinaire, s'intéresse aux effets positifs de la présence animale auprès des enfants inadaptés. Il démontre que l'animal joue un rôle de déclencheur de communication . En effet, avec un animal, la communication verbale se développerait et les échanges seraient plus aisés avec autrui chez des enfants présentant des troubles de la communication. 103 104 105 Freud quant à lui, consultait souvent en présence de ses deux chiens, et a mis au jour tant d'aspects jusqu'alors peu évidents du Moi caché de ses patients. Malheureusement, il n'a jamais évoqué dans ses écrits le possible rôle déclencheur de l'animal. En 1970, la psychomotricienne Renée de Lubersac et le masseur kinésithérapeute Hubert Lallery définissent la Rééducation par l'équitation (R. P. E. ) comme une méthode thérapeutique globale et analytique extrêmement riche qui intéresse l'individu dans son 99 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 100 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 101 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 102 SERVAIS. La relation homme-animal. 2007 103 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 104 CHARBONNIER. Thérapie facilitée par l'animal et maladie d'Alzheimer. 2010 105 HERADE. Le chien, auxiliaire en logopédie orthophonie. 2010 49 complexe psychosomatique, qu'elle soit pratiquée avec des handicapés physiques ou des handicapés mentaux 106. 107 Dans les années 1970, aux Etats-Unis, Corson et Corson (avec la collaboration de Condoret) développent les travaux de Levinson et mènent une expérience avec trente malades âgés de treize à vingt-trois ans, débiles, psychotiques ou catatoniques, dont l'état reste stationnaire malgré les traitements médicamenteux ou psychanalytiques : ils attribuent à chacun un chien différent. Beaucoup se montrent plus communicatifs et sociables, avec un aspect renforcé d'indépendance et de confiance en soi. 108 109 110 L'équipe du Dr. Katcher (Professeur de psychiatrie à l'université de Pennsylvanie), en collaboration avec Condoret, est à l'origine d'une enquête épidémiologique qui a montré que la survie des citadins atteints de troubles vasculaires graves d'origine psychosomatique est en moyenne plus longue chez ceux possédant un animal familier, la présence animale faisant baisser la pression artérielle et contribuant à diminuer la fréquence cardiaque, la glycémie, et le taux de lipides sanguins. 111 En 1975, R. Mugford et J. M. Comisky ont montré que le chien semble favoriser les interactions sociales, cette capacité prenant tout son intérêt pour ceux qui en sont privés (malades, personnes âgées, détenus, etc. ). Ils sont les premiers à utiliser le terme de lubrifiant social pour décrire l'augmentation du contact social grâce aux animaux. 112 113 En 1977, K. Zarrouk prouve l'existence d'une influence des animaux familiers sur les processus physiologiques de l'homme. En effet, il a découvert une diminution de l'expression urinaire des 17-hydroxycorticostéroïdes chez les individus en relation avec eux. 114 106 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. p. 22 107 ANSORGE. La médiation équine comme outil thérapeutique. 2011 108 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 109 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 110 CHARBONNIER. Thérapie facilitée par l'animal et maladie d'Alzheimer. 2010 111 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 112 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 113 HERADE. Le chien, auxiliaire en logopédie orthophonie. 2010 114 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 50 En 1981, les études de Corson et Corson démontrent que les chiens et les chats placés dans des institutions gériatriques agissent sur les pensionnaires comme des catalyseurs de relations sociales . 115 En 1983 et 1986, les études de Katcher, Friedmann et Thomas montrent que caresser un animal familier réduit de façon significative la pression artérielle, la température de la peau et la fréquence cardiaque. 116 117 118 Louise Sherpell a démontré que l'animal familier permet à son propriétaire de vivre plus vieux et en meilleure santé, ainsi que de diminuer les risques de fractures du col du fémur. 119 En 1986, la dénomination Thérapie avec le cheval est adoptée, et la Fédération nationale de thérapie avec le cheval (FENTAC) est créée, et dispense des formations pour les personnes désirant travailler avec le cheval et les personnes handicapées. 120 Belin (2000) explique très bien les dernières recherches dans le domaine de l'aide de l'animal à l'homme : Durant les années 1980, divers auteurs étudient et montrent le rôle de l'animal facilitant la thérapie dans le cas d'état dépressif en provoquant une diminution de l'anxiété [C. M. Brickel (1980), C. Jonas et A. Feline (1981), W. F. Mc Culloch (1983), A. M. Beck (1983)]. Toutes les expériences réalisées tendent à prouver que l'animal est réducteur de stress par son contact visuel, verbal et tactile. Des études initiées aux Etats-Unis par R. Mugfort et J. M. Comisky (1974) et confirmées par Hines (1980/1983) montrent les effets bénéfiques des animaux de compagnie sur la santé des personnes âgées à domicile. Il en est de même en collectivité o des cas spectaculaires d'amélioration de santé sont décrits. C. Bouchard et Ch. Delbourd rapportent une expérience, datant de 1982, mettant des jeunes enfants déficients mentaux en contact avec les biches d'un parc animalier et ceci à l'occasion de visites régulières. Les enfants, généralement repliés sur eux-mêmes, et les biches qui peuplent le parc ont pu établir une véritable relation (Nicolas, un petit blond âgé de sept ans, brandit une carotte au dessus de sa tête ; confiante, une biche se dresse, prend appui sur les épaules 115 VERNAY. Le chien partenaire de vies. 2003 116 ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996 117 ARENSTEIN. La zoothérapie. 2012 118 MONTAGNER. L'enfant et les animaux familiers. 2007 119 ARENSTEIN. La zoothérapie. 2012 120 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 51 de l'enfant, saisit la carotte, et reste près de lui sans crainte ; etc. ) . Cette expérience avec les enfants de l'Institut médico-éducatif du Clos Olive à Toulon (Var) a été suivie par Boris Cyrulnik, Directeur d'enseignement en éthologie à l'Université de Toulon-Var. Celui-ci a constaté que ces enfants, qui ont tant de mal à communiquer avec leur famille et leurs éducateurs, trouvent aussitôt, naturellement, le moyen d'aborder un animal sauvage : [] jamais de face ou en les regardant dans les yeux, contrairement à ce que font les autres enfants []. Ils ont la même timidité que l'animal, les mêmes réserves, et ne l'approchent que par derrière ou de côté, détournant le regard. C'est un code universel, ou presque, chez les êtres vivants. C'est un code que nous avons oublié . Interviewé par le Journal des psychologues, en 1999, Boris Cyrulnik confirme que certains enfants autistes peuvent caresser des biches qui se laissent faire alors qu'elles fuient devant un enfant qui parle, et indique que l'on peut voir aussi certains enfants autistes sourire l'eau au contact des dauphins. 121 jusqu'aux oreilles dans Actuellement, thèses, mémoires et études sur le sujet ne cessent de se multiplier. Ce type de thérapie est en effet en plein essor, dans de nombreux métiers. Enfin, en 2010 a eu lieu la douzième conférence internationale sur les interactions homme/animal (la première ayant eu lieu à Londres, en 1977). Ce genre de pratique prend en effet de l'essor dans le monde entier, et nous comprenons d'autant plus les bienfaits que peuvent nous apporter les animaux, dans tous les domaines, et de quelle manière. Il y est souvent question d'expériences mettant en scène les animaux et les hommes, ces derniers bénéficiant de la présence de l'animal tant sur le plan psychique que le plan physique. Les chercheurs constatent. Mais dorénavant, ils veulent plus : quantifier, reproduire, et peut- être même, à moyen terme, prescrire. 4. Intérêts Le rôle des animaux a longtemps été cloisonné à celui d'animal de compagnie, ou bien de partenaire utilisé à des fins uniquement productives. Il a été élargi ces dernières années. Plusieurs études mettent en évidence le rôle non négligeable que certains animaux peuvent jouer dans certains domaines thérapeutiques et éducatifs. Ainsi, ils permettraient l'amélioration de la qualité de vie de nombreuses personnes atteintes d'handicaps divers. 121 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. p. 21 52 La zoothérapie ne se fait pas pour le plaisir d'emmener son animal au travail, ni pour en côtoyer encore dans le cadre de son métier. Si c'était le cas, la zoothérapie ne serait absolument pas fondée, et on ne l'appellerait pas zoothérapie non plus. L'animal entranerait aussi le rire par son comportement et sa complicité avec le patient et le thérapeute. Il apporterait du sens de l'humour, ou aiderait le patient à le trouver. Et ses comportements joyeux encouragent la bonne humeur. 122 Exercer sa profession avec la médiation d'un animal ou de plusieurs animaux aurait de nombreux effets positifs, exposés dans les chapitres suivants. 4. 1. Effets pour le patient 123 124 L'animal serait un intermédiaire relationnel entre le patient et le thérapeute. Mais il n'est pas un thérapeute : il est le support grâce auquel la médiation va être possible. Car cette aide n'existe que si le thérapeute verbalise et donne du sens à ce qui se joue en séance. Il s'agirait d'un décryptage des symbolisations, et un accompagnement vers la symbolisation. La différence du matériel ou de la pâte à modeler serait le caractère non- malléable de l'animal, avec la nécessité de respecter les contraintes de sa présence. En effet, le patient peut rêver, imaginer et projeter un peu de son histoire dans ce cadre. Mais il se confronterait aussi à la réalité de l'animal, qui se trouve être à la fois vivant, communiquant et sociable. L'animal se présente avec ses propres qualités physiques (odeurs, stature, aspect), et ses qualités abstraites (modalités relationnelles), qui ont l'avantage d'être constantes. L'animal de compagnie ne serait pas incongru, ne présenterait quasiment pas de danger au contact physique, offrirait une attention soutenue, respecterait la confidentialité et serait toujours disponible125. L'animal ne juge pas selon l'aspect physique, les attitudes ou les pensées dites bizarres , mais il réagit au comportement, selon qu'il le perçoit comme menaçant ou non, comme source d'inconfort ou de plaisir. L'animal porte donc une certaine régularité dans son comportement et dans les réponses 122 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 123 ANSORGE. La médiation équine comme outils thérapeutique. 2011. 124 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 125 STEWART (1996), dans ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 53 qu'il fournit, posant des limites immédiates et clairement identifiables. Il permettrait ainsi au patient de mieux repérer les comportements adaptés, en fonction des contextes, et ainsi aborder tout ce qui relève des codes sociaux, en laissant libre cours à son expression, quelle qu'elle soit, dans un cadre contenant. Ne se sentant pas jugé ou même trahi, le patient pourrait aussi exprimer ce qu'il ressent, perçoit et pense. Par son attitude d'écoute apparente, l'animal familier aurait le pouvoir d'apaiser et de rassurer le patient qui lui parle et le regarde, mais aussi de lui donner confiance en lui, et lui permettre de dépasser ou de relativiser ses peurs. Les patients qui souffrent de troubles psychiques peuvent y voir une passerelle affective, un lien possible avec le monde dont ils s'éloignent. Ceux qui sont en rupture avec la société réapprendraient auprès de lui à prendre soin l'un de l'autre, le respect, à être responsable, et à plus longue échéance à accepter les règles communes126. Les personnes ayant des difficultés importantes sur le plan de la communication, comme une déficience auditive, une aphasie, une dysarthrie, des troubles cognitifs (comme la maladie d'Alzheimer), un stade de maladie avancé induisant une fatigue extrême ou de la somnolence, y trouveraient aussi leur compte. L'animal de compagnie accepterait volontiers ces conditions de travail. Il ignorerait les difficultés qu'éprouvent les patients, et il écouterait attentivement, sans signe d'impatience. Ce serait d'ailleurs l'une des raisons pour lesquelles les animaux nous sont tellement chers, peu importe notre état de santé. Même si la parole lui échappe totalement, le patient réussirait à communiquer à un autre niveau : par un échange de gestes, de regards et de touchers avec l'animal. Cet échange permettrait d'ailleurs aux proches et au personnel soignant d'observer une communication qui, bien que non dans la norme, réussirait à satisfaire certains besoins du patient, tout en éliminant les nombreuses exigences de la communication verbale. 127 L'animal favoriserait le développement d'une relation thérapeutique. Avec son effet apaisant, il jouerait un rôle de catalyseur et de médiateur entre le malade et son thérapeute ou son entourage. L'animal ne porte aucun jugement. Il serait l'antidote parfait à nos solitudes, à nos tensions, à nos appréhensions, à notre anxiété. De plus, l'être 126 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 127 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 54 humain a besoin de repères (et particulièrement les enfants). L'animal jouerait ce rôle de repère. 128 Toute interaction avec l'animal nous obligerait à revenir au moment présent, le seul qui nous importe. En effet, d'après Arenstein, il nous enlèverait les ruminations stériles du passé et les rêves hypothétiques du futur 129. L'animal deviendrait un véritable médiateur dans le cas de patients très retirés, voire hostiles, et lorsque le thérapeute est désemparé. Le patient reprendrait sa place, et ne serait plus simplement un malade. D'après Hutton (1992)130, les animaux de compagnie semblent incarner plusieurs des caractéristiques recherchées chez les travailleurs sociaux. Par exemple, ils auraient tendance à favoriser chez les gens le recours à leurs propres capacités pour s'aider, seraient capables d'établir rapidement des relations et de les maintenir, et seraient sensibles aux sentiments et émotions d'autrui. 4. 1. 1. Physiologie Beiger (2008) affirme qu'il est reconnu que parler à un animal ralentirait le rythme cardiaque, alors que parler à une personne l'augmenterait. 131 Un animal rassurerait et apaiserait le patient (effet relaxant), favoriserait le contact, aiderait à communiquer et à recréer des liens sociaux (facilitation sociale). En effet, les animaux pourraient produire un état de détente presque immédiat, un état psychologiquement rassurant, par le simple fait d'attirer et de maintenir notre attention. Selon Stallones, l'animal serait un appui social réduisant et amortissant le stress. Bien entendu, il faut que l'animal lui-même soit tranquille, et que la personne n'ait pas peur de lui132. 128 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 129 ARENSTEIN, dans DE PALMA. Entre l'humain et l'animal, La zoothérapie. 2013. p. 75 130 Dans ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 131 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 132 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 55 L'interaction avec des chiens peut faire augmenter la sécrétion de sérotonine (hormone qui contribue à lutter contre la dépression). La méta-analyse de Souter et Miller (2007) révèle d'ailleurs que les symptômes associés à la dépression sont réduits dans les cinq recherches étudiées. 133 L'animal se blottit souvent contre une plaie ou une douleur. En effet, sa chaleur corporelle et énergétique réconforterait et apaiserait. L'hypothèse de la biophilie aiderait à expliquer pourquoi les animaux peuvent induire un tel état d'alerte calme : à travers l'évolution, les êtres humains et certaines espèces animales ont été mutuellement dépendantes : la survie de l'Homo Sapiens aurait dépendu de façon fondamentale de l'alerte et de la surveillance suivie de la vie végétale et animale. Il se serait adapté aux rythmes de vie animale autour de lui. Les animaux seraient devenus des sentinelles, et leur comportement nonchalant signalait que tout allait bien. Ainsi, une présence animale calme et amicale se serait associée au sentiment de sécurité, et aurait alors induit le sentiment de relaxation chez l'humain. Regarder les animaux en paix pourrait donc créer une combinaison d'excitation moindre, d'attention soutenue et de vivacité, ouvrant le patient perturbé de manière totale à la rééducation. 134 De cette manière, le simple fait que l'animal se repose dans un coin de la pièce ou aux pieds du patient aurait d'énormes effets. De plus, le fait que l'animal de compagnie offre peu de signaux interprétatifs éviterait de surcharger nos systèmes perceptifs et interprétatifs. En effet, dans la plupart des relations humaines normales, notre cerveau doit traiter une immense quantité de signaux de manière quasi simultanée. D'un côté nous avons besoin d'être en relation avec les autres, mais d'un autre cela peut s'avérer très fatiguant et stressant. L'animal quant à lui n'exigerait aucun traitement d'information verbale, favoriserait la concentration, l'observation, et la tranquillité. 135 De manière générale, les animaux familiers auraient pour effets une réduction de l'insécurité affective, de l'anxiété et des peurs, un développement du bien-être, de la confiance en soi et de l'auto-estime, une modification des comportements (comme une diminution de la fréquence et de la durée des comportements autocentrés, des évitements, des phases d'hyperactivité , des agressions ), une amélioration des 133 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 134 MELSON. Les animaux dans la vie des enfants. 2009. 135 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 56 capacités de communication et de sociabilité, une réduction voire une disparition des symptômes psychosomatiques tels qu'une amélioration du sommeil, de l'appétit, une atténuation des allergies, etc. On remarque aussi une fréquence moindre des maladies, une amélioration de la convalescence136, une diminution du stress et de l'anxiété (le système nerveux parasympathique étant touché positivement), une diminution de la pression artérielle137 D'ailleurs, une étude d'Allen et al (1991)138 a montré que les individus avaient une réactivité psychologique moindre lorsqu'une tâche stressante (résoudre des problèmes arithmétiques) était effectuée en présence d'un chien, en comparaison avec la même tâche effectuée en présence d'un chercheur ou d'une personne amie. 4. 1. 2. Cognition L'animal est un médiateur qui aiderait à responsabiliser, sensibiliser, et aider le patient dans son cheminement cognitif. 139 La libération des émotions et des affects s'accompagnerait d'une libération de compétences de base. Ces dernières fondent le développement affectif, relationnel et social du patient (et particulièrement de l'enfant), mais aussi son développement cognitif. 140 L'animal médiateur permettrait aussi une meilleure orientation temporo-spatiale, une stimulation sensorielle (contact avec la réalité, expression des sentiments, amélioration de la concentration), une meilleure motricité, et de la remotivation. L'animal est utilisé comme communicant. Il pourrait ainsi permettre aux psychotiques de différencier la réalité interne de la réalité externe, et donc s'ouvrir au monde, de s'organiser contre les agressions extérieures avec les conséquences de tension qui en découlent. 136 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 137 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 138 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 139 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 140 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 57 Le Docteur Jack Mackay, psychiatre, considère que le contact de l'enfant avec l'animal serait du plus grand intérêt pour son développement affectif, psychologique et social. Cela serait d'autant plus vrai pour des enfants présentant des difficultés de développement, des problèmes d'isolement ou des problèmes relationnels141. 4. 1. 3. Interactions sociales Il a pu être observé que les animaux suscitent des interactions sociales qui commenceraient d'abord entre le thérapeute et le patient, pour ensuite s'élargir aux autres patients, ainsi qu'aux membres du personnel (Etude menée auprès de trente personnes âgées plutôt renfermées, dans un hôpital psychiatrique, aux Etats-Unis). Le contact des animaux et des malades favoriserait un sens des responsabilités et un sentiment d'utilité (Corson & Corson). François Beiger précise : Les activités reliées à l'animal minorent les atteintes psychiques et physiques dues au handicap. C'est un médiateur qui est à la fois un passeur de communication, un chanon de la reconstruction sociale. Il sait apporter la dimension du temps et de l'espace pour permettre d'aboutir à une réalité. Il minimise le sentiment d'exclusion et réduit au minimum l'angoisse de la majorité des personnes. Cela permet à l'enfant ou à l'adulte en difficulté de se confier et de créer des liens affectifs avec l'animal. Il va se développer une confiance. Cette relation peut débuter par le toucher. Elle peut aussi exister dans la responsabilité d'un travail avec l'animal. C'est ce que j'appelle la revalorisation par la médiation d'un animal. François Beiger142 4. 1. 4. Communication D'après Lafrance, Garcia et Labreche (2006)143, la présence d'un chien permet d'augmenter chez une personne le langage expressif verbal et non verbal. Dans le dialogue avec les animaux, le canal non verbal resterait totalement ouvert, et souvent dominant. Les dialogues sur plusieurs niveaux aideraient les patients, et surtout les enfants, à développer leur intelligence émotionnelle, qui n'a que récemment pris place 141 Dans ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 142 Dans BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. p. 4 143 Dans ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 58 en tant que domaine d'étude spécifique, à côté de l'intelligence cognitive et analytique. La communication non verbale pourrait ainsi aider à affiner la capacité à saisir des indices sur l'état interne d'autres êtres vivants en fonction de leurs mouvements corporels, de leurs expressions faciales et du ton ou de la hauteur de la voix. En effet, il se trouve que les enfants s'intéressant à leur animal expriment plus d'empathie et sont plus compétents pour prédire comment les autres vont réagir dans différentes situations. 144 De plus, la communication non verbale de l'animal permettrait un échange plus transparent, o les problèmes d'interprétation liés à la polysémie du langage n'auraient pas lieu d'être. C'est peut-être pour ces raisons que lorsque la communication est réussie , le patient a le sentiment d'une complicité avec l'animal de l'ordre d'une communication quasi-fusionnelle. D'autant plus que celle-ci passerait essentiellement par le corps145. En effet, selon Boris Cyrulnik (1999)146, si l'établissement de relations privilégiées existe, c'est qu'au contraire des relations interhumaines, celles-ci ne sont pas ambivalentes, mais pures, alors que les relations humaines varient en fonction de l'humeur et des attentes de chacun, et laissent une place certaine à l'inconnu. L'établissement de relations privilégiées avec les animaux nous sécuriserait par leur simplicité et leur stabilité dans le temps. 4. 1. 5. Substitut affectif L'animal pourrait aussi remplir un rôle de substitut affectif auprès de personnes en mal d'affection (mal-être social, perte d'un être cher, etc. ) et/ou de substitut physique auprès de personnes présentant un handicap147. Les animaux familiers auraient une forte possibilité de déverrouiller le monde intérieur du patient, et de l'installer sur un versant de sécurité affective, dès lors que le patient perçoit une possibilité d'accordage, levant ainsi les éventuels blocages et inhibitions148. La thérapie assistée par l'animal permettrait aux intervenants de mieux comprendre les patients dans leurs peurs, leur anxiété et leur angoisse. Les émotions deviendraient plus 144 MELSON, Les animaux dans la vie des enfants. 2009. 145 ANSORGE, La médiation équine comme outils thérapeutique. 2011. 146 Dans VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 147 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 148 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 59 palpables. Avec l'aide du thérapeute et de l'animal, le patient aurait davantage confiance en le monde qui l'entoure, et, à des degrés divers, aurait de meilleurs contacts avec la réalité. L'animal transmettrait aussi de l'affection et de l'amitié : il ne laisserait quasiment jamais le patient indifférent. Au contraire, il l'aiderait à faire face à l'isolement ou à une solitude due à une incompréhension dans les relations avec l'entourage. De plus, il permettrait au patient de se valoriser, de trouver son moi , et de canaliser ses émotions. 149 Il suffirait d'une présence animale d'à peine quelques minutes pour atteindre une multitude d'objectifs. Ainsi, l'animal pourrait permettre aux personnes apathiques et complètement retirées de la communication d'exprimer de l'affection et d'autres émotions, de retirer du plaisir du contact physique, un sentiment de bien-être et d'augmentation de l'estime de soi par l'amour inconditionnel de l'animal. 150 4. 1. 6. Effets particuliers pour les patients atteints d'autisme J'ai travaillé avec des adolescents trisomiques et autistes qui ne parlaient pratiquement pas et j'ai pu analyser positivement le dialogue gestuel qui se mettait en place avec les chiens. Le simple fait de tapoter dans les mains pour indiquer à l'animal que l'enfant entrait dans son territoire créait un climat de confiance. En développant cette forme de dialogue, l'enfant pouvait vivre des situations qui lui donnaient la possibilité de se structurer dans une communication qu'il ne découvrait que grâce à cet échange gestuel avec l'animal. Son mutisme, son isolement, son agressivité, son rejet, sa peur étaient autant de problèmes qui étaient canalisés, voire diminués. Cette attitude rendait également l'enfant beaucoup plus serein, plus calme dans son approche. F. Beiger151 Cet extrait de François Beiger est représentatif des différents apports pour les personnes autistes, présents dans la littérature. Les apports sont très variés, mais surtout très marquants : climat de confiance, structuration de la communication, échanges gestuels, diminution de troubles tels que le mutisme, l'isolement, l'agressivité, le rejet 149 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 150 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 151 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 60 et la peur. Rares sont les personnes arrivant à débloquer seules de tels troubles, dans cette pathologie. Dans le chapitre 2. Avec quels animaux et pourquoi, nous allons voir d'autres bienfaits, plus spécifiques, qu'apportent certains animaux à la majorité des personnes autistes. 4. 1. 7. Effets particuliers pour les démences type Alzheimer Dans la maladie d'Alzheimer, la présence animale permettrait de maintenir ou de développer un mode de communication verbale, mais surtout non verbale, par le toucher, le sourire, le rire, la caresse et l'observation. La présence d'un chien sur une base régulière aurait un effet calmant, qui diminuerait l'irritabilité. Il favoriserait aussi les contacts sociaux positifs. Cela se manifeste par des rires et un échange de regards. En s'occupant de l'animal, le patient plongerait alors dans son répertoire de comportements acquis de longue date comme brosser, caresser et nourrir, ce qui lui procurerait un sentiment de valorisation, et favoriserait les réminiscences. Nous verrions en effet souvent leur visage s'illuminer et leurs yeux pétiller, avec souvent l'envie de parler. La communication, même non verbale, serait très favorisée. De plus, la fourrure de l'animal contre leur peau procurerait un sentiment de sécurité et provoquerait l'émergence d'émotions. Le fait de voir et toucher un animal peut déclencher des réactions émotionnelles intenses, qui peuvent réactiver certains souvenirs lointains ayant un rapport avec un animal. Et alors qu'un patient peut ne pas avoir parlé pendant très longtemps, une conversation peut s'engager entre le patient et le thérapeute. Par exemple, une dame va raconter une anecdote de sa vie qui amènera l'intervenant à la questionner au sujet de certains détails, qui peuvent parfois faire ressurgir d'autres souvenirs. La personne malade peut ainsi avoir accès à des souvenirs qui la plongent au cœur d'elle-même, ce qui favorise une communication significative entre elle et le thérapeute. 61 D'après Arenstein, dans La zoothérapie, la zoothérapie aurait de nombreux bienfaits sur les personnes démentes, dont : 152 Une stimulation des fonctions mentales supérieures (concentration, mémoire à court et long terme, orientation) ; Une stimulation de la dextérité manuelle et de la marche ; Une stimulation de l'affect ; Une stimulation de l'élocution ; Une stimulation du lien social (car c'est une source d'objet et d'affection, le partenaire d'une relation dans laquelle il n'y a pas de jugement, favorise la distraction, facilite les contacts sociaux et citoyens) ; Une baisse de la pression artérielle ; Une baisse de la perception de la douleur ; Une aide à la prise de médicaments ; Une stimulation pour participer à certaines activités de la vie quotidienne, activités recréatrices et occupationnelles ; Un apaisement favorisé, par le toucher soyeux, le contact physique. L'environnement devient sécurisant. Et ils peuvent mieux s'adapter à l'environnement, en recréant parfois des liens d'attachement. ; Un développement de la valorisation, en lui permettant de se sentir responsable. ; Une diminution de certains comportements perturbateurs (de manière ponctuelle), tels que l'écholalie. Il est important que l'intervenant se mette à hauteur de la personne et l'aide à caresser l'animal, doucement, de la main, et ce sans parler, afin de ne pas susciter la parole, le but étant de calmer et non de stimuler. Le rythme de la caresse aura un effet apaisant et pourra remplacer l'écholalie. Ils retrouveraient ainsi une part d'autonomie, à réinitialiser certaines fonctions telles que la marche, le langage, le toucher, l'attention. 152 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012 62 4. 1. 8. Effets particuliers pour les personnes âgées en institution Pour les personnes âgées en institution, nous remarquons ces différents apports : 153 154 155 Une responsabilisation vis-à-vis de l'animal, engendrant une motivation supplémentaire pour vivre et par la même volonté de demeurer le plus autonome possible ; Une augmentation des interactions entre les gens, ainsi qu'une amélioration de l'état d'esprit des résidents et du personnel ; Des conversations plus longues et touchers plus fréquents, lorsqu'une activité de groupe inclut un animal ; Une augmentation des interactions sociales et une diminution du sentiment de solitude ; Une stimulation des fonctions cognitives supérieures ; Une amélioration de la mobilité, de la motricité fine ; Une amélioration de la capacité d'interaction verbale et non verbale, et d'attention ; Une amélioration de la mémoire à court mais aussi à long terme ; Une stimulation des fonctions sensorielles (odorat, toucher, ouïe, vue, parole) ; Une amélioration du fonctionnement cardiovasculaire. C'est la conséquence directe de la diminution du sentiment de solitude et du stress, ainsi que de l'incitation à l'exercice physique. De plus, la pression artérielle diminue. Et de manière générale, les résidants de l'institution fréquentent moins le médecin, et il y a une moindre consommation de médicaments. ; Un maintien de la vigilance et une stimulation de la mobilité ; Une augmentation du contrôle de soi ; Une valorisation, une augmentation de l'estime de soi, et une confiance en soi favorisée ; 153 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 154 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 155 MARTIN. La médiation animale : accompagner la personne âgée autrement. 2013. 63 Une résurgence de souvenirs, en rapport avec des animaux ; L'isolement se brise ; Une détente du patient, avec une angoisse réduite ; Un accompagnement en fin de vie. Avec les personnes âgées, l'animal réveillerait les souvenirs, bousculerait les idées moroses, entretiendrait l'estime de soi, combattrait le repli sur soi, briserait l'isolement, les pousserait aux prouesses physiques et les détendrait, l'angoisse se réduisant156. 4. 1. 9. Effets particuliers pour les enfants, en rééducation Melson et Al (1992)157 auraient identifié deux aspects de l'intelligence émotionnelle pour lesquels la coexistence avec les animaux aurait des effets positifs sur les enfants : La théorie de l'esprit : les humains sont intrinsèquement motivés pour décoder la signification de la conduite animale. Lorsqu'ils le font, ils acquièrent une meilleure compréhension de leur propre fonctionnement. Les enfants, auraient plus de facilité à comprendre les pensées et les sentiments des animaux que ceux des humains. Le développement de la compréhension non verbale : l'interaction avec les animaux de compagnie pourrait aiguiser l'habileté des enfants à décoder des signaux non verbaux. La présence de l'animal dans les écoles spécialisées comporterait aussi de nombreux avantages : 158 Il serait une source de plaisir et de satisfaction indéniable ; Le sens des responsabilités semble se développer plus tôt chez les jeunes patients ; 156 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 157 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 158 GUINOT. L'animal et l'enfant. 1983. 64 Chez les aveugles, l'animal sensibiliserait plus souvent et plus efficacement ses sens pour d'autres acquisitions ; Il serait une source d'activité, et il y donnerait du sens ; Il aiderait à peupler une solitude lors de changement d'établissement. L'enfant se sentirait en effet plus rapidement en sécurité, et l'atmosphère deviendrait plus agréable, presque familiale. De manière générale, la thérapie assistée par l'animal apporterait à l'enfant : Une diminution du stress, Un sentiment de sécurité, Une augmentation de l'estime de soi, Un développement de la confiance en soi, Une source énorme de motivation, Une amélioration de la mémoire auditive, visuelle, sensorielle, Une amélioration de la mémoire à court et long terme, Une stimulation de la communication, de la verbalisation, de la socialisation, Une fidélité à la thérapie, Le développement de sa motricité fine et globale, Le développement de ses capacités intellectuelles, Le contrôle de soi (hyperactivité, colères, crises ), L'expression des émotions, Une motivation pour le langage et pour la lecture. La relation avec l'animal permettrait à l'enfant de renforcer sa propre valeur. Elle serait un renforcement de fonctionnement cognitif, notamment de la communication sociale et de la capacité à matriser le langage non verbal. 65 Cette relation aiderait l'enfant à la séparation d'avec les parents, et jouerait un rôle important dans la prise d'indépendance. Il découvrirait son environnement grâce à l'animal. Enfin, l'enfant apprendrait à imiter et à construire son empathie, grâce à lui. 159 4. 1. 10. Effets particuliers pour les personnes hospitalisées La résolution des problèmes, la communication, la prise de décisions et le partage avec les autres sont des bénéfices très importants 160. Ainsi, la relation patient-animal permettrait d'observer des changements selon plusieurs aspects fonctionnels : 161 Aspect biologique et psychologique : nous remarquons une diminution du stress, de l'anxiété, de la douleur, des nausées, des vomissements, de la pression artérielle et de la fréquence cardiaque. Mais le rapport avec l'animal entrane aussi une augmentation de l'appétit, de l'exercice physique, de l'endurance à la fatigue 162, de la coordination et des sensations tactiles, il favorise le repos, et procure un sentiment de sécurité. Aspect intra-personnel : cette relation développe le sens des responsabilités, procure un sentiment d'utilité, augmente l'estime et la confiance en soi, et offre une source de motivation. Aspect interactionnel : cette relation favorise et stimule la communication, la verbalisation, la socialisation, le partage de soi, le soutien et le réconfort, brise l'isolement, diminue l'agressivité envers les autres. Aspect comportemental : on remarque une augmentation de la participation aux activités, ainsi que de l'autonomie, et une fidélité aux traitements plus forte. La présence d'un chien dans les milieux hospitaliers, que ce soit pour les adultes ou les enfants, aiderait les personnes hospitalisées à mieux accepter leur maladie, leur convalescence, à leur donner un sentiment d'utilité, de sécurité, et de complicité, comme l'ont prouvé de nombreuses recherches aux Etats-Unis et au Canada. L'animal 159 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 160 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 161 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 162 ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996. 66 permettrait de rendre plus acceptable le lieu de séjour du malade, de le rendre plus accueillant et plus humain, ces établissements étant parfois déstructurants pour la personnalité des résidents163. La présence d'un chien et de sa réceptivité au contact et aux relations donneraient un sentiment de confiance affective. Ces liens accélèreraient et favoriseraient le contact avec le monde médical, et rendraient plus acceptables l'hospitalisation et ses traitements. Cette relation encouragerait l'expression des émotions, aussi bien positives que négatives (la peur, la joie, la fierté, la douleur, l'inconfort )164. Le témoignage de cette jeune patiente hospitalisée est assez parlant : Ca m'a fait beaucoup de bien, dit Julia. Quand j'étais avec Picotti, je pouvais me détendre et ne pas penser à ma maladie. Il me faisait tout oublier et je me sentais plus humaine. J'aurais pu lui parler pendant des heures. Il me donnait beaucoup d'affection. J'acceptais la prise de médicaments qu'en la présence de Picotti. Témoignage de Julia, enfant hospitalisée. 165 Le chien médiateur pour enfants malades en milieu hospitalier a montré des résultats probants : il y aurait en effet eu des changements positifs, selon quatre dimensions thérapeutiques de la relation enfant-animal : 166 L'aspect bio-psycho : anxiété, douleur, alimentation, repos, nausées, vomissements, exercice physique, sécurité L'aspect intra-personnel : sentiment d'utilité, lien d'amitié, estime de soi, confiance en soi, fierté, motivation L'aspect interactionnel : communication, partage de soi, verbalisation, socialisation, soutien et réconfort, ennui et isolement, agressivité envers les autres L'aspect comportemental : participation aux activités, acceptation, autonomie, fidélité aux traitements Ainsi, dans des programmes de journée avec un chien pour des enfants hospitalisés atteints de cancer, on remarque que les enfants ont moins besoin d'analgésiques et sont moins centrés sur leur maladie. Ils se sentiraient aussi plus en confiance à l'hôpital, en 163 ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996. 164 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 165 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. p. 165 166 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 67 menant une vie un peu plus proche de la normale. Ils ont le privilège d'être le matre du chien le temps d'une journée, dans la Chambre des rêves . Il y aurait ainsi une baisse des symptômes dépressifs, de la tension, de l'anxiété, et parfois même des douleurs et des nausées. L'enfant se sentirait utile et responsable, et devrait donc développer une attitude de vigilance, et être attentif aux besoins du chien, ce qui le décentrerait de sa maladie, et susciterait un sentiment de fierté. Le chien deviendrait une source de réconfort, un confident avec lequel il peut partager son vécu. Les infirmières et les parents qui côtoient régulièrement ces enfants se sentiraient impuissants face à cette souffrance souvent impénétrable. Ils témoignent que derrière une porte o se logent la peur, l'ennui, la peine, l'isolement et aussi la colère. Une porte solidement verrouillée, difficile à ouvrir pour l'entourage, sauf pour le chien. [] On ne saura jamais définir ou expliquer ce qui se passe vraiment entre le chien et l'enfant. Ce qu'on sait, c'est ce qu'on voit. Ce qu'on voit, c'est de la magie, des yeux qui s'illuminent. Un sourire qui était disparu depuis des jours, des semaines et qui revient. Le cœur de l'enfant s'ouvre à nouveau à la vie. Le chien ne juge pas l'apparence de l'enfant malade, il est dépourvu d'esprit critique et de jugement. Il ressent sa détresse, mais aussi sa joie d'être en sa présence. 167 Fine (2006) montre que l'animal de compagnie est déjà employé dans une variété de milieux hospitaliers et communautaires, afin d'atteindre les gens dont la capacité d'interagir avec autrui est réduite. Le témoignage suivant montre un des apports de l'animal pour les personnes hospitalisées : Avec mon chien, je cours dans ma tête . Le chien va aider l'enfant dans un processus de dépassement, voir de sublimation de son handicap. Quand un enfant est amputé, il va nous dire : Ca repousse quand ? Et il ne comprend pas ce qu'on essaie de lui expliquer. Grâce au chien, il ne va plus rêver qu'il va guérir, mais accepter la réalité. J'ai un handicap, d'accord, j'ai compris avec son aide. Je peux recommencer à construire d'autres bases. Le chien, c'est l'étayage, la première petite marche pour commencer à rêver. Et pour oser se montrer tel qu'on est désormais. Pr. Marcel Ruffo168 N'oublions pas qu'avant de côtoyer l'animal vivant, l'enfant a droit, dans un premier temps, à l'animal doudou, à l'animal jouet, à la peluche, aux puzzles, aux livres, aux 167 DE PALMA, Ente l'humain et l'animal, La zoothérapie. 2013. p. 39 168 Dans VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 68 histoires, aux images, etc. , grâce à quoi tout devient moteur, repère, et expression directe de l'attirance. L'animal jouet (et même le vrai animal), permet à l'enfant de faire ses premiers pas, ses premières découvertes de vie. Et c'est par ces contacts que peut se développer la médiation thérapeutique de transition. D'après François Beiger, c'est le champ d'action transitionnel par médiation animale . Ainsi, l'attention que nous portons aux problèmes de l'enfant, ainsi que l'étude qu'on en fait, permettraient à la médiation animale d'apaiser, pour valoriser, et alors donner un sens à la vie de l'enfant. Les relations avec les animaux familiers permettent à l'enfant de [] structur[er] les capacités de base (ou compétences-socles) de l'enfant qui sous-tendent son développement, et jouent un rôle essentiel dans le renforcement de son attachement initial, l'établissement de nouveaux attachements, la régulation de ses comportements et de ses conduites sociales, et ses processus de socialisation. Le contact avec les animaux familiers exerce également une fonction primordiale dans la structuration des processus cognitifs de l'enfant et dans le développement de ses ressources intellectuelles. Lorsqu'ils sont des partenaires, les comportements des animaux familiers stimulent en effet le fonctionnement cérébral de l'enfant (traitement des informations du monde extérieur, raisonnements structurés et organisation de la pensée). La curiosité, l'observation soutenue et sélective, la concentration intellectuelle et l'imagination activent les processus déductifs et inductifs dans une pensée en mouvement. En toute sécurité affective, les animaux familiers donnent ainsi à l'enfant des clés essentielles du savoir et de la connaissance. Ils lui apprennent à apprendre. 169 L'animal est celui qui force à avancer, qui installe la routine dans la normalité à la place du tour de force (particulièrement pour les personnes handicapées), et surtout, celui qui considère la personne, parfois handicapée, comme quelqu'un d'ordinaire. Ce faisant, il lui permettrait, dans une certaine mesure, certes, de s'accepter, de se dépasser peut-être, et de manière générale de reprendre une place dans la société. La présence de l'animal atténuerait le handicap en ce sens que les regards et discussions portent davantage sur 169 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. p. 32 69 l'animal que sur la personne en situation de handicap. Et les rôles s'inversent : les patients deviennent auteurs de soins et non plus objets de soin. 170 L'animal apporte une étincelle de vie dans un milieu qui, trop souvent, en manque singulièrement. Au moment de l'accueil, il représenterait l'objet transitionnel permettant de calmer d'éventuelles angoisses. 171 Il arriverait régulièrement que des patients n'ayant pas réagi à des prises en charge classiques s'améliorent grâce à la zoothérapie. 172 4. 2. Effets pour le thérapeute L'animal aurait aussi beaucoup d'effets bénéfiques pour le thérapeute. Il lui permettrait de ne pas mettre trop de pression sur le patient dans des moments de tension ou de difficulté. En effet, en se tournant vers l'animal, le thérapeute se détendrait, patienterait, se remettrait à l'écoute, et se rééquilibrerait pour ensuite revenir vers le patient avec un esprit plus ouvert. 173 174 La présence d'un animal aiderait à structurer l'interaction thérapeute-patient, sur les plans spatial et temporel, en orientant l'attention ainsi qu'en favorisant le développement d'une attention conjointe. Cette présence favoriserait aussi la concentration, en temporisant l'interaction et en diminuant les parasites. En effet, centré sur l'animal, l'échange ne serait pas trop saturé en éléments verbaux, et comporterait moins d'informations à traiter, moins de distraction et d'hyperactivité. 175 176 L'animal favoriserait aussi une impression positive du patient envers le thérapeute. En effet, une étude de Susan Hunt et ses collègues, de l'école vétérinaire de l'Université de Californie à Davis, a démontré que la présence d'un animal (quel qu'il soit) avec une 170 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 171 GUINOT. L'animal et l'enfant. 1983. 172 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 173 BEIGER, dans ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 174 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 175 BEIGER, dans ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 176 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 70 personne incitait hommes, femmes et enfants à entamer la conversation avec la personne qui s'en occupe, et à avoir plus d'échanges d'expérience et de rires que lorsque la personne est seule. En effet, l'animal donne une impression positive de la personne qui s'en occupe. Ils ont tendance à penser qu'elle est généreuse, amicale, calme D'autre part, les animaux constituent un prétexte pour amorcer la conversation. De ce fait, en situation de thérapie, l'animal rendrait le thérapeute, pour le patient, plus abordable, plus amical et appréciable, plus proche de lui, bref, plus humain . L'animal pourrait percevoir ce qui peut échapper au sujet de ses propres réactions. Il est dit que le chien de K. Lorenz comprenait dès le coup de sonnette si le visiteur était sympathique ou non. 177 Il est important pour le thérapeute de savoir observer et écouter l'animal avec qui il travaille. Il faut comprendre l'onde analytique qu'il dégage en tant que médiateur lorsqu'il travaille avec des personnes dans le besoin. L'animal, et surtout le chien, communiquerait au thérapeute son sentiment, sa sensation, la méfiance ou la confiance qu'il peut avoir envers la personne178. Cela nous est d'ailleurs montré dans la partie pratique de ce mémoire. Il serait le détecteur comportemental de la personne qui est en thérapie. Et il serait très souvent en mesure d'orienter le patient, mais aussi de donner des indices au zoothérapeute. Ainsi, il pourrait servir de sonnette d'alarme, lorsque les patients sont victimes de grandes souffrances psychiques et/ou physiques. De plus, être en relation avec un animal dans le cadre du travail, nous permet d'observer ses comportements et ses réactions, et d'être constant et méthodique dans notre demande et nos attitudes. L'animal nous permettrait d'apprendre la patience. Patience qui fait trop souvent défaut à l'humain, même au thérapeute. Il nous permettrait aussi d'étudier, de repérer les codes de communication relationnelle humain-animal, et d'en créer d'autres. De plus, l'animal nous obligerait à nous défaire de notre toute puissance, étant donné qu'il répond avant tout à son propre rythme. Il faut être à l'écoute de ses réactions. C'est ainsi que l'on dit que pour travailler avec un animal, il faut dialoguer avec lui : il demande que nous soyons à l'écoute de ses réactions. Il faut l'inciter par la confiance, et non par la 177 Dans GUINOT, L'enfant et l'animal. 1983. 178 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 71 contrariété et la violence. Ces règles permettraient à l'humain de mieux se connatre, de se dévoiler, et de contrôler plus facilement ses impulsions. 179 4. 3. Effets dans les services En effet, bien que souvent sujet à des rejets ou incompréhensions, lorsque les réticences sont dépassées (cf IV. 3. 1. ), l'animal apporterait du positif à tous les protagonistes. Il apporterait une autre dimension dans la démarche de soin : il dédramatiserait le contexte, apporterait de l'imprévu, de l'humour 180 Et il serait un partenaire social intégré à la notion d'équipe, qui favoriserait les échanges entre les membres du personnel soignant. Il serait un facteur de lien entre les différentes professions, permettrait une meilleure connaissance de ses collègues, ainsi qu'une meilleure compréhension du travail effectué par chacun. 181 II. Avec quels animaux, et dans quels buts ? La thérapie facilitée par l'animal se fait avec des animaux familiers. Ces derniers seraient considérés à la fois comme des amis qui font partie de la famille, des confidents qui peuvent tout voir et entendre, des complices qui ne trahissent pas et auxquels on peut accorder une confiance aveugle. Ils ne parlent pas et donc ne jugent pas, ne renvoient pas aux difficultés personnelles. De plus, l'animal est un interlocuteur infatigable et complaisant des monologues humains : il ne juge pas, et parat sincèrement intéressé182. Ces animaux familiers auraient la possibilité et la capacité de manifester spontanément des comportements nouveaux, nuancés, étranges, complexes et diversifiés, à la fois dans leur registre spécifique et dans les registres appris et façonnés au contact des humains. Leur capacité à décoder les signaux des humains et à s'ajuster à leurs conduites ainsi que 179 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 180 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 181 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 182 ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996. 72 leur flexibilité génèreraient le sentiment, ou la certitude, qu'ils s'accordent aux émotions et aux affects. 183 Les chiens et chats seraient, entre autres, les plus efficaces en termes de thérapie, de contact. En effet, nous y avons accès dans notre milieu naturel, qui est aussi le leur. Ce qui n'est pas le cas des dauphins par exemple (contact par la force des choses : il faut plonger dans la mer ou dans un bassin protégé, ou tout du moins s'y rendre : ce n'est pas le milieu naturel et quotidien des humains) et des animaux sauvages comme les singes (bien qu'ils soient sociables et de bonne volonté, ils restent exilés dans un monde bipède étranger, ils ne sont pas dans leur milieu naturel, et ne sont pas programmés pour vivre la vie des hommes au milieu des hommes). Nous verrons malgré tout les avantages et inconvénients que peuvent procurer chacun des animaux aux patients. Psychologues et comportementalistes ont étudié les effets de différents animaux sur nos humeurs : nous y retrouvons une amélioration de l'estime de soi, une diminution du stress, et un renforcement du lien social. Chaque animal est susceptible de nous apporter une existence meilleure. Cependant, tous les animaux n'ont pas les mêmes caractéristiques, ni les mêmes avantages et inconvénients ; ils n'apportent pas les mêmes choses à l'homme, particulièrement en thérapie. Examinons à présent les caractéristiques des animaux familiers principalement utilisés en thérapie. 1. Le chien 1. 1. Généralités Le chien demeurerait sans conteste l'animal privilégié de la zoothérapie. C'est d'ailleurs le meilleur ami de l'homme . Doux et docile pour la grande majorité - s'il est bien choisi, qu'il a bénéficié d'une base affective sécure auprès de sa mère, n'a pas été sevré trop tôt - il attirerait l'attention par sa bonne humeur apparente, il serait facile à éduquer (pour 183 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 73 peu que soient évitées quelques erreurs comportementales humaines), et ses prouesses le rendraient attachant et gratifieraient le patient. Il est admis que le chien fait partie de la vie quotidienne des hommes depuis environ 15000 ans. Cette cohabitation serait réussie car le chien possèderait une formidable capacité à s'adapter aux comportements des humains dont il connatrait la personnalité, les humeurs, éventuellement les maladies, par l'habitude qu'il aurait prise de le regarder dans les yeux. Il fournirait au patient un cadre de repères structurants et sécurisants. Les chiens familiers seraient ainsi des agents susceptibles de jouer un rôle non négligeable dans le développement des processus liés à l'attention visuelle soutenue (qui n'auraient pas pu se structurer chez eux ou à l'école, dans le cadre des relations avec l'humain). Ainsi, nous remarquons en particulier des apports dans la communication multi-canale, la lecture des émotions et des affects d'un partenaire qui accepterait les interactions proximales, l'attention visuelle conjointe, l'accordage des émotions et l'attachement sécure . 184 Les chiens sont des partenaires qui stimulent et structurent les processus cognitifs, des catalyseurs des ressources intellectuelles, des inducteurs de projections et de transferts, des activateurs de l'imaginaire. 185 Les chiens sauraient moduler leur comportement en tenant compte du contexte, de la situation du milieu, mais aussi en se fondant sur leurs expériences individuelles et leur vécu. Ils seraient flexibles par rapport aux événements et à l'environnement. Certains seraient même capables d'anticiper les comportements. Et tout cela indépendamment d'un conditionnement d'instrumentalisation. 186 implicite, d'un dressage formel, ou d'une autre forme C'est probablement aux chiens que l'homme, quelles que soient sa culture et son appartenance ethnique, attribue les capacités d'attachement et de fidélité les plus développées, tout en leur reconnaissant des qualités affectives et cognitives hors pair. 187 Cependant, cela dépend des civilisations : les peuples arabes considèrent les chiens 184 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 185 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. p. 29 186 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 187 VERNAY. Le chien partenaire de vies : Applications et perspectives en santé humain. 2003 74 comme des injures, en Afrique ils sont sauvages, au Liban les enfants torturent les chiens, en Chine ils les mangent 1. 2. Communication Un phénomène de double-empreinte serait présent chez le chien : à sa propre espèce, et à l'espèce humaine. Il connat les deux, en est imprimé. Cela s'appelle l'attachement interspécifique : la nécessité de s'attacher rend possible le fait de s'attacher à une autre espèce (exemple des adoptions de chiots tôt). 188 Le chien a donc développé un mode de communication interspécifique avec l'humain. Cette compétence explique le fait que le chien soit l'animal auquel l'homme occidental attribue le plus de qualités affectives et cognitives. Très attentif à ce que fait et dit son matre, en quête permanente du regard humain, d'interactions affiliatives, les yeux-dans-les-yeux renouvelées de longue durée, cet animal de compagnie serait capable de décoder un large éventail des comportements de son matre, tels que ses odeurs, ses vocalisations et onomatopées, mais aussi ses productions langagières. Il peut alors ajuster ses réponses aux attentes, intentions et projets de son matre, tout en lui donnant l'impression qu'il adhère à ses émotions et affects. 189 Les chiens naissent et se développent dans l'attachement, comme nous. Ce qui fait la séparation du chien et du loup, c'est la capacité du chien à déceler les signes/notifications des humains (Claude BEATA, vétérinaire comportementaliste). 190 Le chien est aussi un animal avec un excellent odorat (un million de fois supérieur à l'odorat humain). Cette olfaction hors du commun est d'ailleurs utilisée dans la chasse, aux douanes, à l'armée, dans les dépistages, et pour la recherche de personnes coincées sous des avalanches ou des décombres. Par son incroyable odorat, le chien serait capable de détecter nos émotions, nos colères, nos sentiments, nos joies, et notre état d'esprit général. Il serait capable de sentir les ondes positives ou négatives, et donc de réagir en conséquence. Depuis quelques années il est utilisé pour la détection préventive des crises d'épilepsie, et pour discerner l'odeur corporelle d'un enfant autiste de celle d'un enfant 188 BEATA. Conférence relative au D. U. d'éthologie. 2013 189 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 190 BEATA. Conférence relative au D. U. d'éthologie. 2013 75 normal (avec une éducation adaptée, bien entendu), ce qui peut laisser penser que le chien pourrait contribuer à une meilleure identification des incohérences et des émotions. En outre, les chiens se donnent des règles (entre eux, et vis-à-vis de leur matre). Ce sont de grands observateurs, tout comme leur ancêtre le loup. Ils apprennent donc à partager les espaces, à connatre les habitudes de leur matre et à reconnatre un bruit qui leur devient familier, tout en le prenant comme repère. Ils seraient aussi capable d'analyser l'humeur, la voix, ainsi que les gestes des personnes qu'ils côtoient, et d'adopter des comportements en rapport avec leur analyse. Le chien devient adulte en moyenne vers quinze mois/deux ans. L'homme ayant façonné l'animal à sa manière et pour ses propres besoins, le chien se montre un médiateur exceptionnel qui s'éduquerait d'autant plus facilement lorsque l'on devient complice avec lui. Il enregistrerait très rapidement les signes, les ordres et les gestualités que l'humain lui demande d'apprendre. C'est aussi un animal capable de travailler dans des endroits restreints comme à l'extérieur, o il pourra pleinement exprimer sa complicité avec le patient et le thérapeute. Le chien peut aussi diversifier ses comportements et actions, tout en tenant compte de la problématique du patient. Il resterait très souple. 1. 3. Apports physiologiques Le chien a des effets apaisants sur le système nerveux et les fonctions cardiovasculaires de l'homme. 191 En effet, les personnes possédant un chien auraient moins de troubles psychosomatiques, tels que le mal de dos, les problèmes digestifs ou les troubles du sommeil. Les avantages quant au niveau de cholestérol et de triglycérides, et donc des risques caridiovasculaires inférieurs, se remarquent tout particulièrement lorsque les individus possèdent un chien. 192 191 GUEGEN. Animaux : pourquoi ils nous font du bien. 2008. 192 GUEGEN. Animaux : pourquoi ils nous font du bien. 2008. 76 Le fait de caresser son chien de temps en temps, et de lui parler, active le système nerveux parasympathique, favorisant du même coup une meilleure régulation du rythme cardiaque. 193 Dès 1980, Katcher et coll. mettent en évidence que la présence d'un chien induit une baisse significative des indicateurs physiologiques du stress chez des enfants à qui l'on demande de lire un texte à haute voix. 194 De plus, le simple fait de voir un chien, sans pour autant interagir avec lui, suffit à diminuer la peur et les réactions physiologiques du stress ! 195 1. 4. Pour les personnes souffrant d'autisme Le chien est aussi très bénéfique pour les enfants dits autistes qui perçoivent en vision périphérique et non de face, parce qu'ils ne peuvent soutenir le regard de l'autre. Ils peuvent aborder les animaux sur le côté, ou de face sans regarder les yeux du chien autrement qu'en vision périphérique, ce que le chien perçoit très nettement. Le chien ne va pas orienter son regard vers le visage de l'enfant autiste contrairement à ce qu'il ferait avec un autre enfant, mais va soit orienter son regard vers son matre et/ou thérapeute, soit regarder dans une autre direction, ce qui a pour effet de désinhiber toute réaction de protection à ce qui est perçu comme une intrusion et/ou une agression insoutenable pour l'enfant autiste. Progressivement, l'enfant se risquera à croiser le regard du chien 196. Le patient autiste aurait donc la possibilité de construire une relation par ce regard. Il y trouverait alors un refuge, synonyme d'anxiolytique. Le patient se construirait un cadre spatio-temporel qui le stabiliserait. Ce sentiment de sécurité pourrait même l'amener à enlacer le chien. Au fil du temps, il pourra donner du sens aux regards et aux mimiques. Par ces combinaisons visuelles, il permettrait au zoothérapeute de travailler efficacement. Les écholalies et stéréotypies diminueraient, voire disparaitraient. 197 193 GUEGEN. Animaux : pourquoi ils nous font du bien. 2008. 194 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 195 GUEGEN. Animaux : pourquoi ils nous font du bien. 2008. 196 DUMAS Nathalie. Communication personnelle, à paratre. 2014. 197 BEIGER & JEAN, Autisme et zoothérapie. 2011 77 Même si de taille variable et avec des approches différentes, les études sur la zoothérapie avec l'animal, auraient des résultats rapportant tous des améliorations : attention conjointe, interactions sociales, regard, langage réceptif et expressif, intégration sensorielle, ou encore motivation lors de l'activité elle-même mais aussi motivation à s'engager dans les activités de la vie quotidienne. Enfin, Le cadre thérapeutique de permanence mettant le patient en position secure , favorise l'attachement affectif envers les animaux, dans l'intimité d'une relation enveloppante , contenante, et, dans un lien qui est sans danger sur le plan des complications émotionnelles. Le patient va alors pouvoir s'essayer autour de différents modes de relation. Pour accompagner cela, au fur et à mesure, nous travaillons à l'évolution de la communication et des interactions en amenant des outils particuliers dans la relation (objets, photos, pictogrammes) favorisant l'expression pour les personnes non verbales. Lorsque le verbal existe, nous privilégions ce dernier et travaillons les échanges verbaux adaptés et l'expression des émotions. 198. On ne peut négliger l'exceptionnel impact de l'animal dans le développement des capacités relationnelles et communicationnelles chez la personne autiste, domaine qui lui est spécifiquement déficitaire. L'animal la stimulerait donc sur un mode de communication dit primitif , qui parat spécialement adapté à ses troubles majeurs de la communication et de la relation. L'animal servirait donc d'intermédiaire entre le rejet des contacts sociaux et l'acceptation des relations interpersonnelles, en permettant progressivement à l'enfant autiste déficitaire de s'engager dans un échange relationnel, par exemple avec l'orthophoniste, et ainsi s'engager dans un processus thérapeutique très profitable, d'autant plus que rapide. 199 1. 5. La sécurité affective L'amitié d'un chien est sans conteste plus vive et plus constante que celle de l'homme. Montaigne Le chien nous permettrait, de plus, une sécurité globale, même face à quelqu'un d'agressif. En effet, entre 1986 et 1989, Filiatre et Millot observent que les comportements agressifs ou rugueux d'un enfant envers son chien ont une faible probabilité d'entraner des 198 BEIGER & JEAN, Autisme et Zoothérapie. 2011. p. 123 199 SOREAU, Atelier orthophonique associant un chien auprès de deux jeunes autistes déficitaires. 2010. 78 réactions de menace et d'agression de la part du chien (et donc induire ou renforcer l'insécurité affective), celui-ci réagissant par l'évitement corporel et la fuite200. Ce qui participerait d'autant plus à une baisse de l'insécurité affective chez l'enfant. La sécurité affective qui s'installe et se développe au cours des relations avec le chien se traduit principalement par l'apaisement et la réassurance (les pleurs, gémissements ou tremblements s'atténuent), l'atténuation ou l'arrêt des comportements d'évitement, de crainte et de fuite, ainsi que l'accroissement des comportements affiliatifs (sourires, rires, caresses, jubilations, offrandes et sollicitations). Mais nous constatons aussi l'atténuation ou la non-manifestation des comportements dits hyperactifs (Bouvard, 2002)201 et des comportements d'agression. L'enfant déverrouille en même temps son monde intérieur : il parle à l'animal : le langage joue alors tout son rôle dans l'expression des sentiments et de la pensée, et dans la communication. 202 Le chien, par ses caractéristiques particulières, sa grande habileté relationnelle, sa capacité d'adaptation et son goût pour le jeu, serait l'animal idéal en médiation animale, auprès d'un très large éventail de patients. 2. Le chat 203 Même si la race féline n'a pas aussi bonne réputation que le chien en zoothérapie, ses effets thérapeutiques n'en seraient pas moins puissants. De manière générale, nous pouvons dire que le chat est un compagnon discret, susceptible de réduire le stress et de favoriser les relations sociales. Les chats familiers auraient la particularité de déployer un registre unique de comportements que les humains interprèteraient comme des débordements d'attachement, de tendresse ou d'amour. En effet, ils combinent les ronronnements, les léchages, les frottements appuyés, les recherches permanentes du corps-à-corps, et les miaulements modulés dans les interactions proximales. Ils auraient en même temps la capacité d'indiquer clairement leurs besoins, leurs états de bien-être ou de mal-être, leur 200 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 201 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 202 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 203 GUEGEN. Animaux : pourquoi ils nous font du bien. 2008. 79 souffrance, leurs motivations et leurs intentions. Les chats seraient donc des générateurs et des amplificateurs incomparables des émotions et des affects, particulièrement auprès des enfants. 204 Tout comme le chien, ce serait un très bon catalyseur pour établir une relation entre le patient et le thérapeute. Il permettrait de développer les habiletés sociales, et sa présence stimulerait les fonctions cognitives en captant l'attention. Les études de Karren Allen et ses collègues du département de psychologie de l'université d'Etat de New-York à Buffalo, ont montré que la présence du chat entrane une baisse notable de la pression systolique205 et diastolique206, de la conductivité électrodermale207 et du rythme cardiaque, ainsi qu'une baisse du stress physiologique. Selon les auteurs de cette étude, l'animal, de par sa disposition immédiate en cas de stress, permet de se détendre et de penser à autre chose. 208 Le chat produit un ronronnement qui sécuriserait, et évoquerait la parole, ce qui provoque indéniablement une communication avec lui. Il aurait pour effet de calmer la personne et de baisser la pression artérielle. Le chat utiliserait d'ailleurs ce ronronnement pour se calmer. Ce ronronnement accompagnerait l'humain dans l'imaginaire, l'invraisemblable, le rêve. Ce serait un antidépresseur, un anxiolytique, capable de remplacer bien des tranquillisants. De nombreux spécialistes reconnaissent qu'il peut soulager les malaises physiques et psychologiques, que vivent souvent les patients. Le chat dégagerait une vibration méditative apaisante pour les âmes en détresse, avec sa lenteur, son regard calme et pénétrant, et le fait qu'il soit gracieux. Le sens tactile peut aussi favoriser l'amusement, les rires, l'envie de parler et de se confier, notamment pour les patients soucieux ou introvertis. 209 204 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 205 Pression du sang lorsque le cœur se contracte et se vide 206 Pression du sang lorsque le cœur se relâche et se remplit 207 Activité électrique biologique enregistrée à la surface de la peau et reflétant l'activité des glandes de la sudation et du système nerveux autonome et par conséquent, entre autres, de la perception de l'individu et de son comportement involontaire plutôt que celui d'une réponse qu'il souhaite donner. , consulté le 19. 02. 2014 208 GUEGEN. Animaux : pourquoi ils nous font du bien. 2008 209 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 80 Tout comme le chien, le chat aurait une forte possibilité de déverrouiller le monde intérieur du patient, et de l'installer sur un versant de sécurité affective, dès lors que le patient perçoit une possibilité d'accordage. 210 En s'ajustant continuellement aux informations qu'ils recueillent, les chats enseigneraient aux enfants qu'on ne peut pas faire n'importe quoi, n'importe comment et n'importe quand (selon la nature et le rythme de l'activité, leur propre rythme, et les particularités du milieu). D'une manière générale, les chats démontrent une flexibilité comportementale ainsi qu'une capacité d'adaptation hors du commun par rapport aux variations du milieu. L'enfant peut le prendre comme modèle, en intégrer les principes. 211 Les chats seraient, pour l'enfant, une source inépuisable d'interrogations, de remarques, de projections, de transferts et de projets, et par là même, des sources de stimulation intellectuelle ancrée dans les émotions et l'imaginaire. Ils s'inspireraient beaucoup de son comportement. Pour le choix du chat, François Beiger recommande un chat au pelage soyeux, au tempérament calme et rassurant, comme le chat des bois de Norvège, le Main-Coon, le sibérien ou l'angora. 212 Enfin, il faut garder en mémoire que le chat reste un animal, et non une peluche, ce qui fait qu'un coup de griffe peut arriver, même inopinément, et donc déclencher, parfois, une crise d'angoisse ou une agressivité incontrôlée envers le chat. La zoothérapie en institution implique de d'emmener avec nous l'animal d'un endroit à l'autre, ce qui pourrait lui déplaire, préférant rester sur son territoire. Cependant, les chats résidants en institution seraient tout à fait à leur aise, justement car ce serait leur territoire. 210 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 211 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 212 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 81 3. Le cheval Partout o l'homme a laissé l'empreinte de son pied dans sa longue ascension de la barbarie à la civilisation, nous trouvons celle d'un sabot de cheval à côté. John Trotwood Moore (Vavra) L'histoire du cheval témoigne de sa grande polyvalence. Nous nous sommes servis de lui pour tout : manger, se déplacer, labourer, transporter, faire de la compétition, et faire la guerre. Il a servi l'homme plus que tous les animaux, et maintenant que nous lui demandons sa collaboration pour un apport thérapeutique, nous allons voir ses différents attraits, qualités, et rares défauts. Il est dit du cheval qu'il est la plus noble conquête de l'homme. Pour les thérapeutes et les éducateurs, il se révèle également un précieux auxiliaire. L'hippothérapie (thérapie assistée/facilitée par le cheval) connat un succès croissant et montre à quel point cet animal hautement symbolique peut avoir d'effets sur l'être humain. Renée de Lubersac (psychomotricienne) et Hubert Lallery (kinésithérapeute) sont à l'origine du développement de ce type de prise en charge. Dans les années soixante dix, ils théorisent les bénéfices psychomoteurs de la rééducation par l'équitation . Renée de Lubersac élargit ensuite le champ des applications offertes par la médiation équine en abandonnant ce terme, et en le remplaçant par thérapie avec le cheval (TAC), qui implique un encadrement plus rigoureux, qui doit être assumé par un professionnel de santé formé à l'écoute et à la relation d'aide. Cette dernière approche serait la plus répandue en France. Le travail de la TFC [Thérapie Facilitée par le Cheval] pivote autour d'informations équines, vécues corporellement et émotionnellement. Le déroulement des phases y est démontré. Toutefois, rien ne remplacera l'expérience elle-même, celle qui a lieu au cours d'une rencontre intime entre un cheval et une personne humaine. Ce genre d'expérience s'éveille grâce à la subjectivité et la sensibilité. Cette rencontre change les représentations personnelles du monde. Le cheval a un effet très puissant sur le monde 82 intérieur de l'homme (Karpenkova). Le contact avec le cheval renvoie au-dedans, à soi- même. 213 3. 1. Généralités Lorsque le travail consiste à mettre le patient en selle, le cheval permet aux enfants (et cela est d'autant plus positif pour les enfants en fauteuil) de regarder d'en haut et non d'en bas. Cela leur permettrait d'ouvrir leur regard, avec un contrôle de la tête, et même de faire apparatre les premiers sourires214. Le cheval leur laisserait aussi le pouvoir d'être un acteur-décideur libre de ses mouvements et apte à prendre des initiatives. En chevauchant, nous serions en situation de libérer et de tester nos capacités de traitement de l'information, de raisonnement et de prise de décision dans la troisième dimension de l'espace, en étant porté à tout moment par les compétences, connaissances, appréciations et ressources cognitives du cheval, partenaire équilibré et équilibrant . Le cheval est un partenaire qui se trompe rarement, rassurant par ses capacités d'ajustement corporel, faisant comprendre ce qu'il faut faire ou non, le tout en souplesse et douceur, sans agressivité, jugement, ni sanction. Il donnerait au cavalier le sentiment qu'il est flexible et intelligent. Il stimulerait ainsi des processus et fonctions du cerveau humain comparables à ceux que le chien et le chat révèlent. 215 Tout comme le chien et le chat, le cheval aurait une forte possibilité de déverrouiller le monde intérieur du patient, et de l'installer sur un versant de sécurité affective, dès lors que le patient perçoit une possibilité d'accordage. 216 Mais la latéralisation des yeux, la masse corporelle, les particularités anatomiques (naseaux et gueule impressionnants, sabots), la taille et l'ampleur de leurs comportements limitent le contact œil-à-œil et les interactions proximales. En particulier quand il s'agit d'enfants. Mais elles ne seraient pas impossibles. 217 Hors conditionnement ou dressage, le cheval aurait la capacité de s'ajuster en permanence et de manière très rapide aux contacts manuels, pressions des jambes, vocalisations, 213 ARENSTEIN, LESSARD. La zoothérapie. 2012 214 MELSON. Les animaux dans la vie des enfants. 2009. 215 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 216 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 217 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 83 onomatopées et paroles de son cavalier. Au cours du chevauchement, un accordage tonique, postural, émotionnel, affectif et rythmique entre le cheval et le cavalier se produirait. C'est une certaine forme de communication. 218 Le cheval est un bon matre, non seulement pour le corps, mais aussi pour l'esprit et le cœur. Xénophon, Les Ecuries Namasté Le cheval favoriserait, chez le cavalier, un apaisement contrastant avec la peur des premiers contacts avec l'animal. L'exposition aux stimuli équins désinhiberait certaines fonctions corticales et désensibiliserait les structures psychologiques reliées à la peur. Même lorsque la peur vient de l'aspect massif de l'animal, les patients veulent le toucher, encouragés par leur curiosité. De plus, il y aurait quasiment à chaque fois une attirance fusionnelle envers le cheval219. L'apaisement de ses inquiétudes rendrait le cavalier plus perméable, réceptif et disponible à la diversité des liens affectifs. En effet, le cheval favoriserait la mise en branle d'une réconciliation avec le langage du corps et des liens, les affects. Le corps se relâche et se réchauffe, la respiration conserve plus aisément son rythme et le patient commence à croire qu'il a un avenir. Le cheval aiderait la personne à s'investir : elle se sentirait fortifié et s'apaiserait. Ainsi, les patients développeraient progressivement plus de verbalisations et plus de capacités à aborder une personne inconnue. De plus, des mesures psychométriques auraient révélé une amélioration de l'estime de soi. 220 L'étude de Pamela Schultz et ses collègues, de l'université du nouveau Mexique, a mis en évidence certains effets de l'hippothérapie : baisse significative de comportements pathologiques exprimés habituellement (troubles hyperactifs, colères injustifiées, violences envers soi et autrui ), ainsi qu'une amélioration de la santé psychologique : augmentation de l'estime de soi, baisse de pensées suicidaires, baisse de l'anxiété et de l'angoisse. Pour les chercheurs, le lien affectif avec l'animal, son absence de jugement et surtout le sentiment de responsabilité personnelle résultant du rôle que joue l'enfant sur le bien être de l'animal, expliqueraient ces effets positifs du cheval. 221 218 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 219 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 220 GUEGEN. Animaux : pourquoi ils nous font du bien. 2008. 221 GUEGEN. Animaux : pourquoi ils nous font du bien. 2008. 84 Le respect des règles nécessaires au bon déroulement de l'activité (règles de sécurité, consignes, respect de l'animal et du groupe ) sont des éléments importants dans cette prise en charge, qui mobilise corps et esprit (ce qui en fait un outil très intéressant pour les personnes en rupture sociale). C'est surtout pendant le chevauchement que peuvent être repérées des potentialités cachées, enfouies, ou inhibées, notamment chez les enfants qui ont des troubles du développement ou du comportement, et que des constructions ou reconstructions comportementales, émotionnelles et affectives peuvent être stimulées (Pelletier-Millet, 2004). En effet, au cours de ce corps-à-corps, l'enfant doit tenir compte des mouvements du cheval pour ajuster à tout moment son équilibre corporel et ses gestes grâce aux informations qu'il recueille par ses récepteurs somesthésiques, ses propriocepteurs et ses organes vestibulaires, en combinaison avec les informations visuelles et auditives. Il vit alors des sensations et perceptions nouvelles en même temps qu'il découvre et montre à autrui des capacités d'auto-régulation inattendues. Les interactions tonico-posturales et affiliatives au cours du chevauchement avec un cheval familier peuvent ainsi constituer un révélateur structurant des capacités jusqu'alors non lisibles, brouillées ou inhibées chez des enfants non structurés, destructurés ou polyhandicapés dont l'état nécessite des soins médicaux très lourds (psychotiques, autistes, infirmes moteurs cérébraux ). 222 Le contact avec le cheval peut se faire à pied à côté de lui en promenade, sur lui, mais aussi pendant le pansage. De multiples contextes sont possibles. Le pansage ne doit d'ailleurs pas être sous-estimé : il serait assez gratifiant pour les patients bénéficiant de ce type de prise en charge de se trouver en situation de soignant , alors que dans d'autres contextes on leur attribue presque exclusivement un statut de soigné . Il permettrait de travailler le relationnel, la contenance, la stimulation, le schéma corporel, le sensoriel, la responsabilisation, la (re)valorisation, l'amélioration de la coordination des mouvements, et l'attention. 222 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. p. 26 85 Le plaisir éprouvé semble être un bon moteur de motivation, parfois difficile à mobiliser dans un autre contexte. Les apprentissages ainsi effectués dans un cadre ludique et valorisant peuvent contribuer à l'amélioration de l'estime de soi. 223 L'intérêt pour le cheval engloberait d'une certaine manière le thérapeute médiateur : il peut alors faire son travail beaucoup plus facilement. De manière générale, la valeur de tous ces résultats serait étroitement liée à la qualité des rapports entre les membres du groupe et à la qualification des responsables qui ne sont pas simplement des matres de manège, mais de véritables thérapeutes qualifiés. Plusieurs thérapeutes utilisent le cheval comme outil, en fonction des objectifs qu'ils visent. Ainsi : S'il s'agit d'un psychomotricien, le travail porte plutôt sur l'équilibre tonique, la coordination psychocorporelle, l'orientation dans l'espace et le temps. Un kinésithérapeute, quant à lui, vise une rééducation fonctionnelle, un effet de massage musculaire, alors qu'un éducateur se concentre sur la socialisation, l'intériorisation des règles et de la loi. Un psychologue, lui, travaille sur l'intégration psychique, la relation avec soi-même et avec l'autre. On voit même des orthophonistes qui pratiquent cette médiation pour amener à l'émergence ou à l'amélioration du langage. Tous les représentants du monde du soin peuvent se cotoyer dans ce champ thérapeutique. Natacha Aymon Gerbier 224 l'acquisition des apprentissages, Selon Claudine Lemieux, la motivation et l'intérêt sont à l'origine du succès thérapeutique : L'enfant n'est pas pris entre quatre murs à faire des exercices précis. Il se sent plus libre. La thérapie devient un jeu et le cheval, un compagnon. S'il veut qu'il joue avec lui, il doit réussir à faire certains mouvements et à respecter certaines consignes. C'est alors qu'il voit le résultat instantanément puisque le cheval répond ou ne répond pas. Il peut voir immédiatement l'impact de sa posture et de son comportement. L'effet miroir du cheval permet à l'enfant ou à l'adulte de s'auto-évaluer jugé. Il peut alors constater que certains de ses sans être comportements, qui parfois les humains, ne fonctionnent avec 223 ANSORGE. La médiation équine comme outils thérapeutique. 2011. 224 Dans DE PALMA, Entre l'humain et l'animal, la Zoothérapie. 2013. p. 113-114 86 fonctionnent pas avec les chevaux. Il doit en utiliser d'autres s'il veut arriver à ses fins. Il développe donc un répertoire de nouveaux comportements, qu'il généralisera éventuellement dans d'autres contextes, sans que le cheval soit présent. Claudine Lemieux 3. 