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Implication des canaux Cav3. 2 dans l'effet antalgique du paracétamol et dans la douleur inflammatoire Nicolas Kerckhove To cite this version : Nicolas Kerckhove. Implication des canaux Cav3. 2 dans l'effet antalgique du paracétamol et dans la douleur inflammatoire. Pharmacologie. Université d'Auvergne - Clermont-Ferrand I, 2013. Français. NNT : 2013CLF1PP04. tel-01165233 HAL Id : tel-01165233 Submitted on 18 Jun 2015 HAL is a multi-disciplinary open access L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d'enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. Résumé Le paracétamol est l'antalgique le plus consommé au monde et pourtant son mécanisme d'action n'est toujours pas élucidé. Longtemps reconnu comme un produit proche des anti- inflammatoires non stéroïdiens (AINS) son profil est aujourd'hui reconsidéré grâce aux travaux effectués depuis une dizaine d'années. Il est désormais admis que le paracétamol est un antalgique d'action prioritairement cérébrale et l'impact sur les cyclo-oxygénases, cibles traditionnelles des AINS, ne représente plus la base de son mécanisme d'action. Nos travaux de thèse montrent que l'action antalgique du paracétamol est perdue chez des animaux dont le canal Cav3. 2 a été invalidé, ceci dans divers contextes expérimentaux. Ainsi ces canaux semblent être indispensables { l'effet antalgique du paracétamol. Nous avons également démontré le site de cette implication. En effet, seuls les canaux Cav3. 2 cérébraux sont impliqués dans l'effet du paracétamol, ce qui rejoint les résultats précédents qui présentent le paracétamol comme un antalgique d'action centrale. Au niveau cérébral nous avons aussi démontré que les canaux Cav3. 2 agissaient de concert avec deux acteurs primordiaux pour l'effet du paracétamol : l'AM404, son métabolite actif et les récepteurs TRPV1. La finalité de cette relation est l'inhibition des canaux Cav3. 2 qui induit l'effet antalgique du paracétamol. Parallèlement, nous avons démontré pour la première fois que l'inhibition des canaux Cav3. 2 cérébraux induisait une antalgie. Ceci confirme l'implication tonique de ces canaux supra-spinaux dans la perception douloureuse. Enfin, nous avons également démontré que les canaux Cav3. 2 étaient fortement impliqués dans la douleur de type inflammatoire et, de manière plus surprenante et intéressante, dans les processus inflammatoires associés (développement œdémateux et production des médiateurs pro-inflammatoires). En conformité avec ces résultats, nous avons démontré que l'éthosuximide (un bloqueur des canaux Cav3. 2) était efficace dans le traitement des douleurs inflammatoires et de l'inflammation ainsi que sur leurs comorbidités associées (anxiété et dépression). En conclusion, la confirmation de l'implication des canaux Cav3. 2 dans l'effet du paracétamol et dans la douleur inflammatoire ouvre une voie nouvelle dans la compréhension du mécanisme d'action de cet antalgique et dans la conception et le développement de nouveaux antalgiques, ciblant ces canaux. Cette perspective est renforcée par les démonstrations déjà faites du rôle de ces canaux dans la physiopathologie des douleurs neuropathiques. De plus et de façon intéressante, l'éthosuximide, un antiépileptique utilisé chez l'homme et inhibiteur des canaux Cav3, permet d'envisager la réalisation d'une étude clinique pilote sur l'évaluation de son effet antalgique. Nous proposons le protocole de cette étude, preuve de concept, réalisée dans un premier temps chez des patients atteints de douleurs neuropathiques. Abstract Acetaminophen is the most analgesic consumed worldwide, but its mechanism of action is still not understood. Long recognized as non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), its profile is now reconsidered thanks to the work done over the last ten years. It is now accepted that acetaminophen is an analgesic with a central action and the impact on cyclooxygenase, traditional targets of NSAIDs, is no longer the basis of its mechanism of action. This work show that the analgesic effect of acetaminophen is lost in animals whose Cav3. 2 channel has been invalidated, this in various experimental contexts. Thus, these channels appear to be essential for the analgesic effect of acetaminophen. We also demonstrated the nature of that involvement. Indeed, only the brain Cav3. 2 channels are involved in the effect of acetaminophen, which joined the previous results showing that acetaminophen is a centrally acting analgesic. In the brain, we also demonstrated that Cav3. 2 channels acting in concert with two crucial actors to the effect of acetaminophen : AM404, its active metabolite, and TRPV1 receptors. The purpose of this relationship is the inhibition of Cav3. 2 channels that induces analgesic effect of acetaminophen. In parallel, we have demonstrated for the first time that inhibition of brain Cav3. 2 channels induced analgesia. This confirms the tonic involvement of these channels in supraspinal pain perception. Finally, we also demonstrated that Cav3. 2 channels were heavily involved in the inflammatory pain and, more surprising and interesting, in inflammatory processes associated (edema development and production of pro-inflammatory mediators). Related to these results, we demonstrated that ethosuximide (a Cav3. 2 channel blocker) was effective in the treatment of inflammatory pain and inflammation as well as their associated comorbidities (anxiety and depression). In conclusion, the confirmation of the interaction of Cav3. 2 channels in the effect of acetaminophen and pain perception opens a new path in understanding the mechanism of action of acetaminophen and in the design and development of new analgesics targeting Cav3. 2 channels. This perspective is reinforced by the demonstrations previously done of the role of these channels in the pathophysiology of neuropathic pain. More and interestingly, ethosuximide, an antiepileptic drug used in humans and Cav3 channels inhibitor, allows to consider the realization of a pilot clinical study on the evaluation its antalgic effect. We propose the protocol of this study, proof of concept, performed in a first time in patients of neuropathic pain. Remerciements Je suis sincèrement reconnaissant envers le Professeur Alain Eschalier de la confiance qu'il a bien voulu m'accorder en m'accueillant dans son laboratoire. Votre niaque et vos compétences scientifiques m'ont toujours été d'une grande aide tout au long de mon travail de thèse. Vous m'avez montré l'importance de la rigueur et de la perfection aussi bien dans l'expérimentation que dans la communication scientifique. Je vous adresse mes reconnaissances et mon humble admiration pour tout ce que vous avez fait durant ces 4 années. Je remercie également un autre acteur majeur ayant permis la réalisation de cette thèse, le docteur Christophe Mallet. Merci, Christophe pour ton encadrement quotidien, tes conseils pertinents, ton écoute et ta patience. Je te remercie également pour les moments passés hors contexte professionnel, en espérant continuer à collaborer avec toi. Je remercie le docteur Abdelkrim Alloui pour ces conseils précieux tout au long de mes travaux de thèse. Je remercie le Professeur Claude Dubray pour son aide précieuse et sa collaboration dans nos projets cliniques, ainsi que pour ses conseils avisés. Que vous preniez une part active au jugement de ma thèse en tant que Président me fait honneur et me réjouit sincèrement. Soyez assuré de ma respectueuse reconnaissance et de ma gratitude. En espérant continuer à collaborer avec vous pour de futurs projets cliniques. Je remercie les Professeurs Rémy Schlichter et Serge Perrot de m'avoir fait le l'honneur d'accepter de siéger à mon jury de thèse et d'assumer le rôle de rapporteur pour le jugement de mon travail. Veuillez trouver ici l'expression de ma reconnaissance et de mon plaisir pour votre présence. Je suis très heureux de compter parmi mon jury le Docteur Emmanuel Bourinet en tant qu'examinateur. Je te remercie vivement d'avoir accepté de juger mon travail. Merci pour tous tes conseils, tes idées et ton jugement qui ont su orienter mes travaux de thèses. Je te remercie également, ainsi que toute ton équipe et notamment Amaury François, pour votre accueil et collaboration précieuse et efficace dans ce projet de thèse. Amaury, je tiens à te remercier pour tes conseils et ta disponibilité ainsi que pour les bons moments passés à Montpellier. Je te porte une grande estime en tant que collaborateur et ami. En espérant retravailler avec toi et se revoir dans d'autres contrées que Montpellier. Je ne me fais pas de souci pour la suite de ta carrière scientifique, bon voyage ! Je prie le Docteur Nicolas Authier, qui m'a fait l'honneur de juger ce travail, de bien vouloir trouver ici l'assurance de ma respectueuse considération. En espérant avoir l'honneur de travailler avec toi durant mon parcours professionnel. Je tiens également à remercier la région Auvergne, le FEDER et la SFETD pour leur soutien financier sans lequel ce travail n'aurait pas été possible. Je tiens à exprimer toute ma gratitude au Professeur Serge Alziari et à toute l'équipe de la plateforme PAVIRMA de Clermont-Ferrand pour leur collaboration. Je remercie tous les collègues, qui sont devenus maintenant des amis, de l'équipe Neuro- Dol et autres pour leur aide, leur écoute, leur soutien, leurs conseils et ainsi que pour tous les moments de joies passés hors du laboratoire : Les 3 compères de la promo - Vanessa qui aura su m'initier aux folklores portugais et japonnais (fukushima). - Alexis, le New-yorkais bessonais toujours prêt à rendre service que ce soit professionnel ou personnel. En espérant te rendre visite prochainement ! - Jérémy, dit mymy , la proie des pigeons clermontois et l'adepte du camouflage carreau ! Les collègues du laboratoire - Maïly ou Mayli ou Mailly ou Mayelie ouBref un nom chinois ! Grande professionnelle du style Classe / Pas classe. - Mathieu ditbiiiip (censure) qui aura su me faire découvrir le Kiwi ! - David, l'homme au pieds touffus de la comté de Mauriac avec son précieux Billy qu'il porte autour du doigt et son radis. - Stéphane, grand épicurien et mentor (durant quelques mois, faut pas pousser) à la cheville fragile mais au bel organe. - Jérémy, la personne la plus swag du laboratoire malgré sa rousseur et son dégout du cheval et de la gente féminine cavalière. - Les pioupioux qui n'ont pas encore passé leur thèse (Bonux ! Radhoune, Ludivine, Alisson, Véro, la niakos, Justine, Amandine), je vous souhaite bon courage et surtout continuez à perpétuer la bonne ambiance du laboratoire ! - Les permanents, Fabien choumy , Jérôme et sa madre de jose, Eric l'homme du ciné du vendredi soir, Maryse ChaluT, Anne-Marie (bon rétablissement), Fred Libert notre matre brasseur , Fred C notre second portos , Youssef, Chouki, Christine, Agathe, Laurence, Catherine, Mireille, Alice, Monique, Denis, les animaliers. Je tiens également à remercier mon entourage personnel : mes parents, ma sœur et mon frère, ma famille, mes amis du foot notamment Jérémy, ami ch'ti et collègue de travail adepte d'Usher et Sam bodybuilder et statisticien à ses heures perdues. Enfin, je remercie tout particulièrement Elodie, ma compagne, qui a su me soutenir, me remonter le moral, me changer les idées, m'apporter des conseils durant les moments de doutes. Sans vous tous rien n'aurait été pareil, l'aboutissement heureux de ma thèse, ainsi que l'ambiance tout au long de ces 4 années de thèse n'ont été possible que grâce { vous tous. Encore MERCI. Contributions scientifiques Publications : Ethosuximide for treatment of anxiety related to chronic inflammatory pain. N. Kerckhove, J. Bourdier, E. Bourinet, A. Eschalier and C. Mallet. En rédaction. Cav3. 2 calcium channels are involved in inflammation and pain related. N. Kerckhove, F. Carvahlo, E. Bourinet, A. Eschalier and C. Mallet. En rédaction. Cav3. 2 calcium channels : the key protagonist of the supraspinal effect of acetaminophen. N. Kerckhove, C. Mallet, A. Francois, M. Boudes, J. Chemin, T. Voets, E. Bourinet, A. Alloui and A. Eschalier. Scientific Reports, en révision. State-dependent properties of a new T-type calcium channel blocker enhance Ca(V)3. 2 selectivity and support analgesic effects. Francois A, Kerckhove N, Meleine M, Alloui A, Barrere C, Gelot A, Uebele VN, Renger JJ, Eschalier A, Ardid D, Bourinet E. Pain, 2013. Epididymis response partly compensates for spermatozoa oxidative defects in snGPx4 and GPx5 double mutant mice. Noblanc A, Peltier M, Damon-Soubeyrand C, Kerckhove N, Chabory E, Vernet P, Saez F, Cadet R, Janny L, Pons-Rejraji H, Conrad M, Drevet JR, Kocer A. Plos One, 2012. Communications scientifiques : Congrès SFETD, Paris. Présentation orale, Cav3. 2 calcium channels and inflammatory pain, 2013. Congrès P2T, Angers. Présentation poster, Cav3. 2 calcium channels and inflammatory pain. N. Kerckhove, A. François, A. Alloui, E. Bourinet, C. Mallet and A. Eschalier, 2013. Symposium douleur INSERM, Bordeaux. Présentation orale, Cav3. 2 calcium channels and inflammatory pain. 2013. Congrès SFETD, Lille. Présentation poster, Cav3. 2 T-type calcium : a new target for acetaminophen. N. Kerckhove, A. François, A. Alloui, E. Bourinet, C. Mallet and A. Eschalier. 2012 Congrès IASP, Milan. Présentation poster, Cav3. 2 T-type calcium : a new target for acetaminophen. N. Kerckhove, A. François, A. Alloui, E. Bourinet, C. Mallet and A. Eschalier. 2012. Abcam conference, New frontiers in persistent pain, Paris . Présentation poster, Cav3. 2 T-type calcium : a new target for acetaminophen. N. Kerckhove, A. François, A. Alloui, E. Bourinet, C. Mallet and A. Eschalier. 2011. Prix et récompenses : Prix de thèse P2T, 2013. Prix de thèse SFPT, 2012. Enseignements / Encadrements : Master 2 (Justine Bourdier). Master 1 (Rebecca Rimbaud et Marie-Ambre Monet). IUT (Julie Tessaire). 120h de cours (cours magistraux, TD et TP) en master sciences du médicament et licence de physiologie (UdA, Clermont-Ferrand). SOMMAIRE SOMMAIRE SOMMAIRE SOMMAIRE PREFACE . 1 INTRODUCTION GENERALE I. LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI . 11 A. Historique : retour sur un vieux médicament . 11 B. Généralités : Qu'est-ce que le paracétamol ? . 12 1. Pharmacocinétique . 13 a. Absorption et distribution. 13 b. Elimination . 13 2. Toxicité . 15 a. Hépatotoxicité . 15 b. Néphrotoxicité . 16 c. Autres réactions et interactions médicamenteuses . 16 3. Actions pharmacologiques . 17 a. Antipyrexie . 17 b. Antalgie . 17 i. Etudes cliniques et efficacité antalgique du paracétamol . 17 ii. La controverse : action centrale ou périphérique du paracétamol ? . 18 C. Utilisations cliniques : Us et coutumes du paracétamol. 18 1. Hors milieu hospitalier . 18 2. Milieu hospitalier . 19 II. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX . 23 A. Généralités : vers un pro-médicament . 23 B. Le système cox : le controversé . 25 1. Mode d'action . 25 2. Relation paracétamol et COX . 26 i. Mécanismes de l'inhibition des COX par le paracétamol . 27 ii. Réduction des COX par le paracétamol. 27 iii. AM404 et inhibition des COX . 28 iv. Paracétamol et inflammation . 29 C. Système cannabinoïde . 29 1. Généralités . 30 SOMMAIRE 2. Paracétamol et système cannabinoïde . 31 3. L'AM404, activateur des récepteurs TRPV1 . 32 D. Système vanilloïde . 33 1. Généralités . 33 2. Paracétamol, AM404 et récepteur TRPV1 . 34 E. Le système sérotoninergique . 35 1. Voies sérotoninergiques descendantes et perception douloureuse . 36 a. Les noyaux supraspinaux sérotoninergiques . 36 i. La substance grise périaqueducale. 37 ii. La moelle rostroventrale . 38 b. Impact médullaire des voies sérotoninergiques . 39 2. Voies sérotoninergiques et paracétamol . 41 3. Résumé (Figure 10) . 42 III. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES 47 A. Anabolisme des endocannabinoïdes . 48 1. L'anandamide. 48 2. Le 2-AG . 48 B. Catabolisme des endocannabinoïdes . 49 1. L'anandamide. 49 a. Anandamide Membrane Transporter (AMT) . 49 b. Fatty Acid Amide Hydrolase (FAAH) . 49 2. Le 2-arachidonoylglycérol . 51 C. Récepteurs aux lipoaminoacides et fonctions biologiques . 53 1. Récepteurs aux cannabinoïdes . 53 a. Distribution . 53 b. Ligands. 53 c. Mécanismes de signalisation intracellulaire . 54 d. Effets pharmacologiques . 54 e. Aspects cliniques . 55 2. Récepteurs aux vanilloïdes . 57 a. Généralités. 57 b. Le récepteur TRPV1. 57 SOMMAIRE i. Expression. 57 ii. Rôle dans la nociception. 59 iii. Aspect clinique . 60 3. Lipoaminoacides et TRPV1 . 61 a. L'anandamide . 61 b. Le N-arachydonoyl-dopamine . 61 c. Le 2-arachydonoyl-glycérol. 61 IV. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? . 65 A. Genèse de l'influx nerveux . 65 1. Généralités . 65 2. Canaux ioniques voltage dépendant et influx nerveux . 66 B. Canaux calciques voltage-dépendants . 68 1. Généralités . 68 2. Les canaux HVA . 71 a. Les canaux Cav1 (ou type L). 71 b. Les canaux Cav2 (ou type N, P/Q, R) . 72 3. Les canaux LVA (ou type T) . 72 a. Caractéristiques des canaux de type T . 72 b. Rôles dans l'influx nerveux . 74 c. Pharmacologie . 75 i. Ions métalliques . 75 ii. Les toxines . 76 iii. Molécules endogènes. 76 iv. Molécules de synthèse . 77 Non spécifiques. 77 Spécifiques . 78 d. Expression des canaux de type T . 80 e. Douleur et canaux Cav3. 2 . 80 PROJETS V. PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS . 89 A. PROJET 1 : IMPLICATION DES CANAUX CAV3. 2 DANS L'EFFET ANTALGIQUE DU PARACETAMOL (ARTICLE 1) . 89 SOMMAIRE 1. Problématique . 89 2. Objectifs . 90 B. PROJET 2 : IMPLICATION DES CANAUX CAV3. 2 DANS LA DOULEUR INFLAMMATOIRE ET LES PROCESSUS ASSOCIÉS (ARTICLE 2) . 91 1. Problématique . 91 2. Objectifs . 91 C. PROJET 3 : CANAUX DE TYPE T ET COMORBIDITES ASSOCIEES A LA DOULEUR INFLAMMATOIRE (ARTICLE 3) . 92 1. Problématique . 92 2. Objectifs . 93 D. PROJET CLINIQUE : ETUDE PILOTE EDONOT : EVALUATION DE L'EFFET DE L'ETHOSUXIMIDE CHEZ DES PATIENTS NEUROPATHIQUES D'ORIGINE TRAUMATIQUE. 