2. Communication Le principe de la communication est l'existence d'un émetteur qui adresse un message codé à un destinataire via un canal. La magie de l'équitation résiderait dans le fait que le cheval et le cavalier peuvent être à la fois non seulement émetteur et destinataire, mais aussi message et canal. Chaque mouvement du cheval serait un symbole. Nous pourrions aller jusqu'à dire que les gestes du cheval sont l'expression de nos émotions. 225 Il faut quand même savoir que, dans sa communication avec l'humain, le cheval préfèrerait les tonalités basses. Une tonalité haute et ascendante pourrait provoquer un sentiment d'insécurité. Mais tout dépend de ce que nous voulons qu'il fasse : voix grave pour qu'il ne bouge pas ou qu'il soit lent, voix forte, dynamique et plus aigu pour qu'il accélère, galope, etc. De plus, les chevaux disposeraient des mêmes circuits neuronaux que les humains : ils se souviennent, retiennent à vie ce qu'ils ont compris. Ils apprennent instantanément. Les ressemblances structurelles et fonctionnelles du cerveau permettraient une réelle communication. Le cheval aurait l'avantage d'utiliser un système pluridimensionnel. Et il serait très sensible et perméable : il peut s'énerver aussi vite que s'apaiser. Les chevaux communiquent entre eux, avec un langage sonore non-verbal, corporel, sensoriel et sensitif chargé de significations. Concernant les troubles du langage, nous pouvons travailler sur les sons ayant un impact sur le cheval. Par exemple, en prononçant Oh là ! avec une intonation descendante, le patient constate que le cheval s'arrête. Il voit donc que, même s'il est incapable de formuler des phrases ou des mots, les sons provoquent une action précise et toujours identique. Ainsi, il se découvrirait une motivation à travailler les sons, qui peuvent alors devenir des mots, et même des phrases ! On travaillerait également la confiance en soi et la persévérance. 225 PEREIRA. Parler aux chevaux autrement - Approche sémiotique de l'équitation. 2009. 87 3. 3. Pour les enfants déficients intellectuels Le cheval apporterait une grande aide, particulièrement aux enfants déficients. En effet, grâce à lui, les possibilités d'attention du patient augmenteraient, leur maladresse apparente du début disparatrait, leurs mouvements s'affineraient et se coordonneraient, leur distraction disparaitrait, il y aurait une absence des signes de fatigue et de lassitude, il pourrait finir par avoir des initiatives et par agir sur l'autre (principalement le cheval) d'une manière quasi-normale même dans les pathologies les plus lourdes, il développerait des traits de personnalité non soupçonnés. Et devant ces changements observés et sentis, même les adultes semblent se transformer : l'attachement et la tolérance à l'enfant augmenteraient. Enfin et surtout, le cheval provoquerait bonheur et épanouissement. 226 3. 4. Pour les déficiences motrices 227 Une étude de Renee Casady et Deborah Nichols-Laren228, de l'Université de l'Ohio, sur des enfants souffrant de déficience motrice en situation o ils se trouvaient plaqués sur le flanc ou le dos de l'animal lorsque celui-ci était statique ou en mouvement, a mis en évidence une amélioration de leur coordination musculaire et motrice au terme de dix séances : meilleur équilibre, tonus, amplitude des mouvements Pour les chercheurs, la surface corporelle dynamique du cheval, la parfaite adaptation de son corps, la texture de sa peau, et la souplesse de ses mouvements pendant la marche seraient autant de facteurs qui stimuleraient la motricité de l'enfant. La pratique du cheval a donc une influence mécanique , de par la position que le cavalier doit adopter et ajuster dans l'espace pour pouvoir se maintenir en selle. Cela a pour conséquence la verticalisation du corps, divers effets bénéfiques sur le squelette, une amélioration de la masse musculaire, une facilitation des mouvements respiratoires. L'ensemble des postures et des mouvements effectués interviennent au niveau de l'élaboration du schéma corporel et se traduisent par une amélioration du tonus musculaire, une amélioration de l'équilibre, une 226 GUINOT. L'animal et l'enfant. 1983. 227 ANSORGE. La médiation équine comme outils thérapeutique. 2011. 228 GUEGEN. Animaux : pourquoi ils nous font du bien. 2008 88 amélioration des praxies, une lutte contre l'adduction des membres inférieurs chez les paralysés cérébraux et une organisation spatiale et temporelle. 229 La mise à cheval est en effet souvent employée (bien qu'en thérapie facilitée par le cheval, c'est loin d'être sa seule utilisation ), pour une rééducation fonctionnelle visant à maintenir, recouvrer ou développer en priorité les fonctions motrices. Les patients auraient un goût très prononcé pour le balancement procuré par les pas du cheval230. Cela favorise un ajustement tonique, et donc un travail de l'équilibre et de la posture. Mais ces exercices peuvent également travailler la motricité fine et la coordination ! 3. 5. Pour les personnes autistes de la même manière que les autres animaux, différentes études ont montré que l'équithérapie, par les stimulations kinesthésiques offertes par le cheval très variées et importantes, permettait aux enfants autistes d'augmenter leur faculté à avoir de la volonté - ce concept va de l'exploration (curiosité, volonté d'essayer de nouvelles choses, d'initier une action ) à la compétence (attention soutenue, fierté, recherche de résolution de problèmes pour aller vers la réussite), et enfin à la réalisation (volonté d'augmenter ses performances et de relever des défis) ; d'améliorer l'intégration sensorielle, l'attention conjointe, d'augmenter la motivation sociale231, d'améliorer la sensibilité sensorielle, et de diminuer l'inattention et la distraction, et ainsi améliorer la communication non verbale, et les capacités d'expressions relationnelles et émotionnelles, ainsi que de s'ouvrir au monde extérieur232. Tout comme le cheval, la personne autiste n'aime pas maintenir un contact visuel. Ainsi, l'anxiété est moindre et l'échange moins menaçant. 229 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 230 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 231 BEIGER & JEAN, Autisme et zoothérapie. 2011 232 LUBERSAC (2003), dans SOREAU, Atelier orthophonique associant un chien auprès de deux jeunes autistes déficitaires. 2010. 89 3. 6. Contre-indications Les contre-indications à cette pratique sont les maladies neuro-musculaires évolutives, les myopathies, l'épilepsie, les épiphysites de croissance, les cardiopathies sévères, un âge inférieur à trois ans, les déficits mentaux sérieux, les scolioses sévères ou évolutives, les états anxieux majeurs, les muéloméningocèles233 avec paraplégie, les pathologies vertébrales graves, les rhumatismes inflammatoires, et la sclérose en plaque. 234 En effet, l'équithérapie pourrait être dangereuse, physiquement ou médicalement. 3. 7. Limites L'hippothérapie est coûteuse en énergie, en temps, en moyens humains et financiers. Une séance d'environ 1h30 coûte entre 55 et 70 euros235, un véhicule pour se rendre sur les lieux doit être prévu, et une ou deux personnes doivent être mobilisées pour accompagner le patient ou le groupe de patients, ce qui pose parfois des problèmes de logistique au sein des services. De plus, l'introduction d'un animal dans un service de soins implique des mesures de sécurité particulières, dont seule une personne habilitée par les services compétents peut assumer la responsabilité en cas d'accident. Il est donc fortement déconseillé à toute personne ne pouvant justifier d'un brevet relatif à l'encadrement en milieu équestre d'assumer seul l'encadrement des séances (bien que cette pratique soit tolérée). Enfin, même si le cheval reste un animal domestique, voire de compagnie, on ne peut en faire l'hôte d'une maison : son intervention dans un cadre thérapeutique n'est donc pas souvent continue, car tributaire de séances à l'extérieur. De plus, certaines capacités physiques limitées, et non adaptables comme celles de certains polyhandicapés, ne permettent pas cette pratique (les personnes âgées, par exemple). 236 233 Forme de spina bifida, qui désigne une malformation d'origine congénitale de la colonne vertébrale 234 ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996. 235 ANSORGE. La médiation équine comme outils thérapeutique. 2011. 236 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 90 A une époque qui prône les résultats immédiats et l'amortissement rapide des prises en charge, la médiation équine, coûteuse, n'est pas forcément celle vers laquelle les thérapeutes vont se tourner prioritairement, car elle invite à prendre le temps : le temps d'écouter, de comprendre et d'apprendre à son rythme. Même si pour les patients, soignants, moniteurs et la famille les effets sont généralement visibles, et parfois spectaculaires, les progrès apparaissent sur le long terme et doivent se confirmer dans le temps. 237 4. Le dauphin 238 Le dauphin nourrit l'idée qu'il comprend les signaux et attentes des humains, qu'il établit des relations entre des situations ou contextes bien définis, mais aussi qu'il comprend aussi bien les signaux des humains que les émissions sonores et ultrasonores de ses congénères. 239 Car il s'organiserait en fonction de ce qu'il décode. De plus, de par son apparence rigolarde et amicale (sa bouche étirée donne l'impression qu'il sourit en permanence, et son regard vif force la sympathie), sa peau très douce, le fait qu'il soit puissant et rapide mais très doux quand on s'en approche, se laisse manipuler, joue volontiers avec les humains240, son comportement dépourvu d'agressivité, sa sensibilité à la douleur et au plaisir, ainsi que sa capacité réelle ou supposée d'accompagnement et d'assistance d'humains en difficulté dans le milieu aquatique, le dauphin conduirait la plupart des personnes à penser qu'il a pour eux un véritable attachement et une véritable amitié, voir de l'amour. De plus, leur répertoire varié, sophistiqué et adapté aux situations, de signaux et émissions acoustiques, fait qu'on leur prête souvent un langage comparable à celui de l'homme. 241 L'eau est reconnue pour son potentiel thérapeutique. Donc l'hypothèse de l'eau ajoutée au dauphin est très souvent positive. 242 237 ANSORGE. La médiation équine comme outils thérapeutique. 2011. 238 DELFOUR. Penser le dauphin et son monde. 2007. 239 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 240 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 241 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 242 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 91 Les dauphins paraissent avoir une capacité inépuisable à initier et accepter les interactions les yeux dans les yeux avec les humains, puis à développer une attention visuelle. Ils auraient en effet un élan à l'approche irrépressible à l'égard des humains : ils initieraient l'interaction par leurs modes d'approche (sauts, cabrioles), leur comportement d'accueil ( salut ), les clics vocaux qui invitent au jeu, et la qualité des contacts corporels qu'ils initient et acceptent. Ils peuvent aussi installer une certaine sécurité affective, que ce soit pour les patients ordinaires ou les patients psychotiques ou autistes. Ces comportements spécifiques aux dauphins (et aux chiens) stimuleraient, réactiveraient, structureraient et organiseraient les comportements affiliatifs, et organiseraient le discours du patient, non seulement à l'égard de l'animal, mais aussi avec les humains qu'il retrouve pendant la thérapie, ou bien ensuite dans le milieu familial, à l'école, ou ailleurs. Parallèlement, [les patients] sortent de leurs comportements autocentrés, de crainte et de fuite, ils n'évitent plus la rencontre et l'interaction, ils canalisent leur trop-plein de mouvement (leur hyperactivité ) et leur agressivité. Ils dévoilent au fil des semaines, des capacités inattendues dans les processus de communication, les participations ludiques, les activités de coopération, les ajustements comportementaux, les interactions accordées et les conduites de médiation 243. Tout comme le chien, le chat et le cheval, le dauphin aurait une forte possibilité à déverrouiller le monde intérieur du patient, et de l'installer sur un versant de sécurité affective, dès lors que le patient perçoit une possibilité d'accordage244. Et même si ces comportements peuvent, pour la plupart, s'expliquer par des conditionnements implicites ou par une succession d'apprentissages par essais et par erreurs, les enfants (et les témoins adultes) pensent et disent que ce sont des imitations : Il fait comme nous, il nous a vus faire et il a compris pourquoi et comment nous avons eu ce comportement . Les enfants perçoivent alors le dauphin comme un complice. 245 Enfin, plus encore que les chiens, chats ou chevaux, les dauphins peuvent être des partenaires qui stimulent et structurent chez les enfants un large éventail de processus cognitifs, catalysent les ressources intellectuelles, induisent des projections, transferts et projets, activent l'imaginaire. En effet, le patient aurait l'impression d'être encore 243 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. p. 25 244 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 245 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. p. 27 92 mieux entendu et compris, car l'animal a l'air de lui parler et même de rigoler quand il l'écoute ou lui répond, et ce, particulièrement pour l'inviter à nager ensemble ou à le chevaucher . 246 D'après la littérature, la delphinothérapie serait actuellement particulièrement utilisée et efficace avec l'autisme, la dépression, le retard mental, les difficultés motrices ou langagières, les enfants sourds, trisomiques, cancéreux, hyperactifs, anorexiques, victimes d'abus sexuels, et plus rarement en cas de lésions cutanées ou de déficiences immunitaires. Le dauphin peut être particulièrement utile avec des autistes. En effet, d'après Daniel Meir, psychiatre dans un hôpital universitaire à Jérusalem, On ne guérit pas les autistes à l'aide des dauphins, mais on peut les faire progresser. On peut arriver à un meilleur contact, une meilleure autonomie. [] On sait que les autistes ont un spectre très large de sensibilité auditive. Je pense que le dauphin émet des sons que le patient autiste entend et ressent, qui arrivent à lui et que nous ne sentons pas. J'en suis convaincu. [] Quand on fait écouter des enregistrements de bruits de dauphins à des autistes, ils sont calmes ; quand on arrête, ils s'excitent ; quand on leur remet le bruit du dauphin, ils se calment à nouveau. 247. Enfin, les dauphins arriveraient à imiter des voix, avec leurs sons à la fréquence haute. Et les autistes, présentant pour la plupart un large spectre de sensibilité auditive, il est vraisemblable que les échanges de sons entre dauphins et eux soient tout à fait réels248. De manière générale, la delphinothérapie se déroule en deux temps : un premier temps o le patient nage avec le dauphin, et un second o il apprend à nourrir l'animal et à lui adresser des signaux qu'il comprend. Avec le thérapeute, le dauphin aide les personnes à comprendre qu'elles peuvent parvenir à être en relation avec l'autre (ici un animal intelligent ) et établir, avec succès, une communication. Les comportements de l'animal sont utilisés par le thérapeute comme renforçateur positif des actions du patient, et lui garantiraient une amélioration dans la qualité de sa communication. 246 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 247 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. p. 124 248 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 93 Le premier programme régulier de delphinothérapie a été initié en 1988 au Dolphin Research Center (aux Etats-Unis), par Nathanson et Smith249. Ils avancent que les personnes souffrant de handicaps mentaux augmentent leur niveau d'attention et leur motivation, et donc facilitent les capacités motrices et langagières. Pourtant ces deux thérapeutes avaient des manières de fonctionner différentes : alors que Smith mettait l'accent sur le côté relationnel, analysant ses résultats en termes de communication, de relation, de jeu et d'émotion, les séances de Nathanson apparaissaient plus structurées, les interactions avec les dauphins étant plus contrôlées et les résultats interprétés dans une perspective cognitive (attention, motivation, apprentissage). Parmi tous les programmes menés en delphinothérapie, on remarque celui du DolphinReef d'Eilat en Isral250 251, très positif pour les patients, mais aussi pour les dauphins, ce qui manque cruellement dans les programmes habituels. En effet, les dauphins ne vivent pas en bassin, mais en mer ! Ils sont en effet libres d'aller et venir, choisissent leur partenaire sexuel, vivent la vie de leur groupe, et chassent pour se nourrir en plus de la ration allouée par les responsables du programme. Les dauphins sont authentiques, et cela pèse très certainement dans la relation qu'ils établissent du coup de leur plein gré avec ceux qui fréquentent le centre. Ils n'obéissent pas à un dressage particulier, acceptent certains patients et en refusent d'autres, par un jeu de sympathie- antipathie qui renseignerait parfois le thérapeute sur le sujet avec lequel il travaille. Malheureusement, malgré les multiples qualités du dauphin, et donc des avantages de sa médiation, la mise en place d'une thérapie avec le dauphin est très difficile. En effet, ce type de médiation a des limites : il ne peut se faire qu'en milieu marin. Cela implique de grosses dépenses d'argent (lieux, professionnels, trajets), ainsi qu'un apport ponctuel, de même que pour l'équithérapie, du fait du lieu spécifique extérieur et de la rareté de ce genre d'endroit. Localement, nous avons le Marineland d'Antibes. Plusieurs institutions y ont accès fréquemment, dans le cadre de prises en charges paramédicales. L'administration est souvent réticente quand à l'intérêt et la faisabilité du projet, d'o l'importance d'une documentation, d'objectifs, et donc d'un projet/dossier très pertinent. 249 DELFOUR. Penser le dauphin et son monde. 2007. 250 DELFOUR. Penser le dauphin et son monde. 2007. 251 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 94 Enfin, rares sont les endroits comme le DolphinReef d'Eilat, et nous pouvons nous poser la question du bien-être des dauphins, qui sont des animaux sauvages, lorsqu'ils sont en bassins. Nous allons voir dans la partie III. 4. 6. les risques particuliers pour le dauphin, de ce genre de thérapie. 5. Le perroquet 252 Nous pouvons admettre que les perroquets sont des animaux familiers, lorsqu'ils sont capables de reproduire des bruits de l'environnement, des airs musicaux, des vocalisations, des onomatopées et les paroles des humains. Surtout quand ils paraissent imiter : c'est-à-dire qu'ils donnent le même sens et la même signification dans les mêmes contextes et situations. 253 Le perroquet serait un des animaux les plus interactifs, et même joyeux . Certaines espèces auraient des comportements qui conduisent à des contacts œil à œil renouvelés avec les humains, et ainsi à une attention visuelle soutenue. Mais ces comportements seraient épisodiques et variables selon les contextes et situations. En créant par leurs imitations des situations d'attention visuelle conjointe et en faisant parler leur entourage, les perroquets rassembleraient autour d'eux les gens, stimuleraient les comportements affiliatifs, la communication, et le dialogue. Même si leurs élans à l'interaction sont moins évidents, le fait qu'ils puissent se percher sur la personne et qu'ils aient des productions vocales , voir même langagières , donnerait à la plupart des personnes le sentiment que les mots ont le même sens et la même signification que pour eux-mêmes, voire le sentiment ou la certitude qu'il adhère à leurs émotions, affects et pensées. Un attachement particulier se tisse souvent entre le perroquet et l'humain. Le fait de confier le soin d'une perruche ou d'un perroquet à des personnes âgées placées dans des institutions les conduit d'ailleurs à entretenir plus d'interactions avec d'autres résidents de l'institution, que si on leur confie le soin d'une plante verte par exemple. On 252 BEATA. La communication. 2005. 253 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 95 remarque aussi que ces personnes sont plus souriantes et recherchent davantage les interactions sociales. Le perroquet est donc un compagnon idéal lors de thérapies, particulièrement dans celles du langage et de la communication, comme l'orthophonie. Mais il n'est pas l'animal le plus évident à dresser, et il faut connatre un certain nombre d'éléments sur le perroquet. En effet, d'après Claude BEATA, vétérinaire comportementaliste : Le langage des oiseaux se rapproche du notre par le fait que, s'il comprend un certain nombre d'éléments héréditaires, il est pour le reste acquis tant dans son enfance que dans la suite de l'existence. Trois processus sont donc en jeu : l'inné, l'imitation et l'apprentissage. Il peut exister des difficultés de communication entre l'homme et le perroquet. S'il est vraisemblable que le perroquet en contacts fréquents avec l'homme parvient à décrypter ses mimiques faciales, l'être humain a souvent du mal à interpréter la communication posturale de l'animal. L'imitation de la voix humaine est bien la conséquence la plus connue de la captivité sur la communication du perroquet. Cet apprentissage se fait avec ou sans entrainement, avec ou sans signification et rapport avec les circonstances, avec ou sans succès (inégalité des individus, inégalité des espèces). Le langage des perroquets est prosodique. En effet, ils reproduisent toutes les composantes de la phonétique : intonation, accentuation, tons, rythme, pauses. 254 L'apprentissage de la parole est un moment privilégié de communication entre le propriétaire et le perroquet d'autant plus qu'il doit être, au minimum, quotidien. La méthode du Dr Pepperberg semble particulièrement efficace. Elle repose sur la technique modèle rival, qui exploite le challenge entre l'oiseau et le rival humain pour obtenir la satisfaction du dresseur. Le Dr Pepperberg a montré en 1994 que pour qu'un perroquet comprenne le sens des vocalisations, il faut que l'apprentissage soit référentiel (le mot doit correspondre à l'objet présenté et la récompense correspond à l'acquisition de l'objet), contextuel (en rapport avec le contexte de vie de l'animal, mise en scène de l'objet) et socialement interactif. Sans interactivité avec son dresseur, il n'y a pas d'apprentissage de la parole. Ce qui confirme combien le perroquet est un animal 254 Dans BEATA, La communication. 2005 96 particulièrement social et apte à la communication. Sa très grande empathie et sa très grande réceptivité l'amènent à déceler les émotions des humains. L'état des autres, donc du thérapeute et du patient, a des répercussions sur le perroquet. En criant, il peut exprimer le stress ou l'anxiété d'une personne, par exemple. Il permet de prendre conscience de notre état, et qu'il faut se calmer. Contrairement aux chiens qui absorbent les émotions négatives, les perroquets, eux, les expriment. Il permet de mieux écouter et gérer ses émotions. C'est un système d'alarme qui reflète à l'humain son stress. Ainsi, il est déconseillé d'avoir un perroquet si on désire avoir un contrôle absolu sur l'animal et ne pas se remettre en question dans nos comportements. Le perroquet apparat comme un spécialiste de la communication et l'opinion de Konrad Lorenz Même les oiseaux qui parlent le mieux, ce sont naturellement les grands perroquets, n'apprennent jamais, chose curieuse, à établir le moindre lien entre leur faculté et la plus simple intention 255 est battue en brèche par les travaux de nombreux scientifiques (Todt, Pepperberg, Ségurel-Chardard, etc. ) ainsi que par de multiples témoignages particuliers. Ce serait son besoin d'interactions et de stimulations qui en ferait un animal intéressant en zoothérapie. De plus, il suscite la curiosité et favorise les contacts sociaux. Ce serait un facilitateur social. Certaines mesures seraient à envisager avant de l'emmener en zoothérapie : prévoir un transporteur et s'assurer de lui donner des périodes de repos. Comme il s'agit d'un oiseau tropical, il tolère mal les hivers rigoureux : il faudrait donc chauffer quelques minutes la voiture avant de l'y emmener, et envelopper le transporteur de couvertures. Il faudrait aussi prévoir des objets pour le distraire, car il risque d'utiliser un objet inapproprié, comme des boucles d'oreilles. Pour bénéficier de l'effet thérapeutique du perroquet, les patients doivent avoir de bonnes capacités de compréhension et d'autocontrôle, et bien saisir les consignes du thérapeute s'ils veulent un bon contact avec l'animal. 255 Dans BEATA, La communication. 2005. p. 108 97 Le bec sert à décortiquer leur nourriture, à creuser leur nid (dans les bois), à se nettoyer les plumes, à se faire des câlins, à s'appuyer lorsqu'ils veulent monter sur notre main, et enfin, à se défendre. Mais les perroquets ne seraient pas dangereux. En effet, ils préfèreraient s'envoler plutôt que de mordre, étant des êtres très pacifiques. Le perroquet est une proie et non un prédateur. Le contact physique n'est donc pas toujours évident avec. Il faut donc respecter son rythme : faire preuve de délicatesse, avoir des gestes lents, lorsque le perroquet ne connat pas la personne. La première fois qu'on entre en contact avec un oiseau, il vaut mieux d'abord lui parler, et attendre qu'il soit à l'aise pour s'en approcher. Le perroquet serait d'ailleurs meilleur pour les interactions verbales et relationnelles, avec son intelligence et sa personnalité, plutôt que pour les contacts et caresses. Les perroquets seraient particulièrement intéressants pour les personnes âgées seules, le défi étant de les stimuler un maximum, pour maximiser leur potentiel. Ils seraient très doués pour le spectacle, et aiment faire rire les gens. Ils adoreraient l'attention qu'on leur accorde. Et plus ils sont stimulés, plus ils seraient motivés à donner davantage. Ils apportent de la joie et des rires. Enfin, il faut savoir que le perroquet n'aime pas être seul : il s'arrache les plumes lorsqu'il s'ennuie. De plus, ses coups de bec peuvent être dangereux. Quand il y a des vocalises intempestives, le retour du propriétaire vers son oiseau pour le faire taire est interprété comme une marque d'attention et une récompense, ce qui encourage la survenue de futures vocalises. Ajoutons à cela que les perroquets, bruyants par nature, ne sont pas toujours adaptés à nos appartements mal insonorisés. Il faut donc beaucoup se renseigner avant de se procurer un perroquet. D'autant plus qu'ils vivent en moyenne cinquante ans, les plus vieux pouvant atteindre quatre-vingt-dix ans. 98 6. Autres animaux Tout comme le chien, ces autres animaux ont une forte possibilité de déverrouiller le monde intérieur du patient, et de l'installer sur un versant de sécurité affective, dès lors que le patient perçoit une possibilité d'accordage256. 6. 1. L'âne 257 258 L'âne est un équidé asin , contrairement au cheval qui est un équidé équin . C'est un compagnon rustique, sensible, résistant et fidèle. Il a été domestiqué (en Ethiopie d'abord) il y a environ 5000 ans. Reconnu comme un animal rustique, il est aussi docile que plaisantin, et est capable de grande complicité envers son matre. Pour la zoothérapie, il est important qu'il soit éduqué en douceur, mais avec fermeté, dès son sevrage, c'est-à-dire vers l'âge de six mois. Par ailleurs, travailler avec un âne demande beaucoup de patience et de matrise de soi. Les gestes doivent être posés avec pondération. Etant plus petit que le cheval, il attirerait rapidement le regard des enfants. Il se prêterait parfaitement à une zoothérapie, notamment avec des enfants en déficience mentale, fragiles, ou des cas sociaux. Il saurait se faire comprendre par ses mimiques faciales, son braiment, la position de ses oreilles, et ses attitudes débonnaires. Ce qui aiderait beaucoup les patients à entrer dans la communication. Il renverrait une image apaisante, qui rassure. Comme la plupart des animaux familiers, l'âne aime la compagnie. Et il fait très bon ménage avec des poneys ou des chèvres, et bien sûr d'autres ânes. L'âne aurait un tempérament très curieux. Et comme avec tous les animaux, lorsque nous nous approchons, nous entrons dans son territoire : il est donc recommandé que ce soit lui qui nous approche, qui nous sente, pour qu'il prenne confiance. Ce serait une de ses 256 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 257 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 258 BEIGER & JEAN, Autisme et zoothérapie. 2011 99 manières de nous montrer comment il évalue le danger, quand il découvre une nouvelle situation. Tout comme le cheval, nous pouvons le monter et faire le pansage. Nous y retrouvons les mêmes bénéfices. 6. 2. Le poney 259 Le poney est l'animal de prédilection pour la monte des jeunes enfants. Sa petite taille (1m48 maximum) rassure. Il serait très intelligent, et d'une grande amitié. Nous pouvons faire un travail avec lui dès que l'enfant a trois ans. Il possède les mêmes caractéristiques que l'âne, notamment thérapeutiquement. Le travail en amont de la monte permet de découvrir les soins, le toilettage et le matériel. Le fait de pouvoir mettre l'enfant sur le dos du poney lui apporterait équilibre et verticalité, comme pour le cheval, et le pas de poney déclencherait un mouvement de bassin qui donnerait le sentiment de prolongement du corps de l'humain : l'enfant se sentirait grandi et acteur de l'atelier. Les émotions et sensations peuvent ressortir, et donner une certaine sécurité à l'enfant. De plus, le poney enverrait des messages au zoothérapeute pour dire comment il ressent l'enfant sur son dos. L'enfant ferait de même, par de la mimique ou de la gestuelle. Tout comme le cheval et l'âne, on peut le monter et faire le pansage. Nous y retrouvons les mêmes bénéfices. 6. 3. Le lapin et autres petits rongeurs Il est fréquent de voir le lapin en peluche chez les enfants. La douceur, la légèreté, la gentillesse, la tendresse, l'attachement, l'affection et la complicité que l'on peut avoir avec permettraient un travail de zoothérapie. Avec ses grandes oreilles, il se prête bien à l'écoute et aux confidences. Toutes les mimiques du lapin seraient calmantes et 259 BEIGER & JEAN, Autisme et zoothérapie. 2011 100 rassurantes. Prendre le lapin dans les bras ou sur les genoux, pouvoir lui parler, le suivre des yeux, etc. , seraient autant de facteurs de plénitude et sécurisants. 260 Le lapin permettrait de concentrer les excès de mouvements, l'anxiété, le manque d'assurance, mais aussi le rire, qui est une véritable source de communication et d'épanouissement de soi-même. Une étude de Krskova et al (2010) a montré que le cochon d'Inde provoquait une augmentation significative de la fréquence des contacts sociaux chez 40% des enfants autistes. Mais elle a aussi montré que les enfants autistes préféraient le contact de l'animal à celui d'une personne inconnue, que les contacts avec l'animal étaient à 50% tactiles et à 50% visuels, mais pas verbaux, un changement du type de contact préféré mis en place avec des connaissances, et certains éléments du comportement social n'ont été observés qu'en présence de l'animal. Mais de manière générale, les résultats suggèrent que la présence du cochon d'Inde peut influencer positivement la qualité et la quantité des comportements sociaux chez les enfants autistes. Les cochons d'Inde aiment beaucoup les parcours. Nous pouvons donc travailler sur les positions, créer des parcours avec le patient en lui faisant manipuler certaines formes, on peut, suivant l'évolution, passer de parcours dessinés sur une feuille à un parcours en trois dimensions, etc. Le furet serait parfait pour les adolescents. Il est facile à manipuler, et permet de faire travailler les mains, les doigts et les bras. Mais il faut être vigilant avec les personnes autistes et psychotiques : il faut surveiller que le patient ne nuise pas à l'animal en lui tirant les poils. 261 6. 4. Les oiseaux 262 Les oiseaux en cage, outre leur ramage et leur plumage, ont d'autres atouts qui touchent à la sphère des relations entre individus. Robert Mugford et ses collègues, à Leichester en Angleterre, ont démontré que le fait de confier le soin d'une perruche à des personnes 260 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 261 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 262 Depuis GUEGEN. Pourquoi les animaux nous font du bien. 2008. 101 âgées placées dans des institutions les conduit, de la même manière que nous l'avons vu pour le perroquet, à entretenir plus d'interactions sociales avec d'autres résidents de l'institution, que si on leur confie par exemple le soin d'une plante verte. En se voyant confier le soin d'un animal, les personnes réalisent qu'il dépend d'elles. Et cette perception activerait le même niveau de conscience pour les relations sociales, qui demandent, elles aussi, de faire des efforts, de se préoccuper d'autrui. Le petit oiseau peut donc être une amorce aux relations entre humains. Petits et fragiles, ils sont parfaits pour travailler les membres supérieurs, la motricité fine des personnes âgées et des enfants. Ils amènent aussi à se concentrer et à éviter les gestes brusques en faisant preuve de délicatesse. Leur fébrilité permet à certains patients de travailler leurs peurs et de surmonter l'ambivalence entre le désir et la peur. 6. 5. Les poissons 263 Certes, il est plus difficile d'interagir avec un poisson sur un mode tactile, comme avec un chien ou un chat. Mais la présence d'un aquarium a une fonction apaisante et revigorante pour l'être humain. Selon les psychologues, l'aquarium constituerait une forme particulière de stimulation : à la fois calme et apte à mobiliser l'attention (absence de bruit, caractère harmonieux de la nage, couleurs variées ), les poissons ont pour effets d'apaiser le patient, d'introduire un autre rapport au temps. Nous remarquons aussi une diminution de la pression artérielle, du rythme cardiaque et de l'anxiété chez les personnes observant des poissons en aquarium (Friedman et coll. ; Katcher et coll. )264. Entre autres à l'hôpital Necker à Paris, les médecins en pédiatrie- chirurgie maxillo-faciale utilisent des aquariums dans les salles d'attente et cabinets de soins pour cette raison. Des mesures ont été réalisées, et Alan Beck a montré que les patients avaient moins d'anxiété, ainsi que moins de douleurs. D'autres auteurs ont comparé les effets anxiolytiques dus à la présence d'aquarium comme supérieurs à des séances d'hypnose. En effet, l'aquarium suscite une fixation attentionnelle très 263 GUEGEN. Pourquoi les animaux nous font du bien. 2008. 264 MONTAGNER, L'enfant et les animaux familiers. 2007. 102 appréciable pour détourner l'esprit d'un stress ou d'une douleur : cela amène le patient à moins se focaliser sur ses variables internes (perception de la douleur, anxiété face aux instruments du dentiste, sueurs, etc. ) 7. Profils recherchés 7. 1. Conditions médicales de l'animal Les animaux de compagnie peuvent transmettre des infections de nature bactérienne, virale ou fongique aux humains. Les agents infectieux peuvent provenir des poils, de la peau, de la salive ou des matières fécales de l'animal. D'après le Dr Wallace (infectiologue et chef du comité de contrôle des infections à l'hôpital Huntington, en Californie), des chiens rigoureusement examinés (clinique et para-clinique) peuvent interagir de façon sécuritaire avec des patients d'hôpital. Selon Arenstein et Lessard dans La Zoothérapie (2012), l'examen effectué par le vétérinaire doit comprendre : Un examen physique de base (condition générale et propreté ; yeux ; oreilles, nez, cavité orale, dentition, gorge ; ganglions lymphatiques ; système uro-génital ; téguments ; système nerveux ; abdomen ; système musculo-squelettique ; auscultation cardiaque et pulmonaire) Une analyse des selles [annuelle] (culture, recherche de parasites intestinaux et protozoaires) Une culture de la gorge Un bilan sanguin complet Une vaccination obligatoire. 103 Tous les chiens bénéficient d'un programme prophylactique antipuces et anti-vers et sont évalués sur le plan médical tous les six mois. 265 Ainsi, malgré les risques potentiels de maladies, des mesures d'hygiène simples et un minimum de connaissances sur la prévention, permettraient d'en éviter la transmission de façon adéquate. L'animal doit aussi avoir une très bonne hygiène : soins d'entretien à la dentition et hygiène buccale (dents propres, exempts de tartre) ; poil propre, soyeux et démêlé, sans pellicules ni puces ; les traces de problèmes cutanés feront l'objet d'investigations ; les problèmes de sécrétions nasale et oculaire doivent être analysés ; les oreilles doivent être propres, sans sébum. 266 Les soins d'entretien sont l'occasion de faire participer les patients, lorsque nous sommes en institution, et de créer des activités ludiques avec dans certains cas un but paramédical : mouvements de kinésithérapie, travail sur les postures, le langage 267 Il est possible de laver le chien sans utiliser de base lavante agressive, une à deux fois par semaine. Cependant, une fois par mois suffirait largement, particulièrement lorsqu'il n'y a pas de pathologies médicales fragiles au niveau infectieux. Cela permettrait de limiter les odeurs, d'entretenir le pelage, et de contrôler les infections parasitaires. 268 Le brossage se ferait quant à lui une fois par jour, avec du matériel adapté. Il permettrait l'entretien du pelage, le contrôle d'éventuelles infections parasitaires, mais aussi la socialisation (du jeune animal). Le brossage régulier des dents permettrait de limiter la formation de plaque dentaire, d'assurer une bonne haleine, et serait indispensable pour habituer l'animal aux contacts rapprochés. Il faudrait une brosse spécifique, ou un doigtier en caoutchouc et une pâte dentaire pour carnivores domestiques. 269 265 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie, 2012. 266 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 267 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 268 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 269 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 104 Les soins des oreilles peuvent se faire avec des produits adaptés et, soit de manière régulière en cas d'otite externe chronique, soit de manière systématique après une baignade ou un bain (pour éviter la stagnation d'eau au fond du conduit auditif à l'origine de l'otite), soit tous les huit à quinze jours pour un entretien régulier. 270 Des prélèvements sanguins, de gorge et de selles doivent être effectués à chaque visite médicale. Les animaux doivent recevoir une alimentation saine et équilibrée. 7. 2. Caractéristiques générales D'après François BEIGER, l'animal médiateur doit avoir les caractéristiques suivantes : une existence réelle et concrète, un caractère inoffensif, une malléabilité. Il doit pouvoir travailler dans toutes sortes de jeux, dans différents rôles complémentaires, jouir d'un tempérament l'amenant à être réellement un intermédiaire, un transmetteur, permettant ainsi la communication, reformant le lien, tout en conservant la distance nécessaire, jouir d'une adaptabilité (de façon à ce qu'il corresponde aux exigences du projet), d'une assimilabilité (de façon à favoriser une relation suffisamment intime pour que le sujet puisse s'identifier à lui), et d'une capacité d'avoir le caractère d'un instrument (si besoin est, afin que le sujet puisse l'utiliser comme un prolongement de lui- même) et un élément identifiant pour qu'on le reconnaisse immédiatement. En raison de ces caractéristiques, l'animal intermédiaire entrane une baisse du niveau d'anxiété dans des états qui, étant par nature incontrôlables, n'auraient pas permis un comportement adapté 271. Le chien, lui, doit démontrer de l'intérêt et de l'attention envers les humains, ne présenter aucune agressivité, être à l'aise dans le milieu du travail, connatre les commandements de base (assis, coucher, pas bouger/reste), être fiable, être propre, et selon les circonstances, démontrer de l'intérêt et du respect envers les autres espèces animales. 270 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 271 BEIGER, dans ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie, 2012. 105 Les races de chien privilégiées seraient : Labrador Retriever, Golden Retriever, Caniche standard, Coton de Tuléar, chiens nordiques, terre-neuve, bouvier bernois, berger australien, hovawart 272 Mais bien entendu, avec une éducation adaptée et de bonnes caractéristiques générales, tous les chiens pourraient nous aider, en thérapie. 7. 3. Elevage de l'animal médiateur273 Nous allons parler de l'élevage du chien, mais cette éducation serait transposable, de manière relative, à d'autres animaux de compagnie. Ainsi, l'apprentissage du chiot devrait commencer dès l'âge de deux mois (c'est-à-dire dès l'âge o on peut le séparer de sa mère). Avant cela, c'est à sa mère de le socialiser. Il faudrait également lui apprendre à être manipulé et à reconnatre la voix et l'odeur de son futur matre, ainsi que ses gestes du quotidien. Par la suite, il est important de placer le chiot, progressivement, dans des situations qu'il va rencontrer dans le futur. Ainsi, il faudrait le mettre régulièrement en contact avec des enfants, des bruits du quotidien, avec la rue, les ascenseurs, les voitures, les escaliers, etc. , mais aussi lui faire côtoyer d'autres animaux familiers. Il faut impérativement lui apprendre à matriser son énergie. Ainsi, il ne faut pas le laisser faire n'importe quoi, l'habituer à marcher en laisse, à ne pas sauter, et à être à l'écoute de la personne qui demande une action. François Beiger conseille d'emmener le chiot en garderie, en maternelle, pour l'habituer très tôt à être dans un monde de stress, et lui apprendre à matriser ses aptitudes. Cela aurait aussi des effets bénéfiques pour ces enfants, qui vont pouvoir, entre autres, faire la distinction entre chiot et peluche. Le point essentiel est que le chiot prenne confiance en nous. Un travail d'éducation quotidien, même de courte durée, serait préférable et plus efficace qu'un travail de deux heures d'affilée en fin de semaine. L'éducation que F. Beiger donne à ses chiots est intuitive, et ne se fait que par la voix et son intonation, ainsi que par le regard et par des gestes simples. Cela suffirait largement pour se faire respecter et obéir. 272 BEIGER François. L'enfant et la médiation animale. 2008. 273 D'après BEIGER, L'enfant et la médiation animale, 2008. 106 Pour les réprimander, F. Beiger pointe le chiot du doigt et le regarde dans les yeux en parlant sur un ton plus fort. Il est inutile de le frapper, car cela peut le traumatiser à vie, et même le blesser. Il comprendra parfaitement nos intentions. Au même titre qu'un enfant, le chiot sait très vite faire la différence entre obéissance et désobéissance. Et il finira rapidement par nous respecter. Et si réprimande il y a, elle doit être donnée sur le fait, et non après. D'après Jean Lessard, le principal défi pour les matres est d'établir une cohérence dans l'interaction avec l'animal. Il existerait trois éléments essentiels pour réussir une relation avec son chien : La constance : nous devons toujours avoir les mêmes réactions face aux mêmes comportements du chien L'intention : nous devons persévérer dans notre demande, ne pas abandonner Eviter les émotions négatives : nous devons être conscient de notre intonation et utiliser des mots que le chien peut associer à quelque chose, en prenant une voix aige, mais un ton bas. Il est très important de féliciter le chien lorsqu'il répond à la demande. La voix grave doit être utilisée pour exprimer notre désaccord (on peut même grogner , cela donne plus d'ampleur à l'intervention). Souvent, un simple hé ! est suffisant. Une demande se fait sur un ton neutre. Nous ne devons jamais faire venir un chien à nous pour le réprimander, sinon, lorsqu'il aura compris, il évitera de venir nous voir. 107 Chapitre IV LA THERAPIE FACILITEE PAR L'ANIMAL EN ORTHOPHONIE 108 La zoothérapie en orthophonie est en plein développement, mais n'en reste pas moins qu'à ses débuts. En effet, bien des professionnels ne savent pas que cela est autorisé. Malgré tout, le nombre d'études sur le sujet est en constante augmentation, notamment avec les mémoires d'orthophonie, et des associations telles que le GREFTA, l'Institut Français de Zoothérapie, A&P Sommer, et handi'chien, qui considèrent les orthophonistes comme faisant partie intégrante de ce type de thérapie, et qui participent à la mise à disposition et à la centralisation d'informations sur le sujet. Ils permettent une meilleure prise en considération de ce type de prise en charge, un meilleur soutien, ainsi que la mise à disposition d'informations et de formations, aidant à ce que la prise en charge se passe dans les meilleures conditions possibles, et soit vraiment bénéfique pour le patient. I. L'animal dans la prise en charge orthophonique La zoothérapie en orthophonie suit les mêmes principes que les autres zoothérapies. Elle en possède aussi les mêmes avantages. Nous n'allons donc pas revenir dessus, mais seulement repréciser les apports plus spécifiques à la rééducation orthophonique. Il faut donc garder en tête tous les autres apports cités précédemment. Ainsi, la présence d'un animal en orthophonie permettrait spécifiquement : la libération des émotions et des affects, qui s'accompagnerait d'une amélioration des capacités de communication, du langage expressif verbal et non verbal, et de la sociabilité. Il y aurait une stimulation de l'élocution. Le contact avec l'animal exercerait également une fonction primordiale dans la structuration des processus cognitifs, et dans le développement des ressources intellectuelles, avec la stimulation des fonctions mentales supérieures, de la concentration, de la mémoire à court et long terme. Il y aurait structuration de la relation thérapeute/patient, sur les plans spatial et temporel, en orientant l'attention et en favorisant l'attention conjointe. 109 La curiosité, l'attention soutenue et sélective, la concentration intellectuelle et l'imagination seraient mobilisées, et activeraient les processus déductifs et inductifs dans une pensée en mouvement. En toute sécurité affective, les animaux donneraient les clés essentielles du savoir et de la connaissance : ils apprendraient à apprendre. De manière générale, thérapeute et animal seraient liés l'un à l'autre dans la pensée du patient. De ce fait, si le patient éprouve du plaisir à être avec l'animal, il aura très rapidement envie de communiquer avec le thérapeute. Cette communication étant la base de la rééducation, nous voyons à quel point l'animal peut être utile. De plus, le plaisir éprouvé est un bon moteur de motivation, parfois difficile à mobiliser dans le contexte classique. L'animal en thérapie orthophonique serait particulièrement efficace pour les enfants atteints de troubles envahissants du développement, et pour les adultes ayant une démence type Alzheimer (DTA). En effet, l'animal serait sensible aux normes sociales humaines, mais peu exigeant quant à leur respect. Chez les personnes autistes, l'animal permettrait le développement d'une communication multi-canale non-verbale, lui permettant de développer ses capacités de communication générale, et son faible niveau sensoriel et affectif. Cette expérience relationnelle lui procurerait les bases élémentaires nécessaires à toute relation. Le patient prendrait aussi conscience des effets de son comportement, grâce aux réactions de l'animal. C'est la base du lien social. Enfin, l'animal permettrait au thérapeute d'avoir l'attention de l'enfant, en diminuant les éventuelles perturbations, et d'utiliser le langage. Chez les DTA, il y aurait une stimulation des fonctions cognitives supérieures, une stimulation de la mémoire, une résurgence de souvenirs, le maintien ou le développement de la communication, au moins non-verbale, ainsi que la diminution de certains comportements perturbateurs tels que l'écholalie. 110 Enfin et de manière générale, la présence d'un animal en prise en charge orthophonique aurait un aspect ludique. Elle favoriserait l'humour et la souplesse dans la rééducation. Et présent (ou parfois seulement évoqué), l'animal favoriserait l'établissement d'une très bonne relation thérapeutique. II. Exemples de rééducations Suite à nos lectures, et particulièrement les premières, nous nous sommes aperçues que des exemples types de prise en charge n'étaient que peu donnés. Puis, au fur et à mesure de nos lectures, nous nous sommes rendues compte que chaque thérapeute, et de ce fait chaque orthophoniste, devait adapter ses rééducations avec l'animal, de la même manière qu'il peut le faire sans lui. Ainsi, il peut y avoir autant de types de rééducations avec l'animal, que de patients et d'orthophonistes. Malgré tout, voici quelques exemples de prise en charge orthophonique avec l'animal, tirés de différents mémoires d'orthophonie sur le sujet. Ils comportent cependant des limites : ces études ont été faites avec un nombre insuffisant d'individus pour avoir une valeur scientifique. Elles gardent malgré tout une valeur clinique non négligeable. Et malheureusement, bien que d'autres mémoires d'orthophonie sur le sujet existent, nous n'avons pas pu nous les procurer, le prêt entre bibliothèques universitaires n'étant pas possible pour ces documents-là dans certaines universités. 1. Pour les troubles de la mémoire, les maladies type Alzheimer Nous pouvons mener un atelier de groupe274, en institution, avec des personnes présentant des démences type Alzheimer, moyennes à sévères, et un chien. Cela consiste tout d'abord en une présentation du chien en début de chaque séance. Puis, il y a des jeux de balle, avec différents thèmes abordés, tels que l'aspect physique du chien, ses différences avec un chat, les avantages et inconvénients de posséder un chien, les activités que l'homme peut avoir avec son chien, les caractéristiques et qualités du chien, l'alimentation et les soins donnés aux animaux, les 274 SALICETI. L'activité assistée par l'animal : une solution pour lutter contre l'apathie dans les D. T. A. ? . 2011. 111 différences morphologiques entre l'homme et le chien, les lieux de vie des chiens et ses modes d'existence, les rôles de l'animal de compagnie dans nos sociétés, etc. Durant ces ateliers, les patients posaient naturellement des questions sur l'état de santé du chien, faisaient des remarques sur son physique, sur ce qu'il faisait, etc. Il y avait aussi des évocations naturelles de souvenirs. Friedman275 explique d'ailleurs que le souvenir d'expériences personnelles et agréables suffirait à apaiser le patient. Clémentine Salicetti276 a noté des évocations de souvenirs, des anecdotes et événements passés, exprimés par le patient, de manière spontanée. Il semblerait que la mémoire s'active au contact du chien. Mais pas seulement. En effet, l'animal permettrait aussi des réminiscences de souvenirs plus récents, ou avec un rapport plus ou moins éloigné du chien ou de ses actions (par association d'idées, probablement). Le chien serait, dans ce groupe, un stimulus simple et significatif, sans que cela n'exige de compétence particulière pour le patient. La communication non verbale serait constamment stimulée, de même que l'intérêt et la prise d'initiatives. Le chien inciterait le patient à se lever, à lui lancer la balle, etc. Le patient le ferait pour lui faire plaisir, l'encourager dans ses démonstrations affectives, et donc se faire plaisir à lui- même. L'animal romprait l'isolement affectif et stimulerait l'expression verbale, tout en étant source d'échanges. Le chien serait ici un agent de motivation et de stimulation. Il inciterait le mouvement, la réaction et l'envie par le jeu. Mais aussi le rire, l'action et l'évocation. Il a résulté de ces séances une amélioration du score d'apathie des patients, ainsi qu'une augmentation de l'appétence au langage, pour la plupart. Cet atelier présente tout de même quelques inconvénients. Tout d'abord, le chien était légèrement désorienté par le bruit des patients excités et par les nouvelles odeurs, au début. Mais il s'y est très vite habitué grâce à son naturel sociable et enjoué. Il a été mis en confiance et a apprécié être le centre des attentions des patients. De plus, parfois, certains patients étaient trop obnubilés par le chien pour être attentifs à ce que pouvait dire le thérapeute. Et bien qu'il permette de rompre les barrières entre les patients, les tours de parole n'étaient pas respectés, et les patients avaient tendance à ne 275 Dans SALICETI. L'activité assistée par l'animal : une solution pour lutter contre l'apathie dans les D. T. A. ? . 2011. 276 SALICETI. L'activité assistée par l'animal : une solution pour lutter contre l'apathie dans les D. T. A. ? . 2011. 112 parler que pour eux-mêmes. Bien heureusement, au fur et à mesure des séances, ils ont commencé à parler entre eux et à partager leurs souvenirs. Enfin, et cela vaut pour tous les types de rééducation o l'animal est instrumentalisé , l'animal est un être vivant, qui ne se plie pas forcément à ce qui est prévu (aboyer sur commande, ramener la balle, se laisser caresser, venir quand on l'appelle ). Nous pouvons aussi mettre en place une rééducation individuelle de personne présentant une DTA avec un chien. Dans le mémoire277 présentant cette rééducation, la prise en charge se déroule en institution (EHPAD ou accueil de jour), mais cette rééducation serait adaptable en cabinet libéral. Nous pouvons ainsi poser des questions au patient, en rapport avec l'animal. Ce dernier serait un agent de stimulation, car il invite au jeu, à l'action, aux rires Toutes les actions proposées en rapport avec le chien ne seraient pas vécues comme persécutantes , et les silences ne seraient pas pesants. De plus, l'animal solliciterait de manière spontanée les patients. L'apathie, obstacle majeur en rééducation, serait fortement réduite par la simple présence du chien. D'autre part, la communication serait facilitée, mais pas seulement en thérapie : en observant le chien, en se rappelant des souvenirs ou des anecdotes concernant les animaux, la communication serait facilitée avec les autres résidents. Ils auraient un sujet de conversation. Et le chien favoriserait l'augmentation de l'estime de soi. Nous pourrions aussi travailler la mémoire, l'apraxie et l'agnosie. La présence du chien permettrait à la situation de devenir non stressante, et même plaisante. Nous ne parlons pas de nous mais du chien. Et ce chien qui ne juge pas permettrait d'oublier le jugement d'un tiers. Le patient prendrait alors un grand plaisir à discuter. La présence d'un chien permettrait une augmentation de la communication verbale des patients atteints de DTA. Le temps de communication serait multiplié par 2, 3. 277 CHARBONNIER. Thérapie facilitée par l'animal et maladie d'Alzheimer : quels bénéfices pour la communication ? . 2010 113 Lorsque le chien est dans son coin, il faut expliquer au patient la cause (le chien est fatigué), car il peut se sentir blessé ou rejeté, mais aussi car il peut alors prêter des sentiments, sensations, émotions au chien, poser des questions, faire des liens avec son ressenti personnel, etc. Il peut être vu comme une éponge émotionnelle et un moyen de se projeter. Il permet de parler de soi indirectement. Enfin, il est possible de mettre en place un atelier réminiscences278, pour les patients atteints de troubles de la mémoire : la présence animale et les éventuelles activités l'incluant permettraient au patient la réminiscence de souvenirs en rapport plus ou moins en proche avec cet animal. 2. Pour les troubles du langage écrit Le dyslexique peut lire une histoire à l'animal. Cela diminuerait son stress, et surtout permettrait d'augmenter sa motivation. Même s'il trébuche sur des mots, l'animal ne se formalise pas, et le thérapeute peut alors intervenir subtilement pour aider l'enfant. Son estime de soi augmenterait alors, et il prendrait goût à la lecture. 279 Nous pouvons aussi utiliser le jeu incluant l'animal vivant, Pouchka et Cie , développé par Sylvie McKandie, orthophoniste. Il permettrait de travailler avec les enfants comme les adultes, et en groupe comme en individuel. C'est un jeu de société sur la thématique canine. Son originalité consiste dans le fait que nous faisons appel aux chiens pour certaines épreuves. Ce jeu est très adaptable dans la mesure o l'on choisit les questions et épreuves de jeu en fonction de son public et des domaines que nous voulons travailler avec lui. Ce jeu se fait dans le bien-être de l'animal, car il n'est sollicité que dans certaines épreuves. Il permettrait de relier l'affectif, les émotions et les apprentissages. Mais aussi la structuration de l'espace, du temps, et permettrait aussi de parler de soi, si 278 CHARBONNIER. Thérapie facilitée par l'animal et maladie d'Alzheimer : quels bénéfices pour la communication ? . 2010. 279 GREFF, Le chien : auxiliaire en logopédie-orthophonie ? . 2010 114 on le souhaite. L'une des épreuves consiste par exemple à écrire un petit texte sur l'ardoise posée sur le dos du chien. 280 Figure 1 : chiens de Sylvie McKandie positionnés comme jouant au jeu Pouchka et cie 281. Photo Sylvie McKandie Pour le langage écrit, nous pouvons utiliser la thématique chien, ou utiliser des pictogrammes que nous adaptons. Il est ainsi possible de créer un texte sur le dos du chien à l'aide d'une cape sensorielle, de travailler la compréhension, la lecture et l'orthographe à l'aide de pictogrammes que nous pouvons complexifier ou simplifier, à placer selon un ordre correspondant au texte, associer des étiquettes-mot à un pictogramme ou à une image, corriger des étiquettes-mot, les compléter, les remettre dans l'ordre, et composer une histoire logique sur le support de l'animal. 282 3. Pour les troubles du langage oral Pour travailler le langage oral, un large choix d'activités s'offre à nous. Avec le patient, nous pouvons ainsi faire une observation de la thématique animale, avec par 280 281 Photo de Sylvie McKandie, téléchargée sur le site mckandie-orthophoniste-entre-dans-le-jeu/ le 08. 06. 2014 282 GREFF, Le chien : auxiliaire en logopédie-orthophonie ? . 2010 115 exemple des pictogrammes. L'animal peut être un support vivant pour travailler les versants expressifs et réceptifs dans les domaines de la syntaxe, de la morphosyntaxe, du lexique, de l'articulation. Nous pouvons aussi faire des stimulations des outils de base : schéma corporel, balayage visuel, attention et discrimination visuelle, conscience phonologique, orientation spatiale et temporelle . 283 Nous pouvons aussi demander au patient de raconter une histoire, de résumer une histoire au chien, qui sera attentif et ne jugera pas. Pour le vocabulaire, nous pouvons mettre en place un atelier sens et langage, autour du chien et de son corps : chaque séance mettrait en exergue un sens, et les patients devraient trouver avec quelle partie du corps le chien l'utilise. Par la suite, l'orthophoniste pourrait stimuler ce sens chez les patients avec différents supports. 284 Nous avons aussi la possibilité d'instaurer des activités de Jeux de langage et de vocabulaire. Avec par exemple un travail de langage autour du schéma corporel, en comparant celui du chien avec le nôtre, ou avec d'autres animaux. 285 Nous pouvons aussi mettre en place un atelier langage et parole, des groupes de parole286, car l'animal peut être un sujet intarissable de discussions. 4. Pour la rééducation tubaire, ou le travail du souffle Pour la rééducation du souffle, ou une rééducation tubaire, nous pouvons faire différents travaux de souffle, avec le chien et une balle. Nous pouvons ainsi souffler sur la truffe de l'animal, ce qui provoque une réaction de sa part287, nous pouvons essayer de souffler le plus fort possible sur la balle pour que le chien aille la chercher, etc. 283 GREFF, Le chien : auxiliaire en logopédie-orthophonie ? . 2010 284 SALICETI. L'activité assistée par l'animal : une solution pour lutter contre l'apathie dans les D. T. A. ? . 2011 285 GREFF, Le chien : auxiliaire en logopédie-orthophonie ? . 2010 286 CHARBONNIER. Thérapie facilitée par l'animal et maladie d'Alzheimer : quels bénéfices pour la communication ? . 2010. 287 GREFF, Le chien : auxiliaire en logopédie-orthophonie ? . 2010 116 5. Pour les Troubles Envahissants du Développement Dans un hôpital de jour d'un service de psyciatrie infanto-juvénile, une Thérapie du langage soutenue par la canithérapie est mise en place, avec des enfants de cinq à huit ans présentant des troubles envahissants du développement qui pénalisent la communication verbale, en groupe, ou non. 288 Ainsi, sont mis en place des jeux avec les chiens, des parcours d'agility, de l'obérythmée (exercices de dressage), des promenades, et divers jeux servant à la rééducation orthophonique classique o le chien est présent mais pas acteur. Les stimulations sensorielles permettraient à l'enfant replié sur lui-même de se tourner vers le monde extérieur. De plus, les interactions avec les animaux étant moins complexes, moins subtiles et plus prédictives socialement, les patients auraient plus de facilités à les décoder. Comme ils sont des intermédiaires non jugeants , rassurants, les chiens contribuent à l'établissement de l'alliance thérapeutique. L'orthophoniste a remarqué une amélioration de l'appétence à la relation et à la communication, soulignée par une majoration des comportements affiliatifs (rires, sourires, proxémie avec l'adulte) et une amélioration dans le temps de la communication verbale. Il est aussi possible d'avoir des interactions avec le matériel spécifique de l'animal (ici, pour le chien, un ballon, une brosse, une laisse, et un paquet de friandises), avec des enfants autistes : 289 Ce seraient des interactions naturelles avec l'enfant autiste. Il y aurait un travail sur la prise de conscience et le contrôle des émotions ainsi que leur mise en mots (pour les verbaux), un travail d'affirmation et de confiance en soi, un travail spécifique sur la verbalisation (vocabulaire, constructions syntaxiques, aspects pragmatiques), le développement des capacités de concentration et d'attention, notamment l'attention conjointe, la compréhension de consignes simples soutenues par le langage non verbal, ainsi que l'adaptation et l'ajustement aux sollicitations éventuelles de la chienne. 288 SADIN. Canithérapie en orthophonie ou Louve, le chien qui parle . 2011. 289 SOREAU. Atelier orthophonique associant un chien auprès de deux jeunes autistes déficitaires. 2010. 117 Les mouvements agressifs de certains peuvent aussi disparatre : la chienne fuit, sans être agressive. Elle a en effet été intégrée régulièrement très jeune dans l'établissement, a été habituée très tôt aux mouvements agressifs de certains jeunes et les considère comme des moyens de communication. Ainsi, elle sait comment y réagir, a appris à les anticiper, et à y répondre de façon adaptée. L'orthophoniste a pour objectif de faire évoluer les mouvements agressifs vers un mode de communication adapté. Le patient prendrait conscience de son comportement : il faut qu'il arrête s'il veut partager des moments de complicité et d'interaction avec la chienne. Les mouvements agressifs disparaitraient au fur et à mesure des séances. Les études de Prothmann et coll (2009) et de Redefer et Goodman (1989) 290 seraient confirmées par les observations d'Anne-Claire Soreau (2010)291 : les enfants autistes s'engageraient davantage et plus longuement dans des interactions avec un chien qu'avec un adulte ou des objets, et il y aurait une augmentation du comportement social ainsi qu'une diminution des comportements d'isolement. Enfin, nous avons la possibilité d'utiliser la méthode PECA (ANNEXE 1). Elle permettrait de s'exprimer autrement que verbalement, de renforcer la motivation à la communication, de pouvoir se faire comprendre, libérer l'anxiété par cette communication intuitive, de débloquer des mots ou des phrases incompréhensibles, et d'avoir une angoisse qui s'amoindrit grâce à l'animal tranquillisant. 6. Pour les troubles logico-mathématiques Pour la rééducation de ces troubles, nous pouvons par exemple compter les croquettes, peser une ration et faire des collections. Nous pouvons aussi inventer des problèmes utilisant la thématique de l'animal, et entraner la création/stimulation d'images mentales indispensables en mathématiques (quatre pattes différentes représentations, deux oreilles du chien ). 292 290 Dans SOREAU. Atelier orthophonique associant un chien auprès de deux jeunes autistes déficitaires. 2010. 291 SOREAU. Atelier orthophonique associant un chien auprès de deux jeunes autistes déficitaires. 2010. 292 GREFF, Le chien : auxiliaire en logopédie-orthophonie ? . 2010 118 7. Pour tous les troubles Enfin, nous pouvons tout simplement profiter de la présence de l'animal dans la pièce, avec ses apports inhérents (que nous avons vus dans les chapitres précédents), mais aussi les interactions naturelles et imprévues, de l'animal quelles qu'elles soient, ou conséquentes à la présence de l'animal. Pour conclure, de manière générale, c'est au thérapeute d'adapter la zoothérapie à sa pratique, à sa manière de fonctionner, et surtout à ses patients, pour obtenir les meilleurs résultats possibles, et aider au mieux le patient. Il n'y a pas de méthode toute faite . III. Contraintes d'un animal, en thérapie, pré-requis et contre-indications 1. Les réticences Les orthophonistes voulant travailler avec un animal feraient face à des réticences, de la part de l'administration, du personnel soignant, et quelques fois des patients. Nuisances sonores, odeurs, risques de chute, dégradation des locaux, non respect des espace verts, n'ont pas lieu de justifier un refus, car ils peuvent être empêchés grâce à de simples informations et grâce à l'application de règles vétérinaires de base293. Des explications précises, des renseignements sur les buts de cette pratique, ainsi qu'une réflexion sur les bienfaits de l'animal pour les patients, donnés à cet entourage professionnel permettraient une réassurance. L'introduction de l'animal ne serait pas un danger, particulièrement lorsque des précautions sont prises. 293 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 119 Ainsi, voici quelques éléments de réponses de vétérinaires et scientifiques à opposer aux sceptiques : 294 Les risques concernant la santé, induits par la présence d'un animal en institution, seraient minimes et facilement évitables. Mais il faut prendre au sérieux toutes les interrogations du personnel et des résidents à ce sujet. Derrière les préoccupations de santé, il y aurait d'autres problèmes comme le travail supplémentaire, les phobies, etc. L'information et la discussion réduiraient, voire supprimeraient ces problèmes. Un animal détendrait l'atmosphère et rendrait les résidents plus dynamiques et agréables. Le bienfait serait général. Les chutes, glissades et morsures seraient des risques craints, mais quasi- inexistants, particulièrement si l'on respecte les conditions primordiales. Les tranches d'âges les plus exposées pour les morsures seraient les deux à cinq ans et les dix à quatorze ans. Mais un chien équilibré et bien socialisé n'agresserait pas un enfant, de la même façon qu'il inhiberait sa tendance à l'agression face à un chiot. Il existe des programmes éducatifs de prévention des morsures, qui apprennent à interpréter certaines postures qui traduisent les intentions du chien, à approcher un chien de façon sécuritaire, et à adopter des positions de protection en présence d'un chien menaçant. Voici les principes importants pour assurer un contact agréable et sécurisant avec un chien, d'après Annie Bernatchez, Pour une approche sécuritaire du chien295 : - Nous ne devons pas flatter un chien sans d'abord avoir l'accord de son matre, - Nous devons vérifier si le chien a envie d'être en contact avec nous, - Nous devons nous approcher lentement en gardant les bras le long du corps, et en faisant un poing avec ses mains les pouces vers l'intérieur, - Nous pouvons lui présenter le dessus de la main, - Les chiens qui ne veulent pas être importunés auront tendance à reculer voire à grogner (il ne faut pas insister et respecter sa volonté, sinon, nous risquons de nous faire mordre), 294 VERNAY, Le chien partenaire de vies, 2003. 295 Dans ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996 120 - - si le chien s'approche pour sentir notre main, nous ne devons pas lui toucher le dessus de la tête et encore moins le regarder dans les yeux (il peut les recevoir comme des gestes menaçants) nous devons privilégier la caresse sur la poitrine ou en dessous du menton. - Un chien agressif retrousse ses babines pour montrer ses dents, relève la queue et la maintient immobile, dresse ses oreilles et les poils de son dos et se montre prêt à bondir ou courir. Dans une telle situation, il ne faut surtout pas s'en approcher. De même lorsque le chien a peur et est en position de soumission : sa méfiance risquerait de l'amener à attaquer. Les zoonoses, que nous allons développer par la suite sont nombreuses, mais des prophylaxies très simples permettraient de les tenir à distance. Un animal bien entretenu et à jour de ses vaccinations est parfaitement sain, et aurait donc toute sa place en institution et en cabinet. Un carnet de suivi de santé devrait pouvoir être montré à tout moment pour rassurer les anxieux ou réticents. Le rôle bienfaisant de la médecine est de mettre en place des éléments thérapeutiques innovants, permettant aux résidents de recouvrer à partir de leurs possibilités fonctionnelles une vie sociale, une joie de vivre. Le chien Léon, de ce point de vue là, est tout à fait exceptionnel : un élément dans une trajectoire réfléchie. Dans un espace o on prône le sanitaire, l'hygiène, l'éradication des microbes, la lutte contre les infections nosocomiales, l'arrivée d'un chien avait quelque chose de provocant, de provocateur, d'iconoclaste. Un travail préparatoire avec l'encadrement a montré comment le chien pouvait s'intégrer dans ce nouvel espace. Pr. Olivier Rodat, du CHU de Nantes296 L'essentiel des risques physiques serait donc représenté par les chutes, les glissades sur les déjections d'animaux et par les morsures ou les griffures des personnes en contact avec les animaux. Bien entendu, ces points seraient très facilement évitables. Et la prévention passe par le choix raisonné de l'animal : il faudrait qu'il soit équilibré sur le plan comportemental (donc qu'il ne manifeste pas d'agressivité), correctement éduqué, bien guidé (donc contrôlable dans ses mouvements, sans comportement exubérant ni dangereux). 297 296 Dans VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 297 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 121 2. Les zoonoses Les zoonoses sont des infections (bactéries, virus) et infestations (parasites) qui se transmettent naturellement des animaux à l'homme, et vice-versa. Plus de 300 zoonoses sont répertoriées dans le monde. Elles ont des conséquences sanitaires, mais, selon l'institut national de la recherche agronomique, leur impact médical est très inférieur aux maladies infectieuses non zoonotiques. Bien que de grandes précautions soient prises, il peut toujours, même si très rarement, y avoir des risques de transmission d'agents infectieux par l'animal. Voici un bref tableau récapitulatif des zoonoses298 : Nom Agent Mode de infectieux transmission Symptômes (chez l'humain) Prévention Campylobactériose Cheylétiellose Gale Sarcoptique Campilobact er spp. Cheyletiella sp. Sarcoptes scabiei canis Giardose Giarda spp. Excréments Contact direct (poils ou peau) Contact direct avec l'animal Contact direct avec l'animal ou ses excréments leptospirose Leptospira spp. Urine ou eau contaminée Rage Rhabdovirus Morsure, salive ou griffures Diarrhée, crampes intestinales, fièvre, vomissements, maux de tête et douleurs articulaires ou musculaires Lésion cutanée Lésion cutanée Se laver les mains Examiner la peau de l'animal ; Vermifuger l'animal Examiner la peau de l'animal ; vermifuger l'animal Diarrhée Se laver les mains Fièvre, frissons, maux de tête, douleurs musculaires et fatigue. Jaunisse due à des troubles du foie, des reins et du sang. Maladie mortelle en l'absence de traitement. Premiers signes : légers symptômes neurologiques (anxiété, agitation ), puis coma et mort. Se laver les mains ; Faire vacciner l'animal ; Eviter le contact direct avec l'urine de l'animal suspect. Faire vacciner l'animal Salmonellose (liée surtout aux reptiles) Salmonella sp. Direct ou indirect diarrhée, maux de tête et nausées Immunodéprimé : ne jamais Fièvre, crampes abdominales, Se laver les mains régulièrement ; ou vomissements manipuler de reptiles. Teigne Microsporum canis Par le poil ou par le contact direct avec le champignon Lésion cutanée typique chez l'homme Vers Psittacose (maladie des oiseaux) Toxoplasmose Puces, poux, tiques, mites Pas vraiment de symptômes, mais il peut y avoir de la diarrhée, de la Excréments ou fièvre ou des vomissements ; salive Douleur thoracique ; Certains vers Dipylidium caninum Dirofilaria repens Toxocara canis Selles humides peuvent migrer jusqu'à l'œil et provoquer la cécité (rare). Peut provoquer des maladies respiratoires Se laver les mains ; examiner les animaux pour détecter la présence de plaques alopéciques ; Faire voir les animaux présentant des plaques alopéciques ; Test de Fungassy. Se laver les mains ; Vermifuger l'animal ; utiliser des traitements préventifs (Révolution, Advantage) (surtout dangereux pour les femmes enceintes) 298 D'après le tableau de Shannon Guérin, technicienne en santé animale, et Pierre Verret. 122 Un animal malade, sous traitement ou infecté par une bactérie ou un virus transmissible à l'humain est immédiatement écarté du programme de zoothérapie. De plus, comme les animaux sous médications peuvent potentiellement développer des réactions secondaires (comme un problème de comportement), tout animal médicamenté doit être réévalué par le vétérinaire. Toutes ces zoonoses cependant ne se transmettent pas facilement à l'humain, car les conditions de transmission sont complexes. De plus, ces maladies peuvent être enrayées grâce à un suivi rigoureux de la santé physique des animaux et une hygiène stricte. La première règle est d'enseigner aux gens à bien se laver les mains après avoir eu un contact avec un animal. En effet, extrêmement peu d'expériences de zoothérapie rapportent des cas de zoonoses, même parmi les personnes les plus fragiles au niveau immunitaire. 3. Recommandations générales Tout d'abord, il faut savoir qu'il est impératif de s'associer à un vétérinaire lorsqu'on utilise des animaux dans un cadre de travail. Tout d'abord parce qu'ils peuvent devenir des alliés de choix dans l'élaboration d'un projet de zoothérapie en institut ou hôpital, mais aussi car, en cas d'urgence, il faut pouvoir avoir rapidement des soins. 299 Pour que la rencontre avec les patients se passe bien, il faut éviter de provoquer une éventuelle fuite de l'animal, ce qui peut laisser croire au patient que c'est sa faute, et il se trouverait alors en position de revers. Ce serait un coup dur pour le moral du patient. Et, pour un enfant psychotique, cela pourait déclencher une anxiété, qui s'en suivrait d'une colère voire même d'une agressivité incontrôlable. Il faut donc verbaliser ce que fait l'animal, surtout dans un premier contact. Cela rassurerait le patient. En effet, il ne faut pas oublier que nous restons son repère à qui il peut confier son anxiété. Par la suite, l'animal prendrait le relai, il serait le repère transitionnel sécurisant l'enfant. 300 299 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 300 BEIGER, L'enfant et la médiation animale. 2008. 123 La stérilisation est recommandée afin que l'animal ne soit pas tenté de transgresser des ordres parce que sa libido le travaille. 301 Il faut faire attention à l'alimentation de l'animal : les patients auraient tendance à lui donner des friandises. Il faut donc veiller à la diététique. 302 Il est nécessaire, pour le bien-être de l'animal, de lui laisser la possibilité de s'isoler lorsqu'il en ressent le besoin (environnement bruyant ou violent, ou tout simplement fatigue). 4. Recommandations supplémentaires pour le milieu hospitalier La réglementation en matière d'accueil des animaux dans les maisons de retraite et hôpitaux de France étant assez restrictive, l'acceptation de l'animal ainsi que ses conditions d'accueil sont laissées à l'appréciation de l'établissement. Les indications, contre-indications et limites de la zoothérapie sont traitées sous l'angle de la médecine et de la médecine vétérinaire303. Des précautions supplémentaires sont donc à prendre, nous permettant de manière quasi-systématique l'acceptation du projet de médiation animale. Ainsi, toutes les instances concernées doivent donner leur accord au projet. Il faut donc compter sur des alliés (psychiatre, psychologue, médecin ) pour appuyer le projet. Le concept de ce type de prise en charge doit donc être clair. De plus, la direction doit s'enquérir auprès de son assureur et de ses conseillers juridiques par rapport à la présence d'animaux sur les lieux, en particulier en ce qui concerne les accidents du travail et la responsabilité civile. Un avis écrit doit être obtenu afin de clarifier la situation. Enfin, il faut faire une analyse des ressources matérielles et physiques du lieu : y a-t-il des locaux et équipements nécessaires pour recevoir des animaux ? un espace suffisant ? 301 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 302 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 303 BELIN. Animaux au secours du handicap. 2000. 124 certains locaux peuvent-ils être aménagés pour recevoir des animaux ? y a-t-il accès à des espaces extérieurs à proximité (enclos fermé, lieu de promenade ) ? 304 Il faudrait laver régulièrement le lieu de vie de l'animal, et laver le chien avant toute visite, de même pour les oreilles et les dents. Il faudrait le brosser pour enlever le plus de poils possible. Il faudrait aussi couper et limer les griffes (les patients ayant souvent une peau très fragile, en milieu hospitalier). Immédiatement avant une visite, il faudrait aussi éviter de promener le chien dans des endroits inconnus ou fréquentés par des animaux. Il faudrait aussi bien frotter le chien avec une serviette de bain en arrivant au centre, particulièrement en hiver ou lors d'une journée pluvieuse. Il faudrait aussi que le chien soit facilement reconnaissable, pour éviter que les gens croient que n'importe quel animal peut se présenter au centre : il peut porter un foulard ou une carte d'identité. Il ne faut pas permettre au chien de lécher le plancher ou de sentir les bacs qui contiennent des produits destinés à la lessive. Le chien ne doit pas circuler dans la salle à manger ni dans les postes d'infirmières. Il faudrait aussi mettre un drap sur le lit du patient avant que l'animal y monte ou y pose ses pattes ou sa tête. Il est essentiel de laver les mains du patient à la fin de chaque visite (c'est le moyen le plus efficace de prévenir les infections). Les proches et le personnel doivent faire de même. Et le thérapeute doit se laver les mains après chaque visite de patient. Il faut enfin éviter d'être présent lorsque le malade reçoit des soins, à moins qu'il soit demandé pour un soulagement ou un accompagnement. Une étude du docteur Lynette A. Hart de l'école vétérinaire de l'Université de Californie a démontré que les animaux présents dans les logements subventionnés par le gouvernement ne causaient ni bruit, ni préjudice personnel, ni dégâts matériels. Tout cela est donc largement réalisable. 304 ARENSTEIN & LESSARD. La Zoothérapie. 2012. 125 5. Contre-indications pour le patient Avant de mettre en place la zoothérapie, ou bien avant de recevoir un patient à son cabinet, il faut s'assurer qu'il n'ait pas d'allergies, de peurs, de système immunitaire très faible ou déprimé, d'aplasie médullaire, d'aversions ou encore d'agressions subies par les animaux dans le passé. 305 Au niveau des allergies, certaines races d'animaux ont un pelage très peu allergène. Et il y aurait la possibilité de prendre des cachets contre l'allergie, de manière ponctuelle, au moment de la séance. Une étude récente du Journal of the American Medical Association montre qu'un enfant qui n'a pas été exposé à un animal au cours de sa première année de vie court plus de risques de développer une allergie qu'un enfant y ayant été exposé (mais cette étude manque de recul). De plus, tout individu n'est pas forcément sensible à ce type de démarche. La mise en relation devrait toujours se faire sous le regard attentif d'un référent. 306 Le patient doit accepter volontairement l'approche de l'animal. Dans le cas contraire, il y a un risque de résultat négatif dans l'émotionnel comme dans le relationnel. 307 Enfin, il y a la contre-indication dite relative , pouvant poser problème dans la relation avec l'animal. Ainsi, nous serons beaucoup plus vigilants avec des patients présentant une débilité mentale, une zoophobie, ou des troubles psychiques agressifs. 6. Risques pour l'animal De l'animal humanisé auquel on attribue les dispositions psychologiques et intellectuelles humaines, à l'animal matériel , dont le statut d'être vivant est relégué à celui d'objet, ainsi que la méconnaissance de l'éthologie animale (comportements, aptitudes, besoins), entraneraient des dérives dommageables tant pour l'animal (perte de repères, troubles pathologiques, sujet d'abandon et de brutalité) que pour l'homme (irresponsabilité sociale, problèmes relationnels, retours d'agressivité). 305 ROSSANT & VILLEMIN. L'enfant et les animaux. 1996. 306 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 307 BEIGER. L'enfant et la médiation animale. 2008. 126 Il convient donc de rappeler que la possession d'un animal de compagnie nécessite l'intégration de deux notions d'ordre social : la responsabilité et le respect. La responsabilité qui nous incombe lorsque nous faisons le choix de nous occuper d'un animal, ainsi que le respect que nous devons à cet animal qui partage notre vie, mais aussi à ceux qui le subissent (tout le monde n'est pas enclin à accepter l'animal d'autrui). Les propriétaires d'animaux sont donc amenés à suivre un certain nombre de règles sociales et législatives, visant à ne pas troubler l'ordre de la vie en collectivité. 308 Les marqueurs d'inconfort peuvent être variables suivant les animaux. Mais de manière générale, nous remarquons des marqueurs spécifiques précoces de stress, qui peuvent varier de la boulimie à l'anorexie, de l'insomnie à l'hypersomnie, ou de l'agressivité à la perte des apprentissages (propreté, réponse aux ordres classiques, ). Les critères sanitaires sont aussi significatifs : troubles cutanés ou digestifs chroniques, affection douloureuse chronique , ainsi que les critères physiologiques tels que la tachycardie, tachypnée, hypersalivation De plus, il faut respecter les rythmes physiologiques de l'animal. Il a en effet besoin de temps de repos avec une aire bien à lui (un lieu o il puisse se retirer sans être dérangé), et des temps de promenade. 309 Il faut aussi lui laisser la possibilité de s'isoler s'il en ressent le besoin, même pendant les séances de rééducation o il devrait être actif. Risques spécifiques au dauphin : La vie du dauphin capturé est caractérisée par : Le passage d'une vie libre dans un espace illimité à une vie captive dans un espace restreint ; Une alimentation méritée et morte sous forme décongelée se substituant à une alimentation chassée et vivante ; La présence de l'homme et un comportement social entre animaux modifié. La forte concentration en chlore de l'eau provoque des irritations ophtalmiques au dauphin. 308 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 309 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 127 Il existe donc des animaux capturés qui se jettent la tête la première contre la paroi du bassin ou qui se laissent mourir de faim. En effet, il ne faut pas oublier que, contrairement aux hommes, les dauphins à l'état sauvages ne viennent pas dans ces endroits spécifiques pour rencontrer l'espèce humaine, mais pour se reposer, se socialiser et se reproduire, et ce depuis des décennies. Il est urgent de réfléchir à la responsabilité et à la conséquence de nos actes sur ces animaux. 310 Cela nous permet de nous poser la question de l'intérêt de la delphinothérapie, et même de manière générale de la captivité d'animaux sauvages dans des endroits clos et restreints. 7. Assurances et responsabilité 311 Les dégâts causés par les animaux familiers sont prévus dans un contrat d'assurance et de responsabilité civile. A partir du moment o il ne s'agit pas d'un animal de catégorie 1 (chien d'attaque) ou 2 (chien de défense), aucune déclaration spécifique n'est requise. Toutefois, dans le cas d'un animal, en institution ou hôpital, amené à rencontrer un grand nombre de personnes pas forcément à l'aise avec leur corps, il est conseillé à l'institut de signaler sa présence à l'assureur. Le principe du primum non nocere est un effet primordial. En effet, la science qui consiste à mesurer les effets de l'animal sur l'homme n'en est qu'à ses débuts. Surtout, nous ne pouvons administrer un animal comme un médicament. Il n'est pas comme un antibiotique qui va chasser à coup sûr une infection : il peut avoir des champs d'action différents selon les personnes, voire aucun effet sur certaines d'entre elles. Mais ce qui est certain, c'est qu'il ne participe pas à la détérioration de ceux qu'il côtoie (sauf dans les cas de phobie, qu'il faut traiter de façon spécifique). De plus, les bénéficiaires de la zoothérapie doivent garder la possibilité d'accepter ou de refuser leur participation au programme : s'ils ne se sentent pas capables d'y adhérer, si la proximité de l'animal les perturbe, il faut respecter leur intérêt. Ou alors revoir la manière 310 DELFOUR. Penser le dauphin et son monde. 2007. 311 VERNAY, Le chien partenaire de vies. 2003. 128 dont nous pouvons mener le programme. Certaines personnes par exemple bénéficient déjà d'un bénéfice par la simple présence de l'animal dans la pièce, à condition qu'il ne s'approche pas trop près d'eux. Et même si les patients sont parfois privés de la parole, ils gardent un langage gestuel, ou au moins des attitudes, qui ne laissent aucun doute sur ce qui les dérange ou leur plat. Enfin, l'animal, comme nous l'avons vu précédemment, n'est pas un médicament vivant. C'est un être sensible, investi d'une mission difficile. Il est parfois capable d'obtenir ce qui est refusé au thérapeute (un sourire, un effort particulier, l'envie de travailler, une volonté de communiquer, etc. ), alors qu'il est en même temps tributaire de cette même personne. De ce fait, le référent doit veiller sur la qualité de vie de l'animal, en s'imprégnant de tout ce dont il a besoin. Mais il faut tout de même faire attention à ne pas tomber dans l'anthropomorphisme, ou l'affectif bêtifiant. IV. Limites La question de l'effet thérapeutique pose problème entre chercheurs et cliniciens. En effet, il apparatrait que les animaux en eux-mêmes n'ont pas d'effet thérapeutique sur les patients : tout dépendrait de ce que fait le thérapeute. De plus, les effets ne seraient pas les mêmes suivant les patients, leurs troubles, leur réceptivité à l'animal, le contact avec le thérapeute, le thérapeute en lui-même, l'animal, etc. Ce qui rend donc compréhensible le fait que les chercheurs n'arrivent pas à reproduire les résultats dont témoignent les praticiens. Non parce que les praticiens ne seraient pas assez rigoureux ou trop investis dans le fait que ce genre de prise en charge puisse marcher, mais parce que les procédures expérimentales exigent que toutes choses soient égales par ailleurs , ce qui empêche les thérapeutes de construire de nouvelles réalités avec leurs patients. Et nous neutralisons le potentiel de changement apporté par la présence animale, et donc l'effet thérapeutique, lorsque tout, hormis la présence animale, doit être identique à une prise en charge 129 normale . Or, pratiquer avec l'animal comme si ce dernier était absent réduit grandement le champ des possibles. 312 Malgré tout, et comme dans la société actuelle il nous faut des preuves normées, le GREFTA, entre autres, développe des bilans et propose des formations. Tout d'abord afin d'enrichir la pratique de la zoothérapie, mais aussi pour que cette pratique soit davantage acceptée et s'ancre de plus en plus, particulièrement dans les instituts et hôpitaux o l'accès à la médiation animale est plus que limité et soumise à de grosses contraintes souvent abusives, et surtout dissuasives, pour le zoothérapeute. Enfin, il ne faut pas déconnecter l'animal d'avec la nature, ni d'avec sa nature. Il ne faut pas oublier que c'est ce qui fait sa richesse. Car il peut en effet devenir un simple outil, ce qui augmenterait le risque d'usages non éthiquement corrects, et nous perdrions une grande partie de tout ce qu'il peut nous apporter, en tant que thérapeute, mais aussi en tant qu'humain. 313 312 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 313 SERVAIS, La relation Homme-Animal. 2007 130 Mon nom est Doug. Je viens juste de vous rencontrer, et je vous aime déjà. Film d'animation Là-haut, 2009. 1h35. Réalisé par Pete Docter et Bob Peterson. Disney Pixar Dans la partie théorique, nous avons fait un inventaire le plus complet possible de tous les apports intéressants et utiles qu'un animal pouvait amener dans le cadre d'une prise en charge thérapeutique, notamment orthophonique. Mais, nous manquons encore d'études sur le sujet en particulier d'ordre pratique, relativement à la nature et la réalisation d'exercices adaptés aux différents patients reçus en orthophonie. Afin d'apporter notre concours à cette thérapeutique nouvelle dans notre métier, nous sommes allée à la rencontre d'orthophonistes qui travaillent avec leurs animaux. Nous avons effectué un stage de deux jours avec Anne SADIN, orthophoniste, dans un CATTP et un hôpital de jour à La Garde (83), ainsi qu'un stage pratique d'une demi- journée par semaine, tout au long de notre quatrième année d'études, au cabinet de Nathalie DUMAS, orthophoniste en libéral à Nice (06). Nous avons ainsi pu y observer des exemples de prises en charge très différentes entre les deux praticiennes, qui nous permettent de vous présenter des vignettes cliniques. Nous avons également recueilli les témoignages d'autres orthophonistes, ainsi que de patients et de leurs proches. Nous avons enfin réalisé un questionnaire (ANNEXE 2), envoyé à une vingtaine d'orthophonistes travaillant avec leur animal (contacts par les réseaux sociaux, et le bouche-à-oreille). Nous n'en avons reçu que dix, auxquels viennent s'ajouter les entretiens oraux de deux autres orthophonistes. Compte tenu du faible nombre de réponses au questionnaire et du fait que les orthophonistes n'ont pas toutes répondu à toutes nos questions, celui-ci n'a qu'une valeur indicative mais non statistique, et n'a pas la prétention d'une étude scientifique. Ce mémoire est avant tout une enquête qui s'inscrit dans une démarche qualitative ayant une valeur descriptive. Les noms et prénoms des patients cités ont été changés afin de préserver leur vie privée. 132 Chapitre I GENERALITES 133 I. Animaux et types d'exercices Les orthophonistes qui travaillent en libéral privilégient les animaux de compagnie les plus répandus, à savoir d'abord le chien, puis le chat. Le chien est très probablement le plus pratique à emmener, que ce soit au cabinet ou lors des déplacements au domicile des patients. Lorsque le cabinet se situe au domicile de l'orthophoniste, il est fréquent d'y rencontrer plusieurs animaux d'espèces différentes. Trois orthophonistes ayant répondu travaillent en tant que salariées : en CATTP314, hôpital de jour pour TED315, IME316 et SESSAD317. La première travaille avec des chiens, des chevaux et des poneys, la deuxième avec son chien et occasionnellement un chat, et la dernière avec ses deux chiennes (en alternance). En structure, plus d'espèces différentes d'animaux seraient ainsi possibles : le cheval, le poney, l'âne Animal(aux) Mode d'exercice Chien Chat Chevaux Autre Cabinet à domicile Cabinet Salarié Orthophoniste 1 Orthophoniste 2 Orthophoniste 3 Orthophoniste 4 Orthophoniste 5 Orthophoniste 6 Orthophoniste 7 Orthophoniste 8 Orthophoniste 9 Orthophoniste 10 Orthophoniste 11 Orthophoniste 12 1 1 1 2 2 1 1 1 2 2 1 (1) 1 2 2 X 2318 X X X X X X X X X X X X X 314 Centre d'Accueil Thérapeutique à Temps Partiel 315 Trouble Envahissant du Développement 316 Institut Médico-Educatif 317 Service d'Education Spéciale et de Soins A Domicile 318 Madame Dumas travaille en extérieur avec ses chevaux, dans un centre équestre du Lubéron, de manière occasionnelle. 134 ' i x u a m n a d s e p y t e d e r b m o N ' e c i c r e x e d n e y o m r a p 6 5 4 3 2 1 0 Salarié Cabinet Cabinet à domicile Chien(s) Chat(s) Chevaux Autre 3 1 1 0 6 1 0 0 3 3 0 0 II. Mise en place de la zoothérapie Mais d'o leur est venue cette idée ? Pour la très grande majorité des orthophonistes interrogées, elles ne conçoivent pas de vivre sans leur animal, y compris pendant leurs heures de travail. Dans tous les cas, elles ont un très grand amour de leurs animaux et des animaux en général. Mais il ressort aussi du questionnaire que la plupart d'entre elles pressentait que cette présence animale serait bénéfique aux patients. Dans cinq cas sur douze, la présence systématique de l'animal a résulté d'une rencontre fortuite entre un patient et l'animal. Deux orthophonistes ont précisé que l'élément déclencheur , et surtout le plus percutant, fut la rencontre de leur chienne avec un enfant autiste ne s'exprimant pas verbalement, exactement comme Boris Levinson, ce qui a, instantanément, eu pour effet que l'enfant parle. D'autres raisons ont été évoquées en complément, ou non, des précédentes : La passion de l'équitation, l'envie, en tant que propriétaire équin conscient des effets positifs des activités autour et avec les équidés, d'en faire profiter les patients ; la rencontre avec des instructeurs diplômés en handisport ; la diffusion des sports paralympiques qui inscrivent les épreuves hippiques dans leurs programmes ; la rencontre d'autres professionnels de santé qui travaillent avec ces professionnels : une orthophoniste témoigne J'ai entendu parler de La rééducation par le cheval par une amie psychomotricienne, lors de mes études. 135 Passionnée des chevaux, c'est ce que j'ai fait. Puis j'ai étendu ma pratique à la médiation animale avec mon chien. Un reportage télévisé aux informations ou dans un magazine spécialisé J'ai vu un reportage sur la zoothérapie lors de mes études en Belgique. La rencontre avec des formateurs de chiens d'assistance aux personnes porteuses de handicaps (cécité, IMOC, etc) lors d'une manifestation ou d'un salon canin par exemple ont été le facteur décisif qui a permis à l'orthophoniste de franchir le pas comme le livre ce témoignage : J'ai rencontré des professionnels de l'association Handi'Chien qui m'ont ouvert les yeux sur les possibilités qui s'offrent à nous. ou encore Cela s'est fait par une rencontre fortuite entre un patient et son chien, venant de Handi'Chien, et briefé à la LSF, pour calmer les troubles du comportement du patient. J'ai fait le lien lors de la remise du chien, avec la méthode Makaton. ; Une formation spécifique en éthologie et/ou en zoothérapie : J'exerce selon la théorie éthologique. Je suis titulaire d'un diplôme universitaire d'éthologie humaine et animale, qui permet de comprendre les comportements émotionnels primaires, non conscients et préconscients, préverbaux, gestuels, comme des miroirs de ceux des autres animaux. Ce qui permet d'envisager la rééducation orthophonique selon un double aspect : l'animal miroir émotionnel du patient. L'animal thérapeute prend en charge l'affect pendant que l'orthophoniste travaille les instrumentaux. Cela permet aussi de connatre les comportements des animaux selon chaque espèce, mais aussi individuellement. J'ai aussi une formation en asinothérapie, qui permet de soigner les dépressifs et handicapés physiques et mentaux par la médiation de l'âne. Mais je précise que de manière générale, je ne considère pas l'animal comme un moyen ou un outil, mais comme une personne, un interlocuteur à part entière. nous explique Nathalie Dumas. Des recherches personnelles et/ou dans le cadre des études en orthophonie : Mon mémoire d'orthophonie sur la thérapie facilitée par l'animal et Alzheimer ; des lectures ; la visite de l'Institut Français de Zoothérapie. Les raisons peuvent être très variées, mais ont pour dénominateur commun ce même amour de l'animal. 136 III. Formations spécifiques Nous remarquons que peu d'orthophonistes sont formées à une méthode précise de médiation animale. De manière générale, le recours à l'animal de compagnie s'effectue de façon naturelle, spontanée, écologique et intuitive. Le questionnaire révèle que seules quatre orthophonistes sur douze ont fait des formations. Et ces dernières sont toutes différentes : Formation de référent de chien accompagnateur social : Je suis en contact régulier avec l'association Handi'Chiens, je participe à la formation des futurs référents de chiens d'accompagnement social. J'ai également été la référente de deux mémoires d'étudiantes en orthophonie sur ce thème. Je me suis personnellement formée sur le tas . Les lectures m'ont tout de même grandement aidée, de plus que partager avec d'autres professionnels référents d'un chien Handi'Chien . Cette orthophoniste a pu bénéficier d'un chien formé par Handi'Chien, ainsi que d'une formation appropriée qui porte sur l'assistance à la personne dans ses besoins quotidiens mais pas, à proprement parler, de formation à la médiation thérapeutique. Comme précisé dans le sous-chapitre précédent, une orthophoniste est titulaire du diplôme d'éthologie humaine et animale et d'asinothérapie. Elle lit aussi de nombreux livres sur le sujet. Une seconde orthophoniste a été formée à l'Institut Français de Zoothérapie. Une troisième s'est formée à l'obérythmé, et l'Agility319, elle est titulaire d'un D. U. d'éthologie et lit des livres et publications. D'autres sont en attente : Je me suis renseignée via les lectures pour mon mémoire. Je n'ai pas encore eu (ou pris ) le temps de faire des formations ; J'attends d'avoir un patient avec une pathologie lourde , comme l'autisme, le polyhandicap, etc. Je m'adapterai, car je trouve intéressant de faire ce travail thérapeutique avec l'animal. Je crois tout à fait que l'animal peut apporter des choses. Mais pour l'instant je n'ai pas ce 319 Les activités Agility et Obérythmée sont basées sur le dressage du chien. Elles seront expliquées dans le chapitre II. 2. 1. 1. de cette partie pratique. 137 type de pathologie, donc l'animal apporte des éléments positifs pour les patients, sans que j'aie besoin de faire de formation particulière . Quant à l'histoire d'une éventuelle formation, Sylvie McKandie précise : Il me parat tout à fait indispensable de se former à cette médiation particulière ainsi qu'aux comportements de l'animal avec lequel on travaille de façon à pouvoir décrypter ses messages et anticiper tout mal-être de sa part ou comportement indésirable. Sans formation et sans partenariat avec des professionnels (vétérinaires, moniteurs d'équitation, etc. ) la médiation animale pourrait présenter un danger que ce soit pour l'animal ou le bénéficiaire. Pour ma part, mes formations ont été précieuses : Formation d'éducateur canin comportementaliste, DURAMA (Diplôme universitaire de relation d'aide à la médiation animale), Galop 7, Formation Handi-cheval niveau 2. Ces réponses signent, pour la grande majorité des orthophonistes, une non connaissance des possibilités de formation, mais aussi et surtout le fait que ce type de prise en charge n'en est qu'à ses débuts, bien qu'en plein essor. Pour beaucoup d'orthophonistes non formées ces formations paraissent intéressantes (lorsqu'elles en ont connaissance), mais pas indispensables d'autant plus qu'elles ne sont pas prises en charge financièrement par la FIF-PL, organisme de financement des formations professionnelles postérieures à la formation initiale d'orthophoniste. Lors de nos recherches, nous nous sommes renseignée sur les différentes formations possibles. Leur nombre est grand. Nous avons remarqué que toutes ces formations se font sur un assez long terme (elles ne se limitent pas à quelques week-ends), sont donc assez chères, et ne se situent que dans quelques villes. Les orthophonistes, étant des professionnels libéraux ou bien salariés dépendant du bon vouloir de leur employeur pour leurs congés, nous comprenons que ces longues études en aient découragé plus d'un. En comparaison, les apports patents de leur animal leurs semblent des éléments suffisants qui justifient, à tort ou à raison, l'absence de formation de la majorité. 138 IV. Contraintes et difficultés Les orthophonistes interrogées respectent les règles d'hygiène et de sécurité : les animaux sont tous soignés, vermifugés, vaccinés, et ont un vétérinaire référent. Une des orthophonistes interrogées précise que travailler avec son animal est certes, très plaisant, mais cela demande plus d'attention de notre part et les journées avec le chien sont plus fatigantes . Une autre orthophoniste pense le contraire. Ce ressenti doit dépendre des manières de vivre et de ressentir les contraintes dues à la présence animale de chaque orthophoniste, donc de chaque être humain. Figure 2 : Chatons de deux mois, sortant d'un bain 1. Orthophoniste salarié, en institut ou hôpital de jour Les difficultés relèvent surtout de l'acceptation et de la mise en place du projet, par l'administration. Il a fallu beaucoup convaincre, expliquer, rassurer et écrire avant de pouvoir mettre en place des projets : en particulier expliquer en quoi une orthophoniste est légitime d'utiliser ce type de médiation, et les plus que cela peut apporter aux prises en charge orthophoniques. Il a fallu également aborder les aspects légaux par rapport à la présence des chiens dans l'institution (donner les textes de loi) et aussi les peurs de certains professionnels (par exemple par rapport aux possibles morsures ; le fait que les chiens aient été testés par des professionnels a beaucoup rassuré). Le soutien de l'équipe de soin et de certains personnels éducatifs a été précieux. 139 Il en a été de même pour une autre professionnelle : J'ai rencontré des difficultés, principalement pour amener le chien dans un établissement (CAMSP320, puis IME321) ; j'ai du élaborer plusieurs projets écrits, passer par des commissions CHSCT322. Pour certains collègues, malgré des explications et un aperçu pratique de mon intervention avec l'animal, le médiateur animal n'a pas complètement sa place ou de véritables intérêts dans la prise en charge orthophonique. Faire intégrer un animal en institut est donc plutôt difficile à faire accepter par l'administration, mais aussi par les autres professionnels. Mais il y a très souvent des évolutions très positives, comme nous l'explique cette orthophoniste : Il faut souvent beaucoup négocier pour que l'hôpital prenne une assurance, par exemple pour l'agilipsy. Et il n'y a pas de manière prédéfinie de faire pour faire accepter cette pratique. C'est souvent très dur de faire accepter l'animal dans de bonnes conditions. L'administration, lorsqu'elle accepte, met beaucoup de contraintes. Mais l'administration a rapidement vu que cette méthode marche, et est sans danger. Du coup, nous sommes passés d'un thérapeute pour un enfant et un chien, à un thérapeute pour deux enfants et un chien. 2. Orthophoniste exerçant en libéral En exercice libéral, les contraintes sont principalement liées à l'hygiène. En effet, le ménage du cabinet doit être fait tous les jours pour éviter que les poils ne s'accumulent et limiter les risques d'allergie (passer au moins l'aspirateur), les animaux doivent être propres, donc toilettés régulièrement (mais ce peut être aussi un objectif de rééducation), promenés en ce qui concerne les chiens (également thérapeutique). Concernant l'hygiène de l'animal, les chats se lavent tout seul mais, ce faisant, ils imbibent leurs poils de salive qui est le principal allergène du chat juste avant l'ammoniaque contenu dans les urines. La salive stagne dans la sous couche de poils c'est pourquoi on préférera les chats qui n'ont pas de sous couche tels que l'angora turc ou des chats croisés angora. Cependant, donner un bain une fois par semaine au chat permettrait de réduire considérablement les réactions allergiques selon madame Dumas qui a ainsi pu 320 Centre d'Action Médico-Social Précoce 321 Institut Médico Educatif 322 Commission d'Hygiène, de Sécurité, et des Conditions de Travail 140 permettre que des enfants allergiques viennent la consulter et adoptent eux-mêmes des chats qu'ils habituent au bain avant l'âge de trois mois. La plupart des orthophonistes lavent leur chien environ une fois par mois mais la fréquence varie grandement selon la sensibilité de chacun. Une des orthophonistes lave en effet son chien une fois par semaine (ce qui reste assez contraignant) : Je lave mon chien toutes les semaines, pace que les enfants le prennent dans les bras. C'est un chien qui vit en appartement, donc il n'est pas forcément sale, mais quand même. Donc je le lave moi-même, toutes les semaines, attentivement. Les adultes aussi le prennent dans les bras parfois, je le retrouve sur les genoux de certains patients qui aiment bien. Donc je le lave pour la propreté et qu'il n'y ait pas d'odeurs. Je suis très attentive aux odeurs. Avec le chat ça va, mais avec le chien c'est affolant. Niveau hygiène, j'essaie de faire le maximum pour que le fait qu'il y ait des animaux n'impacte pas trop le cabinet. La contrainte peut aussi venir des associés ou collaborateurs. Une orthophoniste témoigne : Ma collègue avait, dans un premier temps, peur que ça dérange des patients, et à cause des allergies. J'ai forcé, je ne prenais ma chienne que dans mon bureau au début. Puis quand c'est devenu la mascotte, elle allait dans la salle d'attente. Ainsi, en remarquant les incroyables effets de l'animal, comparé aux contraintes devenant minimes, l'animal se fait quasiment toujours accepter par tout le monde. Lorsqu'il y a plusieurs animaux, il ressort du questionnaire que le cabinet doit se trouver à domicile, le déplacement de deux chiens et deux chats quotidiennement n'étant pas possible . Il faut enfin interdire aux patients et à leurs accompagnants de venir avec de la nourriture au cabinet, pour éviter de tenter les chiens qui risqueraient d'avoir des comportements mettant les patients en danger et/ou qui pourraient les rendre malades. Une orthophoniste précise que, même si c'est de manière moindre qu'en institution, on passe encore beaucoup de temps à devoir justifier de la présence d'un animal dans un cabinet paramédical . 141 Enfin, une des orthophonistes a fait une remarque très juste : L'animal reste un être dont la santé s'altère avec le temps et qu'il faut savoir ménager (et accepter qu'il puisse un jour ne plus être à nos côtés, car il est un partenaire de travail plus qu'un simple outil). Les contraintes de la présence animale au travail de l'orthophoniste restent quand même minimes, et dépendent beaucoup de la sensibilité personnelle, ainsi que des personnes étant de près ou de loin autour du projet. Nous allons maintenant voir les limites que les orthophonistes se fixent elle-même, pour un fonctionnement le plus optimal et sécuritaire. V. Limites Les limites sont liées aux patients : leur tolérance, leurs peurs, leurs allergies. De ce fait, une orthophoniste a trouvé une alternative : Il n'est pas possible de se faire assister de son animal pour tous les patients. Je prends mon chien avec moi deux jours par semaine. J'ai essayé de mettre les patients pour lesquels je savais que la médiation pouvait être un bon support et apport ces jours-là. Les patients allergiques viennent les autres jours. Mon cabinet est composé de plusieurs pièces, même quand le chien est au cabinet, il n'est pas dans le bureau de consultation en permanence : le chien a besoin de repos, et pour certains patients, mon projet d'inclure la médiation n'a pas été évoqué. La présence d'un animal dans le cabinet est systématiquement précisée lors de la prise de rendez-vous. Malgré cela, des patients allergiques aux chats par exemple, ont quand même très envie d'avoir une présence animale en rééducation orthophonique. En lavant ses chats toutes les semaines, madame Dumas parvient à répondre à leur demande mais la rééducation orthophonique est suspendue lors des pics allergiques des patients qui, la plupart du temps, sont allergiques à plusieurs allergènes. Dans ce cas, madame Dumas conseille de consulter un orthophoniste relais, le temps que la période critique soit achevée. Mais les patients préfèrent souvent se passer de prise en charge plutôt que de 142 consulter ailleurs, d'autant plus que les cabinets sont saturés. Cette composante est expliquée dès la première rencontre afin que les patients choisissent librement quel type de prise en charge orthophonique leur convient le mieux, la fréquence et la régularité des séances étant un élément fondamental de la rééducation. Certains patients ont peur. Mais une orthophoniste précise qu'en dix-neuf ans d'exercice avec des chiens, elle n'a été confrontée qu'à deux patients phobiques. Dans ce cas, la chienne va dans le bureau de son associée. D'autres mettent l'animal dans une autre pièce, ce qui lui permet de se reposer. C'est parfois l'occasion de tenter de travailler à lever cette phobie, avec l'accord du patient. Ainsi, une autre orthophoniste précise : Dans un premier temps, je propose d'attacher mon chien dans le bureau le temps que l'enfant s'habitue. Jusqu'à présent, l'appréhension de l'enfant a vite disparu . Enfin, il ressort du questionnaire qu'il ne faut pas forcer le patient à interagir avec l'animal. Le but n'est pas de le mettre mal à l'aise. Mais pour la plupart des orthophonistes interrogées, cela n'arrive jamais ! La prise en charge de patients en post-opératoire, ou de pathologies avec un risque infectieux est refusée, pour leur sécurité. Ce problème de sécurité se pose aussi lors des visites à domicile. Les poils ont tendance à rester sur les vêtements, dont les poils de chat, qui sont très allergènes. Il faut donc se renseigner sur les éventuels troubles respiratoires, et les allergies. Et au moins porter une blouse, dans certains cas. Une orthophoniste répond à la question des limites, en précisant que les seules qu'elle s'est imposées sont celles imposées par le patient (peur, ou non souhait d'approcher l'animal), ou par l'animal lui-même (fatigue, état de santé ) . Enfin, la plupart des professionnelles interrogées mettent en place des règles très strictes visant au bien-être et à la protection de leur animal, ainsi qu'à la sécurité et au respect de chacun. 143 Chapitre II APPORTS DES ANIMAUX EN PRISE EN CHARGE ORTHOPHONIQUE 144 Nos observations de stages ainsi que certaines réponses à notre questionnaire nous ont permis de présenter ci-après quelques vignettes cliniques et exemples concrets de rééducation orthophonique accompagnée de l'animal. Nous avons décidé de citer les témoignages des orthophonistes questionnées qui permettent d'avoir des idées de prise en charge avec l'animal, ainsi que des précisions, bien que générales, sur tous les apports de ce genre de thérapie orthophonique. La partie théorique de ce mémoire a consisté à mettre en évidence l'existence de plusieurs façons d'obtenir une amélioration de l'état du patient grâce à la médiation animale. D'une part la manière la plus visible , compréhensible et acceptable qui, pour ces motifs, est celle qui a donné lieu au plus grand nombre de publications, réside dans une utilisation instrumentalisée de l'animal : l'orthophoniste et le patient réalisent une activité ou une action de manière volontaire et consciente avec l'animal, et d'autre part, des manières plus écologiques et spontanées de travailler avec les animaux, parfois imprévisibles, c'est-à- dire lorsque l'animal ou le patient choisissent d'établir un contact, voire même un lien, d'eux-mêmes. Enfin, l'animal apporte au patient, comme à tout humain qui partage sa vie avec les animaux, une amélioration de son état général, un apaisement qui a pour effet de diminuer son niveau d'anxiété et permet à l'orthophoniste de travailler dans des dispositions d'esprit différentes. L'analyse des questionnaires montre que toutes les orthophonistes qui y ont répondu mentionnent les bénéfices obtenus de ces trois façons différentes dans le cadre des prises en charge des patients. 145 I. Analyse des questionnaires 1. Apports spontanés, non prévisibles 1. 1. Relations écologiques De manière générale, grâce aux animaux, les patients se sentiraient dans un milieu plus naturel, écologique, et donc se confieraient et se sentiraient plus à l'aise. La présence animale en rééducation orthophonique permettrait aussi de gagner du temps dans la rééducation. Quatre orthophonistes ayant répondu soutiennent ce dernier point, en précisant que cela serait particulièrement le cas pour les enfants présentant un spectre autistiques, des retards de langage ou des dysphasies. L'animal rendrait plus ludique la rééducation. Sa présence encouragerait aussi les efforts, favoriserait l'investissement de la séance, la motivation à s'appliquer par exemple. Sept orthophonistes sur douze vantent les effets écologiques de leur animal sur le langage et la parole de patients. Elles avancent tout d'abord le fait que les animaux auraient la capacité de (r)éveiller un désir de communication et donneraient une motivation plus importante à mieux oraliser. Avec certains enfants autistes, ils permettraient même de déclencher le langage, le premier mot étant destiné au chien, ou étant le nom du chien. Ainsi, une des orthophonistes interrogées témoigne : Je travaille avec une petite trisomique de quatre ans, qui commence à peine à parler. Elle jargonne, avec des gestes et des mimiques complètement adaptés, mais difficiles à comprendre. On travaille sur l'acquisition de la parole et du langage. Comme elle a un peu peur quand le chien s'approche, elle a très vite appris à dire vas là-bas . Et le chien va à sa place. De plus, de manière générale, l'animal permettrait de s'orienter vers une rééducation orthophonique plus classique : Peu à peu, l'enfant se consacre de moins en moins à l'animal pour se donner beaucoup plus et cette fois volontiers dans des activités ludiques : le travail de rééducation à proprement parler, les acquisitions du langage, de la parole, etc. Et l'animal reste présent en cas de régression ou de moment difficile. Il reste un soutien et une affection à la demande . 146 Une des orthophonistes précise que nous pouvons travailler sur les émotions, car avec un animal, nous sommes dans une communication émotionnelle. On peut ainsi travailler sur l'identification et l'expression des émotions de façon plus concrète. . Enfin, la présence des animaux ferait travailler toutes les mémoires. Leur présence remarquable et marquante constituerait un événement à retenir dans la durée, élément utile pour les patients ayant des troubles mnésiques. Ainsi, Monsieur Dupont, souffrant d'une Sclérose en plaques avec de gros troubles de la mémoire, a pu, petit à petit, retenir des éléments ayant un rapport plus ou moins proche avec cette prise en charge, même lorsqu'il n'avait pas de séance d'orthophonie pendant plus d'une semaine ! Alors qu'auparavant il oubliait tout du jour au lendemain. Sa mémoire de manière générale, même celle sans rapport avec les animaux s'est améliorée. Cinq orthophonistes ont remarqué que leur animal stimulait la mémoire des patients atteints de la maladie d'Alzheimer. L'une d'elle avance que son animal stimulerait la mémoire en favorisant les souvenirs émotionnellement chargés. Figure 3 : Mr Dupont dans la salle d'attente à gauche, dans le bureau à droite L'animal permettrait aussi aux patients fatigués de se reposer, sans en avoir conscience : Il permet de décompresser, de souffler en parlant, de faire des pauses sans que le patient ne se rende compte que nous faisons cette pause à cause de sa maladie : on ne met pas le doigt dessus. Trois orthophonistes sur douze pratiquent les promenades des chiens en laisse, avec de jeunes patients. Ils se sentiraient responsables, et aborderaient ensuite les apprentissages avec sérieux. Une des orthophonistes précise : La promenade avec les chiens permet de contrôler l'impulsivité, d'améliorer l'attention et la concentration, de savoir se freiner, d'attendre, d'allonger ou raccourcir la laisse, faire attention au chien et aux autres, etc. 147 Cette activité les responsabilise : ils sont beaucoup plus investis, ça les grandit , ils deviennent sérieux de manière générale, donc aussi pendant les séances de rééducation. Cette dernière devient beaucoup plus efficace. Figure 4 : Une patiente et l'orthophoniste promenant les chiens Enfin, l'animal peut aussi avoir une attitude passive, en étant simplement un objet d'attention et de discussion entre le patient et le thérapeute. Il est un sujet de conversation inépuisable qui permet à l'enfant de se livrer davantage encore au cours des promenades qui sont informelles et ont lieu en dehors de tout cadre (et après la séance chez madame Dumas), lorsque l'enfant peut relâcher toute tension. 1. 2. Hasard Par le comportement spontané des patients, et surtout des animaux, des situations inattendues se créent, qui seraient très positives pour la rééducation des patients. Les douze orthophonistes le précisent, en répondant au questionnaire. Ainsi, les apports du hasard se font tout d'abord au niveau de la communication, du langage. En voici des exemples : Certains font une petite pause pendant la séance et vont s'asseoir près du chien sur le canapé, lui parlent et le caressent. Le chat s'immisce dans la séance. Il chercher à jouer, il demande des caresses. Ou bien il est en train de dormir dans la pièce lorsque l'enfant arrive. On parle de 148 l'animal, ça détend l'atmosphère, et ça les fait rire par exemple quand tout à coup le chat saute sur le bureau et lance le dé à son tour. L'enfant souhaite parfois que le chien joue avec nous. Il a donc lui aussi droit à sa planche de Loto ! Virgule (la chienne) est passive, mais les enfants peuvent aller lui parler, la caresser. Sa présence est apaisante. Comme elle ronfle, elle permet aussi de travailler l'attention. Et comme elle est handicapée, plein de questions arrivent des patients, qui veulent tous en prendre soin. De son côté, ma chienne va vers tout le monde, et ensuite les enfants communiquent. Quand elle n'est pas là, ils la cherchent ! Certains enfants dysphasiques sans aucun langage ont commencé à s'exprimer en disant le nom de ma chienne pour l'appeler, puis en lui disant assise ! . Figure 5 : Petite pause avec le chien, sur le canapé Les comportements inattendus d'un animal peuvent aussi avoir des effets positifs sur l'articulation du patient. Nathalie Dumas en témoigne : Avec un petit garçon de quatre ans et demi, alors que je travaillais l'articulation, ma chatte se trouvait dans mon bureau et était très intéressée par les playmobils avec lesquels cet enfant jouait. J'ai mis de l'eau dans la piscine, pour que l'enfant y fasse voguer des bateaux, avec des personnages qui ne tenaient pas très bien en équilibre dessus. La chatte, attirée par les mouvements des objets et de l'eau, mis la patte dedans et but de l'eau. Cela ne plaisait pas à l'enfant, car elle retirait et faisait tomber son bel ouvrage. Il lui disait de ne pas toucher mais, comme il avait un trouble articulatoire à type de schlintement, le résultat n'était pas convenable. J'ai saisi l'occasion de le faire travailler sur le phonème []en lui disant (pieu mensonge) que la chatte ne pouvait pas obéir car elle ne reconnaissait pas le mot en raison de la 149 déformation. La rééducation avait commencé dès le début de la prise en charge, sans succès. Mais là, après quelques répétitions, il réussit à prononcer touche pas ! . J'ai fait comprendre d'un regard à Rose (la chatte) qu'elle devait aller jouer ailleurs, ce qu'elle fit gentiment. Le [] et le []se mirent en place chez cet enfant depuis lors. Figure 6 : Rose des Sables, attirée par l'eau et les personnages Ces manifestations que l'on attribue au hasard peuvent se produire à n'importe quel moment de la séance et ne peuvent manquer d'avoir des répercussions sur l'organisation et le déroulement de celle-ci. Elles permettent des rebondissements dans des séances dites classiques . Ainsi, avec Lisa, dyscalculique de six ans cinq mois, nous travaillions les équivalences depuis plusieurs séances avec le même support : des dés et des figurines. Elle semblait avoir compris et avait méticuleusement disposé sur le bureau le matériel bien trié et organisé lorsque le chat sauta et s'assit le plus naturellement du monde dessus, semant le chaos. Mais du chaos nat l'ordre et madame Dumas a saisi cette occasion pour dire à Lisa qu'il était temps de changer de jeu afin de vérifier que la notion d'équivalence était acquise. L'animal, par son comportement imprévisible a ainsi modifié la séance de manière aléatoire et permis à l'orthophoniste de vérifier que le travail effectué avait été efficace. La surprise, le rire dû à la situation incongrue provoquée par l'animal permettrait, par l'adjonction des émotions aux acquisitions, que le patient s'en imprègne mieux. Enfin, les comportements inattendus des animaux donneraient une grande motivation : En prise en charge de groupe, ma chienne vient poser sa balle auprès d'un jeune qui n'ose pas se joindre au jeu. 150 Mon chien va solliciter un jeune autiste en tirant délicatement sur le mouchoir qu'il agite devant lui, ce qui provoque des éclats de rire partagés. Les animaux ont aussi été très bénéfiques pour un bébé de dix mois, ayant été victime d'une A. V. C. sylvien ischémique profond, et ayant une hémiplégie droite. Il a voulu pour la première fois se mettre à plat ventre et ramper pour venir vers le chat, qui s'était mis sur moi. Son visage s'illumina alors, et il fit de grands sourires. Une autre fois, la chienne Shi-Tsu l'a aussi motivé pour se redresser, avec son bras paralysé, pour la caresser avec son autre main. L'animal l'a motivé, il n'aurait pas fait tout cela en temps normal. Figure 7 : Le bébé hémiplégique, stimulé par le chat et la chienne L'animal peut aussi intervenir spontanément, pour améliorer le comportement, et donc permettre la prise en charge : Je prends en charge un petit enfant autiste, qui a des relations assez extraordinaires avec le chien. Pour un enfant autiste, il a été en contact avec lui vraiment très vite. Un réel contact, à aller le chercher, sans aucune peur. En ce moment il ne va pas bien du tout, il est en crise permanente. Il ne supporte pas le bruit. Lors de la dernière séance, le bébé des voisins s'est mis à pleurer. Le patient s'est alors mis à hurler, et je n'arrivais pas à le calmer, pour la première fois. Le chien n'a pas supporté que le patient crie. Il est alors venu près de lui, a mis ses pattes sur lui, et a 151 gentiment aboyé. Au début, le petit a été surpris, a eu peur. Je lui ai expliqué pourquoi le chien avait aboyé : Non, tu sais, il ne veut pas te mordre. Il a peur parce que tu cries, et qu'il n'a jamais entendu crier ici. Il ne comprend pas ce qui t'arrive. . Le petit s'est alors arrêté de crier. Donc là, la présence du chien a été radicale. En outre, il est des cas o les animaux sont indispensables, o aucune rééducation ne serait possible sans eux. Nathalie Dumas cite le cas d'Un enfant souffrant de psychose infantile {qui]ne pouvait travailler qu'avec ma chienne Salsa (Golden retriever) dans les bras, ou mon autre chienne Lit-Shi (Shi-Tsu), plus petite, sur le bureau. Il n'a d'ailleurs accepté de venir en rééducation orthophonique que parce qu'il y avait des animaux. Il a commencé à lire avec des encyclopédies sur les chats et les chiens, seuls livres qu'il acceptait. Puis cela s'est étendu aux autres animaux. C'est de cette manière qu'il a appris à lire. Après un an de rééducation, il a pu passer à un logiciel sur l'ordinateur, sans les animaux. Figure 8 : La chienne Lit-Shi, sur le bureau, pour le patient La spontanéité des animaux comme des patients, mais aussi la réactivité et la créativité de l'orthophoniste permettraient donc à la rééducation de se passer dans les meilleures conditions possibles. 2. Gestion des émotions et comportement La présence d'un animal en orthophonie présente d'intérêts, qui ne relèvent pas à proprement parler de l'orthophonie, mais qui permettent que la prise en charge se déroule dans les meilleures conditions possibles. 152 2. 1. Une ambiance positive Neuf orthophonistes sur douze ont précisé dans le questionnaire que l'ambiance au cabinet était meilleure avec l'animal. En effet, l'ambiance serait celle du quotidien, et non celle d'un cabinet médical. Lorsqu'ils arrivent, les patients sentiraient souvent beaucoup de convivialité, et diraient souvent Quel accueil ! . Ils seraient ainsi tout de suite dans un bon état d'esprit, de bonne humeur, d'emblée. Grâce à cette ambiance, les patients se sentiraient à l'aise, n'auraient pas peur, et se sentiraient ainsi apaisés, plus calmes et réceptifs. Une des orthophonistes précise que son animal favoriserait les relations positives. 2. 2. Des émotions négatives diminuées Dix orthophonistes sur douze ont précisé que leur animal aidait les patients tristes, voire dépressifs, à s'apaiser, et même à aller mieux. Et ce, pour les adultes comme les enfants. Voici quelques témoignages, qui parlent d'eux-mêmes : Ma chienne Shi-Tsu monte sur les genoux des personnes dépressives, alors qu'en temps normal elle ne monte jamais sur les gens. En général, le patient se met à parler, à pleurer, et dire ce qui ne va pas. On peut alors orienter la personne vers un spécialiste pour soigner sa dépression. Avec les personnes âgées ou en difficultés, avec une émotion négative ou triste, le chien va très souvent poser sa tête sur leurs genoux, entre leurs jambes. Il reste là, vient se frotter. Il envoie vraiment un message de présence chaleureuse, d'accompagnement. Ce qui fait du bien aux patients. C'est un réconfort pour les patients adultes : aphasiques, sclérose en plaques, Alzheimer, etc. Pour les adultes Parkinsoniens, avec la maladie d'Alzheimer, ou tout simplement les adultes à domicile, les effets de mon chien sont tout simplement incroyables. C'est un animal plein de compassion. Donc à partir du moment o la personne est déprimée, ou se sent mal, mon chien va changer à coup sûr de comportement : il 153 se colle à ses pieds, cherche à établir le contact, pour compatir, rassurer. Pour les enfants qui ont des chagrins ou des problèmes affectifs, mon chien cherche aussi à intervenir. Il fait du bien aux patients. C'est une affection que certains patients ne peuvent pas avoir ailleurs. Je pense que mon animal donne une présence affective (ou au moins physique) supplémentaire très appréciée des patients. Il aide ceux qui ont du chagrin. Il arrive fréquemment à l'IME que des jeunes n'allant pas bien ce jour-là demandent à venir se récupérer auprès de mon chien. R. explique longuement au poney qu'il est triste car son grand-père est mort. Les enfants en situation monoparentale se couchent souvent sur ou à côté de Salsa (Golden Retriever), en la serrant fort dans leurs bras, lorsqu'ils ne vont pas bien. Ils satisfont leur manque d'amour de nature filiale. Ca leur fait du bien, ça les apaise, puis on peut travailler. Ces différents témoignages, empreints d'amour pour les animaux, auxquels il faut excuser Figure 9 : Salsa, avec un patient les qualificatifs parfois trop anthropomorphistes que leur attribuent spontanément les orthophonistes, semblent bien confirmer ce que nous avons vu dans la partie théorique, à savoir que l'animal sentirait les différentes émotions et qu'il ressentirait le besoin de se 154 rapprocher des personnes en souffrance, le résultat étant un apaisement du patient dont personne ne peut dire s'il est ou non souhaité par l'animal, mais c'est, pour notre objet d'étude, le résultat qui nous importe. 2. 3. Une prise en charge mieux acceptée La présence d'un animal en rééducation orthophonique permettrait à certains patients de mieux accepter la prise en charge. Dix orthophonistes sur douze l'ont d'ailleurs précisé. En effet, grâce aux animaux, les patients se sentiraient dans un milieu plus naturel, écologique, et donc se confieraient et se sentiraient à l'aise plus facilement. La présence animale recrée une situation familière ; le patient ne se sent pas à l'hôpital, il n'est pas face à une blouse blanche mais comme dans la vie , ce qui serait précieux dans le cas de certaines pathologies (troubles du comportement ou de la personnalité, qui co-existent avec des troubles du langage, par exemple). Dans ce contexte, le patient ne se sentirait plus ciblé par une recherche de performances de la part de l'orthophoniste, mais dans une vraie communication, autour d'un intérêt commun au patient et au professionnel. La communication avec l'animal, puis l'orthophoniste se ferait donc rapidement et simplement, l'animal étant disponible dans un registre immédiatement accessible, compréhensible et prévisible par l'enfant. Et pour certains, une relation duelle classique serait trop violente . Ainsi, cette orthophoniste témoigne : Le chien aide pour les passages d'un espace à l'autre et d'une personne à l'autre. Ainsi, L. qui ne supportait pas la fin de la séance, refusait de quitter le bureau et faisait généralement une grosse colère, a vu ce comportement disparaitre à l'arrivée du chien. Maintenant, L. repart avec le chien en laisse en fin de séance. Cela lui rend les transitions plus supportables. . Pour des patients plus grands, une des orthophonistes confirme : La prise en charge est intéressante pour nouer des liens, apprivoiser les jeunes, obtenir un déclic, mettre le jeune en mouvement. Ces prises en charge ont pour objectif de déboucher sur un travail classique, lorsque c'est possible. . Une dernière professionnelle conclue par le fait que son animal détend, met les patients à l'aise, ce permet d'aborder les difficultés avec un aspect moins rééducatif, ce que la plupart des patients accepte mieux. 155 De plus, l'animal et le thérapeute seraient liés dans la pensée du patient, qui prendrait alors beaucoup de plaisir à venir, même lorsque l'animal n'est pas là. 2. 4. Une meilleure estime de soi Quatre des orthophonistes interrogées remarquent une meilleure estime de soi des patients. D'après elles, ce serait valorisant de travailler avec un animal. Il apporterait de la sérénité, et la prise de conscience d'un grand nombre de choses, telles que le fait que nous ne sommes pas à l'école, que nous sommes là pour l'aider, que tout le monde a le droit de parler, et que nous pouvons prendre notre temps. Ceci augmenterait la confiance en soi. 2. 5. Un comportement amélioré Certains orthophonistes précisent que, lorsque le comportement d'un patient est inapproprié, les réactions de l'animal lui permettraient d'en prendre conscience. Par exemple, si nous brusquons un chien, il s'en va, alors que si nous l'abordons calmement, il vient au contact. Petit à petit, le patient adopterait un comportement adapté à l'animal qui pourrait servir de modèle et s'étendre aux relations que ce patient a avec les humains. Voici un exemple de comportement amélioré tout à fait significatif : Lors d'une séance de groupe, l'un des jeunes collégiens était extrêmement agité, à la limite de la violence, et menaçant le bon déroulement de la séance. Mon chien qui était alors dans son panier s'est levé à un moment critique, et est allé spontanément se coucher aux pieds de ce jeune, qu'il réussit à calmer. Ce patient dira plus tard dans la semaine qu'Eskimo (le chien) l'avait aidé. . Autre exemple : Un jeune collégien est arrivé au service et était trop opposé à l'idée de passer un bilan orthophonique. La présence du chien dans la pièce a suscité son intérêt, fait tomber son agressivité, et a permis la passation de bilan. Dans tous les cas, l'animal permettrait au patient d'avoir un meilleur comportement le temps de la séance. Une orthophoniste ajoute : Sans les animaux, avec certains patients, on ne pourrait pas travailler. 156 2. 6. Sécurité L'animal, et particulièrement le chien, permettrait aux orthophonistes de se sentir plus en sécurité dans leur cabinet, surtout lorsqu'elles travaillent seules. Mais d'après Nathalie Dumas, le chien permettrait aussi la sécurité des patients, particulièrement des enfants : La prise en charge d'un enfant de quatre ans, qui ne parlait pas, ne progressait que très lentement jusqu'au jour o ma chienne s'est interposée entre l'enfant et le grand-père, en aboyant et grognant en direction du vieil homme, pour protéger le petit. En effet, la séance précédente, le grand-père avait giflé l'enfant dans la salle d'attente parce qu'il était trop agité. Il devenait de plus en plus agressif, et le petit de plus en plus destructeur au cours des séances. Après que ma chienne ait adopté ce comportement, suivie par la deuxième chienne venue aboyer en renfort, j'ai expliqué à l'enfant ce qui s'était passé et que les chiennes voulaient le protéger parce qu'elles avaient compris que le grand-père n'était pas toujours gentil avec lui. Je lui ai lu une histoire de Pomme d'Api qui illustrait la même situation, et l'enfant a commencé à parler pour la première fois. Bien sûr le langage n'était pas correctement articulé mais l'enfant s'est mis à s'exprimer, à faire des phrases, à commenter ses jeux en séance (dnette, garage, playmobil). Le chien procure un sentiment de sécurité, car le golden retriever protège les enfants contre les parents agressifs ou maltraitants. . Ainsi, il permet d'engager le dialogue sur ce sujet, que ce soit avec la personne maltraitante ou l'enfant, et d'intervenir si nécessaire, voire d'effectuer un signalement auprès de la justice si nous ne parvenons pas à résoudre le problème relationnel et à faire cesser la violence. Le fait qu'un animal ressente de l'agressivité permet d'en parler, et souvent de résoudre le problème. En effet, comme nous l'avons vu dans la partie théorique de ce mémoire, les animaux ressentent des choses que, nous humains, ne ressentons pas ou plus. Bien connatre l'animal, et ses comportements permet souvent de déceler des choses profondes, ou qui peuvent être dangereuses pour le patient. Il nous permet d'agir en fonction de l'état du patient. 157 Nathalie Dumas ajoute qu' il est, dans le cas d'un chien qui détecte l'agressivité et s'interpose entre l'adulte et l'enfant, encore plus essentiel d'être bien formé, de connatre parfaitement le comportement de son chien et de savoir anticiper ses réactions. Le chien doit obéir aveuglément et sans restriction aucune à son matre, faute de quoi on risquerait un accident. Cela est vrai de tous mes animaux : les chiens ne mordent pas quel que soit le comportement du patient, mes chats ne sortent pas les griffes et mes chevaux sont éduqués à n'adopter aucun comportement de peur ni de fuite ni de recherche de nourriture en présence de patients lorsqu'ils travaillent et doivent savoir rester parfaitement immobiles lorsque les patients s'affairent autour d'eux, obéir à mes gestes, postures et regards. Lorsque j'ai le moindre doute sur leur capacité à obéir ou sur mes propres capacités attentionnelles et de sérénité, je ne travaille pas avec eux ; c'est une question de prudence élémentaire. 3. Utilisation instrumentalisée de l'animal par l'orthophoniste Que ce soit dans une démarche prévue dans un projet ou une formation, ou bien en réagissant de manière ponctuelle et ciblée sur une difficulté du patient, nous remarquons dans les questionnaires une utilisation instrumentalisée très utile de l'animal. En voici des exemples variés, mettant en exergue la multitude de possibilités. Ainsi, nous allons en étudier plusieurs, classés selon les troubles qu'ils prennent en charge. 3. 1. Travail des relations topologiques Lorsque l'animal est bien éduqué, et très obéissant, un travail sur les relations topologiques serait donc possible. Deux orthophonistes l'ont précisé dans les questionnaires. Ainsi, au lieu de travailler sur la base de cartes et de dessins, nous pouvons travailler l'espace et la notion droite-gauche ( montre sur toi, sur le chien ), directement sur le chien, comme sur les photos ci-dessous. 158 Figure 10 : travail des relations topologique avec le chien Toujours pour ce même travail, le chien pourrait aussi participer de façon active, en répondant aux consignes données par le patient, en se mobilisant sur un petit parcours. Pour cela, il faut que le chien soit entrané, voire conditionné à effectuer certaines tâches ou jeux avec les patients. 3. 2. Travail du langage oral expressif Le travail du langage oral est le plus plébiscité de la part des orthophonistes interrogées. En effet, douze professionnelles sur douze ont développé les différentes possibilités pour mener à bien ce travail, même brièvement. Ainsi, nous pouvons demander au patient de construire des phrases à partir de photos de l'animal placé dans différentes situations, avec ou sans l'enfant. Nous pouvons filmer l'enfant avec l'animal, puis travailler le commentaire oral de la situation (autorisation de filmer obligatoirement signée par les parents) en faisant décrire la situation vécue, mais également en faisant verbaliser le patient sur les émotions qu'il a ressenties. 159 Nous pouvons aussi travailler la temporalité, la séquentialité, en prenant des photos à différents moments de la séance, ou lors de séances différentes pour les classer dans l'ordre chronologique. Exemple : D'abord Rose des Sables regarde, puis/ensuite elle approche, enfin elle joue avec les personnages et l'eau : Figure 11 : Photos pour un travail sur la séquentialité Nous pouvons aussi travailler le vocabulaire, autour de l'animal. Certaines orthophonistes le font à chaque séance, et précisent que cela plat beaucoup aux patients. Ils peuvent en effet toucher l'animal, qui réagit : quand ils prennent la patte du chien, celui-ci la retire, et quand ils la demandent, il la donne. Lorsque l'animal est éduqué à donner la patte, le mot patte est donc acquis à une très grande vitesse. De même que le mot queue . De plus, nous pouvons nous servir des bruits qu'il peut faire, travailler sur les désignations de son corps (pattes, queue, moustache, poils), remarquer les différences avec les autres animaux, mais aussi les comparer avec nous, humains. Un travail du schéma corporel de l'enfant et du chien serait donc aussi possible. Une dimension archaïque de l'animal permettrait de travailler avec les patients les plus en difficultés, autour de la sensorialité (contact, bruits, odeurs) et besoins primaires, tout en proposant une enveloppe langagière. Nous pouvons ainsi facilement travailler le vocabulaire et le langage. Et comme l'animal est un être vivant et très intéressant pour les patients, ces derniers s'imprégneraient beaucoup plus vite de ce langage-là. Une orthophoniste interrogée témoigne : Je me souviens avoir travaillé le langage avec un patient de quatre ans cinq mois, avec un gros retard de langage, qui ne parlait quasiment pas. Le chien m'a aidé à montrer qu'il est possible de parler à quelqu'un qui ne parle pas. Je crois que le chien a été une espèce de tiers : il nous montrait qu'il comprenait ce qu'on lui disait, qu'il avait un langage non verbal. Et comme l'enfant avait l'air d'être sensible à ce qui se passait, je l'ai utilisé, pour passer de cette communication 160 non verbale à une communication verbale. En faisant par exemple de la dénomination des différentes parties du corps : les pattes, le museau, les dents, etc. et des ordres : touche, tire, etc. . L'animal peut aussi servir de moyen d'accès au patient. Ainsi, Nathalie Dumas prenait en charge un enfant sans langage de deux ans et cinq mois, qui ne voulait pas qu'on le touche. L'orthophoniste a donc utilisé la DNP323 sur l'un de ses animaux. L'enfant a ainsi pu bénéficier d'un retour auditif, visuel, mais aussi un retour par les réactions de l'animal, faute de ressentir les contacts tactiles de cette technique rééducative lui-même. Au fur et à mesure des séances, probablement à force de remarquer que ce rapprochement tactile ne posait aucun souci à l'animal, le patient commença à accepter de se laisser toucher. Associé à une guidance parentale, l'enfant commença à dire quelques mots. L'un de ses premiers mots a d'ailleurs été Mini , en référence à un des chats de l'orthophoniste se nommant Gemini Crocket. 3. 3. Travail de la compréhension Des jeux avec le chien (balles, cachettes, demandes ) ou à partir du chien (photos, histoires ) permettraient de travailler différentes choses, selon les pathologies. Comme par exemple : la compréhension, le raisonnement, l'ouverture à la relation Figure 12 : Chien qui lit le journal : exemple de photo permettant de travailler sur la compréhension et les situations absurdes 323 Dynamique Naturelle de la Parole 161 Cependant, rares sont les orthophonistes qui ont précisé cet aspect-là de la prise en charge avec l'animal dans le questionnaire qui ne se prête évidemment pas à un recueil exhaustif de leurs expériences. 3. 4. Travail du langage écrit Il ressort des questionnaires que l'animal peut être un auxiliaire précieux dans la rééducation du langage écrit, que ce soit en expression ou en compréhension. Il est en effet un support pertinent, et surtout très motivant. La rééducation de l'écriture, de la syntaxe, de l'orthographe, de la grammaire, etc. , se trouve favorisée par la présence d'animaux qui font des choses susceptibles d'être racontées, expliquées, transcrites sous forme de phrases ou d'histoires. L'animal de l'orthophoniste est en interaction avec elle, vit au quotidien avec elle, ce qui l'amène à pouvoir rapporter une grande quantité d'anecdotes qui intéressent l'enfant au point qu'il ait envie de les écrire. Prendre des photos des animaux dans des circonstances variées, ou lors de la participation à la séance, ou encore pendant la promenade, ou le week-end, lors de sorties, peut permettre de créer un album photos dans lequel l'enfant écrit les légendes, des commentaires grâce aux moyens fournis par l'informatique. L'orthophoniste peut le partager via internet avec l'enfant et sa famille ce qui constitue des motivations à l'écriture intéressantes. L'enfant et l'orthophoniste peuvent également échanger des photos de leurs animaux respectifs ou d'événements concernant des animaux via les réseaux sociaux, en joignant des commentaires écrits, etc. Mais d'autres solutions encore plus ludiques seraient possibles. Ainsi, Sylvie McKandie témoigne : Le chien participe ponctuellement au travail. Notamment avec le jeu Pouchka & cie , que j'ai créé. C'est un jeu de société sur le thème canin. A partir de ce jeu, on peut organiser le travail orthophonique. Ce qui donne envie aux patients de participer, outre le thème, c'est qu'on fait appel au chien pour certaines épreuves. Ainsi, pour une partie du jeu de Pouchka avec des jeunes présentant des blocages importants pour le passage à l'écrit, j'ai créé une série d'épreuves pour qu'ils écrivent sans même y penser. Tous réalisent leur épreuve en écrivant de façon très fluente (et souvent avec moins d'erreurs qu'habituellement ! ) pris par le plaisir, ou le 162 stress, ou les deux, de la proximité avec le chien (il s'agit par exemple d'écrire un petit texte sur l'ardoise posée sur le dos du chien ! ). Une autre orthophoniste précise que son animal peut être employé comme un support , grâce à un sac ou une cape qu'il porte sur le dos, et o l'on peut scratcher ou glisser dans les poches différentes images ou mots. Figure 13 : Adolescent qui n'écrit que parce que le chat s'intéresse aux mouvements du stylo sur la feuille Ainsi, l'animal serait une source d'inspiration et de créativité qui rendrait le langage écrit plus accessible, et surtout plus plaisant, aux patients présentant des troubles dysgraphiques et/ou dysorthographiques mais aussi de l'évocation écrite. 3. 5. Travail sur les troubles autistiques De nombreux ouvrages et travaux ont montré que la présence animale serait souvent bénéfique pour l'enfant autiste. De ce fait, une des orthophonistes a précisé travailler la compréhension générale grâce à la compréhension de la communication des animaux, avec son jeune patient autiste verbal. Elle ajoute qu'elle peut par exemple préciser un chien et un chat qui remuent la queue, ça ne veut pas dire la même chose. . Il y aurait aussi tout un travail sur le fait que nous communiquons les uns avec les autres. Une autre orthophoniste aurait revisité le programme TEACCH, en y incluant la médiation animale. 163 Enfin, Nathalie Dumas précise : Avec les enfants autistes, l'animal, chien ou chat, a toujours servi d'intermédiaire entre l'enfant et moi, c'est-à-dire que l'enfant s'intéresse à l'animal, le touche avec plus ou moins de brusquerie, lui met les doigts dans tous les orifices (yeux, oreilles, nez, bouche), lui tire la queue, les poils, se couche dessus, marche dessus quelquefois et surtout pose des questions à propos de l'animal ce qui permet d'engager le dialogue. Le fait que l'animal soit au ras du sol, en général plus bas que l'enfant et que je me mette au même niveau que l'animal, que je regarde l'animal et pas l'enfant, permet au jeune autiste de parler sans avoir d'échange de regards car ce sont ceux-ci qui l'angoissent particulièrement. L'animal n'est pas vraiment instrumentalisé mais il faut pouvoir accepter qu'il ne soit pas respecté, de prime abord (une seule fois par acte douloureux pour l'animal au maximum, l'idéal étant de réussir à anticiper et à ralentir le geste de l'enfant avant qu'il ne touche l'animal, ce qui n'est pas toujours possible lorsqu'on découvre l'enfant), et de commencer les échanges verbaux par l'éducation de l'enfant au respect de l'animal donc de l'autre et à la prise de conscience que l'autre existe en dehors de lui, qu'il ressent des douleurs, qu'il éprouve des sentiments que l'enfant doit respecter, etc. Il est évident qu'il faut empêcher que l'enfant refasse une seconde fois un geste brutal, nous devons anticiper et empêcher le geste brusque de l'enfant d'atteindre son objectif. Après cette période, l'animal va devenir le confident et le calmant de l'enfant (il calme ses angoisses). Après seulement on pourra travailler avec une balle, un jouet ou faire une activité par l'intermédiaire du chien ou du chat. Avec ces enfants, les chiens seraient beaucoup utilisés pour les responsabiliser par les promenades, le brossage, l'alimentation (faire attention à quand leur donner à manger, quoi, combien, à boire, etc. ). Les promener en extérieur les rendrait fiers, et leur prouverait qu'ils sont capables de sortir sans être envahis par les bruits, la diversité extérieure, et le non identifiable, grâce à la présence du chien. Ils sauraient qu'ils sont capables d'anticiper la traversée de la route en raccourcissant et bloquant la laisse, etc. 164 II. Cas cliniques Nos stages nous ont permis d'observer différents types de prise en charge facilitée par l'animal. Le premier présente une prise en charge de groupe, en institution, et le deuxième présente une prise en charge systémique, en libéral. 1. 1. Prises en charge de groupe, en institution : groupe Agilipsy Tout d'abord, voici une définition de l'Agility, selon le site Agility. free. fr : L'agility dog est une discipline sportive et éducative destinée aux chiens et à leurs matres. Elle consiste à faire évoluer l'animal sans aucune entrave sur un parcours d'obstacles. Le chien n'a pas de collier et il n'est pas tenu en laisse. Les obstacles sont de différents types. On trouve des haies, des sauts en longueur, le slalom, le saut en hauteur, le pneu, la passerelle, la balançoire, la rivière, le tunnel, la chaussette, la table et le A. [] L'agility est autant un sport canin qu'un exercice de dressage pour son matre. Toutes les races de chiens, même les plus petites, peuvent y accéder. 324 Il est parfaitement possible d'adapter l'Agility lors de prises en charges orthophoniques. Ainsi, dans un CATTP de La Garde (83), l'orthophoniste Anne Sadin et la psychomotricienne Lauriane Dufourt ont créé le groupe Agilipsy . Trois enfants âgés de six à onze ans, Enzo, Mohamed et Thomas, constituent ce groupe qui est réuni une fois par semaine, toute l'année, de 9h30 à 11h30. Les séances commencent par une prise de contact avec les animaux, dans la salle de psychomotricité du centre. C'est à ce moment-là que les chiennes sont réparties entre les enfants qui en deviennent alors responsables pour la matinée. Chaque semaine, les enfants changent d'animal afin qu'ils ne s'occupent pas toujours du même. Puis ils se rendent en minibus jusqu'au club canin qui a signé une convention avec le CATTP. 324 consulté le 28/05/2014 165 A l'arrivée au club canin, le parcours d'Agility est déjà en place. L'orthophoniste explique les règles, et ce qu'il va falloir faire. Les enfants effectuent le parcours un par un, d'abord obstacle par obstacle puis, pour finir, le parcours en entier. Pour que la séance se passe en toute sécurité, les thérapeutes expliquent aux patients que les chiens ne sont pas des jouets, qu'ils ont des peurs, des envies, et qu'ils peuvent avoir mal. Elles sont aussi constamment là pour rappeler les règles, règles qu'ils n'ont pas pour habitude de respecter. L'Agilipsy permettrait de travailler le langage, la psychomotricité, la relation, l'acceptation des limites, l'attention visuelle et la concentration. a. Présentation des animaux Trois chiennes font partie de ce programme. Les deux premières sont les chiennes de l'orthophoniste, et la troisième celle de la psychomotricienne. Il y a d'abord Louve, Spitz italien, âgée de neuf ans. C'est une petite chienne vive qui sollicite et interpelle les enfants. Comme elle est éduquée à l'obérythmée325, ils aiment lui faire exécuter de petits tours. Sunny est une chienne de trois ans de race Shetland. Calme et douce, elle permet aux enfants les plus craintifs une réassurance et une approche plus affective. Ils aiment la caresser et lui parlent beaucoup. Dolly est une chienne Golden retriever de quatre ans. C'est une chienne joyeuse et très affectueuse, qui mobilise les enfants dans le jeu et les ouvre vers l'extérieur. Sa fougue et son dynamisme n'influencent en rien son respect des enfants qu'elle aborde avec retenue et gentillesse. Cette dernière ne fait pas d'Agility en club, ce qui demande aux patients de plus s'affirmer pour qu'elle leur obéisse, qu'elle les écoute. 325 L'obé-rythmée, ou obéissance rythmée, est un sport canin, dans lequel le chien évolue avec son matre avec qui il présente une chorégraphie en musique. Il s'agit d'une discipline dérivée de l'obéissance classique . 166 b. Le travail avec les patients 1. Patient 1 : Enzo Enzo est un garçon de dix ans cinq mois, entré en 2010 au CATTP pour trouble du comportement, intolérance à la frustration, troubles attentionnels et de la concentration et hétéro agressivité. Enzo se présente comme un enfant directif, brusque, qui reprend ses camarades et ne prend pas en considération son environnement. Il peut se mettre à hurler, a du mal à se poser, ne laisse pas sa place à l'autre, est dans la destruction et teste les limites. Il est parfois en représentation, provocateur, répondant à l'adulte, lui tenant tête, le tout avec une agitation psychomotrice importante. Il peut se mettre en danger, avoir des attitudes régressives (lors de la lecture, histoire, relaxation) réclame de l'adulte qu'il s'intéresse exclusivement à lui et recherche son contact. La relation à l'autre semble le faire souffrir, il peut être hermétique au recadrage et a besoin d'être contenu. a. Objectifs poursuivis Les principaux objectifs de ce groupe Agilipsy pour Enzo consistent à améliorer son attention et sa concentration, augmenter sa tolérance à la frustration, lui faire accepter les limites, prendre en compte l'autre, comprendre ses paroles, expressions et sentiments. b. Remarques lors de la première séance Enzo a déjà pu bénéficier du groupe Agilipsy lors de l'année scolaire 2012-2013. Il est très bavard lors de l'atelier. Enzo a un problème dans l'acceptation des limites. Mais grâce à ces séances, et donc à l'animal et les limites imposées pour le bien-être de ce dernier, certaines limites commencent à se poser. Ayant une grande impulsivité, Enzo est obligé de faire de gros efforts pour que le chien obéisse. Cela est accepté par l'enfant, car comme les règles sont données pour le bien du chien, ce n'est pas une intrusion directe lorsqu'on lui interdit quelque chose. 167 Figure 14 : Enzo faisant faire le parcours à Sunny c. Evolution, cinq mois plus tard Enzo est très valorisé par le travail avec les chiens, et les responsabilités qu'on lui donne. Il fait preuve de beaucoup d'empathie envers les autres enfants et les chiens, mais il tend à prendre une place de leader, et cherche à prendre la place de l'adulte, probablement dans l'optique de dénigrer l'autre pour se mettre en valeur. Dans ce groupe, il est très ouvert sur le plan social et relationnel. Mais il ne semble pas connatre les codes sociaux. Il peut s'isoler du groupe lorsqu'on le recadre, mais il revient très vite vers l'adulte pour retrouver et regagner son affection. Enzo a besoin d'être en mouvement, pour décharger une certaine tension. Il prend énormément de plaisir à faire effectuer un parcours au chien. Il semble avoir besoin de dépasser ses limites, et a une grande soif de connaissances. d. Conclusion L'expérience de zoothérapie avec la séance d'Agilipsy est donc positive pour Enzo. Son empathie a beaucoup augmenté, et il s'ouvre plus au niveau social et relationnel, donc sur le plan de la communication et de la prise en compte de l'autre. Les mouvements lors de la séance d'Agilipsy doivent aider à ce comportement, les tensions ayant l'air de se décharger. Enfin, nous remarquons qu'Enzo prend énormément de plaisir dans cette activité. 168 Malgré tout, les séances d'Agilipsy ne sont pas miraculeuses. En effet, il cherche systématiquement à prendre le dessus sur les autres, voire à prendre la place de l'adulte. Et lorsqu'on le reprend, il a encore besoin de s'isoler un petit moment. Ce groupe d'Agilipsy lui semble donc bénéfique, l'aide dans ses troubles de la communication, de sa relation à l'autre. 2. Patient 2 : Mohamed Mohamed a onze ans, et présente un trouble de la relation avec une inhibition psychomotrice, des troubles de la personnalité et un retard de langage. Selon les exercices proposés, ce patient peut refuser de participer, probablement par crainte d'être en difficultés. Il peut se fermer voire se bloquer, s'isoler lorsqu'il se sent observé. Son entrée en relation à l'autre est inadaptée : dévalorisation, brusqueries. Cependant, à l'aide d'un médiateur il semble plus à l'aise. Il peut avoir des moments d'agitation, puis des propos régressifs. Il est considéré par le personnel soignant comme un enfant inhibé, qui a du mal à prendre sa place. Il est souvent en périphérie du groupe. Enfin, il ne verbalise pas ses désirs, et de ce fait ne sollicite pas l'autre lorsqu'il est en difficultés. a. Objectifs poursuivis Les objectifs poursuivis sont son intégration dans un groupe, un travail autour de son inhibition, autour du regard de l'autre, de la valorisation, et un travail sur le repérage temporo-spatial et le langage. b. Remarques lors de la première séance Lors de la prise de contact dans la salle de psychomotricité, Mohamed est le seul qui, bien qu'attiré par les chiennes, ne parle pas beaucoup et attend qu'elles viennent vers lui au lieu d'aller à leur rencontre. Ce jour-là, Mohamed s'occupe de Dolly, la Golden retriever qui ne connat pas le parcours et n'est pas habituée à l'Agility. Il travaille donc la concentration, la frustration, mais surtout l'affirmation de soi : dans la voix, être ferme, donner des ordres, guider . Mohamed commence déjà à se désinhiber, avec la chienne. 169 Lui qui parle très peu en temps normal, commence doucement à dire ce qu'il souhaite. Il reste malgré tout très inhibé lorsqu'une des thérapeutes lui pose une question. Déjà, lors de cette première séance, Mohamed ose un peu plus s'affirmer avec le chien. Il parle plus fort, plus souvent, et est très content de voir les animaux. Mais la bave des chiens le gêne, lorsqu'il leur donne une croquette, pour les féliciter du parcours. De manière générale, les chiens diminuent son inhibition. Figure 15 : Mohamed, avec Dolly c. Evolution, au bout de 2 mois Mohamed ne supporte toujours pas le regard de l'autre. Il a du mal à faire des choix, est fuyant, présente des rires immotivés et à des difficultés pour organiser sa pensée et donc l'exprimer. Il est maladroit et mal à l'aise avec son corps. Cependant, le travail avec les chiens l'oblige à investir son corps et à le mettre en mouvement. Il sort alors de son immobilisme , et est incité à prendre des initiatives motrices. Des difficultés en motricité fine sont constatées : il n'arrive pas à enlever le collier du chien, à coordonner ses mouvements. Il semble ne pas comprendre les consignes multiples. Mais il a commencé à être en lien avec Enzo, ce qui semble lui donner de l'assurance et l'aider à dépasser ses peurs et blocages. Cette relation le met face à un statut de grand , ce qui le rend sujet/acteur. Il parle beaucoup au chien, est en relation avec, et est bienveillant. Le chien joue le rôle de médiateur dans la relation, ce qui permet aux thérapeutes d'accéder à Mohamed. 170 Mohamed commence à pouvoir manifester des émotions, il n'est plus sur un mode linéaire. Il a encore du mal à s'affirmer, mais en présence de l'animal il devient protecteur, affectueux et empathique. Un travail autour du décodage et de la verbalisation des émotions est envisagé. d. Conclusion Les séances d'Agilipsy aident Mohamed dans l'affirmation de soi. Petit à petit, il commence à dire ce qu'il désire. La diminution de son inhibition avec les chiennes semble se transposer avec quelques uns de ses camarades. Il commence en effet à être en lien avec ses pairs, ce qui lui donne de l'assurance et l'aide à dépasser ses peurs et blocages. Mohamed commence aussi à manifester ses émotions. Enfin, cet enfant est dans la relation et affectueux, protecteur et bienveillant avec les chiennes. Elles sont ainsi des médiateurs dans la relation avec ses pairs et les thérapeutes. 3. Patient 3 : Thomas Thomas a six ans et présente des troubles du comportement, avec une intolérance à la frustration, à l'échec. Il est autocentré, a des difficultés dans la prise en compte de l'autre. Il n'entre en contact avec ses camarades que dans un esprit de compétition, pour faire mieux qu'eux. Irritable, il prend le dessus en raison de son agitation, sa voix forte et sa tendance à couper la parole. Il recherche très souvent l'exclusivité. Thomas cherche à détourner l'attention de l'enfant qui aurait le rôle principal . Dans des moments de frustration, il peut se mettre en crise, ce qui paralyse l'ensemble de la séance. Il cherche à attirer l'attention, ce qui entrane des attitudes de toute-puissance, sans laisser de place aux autres enfants. Il est possible de désamorcer une crise en le détournant par le biais d'un autre plaisir. Il est en revanche impossible de le raisonner avec des mots, et cela ne fait qu'amplifier sa colère. Thomas a du mal à différer ses pensées et intérioriser ses ressentis. 171 a. Objectifs poursuivis Pour Thomas, les axes de travail sont en lien avec les relations aux pairs, l'intolérance à la frustration, les troubles de la concentration, l'instabilité psychomotrice et le respect des consignes. b. Déroulement lors de la première séance Lors du premier contact dans la salle de psychomotricité, Thomas est très content, et même très excité. Il parle beaucoup dès son arrivée, soliloque souvent, et a une grande agitation corporelle. Il est très distrait et est principalement attiré par Louve qu'il aime faire aboyer en mettant son visage trop près du sien. On remarque ainsi l'importance des chiens bien élevés, et aptes à recevoir de manière totalement pacifique les comportements souvent surprenants, voire dangereux, des enfants. Les chiennes sont ici douces et habituées au contact des enfants. Figure 3 : Thomas mettant sa tête trop près de Louve Lors du trajet en minibus, l'excitation ne s'amoindrit pas. Thomas soliloque beaucoup, et essaie de prendre la petite chienne Louve sur lui. L'orthophoniste lui explique donc pourquoi il faut laisser les chiens tranquilles lors du trajet. Cette injonction est plutôt bien acceptée : ce n'est pas une interdiction formelle comme il peut en avoir l'habitude, mais une interdiction relative au bien-être de l'animal. Arrivé au centre d'Agility, l'agitation corporelle de Thomas ne s'est pas réduite. Les thérapeutes doivent beaucoup le contenir, pour la sécurité des enfants et des animaux. 172 Lorsque l'orthophoniste explique ce qu'il va falloir faire, il n'est pas très attentif, son attention est fluctuante, attirée par la chienne. Thomas est ensuite le premier à passer. Dans les moments o ce n'est pas son tour, il parle beaucoup et stimule beaucoup la chienne, pas toujours de manière appropriée. Les thérapeutes doivent le reprendre sur sa conduite. Ce qu'il accepte, sans crise. De manière générale, Thomas a un grand retard. Il a une agitation corporelle constante, ainsi qu'une attention visuelle et auditive très faible. Il est immature, et est très distrait et attiré par les chiens. Il n'est que rarement disponible à ce qu'on lui dit, il est dans l'agir. Il n'arrive pas à arrêter son idée, à changer de sujet. Figure 4 : Thomas faisant faire le parcours à Louve c. Evolution, six mois plus tard Il y a tout d'abord, chez Thomas, une évolution dans le nombre de productions depuis le début de l'année. Il s'est posé, et peut rester plus longtemps sur une production. Il reste très centré, dans sa bulle , mais il semblerait que cela le protège de l'agitation du groupe. Contrairement aux autres groupes auxquels Thomas participe, l'intolérance à la frustration est souvent gérable par la parole. Dans l'ensemble, Thomas arrive à se contenir et à exprimer ses ressentis à travers son travail. Les séances à l'extérieur lui demandent moins de concentration et moins de proximité à l'autre. Elles lui permettent de gérer lui-même les distances aux autres. 173 Il suit de plus en plus le modèle des grands (Mohamed et Enzo), qui sont plus agiles. De ce fait, il a été observé de nets progrès au niveau moteur. Néanmoins, il garde peu d'affects envers les chiennes, et fait toujours preuve d'immaturité. Il reste autocentré à ce niveau. Il ne cherche pas la relation avec les autres enfants, et l'autre n'existe qu'en tant que rival, qui d'après lui a toujours davantage que lui. En général, il fuit tout effort, mais encouragé par l'adulte il finit quand même par réaliser ce qu'on lui demande. Il étourdit le groupe avec un discourt perçant, quasi incessant, qui vise plus à monopoliser l'attention qu'à communiquer un message. Son discours spontané est souvent incohérent. d. Conclusion Tout d'abord, ces séances de groupe procurent à Thomas beaucoup de plaisir, il est très motivé. Ses comportements brusques et surprenants sont mis en évidence par les réactions pacifiques des chiennes (aboiements, fuite), soutenues par les explications des thérapeutes. Il a mis du temps à intégrer cela, mais petit à petit il commence à prendre conscience des effets de son comportement sur les autres. Il accepte aussi les interdictions, grâce à la justification du bien-être des chiennes. Thomas s'est posé, et peut rester plus longtemps sur un thème, une production. Et contrairement aux autres activités de groupe auxquelles il peut participer, son intolérance est devenue gérable par la parole d'un thérapeute. Thomas arrive maintenant à se contenir, et à exprimer ses ressentis. Néanmoins, son plaisir d'être avec les animaux a tendance à trop l'exciter. Il a toujours une agitation corporelle et verbale. Il reste aussi très centré sur lui-même. Thomas exprime peu d'affects envers les chiennes, et fait toujours preuve d'immaturité. Il ne cherche pas à être en relation avec les autres enfants, qui sont pour lui des rivaux. Son discours spontané reste encore souvent incohérent. 174 c. Conclusion Les séances de groupe Agilipsy sont donc, de manière générale, profitables aux enfants présentant des troubles du comportement, de la relation à l'autre, et de l'expression des émotions. Tous ont fait des progrès, malgré les limites spécifiques à chaque enfant. L'orthophoniste et la psychomotricienne précisent que ces prises en charge avec l'animal restent dangereuses, car la morsure n'est pas loin. Il faut donc absolument que le matre et le chien soient formés. D'autant plus si la population ciblée comporte des enfants aux réactions telles que des mouvements brusques voire violents, des cris, etc. Enfin, il faut savoir que les séances d'Agilipsy sur le terrain n'ont pas lieu toutes les semaines. Une fois sur deux ou sur trois, il est prévu une promenade, o la parole se délie beaucoup, car les chiens vont à leur guise. Les enfants sont donc plus disponibles pour s'intéresser à autre chose. Il peut aussi y avoir des jeux avec la balle, des petits parcours, une partie de cache-cache (l'enfant se cache avec une croquette, et le chien doit le retrouver), et de l'obérythmée (à laquelle l'orthophoniste et ses chiennes sont formées). 