94 1. Problématique . 94 2. Objectifs . 95 RESULTATS VI. ARTICLE 1 : Cav3. 2 calcium channels : the key protagonist of the supraspinal effect of acetaminophen . 101 A. RESUME . 101 B. INTRODUCTION . 102 C. RESULTATS . 103 1. Le paracetamol échoue à produire un effet antalgique chez les KO Cav3. 2. . 103 2. Les canaux Cav3. 2 supraspinaux sont nécessaires à l'effet du paracétamol. . 105 3. L'AM404, requiert les canaux Cav3. 2 pour induire son effet antalgique . 107 4. Récepteur TRPV1 et canal Cav3. 2 : preuve d'une relation fonctionnelle. . 108 D. MATERIELS ET METHODES . 112 1. Animaux . 112 2. Etudes comportementales . 113 a. Immersion de la patte et de la queue . 113 b. Test au formol. 113 c. Test de von Frey . 113 d. Induction du modèle de monoarthrite. 113 3. Électrophysiologie . 113 a. Culture cellulaire et enregistrements électrophysiologiques . 113 SOMMAIRE b. Imagerie calcique. 114 4. Analyses statistiques . 114 E. INFORMATIONS SUPPLEMENTAIRES . 115 F. RESULTATS COMPLEMENTAIRES NON PUBLIÉS . 118 G. DISCUSSION / PERSPECTIVES . 120 1. Cav3. 2 supraspinaux et perception douloureuse . 120 2. Cav3. 2 et paracétamol . 123 3. Les canaux Cav3. 2 et l'AM404 . 124 4. Relation fonctionnelle entre canaux Cav3. 2 et récepteurs TRPV1 . 125 5. Canaux Cav3. 2 et récepteurs CB1 . 127 6. Canaux Cav3. 2 et voies descendantes sérotoninergiques . 128 7. Canaux Cav3. 2 et autres antalgiques . 131 8. Conclusion . 132 VII. ARTICLE 2 : Cav3. 2 channels are involved inflammatory pain and associated process . 137 A. INTRODUCTION . 137 B. RESULTATS . 139 C. INFORMATIONS SUPPLEMENTAIRES . 145 D. RESULTATS COMPLÉMENTAIRES NON PUBLIES . 146 E. MATERIELS ET METHODES . 148 1. Animaux . 148 2. Modèle Carragénine . 148 3. Test de von Frey . 148 4. Culture de macrophages issus de moelle osseuse (BMDM) . 148 5. ELISA . 149 6. Mesure et culture d'œdème . 149 7. Immunocytochimie . 149 8. Imagerie Calcique. 149 9. Souris chimériques . 149 10. RT-q-PCR . 150 11. Analyses Statistiques. 150 F. DISCUSSION / PERSPECTIVES . 151 1. Implication des canaux Cav3. 2 dans la douleur inflammatoire . 151 SOMMAIRE 2. Implication des canaux Cav3. 2 dans le développement œdémateux . 152 3. Les canaux Cav3. 2 exprimés par les cellules immunitaires interviennent dans le développement œdémateux . 152 4. Les canaux Cav3. 2 participent à l'activation des macrophages. 154 5. Ethosuximide et douleurs inflammatoires. 155 6. Conclusion . 156 VIII. ARTICLE 3 : Canaux de type T et comorbidités associées à la douleur inflammatoire. . 161 A. INTRODUCTION . 161 B. RESULTATS . 162 C. MATERIELS ET METHODES . 167 1. Animaux . 167 2. Produits . 167 3. Comportements . 167 a. Modèle monoarthrite (CFA) . 167 b. Test de von Frey . 168 c. Grip test . 168 d. Rotarod . 168 e. Open field . 168 f. Elevated plus maze . 168 g. Tail suspension test . 169 h. Forced swimming test. 169 i. Novelty suppress feedeing test . 169 4. Analyses Statistiques. 169 D. INFORMATIONS SUPPLEMENTAIRES . 170 E. DISCUSSION / PERSPECTIVES . 170 1. Implication du canal Cav3. 2 dans l'anxiété et la dépression en contexte sain. 170 2. Effet anxiolytique et antidépresseur de l'éthosuximide en contexte inflammatoire. 172 3. Conclusion . 174 IX. PROJET CLINIQUE EDONOT : Ethosuximide et DOuleur Neuropathique d'Origine Traumatique . . 179 A. RESUME . 180 B. RATIONNEL DE L'ETUDE / JUSTIFICATION SCIENTIFIQUE . 183 SOMMAIRE 1. Dernier état des connaissances scientifiques . 183 2. Etat des lieux des connaissances sur l'expérimentation préclinique . 184 3. Retombées attendues . 186 C. MEDICAMENT A L'ETUDE . 186 1. Description du traitement . 186 2. Posologie, modalités d'administration et durée du traitement . 187 CONCLUSION X. CONCLUSION GENERALE . 193 XI. ANNEXES . 197 ANNEXE 1 : ARTICLE 1. 197 ANNEXE 2 : SCHEMA DE L'ETUDE CLINIQUE EDONOT. 217 ANNEXE 3 : TABLEAU DES EVALUATIONS POUR UN SUJET . 218 ANNEXE 4 : CARNET DE SUIVI . 219 ANNEXES 5 : ABREVIATIONS . 220 XII. REFERENCES. 223 PREFACE PREFACE PREFACE Ayant eu depuis toujours l'ambition de faire mon métier au sein de la recherche médicale et en contact avec le milieu hospitalo-universitaire, je me suis orienté très tôt dans le domaine de la biologie et plus récemment dans le domaine des neurosciences et de la pharmacologie. La compréhension de notre système nerveux cérébral et la perspective d'apporter de nouvelles innovations scientifiques pour le patient et plus généralement pour le monde médical ont toujours su garder ma motivation et mes ambitions intactes. Afin de pouvoir réaliser mes ambitions, à Clermont-Ferrand, le choix de rejoindre l'équipe du Pr. Alain Eschalier s'est imposé de lui-même. En effet, cette équipe nommée Laboratoire de Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la Douleur possède toutes les structures, le personnel, l'expérience, les connaissances et les collaborations (CHU, CIC, CETD) permettant une recherche préclinique avancée pouvant prétendre à une transposition clinique à court terme. Ainsi, mes travaux de thèse s'inscrivent dans une optique de recherche originale, partant de l'observation clinique pour aboutir { l'élaboration d'un projet clinique faisant suite à nos travaux précliniques. Cette vision innovante de la recherche scientifique, appelée recherche translationnelle , est définie par l'Agence Nationale de la Recherche comme tel : Le concept de recherche translationnelle s'est imposé comme l'expression d'un besoin essentiel pour que les promesses de la recherche fondamentale se traduisent rapidement par une amélioration de la santé des individus et des populations. L'activité translationnelle est un moteur puissant pour la recherche clinique. Elle la stimule par des innovations thérapeutiques, méthodologiques ou des outils d'investigation émanant de la recherche fondamentale, et réciproquement par la dissémination vers la recherche fondamentale d'observations nouvelles sur la nature et la progression des maladies . Durant une longue période, la recherche clinique a subi un certain manque de prestige par rapport à son partenaire, la recherche fondamentale, créant ainsi un large fossé entre ces deux disciplines. L'apparition d'une nouvelle optique de recherche appelée recherche translationnelle a permis de réduire ce fossé, facilitant la coopération entre recherche fondamentale et recherche clinique, ceci étendu sur la totalité du processus de recherche. Mais à quoi correspondent et quels sont les buts de ces différentes visions de la recherche ? PREFACE La recherche clinique concerne l'Homme, qu'il soit patient ou non, dans toutes les spécialités qui s'intéressent { sa santé. Elle se base sur des outils statistiques et épidémiologiques, se développe au chevet du patient ou en consultation, mais aussi en réseau avec les partenaires de la prise en charge du patient. Les hôpitaux ou les lieux spécialisés comme les centres d'investigations cliniques (CIC) et les centres d'études du traitement de la douleur (CETD) sont les structures o s'effectue la recherche clinique, faisant appel, directement ou indirectement, à tous les métiers hospitaliers (médecins, infirmiers, pharmaciens, attachés de recherche clinique). Son but principal est d'améliorer la connaissance d'une maladie, d'une méthode d'investigation ou d'un traitement. La recherche cognitive, ou plus communément dénommée recherche fondamentale, est définie telle quelle dans le dictionnaire : recherche orientée vers les domaines fondamentaux d'une discipline . Dans les sciences du vivant, le but premier de la recherche fondamentale est de découvrir et déchiffrer les systèmes biologiques qui régentent et déterminent notre vie et la vie en générale, sans aucune prétention { d'éventuelles applications futures. Par conséquent, la recherche fondamentale étudie divers modèles biologiques comme principalement les végétaux, la bactérie, le virus, le ver, la drosophile, le poisson et également les mammifères comme le rat et la souris qui restent tous des organismes moins complexes que l'être humain. A la vue de ces définitions, l'Homme et plus particulièrement le patient pourraient grandement bénéficier d'une interaction entre recherche fondamentale et clinique. C'est dans ce but que la recherche dite translationnelle a émergé durant ces vingt dernières années. La recherche translationnelle est donc devenue la passerelle nécessaire entre recherche fondamentale et clinique ayant pour but d'accélérer l'accès aux innovations diagnostiques et thérapeutiques les plus modernes au bénéfice du patient. C'est par son intermédiaire que les avancées scientifiques aboutissent à des applications cliniques parfois distantes de leurs projets initiaux. Autrement dit, la recherche translationnelle permet la vectorisation des connaissances PREFACE issues de la recherche fondamentale vers l'application concrète de ces innovations scientifiques chez l'Homme (Figure 1). La recherche translationnelle se sert de la recherche fondamentale pour découvrir et mettre { l'essai de nouveaux ou anciens médicaments qui pourraient potentiellement prévenir, guérir et traiter des maladies, le traitement de la douleur chronique par exemple. Figure 1 : La recherche translationnelle : de la recherche au patient. D'après Pr. Gilles Vassal et Dr. Suzette Delaloge, Institut de cancérologie Gustave Roussy, Conférence de presse du jeudi 14 septembre 2006 La recherche translationnelle ne se cantonne pas seulement dans le sens recherche fondamentale vers recherche clinique. La recherche translationnelle se base également sur l'observation clinique afin de poser des questions à la recherche fondamentale dans le but de répondre aux questions de santé publique (Figure 2). Prenons l'exemple de l'hypersensibilité douloureuse ou des effets indésirables induits par la consommation d'opiacés, phénomènes observés par la clinique et actuellement étudiés d'un point de vue fondamental par notre laboratoire afin de répondre à ce problème notoire dans la prise en charge de la douleur. Ainsi, c'est sur ces observations cliniques que notre laboratoire se repose pour répondre aux problématiques de santé publique concernant le traitement de la douleur. PREFACE Figure 2 : La recherche translationnelle : du patient à la recherche. D'après Pr. Gilles Vassal et Dr. Suzette Delaloge, Institut de cancérologie Gustave Roussy, Conférence de presse du jeudi 14 septembre 2006 Ainsi, la recherche translationnelle se développe en partie à proximité du patient et a plusieurs objectifs : Analyser et transmettre rapidement les innovations scientifiques vers des applications diagnostiques et thérapeutiques, au bénéfice des patients, avec objectif de résultats rapide (< à 5 ans). Assurer un continuum entre recherche scientifique et soins, du chercheur au malade, en associant médecins, chercheurs et patients. Contribuer à la mise à disposition rapide des innovations validées en termes de rapport bénéfice/risque. Observer la clinique et interroger la recherche fondamentale pour répondre à des sujets de santé publique majeurs. Au final, ces différentes étapes de recherche possèdent des objectifs propres et entrelacés, mais malgré leurs objectifs, leurs lieux d'activités et leur production des connaissances distincts, elles se nourrissent mutuellement. Depuis près de 20 ans, le Pr. Alain Eschalier, s'efforce de construire cette relation autour du traitement de la douleur. Cependant, { l'heure actuelle, il existe encore trop peu d'études dites PREFACE de recherche translationnelle . La recherche sur le traitement de la douleur n'échappe pas à ce constat. En effet, à ce jour, beaucoup de nouvelles cibles ou de nouveaux médicaments ayant un potentiel thérapeutique sont étudiés mais rares sont ceux qui atteignent les études cliniques soit par manque de données précliniques, soit par manque de moyen, soit du fait d'une pertinence clinique trop faible ou soit encore par échec du concept lors d'études plus poussées chez l'animal (absence d'effet espéré, toxicité, effets indésirables). A la vue de ce constat, beaucoup d'entreprises pharmaceutiques ont abandonné la recherche de nouveaux antalgiques, s'orientant vers d'autres domaines de recherches plus d'actualité (cancer, Alzheimer, Parkinson) ou sur de nouvelles associations médicamenteuses et formes galéniques. De ce fait, en dépit d'immenses efforts d'investissement réalisés chaque année pour mettre au point de nouvelles innovations à visée thérapeutique, l'arsenal thérapeutique disponible pour le traitement de la douleur, et plus particulièrement les douleurs chroniques (neuropathiques et inflammatoires), repose majoritairement sur des molécules empiriques possédant un rapport bénéfice / risque faible à long terme1. Malgré cela notre laboratoire garde pour objectif de comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la perception douloureuse avec, pour but final, d'apporter aux cliniciens et aux patients de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à traiter la douleur. Il a également recours à une stratégie basée sur l'étude des mécanismes d'actions d'antalgiques de références. Ceci permettra aux chimistes de créer de nouvelles molécules, à visée antalgique, agissant sur les acteurs impliqués dans leurs effets antalgiques, avec pour but final, un développement clinique. C'est ce que nous nous proposons de faire dans cette thèse en étudiant un antalgique universellement connu et utilisé, le paracétamol. Son effet antalgique certes limité est contrebalancé par sa très bonne tolérance par l'organisme aux doses thérapeutiques adéquates, ceci suggérant que les processus physiologiques impliqués dans son mécanisme d'action soient spécifiques { l'antalgie. Il est donc important de connatre les processus biologiques mis en jeu et son mécanisme d'action, ceci pouvant mettre à terme l'élaboration de nouvelles molécules à visée antalgique plus efficaces que le paracétamol tout en gardant sa très bonne tolérance. Nos recherches pré-cliniques, via l'étude du mécanisme d'action du paracétamol, nous ont permis de découvrir une nouvelle cible thérapeutique potentielle : les canaux calciques Cav3. 2. La finalité de nos études fut le retour à la clinique avec l'évaluation de l'effet d'un bloqueur de ces canaux, l'éthosuximide (zarontin), sur les douleurs chroniques neuropathiques. Ainsi, ces travaux, de par un va et vient entre recherche clinique et pré-clinique, s'intègrent totalement dans une volonté de recherche translationnelle. PREFACE LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI INTRODUCTION GENERALE LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI I. LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI A. Historique : retour sur un vieux médicament Durant les années 1800, les innovations scientifiques et médicales en termes de pharmacopée étaient systématiquement publiées chaque année dans un journal de référence : l'Officine. A cette époque, la pharmacopée des antalgiques est plus que conséquente, s'expliquant par un large engouement des industriels de l'époque dans la découverte et la formulation de nouveaux antalgiques (galénique, associations). Ceci permit d'enrichir grandement les étagères de la pharmacopée, en termes d'antalgiques (en moyenne une trentaine par an)2. C'est justement durant ce siècle qu'un nouveau composé, possédant des propriétés antalgiques et antipyrétiques, fut découvert de manière fortuite* et appelé acétanilide. Suite à cette découverte, le Dr. Morse (chimiste), appartenant à la compagnie Bayer, synthétisa en 1878 plusieurs dérivés de l'acétanilide dont la phénacétine et le para-acétyl-amino-phénol (paracétamol)3. Parmi ces deux composés, la phénacétine fut sélectionnée et le paracétamol mis { l'écart du fait de sa supposée néphrotoxicité, qui s'avérera erronée ou surestimée par la suite. Ainsi, durant plusieurs années, la phénacétine connue un fort engouement dans le monde médical. Quelques années plus tard, l'aspirine fut découverte (1899) et éclipsa en partie la phénacétine conduisant { la commercialisation de plusieurs associations d'antalgiques contenant majoritairement de la phénacetine, de l'aspirine, de la caféine, et parfois un barbiturique. Malheureusement, la surconsommation de ces mélanges médicamenteux entrana l'observation de graves effets indésirables et intoxications4. Avec les évolutions technologiques de la chimie durant le siècle suivant, la molécule active de l'acétanilide et de la phénacétine, suite { leur métabolisation, fut découverte, redécouverte même5, et à la grande surprise ce fut le paracétamol, permettant, enfin, sa commercialisation6. Par la suite, grâce à son rapport bénéfice / risque et son excellente tolérance, le paracétamol Cahn et Hepp étudiaient les effets du naphtalène sur les parasitoses intestinales et durent aller se fournir dans une officine alors qu'ils étaient en rupture de stock. Le pharmacien délivra par erreur de l'acétanilide qui fut administré { leurs patients parasités. Cette erreur leur permit de constater que leurs patients présentaient une forte réduction de leur fièvre. Cahn, A ; Hepp, P. (1886), Das Antifebrin, ein neues Fiebermittel, Centralbl. Klin. Med. 1886, 7, 561-65. LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI devint l'antalgique et l'antipyrétique de référence dans le monde pour le traitement symptomatique des douleurs faibles à modérées et de la fièvre quel que soit l'âge7. B. Généralités : Qu'est-ce que le paracétamol ? Le paracétamol (ou acetaminophen) appartient à la classe des antalgiques antipyrétiques non salicylés. La dénomination acetaminophen est utilisée aux Etats-Unis, au Canada, au Japon, en Corée du Sud, à Hong Kong et en Iran alors que le nom paracétamol est utilisé dans les autres pays8. En France, le paracétamol reste le médicament le plus utilisé. D'ailleurs, les trois médicaments les plus prescrits sont tous composés de paracétamol et totalisent plus de 260 millions de doses (le moniteur des pharmacies cahier III, 2006). Cette utilisation massive et universelle s'explique par son avantage, non négligeable et rare dans la médication, d'avoir peu de contre-indications, de pouvoir être prescrit à tout âge et d'être dénué d'effets indésirables graves lors de son utilisation à la posologie recommandée. Néanmoins, comme toute molécule active, en cas de fort surdosage le paracétamol est toxique pour le foie et est chaque année responsable de décès par hépatite fulminante. En effet, le surdosage involontaire en paracétamol est la première cause de défaillance du foie en Angleterre et aux États-Unis912. Les Etats-Unis comptent chaque année plus de 100 000 cas de surdosage avec en moyenne plus de 450 décès13, 14. Ces chiffres importants sont expliqués par le fait que de nombreux produits sont disponibles aux États-Unis en vente libre sans ordonnance contenant du paracétamol sans que cela ne soit indiqué sur la bote et par le fait que les conditionnements des antalgiques à base de paracétamol dépassent souvent la dose de 8 grammes susceptible d'induire des troubles graves. En France dans les années 1980, l'Agence du médicament, ancien nom de l'Afssaps et maintenant de l'ANSM, avait réduit le conditionnement des antidouleurs à base de paracétamol pour qu'ils ne dépassent pas cette dose. Depuis ce changement de conditionnement, les décès par intoxication n'ont pas augmenté alors que la consommation n'a pas cessé de crotre. Ainsi en 1990, 177 420 000 botes de paracétamol ont été vendues en France, et 5 335 intoxications et 6 décès ont été recensés. Ces chiffres restent stables. Aux USA et en Europe, le paracétamol est également fréquemment utilisé pour des tentatives de suicide13. En France en 2006, 1798 intoxications volontaires par le paracétamol ont LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI été dénombrées, soit 10% des intoxications médicamenteuses volontaires, ce qui place le paracétamol en première position devant le bromazépam15. Les suicides au paracétamol sont aussi difficiles à évaluer car il n'existe pas de registre national des intoxications volontaires16. 