1. 2. Prise en charge systémique, en libéral Voici un exemple de prise en charge sur huit mois d'un enfant âgé de trois ans, réputé sans langage, ayant souffert d'hospitalisme tel que décrit par René Spitz. 1. 2. 1. Présentation du patient Laurent est adressé au cabinet de Nathalie Dumas par un pédiatre le 7 octobre 2013 après que les parents ont consulté plusieurs orthophonistes. Il est également pris en charge au CHU de Nice par différents professionnels de santé : psychiatres, pédiatres, neurologues, généticiens, etc ; et en libéral par des kinésithérapeutes et psychomotriciens. A la maison, la famille bénéficie de l'assistance de deux travailleurs sociaux et d'un éducateur. L'enfant fréquente une crèche le matin, assisté de la maman. Il est alors âgé de deux ans et demi ; il est le quatrième enfant d'une fratrie de cinq. 175 Il est très difficile d'obtenir des renseignements précis de la part des parents, qui s'expriment difficilement. Leur anxiété est manifeste, massive : ils sont totalement désemparés. Le premier travail a donc consisté à calmer leur anxiété et à faire diminuer leur angoisse en les rassurant sur les capacités intellectuelles et les aptitudes à la communication de leur enfant. Il a fallu gagner leur confiance, pour pouvoir mettre en place à la fois une guidance parentale sous la forme d'une thérapie familiale d'inspiration systémique, en recevant tous les intervenants et participants à la vie de l'enfant, afin de modifier l'ensemble des interactions, pour obtenir le contexte le plus favorable au développement du langage, ainsi qu'une rééducation orthophonique à la fois ordinaire, et par la médiation animale sous tous ses aspects : spontanée, canalisant les angoisses, modélisante et instrumentalisée . L'enfant présente des anomalies morphologiques : dysmorphie des membres, cavité buccale ovalaire, implantation dentaire anarchique, pseudo bec-de-lièvre, hypotonie musculaire qui font soupçonner une maladie d'origine génétique, cependant les investigations n'ont rien montré de probant. Le CHU a évoqué un spectre autistique auquel ni le pédiatre, ni Nathalie Dumas ne croient. Tous deux penchent pour les conséquences de carences graves depuis la naissance, les parents n'ayant pas été en capacité de stimuler le nourrisson, l'ayant laissé allongé dans son lit sans lui parler, sans avoir aucune interaction avec lui jusqu'à l'âge de neuf mois. Il présente un retard global de développement sur les plans moteur et langagier. Une IRM effectuée quelques mois après le début de la prise en charge a montré qu'une partie importante du néocortex était lisse et que tous les lobes étaient concernés. La compréhension du langage est bonne ; elle semble correspondre à l'âge du patient. Par contre, l'expression est nulle au moment de la prise en charge. L'enfant ne peut que pleurer et crier. 1. 2. 2. Présentation des animaux Quatre animaux sont présents lors de la prise en charge : deux chats croisés angora et tigré européen, issus de la même portée, nés dans l'écurie des chevaux de Madame Dumas, éduqués dès l'âge de quinze jours à la 176 manipulation intensive par l'humain, dont l'Umwelt a immédiatement été volontairement imprégné des caractéristiques physiologiques de Madame Dumas et de ses chiennes (en plus de celle des chevaux), dont le lieu de vie est devenu le bureau de l'orthophoniste après le sevrage et ce, pendant trois semaines, après quoi ce lieu de vie a progressivement été étendu à tout l'appartement. La femelle a été nommée Rose des Sables et le mâle Gemini Crocket. Tous deux sont du même âge que l'enfant. et deux chiennes : l'anée de tous, Salsa, est un Golden Retriever à poils longs âgée de douze ans et trois mois lors de la rencontre, premier animal médiateur de Nathalie Dumas ; la seconde, Lit-Shi est un Shi-tsu alors âgée de neuf ans et dix mois. Contrairement aux chats, les deux chiennes n'ont pas bénéficié d'une éducation spécifique dès la naissance, ce qui ne les empêche pas d'être naturellement médiatrices, chacune dans son registre. 1. 2. 3. Objectifs poursuivis lors de la prise en charge globale dont orthophonique Les principaux objectifs poursuivis sont multiples lorsque l'on est en présence d'un tableau clinique aussi complexe, mais nous en avons privilégié cinq : En premier lieu, il s'agissait de définir qui serait le meilleur interlocuteur, accompagnateur de l'enfant et tuteur de résilience dans cette prise en charge, car il était absolument indispensable de créer un lien d'attachement privilégié avec l'un des membres de la famille, et que celui-ci devienne un référent sécurisant pour l'enfant, afin de lui permettre de panser les plaies de ses traumatismes et d'aller au devant des apprentissages. Chaque personne a été reçue en séance seule avec l'enfant : la mère, le père, les deux frères anés, la grand-mère paternelle et les deux travailleurs sociaux. La mère s'est révélée avoir une relation pathologique délétère avec son fils. Ils avaient une relation ambivalente de type fusionnelle rejetante. Or, cette maman est gravement phobique des animaux, phobie qu'elle a transmise à tous ses enfants. C'est cette phobie, en particulier des gros chiens et donc de Salsa, qui a permis à Madame Dumas de justifier de la nécessité d'écarter la mère de la prise en charge orthophonique et d'investir le père de cette mission d'éducateur privilégié, de 177 tuteur de résilience seul apte à sécuriser son enfant. De nombreuses séances ont été nécessaires pour créer un lien d'attachement suffisamment positif pour commencer un travail proprement orthophonique mais la nature de la relation n'est pas encore totalement satisfaisante. Permettre le développement du langage oral en expression, parallèlement au développement moteur global et fin. Permettre au langage de continuer à se développer et à se structurer sur le versant réceptif. Permettre à l'enfant de développer ses capacités cognitives nécessaires aux apprentissages. Stimuler l'enfant afin qu'il soit dans l'interaction communicationnelle, dans l'attention conjointe, le contact oculaire. 1. 2. 4. Description de certaines séances a. Autour de la phobie des animaux Les premières séances ont mis en évidence la phobie de la maman, le caractère transmissible de cette phobie, l'incapacité de la mère à contrôler sa panique. Les chiennes venant accueillir les patients à la porte d'entrée, la mère s'agrippait à Laurent qu'elle tenait fort dans ses bras au point de lui faire mal, reculant dans le couloir en poussant de petits cris chaque fois que les chiennes s'approchaient d'elle, en demandant à l'orthophoniste de les faire rentrer dans l'appartement attenant au cabinet. La première fois les chiennes ont été mises à l'écart dans l'appartement, mais Nathalie Dumas a expliqué qu'elle obtenait de meilleurs résultats en travaillant par la médiation animale, et a proposé à la maman de lui apprendre à ne plus avoir peur des animaux. Au cours des quelques premières séances, l'orthophoniste se rendant compte du caractère pathologique de la relation de la mère à son enfant et réciproquement ; l'enfant pleurant, la mère s'agrippant à lui, le prenant puis le rejetant ; elle considéra qu'il était urgent de les séparer sans quoi elle ne parviendrait à rien. Elle choisit donc de réintégrer les chiennes 178 dans le cabinet et d'expliquer aux parents, après s'être assurée que le père serait un meilleur partenaire et qu'il était volontaire pour incarner ce rôle, qu'il était dorénavant impossible de poursuivre la prise en charge avec la maman. C'est donc cette phobie des animaux qui a permis de mettre en place le contexte environnemental et relationnel le plus favorable au développement de l'enfant. En outre, aujourd'hui, la maman a beaucoup moins peur des animaux grâce à la confiance de son fils en eux. Elle envisage même la possibilité d'adopter un chaton parce qu'elle réalise que les animaux ont apporté de la confiance en soi et de la sérénité à son enfant. Figure 16 : La mère peut maintenant rester sans paniquer avec les chiens à proximité b. Le langage en expression : apparition du babillage Dès les premières séances, le chat, Gemini Crocket est entré en scène, de sa propre initiative. Il s'est spontanément introduit entre l'enfant et l'orthophoniste. L'enfant ne 179 parlait pas du tout. Madame Dumas avait mis en place la méthode Baby sign qui consiste à utiliser des gestes simples de la langue des signes française (LSF) associés au mot correspondant utilisé seul, comme par exemple le geste de boire accompagné du verbe boire . C'est ainsi qu'elle s'est rendue compte que l'enfant comprenait le langage et qu'il n'avait nul besoin du recours aux gestes. Gemini Crocket a grandement contribué à cette prise de conscience et à l'apparition du babillage de Laurent, en sautant sur les genoux de l'orthophoniste qui était accroupie à côté de l'enfant qui apprenait à se balancer sur une baleine à bascule (trouver l'équilibre, prendre conscience de son corps dans l'espace, de l'impact de la posture, se muscler, etc. mais aussi apaiser l'enfant par un bercement continu). Le chat, assis sur les genoux de Madame Dumas, s'est mis à ronronner et à se frotter contre sa joue ; l'orthophoniste a répondu au chat en mimant son ronronnement ; Laurent s'est alors fort intéressé à la scène, le regard d'abord étonné, puis a souri et s'est mis à babiller pour la première fois. Toutes les séances suivantes, Gemini Crocket a recommencé le même scénario et l'enfant a réussi à acquérir tous les phonèmes, en imitant le modèle proposé par l'orthophoniste. Laurent ébauche les noms des personnes qu'il rencontre au cabinet et des animaux. Aucun mot n'est, pour l'instant, articulé entièrement. L'enfant prononce soit les voyelles seules pour certains mots avec une prosodie spécifique à chacun, soit uniquement la deuxième syllabe des mots. Il dit une phrase de deux mots : ve a qui signifie je ne veux pas et une de trois mot en a é pour s'en aller mais il n'est pas certain qu'il ait compris que les phrases étaient constituées de plusieurs mots. c. Le développement de capacités cognitives associées au langage Laurent a développé sa motricité grâce au château d'escalade avec toboggan que madame Dumas a installé dans son cabinet. Le toboggan a une face glissante et une autre en escalier, ce qui permet, en travaillant la motricité, de travailler le langage fonctionnel : Laurent doit dire aide ou tourner pour que l'orthophoniste mette en place le bon côté pour monter ou pour glisser. Il réussit à articuler à peu près ces deux mots. Or, c'est aussi la cabane dans laquelle les jumeaux félins aiment à jouer à cache-cache et à s'attraper. Gemini Crocket n'apprécie pas que quiconque y joue sans lui, il s'est donc mis spontanément à jouer à cache-cache au cours des séances, ce qui a permis de travailler le 180 rituel cher à Freud de l'apparition et de la disparition fort-da ou encore jeu du coucou, qui est là et l'enfant a appris à toquer et à répondre [e ] pour c'est Laurent , [e a a li] pour c'est Nathalie ou [e i i] pour c'est Gemini . Il dit aussi quelquefois [m : ] pour le chat. L'enfant dit également [ va] ou [ vwa] pour au revoir et d'autres mots rituels. Figure 17 : Laurent observant Gemini qui veut grimper comme l'orthophoniste qui touche le plafond. Le but est d'amener l'enfant à escalader autrement que par l'escalier. Une modélisation est offerte spontanément par le chat. Figure 18 : Laurent montant sur les escaliers du château d'escalade, et regardant la chienne Lit-Shi, qui l'observe elle aussi Ensuite, Gemini s'est mis à jouer à cache-cache en allant se cacher derrière la porte de séparation du cabinet et de l'appartement et en miaulant pour qu'on vienne le chercher. Ce qui a permis à l'enfant de généraliser ce qu'il avait appris dans la cabane à d'autres lieus du cabinet et en dehors du cabinet. 181 Le chat a également servi de modèle (modélisation) pour les postures : assis, debout sur ses pattes arrières, etc. Les jeux éducatifs utilisés comportent ou représentent préférentiellement des animaux. d. Le contact oculaire, l'attention conjointe Figure 19 : Laurent regardant Salsa, après l'avoir caressée Dans le but de travailler le contact œil à œil, la poursuite oculaire et l'attention conjointe, Madame Dumas nous a demandé de travailler avec Laurent et Salsa en jouant avec une balle de tennis, jeu favori de la chienne, à partir du mois d'avril 2014. Laurent est dans les escaliers, il monte au palier supérieur, doit prendre la balle et la lancer en regardant Salsa, d'abord entre les barreaux puis, après plusieurs séances, par-dessus la rampe. Au début, l'enfant ne regarde pas Salsa. Dans les premiers temps il ne regardait personne. Puis il nous regardait. Il prend la balle et la laisse simplement tomber sans la jeter. Progressivement, bien que de façon non stable, il regarde la chienne en lui jetant la balle, il nous regarde en la prenant. Nous avons également joué, lors de deux ou trois séances, à se lancer la balle l'un à l'autre, à la rattraper, etc. Madame Dumas a développé la séquentialité en organisant une succession d'actions, soit toujours les mêmes, soit incluant des variantes pour prévenir les persévérations et permettre de conserver une dimension volontaire et créative en marge de l'acquisition d'automatismes : prendre la balle ou la ramasser par terre, la lancer à Salsa, puis 182 descendre les marches de l'escalier en les comptant et en disant un pas , deux pas etc. , afin de commencer à familiariser Laurent avec le comptage. Il prononce un pas et certains nombres dont six, huit et dix. On termine parfois en sautant la dernière marche, soit un pied après l'autre, soit les pieds joints, soit en étant tenu par les mains et en effectuant un tourniquet. Pendant que Salsa joue à la balle et va la poser dans la poussette de l'enfant car il y subsiste toujours quelques miettes à voler, Lit-Shi monte et descend les marches avec lui. Pour ce petit garçon, sa poussette est sa base de sécurité. Le fait que Salsa s'y intéresse a créé une sorte de complicité entre eux deux. Lorsqu'il joue à des jeux éducatifs, Salsa est couchée à côté de lui et il la caresse. Cet enfant n'a plus aucune peur des chiens ni des chats, même lorsque sa maman vient au cabinet et manifeste sa phobie qui régresse également. e. Calmer les angoisses, les pleurs Gemini Crocket a joué un rôle de modèle fondamental dans les situations de pleurs o l'enfant se réfugiait dans les bras de son père, situation de recherche de réconfort extrêmement fréquente au début de la prise en charge et qui s'est raréfiée progressivement. Lorsque l'enfant, après avoir acquis un comportement nouveau, un mot ou un concept nouveau, se mettait à pleurer et à supplier le père de le prendre dans les bras, le chat faisait la même chose avec l'orthophoniste. Il sautait sur ses genoux et mettait ses pattes avant autour de son cou en frottant sa tête contre celle de madame Dumas en miaulant, ce qui avait pour effet d'attirer l'attention du nourrisson sur la dyade chat/orthophoniste, et, par un effet de miroir, parce que l'orthophoniste verbalisait ce qui se passait au niveau des émotions de l'enfant en les comparant ou les attribuant au chat, de calmer Laurent. Le fait de caresser Salsa est une manifestation de ses capacités d'affection envers les animaux et correspond peut-être à un effet calmant, apaisant des angoisses que peut éprouver l'enfant en situation d'apprentissage, à moins qu'il prenne simplement plaisir à caresser sa fourrure. Dans la salle d'attente, il s'intéresse depuis peu à un plaid très doux synthétique qui a la texture d'une fourrure bouclée courte. L'enfant semble développer son sens tactile en généralisant ou comparant, ce qui est une acquisition cognitive. 183 Figure 20 : Salsa qui se colle à Laurent, puis Laurent qui la caresse 1. 2. 5. Conclusion Comme nous pouvons le constater avec ce cas clinique, tout est travaillé en même temps, de manière holistique et systémique, sans isoler la médiation animale de la psychothérapie ni de la rééducation orthophonique proprement dite. Les ressources utilisées par Madame Dumas sont nombreuses et variées ; elle n'utilise pas qu'une seule technique et s'adapte en permanence aux situations créées soit par le patient, soit par les animaux, soit par les personnes présentes, nous-même ou l'accompagnant de l'enfant, soit provoquées par elle-même à dessein. Nous n'avons mentionné qu'un nombre limité d'exemples mais il y en a à foison et les possibilités offertes par la présence des animaux, au quotidien, avec leur être d'attachement (ici Nathalie Dumas et Anne Sadin), lors des rééducations orthophoniques sont infinies et applicables à toutes les situations de rééducation et à tous les patients, exception faite des laryngectomisés. 184 Chapitre III TEMOIGNAGES DES PATIENTS 185 Les avis des patients sur le fait qu'un animal soit présent lors de leur rééducation orthophonique ne sont que très rarement négatifs. Et lorsqu'ils le sont, ce n'est jamais pour longtemps. Les rares fois o il y a des retours négatifs sont les fois o il y a des peurs, ce qui arrive peu. Et la peur vient généralement de la mère. Souvent c'est à cause de la taille de l'animal. Mais au bout de deux ou trois séances cette peur s'atténue grandement, les présentations étant faites et les patients étant rassurés, voire même contents. Généralement, ils en arrivent à dire qu'ils adorent les chiens, ils lui disent bonjour, lui demandent comment il va, lui parlent. De manière générale, les commentaires des patients sont très positifs, en effet. Et ce, quels que soient les âges ou les pathologies. Six orthophonistes sur douze ont des patients qui leur ont précisé que leur animal était une grande motivation pour venir. Un jour, une maman aurait précisé à une orthophoniste interrogée que son enfant était venu en courant, car il savait qu'il allait retrouver le chien de l'orthophoniste. Deux orthophonistes précisent par ailleurs que l'animal permettrait très souvent à la fratrie de s'intéresser à la prise en charge. Dans les commentaires des patients, et des parents, le bien-être que l'animal leur apporte est très souvent mis en évidence. Dix orthophonistes sur douze l'ont précisé. I. Témoignages des parents des patients La plupart des parents trouvent que la présence d'un animal en rééducation orthophonique apporte beaucoup de calme et de sérénité à leur enfant. Nathalie Dumas ajoute : Globalement, les parents qui ne veulent pas adopter d'animal pour l'enfant sont contents que l'enfant ait une relation avec un animal, sans en subir les contraintes. La mère d'un enfant pris en charge pour un retard de parole et de langage précise : Votre animal permet à mon enfant le plaisir de venir en séance. Et son vocabulaire s'enrichit ! De plus, il se repère mieux dans le temps, autour de la prise en charge. Et on peut échanger avec l'orthophoniste. 186 Certains parents demandent même à ce que l'animal reste dans la salle d'attente, comme ça je ne m'ennuie pas en attendant . II. Témoignages des patients Il arrive souvent que des patients, principalement des enfants, dont la prise en charge se termine, demandent à être pris en photo avec l'animal de l'orthophoniste. Quelques orthophonistes le proposent même systématiquement, lorsqu'elles voient que le patient est très attaché à l'animal. Il arrive aussi que les patients demandent à revenir voir de temps en temps l'animal, ce que les orthophonistes acceptent volontiers. Figure 21 : Retrouvailles émouvantes avec Salsa, un an après la fin de la rééducation Beaucoup de patients font des commentaires sur l'ambiance générale du cabinet. Ainsi, un patient de huit ans précise Oh bah c'est chouette, on a le comité d'accueil ! Ils sont sympas. . Des patients adultes ajoutent que l'animal apporte de la douceur, un cadre amical proche de la maison. . Ils sont, de manière générale, enthousiastes : Il amène un côté plus cordial à la rééducation. Plus original également. . Une patiente de quatorze ans, dyslexique, dyspraxique, et avec des difficultés mnésiques et attentionnelles répond à notre question par : Je préfère, c'est plus souple, c'est mieux. On est plus à l'aise, on arrive mieux à avoir du contact avec les animaux, c'est plus facile après. Et moi aussi j'ai des animaux, ça me fait un lien avec l'orthophoniste. On en discute pas mal. 187 Beaucoup sont vraiment heureux, car ils aiment véritablement les animaux. Ainsi, lorsque nous leur demandons ce qu'ils pensent de la présence d'un animal au cabinet de l'orthophoniste, une patiente de douze ans, dyslexique dysorthographique, et présentant des troubles de l'attention et de la mémoire, répond C'est bien car j'adore les animaux. Je préfère qu'il y en ait. . Un autre patient, du même âge, tient à peu près le même discours : J'adore les animaux ! Et je suis très content de tous les revoir à chaque fois. Cependant, les enfants ne sont pas les seuls à tenir ce type de discours. Ainsi, un patient de soixante-douze ans, ayant fait un AVC (Accident Vasculaire Cérébral) et un AIT (Accident Ischémique Transitoire) répond à notre question par : J'aime beaucoup qu'il y ait des chats. Comme l'orthophoniste, j'ai un chat. Et elle s'appelle aussi Rose. C'est un gros sujet de conversation. Un patient précise même : Les animaux m'intéressent. Et j'aime son animal. C'est mon ami, il est de mon côté . Il m'apaise. Je me sens plus fort, je peux ainsi mieux affronter le monde. De manière générale, les patients, enfants comme adultes, ont une meilleure image d'une orthophoniste possédant et travaillant avec son compagnon à quatre pattes, qu'une orthophoniste classique . Ainsi, une patiente de cinquante ans précise : J'ai les mêmes à la maison. Je sais donc que je vais avoir affaire à quelqu'un qui me comprend (l'orthophoniste), car elle aime aussi les animaux, elle me comprend mieux que les autres ; ça fait une ambiance décontractée, aussi. Ils viennent dans la salle d'attente, ça fait de la compagnie, c'est mieux que de lire un magazine. Il n'y a pas de barrières. On a plus de rapports avec les gens qui ont des chiens, ça permet de se rapprocher les uns des autres. Une patiente de dix-sept ans, dyslexique-dysorthographique le verbalise vraiment : Je pense que l'orthophoniste est plus aimante, car elle aime les animaux, donc les humains. Je pense aussi qu'elle est douce, qu'elle est gentille. On a plus de plaisir à venir. C'est souvent un sujet de conversation. Et c'est un sujet qui rapproche. La communication est plus facile dans les deux sens. J'aime les animaux aussi. Je les adore ! Leurs interventions permettent de rigoler, de relâcher, dans des situations de stress ou de difficulté. En plus les animaux m'aiment beaucoup (rires). Et le contact physique m'apaise. . Enfin, une orthophoniste ajoute : Quand les patients ont eux-mêmes des 188 animaux (ou aiment les animaux de manière générale), ils se sentent tout de suite en confiance. Ils se disent c'est une personne bien, elle aime les animaux, comme moi . Ils voient que l'orthophoniste est quelqu'un avec des sentiments, qui sait prendre soin d'autrui, que c'est un pilier, quelqu'un de solide sur qui ils peuvent s'appuyer . L'orthophoniste deviendrait donc quelqu'un de confiance et de fiable. La relation thérapeutique s'installerait plus rapidement et facilement. Des patients remarquent même les apports que cette présence animale leur offre. Ainsi, une patiente de quatorze ans répond à notre question en disant : Avec les animaux c'est bien, ils apportent quelque chose. On est plus en confiance, plus à l'aise pour parler. Et l'orthophoniste partage ma passion de l'équitation. On parle beaucoup des animaux. . Un patient de neuf ans, dyslexique dysorthographique précise même : Je préfère avec les animaux. Ça me patiente. . Une patiente de quinze ans, dyslexique, remarque ses apports personnels, mais aussi ceux des autres patients : Les enfants peuvent voir comment ils font, ça a une certaine importance. J'ai commencé à faire du cheval parce que l'orthophoniste en a. Figure 22 : Patiente dyslexique discutant, avec le chat sur la table Enfin, Mr Dupont, ayant une sclérose en plaques répond de manière plutôt pertinente : Je suis content. Ils me calment, apportent un regard sur moi. C'est agréable. Et c'est original aussi. C'est une relation qui se construit. Lorsque je suis arrivé chez cette orthophoniste, je n'ai eu aucun apriori, bien que cette situation soit inattendue. Par rapport à ma maladie, il faut que je me rappelle d'un jour sur l'autre qu'ils sont là, leurs noms. Et je me demande s'ils se rappellent de moi. Et oui c'est le cas, et ça fait du bien. 189 Figure 23 : Mr. Dupont, avec les chats de l'orthophoniste Globalement, les patients et leur entourage ont des retours très positifs de la présence d'un animal chez leur orthophoniste. La plupart, en particulier les enfants, ont du mal à verbaliser les bienfaits de ce genre de prise en charge. Mais il ressort systématiquement de leurs commentaires une impression de bien-être, de plaisir. 190 Chapitre IV CONCLUSION 191 Cette partie pratique a d'abord révélé que les animaux privilégiés pour la médiation animale en orthophonie sont le chien, puis le chat. Ce sont en en effet les animaux de compagnie les plus populaires en France, ils peuvent travailler dans des endroits restreints comme à l'extérieur, et le chien peut être emmené d'un lieu à un autre facilement. Les orthophonistes qui ont répondu au questionnaire comme celles avec lesquelles nous avons effectué nos stages pratiquent la rééducation facilitée par l'animal ou zoothérapie parce qu'elles aiment les animaux avec lesquels elles vivent et qu'elles savent quels bénéfices chacun d'entre nous retire de cette cohabitation, orthophoniste aussi bien que patient. Certaines se sont renseignées sur les différents moyens développés en thérapies par la médiation animale en vue d'aider au mieux leurs patients tout en travaillant avec leur animal. Cependant, peu de professionnelles se sont formées de manière spécifique. L'analyse des questionnaires et nos observations cliniques nous ont permis de constater que l'animal pouvait être utile au patient et assister les rééducations orthophoniques de trois façons différentes, permettant ainsi trois types d'apports différents. Le premier serait l'apport spontané, non prévisible, avec un aspect sur les relations écologiques, et l'autre sur le hasard. Le deuxième serait l'apport sur la gestion des émotions et le comportement, avec la création d'une ambiance particulièrement positive lors de la prise en charge, des émotions négatives diminuées, une prise en charge mieux acceptée, une estime de soi augmentée, un comportement amélioré et une sécurité plus importante. Le dernier apport serait celui relatif à une utilisation instrumentalisée de l'animal par l'orthophoniste, avec des effets sur le langage oral expressif, la compréhension, les relations topologiques, le langage écrit, et les troubles autistiques. De plus, nous avons constaté qu'il peut y avoir autant de manières de prise en charge via la zoothérapie qu'il y a d'orthophonistes, d'animaux et de patients. Et bien que cette partie pratique nous procure de multiples exemples possibles de rééducation facilitée par l'animal en orthophonie, nous pouvons conclure par nos lectures, nos rencontres et l'analyse des questionnaires que chaque orthophoniste devrait avoir sa manière de fonctionner, en composant avec sa sensibilité, ses envies, ses idées, sa créativité, ses convictions, son animal, et surtout ses patients. 192 Les avis et commentaires des patients sont très positifs sur le sujet. Or, un patient satisfait serait un patient motivé, et ainsi la rééducation pourrait être plus efficace. Néanmoins, les patients ayant un avis très négatif sur le sujet sont peut-être allés consulter un autre professionnel, rendant les témoignages négatifs quasi absents. Toutefois, cette enquête étant uniquement qualitative, sur un nombre limité d'individus, et les effets de l'animal étant à la libre interprétation des orthophonistes, nous pouvons supposer que certains commentaires des orthophonistes sur les effets de leur animal pour les patients soient extrapolés, et d'autres oubliés. Nous sommes certainement loin du compte et il existe sans doute des manières de travailler en rééducation orthophonique avec des animaux que nous ne connaissons pas. Cependant, ces résultats constituent une ouverture crédible à la poursuite des recherches, le développement d'études plus spécifiques et normées sur le sujet étant nécessaire. 193 CONCLUSION GENERALE L'analyse des questionnaires ainsi que nos observations cliniques nous ont permis de constater que l'animal pouvait être utile aux patients et assister les rééducations orthophoniques de trois façons différentes qui coexistent le plus souvent et sont complémentaires. Tout d'abord, l'animal vient spontanément à la rencontre des humains, malades ou non. Son comportement naturel l'amène à adapter son attitude et ses réactions en fonction des caractéristiques de la relation engagée, de ses caractéristiques propres et de celles de ses collaborateurs humains. Cette situation est la plus écologique qui soit car l'animal vit avec son matre qui est attentif à lui en permanence et le laisse participer à ses rééducations comme bon lui semble, sans contrainte. La situation de rééducation ressemble davantage à la vie familiale ou amicale plaçant chacun des partenaires dans une relation symétrique de communication. Les interactions donnent lieu à des prises en charge plus vivantes, plus propices aux échanges, à la connivence, à la complicité, que la pratique classique et laisse place au hasard qui, comme nous l'avons vu, constitue l'occasion de remanier une séance comme le patient doit remanier son cerveau en s'adaptant rapidement selon l'orchestration savante de l'orthophoniste ; Ensuite, l'animal apporte un réconfort, apaise les angoisses, protège, sécurise, tutoie les émotions. Il favorise, comme l'on montré des expériences scientifiques, la régulation du rythme cardiaque, la diminution des tensions, une meilleure respiration donc oxygénation du cerveau. Il délie les langues, augmente l'estime de soi par la revalorisation narcissique dans la mesure o il ne manifeste aucun jugement de valeur. Enfin, l'animal se prête volontiers aux jeux, ce qui permet son utilisation instrumentalisée par l'orthophoniste, qui peut développer une quantité infinie de situations afin de travailler les difficultés des patients, qu'ils touchent le langage oral ou écrit, les troubles de la structuration spatio-temporelle, du raisonnement logico- mathématiques, les retards de langage autant que les aphasies, l'autisme ou encore les maladies neurodégénératives. 194 Depuis les vingt dernières années, nous remarquons une prolifération ainsi qu'une richesse des expériences menées. Une quantité grandissante de livres, mémoires et thèses sur le sujet, ainsi que des programmes de formation et d'associations voient le jour. Au vu des diverses expériences et résultats, l'intérêt et les bienfaits de la relation avec l'animal, en thérapie, ont déjà été maintes fois démontrés. Mais si ce type de thérapie est fréquemment utilisé aux Etats-Unis et au Canada ; en France, c'est une discipline nouvelle et peu développée, qui ne retient pas l'attention qu'elle mériterait, et les études qui y sont consacrées sont trop souvent sous-estimées. La zoothérapie demeure donc à ce jour une technique appelée alternative . Il reste alors encore de nombreuses pistes à creuser, que ce soit en orthophonie comme dans les autres métiers du paramédical, du social et du médical, par des études ayant une plus grandes portée scientifique. Nous espérons que ce mémoire aura permis de regrouper les bases de cette pratique, ainsi que quelques idées permettant d'imaginer toutes sortes de prises en charge. Nous avons aussi remarqué que les apports de l'animal sont multiples, variés et probants pour de très nombreuses pathologies que les orthophonistes sont amenés à prendre en charge. Cependant, pour que cette pratique soit reconnue, il faudra que des études continuent de voir le jour, que des articles continuent d'être publiés, et les expériences de zoothérapie multipliées. Mettre en place ce genre de démarche est difficile, tant on se heurte aux normes draconiennes d'hygiène et de sécurité en institution, ainsi qu'à des réticences idéologiques de la part d'un certain nombre de personnes. Nous sommes confrontés à la peur du risque qui pourtant parat minime (hygiène, accident) et le besoin de se protéger de toute adversité, ce qui limite encore très fortement la concrétisation de ce type de projet. En effet, de nombreux projets de médiation animale se voient refusés, alors qu'ils pourraient beaucoup apporter aux patients. Bien que l'animal ne soit pas indispensable, ses bénéfices pour le patient sont réellement observables. Des précisions doivent être apportées aux professionnels souhaitant se lancer dans cette formidable aventure. La zoothérapie ne sert pas à se cacher derrière son animal. C'est au professionnel de tenir les rênes, d'adapter les moyens qu'il met en place. Ses moyens doivent être adaptés, et dérouler d'une réflexion. 195 En effet, jamais un animal ne pourra remplacer un professionnel du paramédical, de la santé ou du social. Mais il peut l'aider. Il convient donc d'analyser attentivement la relation animal/patient/thérapeute, les réactions et comportements de l'animal, ainsi que tout ce que nous pouvons en tirer. Il faut aussi garder en tête que l'animal n'est pas un outil ou un jouet que l'on peut manier à sa guise. Il est bien plus, il est un être vivant doué de sensibilité. C'est d'ailleurs ce qui en fait sa spécificité. Cependant, certaines précautions doivent être prises, afin de garantir la sécurité et le bien-être du patient comme de l'animal. Mener et vivre ce genre de recherche scelle définitivement la foi en ce type de démarche. Cela nous a donné l'envie de continuer à faire découvrir cette pratique, mais surtout de la mettre en œuvre dès que cela nous sera possible. En matière de zoothérapie, il reste tant à faire. Nous espérons donc que ce travail contribuera à l'évolution des mentalités, et qu'il pourra donner lieu à d'autres recherches, plus approfondies, en orthophonie, telle qu'une validation scientifique de l'apport véritable des animaux dans les rééducations orthophoniques. Ou encore des études sur un animal (le cheval, par exemple) et/ou une pathologie en particulier, permettant d'avoir des pistes concrètes de rééducation. Ce sont de telles recherches qui permettront à la zoothérapie de continuer à évoluer. Boris Cyrulnik, Si les lions pouvaient parler , 1998 196 BIBLIOGRAPHIE Livres : ARENSTEIN George-Henri & LESSARD Jean. La Zoothérapie, Nouvelles avancées. 2012. Canada. Edition Option Santé. 263 pages. ISBN 978-2-922598-28-5 BEATA Claude (Sous la dir. ) La Communication. 2005. France Quercy Cahors : Collection Zoopsychiatrie, édition SOLAL, 253 pages, ISBN-10 : 2914513844 BEATA Claude. Au risque d'aimer - Phéromones. 2013. France. Edition Odile Jacob. P. 86-87-88. 336 pages. ISBN : 978-2-7381-2984-0 BEIGER François. L'enfant et la médiation animale. 2008. France, Paris. Edition Dunod. 208 pages. ISBN : 978-2-10-051536-3 BEIGER François, JEAN Aurélie. Autisme et zoothérapie, Communication et apprentissages par la médiation animale. 2011. France, Paris. Edition Dunod. 160 pages. ISBN : 978-2-10-052659-8 BELIN Bernard. Animaux au secours du handicap. 2000. France, Paris Canada, Montréal. Edition L'Harmatan, Collection Technologie de l'action sociale. 244 pages. ISBN : 2-7384-8886-2 BRIN-HENRY, COURRIER, LEDERLE, MASY. Dictionnaire d'Orthophonie. 2004. France Isbergues. Ortho Edition. ISBN : 2-914121-22-9 DE PALMA Maryse. Entre l'humain & l'animal. La zoothérapie. 2013. Suisse, Genève. Edition Ambre. 256 pages. ISBN : 978-2-940500-5-4 MELSON Gail. Les animaux dans la vie des enfants. 2009. France Paris. Edition Petite Bibliothèque Payot. 336 pages. ISBN : 978-2-228-90390-5 PEREIRA Carlos. Parler aux chevaux autrement - Approche sémiotique de l'équitation. 2009. Edition Amphora. Pages 146 à 156. 160 pages. ISBN : 2851807757 ROSSANT Lyonel & VILLEMIN Valérie. L'enfant et les animaux. 1996. France Tours. Collection Vivre et Comprendre, édition ellipses. 127 pages. ISBN 2-7298-9642-2 SAINT-EXUPERY (De) Antoine. Le Petit Prince. Edition Gallimard 1999. pp. 69, 70. ISBN : 2-07-075589-4 Dr VERNAY Didier (sous la direction). Le chien partenaire de vies : Applications et perspectives en santé humain. 2003. France. Edition érès. 160 pages. ISBN : 2-7492- 0175-6 197 Mémoires et Thèses : CHARBONNIER Leslie. 2010. Thérapie facilitée par l'animal et maladie d'Alzheimer : quels bénéfices pour la communication ? . Nice. Mémoire d'Orthophonie. DUVAL-DESNOES Laurence. 2008. L'animal peut-il aider l'individu autiste ? 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Mémoire de fin d'études universitaires de D. U. d'éthologie SALICETI Clémentine. 2011. L'activité assistée par l'animal : une solution pour lutter contre l'apathie dans les D. T. A. ? . Nice. Mémoire d'Orthophonie. SOREAU Anne-Claire. 2010. Atelier orthophonique associant un chien auprès de deux jeunes autistes déficitaires : étude descriptive et apport. Tours. Mémoire d'Orthophonie. TELLO Annick. 1985. A propos de l'animal. Nice. Mémoire d'Orthophonie Articles : ANSORGE Jessie, La médiation équine comme outils thérapeutique . Le Journal des psychologues, 2011/3 n286, p. 52-55 DOI : 10. 3917/jdp. 286. 0052 BIRRAUX Annie, Les animaux dans les phobies de l'enfant . Enfances & Psy, 2007/2 n35, p. 8-14. DOI : 10. 3917/ep. 035. 0008 198 BROSSIER-MEVEL Françoise et MEVEL Docteur Gérard, Sous le regard Une rencontre thérapeutique en présence d'un chien guide d'aveugle. Le Divan familial, 2011/1 n26, p. 55-64. DOI : 10. 3917/difa. 026. 0055 COSSON Franck, L'animal médiateur de l'humain Puissante, mais limitée par l'artificialité, la modernité éprouve le besoin de retrouver une relation à la nature. Revue internationale de psychosociologie et de gestion des comportements organisationnels, 2007/30 Vol. XIII, p. 71-88. DOI : 10. 3917/rips. 030. 0071 DELFOUR Fabienne, Penser le dauphin et son monde Entre croyances anthropocentriques et démarche scientifique. Enfances et Psy, 2007/2 n35, p. 35-45. DOI : 10. 3917/ep. 035. 0035 DOREY Jean-Louis, Des animaux et des hommes . Le Divan familial, 2011/1 n26. DOI : 10. 3917/difa. 026. 0027 ETHOLOGIA, L'enfant et l'animal, une harmonie à construire . Etho News, n109, 2004/08 GEORGES Véronique. 2012. L'animal, bien plus qu'une compagnie pour l'enfant. Nice Matin, 28/10/2012, p. 16. GUEGUEN Nicolas, Animaux : pourquoi ils nous font du bien . Cerveau & Psycho, n25. 2008. 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DOI : 10. 3917/ep. 035. 0046 199 Conférence : Colloque Le modèle animal, Université du Sud Toulon-Var, 2013, avec : Claude BEATA, vétérinaire comportementaliste : Représentation, attachement et pathologie Boris CYRULNIK, psychiatre et psychanalyste : Du cerveau à l'âme Vinciane DESPRES, philosophe, éthologue, fondatrice de la zoopsychiatrie Claude PAOLINO, vétérinaire : Homme Animal Thérapie 1er Congrès Mondial sur la Résilience, De la recherche à la pratique, Paris du 7 au 10 juin 2012 ; Intervention de Pierre Rousseau, Collaborateur scientifique à la faculté de psychologie et des sciences de l'éducation, université de Mons, Belgique, Atelier du 9 juin 2012 à 14h30 Résilience et interactions précoces Collection d'enregistrements de Nathalie DUMAS. Documents électroniques : AGILITY. 2013. . Consulté en avril 2014 ASSEMBLEE NATIONALE. 2014. Consulté en juin 2014. ASSOCIATION 30 MILLIONS D'AMIS. Animaux thérapeutes, Des chiens thérapeutes. Consulté tv/decouverte/animaux-therapeutes. html octobre 2013. en ASSOCIATION 30 MILLIONS D'AMIS. Animaux thérapeutes, Parole de chien. Consulté 2013. tv/decouverte/parole-de-chien. html octobre en ASSOCIATION 30 MILLIONS D'AMIS. Un chien à l'école. Consulté en octobre 2013. ASSOCIATION OPERRHA. . Consulté en mars 2014. BATTAGLIA V. 2005. Domestication de l'animal. Consulté en novembre 2013. domestication animal. htm CENTRE DE ZOOTHERAPIE (Québec). . Consulté en mars 2014. DARDUIN. 2011. entre-dans-le-jeu/ . Consulté en février 2014. INSTITUT AGATEA. . Consulté en mars 2014 FONDATION A&P SOMMER. 2014. Consulté en décembre 2013 et mars 2014 FORMATIONS CEEPHAO. Consulté en mars 2014. 200 HANDI'CHIEN. . Consulté en décembre 2013. INSTITUT FRANÇAIS DE ZOOTHERAPIE. . Consulté en mars 2014. LAROUSSE DICTIONNAIRE. Larousse. fr Consulté en juin 2014 MAUGUIT Quention. 2012. Animaux domestiques : l'étonnante histoire de leurs origines. (Futura-sciences). /magazines/nature/infos/actu/ d/zoologie-animaux-domestiques-etonnante-histoire-leurs-origines-393 . Consulté en novembre 2013. Wikipédia. 2014. . Consulté en février 2014. 201 ANNEXES Annexe I : La méthode PECA : 326 Il existe de nos jours des méthodes de communications alternatives qui permettent déjà à l'adolescent autiste de s'exprimer autrement que verbalement. Notamment la méthode mise au point par le Dr. Andrew Bondy et Lori Frost, sa collaboratrice, qui après de nombreuses années d'expérience après de personnes autistes, ont développé vers la fin des années 80 une méthodes qu'ils ont appelé PECS (Picture Exchange Communication System). Le PECS est un procédé de communication alternative, créé à l'intention des personnes autistiques qui ne s'expriment pas verbalement. Cette approche originale fait l'objet d'une reconnaissance croissante de la part des professionnels et intègre les principes de base de l'analyse comportementale appliquée. En partant de ce système de communication, j'ai donné à l'animal le rôle de communicant principal par sa position de médiateur et les résultats ne se sont pas fait attendre auprès d'enfants autistes. J'ai créé la méthode PECA (Progressive Exchange of Communication by the Animal327). Auprès des enfants autistes, lorsque nous faisons une approche thérapeutique par la médiation animale, nous utilisons l'animal comme un médiateur transitionnel pour inciter l'enfant à faire, à communiquer, à développer une relation à l'autre, une certaine autonomie, un apprentissage du langage, à structurer son environnement. Le système PECA est axé sur la communication par échange avec l'animal ou avec un objet ou un accessoire qui est en relation avec l'animal. Exemple : pour un chien, le collier, la laisse, une brosse, la croquette, une gamelle pour un poney, le licol, la longe, le cure sabot, l'étrille, le foin Cette communication se présente sous la forme de pictogramme. Nous travaillons principalement avec des photos, des montages de cahiers, de programmes qui représentent toujours une action, une activité, un lien et qui donnent un sens à l'atelier pour permettre au patient de communiquer. Il faut multiplier les objets par rapport à l'utilité et à l'action que la personne doit pouvoir développer avec l'animal. 326 BEIGER, JEAN, Autisme et Zoothérapie, 2011. pp. 28, 29 327 PECA échange progressif de la communication par l'animal Ils vont renforcer la motivation de vouloir communiquer pour l'enfant autiste par son désir de vouloir être avec l'animal. L'enfant va apprendre à associer l'image avec la réaction obtenue. La méthode PECA permet au plus jeune âge de l'enfant de lui apprendre à découvrir son environnement, à se situer dans ses propres repères spatio-temporels, à travailler sur le schéma corporel en lui faisant découvrir le corps de l'animal et le renvoyer au sien. Autre règle extrêmement importante lorsque nous travaillons avec des enfants en situation de handicap mental, nous devons toujours commenter verbalement notre action aussi bien auditive que visuelle. C'est ce que j'appelle les locutions descriptives qui désignent ce que je fais dans certaines situations. Pourquoi je les fais et comment je les fais. L'enfant entend mes commentaires et va les enregistrer de différentes manières. L'enfant autiste va également être dans le mimétisme. Il ne faut pas non plus s'attendre à des résultats immédiats. L'enregistrement que l'enfant aura fait ne peut se dégager de lui que des semaines voire des mois après et très souvent grâce à un échange progressif de communication par l'animal. Annexe II : Questionnaire Questionnaire sur ce que l'animal apporte en orthophonie 1. Travaillez-vous : En libéral Dans une structure. Laquelle ? : 2. Avec quel(s) animal(aux) menez-vous vos rééducations ? - Depuis combien de temps ? - 3. Qu'est-ce qui vous a donné l'idée ou l'envie de travailler avec des animaux ? Je ne conçois pas de vivre sans la compagnie de mon animal Une théorie (développez) : éthologique : comportementaliste : philosophique : autre : Une rencontre fortuite, entre un patient et mon animal, qui m'a donné envie de poursuivre : Des discussions fortuites avec des collègues ou sur des forums Une émission, un reportage : Autre : 4. Avez-vous rencontré des difficultés ou contraintes ? Lesquelles ? Qu'avez-vous fait pour y pallier ? - 5. Vous êtes vous imposé des limites ? Lesquelles ? - 6. De quelle manière votre animal vous aide-t-il lors des prises en charge ? : De manière explicite, utilisation plus instrumentalisée de l'animal : vous lui demandez de réaliser des choses, ou au patient de réaliser des choses avec l'animal. Lesquelles ? De quelle manière ? Avez-vous des exemples ou vignettes cliniques à me proposer ? - De manière implicite : c'est le patient ou l'animal qui choisit d'établir le contact, avec un fonctionnement écologique. Avez-vous des exemples ou vignettes cliniques à me proposer ? - Autre. De quelle manière ? Avez-vous des exemples ou vignettes cliniques à me proposer ? - 7. Quels sont les bénéfices qu'apporte l'animal à la prise en charge du patient ? - D'après vous : - D'après vos patients : - D'après leur famille : 8. Trouvez-vous des inconvénients ou effets négatifs à cette pratique ? - 9. Avec quel type de patients utilisez -vous votre animal ? Et avec lesquels est-il particulièrement utile ? Y en a-t-il o votre animal est inutile ? - 10. Avez-vous une ou des vignette(s) clinique(s) à me proposer en plus des précédentes ? (de préférence avec une vidéo ou une série de photos) - 11. Vous êtes-vous renseigné sur la manière de faire avec votre animal médiateur de thérapie ? Comment ? Avez-vous suivi une ou des formations en rapport ? Lesquelles ? Ont-elles été utiles ? - 12. Le contact avec votre animal a-t-il donné envie à certains patients de prendre un animal de compagnie chez eux ? 13. Si oui, quels bénéfices avez-vous constaté sur l'état général du patient et sur les pathologies relevant de l'orthophonie ? - TABLE DES ILLUSTRATIONS Figure 1 : chiens de Sylvie McKandie positionnés comme jouant au jeu Pouchka et cie . . 115 Figure 2 : Chatons de deux mois, sortant d'un bain . 139 Figure 3 : Mr Dupont dans la salle d'attente à gauche, dans le bureau à droite . 147 Figure 4 : Une patiente et l'orthophoniste promenant les chiens . 148 Figure 5 : Petite pause avec le chien, sur le canapé . 149 Figure 6 : Rose des Sables, attirée par l'eau et les personnages . 150 Figure 8 : Le bébé hémiplégique, stimulé par le chat et la chienne . 151 Figure 7 : La chienne Lit-Shi, sur le bureau, pour le patient . 152 Figure 9 : Salsa, avec un patient . 154 Figure 10 : travail des relations topologique avec le chien . 159 Figure 11 : Photos pour un travail sur la séquentialité . 160 Figure 12 : Chien qui lit le journal : exemple de photo permettant de travailler sur la compréhension et les situations absurdes . 161 Figure 13 : Adolescent qui n'écrit que parce que le chat s'intéresse aux mouvements du stylo sur la feuille . 163 Figure 14 : Enzo faisant faire le parcours à Sunny . 168 Figure 15 : Mohamed, avec Dolly . 170 Figure 16 : La mère peut maintenant rester sans paniquer avec les chiens à proximité . 179 Figure 17 : Laurent observant Gemini qui veut grimper comme l'orthophoniste qui touche le plafond. Le but est d'amener l'enfant à escalader autrement que par l'escalier. Une modélisation est offerte spontanément par le chat. . 181 Figure 18 : Laurent montant sur les escaliers du château d'escalade, et regardant la chienne Lit-Shi, qui l'observe elle aussi . 181 Figure 19 : Laurent regardant Salsa, après l'avoir caressée . 182 Figure 20 : Salsa qui se colle à Laurent, puis Laurent qui la caresse . 184 Figure 21 : Retrouvailles émouvantes avec Salsa, un an après la fin de la rééducation . 187 Figure 22 : Patiente dyslexique discutant, avec le chat sur la table . 189 Figure 23 : Mr. Dupont, avec les chats de l'orthophoniste . 190 Latitia Marzo (Auteur) J'AI RENCONTRE UN ANIMAL CHEZ MON ORTHOPHONISTE : Enquête sur les apports de l'animal dans la prise en charge orthophonique 208 pages, 59 références bibliographiques Mémoire d'orthophonie UNS / Faculté de Médecine - Nice 2014 RESUME La zoothérapie (aussi appelée thérapie facilitée ou assistée par l'animal) est une pratique en évolution dans les professions paramédicales, dont l'orthophonie. Des recherches sur le sujet voient de plus en plus le jour. Ce mémoire comporte une synthèse non exhaustive des recherches effectuées dans ce domaine. Il met en évidence les nombreux apports de l'animal dans les métiers du paramédical, du social et du médical, accompagnés d'exemples de possibilités de prise en charge tirés de certains mémoires d'orthophonie sur le sujet. Pour étayer cela, le mémoire comporte, de manière qualitative, des exemples de rééducation, ainsi que des témoignages d'orthophonistes et de patients. Ils ont été obtenus grâce à des questionnaires et des stages, en institut et en libéral. Ces deux parties font ressortir les nombreux apports des différents animaux en prise en charge orthophonique, mais aussi les limites, contre-indications et inconvénients de cette pratique. La zoothérapie est une médiation encore peu connue, mais qui mérite de l'être, et surtout d'être comprise ; ses grands avantages étant transposables en orthophonie. MOTS-CLES Animal Communication non-verbale Comportement Compréhension Interaction Langage Mémoire Motricité Orthophonie Parole - Zoothérapie Rééducation Thérapie Jeune enfant (de 0 à 3 ans) Enfant (de 0 à 12 ans) Adolescent (de 12 à 18 ans) Adulte Personne âgée DIRECTEUR DE MEMOIRE Christian Bellone CO-DIRECTEUR DE MEMOIRE Nathalie Dumas	HAL	Scientific
Docetaxel Winthrop ne doit pas être administré aux patients dont le nombre de neutrophiles est inférieur à 1 500 cellules/ mm3, aux femmes enceintes ou allaitantes, ou aux patients présentant de graves maladies du foie.	EMEA_V3	Medicinal
Vieillesse(s) en exil	WMT16	Scientific
Production de malondialdéhyde et résistance des membranes érythrocytaires aux radicaux libres, en fonction d'un apport alimentaire suffisant ou non en protéines, associé à différentes huiles (tournesol, soja, coprah, Saumon)	WMT16	Scientific
Algies pelviennes psychogènes	WMT16	Scientific
Volvulus du côlon pelvien	WMT16	Scientific
Evaluation des connaissances et comportements relatifs au SIDA de travailleurs saisonniers en Suisse	WMT16	Scientific
Les levures, dans les stations d'épuration des eaux usées	WMT16	Scientific
LE COEUR S'ENILE	WMT16	Scientific
Anatomie chirurgicale des perforantes de la jambe	WMT16	Scientific
Histoplasmose disséminée révélée par une miliaire fébrile chez un patient atteint par le virus de l'immunodéficience humaine	WMT16	Scientific
Évaluation de l'acceptabilité du vaccin contre le papillomavirus auprès de lycéens masculins de Lorraine	WMT16	Scientific
Hyperthyroïdie après traitement par gonadotrophines d'un état d'hypopituitarisme avec hypogonadisme	WMT16	Scientific
Le principe actif d' Hycamtin, le topotécan, est un anticancéreux qui appartient à la classe des inhibiteurs de la topoisomérase .	EMEA_V3	Medicinal
Séquence en acides aminés au voisinage du point d'attache d'un glycopeptide de mucine bronchique humaine	WMT16	Scientific
36 Latvija Novartis Pharma Services Inc.	EMEA_V3	Medicinal
Le rôle du médecin dans l'aide éducative aux parents	WMT16	Scientific
Réflexions sur la consultation d'anesthésie a l'hôpital boucicaut	WMT16	Scientific
Modification de la spirographie des paraplégiques en différentes positions dans l'air et dans l'eau	WMT16	Scientific
Au sujet du traitement des tumeurs noires de la peau	WMT16	Scientific
Lors des études cliniques chez le volontaire sain, la rosiglitazone, administrée en dose unique jusqu' à 20 mg, a été bien tolérée.	EMEA_V3	Medicinal
La transition de l'enfant à l'adulte en neurochirurgie : exposition du problème	WMT16	Scientific
Infarctus cérébral au cours d'un accès migraineux. Etude angiographique et tomodensitométrique	WMT16	Scientific
Dérivation biliaire atypique : l'anastomose hépato-vésiculaire	WMT16	Scientific
Carcinome verruqueux de l'ongle	WMT16	Scientific
Le pterygium colli est une malformation congénitale o le cou du sujet parat court, large et bridé, quasi palmé . Cette anomalie peut participer à des syndromes génétiques distincts : syndrome de Noonan ; syndrome de Turner, ; et le plus rare encore syndrome de Klippel-Feil (SKF). L'étymologie du terme se réfère à Pterygium du grec ancien , pterygion (petite aile) et Colli du Latin Collum (Cou). Notes et références Portail de la médecine	WIKIPEDIA	Wiki
Mesure du contenu plaquettaire en catécholamines pour le diagnostic des phéochromocytomes avec hypertension intermittente	WMT16	Scientific
L'équilibre du diabétique en période opératoire	WMT16	Scientific
Le système des cellules C et les apudomes expérimentaux de la thyroïde chez le Rat : actions combinées du 2-acétylaminofluorène et de la chlorpromazine permettant l'obtention systématique de tumeurs de type médullaire. Etude ultrastructurale	WMT16	Scientific
Une référence commune : la psychanalyse ? Reconnatre que l'autre est son prochain	WMT16	Scientific
Le résultat final primaire dans l' étude GOAL était la proportion de patients dont l' asthme parvenait à être contrôlé.	EMEA_V3	Medicinal
Les arthropathies de l'hypoconvertinémie. A propos d'une observation	WMT16	Scientific
DEUX PETITS CANCERS DE L'OESOPHAGE	WMT16	Scientific
Prise en charge de la vessie neurogène	WMT16	Scientific
Etude de la tcxicité aigu de l' eserine , VX et le paraoxon , pour établir un modèle mathématique de l' extrapolation á l' etre humain .	QUAERO	Scientific
ASPECTS CLINIQUES ET TECHNIQUES DE L'ISCH'EMIE C'ER'EBRALE EN G'ERIATRIE	WMT16	Scientific
Sexualité et infertilité	WMT16	Scientific
Thérapie médicale actuelle des syndromes parkinsoniens	WMT16	Scientific
Quelles études ont été menées avec Sutent ?	EMEA_V3	Medicinal
Action de l'aminophylline sur la force de contraction du diaphragme des malades atteints d'une insuffisance respiratoire obstructive chronique	WMT16	Scientific
Le lien familial et l'obligation alimentaire	WMT16	Scientific
Une surveillance des enzymes hépatiques est aussi recommandée chez les patients traités par d' autres médicaments présentant une toxicité hépatique.	EMEA_V3	Medicinal
RINGER LACTATE FRESENIUS KABI FRANCE, solution pour perfusion - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 26/02/2018 RINGER LACTATE FRESENIUS KABI FRANCE, solution pour perfusion Chlorure de sodium. 0, 600 g Chlorure de potassium . 0, 040 g Chlorure de calcium dihydraté . 0, 027 g Quantité correspondant à chlorure de calcium anhydre . 0, 020 g Solution de lactate de sodium . 0, 634 g Quantité correspondant à lactate de sodium anhydre. 0, 317 g Pour 100 ml. Sodium : 130, 9 mmol/l Calcium : 1, 84 mmol/l Potassium : 5, 4 mmol/l Chlorures : 111, 7 mmol/l Lactate : 28, 3 mmol/l Osmolarité : 279 mosmol/l Osmolalité : 255 mosmol/kg Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Hypovolémie quelle qu'en soit la cause : chocs hémorragiques, brûlures, pertes hydroélectrolytiques périopératoires. Acidose métabolique en dehors de l'acidose lactique. Elle est déterminée par le médecin en fonction de l'état clinique du malade et des examens biologiques. Mode d'administration Cette solution s'utilise en perfusion intra-veineuse lente, dans des conditions d'asepsie rigoureuse. L'équilibre hydrique, les électrolytes sériques et l'équilibre acido-basique pourront faire l'objet d'une surveillance avant ou pendant l'administration, avec une attention particulière portée à la natrémie chez les patients présentant une libération non-osmotique excessive de la vasopressine (syndrome de sécrétion inappropriée de l'hormone antidiurétique, SIADH) et chez les patients traités concomitamment par des médicaments agonistes de la vasopressine, en raison du risque d'hyponatrémie nosocomiale (voir rubriques 4. 4, 4. 5 et 4. 8). La surveillance de la natrémie est particulièrement importante pour les solutés hypotoniques. Le volume et la vitesse de perfusion dépendent de l'âge, du poids, de l'état clinique (ex. brûlures, chirurgie, lésion de la tête, infections) et le traitement concomitant doit être déterminé par le médecin consultant spécialisé dans le domaine des traitements à base de solutés intraveineux en pédiatrie (voir rubriques 4. 4 et 4. 8). Insuffisance cardiaque congestive, Hyperkaliémie, Hypercalcémie, Alcalose, En association avec un digitalique ou avec les diurétiques épargneurs de potassium en dehors d'une hypokaliémie (voir rubrique 4. 5). Cette solution ne doit pas être injectée par voie intramusculaire. Risque de complications liées au volume de solution et à la quantité d'électrolytes que l'on administre. Risque de surcharge du système cardio-vasculaire avec œdème pulmonaire surtout chez les sujets prédisposés. En cas d'administration de perfusions à des volumes élevés, un suivi spécifique des patients atteints d'insuffisance cardiaque ou pulmonaire ainsi que des patients présentant une libération non-osmotique de la vasopressine (incluant le SIADH) doit être assuré, en raison du risque d'hyponatrémie nosocomiale (voir ci-dessous). Hyponatrémie : Les patients présentant une libération non-osmotique de vasopressine (ex. en cas d'affections aigus, de douleur, de stress postopératoire, d'infections, de brûlures, et de pathologies du système nerveux central), les patients atteints de pathologies cardiaques, hépatiques et rénales ainsi que les patients exposés à des agonistes de la vasopressine (voir rubrique 4. 5) encourent un risque particulièrement élevé d'hyponatrémie aigu lié à la perfusion de solutés hypotoniques. L'hyponatrémie aigu peut conduire à une encéphalopathie hyponatrémique aigu (œdème cérébral) caractérisée par des céphalées, des nausées, des convulsions, une léthargie et des vomissements. Les patients présentant un œdème cérébral encourent un risque particulièrement élevé de lésion cérébrale sévère, irréversible et engageant le pronostic vital. Les enfants, les femmes en âge de procréer et les patients présentant une compliance cérébrale réduite (ex. à la suite d'une méningite, de saignements intracrâniens, d'une contusion cérébrale ou d'un œdème cérébral) encourent un risque particulièrement élevé d'œdème cérébral sévère et engageant le pronostic vital, dû à une hyponatrémie aigu. La perfusion de solution RINGER LACTATE FRESENIUS KABI FRANCE peut entraner une alcalose métabolique en raison de la présence d'ions lactates. Chez le sujet insuffisant hépatique, la solution RINGER LACTATE FRESENIUS KABI FRANCE peut ne pas produire son action alcalinisante, le métabolisme du lactate pouvant être altéré. En cas de transfusion sanguine concomitante et en raison de la présence de calcium, la solution RINGER LACTATE FRESENIUS KABI FRANCE ne doit pas être administrée dans le même dispositif de perfusion en raison du risque de coagulation. Précautions d'emploi A utiliser avec précaution en cas de : insuffisance cardiaque congestive, insuffisance rénale sévère, œdèmes avec rétention sodique, traitement par corticostéroïdes et leurs dérivés. Cette solution contenant du potassium devra être employée avec prudence chez les sujets ayant une hyperkaliémie ou une insuffisance rénale sévère. L'utilisation de cette solution nécessite une surveillance de l'état clinique et biologique du patient (ionogrammes sanguin et urinaire). Les médicaments cités ci-dessous augmentent l'effet de la vasopressine, ce qui entrane une diminution de l'excrétion rénale d'eau sans électrolyte et peut causer une augmentation du risque d'hyponatrémie nosocomiale à la suite d'un traitement à base de solutés intraveineux incorrectement équilibré (voir rubriques 4. 2, 4. 4 et 4. 8). chlorpropamide, clofibrate, carbamazépine, vincristine, inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, 3, 4-méthylènedioxy-N-méthamphétamine, ifosfamide, antipsychotiques, narcotiques chlorpropamide, anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), cyclophosphamide desmopressine, ocytocine, terlipressine INTERACTIONS LIEES A LA PRESENCE DE CALCIUM Associations contre-indiquées troubles du rythme cardiaque graves voire mortels. : risque d'hypercalcémie par diminution de l'élimination urinaire du calcium. INTERACTIONS LIEES A LA PRESENCE DE POTASSIUM Associations contre-indiquées, sauf en cas d'hypokaliémie amiloride, canrénoate de potassium, éplérénone, spironolactone, triamtèrène Associations déconseillées : amiloride, canrénoate de potassium, spironolactone, éplérénone, triamtérène Hyperkaliémie potentiellement létale, notamment chez l'insuffisant rénal (addition des effets hyperkaliémiants). Hyperkaliémie potentiellement létale, surtout lors d'une insuffisance rénale (addition des effets hyperkaliémiants). Eviter cette association La survenue d'une hyperkaliémie peut dépendre de l'existence de facteurs de risque associés. Ce risque est majoré en cas d'association des médicaments suscités. En conséquence, leur coprescription est déconseillée ou même contre-indiquée. Associations à prendre en compte Risque de majoration de l'hyperkaliémie, potentiellement létale. Associations déconseillées Les corticostéroïdes sont associés à une rétention hydrosodée (avec œdèmes et hypertension). Associations faisant l'objet de précautions d'emploi Risque de baisse de l'efficacité du lithium par augmentation de son élimination rénale par les sels de sodium. Ce produit peut être utilisé pendant la grossesse ou l'allaitement, si nécessaire. Des précautions particulières s'imposent lors de l'administration de RINGER LACTATE FRESENIUS KABI FRANCE à des femmes enceintes pendant le travail, en particulier en ce qui concerne le sodium sérique s'il est administré en combinaison avec de l'ocytocine (voir rubriques 4. 4, 4. 5 et 4. 8). Les effets indésirables mentionnés ci-dessous, pouvant survenir avec RINGER LACTATE FRESENIUS KABI France, solution pour perfusion sont listés par classe de systèmes d'organes et par fréquence selon la convention suivante : très fréquent ( 1/10) ; fréquent (1/100, ; peu fréquent ( 1/1000, ; rare ( 1/10 000, ; très rare ( 000) ; et fréquence indéterminée (ne peut être estimée sur la base des données disponibles). Ces effets indésirables peuvent aussi apparatre en cas de mauvaises conditions d'utilisation ou de débit d'administration trop rapide. *L'hyponatrémie nosocomiale peut causer des lésions cérébrales irréversibles et entraner le décès en raison du développement d'une encéphalopathie hyponatrémique aigu (voir rubriques 4. 2, 4. 4 et 4. 5). Risque d'alcalose métabolique, en cas d'excès d'apport ou d'altération du métabolisme des lactates. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . De mauvaises conditions d'utilisation, comme un surdosage, peuvent entraner des signes d'hypervolémie qui devra être traitée en milieu spécialisé. Une épuration extra-rénale peut être nécessaire. Solution cristalloïde isotonique destinée au remplissage vasculaire et à la rééquilibration hydroélectrolytique et qui possède une composition ionique très proche du liquide extracellulaire. La correction de la déshydratation extracellulaire et/ou du déficit volémique s'accompagne d'une hémodilution. Les propriétés pharmacologiques sont celles de ses composants (sodium, potassium, calcium et chlorure), la solution de RINGER LACTATE FRESENIUS KABI FRANCE est neutre et possède un excès d'ions chlorures par rapport aux ions sodium en raison de la présence de chlorure de potassium et de chlorure de calcium. L'ion lactate est un anion tampon précurseur de bicarbonate participant ainsi à la régulation de l'équilibre acido-basique. Cette transformation peut être altérée en cas d'insuffisance hépatocellulaire. En cas d'excès d'apport d'ions lactates, une alcalose métabolique peut en résulter. En cas de blocage du métabolisme du lactate (acidose lactique de type B), l'apport de lactate aboutit à une accumulation de cet anion dans le sang. En revanche, lors de la correction d'un état de choc hypovolémique (avec acidose lactique de type A), l'amélioration des conditions circulatoires, et donc de la perfusion hépatique, permet de rétablir un métabolisme normal du lactate ce qui corrige le processus. Il incombe au médecin de juger de l'incompatibilité d'une médication additive vis-à-vis de la solution RINGER LACTATE FRESENIUS KABI FRANCE, en contrôlant un éventuel changement de couleur et/ ou une éventuelle formation de précipité, de complexe insoluble ou de cristaux. Incompatibilité physico-chimique avec certains antibiotiques administrés par voie IV (amphotéricine B, oxytétracycline). Avant adjonction d'un médicament, vérifier si la zone de pH pour laquelle il est efficace correspond à celle de la solution RINGER LACTATE FRESENIUS KABI FRANCE. Se référer également à la notice accompagnant le médicament à ajouter. 3 ans. Flacon (polypropylène) de 250, 500 ou 1000 ml. Bote de 10 ou 12. Flacon (polyéthylène) de 250, 500 ou 1000 ml. Bote de 1, 10, 20 ou 30. Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées. 5 PLACE DU MARIVEL 92316 SEVRES CEDEX FRANCE 34009 558 540 7 4 : 250 ml en flacon (polypropylène). Bote de 12. 34009 571 349 5 2 : 500 ml en flacon (polypropylène). Bote de 12. 34009 571 913 8 2 : 1000 ml en flacon (polypropylène). Bote de 10. 34009 383 178 2 4 : 250 ml en flacon (polyéthylène). Bote de 1. 34009 383 179 9 2 : 250 ml en flacon (polyéthylène). Bote de 10. 34009 383 180 7 4 : 250 ml en flacon (polyéthylène). Bote de 20. 34009 383 181 3 5 : 250 ml en flacon (polyéthylène). Bote de 30. 34009 383 183 6 4 : 500 ml en flacon (polyéthylène). Bote de 1. 34009 383 184 2 5 : 500 ml en flacon (polyéthylène). Bote de 10. 34009 383 185 9 3 : 500 ml en flacon (polyéthylène). Bote de 20. 34009 383 186 5 4 : 1000 ml en flacon (polyéthylène). Bote de 1. 34009 383 187 1 5 : 1000 ml en flacon (polyéthylène). Bote de 10. Sans objet. Liste I.	BDPM	Medicinal
Utilisation de la méthadone dans le traitement des toxicomanies aux opiacés	WMT16	Scientific
- une hémorragie, en particulier une hémorragie intracrânienne ou gastro-intestinale ;	EMEA_V3	Medicinal
patients intolérants à l' itraconazole ;	EMEA_V3	Medicinal
Mécanismes et spécificité du priming immunitaire antiviral chez un Lophotrochozoaire, l'huitre creuse Crassostrea gigas Maxime Lafont To cite this version : Maxime Lafont. Mécanismes et spécificité du priming immunitaire antiviral chez un Lophotro- chozoaire, l'huitre creuse Crassostrea gigas. Immunologie. Université de Perpignan, 2017. Français. NNT : 2017PERP0041. tel-02426215 HAL Id : tel-02426215 Submitted on 2 Jan 2020 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. UNIVERSITE DE PERPIGNAN VIA DOMITIA Délivré par Préparée au sein de l'école doctorale ED 305 Energie et Environnement Et de l'unité de recherche UMR5244 Interactions Hôtes-Pathogènes-Environnements Spécialité : Biologie Présentée par Maxime LAFONT Mécanismes et spécificité du priming immunitaire antiviral chez un Lophotrochozoaire, l'hutre creuse Crassostrea gigas Soutenance prévue le 22/11/2017 devant le jury composé de : Mme Christine BRAQUART-VARNIER, PR, Université de Poitiers Rapporteur Mme Christine COUSTAU, DR, CNRS M. Guillaume MITTA, PR, UPVD M. Yannick LABREUCHE, CR, Ifremer Rapporteur Examinateur Examinateur Mme Caroline MONTAGNANI, CR, Ifremer Directrice de Thèse M. Benjamin GOURBAL, MC, UPVD Co-directeur de Thèse Ce travail est avant tout réalisé en collaboration, avec l'aide, et l'implication de nombreuses personnes qui ont rendu ce travail possible et m'ont permis de réalise cette thèse. Je tiens à remercier Mesdames Christine Braquart-Varnier et Christine Coustau de m'avoir fait l'honneur d'accepter d'être rapporteur de ma thèse et la qualité des échanges scientifiques Je voudrais aussi remercier Monsieur Yannick Labreuche, d'avoir accepté d'être examinateur de cette thèse et de son aide lors de mes différents comités de thèse. Je remercie l'Université de Perpignan Via Domitia ainsi que l'Ifremer de m'avoir accordé un financement pour cette thèse tant en terme de bourse doctorale que pour la bourse de financement internationale qui m'a été allouée. Je souhaite par ailleurs remercier la région Occitanie pour le financement attribué au projet Provigas dans lequel ma thèse s'est largement intégrée. Je tiens à remercier très chaleureusement Monsieur Guillaume Mitta pour m'avoir accueilli au sein du laboratoire IHPE. Je tiens aussi à te remercier d'avoir accepté d'être examinateur de ma thèse et je tiens surtout à te remercier pour ton investissement quotidien et ta présence bienveillante auprès des membres du laboratoire. Je me rappellerai ma première venue au laboratoire, tu as été très présent, encourageant et m'a soutenu dès le début, avant même le concours. Pour tout ça, je souhaite t'exprimer toute ma reconnaissance et un énorme merci ! Je souhaite sincèrement remercier Yannick Gueguen et Delphine Destoumieux- Garzn pour leur accueil au laboratoire IHPE et leur manière de faire vivre cette équipe. Votre investissement et votre présence tant sur le plan personnel que professionnel ont été pour moi des sources de motivations et de joies au cours de ma thèse. Même si les réunions m'ont longtemps rebuté, vous m'avez appris l'importance des échanges et des discussions en Science, la plus grande force de notre métier je pense. C'est avec une certaine émotion que je quitte ce laboratoire, vous avez beaucoup contribué à la réussite de cette thèse, alors sincèrement, merci ! Je souhaite remercier mes directeurs de thèse pour l'ensemble de ma thèse. Caroline, tu as cru en moi dès le début, tu m'as formé sur énormément de techniques et tu m'as transmis une grande partie de ton savoir faire et de ta méthodologie. Merci de m'avoir encouragé et d'avoir eu un investissement aussi énorme au cours de ma thèse. Tu m'as aussi permis de décrocher cette bourse internationale et fais de cette thèse ce résultat, dont je suis fier, alors un énorme et très sincère merci pour ton de ton implication au cours de ma thèse et d'avoir guidé mes travaux. Benjamin, merci pour tes conseils, ta disponibilité et les discussions scientifiques durant ma thèse. Ton expérience sur le priming et ta gentillesse ont été pour moi des moteurs. Vous m'avez tous les deux donné des clés de réussites scientifiques, merci mes chefs ; ) Je souhaite remercier toutes les personnes avec qui j'ai pu collaborer directement durant cette thèse, notamment David Raftos et Tim Green de l'université Macquarie, pour leur accueil et leur bienveillance. Merci pour votre ouverture scientifique qui a été pour moi une source de motivation et d'envie de science incroyable. Je voudrais remercier l'ensemble des partenaires du projet Provigas qui ont participé au bon déroulement de ma thèse, notamment les partenaires du CRCM et du Cepralmar Adeline Perignon, Denis Regler, Anahita Marzin, Erika Gervasoni. Merci aux membres du projet ANR Decipher et particulièrement Bruno Petton, Julien de Lorgeril, Yannick Gueguen et Guillaume Mitta pour la qualité du matériel biologique grâce auquel j'ai pu réaliser de belles expérimentations durant ma thèse. Je voudrais aussi remercier l'ensemble des membres du laboratoire IHPE qui ont accompagnés de près ou de loin ces travaux, particulièrement Agnès Vergnes, Philippe Haffner et Marc Leroy. Ces 3 ans au laboratoire m'ont aussi permis de rencontrer de belles personnes avec qui j'ai beaucoup partagé et j'en suis certain, nous garderons contact pour aller boire des verres de vin blanc, faire des parties de pêches, organiser des apéros ou aller au ranch à côté de Paul Va, alors Delphine, Guillaume, Jérémie, Marco, Yannick, Julien, je vous attends. Comment ne pas aussi remercier les collègues étudiants avec qui j'ai partagé mon bureau et tant de bonne humeur en commençant par Samuel, (je sais tu n'es pas étudiant). Tu as été le grand homme de notre bureau, l'épaule, la force tranquille et même si la pêche n'aura pas ton fort, j'ai trouvé un ami ! Merci aussi à Célina, Aurore, Carmen, Maeva, Louise, Chloé, Léa-Lou, Lenny, Abi, Erwan, Vaihiti, Pierre- Louis avec qui j'ai partagé tant de bons moments donc la place manque ici pour tous vous remercier. Bien sur je n'oublie pas l'équipe thésards, Aude, Tristan, Daniel, et le type du fond, mon amis Etienne. Toi tu auras été ma belle rencontre de cette thèse. Tu es un mec en or un peu fumant mais avec qui je n'ai partagé que du bon, scientifiquement et tellement de bons moments en dehors du labo, alors, BENJAAAAAMMMMMM ? . Tu es un vrai scientifique, tu as compris le concept du nuts et son sens scientifique. Je te garde une belle place ici au chaud dans mon cœur. Je voudrais aussi remercier mes amis qui m'ont supportés et à qui je souhaite vous dédier une partie de cette thèse, Julie Matthieu, Alexis, Marion, Titi, Lucie, Toinou, Vik, Thibault, Antoine, Pierre, Marina, Manue, Aude, Lauris et bien sur Célia vous m'avez tous apporté beaucoup, fais découvrir le Nord, le Sud, Le centre, L'est et l'Ouest, le tout condensé dans une potion magique à partager, vous êtes les ingrédients de ma chartreuse. Enfin, je vous remercier et dédier cette thèse à ma famille, mon frère Julien, ma belle sœur Fanny et mes adorables bouts de choux, Lucas et Sofia ainsi qu'à mes parents Thierry et Muriel. Vous m'avez permis d'aller au bout d'un rêve, vous avez toujours tout fait pour me propulser vers l'avenir et ce depuis mon premier jour. Alors je vous dédie chaque mot et chaque ligne de ces travaux que je suis fier d'avoir réalisés et qui n'auraient jamais existé si vous n'étiez pas aussi merveilleux. Alors merci du fond du cœur. La perle précieuse provient d'une vulgaire hutre Proverbe Chinois Table des matières Liste des figures et tableaux Liste des sigles et abréviations Introduction générale Contexte scientifique Rappels bibliographiques I. Modèle biologique : l'hutre creuse Crassostrea gigas ou Magallana gigas A. Classification B. Anatomie et physiologie de l'hutre C. Cycle de vie et écologie D. Caractéristiques génomiques de l'hutre C. gigas E. L'hutre en aquaculture II. Mortalités massives chez l'hutre creuse Crassostrea gigas A. Mortalités des adultes B. Mortalités des larves et des juvéniles 1. Historique 2. Etiologie du syndrome de surmortalité massive des juvéniles a) Facteurs génétiques b) Facteurs abiotiques (1) La température (2) La salinité c) Facteurs biotiques (1) Les micro-algues (2) Les bactéries (3) L'OsHV-1 (a) Morphologie, structure et classification (b) Génome de l'OsHV-1 et de ses variants (c) Diagnostic d'une infection à l'OsHV-1 III. L'immunité de l'hutre creuse Crassostrea gigas A. Les tissus immunitaires B. Reconnaissance par le système immunitaire C. Signalisations et mécanismes de l'immunité antivirale 1. Un système de type interféron 2. L'ARN interférence 3. Voies de mort cellulaire programmée a) L'apoptose b) L'autophagie 4. Les effecteurs immunitaires a) Les protéines plasmatiques b) Les protéines et peptides antimicrobiens 1 2 3 5 7 7 7 8 9 10 11 13 13 13 13 15 15 16 16 16 17 17 17 18 19 21 22 24 24 27 31 31 34 35 35 36 37 37 37 39 39 41 41 42 43 51 51 52 75 77 77 80 86 86 87 109 113 117 130 132 155 IV. Une nouvelle vision de l'immunité innée A. Le priming immunitaire B. Le priming immunitaire chez les invertébrés 1. Le priming à l'échelle intra-individuelle 2. Le priming à l'échelle inter-individuelle 3. Mécanismes du priming immunitaire Chapitre 1 : Caractérisation du priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas I. Introduction II. Article 1 : Long-lasting antiviral innate immune priming in the Lophotrochozoan Pacific oyster, Crassostrea gigas III. Synthèse des résultats et conclusions IV. Données complémentaires A. Le priming immunitaire antibactérien B. Le priming immunitaire trans-générationnel Chapitre 2 : Mécanismes du priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas I. Introduction II. Article 2 : Molecular mechanisms underlying antiviral innate immune priming in the Lophotrochozoan Pacific oyster, Crassostrea gigas III. Synthèse des résultats, conclusions et perspectives à court terme IV. Données complémentaires Discussion générale et perspectives Conclusion générale Références bibliographiques Annexe : Bilan des valorisations, activités de recherche et d'enseignement Liste de Figures et tableaux Figures Fig. 1 : Anatomie de l'hutre creuse Crassostrea gigas adulte Fig. 2 : Cycle de reproduction de l'hutre creuse, Crassostrea gigas Fig. 3 : Historique de la production d'hutre Ostrea edulis (vert), Crassostrea angulata (bleu) et Crassostrea gigas (rouge) en France Fig. 4 : Triade épidémiologique Fig. 5 : Structure des virus de l'ordre des Herpesvirales Fig. 6 : Classification des virus de l'ordre des Herpesvirales Fig. 7 : Représentation schématique des fonctions immunitaires des hémocytes d'hutre creuse Crassostrea gigas Fig. 8 : Les hémocytes de l'hutre creuse Crassostrea gigas Fig. 9 : Principales voies de signalisations régulant le système Interféron chez les vertébrés Fig. 10 : Représentation de voies de signalisations antivirales conservées chez l'hutre Fig. 11 : Mécanismes de l'ARN interférence chez l'homme et la drosophile Fig. 12 : Schéma résumé des mécanismes moléculaires immunitaires de défense lors de priming immunitaire chez les plantes et chez un monocyte de mammifère Fig. 13 : Modèle de réponse immunitaire innée chez les invertébrés Fig. 14 : Mécanismes potentiellement impliqués dans le phénomène de priming immunitaire chez les arthropodes Fig. 15 : Effet du priming bactérien sur la survie des hutres lors d'infections bactériennes Fig. 16 : Etude de la durée de la stimulation de géniteurs avant la reproduction pour le priming trans-générationnel Fig. 17 : Etude de l'origine maternelle ou paternelle du priming trans-générationnel Fig. 18 : Proportion relative de 3 populations hémocytaires d'hutres lors de stimulation bactériennes ou avec du poly(I : C) Tableau Table 1 : Classification de l'hutre creuse Crassostrea gigas 9 10 12 15 19 20 25 26 32 33 35 45 46 49 78 82 84 114 7 1 Liste des sigles et abréviations ADN/ ARN Acide désoxyribonucléique/ ribonucléique ADNc ARNm AVNV CNC DP dsRNA EcSOD FAO FACS FSW ICTV IFN IRF ISG LGP32 LPS miRNA NSI ORF OsHV-1 PAMP PCR PRR Acide désoxyribonucléique complémentaire Acide ribonucléique messager Acute Viral Necrosis Virus Comité National de le Conchyliculture DNA polymerase double stranded RNA Extracellular superoxide dismutase Food and agriculture organization Fluorescence-activated cell sorting Filtered seawater International Committee on Taxonomy of Viruses Interféron Interferon regulatory factor Interferon stimulated gene Vibrio tasmaniensis LGP32 Lipopolysaccharide micro ARN Naissain Standardisé de l'Ifremer Open Reading Frame Ostreid HerpesVirus 1 Pathogen-associated molecular pattern Polymerase chain reaction Pathogen-associated pattern Recognition Receptor Poly(I : C) Acide polyinosinique-polycytidylique RIG RLR Retinoïc acid-inducible gene RIG-1-like Receptor RNA-seq Séquençage des ARN RNAi RNA interference RT-qPCR Real time quantitative polymerase chain reaction siRNA TLR WSSV small interfering RNA Toll-like receptor White Spot Syndrome Virus 2 Introduction générale Delphine Destoumieux-Garzon Introduction générale Ce projet de thèse porte sur un modèle biologique d'importance économique, l'hutre creuse Crassostrea gigas. Depuis 2008, les élevages de C. gigas sont victimes de phénomènes de surmortalité massive sans précédents affectant les juvéniles. Ce syndrome de surmortalité massive touche aujourd'hui l'ensemble des bassins ostréicoles français, de la mer Méditerranée à la Manche, conduisant à des taux de mortalité de 80 à 100% chez les juvéniles (Segarra et al. 2010). Au niveau international, cette crise touche désormais la plupart des pays producteurs (Burge et al. 2006, Lynch et al. 2012, Roque et al. 2012, Jenkins et al. 2013, Keeling et al. 2014). Ce syndrome de surmortalité massive a une étiologie complexe et d'origine multifactorielle impliquant différents facteurs abiotiques et biotiques. Cest une maladie poly-microbienne impliquant différentes bactéries du genre Vibrio, plus particulièrement Vibrio tasmaniensis et Vibrio crassostreae pathogènes du naissain (Gay et al. 2004, Lemire et al. 2015). Hormis les bactéries, l'apparition des surmortalités coïncide avec l'augmentation de la prévalence d'un nouveau variant d'un virus de type herpès, l'Ostreeid herpesvirus 1 (OsHV-1) identifié en 2008 (Segarra et al. 2010, Martenot et al. 2011). Afin de comprendre les causes de ces mortalités dramatiques dans les populations d'hutres françaises un intérêt tout particulier a été porté à une meilleure compréhension des interactions immunobiologiques entre les hutres et les pathogènes potentiels, identifiés comme responsables de ces mortalités. Ainsi une meilleure caractérisation et description du fonctionnement du système immunitaire des hutres ont été entrepris. Comme pour tous les invertébrés, les mécanismes de défense des hutres reposent sur un système immunitaire de type inné. Les connaissances sur leur immunité sont encore aujourd'hui fragmentaires (Wang et al. 2017). Cependant, différentes études ont permis de mieux caractériser les mécanismes de défense et la réponse antimicrobienne de l'hutre creuse (Bachere et al. 2004, Schmitt et al. 2011, Bachere et al. 2015) mettant en jeu des voies de signalisation conservées (Green et al. 2015a), ainsi qu'un large panel d'effecteurs antimicrobiens (Destoumieux et al. 1997, Montagnani et al. 2001, Gonzalez et al. 2006, Gonzalez et al. 2007, Fleury et al. 2009, Gueguen et al. 2009, Rosa et al. 2011, Rosa et al. 2012, Schmitt et al. 2012). Par ailleurs, les données génomiques et transcriptomiques récentes ont considérablement consolidé nos connaissances sur les bases moléculaires de l'immunité des hutres (Gueguen et al. 2003, Fleury et al. 2009, Roberts et al. 2009, Taris et al. 2009, de Lorgeril et al. 2011, Wang et al. 2017). Depuis fin 2012, le génome de C. gigas a été entièrement séquencé (Zhang et al. 2012) et a déjà permis de mettre en évidence que l'hutre possède en théorie le répertoire moléculaire nécessaire pour mettre en place une réponse antivirale (i. e. conservation des principales voies de la réponse antivirale connues chez les vertébrés et invertébrés). Ces travaux tendent à montrer que des mécanismes antiviraux sont conservés chez 3 l'hutre : la voie des interférons ou encore l'autophagie et l'apoptose (Green and Montagnani 2013, Jouaux et al. 2013, Segarra et al. 2014c, Green et al. 2015a, He et al. 2015). Etant dotés d'une immunité innée et dépourvus de cellules de type lymphocytaire et d'immunoglobuline comme les vertébrés, les invertébrés ont longtemps été considérés comme incapables de développer des mécanismes immunitaires adaptatifs. Le système immunitaire des invertébrés était considéré encore il y a peu comme un système simple. Cependant, ces dernières années, une nouvelle vision de l'immunité innée et de la complexité du dialogue hôte- microorganismes a pu émerger de travaux portant sur les invertébrés (Schmid-Hempel 2005, McFall- Ngai et al. 2013). Des mécanismes de reconnaissances spécifiques ont été mis en évidence et la question de l'existence d'une forme de mémoire immunitaire a été posée (Little and Kraaijeveld 2004, Kurtz 2005, Hauton and Smith 2007, Schulenburg et al. 2007). Ces mécanismes ont été associés au terme de priming immunitaire , d'immunité entrainée ou encore de mémoire immunitaire innée (Kurtz and Franz 2003, Netea 2013). Le priming immunitaire peut se traduire par le fait qu'une expérience passée avec un agent pathogène procure à un macro-organisme ou à sa descendance des capacités immunitaires accrues face à une nouvelle rencontre avec le même pathogène. Bien que les exemples s'accumulent sur son existence chez les invertébrés et par la même, des indices de l'existence d'une forme de réponse adaptative, ce phénomène est au cœur des débats au sein de la communauté des immunologistes (Kurtz and Franz 2003, Kurtz 2004, Little and Kraaijeveld 2004, Kurtz 2005, Sadd et al. 2005, Sadd and Schmid-Hempel 2006, Hauton and Smith 2007, Pham et al. 2007, Little et al. 2008, Roth et al. 2009, Sadd and Schmid-Hempel 2009, Hernandez-Martinez et al. 2010, Rodrigues et al. 2010, Roth et al. 2010, Portela et al. 2013). Le priming a également été associé à l'observation de différentes formes de protection immunitaire montrant des taux de survies accrus chez des animaux stimulés en comparaison avec des animaux non stimulés (voir (Milutinovi and Kurtz 2016) pour revue). Des travaux réalisés au laboratoire ont mis en évidence que l'injection d'un stimulus non spécifique, l'acide polyinosinique-polycytidylique (poly(I : C), un analogue synthétique d'ARNs doubles brins, caractéristiques de nombreux virus, permettait d'induire la réponse antivirale de l'hutre (Green and Montagnani 2013). Les travaux menés au sein de l'équipe ont permis de mettre en évidence que la charge virale du naissain infecté par le virus, préalablement stimulé par le poly(I : C) était fortement réduite voire inexistante contrairement aux contrôles non stimulés (Green and Montagnani 2013). Ce résultat montre pour la première fois, qu'il est possible d'induire un état antiviral chez l'hutre, capable de la protéger contre le virus OsHV-1. Ces éléments semblent donc faire appel au phénomène de priming immunitaire chez C. gigas. C'est exactement l'existence de ce priming immunitaire que nous avons cherché à confirmer et caractériser chez C. gigas dans le cadre de ces travaux de thèse. 4 Contexte scientifique C'est dans ce contexte qu'un nouvel axe de recherche sur le priming immunitaire antiviral a été développé au sein de l'UMR 5244 IHPE (Interactions Hôtes-Pathogènes-Environnements). Les membres de l'équipe MIMM dans laquelle ont été réalisés ces travaux de thèse, sont spécialisés depuis plus de 20 ans dans l'étude de la réponse antibactérienne immunitaire des hutres. Leurs travaux ont permis de mettre en évidence l'existence chez l'hutre de mécanismes efficaces pour éliminer les agents infectieux reposant sur une réponse du type innée mettant en jeu des voies conservées de signalisation (Escoubas et al. 1999, Bachere et al. 2004, Montagnani et al. 2004, Montagnani et al. 2008), ainsi qu'un large panel d'effecteurs antimicrobiens (Schmitt et al. 2010, Bachere et al. 2015). En parallèle, des mécanismes d'échappement par les bactéries ont été caractérisés soulignant la complexité du dialogue hôte-microorganismes (Duperthuy et al. 2011). Par ailleurs, des travaux ont abouti à la caractérisation, au niveau transcriptomique, de la réponse de l'hutre aux bactéries pathogènes V. splendidus et V. aestuarianus (de Lorgeril et al. 2011). D'autres travaux ont récemment émergés visant à comprendre les mécanismes d'interaction de deux populations bactériennes pathogènes V. tasmaniensis et V. crassostreae chez l'hutre (Thèse de Doctorat de Tristan Rubio, 2014-2017). Enfin, le projet ANR DECIPHER vise de manière intégrative à déchiffrer l'ensemble des facteurs impliqués dans ces phénomènes de surmortalité massive affectant les juvéniles de C. gigas depuis 2008. De plus, compte-tenu de la prévalence du virus OsHV-1 lors de ces phénomènes, un nouvel axe de recherche mis en place visait à répondre à la question désormais essentielle des bases moléculaires de la réponse antivirale encore méconnues chez les mollusques (Green and Montagnani 2013, Green et al. 2014a, Green et al. 2015a, Green et al. 2016b). Notre équipe a alors entrepris d'étudier les possibilités de protection antivirale chez l'hutre. Une première approche expérimentale, visait à tester l'induction d'une réponse antivirale par le poly(I : C), couramment utilisé pour étudier la réponse antivirale chez les vertébrés (Fortier et al. 2004). Chez l'hutre Saccostrea glomerata son injection a déjà été testée et résulte en l'induction de gènes de l'immunité (Green and Barnes 2009). Chez le poisson, il induit un état antiviral protecteur, jusqu'à 10 mois après l'immunisation (Plant et al. 2005). Les résultats obtenus au sein de l'équipe suggèrent pour la première fois l'existence d'un phénomène de priming immunitaire antiviral chez l'hutre et la possibilité d'induire une réponse antivirale permettant de protéger les hutres d'un virus pathogène. Ces résultats ont permis de développer le projet PROVIGAS (Protection antivirale chez l'hutre Crassotrea gigas) coordonné par Caroline Montagnani et financé par la région Occitanie et l'Ifremer. Ce projet proposait, (i) d'approfondir nos connaissances sur les caractéristiques de cet effet protecteur (maintien, spécificité) pour en tester les effets durant des épisodes de surmortalité 5 massive en milieu naturel, (ii) d'explorer les bases moléculaires et cellulaires de ce phénomène, (iii) de caractériser les bases encore méconnues de la réponse antivirale. L'objectif final sera d'explorer les potentialités d'applications biotechnologiques alternatives aux programmes actuels de sélection de masse pour soutenir les filières aquacoles. Ces travaux de thèse s'inscrivent dans cet objectif et ont entrepris d'étudier les possibilités de protection antivirale chez l'hutre creuse Crassostrea gigas. De plus, des travaux réalisés dans l'équipe EcoEvI, deuxième équipe du laboratoire IHPE, s'intéressent notamment à la réponse immunitaire innée et mémoire chez le gastéropode Biomphalaria glabrata vis-à-vis du ver parasite Schistosoma mansoni (Portela et al. 2013, Pinaud et al. 2016)(Thèse de Doctorat de Silvain Pinaud, 2014-2017). Ces deux thèses menées au sein du même laboratoire sur deux modèles différents de Lophotrochozoaires se sont apportées beaucoup réciproquement quant à la compréhension de ces processus immunitaires mémoriels chez les mollusques. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse vise principalement à identifier le priming immunitaire par une approche phénoménologique et décrire les mécanismes du priming immunitaire antiviral par une approche moléculaire globale, chez l'hutre creuse Crassostrea gigas. Le manuscrit de cette thèse est d'abord composé d'une revue bibliographique de l'état de l'art sur (I) le modèle : l'hutre creuse Crassostrea gigas, (II) les mortalités massives affectant C. gigas (III) l'immunité chez C. gigas et particulièrement l'immunité antivirale et enfin (IV) le priming immunitaire. Le premier chapitre est consacré aux résultats portant sur la caractérisation du priming immunitaire antiviral chez C. gigas, par une approche descriptive phénoménologique lors d'infection avec le virus OsHV-1 en milieu contrôlé et en milieu naturel. Le deuxième chapitre concerne les résultats de l'étude des mécanismes moléculaires sous- jacents au phénomène de priming immunitaire antiviral par une approche transcriptomique globale. La dernière section concerne une discussion générale de ces travaux ainsi que des perspectives de recherche sur le phénomène de mémoire immunitaire antivirale chez l'hutre creuse ainsi que le rôle de l'OsHV-1 dans cette maladie poly-microbienne mais aussi des perspectives pour la profession ostréicole en terme d'application pour le contrôle et la lutte contre les agents pathogènes impliqués dans ce phénomène de surmortalité massive d'hutres enregistrées depuis 2008. 6 Rappels bibliographiques Montagnani C. Rappels bibliographiques Modèle biologique : l'hutre creuse I. Crassostrea gigas ou Magallana gigas A. Classification L'hutre creuse ou hutre du Pacifique ou hutre Japonaise Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) est un Lophotrochozoaire appartenant à l'embranchement des mollusques bivalves de la famille des Ostreidae (Table 1). Le genre Crassostrea comprend une 20aine d'espèces dont notamment l'hutre portugaise, Crassostrea angulata ou l'hutre américaine Crassostrea virginica. En 2016, Salvi et Mariottini ont proposé une nouvelle classification du genre des Crassostrea. L'analyse phylogénétique de la région ITS2 des Crassostreinae a permis de les séparer en 2 genres distincts : Crassostrea et Magallana (Salvi and Mariottini 2016). L'hutre creuse Crassostrea gigas a dans cette étude été re-classifiée comme appartenant uniquement au genre Magallana et pourrait donc aussi être appelée Magallana gigas. Table 1 : Classification de l'hutre creuse Crassostrea gigas Règne : Clade : Classification Animal Lophotrochozoa Embranchement : Mollusques Classe : Bivalve Sous-classe : Pteriomorphia Ordre : Ostreida Super-famille : Ostreoidae Famille : Ostreidae Sous-famille : Crassostreinae Re-classification (Salvi et Mariottini 2016) Genre : Espèce : Crassostrea Magallana Crassostrea gigas Magallana gigas 7 B. Anatomie et physiologie de l'hutre L'hutre creuse C. gigas est composée d'un corps mou, contenu dans une coquille constituée de 2 valves asymétriques, l'une plate (supérieure) et l'autre creuse (inférieure) (Figure 1). Ces valves sont reliées entre elles par un ligament au niveau de la charnière et par un muscle adducteur permettant une fermeture hermétique (Galtsoff 1964). Les valves sont composées de feuillets de carbonate de calcium produit par le bord du manteau, un organe recouvrant la chair de l'hutre. Le bord de manteau participe notamment à la production de la coquille mais joue aussi un rôle de senseur des changements environnementaux. Cette fonction permet notamment de réguler le flux d'eau dans l'hutre ou d'assurer la fermeture des deux valves lors de périodes émergées. L'hutre possède des palpes labiaux assurant un tri et un acheminement des particules en suspension jusqu'à la bouche, qui vont ensuite être acheminées à l'estomac, l'intestin (entouré par la glande digestive) puis excrétées sous forme de fèces au niveau de l'anus. La gonade est, chez l'hutre, un organe non permanent recouvrant la glande digestive. Le rôle de tri des particules est assuré par les branchies dont les cils entranent un flux d'eau acheminant les particules à la bouche. L'hutre possède une paire de branchies lamellaires jouant un rôle très important dans la respiration et l'assimilation de l'oxygène. Dépourvues d'hémoglobine et d'hémocyanine, l'oxygène serait directement dissous dans l'hémolymphe, le sang de l'hutre. La circulation de l'hémolymphe est assurée par le cœur composé d'un ventricule et de deux oreillettes. L'hémolymphe circule dans l'hutre au niveau des artères, veines et sinus comme au niveau du muscle adducteur de la coquille et va aussi s'infiltrer dans l'ensemble des tissus de l'hutre, qualifiant le système circulatoire des hutres de semi-ouvert (Cheng 1981). L'hémolymphe est constituée de plasma dans lequel circulent des cellules immunocompétentes, les hémocytes. L'organe hématopoïétique n'est pas encore clairement identifié, malgré des travaux ayant montré un rôle potentiel assuré par les branchies (Jemaa et al. 2014, Li et al. 2017a). 8 Figure 1 Anatomie de l'hutre creuse Crassostrea gigas adulte. A. Schéma de la vue intérieure de la valve inférieure concave. B. Schéma d'une vue latérale d'une hutre ouverte. Modifié d'après Galtsoff, 1964. C. Cycle de vie et écologie L'hutre creuse C. gigas est un organisme hermaphrodite successif alternatif à tendance protandre (majoritairement mâle dans les premières années). En tant qu'organisme poïkilotherme (qui ne régule pas sa température), la maturation et l'émission de gamètes se font généralement en été, lorsque les conditions sont favorables, notamment sous l'effet de la température (Fabioux et al. 2005). La fécondation est externe et la rencontre entre les gamètes s'effectue dans la colonne d'eau. Vingt-quatre heures après la fécondation, une larve D est formée (Figure 2) ; entre le 2ème et le 20ème jour, la larve dite véligère est nageuse dans la colonne d'eau et vers le 21ème jour, la larve appelée pédivéligère va subir une métamorphose notamment l'apparition d'un pied, elle va chercher un support et se fixer définitivement (Figure 2). A partir de ce stade et jusqu'à leur première reproduction, ces jeunes hutres sont appelées naissain ou juvéniles, elles sont ensuite considérées comme adultes. Durant leur développement, du stade naissain jusqu'à la fin de leur vie, les hutres ne vont plus subir de métamorphoses et vont uniquement crotre. Les hutres sont des organismes 9 BouchePalpes labiauxCavité péricardiqueBranchiesMuscle adducteurCoquilleBord de manteauManteauAnusCœurGlande digestiveGonadeBord de manteauAnusMuscle adducteurABCharnière sessiles (fixés à leur support) benthiques et on retrouve les stades fixés dans la zone de balancement des marées (intertidale) et dans la zone infralittorale immergée en permanence. On retrouve les hutres dans différentes régions du globe et en tant qu'organisme euryhalin et eurytherme, cette espèce peut être présente dans différents écosystèmes allant des zones de pleine mer aux zones estuariennes, mais aussi en eau saumâtre. Ce sont des organismes invasifs (Rohfritsch et al. 2013) filtreurs suspensivores en aval du réseau trophique de leur écosystème et ont la capacité de filtrer jusqu'à 5 litres d'eau par heure pour les adultes, jouant un rôle majeur dans la dépuration du milieu (Galtsoff 1964). Figure 2 : Cycle de reproduction de l'hutre creuse, Crassostrea gigas D. Caractéristiques génomiques de l'hutre C. gigas L'hutre creuse Crassostrea gigas possède 20 chromosomes (10 paires, 2n 20) (Bouilly et al. 2008). En 2012, le génome de C. gigas a été séquencé (GenBank : AFTI00000000) (Zhang et al. 2012). Le séquençage a été réalisé par la technique WGS (Whole-genome shotgun) sur une hutre femelle adulte issue de quatre lignées consanguines frère-sœur et une hutre sauvage . Ce génome a permis de prédire 28 027 gènes pour environ 492Mb. Parmi ces gènes, 96. 1% ont une activité transcriptionnelle démontrée par des analyses de séquençages des ARN (RNA-seq) réalisés sur différents organes d'hutres au cours de différents stades de développement (Zhang et al. 2012). Le génome de l'hutre est extrêmement polymorphe avec des séquences répétées représentant 36. 1% du génome. L'annotation des différents gènes du génome a été réalisée (1) par prédiction de novo, (2) par comparaison de séquences protéiques des gènes prédits par rapport à 6 génomes de 10 FécondationEnviron 20 joursOvocyteSperma-tozoïdeLarve DLarve véligèreLarve pédivéligèreNaissain -juvénile24h2-20èmejours21èmejourFixationColonne d'eauSubstratAdultes2 à 3 ans référence (Capitella teleta, L. gigantea, Helobdella robusta, Anopheles gambiae, C. elegans et D. melanogaster) et (3) par homologie de séquences des transcrits identifiés en RNA-seq, notamment par ontologie génique. Le séquençage du génome a permis le développement d'une multitude d'études s'intéressant aux réponses transcriptomiques globales par RNA-seq chez des hutres lors de différents stress. Différents transcriptomes d'hutres ont donc été réalisés durant différents stades de développement (Zhang et al. 2012), en réponse à des stress abiotiques comme un stress osmotique (Zhao et al. 2014), thermique (Lim et al. 2016) ou chimique (Bachere et al. 2017) mais aussi en réponse à des stress biotiques comme des algues toxiques (Payton et al. 2017), des bactéries (Thèse de Doctorat de Tristan Rubio, 2014-2017) et du virus OsHV-1 (Segarra et al. 2014c, He et al. 2015, Rosani et al. 2015). E. L'hutre en aquaculture La répartition de C. gigas est mondiale et s'étend sur tous les continents excepté l'Antarctique, du Sud de l'Alaska jusqu'en Australie. Cette espèce représente un fort intérêt commercial et provient principalement de l'élevage. La production mondiale d'hutre creuse était estimée à 613 058 tonnes en 2015 (FAO, 2016). La France, principal producteur européen avec environ 72 000 tonnes annuelles, est le 4ème pays producteur derrière la Chine, le Japon et la Corée. L'ostréiculture représente en France le principal élevage en conchyliculture et en aquaculture en termes de tonnage. Ce secteur agro-alimentaire génère plus de 17 000 emplois directs en France, impliquant des enjeux socio-économiques très importants (CNC, 2016). Les élevages ostréicoles en France ont été touchés par différentes crises qui ont entrainé au cours de l'Histoire des changements d'espèces dans les parcs ostréicoles (Figure 3). Les élevages d'hutres plates Ostrea edulis, considérée comme l'espèce autochtone en France, ont été touchés dans les années 1920 par des mortalités massives pouvant aller jusqu'à 90% des élevages (Barbosa Solomieu et al. 2015, Pernet et al. 2016) (Figure 3). Ce sont ces mortalités qui ont poussé les ostréiculteurs à introduire une nouvelle espèce : l'hutre portugaise, Crassostrea angulata. Cette espèce a elle aussi été victime d'une épizootie associée à un Iridovirus à la fin des années 1960 (Comps et al. 1976). Une deuxième épizootie a affecté les élevages d'O. edulis déjà faibles, dont les agents pathogènes associés sont les parasites Marteilia refringens et Bonamia oestreae (Comps et al. 1980) (Figure 3). Ces deux épizooties successives ont entrainé l'introduction de l'hutre creuse C. gigas à la fin des années 1960, début des années 1970. Depuis cette introduction, il s'agit de l'espèce principalement élevée représentant 99% des élevages français, le dernier pour cent correspondant à l'hutre plate O. edulis. Cependant, depuis 2008, les cheptels d'hutres sont affectés par des épisodes de surmortalité massive affectant le naissain (Segarra et al. 2010). 11 Figure 3 : Historique de la production d'hutre Ostrea edulis (vert), Crassostrea angulata (bleu) et Crassostrea gigas (rouge) en France. Les principaux agents pathogènes associés aux mortalités chez les hutres adultes (grosses hutres) ou aux juvéniles et naissains (petites hutres) sont représentés en fonction de l'année de leur identification (d'après Bernard. 2011). 12 Origine inconnueMarteliarefringensBonamia ostreaeMortalités estivalesOsHV-1 var II. Mortalités massives chez Crassostrea gigas l'hutre creuse L'hutre creuse Crassostrea gigas a subi et subit aujourd'hui encore des mortalités massives, à l'origine de la diminution de la production en France. Ces mortalités touchent les différents stades de développement : les stades larvaires, le naissain et les juvéniles, ainsi que les adultes. A. Mortalités des adultes Depuis les années 1950, des épisodes de mortalité ont été décrits dans différents pays incluant le Japon, les Etats-Unis et la France (Mori. 1979, Perdue et al. 1981). Depuis les années 1980, de nombreuses études ont rapporté des mortalités importantes en France, dans toutes les zones d'élevage allant du bassin d'Arcachon (Maurer et al. 1986) jusqu'en Normandie (Costil et al. 2005). Ces mortalités étaient nommées mortalités estivales du fait de l'apparition systématique de ces épisodes pendant les mois chauds de l'année. Ces épisodes ont participé en 1993 à la création d'un REseau MOllusques des Rendements Aquacoles (REMORA) afin de suivre entre autre l'évolution de ces mortalités (Goyard. 1996, Fleury et al. 1999). Ces différents travaux ont mis en évidence que ces mortalités observées sont en lien avec la température et une nourriture abondante, induisant une sur-maturation des gonades, pouvant entraner un stress physiologique à l'origine de ces mortalités. D'autres projets scientifiques ont participé à la compréhension de ces phénomènes, c'est le cas du projet MOREST (MORtalités ESTivales) (Samain et McCombie, 2008) qui a lui aussi associé ces mortalités à un trade-off entre l'investissement physiologique à la reproduction et les capacités de survie. Ils font aussi rapport de trois autres facteurs que sont la prédisposition génétique, l'environnement (notamment la température de l'eau, la salinité ou des agents polluants) et la présence d'agents pathogènes associés comme la bactérie Vibrio aestuarianus (Labreuche et al. 2006, Garnier et al. 2008, Travers et al. 2015) (Figure 3). En ce qui concerne le virus OsHV-1, même s'il est possible de le détecter dans des hutres adultes asymptomatiques (Arzul et al. 2002, Barbosa- Solomieu et al. 2004), les hutres adultes restent peu sensibles aux infections virales à l'OsHV-1 (Segarra et al. 2014a, Green et al. 2016b). B. Mortalités des larves et des juvéniles 1. Historique En 1979, des mortalités très importantes pouvant atteindre 100% ont été observées chez des larves de C. gigas dans des écloseries aux États-Unis. Les larves présentent des difficultés de nage 13 et un manteau et bord de manteau érodés puis la mort (Leibovitz et al. 1978). Ces travaux ont permis d'identifier un virus classé dans la famille des Iridoviridae associé aux mortalités. En 1991 en France et en Nouvelle-Zélande, d'autres épisodes de mortalité sont observés en écloserie et sont associés à la présence d'un virus s'apparentant aux virus de type herpès (Hine et al. 1992, Nicolas et al. 1992). En 1994 Renault et ses collaborateurs identifient par microscopie électronique à transmission la présence de particules virales de type herpès (Renault et al. 1994). D'autres agents pathogènes ont été associés à des épisodes de mortalité larvaire, notamment des bactéries du genre Vibrio, Vibrio alginolyticus, Vibrio coralliilyticus, Vibrio tubiashii, et Vibrio splendidus biovar II (Jeffries 1982, Hada et al. 1984, Sugumar et al. 1998, Genard et al. 2013). Chez les juvéniles, des mortalités ont été rapportées dès 1993 et associées à une forte température de l'eau et la présence d'un virus (Renault et al. 1994). Par homologie de morphologie, ce virus a été identifié comme étant un herpès virus, l'Ostreid Herpes Virus 1 (OsHV-1) (Renault et al. 1994, Le Deuff and Renault 1999, Davison et al. 2005). La présence de ce virus a été associée à des phénomènes de mortalité en France et en Californie entre les années 1993 et les années 2000 (Renault et al. 2000, Renault and Novoa 2004, Friedman et al. 2005, Burge et al. 2006). A partir de 2008, des surmortalités massives, sans précédent chez des juvéniles de Crassostrea gigas ont été décrites sur des parcs ostréicoles, entranant des pertes entre 60% et 100% dans certaines zones d'élevages (Segarra et al. 2010, Martenot et al. 2011). Il s'agit d'une maladie poly- microbienne et l'apparition de ces mortalités correspond à la détection d'un nouveau variant de l'OsHV-1 (Segarra et al. 2010, Martenot et al. 2011). Ces mortalités appelées syndrome de surmortalité massive des juvéniles ou POMS ( Pacific oyster mortality syndrome en Australie), touchent jusqu'à aujourd'hui la plupart des pays producteurs au niveau mondial s'étendant à toutes les côtes de la France (Martenot et al. 2011, Renault et al. 2012), en Chine (Bai et al. 2015), au Japon (Shimahara et al. 2012), en Espagne (Roque et al. 2012), en Irlande (Prado-Alvarez et al. 2016), en Australie (Jenkins et al. 2013), en Nouvelle-Zélande (Keeling et al. 2014). L'ensemble des épisodes de mortalités décrits précédemment sont d'origines multifactorielles avec une étiologie complexe impliquant le concept de la triade épidémiologique illustrée par Snieszko en 1974 (Snieszko 1974) (Figure 4). Cette triade illustre le fait qu'une maladie infectieuse apparat quand un hôte sensible est exposé à un ou plusieurs agents pathogènes virulents dans des conditions environnementales particulières. Différents facteurs de risques ont été identifiés dans la maladie du syndrome de surmortalité massive des juvéniles, notamment à l'échelle de l'hôte par les techniques d'élevages, mais aussi des facteurs génétiques et physiologiques qui influencent la sensibilité ; ainsi que des transferts entre sites ou encore la densité d'élevages qui favorisent la 14 transmission de la maladie (Pernet et al. 2012, Normand et al. 2014a). D'autres facteurs sont impliqués (décrits dans la section B. 2. b. 3. ) liés aux facteurs biotiques ou abiotiques de l'environnement, comme la présence de prédateurs, la disponibilité en nourriture, l'eutrophisation, la pollution, des changements de paramètres tels que la disponibilité en oxygène ou encore la salinité peuvent être incriminés ; mais aussi la présence de toxines ou d'agents pathogènes impliqués directement dans ces mortalités. Figure 4 : Triade épidémiologique ; une maladie infectieuse apparat quand un hôte sensible est exposé à un ou plusieurs agents pathogènes virulents dans des conditions environnementales particulières (d'après Snieszko, 1974). 2. Etiologie du syndrome de surmortalité massive des juvéniles a) Facteurs génétiques La sélection génétique peut être une possibilité permettant d'améliorer les taux de survie des hutres (Degremont et al. 2015a). A partir de 2006, des hutres ayant passé un premier filtre de sélection pendant des épisodes de mortalité massive ont été reproduites et leur descendance issue de sélection génétique a montré des taux de survie améliorés par rapport à des hutres non sélectionnées, en milieu naturel et face aux infections à l'OsHV-1 (Degremont et al. 2007, Degremont et al. 2010a, Degremont 2011). Segarra et ses collaborateurs en 2014 ont comparé la sensibilité de deux familles biparentales de C. gigas, face à une infection à l'OsHV-1 et ont ainsi confirmé un poids important de la composante génétique dans la survie (Segarra et al. 2014c). D'autres travaux ont clairement mis en évidence que la sélection génétique permettait d'améliorer la résistance face au virus OsHV-1, mais n'affectait pas la résistance face aux bactéries Vibrio aestuarianus (Azéma et al. 2017). 15 HôteEnvironnementPathogène(s)Maladie infectieuse b) Facteurs abiotiques (1) La température La température est un facteur ayant été associé aux épisodes de surmortalité, ceux-ci n'apparaissant que lorsque la température du milieu dépasse les 16C (Garcia et al. 2011). La température peut avoir différents effets lors de ces épisodes de surmortalité, sur la physiologie de l'hôte et sur les agents pathogènes pouvant être associés. L'hutre est un organisme poïkilotherme dont les fonctions physiologiques peuvent être affectées par la température (Clark et al. 2013). Un choc thermique peut influencer la régulation de différentes voies immunitaires comme l'apoptose ou encore la voie PI3K/AKT/mTOR (Zhang et al. 2012, Guo et al. 2015), mais aussi l'expression de gènes immunitaires antiviraux (Green et al. 2014a). L'effet de la température peut aussi influencer la prolifération d'agents pathogènes d'hutres comme des bactéries du genre Vibrio dont l'optimum de croissance se situe aux alentours de 20-25C (Vezzulli et al. 2015). Par ailleurs la virulence de l'OsHV- 1 en laboratoire a été reliée à une augmentation de la température dans une gamme allant de 16C à 26C (LeDeuff et al. 1996, de Kantzow et al. 2016). Cette gamme de température influence la transmission et la virulence de l'OsHV-1, qui est plus virulent à des températures chaudes que froides (Petton et al. 2013, Martenot et al. 2015). Normand et ses collaborateurs ont par ailleurs montré qu'une augmentation progressive de la température chez des hutres en apparence saines, pouvait entraner une augmentation de la réplication de l'OsHV-1 et favorisait les mortalités (Normand et al. 2014a). (2) La salinité Les hutres sont des organismes euryhalins et peuvent être soumises à de grandes variations de salinité. Ces variations peuvent se traduire par une augmentation de la concentration en sel pendant les périodes chaudes en lien direct avec une évaporation importante ou bien à l'inverse une diminution lors d'épisodes de précipitations importantes. Toutefois, ces variations ne sont pas sans effet sur les organismes, entranant des changements dans la physiologie des hutres, notamment à l'échelle hémolymphatique (Knowles et al. 2014). La salinité a un effet sur l'activité des hémocytes et une diminution de la salinité entrane une diminution de la viabilité des hémocytes (Gagnaire et al. 2006, Matozzo and Marin 2011). Un stress hyalin peut aussi entraner l'induction de différents gènes impliqués notamment dans l'adhésion cellulaire et la communication, les canaux ioniques et des gènes de réponse immunitaire (Zhao et al. 2012). La salinité joue aussi un rôle sur la présence et la virulence d'agents pathogènes associés. C'est le cas chez les bactéries Vibrio splendidus et Vibrio aesturianus par exemple, dont l'optimum de salinité est de 20%o (Vezzulli et al. 2015). Par ailleurs, la salinité joue un rôle lors d'infections avec le virus OsHV-1 o une acclimatation des hutres à une 16 faible salinité (10%o) permet de réduire les mortalités lors d'infections avec ce virus (Fuhrmann et al. 2016). Ces variations de salinité ont été reliées aux épisodes de mortalité en Australie qui apparaissent juste après une diminution de la salinité dans les milieux d'élevage (Whittington et al. 2013). c) Facteurs biotiques (1) Les micro-algues En 2011, Cassis et ses collaborateurs ont montré que les mortalités de juvéniles de C. gigas étaient reliées à un grand nombre de paramètres biotiques et abiotiques, notamment une grande abondance en micro-algues fourragères permettait une bonne croissance et était associée à de faibles mortalités (Cassis et al. 2011). Cependant, Abi-Khalil et collaborateurs ont montré en 2016 que l'exposition de juvéniles de C. gigas à une toxine paralysante (PST pour Paralytic Shellfish Toxin ), produite par le dinoflagellé Alexandrium catanella augmente la sensibilité aux infections avec la bactérie Vibrio tasmaniensis LGP32 (Abi-Khalil et al. 2016). (2) Les bactéries Différentes bactéries sont associées au phénomène de surmortalité des hutres juvéniles, principalement des bactéries du genre Vibrio (Petton et al. 2015). Les vibrios sont des bactéries à gram négatif appartenant à la classe des gammaproteobactéries, présents dans les environnements aquatiques. Deux populations de vibrios du clade Splendidus ont été plus particulièrement étudiées pour leur association avec les mortalités d'hutres juvéniles : Vibrio crassostreae et Vibrio tasmaniensis. Des travaux réalisés par Gay et collaborateurs en 2004 ont permis d'isoler la souche LGP32 à partir d'hutres moribondes, qui est un Vibrio tasmaniensis du clade Splendidus (Gay et al. 2004). Vibrio tasmaniensis LGP32 est un agent pathogène intracellulaire facultatif des hémocytes (Duperthuy et al. 2011). Il possède une activité cytotoxique vis-à-vis des hémocytes qui dépend de son internalisation par phagocytose (Vanhove et al. 2016). Plus récemment, une autre population, Vibrio crassostreae, a été retrouvée associée à des mortalités d'hutres juvéniles (Lemire et al. 2015). Bien que les mécanismes de virulence de ces vibrios restent encore peu décrits, plusieurs déterminants génétiques ont été identifiés comme étant impliqués dans la pathogénicité des Vibrio crassostreae. Notamment un gène appelé R5-7 qui fait partie d'un ilot génomique chromosomique identifié en génomique comparative (Lemire et al. 2015), ainsi qu'un plasmide qui est nécessaire à leur pathogénicité (Bruto et al. 2017). Plus largement, l'ensemble des travaux de l'équipe de Frédérique Le Roux montrent qu'il existe une diversité de vibrios associés aux hutres et que différentes souches et/ou populations présentent des traits de virulence vis-à-vis des hutres. Ceci 17 suggère fortement que les mortalités des hutres juvéniles, comprennent une composante poly- microbienne pouvant impliquer une diversité de bactéries. (3) L'OsHV-1 Un virus morphologiquement proche de la famille des herpès virus appelé Ostreid Herpes virus 1 (OsHV-1) a été caractérisé à partir de 1991 et associé à des épisodes de mortalité chez C. gigas en France (Nicolas et al. 1992)(Renault et al. 1994), aux Etats-Unis (Friedman et al. 2005), en Nouvelle-Zélande (Hine et al. 1992) et au Mexique (Vasquez-Yeomans et al. 2004). Ce virus a par ailleurs été détecté dans d'autres espèces de bivalves marins comme les hutres Ostrea edulis Crassostrea rivularis et Crassostrea angulata, ou les palourdes Ruditapes philippinarum et Ruditapes decussatus, mais aussi chez la coquille Saint-Jacques Pecten maximus ou chez Scapharca broughtonii (Arzul et al. 2001a, da Silva et al. 2008, Xia et al. 2015). Depuis 2008, les surmortalités massives observées chez les juvéniles sur parcs ostréicoles sont associées à la détection d'un nouveau variant de ce virus, appelé OsHV-1 microvar (OsHV-1 var) (Segarra et al. 2010, Martenot et al. 2011). Ces mortalités peuvent atteindre une ampleur considérable avec des taux de mortalité allant de 60% à 100% dans certaines zones d'élevage (Segarra et al. 2010, Martenot et al. 2011). Différents auteurs ont émis l'hypothèse que ce virus (OsHV-1 var) soit plus virulent que la souche de référence (OsHV-1) et un des agents principaux dans l'étiologie des mortalités de juvéniles (Segarra et al. 2010, Martenot et al. 2011, Schikorski et al. 2011b) puisque les mortalités coïncident avec la détection d'ADN viral (Petton et al. 2015). Pour empêcher la propagation de ce virus, des mesures sanitaires ont été mises en place afin de limiter les échanges d'hutres potentiellement infectées entre zones d'élevages. En effet, la principale voie de transmission de l'OsHV-1 entre individus se fait par l'eau de mer (Schikorski et al. 2011a, Paul-Pont et al. 2013). De l'ADN viral est détectable dans l'eau de mer sur parcs ostréicoles lors d'épisodes de surmortalité (Sauvage et al. 2009). En laboratoire, des expérimentations ont montré une transmission horizontale entre les individus par cohabitation (Schikorski et al. 2011a) confirmant la transmission par l'eau de mer en milieu naturel. La transmission peut aussi se faire verticalement via le transfert des géniteurs vers la descendance comme l'ont suggéré Barbosa- Solomieu et ses collaborateurs en 2005 (Barbosa-Solomieu et al. 2005). De plus, la détection de l'OsHV-1, chez des adultes asymptomatiques pourrait avoir un rôle de réservoir dans la transmission de la maladie (Evans et al. 2017a). Par ailleurs, ce virus a été détecté chez d'autres espèces, asymptomatiques à l'OsHV-1 suggérant un rôle de réservoir important dans la persistance et la transmission (Evans et al. 2017b). Le virus peut aussi être transmis en laboratoire par injection dans le muscle adducteur d'une suspension virale réalisée à partir d'animaux morts ou moribonds 18 porteurs de l'OsHV-1 (Schikorski et al. 2011b) entranant des mortalités pouvant aller jusqu'à 100% en moins de 5 jours. (a) Morphologie, structure et classification Il existe aujourd'hui 103 espèces de virus classées parmi l'ordre des Herpesvirales (ICTV, 9ème rapport, 2016). La classification des virus dans cet ordre se fait principalement par des caractéristiques morphologiques et structurelles communes à tous ces virus (Figure 5) : - Une morphologie similaire (non différentiable par microscopie électronique) - Une taille comprise entre 100 et 200nm - Une enveloppe composée d'une bicouche lipidique et de glycoprotéines - D'un tégument composé de différentes protéines requises pour la formation de virions - D'une capside icosaédrique - D'un génome composé d'ADN double brin linéaire d'une taille comprise entre 125 et 295kpb dont la composition en G C varie entre 32% et 75% Figure 5 : l'ordre des Herpesvirales Dr. Marko Reschke) Structure des virus de (Extrait de L'ordre des Herpesvirales réunit notamment les 2 familles des Alloherpesviridae et les Herpesviridae. Les Herpesviridae sont divisés en 3 sous familles composées des Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae et Gammaherpesvirinae (Figure 6). On retrouve notamment dans la sous famille des Alphaherpesvirinae le genre des Simplexvirus parmi lequel on retrouve les virus HSV-1 et HSV-2 infectant l'Homme. L'Ostreid herpesvirus 1 (OsHV-1) possède l'ensemble des caractéristiques morphologiques des Herpesvirales et a donc été classé dans cet ordre (Davison et al. 2005, Davison et al. 2009). Cependant, il n'a pas été classé dans la famille des Herpesviridae. Les travaux de Savin et 19 NucléocapsideTégumentNucléoïde(génome)EnveloppeGlycoprotéine ses collaborateurs en 2010, se sont intéressés à la séquence de l'ADN polymérase de différents herpès virus, présents chez différentes espèces d'hôtes. Ces auteurs ont montré une divergence entre les herpès virus de mammifères et d'oiseaux, d'invertébrés marins, de poissons et d'amphibiens (Figure 6), classant l'OsHV-1 dans une nouvelle famille, les Malacoherpesviridae (Davison et al. 2005, Davison et al. 2009, Savin et al. 2010). Cette famille comprend deux genres, les Ostreavirus, représentant deux membres, l'OsHV-1 de référence et l'OsHV-1 var représenté par ses deux variants A et B (Burioli et al. 2017) et les Aurivirus dont un seul membre est décrit, l'Haliotid herpesvirus 1 aussi appelé Abalone Herpes Virus 1 (AbHV1) représentant deux variants isolés en Australie et en Thaïlande. Ce virus a été identifié chez l'Ormeau Haliotis diversicolor dont les caractéristiques semblent très proches de l'OsHV-1 (Chang et al. 2005, Savin et al. 2010). Il n'existe à l'heure actuelle aucune lignée cellulaire de bivalves et il est encore impossible d'infecter des lignées hétérologues avec l'OsHV-1. Le cycle de réplication de l'OsHV-1 est à ce jour encore inconnu. Des travaux récemment ont montré qu'il est possible d'infecter des primo-cultures ex vivo d'hémocytes et que le virus OsHV-1 s'y réplique (Morga et al. 2017). Figure 6 : Classification des virus de l'ordre des Herpesvirales. D'après (Burioli et al. 2017). 20 (b) Génome de l'OsHV-1 et de ses variants A partir de purification de particules virales chez des larves de C. gigas infectées (Le Deuff and Renault 1999), le séquençage complet du génome de l'OsHV-1 a été réalisé en 2005 (GenBank : AY509253)(Davison et al. 2005). D'une taille de 207 439 pb, ce génome comporte 124 ORFs. Un premier variant de l'OsHV-1 appelé OsHV-1 var a été identifié en 1997 chez Crassostrea gigas et la palourde Ruditapes philippinarum présentant une délétion de 2. 8kpb dans une région répétée inversée (Arzul et al. 2001b). Ce variant n'a été que très rarement détecté en France et il est possible qu'il ne soit qu'un variant infectant la palourde et qu'une transmission interspécifique ait permis de le détecter dans l'hutre (Arzul et al. 2001b). Depuis 2008, un nouveau variant a été identifié. Il s'agit d'un variant appelé OsHV-1 var (Segarra et al. 2010, Martenot et al. 2011). Le génome de ce variant a été séquencé en 2017 et a révélé une homologie de 94. 4% avec le génome de référence, pour 128 ORFs (Burioli et al. 2017). Les auteurs ont émis l'hypothèse que cette homologie très importante et les différentes mutations, insertions et délétions identifiées pourraient être à l'origine de la virulence de ce variant. Le séquençage de ce variant a permis d'identifier : - - la perte de 5 ORFs (ORF36, ORF37, ORF48, ORF62 et ORF63) clivage de 6 ORFs (ORF5, ORF32, ORF50, ORF65, ORF73 et ORF105) en 2 ORFs disctinct numérotés . 1 et . 2. - l'addition de 4 nouveaux ORFs (ORF IN. 1 à IN. 4) résultant de l'insertion de 2671 pb dans la région longue unique située entre les ORFs 42 et 44 du génome de référence - des délétions importantes dans 4 autres ORFs (ORF3, ORF53, ORF41 et ORF120) compromettant probablement la fonction de ces gènes D'après ces données de séquençage et par homologie de séquence avec d'autres virus, des groupes d'ORFs ont pu être identifiés et des fonctions ont pu être prédites : - 16 gènes codant des enzymes faisant partie des ATPases (ORF109), du complexe hélicase/primase (ORF7, ORF24, ORF49, ORF66, ORF67, ORF115), ADN polymérase (ORF 100), DUTpases (ORF27, ORF34, ORF75), ribonucléotides réductases (ORF20, ORF51), un domaine Deoxynucléoside kinase (ORF44), ARN-Ligase (ORF64) et Exonucléase (ORF95) - 19 gènes codant des protéines membranaires (ORF16, ORF22, ORF25, ORF32, ORF41, ORF IN. 4, ORF50. 2, ORF54, ORF57, ORF59, ORF65. 1, ORF68, ORF72, ORF77, ORF80, ORF84, ORF88, ORF103 et ORF111) 21 - 8 gènes possédant des motifs RING finger (ORF9, ORF38, ORF53, ORF96, ORF97, ORF117, ORF118, ORF121) - 9 gènes codant des protéines sécrétées (ORF13, ORF15, ORF17, ORF IN. 1, ORF50. 1, ORF65. 2, ORF74, ORF83 et ORF 120) - 4 gènes codant des inhibiteurs d'apoptose ayant un motif Baculovirus inhibitor of apoptosis Repeat (BIR) (ORF42, ORF87, ORF99 et ORF106) - 70 gènes codant des protéines de fonctions inconnues, soit 56% du génome En raison du nombre très important d'ORFs dont les fonctions sont inconnues, il est difficile de pouvoir identifier et d'interpréter les différences de virulence entre l'OsHV-1 de référence et le variant var (Rosani et al. 2017). Par ailleurs, d'autres données provenant d'analyses par PCR emboitée réalisées sur des échantillons d'hutres infectées provenant de France, Chine, Japon, Australie, Etats-Unis, Mexique, Corée et Nouvelle-Zélande ont permis de mettre en évidence l'existence d'au moins 24 types différents d'OsHV-1 (Bai et al. 2015). Ces données révèlent des variations géniques entre les différentes souches dans 598 pb parmi les 207 439 pb du génome. A l'heure actuelle, ces différents types ne sont pas corrélés au génotype des hôtes, mais principalement au lieu géographique, suggérant que différents variants coexistent dans le monde. Il n'est pas surprenant de trouver la coexistence de ces différents variants puisque le génome d'un virus ne peut pas être défini comme une séquence unique correspondant à un type appelé sauvage , mais consiste en une distribution de séquences mutantes, chacune différente de la séquence des autres clones (Arzul et al. 2017). Chez le pétoncle Chlamys farreri, un herpès virus, l' Acute Viral Necrosis Virus ou AVNV, a été identifié lors d'épisodes de mortalité. Il semblerait que ce virus soit un variant de l'OsHV-1 (Renault et al. 2012, Ren et al. 2013). Un autre variant de l'OsHV-1 a été identifié chez Scapharna broughtonii (OsHV-1-SB) pendant des épisodes de mortalité et le séquençage de son génome a permis de mettre en évidence une identité de 95. 2% avec l'ADN de l'OsHV-1 de référence et de 97. 3% avec l'AVNV (Xia et al. 2015). (c) Diagnostic d'une infection à l'OsHV-1 Il n'existe pas de signe clinique permettant d'identifier une infection au virus OsHV-1 en milieu naturel. Les signes cliniques sont la mort des animaux, ou un ralentissement de la fermeture des valves, mais ces signes ne sont pas spécifiques d'une infection à l'OsHV-1. En revanche, il existe un large panel de méthodes cliniques permettant d'identifier la présence de l'OsHV-1 en laboratoire. 22 - La microscopie électronique à transmission. Cette technique ne permet pas d'identifier clairement l'OsHV-1, mais permet d'identifier la présence de virus. Cette approche a notamment permis de suggérer que le manteau, le cœur, les hémocytes, les palpes labiaux, les branchies ainsi que la glande digestive pouvaient être des organes de réplication (Renault et al. 1994, Renault et al. 1995, Schikorski et al. 2011a). - PCR conventionnelle. Différentes amorces ont été dessinées pour permettre la détection de l'OsHV-1 et du variant OsHV-1var notamment les amorces C9/C10, C2/C6 et DP ciblant l'ADN polymérase située dans une région peu polymorphe du génome (Batista et al. 2007, Webb et al. 2007). - PCR quantitative en temps réel. Deux types de PCR quantitative en temps réel ont été développées, la méthode SYBR green et la méthode TaqMan (Pepin et al. 2008, Martenot et al. 2010). Ces techniques permettent une quantification absolue de l'ADN viral, mais ne peuvent pas être reliées directement au nombre de particules virales potentiellement infectieuses. En revanche, la PCR en temps réel PMA (propidium monoazide) permet de quantifier les particules virales encapsidées, sans quantifier les virus dégradés ou l'ADN libre (Moreau et al. 2015a). - L'hybridation in situ (HIS). Cette technique permet de détecter l'ADN ou les ARNm de l'OsHV-1 de référence ainsi que les différents variants, mais ne permet pas de discriminer les différents génotypes dans un même échantillon (Arzul et al. 2002, Lipart and Renault 2002, Corbeil et al. 2015, Bueno et al. 2016). Cette technique a permis d'identifier la présence de l'OsHV-1 dans différents organes mais aussi d'identifier sa réplication dans l'hutre. - Séquençage. La technique de séquençage ADN du génome du virus purifié permet de pouvoir identifier la présence de l'OsHV-1 et de pouvoir clairement identifier le génotype du virus (Davison et al. 2005, Burioli et al. 2017). Le suivi des transcrits viraux par la technique de séquençage ARN permet de pouvoir identifier la présence de virus OsHV-1 infectieux (He et al. 2015, Rosani et al. 2015, Rosani and Venier 2017). 23 III. L'immunité de l'hutre creuse Crassostrea gigas Chez les vertébrés, les mécanismes de défense reposent sur une immunité de type innée et de type adaptative. La combinaison de ces deux systèmes permet une réponse rapide et non-spécifique (défense innée) et une seconde réponse dépendante de la première très spécifique et capable de mécanisme de mémoire face à des agents pathogènes déjà rencontrés (défense adaptative ou défense acquise). Chez les invertébrés, le système immunitaire repose sur une immunité de type innée et comme le disaient Loker et ses collaborateurs en 2004, il semble qu'il reste encore beaucoup à faire pour caractériser l'immunité des invertébrés (i. e. Invertebrate immune systems- not homogeneous, not simple, not well understood (Loker et al. 2004). A la différence des vertébrés, les invertébrés sont dépourvus de lymphocyte et ne produisent pas d'anticorps et vont donc mettre en place une toute autre stratégie de défense faisant intervenir une série de cascades de réactions permettant l'élimination des agents pathogènes. La première ligne de défense face à des infections sont les barrières physico-chimiques que sont chez l'hutre la coquille, le mucus sur les épithélia, ou encore la régulation du flux d'eau dans la coquille. Suite à la reconnaissance des agents pathogènes par le système immunitaire, la défense de l'organisme repose alors sur des réponses de type cellulaires et des cascades immunitaires humorales permettant d'enrayer l'invasion et l'expansion des pathogènes. A. Les tissus immunitaires Chez l'hutre, comme chez les autres bivalves, les mécanismes de réponse immunitaire reposent principalement sur des cellules circulantes multi-potentes et immunocompétentes que sont les hémocytes et les cellules épithéliales de différents organes participant aux mécanismes de défense antimicrobiens (Gueguen et al. 2006, Itoh and Takahashi 2008, Bachere et al. 2015). Les hémocytes peuvent être circulants dans les sinus, vaisseaux et cœur mais peuvent aussi migrer dans différents organes comme la branchie ou le manteau (Bachere et al. 2004). Les hémocytes ont différentes fonctions notamment dans la cicatrisation, la réparation de la coquille, le transport de nutriments, mais aussi des fonctions immunitaires (Sminia and Vanderknaap 1987, Montes et al. 1995, Canesi et al. 2002). Ce sont des cellules capables de reconnatre le soi du non-soi par la reconnaissance de motifs associés aux agents pathogènes (PAMPs) ou d'opsonines et ainsi de déclencher des mécanismes de réponses à médiations cellulaires (agrégation, phagocytose, apoptose encapsulation) et la sécrétion de composés microbicides (des peptides antimicrobiens, des pièges à ADN (NETs), des enzymes hydrolytiques, des espèces réactives de l'oxygène) suite à l'activation de 24 différentes cascades de voies de signalisation immunitaires (Bachere et al. 2015) (Figure 7). Lors d'une blessure, de contaminations ou d'infections par des agents pathogènes, les hémocytes vont être recrutés et vont alors migrer vers le site affecté via l'hémolymphe. Ces cellules vont s'agréger entre elles permettant d'immobiliser le corps étranger et ainsi limiter l'infection (Feng 1988). Les hémocytes sont des cellules capables de phagocytose, processus permettant l'absorption et l'élimination de particules de petite taille (>0. 5m) telles que les bactéries ou les levures. La phagocytose se déroule en 3 étapes : la reconnaissance de la particule via des récepteurs de phagocytose qui peuvent interagir avec des ligands présents à la surface des particules directement ou indirectement via des opsonines ; l'internalisation de la particule à phagocyter via une déformation de la membrane plasmique soutenue par des modifications du cytosquelette d'actine pour former le phagosome ; ensuite le phagosome va subir un processus de maturation notamment via la fusion avec des compartiments lysosomaux pour devenir un phagolysosome. Ce phagolysosome possède différentes activités microbicides et de dégradation comme : un milieu acidifié, différentes activités enzymatiques comme des hydrolases et des protéases, des peptides antimicrobiens, des espèces réactives de l'oxygène (ROS) ou encore de fortes concentrations de métaux toxiques comme le Cuivre et le Zinc (Flannagan et al. 2009). Figure 7 : Représentation schématique des fonctions immunitaires des hémocytes d'hutre creuse Crassostrea gigas. Extrait de (Bachere et al. 2015). Le terme hémocyte regroupe un ensemble de 3 populations principales de cellules différentes dont la classification a été réalisée à partir de critères morphologiques et ultra- 25 structuraux par différents auteurs. On distingue ainsi les granulocytes (comportant des granules dans le cytoplasme), les hyalinocytes (ne comportant pas de granules dans leur cytoplasme) et les blast- like cells qui sont des cellules de petite taille dont le rapport noyau/cytoplasme est supérieur à 1 (Hine 1999, Bachere et al. 2015) (Figure 8). Actuellement il n'existe pas de consensus clair chez l'hutre sur le nombre de lignages cellulaires parmi les hémocytes. Différentes hypothèses s'opposent allant de l'hypothèse d'un seul lignage cellulaire avec différents stades de maturation des blast- like aux granulocytes en passant par les hyalinocytes jusqu'à l'hypothèse d'une diversité de lignages qui restent à caractériser (Bachère et. al. 2015). De plus, il n'existe pas de lignée cellulaire d'hémocyte ni de culture de primo-culture pérennes pouvant servir d'outil de routine pour des études ex vivo. Figure 8 : Les hémocytes de l'hutre creuse Crassostrea gigas. Les agranulocytes (A, B et C), (A) les blast-like , (B) et (C) les hyalinocytes. Les granulocytes (D et E). Microscopie électronique à transmission x15000. Extrait de (Bachere et al. 2004). A l'heure actuelle, aucun tissu hématopoïétique des hémocytes n'a été clairement identifié. Des travaux ont montré une augmentation du nombre d'hémocytes et une stimulation de gènes liées à l'hématopoïèse (Runx1 et BMP7) dans des branchies d'hutres lors d'une seconde infection avec la 26 bactérie Vibrio splendidus, suggérant cet organe comme site d'hématopoïèse (Zhang et al. 2014, Li et al. 2017a). D'autres travaux ont identifié la présence de cellules apparentées à des cellules souches ou cellules progénitrices au niveau de l'épithélium basal de la branchie, capables de différentiation en hémocytes, suggérant que les branchies sont des organes participant à l'hématopoïèse (Jemaa et al. 2014). B. Reconnaissance par le système immunitaire La première étape de l'activation du système immunitaire est la reconnaissance des agents pathogènes via des motifs moléculaires associés aux pathogènes ( Pathogen-associated Molecular Patterns ou PAMPs). Ces PAMPS sont de natures très diverses, dépendant du type d'agent pathogène. Chez les bactéries, ces PAMPS peuvent être des lipopolysaccharides (LPS) ou des peptidoglycanes, tandis que chez les virus des glycoprotéines ou les acides nucléiques ADN, ARN double brin ou simple brin, peuvent avoir cette fonction (Mogensen 2009). La reconnaissance de ces PAMPs par l'organisme infecté se fait par des récepteurs de reconnaissance de motifs associés aux pathogènes ( Pathogen-associated pattern Recognition Receptors ou PRRs). Le séquençage du génome de Crassostrea gigas notamment (Zhang et al. 2012), a permis d'identifier un très grand répertoire de PRR parmi lesquels : Les protéines de reconnaissance du peptidoglycane (PGRP) sont des molécules essentielles dans l'immunité innée des vertébrés et des invertébrés par leur capacité à reconnatre spécifiquement le peptiglycane de la paroi cellulaire des bactéries et de les éliminer (Royet et al. 2011). Chez l'hutre, l'analyse du génome a permis de prédire 9 PGRP (Zhang et al. 2015). Les FREPS (Fibrinogen-related proteins), membres de la superfamille des immunoglobulines, jouent un rôle de PRR très important dans différents processus de défense comme l'agglutination, la lyse bactérienne et la défense contre les parasites (Hanington and Zhang 2011). Chez les invertébrés, les FREPs ont été initialement identifiées chez un gastéropode, Biomphalaria glabrata lors d'une infection parasitaire (Adema et al. 1997). Les FREPs ont été décrites comme impliquées dans une réponse antibactérienne chez la crevette Litopenaeus vannamei mais pas impliquées lors d'une infection avec le White spot syndrome virus (WSSV) (Coelho et al. 2016). Chez l'hutre, il existe une très grande diversité de ces molécules, avec plus de 190 apparentées aux FREPs caractérisées dans le génome (Zhang et al. 2012, Huang et al. 2015, Zhang et al. 2015). Cependant, ces molécules ont été caractérisées en tant que FREPs par homologies de séquences chez d'autres organismes par rapport au domaine fibrinogen-like présent dans la région C-terminale mais la présence 27 d'immunoglobuline n'a pas été recherchée, leur fonctionnalité n'est pas encore démontrée (Huang et al. 2015). Les récepteurs scavenger (SRs) sont des récepteurs membranaires ou endocytiques ayant différentes fonctions physiologiques mais aussi immunitaire via la reconnaissance de PAMPs. Chez l'homme, des travaux ont montré qu'un récepteur scavenger (le récepteur BI) était impliqué dans la reconnaissance de glycoprotéines du virus de l'hépatite C (Catanese et al. 2010). Chez l'hutre, il existe une grande diversité de SR. En effet, les données du génome ont permis de révéler 71 gènes annotés comme codant des SR. Des travaux réalisés chez C. gigas ont montré une augmentation du niveau de transcription de différents récepteurs scavenger pendant les épisodes de mortalité estivale suggérant leur rôle dans l'adaptation à un environnement complexe (Huvet et al. 2004, Fleury et al. 2010). Les lectines sont des protéines impliquées notamment dans la liaison aux glycoprotéines, glycolipides ou polysaccharides présents à la surface de différents pathogènes. Chez les invertébrés, il existe un grand nombre de lectines dont les fonctions peuvent être directement associées à une activité antimicrobienne ou jouer un rôle d'opsonine. Chez l'hutre creuse, différents types de lectines ont été identifiées, les gigalines, le ficollines, les lectines de type C, les integrines, les galectines et les chitinases-like lectines (Terahara et al. 2006, Badariotti et al. 2007, Yamaura et al. 2008, Duperthuy et al. 2011). Les lectines de types C peuvent être solubles ou trans-membranaires et des travaux chez l'hutre C. gigas ont montré que ces molécules sont impliquées dans la reconnaissance de bactéries gram- positives ou peuvent jouer un rôle d'opsonine et augmenter l'activité de phagocytose face à Vibrio splendidus , au même titre que les galectines (Li et al. 2015, Jia et al. 2016). Les lectines de type C peuvent aussi jouer un rôle dans la reconnaissance d'un grand nombre de glycoprotéines virales entranant une stimulation de l'activité de phagocytose ou la production de cytokine chez les vertébrés (Dambuza and Brown 2015). A l'heure actuelle, des analyses transcriptomiques réalisées chez l'hutre lors d'infections à l'OsHV-1 ont permis d'identifier une surexpression d'une lectine de type C et d'une galectine (He et al. 2015). Le séquençage du génome de C. gigas a permis de mettre en évidence un grand nombre de gènes codant des protéines contenant un domaine C-type lectin (266 gènes) suggérant un rôle important de ces molécules dans les mécanismes de défense immunitaire (Zhang et al. 2015). D'autres types de lectines, les mannoses-binding lectins (MBLs), sont des membres des collectines et sont capables de se lier à différents types d'agents pathogènes 28 (bactéries, parasites, virus) (Kilpatrick 2002). Ces MBLs ont la capacité d'activer le système du complément chez les vertébrés (Holmskov et al. 2003). Le système du complément possède différentes fonctions comme l'opsonisation, des activités antimicrobiennes et la reconnaissance de différents types d'agents pathogènes (Nonaka 2001). Le système du complément est composé de 3 voies principales chez les vertébrés : la voie classique (déclenchée par les anticorps), la voie des lectines activée par les MBLs et la voie alternative déclenchée par les agents pathogènes directement (Nonaka and Miyazawa 2002). Chez l'hutre, des travaux ont récemment montré un rôle potentiel de lectines de type C et de MBLs dans l'activation du système du complément en réponse à une infection avec Vibrio splendidus (Li et al. 2015). Des protéines très importantes dans le système du complément sont les C1q, capables d'activer la voie classique, mais aussi dans la reconnaissance des agents pathogènes et jouent un rôle important dans le système immunitaire inné (Fraser et al. 2006). Chez l'hutre, 337 gènes codent ces protéines contenant un domaine C1q dont seulement un seul présente une homologie avec un C1q de vertébré et un domaine collagène (Gerdol et al. 2015, Zhang et al. 2015). Lors d'une infection avec des bactéries du genre Vibrio aesturianus, V. tubiashii, V. aesturianus, V. alginolyticus et Micrococcus luteus, l'expression de 164 gènes codant des C1q est régulée et 154 sont régulés suite à un stress abiotique (thermique, hyalin et exposition à l'air) (Zhang et al. 2015). Ces résultats suggèrent une diversification des fonctions de C1q chez C. gigas. Les recepteurs Toll (TLRs) sont des récepteurs clés dans l'immunité innée, impliqués dans la reconnaissance d'un large éventail d'agents pathogènes directement ou indirectement. Chez les vertébrés, ces récepteurs Toll peuvent être localisés au niveau de la membrane cellulaire et contiennent un domaine extracellulaire riche en leucine, un domaine transmembranaire et un domaine intracellulaire appelé TIR (Toll/ Interleukin-1 receptor). Le domaine extracellulaire est impliqué dans la reconnaissance des agents pathogènes et le domaine intracellulaire dans la transduction du signal (Barton and Medzhitov 2003). D'autres récepteurs Toll sont intracellulaires, localisés au niveau de l'endosome. Chez les mammifères, les récepteurs TLR1, 2, 6 et 10 reconnaissent entre autres les lipopeptides, TLR4 reconnat les LPS, TLR3 qui est au niveau de l'endosome reconnat les ARNs doubles brins et TLR9 reconnat les motifs CpG de l'ADN (Lee and Min 2007), suggérant une grande diversité de PAMPs pouvant être reconnus. Chez les insectes, la reconnaissance des récepteurs Toll est indirecte avec les structures microbiennes et se fait via la protéine Spaetzle, qui est le ligand Toll (Weber et al. 2003). 29 Chez C. gigas, il existe un grand nombre de gènes codant des récepteurs Toll (83 gènes) identifiés dans le génome (Zhang et al. 2015). A l'heure actuelle, 6 TLRs ont été identifiés comme participant à la réponse immunitaire lors d'infections principalement avec des bactéries (CgTRL-1 à 6) (Zhang et al. 2011a, Zhang et al. 2013b, Wang et al. 2016). Des travaux publiés en 2015 ont également montré par analyse transcriptomique que 19 transcrits codant des TLRs sont sur-exprimés en réponse à des bactéries du genre Vibrio, des LPS ou le virus OsHV-1 (Zhang et al. 2015). D'autres travaux ont également montré cette sur- expression de différents TLRs en réponse aux infections à l'OsHV-1 (Jouaux et al. 2013, Segarra et al. 2014c, He et al. 2015, Green et al. 2016b). Les récepteurs RIG-I-like (RLRs) sont des récepteurs cytoplasmiques de la famille des hélicases d'ARN double brin. Les deux principaux RLRs sont RIG-1 (Retinoïc acid-inducible gene) codé par le gène ddx58 et MDA5 (melanoma differentiation associated protein 5). RIG- 1 est capable de détecter les ARNs doubles brins de petite taille ( d'origine virale mais aussi synthétique comme le poly(I : C) (l'acide polyinosinique-polycytidylique) (Huang et al. 2017) et les ARNs simples brins, uniquement ceux portant une tri-phosphorylation en 5', permettant de discriminer le Soi du non-Soi (Kato et al. 2006, Pichlmair et al. 2006). MDA5 quant à lui reconnat spécifiquement les ARNs doubles brins de grande taille (>1000pb)(Reikine et al. 2014). Chez la drosophile Drosophila melanogaster, les récepteurs RIG-1 like sont absents et ce sont les TLRs et Dicer, impliqués dans la voie de lARN interférence, qui jouent le rôle de senseur d'acides nucléiques (Deddouche et al. 2008). Dans le génome de C. gigas, 11 RLRs ont été identifiés (Zhang et al. 2015), parmi lesquels 7 sont surexprimés en réponse à une infection à l'OsHV-1 ou au poly(I : C) (Green et al. 2014a, He et al. 2015). Comme nous venons de le voir, il existe une grande diversité de récepteurs immunitaires chez l'hutre creuse Crassostrea gigas. L'identification de ces molécules a bien souvent été réalisée in silico par homologie de séquence ou par des approches transcriptomiques ciblées. Alors que les différentes fonctions de ces mécanismes sont aujourd'hui relativement bien connues chez les vertébrés ou des organismes modèles, chez l'hutre creuse, la preuve formelle de la conservation de leur fonction n'est pas encore démontrée et leurs ligands non identifiés. Cependant, l'existence dans le génome d'une grande diversité de molécules ayant des fonctions connues chez d'autres organismes révèle comme le titrait Zhang et ses collaborateurs en 2015 une expansion massive et une divergence fonctionnelle des gènes immunitaires chez l'hutre creuse (Zhang et al. 2015). 30 C. Signalisations et mécanismes de l'immunité antivirale Suite à la reconnaissance des agents pathogènes, différentes cascades immunitaires vont être activées notamment par la régulation de différentes voies de signalisations immunitaires. Différentes études se sont intéressées aux mécanismes immunitaires influencés par des agents pathogènes et se sont bien souvent intéressées à la caractérisation de composés antimicrobiens, d'activités enzymatiques ou aux réponses transcriptomiques comme c'est le cas lors d'infections avec le virus OsHV-1(Green and Montagnani 2013, Jouaux et al. 2013, Green et al. 2014a, Normand et al. 2014b, Segarra et al. 2014c, Green et al. 2015a, He et al. 2015, Rosani et al. 2015, Green et al. 2016b). Ces travaux ont permis de mettre en lumière et d'identifier différents gènes régulés en réponse à l'OsHV-1 et ainsi proposer l'implication de différentes voies de signalisations antivirales. 1. Un système de type interféron L'avancée majeure apportée par le séquençage du génome de C. gigas en 2012 a permis de mieux comprendre l'immunité antivirale chez C. gigas (Zhang et al. 2012). En 2015, à partir d'analyses in silico, Green et collaborateurs ont ainsi pu identifier différentes voies de signalisations antivirales conservées dans le génome de l'hutre, permettant de supposer l'existence d'un système de type interféron en comparaison au système interféron identifié chez les vertébrés (Green et al. 2015a). Le système interféron est, chez les vertébrés, le principal mécanisme de défense immunitaire antiviral. Ce système va de la reconnaissance virale (glycoprotéines, ARN doubles brins) jusqu'à la sécrétion de protéines, les interférons (Randall and Goodbourn 2008). Ces protéines servent de messagers d'alerte pour les autres cellules au cours d'une infection virale permettant ainsi la production d'un ensemble de molécules antimicrobiennes, en empêchant l'entrée du virus dans de nouvelles cellules et en activant des mécanismes antiviraux comme l'apoptose ou l'autophagie (Randall and Goodbourn 2008) (Figure 9). L'activation de ce signal se fait par la voie JAK/STAT (Janus kinases/ Signal transducers and activators of transcritpion) entranant la transcription de nombreux gènes stimulés par l'interféron (ISGs, pour interferon stimulated genes ) et la stimulation de différents mécanismes antiviraux (Darnell et al. 1994). Chez la drosophile, la voie JAK/STAT est conservée et impliquée dans la réponse antivirale, mais aucun interféron n'a encore été identifié (Dostert et al. 2005, Honda et al. 2006, Kingsolver et al. 2013, Myllymaki and Ramet 2014). 31 Figure 9 : Principales voies de signalisations régulant le système Interféron chez les vertébrés. (D'après (McNab et al. 2015) et (Crouse et al. 2015) Chez l'hutre, les données du génome ont révélé l'existence de nombreux gènes similaires aux ISGs tels que : 2'-5-oligoadenylate synthetase (OAS) ; la protéine Mx ; la viperin, ADAR-L ; protéine kinase R ou IFI44 (Green et al. 2015a) (Figure 10). En 2016, des auteurs ont identifié chez l'hutre creuse un récepteur de cytokine (CgIFNR-3), capable d'activer la voie JAK/STAT et la transcription de différents ISGs (Lacoste et al. 2002, Zhang et al. 2016). Par ailleurs, l'hutre est capable de reconnatre des ARNs doubles brins non spécifiques (poly(I : C) et d'entraner une réponse antivirale efficace lors d'une infection à l'OsHV-1 en limitant sa réplication (Green and Montagnani 2013). Plusieurs senseurs d'acides nucléiques viraux ont été identifiés dans le génome (Zhang et al. 2012) comme par exemple des TLRs, des RLRs, cGAS (détectant l'ADN cytosolique) (Figure 10). En aval de ces récepteurs, différents effecteurs des voies de signalisations ont été identifiés, notamment comme des éléments de la voie NF-B (Kawai and Akira 2007), comme IKK, Cg-Rel ou IB (Escoubas et al. 1999, Montagnani et al. 2004, Montagnani et al. 2008). De plus, des IRFs (Interferons regulatory factors) ou encore STING (stimulator of interferon) intervenant dans la production d'interféron de type I chez les vertébrés sont présents dans le génome de C. gigas. Ces différentes voies de signalisations sont capables d'activer des facteurs de transcriptions permettant l'induction de la transcription de molécules immunitaires comme les cytokines ou les peptides antimicrobiens. Si à l'heure actuelle, il n'existe aucune preuve formelle de l'existence d'interférons chez C. gigas, ni de la conservation fonctionnelle de ces voies, les données obtenues à 32 partir des études transcriptomiques réalisées lors d'infections avec l'OsHV-1 permettent de supposer son existence ou du moins un système proche du système interféron des vertébrés (Green et al. 2015a) (Figure 10). Figure 10 : Représentation de voies de signalisations antivirales conservées chez l'hutre Crassostrea gigas, identifiées à partir du génome (Zhang et al. 2012). (Extrait de (Green et al. 2015a) 33 2. L'ARN interférence Le mécanisme ARN interférence ou RNAi est un mécanisme bien décrit chez les vertébrés permettant de contrôler l'expression de gènes à l'échelle transcriptomique et post-transcriptomique (Meister and Tuschl 2004). L'ARN interférence est un processus conservé au cours de l'évolution, caractérisé dans différents règnes (mycètes, animaux et végétaux) déclenché par la reconnaissance d'ARNs doubles brins par Dicer, une ribonucléase clivant les ARNs doubles brins en fragments d'ARN doubles brins non codants, de taille variable (20-25 pb). Les petits ARNs formés sont ensuite recrutés et transportés vers le complexe RISC (RNA-induced silencing complex) via les protéines argonautes (AGO) entranant la dégradation des ARNs messagers cibles, de séquence complémentaire des brins recrutés (Fire et al. 1998, Wang et al. 2010, Jeang 2012). Différents types de petits ARNs non codants ont été caractérisés chez différentes espèces, entre autre, les petits ARNs interférents (siRNA), les micros ARNs (miRNA) et les piRNAs (PIWI-interacting RNAs) (Kingsolver et al. 2013) (Figure 11). L'ARN interférence est décrit comme étant impliqué dans la réponse antivirale innée chez les vertébrés et les arthropodes. Les siRNAs sont générés à partir d'ARN double brin d'origine exogène comme les virus et la voie des siRNAs est reconnue comme étant un mécanisme de défense contre le virus à ARN et les virus à ADN (Deddouche et al. 2008, Jeang 2012). Les miRNAs ont été caractérisés comme intervenant lors d'infections virales, ils sont produits par l'hôte mais peuvent aussi être produits par les virus eux-mêmes (Piedade and Azevedo-Pereira 2016). Les virus peuvent (i) éviter les miRNAs de l'hôte ciblant les ARNs viraux (Cullen 2013) ; (ii) bloquer la voie de l'ANR interférence de l'hôte en interagissant avec des protéines clés (Lu and Cullen 2004) et (iii) synthétiser leurs propres miRNAs, particulièrement les virus de la famille des Herpesviridae (Grundhoff and Sullivan 2011, Kincaid and Sullivan 2012). Bien que différents miRNAs aient été identifiés chez l'hutre creuse en réponse à différents stress osmotiques (Chen et al. 2017) ou bactériens (Zhou et al. 2014), leur rôle antiviral chez l'hutre et les bivalves en général est à ce jour encore inconnu. Un seul article discute de la présence de miRNAs identifiés in silico chez la petoncle Chlamys farreri lors d'infections virales par le virus AVNV ayant potentiellement des rôles dans différents processus physiologiques et immunitaires (Chen et al. 2014). Ces travaux sont peut-être la preuve qu'il existe une réponse antivirale induite par la voie RNAi chez les bivalves. Des travaux réalisés in silico à partir de données génomiques ont permis d'identifier 100 potentiels miRNAs chez l'hutre (Xu et al. 2014). De plus, le génome de l'hutre a permis d'identifier différents éléments de la voie de l'ARN interférence comme Dicer (un seul horthologue), 4 protéines argonautes ( 2 AGO et 2 PIWI) ou encore une sous-unité du complexe RISC (TRBP), suggérant une potentielle implication de la voie de l'ARN interférence chez l'hutre creuse (Green et al. 2015a, He et al. 2015, Rosani et al. 2016). 34 Figure 11 : Mécanismes de l'ARN interférence chez l'homme et la drosophile. (a) la voie des siRNA (chez l'homme), (b) la voie des miRNA (chez l'homme) et (c) la voie des piRNA (chez Drosophila melanogaster). Extrait de (Jinek and Doudna 2009). 3. Voies de mort cellulaire programmée a) L'apoptose L'apoptose est un mécanisme cellulaire fondamental avec rôle physiologique contribuant à l'homéostasie de l'organisme (Conradt 2009), mais aussi un rôle dans le système immunitaire inné , empêchant notamment la réplication de virus et la libération de nouveaux virions (Nakanishi 2006). L'apoptose peut être activée par la voie extrinsèque ou la voie intrinsèque. La voie extrinsèque est stimulée par des ligands de type cytokines sur des récepteurs de types Tumor necrosis factor (TNFR) ou au Fas-ligand (Ashkenazi 2002) permet l'activation de l'apoptose via des caspases. Cette activation peut être rétro-contrôlée via la voie NF-B. La voie intrinsèque fait intervenir la 35 mitochondrie via la libération du cytochrome c dans le cytosol. Cette libération est régulée par Bcl-2 entranant la formation d'un complexe appelé apoptosome, activant des caspases, conduisant à l'apoptose (Kiss 2010, Galluzzi et al. 2012). Ces différentes voies peuvent être régulées par des protéines pro-apoptotiques mais aussi anti-apoptotiques. On retrouve chez l'hutre un grand nombre de molécules pro-apoptotiques et un grand nombre de molécules anti-apoptotiques comme Bcl-2 ou des protéines inhibitrices d'apoptose (IAP) (Zhang et al. 2011b, Qu et al. 2015). Des travaux en 2014 ont montré une augmentation de l'expression de Bcl-2 et d'IAP chez C. gigas lors d'infection à l'OsHV-1, suggérant que cette augmentation soit une réponse de l'hôte face au virus, entranant une stimulation des processus d'apoptose (Jouaux et al. 2013, Green et al. 2014a, Segarra et al. 2014a). Chez les Alphaherpesviridae, différents gènes précoces de la réplication du virus sont capables d'activer l'apoptose pour des raisons encore peu décrites, tandis que d'autres gènes codant des inhibiteurs d'apoptose sont ensuite exprimés (Nguyen and Blaho 2009). Dans le génome de l'OsHV-1, 4 gènes codent des inhibiteurs d'apoptose, suggérant que ce mécanisme de mort cellulaire joue un rôle important parmi les défenses antivirales de C. gigas (Burioli et al. 2017). De plus, des travaux réalisés en 2014 ont montré que les adultes sont moins sensibles aux infections à l'OsHV-1 que les juvéniles, et qu'il sont capables d'inhiber la réplication virale (Segarra et al. 2014a). Ces informations ont été reliées à l'augmentation de l'expression de nombreux gènes codant des IAP chez les hutres infectées, suggérant le mécanisme d'apoptose comme un des facteurs impliqués dans la résistance des adultes (Green et al. 2014a, Segarra et al. 2014a). b) L'autophagie L'autophagie est un mécanisme de mort cellulaire lui aussi impliqué dans l'homéostasie cellulaire mais aussi dans l'immunité. Ce mécanisme va former un autophagosome ciblant les agents pathogènes intracellulaires et des protéines cytosoliques, puis par fusion avec un lysosome pour former un autolysosome et dégrader par réaction enzymatique le contenu (Deretic 2006). Chez les vertébrés, PKR, un ISG, peut déclencher ce mécanisme en réponse à une infection par un herpès virus à la suite de la reconnaissance d'ARNs doubles brins viraux (Richetta and Faure 2013). D'autres molécules comme les TLRs via leur ligand, MyD88 sont capables de stimuler l'autophagie en réponse à des virus (Richetta and Faure 2013). Chez l'hutre C. gigas, l'autophagie semble être un mécanisme important lors d'infection avec le virus OsHV-1. Moreau et collaborateurs en 2015 ont identifiés la présence de gènes impliqués dans l'autophagie tels que les gènes ATG (Moreau et al. 2015b). De plus, ces auteurs ont montré par inhibition de l'autophagie une diminution du taux de survie d'hutres infectées avec l'OsHV-1 et la bactérie Vibrio aesturianus (Moreau et al. 2015b). Ces 36 résultats montrent l'existence fonctionnelle et suggèrent l'importance de l'autophagie dans les mécanismes immunitaires antibactériens et antiviraux chez l'hutre. 4. Les effecteurs immunitaires En plus des mécanismes à médiation cellulaire comme la phagocytose, l'apoptose ou l'autophagie, il existe une grande diversité de mécanismes permettant d'enrayer les infections microbiennes pathogéniques. La plupart de ces mécanismes a été identifiée chez l'hutre lors d'infections bactériennes ou fongiques (Bachere et al. 2015). a) Les protéines plasmatiques Différentes protéines plasmatiques ont été identifiées chez C. gigas, notamment des Superoxides dismutases extracellulaires (EcSODs) et la cavortin. Les SODs jouent un rôle important d'anti-oxidant par rapport aux espèces réactives de l'oxygène (ROS), elles-même impliquées dans la lutte contre des agents pathogènes, mais causant aussi des dommages oxydatifs sur l'hôte (Cutler 1991). Parmi les SODs, un membre est capable de se lier au LPS et jouer un rôle d'opsonine et participer à la lutte contre Vibrio splendidus (Gonzalez et al. 2005, Duperthuy et al. 2011). Lors d'infections virales à l'OsHV-1, la surexpression de différents gènes codant des SOD a été identifiée (Normand et al. 2014b) mais aucune fonction antivirale directe n'a encore été associée. La cavortin quant à elle est une des protéines majeure de l'hémolymphe (Scotti et al. 2007). En 2014, Green et collaborateurs ont réalisé des tests d'activités antivirales sur l'herpès virus de type 1 dans des cultures cellulaires Vero, en utilisant la cavortin extraite chez l'hutre creuse (Green et al. 2014b). Ces résultats ont montré que la cavortin avait un effet virucide direct. b) Les protéines et peptides antimicrobiens Les peptides antimicrobiens (AMPs) sont des effecteurs immunitaires dont la fonction principale est microbicide ou bactériostatique. La caractérisation des peptides antimicrobiens est principalement abondante pour les fonctions bactéricides et bactériostatiques. Ils peuvent agir, en formant des pores sur la membrane bactérienne entranant la lyse (Brogden 2005), empêcher les processus vitaux des bactéries comme la synthèse de protéines ou de composants de la paroi, mais aussi être recrutés par les phagocytes pour éliminer les agents pathogènes (Bulet et al. 2004) pour revue). Chez l'hutre creuse, différentes protéines et peptides ont été identifiés, participant à des mécanismes antimicrobiens dont leurs propriétés antivirales n'ont pas été recherchées et ne sont actuellement pas connues. Ces protéines et peptides peuvent être classés en 6 classes : les défensines, les Big-défensines, les peptides riches en proline (PRPs), les bactéricidal/permeability 37 increasing proteins (BPI), les ubiquitines et les molluscidines (Bachere et al. 2015) pour revue). Des travaux récents ont identifié un peptide antimicrobien, la myticine C, chez la moule Mytilus galloprovincialis, ayant une activité antivirale sur le virus OsHV-1 ainsi que 2 herpès virus humains (HSV-1 et 2) (Novoa et al. 2016). Ces travaux suggèrent que la synthèse de ce peptide dans l'hémolymphe des moules serait responsable de la protection de cette espèce face aux infections virales à l'OsHV-1 en milieu naturel. 38 IV. Une nouvelle vision de l'immunité innée Les réponses immunitaires d'un hôte contre des microbes sont généralement catégorisées entre innées et adaptatives. Ces différences de réponse sont distinguées par les mécanismes de reconnaissance et les mécanismes déclenchés pour lutter contre le microbe (Dempsey et al. 2003). L'immunité adaptative a la capacité de se souvenir d'un agent pathogène déjà rencontré et de développer un phénomène de mémoire immunitaire, mais aussi de déclencher une réponse plus rapide et plus intense de manière extrêmement spécifique vis-à-vis de l'agent pathogène lors de cette deuxième rencontre (Litman et al. 2010). Cette mémoire immunitaire et cette spécificité de réponse procurent un avantage certain lors d'une seconde infection. L'immunité innée a longtemps été considérée comme étant non-spécifique, incapable de différencier des microbes très similaires et répondant de manière similaire lors d'infections répétées, c'est à dire dépourvue de capacité mémorielle (Medzhitov 2010). Les invertébrés étant connus pour posséder exclusivement un système immunitaire inné, dépourvus de cellules de type lymphocytaire et d'immunoglobulines, ont longtemps été jugés incapables de développer des mécanismes immunitaires spécifiques et mémoriels. Cependant, ces dernières années, une nouvelle vision de l'immunité innée a pu émerger sur la base de travaux portant sur les invertébrés et les vertébrés (Kurtz and Franz 2003, Schmid- Hempel 2005, McFall-Ngai et al. 2013, van der Meer et al. 2015). A. Le priming immunitaire Pour comprendre le priming immunitaire, il faut remonter à 1977 o des auteurs ont remarqué que plusieurs allogreffes successives sur du corail étaient rejetées de plus en plus rapidement, suggérant l'existence d'une forme de mémoire immunitaire (Hildemann et al. 1977). En 2003, des auteurs ont infectés des copépodes Macrocyclops albidus avec une lignée frère-sœur de leur parasite naturel Schistocephalus solidus puis les ont réinfectés 4 jours plus tard avec cette même lignée (homologue) ou avec une autre lignée (hétérologue). Les résultats ont montré une diminution plus importante du succès de réinfection lors de la seconde exposition avec la lignée homologue par rapport à la lignée hétérologue, introduisant la notion de mémoire immunitaire et de spécificité chez un invertébré (Kurtz and Franz 2003). Ces travaux introduisent pour la première fois la notion de mémoire immunitaire et de spécificité chez un organisme invertébré. Chez les plantes, la protection contre les agents pathogènes est caractérisée par une combinaison de mécanismes de résistance constitutive et de résistance acquise appelée résistance systémique acquise (Dangl and Jones 2001). L'infection de plantes par différents types d'agents 39 pathogènes à virulence atténuée entrane une protection lors d'une seconde infection avec ce même agent pathogène, incluant une grande diversité d'agents pathogènes (virus, bactéries, champignons) (pour revue, voir (Durrant and Dong 2004). Ces informations suggèrent l'existence d'une forme de mémoire immunitaire chez les plantes. Chez les vertébrés, des travaux réalisés à partir de souris Rag1 -/- (déficientes en lymphocytes B et T fonctionnels), stimulées avec une dose non-létale de Candida albicans puis réinfectées 7 jours plus tard avec la même souche pathogène, ont montré une amélioration du taux de survie par rapport à des souris non stimulées (Quintin et al. 2012a). Ces observations sont associées à une reprogrammation fonctionnelle des monocytes impliquant notamment des mécanismes épigénétiques et montrent une forme de mémoire immunitaire non reliée au système classique de l'immunité adaptative des vertébrés (Quintin et al. 2012b). D'autres types cellulaires associés au système immunitaire inné, les Natural Killer ou NK ont montré des capacités de mémoire immunitaire lors d'infection par un cytomégalovirus murin (MCMV) (Sun et al. 2009). L'ensemble de ces observations a été regroupé sous le terme d' immunité entrainée ou trained immunity (Netea et al. 2011). Depuis, différentes formes de mémoire immunitaire ont été mises en évidence chez les plantes, les vertébrés et les invertébrés, associées au système immunitaire innée (Kurtz 2004, Netea et al. 2011, Conrath et al. 2015, Milutinovi and Kurtz 2016) pour revue). Cependant l'interprétation de ces phénomènes est complexe. En particulier, il n'existe pas de distinction claire entre l'observation d'une réponse maintenue après une infection et celle d'une véritable mémoire immunitaire (se traduisant en partie par un retour à un niveau de réponse basal avant une nouvelle activation de la réponse immune). Des auteurs proposent de séparer la définition de la mémoire immunitaire des mécanismes de cette mémoire (Kurtz 2005). A l'heure actuelle, la terminologie de ces observations et des mécanismes est au cœur des débats scientifiques. Ne pouvant associer ces mécanismes à l'immunité adaptative des vertébrés, ces mécanismes ont été associés au terme de priming immunitaire ( immune priming ) chez les invertébrés (Little and Kraaijeveld 2004) ou d' immunité entrainée ( trained immunity ) chez les vertébrés (Netea et al. 2011). De manière plus générale, ces mécanismes sont associés à une mémoire immunitaire innée pouvant être définie comme la capacité d'un organisme à stocker ou à utiliser l'information d'une première rencontre avec un antigène ou un agent microbien ou parasitaire, afin d'avoir une réponse immunitaire améliorée lors d'une seconde rencontre (Kurtz 2005). 