1. Pharmacocinétique a. Absorption et distribution Suite à son ingestion, le paracétamol est rapidement absorbé, indépendamment de la dose, par diffusion passive, ceci étant corrélé à ses propriétés physicochimiques (pKa 9, 5 ; non ionisé dans l'intestin)6, 17, 18. Un tiers de cette absorption s'effectue au niveau gastrique et colique alors que les deux tiers restant sont absorbés au niveau intestinal. Chez l'Homme, le pic plasmatique du paracétamol (Tmax) est variable selon sa forme galénique et la voie d'administration, cela peut-être rapide, 15-60 min, ou plus lent, 2-3 h6, 1921. En ce qui concerne les autres paramètres pharmacocinétiques, sa biodisponibilité (dépendante de la dose) est de 0, 89 pour une dose orale de 1 g, et son volume de distribution est important, 0, 8 { 1, 4 L/kg chez l'adulte6, 22. De manière intéressante, les concentrations observées dans le liquide céphalorachidien sont équivalentes à celles retrouvées dans le plasma, traduisant une diffusion au travers de la barrière hématoencéphalique très rapide 17, ce qui est compatible avec une potentielle action centrale du paracétamol. b. Elimination L'élimination d'un médicament est évaluée par le temps nécessaire pour diminuer de moitié la concentration plasmatique (temps de demi-vie d'élimination) et est la résultante de plusieurs phénomènes associés à la métabolisation et l'excrétion du médicament par l'organisme. Elle est de 2 h chez l'Homme pour le paracétamol6. Suite { l'effet de premier passage hépatique survenant lors d'une administration orale, l'élimination urinaire sous forme inchangée du paracétamol est seulement de 2 à 5%, traduisant une métabolisation majoritaire au niveau du foie et du rein. C'est { ce niveau que 2 voies de métabolisation majeures interviennent : la glycuroconjugaison et la sulfoconjugaison permettant la transformation du paracétamol, à hauteur de 90%, en divers métabolites22 dont la majorité sera éliminée dans les urines au bout de 24h23, 24. LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI Figure 3 : Pharmacocinétique du paracétamol. D'après Bannwarth et Pehourcq 2003 ; Clissold 1986 ; Grattan 2000 ; Rygnestad et coll. 2000. Un des métabolites majoritaires du paracétamol est le NAPQI (N-acétyl-para- benzoquinone imine)2527, c'est également ce composé qui est responsable de la toxicité du paracétamol en cas de surdosage. En condition thérapeutique, l'acteur principal dans la métabolisation du paracétamol est le cytochrome P450 2E1 (CYP2E1)28, 29 permettant la formation du NAPQI (composé très hépatotoxique) qui sera rapidement détoxifié puis éliminé dans les urines. Dans le cas d'une intoxication suite { un surdosage en paracétamol, les mécanismes de détoxication arrivent à saturation et les taux de NAPQI qui s'accumule massivement dépassent les capacités de réduction par le glutathion. Enfin, en ce qui concerne sa clairance totale, aux doses thérapeutiques, elle est de l'ordre de 3 à 5 ml/min/kg pour le paracétamol et de 7 et 9 ml/min/kg respectivement pour ses métabolites sous formes glucuro- et sulfoconjuguées. Il faut noter toutefois qu'une nouvelle voie métabolique a été découverte par Hgestatt et coll. 30, celle-ci sera développée dans le chapitre Mécanismes d'action antalgique du paracétamol : les fondamentaux . Voir résumé (Figures 3 et 4). LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI Figure 4 : Métabolisme du paracétamol 2. Toxicité Comme mentionné en début de chapitre, le paracétamol a l'avantage d'être très bien toléré par l'organisme aux doses thérapeutiques31. Malheureusement, lors d'un surdosage involontaire ou volontaire, si ingestion de plus de 8 g chez l'adulte et 150 mg/kg chez l'enfant, il apparait des risques de toxicité. a. Hépatotoxicité L'hépatotoxicité sévère est liée { la saturation du système de détoxication hépatique vue précédemment32. En effet, le NAPQI, métabolite très toxique, induit à forte dose une nécrose hépatique par divers mécanismes13, 3338. Heureusement, dès 1974 un antidote fut mis { disposition lors d'intoxication au paracétamol : la N-acétylcystéine. Cet antidote a pour but principal de se substituer au glutathion endogène et d'assurer la détoxication du NAPQI, réduisant et limitant ainsi sa toxicité cellulaire (dommages oxydatifs)39. Suite à cela, toutes atteintes du système hépatique chez l'Homme, insuffisance hépatique chronique ou alcoolisme, doit être prise en considération en cas de prise de paracétamol. Ainsi, LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI dans le cas d'insuffisance hépatique chronique, même si aucune étude ne montre d'influence chez l'Homme4042, la dose maximale de 1 g trois fois par jour est préconisée par sécurité. En ce qui concerne les patients alcooliques, les conclusions sont plus complexes, il existe plusieurs études contradictoires dont certaines montrent une potentialisation de l'hépatotoxicité du paracétamol par la prise d'alcool chronique4348 alors que d'autres ne montrent aucune corrélation4952. Malgré tout, la FDA recommande un maximum de 2, 5 g/jour de paracétamol pour les personnes ayant consommé 57 g d'alcool (1, 5 litre de bière { 5 ou 1 bouteille (75 cl) de vin { 12 ou d'une bouteille (environ 20 cl) de whisky à 40). b. Néphrotoxicité Comme pour la toxicité hépatique, aucune étude scientifique (clinique, expérimentale et épidémiologique) n'a démontré d'effet néphrotoxique du paracétamol toujours dans le cadre de doses thérapeutiques53, 54. Pourtant, lors d'intoxication ou de surdosage, des nécroses rénales ont été rapportées que ce soit chez l'Homme ou l'animal5560. Le responsable désigné pourrait être, via les mêmes mécanismes que précédemment, le NAPQI61. Mais cette fois, un autre coupable semble être désigné : le p-aminophénol, un autre métabolite issu de la déacétylation du paracétamol57. Ce composé, découvert antérieurement, est un puissant néphrotoxique62, 63. Comme pour l'hépatotoxicité, rien ne démontre un risque augmenté de nécrose rénale chez des patients insuffisants rénaux, malgré quelques controverses6466. Une prise à hauteur 3 g/jour, à raison de 1 g trois fois par jour est toutefois recommandée pour ces patients. c. Autres réactions et interactions médicamenteuses Beaucoup d'études ont évalué la toxicité et les effets indésirables du paracétamol dans diverses situations, par exemple au niveau gastrique, au niveau hématologique et même au niveau allergique. Toutes les études ne montrent aucun effet indésirable ni toxicité du paracétamol malgré quelques cas contradictoires isolés et contestés6770. Concernant les interactions médicamenteuses, le probénécide (uricosurique dans le traitement de l'hyperuricémie et de la goutte) réduit environ de moitié la clairance du paracétamol en bloquant sa conjugaison avec l'acide glucuronique. Une diminution de la dose de paracétamol doit être prise en considération lors d'un traitement simultané avec du probénécide. La salicylamide (médicament vendu sans prescription, similaire { l'aspirine) peut prolonger la demi-vie d'élimination du paracétamol. L'administration concomitante de paracétamol et de LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI zidovudine (antirétroviral) renforce la tendance { la neutropénie. L'utilisation concomitante de paracétamol (4 g par jour pendant au moins 4 jours) et d'anticoagulants oraux peut conduire { de légères variations de l'International Normalized Ratio (INR), un indicateur de la coagulation. Dans ce cas, une surveillance accrue de l'INR est nécessaire pendant la période d'utilisation concomitante et 1 semaine après l'arrêt du paracétamol. 3. Actions pharmacologiques a. Antipyrexie Dès la découverte du paracétamol, son effet antipyrétique associé à son effet antalgique, a déclenché l'engouement médical pour cette molécule. Par la suite, de nombreuses études cliniques ont confirmé cette action antipyrétique7174. Une des hypothèses avancées pour expliquer ce mécanisme serait l'inhibition des cyclooxygénases, et plus particulièrement l'isoforme COX-27578. En effet, l'augmentation de la concentration de la PGE2, dans le fluide cérébrospinal, suite à un agent pyrogène est diminuée lors de l'administration de paracétamol79. Cette hypothèse reste néanmoins controversée et la tendance actuelle des études tend à montrer un effet plutôt hypothermisant qu'antipyrétique79. En effet, le paracétamol n'a pas de prévention sur la survenue de la fièvre et son administration chez un sujet sain semble induire une hypothermie80. Les mécanismes mis en jeu seraient la résultante d'un mécanisme associé au système cannabinoïdergique81. b. Antalgie Cette partie sera détaillée et plus approfondie dans le chapitre suivant. Ne seront repris ici que quelques généralités sur l'effet antalgique du paracétamol. i. Etudes cliniques et efficacité antalgique du paracétamol D'un point de vue purement clinique, dès sa commercialisation l'effet antalgique du paracétamol fut confirmé et accepté par la communauté scientifique et médicale82 et ceci dans différents types de douleur qu'elles soient aigus ou chroniques. LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI ii. La controverse : action centrale ou périphérique du paracétamol ? Bien que l'effet antalgique du paracétamol soit avéré et non discutable, son mécanisme d'action quant { lui reste encore flou et son site d'action (central ou périphérique) reste encore actuellement très discuté même si l'accumulation des données fait pencher la balance pour un effet majoritairement voire strictement central. Voici quelques arguments plaidant pour la dernière hypothèse. 1) Le paracétamol passe la barrière hémato-encéphalique17, 8386. 2) Le paracétamol induit un effet antinociceptif sur des tests nociceptifs dits centraux , tels que le réflexe aux fibres C chez le rat87, le hot plate test 88, le tail immersion test 89, le test de Randall et Selitto90, le réflexe RIII chez l'Homme91, 92 ou encore l'administration intrathécale de NMDA ou de substance P ou de capsaïcine93, 94. 3) La modulation d'acteurs centraux, comme le système sérotoninergique83, 90, 9599, le récepteur TRPV1100, le récepteur TRPA1101 et le récepteur adénosine A198, 102, modifie l'action antalgique du paracétamol. 4) Aucun effet antalgique observé lors d'une administration locale de paracétamol103106. C'est sur ce dernier point que le débat existe et sur lequel les pro-périphérie se basent pour défendre un effet périphérique du paracétamol. Quelques études ont d'ailleurs démontré un effet antalgique du paracétamol lorsque celui-ci est injecté au niveau de sites périphériques98, 107109. C. Utilisations cliniques : Us et coutumes du paracétamol 1. Hors milieu hospitalier Le paracétamol reste l'antalgique de choix prescrit par les médecins généralistes pour le traitement symptomatique des douleurs aigus ou chroniques, d'intensité légère à modérée (pour revue110). Plusieurs formes galéniques et associations médicamenteuses contenant du paracétamol existent pour une utilisation seule (Doliprane, Efferalgan, Dafalgan) ou en LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI association avec d'autres antalgiques (codéine, tramadol, acide acétylsalicylique, ibuprofène). Lors d'associations avec d'autres antalgiques, il rentre dans la classification des antalgiques indiqués dans les douleurs d'intensité modérée à intense ou ne répondant pas à l'utilisation d'antalgiques seuls. Le second contexte justifiant la prescription du paracétamol est le traitement symptomatique de la fièvre, en particulier chez l'enfant chez qui il constitue l'antipyrétique de première intention111. Malheureusement, l'efficacité antalgique du paracétamol a des limites en particulier lorsque l'intensité de la douleur devient importante. C'est le cas pour certaines douleurs arthrosiques à stade avancé112, 113 et cancéreuses110, 114, 115. Malgré cela, le paracétamol est présent dans les recommandations de l'OMS, pour le traitement des douleurs chroniques, lorsque son efficacité suffit. 2. Milieu hospitalier Le paracétamol est peu efficace seul sur la plupart des douleurs post-opératoires, mais son innocuité en fait une molécule utilisée quasiment systématiquement. Toutefois, il possède un effet additif et une synergie vraie, respectivement, sur l'action des anti-inflammatoires stéroïdiens (AINS) et des morphiniques116, sans toutefois réduire les effets secondaires dus à la morphine117. Après une chirurgie plus légère, il peut réduire la consommation et les effets indésirables du tramadol118. Sa puissance n'est comparable { celle des AINS que lorsque la chirurgie est peu algogène119, 120, mais sur certains modèles postopératoires (p. ex. extractions dentaires, ORL pédiatrique), il est illusoire de penser se passer des AINS121, 122. Dans la plupart des cas, le paracétamol est utilisé en combinaison avec d'autres antalgiques comme les morphiniques, les AINS, la caféinedans le traitement des douleurs inflammatoires (post- opératoires, arthrite), neuropathiques (lombalgies) et cancéreuses110. - Effets additifs sur les AINS123. - Synergie additive avec les opiacés123125. - Chez l'enfant : ml/kg toutes les 4-6 h de Perfalgan pur (500 mg / 50 ml). Pour les douleurs modérées, la forme intrarectale (40 mg/kg) a le mérite d'agir plus longtemps que la forme intraveineuse126. - Des formes à libération prolongée sont en cours de développement127. LE PARACETAMOL : MODE D'EMPLOI Nous avons ainsi fait le portrait du médicament le plus utilisé dans le monde qui possède l'avantage majeur d'être très bien toléré mais aussi l'inconvénient d'être peu ou pas efficace dans les douleurs intenses et chroniques. Malgré plus d'un siècle d'interrogations sur son mécanisme d'action, celui-ci reste encore flou. Nous allons détailler, dans la partie suivante, les différents mécanismes évoqués à ce jour. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX INTRODUCTION GENERALE MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX II. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Du XXème siècle jusqu'{ nos jours, de nombreuses études se sont attelées { découvrir et comprendre le mécanisme d'action du paracétamol avec plus ou moins de succès. Ceci débute dès 1971 avec les prix Nobel Vane et Flower, découvreurs du mécanisme d'action des AINS128, tels que l'aspirine, mettant en jeu le blocage d'enzymes appelées cyclooxygénases (COX). Ces deux nobélisés ont émis l'hypothèse d'un mécanisme similaire pour le paracétamol129, malgré le fait que celui-ci ne possède pas d'action anti-inflammatoire, ni les effets indésirables associés aux AINS (ulcération, syndrome hémorragique)130. Encore actuellement, plusieurs études recherchent une relation entre le système COX et l'effet antalgique du paracétamol, études très contestées et peu concluantes. Plus récemment, d'autres études ont mis en évidence l'implication d'autres systèmes centraux : les systèmes sérotoninergique103, 131 et cannabinoïde / vanilloïde100, 131. Force est de constater qu'{ l'heure actuelle le paracétamol garde encore jalousement ses secrets même si les récentes études ainsi que mes travaux de thèse permettent de disperser quelque peu le brouillard autour de son mécanisme d'action. Suite à ces différentes études, il est établi et accepté par la communauté scientifique que le paracétamol n'agit pas sur une cible unique. Il met en jeu différentes voies métaboliques et neuronales qui elles-mêmes impliquent différents acteurs, constituant ainsi un réseau de protagonistes participant chacun à leur façon et { différents niveaux aux cascades de réactions biologiques nécessaires { l'effet antalgique du paracétamol. Un système très complexe pour un vieux médicament. Démêlons tout d'abord les connaissances actuelles afin de mieux percevoir son mécanisme d'action. A. Généralités : vers un pro-médicament De nombreuses études mettent en avant plusieurs arguments reposant sur différentes voies centrales possibles. Parmi ces différentes voies, l'inhibition des COX centrales fut la première à être supposée130, 132, 133 mais cette hypothèse reste { l'heure actuelle controversée. Plus tard, de nombreuses études ont mis en lumière, que ce soit chez l'animal ou l'Homme, une MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX implication des voies sérotoninergiques descendantes dans l'effet antalgique du paracétamol, mettant en jeu des récepteurs sérotoninergiques médullaires différents en fonction de la modalité de la stimulation nociceptive83, 90, 95, 96, 98, 99, 103, 131, 134138. Récemment, deux nouveaux systèmes, très reliés entre eux, ont été découverts comme étant très fortement impliqués dans le mécanisme d'action du paracétamol : les systèmes cannabinoïde et vanilloïde. En effet, le blocage du récepteur aux cannabinoïdes de type 1 (CB1) , par leur antagoniste AM251, inhibe l'effet antalgique du paracétamol131, 139, 140. Le système vanilloïde quant à lui met en jeu les récepteurs TRPV1 et comme précédemment, le blocage central de ce récepteur inhibe l'effet antalgique du paracétamol100. Ces différentes études montrent plusieurs choses, tout d'abord qu'il existe bien un effet central du paracétamol mais plus intéressant, que l'inhibition d'une seule de ces différentes voies permet l'inhibition de l'effet antalgique du paracétamol amenant { la conclusion d'un effet strictement central (dans le cas du système vanilloïde) mais également l'existence d'un lien fonctionnel entre ces voies. Ce point commun entre ces deux systèmes fut découvert très récemment par notre laboratoire en collaboration avec une équipe suédoise. Cette découverte a permis de mettre en évidence une nouvelle voie métabolique du paracétamol, uniquement mise en jeu au niveau central, aboutissant { la formation d'un composé inédit, l'AM40430. Ce composé formé { partir de l'association entre l'acide arachidonique et le p- aminophénol grâce à une enzyme particulière, la Fatty Amino Acid Hydrolase (FAAH), a la particularité originale d'être un activateur à la fois des récepteurs TRPV1 et CB130, 131, 140142 (Barrière et coll. , in press). De ce fait, cet AM404 semble être le métabolite actif du paracétamol induisant, de par ses actions centrales, l'effet antalgique du paracétamol. L'hypothèse avancée expliquant le lien entre ces protagonistes et le système sérotoninergique, serait que l'activation des récepteurs CB1 et TRPV1 par l'AM404 au niveau cérébral permettrait l'activation de zones spécifiques impliquées dans la mise en œuvre des voies sérotoninergiques descendantes. Une des zones privilégiées et en cours d'étude dans notre laboratoire est la substance grise périaqueducale (PAG), zone qui possède la particularité d'exprimer, au niveau neuronal, les récepteurs CB1 et TRPV1 et l'enzyme FAAH. De plus, son activation directe induit un effet antalgique chez l'animal143 via l'activation de la moelle rostro ventrale (RVM)149153 et des voies sérotoninergiques descendantes154159. Fort de ces différents et nombreux arguments, le courant majoritaire actuel montre que le paracétamol agirait uniquement au niveau central. Malgré cela, certaines études montrent un effet périphérique potentiel du paracétamol98, 108, 109, 160. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Le mécanisme d'action antalgique du paracétamol reste encore à être élucidé mais les données actuelles nous orientent vers des mécanismes centraux. Comment sont mis en jeu ces différents processus ? B. Le système cox : le controversé Les AINS, dont l'aspirine, sont des inhibiteurs de la production des prostaglandines comme l'ont démontré John Vane et coll. en 1971128. Néanmoins, si l'on creuse les écrits scientifiques plus anciens, on se rend compte que les effets de l'aspirine sont connus et décrits depuis plusieurs siècles remontant même jusqu'{ la période du règne égyptien (1850 av. J. C. ). A cette époque, des feuilles de saule blanc étaient utilisées à des fins antalgique et antipyrétique, feuilles qui par la suite ont montré qu'elles contenaient le principe actif de l'aspirine : la saliciline. Revenons brièvement sur l'implication de ces enzymes dans la nociception. 1. Mode d'action Les COX sont les enzymes essentielles pour la synthèse des prostaglandines161 (Figure 5). Il en existe deux isoformes (COX-1 et COX-2). Ces deux enzymes possèdent une différence majeure en termes d'expression dans l'organisme : - La COX-1 est exprimée dans la majorité des tissus de manière constitutive en tant qu'enzyme de régulation162. - La COX-2, est exprimée uniquement dans quelques tissus (prostate, système nerveux central (SNC), reins, endothélium vasculaire et appareils reproducteurs)162, mais surtout essentiellement de manière inductible163 en réponse à un stress (p. ex. inflammation). Si l'on se concentre sur le SNC, la COX-1 est majoritairement exprimée au niveau des cellules du tronc cérébral et de la moelle épinière164, alors que la COX-2 est retrouvée dans les neurones et les cellules gliales de l'hippocampe, l'hypothalamus, le cortex, l'amygdale et la moelle épinière165, 166. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Figure 5 : Métabolisme des prostanoïdes Mais qu'en est-il de la relation entre ces COX et l'effet antalgique du paracétamol ? 2. Relation paracétamol et COX Une des premières publications mettant en avant une relation entre paracétamol et COX est une étude réalisée in vitro sur des COX purifiées mises en contact avec différentes concentrations de paracétamol. Plusieurs études in vitro, sur culture cellulaire, ont montré que le paracétamol était capable de diminuer la production de PGE279, 167171, ceci variant selon la dose de paracétamol utilisée. Enfin, d'autres études ex vivo, menée chez l'Homme, montrent une inhibition de l'activité COX-2 par des doses thérapeutiques de paracétamol172 ou plus récemment chez la souris173. Ainsi, nous ne pouvons exclure le fait d'une relation plausible entre COX et paracétamol. Penchons-nous sur les mécanismes moléculaires potentiellement mis en jeu dans cette inhibition. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX i. Mécanismes de l'inhibition des COX par le paracétamol Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer le mécanisme moléculaire de l'inhibition des COX par le paracétamol, la plupart étant écartées ou non confirmées : 1) Inhibition de la libération d'acide arachidonique des membranes cellulaires172, 174 Invalidée175. 2) Compétition entre paracétamol et acide arachidonique pour le site actif de la COX Non confirmée176 3) Inhibition par le NAPQI168 Invalidée133. 4) Réduction de la COX, de ce fait inactivée, par l'inhibition d'un tonus peroxyde130, 133, 172, 177, 178 Controversée179. 5) Inhibition de la COX par l'AM40430, 180. Les deux dernières hypothèses semblent être cohérentes et seront développées ci-dessous. ii. Réduction des COX par le paracétamol Dès 1982, Hanel et Lands ont émis l'hypothèse que l'activation des COX par leur oxydation pouvait être médiée par les peroxydes et que cette oxydation serait diminuée voire supprimée en présence de composés réducteurs aboutissant in fine à l'inactivation des COX par réduction130. Partant de cette hypothèse, plusieurs études se sont intéressées à la capacité de réduction du paracétamol vis-à-vis des COX. Ceci a été démontré par plusieurs études dès 1987132, 172, 174, 181, 182. De plus, les peroxynitrites ont été confirmées comme nécessaires à l'activité de la COX et le paracétamol décrit comme un puissant piégeur de peroxynitrites et réducteur des COX via ce mécanisme133 (Figure 6). Figure 6 : Inhibition des cyclooxygénases par le paracétamol. a) Mécanisme d'action des cyclooxygénases. b) Site d'action du paracétamol sur l'activité COX. AA : acide arachidonique ; PP : protoporphyrine ; R-OOH : hydroperoxyde lipidique ; Tyr : tyrosine. Modifié d'après Ouellet et Percival 2001 ; Schildknecht et coll. 2007. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Ces études confirment que les conditions d'oxydo-réduction modulent l'effet du paracétamol sur les COX. Le cerveau étant un organe très protégé du stress oxydatif, contrairement { la périphérie en cas d'inflammation, l'activité inhibitrice du paracétamol sur les COX serait donc plus favorable dans le tissu cérébral que dans le tissu périphérique présentant une inflammation. Ainsi, la faiblesse de son effet antalgique et anti-inflammatoire périphérique peut être expliqué par la conjoncture de différents paramètres : - Présence d'autres peroxydes183, - Fort taux de radicaux libres, - Forte expression de la COX-2, - Taux très faibles de peroxydes nécessaires à son activation184, - Taux élevés d'espèces oxygénées réactives. De ce fait, les peroxydes de par leur action oxydante, limitent le pouvoir réducteur du paracétamol vis-à-vis des COX et donc son efficacité anti-inflammatoire et antalgique. Les taux de péroxydes sont bien inférieurs dans le SNC d'o l'hypothèse d'une action anti-COX centrale du paracétamol. Ainsi, l'action du paracétamol sur l'activation des COX semble être expliquée par une théorie plus plausible qui est la diminution de leur oxydation nécessaire à leur activation. Mais, avec les études très récentes, une autre théorie a vu le jour. iii. AM404 et inhibition des COX En 2005, Hgesttt et coll. , ont proposé que l'inhibition des COX par le paracétamol s'effectue via un de ses nouveaux métabolites : l'AM40430. En effet, l'AM404 est capable d'inhiber de manière dose-dépendante (0, 1-1, 0 M) à la fois l'activité des COX purifiées et la synthèse de PGE2 induite par le LPS (1 g/mL) sur une culture de macrophages30. Cette hypothèse est séduisante puisque l'AM404 est produit uniquement dans le cerveau, elle est en accord avec l'action principalement centrale du paracétamol. Ceci vient corroborer l'hypothèse précédente selon laquelle le paracétamol aurait une action inhibitrice des COX préférentiellement au niveau central. En conclusion, le paracétamol semble posséder la capacité d'inhiber les COX avec une action centrale préférentielle. Malgré cela, les COX ne pouvant être séparées de la réponse inflammatoire et tous les symptômes s'y rapportant, le paracétamol pourrait avoir un potentiel anti-inflammatoire. Qu'en est-il réellement ? MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX iv. Paracétamol et inflammation Comme pour les études in vitro, les résultats obtenus in vivo chez l'animal n'échappent pas aux divergences de résultats. En effet, la capacité du paracétamol à réduire une inflammation (œdème) chez l'animal a été démontrée par Seegers185 dans le modèle à la carragénine chez le rat. A contrario, plusieurs autres études n'ont observé aucune activité anti-inflammatoire dans ce même modèle129, 136, 186, 187 ou dans d'autres modèles d'inflammation103, 188. En clinique, chez des patients poly-arthritiques, les résultats obtenus convergent vers la même conclusion que chez l'animal : le paracétamol ne réduit pas l'inflammation189, 190. Ceci est corrélé avec les concentrations synoviales en PGE2 inchangées chez ces patients suite à un traitement par du paracétamol191194. Néanmoins, comme chez l'animal des divergences apparaissent. C'est le cas de plusieurs études qui montrent que le paracétamol réduit l'inflammation tissulaire suite à une chirurgie195 . Associé à ces effets macroscopiques, le paracétamol administré par voie orale (500 mg) réduit la synthèse de prostacycline chez des volontaires sains201, 202. Enfin, une étude, cette fois ex-vivo, par mesure du taux plasmatique de PGE2 induit par le LPS et du niveau de coagulation induit par le TBX2 a été réalisée sur des volontaires sains ayant reçu du paracétamol (1 g, per os) et montre une réduction de l'activité COX203. En conclusion, le système COX semble, en fonction du contexte douloureux, impliqué dans l'effet du paracétamol mais au vu des nombreuses discordances et du faible impact du paracétamol sur ce système, il est fort probable qu'un autre système intervienne. C'est ce que nous allons voir dans les parties suivantes avec pour commencer le système cannabinoïde. C. Système cannabinoïde Reprenons o nous nous étions arrêté en début de chapitre : { la découverte d'une nouvelle voie métabolique cérébrale du paracétamol et de son métabolite actif, l'AM404. L'AM404 est un composé lipophile, dont la structure primaire se compose d'acide arachidonique, il est donc un arachidonic-related compound et se rapproche structurellement MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX de la famille des lipoaminoacides qui inclut les endocannabinoïdes (ou lipides endogènes) tels que l'anandamide204, le N-arachydonoyl-dopamine et le 2-AG205, 206 ainsi que les composés synthétiques tels que l'oléamide, l'arvanil, le palvanil et le linvanil207, 208. Ces composés induisent de multiples effets biologiques et de manière intéressante partagent les effets antalgiques des cannabinoïdes exogènes (p. ex. 9-tetrahydrocannabinol ou 9-THC) dans de nombreux tests d'exploration de la nociception chez l'animal. Une étude récente a néanmoins montré que la plupart de ces composés induisaient une antalgie non dépendante des CB1 et CB2209. Cela suppose que leur action antalgique implique d'autres systèmes que nous verrons par la suite. Avant de détailler les fonctions et effets de l'AM404 ainsi que ceux des arachidonic- related compound (voir chapitre arachidonic-related compound : Nouvelle classe de médiateurs lipidiques ) intéressons-nous aux rôles du système cannabinoïde dans l'effet antalgique du paracétamol. 1. Généralités L'origine du système cannabinoïde provient de la plante Cannabis sativa qui est à la fois une plante médicinale reconnue mais également une drogue psychotrope illicite, plus connue sous le nom de cannabis, marijuana ou haschich210. La description de ses propriétés thérapeutiques remonte en 2737 avant J. C. dans un traité de pharmacologie de la médecine traditionnelle chinoise, le Shen Nung Ben Ts'ao écrit par l'empereur chinois Shen-Nung. Dès 950 avant J. C. , des traces de 9-THC, le principal composé psychoactif du cannabis, ont été retrouvées dans des momies égyptiennes211. Enfin, ses effets psychotropes ont été décrits au 19ème siècle par le poète Charles Baudelaire dans Les Paradis Artificiels . C'est seulement après plus de vingt ans de recherches pharmacologiques, suite à l'identification du 9-THC212, que la caractérisation et le clonage des cibles moléculaires du cannabis furent dévoilés au grand jour. Ces cibles sont principalement : les récepteurs cannabinoïdes CB1 et CB2213, 214. Nous reviendrons sur leurs rôles et fonctions dans le chapitre arachidonic-related compound : Nouvelle classe de médiateurs lipidiques . Pour le moment intéressons-nous à leur implication dans l'effet antalgique du paracétamol. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX 2. Paracétamol et système cannabinoïde Suite à la découverte de la nouvelle voie métabolique du paracétamol, une étude menée dans notre laboratoire fut la première { émettre l'hypothèse d'une interaction entre système cannabinoïde et paracétamol. Quel est ce lien ? Le responsable serait l'AM404, le nouveau composé actif dérivant de la transformation du p-aminophénol (issu de la transformation hépatique du paracétamol) par l'enzyme FAAH. Cet AM404 est retrouvé très majoritairement dans le cerveau mais aussi en faible quantité au niveau spinal, il reste absent dans le foie et le sang alors que le p-aminophénol est présent dans tous les tissus, notamment au niveau hépatique o les taux sont les plus élevés30 (Figure 7). L'implication de l'enzyme FAAH dans cette métabolisation a été mise en évidence de par son blocage soit de manière pharmacologique par le PMSF (inhibiteur des sérines protéases) soit génétiquement chez les souris KO FAAH. Le blocage de la FAAH empêche la formation cérébrale d'AM404 autant in vivo qu'in vitro30. Ainsi, le paracétamol serait déacétylé au niveau hépatique en p-aminophénol, lui-même conjugué à l'acide arachidonique par la FAAH au niveau cérébral pour former l'AM404. Figure 7 : Métabolisme cérébral du paracétamol et distribution de ses métabolites. A) Nouvelle voie métabolique du paracétamol aboutissant { la formation de l'AM404. B) Chromatogrammes représentatifs des échantillons obtenus à partir de cerveau de rat montrant la présence de [2H4] AM404 et [2H4] p-aminophénol chez des animaux traités avec 300 mg / kg [2H4] paracétamol pendant 20 min. C) L'AM404, le p-aminophénol (p-PA), et le paracétamol (ACAP) ont été dosés dans divers tissus obtenus à partir de rats après l'administration de paracétamol (300 mg / kg) ou d'un véhicule pendant 20 min. Les quantités maximales d'AM404 et de p-aminophénol ont été trouvées dans le cerveau et le foie, respectivement. Modifié d'après Hgesttt et coll. 2005. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Malgré cette étude, il restait la question du lien entre paracétamol (AM404) et système cannabinoïde. C'est dans ce but que notre laboratoire s'est mis { l'œuvre pour découvrir ce lien. Et ce fut le cas en 2008, grâce { l'étude de Mallet et coll. 131 qui a démontré que l'effet du paracétamol (300 mg/kg p. o. ) chez le rat était inhibé lors d'une administration d'AM251 (antagoniste CB1) et ceci dans toutes les modalités expérimentales (thermique, mécanique et chimique). Cet effet fut confirmé { l'aide de souris déficientes pour le gène codant le récepteur CB1 (KO CB1), validant le lien entre paracétamol et système cannabinoïde déjà soulevé par Ottani et coll. 140. Notre équipe est allée plus loin dans l'investigation et a montré que le blocage de la FAAH par l'URB597, ainsi que par le PMSF, diminuait aussi l'antalgie induite par le paracétamol, confirmant { la fois l'implication de la FAAH et de l'indispensable AM404 pour l'effet antalgique du paracétamol. Ainsi, il existe bien une relation entre AM404 et récepteurs CB1 mais ce lien est-il une interaction directe entre ces deux protagonistes ? La réponse est mitigée, l'étude de Zygmunt141 a démontré que l'AM404 était capable de se fixer sur les récepteur CB1 mais avec une faible affinité (Ki 1, 8 M) alors que, contrairement aux agonistes connus des récepteurs CB1, l'AM404 n'induit pas d'accumulation d'AMPc in vitro215. Ces données tendent à écarter l'hypothèse selon laquelle l'AM404 pourrait activer directement le récepteur CB1. Par contre, l'AM404 est capable de renforcer l'activité du système cannabinoïde par l'inhibition de la recapture de l'anandamide (effectuée par la FAAH), et donc provoquer son accumulation142, 215218. Or l'anandamide possède quant à elle une forte affinité pour le CB1 (Ki 17 nM)141. Ainsi, l'AM404 sous-tendrait l'effet antalgique du paracétamol via l'activation directe ou indirecte des récepteurs CB1. 