40 B. Le priming immunitaire chez les invertébrés 1. Le priming à l'échelle intra-individuelle Depuis les travaux de Kurtz et ses collaborateurs en 2003 (Kurtz and Franz 2003), de nombreux travaux se sont intéressés au phénomène de priming immunitaire chez les invertébrés. A l'heure actuelle, de plus en plus d'observations de l'existence du priming immunitaire et de mémoire immunitaire émergent dans la littérature, chez différents phylla (échinodermes, céphalocordés, nématodes, annélides, cnidaires, cténophores, éponges, mollusques et arthropodes (voir (Milutinovi and Kurtz 2016) pour revue). Les études se focalisent principalement chez les arthropodes, sur des organismes modèles et non modèles. Chez le ver de farine Tenebrio molitor, une injection de LPS entrane une réponse immunitaire maintenue permettant de protéger la larve d'une infection avec un champignon pathogène Metarhizium anisopliae 4 jours après la stimulation (Moret and Siva-Jothy 2003). Chez le bourdon Bombus terrestris, une injection de bactéries (Pseudomonas fluorescens, paenibacillus alvei ou paenibacillus larvae) puis une infection avec ces mêmes bactéries entrane une protection non spécifique (contre l'ensemble des bactéries utilisées) si les infections sont réalisées 8 jours après la primo-stimulation, mais une protection spécifique (uniquement la même bactérie) si les infections sont réalisées 22 jours après la primo-stimulation (Sadd and Schmid-Hempel 2006). Chez l'isopode Porcelio scaber, une injection de bactéries tuées augmente les capacités de phagocytose de cellules immunitaires in vitro (Roth and Kurtz 2009). Chez les crevettes Penaeus monodon, Fenneropanaeus indicus, Litopenaeus vannamei Penaeus chinensis ou Panaeus japonicus différents travaux se sont intéressés à la stimulation de la réponse immunitaire dans un objectif de vaccination pour lutter contre les maladies causées par le white spot syndrome virus (WSSV). Pour stimuler les crevettes, différents stimulants ont été utilisés, des virus inactivés (Namikoshi et al. 2004, Singh et al. 2005), des protéines recombinantes de virus (Witteveldt et al. 2004), des séquences d'ADN de protéines d'enveloppe virale VP28 (Li et al. 2010) ou des ARNs doubles brins (Robalino et al. 2004, Kim et al. 2007) impliquant notamment la voie ARN interférence (Labreuche et al. 2010). Ces différents stimulants permettent d'induire une réponse antivirale et d'améliorer le taux de survie lors d'infections avec le WSSV. Chez les mollusques, le priming immunitaire est très peu étudié comparé aux arthropodes. Les premiers travaux ont été réalisés chez le gastéropode Biomphalaria glabrata, hôte intermédiaire de Schistosoma mansoni, un trématode parasite. Des auteurs ont montré une diminution du taux de ré-infestation lors d'une seconde infection avec ce trématode réalisée à partir de 10 jours après la première rencontre (Sire et al. 1998) ; mais aussi une spécificité de réponse directement reliée au génotype et à la souche du parasite ré-infestant (Portela et al. 2013). Les auteurs concluent que la spécificité de ce priming immunitaire était dépendante de 41 la distance génétique entre le parasite utilisé pour la première infestation et celui utilisé pour la seconde infestation, illustrant un priming immunitaire génotype dépendant chez B. glabrata. D'autres travaux ont été réalisés chez les bivalves et ont rapporté un phénomène de priming immunitaire, chez le pétoncle Chlamys farreri montrant une amélioration du taux de survie lors d'une infection avec Vibrio anguillarum chez des pétoncles stimulés avec cette même bactérie tuée à la chaleur 7 jours avant l'infection (Wang et al. 2013). Chez l'hutre creuse Crassostrea gigas, 3 études ont montré lors de stimulations des hutres avec des bactéries Vibrio splendidus tuées à la chaleur puis une seconde infection avec la bactérie virulente : une augmentation du nombre total d'hémocytes (suggérant une stimulation de l'hématopoïèse) et du taux de phagocytose (Zhang et al. 2014, Li et al. 2017a) ; une implication de EcSOD dans le mécanisme du priming antibactérien (Liu et al. 2016), mais ces résultats restent à être confirmés. En effet, ces différents travaux n'associent jamais le priming à une amélioration du taux de survie, uniquement à une observation de mécanismes de réponses modulées au cours de la primo-stimulation et de la seconde infection. Des travaux ont été initiés au laboratoire d'accueil de cette thèse et ont montré que l'injection de poly(I : C) à des juvéniles d'hutres permettait d'entraner une réponse immunitaire améliorée lors d'infection par le virus OsHV-1, entranant une augmentation de l'expression de gènes antiviraux et une diminution de la charge virale (Green and Montagnani 2013). En revanche, des hutres stimulées avec des bactéries inactivées présentaient des charges virales similaires aux individus non stimulés. Ce résultat montre pour la première fois, qu'il est possible d'induire un état antiviral chez l'hutre, capable de les protéger d'un virus pathogène de façon spécifique. Cependant, les différentes études du priming immunitaire se sont principalement focalisées sur les modèles arthropodes et les agents pathogènes les plus étudiés restent aujourd'hui les bactéries et les parasites. A ce jour, très peu d'études s'intéressent au priming immunitaire antiviral. Par ailleurs, sans remettre en cause l'existence du priming immunitaire chez certaines espèces, le phénomène de priming n'a pas pu être mis en évidence. On peut citer le cas de la fourmi Formica selysi dont une première stimulation avec le champignon Beauveria bassiana ne protège pas d'une seconde infection (Reber and Chapuisat 2012). Chez la drosophile, une primo stimulation avec un virus à ARN (Drosophila C virus) ne permet pas de protéger d'une seconde infection (Longdon et al. 2013). 2. Le priming à l'échelle inter-individuelle Une autre composante du priming immunitaire a été suggérée, liée au mode de vie des invertébrés, l'immunité sociale . Cette composante est un aspect écologique très important particulièrement chez les hyménoptères (insectes sociaux), notamment si on considère une colonie 42 comme un super-organisme . Différents travaux ont été réalisés dans des interactions termites- champignons (Traniello et al. 2002), fourmis-bactéries (Hamilton et al. 2011) et fourmis-champignons (Konrad et al. 2012). La fourmi Camponotus pennsylvanicus possède deux estomacs. Un estomac servant à la digestion pour la fourmi et un second estomac dit social servant à pré-digérer le bol alimentaire et à régurgiter les aliments pour nourrir les autres insectes de la colonie (trophallaxie). Les travaux d'Hamilton et collaborateurs ont montré que ce bol alimentaire pouvait contenir des bactéries ayant été rencontrées hors de la colonie, pouvaient alors s'échanger entre les individus au sein de la colonie et ainsi stimuler l'immunité des congénères (Hamilton et al. 2011). Par ailleurs, et particulièrement dans le cas d'insectes sociaux dont généralement une seule mère engendre une descendance nombreuse, le transfert d'immunité d'une génération à l'autre peut se révéler un facteur avantageux dans la survie de la colonie. Ces travaux pourraient montrer une forme de priming immunitaire en prenant en compte la colonie comme un super organisme (Cremer and Sixt 2009). De plus en plus de travaux ont montré un transfert d'immunité vertical, des parents vers la descendance, à partir de parents ayant été exposés à différents agents pathogènes ou stimuli. On parle alors de priming immunitaire trans-générationnel (Sadd et al. 2005, Moret 2006). Ce phénomène a été observé chez différentes espèces d'arthropodes en interaction avec une grande variété de microbes et de parasites (Huang and Song 1999, Little et al. 2003, Sadd et al. 2005, Moret 2006, Sadd and Schmid-Hempel 2007, Tidbury et al. 2011, Zanchi et al. 2012, Tate et al. 2017). Ce priming immunitaire trans-générationnel peut être d'origine maternelle ou paternelle et suivant les espèces, et peut protéger tous les stades de développement (Roth et al. 2010, Zanchi et al. 2011). Chez l'hutre creuse Crassostrea gigas, une stimulation des géniteurs par un ARN double brin synthétique, le poly(I : C), entranant une amélioration du taux de survie des larves au cours d'infection par le virus OsHV-1 (Green et al. 2016a) suggère l'existence de priming trans- générationnel pour cette espèce. 3. Mécanismes du priming immunitaire Malgré une augmentation de l'observation de phénomènes de mémoire immunitaire et de spécificité, beaucoup de travaux se cantonnent à des descriptions phénoménologiques et les mécanismes sous-jacents sont encore mal connus. Cependant, quelques études ont apporté des pistes sur les mécanismes du priming immunitaire. Chez les vertébrés, des travaux in vitro ont montré que l'immunité entranée, induite par Candida albicans, ou -glucane, était liée à un récepteur du -glucane qui par stimulation de différentes voies de signalisation entranait la reprogrammation des monocytes. Cette reprogrammation est associée à des changements 43 épigénétiques, en particulier des tri-méthylation des histones H3K4 sur les promoteurs des gènes TNF et IL6 (Quintin et al. 2012a, Quintin et al. 2012b, van der Meer et al. 2015, Netea and van der Meer 2017). Cette même étude a montré que le traitement des monocytes par le -glucane entranait une augmentation du niveau d'expression et la phosphorylation de la kinase Mitogen- activated protein kinase (MPK), appelée p38 via l'activation d'un TLR et d'une augmentation de l'expression de PRR (Quintin et al. 2012a) (Figure 12). La reprogrammation épigénétique semble être un des mécanismes essentiels à l'immunité entranée chez les vertébrés (Saeed et al. 2014). Chez les plantes, des mécanismes similaires ont été identifiés chez Arabidopsis thaliana, via la stimulation par la benzothiadiazole (capable d'activer la réponse systémique acquise (SAR). Les auteurs ont identifié une augmentation de l'activité transcriptionnelle de MPK3 et 6, de différents PRR ainsi que des changements épigénétiques, notamment des tri-méthylations des histones H3K4 (Conrath et al. 2015) (Figure 12). Ces résultats semblent indiquer une conservation ou une convergence dans l'évolution de la mémoire immunitaire innée chez les plantes et les vertébrés (Conrath et al. 2015). 44 Figure 12 : Schéma résumé des mécanismes moléculaires immunitaires de défense lors de priming immunitaire chez les plantes (vert) et chez un monocyte de mammifère (bleu), chez des cellules naïves, après stimulation ou infection chez ces cellules stimulées. (extrait de (Conrath et al. 2015). 45 Chez les invertébrés, les mécanismes du priming immunitaire sont encore méconnus. Quelques travaux principalement réalisés chez la drosophile ont permis de suggérer des mécanismes sous- jacents au phénomène de priming immunitaire. De manière générale, 3 types de scénarios peuvent soutenir les observations d'amélioration de réponse immunitaire lors d'une seconde infection (Coustau et al. 2016) (Figure 13) : - (A) une réponse maintenue ( sustained response ) consistant à une sur-expression de molécules immunitaires suite à la première infection pendant une longue période - (B) une réponse rappelée ( recalled response ), consistant à stocker l'information se traduisant par un retour d'expression à un niveau basal suite à la première infection, puis une réponse plus rapide et plus intense lors de la seconde infection - (C) un shift immunitaire ( immune shift ) avec des effecteurs immunitaires différents entre la première et la seconde infection Figure 13 : Modèle de réponse immunitaire innée chez les invertébrés, lors d'une première infection (flèche noire) puis d'une seconde infection (flèche bleue). (A) une réponse immunitaire maintenue sur une longue durée permettant une protection, (B) une réponse immunitaire rappelée plus rapidement et plus intensément lors de la seconde infection et (C) un shift immunitaire avec des effecteurs immunitaires différents entre la première et la seconde infection. (extrait de (Coustau et al. 2016). 46 (A) Réponse maintenue(B) Réponse rappelée(C) Shift immunitaireRéponse immunitaireRéponse immunitaireRéponse immunitairePremière infectionSeconde infectionTemps Le premier de ces scénarios consiste en une activation sur le long terme d'effecteurs immunitaires permettant une meilleure défense lors d'une seconde infection. Le second correspond à une réponse immunitaire qui s'estompe avec le temps mais qui est activée plus rapidement et plus intensément lors de la seconde infection. Ces différentes hypothèses reposent sur des mécanismes différents, la première consistant en une réponse maintenue et une activation continue tandis que la seconde repose sur un stockage de l'information impliquant une forme de mémoire immunitaire. Des auteurs suggèrent qu'en réalité ce soit une combinaison de ces scénarios qui soit à la base des mécanismes de priming immunitaire chez les invertébrés (Milutinovic et al. 2016). Parmi ces mécanismes il est à noter une diversification des récepteurs. Les invertébrés n'ont pas de cellules lymphocytaires comme les vertébrés, mais des récepteurs extrêmement diversifiés ont été identifiés. C'est le cas des Down syndrome cell adhesion molecule (Dscam) (Figure 14), dont l'épissage alternatif résulte en plusieurs milliers d'isoformes (Watson et al. 2005) pouvant être relié à une forme de spécificité de réponse ou un rôle d'opsonine chez la drosophile pouvant alors peut-être jouer un rôle dans le priming immunitaire (Dong et al. 2006, Kurtz and Armitage 2006, Dong et al. 2012). Ce rôle joué par une diversification de récepteurs est aussi au cœur des débats chez le gastéropode Biomphalaria glabrata dont la diversification des FREPs (Zhang and Loker 2003) semble être impliquée dans la mémoire immunitaire et la spécificité de réponse face à Schistosoma mansoni (Mone et al. 2010, Pinaud et al. 2016). Chez Chlamys farreri, des auteurs ont montré une augmentation transcriptomique de l'expression de lectines de type C en réponse à un priming par un vibrio (Wang et al. 2013a). La présence dans le génome de l'hutre C. gigas d'une grande diversité de récepteurs immunitaires et d'une expansion massive de récepteurs (Zhang et al. 2012, Zhang et al. 2015), pourraient être impliqués dans les mécanismes de mémoire immunitaire et de spécificité de réponse. Par ailleurs, de plus en plus de travaux suggèrent que la phagocytose joue un rôle important dans le priming immunitaire, notamment en termes de spécificité (Figure 14). Les travaux de Pham et collaborateurs en 2007 ont montré que le priming immunitaire antibactérien avec Staphylococcus pneumoniae est dépendant de la phagocytose (Pham et al. 2007). La stimulation avec cette bactérie tuée à la chaleur protégeait la drosophile contre une seconde infection homologue avec une dose sub-létale mais ne protégeait pas d'une infection hétérologue (Pham et al. 2007). Ces auteurs ont montré qu'en bloquant la phagocytose, la spécificité de réponse était perdue. Ces travaux suggèrent une sécrétion de PRR par les hémocytes ou une augmentation de l'expression de ces PRR directement chez les hémocytes permettant de reconnatre spécifiquement les agents pathogènes lors d'une seconde infection. D'autre travaux ont suggéré le rôle de la phagocytose dans le priming immunitaire, notamment chez Porcelio scaber dont une seconde infection homologue augmentait 47 l'activité de phagocytose (Roth and Kurtz 2009). Chez l'hutre, des travaux réalisés lors de priming bactériens avec Vibrio splendidus ont aussi montré une augmentation de l'activité de phagocytose lors d'une seconde infection homologue et ont permis de faire l'hypothèse d'un rôle de la phagocytose et de superoxyde dismutase extracellulaire dans les mécanismes de priming (Zhang et al. 2014, Liu et al. 2016, Li et al. 2017a). D'autres mécanismes à médiation cellulaire ont été suggérés comme participant aux mécanismes de mémoire immunitaire et de spécificité de réponse au cours du priming immunitaire, comme l'encapsulation (Roth et al. 2010) ou des différentiations ou proliférations hémocytaires chez la drosophile (Rodrigues et al. 2010). En 2015, Futo et collaborateurs ont montré la dépendance du microbiote dans l'induction du priming immunitaire chez Tribolium castaneum face à Bacillus thuringiensis (Futo et al. 2015). D'autres travaux réalisés chez la drosophile ont montré un rôle important du microbiote dans le priming immunitaire antiviral. Le microbiote stimule la régulation de différentes voies immunitaires comme les voies ERK et NF-B, impliquées dans ce phénomène de priming antiviral (Sansone et al. 2015). D'autre travaux ont suggérés l'implication de protéines et peptides antimicrobiens dans le phénomène de priming immunitaire (Figure 14), particulièrement chez les insectes (Dubuffet et al. 2015). Différents travaux ont montré que la persistance de peptides antimicrobiens dans l'hémolymphe d'insectes pour des durées pouvant aller jusqu'à 28 jours (Haine et al. 2008) pouvait participer à la protection sur le long terme jouant un rôle prophylactique (Moret and Siva-Jothy 2003). Cependant, les peptides antimicrobiens ne sont souvent qu'à large spectre et peu spécifiques. Leur rôle de ce maintien dans le temps et la spécificité de réponse reste encore à être identifié. 48 Figure 14 : Mécanismes potentiellement impliqués dans le phénomène de priming immunitaire chez les arthropodes. Extrait de (Milutinovic et al. 2016). 49 Enfin, Hauton et collaborateurs titraient : une immunité adaptative chez les invertébrés : une maison de paille sans fondations mécanistiques (Hauton and Smith 2007). Ils relèvent bien ici la question au cœur des débats scientifiques, la mémoire immunitaire innée ne sera acceptée que lorsque des mécanismes seront clairement identifiés. Il est donc nécessaire de bien décrire les phénotypes du priming, pour ensuite pouvoir identifier les mécanismes moléculaires du priming immunitaire dont les approches globales peuvent permettre de comprendre l'ensemble de la mécanistique. A ce jour, seulement quelques études se sont intéressées à une approche génomique globale pour explorer les mécanismes du priming immunitaire (Barribeau et al. 2016, Pinaud et al. 2016). 50 Chapitre 1 : Caractérisation du priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas C. Montagnani Chapitre 1 : Caractérisation du priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas I. Introduction Cette première partie des résultats de cette thèse est consacrée à l'identification et à la description phénoménologique du priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas au cours d'infections virales par le virus OsHV-1. Des résultats préliminaires obtenus au laboratoire ont mis en évidence que l'injection de l'ARN double brin synthétique, le poly(I : C), permettait d'induire une réponse antivirale efficace lors d'infections avec le virus OsHV-1 (Green and Montagnani 2013). Cette injection de poly(I : C) était associée à une charge virale très faible comparée aux animaux non stimulés et différents gènes immunitaires antiviraux étaient régulés en réponse au poly(I : C). Par ailleurs, une stimulation des hutres par la bactérie Vibrio tasmaniensis LGP32 tuée n'entranait pas d'effet antiviral sur la charge virale lors d'infections à l'OsHV-1. Notre hypothèse est donc qu'il existe une forme de priming immunitaire antiviral chez l'hutre, puisque une forme de mémoire immunitaire a priori spécifique semble émerger des résultats de ces travaux. Ces résultats soulèvent donc différentes questions, à savoir : (i) Le poly(I : C) protège-t-il des mortalités virales ? (ii) Est-ce que cette protection est spécifiquement induite par le poly(I : C) ? (iii) Est-ce que le poly(I : C) protège uniquement du virus OsHV-1 ? (iv) Le poly(I : C) est-il efficace pour protéger les hutres pendant un épisode de surmortalité massive affectant les juvéniles ? (v) Quelle est la durée de la protection induite par le poly(I : C) ? Pour répondre à ces questions, nous avons choisi une approche phénoménologique permettant de pouvoir caractériser le priming immunitaire chez l'hutre et définir un modèle expérimental poly(I : C)/hutre. L'ensemble des travaux réalisés pour répondre à ces questions sont présentés dans l'article 1 (Long-lasting antiviral innate immune priming in the Lophotrochozoan Pacific oyster, Crassostrea gigas, Scientific report, under second review). 51 II. Article 1 : Long-lasting antiviral innate immune priming in the Lophotrochozoan Pacific oyster, Crassostrea gigas Long-lasting antiviral innate immune priming in the Lophotrochozoan Pacific oyster, Crassostrea gigas Maxime Lafont1, 2, Bruno Petton3, Agnès Vergnes1, Marianna Pauletto4, Amélie Segarra5, Benjamin Gourbal2, and Caroline Montagnani1* 1 Ifremer, IHPE, UMR 5244, Univ. Perpignan Via Domitia, CNRS, Univ. Montpellier, F-34095, Montpellier, France 2 Univ. Perpignan Via Domitia, IHPE UMR 5244, CNRS, IFREMER, Univ. Montpellier, F-66860 Perpignan, France 3Ifremer, LEMAR UMR6539, F-29840 Argenton-en-Landunvez, France 4 Department of Comparative Biomedicine and Food Science. University of Padova, Viale dell'Università 16, 35020 Legnaro (PD), Italy 5 Univ. Brest Occidentale, LEMAR UMR 6539 CNRS/UBO/IRD/Ifremer, Institut Universitaire Européen de la Mer, F-29280, Plouzané, France Corresponding author- cmontagn@ifremer. fr ABSTRACT In the last decade, a paradigm shift has emerged in comparative immunology. Invertebrates can no longer be considered to be devoid of specific recognition and immune memory. However, we still lack a comprehensive view of these phenomena and their molecular mechanisms across phyla, especially in terms of duration, specificity, and efficiency in a natural context. In this study, we focused on a Lophotrochozoan/virus interaction, as antiviral priming is mostly overlooked in molluscs. Juvenile Crassostrea gigas oysters experience reoccurring mass mortalities events from Ostreid herpes virus 1 with no existing therapeutic treatment. Our results showed that various nucleic acid injections can prime oysters to trigger an antiviral state ultimately protecting them against a subsequent viral infection. Focusing on poly(I : C) as elicitor, we evidenced that it protected from an environmental infection, by mitigating viral replication. That protection seemed to induce a specific antiviral response as poly(I : C) fails to protect against a pathogenic bacteria. Finally, we showed that this phenomenon was long-lasting, persisting for at least 5 months thus suggesting for the first time the existence of innate immune memory in this 52 invertebrate species. This study strengthens the emerging hypotheses about the broad conservation of innate immune priming and memory mechanisms in Lophotrochozoans. Introduction In the last decade, a radical paradigm shift has emerged in immunity. It is now clear that the innate immune system is capable to provide forms of immune memory as demonstrated by the compelling studies emerging on invertebrates, plants, vertebrates, and even bacteria 1. These studies have shown in a wide range of organisms lacking conventional adaptive immune responses that they can adapt upon primary exposure and are capable to implement an improved immune response upon secondary exposure to a parasite (including macro- and micro-parasites as bacteria and viruses) 2-8. In vertebrates, seminal papers from Netea et al. showed that cells of the innate immune system can also build immunological memory notably via epigenetic reprogramming allowing for enhanced non- specific inflammatory responses upon secondary challenges 9. Since these processes rely on different molecular mechanisms than those of adaptive immunity (Ig- and lymphocyte-mediated), they have been designated as immune priming or innate immune memory in invertebrates, and trained immunity in vertebrates10. Those data have blurred the boundaries between adaptive and innate immune responses that have even been described as a continuum of host defences and they currently challenge the commonly accepted dogmas in immunity. Since this field of research is still in its infancy, it is very delicate to come up with a universal description of innate immune priming. The broadest definition of these processes would be the ability to store or re-use the information on a previously encountered non-self antigen or parasite, to induce enhanced resistance or tolerance (in terms of immune response, parasite elimination and host survival capacities) upon secondary exposure. Studies testing this phenomenon in invertebrates appear to be quite heterogeneous and largely differ in terms of experimental design, host-parasite combinations, elicitors used for priming (pathogenic versus inactivated pathogens or non-infectious agents), time span between priming and challenge, route of priming (oral versus injection) and the degree of the demonstrated specificity of the primed response 11, 12. Moreover this improved protection has been observed either within the same developmental stage (within generation immune priming), across life stages (ontogenic immune priming), or across generations (transgenerational immune priming). Regarding the time span between priming and challenge, it can extend for weeks, sometimes for almost the lifetime of the organism (from larval stage to adult), but it remains in most cases rather short and does not extend over 3 months11. However, those studies have mainly focused on arthropods regarding bacteria and macro- parasite interactions. To date, antiviral immune priming has been explored in a handful studies on Caenorhabditis elegans and insects 13, 14. Most studies were focusing on crustaceans where several studies reported the potential development of vaccines to combat a major viral pathogen (the white spot syndrome virus, see 15 for review). Hence available evidence for innate immune priming is still fragmentary and we still lack a complete view of this phenomenon across phyla especially in terms of duration and specificity, and efficiency in a natural context and underlying molecular mechanisms. In Lophotrochzoans, studies conducted over the last ten years on the gastropod Biomphalaria glabrata has provided compelling evidence of innate immune memory against the parasite Schistosoma mansoni. B. glabrata is able to mount a highly specific, inducible and time-dependent protection against different species or strains of Schistosoma in a genotype-dependant manner 7, 16. Immune priming seems to be supported by snail humoral factors that lead to the degeneration and death of the parasite 7 following a shift from cellular to humoral response upon secondary infection 17. In the present study, we focused on a marine bivalve mollusc, the Pacific oyster Crassostrea gigas (now termed Magallana gigas, Thunberg, 1793)18. C. gigas is the main aquaculture animal species produced in the world, exploited in more than 27 countries (FAO Fisheries & aquaculture). But this species has been subjected to recurrent mortality events plaguing oyster production worldwide. Since 2008, a pathogen has been strongly associated to mortality events impacting juvenile oysters, the herpes-like virus OsHV-1 var (Ostreid herpes virus 1) that can induce a 100% mortality rate 19-21. In bivalves information are still scarce and to date only a few studies have investigated innate immune 53 priming mechanisms. In the scallop Chlamys farreri, authors showed an improved immune response and survival to the bacterium Vibrio anguillarum following previous exposure to the same pathogen. In C. gigas, sceptic immune priming with heat killed Vibrio splendidus conferred enhanced phagocytic responses and haematopoiesis upon re-infection with the same pathogen 22, 23. In a previous work, we developed a model system for oyster/virus interaction using a non-infectious elicitor, the viral mimic synthetic double stranded RNA (dsRNA) called poly(I : C). Poly(I : C) has been known to be a key signature of viral infection and widely used as a viral mimic in vertebrates and has been used in fish models to enhance antiviral defenses 24-27. As a non-hazardous synthetic compound, it also ensures good reproducibility between experiments and safety. Importantly, dsRNA is also produced by DNA viruses such as herpes viruses, likely due to overlapping converging transcription of viral genes 28. Recent data also tested the impact of prior injection of dsRNA on viral protection29. These studies showed that short-term priming with poly(I : C) and dsRNA injections were able to develop an antiviral state mitigating the viral loads in oysters upon subsequent viral challenge and inducing genes from an IFN-like pathway 29-31. Recent data also suggested that this effect could be maintained across generations 32. These researches have opened up new perspectives to explore immune defenses of these phylogenetically key and commercially important animals. Understanding this aspect of immunology in bivalves is of main importance in light of the global concern of increasing epizootic disease outbreaks currently affecting oysters. But as of yet, we still lack a comprehensive view of the antiviral immune priming phenomenon in the oyster. In particular, it is unknown whether the different dsRNA or other nucleic acids are equally efficient to prime oysters ; if poly(I : C) is able to reduce mortalities as well as viral loads ; if the protection can extend over 54h of priming ; if that protection is restricted to antiviral response and if it is efficient in the environment. To deeply characterize this phenomenon, we present here a comprehensive phenomenological approach of antiviral immune priming processes in the oyster. We explored the protective effect of nucleic acid exposition in comparing various types of nucleic acids (dsRNA, ssRNA, various lengths, synthetic) and testing priming efficiency against a bacterial as well as lasting effect by following survival and pathogen clearance throughout the experiments. Furthermore, we validated these processes in the field in looking at host survival during a naturally occurring disease outbreak. Results Various nucleic acid injections enhance oyster survival upon viral infection. Previous studies showed that HMW poly(I : C) and dsRNA were able to significantly reduce viral loads upon OsHV-1 infection but also mortality rates regarding dsRNA priming. Building on these observations, we compared the efficiency of the nucleic acids previously tested added to previously untested nucleic acids as LMW poly (I : C), OsHV1-dsRNA, OsHV1- ssRNA29, 30. We aimed at assessing whether this phenomenon was specific to the dsRNA analog used. To test this, we primed oysters by injection with different types of nucleic acids 1 day before an OsHV-1 challenge. We tested the poly(I : C) HMW previously used, poly(I : C) of low molecular weight (LMW), in-house synthesized double- or single-stranded RNA derived from the gene encoding the green fluorescent protein (GFP) or from the ORF 87 of the OsHV-1 encoding an inhibitor of apoptosis. Survival rates after OsHV-1 challenge showed that all nucleic acids injected were able to significantly reduce oyster mortalities as opposed to the injection of the filtered seawater control that only reached 20% survival (80% mortality) (Figure 1a). Poly(I : C) HMW and LMW were the most efficient leading to 100 and 97% survival, respectively, whereas GFP-dsRNA, OsHV1-dsRNA, and OSHV1-ssRNA lead from 83% to 90% survival. Altogether the prior injection of any nucleic acid 24h before an OsHV-1 challenge significantly increased the survival rate of the oysters by at least 63%. As a first attempt to understand the mechanisms underlying this phenomenon, we quantified by quantitative PCR (qPCR) the OSHV-1 loads in oysters following challenge (Figure 1b). Results indicated that oysters from the control group, FSW primed oysters, showed a high level of virus DNA loads with a peak at 4. 105 copies of DP (OsHV-1 DNA polymerase gene) per ng of oyster genomic DNA at 2 days post-infection. Regarding nucleic acid-treated oysters, poly(I : C) HMW and LMW showed no quantifiable amounts of viral DNA (below qPCR detection limit). The GFP-dsRNA-treated oysters showed significant amounts of virus DNA with viral loads reaching 4, 6. 105 at 2 days post-infection. OsHV1-ssRNA and OsHV1-dsRNA 54 treated oysters showed increasing viral loads reaching 3. 104 and 3. 102 copies of DP. ng-1 oyster DNA at 2 days post-infection, respectively. Altogether, our results revealed that the virus protection observed in the oyster against OsHV-1 wasn't specific of a particular dsRNA. These nucleic acids cannot only reduce viral loads in OsHV-1 infected oysters but also reduce mortalities. Since the stronger responses were observed when priming with poly(I : C) HMW, we used it as a model to mimic DNA virus infection and further characterized antiviral protection and immune priming in oysters. Figure 1 : Poly(I : C) as other dsRNA can protect against viral infection and reduce mortality due to viral infection a. KaplanMeier survival curves were generated from spats primed by injection after anesthesia with 5g/ animal of different nucleic acids (poly(I : C) HMW ; poly(I : C) LMW ; OsHV1 dsRNA ; OsHV1 ssRNA ; GFP dsRNA) or filtered seawater (FSW) as a control and injected 1 day post-priming with OsHV-1 var homogenate (1. 79 x 107 copies of DNA polymerase -DP- gene per oyster) or OsHV-1-free control homogenate. Mortalities in each group of 30 oysters (10 per tank, n 3x10 per treatment) were monitored for 9 days after infection. Controls reaching 100% survival appear hidden and merged behind the poly(I : C) primed line (green). Different letters next to the graphed lines indicate statistically significant difference among treatment at a-b, p-value b-c p- value< 0. 0001 (log-rank test, n 30). b. OsHV-1 DNA detection by quantitative PCR in 3 pools of 3 spats in the same experiment. Results are expressed as the mean number of DP gene copies detected per ng of genomic DNA extracted from whole spat pools. The effect of priming on OsHV-1 loads was determined using Kruskal-Wallis test (p-value Significant differences between treatments were performed compared to T0 using Mann-Whitney (n 3 pools of 3 oysters)(, p- value < 0. 1). 55 Poly(I : C) treatment fails to protect against a pathogenic bacteria Next, we tested whether this protection was specific to a viral infection. In a previous study we showed that injection of heat-killed bacteria did not protect against a subsequent viral infection suggesting that priming could be specific to virus protection30. To test this hypothesis, we performed the reverse experiment that is to say, priming with poly(I : C) before challenge with bacteria. But firstly, we tested the dose-dependency of poly(I : C) protection and established an optimal dose in monitoring protection efficiency from 1. 9 ng to 19 g of poly(I : C) per gram of oyster flesh (Supplementary Figure 1S). We showed that the protection efficiency was dependent on the quantity of poly(I : C) injected and was effective from a concentration of 0. 019 g. g-1 of oysters. We then used the maximal dose leading to the maximal survival rates (19g. g-1 of oysters) in all the experiments conducted herein. We primed oysters by injection with poly(I : C), or FSW as a control, 24h before challenging them either with an OsHV-1 inoculum or a control inoculum prepared from virus-free oysters or a lethal dose of the pathogenic Vibrio tasmaniensis LGP32 bacterial strain (Figure 2) 33. Results confirmed that poly(I : C) was efficient in protecting oyster against an OsHV-1 challenge with a 98% survival rate as opposed to FSW-challenged oysters demonstrating 74% survival. However, poly(I : C) failed to protect oysters against a bacterial infection demonstrating only 13% survival which was not significantly different from the FSW-primed oysters challenged by bacteria (24% survival) . Altogether these results showed that poly(I : C) priming failed to protect against that one specific bacterial strain and might suggest that poly(I : C) specifically triggers antiviral response and protection. Figure 2 : Poly(I : C) specifically protects against viral but not bacterial infection. KaplanMeier survival curves were generated from spats primed by injection after anesthesia with poly(I : C) (19g. g- 1 of oyster) or with filtered seawater as a control and injected 1 day post-priming with OsHV-1 var homogenate (1. 1 x 107 copies of DP gene per oyster) or OsHV-1-free control homogenate or Vibrio tasmaniensis LGP32 (7 x 107 UFC per oyster). One control conditions without injection is represented as non-treated (black line). Controls reaching 100% survival (poly(I : C) and FSW primed oysters challenged with the control inoculum) appear hidden and merged behind the non-treated control line. Mortalities in each group of 45 oysters (15 per tank) were monitored for 10 days after infection. a-b and b-c, p-value log-rank test (n 45). Poly(I : C) treatment triggers a long lasting antiviral protection also efficient during a naturally occurring disease outbreak In the previous experiments presented here, antiviral protection has been observed only 1 day after poly(I : C) injection. To test whether this observed protection could be long-lasting, we expanded the lapse time between prior poly(I : C) priming and OsHV-1 challenge. To this end, oyster spats were primed by injection either with poly(I : C) or FSW as a control and stored in a bio-secured nursery facility. To determine if the poly(I : C) was still protecting from OsHV-1 infection, oysters were regularly challenged by injection with an OsHV-1 inoculum prepared from the same batch of infected 56 oysters, at 1, 14, 28, 56 and 126 days after poly(I : C) treatment (see experimental scheme in Figure 3). Kaplan-Meier survival curves at all time points, showed that poly(I : C) was still efficient in protecting oysters from 24h to 126 days post-priming with consistent survival rates ranging from 89% to 96% (Figure 4). Figure 3 : Schematic representation of the experimental design used to test the duration of poly(I : C) priming and the efficiency in the environment. The same batch of oysters was anaesthetized before being injected with poly(I : C) or filtered seawater (FSW). Four priming experiments were performed at different times : at 126 days (priming A), 99 days (priming B), 71 days (priming C), 24h (priming D) before immersion in the Thau lagoon (Mediterranean Sea). For priming A, the antiviral effect of the treatment was tested at 1 day, 14 days, 28 days, 56 days or 126 days post-treatment in experimental infections with OsHV-1. Throughout all the experiments, a batch of oysters remained untreated as a control. During each experimental infection, mortalities were monitored daily post-challenge. During the environmental test, mortalities were monitored daily and sampling performed when mortalities occurred (9 and 14 days post- immersion). We then tested the efficiency of the poly(I : C) treatment in the Thau lagoon (Mediterranean Sea, France) affected by recurrent seasonal mortality events associated with OsHV-1. We deployed two distinct oyster cohorts twice in Thau lagoon in 2015 and 2016. In the first deployment, a first cohort of oysters were injected with poly(I : C) or non-treated as a control and then placed in the field before the disease outbreak (1 day after priming). Oysters primed with poly(I : C) had a 80% survival compared to control oysters which had 29% survival. Poly(I : C)-oysters had a 51% higher survival (Figure 5a). Since mortalities occurred only 30 days after immersion in the field and that survival rates were maintained for 119 days after immersion, it suggested that priming duration could be extending largely over 1 day and could be long-term. To confirm this efficiency in the field and the long-lasting effect of poly(I : C), we designed a second experiment. As a mirror to the duration experiment, we primed oysters at different lapse times before deploying them in the Thau lagoon on a second year (2016) (Figure 2). Using another cohort of specific pathogen-free oysters, we primed oysters by injection of poly(I : C) or filtered seawater as a control at 126 days, 99 days, 71 days and 1 day before challenge in the field (Figure 5). Mortality monitoring showed that poly(I : C) was still very efficient in protecting oysters against a natural infection with 83% to 92% survival (Figure 5b). The protection lasted until the end of the experiment, i. e. 156 days, more than 5 months after poly(I : C) initial exposition. In addition, in that second experiment, we quantified viral loads in oysters during the mortality outbreak (Figure 5c). Results show that viral loads were high in non-treated oysters reaching 2. 105 copies of DP and FSW-treated oysters reaching a mean of 3. 105 copies of DP gene. ng-1 of oyster gDNA. In contrast, poly(I : C)-treated oysters showed reduced viral loads however reaching a mean of 3. 104 copies of DP. ng-1 at 14 days post-immersion. Nonetheless, those results confirmed that poly(I : C) is able to trigger a long-lasting antiviral state in the environment enabling oysters to resist to the disease. The maintenance of this protection over time could either be a direct consequence of the early 57 Poly (I : C)FSW1d 14d 28d 56d 126dT0-A1d 14d 28d 56d 126d1d 14d 28d 56d 126d1d 14d 28d 56d 126dAnes-thesiaPoly (I : C)FSWT0-NTPriming A (-126 days)Non TreatedVirus challenge24h-48h-6dPriming C(-71 days)Priming D(-1 day)Poly (I : C)FSWPriming B (-99 days)9d-14dEnvironmentalchallenge Mortalitymonitoring(Fig. 4)MortalitymonitoringVirus loads(Fig. 5)Poly(I : C)FSW poly(I : C) treatment but also to the persisting presence of poly(I : C) in oysters. To address that issue, we tested poly(I : C) stability in seawater and in the oyster hemolymph (circulating fluid or blood equivalent, cell free fraction) by following its presence using the J2 antibody raised against dsRNA (Figure 6)28. Poly(I : C) appeared as a smear as its size ranges from 1. 5 kb to 8 kb. The J2 antibody allowed us to show that the smears observed were only due to the presence of poly(I : C), as negative controls (fluids without poly (I : C) and gDNA did not induce any signal. No signals were obtained when blotting without the primary antibody (Supplementary Figure 2S). If poly(I : C) seemed stable in sterile water for 2 days, results showed a rapid degradation of poly(I : C) in seawater as well as in the hemolymph with a signal totally extinguished between 24h (hemolymph) and 48h (seawater) after contact. Even if we can't exclude the persistence of poly( : C) in oyster cells, altogether these results confirmed that poly(I : C) priming is a long-lasting phenomenon, efficient in protecting oysters in the field. Figure 4 : Duration of poly(I : C) priming. KaplanMeier survival curves were generated from spats primed by injection after anesthesia with poly(I : C) (19g. g-1 of oyster) or with filtered seawater as control and injected 1 day (a), 14 days (b), 28 days (c), 56 days (d) or 126 days (e) post-priming A with OsHV-1 var homogenate (7. 7 x 106 and 4. 4 x 106 copies of DP gene per oyster, respectively) or a pathogen free control homogenate. One control conditions without injection is represented as non- treated (black line). Conditions demonstrating 100% survival rates can appear hidden and merged with other ones reaching the same survival rate. Mortalities in each group of 45 oysters (15 per tank) were monitored for 10 days after infection. a, b indicate p-value log-rank test (n 45). 58 Figure 5 : Poly(I : C) priming efficiency during a naturally occurring disease outbreak. a. Kaplan Meier survival curves were generated from spats primed by injection after anesthesia with 10 g of poly(I : C) per oyster (green line) 1 day before deployment in a coastal lagoon of the Mediterranean sea (Thau Lagoon, France) before a disease outbreak (April 2015). Animals without treatment are represented as non-treated control (black line). Mortalities in groups of 100 oysters were monitored for 119 days after deployment. Different letters next to the graphed lines indicate statistically significant difference among treatment at p-value test ; n 100). b. KaplanMeier survival curves were generated from spats primed after anesthesia with poly(I : C) (19g. g-1 of oyster) (green lines) or with filtered seawater as a control (FSW, red lines), 126 days (priming A), 99 days (priming B), 71 days (priming C) or 1 day (priming D) before deployment in the Thau Lagoon during a disease outbreak (June 2016). Animals without treatment are represented as non-treated control (black line). Mortalities in groups of 100 oysters were monitored for 30 days after deployment. Different letters next to the graphed lines indicate statistically significant difference among treatment at a-b p-value b-c p-value (log-rank test, n 100). c. OsHV-1 DNA detection on 2016 experiment, by quantitative PCR. Results are expressed as the mean number of DP copies detected per ng of genomic DNA extracted from whole spat pools at 9 and 14 days post immersion. The effect of priming on OsHV-1 var loads was determined using Kruskal-Wallis test. Statistical differences represent an increase of OsHV-1 loads compared to the loads at the beginning of the experiment (T0). Significant differences between treatments were performed using Mann-Whitney test (* p-value * p- value * p-value n 12 pools of 3 oysters for poly(I : C) and FSW treated oysters and n 3 pools of 3 oysters for non-treated oysters). 59 Figure 6 : Poly(I : C) persistence in seawater and oyster hemolymph Immuno-northern blotting using antibodies against double stranded RNA. Poly(I : C) was incubated for 0, 24h, 48h with sterile water (W), seawater (SW) or oyster plasma (P) (cell free hemolymph) and 1g of each sample separated in 1% agarose non-denaturing gel. A SmartLadder (MW-1700-02, Eurogentec) was used. Sterile water, seawater and plasma without addition of poly(I : C) were used as negative controls. After electrophoresis, (a) nucleic acids were stained using GelRed (image partially cropped) or (b) blotted onto a nylon membrane and immuno-localized using the J2 antibody (Scicons) (image partially cropped). For immune-blotting, 1g of C. gigas genomic DNA (gDNA) was added to the gel in place of the ladder, as a negative control. Full-length blots/gels are presented in Supplementary Figure 2S. 60 DISCUSSION In the present study, we characterized the extent of nucleic acid antiviral priming in the oyster. We demonstrated for the first time that nucleic acids of different structures (single or double stranded) or various lengths (from 300 bp to 8 kb) could all be efficient in inducing an antiviral state and able to reduce mortalities upon viral infection, ranging from 83% to 100% survival. In these trials, poly(I : C) HMW was the most efficient in mitigating oyster mortalities (100% survival). These results are in accordance with studies in vertebrates that provide evidence that the length of dsRNA drives distinct innate responses in different cell lineages and demonstrate that HMW poly(I : C) induces stronger antiviral response than LMW poly(I : C)34. If poly(I : C) was drastically reducing viral loads in infected oysters, viral loads and mortality rates did not seem to be clearly related for other nucleic acid tested. That discrepancy might be due to the fact that we did not obtain 100% protection rates for this priming experiment. Previous studies also showed variability in responses to dsRNA injection possibly due to variability in accurate administration, potential excretion or poor cellular uptake35, 36. The elevated viral loads observed might thus be due to sub-optimal injections (low doses or inefficient injections) and further sampling of infected oysters. In addition, we cannot exclude the hypothesis that oysters might, as in vertebrate systems, possess different pathways to recognize different nucleic acids inducing different antiviral responses and different kinetics of viral countermeasures. In mammals, innate immune sensing of nucleic acids represents the major antiviral defense mechanisms37. Nucleic acids and poly (I : C) have been described as effective viral PAMPs recognized by cytosolic or endosomal specific receptors (RIG-I-like receptors, Toll-like receptors, cGAS) as well as various nuclease systems 38-43. They participate in inducing type I IFN to restrict the propagation of foreign genetic material in ultimately interfering with virus assembly and protein translation, or in the induction of several types of cell death including apoptosis44, 45. In the oyster, in silico analyses of the C. gigas genome revealed the conservation of numerous nucleic acid receptors and components of the IFN pathway (TLRs, RIG-like receptors, PKR, Interferon Stimulated Genes) 30, 46-50. Moreover, previous studies revealed that poly(I : C) and dsRNA induce genes related to the mammalian IFN pathway 29, 31, 51- 53. These indications of structural or functional conservations of nucleic acid sensing pathways in the oyster could explain the potent activity of a broad range of nucleic acid46, 48, 54. In the light of recent studies, Crisan et al. (2016) have also hypothesized that damage-associated molecular patterns (as nucleic acids) might induce long-term effects on the innate immune system resulting in innate immune memory55, 56. We could then hypothesize that nucleic acids might have a similar capacity to that observed for certain microbes or ligands in priming the immune responses to remember a previous injury. Still, more studies are needed and are currently undergoing in our laboratory to unravel the molecular and cellular bases behind immune priming and the specificity of different nucleic acids recognition. The identification of the receptors, effectors, and signaling pathways behind these processes might not only contribute to the design of other antiviral strategies for virus control in invertebrates, but might also provide a better understanding of the conservation of the invertebrate innate antiviral system. Based on the demonstrated efficiency of HMW poly(I : C) antiviral priming, we further used this in vivo model of interaction to complete the characterization of the antiviral immune priming in the oyster. The use of poly(I : C) in place of a replicating virus allowed to analyze immune responses in a non-pathogenic context, in the absence of any interference that may occur via specific viral proteins. We originally showed that the viral load reduction (OsHV-1 DNA detection below quantification limits) due to poly(I : C) priming was related to a significant decrease in oyster mortalities when facing the OsHV-1 virus with an average survival rate of 95% (ranging from 100% to 78%) over experiments in laboratory conditions. In addition, we demonstrated for the first time that the priming effect was as efficient in experimental challenges using OsHV-1 as in the field when facing a naturally occurring disease outbreak. Priming with poly(I : C) indeed induced in the field, over two independent deployments during two successive years, an average survival rate of 88% (ranging from 80 to 93%). Once again, if viral loads remained low nine days after immersion in the field, we were able to detect virus DNA in primed oysters at 14 days after immersion, when the mortality rates were still low. This is probably due to heterogeneity in efficiency of poly(I : C) treatment and the fact that we tested a batch 61 of oysters that did not reached 100% survival and experienced from 8% to 17% mortality. In mammals, Poly(I : C) was also shown to be a good therapeutic agent against herpes simplex virus (HSV-2) that did not prevent viral infection but decreased disease 44. Interestingly, previous studies on the causative agents and etiology of the massive juvenile oyster mortalities revealed that the respective role of bacteria versus OsHV-1 was still unclear in this polymicrobial disease hampering development of effective prophylactic and therapeutic interventions57-59. Our results originally demonstrate that when the virus replication is impaired, disease does not occur which strengthens the hypothesis that the OsHV-1 virus plays a major role in triggering the disease19. However, additional studies will be required to decipher whether oysters actually die from a viral disease or from a secondary bacterial infection as demonstrated for vertebrate viral diseases. In these cases virus would act as a primary offender leading to dysfunctional innate immune response and enhanced susceptibility to bacterial infection 60, 61. We also investigated the specificity of poly(I : C) priming in the oyster. When challenged with a pathogenic bacterial strain, poly(I : C)-primed oyster survival did not exceed 13%. This result suggests that poly(I : C) would specifically induce an antiviral response. In invertebrates, a variety of studies have addressed the specificity of enhanced protections qualified as immune priming, and observed notable differences, from cross-reactivity (non-specific) 62 to highly specific 63, 64. The degree of specificity associated with this phenomenon is thus likely to be dependent on the pathogen and immune mechanisms involved. However, in the oyster, previous studies showed that C. gigas possesses distinct and specific antiviral and antibacterial responses 53, but also that priming with heat- killed bacteria wasn't efficient in protecting oysters against OsHV-130. Added to the fact that nucleic acid injection induces IFN-like pathways in vertebrates and invertebrates, not regulated following bacterial infection, it further suggests that the protection might be specific to an antiviral protection29- 31, 53. Nevertheless, future work should test challenging poly(I : C) (or other nucleic acid)- primed oysters with different pathogenic bacterial strains to generalize this statement and confirm whether it is a hallmark of oyster antiviral immune priming. Furthermore, we showed that poly(I : C) increased survival rates in a long-lasting way. Our results demonstrated for the first time that this protection could last for more than 5 months in laboratory and environmental conditions. In human tissues, poly(I : C) possesses a short half-life (4 hours) and is rapidly degraded likely due to endonuclease activities 24, 44, 65. In seawater or in the oyster's hemolymph, we showed that poly(I : C) persistence did not exceed 2 days 65. Likewise, Masood et al. observed in the oyster Saccostrea glomerata, that poly(I : C) detection in the hemocytes decreased significantly from 15h post-injection, also suggesting a short lifetime in oyster tissues 66. These data suggest that immune priming may not be due to a persistence of poly (I : C) in oyster tissues. Only a few studies have addressed the time course of innate immune priming and examined resistance at different time points after priming. In those studies, performed in various invertebrates including crustaceans, insects and even cnidarians, the improved response to the different pathogens was often shown to be short-lived and did not exceed 3 months 15, 67. In molluscs, duration was not explored over 56 days for B. glabrata/S. mansoni interactions16. In C. gigas, the duration limit was not explored over 54h for poly (I : C) stimulation and over 7 days for vibrio immune priming 22, 23, 30, 31, 68. In our case, the duration observed thus largely extended over the one observed in previous experiments using poly(I : C) and might even extend over that period since we did not test longer timespans. To our knowledge this is the first demonstration of such duration in a mollusc or invertebrate species. These results, added to the fact that primed oysters are still able to induce antiviral protection a long time after elimination of poly(I : C), are suggestive of the existence of innate immune memory mechanisms in the oyster. However, the notion of innate immune memory in invertebrate is an intense subject of debate. This notion has been introduced by Kurtz et al. (2003)4 in a phenomenological approach that wasn't supported by mechanistic analyses. Since then, numerous studies have tried to come up with a general definition of this phenomenon and attributed to invertebrate innate immune memory multiple mechanisms ; from the sensu stricto recalled response (where immune parameters have to return to a resting state) to sustained responses or even biphasic shifting responses69. In our case, we cannot exclude that oysters are experiencing either of these scenarios and further work are granted to find relevant priming markers to help understand the mechanisms involved in this antiviral protection. Finally, it is interesting to note that our data were obtained on different cohorts of naïve oysters tested at the same age, thus supporting the fact that the observed innate immune priming effect was not 62 due to a specific genetic background. Hence, these processes seem to be a general trait in oysters, even if we cannot exclude natural variations in priming capacities. Taking this trait into account would be of outmost importance in view of the therapeutic potential of innate immune priming. The possible use of immune priming has indeed been a subject of intense research to develop pseudo-vaccines to reduce infection in economically important invertebrates, notably in crustaceans to mitigate recurrent viral diseases15, 70, 71. The practical difficulties associated with vaccine administration and potential safety issues that should be considered for food sources underlie the need to further explore this new strategy of pathogen control. Regarding application potential, it is noteworthy that the observed protection by poly(I : C) was not relevant to the route of priming used11, 72, 73. When testing bathing oysters in poly(I : C), we obtained similar protection results as for injection (Supplementary Figure 3S). In conclusion, in the present study we demonstrate that antiviral immune priming processes are not restricted to arthropods and are also present in Lophotrochozoans, further highlighting the diversity of invertebrate immune processes. This model may provide better understanding of disease mechanisms underlying viral infections and could be used to explore novel antiviral strategies to help mitigate disease threats upon marine bivalves. Numerous questions are still emerging about characteristics of innate immune priming and more work is warranted to try and draw a comprehensive view of all these processes existing across phyla in regard to the diversity of interactions studies and multiplicity of mechanisms involved. To try and understand the nature and origin of these convergent or conserved innovations, a recurrent question is the molecular bases of immune priming and memory. Future studies should endeavour to investigate molecular bases of this phenomenon as well as its ecological and adaptive significance in oyster populations. MATERIALS & METHODS Experimental animals Experiments have been performed on specific pathogen -free (SPF) (i. e. free of mortality, negative for OsHV-1 detection and very low Vibrio sp. bacteria concentrations 74) juvenile C. gigas oysters (or Magallana gigas, Thunberg, 1793) (4-8 months old, less than one-year old) from the FINA Ifremer project and from the DECIPHER ANR program (ANR-14-CE19-0023). SPF oysters were produced following standardized protocols under sanitary controlled conditions at the Ifremer research facility of Argenton. These batches of oysters were chosen for their naive and pathogen-free character and were used indifferently, depending on their availability at the time of the experiments, independently of their genetic background. For reproducibility issues, oysters were always tested at comparative ages (4 months old), except for duration and field experiments where priming efficiencies were monitored until 8 months-old. Preparation of pathogens or control inoculums OsHV-1 inoculums (or virus homogenates) were prepared according to 75 from moribund oysters experimentally infected with OsHV-1 in previous trials and frozen at -80C. All inoculums used in the different experiments discussed in this study were prepared from the same batch of infected oysters to ensure reproducibility (except for experiment in supplementary files). Viral DNA loads (OsHV-1 var genomes copies. L-1) in inoculums were estimated by qPCR 19 and indicated for each experiment. Viral inoculums were confirmed to be free of cultivable bacteria by plating 40l on LB NaCl agar plates. Control inoculums (control homogenate) were prepared following the same protocol from healthy naïve oysters showing no detectable amount of viral DNA. Vibrio inoculum was prepared from Vibrio tasmaniensis LGP32 strain that was isolated from C. gigas undergoing a mortality episode 76. Vibrios were grown under agitation at 20C in Zobell medium for 24h. Cultures of V. tasmaniensis LGP32 were centrifuged (1000 x g, 10 min, 20C) and re-suspended two successive times in sterile seawater to an optical density (OD600) of 1 (1 x 109UFC/ml). 63 Priming solutions For priming experiment, the following nucleic acids were used : poly(I : C) HMW (Invivogen, cat. code : tlrl-pic), poly(I : C) LMW (Invivogen, cat. code : tlrl-picw), double stranded RNA GFP (GFP dsRNA), double stranded RNA OsHV-1 (OsHV1 dsRNA), single stranded RNA OsHV-1 (OsHV1 ssRNA). Poly(I : C) comprises long strands of inosine poly(I) homopolymer annealed to strands of cytidine poly(C) homopolymer. The average size of Poly(I : C) HMW is from 1. 5 kb to 8 kb and the average size of Poly(I : C) LMW is from 0. 2 kb to 1 kb. Poly(I : C) solutions were prepared following manufacturer instructions and diluted in sterile filtered (0. 02m) seawater to the desired concentration. Double stranded and single stranded RNAs were synthesized using the Ambion MEGAscriptRNAi kit (cat. #AM1626). To generate transcription template for both strands of the dsRNA, two separate PCRs with a single T7 promoter-containing PCR primer in each were performed. For OsHV-1 dsRNA and ssRNA, a 330 pb fragment targeting the ORF 87 genomic sequence (Genbank AN KF517121) was amplified using primers from 77 (with the T7 promoter appended to the 5' end of the primers) using cDNAs synthesized from RNA extracted fromOsHV-1 infected animals. For GFP dsRNA, a 692 bp fragment targeting the green fluorescent protein sequence was amplified using primers GFP-T7-F-GFP-T7-R-using the plasmid pJGFPH as a template. and Priming and challenge experiments For each experimental priming and challenge experiment, animals were previously anesthetized in hexahydrate MgCl2 (ACROS, cat. # 197530250, 50g. L-1, 100 oysters/liter) according to 78 for 4 to 10h. Oysters were injected using 26-gauge needle attached to a multi-dispensing hand pipette, either with 20L or 40L of the priming solution and 20l of the pathogen/control inoculums in the adductor muscle to spread into the circulatory system. Injection of sterile filtered seawater (FSW- in the same proportion used for nucleic acids resuspension) was used as a priming injection control. For all experimentations, a group of oysters were only anesthetized or non-treated as non-injected control. Non-treated oysters refer to oysters that were not primed, nor challenged in controlled conditions and not primed in the field experiment. For short term rearing ( oysters were replaced in seawater in plastic tanks at room temperature ; for long term rearing after priming (>24h), oysters were maintained at 141C and fed in a biosecure nursery facility at Ifremer's Aquaculture Research Facility in Palavas-les-Flots (Laboratoire Aquaculture en Languedoc-Roussillon, LALR, Southern France). All challenge experimentation were performed in 3 replicates with spats in 1L of seawater in plastic tanks regulated at 20 1C. In each tank, spats were separated in two groups ; one for mortality monitoring and one for sampling. Sampling consisted in individually removing shells of each oyster with a sterile scalpel blade and snap-froze the whole oyster in liquid nitrogen by pool of three animals. The oysters were stored at -80C before grinding to powder and nucleic acid purification. Mortality was followed daily and dead spats were removed from tanks and stored at -80C. Survival rate data were analyzed for statistical differences between treatments by log rank test on Kaplan-Meier survival curves. Figure 3 is depicting priming experiments 4 and 5. (1)Priming specificity studies : testing various nucleic acid injections Different nucleic acid were used (poly(I : C) HMW, poly(I : C) LMW, GFP dsRNA, OsHV1 dsRNA, OsHV1 ssRNA). For each condition, 270 spats of a susceptible oyster line (F15-Decipher project) were primed after anesthesia (6h) with 20L (5 g/oyster) different nucleic acids or with filtered seawater as a control. For each priming condition, 24h after priming, 135 spats were injected with 20l of OsHV-1 inoculum (8. 9 x 105 copies of DP gene. L-1) and 135 spats injected with control inoculums, excepted for anesthesia and non-treated conditions. (2)Poly(I : C) HMW dose effect Different doses of poly(I : C) HMW (19g, 1. 9g, 190ng, 19ng and 1. 9ng. g-1 of oyster) were injected to oysters after anesthesia. For each condition, 360 spats of a susceptible oyster line (F11-Decipher project) were primed with 40L of poly(I : C) HMW at different concentrations after anesthesia (5h) or injected with filtered seawater as a control. For each condition, 24h after priming, 180 spats were 64 injected with 20L of OsHV-1 inoculum (1. 1x106 copies of DP gene. L-1)and 180 spats injected with a control inoculums, excepted for anesthesia and non-treated conditions. (3)Poly(I : C) specificity of protection against Vibrio and virus For each condition, 300 spats from the same 01-2016 FINA cohort (Ifremer production)74 were injected after anesthesia (10h) with poly(I : C) HMW (19g. g-1 of oyster) or filtered seawater as a control. For each priming condition, 24h after priming, 100 spats were infected with OsHV-1 (5. 6x105 copies of DP gene. L-1), 100 spats with a control inoculums and 100 spats with V. tasmaniensis LGP32 (3. 5x106 UFC. L-1). (4)Duration of the poly(I : C) protection For each priming condition (figure 3), 1200 spats from the same 01-2016 FINA cohort (Ifremer production)74 were injected after anesthesia with poly(I : C) HMW(19 g. g-1 of oyster) and 1200 spats with filtered seawater as a control on the same day. At different time post-priming , i. e. 1, 14, 28, 56 or 126 days after priming, a group of oysters (120 spats) was infected with OsHV-1 (mean : 7. 4x105 copies of DP gene. L-1) or control inoculums (120 spats) to determine if the poly(I : C) was still protecting from OsHV-1 infection. (5)Efficiency and duration of the poly(I : C) protection in the environment A first experiment was performed in 2015. SPF oysters used are from the same 8-months old SPF 01- 2015 FINA cohort (Ifremer production). Four groups of 100 oysters were anesthetized in MgCl2 and injected with poly(I : C) HMW (10g per oyster) or non-treated as a control, 1 day before immersion in the Thau lagoon (4322'45. 1 N 334'16. 1 E, France). A second experiment was performed in 2016. SPF oysters from the 01-2016 FINA cohort (Ifremer production) were injected after anesthesia with poly(I : C) (19 g. g-1 of oyster) or filtered seawater as a control, 126, 99, 71 days or 24h (priming A to D, respectively, see figure 3) before deposition in the Thau lagoon (4322'45. 1 N 334'16. 1 E, France). Each condition was divided in two : one for sampling (72 spats) and one for mortality monitoring (100 spats). In parallel to immersion in the natural environment, for each priming times, laboratory infections with OsHV-1 var (2. 2 x 105 copies of DP gene. L-1) have been carried out following previous protocol. (6)Poly(I : C) protection through bath treatment After anesthesia, 20 oysters were exposed to two doses of poly(I : C) HMW (dose 1 was 0. 76g. mL-1 and dose was 0. 38g. mL-1) in 100 mL seawater baths for 2 and a half hours. Each treatment was performed in duplicate. After 2h30 of exposure, oysters were replaced in a 1L tank with fresh seawater for 24h. Each oyster group was then anaesthetized and divided in 2. Twenty oysters for each treatment, as well as non-treated oysters as a control, were injected with a viral homogenate containing OsHV-1 (3. 6x107 copies of DP gene per oyster) and the 20 others with a pathogen free control homogenate (0 copies of DP gene per oyster) and mortalities were monitored daily for 8 days. Nucleic acid purification Oyster pools were homogenised by bead-beading (Retsch, Mixer Mill MM400) with a stainless steel ball bearing and housing that had been pre-chilled with liquid nitrogen. Genomic DNA was purified from homogenised oyster tissues using the Macherey-Nagel Genomic DNA from tissue kit (cat. # 740952. 250) following manufacturer's instruction with an additional step of RNAseA treatment (Macherey-Nagel, cat. # 740505). The quality and quantity of genomic DNA was estimated on Nanodrop 2000 spectrophotometer (Thermoscientific). Total DNA was resuspended to a final concentration of 20 ng. l-1 prior to quantitative PCR. Viral detection and quantification Detection and quantification of OsHV-1 DNA was performed using quantitative PCR (qPCR). All amplification reactions were performed in duplicate using a Roche LightCycler 480 Real-Time thermocycler (qPHD-Montpellier GenomiX platform, Montpellier University). PCR reaction volumes were 6 l containing LightCycler 480 SYBR Green I Master mix (Roche), 100 nM of pathogen specific primers and 20 ng of DNA using an initial denaturation (95C for 10 min) followed by 40 65 cycles of denaturation (95C, 10s), hybridization (60C, 20s) and elongation step (72C, 25s). Virus specific primer pairs targeting a region of the OsHV-1 genome, predicted to encode a DNA polymerase catalytic subunit (DP) were chosen as previously described (ORF100, nucleotides 147655153291 of AY509253) : OsHVDPFor- ATTGATGATGTGGATAATCTGTG/ OsHVDPRev- GGTAAATACCATTGGTCTTGTTCC) 79, 80. For absolute quantification, DP amplification products were cloned into the pCR4-Topo vector and replicated in Escherichia coli DH5a (Invitrogen). Plasmids were extracted using the Wizard Plus SV miniprep DNA purification system (Promega) and standard curves of known concentration of plasmid generated according to the Applied Biosystems manual of absolute real-time RT-PCR quantification. Absolute quantification of OsHV-1 genome copies in oyster samples was then estimated by comparing the observed crossing point (Cp) values to known plasmid standards from 103 to 109 copies of DP. The effect of priming on OsHV-1 var load was determined using Kruskal-Wallis test (p using the computer software package, GraphPad Prism v. 6. 0. Mann Whitney test was used to compare rank of means if significant differences were found (p Immuno-northern-blotting for Poly(I : C) persistence assay 20g of poly(I : C) was diluted in 500L of filtered seawater (0. 02m) or filtered hemolymph (0. 2m extracted from a pool of 13 oysters) or sterile RNase-DNAse free water as a control and incubated at 17C. Each condition was sampled at time 0h, 24h, 48h and 4 days. Presence of poly(I : C) in each sample was first monitored by gel electrophoresis on a 1% agarose in Tris-acetate-EDTA 1X gel. 20L of each sample (1g of poly(I : C) and 5l of ladder (SmartLadder MW-1700-02, Eurogentec) was electrophoresed during 2 hours at 4C and 50V ; nucleic acid presence was revealed by GelRed nucleic acid stain (Biotium) for 10 min. Gel image was taken using the Molecular Imager Gel Doc XR system (Bio-Rad) and the Quantity One Software Version 4. 6. 3 (Bio-Rad) after 4 seconds of exposition. Presence of poly (I : C) was secondly revealed by immuno-northern-blotting using the J2 antibody (Scicons) specific to dsRNA28, based on the DIG DNA labeling and detection kit protocol from Roche (cat. No. 11093657910). A total of 20L of each sample, 1g of C. gigas genomic DNA and 2 additional lanes deposited with 1g of poly(I : C) were deposited on a non-denaturating 1% agarose TAE gel and electrophoresed for 2h at 50V and 4C. Gel was blotted onto an Hybond-N nylon membrane (GE Healthcare) by semidry electroblotting in 1X TAE buffer for 45 min (appligene vacuum blotter, 50mbar) before UV crosslinking using the spectrolinker (spectronics corporation- optimal crosslink at 120000J/cm2). The membrane was blocked with a blocking solution containing 10% blocking reagent (Roche Diagnostics) in maleic acid buffer (0. 1Maleic acid, 0. 15M NaCl, pH7. 5) for 30 min at room temperature (RT) and then cut in two. The first part was incubated with the primary antibody (J2-scicons) diluted at 1 : 600 in blocking solution for 1h at RT. The second one with the 2 additional poly(I : C) lanes was not incubated with the J2 primary antibody and then treated the same way as the first membrane. After washing twice with washing buffer (0. 1Maleic acid, 0. 15M NaCl, pH7. 5- 0. 3% (v/v) tween 20) for 15 min at RT, membranes were incubated with appropriate AP-conjugated secondary antibody (Goat anti-mouse, SIGMA#A0162) diluted 1 : 5000 in blocking solution. After washing, color revelation was performed by incubating the membrane in color substrate solution (2% NBT/BCIP stock solution (Roche Cat. No. 11681451001) diluted in a detection buffer composed of 0. 1M Tris-HCl-0. 1M NaCl, pH 9. 5) in the dark. Membranes were scanned to TIFF files using the Ilssemoquentdenous Version 10 (Max) with no contrast modifications. 66 Acknowledgements C. M. and M. L. are grateful to A. Pérignon and D. Regler from the Comité Régional de Conchyliculture de Méditerranée and E. Gervasoni from the Cepralmar for their support throughout the project and help on the field. C. M. is very grateful to Delphine Destoumieux-Garzon for team leadership and continuous support. The authors wish to thank P. Haffner, A. Delort, M. Leroy and the IHPE MIMM team for laboratory assistance and help during the multiple injection trials. We thank M. Eychenne for pJGFPH plasmid. The authors acknowledge the use of the facilities of the experimental platform of the Ifremer Palavas Station ; the Ifremer nursery team in Bouin (France) ; the FINA Ifremer program and the DECIPHER project (ANR-14-CE19-0023) for SPF oyster production. C. M. and M. L. would like to thank Jean-Michel Escoubas, Yannick Labreuche, T. J. Green and Arnaud Huvet for manuscript improvements. M. L. was supported by grant from the Perpignan University (UPVD) and Ifremer. This work was part of the PROVIGAS project (Protection antivirale de l'hutre Crassostrea gigas - antiviral protection of the Pacific oyster) financially supported by la région Occitanie/ Pyrénées-Méditerranée (project call Chercheuse(r) d'avenir 2013) and Ifremer. Author contributions statement Conceptualization, C. M. , M. L. ; Writing original draft, C. M. , M. L. ; Writing corrections C. M. , M. L. , B. G. , M. P. , A. S. ; Sample treatments C. M. , M. L. , A. V. Production of biologic material, B. P. ; Biostatistics treatment, M. L. ; M. L. supervision, C. M. , B. G. All authors read and approved the final manuscript. Competing interests All authors concur to declare that there are no professional or personal competing interests regarding this original work. Additional information Competing financial interests : All authors concur to declare that there are no financial competing interests regarding this original work. 67 Additional-supplementary files Supplementary figure 1 S : Poly(I : C) specifically protects against viral infection in a dose dependent manner KaplanMeier survival curves generated from spats primed by injection with poly(I : C) HMW at different doses (19g, 1. 9g, 0. 19g, 0. 019g or 0. 0019g per g of oyster) and injected 1 day post- priming with OsHV-1 var homogenate (2. 3 x 107 copies of DP per oyster). Priming with sterile filtered seawater (FSW) or poly(I : C) (19g per gram of oyster) before challenge with control inoculums was used as control (lines are hidden behind non-treated control). Mortalities were monitored for each treatment group comprising 45 oysters (15 per tank) for 10 days after infection. Different letters next to the graphed lines indicate statistically significant difference among treatment with a-b corresponding to p-value b-c to p-value c-d to p-value d-e to p-value (log-rank test, n 45). 68 Supplementary figure 2S : Immuno-northern-blotting for Poly(I : C) persistence assay a. Uncropped image of Poly(I : C) electrophoresis referencing to Figure 6a. b. Uncropped image of poly(I : C) immuno-localized using the J2 antibody (Scicons) referencing to Figure6b. c. Uncropped image of control membrane for immune-northern-blotting : 2 lanes loaded with 1g of poly(I : C) were separated on 1% TAE agarose gel and blotted onto the same membrane. Membrane was cut in two and one part (Figure 6b and supplementary Figure 2sb) was treated with the J2 antibody whereas for the other part (supplementary Figure 2Sc) was only treated with the secondary antibody. b. a. c. 69 Supplementary figure 3S : Poly(I : C) protection through bath treatment KaplanMeier survival curves were generated from spats exposed after anesthesia to two different poly(I : C) bath treatments (1) 76g. mL-1, solid green and blue lines or (1/2) 38g. mL-1, dotted green and blue lines) or only anesthetized as control (red and grey lines) during 2h30. Twenty four hours after treatment, oysters were injected with OsHV-1 homogenate (3. 6x107 copies of DP gene per oyster ; solid green, dotted green and red line) or with a pathogen free control homogenate (0 copies of DP gene per oyster ; solid blue, dotted blue and grey line). Mortalities in groups of 20 oysters per treatment were monitored for 8 days after injection. Different letters next to the graphed lines indicate statistically significant difference among treatment at p-value (log-rank test ; n 20). 70 References Criscitiello, M. F. & de Figueiredo, P. Fifty shades of immune defense. PLoS Pathog 9, e1003110 (2013). Kurtz, J. Memory in the innate and adaptive immune systems. Microbes Infect 6, 1410-1417 (2004). Sadd, B. M. & Schmid-Hempel, P. Insect immunity shows specificity in protection upon secondary pathogen exposure. Curr Biol 16, 1206-1210 (2006). Kurtz, J. & Franz, K. Innate defence : evidence for memory in invertebrate immunity. Nature 425, 37-38 (2003). Rodrigues, J. , Brayner, F. A. , Alves, L. C. , Dixit, R. & Barillas-Mury, C. Hemocyte differentiation mediates innate immune memory in Anopheles gambiae mosquitoes. Science 329, 1353-1355 (2010). Cooper, E. L. , Rinkevich, B. , Uhlenbruck, G. & Valembois, P. Invertebrate immunity : another viewpoint. Scand J Immunol 35, 247-266 (1992). Portela, J. et al. 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Synthèse des résultats et conclusions Nous avons étudié le priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas avec une approche phénoménologique pour en définir les limites en terme d'impact sur la survie à OsHV-1, de spécificité et de durée, pour répondre à différentes questions : Questions (i) et (ii) : Le poly(I : C) protège-t-il des mortalités virales et est-ce que cette protection est spécifiquement induite par le poly(I : C) ? Oui, l'injection de poly(I : C) 24h avant une infection virale à l'OsHV-1 protège des mortalités. Cependant, d'autres types d'acides nucléiques sont capables d'induire cet effet protecteur. Ces différents acides nucléiques sont : (i) du poly(I : C) à haut poids moléculaire (poly(I : C) HMW ; 1. 5-8kb) ; (ii) du poly(I : C) à bas poids moléculaire ( ; (iii) de l'ARN double brin synthétique dessiné sur la GFP ; (iv) ou sur l'OsHV-1 et (v) de l'ARN simple brin dessiné sur l'OsHV-1. L'injection de ces différents types d'acides nucléiques 24h avant l'infection virale permettait de protéger les hutres des mortalités, allant de 100% à 78% de survie, le poly(I : C) HMW étant le plus efficace. Par ailleurs, l'analyse de la charge virale chez ces animaux stimulés avec les différents acides nucléiques a permis de confirmer les résultats précédents d'une charge virale réduite chez les stimulés par rapport à ceux non stimulés. Question (iii) : Est-ce que le poly(I : C) protège uniquement du virus OsHV-1 ? Le poly(I : C) protège des virus dont l'OsHV-1, mais ne protège pas face à une infection bactérienne par Vibrio tasmaniensis LGP32. Cette observation suggère un degré de spécificité de protection antivirale. Cependant à la lumière des travaux réalisés chez d'autres invertébrés montrant des degrés divers de spécificité et de protection croisées, nos résultats nécessiteraient d'être validés en testant l'effet de la stimulation du poly(I : C) lors d'infections par d'autres souches bactériennes pathogènes d'hutres. Question (iv) : Le poly(I : C) est-il efficace pour protéger les hutres pendant un épisode de surmortalité massive affectant les juvéniles en milieu naturel ? Oui, l'injection de poly(I : C) à des juvéniles d'hutres avant d'être déposés en milieu naturel au milieu de parcs ostréicoles, a permis d'améliorer le taux de survie de 62% en moyenne, avec en moyenne 89. 5% des hutres stimulées avec du poly(I : C) survivantes 30 jours après la mise en eau contre seulement 27. 5% en moyenne pour les hutres non stimulées. 75 Question (v) : Quelle est la durée de la protection induite par le poly(I : C) ? Une durée minimale de 5 mois. Des hutres ayant reçu une injection unique de poly(I : C) entre 24h et 126 jours (environ 4 mois) avant (i) des infections virales à l'OsHv-1 réalisées au laboratoire ou (ii) déployées dans le milieu naturel, ont permis de montrer un effet protecteur du poly(I : C). Pour les hutres infectées en milieu contrôlé, les tests n'ont pas été réalisés au-delà de 126 jours, et en milieu naturel, les hutres étaient encore protégées 1 mois après la mise en eau soit 5 mois après l'injection de poly(I : C). Cette protection ne proviendrait pas d'une stimulation continue du poly(I : C) puisque nous avons démontré par marquage anticorps que le poly(I : C) était rapidement dégradé, entre 24h dans l'hémolymphe et 48h dans l'eau de mer. Toutefois, il sera nécessaire de tester la stabilité du poly(I : C) au sein des tissus de l'hutre. En conclusion, ces résultats identifiés grâce à notre modèle et l'utilisation du poly(I : C) à haut poids moléculaire comme stimulant ont permis de mieux caractériser le phénomène de protection antivirale chez l'hutre creuse Crassostrea gigas. Le poly(I : C) protège des mortalités lors d'infections virales à l'OsHV-1 mais est inefficace contre une bactérie pathogène (introduisant la notion de spécificité). La stimulation protège sur le long terme et suggère une forme de mémoire immunitaire. L'ensemble de ces résultats démontre l'existence d'un priming immunitaire antiviral chez C. gigas. Par ailleurs, ce modèle poly(I : C)/C. gigas, peut fournir un très bon outil dans la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents au priming immunitaire antiviral. 76 IV. Données complémentaires A. Le priming immunitaire antibactérien Dans le contexte de cette maladie poly-microbienne, nous avons montré un priming immunitaire antiviral efficace pour protéger les hutres d'infections virales. Cependant, dans cette maladie poly-microbienne, l'hutre est soumise à différentes populations bactériennes au cours de sa vie, dont certaines sont pathogènes (LeRoux et al. 2015, Bruto et al. 2017). Des travaux récents réalisés chez l'hutre ont permis de révéler l'existence d'un priming immunitaire antibactérien lors de stimulations des hutres avec des bactéries du genre Vibrio, du clade Splendidus (Zhang et al. 2014, Liu et al. 2016, Li et al. 2017a). Ces travaux se sont focalisés sur les réponses cellulaires de l'hutre mise en place au cours de ce priming mais ne se sont pas intéressés à l'effet de cette primo- stimulation en termes de survie lors de la seconde infection. C'est un aspect que nous avons abordé au cours de ma thèse au travers de travaux préliminaires. Pour identifier si le priming immunitaire antibactérien est efficace pour protéger des mortalités lors d'infections bactériennes, nous avons injecté 135 naissains standardisés de l'Ifremer de la cohorte 2015 1 avec chacune 50l d'eau de mer contenant 1. 88x108 CFU de Vibrio tasmaniensis LGP32 (Gay et al. 2004) tués à la chaleur (90C, 10min) (LGP32 HK). Cette solution a été contrôlée comme dépourvue de bactéries vivantes par étalement de 50l de cette solution sur milieu LB NaCl. Comme contrôle de primo-stimulation, 135 hutres ont été injectées avec le même volume d'eau de mer autoclavée et filtrée à 0. 2 m (FSW). Vingt-quatre heures après cette primo stimulation, nous avons infecté ces différentes hutres, soit avec un inoculum viral enrichi en OsHV-1 (1. 43x108 unités génomiques / hutres) (Schikorski et al. 2011b), soit avec 1. 88x108 CFU/hutre de Vibrio tasmaniensis LGP32, soit avec de l'eau de mer autoclavée et filtrée à 0. 2m comme contrôle négatif d'infection. Chaque condition de traitement a été réalisée en trois réplicas en déposant 15 hutres dans des bacs contenant 800ml d'eau de mer filtrée. Un suivi de mortalité quotidien a été réalisé pendant 15 jours (Figure 15) et les hutres mortes ont été retirées des bacs d'infection. 77 Figure 15 : Effet du priming bactérien sur la survie des hutres lors d'infections bactériennes. Courbe de survie d'hutres injectées avec de l'eau de mer autoclavée et filtrée à 0. 2m (FSW, courbes pleines) ou avec 1. 88x108 CFU/hutre de Vibrio tasmaniensis LGP32 tués à la chaleur (LGP32 HK, courbes pointillées), puis injectées 24h après par 1. 43x108 copies de virus OsHV-1/hutre (vert) ou par 1. 88x108 CFU/hutre de Vibrio tasmaniensis LGP32 (rouge) ou avec de l'eau de mer autoclavée et filtrée à 0. 2m (bleu). Test de log-rank ; p-value 0. 0013 ; n 45. Concernant les infections bactériennes, le taux de survie des hutres non stimulées avec les bactéries tuées (i. e. FSW LGP32) est faible, avec 6. 7% de survie 15 jours après l'infection (courbe pleine, rouge). En revanche, chez les hutres primo-stimulées avec les bactéries tuées (courbe pointillée, rouge) bien que le taux de survie final soit similaire à la condition contrôle 8. 9% de survie à 15 jours, la cinétique de la courbe de survie est différente. En effet, durant les 4 premiers jours d'infection, le taux de survie est amélioré de 20% chez les hutres stimulées avec les bactéries tuées par rapport aux hutres de la condition contrôle. Cette protection diminue ensuite pour finalement atteindre à 15 jours le même taux de survie que les hutres non stimulées. Ces résultats préliminaires montrent pour la première fois que la stimulation d'hutres par des bactéries tuées ne permet pas de protéger des mortalités aux doses utilisées dans le contexte de notre étude. Il est possible que cete inefficacité soit due à la durée entre la stimulation et l'infection qui pourrait ne pas avoir permis une réponse immunitaire efficace et adaptée en 24h. Cependant, nos résultats suggèrent pour la première fois que cette primo stimulation des hutres par Vibrio tasmaniensis LGP32 permet de ralentir significativement la cinétique d'infection d'au moins 4 jours lors d'infections bactériennes. Plusieurs hypothèses peuvent être émises par rapport à cette observation. Nous pouvons émettre comme première hypothèse que le délai entre la primo-stimulation et l'infection était trop court pour permettre une activation efficace des mécanismes impliqués dans le priming immunitaire. Dans ce cas, il serait intéressant de répéter cette expérimentation avec des délais plus importants entre la 78 051015050100Days post-infectionPercent survivalFSWLGP32 HKLGP32 HKFSWLGP32 HK FSW OsHV-1 LGP32 primo-stimulation et l'infection. Par ailleurs, nous pouvons émettre comme hypothèse que l'injection de bactéries tuées dans les hutres puisse saturer les récepteurs hémocytaires et ainsi ralentir le processus infectieux lors de l'injection des bactéries V. tasmaniensis LGP32 virulentes. Des d'études réalisées par d'autres auteurs sur le priming immunitaire antibactérien chez l'hutre (Liu et al. 2016) suggèrent l'implication de la superoxide dismutase extracellulaire (EcSOD) dans les mécanismes de priming immunitaire. Cependant, il est difficile de pouvoir comparer leurs observations avec nos résultats puisque la souche bactérienne qu'ils ont utilisée dans leurs expérimentations est un Vibrio splendidus identifié chez le pétoncle Patinopecten yessoensis dont l'effet sur l'hutre est encore inconnu (Liu et al. 2013a). Ensuite, nous pouvons émettre comme hypothèse que les mécanismes de la phagocytose pourrait être saturés par les bactéries tuées primo-injectées et ainsi les V. tasmaniensis LGP32 virulentes ne pourraient plus entrer dans les hémocytes et exercer leur pouvoir pathogène (Duperthuy et al. 2011, Vanhove et al. 2016). Concernant cette hypothèse, d'autres travaux réalisés sur le priming immunitaire antibactérien chez l'hutre ont suggéré un rôle important de l'augmentation de l'activité de phagocytose dans ce phénomène (Zhang et al. 2014). Ces observations ont été d'ailleurs soutenues par des travaux montrant une augmentation de l'hématopoïèse suite à une primo-stimulation par des bactéries tuées (Li et al. 2017a). Ces résultats pourraient aller dans le sens de notre hypothèse impliquant le rôle de la phagocytose dans cette protection transitoire. D'une part, pour confirmer l'hypothèse que les mécanismes de phagocytose sont saturés par les bactéries injectées lors de la primo-stimulation, les contenus hémocytaires pourraient être analysés. Pour cela il pourrait être envisagé de stimuler des hutres avec Vibrio tasmaniensis LPG32 tués à la chaleur alors que d'autres hutres seraient non stimulées. Vingt-quatre heures après, l'ensemble de ces hutres seraient infectées avec la souche Vibrio tasmaniensis LGP32 porteuse d'un plasmide exprimant la GFP. A partir des hémocytes prélevés dans ces différentes conditions, si la phagocytose est saturée par les bactéries tuées primo-injectées, il y aurait très peu de bactéries GFP phagocytées et par mesure de fluorescence, nous pourrions conclure si ce phénomène est impliqué ou non. De plus, pour confirmer cette hypothèse, il serait alors intéressant de pouvoir bloquer ce mécanisme de phagocytose via l'utilisation de billes de latex pour ainsi confirmer le rôle de la phagocytose in vivo. Concernant les infections virales, notre expérimentation nous a permis de montrer un taux de survie important de 84. 4% 15 jours après l'infection chez les hutres primo-injectées avec l'eau de mer puis infectées avec l'OsHV-1 (courbe pleine verte). En revanche, chez les hutres primo-stimulées avec les bactéries V. tasmaniensis LGP32 tuées à la chaleur (courbe pointillée verte), il n'y a pas de protection croisée, au contraire les mortalités sont aggravées avec 53. 3% de survie 15 jours après les infections. Des résultats obtenus récemment au laboratoire ainsi que des données de la littérature 79 suggèrent qu'il existe des réponses antivirales et antibactériennes bien distinctes mais dont les bases cellulaires, mécanismes d'activation voire de différenciation restent à établir (Zhang et al. 2015, Green et al. 2016b). Il se pourrait donc que dans notre étude, l'exposition préalable de l'hutre à une bactérie pourrait induire une réponse spécifique antibactérienne lors du priming et empêcher l'hôte de mobiliser une réponse antivirale efficace lors de la rencontre avec le virus. Afin de pouvoir confirmer cette hypothèse, il serait important de pouvoir confirmer ces résultats dans un premier temps et de pouvoir comparer par une approche globale, les réponses immunitaires d'hutres dans un contexte d'infection bactérienne ou virale. L'approche transcriptomique globale par RNA-seq réalisée dans le cadre de la thèse de Tristan Rubio (Thèse de Doctorat de Tristan Rubio, 2014-2017) lors d'infection bactérienne combinée à nos travaux réalisés sur l'étude des mécanismes du priming immunitaire lors d'une infection virale (cf Chapitre 1, Article 1) pourraient permettre de comprendre si l'immunité antibactérienne se met en place au détriment de l'immunité antivirale. B. Le priming immunitaire trans-générationnel Les travaux présentés dans l'article 1 (cf Chapitre 1, Article 1) ont permis de montrer l'existence d'un priming immunitaire antiviral efficace à l'échelle de l'individu sur le long terme. Afin d'aller plus loin dans l'étude de ce priming immunitaire antiviral, Green et collaborateurs en 2016 se sont intéressés au priming trans-générationnel chez l'hutre (Green et al. 2016a). Ces travaux ont permis de montrer que la stimulation de géniteurs par le poly(I : C) 3 jours avant la reproduction permettait d'améliorer le taux de survie des larves D âgées de 24h lors d'infections virales à l'OsHV-1, pour une durée minimale de 96 heures (59. 7% de survie en moyenne) par rapport à des larves issues de géniteurs non stimulées (18. 9% de survie en moyenne). Ces résultats extrêmement encourageants notamment en termes d'application potentielle pour la profession ostréicole ont cependant soulevé différentes questions fondamentales sur l'origine de cette protection. Différentes études réalisées chez les invertébrés étudiant le priming immunitaire trans-générationnel (TGIP) ont montré que ce transfert vertical d'immunité pouvait être d'origine maternelle ou paternelle suivant les espèces (Roth et al. 2010, Zanchi et al. 2011). Dans le cadre de cette thèse, j'ai eu la chance d'obtenir une bourse de financement de 3 mois, qui m'a permis d'aller étudier ces questions avec le Dr Green et le Pr David Raftos au Sydney Institut of Marine Science. Les résultats préliminaires obtenus au cours de cette mission en Australie sont présentés ci-après. Nos travaux se sont dans un premier temps intéressés à définir si la période de stimulation des géniteurs avant les reproductions pouvait influencer cette protection. Pour aborder cette question, nous avons injecté un lot d'hutre, composé de 3 mâles et 6 femelles, avec du poly(I : C) 3 jours avant les reproductions (Figure 16 B). Un deuxième lot de géniteurs composé de 2 femelles et 80 de 6 mâles a été injectés avec du poly(I : C) 10 jours avant les reproductions (Figure 16 C). Comme contrôle négatif de stimulation, un dernier lot de 4 femelles et 5 mâles a été injecté avec de l'eau de mer 3 jours avant les reproductions (Figure 16 A). L'ensemble de ces expérimentations ont été coordonnées pour pouvoir réaliser les reproductions le même jour. Vingt-quatre heures après ces reproductions, les larves issues de chaque famille d'hutre provenant des géniteurs stimulés avec du poly(I : C) 3 jours avant, 10 jours avant ou contrôles ont été divisées en deux lots distincts. Un lot a été infecté par le virus OsHV-1 par ajout d'une solution infectieuse contenant l'OsHV-1 dans l'eau d'élevage larvaire d'après le protocole de Green et collaborateurs en 2016 (Green et al. 2016a). Le second lot a servi de contrôle négatif et n'a pas été infecté (NC). Le taux de mortalité larvaire a été suivi quotidiennement pendant 2 jours dans l'ensemble de ces bassins d'élevages larvaires (Figure 16 D). Les suivis de taux de mortalité chez les différentes familles larvaires non infectées (Figure 16 D, NC) montrent un faible taux de mortalité entre 8% et 15% en moyenne pour toutes les conditions. Lors d'infections avec le virus OsHV-1 (Figure 16 D, OsHV-1), 2 jours après l'infection, chez les larves provenant de géniteurs non stimulés (Figure 16 D, OsHV-1, histogramme vert), le taux de mortalité est plus élevé avec 45% de mortalité en moyenne. Chez les larves provenant de géniteurs stimulés au poly(I : C) 3 jours avant les reproductions, le taux de mortalité est plus faible, similaire aux larves non infectées avec 14% de mortalité en moyenne (Figure 16 D, OsHV-1, histogramme rouge). En revanche, chez les larves provenant de géniteurs stimulées au poly(I : C) 10 jours avant les reproductions (Figure 16 D, OsHV-1, histogramme bleu), les larves ne sont pas protégées, le taux de mortalité est similaire à celui des larves provenant de géniteurs non traités (37% de mortalité en moyenne). 81 Figure 16 : Etude de la durée de la stimulation de géniteurs avant la reproduction pour le priming trans-générationnel. Schéma du design expérimental (A, B et C) et pourcentage de mortalité cumulé de larves lors d'infection à l'OsHV-1 (D). Le diagramme A représente les couples d'hutres mâles et femelles injectés avec de l'eau de mer stérile 3 jours avant les reproduction et les diagrammes B et C, les couples d'hutres injectées avec du poly(I : C) 3 jours avant les reproductions (B) ou 10 jours avant les reproductions (C). Les histogrammes correspondent au taux de mortalité cumulé, 2 jours après infection des larves âgées de 24h, issues de des différentes reproductions, avec le virus OsHV-1 ou non infectées (NC) (D). One-way Anova (p-value Ces résultats préliminaires confirment les résultats préalablement publiés chez l'hutre, l'injection de poly(I : C) à des géniteurs 3 jours avant les reproductions permet de protéger la descendance larvaire âgée de 24h, contre des infections virales à l'OsHV-1 (Green et al. 2016a). Cependant, nos résultats suggèrent que cette protection transmise à la descendance est dépendante de la durée entre la stimulation avec le poly(I : C) et la reproduction. Si la stimulation des géniteurs est trop éloignée dans le temps des reproductions et donc des infections, les larves ne sont plus protégées. Nos résultats préliminaires tendent à montrer une protection transmise qui serait transitoire. Ces résultats préliminaires sont les premiers à ma connaissance suggérant la notion de dépendance du moment de la stimulation des géniteurs. Les travaux de Green et ses collaborateurs 82 en 2016 posaient la question des mécanismes sous-jacents à cette protection transmise à la descendance (Green et al. 2016a). Cette protection provient-elle d'une reprogrammation épigénétique lors de la primo-stimulation comme cela est suggéré dans quelques études sur d'autres modèles (Ottaviani et al. 2013, Norouzitallab et al. 2016, Vilcinskas 2016, Mukherjee et al. 2017) ? Cette hypothèse reste encore à être explorée, puisque très peu de données concernant le rôle de reprogrammations épigénétiques dans les mécanismes participant au TGIP sont disponibles. La deuxième hypothèse qui pourrait-être émise serait une transmission directe par la mère. Chez d'autres organismes, des travaux ont montré cette transmission via des composants immunitaires comme des peptides antimicrobiens comme c'est le cas chez le poisson (Zhang et al. 2013a), de différents PAMPS bactériens comme des LPS, peptidoglycanes ou zymosan directement dans l'œuf chez l'abeille Apis mellifera (Salmela et al. 2015). Nous avons abordés cette hypothèse pour définir si la protection pouvait provenir de la mère et /ou du père. Dans un second temps nos travaux ont donc porté sur visés à comprendre si dans le modèle hutre, l'approvisionnement de la protection est d'origine maternelle et/ou paternelle, nous avons réalisé des expérimentations au cours desquelles des hutres femelles ou des hutres mâles ont été stimulées avec du poly(I : C). Pour déterminer l'effet de la stimulation maternelle, nous avons réalisé différentes familles d'hutres à partir de reproductions entre des hutres femelles injectées avec de l'eau de mer comme contrôles ou stimulées par le poly(I : C) 3 jours avant la reproduction, avec un seul mâle injecté avec de l'eau de mer (Figure 17 a). L'inverse a été réalisé pour étudier l'effet de la stimulation paternelle (Figure 17 a). Nous avons ainsi obtenu 17 familles d'hutres ; 4 familles provenant de mères stimulées au poly(I : C) et 4 familles provenant de mère non stimulées ainsi que 4 familles provenant de pères stimulés au poly(I : C) et 5 familles de pères non stimulés (Figure 17 a). Vingt-quatre heures après les reproductions, une partie des larves D (âgées de 24h) provenant des différentes familles ont été infectées avec le virus OsHV-1 par ajout d'une solution infectieuse contenant l'OsHV-1 dans l'eau d'élevage larvaire. L'autre partie des larves servant de contrôle n'a pas été infectée (NC) (Figure 17 b et c). Le suivi de mortalité larvaire a été réalisé quotidiennement pendant 2 jours dont le taux de mortalité est présenté dans la figure 17 b pour l'effet maternel et la figure 17 c pour l'effet paternel. 83 Figure 17 : Etude de l'origine maternelle ou paternelle du priming trans-générationnel. Design expérimental (a) et pourcentage de mortalité cumulé de larves d'hutres lors d'infections à l'OsHV-1 (b et c). Le diagramme (a) représente les couples d'hutres réalisés pour déterminer une provision maternelle ou paternelle au priming immunitaire antiviral trans-générationnel. Pour déterminer la provision maternelle (maternal effects) des hutres femelles ont été injectées avec du poly(I : C) (poly(I : C)-primed) ou de l'eau de mer stérile (seawater-primed) et reproduites avec un seul mâle injecté avec de l'eau de mer. Pour déterminer la provision paternelle (paternal effects) des hutres mâles ont été injectées avec du poly(I : C) (poly(I : C)-primed) ou de l'eau de mer stérile (seawater- primed) et reproduites avec une seule femelle injectée avec de l'eau de mer. Les histogrammes correspondent au taux de mortalité cumulé, 2 jours après infection, des larves âgées de 24h, issues de des différentes reproductions, avec le virus OsHV-1 ou non infectées (NC) (b et c). Concernant les larves contrôles n'ayant pas reçu d'OsHV-1 (NC), provenant de père et de mères stimulées au poly(I : C) ou non, les taux de mortalité 2 jours après l'infection sont faibles et similaires entre les conditions (entre 2. 8% et 4. 4%). Dans les lots contrôles o les parents n'avaient pas été stimulés au poly(I : C), nous avons observé un taux de mortalité de 17. 4% en moyenne (Figure 17 b, histogramme vert). Par contre, chez les larves provenant de mères stimulées au poly(I : C), le 84 taux de mortalité est significativement réduit avec 8. 3% de mortalité en moyenne 2 jours après l'infection (Figure 17 b, histogramme rouge). Concernant les larves provenant de pères stimulés au poly(I : C) (Figure 17 c, histogramme rouge) ou non stimulés (Figure 17 c, histogramme vert), les taux de mortalités sont similaires et plus importants que pour les larves provenant de femelles traitées au poly(I : C) (20. 6% et 31. 5% en moyenne, respectivement). Ces résultats suggèrent donc une origine maternelle et non paternelle à cette protection trans-générationnelle. Ces résultats préliminaires tendent donc à supporter l'hypothèse d'un transfert de composants immunitaires ou immuno- modulateurs par l'intermédiaire des gamètes femelles. L'ensemble de ces travaux préliminaires devront par la suite être confirmés en reproduisant ces analyses. Ensuite, l'hypothèse d'un transfert, d'origine maternelle et transitoire, soulève la question de la nature des composés qui pourraient être transmit dans les ovocytes. Le premier candidat à rechercher est le poly(I : C) lui-même. Bien que le poly(I : C) soit dégradé rapidement dans l'hémolymphe et l'eau de mer en moins de 48h (cf Chapitre I, Article 1), sa persistance dans les différents de l'hutres n'est pas encore identifié. La présence de poly(I : C) dans les ovocytes pourrait alors être transmit aux larves et dans ce cas, il ne s'agirait pas de priming trans-générationnel dans notre étude, mais de stimulation immunitaire directe sur les larves. Des analyses complémentaires du suivi de la persistance du poly(I : C) pourraient être envisagées par l'utilisation d'anticorps spécifiques du poly(I : C) ou le suivi de poly(I : C) marqué à le rhodamine (Masood et al. 2016, Masood et al. 2017). Par ailleurs, afin d'identifier si le contenu protéique des ovocytes pourrait influencer la protection des larves, une approche protéomique par la technique de migration sur gel en 2 dimensions (2D-PAGE) a été réalisée et est en cours d'analyse. Par ailleurs, nos résultats soulèvent la question de la durée de cette protection chez les larves. Il serait alors intéressant d'identifier la durée de la protection en réalisant le même protocole que nous avons utilisé puis d'infecter régulièrement de jeunes hutres, à différents stades de vie, pour contrôler leur sensibilité aux infections virales à l'OsHV-1 et ainsi déterminer la durée dans le temps de cet effet protecteur. 85 Chapitre 2 : Mécanismes du priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas Montagnani C. Lafont M. Chapitre 2 : Mécanismes du priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas I. Introduction La seconde partie des résultats de cette thèse est consacrée à l'identification des mécanismes moléculaires sous-jacents au priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas. Le séquençage du génome de l'hutre C. gigas (Zhang et al. 2012) a permis d'identifier in silico de nombreuses voies de signalisations antivirales conservées chez l'hutre (Green et al. 2015a). Par ailleurs, différentes études se sont intéressées aux réponses transcriptomiques de l'hutre lors d'infection à l'OsHV-1, visant à comprendre les mécanismes moléculaire de l'hutre lors d'infection à l'OsHV-1 (Zhang et al. 2012, Green and Montagnani 2013, Jouaux et al. 2013, Green et al. 2014a, Segarra et al. 2014a, Segarra et al. 2014c, He et al. 2015, Rosani et al. 2015, Green et al. 2016b). De plus, le génome de l'OsHV-1 est séquencé et permet donc de suivre l'expression des transcrits viraux au cours d'une infection virale (He et al. 2015, Rosani et al. 2015). Comme nous venons de le voir dans la description phénoménologique du priming immunitaire chez l'hutre, l'injection de poly(I : C) à des hutres naïves permet de les protéger des mortalités impliquant l'infection par l'OsHV-1. Nous possédons donc un modèle nous permettant de comprendre les mécanismes sous-jacents du priming immunitaire antiviral chez l'hutre. Nous avons choisi d'étudier les mécanismes moléculaires du priming immunitaire antiviral chez l'hutre par une approche transcriptomique globale par RNA-seq. Cette approche par dual RNA-seq , permettra de suivre d'une part la réponse de l'hôte, mais aussi la réponse du virus. Cette étude vise à répondre principalement à deux questions : (i) quels sont les mécanismes mis en place en réponse au poly(I : C) ? (ii) quels sont les mécanismes de protection antivirale au cours de l'infection par OsHV-1 (au niveau des réponses de l'hôte et de l'activité du virus) ? Les résultats de ces travaux sont présentés sous la forme d'une publication en préparation qui nécessitera la finalisation de quelques analyses complémentaires en vue d'une soumission prochaine de l'article. 86 II. Article 2 : Molecular mechanisms underlying antiviral the Lophotrochozoan Pacific oyster, Crassostrea gigas immune innate priming in Molecular mechanisms underlying antiviral innate immune priming in the Lophotrochozoan Pacific oyster, Crassostrea gigas Keywords : Oyster ; POMS ; Poly(I : C) ; innate immunity ; priming ; OsHV-1 ; antiviral response ; immune memory. ABSTRACT Since the last decade many discoveries evidenced a form of innate immune memory and specificity during a second encounter with a pathogen leading to an induced protection. This phenomenon called innate immune priming has been identified in a broad range of invertebrate species but studies were mainly focused on phenomenological approaches. The molecular mechanisms underlying this phenomenon are still unclear. The present study focuses on the mechanisms of antiviral immune priming in a Lophotrochozoan bivalve, the oyster Crassostrea gigas, in which innate immune priming has recently been identified using poly(I : C) as elicitor against the Ostreid herpes virus 1. Our dual RNA sequencing approach revealed for the first time that poly(I : C) induces a strong and complex antiviral response during priming. This response leads to an impaired OsHV-1 replication protecting the oyster. Our results originally suggests that poly(I : C) induces a sustained antiviral response supporting innate immune memory mechanisms. INTRODUCTION A wide range of organisms rely on innate immune systems to defend themselves and have thus long been considered incapable of developing adaptive immune mechanisms and to lack specificity. However, in recent years a paradigm shift has emerged showing that the innate immune system is more complex than previously thought. Indeed, multiple studies carried out on the innate immunity of invertebrates and plants have shown that they were capable to implement an improved immune response upon a second infection with a pathogen already encountered (Cooper et al. 1992, Kurtz and 87 Franz 2003, Kurtz 2004, Schmid-Hempel 2005, Portela et al. 2013, Cooper and Eleftherianos 2017). Interestingly, those observations were reinforced by the demonstration that, in vertebrates, cells of the innate immune system could also build immunological memory (Netea 2013, Netea and van der Meer 2017). Since this phenomenon cannot be associated with the conventional adaptive immunity found in vertebrates (lymphocyte and immunoglobulin-related), it has been associated with the term of innate immune priming, trained immunity or innate immune memory. Studies on immune priming are extremely heterogeneous in terms of invertebrate taxa studied ; host-pathogen interactions (mainly focused on interactions with bacteria and macro-parasites) ; elicitors used (lived or killed pathogens, active molecules) ; routes of inoculation (oral or injection) ; duration (from a few days to months) ; and degrees of specificity (for review, see (Milutinovi and Kurtz 2016). Consequently, numerous questions are still emerging about the very existence of innate immune memory/priming in invertebrates and more work is warranted to try and draw a comprehensive view of all these processes across phyla in regard to the diversity of interactions studied. To try and understand the nature and origin of these convergent or conserved innovations, a recurrent question is the molecular bases of these phenomena that are still poorly understood. Several mechanistic models have however been suggested to be associated with specificity and innate immune memory and priming. These processes have been suggested to rely either on (i) a sustained response consisting in a long-lasting up regulation of immune effectors after the first encounter with an intruder ; (ii) a recalled response consisting in storing information after a first encounter with an intruder and then to generate a faster and stronger response after the second encounter ; or (iii) an immune shift from cellular to humoral response between the first and the second encounter (Coustau et al. 2016). These models have been related to a variety of disparate molecular and cellular mechanisms. Epigenetic reprogramming has been considered as the main mechanism driving trained immunity in mammalian innate immune cells, allowing shortterm adaptations of the epigenome (Netea et al. 2011, Quintin et al. 2014). In invertebrates, epigenetic mechanisms have also been investigated and have been implicated in immune priming processes (Vilcinskas 2016, Castro-Vargas et al. 2017). In addition, reports have suggested that alternative splicing of certain classes of immune recognition receptors (DSCAMs for Down syndrome cell adhesion molecule, FREPs for fibrinogen-related proteins) as well as humoral factors (antimicrobial peptides) and cellular processes as phagocytosis or hematopoietic proliferation that could also play major roles in specific recognition and immune priming (Watson et al. 2005, Dong et al. 2006, Roth and Kurtz 2009, Mone et al. 2010, Rodrigues et al. 2010, Hanington and Zhang 2011, Zhang et al. 2014, Armitage et al. 2015). Hence, untangling the molecular basis underlying invertebrate innate immune priming and memory from an increasing variety of phylogenetically distant models would shed light on the specific or universal characteristics of these phenomena. In the present study, we focused on a member of the Lophotrochozoa phylum, the Pacific oyster Crassostrea gigas (or Magallana gigas (Salvi and Mariottini 2016), Thunberg 1793), a main aquaculture species in the world. Lophotrochozoa is one of the widest groups in the animal reign that is still poorly explored regarding these processes. In this phylum, the few studies that have investigated the innate immune priming focused on only three models, the gasteropod Biomphalaria glabrata, and two bivalves, Chlamys farreri and C. gigas. The interaction between B. glabrata and the flat worm Schistosoma mansoni has been extensively studied. These studies have unraveled original mechanisms and established a new model for anti-parasite innate immune memory (Sire et al. 1998, Portela et al. 2013, Coustau et al. 2016, Pinaud et al. 2016). In bivalves, however, information is still scarce. A few studies focused on anti-bacterial immune priming. In the clam Chlamys farreri, authors showed improved survival and increased of transcripts expression of C-lectins upon secondary challenge with Vibrio anguillarum, suggesting their involvement in the immune priming (Wang et al. 2013). In the Pacific oyster, studies on antibacterial priming with heat-killed Vibrio splendidus revealed an enhanced phagocytic response and hematopoiesis upon second infection with the same pathogen and a potential role of extracellular superoxide dismutase (Zhang et al. 2014, Liu et al. 2016, Li et al. 2017). But the main information regarding bivalve immune priming was obtained on antiviral immune priming in C. gigas. Indeed, the Pacific oyster has been plagued for years with a juvenile mortality syndrome with no existing prophylactic or therapeutic treatments. These recurrent mortalities are associated with a herpes-like virus OsHV-1 var (Ostreid herpes virus 1) (Segarra et al. 2010, Martenot et al. 2011, Pernet et al. 2012) that have motivated researches on ways to protect these 88 commercially important animals and to deepen our knowledge on the antiviral innate immune system. To date, a few studies investigated the antiviral immune priming in invertebrates. Some studies showed failure of protection in models like Drosophila melanogaster (Longdon et al. 2013) while others showed success in other invertebrates such as insects, nematods and mostly crustaceans (Johnson et al. 2008, Rechavi et al. 2011, Tidbury et al. 2011). In the latter, numerous research suggested the potential application for anti-viral immune priming (pseudo- vaccination) to fight pathogenic viruses causing high mortality in shrimp farming (Chang et al. 2017). In these phyla, several molecular mechanisms have been suggested to be associated with antiviral immune priming from the RNA interference and interferon (IFN) pathways to epigenetics. In the oyster, previous work showed that prior injection of double stranded RNA (dsRNA) could induce an antiviral state hampering the replication of the OsHV-1 virus and induce protection of the oyster against that virus (Green and Montagnani 2013, Pauletto et al. 2017). In particular, we developed a model system to study antiviral immune priming in the oyster and oyster/virus interaction using a non-infectious elicitor, the viral mimic synthetic double stranded RNA (dsRNA) called poly(I : C) (Green and Montagnani 2013, Green et al. 2014, Lafont et al. 2017). Poly(I : C) has been known to be a key signature of viral infection and widely used as a viral mimic in vertebrates known to enhance antiviral defenses and IFN pathways (Matsumoto and Seya 2008, Yoshida and Azuma 2013). In the oyster, we showed that injection of poly(I : C) induced an antiviral state mitigating the viral load upon injection of a pathogenic Ostreid Herpesvirus-1 (OsHV-1) and IFN-like pathways genes (Green and Montagnani 2013, Green et al. 2014). More recently, we have demonstrated, from a phenomenological approach, that stimulation of oysters by poly (I : C) protects oysters against OsHV-1 infection (Lafont et al. in review). From our work, a long-term protection have been demonstrated since an infection carried out 4 months after poly(I : C) priming made it possible to protect the oysters, in a controlled environment, but also in the natural environment during a massive disease outbreak. This work demonstrated that antiviral immune priming is not restricted to arthropods and suggested the existence of a form of antiviral innate immune memory in the Pacific oyster. This phenomenological approach raised the question of the mechanisms underlying the antiviral immune priming. Different studies have shown that dsRNA, poly(I : C) and OsHV-1 injection could regulate genes from the IFN pathway but we still lack a comprehensive and broader view of the molecular mechanisms involved in antiviral immune priming and if it follows one of the previously described mechanistic models (Jouaux et al. 2013, Green et al. 2015, He et al. 2015, Rosani et al. 2015, Green et al. 2016, Huang et al. 2017). This study is the first to carry out a global transcriptomic analysis via the RNA-seq technique to identify the molecular determinants involved in antiviral innate immune memory in an invertebrate. In addition, this study provides a better understanding of the immunological interactions between Crassostrea gigas and OsHV-1 and provides tools for the control of the disease affecting oysters in the world, representing important socio-economic issues. MATERIAL & METHODS Experimental animals Experiment has been performed with specific pathogen free juveniles (SPF- i. e. free of mortality, negative for OsHV-1 detection and very low Vibrio sp. bacteria concentrations (Petton et al. 2013) (3. 5 months ; 20. 6 0. 1 mm shell length ; 1. 620. 1 g total weight ; meanSE) of the Pacific oyster Crassostrea gigas (or Magallana gigas (Salvi and Mariottini 2016), Thunberg, 1793). Oysters were offspring of the F11 family of the DECIPHER program (ANR-14-CE19-0023) produced in July 2016. These oysters were chosen for their high susceptibility to the juvenile oyster syndrome (de Lorgeril et al. , in prep. ). Preparation of pathogens/control inoculums OsHV-1 inoculum (or OsHV-1 homogenate) was prepared according to (Schikorski et al. 2011) from moribund oysters experimentally infected with OsHV-1 in previous trials and frozen at - 80C. Viral DNA loads (OsHV-1 genomes copies. L-1) in inoculums were estimated by quantitative PCR (qPCR) (see section : Viral detection and quantification). Control inoculum (control 89 homogenate) was prepared following the same protocol from healthy oysters showing no detectable amount of viral DNA. Inoculums were confirmed to be free of cultivable bacteria by plating 40l on LB NaCl agar plates. Priming experiment As priming solution, poly(I : C) HMW (Invivogen, cat. code : tlrl-pic) was prepared following manufacturer's instructions and diluted in filtered seawater to a concentration of 475 ng. L-1. As a control, a solution of autoclaved and filtered seawater (FSW) at 0. 02m was used. For priming experiment, oysters were anesthetized in hexahydrate MgCl2 (ACROS, cat. # 197530250, 50g. L-1, 100 oysters. L-1) according to Suquet et al. (Suquet et al. 2009) for 8h. Animals were then primed by injection of 40L of priming solutions in the adductor muscle, using a 26-gauge needle attached to a multi-dispensing hand pipette. A group of oysters was kept untreated during all the experimentation (i. e. not primed, nor challenged). Oysters were reared in seawater at 151C for 10 days. For challenge, oysters were re-anesthetized and injected with 20L of OsHV-1 or control inoculum (same injection method). Each challenge was performed in 4 replicates in 5L seawater plastic tanks regulated at 201C. In each tank, oysters were separated in two groups ; one for survival monitoring (15 oysters) and one for sampling (75 oysters). Survival was followed daily and dead oysters were removed from tanks. Survival rates were analyzed for statistical differences between treatments by log-rank test on Kaplan-Meier survival curves using the computer software package GraphPad Prism v. 6. 0. Sampling Sampling was done at time 0 (T0), 12h (0. 5 days), 1 day and 10 days post-priming (DPP) and at 0. 5, 1, 2 and 7 days post-challenge (DPC). Sampling consisted in individually removing shells of each animal with a sterile scalpel blade and snap-frozen the whole oyster in liquid nitrogen by pool of 15 animals. Samples were stored at -80C before grinding and homogenization by bead-beading (Retsch, Mixer Mill MM400) with a 20 mm stainless steel ball in a 50mL stainless steel bowls pre- chilled in liquid nitrogen. Powders obtained were then stored at -80C and used for DNA and/or RNA extractions. Samples from T0, 0. 5, 1 and 10 DPP, 0. 5 and 1 DPC were used for DNA and RNA analyses, other samples for DNA analyses only (Figure 1). Extraction of nucleic acids Genomic DNA was purified from homogenized oyster powders using the Macherey-Nagel Genomic DNA from tissue kit (cat. # 740952. 250) following manufacturer's instructions with an additional step of RNAseA treatment (Macherey-Nagel, cat. # 740505). The quality and quantity of genomic DNA was estimated on Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Thermoscientific). Total DNA was resuspended to a final concentration of 20 ng. L-1 prior to qPCR. Total RNA was extracted from oyster pool powders (10 mg) homogenized in 500L of Tri-Reagent (Invitrogen) by vortexing 2h at 4C. Prior to extraction, insoluble materials were removed by centrifugation at 12000xg for 10min at 4C and supernatant was incubated with 100L of chloroform at 20C for 3min. After centrifugation 12000xg for 15min at 4C, total RNA in the aqueous phase was extracted using the Direct-Zol RNA Miniprep kit (Zymo Research ; ref : R2052) according to the manufacturer's protocol. Quantity and purity of total RNAs were checked using the Nanodrop ND-1000 spectrophotometer (Thermoscientific) and capillary electrophoresis (Agilent BioAnalyzer 2100). Viral detection and quantification Detection and quantification of OsHV-1 DNA was performed using quantitative PCR (qPCR). All amplification reactions were performed in duplicate using a Roche LightCycler 480 Real-Time thermocycler (qPHD-Montpellier GenomiX platform, Montpellier University). PCR reaction volumes were 6 l containing LightCycler 480 SYBR Green I Master mix (Roche), 100 nM of pathogen specific primers and 20 ng of DNA. PCR reactions were performed using an initial denaturation (95C 90 for 10 min) followed by 40 cycles of denaturation (95C, 10s), hybridization (60C, 20s) and elongation step (72C, 25s). Virus specific primers targeting a region of the OsHV-1 genome predicted to encode a DNA polymerase catalytic subunit (DP) were chosen as previously described (ORF100, nucleotides 147655153291 of AY509253) : OsHVDPFor- ATTGATGATGTGGATAATCTGTG/ OsHVDPRev- GGTAAATACCATTGGTCTTGTTCC) (Kovacs et al. 2005, Webb et al. 2007). For absolute quantification, DP amplification products were cloned into the pCR4-Topo vector and replicated in Escherichia coli DH5a (Invitrogen). Plasmids were extracted using the Wizard Plus SV miniprep DNA purification system (Promega) and standard curves of known concentration of plasmid generated according to the Applied Biosystems manual of absolute real-time RT-PCR quantification ( pcr. pdf). Absolute quantification of OsHV- 1 genome copies in oyster samples was then estimated by comparing the observed Cp values to known plasmid standards from 103 (limit of detection) to 109 copies of DP. Viral load data, expressed in copies of DP. ng-1 of total gDNA, were transformed with the neperian logarithm function ( ln( 1) ) and normality (D'Agostino and Pearson omnibus normality test, p-value and variance homoscedasticity (Brown-Forsythe test, p-value were tested. The effect of priming on OsHV-1 load was determined using one-way analysis of variance (Anova) using the computer software package GraphPad Prism v. 6. 0. Bonferroni's correction for multiple comparison test was used to compare the viral load from each post-challenge sample to 10 DPP. RNA sequencing (RNA-seq) Quality check of total RNA and total RNA integrity was analyzed by capillary electrophoresis (Agilent BioAnalyzer 2100) showing no degradation. mRNAs purification and library construction was performed by MGX (Montpellier Genomix, Institut de Génomique fonctionnelle, Montpellier, France) using the Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit according to the manufacturer's protocol. Libraries were sequenced by MGX in single-end, 50 bp length fragments, using an Illumina HiSeq 2500. RNA Sequence raw data will be deposited on GenBank (to be submitted). OsHV-1 transcriptome analyses All sequenced reads were aligned (Refseq NC 005881. 2 ; (Davison et al. 2005) using Bowtie2 (Galaxy Version 2. 3. 0. 1 ; (Langmead and Salzberg 2012) (Supplemental table 1). The reads' count was performed using HTSeq-count (Galaxy version 0. 6. 1)(Anders et al. 2014). For each sample, each ORF at each time, the reads' count number was normalized (NC) accordingly to the following formula : to the OsHV-1 reference genome NC ( CORF SORF ) / ( Nreads N ) where : read count, size of the ORF in bp, the total number of reads sequenced for a sample and N the mean of all reads sequenced for all samples ( 37. 40 million reads). For each sample, all normalized reads' counts for all ORF were added up. The effect of priming on replication during OsHV-1 challenge was determined using one-way Anova as described in the Viral detection and quantification section. Bonferroni's correction for multiple comparison test was used to compare the NC from each post-challenge sample to 10 DPP (poly(I : C) or FSW). Oyster transcriptome analyses All data treatments were carried out on a local Galaxy server ( (Afgan et al. 2016). Reads quality was checked by FastQC software (version 0. 11. 5) and the high quality observed (Phred score >32) allowed us to keep all sequenced reads for further analyses. The sequencing depth was between 25. 4 and 56. 8 million reads per sample (Supplementary Table 1). Mapping on the C. gigas reference genome (version V9, (Zhang et al. 2012), (GenBank : AFTI00000000) was performed using RNA STAR (Galaxy version 2. 4. 0d-2) under defaults parameters (Dobin et al. 2013). The reads count was performed using HTSeq-count (Galaxy version 0. 6. 1), under the following parameters ; union mode and minimum alignment quality 10 (Anders et 91 al. 2014). With the bam file, the . gff file giving the genomic coordinate of annotated genes by Zhang et al. 2012 (Zhang et al. 2012) was used as inputs. DEseq2 (Galaxy version 2. 11. 39) was used to analyze the differential gene expression level between treatments (Love et al. 2014). Fold changes between treatments were considered significant when the adjusted p-value with the False Discovery Rate (FDR) (Benjamini-Hochberg procedure ; (Benjamini and Hochberg 1995) was Gene ontology analysis In order to identify biological functions affected by poly(I : C) priming, enrichment analyses were performed by a gene ontology (GO) analysis using a rank-based statistical test (Mann-Whitney U-test) combined to an adaptive clustering (Nielsen et al. 2005, Kosiol et al. 2008, Voolstra et al. 2011) selecting only specific biological processes category. Analyses were done with a R and Perl script from (Wright et al. 2015) with the following parameters : largest 0. 1 ; smallest 10 ; clusterCutHeight 0. 25. To generate the table of significance measures, from the 28. 027 genes of the oyster genome, the log2 fold change was assigned to genes differently expressed (DEseq2 ; FDR in comparison between poly(I : C) and FSW treatments at 0. 5, 1 and 10 DPP (Figure 4A), and 0 to genes that were not differentially expressed. A GO category was considered enriched for a FDR To synthetically represent the GO results, a ratio was calculated for up-regulated and down- regulated enriched categories with the following calculations : (1) for up-regulated enriched categories(number of genes significantly up-regulated in the category / total number of genes in this category) or (2) for down-regulated enriched categories -1 x (number of genes significantly down- regulated in this category / total number of genes in this category). Results were then represented on a heatmap using a Hierarchical Ascending Clustering (HAC) with Uncentred Pearson correlation (Gene Cluster 3. 0 software). Analyses of transcript differential expressions along the priming and challenge kinetics In order to characterize the effect of priming and challenge on the expression pattern of candidate genes through time, a second DEseq2 analysis was performed on the set of genes present in the enriched GO categories previously obtained. Regarding post-priming (poly(I : C) or FSW), each time point (i. e. 0. 5, 1 and 10 days) was compared to T0. Regarding post-challenge with OsHV-1, each time point (i. e. 0. 5 and 1 day) was compared to 10 DPP (Table 1). For representation purpose, Log2 fold change was set to 0 for non-significantly differentially expressed genes. To precisely determine the effect of OsHV-1, a third DESeq2 analysis was performed post-challenge by comparison between OsHV-1 and control inoculums treatments in poly(I : C) and FSW primed conditions. RESULTS From sensitivity to resistance against OsHV-1 : Poly(I : C) priming induces a phenotypic reversal Previous experiments evidenced in Crassostrea gigas the existence of a long -lasting immune priming against OsHV-1, after HMW poly(I : C) injection (Lafont et al. in review). Based on these observations, we used poly(I : C) in order to characterize the molecular mechanisms underlying this phenomenon. To this end, we used a full-sib oyster line from the DECIPHER ANR program (ANR- 14-CE19-0023) that was highly susceptible to the juvenile oyster syndrome (de Lorgeril et al. , in prep). In experimental and natural infections, this oyster line reached 99. 27 % mortality in ecologically realistic experimental infections and 100 % mortality in the field during a disease outbreak. We primed oysters with poly(I : C) or filtered seawater (FSW) 10 days before an OsHV-1 challenge (Figure 1). 92 Fig. 1 : Experimental design used to identify molecular mechanisms underlying poly(I : C) priming. Specific pathogen free (SPF) oysters, highly susceptible to the juvenile oyster syndrome, were anesthetized before being primed with poly(I : C) or filtered seawater (FSW). Ten days post-priming (10 DPP) oysters from each condition were challenged with OsHV-1 homogenate (1. 32x108 copies of DP gene per oyster) or OsHV-1- free homogenate (control). A part of the initial batch of oysters was kept untreated during the experiment. Survival of oysters was monitored during 10 days post-challenge. Three pools of 15 oysters for each condition were sampled post-priming (T0, 0. 5 days, 1 day and 10 days) and post-challenge (DPC) (0. 5 days, 1 day, 2 days and 7 days) for viral load analyses ( black asterisks) or RNA sequencing (* in blue). Poly(I : C) and FSW priming led to extremely contrasted phenotypes upon OsHV-1 challenge (Figure 2). Control treatments injected with control inoculum or non-treated, had no effect on the phenotype with 100% survival at the end of the experiment. Oysters injected with FSW and challenged with OsHV-1 were highly susceptible to OsHV-1 with only 5% survival at the end of the experiment, 10 days post-challenge. Mortalities occurred between 2 and 6 days post-challenge. However, poly(I : C) priming led to 100% protection after OsHV-1 challenge, with a significant difference of survival rate (log-rank test p-value compared to controls. Fig. 2 : Poly(I : C) priming induces phenotypical reversal upon OsHV-1 challenge. Oysters were primed by injection with poly(I : C) (19g. g-1 of oyster) or filtered seawater (FSW) as control or non-treated. Oysters were then challenged, 10 days post-priming, with OsHV-1 homogenate (1. 32x108 copies of DP gene per oyster) or OsHV-1-free control homogenate by injection or non-treated as controls. Conditions demonstrating 100% survival rates can appear hidden and merged with other ones reaching the same survival rate. Survivals in each group of 60 oysters (15 per tank) were monitored for 10 days after challenge. (Kaplan-Meier survival curves, * p-value log-rank test ; n 60). 93 10DPPAnes-thesiaPoly(I : C)FSWPrimingSPFoystersChallengeT0Non treatedOsHV-1OsHV-1ControlControl0. 5 DPP1DPP0. 5 DPC1 DPC2 DPC7 DPC10DPCAnes-thesia0246810050100Time post infection (days)Survival rate (%)Poly(I : C)Poly(I : C)Poly(I : C)FSWFSWFSWNon treated* OsHV-1inoculum Controlinoculum Notreatment100% survival We then tested the consequences of priming on viral replication (Figure 3). First, we followed viral loads by quantifying OsHV-1 gDNA by qPCR in whole oyster tissues. In priming control, (oysters challenged with OsHV-1 after a FSW injection), viral loads reached 9. 4. 104 copies of DP. ng-1 of total gDNA at 0. 5 days to 1. 3. 106 copies of DP. ng-1 of total gDNA at day 2 on average (one-way Anova ; p-value before mortalities occurred (Figure 3A). Seven days post-challenge, only 5% of oysters were still alive which did not enable the quantification of OsHV-1 DNA loads. In oysters primed with poly(I : C) and challenged with OsHV-1, viral loads were significantly lower than in FSW- injected oysters. The levels quantified were 280 to 13 times lower, especially in early times after infection (from 3. 3. 102 copies of DP. ng-1 of total gDNA at day 0. 5 to 1. 105 copies of DP. ng-1 of total gDNA at day 2, on average). In these animals, the viral loads never reached the level found in FSW- injected oysters and were only at 1. 1. 103 copies of DP. ng-1 of total gDNA at 7 DPC. Secondly, as the increase of OsHV-1 DNA load is related to the transcriptional activity of the virus, we followed the expression pattern of OsHV-1 transcripts in RNA-seq data. Alignment of the Illumina sequenced reads to the OsHV-1 genome (Kovacs et al. 2005) (Supplementary Table 1) allowed us to estimate the number of OsHV-1 transcripts after challenge (Figure 3B). For oysters primed with FSW, OsHV-1 replication was detectable from 0. 5 DPC (12 hours) with a total of 1. 104 transcripts normalized counts on average to 1 DPC, with 5. 4. 104 counts on average (one-way Anova ; p-value Virus replication was active from 0. 5 DPC and increased at 1 DPC with 5 times more transcripts. For oysters primed with poly(I : C), no transcripts were detected at 0. 5 DPC and no significant increase was detected at 1 DPC with only 1. 4. 102 counts on average. No mortalities, no viral DNA nor transcripts were detected in negative control conditions (i. e. challenge with control inoculum or without treatment). Altogether, these results showed that (i) in FSW-primed oysters, high replication of OsHV- 1 leads to high viral loads, associated to low survival rates and (ii) in the poly(I : C)-primed oysters, the priming restrains virus replication leading to low viral loads in oysters, associated to a high survival rate. Priming with poly(I : C) thus inverted the phenotype of susceptibility to disease under OsHV-1 challenge. Fig. 3 : Poly(I : C) stimulation restrains OsHV-1 replication in the oyster. OsHV-1 DNA detection by quantitative PCR (A) and total OsHV-1 transcripts normalized read counts mapped on the OsHV-1 genome (B) at different times after pathogenic (OsHV-1 inoculum) or non-pathogenic (control inoculum, blue) challenges. Challenges were realized 10 days post-priming (10 DPP) with filtered seawater (FSW ; red) or poly(I : C) (green). Different letters above histograms indicate statistically significant differences for each time compared to 10 DPP using one-way Anova (a, p-value < 0. 05 ; b and c, p-value < 0. 001 ; n 3 pools of 15 oysters). 94 OsHV-1 DNA load(copies of DP per ng of total gDNA)10 DPP0. 512705. 01051. 01061. 5106Non treatedPoly(I : C)Poly(I : C)FSWFSWabc OsHV-1inoculum Controlinoculumdays post challengeaOsHV-1 RNA reads10 DPP0. 5102. 01044. 01046. 01048. 0104FSWPoly(I : C)days post challenge OsHV-1inoculum ControlinoculumPoly(I : C)FSWabOsHV-1 DNA load(copies of DP per ng of total gDNA)10 DPP0. 512705. 01051. 01061. 5106Non treatedPoly(I : C)Poly(I : C)FSWFSWabc OsHV-1inoculum Controlinoculumdays post challengeaOsHV-1 DNA load(copies of DP per ng of total gDNA)10 DPP0. 512705. 01051. 01061. 5106Non treatedPoly(I : C)Poly(I : C)FSWFSWabc OsHV-1inoculum Controlinoculumdays post challengeaAB Poly(I : C) priming induces a strong and complex innate immune response in the oyster. In order to identify molecular mechanisms underlying the contrasted phenotypes observed, the transcriptomic response of oysters was analyzed by RNA-seq after poly(I : C) priming or FSW injection at 0. 5, 1 and 10 days post-priming (DPP). All Illumina sequenced reads were aligned to the C. gigas V9 reference genome (Zhang et al. 2012) and 73. 9% of reads on average mapped on this genome (Supplementary Table 1). Differential expression of genes was analyzed using the DEseq2 package through the comparison between poly(I : C) priming and FSW injection at each time points. DEseq2 results showed that 2150 genes were significantly differentially expressed in at least one comparison (Figure 4). Among these genes, 43. 3% are regulated early after priming (less than 1 day) and 56. 7% are specifically regulated between 1 and 10 days (Figure 4B). These genes were analyzed by gene ontology (GO) to identify biological processes modulated by poly(I : C), using a rank-based statistical test (FDR A total of 68 categories was significantly regulated in response to poly(I : C) at least one time (Supplementary Fig. 1). Enriched categories and intensity of enrichment calculated by the following formula number of genes significantly regulated in a category / total number of genes in this category are represented in a heatmap (Figure 5). A hierarchical clustering was used to represent the 68 significantly regulated categories that were classified into 6 clusters. Among all clusters, four were found over-regulated (1 to 4) and two were found down-regulated (5 and 6). Clusters 1, 3 and 4 were over-regulated early after priming (0. 5 and 1 DPP). Considering all enriched categories, 88% (60 functions ; clusters 2 and 3) are still over-regulated 10 days after poly(I : C) priming. Cluster 6 contains categories down-regulated in response to poly(I : C) only at day 10 DPP. The majority of these categories are involved in immunity (clusters 1, 3) and interestingly, some of these categories were directly related to innate immunity and/or antiviral immunity, such as : innate immune response, regulation of cell death, Toll signaling pathways, response to virus and regulation of type I interferon production. Excluding the unknown category, the 67 other enriched categories refer to 658 genes regulated post-priming with poly(I : C). Fig. 4 : DESeq comparison performed in order to identify genes involved in poly(I : C) priming in oyster. Comparisons were performed between poly(I : C) and FSW at 0. 5, 1 and 10 days post-priming (DPP) and plotted values in the table represents the number of genes differentially expressed identified by DEseq2 (FDR The total number of genes (2150) regulated in at least one comparison is represented in the last column (A). The Venn diagram represent the 2150 genes in each comparison (B). 95 0. 5 DPP1 DPP10 DPP0. 5 DPP3721 DPP89410 DPP1759Days post-FSW priming (control)Days post-poly(I : C) priming2150Total regulated genesAB0. 5 DPP1 DPP10 DPP0. 5 DPP3721 DPP89410 DPP1759Days post-FSW priming (control)Days post-poly(I : C) priming2150Total regulated genesAB Fig. 5 : Poly(I : C) stimulates a strong innate immune response in oysters. Heatmap of enrichment of Gene Ontology categories of biological processes at 0. 5 days, 1 day and 10 days post-priming (DPP) with poly(I : C). GO enrichment analyses were done using a rank-based statistical test on log2 fold changes of differentially expressed genes at each time compared to control (seawater priming). A category was considered enriched under a FDR Plotted values are ratio calculated as the number of genes significantly up-regulated (red) or down- regulated (green) in a category, divided by the total number of oyster genes in this category. Hierarchical clustering separated 6 different clusters numerated from 1 to 6 (Gene Cluster 3. 0 software). 96 Poly(I : C) induces an efficient antiviral response responsible for protection against OsHV-1 In order to identify the molecular mechanisms behind these 2contrasted phenotypes, we analyzed the expression pattern and functions associated with the 658 genes belonging to the gene ontology categories previously identified in post-priming analyses, all along the kinetic of our experiment. We first identified the expression profiles of this set of genes using DESeq2. We compared the expression profile of the 658 genes at each time point post-poly(I : C)/FSW priming (i. e. 0. 5, 1 and 10 DPP) to the initial T0. Then, to analyse the effect of OsHV-1 challenged in primed or non-primed oysters, we compared the expression profile of these genes at each time post-challenge (i. e. 0. 5 and 1 DPC) with the 10 days post-priming conditions (10 DPP poly(I : C) or 10 DPP FSW) (Table 1 & suppl. Table 2). For each comparison, the log2 fold change of significantly differentially expressed genes (FDR was plotted, while 0 was assigned to non-significant differences. the priming Firstly, concerning response, poly(I : C)-primed oysters showed early transcriptional regulation at 0. 5 DPP with 40. 7% (268/658) of the candidates genes that were differentially expressed, among which 30. 6% (82/268) are strongly regulated (regulated with a fold change >1 or (Table 1). At 1 DPP, 63. 4% (417/658) of the candidate genes are regulated among which 47% (196/417) are strongly regulated and at 10 DPP, 75. 5% (497/658) genes are regulated with 52. 7% (262/497) regulated with a fold change >1 or From these strongly regulated genes at 10DPP, 88. 2% (231/262) are up-regulated and only 11. 8% down-regulated (31/262). Interestingly, from the whole set of genes, 56. 8% (374/658) were regulated at early points 0. 5 DPP and/or 1 DPP and their expression still regulated at 10DPP. Then, concerning OsHV-1 challenge response of poly(I : C)-primed oysters, the results showed very low transcription modifications compared to 10 DPP. At 0. 5 DPC, only 9. 6% (63/658) genes among which 41. 3% (26/36) are regulated with a fold change >1 or At 1 DPC, 12. 6% (83/658) of genes are regulated among which 10. 8% (9/83) are strongly regulated. Altogether, for all candidate genes post-challenge at 0. 5 DPC and/or at 1 DPC compared to 10 DPP different expression patterns are observed : 72. 3% (476/658) of genes are maintained ; 13. 7% (90/658) of genes are regulated at 10 DPP and over-regulated post-challenge ; 11. 6 % (76/658) of genes are not regulated either post-poly(I : C) priming nor post-challenge ; 1. 5% (10/658) of genes are specifically regulated post-challenge and 0. 9% (6/658) of genes have a recalled expression pattern (i. e. regulated in early times post-priming but not at 10 DPP and regulated post- challenge) (Figure 6A). These results indicated that a majority of these genes (86%) adopted a sustained and sustained and regulated post-challenge following poly(I : C) priming. Interestingly, no genes were found differentially expressed in comparisons between poly(I : C)-primed oysters after either OsHV-1 or control inoculum challenges, revealing no additional effect of OsHV-1 injection. These results are illustrated in figure 7 in a heatmap where all the 658 transcripts are plotted at the different times post-priming and post-challenge (Figure 7A). This illustration shows that the pattern of expression of these genes is mainly sustained post-priming and predominantly up-regulated. Indeed, 68 transcripts were down-regulated (18%) versus 306 up-regulated (82%) among the 374 genes whose expression was sustained post-priming. Those genes were not regulated after OsHV-1 challenge demonstrating that poly(I : C) priming strongly induced gene transcription predominantly following a sustained response pattern all along the experiment. Secondly, concerning the non-efficient response to OsHV-1, we assessed in a first step the effect of FSW injection (Table 1). At 0. 5 DPP 28. 4% (187/658) of genes are regulated among which 11. 8% (22/187) are strongly regulated. At 1 DPP, 30. 9% (203/658) of genes are regulated among which 16. 7% (34/658) are strongly regulated and at 10 DPP, 48% (317/658) of genes are regulated among which 32. 8% (104/317) are strongly regulated. Among all these candidate genes, 24. 2% (159/658) previously regulated in early response at 0. 5 DPP and/or 1 DPP whose regulation is sustained during priming. Then, concerning OsHV-1 challenge response of FSW-injected oysters, the results showed strong transcription modifications compared to 10 DPP. At 0. 5 DPC, only 39. 1% (257/658) genes among which 42% (110/257) are regulated with a fold change >1 or At 1 DPC, 64. 3% (423/658) of genes are regulated among which 61. 5% (260/423) are strongly regulated. 97 Altogether, for all candidate genes post-challenge at 0. 5 DPC and/or at 1 DPC compared to 10 DPP different expression patterns are observed : 22. 5% (148/658) of genes are maintained ; 30. 1% (198/658) of genes are regulated at 10 DPP and over-regulated post-challenge ; 11. 1 % (73/658) of genes are not regulated either post-FSW injection nor post-challenge ; 28. 5% (188/658) of genes are specifically regulated post-challenge and 7. 8% (51/658) of genes have a recalled expression pattern (i. e. regulated in early times post-FSW injection but not at 10 DPP and regulated post-challenge) (Figure 6B). These results revealed different patterns of expression induced in FSW priming after OsHV-1 challenge with only 52. 6% of genes with a sustained or sustained and regulated PC but 28. 6% that were specifically up-regulated post-challenge. As illustrated in figure 7, these results show that in non-primed oysters, that set of 658 genes is poorly regulated after FSW injection and mainly up-regulated after OsHV-1 challenge. Interestingly, as all genes were plotted on the same lines, we showed that most genes involved in a sustained response after poly(I : C) priming are also up-regulated in a non-primed context after virus challenge (Figure 7B). These results illustrate that the same set of genes might be involved in responses to poly (I : C) and to the virus but was inefficient in protecting the oyster in the latter case. Altogether, this strongly suggests that the implementation of an efficient antiviral response in the oyster is highly dependent on the timely activation of antiviral mechanisms. Table 1 : DESeq comparison performed in order to calculate the level of expression of candidate genes during priming (poly(I : C) or filtered seawater (FSW) and OsHV-1 challenge. Expression pattern of the 658 genes identified by gene ontology analysis during priming, was analysed using DESeq2 package in comparing each time point post-priming (i. e. 0. 5, 1 and 10 days post-priming (DPP) to T0 ; and each time point post- challenge (i. e. 0. 5 and 1 day post-challenge (DPC) with OsHV-1, to 10 DPP. Indicated values represent the number of genes differentially expressed identified by DEseq2 (FDR from the 658 genes. Percentages of genes with a fold change -1< or >1were calculated from the global number of regulated genes. Fig. 6 : Regulation profile of primed transcripts after OsHV-1 challenge. Pie chart of the percentage of genes following different expression profile following poly(I : C) (A) or FSW (B) priming and OsHV-1 infection. Five expression profiles were identified (1) sustained when gene expression is maintained between 0. 5DPP and/or 1DPP and still regulated at 10DPP ; (2) sustained and regulated when genes are regulated at 10 DPP and over-regulated post-challenge ; (3) regulated only PC when genes were not regulated during priming but only after challenge ; (4) not regulated when genes are not regulated either post- priming injection nor post-challenge ; (5)recalled when genes are regulated in early times post-priming but not at 10 DPP and regulated post-challenge. 98 658#%#%#%#%#%#%#%PIC0, 5DPP26840, 78230, 6PIC1DPP41763, 419647, 0PIC10DPP49775, 526252, 7PIC0, 5DPC639, 62641, 3PIC1DPC8312, 6910, 8FSW0, 5DPP18728, 42211, 8FSW1DPP20330, 93416, 7FSW10DPP31748, 210432, 8FSW0, 5DPC25739, 111042, 8FSW1DPC42364, 326061, 5148, 073, 028, 6188, 030, 1198, 022, 511, 66, 00, 97, 851, 011, 1expression pattern37456, 8159, 024, 247672, 390, 0-1 >1regulated only PCnot regulated10DPP10DPPrecalled13, 710, 01, 576, 0transcript regulation fold change primingchallengeglobalsustainedsustained & regulated Fig. 7 : Poly(I : C) induces an antiviral immune response protecting the oyster against OsHV-1 challenge. Heatmap showing expression kinetics of the 658 transcripts of oyster primed with poly(I : C) (A) or injected with filtered seawater (FSW) as control (B) and challenged after 10 days with OsHV-1. Color scale indicates the log2 fold change calculated by DEseq2, of the 658 transcripts identified by GO in comparing : post-priming (poly(I : C) or FSW) : 0. 5, 1 and 10 days to T0 (FDR ; post-challenge : 0. 5 and 1 days were compared to 10 days post- priming (poly(I : C) or FSW) (FDR Same transcripts are indicated in the same position for each condition (Gene Cluster 3. 0 software). To get a deeper insight into the mechanisms involved in the antiviral protection observed, we then analyzed the functions associated to these sets of genes. We assigned a function (antiviral, antibacterial, or both when possible) to each gene compared to the known literature. We focused here on the genes that followed a sustained expression profile post-poly(I : C) priming (374/658, 56. 8%) that were also up-regulated (306/374, 82%) (Figure 8, Suppl. Table 2). We found that 56% (171/306) could be assigned to an antiviral response (virus), 10% to an antibacterial response (bacteria) or potentially to both responses (22%, V/B) while 12% could not be directly associated with an immune function (other) (Figure 8A). Most genes could thus be associated with an antiviral function (237/306, 77%). Out of the virus and V/B categories (237/306), we then assigned the genes to known antiviral pathways (Figure 8B). We evidenced that most genes (93/237 ; 39%) could be associated with the IFN-like pathway including RLR and STING dependent pathways (e. g. RIG-1, helicase, IRF), and ISG (e. g. ADAR-L, IFI44, viperin, SAMHD-1). A number of genes could also be associated the Toll/NF-kB (15/237 ; 6%) and the JAK/STAT (12/237 ; 5%) pathways that are tightly linked to the IFN pathway. The second most represented category is the apoptosis pathway (20/237 ; 9% ; e. g. TNF, Fas, caspases, IAP). The RNAi pathway was poorly represented within this set of genes (1/237 ; 0. 42%) suggesting that it is poorly involved in poly(I : C) response or not regulated. Finally, 41% of the genes could not be clearly associated with known antiviral pathways. Altogether these analyses allowed us to identify sets of candidate genes that will help to confirm the sustained profile hypothesis on long-lasting experiments (Lafont et al. , 2017- cf chapitre 1, Article 1) and get a better inside into the mechanisms involved in antiviral protection. 99 0. 51100. 51100. 510. 51Dayspost-poly(I : C) primingDayspost-FSW injectionDayspost-OsHV-1 challengeDayspost -OsHV-1 challengeABPrimedoystersNon-primedoysters Fig. 8 : Putative immune functions of up-regulated genes with a sustained expression profile post poly (I : C) priming. A. Putative functions of up-regulated genes following a sustained expression pattern during poly (I : C) priming were identified according to the literature and each of the gene were assigned to the antibacterial response (bacteria), antiviral response (virus), both responses (V/B) or with no direct implication in immunity (other). B. Among the virus and V/B response, genes were assigned to known signaling pathways implicated in antiviral response (apoptosis, IFN-like pathway, RNAi, JAK/STAT, Toll/NF-kB pathway) or not (other). 100 Additional-supplementary files Supp. Table 1 : Library and mapped reads on C. gigas genome or OsHV-1 genome used for RNA-seq analyses. The percentage of reads mapped (%) to the C. gigas genome (Zhang et al. 2012) or OsHV-1 genome (Kovacs et al. 2005) correspond to the number of mapped reads (MR) relatives to the total sequenced reads for a library sequenced in single-end. Each library is related to replicate of a sampling of oysters at T0 and different days post-priming (DPP) with poly(I : C) or filtered seawater (FSW) and at days post-challenge (DPC) with OsHV-1 injected 10 days after priming. 101 Time of samplingReplicatMR (Million)%MR%148, 836, 2274, 200239, 029, 4575, 500333, 325, 0475, 300134, 125, 6975, 3241, 831, 1574, 5356, 841, 1772, 4133, 824, 3572, 1250, 036, 9173, 8334, 525, 4873, 8129, 021, 8075, 200, 00249, 136, 6574, 700, 00328, 320, 9874, 200, 00132, 224, 2175, 180, 00240, 830, 0873, 8340, 00325, 419, 0875, 110, 00125, 919, 5175, 320, 00237, 728, 0774, 427050, 01329, 121, 9575, 370, 00133, 725, 1274, 5229, 922, 3574, 7331, 823, 8675, 0133, 323, 9972, 1229, 421, 8874, 4353, 840, 0374, 5141, 931, 1174, 360, 00235, 526, 2874, 000, 00342, 230, 7472, 9120, 00136, 627, 6375, 45, 6E 040, 15235, 422, 9664, 91, 0E 050, 28328, 320, 6272, 85, 0E 040, 18139, 028, 6873, 54, 6E 051, 19239, 829, 5474, 23, 4E 050, 86351, 937, 8172, 85, 6E 051, 08C. gigasOsHV-1FSW0. 5 DPP1 DPP10 DPP0. 5 DPC1 DPCTotal Sequenced Reads (Million)T0Poly(I : C)1 DPC0. 5 DPC10 DPP1 DPP0. 5 DPP 102 103 Supp. Figure 1 : Gene ontology categories affected by poly(I : C) priming Gene ontology categories enriched by Log2fold change of genes up-regulated (red) or down-regulated (blue) in oysters primed with poly(I : C) compared to FSW at 0. 5 days post-priming (A), 1 day post-priming (B) or 10 days post-priming (C), summarized by categories belonging to biological process. The size of the font indicates the significance of the term calculated by Mann-Whitney U-test (p p < 0. 001 or p The fraction preceding the GO term indicates the number of genes significantly regulated in a category (numerator) and the total number of genes in this category (denominator). Branching indicates shared genes among GO categories. 104 References Afgan, E. , D. Baker, M. van den Beek, D. Blankenberg, D. Bouvier, M. ech, J. Chilton, D. Clements, N. Coraor, C. Eberhard, B. Grning, A. Guerler, J. Hillman-Jackson, G. Von Kuster, E. Rasche, N. Soranzo, N. Turaga, J. Taylor, A. Nekrutenko, and J. Goecks. 2016. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses : 2016 update. Nucleic Acids Research 44 : W3-W10. Anders, S. , P. T. Pyl, and W. Huber. 2014. HTSeq-a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics 31 : 166-169. Armitage, S. A. O. , R. Peuss, and J. Kurtz. 2015. 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Cependant, des analyses complémentaires sont nécessaires pour comprendre ces mécanismes et sont exposées en perspective à court terme au travers des différentes questions posées, permettant de compléter et de soumettre l'article présenté. Question (i) : quels sont les mécanismes mis en place en réponse au poly(I : C) Les analyses comparatives entre des hutres stimulées avec du poly(I : C) et des hutres contrôles, injectées avec de l'eau de mer, ont révélé que 2150 gènes étaient différentiellement exprimés. Les analyses d'enrichissement ont permis de mettre en évidence 67 catégories de gene ontology enrichies, contenant 658 gènes des 2510 précédemment identifiés. Parmi ces catégories, de nombreuses fonctions sont reliées à l'immunité innée ( immune response , innate immune response , Toll signaling pathway , regulation of cell death , defense response to other organism Immune effector process , immune system process , regulation of defense response , response to stress . Parmi ces différentes fonctions immunitaires, l'implication de l'immunité antivirale est suggérée particulièrement par les fonctions response to virus et regulation of type I interferon . Le système interféron est bien décrit chez les vertébrés (Der et al. 1998) mais n'est pas identifié chez les arthropodes et plus généralement chez les invertébrés (Paradkar et al. 2012, Kingsolver et al. 2013). Cependant, des analyses in silico du génome de l'hutre ont suggéré l'existence d'un système interferon-like (Zhang et al. 2012, Green et al. 2015a). Différentes études ont montré la régulation de différents gènes reliés au système interféron chez l'hutre lors d'infections avec l'OsHV-1 suggérant son implication dans les mécanismes antiviraux (Jouaux et al. 2013, Segarra et al. 2014c, He et al. 2015, Rosani et al. 2015, Green et al. 2016b). Des travaux réalisés sur la réponse antivirale en utilisant du poly(I : C) et des ARNs doubles brins ont également suggéré l'implication d'un système de type interféron chez l'hutre (Green and Montagnani 2013, Green et al. 2014a, Green et al. 2015a, Green et al. 2016b, Pauletto et al. 2017). De plus, des auteurs ont montré une augmentation du niveau d'expression d'un homologue à un récepteur à interféron (CgIFNR-3) 109 ainsi que l'implication du récepteur RIG-1 lors de stimulations des hutres par le poly(I : C) (Zhang et al. 2016, Huang et al. 2017). Nos travaux sont les premiers à suggérer par une approche globale un investissement fort de ce système de type interféron en réponse au poly(I : C). Pour compléter cette analyse, l'identification du nombre de gènes significativement régulés, impliqués dans différentes voies des signalisations permettra d'avoir une vision plus globale des différentes voies régulées par le poly(I : C). Question (ii) : quels sont les mécanismes de protection antivirale au cours de l'infection par OsHV-1 (au niveau des réponses de l'hôte et de l'activité du virus) ? - Les mécanismes de protection au niveau de l'hôte Parmi l'ensemble des gènes identifiés par gene ontology (658 gènes), nous avons observé différents profils d'expression en réponse à l'OsHV-1 chez des hutres stimulées avec le poly(I : C). Les profils majoritaires correspondent à un profil de type maintenu ( sustained ) pour 72. 3% des gènes et un profil maintenu post-priming puis à nouveau régulé lors du challenge pour 13. 7% des gènes. A eux deux, ces profils représentent 86% des gènes (566/658 gènes). En revanche, lors d'infections virales, chez des hutres infectées avec l'OsHV-1 n'ayant pas été primées (primo-injectée avec FSW), 52. 6% des gènes (271/658 gènes) ont ces profils. Lors de l'infection virale, 28. 