3. L'AM404, activateur des récepteurs TRPV1 Parallèlement aux recherches sur le système cannabinoïde et ses récepteurs CB1/ CB2 dans l'action du paracétamol, Zygmunt et coll. ont également montré que l'AM404 était capable d'agir positivement sur un autre récepteur largement impliqué dans la nociception, le Transcient Receptor Potential Vanilloid-1 (TRPV1) appartenant au système vanilloïde. En effet, l'AM404 induit une augmentation des courants TRPV1, abolie par la capsazépine (antagoniste spécifique du TRPV1), dans un modèle d'expression hétérologue en œuf de Xénope141 tout en possédant une forte affinité pour ce récepteur142. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Ainsi l'AM404, de par sa structure chimique, se comporte comme les lipoaminoacides, tels que l'anandamide, en possédant la capacité d'activer les récepteurs TRPV1 et indirectement les CB1, devenant à la fois un endovanilloïde et un endocannabinoïde. L'AM404 semble donc interagir très fortement avec le récepteur TRPV1 et donc le système vanilloïde. Quel est le rôle de ce système dans la nociception et surtout est-il, lui aussi, mobilisé dans l'effet antalgique du paracétamol ? D. Système vanilloïde 1. Généralités L'origine des observations ayant permis d'aboutir { la découverte du récepteur TRPV1 et du système vanilloïde remonte { l'antiquité avec les Euphorbium (médication { base d'Eucalyptus resinifera). Ces Euphorbium, dont le nom dérive du médecin romain Euphorbius, furent utilisés dans le traitement des douleurs articulaires et inflammatoires jusqu'{ la fin de la Renaissance o ils furent abandonnés à cause de leur pouvoir irritant trop important219. Le principe actif de l'Euphorbium fut identifié en 1975 et nommé résinifératoxine (RTX) du nom de la plante dont elle est extraite220. Cette RTX possède une analogie structurale très importante avec la capsaïcine (principe actif irritant du piment), toutes deux possédant une fonction (homo)vanillyl responsable de leurs actions biologiques et appartenant à la famille des vanilloïdes219. Du fait du faible coût et de la grande disponibilité de la capsaïcine, la majorité des recherches se sont concentrées sur cette molécule. La première observation biologique suite à l'administration de la capsaïcine fut son effet pronociceptif, via l'activation des nocicepteurs polymodaux, chez l'animal et chez l'Homme221224. D'autres études ont mis en évidence qu'une forte dose de capsaïcine administrée chez le rat nouveau-né (50 mg/kg) produisait une dégénérescence des fibres périphériques de petits diamètres et des neurones des DRG respectivement à hauteur de 40% et 43%. Cette dégénération est associée également à une L'AM404 est capable d'augmenter les taux d'anandamide circulant et cérébraux via l'inhibition de la recapture de l'anandamide. L'accumulation d'anandamide est susceptible d'activer les récepteurs CB1 215, 216. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX diminution de la production de substance P (80 à 90%), de CGRP, ceci permettant de conclure que les neurones exprimant la substance P et la CGRP sont capsaïcine sensibles (Pour revue225). A la vue de ce constat, l'existence d'un récepteur spécifique { la capsaïcine ou aux vanilloïdes en général semble être fort probable : un récepteur présent sur les fibres de petit diamètre, participant à la production de substance P et CGRP et impliqué dans les phénomènes douloureux. Les études de radiomarquage ([3H]RTX) ont permis de visualiser le récepteur tout au long de la fibre et au niveau des couches superficielles de la moelle épinière226, 227. Suite à cela, le clonage et la caractérisation biologique de ce récepteur ont été réalisés en 1997 et ont mis en évidence que ce récepteur appartenait à la famille des récepteurs TRPs (Transient Receptors Potential)228 et fut appelé TRPV1. Comme pour les récepteurs aux cannabinoïdes, l'implication de ce canal dans la nociception sera détaillé dans le chapitre arachidonic-related compound : Nouvelle classe de médiateurs lipidiques . Quel est son rôle dans l'antalgie produite par le paracétamol ? 2. Paracétamol, AM404 et récepteur TRPV1 Comme précédemment, tout débuta en 2005 avec les études menées sur le métabolisme du paracétamol par Hgesttt30 qui ont permis de mettre en évidence une nouvelle voie de métabolisation du paracétamol, aboutissant à la formation, strictement supraspinal, d'un nouveau composé actif, appelé AM404 chez des rats traités avec une dose antalgique de paracétamol (300 mg/kg i. p. ). Parallèlement, les récents travaux se penchant sur l'impact de l'activation des récepteurs TRPV1 supraspinaux, et particulièrement au niveau de la PAG, sur la nociception concluent { un rôle de ces récepteurs dans l'initiation de processus antalgiques via l'activation des voies inhibitrices descendantes229234. Enfin, en 2010, Mallet et coll. 100 ont démontré une relation étroite entre les TRPV1 supraspinaux et l'action antalgique du paracétamol. En effet, l'action antalgique du paracétamol (et de l'AM404) est abolie lors de l'inhibition des récepteurs TRPV1 que ce soit de manière systémique par l'utilisation de souris knock-out TRPV1 ou soit de manière plus ciblée par l'injection intracérébroventriculaire de capsazépine (antagoniste TRPV1). De plus, cette étude a montré que l'injection intracérébroventriculaire d'AM404 provoquait un effet antinociceptif, effet totalement abolie lors du blocage des récepteurs TRPV1 (KO TRPV1 et capsazépine). Pour finir, des études en cours au laboratoire ont montré 1) que la FAAH, le TRPV1 et le CB1 étaient présents et colocalisés au niveau supraspinal (PAG) (Barrière et coll. , en rédaction), ce qui corrobore les résultats de Maione et coll. sur la colocalisation CB1 / TRPV1 dans la PAG230 ; 2) MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX que le blocage de ces différents acteurs (FAAH, CB1 et TRPV1), spécifiquement dans la PAG { l'aide de divers antagonistes, aboli l'effet antalgique du paracétamol et de l'AM404 (Barrière et coll. in press). Ainsi, au vu de cette dernière étude et de celles en cours, il apparat une implication du système vanilloïde dans l'effet antalgique du paracétamol, système qui en plus est en étroite relation avec le système cannabinoïde lui aussi également impliqué dans l'effet du paracétamol. Ces deux systèmes possèdent un point commun : les arachidonic-related compound , dont l'AM404, qui sont capables de moduler ces deux systèmes pour induire leur effet antalgique. Maintenant que les acteurs (AM404, FAAH, CB1 et TRPV1) et la structure (PAG) au niveau supraspinal ont été identifiés, d'autres questions restent en suspens notamment quelle est la voie neuronale mise en jeu dans l'effet antalgique du paracétamol ? Les études précédentes semblent nous orienter vers les voies inhibitrices descendantes (notamment sérotoninergique) secondairement à l'implication de la PAG. Qu'en est-il réellement ? E. Le système sérotoninergique La première description de la contribution du système sérotoninergique descendant à l'action antalgique du paracétamol fut faite dès 1991235. Cette étude se base sur de précédents résultats ayant démontré que plusieurs antalgiques, comme l'aspirine236, mettaient en jeu le système sérotoninergique descendant pour induire leur effet antalgique. Ainsi, plusieurs auteurs ont montré que l'inhibition des voies sérotoninergiques soit par la 5, 7-dihydroxytryptamine (5, 7- DHT)95, soit par le p-chlorophénylalanine (PCPA)237 abolissait l'effet antalgique du paracétamol. Ces études mettent en lumière l'implication d'une voie neuronale dans l'effet antalgique du paracétamol et appuient le fait que l'action du paracétamol est principalement voire exclusivement au niveau central. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Cette voie neuronale prend naissance au niveau des noyaux de la Rostro Ventrale Medulla (RVM) pour venir faire synapse au niveau médullaire avec des neurones exprimant les récepteurs à la 5-HT afin de les activer ce qui, in fine, engendrerai le processus antalgique. 1. Voies sérotoninergiques descendantes et perception douloureuse a. Les noyaux supraspinaux sérotoninergiques Les structures nerveuses supraspinales sont nombreuses à recevoir des afférences sérotoninergiques. La zone du cerveau produisant la majorité de la 5-HT est la RVM qui contient à elle seule la moitié de toute la 5-HT cérébrale238, 239. C'est en grande partie { partir de la RVM que des afférences nerveuses se projettent jusque dans la moelle épinière (ME), via le faisceau dorsolatéral (funiculus dorsolateralis), en majorité au niveau des neurones des couches superficielles de la corne dorsale (couches I et II0)154, 239242 (Figure 8). Il existe également une source périphérique de 5-HT provenant des afférences nerveuses au sein de la ME même si celle-ci reste de faible proportion expliquant le fait que l'élimination de la 5- HT dans la ME après section de cette Figure 8 : Voies sérotoninergiques. Les zones du cerveau innervées par les voies sérotoninergiques sont illustrées en dernière ne soit pas totalement rouge. Les noyaux du raphé (RVM) sont { l'origine des afférences sérotoninergiques 243, 244 complète . D'autres noyaux ont également été reliés au système sérotoninergique descendant, c'est le cas pour la PAG, noyau très connu pour son implication dans la nociception et principal modulateur de la RVM. L'hypothalamus, le noyau parabrachiale, le noyau du tractus solitaire et également le cortex participent { l'activation des voies sérotoninergiques descendantes via divers relais mettant en jeu la PAG et la RVM ou directement sur la ME. Il est aujourd'hui admis que le La RVM contient notamment les noyaux du raphé tels que le noyau raphé magnus, obscurus et pallidus. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX funiculus dorsolateralis regroupe principalement les voies inhibitrices descendantes en provenance de ces différents noyaux245247. Dans la suite de ce chapitre, par souci de simplicité et de cohérence, nous ne nous pencherons que sur les deux noyaux principaux : la PAG et la RVM. i. La substance grise périaqueducale Reprenons le noyau source majoritaire de 5-HT : la RVM. Ce noyau est sous le contrôle d'un autre noyau : la PAG. Ces deux noyaux font partie intégrante d'une boucle spino-bulbo- spinale largement connue comme étant impliquée dans la modulation de la nociception248, 249. La communauté scientifique s'est intéressée à la PAG dès lors que Reynolds et coll. 250 ont démontré qu'une stimulation électrique de cette zone chez un rat éveillé pouvait induire une antalgie profonde, résultat reproduit chez le chat une vingtaine d'années plus tard251, 252. Ces recherches ont été complétées par des études anatomiques, électrophysiologiques et pharmacologiques afin de mieux comprendre ces relations dans la physiologie de la nociception. Voici les résultats obtenus : - La PAG envoie des afférences dans la RVM154, 253, 254, - La stimulation électrique de la PAG induit un effet antalgique255258, - Une lésion ou un blocage pharmacologique de la RVM abolit l'antalgie produite par une stimulation de la PAG256260, - Une injection d'opioïde dans la PAG produit à la fois une antalgie et une activation des neurones de la RVM261. Il a été corrélé à ces études une libération de la 5-HT au niveau médullaire résultant de la stimulation électrique ou d'une microinjection de morphine dans la PAG262, 263 expliquant l'effet antalgique observé. Il est à noter que celle-ci est inhibée par une administration intrathécale d'antagonistes des récepteurs de la 5-HT262, 264266 prouvant l'implication spécifique de la 5-HT dans l'effet antalgique observé. Ces résultats ont permis d'établir que la PAG, via l'activation des voies sérotoninergiques descendantes, était impliquée dans la nociception et également reliée fonctionnellement avec la RVM qui est un véritable relais dans la modulation de la nociception. Voyons maintenant le rôle de cette fameuse RVM dans la nociception. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX ii. La moelle rostroventrale Comme vu précédemment, les neurones sérotoninergiques issus de la RVM participent activement à la modulation de la transmission nociceptive médullaire, notamment en inhibant l'activité des cellules neuronales de la corne dorsale de la ME154, 249, 254, 255, 267273. Ceci est confirmé par le fait que des administrations systémiques d'un agent déplétant la 5-HT ou intrathécales d'antagonistes des récepteurs à la 5-HT empêchent cette modulation nociceptive médullaire242, 274276. De plus, la source majoritaire des afférences descendantes du faisceau dorsolatéral (voies inhibitrices descendantes) jusqu'à la ME sont des fibres issues de la RVM254, 269. Néanmoins, les voies sérotoninergiques descendantes ne sont pas exclusivement inhibitrices, elles peuvent être également facilitatrices240, 245, 277280. Différentes études ont permis de mettre en évidence que l'activation de la RVM par de faibles stimulations (électrique et pharmacologique) induisait une facilitation de la nociception au niveau médullaire, observation inverse lors de fortes doses245, 281283. Il existe donc au sein de la RVM des unités cellulaires répondant spécifiquement et différentiellement aux stimulations, contribuant à la modulation bidirectionnelle de la transmission nociceptive spinale. Ces cellules neuronales ont été caractérisées254, 284 : - Les cellules OFF activité constante et mise en pause lors d'une stimulation nociceptive ; - Les cellules ON non actives { l'état basal et décharge par bouffée de potentiel d'action (PA) en réponse à une stimulation douloureuse ; - Les cellules neutres aucun changement de leur activité quelle que soit la stimulation. Ces cellules se projettent, dans leur totalité, au niveau de la corne dorsale de la moelle épinière (couches I, II et V)285. L'activité des cellules OFF a été corrélée à l'inhibition des afférences nociceptives et serait donc la génératrice de la voie descendante inhibitrice. A contrario, l'activité des cellules ON serait la responsable de la voie facilitatrice285287. Suite à plusieurs autres études, il a été admis que l'activité de ces cellules, ainsi que leur boucle modulatrice spino-bulbo-spinale étaient fortement impliquées dans le développement et le maintien des symptômes d'hypersensibilité associés à la douleur254, 280, 288. Il faut néanmoins ajouter un bémol à cette dualité qui ne semble pas si simple que cela et que quelques études remettent en cause289291. Plusieurs études ont donc démontré que la 5-HT modulait la nociception à partir des deux MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX structures évoquées ci-dessus ; d'autres noyaux centraux (thalamus, cortex somatosensoriel, formation réticulée ou la substance noire)242, 294298 sont également impliqués. Mais que se passe-t-il au niveau médullaire ? b. Impact médullaire des voies sérotoninergiques Une chose est certaine { propos du système sérotoninergique médullaire, c'est que ce système est très complexe et qu'encore beaucoup de points d'interrogations persistent. Cette complexité s'explique par plusieurs points : - Existence de quatorze sous-types de récepteurs à la 5-HT240, 292296 (Tableau 1), - Expression différente selon le type de neurone (GABAergique, glutamatergique), localisation pré ou post-synaptique. - Fonctions différentes selon le type de récepteur à la 5-HT (activateur, inhibiteur) et de la stimulation douloureuse90, 240, 297. Tableau 1 : Tableau récapitulatif des fonctions des récepteurs 5-HT 5-HT1B, 5-HT2A, 5-HT2C et 5-HT3 seraient impliqués pour des stimulations mécaniques, alors que les 5-HT1A seraient impliqués pour des stimulations thermiques. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Plusieurs études ont montré que l'injection de 5-HT par voie intrathécale induisait un effet antalgique dans divers tests nociceptifs (tail-flick, pression de la patte) chez le rat et la souris298 . D'autres études révèlent que les sous-types 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D et 5-HT3 sont les plus abondants au niveau médullaire302, 303. Ceci laisse penser que l'effet antinociceptif de la 5-HT injectée par voie i. t. passerait par ces différents sous-types mais malheureusement, les études et conclusions restent limitées du fait du manque d'agonistes ou d'antagonistes spécifiques. Voir résumé Figure 9. Comment s'intègre cette voie neuronale dans l'effet antalgique du paracétamol ? Figure 9 : Voies sérotoninergiques descendantes. Représentation schématique de la régulation des voies sérotoninergiques descendantes et leur influence sur la modulation de la nociception spinale. DRG : ganglion de la racine dorsale de la moelle épinière ; ININ : interneurones inhibiteurs ; PAF : fibres afférentes primaires ; PN : neurones de projection ; RVM : rostroventral medulla. Modifié d'après Millan 2002 et Basbaum 2009. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX 2. Voies sérotoninergiques et paracétamol Notre unité de recherche s'est largement penchée sur l'implication de cette voie neuronale dans l'effet antalgique du paracétamol, dans le but d'en démêler les différents acteurs et les mécanismes sous-jacents. Suite à de nombreuses publications, nous avons largement contribué à démontrer et confirmer l'implication des récepteurs sérotoninergiques spinaux, cible finale de la voie sérotoninergique descendante, dans l'effet du paracétamol. En effet, l'inhibition des récepteurs de la 5-HT par administration intrathécale d'antagonistes, réduit l'effet antalgique du paracétamol dans le cas de stimulus mécanique ou chimique et ceci de manière différentielle en fonction du sous-type de récepteur bloqué90, 99, 135, 136, 300, 304. Au vu de ces études, il apparait que l'effet antalgique du paracétamol impliquerait bien spécifiquement les voies sérotoninergiques descendantes. De plus, notre équipe a démontré l'implication du système sérotoninergique chez l'Homme. En effet, l'administration d'antagonistes des récepteurs 5-HT (tropisétron, 5 mg, i. v. et granisétron, 3 mg, i. v. ), chez des volontaires sains exposés à une douleur induite par stimulation électrique, supprime l'effet antalgique du paracétamol (1 mg, p. o. )96, 97. Néanmoins ces derniers résultats sont à confirmer car une étude récente n'a pas montré d'effet inhibiteur du tropisétron sur l'effet antalgique du paracétamol305. La théorie d'une action directe du paracétamol sur les récepteurs à la 5-HT a été vite balayée par deux études306, 307. De ce fait, un mécanisme sérotoninergique par mobilisation de la 5-HT a été postulé. Ceci fut confirmé au niveau supraspinal par l'observation d'une augmentation dose-dépendante de la concentration cérébrale en 5-HT dans le cortex, l'hypothalamus, le striatum, l'hippocampe et le tronc cérébral après administration systémique de 83, 237, 308, 309 paracétamol . Les mêmes antagonistes des récepteurs à la 5-HT inhibent l'effet antalgique de la 5-HT et du paracétamol. Cet argument supplémentaire conforte l'hypothèse d'un renforcement de la voie sérotoninergique descendante par le paracétamol, aboutissant à la production médullaire de 5-HT pouvant expliquer son effet antalgique. La compréhension encore partielle de l'effet du paracétamol sur le système sérotoninergique justifie cependant de plus amples études concernant la nature même de cette relation notamment au niveau spinal. En effet, notre équipe a montré que, malgré une inhibition de l'effet du paracétamol par le tropisétron, des oligonucléotides antisens contre les récepteurs 5- MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX HT3 ne modifiaient pas cet effet135. Ainsi ces récepteurs semblent exclus au profit d'un récepteur tropisétron sensible qui reste à identifier. Enfin, suite { nos recherches ayant mis en évidence l'implication du système sérotoninergique, Mallet et coll. 131 se sont également attelés à découvrir son lien avec le système cannabinoïde. Lien qui est sans nul doute existant vu que l'inhibition d'un seul de ces systèmes inhibe totalement l'effet antalgique du paracétamol. Pour cela, l'effet antalgique induit par l'ACEA (agoniste CB1) fut testé chez des animaux dont les voies descendantes sérotoninergiques étaient détruites (5, 7-DHT) ou ayant leurs récepteurs 5-HT1A et tropisétron sensibles spinaux bloqués par respectivement le WAY100635 et le tropisétron. L'ACEA perd son effet antalgique dans ces différentes conditions mettant en lumière pour la première fois l'implication des voies descendantes sérotoninergiques dans l'effet antalgique médié par le système cannabinoïde131. Des études sont actuellement en cours au laboratoire pour évaluer le lien avec le système vanilloïde. 3. Résumé (Figure 10) En résumé de ce chapitre, nous suggérons que le mécanisme d'action du paracétamol au niveau central puisse être le suivant : 1) Nouvelle voie métabolique du paracétamol donnant naissance au p-aminophénol, composé apte à traverser la BHE. 2) Ce p-aminophénol est spécifiquement transformé en AM404 grâce à la FAAH réalisant l'association du p-aminophénol avec l'acide arachidonique. Ceci est restreint { quelques régions cérébrales exprimant la FAAH (p. ex. PAG). 3) L'AM404, un arachidonic-related compound proche de l'anandamide, activerait le récepteur TRPV1, qui agit conjointement avec le récepteur CB1 afin d'activer la PAG aboutissant ainsi à l'augmentation de l'activité des cellules OFF de la RVM initiant ainsi l'activation des voies inhibitrices descendantes. 4) L'activation des voies inhibitrices descendantes recruterait spécifiquement les faisceaux sérotoninergiques descendants qui, au niveau médullaire, activeraient les récepteurs sérotoninergiques capables d'induire une antalgie soit par le biais d'une activation des interneurones inhibiteurs, soit par l'inhibition de l'activité des interneurones excitateurs, des neurones de projection ou bien des fibres afférentes primaires. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Cette hypothèse, qui impose la nécessaire présence conjointe des trois protagonistes CB1/TRPV1/FAAH dans des régions cérébrales par ailleurs impliquées dans la modulation de la douleur est telle que peu de régions semblent susceptibles d'être impliquées. Parmi ces structures, la PAG, au regard de l'expression de ces trois protagonistes, de son rôle dans les processus intégratifs de la nociception et enfin par ses connexions avec les voies inhibitrices descendantes semble être la plaque tournante dans l'effet central du paracétamol. Ce qui est confirmé actuellement au sein du laboratoire. Il est à noter que très récemment, trois études ont démontré respectivement l'implication des récepteurs spinaux TRPA1101 et adénosine A198, 102. Cela montre que les mécanismes spinaux mis en jeu dans l'effet antalgique du paracétamol restent encore à être élucidés. En conclusion de ce chapitre, nous pouvons dire que l'AM404 est le fer de lance de l'effet antalgique du paracétamol, du fait de son implication dans tous les systèmes biologiques impliqués dans l'effet antalgique du paracétamol cités précédemment. L'effet de cet AM404 passerait par l'augmentation du tonus endocannabinoïde / vanilloïde (lipoaminoacides) au niveau du cerveau. Le prochain chapitre s'étendra plus largement sur les rôles de cette famille de molécules dans la nociception et l'activation des systèmes cannabinoïde et vanilloïde. MECANISME D'ACTION ANTALGIQUE DU PARACETAMOL : LES FONDAMENTAUX Figure 10 : Historique des découvertes et hypothèses sur l'effet du paracétamol. INTRODUCTION GENERALE ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES III. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES Comme présenté dans le chapitre précédant, l'AM404, un arachidonic-related compounds , comme l'est l'anandamide, est la plaque tournante commune à tous les systèmes biologiques impliqués dans l'effet antalgique du paracétamol. Cette classe de médiateurs lipidiques, dont font partie les endocannabinoïdes, a été décrite, dans les années 1990, comme présentant un effet antinociceptif. Une multitude d'études sur ces composés lipidiques et leur rôle dans la nociception a ouvert de nouvelles perspectives pharmacologiques dans le traitement de la douleur. Dans cette partie, nous ne nous intéresserons qu'aux membres majeurs de la famille des arachidonic-related compounds endogènes : les endocannabinoïdes. L'existence dans l'organisme, notamment au niveau du système nerveux central, des récepteurs cannabinoïdes et vanilloïdes laissent supposer l'implication de ligands endogènes dans leur modulation. C'est dans ce cadre que le membre majeur de la famille des endocannabinoïdes fut découvert et appelé N-arachidonoyl-éthanolamide (anandamide)204, 232. D'autres membres ont par la suite été découverts dont les principaux sont le 2-arachidonoyl-glycérol (2-AG), le N- arachidonoyl-dopamine (NADA) et le N-arachidonoyl-glycine (NAGly)206, 310, 311. Ces différents lipides bioactifs interagissent avec beaucoup de cibles mais principalement avec des récepteurs aux protéines G comme les récepteurs CB1 / 2204, 311 et des canaux ioniques comme le TRPV1141, 205, 312. Les endocannabinoïdes anandamide et 2-AG ont été retrouvés avec des taux élevés dans l'ensemble du SNC (du pmol au mol/g de tissus selon les régions)313, 314, ceci sans corrélation avec la présence ou non des récepteurs CB. L'existence de ce système endocannabinoïdergique au sein du SNC ainsi que les effets centraux déjà connus des exocannabinoïdes (comme le THC), suggèrent que ce système jouerait un rôle important dans la modulation de la nociception. Qu'en est-il réellement ? Dans les parties qui suivront, il ne sera détaillé, par souci de simplicité, que les deux membres majeurs des endocannabinoïdes, l'anandamide et le 2-AG représentatifs de cette famille lipidique. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES A. Anabolisme des endocannabinoïdes 1. L'anandamide Initialement, des travaux ont suggéré l'implication de la FAAH dans la formation de l'anandamide par association d'acide arachidonique et d'éthanolamine315, mais les concentrations cellulaires de ces deux acteurs sont trop faibles pour permettre à la FAAH cette transformation. Ainsi, cette enzyme n'est probablement pas impliquée dans le rôle de la synthèse physiologique de l'anandamide. Actuellement, la formation de l'anandamide ne dépend pas que d'une seule voie métabolique. Trois voies peuvent être mises en jeu, indépendantes les unes des autres et compensatrices en cas de déficit d'une des voies. La voie métabolique majoritaire propose que l'anandamide soit synthétisée { partir d'un précurseur lipidique identique dans les différentes voies, appelé N-(NArPE) issu de l'association entre l'acide arachidonique et le diacylglycérol. Suite à cela, le NArPE sera pris en charge par différentes enzymes constituant ces différentes voies, qui sont la N-acyl phosphatidyléthanolamine- spécifique phospholipase D (NAPE-PLD), l', -hydrolase 4 (ABHD4), la glycérophospho-diestérase 1 (GDE1), la protéine tyrosine phosphatase N22 (PTPN22), et la lysophospholipase-D (lysoPLD)316, 317, aboutissant { la formation d'anandamide et ceci de manière calcium dépendante317319. 2. Le 2-AG En ce qui concerne le 2-AG, son anabolisme est moins complexe que celui de l'anandamide. Il fait intervenir une voie majoritaire débutant par le clivage des phospholipides membranaires par la phospholipase C (PLC) formant le 1-acyl-2-arachidonoylglycérol (AArG). L'AArG est ensuite pris en charge par les deux isoformes et de la diacylglycérol lipase (DAGL et ) pour être hydrolysé et former le 2-AG316, 317. Ces données sont appuyées par le fait que l'invalidation du gène de la DAGL ou induit une perte de la formation de 2-AG à hauteur de 80% et 30% respectivement dans le cerveau232, 320. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES B. Catabolisme des endocannabinoïdes 1. L'anandamide Suite à sa libération dans la synapse et ses actions sur ses récepteurs, l'anandamide est rapidement pris en charge par son transporteur membranaire (Anandamide Membrane Transporter, AMT), situé en post-synaptique, pour faciliter sa diffusion membranaire et sa dégradation cytosolique. a. Anandamide Membrane Transporter (AMT) Ce transporteur membranaire reste encore controversé du fait des propriétés physicochimiques de l'anandamide communes { tous lipides qui lui permettent de traverser les membranes plasmiques avec une grande facilité. Deux autres hypothèses ont vu le jour : une diffusion passive de l'anandamide ou l'implication de la FAAH dans ce transport321324. Malgré tout, plusieurs études tendent { démontrer qu'il existerait bien un transporteur spécifique317, 325330. La dernière étude en date à ce sujet vient lever le voile sur ce transporteur membranaire, il serait un variant d'épissage de la FAAH (FAAH-1) qui permet le transport actif de l'anandamide de la synapse vers la cellule postsynaptique331. Enfin dès 1997, l'AM404 a été démontré comme capable d'inhiber spécifiquement le transport d'anandamide, décrit aujourd'hui comme étant une isoforme de la FAAH208, 215, 332, 333. Ainsi, bien que les caractéristiques physico-chimiques de cet AMT restent encore à être confirmées, le variant d'épissage de la FAAH semble lui correspondre. Nous verrons plus tard que le paracétamol semble être un inhibiteur indirect de la FAAH, via l'AM404, participant à l'augmentation du tonus endocannabinoïdergique central dans son effet antalgique. b. Fatty Acid Amide Hydrolase (FAAH) Dès que l'anandamide est libérée dans le cytoplasme cellulaire, l'enzyme FAAH entre en jeu pour la dégrader. La FAAH se localise au niveau des membranes microsomiales et ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES mitochondriales sous forme de dimères. Son expression dans l'organisme reste très large du fait de sa participation dans de nombreux processus biologiques : cirrhotiques334, capacitation testiculaire335, modulation du transit336 et de la transmission nociceptive337, 338. Au sein du système nerveux, la FAAH possède une expression majoritaire dans les cellules neuronales avec une étroite colocalisation avec les récepteurs CB1 que ce soit chez l'animal ou chez l'Homme339, 340. Cette enzyme fait partie de la famille des sérines hydrolases avec l'unique particularité, au sein de cette famille, de posséder une triade catalytique Sérine-Sérine-Lysine qui a permis la synthèse d'inhibiteurs comme l'URB597 (pour revue341). Les rôles biologiques de la FAAH ont tout d'abord été étudiés par l'utilisation de souris knock-out pour le gène codant la FAAH. Ces souris faah-/- présentent une dégradation des endocannabinoïdes jusqu'{ 100 fois moins importante, ceci accompagné d'une augmentation du taux d'endocannabinoïde cérébral (10 fois plus) en comparaison à des souris sauvages, confirmant ainsi le rôle prépondérant de cette enzyme dans le catabolisme des endocannabinoïdes. D'un point de vue comportemental, les souris faah-/- réagissent plus fortement aux effets hypothermisants et pro-cataleptiques d'une injection d'anandamide (50 mg/kg, i. p. ). Elles présentent également un phénotype d'hyposensibilité { la douleur dans différents tests de douleur aigu (thermique et chimique) et chronique (neuropathique et inflammatoire)342, 343. En condition inflammatoire (modèle à la carragénine), les souris faah-/- présentent un développement œdémateux diminué, ce qui laisse supposer un rôle également pro-inflammatoire périphérique de cette enzyme343. Pour répondre à cette question, des souris knock-out FAAH spécifiquement à la périphérie ont été générées. Les résultats obtenus ont permis de démontrer que la FAAH centrale serait impliquée dans les processus de modulation de la douleur, ceci dépendant du récepteur CB1. De plus, la FAAH périphérique participerait aux phénomènes inflammatoires indépendamment cette fois des récepteurs aux cannabinoïdes344, 345. Suite à ces résultats, plusieurs inhibiteurs de la FAAH (URB-) ont vu le jour avec pour but final le traitement de la douleur aigu et chronique. L'année dernière, seul le PF-04457845 fut testé en essai clinique de phase 2 chez des patients souffrants de douleur arthrosique au genou et malheureusement l'étude fut arrêtée lors de l'analyse intermédiaire qui n'a montré aucune amélioration de la douleur (score WOMAC) en comparaison au placebo346. Actuellement, aucune étude clinique n'étudie l'impact sur la douleur d'inhibiteur de la FAAH qui ont pourtant l'avantage de ne pas induire les effets indésirables classiquement observés lors de l'administration d'agonistes CB1, comme l'hypolocomotion ou l'augmentation de l'appétit344, 347. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES 2. Le 2-arachidonoylglycérol La monoacylglycérol lipase (MAGL) est l'enzyme principale participant { la dégradation du 2-AG, bien que la FAAH semble y participer en moindre mesure348. Comme la FAAH, la MAGL est une sérine hydrolase, exprimée de manière hétérogène dans le cerveau au niveau des terminaisons axonales349. Actuellement, le développement d'inhibiteurs spécifiques de la MAGL comme le JZL184 a permis de mettre en évidence que le blocage de cette enzyme diminue les symptômes d'hypersensibilité au chaud et au froid dans le modèle de Chronic Constriction Injury (CCI), corrélé avec l'augmentation des taux de 2-AG cérébraux350, 351. Quels sont les récepteurs membranaires de ces lipides endogènes nécessaires à leurs actions biologiques ? (Pour résumé voir figure 11) ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES Figure 11 : Métabolisme et transduction du signal de l'anandamide et du 2-AG. 2-AG : 2-Arachidonoylglycérol ; AA : Acide Arachidonique ; AC : Adénylate Cyclase ; AL : 2-arachidonoyl-lysophospholipide ; AMPc : Adénosine Monophosphate cyclique ; ATP : Adénosine triphosphate ; CB1 : récepteur cannaiboïde 1 ; DAG : 1, 2 Diacylglycérol ; DGL : diacylglycerol lipase ; EA : Ethanol Amine ; Et : ethanol ; FAAH : Fatty Acid Amide Hydrolase ; G : protéines Gi/Go ; GP : Glycéro- Phospholipide ; iR : récepteur ionique : MAPK : Mitogen-Activated Protein Kinases ; MGL : Monoglycéride Lipase ; mR : récepteur métabotropique ; NAPE : N-arachidonoyl-phosphatidyléthanolamine ; NAPE-PLD : NAPE Phospholypase D ; NAT : N-acétyltransférase ; PL : Pholspholipide ; PLA1 : Phospholipase A1 ; PLC : Phospholipase C ; T : Transporteur Membranaire ; TRPV1 : Transient Receptor Potential Vanilloid-1. Modifié d'après Guzmán et coll. 2003 et Di Marzo et coll. 2004. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES C. Récepteurs aux lipoaminoacides et fonctions biologiques Les lipoaminoacides et leurs récepteurs associés sont très anciens et très conservés à travers les espèces, traduisant leur importance pour l'organisme352. Chez les mammifères, il existe plusieurs récepteurs aux lipoaminoacides : - Cannabinoïdergique : CB1 et CB2353. - Récepteurs TRPs : TRPV1, TRPA1 et TRPV4354357 - Autres : récepteurs nucléaires PPAR et , récepteur orphelin GPR55358360. Dans le cadre de cette thèse nous ne nous focaliserons que sur les récepteurs impliqués dans l'action du paracétamol : CB1 et TRPV1. 