5% des gènes (188/658 gènes) sont régulés spécifiquement au challenge. Ces différences de profils entre les deux conditions de primo-stimulation lors d'infections virales suggèrent que la réponse de type maintenu pourrait être la clé de la protection et qu'une activation précoce permettrait de protéger les hutres des infections virales. De plus, chez les hutres stimulées avec le poly(I : C), qu'elles aient subi une infection à l'OsHV-1 ou non, aucun gène n'est significativement différentiellement régulé. Cependant, ces résultats nécessitent plus d'analyses. L'objectif de la suite des analyses sera d'identifier un cœur de gènes parmi les gènes candidats que nous avons identifiés participant aux mécanismes de protection. Dans un premier temps, nous allons nous intéresser aux 658 gènes. Nous allons traiter séparément tous les différents profils d'expression et les comparer entre les différentes conditions d'infection (stimulées au poly(I : C) ou non). La fonction putative de chaque gène sera identifiée pour en déduire l'implication potentielle dans ces mécanismes. Cette information permettra de discriminer les gènes essentiels et d'identifier les différentes voies de signalisations régulées. Dans un deuxième temps, l'étude de l'ensemble des gènes régulés par le poly(I : C) (2150 gènes) devra être réalisée pour étudier les gènes qui n'appartiennent pas aux catégories GO enrichies. Cette approche nous permettra (1) d'enrichir les données sur les voies de signalisations identifiées et (2) d'identifier d'autres gènes candidats pouvant être décrits dans la littérature comme étant impliqués dans une stimulation par un acide nucléique ou par un virus pouvant être de bons 110 candidats pour comprendre les mécanismes de priming immunitaire. Ensuite, dans le génome de l'hutre, il existe de nombreuses familles multi-géniques. Par exemple, pour les récepteurs Toll, 83 gènes ont été identifiés ou pour les récepteurs RIG-like, 11 gènes sont identifiés (Zhang et al. 2012, Zhang et al. 2015). L'identification précise des gènes impliqués dans ces familles multi-géniques permettra de caractériser plus finement les voies de signalisation affectées. Enfin, les différents profils que nous avons obtenus tendent à montrer qu'une réponse de type maintenue est principalement mise en place, soulevant la question du coût physiologique chez l'hutre pour le maintien du niveau d'expression de ces gènes au cours du temps. Afin de confronter ces hypothèses non plus à 10 jours, mais sur le long terme, nous allons suivre le niveau d'expression de gènes candidats, par qPCR, sur un autre lot d'hutres stimulées sur une cinétique plus longue. Dans l'article 1 présenté dans le chapitre 1, l'expérimentation ayant montré un effet protecteur du poly(I : C) permettra de suivre l'expression des gènes candidats sur une cinétique de 126 jours. - Les mécanismes de protection au niveau de l'activité de l'OsHV-1 Le suivi de la charge virale et de l'activité de réplication du virus via l'étude des transcrits viraux a permis de révéler que la stimulation avec du poly(I : C) restreint la réplication du virus dans les hutres. Dans cette expérimentation, nous avons confirmé que, dans les hutres non stimulées, l'injection de virus OsHV-1 a entrané une augmentation de la charge d'ADN viral quantifiable suggérant une réplication virale. Pour les hutres stimulées par le poly(I : C), ce travail a confirmé que la stimulation des hutres avant une infection virale avec OsHV-1 réduisait la charge virale (cf Chapitre 1, Article 1 et (Green et Montagnani 2013b). En outre, le séquençage du transcriptome a permis d'étudier l'expression des gènes de l'OsHV-1 suite à l'infection chez des hutres stimulées ou non. En ce qui concerne les hutres non stimulées, suite à l'infection virale, notre expérience a confirmé une activité transcriptionnelle du virus dès 12 heures après l'infection, plus important encore à 24 heures après l'injection d'OsHV-1, en accord avec la littérature (Segarra et al. 2014b, Segarra et al. 2014c, He et al. 2015). D'autre part, chez les animaux stimulés avec du poly(I : C) 10 jours avant l'injection d'OsHV-1, nous n'observons aucune activité transcriptionnelle 12 heures après l'infection. Cependant, la charge virale d'ADN détectée 2 jours après l'infection pourrait correspondre à une activité transcriptionnelle faible du virus identifiée par RNA-seq 24 heures après l'infection. Il est possible que cette détection très faible de transcrits viraux 24 heures après l'infection puisse provenir d'une stimulation mal effectuée du poly(I : C) ou incomplète n'ayant pas permis d'enrayer cette infection virale. Par ailleurs, il est possible que le poly(I : C) restreigne l'entrée du virus dans la cellule, mais que certains virus réussissent à se répliquer. Chez les vertébrés, des 111 travaux ont caractérisé les étapes de réplication d'herpès virus et ont montré que la synthèse d'ADN viral précède la sécrétion des nouveaux virions (Roizman and Sears, 1987). Chez l'hutre, des travaux ont montré la détection de transcrits viraux correspondant à de l'ADN polymérase (ORF100) essentiel pour la réplication du génome viral dès 18h après l'injection de l'OsHV-1 (Segarra et al. 2014b). Il est donc possible que l'ADN détecté soit de l'ADN néo-synthétisé mais ne corresponde pas à de nouveaux virions. Cependant, il semble clair que l'injection de poly(I : C) dans les hutres a permis de stimuler les mécanismes immunitaires permettant de restreindre la réplication virale. Par ailleurs, durant la rédaction de cette thèse, après que les analyses par RNA-seq aient été réalisées, le génome de l'OsHV-1var a été séquencé (Burioli et al. 2017, Rosani and Venier 2017) et est maintenant disponible. L'ensemble de nos analyses par RNA-seq devront être à nouveau effectuées sur ce nouveau génome. En conclusion, d'une part, l'injection de poly(I : C) entrane une surexpression d'un ensemble de gènes, notamment impliqués dans l'immunité, dont l'expression est majoritairement maintenue jusqu'à au moins 10 jours après stimulation. Ce fort niveau de régulation dès l'infection avec le virus OsHV-1 semble être efficace puisqu'il est associé à une réplication de l'OsHV-1 quasi-inexistante et à une protection totale de ces hutres. D'autre part, l'injection d'eau de mer comme contrôle n'entrane qu'une très faible régulation de ces gènes dont l'expression va être très fortement régulée après l'infection avec l'OsHV-1. Cette régulation transcriptomique à l'arrivée du virus est probablement trop tardive et donc inefficace, le virus se réplique fortement et le taux de survie des hutres est proche de zéro. 112 IV. Données complémentaires Différentes études réalisées dans le cadre de différents types d'interactions ont montré l'implication de mécanismes cellulaires dans le phénomène priming immunitaire, telle que la phagocytose (Mori and Stewart 2006, Pham et al. 2007, Rowley and Powell 2007, Roth and Kurtz 2009, Fu et al. 2010, Pope et al. 2011, Zhang et al. 2014). Chez l'hutre, les principales cellules immunocompétentes et phagocytaires sont les hémocytes (Bachere et al. 2015) qui ont été classés en 3 grandes catégories, les blastes, les hyalinocytes et le granulocytes en fonction de leur taille et de leur morphologie (Bachere et al. 1988, Bachere et al. 2015). Nous avons réalisé au cours de cette thèse des travaux préliminaires visant à déterminer l'implication des hémocytes dans le phénomène de priming immunitaire. Pour cela, nous avons réalisé une expérimentation visant à suivre l'évolution des populations hémocytaires sur des temps courts après la stimulation des hutres avec différentes solutions. Pour cela, nous avons injecté trois lots de 15 hutres avec trois types de solutions stimulantes : - Poly(I : C) (10g), pour suivre sont effet lors du priming immunitaire antiviral - V. tasmaniensis LGP32 tués à la chaleur, afin d'identifier s'il existe des différences de réponses antivirales/antibactériennes. - de l'eau de mer filtrée comme contrôle d'injection. Nous avons prélevé l'hémolymphe de 5 des 15 animaux à 3 temps post injection : 24h, 48h et 96h. L'hémolymphe prélevée a été analysée en cytométrie en flux (FACS) permettant d'analyser les proportions des différentes populations hémocytaires. La proportion relative de chaque population hémocytaire par rapport au nombre total d'hémocytes analysés a été calculée pour chaque type de stimulant utilisé (Figure 18) 113 Figure18 : Proportion relative de 3 populations hémocytaires d'hutres lors de stimulation bactériennes ou avec du poly(I : C). Trois populations hémocytaires (blastes, hyalinocytes et granulocytes) étudiées chez du naissain d'hutre injecté par (A) de l'eau de mer filtrée (FSW), (B) du poly(I : C) ou (C) V. tasmaniensis LGP32 à 24h, 48h et 96h après l'injection des solutions. (D) la sous-population de granulocytes pour les différentes conditions aux différents temps. n 5, p-value Anova. Les résultats montrent que les animaux contrôles injectés avec de l'eau de mer seule (FSW) ne présentent pas de différence significative entre les populations hémocytaires, blastes, hyalinocytes et granulocytes aux différents temps post injection (Figure 18 A). Concernant les hutres injectées avec V. tasmaniensis LGP32 tués à la chaleur, il n'y pas de différences de pourcentage pour les blastes et les hyalinocytes aux différents temps. Par contre, nous observons une diminution du pourcentage de granulocytes à 96h (17%), par rapport à 24h et 48h (30 et 32 %, respectivement) (Figure 18 B). Concernant les hutres stimulées avec le poly(I : C) là non plus il n'y a pas de changements populationnels pour le blastes et les hyalinocytes. Cependant, nous observons une 114tuées à la chaleurTemps post injectionPourcentage de populationI : C)Temps post injectionPourcentage de populationFSWTemps post injectionPourcentage de populationpost injectionPourcentage de granulocytesFSW LGP32Poly(I : C)*ABCD augmentation du pourcentage de granulocytes entre 24h (22%) et 48h (39%), qui redescend ensuite au niveau basal à 96h (26%) (Figure 18 C). Ces résultats montrent donc des profils distincts entre les variations de pourcentages de granulocytes chez des animaux stimulés avec des bactéries tuées ou du poly(I : C). Nous pouvons émettre différentes hypothèses pour expliquer ces variations. Une diminution des granulocytes pourrait être due à un phénomène de dégranulation ou une mobilisation, par infiltration, dans d'autres tissus de l'hutre. La diminution du pourcentage de granulocytes suite à une dégranulation a déjà été mise en évidence dans les hémocytes en réponse à l'exposition à une protéine de reconnaissance des peptidoglycanes (Iizuka et al. 2014). Une augmentation des granulocytes pourrait reposer sur une différenciation de cellules agranulaires en cellules granulaires. L'induction de la production de composés granulaires au sein des hémocytes (au cours de la phagocytose par exemple). L'observation d'une augmentation puis d'une diminution de la quantité de granulocytes lors d'une infection virale a par ailleurs déjà été observée chez le pétoncle Chlamys farreri face au virus AVNV suggérant son implication dans les processus immunitaires (Lin et al. 2011). De plus, des travaux portant sur les réponses cellulaires antivirales chez les vertébrés, ont identifié la présence de granules de stress impliqués dans une réponse antivirale (Simpson-Holley et al. 2011, Rozelle et al. 2014). Ces granules de stress sont des corps cytoplasmiques capables de stocker des ARNm et des protéines recrutés en condition de stress (Anderson and Kedersha 2009). Cette composition serait adaptée spécifiquement à un type de stress (réponse antivirale, stress thermique, stress oxydatif, hyperosmolarité, etc. ). Il a été démontré que la quantité de ces granules augmentait en nombre dans le cas d'infections virales chez les vertébrés (Anderson and Kedersha 2009). Ces granules de stress ont été caractérisées comme contenant différents composants d'initiation à la traduction (Buchan and Parker 2009). La présence de granules de stress a été caractérisée chez la drosophile lors de stress thermiques (van der Laan et al. 2012, Gareau et al. 2013, Jevtov et al. 2015). Dans l'hypothèse de la conservation de ces granules de stress chez lhutre, il serait intéressant de rechercher leur présence au sein des populations de granulocytes, notamment par microscopie électronique et par des techniques de révélations par anticorps (protocole établi chez les vertébrés) pour comprendre leur rôle dans le priming. De manière plus générale, nos résultats soulèvent la question de la nature et de la fonction de ces granulocytes. Il serait intéressant de caractériser et d'étudier leur fonction pour comprendre leur implication dans les phénomènes de priming. Ces résultats devront être confirmés en répétant ces expérimentations, sur des temps plus longs après l'injection de poly(I : C) ou de bactéries tuées pour en déterminer la persistance de l'effet. Par ailleurs, en utilisant cette même technique utilisée dans nos travaux préliminaires, les proportions hémocytaires chez des hutres stimulés puis infectés avec les pathogènes virulents 115 pourraient être suivies afin d'identifier leurs réponses au cours de la primo-stimulation et du challenge. De plus, afin d'évaluer les modifications fonctionnelles des populations hémocytaires, des suivis d'activités de phagocytose pourraient être envisagés. Ensuite, comme il n'existe pas de consensus clair sur les lignages hémocytaires (Bachere et al. 2015), des travaux pourraient être réalisés pour identifier d'éventuels progéniteurs. Grâce au suivi des évènements de mitoses par incorporation d'un analogue nucléotidique, l'EdU (5-ethynyl-2-deoxyuridine) puis une révélation en fluorescence analysable en FACS. 116 Discussion générale et perspectives Lafont M. Discussion générale et perspectives L'hutre creuse est victime d'une maladie poly-microbienne tuant depuis 2008 les juvéniles et le naissain dans des proportions alarmantes pouvant atteindre 100% et pour laquelle il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement prophylactique ou thérapeutique (Segarra et al. 2010). Dans cette maladie, la présence d'un agent infectieux, le virus OsHV-1 est fortement associé à ces épisodes de surmortalité massive(Segarra et al. 2010, Martenot et al. 2011). Au début de ces travaux, très peu de données étaient disponibles sur la réponse antivirale chez les mollusques et l'hutre. C'est dans ce contexte qu'ont été développés, au sein de mon laboratoire d'accueil, des projets visant à comprendre et décrire la réponse antivirale et envisager des moyens de protection en utilisant le priming immunitaire. Le priming immunitaire correspond à une amélioration de la réponse immunitaire lors d'une seconde rencontre avec un agent pathogène déjà rencontré. Des premiers travaux avaient permis de mettre en évidence qu'une injection d'ARN double brin synthétique, le poly(I : C), permettait d'entraner une réponse antivirale efficace lors d'une infection avec l'OsHV-1 (Green and Montagnani 2013). Ces résultats ont donc suggéré pour la première fois l'existence d'un priming immunitaire antiviral chez un Lophotrochozoaire, l'hutre creuse Crassostrea gigas. En se basant sur des données préliminaires obtenues au laboratoire, ces travaux de thèse avaient pour objectif de caractériser le priming immunitaire antiviral l'hutre creuse Crassostrea gigas face au virus pathogène, l'Ostreid herpès virus 1 (OsHV-1). Ces travaux de thèse se sont focalisés dans un premier temps sur une approche phénoménologique permettant de décrire le phénomène de priming immunitaire et dans un deuxième temps sur une approche globale permettant d'appréhender les mécanismes moléculaires sous-jacents au priming immunitaire antiviral chez l'hutre. 1. Le priming immunitaire et ses mécanismes chez l'hutre creuse La caractérisation du priming immunitaire est un aspect très important pour la compréhension de ce phénomène et beaucoup d'études ne se focalisent encore que sur une description partielle de ce phénomène. Il est important de pouvoir intégrer différents aspects comme l'effet sur l'amélioration de la survie, mais aussi 2 éléments importants, à la base de ce phénomène, la spécificité de la réponse et la mémoire immunitaire. A l'heure actuelle, le priming immunitaire antiviral est encore très peu décrit dans la littérature et beaucoup de questions restent encore sans réponse concernant ces mécanismes. C'est ce que ces travaux de thèse ont entrepris : décrire le priming immunitaire antiviral de la manière la plus exhaustive possible pour clairement 117 identifier et caractériser ce priming immunitaire. Pour ce faire, nous avons utilisé un modèle in vivo utilisant le virus pathogène OsHV-1, un agent mimétique viral, le poly(I : C) et un hôte expérimental, l'hutre creuse Crassostrea gigas. a. Spécificité du priming immunitaire chez l'hutre Une des caractéristiques et sujet de débat concernant le priming immunitaire est sa spécificité. Des travaux ont mis en évidence des cas de protections croisées comme par exemple entre une primo stimulation avec du LPS qui protège d'une infection fongique chez Tenebrio molitor (Moret and Siva-Jothy 2003). D'autres travaux ont suggéré le rôle d'une primo-stimulation avec la bactérie du genre Wolbachia chez le moustique Aedes aegypti entranant une forte protection antivirale contre le virus de la dengue (Rances et al. 2012). Les travaux précédents réalisés au laboratoire suggèrent que le poly(I : C) induit une protection spécifiquement antivirale. En effet, ces travaux ont montré que la stimulation des hutres par des bactéries pathogènes V. tasmaniensis LGP32 tuées à la chaleur ne permettait pas de protéger des infections virales à l'OsHV-1 (Green and Montagnani 2013)(Lafont et al. en révision). Chez l'hutre, nous n'avons pas observé ce phénomène de protection croisée par une stimulation bactérienne entranant une protection antivirale. Nos résultats suggèrent donc une forme de spécificité de réponse. Nous avons donc au cours de cette thèse mené des approches pour pouvoir caractériser la spécificité du priming antiviral et explorer d'autres formes de priming immunitaire. Dans un premier temps, nous avons testé la spécificité de la protection induite pas le poly(I : C). Nous avons montré qu'une protection antivirale efficace pouvait être induite par l'injection du poly(I : C) mais aussi de différents types d'acides ribonucléiques doubles brins et simples brins, de tailles et de séquences variables (cf Chapitre 1, Article 1). Des travaux réalisés chez la crevette ont montré que cette diversité d'acides nucléiques permettait de protéger des infections virales au WSSV (white spot syndrome virus) (Escobedo-Bonilla et al. 2015). Cependant, le poly(I : C) ne protégeait que transitoirement des infections virales (Robalino et al. 2004, Wang et al. 2013b). Chez la truite arc-en- ciel tout comme chez les mammifères, des travaux ont montré que différents ARN doubles brins induisaient une protection antivirale mais que cette protection était dépendante de la taille des fragments d'ARN utilisés (Mian et al. 2013, Poynter and DeWitte-Orr 2015). Les ARNs de grande taille entranaient une réponse plus robuste que ceux de petite taille (Poynter and DeWitte-Orr 2015). L'ensemble de ces travaux suggère chez les vertébrés et les invertébrés que les réponses immunitaires sont dirigées par différents mécanismes et différentes voies de signalisations (Robalino et al. 2007, de Faria et al. 2013, Labreuche and Warr 2013, Mian et al. 2013, Wang et al. 2015). Il serait intéressant de pouvoir, chez l'hutre, identifier précisément les mécanismes mis en jeu lors des 118 stimulations avec ces différents acides nucléiques. Pour cela, nous pourrions d'une part comparer les profils d'expression transcriptomique des gènes candidats identifiés par nos travaux de RNA-seq lors de stimulation avec du poly(I : C) avec les profils de réponse lors de stimulation avec les autres acides nucléiques. Une autre approche plus globale par RNA-seq de novo permettrait alors de pouvoir identifier les différences de mécanismes mis en place lors de la stimulation par ces différents acides nucléiques. Enfin, afin de décrire ce priming immunitaire antiviral de manière plus exhaustive à des fins appliquées et pour comprendre plus en profondeur les mécanismes mis en jeu, il serait important de pouvoir tester une plus grande amplitude de stimulant pour caractériser les limites de ce priming. Pour cela, d'autres types de molécules ayant montré des effets antiviraux chez d'autres modèles pourraient être utilisées comme : du LPS ayant montré un potentiel d'activation de TLR3 (agoniste du poly(I : C)chez les vertébrés (Pan et al. 2011) ; de l'ADN CpG (Wang et al. 2013b) ; de l'ADN codant des protéines virales de l'OsHV-1 (Rout et al. 2007) ou encore directement des protéines virales de l'OsHV-1, dont la technique a été testée à partir de protéines de WSSV chez la crevette (Witteveldt et al. 2004). Dans un second temps, nous voulions tester si la protection induite par le poly(I : C) était spécifique de la protection au virus OsHV-1. A l'heure actuelle, aucun autre virus pathogène n'est identifié chez Crassostrea gigas, associé aux mortalités, rendant impossible l'étude de l'effet du poly(I : C) sur d'autres virus que l'OsHV-1 chez C. gigas. Nous nous sommes donc intéressés à un autre microbe pathogène associé aux mortalités chez les juvéniles de C. gigas, la bactérie pathogène Vibrio tasmaniensis LGP32. Chez l'hutre, nous avons montré que le poly(I : C) ne protégeait pas des infections contre V. tasmaniensis LGP32 suggérant donc une réponse immunitaire poly(I : C) dépendante, spécifiquement antivirale. Ce résultat est cohérent avec la littérature. En effet aucune étude ne faisant état d'une protection croisée suite à une primo-stimulation virale contre des bactéries n'a encore été publiée à notre connaissance. Cependant, il faudrait confirmer ce résultat d'absence de protection croisée en testant l'effet du poly(I : C) sur d'autres agents pathogènes et notamment d'autres espèces bactériennes pathogènes chez l'hutre de l'espèce Vibrio tasmaniensis et de l'espèce Vibrio crassostreae (Gay et al. 2004, Lemire et al. 2015, Bruto et al. 2017). Enfin, des travaux suggèrent que le priming immunitaire n'est pas restreint à la protection antivirale chez l'hutre mais que des mécanismes antibactériens pourraient aussi exister (Zhang et al. 2014, Liu et al. 2016, Li et al. 2017a). Nos résultats préliminaires restent à être confirmés et les mécanismes restent encore à être identifiés. Ces observations représentent une perspective intéressante dans le modèle hutre o des priming immunitaires antibactériens et antiviraux sont identifiés et pourraient permettre de comprendre le poids relatif de chaque agent pathogène dans cette maladie multifactorielle. 119 b. Une protection à long terme Une autre question au cœur des débats concernant le priming immunitaire est celle de l'existence d'une forme de mémoire immunitaire innée. Dans nos travaux, nous avons montré une amélioration de la survie sur le long terme, lors d'infections réalisées en milieu contrôlé et en milieu naturel plus de 4 mois après la stimulation avec le poly(I : C). Comparée à d'autres études, cette durée est la plus longue identifiée chez un invertébré. Cependant, il est important de tenir compte de la durée de vie de l'animal. Chez l'hutre creuse, les larves, le naissain et les juvéniles sont sensibles aux infections à l'OsHV-1 tandis que les adultes le sont beaucoup moins. Sachant que cette transition des stades larvaires aux stades adultes dure environ 2 ans (dépendant de l'élevage et extrêmement variable suivant les zones géographiques), la durée de protection que nous avons identifiée représente environ 20% de la période sensible de l'hutre. Il est donc nécessaire de pouvoir tester la durée de la protection du poly(I : C) sur toute la vie de l'hutre pour déterminer si cet effet protecteur est durable et stable ou alors à long terme mais transitoire. De plus, il est intéressant de noter que cette protection induite par le poly(I : C) est relativement longue et semble stable chez l'hutre en comparaison aux protections transitoires observées chez différents modèles invertébrés (Milutinovi and Kurtz 2016). En effet, chez la crevette, l'injection de poly(I : C) 6h avant une infection virale par le WSSV protège des mortalités (Wang et al. 2013b) tandis que si le poly(I : C) est injecté 72h avant l'infection, aucune protection n'est observée (Robalino et al. 2004). Ces résultats suggèrent chez la crevette une réponse antivirale précoce et transitoire qui ne permet pas de protéger sur le long terme. A l'inverse, chez l'hutre, nous avons montré que cette protection est précoce et durable suggérant ainsi l'existence d'une forme de mémoire immunitaire. Une des possibilités de cette protection sur le long terme serait une persistance du poly(I : C) dans l'hutre qui stimulerait de manière continue les mécanismes antiviraux. Nos travaux ont montré que le poly(I : C) est dégradé en moins de 24h dans l'hémolymphe et en moins de 48h dans l'eau de mer (cf Article 1, chapitre 1) et les travaux de Masood et collaborateurs ont montré que la détection du poly(I : C) diminuait après 15h post-injection chez l'hutre Saccostrea glomerata (Masood et al. 2016) et après 24h chez C. gigas en suggérant sa persistance à 48h (Masood et al. 2017). De plus, chez l'homme, le poly(I : C) a un temps de demi-vie de 6 minutes dans le plasma humain (Declercq 1979). Il est peu probable que cette protection sur le long terme soit due à une stimulation continue induite par la persistance du poly(I : C) dans l'hutre. Cependant, il est nécessaire de pouvoir identifier la localisation du poly(I : C) dans les différents tissus de l'hutre et d'y suivre sa persistance. Pour cela, il est envisageable d'effectuer des marquages anticorps anti-poly(I : C) sur des coupes histologiques d'hutres. 120 Cependant, une réponse immunitaire de type maintenue pose la question du coût énergétique pour l'hutre. En effet, une réponse maintenue est extrêmement couteuse et un investissement aussi important ne peut pas être sans répercussion sur l'hutre (Moret and Schmid- Hempel 2000). Dans le cas d'un trade-off entre une diminution de l'investissement physiologique d'une fonction ou d'un processus biologique au détriment de l'immunité a été démontré notamment chez les plantes (Huot et al. 2014) et les invertébrés (Schwenke et al. 2016). Dans le cas de l'hutre, cet effet de l'investissement énergétique dans l'immunité pourrait avoir un impact dans les populations d'hutres en zones d'élevages. Il serait intéressant dans ce cas d'étudier la fitness des hutres au cours du priming par du poly(I : C) et de déterminer si une réponse maintenue pourrait se faire au détriment de la croissance des animaux ou de tout autre processus physiologique. c. Les mécanismes du priming immunitaire antiviral Pour étayer les hypothèses concernant la spécificité et la mémoire induite par le priming immunitaire, la question clé reste celle des bases moléculaires sous-jacentes à ces processus. Au cours de cette thèse, nous avons entrepris d'identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents au phénomène de priming immunitaire antiviral, encore peu décrits et dont les données sont extrêmement fragmentaires dans la littérature. Pour ce faire, nous avons réalisé une approche globale par séquençage des ARN pour identifier les gènes régulés au cours de ce priming immunitaire antiviral chez C. gigas. Par cette approche, nous avons pu constater que le poly(I : C) entranait la régulation de nombreux gènes impliqués dans différentes fonctions immunitaires et notamment des fonctions antivirales, ce qui expliquerait pourquoi la protection est spécifique contre l'OsHV-1 et ne protège pas contre Vibrio tasmaniensis LGP32. Parmi ces fonctions nous pouvons relever le système interferon de type I ainsi que des mécanismes de mort cellulaire programmée. Alors que bien décrit chez les vertébrés (Randall and Goodbourn 2008), le système interféron est un des mécanismes antiviraux absents chez les insectes (Kingsolver et al. 2013). Chez l'hutre, la voie des interférons semble être conservée d'après les analyses in silico du génome (Green et al. 2015a). Les travaux réalisés par Green et collaborateurs en 2015 ont en effet pu mettre en évidence la présence dans le génome de différentes voies de signalisation antivirales suggérant l'existence d'un système de type interféron (Green et al. 2015a). Des analyses transcriptomiques réalisées lors d'infections par l'OsHV- 1 ou de stimulations d'hutres par le poly(I : C), suggèrent son existence fonctionnelle, bien qu'à ce jour, aucun interféron n'a encore été identifié chez l'hutre (Segarra et al. 2014c, He et al. 2015, Rosani et al. 2015, Green et al. 2016b, Pauletto et al. 2017). Cependant, l'expression de différents ISGs (interferon stimulated genes) peut aussi être directement induite en l'absence d'interféron (Sen and Peters 2007). D'autres fonctions identifiées lors de l'approche RNA-seq sont les mécanismes de mort cellulaire. Ces fonctions de mort cellulaire, sont des mécanismes permettant de juguler 121 l'infection virale en limitant la réplication du virus dans les cellules. L'apoptose est un des mécanismes souvent décrits comme impliqués dans les réponses antivirales lors d'infections avec l'OsHV-1 (pour revue, voir (Wang et al. 2017) et (Arzul et al. 2017). De plus, il n'est pas surprenant de voir l'apoptose régulée en réponse à un ARN double brin, ce phénomène est caractérisé chez les vertébrés (Gantier and Williams 2007). Cependant, chez l'hutre, quelle est la fonction de l'apoptose lors d'une stimulation avec des acides nucléiques alors que l'OsHV-1 n'est pas présent dans l'organisme ? Bien qu'a priori ce mécanisme ne présente aucun intérêt pour l'hutre dans ce cas, dans nos analyses, nous avons identifié différentes molécules pro-apoptotiques telles que des caspases et d'autres anti-apoptotiques tels que des IAP (inhibitor of apoptosis proteins). Il serait nécessaire d'identifier l'apoptose d'un point de vue fonctionnel, dans des coupes histologiques d'hutres stimulées par du poly(I : C) et suivre par marquage TUNEL ou TMRNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase TetraMethylRhodamine Nick End Labelling) des fragmentations d'ADN et ainsi déterminer si des cellules rentrent en apoptose en réponse à la stimulation avec du poly(I : C). Un autre mécanisme antiviral bien connu chez les vertébrés et les invertébrés est l'interférence de l'ARN. C'est une des voies préférentielles dans l'immunité antivirale des arthropodes (Kemp et al. 2013, Nayak et al. 2013). Ce mécanisme a été identifié chez la crevette (pour revue, voir (Labreuche and Warr 2013), notamment lors de primo-stimulations avec des acides nucléiques, efficaces pour lutter contre le virus WSSV (Nilsen et al. 2017). Chez l'hutre, le génome de l'hutre a révélé la présence de ce mécanisme conservé au cours de l'évolution (Green et al. 2015a). Cette voie est fonctionnelle chez les mollusques (voir pour revue, voir Owens et al. 2015), mais la stimulation de cette voie par des acides nucléiques synthétiques tels que le poly(I : C), n'ayant pas d'homologie de séquence avec des ARNm suggère qu'elle n'est pas impliquée dans la réponse au poly(I : C). Nos analyses transcriptomiques par RNA-seq tendent à confirmer cette hypothèse puisque nous n'observons pas de régulation transcriptomique de cette voie. En revanche, des ARNs doubles brins présentant des homologies de séquences avec le virus OsHV-1 pourraient jouer un rôle dans cette immunité antivirale. Cette piste reste encore à être étudiée. Par ailleurs, la diversification des récepteurs (PRRs) pourrait participer aux mécanismes de priming immunitaire antiviral. Dépourvus d'un système adaptatif, les invertébrés possèdent cependant de nombreux récepteurs extrêmement diversifiés pouvant être impliqués dans la spécificité de réponse comme c'est le cas notamment des Dscam et des FREPs. En effet, les Dscam sont impliqués dans le phénomène de spécificité de réponse lors d'infections récurrentes permettant de répondre plus efficacement lors d'infections consécutives de manière spécifique (Dong et al. 2006, Kurtz and Armitage 2006, Dong et al. 2012). Concernant les FREPs, ces protéines ont été suggérés comme participant aux mécanismes de spécificité de réponse dans le phénomène de 122 priming immunitaire chez Biomphalaria glabrata face à Schistosoma mansoni (Knight et al. 2014, Pinaud et al. 2016). Dans le génome de l'hutre, la présence de récepteurs extrêmement diversifiés pourrait jouer ce rôle (Zhang et al. 2015) et l'augmentation du nombre de ces récepteurs suite à une primo stimulation pourrait alors ainsi permettre de répondre plus rapidement et plus efficacement lors d'une seconde infection et ainsi participer au phénomène de mémoire immunitaire. Cependant, ces molécules sont caractérisées comme telles à partir d'homologies de séquences par rapport à des organismes modèles et leur rôle fonctionnel reste encore à démontrer. Par ailleurs, des travaux réalisés chez les vertébrés ont émis l'hypothèse que des molécules de danger (DAMPS, pour damage-associated molecular patterns ) jouent un rôle indirect dans l'activation de réponse immunitaire innée antivirale (pour revue, voir (Collins and Mossman 2014). Ces DAMPS peuvent aussi induire une protection à long terme (Crisan et al. 2016) et pourrait donc participer à cette protection sur le long terme. Tandis que le poly(I : C) est dégradé rapidement dans les fluides de l'hutre et l'eau de mer, nous avons observé une réponse de type maintenue au niveau de l'expression transcriptomique. Bien que la persistance du poly(I : C) dans les tissus n'ait pas été identifiée (Masood et al. 2017), si ce n'est pas une activation continue due au poly(I : C), l'hypothèse d'une réponse maintenue, pendant 10 jours dans notre expérimentation, soulève différentes questions. En effet, quel est le profil d'expression des gènes candidats sur le long terme ? Différentes hypothèses existent sur les profils de réponse immunitaire et peuvent être de type maintenue, rappelée ou de type shift immunitaire (Coustau et al. 2016). Dans ce cas, quel est le type de profil engagé dans le cas du priming immunitaire antiviral chez l'hutre sur le long terme ? Nos résultats provenant de nos analyses phénoménologiques montrent une protection au minimum de 126 jours et nos résultats obtenus par RNA-seq tendent à montrer un profil majoritairement maintenu à 10 jours. Il est possible que les temps étudiés dans notre étude transcriptomique ne soient pas suffisamment longs pour observer un retour à un niveau basal d'expression. Il est donc nécessaire de pouvoir suivre sur une cinétique beaucoup plus longue le niveau d'expression de différents gènes candidats identifiés à partir de nos données transcriptomiques, pour pouvoir clairement identifier le ou les profils de réponses impliqués dans le priming immunitaire antiviral chez C. gigas. Les hypothèses de mémoire immunitaire et des mécanismes moléculaires seront testés par le suivi des gènes candidats par PCR quantitative en temps réel. Lors de nos expérimentations pour identifier sur le long terme, nous avions montré une protection efficace pour une durée minimale de 4 mois en laboratoire (cf Chapitre 1, Article 1). Nous disposons donc de l'échantillonnage nécessaire pour répondre à la question du maintien non plus à 10 jours, mais à 126 jours. Par ailleurs, ces analyses moléculaires par des approches transcriptomiques permettent d'identifier des voies de signalisations a priori impliquées dans le priming immunitaire ainsi que des gènes candidats. Cependant, le rôle de 123 ces candidats n'est que putatif. En effet, il serait nécessaire de pouvoir valider de manière fonctionnelle l'implication de ces gènes dans ce phénomène de priming immunitaire et ainsi caractériser leur rôle dans les mécanismes de protection. Chez l'hutre, quelques travaux ont utilisé la technique de l'interférence à l'ARN en utilisant des ARN doubles brins relativement longs, entre 525 pb et 877 pb, pour réprimer avec succès l'expression du gène vasa (Fabioux et al. 2009). Cette technique a été aussi utilisée avec succès en ciblant TGF chez l'hutre (Huvet et al. 2012). Cependant, l'utilisation de cette technique peut présenter des limites en termes d'applications lorsque ce sont des gènes immunitaires que l'on cherche à interférer. En effet les ARNs doubles brins plus ou moins longs stimulent l'immunité antivirale via la reconnaissance par d'autres mécanismes que les voies de l'interférence à l'ARN. Récemment, des travaux ont montré l'efficacité de l'injection de siRNA à des hutres pour réprimer in vivo l'expression de gènes immunitaires comme Bax (Li et al. 2017b) ou de RIG-1 (Huang et al. 2017). Ces dernières approches peuvent permettre une approche prometteuse pour caractériser de manière fonctionnelle l'implication des gènes candidats. Concernant les gènes candidats à suivre, ce choix est une étape critique. Différents paramètres issus de l'ensemble de nos résultats et de la littérature vont permettre d'orienter le choix de ces gènes. Premièrement, notre analyse transcriptomique globale a révélé de nombreux gènes régulés par la stimulation avec du poly(I : C) jusqu'à 10 jours, mais nos expérimentations phénoménologiques ont montré que la protection est induite dès 24h. Cette observation tend donc à montrer que les gènes régulés dès 24h font partie des gènes candidats pour expliquer l'efficacité du priming antiviral. Ensuite, dans la littérature, de nombreux travaux se sont intéressés à la réponse transcriptomique lors d'infection virale (Jouaux et al. 2013, Green et al. 2014a, He et al. 2015, Rosani et al. 2015, Green et al. 2016b) et ont donc permis d'identifier des gènes régulés chez l'hutre lors de l'infection virale pour tenter de limiter cette infection. Ces différents travaux ont étudié la réponse antivirale chez des hutres infectées avec un broyat d'hutre contenant l'OsHV-1 (Schikorski et al. 2011b). Cependant, dans cette solution infectieuse, peuvent se trouver différents éléments comme des acides nucléiques libres, d'hutres, de virus ou de bactéries, mais aussi des produits de dégradation virales comme des protéines d'enveloppes, de nucléocapsides ou des produits de dégradations bactériens comme des LPS par exemple. Il y a donc a priori dans ces études, des gènes non nécessaires à la lutte contre l'OsHV-1 sont régulés, empêchant ainsi d'identifier les gènes clés de la réponse immunitaire antivirale. De plus, les études transcriptomiques réalisées dans le cadre du projet DECIPHER sur des familles d'hutres aux phénotypes extrêmement contrastés en terme de survie à cette maladie poly-microbienne tendent à montrer une réponse très précoce chez les hutres résistante et une réponse similaire, plus intense mais plus tardive chez les hutres sensibles (de Lorgeril et al. en préparation). En complément, nos travaux réalisés sur l'étude de l'effet du poly(I : C) 124 pourraient donc apporter une clé permettant de déchiffrer les gènes essentiels et nécessaires à la protection des hutres. A partir de l'ensemble de ces informations et la confrontation des gènes identifiés comme étant régulés lors d'infections à l'OsHV-1 provenant de la littérature, des données provenant du projet DECIPHER ainsi que nos données de RNA-seq, nous pourrions identifier différents gènes dont l'expression précoce est nécessaires aux hutres pour survivre aux infections virales et alors être de bons gènes candidats à l'étude des mécanismes du priming immunitaire antiviral. D'autres hypothèses de mécanismes sous-jacents au priming immunitaire peuvent être envisagées d'après la littérature et nos expérimentations préliminaires. C'est le cas notamment de la reprogrammation épigénétique ou des mécanismes cellulaires. Ces mécanismes pourraient apporter des réponses à deux questions essentielles : o et comment le message de mémoire est-il stocké ? Tout d'abord, de plus en plus de travaux réalisés chez les vertébrés tendent à montrer que la reprogrammation épigénétique est un des éléments centraux dans les mécanises immunitaires entranant une expression génique appropriée en réponse à différents facteurs notamment des pathogènes (Fernandez-Morera et al. 2010). Cette reprogrammation épigénétique passe par des modifications de marques ou de processus épigénétiques parmi lesquels on retrouve, la méthylation de l'ADN, la modification de la structure chromatinienne, le changement de marque des histones ou encore l'implication d'ARN non codant jouant un rôle dans les étapes de transcription (Bannister and Kouzarides 2011). La reprogrammation épigénétique a été montrée comme jouant un rôle central dans la mémoire immunitaire innée ( trained immunity ) chez les vertébrés (Saeed et al. 2014). Chez les plantes, la reprogrammation épigénétique est suggérée comme étant un des mécanismes impliqués dans la résistance systémique acquise (ou systemic acquired resistance , SAR) (Conrath et al. 2015). A l'heure actuelle, aucune étude n'a permis de clairement révéler le rôle d'une reprogrammation épigénétique dans le priming immunitaire durant la vie de l'individu ou de manière trans-générationnelle. Cependant, différents travaux ne font que suggérer que ce mécanisme pourrait participer au priming immunitaire (Castro-Vargas et al. 2017) et plus généralement à la résistance à certains pathogènes (Galindo-Villegas et al. 2012, Vilcinskas 2016, Mukherjee et al. 2017). De plus, des travaux réalisés dans le laboratoire sur le modèle Biomphalaria glabrata dans le cadre de la thèse de Silvain Pinaud (Thèse de Doctorat de Silvain Pinaud, 2014-2017), tentent d'étudier ces mécanismes et suggèrent l'implication d'une reprogrammation épigénétique comme support de l'immunité innée mémoire chez ce mollusque gastéropode (communication personnelle, Silvain Pinaud et Benjamin Gourbal). Ensuite, durant ces travaux de thèse, nous avons identifié des mécanismes moléculaires reliés au phénomène de priming immunitaire. Cependant, l'ensemble des analyses a été réalisé sur des individus entiers et les mécanismes cellulaires n'ont pas encore été 125 caractérisés. Les travaux réalisés chez l'hutre dans le cadre de priming immunitaire antibactériens ont révélé un rôle important des mécanismes de phagocytose joué par les hémocytes(Zhang et al. 2014, Li et al. 2017a). De plus, des travaux récents ont montré que l'OsHV-1 est détectable dans les hémocytes par des techniques de PCR quantitative, immunofluorescence et microscopie électronique à transmission et semble donc être un des tissus cibles de l'OsHV-1 (Martenot et al. 2017). Dans le cadre de ma thèse nous avons entrepris d'étudier les réponses cellulaires au cours du priming immunitaire antiviral et nous avons observé des changements de proportions populationnelles particulièrement chez les granulocytes lors de stimulations avec du poly(I : C) (cf Chapitre 2, IV). En reliant nos résultats avec ceux de la littérature, il est probable que différentes sous-populations hémocytaires soient particulièrement impliquées dans cette immunité antivirale. Une approche possible serait de suivre ces différentes sous populations chez des hutre stimulées ou non par du poly(I : C) puis infectées par l'OsHV-1. D'une part, des tris cellulaires effectués par FACS ( fluorescence-activated cell sorting ) permettraient de dénombrer et séparer les différentes sous populations hémocytaires. D'autre part, des marquages par immunofluorescence permettraient d'identifier la présence de l'OsHV-1 dans ces sous-populations hémocytaires et ainsi caractériser leur rôle dans les mécanismes de priming immunitaire antiviral. Enfin, les résultats que nous avons obtenus par nos analyses de RNA-seq ont donc permis de montrer une réponse immunitaire majoritairement de type maintenue. De plus, ces résultats nous ont aussi permis de révéler que l'hutre devait répondre très précocement pour pouvoir être protégée des infections à l'OsHV-1. De plus, durant les travaux de cette thèse, nous avons travaillé à partir d'hutres de fonds génétiques extrêmement différents et qui étaient toutes protégées des infections suite à la stimulation par le poly(I : C). Nos travaux ont permis de suggérer que des hutres sensibles aux infections virales sont capables de survivre si elles ont été stimulées par le poly(I : C) permettant d'activer précocement l'expression des gènes nécessaires à la survie. Les travaux réalisés dans le cadre du projet DECIPHER ont eux aussi révélé que la réponse immunitaire des hutres résistantes était plus précoce que celle des hutres sensibles au syndrome de mortalité massive des juvéniles (de Lorgeril et al. en préparation). L'ensemble de ces observations, pose donc la question des mécanismes déclencheurs de cette réponse. Les hypothèses émises précédemment concernant les mécanismes épigénétiques pourraient participer à expliquer cette précocité d'activation. 126 2. Le rôle de l'OsHV-1 dans la maladie poly-microbienne Dans ces travaux de thèse, nous avons montré que la primo-stimulation des hutres par du poly(I : C) avait pour conséquence une charge virale beaucoup plus faible lors d'infection à l'OsHV-1 par rapport à des animaux non stimulés. Ces résultats sont cohérents avec ceux observés dans d'autres études chez l'hutre (Green and Montagnani 2013), mais aussi chez les vertébrés (Alexopoulou et al. 2001). Notre approche par RNA-seq nous a permis de suivre les transcrits viraux lors d'infections chez les hutres stimulées ou non stimulées. La réplication de l'OsHV-1 est beaucoup plus réduite voire inexistante lorsque les hutres avaient été stimulées avec le poly(I : C) (cf Article 2, chapitre 2), ce qui explique des charges virales en ADN détectées très faibles. Cependant, nous pouvons émettre 2 hypothèses par rapport à ces résultats. Soit la stimulation des hutres par le poly(I : C) a pour effet d'empêcher ou de limiter l'entrée du virus, soit elle n'empêche pas l'entrée du virus mais limite sa réplication dans des étapes critiques du cycle de réplication. Concernant la première hypothèse, chez les vertébrés, des travaux ont montré que la stimulation de macrophages murins avec du poly(I : C) entrane une augmentation de l'enzyme cholestérol 25-hydroxylase via la production d'interferons (Park and Scott 2010). Cette enzyme convertit le cholestérol en 25- hydroxycholesterol (25HC), capable d'empêcher l'entrée de nombreux virus enveloppés à ADN et ARN comme le virus Ebola, le VSV (Virus de la stomatite vésiculaire), le HIV (virus de l'immunodéficience humaine) ou encore l'herpès virus murin 68 (MHV68) (Liu et al. 2013b). Le 25HC bloque la fusion de la membrane entre le virus et la cellule l'empêchant ainsi de rentrer dans la cellule et donc de s'y répliquer. Cette molécule est présente dans le génome de l'hutre (CGI 10015440), mais n'est pas régulée dans notre modèle lors d'une stimulation par le poly(I : C) ni l'OsHV-1. Il est donc possible qu'un mécanisme similaire soit mis en jeu dans notre modèle, mais n'ait pas encore été identifié. Concernant la deuxième hypothèse, des travaux réalisés chez les vertébrés ont montré que la grande diversité d'ISGs (Interferon stimulated genes) peut empêcher la réplication virale en intervenant dans toutes les étapes du cycle (fusion à la membrane, transcription, traduction, assemblage, excrétion). C'est le cas de la vipérine, un ISG présent chez l'hutre (Green et al. 2015b), dont la cible chez les vertébrés sont les radeaux lipidiques ; son interaction avec ces radeaux lipidiques va empêcher la libération des virus néo-synthétisés (Wang et al. 2007). Dans ce cas, l'ADN viral est quantifiable par les techniques de qPCR, mais il n'y a pas de nouveaux virus libérés. Dans nos analyses, nous observons une augmentation très faible de la charge virale en ADN chez les animaux stimulés avec du poly(I : C) et infectés avec l'OsHV-1 ainsi qu'une très faible réplication virale. Il est donc probable que ce soit une combinaison de nos deux hypothèses qui soit mise en place, le poly(I : C) empêche l'entrée du virus OsHV-1, mais quelques virus échappent à ce premier contrôle et entrent dans la cellule puis initient une réplication qui serait ensuite bloquée 127 avant la libération des nouveaux virus. A l'heure actuelle, le cycle viral de l'OsHV-1 n'est pas caractérisé et l'absence de lignées cellulaires ne permet pas encore de confirmer ou infirmer ces hypothèses. Cependant, ces hypothèses pourraient être vérifiées via le suivi des transcrits d'OsHV-1 par RNA-seq sur une cinétique plus longue ainsi que l'identification des fonctions des transcrits régulés. Par ailleurs, des observations en microscopie électronique à transmission pourraient permettre de savoir si le virus rentre ou non dans des cellules. Des travaux récents ont permis de montrer que l'OsHV-1 est capable de se répliquer dans des primo-cultures d'hémocytes et ces travaux pourraient permettre de lever ce verrou (Morga et al. 2017). Nos résultats en milieu contrôlé ont montré que le poly(I : C) protège des mortalités lors d'infections à l'OsHV-1 mais ne protège pas des infections avec une bactérie pathogène chez l'hutre. Dans nos expérimentations en milieu naturel, nous avons montré que le traitement des hutres avec du poly(I : C) permettait de protéger du syndrome de surmortalité massive affectant les juvéniles alors que le site ostréicole o se trouvaient les hutres était positif aux détections de Vibrios du clade Splendidus (RESCO, Juin 2016). De plus, nous avons montré que le poly(I : C) permet de limiter drastiquement la réplication du virus, montrant ainsi clairement un rôle primordial du virus dans cette maladie poly-microbienne affectant les juvéniles. Le virus OsHV-1 apparat donc comme essentiel et nécessaire au déclenchement de la maladie. Ainsi, différentes questions restent en suspens. Comment l'OsHV-1 participe-t-il au phénomène de surmortalité massive chez les juvéniles ? Le virus OsHV-1 est-il suffisant pour induire les mortalités ? Ces questions sont au cœur du projet DECIPHER. Pour répondre à cette première question, les travaux réalisés ont permis de révéler que l'infection virale déstabilise le microbiote des hutres puis des bactéries opportunistes vont coloniser l'hutre, parmi lesquelles on peut retrouver des pathogènes, participant au phénomène de mortalité (de Lorgeril et al. en préparation). Ces résultats semblent orienter les hypothèses vers un rôle essentiel et nécessaire de l'OsHV-1 mais a priori pas suffisant (Petton et al. 2015). Pour confirmer cette hypothèse, il faudrait infecter des hutres axéniques uniquement avec l'OsHV-1, ce qui est à l'heure actuelle impossible dans ce modèle. Par ailleurs, dans le cadre d'infections naturelles, différents travaux ont révélé des charges virales pouvant être importantes chez des individus ne déclenchant pas de mortalité, soulevant ainsi des questions de tolérance lors de ces infections en milieu naturel (Petton et al. 2015, Evans et al. 2017a). 128 3. Perspectives appliquées A l'heure actuelle, les sélections d'hutres reposent sur des programmes de sélections massales, longs et très coûteux (Degremont et al. 2010b, Degremont et al. 2015b). Comme nous venons de le voir au cours de cette thèse, nos travaux ont permis de mettre en évidence que la stimulation des hutres par le poly(I : C) permettait de réduire considérablement les mortalités lors d'infections virales à l'OsHV-1. De plus, le traitement des hutres par cet ARN double brin permet de protéger les hutres du phénomène de surmortalité massive en milieu naturel, améliorant le taux de survie entre 80% et 93% suite à deux déploiements deux années consécutives. Ces résultats sont extrêmement encourageants pour permettre d'apporter des solutions de sortie de crise ostréicole. Cependant, il est à l'heure actuelle difficilement envisageable de pouvoir traiter l'ensemble d'une production en injectant du poly(I : C) aux hutres. Bien que la stimulation des hutres par le poly(I : C) soit réalisable par balnéation, la question de l'effet du poly(I : C) sur la consommation humaine reste en suspens pour des raisons sanitaires. En revanche, les travaux développés par Green et collaborateurs ainsi que les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse (cf Chaptire 1, IV, B) ont montré que cette protection antivirale induite par le poly(I : C) pourrait être transmise à la descendance (Green et al. 2016a). Ces résultats sont extrêmement intéressants et présenteraient une avancée majeure en termes d'application car ils permettent d'éviter le traitement direct des hutres à visée commerciale en traitant seulement les géniteurs. Il est maintenant important de tester l'effet de cette stimulation parentale sur plusieurs générations d'hutres pour en déterminer les bénéfices apportés en termes de survie et ainsi éviter tout risque sanitaire lié à la consommation de poly(I : C). D'autres travaux par QTL ont permis d'identifier des loci impliqués dans la résistance chez C. gigas aux infections à l'OsHV-1 (Sauvage et al. 2010). Les gènes candidats impliqués dans la survie des hutres lors de stimulations par le poly(I : C), identifiés à partir de notre approche globale, pourraient être comparés avec ces analyses QTL et ainsi participer aux approches de sélection de familles d'hutres par rapport à des traits de survie. 129 130 Conclusion générale Montagnani C. Conclusion générale Cette thèse a porté sur l'identification et la caractérisation du priming immunitaire antiviral chez l'hutre creuse Crassostrea gigas. Ces travaux ont été réalisés dans un contexte d'épisodes de surmortalité massive d'origine poly-microbienne, affectant l'ostréiculture à l'échelle mondiale depuis 2008. Grâce à l'utilisation d'un ARN double brin synthétique, un agent mimétique viral, le poly(I : C), nous avons pu identifier un priming immunitaire antiviral efficace chez l'hutre face à l'Ostreid herpes virus (OsHV-1). Dans un premier temps, notre approche phénoménologique (cf Chapitre I, Article 1) a permis de montrer que la stimulation des hutres avec différents acides ribonucléiques de taille et de séquence variables, notamment le poly(I : C) permettait d'améliorer le taux de survie de près de 100% lors d'infections virales à l'OsHV-1. Cependant, cette protection semble spécifiquement antivirale puisque le poly(I : C) ne protège pas d'infections bactériennes à Vibrio tasmaniensis LGP32. De plus, nous avons montré que cette protection antivirale était efficace sur le long terme pour protéger des infections à l'OsHV-1, avec une durée minimale de 5 mois. Cette protection est par ailleurs efficace en milieu naturel sur l'étang de Thau permettant de protéger les hutres d'épisodes de surmortalité massive. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés aux mécanismes de ce priming immunitaire par une approche transcriptomique globale par RNA-seq (cf Chapitre 2, Article 2). Cette approche nous a permis d'identifier d'une part que la stimulation des hutres par le poly(I : C) entranait la régulation de différentes fonctions immunitaires et notamment l'implication d'un système de type interféron. D'autre part, la stimulation des hutres par le poly(I : C) entrane une réponse immunitaire majoritairement maintenue ( sustained response ) pouvant expliquer la protection acquise observée suite à une infection par l'OsHV-1. Chez ces hutres stimulées par le poly(I : C), l'entrée du virus OsHV-1 dans les cellules et/ou sa réplication semble réprimée voire empêchée. L'ensemble de ces expérimentations en milieu naturel et en milieu contrôlé suggère ainsi un rôle essentiel de l'OsHV-1 dans cette maladie poly-microbienne affectant les hutres. De plus, toutes les expérimentations ont été réalisées avec des hutres de fonds génétiques différents et étaient toutes protégées des infections à l'OsHV-1 suite à une stimulation par le poly(I : C). Nous suggérons donc que toutes les hutres ont une potentialité de protection face au virus OsHV-1 mais que cette protection nécessite une activation précoce des mécanismes immunitaires, que le poly(I : C) a permis d'activer. 130 Ces travaux de thèse ont donc permis, d'un point de vue fondamental, d'apporter de nouvelles connaissances sur le phénomène de priming immunitaire antiviral encore très peu décrit dans la littérature pour la majorité des modèles vertébrés et invertébrés. Ainsi, nos travaux ont donc permis d'en étudier les mécanismes montrant qu'il y a bien une composante immunitaire à ce phénomène, au cœur des débats en immunologie. En répondant en partie à la requête de Rowley et Powell (Rowley and Powell 2007) qui jugeaient nécessaire de pouvoir travailler sur des modèles dans lesquels il est possible d'étudier les bases moléculaires du priming immunitaire, cette thèse a permis d'apporter une pierre à l'édifice de l'immunité innée et du priming immunitaire. Chez l'hutre creuse Crassostrea gigas, il y a bien une composante immunitaire à cette protection et cette espèce non- modèle peut être un bon candidat permettant d'étudier les mécanismes du priming immunitaire. D'un point de vue appliqué, ces travaux ouvrent à présent une voie de recherche visant à proposer et à mettre en place de nouveaux moyens de lutte contre les maladies des hutres, afin de soutenir les filières ostréicoles. Ceci constituera à présent les grands enjeux sociétaux et économiques auxquels il nous faudra répondre dans les prochaines années. 131 Références bibliographiques Lafont M. Références bibliographiques -A- Abi-Khalil, C. , C. Lopez-Joven, E. Abadie, V. Savar, Z. Amzil, M. Laabir, and J. L. Rolland. 2016. Exposure to the Paralytic Shellfish Toxin Producer Alexandrium catenella Increases the Susceptibility of the Oyster Crassostrea gigas to Pathogenic Vibrios. Toxins 8. Adema, C. M. , L. A. Hertel, R. D. Miller, and E. S. Loker. 1997. 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Comparative Transcriptome Analysis of Two Oysters, Crassostrea gigas and Crassostrea hongkongensis Provides Insights into Adaptation to Hypo-Osmotic Conditions. Plos One 9. Zhou, Z. , L. L. Wang, L. S. Song, R. Liu, H. Zhang, M. M. Huang, and H. Chen. 2014. The Identification and Characteristics of Immune-Related MicroRNAs in Haemocytes of Oyster Crassostrea gigas. Plos One 9. 154 155 Annexe : Bilan des valorisations, activités de recherche et d'enseignement Valorisations : - Publications scientifiques : (1) Jouaux A. , Lafont M. , Blin J. -L. , Houssin M. , Mathieu M. and Lelong C. 2013. Physiological change under OsHV-1 contamination in Pacific oyster Crassostrea gigas through massive mortality events on fields. BMC genomics 14. (2) Lafont M. , Petton B. , Vergnes A. , Pauletto M. , Segarra A. , Gourbal B. and Montagnani C. Long-lasting antiviral innate immune priming in the Lophotrochozoan Pacific oyster, Crassostrea gigas. En révision à Scientific reports. (3) Lafont M. et al. , Molecular mechanisms underlying antiviral innate immune priming in the Lophotrochozoan Pacific oyster, Crassostrea gigas. En préparation. (4) Lafont M. et al. , Transgenerational antiviral immune priming in the Pacific oyster C. gigas. En préparation. (5) de Lorgeril et al. , Cracking the code of oyster polymicrobial disease : herpesvirus fosters bacterial septicemia by compromizing oyster antibacterial defenses. En préparation. - Communications : (1) Lafont M. , Charrière G. M. , Gourbal B. and Montagnani C. Molecular mechanisms and specificity of immune priming in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Réunion annuelle du réseau écologie des interactions durables (REID), du 23 au 26 Mars 2015, Lyon. (poster) (2) Lafont M. et Montagnani C. Bilan de l'avancée des travaux sur le priming antiviral auprès du Comité Régional de la conchyliculture en Méditerranée, en 2014 et en 2015. (présentation orale) (3) Lafont M. et Montagnani C. Réunion annuelle du projet PROVIGAS (Protection antivirale chez l'hutre C. gigas), en 2014-2016. (4) Lafont M. , Gourbal B. and Montagnani C. Workshop Innate Immune Memory In Invertebrates. 30 Mars 2016, Perpignan. (présentation orale) (5) Lafont M. , Gourbal B. and Montagnani C. Evidence for antiviral immune priming and immune memory in a Lophotrochozoan, the Pacific oyster Crassostrea gigas. Innate Immune Memory conference, 14-16 Mars 2017, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK. (poster) (6) Lafont M. , Gourbal B. , Montagnani C. Evidence for antiviral immune priming and immune memory in a Lophotrochozoan, the Pacific oyster Crassostrea gigas. Immuninv 2017, 7-9 juin 2017, Lyon, France. (présentation orale) Formations suivies dans le cadre de la thèse : - - - Formation atelier de qualification au CNU Formation à l'anglais scientifique Formation en communication orale et valorisation scientifique 155 Enseignement : Enseignements réalisés en tant que vacataire - - Travaux pratiques de microbiologie en 2ème année de Biologie, Université Montpellier x 12 heures (Marie-Hélène Boyer). Travaux pratiques de physiologie animale et de biologie moléculaire en 1ère année du département de Génie Biologie de l'IUT de Perpignan x 25 heures (David Duval). Encadrement : - Stagiaire de 2ème année de l'IUT génie biologique de Montpellier (Abigaïl Delort). Responsabilités au sein du laboratoire : - Représentant élu des personnels non-permanents au sein du conseil d'unité (2015-2017). - Membre du comité de valorisation et de communication de l'unité. Bourse de financement annexe à la thèse : - Obtention du financement d'une bourse de mobilité Internationale subventionnée par l'Ifremer. Trois mois de recherche ont été réalisés au Sydney Institute of Marine Science (SIMS) et à l'Université Macquarie en collaboration avec le Dr Timothy Green et le Pr David Raftos. 156 Résumé Depuis 2008, des épisodes de surmortalité massive d'origine multifactorielle, affectent les élevages de juvéniles d'hutre creuse Crassostrea gigas à l'échelle mondiale dont le virus ostreid herpesvirus type 1 (OsHV-1) peut être considéré comme un des agents pathogènes majeurs. L'immunité des hutres, comme pour l'ensemble des invertébrés, repose sur un système immunitaire inné et a longtemps été considéré comme très peu spécifique et dépourvu de capacité mémorielle. Cependant, ces dernières années, cette vision simpliste de l'immunité des invertébrés a pu être remise en question par l'intermédiaire d'études ayant démontré l'existence d'une réponse immunitaire spécifique et mémoire. Cependant les connaissances sur les mécanismes sous-jacents à ces phénomènes restent encore aujourd'hui extrêmement fragmentaires. Dans le cadre de cette thèse, l'objectif était de caractériser le priming immunitaire antiviral ainsi que ses mécanismes chez l'hutre creuse face au virus OsHV-1. En stimulant les hutres avec un agent mimétique viral, le poly(I : C), les résultats de ces travaux ont montré que cette molécule protégeait spécifiquement contre l'OsHV-1 en améliorant le taux de survie des hutres de près de 100%, mais ne protégeait pas d'infections bactériennes à Vibrio tasmaniensis LGP32. Cette protection est efficace en milieu contrôlé comme en milieu naturel sur le long terme, pour une durée minimale de 5 mois, permettant de protéger les hutres d'un épisode de mortalité. Une approche transcriptomique globale (RNA-seq) a permis d'identifier différentes voies de signalisations immunitaires antivirales différentiellement régulées suite à la stimulation par le poly(I : C). Les profils de régulation de ces transcrits présentent une expression majoritairement maintenue dans le temps, pendant au moins 10 jours, ce qui pourrait expliquer la protection observée. L'ensemble de ces résultats montre l'existence d'un phénomène de priming immunitaire antiviral efficace chez un mollusque Lophotrochozoaire et apporte une contribution à la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à ce phénomène. Ces travaux ont permis d'apporter des pistes de sortie de crise pour la filière ostréicole jusqu'alors inexplorées. Mots-clefs : Mollusque, hutre creuse, Crassostrea gigas, OsHV-1, poly(I : C), immunité innée, priming immunitaire, mécanismes antiviraux Abstract Since 2008, mass mortality events of multifactorial origin have affected the Pacific oyster Crassostrea gigas farms worldwide, in which ostreid herpesvirus type 1 (OsHV-1) can be considered as one of the major pathogens. The immunity of oysters, as for all invertebrates, is based on an innate immune system that has long been considered to be scarcely specific and to lack memory. However, in recent years this simplistic view of invertebrate immunity has been questioned through studies that have demonstrated the existence of a specific immune response and memory. However, knowledge about the mechanisms underlying these phenomena still remains extremely fragmentary. The aim of this thesis was to characterize the antiviral immune priming and its mechanisms in the Pacific oyster against OsHV-1. By stimulating oysters with a viral mimic, poly(I : C), the results of this work have shown that this molecule specifically protects against OsHV-1 by improving oyster survival by almost 100% but does not protect against bacterial infections at Vibrio tasmaniensis LGP32. This protection is effective in a controlled environment as well as in the natural environment on the long term, for a minimum duration of 5 months, allowing protecting oysters from mass mortality events. A global transcriptomic approach (RNA-seq) carried out during this thesis allowed us to identify different antiviral immune pathways differentially regulated following the stimulation by poly(I : C). The regulation profiles of these transcripts exhibit expression mostly maintained over time, for at least 10 days, which could explain the observed protection. All these results show the existence of an effective antiviral immune priming phenomenon in a Lophotrochozoan mollusc and contribute to the understanding of the molecular mechanisms underlying this phenomenon. This work opens new perspectives hitherto unexplored to support oyster farming against this crisis. Key words : Mollusc, Pacific oyster, Crassostrea gigas, OsHV-1, poly(I : C), innate immunity, immune priming, antiviral mechanisms	HAL	Scientific
Analyse quantitative des morphologies a l'état adulte, des eudiploïdes et de trois types de trisomiques chez Pleurodeles waltlii (Amphibien, Urodèle)	WMT16	Scientific
Comment diminuer le nombre des IVG en France ? . Gynécol Obstét Fertil 2003 ; 31 : 499-503	WMT16	Scientific
(voir Annexe 1, - A introduire localement)	EMEA_V3	Medicinal
Influence de différents sels minéraux sur la croissance de cultures d'Escherichia coli soumises à l'action de la streptomycine ou d'autres antibiotiques	WMT16	Scientific
Depuis 1998, il a été montré chez de nombreux eucaryotes que l'ARN double brin pouvait induire une suppression de l'expression génique par des mécanismes spécifiques de séquence L'inhibition de l'expression peut avoir lieu à différents niveaux (transcription, traduction, dégradation de l'ARNm) Initialement, l'appellation d'interférence par l'ARN désignait la dégradation ciblée des ARN messagers induite par l'ARN double brin Mais il est apparu ensuite que le blocage de la traduction constituait probablement un autre aspect du même mécanisme Mécanisme de l'interférence par l'ARN C'est en 1998 que le groupe d'A Fire a mis en évidence chez le nématode Caenorhabditis elegans la capacité de l'ARN double brin d'induire la dégradation des ARN simple brin contenant les mêmes séquences Grâce aux données obtenues chez les plantes, le champignon ascomycète Neurospora crassa, C elegans, la drosophile et, plus récemment, chez les mammifères, les grandes lignes du mécanisme sous-jacent ont pu être établies (Figure 1) Les molécules d'ARN double brin sont d'abord découpées par une RNase double brin, l'éminceuse (Dicer) , produisant des fragments d'environ 21 nucléotides, les petits ARN interférants (short interfering RNA, siRNA) Ces petits ARN sont ensuite incorporés sous forme de simple brin dans un complexe ribonucléoprotéique o ils servent de guide pour la reconnaissance de la cible Le complexe, dénommé RISC (RNA-induced silencing complex), peut avoir soit une activité de nucléase spécifique de séquence (Figure 1) , soit induire un blocage de l'élongation de la traduction (Figure 2A) Il semble que ce soit le même complexe RISC (ou des variantes très proches entre elles ) qui assure ces deux fonctions, la nature de l'appariement avec la cible déterminant le résultat : coupure endonucléolytique pour un appariement parfait , blocage de la traduction dans certains cas d'appariement imparfait générant une boucle centrale (Figure 2B) Parmi les constituants de RISC, figurent une protéine de la famille argonaute (eIF2C2, un homologue du facteur d'initiation de la traduction eIF2 chez les mammifères) et le produit du gène de l'X fragile qui est un régulateur de la traduction En revanche, la nucléase responsable de la coupure endonucléolytique n'a pas encore été identifiée Il est possible d'induire une interférence en introduisant directement dans les cellules les petits ARN interférants à la place des ARN double brin de grande taille Le schéma d'un ARN interférant consensus est présenté dans la Figure 3A Ces molécules étant produites par une RNase III, ont des extrémités 3' qui comprennent en moyenne deux nucléotides non appariés Il semble que la nature de ces deux nucléotides ne joue pas de rôle essentiel dans l'interférence ; ils peuvent donc ne pas être complémentaires de la séquence du gène cible et être modifiés (désoxynucléotides, nucléotides biotinylés) La phosphorylation préalable de l'extrémité 5' des molécules n'étant pas indispensable en raison de l'existence d'une kinase cellulaire, il est possible d'utiliser des molécules synthétisées chimiquement (avec des extrémités 5'-OH) Dans des lysats cellulaire, le site de coupure a pu être déterminé : il est localisé en face de la liaison 10-11 de l'ARN guide (Figure 3B) Utilisation de l'interférence chez les mammifères Dans des cellules de mammifères, la présence d'ARN double brin induit généralement une réponse de type interféron qui comporte également une dégradation des ARNm et une inhibition de la traduction qui ne sont pas spécifiques de séquence L'interférence par l'ARN existe pourtant bien chez les mammifères comme le montrent des travaux utilisant des ARN double brin de grande taille dans des contextes cellulaires o la réponse de type interféron est absente (développement précoce chez la souris , cellules souches embryonnaires [ES] et de tératocarcinome) L'induction de la réponse de type interféron n'étant efficace que pour des ARN double brin de plus de 30 nucléotides, il était plausible que l'introduction de petits ARN interférants n'induise pas ou peu de réponse de type interféron C'est ce que le groupe de T Tuschl a montré en 2001 , qui a de plus rapidement établi la faisabilité de cette approche en l'appliquant à une vingtaine de gènes La petite taille des ARN interférants rend leur introduction dans des cellules de mammifère plus facile que celle de plasmides et il est possible d'induire une interférence dans plus de 90 % des cellules pour les lignées cellulaires facilement transfectables Le niveau d'inhibition est souvent de l'ordre de 80 % en ARN ou en protéine Vecteurs d'expression et utilisation in vivo Chez les mammifères, contrairement aux plantes, aux champignons et au nématode, il ne semble pas exister de mécanisme d'amplification ou de régénération de l'ARN double brin En conséquence, l'introduction de petits ARN interférants n'induit qu'une suppression transitoire de l'expression, de quelques jours à deux semaines, en fonction de la quantité d'ARN transfectée et de la prolifération des cellules Pour obtenir une suppression à long terme de l'expression, la stratégie la plus simple est d'utiliser un vecteur d'expression qui produit dans la cellule une molécule en épingle à cheveux dont la structure est proche de celle d'un petit ARN interférant (Figure 3C) De nombreux vecteurs ont été construits avec un promoteur polymérase III, car cette polymérase qui transcrit la plupart des petits ARN cellulaires, n'est pas couplée à une enzyme de coiffage de l'extrémité 5' du transcrit, et s'arrête spécifiquement dans une séquence de terminaison de la transcription (TTTTT) Les promoteurs les plus utilisés sont ceux du petit ARN U6 impliqué dans l'épissage, et de l'ARN H1, un composant de la RNase P, ces promoteurs étant fonctionnels dans tous les types cellulaires [ , ] La séquence de la boucle ne semble pas jouer de rôle spécifique Ces cassettes d'expression pour des molécules en épingle à cheveux ont été introduites dans des vecteurs viraux et ne semblent pas interférer avec la production virale, même pour des rétrovirus Des vecteurs lentiviraux ont également été utilisés et permettent l'infection de cellules ES et de cellules quiescentes Plusieurs études ont montré que les petits ARN interférants ou des vecteurs d'expression pour des molécules en épingle à cheveux pouvaient être utilisés in vivo chez la souris, par exemple avec la méthode de transfection hydrodynamique Des vecteurs viraux ont aussi été utilisés in vivo chez la souris Enfin, H Hasuwa et al ont utilisé un vecteur d'expression avec le promoteur H1 dans des souris transgéniques et obtenu une bonne efficacité d'inhibition dans tous les tissus étudiés, démontrant directement le large domaine d'action de l'interférence Choix de la séquence cible et spécificité Il semble que la question de l'accessibilité soit moins critique pour les petits ARN interférants que pour les oligonucléotides antisens, puisque des séquences choisies de manière arbitraire ont une activité biologique dans près de la moitié des cas La présence des protéines du complexe RISC contribue probablement à ce résultat Cependant, pour certains gènes, il peut être nécessaire de tester beaucoup de séquences avant de trouver des petits ARN interférants qui soient actifs La composition en bases G/C, qui détermine la structure secondaire, est un des éléments à prendre en compte pour choisir une cible (voir pour une discussion des critères de choix) Une meilleure compréhension de l'insertion des petits ARN interférants dans le complexe RISC permet d'expliquer une partie des échecs En effet, c'est le brin du petit ARN interférant dont l'extrémité 5' peut se désapparier le plus facilement qui est introduit dans le complexe tandis que l'autre brin est dégradé Ce biais d'incorporation peut conduire au ciblage presque exclusif d'un ARNm ou de sa séquence complémentaire [ , ] Tout indique que le complexe RISC agit via un appariement de l'ARN guide avec l'ARN cible Les petits ARN interférants ont une taille suffisante pour être spécifiques d'un gène (16 nucléotides sont en principe suffisants) Cependant, la spécificité nécessite que l'énergie d'hybridation soit sensible à la présence de mésappariements et donc que la séquence ne soit pas trop longue De fait, un ARN guide dont la séquence ne serait complémentaire qu'avec 18 ou 17 nucléotides de l'ARN cible pourrait former un hybride stable et induire une coupure efficace de celui-ci Tant que le seuil à partir duquel une interférence peut exister n'a pas été clairement établi, les recherches in silico ne peuvent constituer qu'un guide vis-à-vis des cibles potentielles De plus, une complémentarité imparfaite peut conduire à une inhibition de la traduction Dans des études expérimentales via le transcriptome, l'existence de cibles collatérales a été observée, mais avec des efficacités limitées Pour confirmer un phénotype, il est donc indispensable d'utiliser deux ARN interférants qui ciblent des séquences différentes sur le même gène Au-delà des cibles collatérales, la question de l'innocuité pour la cellule d'un traitement par des petits ARN interférants ou des vecteurs d'expression reste ouverte En particulier, l'induction de gènes de la réponse de type interféron, dont celui de l'oligoA synthétase, a été observée en réponse à certains petits ARN interférants [ , ] Une autre source de difficultés repose sur l'idée même de réorienter une machinerie cellulaire vers des cibles choisies par l'expérimentateur Il est donc souhaitable de n'utiliser que la dose minimale efficace d'ARN interférants Amplitude de l'inhibition Un autre aspect de l'interférence par l'ARN qui a fait l'objet de réserves est celui de l'inhibition incomplète de l'expression En fait, ce caractère partiel de l'inhibition peut aussi constituer un des points forts de cette approche en permettant d'analyser la fonction de gènes essentiels et, de manière plus générale, d'étudier la relation entre le niveau d'expression et la physiologie cellulaire Ainsi, dans le cas du gène suppresseur de tumeur p53, trois vecteurs d'expression pour des ARN en épingle à cheveux ont permis d'obtenir trois niveaux d'inhibition différents et d'analyser le lien entre le niveau d'expression de p53 et l'agressivité des cellules tumorales L'interférence par l'ARN permet donc d'aborder la physiopathologie des régulations génétiques Cribles à grande échelle Chez C elegans, il est possible d'induire l'interférence par l'ARN à l'aide de plusieurs stratégies expérimentales, généralement mises en œuvre chez la larve Cette flexibilité reflète l'existence d'un transport de l'ARN double brin dans les cellules, ce qui permet d'observer une inhibition systémique chez l'adulte Cette propagation, et surtout la transmission à la descendance de l'inhibition sur une génération, reflètent également l'implication d'une polymérase ARN dépendante de l'ARN (pAdA) qui peut amplifier le signal inducteur de l'interférence Chez les mammifères, il existe un homologue du transporteur de l'ARN double brin mais sa fonctionnalité n'a pas encore été établie L'administration par voie alimentaire offre une approche particulièrement simple pour la mise en œuvre de cribles géniques à grande échelle chez C elegans Ahringer et al ont réalisé une collection de 16 757 souches d'E coli dont chacune exprime de l'ARN double brin correspondant à un gène de C elegans, ce qui permet d'inactiver individuellement 86 % des gènes identifiés chez cet organisme Cette collection a déjà servi à réaliser plusieurs cribles pour rechercher les gènes impliqués dans le développement embryonnaire, le stockage des lipides, la réparation de l'ADN et la longévité Du fait de la possibilité d'analyser le phénotype à la génération suivante et de l'efficacité de l'interférence chez C elegans, cette approche épigénétique est pratiquement aussi puissante qu'une approche génétique réelle et plus simple à mettre en œuvre La transposition d'une telle approche chez des mammifères doit tenir compte des contraintes expérimentales : utilisation de petits ARN, effets transitoires et inhibition partielle de l'expression L'utilisation de vecteurs d'expression permet de s'affranchir de l'effet transitoire et, via la conservation de souches bactériennes, de disposer d'une ressource renouvelable à moins d'utiliser un vecteur viral, la mise en œuvre de cet outil nécessite une transfection et l'interférence ne touchera donc qu'une partie des cellules Plusieurs collections de plasmides sont en cours de construction [ , ] et des criblages sur des familles enzymatiques ont déjà donné des résultats importants à terme, cette stratégie devrait pouvoir être utilisée pour l'ensemble des gènes humains ou murins Elle restera quand même plus lourde à mettre en œuvre que chez C elegans, même s'il est possible d'inactiver simultanément plusieurs gènes ou d'utiliser une sélection positive pour les cellules ayant acquis le phénotype recherché Cibles endogènes des petits ARN Chez les plantes, l'interférence par l'ARN joue un rôle central dans la défense contre les infections virales, la plupart des virus ayant un génome ARN et produisant de l'ARN double brin au cours du cycle viral D'ailleurs, de nombreux virus contiennent un gène qui code pour un inhibiteur de l'interférence par l'ARN Outre des virus, les séquences répétées dans le génome sont des cibles probables de l'interférence par l'ARN pour peu qu'elles soient transcrites sur les deux brins à partir de copies réarrangées ou intégrées tête-bêche dans le génome Selon R Plasterk, l'interférence par l'ARN constituerait pour le génome des plantes un analogue du système immunitaire en limitant la prolifération d'éléments génétiques parasites La mutation de certains des gènes nécessaires à l'interférence par l'ARN conduit d'ailleurs à une activation des éléments transposables chez C elegans () () m/s 2004, n 8-9, p 767 Les expériences de clonage systématique des petits ARN cellulaires chez différentes espèces ont révélé la présence de nombreux petits ARN simple brin d'environ 21 nucléotides, les microARN Ces molécules sont issues de la maturation par l'éminceuse d'un transcrit fortement structuré d'environ 70 nucléotides Chez les mammifères, on estime qu'il existe plus de deux cents microARN et qu'ils sont majoritairement impliqués dans une régulation de la traduction Une prédiction des cibles possibles chez les mammifères vient d'ailleurs d'être effectuée, il s'agit de gènes impliqués dans le développement et le cycle cellulaire, mais aussi dans le métabolisme C'est probablement ce rôle dans la maturation des microARN qui fait de l'éminceuse un gène essentiel chez la souris Conclusions En quelques années, l'interférence par l'ARN s'est imposée comme la meilleure technique pour inhiber l'expression d'un gène dans des cellules de mammifères en culture, de manière transitoire ou à long terme, et peut-être même in vivo Si la spécificité de l'inhibition reste une difficulté majeure, la facilité de mise en œuvre de cette approche représente un atout important Il est déjà évident que l'interférence par l'ARN sera l'outil de choix de la génomique fonctionnelle à travers des criblages systématiques, mais aussi des expériences de colétalité ou de complémentation Enfin, la possibilité de disposer d'ARN interférants ayant des efficacités d'inhibition différentes permet d'explorer quantitativement les réseaux de régulation.	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Fosamprenavir/ ritonavir amprenavir ASC 1, 69 (1, 53-1, 86) 700/ 100 mg deux fois amprenavir Cmin 1, 77 (1, 39-2, 25) par jour amprenavir Cmax 1, 62 (1, 47-1, 79) étravirine ASC a étravirine Cmin a étravirine Cmax a	EMEA_V3	Medicinal
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La dépression résistante, ou dépression réfractaire aux traitements, est un terme de psychiatrie clinique pour décrire une dépression majeure qui ne répond pas correctement aux protocoles de traitements antidépresseurs sur une certaine durée. Il existe plusieurs définitions de la dépression résistante, mais elles n'englobent pas la résistance aux psychothérapies. Traditionnellement, l'absence de réponse (c'est-à-dire que les symptômes dépressifs ne s'améliorent pas) est considérée comme une résistance au traitement. Néanmoins, de nombreux cliniciens considèrent qu'une réponse est insuffisante si la personne n'obtient pas la rémission totale des symptômes. Certains facteurs sont susceptibles de concourir à une réponse insuffisante : arrêt précoce du traitement, dosage insuffisant des médicaments, non-observance du traitement par le patient, erreur de diagnostic et présence d'autres troubles psychiatriques concomitants. L'expression dépression résistante peut aussi s'accompagner d'une précision sur la classe de médicaments auquel le patient ne répond pas (ex : résistance aux ISRS). Face aux dépressions résistantes, des traitements adjuvants comme la psychothérapie, les sels de lithium ou l'aripiprazole présentent de faibles indices d'efficacité. D'après un article paru dans Actualités sur les maladies dépressives, la résistance aux traitements serait retrouvée chez 15 à 30 % des sujets souffrant d'un épisode dépressif majeur (EDM) . Dans le cas d'une absence de réponse aux traitements médicamenteux, la thérapie de stimulation cérébrale profonde présente des résultats prometteurs. Les zones cibles de la stimulation sont alors le gyrus cingulaire, la capsule interne ou le noyau accumbens. La stimulation cérébrale profonde dans le traitement de la dépression a été mise en œuvre pour la première fois par une neurologue américaine, le Dr Helen S. Mayberg, . Facteurs de risques Troubles psychiatriques comorbides Les troubles psychiatriques comorbides passent souvent inaperçus dans le traitement de la dépression. S'ils ne sont pas traités, les symptômes de ces troubles peuvent interférer avec l'évaluation et le traitement. Les troubles anxieux sont l'un des types de troubles les plus courants associés à la dépression résistante au traitement. Les deux troubles coexistent souvent et présentent des symptômes similaires. Certaines études ont montré que les patients souffrant à la fois de dépression majeure et de trouble panique sont les plus susceptibles de ne pas répondre au traitement. La toxicomanie peut également être un facteur prédictif d'une dépression résistante au traitement. Il peut amener les patients déprimés à ne pas respecter leur traitement, et les effets de certaines substances peuvent aggraver les effets de la dépression. Parmi les autres troubles psychiatriques susceptibles de prédire une dépression résistante au traitement figurent le trouble du déficit de l'attention avec ou sans hyperactivité, les troubles de la personnalité, les troubles obsessionnels compulsifs, et les troubles de l'alimentation. Troubles médicaux comorbides Certaines personnes chez qui l'on diagnostique une dépression résistante au traitement peuvent souffrir d'un problème de santé sous-jacent non diagnostiqué qui cause ou contribue à leur dépression. Les maladies endocriniennes telles que l'hypothyroïdie, le syndrome de Cushing et la maladie d'Addison sont parmi les plus fréquemment identifiées comme contribuant à la dépression. D'autres incluent le diabète, les maladies coronariennes, le cancer, le VIH et la maladie de Parkinson. Un autre facteur est que les médicaments utilisés pour traiter les troubles médicaux comorbides peuvent diminuer l'efficacité des antidépresseurs ou provoquer des symptômes de dépression. Caractéristiques de la dépression Les personnes atteintes de dépression qui présentent également des symptômes psychotiques, tels que des délires ou des hallucinations, sont plus susceptibles de résister au traitement. Une autre caractéristique dépressive qui a été associée à une mauvaise réponse au traitement est la durée plus longue des épisodes dépressifs Enfin, les personnes souffrant d'une dépression sévère et celles qui sont suicidaires sont plus susceptibles de ne pas répondre au traitement antidépresseur. Traitements Pharmacothérapie Trois options thérapeutiques médicamenteuses peuvent être utilisés lorsqu'un traitement médicamenteux s'avère inefficace : le changement de médicament, la polythérapie (association de deux types différents d'antidépresseurs), ou l'association d'un traitement adjuvant (ajout d'un médicament non antidépresseur susceptible d'accrotre l'efficacité de l'antidépresseur). Autres traitements Électroconvulsivothérapie La électroconvulsivothérapie n'est généralement considérée comme une option thérapeutique que dans les cas graves de dépression résistante au traitement. Elle est utilisée lorsque les médicaments n'ont pas réussi à améliorer les symptômes de manière répétée, et généralement lorsque les symptômes du patient sont si graves qu'il a été hospitalisé. Il a été montré que l'électroconvulsivothérapie permet de réduire les pensées suicidaires et de soulager les symptômes dépressifs. Elle est associée à une augmentation du facteur neurotrophique dérivé de la lignée des cellules gliales. rTMS La rTMS (stimulation magnétique transcrânienne répétitive) est progressivement reconnue comme une option thérapeutique précieuse dans la dépression résistante au traitement. Un certain nombre d'essais randomisés contrôlés par placebo ont comparé la rTMS réelle à la rTMS fictive. Ces essais ont systématiquement démontré l'efficacité de ce traitement contre la dépression majeure. Il y a également eu un certain nombre de méta-analyses d'essais randomisés contrôlés. Références (en) Cet article est partiellement ou en totalité issu de l'article de Wikipédia en anglais intitulé Treatment-resistant depression (voir la liste des auteurs). Portail de la médecine Portail de la psychologie Portail des neurosciences	WIKIPEDIA	Wiki
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