1. Récepteurs aux cannabinoïdes a. Distribution Le récepteur CB1 est très largement exprimé dans le SNC au niveau des terminaisons pré- synaptiques du cortex, de certains noyaux de la base, du thalamus, de l'hippocampe, du septum, de l'amygdale, du cervelet ainsi qu'au niveau de la corne dorsale de la moelle épinière, des ganglions de la racine dorsale et des terminaisons des afférences primaires213, 361369. Cette expression quasi ubiquitaire dans le SNC montre l'importance majeure de ce système neurochimique dont la signification fonctionnelle n'a été explorée que très récemment. Toutefois, le récepteur CB1 possède une faible expression périphérique dans divers tissus370375. b. Ligands Plusieurs membres de la famille des lipoaminoacides sont capables d'interagir avec les récepteurs CB1, parmi ceux-ci il y a : - Les cannabinoïdes, principaux ligands exogènes issus de la plante cannabis savita212, 376, - Les cannabinoïdes modifiés ou non classiques issus de l'industrie pharmaceutique377, 378, - Les aminoalkylindoles379, ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES - Les cannabinoïdes endogènes ou endocannabinoïdes, - Divers antagonistes synthétiques380382. c. Mécanismes de signalisation intracellulaire De par leur localisation pré-synaptique, les récepteurs CB1, via les cannabinoïdes, joueraient un rôle dans la modulation de la libération des neurotransmetteurs des terminaisons axonales. Cette hypothèse a été confirmée par un grand nombre de données expérimentales, qui montrent par exemple que la 9-THC inhibe la libération d'acétylcholine suite à la stimulation électrique de l'iléon ou encore des neurones du SNC (Pour revue383). Leur activation entrane plusieurs actions intracellulaires : - Inhibition des canaux calciques de type L, N, P/Q384386. - Activation de certains canaux potassiques384, 387. - Activation de plusieurs isoformes des Mitogen- Activated Protein Kinases (MAPK) telles que ERK1 et ERK2, p38, phosphatidylinositol-3-kinase et JNK388393. Ces effets se produisent via l'activation de la protéine Gi/Go394, 395 mais également via une voie indépendante de la protéine Gi/Go faisant intervenir des protéines adaptatrices396. d. Effets pharmacologiques Chez l'animal, les cannabinoïdes induisent une tétrade d'effets pharmacologiques caractéristiques397, 398 utilisée pour le criblage des cannabinoïdes. La tétrade se compose de : - Hypothermie : les cannabinoïdes agissent sur la température corporelle en induisant une hypothermie, effet surtout étudié chez l'animal399402 - Sédation et Catalepsie : la sédation, chez l'animal, s'évalue en majorité par l'étude de la locomotion. Les effets des cannabinoïdes, chez l'animal, sur la locomotion sont biphasiques. En effet, de faibles doses de cannabinoïdes induisent une hyperlocomotion403, 404 alors qu'{ contrario de fortes doses provoquent une hypolocomotion, pouvant aller jusqu'à induire une catalepsie403, 405. - Antinociception : les effets des agonistes CB1, en termes d'antalgie sont connus depuis plus d'un millénaire grâce { l'utilisation du cannabis. Malgré tout, cela ne fait qu'un peu plus d'une dizaine ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES d'années que le circuit neuronal mis en jeu fut découvert. L'utilisation d'un agoniste des récepteurs CB1 (le WIN55, 212-2) a permis cette découverte suite { l'observation de l'abolition de la réponse des cellules ON et le maintien de la fréquence de dépolarisation des cellules OFF de la RVM faisant suite à son administration. Ceci aboutissant à l'activation de la RVM et donc aux voies inhibitrices descendantes bloquant l'influx nociceptif au niveau médullaire, effet similaire { celui de la morphine240. D'autres expériences se sont intéressées aux rôles des endocannabinoïdes dans une autre zone supraspinale importante dans la nociception : la PAG. Ces études ont montré que l'anandamide, de manière CB1 dépendante, inhibait dans cette zone les influx nociceptifs et que lors d'une activation de la PAG par électrostimulation ou d'une stimulation douloureuse périphérique, une accumulation d'anandamide était observée dans la PAG231. L'implication des endocannabinoïdes et du récepteur CB1 a été également mise en évidence dans le cas de l'antalgie induite par le stress. En effet, il est connu que le stress induit un effet antalgique chez l'animal, effet qui n'est pas retrouvé lors du blocage des récepteurs CB1 par le SR141716A dans la PAG ou effet potentialisé lors de l'augmentation du tonus endocannabinoïdergique par des inhibiteurs de la MAGL (URB602) ou de la FAAH (URB597)349. e. Aspects cliniques Suite à ces observations précliniques, de nombreuses études se sont intéressées au potentiel thérapeutique de l'utilisation des cannabinoïdes et d'inhibiteurs de la FAAH dans la prise en charge de la douleur. Cela fait de nombreuses décennies que le cannabis est connu pour ses vertus thérapeutiques. De nombreux articles sur différentes espèces de cannabis sont publiés en Europe et en Amérique du Nord pendant la seconde moitié du XIXe siècle. L'usage thérapeutique du cannabis et du hashish est courant aux États-Unis jusque dans les années 1930, et fait son apparition dans la pharmacopée américaine officielle en 1851. Il est prescrit généralement comme un antalgique, un sédatif, un antispasmodique ou un antiémétique. Au XXIe siècle, dans les pays o il est autorisé, le cannabis médical est employé dans une très grande variété de maladies et de pathologies, incluant nausées et vomissements, anorexie et cachexie, spasmes, troubles du mouvement, douleurs, glaucome, diarrhées, épilepsie, asthme, dépendance et état de manque, symptômes psychiatriques, maladies auto-immunes et inflammations et insomnies. Le cannabis existe sous plusieurs formes médicales, dont la disponibilité dépend de la législation du pays o il est autorisé. Il peut aussi être prescrit à l'état naturel afin d'être consommé fumé, ou par ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES inhalation de vapeur de THC (tétrahydrocannabinol) sublimé, et là encore sa prescription la plus courante reste relative aux malades en phase terminale. En France, l'utilisation de médication { base de cannabis reste illégale mais une ATU (Autorisation Temporaire d'Utilisation) a été accordée par l'ANSM pour le Dronabinol ou Marinol (delta-9-tétrahydrocannabinol synthétique) délivrés dans les indications suivantes : douleurs résistantes aux traitements standards (41 cas) ; affections inflammatoires du système nerveux (12 cas) ; maladie d'Unverricht- lundborg (8 cas) ; appétit / nausées (7 cas) ; syndrome de Tourette (3 cas) ; dystonie résistante aux traitements standards (8 cas) ; douleurs paroxystiques (1 cas). Depuis 2001, toutes les ATU demandées pour le Sativex (8 cas) ont été refusées. En juin 2013 est publié au Journal officiel un décret permettant { l'ANSM de délivrer éventuellement des AMM pour des médicaments contenant du cannabis ou ses dérivés (Décret no 2013-473 du 5 juin 2013). De nombreuses études ont confirmé cet effet antalgique dans divers types de douleur406 . En effet, différentes médications à base de cannabis (dronabinol, nabilone, extrait de cannabis, cigarette au cannabis, Sativex) ont été montrées comme bénéfiques dans les douleurs migraineuses410, cancéreuses411414, neuropathiques périphériques415418 et centrales419422, rhumatismales423, 424 et fibromyalgiques425. De nombreuses études cliniques, menées par les laboratoires GlaxoSmithKline sont actuellement en cours pour valider l'utilisation du cannabis dans différents contextes douloureux. A noter que plusieurs études cliniques étudient actuellement l'effet antalgique d'un agoniste synthétique CB2 (le GW842166) dans les douleurs inflammatoires et arthrosiques (source : Malgré une étude précédente non concluante, du même laboratoire, sur les douleurs aigus426. Dans la continuité de ces études, l'utilisation d'un antagoniste de la FAAH (le PF- 04457845) a été étudiée dans deux études cliniques menées par les laboratoires Pfizer, évaluant son effet antalgique sur la douleur aigu et arthrosique. Les résultats sont malheureusement non concluants346. Voyons maintenant l'implication des récepteurs aux vanilloïdes dans les effets des lipoaminoacides. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES 2. Récepteurs aux vanilloïdes a. Généralités Dans la famille des canaux TRPs, il existe six sous familles : les TRPC (Canonical), TRPV (Vanilloid), TRPM (Melastatin), TRPP (Polycystin), TRPML (Mucolipin) et TRPA (Ankyrin). Chaque sous-famille est composée de plusieurs membres qui s'organisent en tétramères pour être fonctionnels soit sous forme homotétramérique soit sous forme hétérotétramérique. Ce sont tous des canaux perméables aux cations, dont le domaine pore est situé entre le cinquième et le sixième domaine transmembranaire. Contrairement à d'autres familles de récepteurs, l'homologie de séquence entre les récepteurs TRPs est très faible expliquant leur diversité de modes d'activation (température, composés chimiques, osmolarité, stimulation mécanique, lipides, lumière, produits du stress oxydatif, acidité ou encore les phéromones). A ce jour, presque toutes les cellules testées expriment au moins un membre de cette famille. Ainsi, les rôles physiologiques de ces canaux sont multiples et non limités aux mécanismes de transduction du message douloureux427. Le récepteur TRPV1, par exemple, est capable d'interagir directement avec des résidus de type vanilloïdes, mais pas seulement. Le chaud nociceptif (> 43C), et le pH acide ont été largement décrits comme activateurs du TRPV1. Ainsi, il est donc communément admis pour être un thermorécepteur périphérique228, 427, 428. De plus, depuis son clonage, un large panel d'études pharmacologiques et fonctionnelles a démontré que ce canal est un acteur important dans le développement des processus douloureux périphériques qu'ils soient aigus ou chroniques. Ainsi, l'administration périphérique de capsaïcine, agoniste des récepteurs TRPV1, induit un phénomène douloureux important immédiat suivi d'un effet antalgique expliqué par la désensibilisation des fibres nociceptives primaires429436. De plus, l'utilisation d'antagonistes sélectifs du TRPV1 permet d'abolir les processus d'hypersensibilité observés et ceci dans de nombreux modèles animaux428, 437. b. Le récepteur TRPV1 i. Expression Le récepteur TRPV1 a initialement été jugé comme uniquement exprimé dans les neurones de petit et moyen diamètre dans les DRG et le trijumeau, conformément à l'action sélective des ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES vanilloïdes228, 438440. Cependant, des études ultérieures utilisant des techniques plus sensibles ont démontré que le TRPV1 était exprimé dans de nombreuses autres structures neuronales441445 et non neuronales441, 446, 447. Le niveau d'expression dans les neurones sensoriels périphériques de petit diamètre semble être 30 fois plus élevé au moins que partout ailleurs dans le corps. L'expression des récepteurs TRPV1 et leur fonctionnalité au niveau périphérique n'est plus { démontrer et est admise par la communauté scientifique. Malheureusement, ce n'est pas encore tout { fait le cas d'un point de vue central et plus particulièrement supraspinal. Plusieurs études comportementales ont largement démontré les effets hypothermisant et antinociceptif de la capsaïcine injectée au niveau supraspinal431, 448, 449. Ces résultats suggèrent que les récepteurs TRPV1 supraspinaux, { l'inverse des récepteurs TRPV1 périphériques, sont impliqués dans des processus d'antinociception. Malgré tout, la présence et la fonctionnalité du récepteur TRPV1 au niveau supraspinal fait débat encore actuellement avec des études qui se contredisent à tour de rôle. L'expression du récepteur TRPV1 au niveau supraspinal a été étudiée par diverses méthodes (radioligands, immunohistochimie, hybridation in situ, RT-Q-PCR. )442445, 450, 451. Malgré cela, ces études n'ont pas permis d'avoir une réponse nette sur sa présence et il aura fallu attendre une étude récente de Cavanaugh et coll. 441, 452 afin d'éclaircir ce débat grâce { la génération d'une souche de souris C57Bl6J Trpv1-LacZ qui permet de visualiser spécifiquement les neurones exprimant le récepteur TRPV1 (couleur bleue). Les résultats ont montré une expression, certes faible mais présente, des récepteurs TRPV1 au niveau supraspinal (Figure 12). Qu'en est-il de ses fonctions dans la nociception ? Figure 12 : Expression supraspinale du TRPV1. Evaluation de l'expression du récepteur TRPV1 chez des souris exprimant un gène rapporteur Lac-Z sous promoteur TRPV1. H, gauche) Expression du TRPV1 au niveau de la PAG. A-H, droite) Diverses régions supraspinales exprimant de manière plus ou moins importante le récepteur TRPV1. Modifié d'après Cavanaugh et coll. 2011. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES ii. Rôle dans la nociception L'implication des récepteurs TRPV1 périphériques et spinaux dans la nociception, avec un effet pronociceptif lors de son activation, n'est plus { démontrer et est bien admise par la communauté scientifique (pour revue453). Ainsi, dans ce manuscrit de thèse nous ne nous focaliserons que sur l'aspect supraspinal de l'implication du TRPV1 dans les processus douloureux. Seules quelques études récentes se sont intéressées à la modulation du TRPV1 au niveau supraspinal en se focalisant sur la PAG. Il a été démontré que le blocage du récepteur TRPV1 supraspinal (résinifératoxine, 0, 5 nmol, intra-PAG) induit une hyperalgie thermique corrélée à la diminution de l'activité des cellules OFF de la RVM et, a contrario, l'activation du TRPV1 (capsaïcine 6 nmol, intra-PAG) induit un effet opposé (antalgie et activation des cellules OFF)229. Ce qui est plus intéressant dans ces études est que cet effet antinociceptif est drastiquement réduit par l'inhibition du récepteur TRPV1 par la capsazépine (6 nmol, intra-PAG) mais plus surprenant, également par la coadministration d'un agoniste CB1 (WIN55, 212-2 ; 25 nmol). Par la suite, deux études230, 454, toujours dans cette zone du cerveau, chez le rat ont permis de confirmer le lien fonctionnel entre ces deux récepteurs dans la régulation de la nociception. Au final, les récepteurs TRPV1 supraspinaux sont bien impliqués dans la nociception et il semblerait que ceux-ci soient en interrelation avec le système cannabinoïde via les récepteurs CB1. Cette dernière donnée n'est pas surprenante si l'on considère que l'anandamide est { la fois un activateur des TRPV1 et CB1, et l'hypothèse mise en avant serait qu'au niveau cellulaire, dans la PAG, le récepteur TRPV1 serait étroitement associé avec le récepteur CB1, lui permettant de répondre à une augmentation des taux des endocannabinoïdes. Cette activation physiologique du récepteur TRPV1 par l'anandamide serait responsable de l'activation des voies inhibitrices descendantes au travers de l'activation des cellules OFF de la RVM. Ainsi, le fait que l'anandamide soit { la fois un fort agoniste des récepteurs CB1 et TRPV1 suggère une forte interaction entre ces deux récepteurs dans les processus physiologiques dépendants des lipoaminoacides, et potentiellement de l'AM404. Pour appuyer cette hypothèse, une étude a montré une colocalisation supraspinale entre les récepteurs CB1 et TRPV1 dans plusieurs zones du cerveau dont la PAG450. Cette interaction reste toutefois à être confirmée par de plus amples études qui sont actuellement en cours au laboratoire. Suite { ces nombreuses études sur l'implication des récepteurs TRPV1 dans les processus nociceptifs, intéressons-nous aux débouchés cliniques actuels. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES iii. Aspect clinique Les nombreuses études précliniques, ayant maintes fois démontré l'implication des récepteurs TRPV1 dans la nociception, ont encouragé les industries pharmaceutiques { s'orienter massivement dans le développement de nouvelles thérapeutiques impliquant le TRPV1455. Ainsi chez l'Homme, comme observé chez l'animal, l'administration périphérique d'agonistes TRPV1 induit immédiatement une sensation douloureuse importante qui est suivie d'une antalgie provoquée par la désensibilisation des fibres nociceptives périphériques455. Suite à ces observations, de nombreuses préparations de capsaïcine sont désormais utilisées dans la pratique clinique, comme l'Elastotherm 0, 075% crème (AMM en 2006) et le Qutenza 8% 179 mg (AMM en 2009). Ces types de crèmes à base de capsaïcine sont indiqués, respectivement, dans le traitement local des douleurs neuropathiques et musculaires. Les effets antinociceptifs chez l'Homme de la capsaïcine ont étaient plus ou moins validés par de récentes méta-analyses cliniques455, 456. Il a été rapporté un effet bénéfique de ces crèmes sur la douleur chez des patients souffrant d'une névralgie post-herpétique, de douleurs post- chirurgicales (bunionectomie hallux valgus) et articulaires (prothèse totale de genou). Il faut néanmoins ajouter { cela que la douleur provoquée par l'application du patch et l'érythème qui s'en suit impose l'utilisation d'autres antalgiques (lidocaïne 4%) avant l'application (60 min) afin de permettre au patient de supporter le traitement. Malgré tout, l'utilisation de ces crèmes { base de capsaïcine dans la pratique clinique doit encore être soumise à une évaluation précise de leurs effets antalgiques et notamment dans plusieurs types de douleurs au travers d'études cliniques multicentriques. En ce qui concerne le développement des antagonistes TRPV1, les effets indésirables associés à ce type de molécules constituent un frein important. En effet, il est bien connu qu'ils induisent une hyperthermie ( 1 { 1, 4C) chez l'Homme comme l'animal, ainsi qu'une perte de la sensation de la chaleur (brûlures fréquentes). C'est pour cela que l'étude de phase I, utilisant l'AMG597 (le plus puissant antagoniste TRPV1) a été arrêtée suite { des hyperthermies persistantes de l'ordre de 39 voire 40C, pendant 3 { 4 jours 455. La molécule la plus prometteuse dans le traitement de la douleur actuellement en test est le SB-705498. Dans un modèle de douleur induite chez le volontaire sain (modèle de brûlure aux UVB), le SB-705498 augmente les seuils de douleurs induites par le chaud mais pas par la capsaïcine457. ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES 3. Lipoaminoacides et TRPV1 a. L'anandamide Les exovanilloides , dont le représentant majeur est la capsaïcine, sont connus depuis plusieurs décennies. Ce ne fut que plus récemment que le premier endovanilloïde fut décrit, c'est un composé largement connu comme endocannabinoïde et appelé anandamide354, 458460. Malgré tout, l'anandamide reste un agoniste bien moins puissant que la capsaïcine, de l'ordre d'un facteur 10355, 460, mais ceci est dépendant de la température (puissance maximale à 37C)461 et du type cellulaire355, 462, 463. Les interactions anandamide / TRPV1 sont bien décrites au niveau périphérique mais très peu d'études existent sur cette interaction au niveau supraspinal, notamment à cause de la controverse sur l'existence même du TRPV1 au sein du cerveau. Seule une étude montre que l'augmentation du taux d'anandamide cérébral (PAG) était à même de provoquer une hyposensibilité thermique au travers de l'activation du récepteur TRPV1 et de l'activation des voies inhibitrices descendantes230. Résultats qui confirment ceux d'une étude précédente qui a démontré que l'antalgie induite par une stimulation électrique de la PAG est accompagnée d'une augmentation des taux d'anandamide dans cette même structure. Ainsi, le rôle antinociceptif du couple anandamide / TRPV1 dans cette région du cerveau semble exister. b. Le N-arachydonoyl-dopamine Il existe une multitude d'autres ligands TRPV1 similaires { l'anandamide mais leur implication dans la nociception reste encore à déterminer. Prenons par exemple le NADA, un composé qui possède une affinité forte pour les récepteurs TRPV1 et CB1 et qui se trouve en forte quantité dans le cerveau contrairement à la périphérie205, 311, 464466. Son anabolisme reste encore à être identifié et il semblerait jouer le rôle de neuromodulateur au travers des récepteurs TRPV1 et CB1. c. Le 2-arachydonoyl-glycérol Une étude actuellement menée par notre laboratoire a montré que le 2-AG était capable d'activer les récepteurs TRPV1 au niveau d'artères mésentériques de rat. Consistant avec le ARACHIDONIC-RELATED COMPOUNDS : NOUVELLE CLASSE DE MEDIATEURS LIPIDIQUES résultat précédent, le 2-AG n'induit plus ou très peu de vasodilatation chez les souris KO TRPV1. A contrario, l'inhibition de la dégradation du 2-AG par la MAGL potentialise ses effets vasodilatateurs, ceci dépendant du TRPV1. Enfin, d'un point de vue comportemental, l'utilisation d'un antagoniste de la MAGL (JZL-184) par voie intracérébroventriculaire induit un effet antinociceptif, également dépendant du TRPV1 (Zygmunt et coll. , en soumission). En conclusion de ces études, existe-t-il une pertinence clinique { l'utilisation de ligands TRPV1 ? Malgré un effet clinique notable sur la douleur, le développement de thérapeutiques antalgiques basées sur la modulation spécifique du récepteur TRPV1 se heurte à plusieurs facteurs : 1) Complexité de la biologie du récepteur TRPV1 au travers des espèces, 2) Nécessité d'une modulation de récepteurs TRPV1 centraux pour obtenir un effet antalgique suffisant, 3) Effets hyperthermisants des antagonistes. Très récemment un travail impliquant notre laboratoire a démontré que les lipoaminoacides étaient capables de moduler négativement un autre type d'acteur très impliqué dans les processus douloureux, les canaux ioniques voltage dépendants et plus précisément les canaux calciques voltage dépendant de type T467. Cette nouvelle famille de canaux calciques fut découverte il y a peu de temps mais déjà de nombreuses études ont démontré leur forte implication dans la nociception. L'importance de ces canaux calciques dans les processus douloureux et le fait que les arachidonic-related compounds , comme l'anandamide et l'AM404, soient capables de les inhiber468, en plus de moduler des acteurs comme le CB1 et TRPV1, constituent des arguments forts en faveur de l'intérêt de ces protéines pour la modulation pharmacologique de la douleur. Compte tenu de l'implication de l'AM404 dans l'effet du paracétamol, nous émettons l'hypothèse que ces canaux pourraient également être mobilisés dans l'effet antalgique du paracétamol, ce qui justifie de donner plus de détails sur ces canaux calciques voltage dépendants. INTRODUCTION GENERALE LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? IV. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? A. Genèse de l'influx nerveux 1. Généralités Toute perception de l'environnement par l'organisme n'est possible que par la transformation des stimulations en signal détectable et analysable par l'organisme, c'est-à-dire en signal électrique ou chimique. Pour cela il existe des protéines spécialisées dans la détection spécifiques des diverses stimulations extérieures ou endogènes { l'organisme. Dans le système nerveux, ces protéines ont pour rôle de détecter les stimulations (mécanique, thermique, chimique) puis de les coder en message électrique. Message électrique qui sera à son tour transmis le long de l'axone grâce { d'autres types protéiques ayant pour but final la transformation du signal électrique en signal chimique par des protéines spécialisées au niveau des synapses ce qui permettra la transmission du signal entre neurones. Parmi les différentes protéines intervenant, nous pouvons citer les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) ou à la tyrosine kinase (RTK) et les canaux ioniques. Ce sont ces derniers que nous développerons plus en détail. Ce sont ces différents canaux qui vont transformer la stimulation en influx électrique grâce au flux d'ion généré (hyperpolarisant ou dépolarisant) par leur activation. C'est suite { la somme de ces flux d'ions qu'un courant va être généré et que le potentiel membranaire de repos du neurone sera changé en potentiel transducteur. Le courant produit est dépendant de la nature de la stimulation mais également proportionnel à son intensité et sa durée. Le courant généré, s'il est assez fort pour donner naissance à un potentiel transducteur important, va permettre la création de potentiels d'action (PA), permis par l'activation des canaux sodiques voltage-dépendants (Nav) entrainant une dépolarisation du neurone. Cette dépolarisation va immédiatement activer d'autres canaux voltage-dépendants, les canaux potassiques (Kv), qui eux vont { l'inverse créer un courant hyperpolarisant pour contrer la dépolarisation et restaurer le potentiel membranaire de repos du neurone. Ces phases de dépolarisation / repolarisation vont générer les PA isolés ou en bouffées, en fonction du type de LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? stimulation et du type de neurone. C'est alors que le message nerveux sera codé en fonction de la fréquence des PA. Dans le cas d'une stimulation douloureuse périphérique, 1) la stimulation est détectée au niveau des terminaisons libres des fibres afférentes primaires, 2) la stimulation est transformée en signal électrique, 3) le signal électrique (PA) est propagé sans interruption le long de l'axone jusqu'{ la corne dorsale de la moelle épinière (en passant par le DRG), 4) le signal électrique est transformé en signal chimique au niveau de la synapse pour être transmis au second neurone (neurone de projection), grâce { l'intervention de canaux calciques voltage dépendants. 2. Canaux ioniques voltage dépendant et influx nerveux Dans la suite de ce paragraphe nous détaillerons les canaux calciques voltage-dépendants, famille possédant le canal calcique Cav3. 2 étudié dans mes travaux de thèse, et leurs rôles dans la nociception. La super famille des canaux ioniques voltage-dépendants comprend 152 membres caractérisés469 (Figure 13). On peut dénombrer : - les canaux sodiques : Nav1. 1 à 1. 9469, 470, - les canaux potassiques : Kv1 à 12, K2p1 à 18, Kir1 à 7 et Kca1 à 5471473, - les canaux calciques : Cav1 (Cav1. 1 à 1. 4), Cav2 (Cav2. 1 à 2. 3) et Cav3 (Cav3. 1 à 3. 3)469, 470, 474. - les canaux non sélectifs : TRP (TRPC à 7, TRPM1 à 8, TRPV1 à 6, ANKTM1, TRPP1 à 3 et TRPML1 à 3, préférentiellement Ca2 ), HCN1 à 4, CNGA1 à A4, CNGB1 et CNGB3 (préférentiellement K )469 Figure 13 : Superfamille des canaux ioniques voltage dépendants. D'après Yu et Catterall 2004. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? Ces canaux participent { l'excitabilité neuronale, la génération des PA, la propagation du message nerveux, la libération des neurotransmetteurs et donc par conséquent jouent un rôle important dans la nociception. Les canaux sodiques et calciques sont les acteurs majoritaires participant à la phase de dépolarisation du PA, les canaux potassiques, quant à eux, contribuent à la phase de repolarisation et d'hyperpolarisation (Tableau 2). Tableau 2 : Tableau récapitulatif des structures et fonctions des canaux voltage dépendants LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? B. Canaux calciques voltage-dépendants 1. Généralités Pendant longtemps le sodium fut considéré comme l'ion majoritaire nécessaire { la génération des PA. Dès 1953 cette idée fut révoquée par l'étude de muscles de crustacé ayant démontré l'implication des ions calcium dans la génération des PA475. Plus tard, l'implication des ions calcium fut étudiée plus en détail et l'on découvrit l'existence d'une augmentation calcique durant la phase ascendante du PA475 et qu'il existe une grande hétérogénéité dans l'expression et la distribution des canaux calciques dans l'organisme quelle que soit l'espèce. La fonction de ces canaux ne se cantonne pas { l'excitabilité neuronale, les canaux calciques participent également à de nombreuses fonctions biologiques allant de la contraction musculaire, l'exocytose jusqu'{ la maturation des spermatozoïdes474, 476478 (Tableau 3). Suite à la découverte de ces différents canaux calciques ainsi que des différents courants calciques associés, deux grands groupes de canaux calciques ont été distingués en fonction de leur réponse au voltage. Le groupe des canaux calciques à haut seuil d'activation (High Voltage Activated, HVA) et le groupe à bas seuil d'activation (Low Voltage Activated, LVA)469, 479 (Figure 14). La famille des canaux HVA se compose de différents membres (L, N, P/Q, R), différenciés selon leur profil électrophysiologique. Les canaux calciques de type L sont appelés ainsi pour leur Large conductance et leur temps d'inactivation très lent ( Long lasting ). Les types N, n'ayant aucune similitude électrophysiologique avec les L, caractérisés au niveau des neurones sensoriels de poulet furent ainsi nommés pour Neuronal ou Neither (non type L). Par la suite, { l'aide de la découverte et de l'utilisation de nouvelles toxines, les canaux de type P/Q furent découverts dans les cellules de Purkinje du cervelet, d'o leur nom. Enfin, les types R tiennent leur nom de Résistant ou Residual du fait que ces courants résistent à toutes les toxines. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? Tableau 3 : Tableau récapitulatif des fonctions des canaux calciques voltage dépendant. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? La famille des canaux LVA quant à elle ne se compose que des canaux de type T pour Tiny and Transient conductance en raison de leur faible conductance et leur inactivation rapide. Les types L et T sont les seuls à être exprimés dans une grande variété de types cellulaires alors que les courants de type N, P/Q, et R se retrouvent essentiellement dans les neurones474. Les canaux calciques sont composés de plusieurs sous unités480483. La sous-unité principale est appelée 1, elle possède une structure similaire à celle des canaux sodiques : quatre domaines de 6 segments transmembranaires chacun, reliés entre Figure 14 : Phylogénie des canaux sodiques (Nav) eux par des boucles intracellulaires. La boucle et calciques (Cav). Les valeurs de bootstrap allant de 50 à 74% sont représentés par un formant le pore (P loop) se situe entre les astérisque * ; Les valeurs de 75 à 100% sont segments S5 et S6 de chaque domaine, et les représentés par *, et celles qui sont sont non représentées. La barre d'échelle correspond segments S1 à S4 portent la sensibilité au voltage au nombre de changements nécessaires pour expliquer les différences dans les séquences et la sélectivité au calcium est portée par la protéiques. La longueur des branches verticales n'est pas représentative. D'après Yu et Catterall séquence d'acides aminés EEEE (4 acides aminés 2004. glutamate). Comme pour les canaux sodiques, la sous-unité 1 est accompagnée de sous-unités annexes, la sous-unité (intracellulaire) et la sous-unité 2 (transmembranaire ou extracellulaire) reliée par des ponts disulfure à la sous-unité (transmembranaire), plus communément appelée sous-unité 2 (Figure 15). Ces sous-unités associées { la sous unité 1 sont essentielles à sa fonctionnalité dans le cas des canaux HVA. En effet, elles ont divers rôles comme l'adressage à la membrane, la dépendance au voltage et la probabilité d'ouverture du canal484, 485. Le clonage des différentes sous-unités 1 associées aux différents courants calciques observés a permis de déterminer 10 sous unité 1 différentes (1S et 1A { I) organisées en 3 familles : Cav1, Cav2 et Cav3. Les Cav1 représentent les courants de type L et sont composés de 4 membres (Cav1. 1, Cav1. 2, Cav1. 3, Cav1. 4). Les Cav2 regroupent les courants de type N, P/Q, R et comportent 3 membres (Cav2. 1 pour le type P/Q, Cav2. 2 pour le type N, et Cav2. 3 pour le type R)486, 487. Enfin, les Cav3 sont { l'origine des courants de type T et possèdent 3 membres : Cav3. 1, Cav3. 2 et Cav3. 3. Les arbres phylogénétiques de ces différents membres montrent une homologie de séquence { hauteur de 50% pour les canaux Cav1 et Cav2, alors que les canaux Cav3 n'en LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? présentent que 30%, constituant ainsi une distinction entre canaux HVA et LVA très tôt dans l'évolution des espèces474, 488. Figure 15 : Structure primaire des canaux calciques voltage dépendant. Chaque cylindre représente les hélices alpha, reliés entre eux par les chanes polypeptidiques. Les deux lignes en zigzag représentent l'ancre glycophosphatidylinositol. Les chiffres romains indiquent les différents domaines de la sous-unité . En jaune sont représentés les segments responsables de la détection du potentiel, et en vert les segments du pore du canal. Modifié d'après Catterall 2011. 2. Les canaux HVA a. Les canaux Cav1 (ou type L) Les canaux Cav1 participent à de nombreuses fonctions biologiques comme la contraction musculaire (Cav1. 1 dans le muscle et Cav1. 2 dans le cœur)489, 490. Les courants de type L participent également activement { l'exocytose, c'est le cas par exemple pour la sécrétion des catécholamines (cellules chromaffines) et des neurotransmetteurs (photorécepteurs et cellules auditives)491493. Au niveau du système nerveux, les canaux Cav1 sont retrouvés au niveau des DRGs494496 mais leur fonction est encore mal connue. Au niveau de la ME, ces canaux semblent avoir un rôle dans la plasticité neuronale497499. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? b. Les canaux Cav2 (ou type N, P/Q, R) Le rôle prépondérant de ces canaux au sein du système nerveux est la transmission du message nerveux de par leur interaction avec la protéine SNARE impliquée dans la fusion des vésicules synaptiques nécessaires au relargage des neurotransmetteurs (Cav2. 1 et 2. 2)500505 et par leur implication dans la modulation de la plasticité synaptique (Cav2. 1, 2. 2 et 2. 3)506510. Ces canaux calciques N et P/Q sont retrouvés au niveau des synapses entre les neurones des FAP et les neurones de la ME o ils contrôlent le relargage des neurotransmetteurs496, 504, 511513. Cependant, le courant majoritaire, responsable des courants HVA au niveau des DRGs, reste le courant Cav2. 2 (type N), responsable entre autres de la libération de CGRP et de substance P par les fibres C et A504, 514. En ce qui concerne la dernière isoforme, le canal Cav2. 3 (type R), comme ces prédécesseurs, elle semblerait intervenir dans la transmission synaptique mais de plus amples études sont à effectuer496, 515517. 3. Les canaux LVA (ou type T) Cette dernière famille de canaux calciques concerne directement cette thèse est sera donc étudiée plus en détail. Les membres de cette nouvelle famille de canaux calciques furent découverts pratiquement en même temps, à une année près, par l'équipe de Perez-Reyes en 1998-1999 chez le rat (Cav3. 1 et 3. 3) et le cœur humain (Cav3. 2)518520. Par la suite, de nombreux variants d'épissage ont été découverts, variation notamment au niveau des boucles entre les domaines, présentant des courbes d'inactivation ou d'activation et une localisation cellulaire différentes521 Les canaux de type T ont la particularité de présenter une différence majeure avec les canaux HVA : celle de ne pas posséder d'interaction physique ou fonctionnelle avec la sous-unité régulatrice , en condition physiologique526529. De plus, aucune sous-unité nécessaire ou modulant l'activité des canaux LVA n'a été identifiée à l'heure actuelle522. a. Caractéristiques des canaux de type T La caractéristique principale de ces canaux, qui en fait leur intérêt principal, est leur capacité { s'ouvrir { des potentiels membranaires proches du potentiel de repos des neurones. Leurs caractéristiques électrophysiologiques sont : LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? - Activation : -49 mV pour Cav3. 1 ; -48 mV pour Cav 3. 2 ; et - 41 mV pour Cav3. 3. Les temps d'activation (dépolarisation de -110 mV à -40 mV) sont de 4. 4 ms pour Cav3. 1 ; 5, 7 ms pour Cav3. 2 et 33, 9 ms pour Cav3. 3530. - Inactivation : -74 mV pour Cav3. 1 ; -75 mV pour Cav3. 2 ; et -69 mV pour Cav3. 3. Les temps d'inactivation (dépolarisation de -110 mV à -40 mV) sont de 18, 8 ms pour Cav3. 1 ; 23, 4 ms pour Cav3. 2 et 122 ms pour Cav3. 3530. - Déactivation : une caractéristique des canaux T qui les différencient des canaux HVA est leur temps de déactivation (passage de l'état ouvert à fermé) qui est beaucoup plus lent (LVA : 2 à 12 ms ; HVA : 300 s)531. Cette particularité permet une entrée de calcium plus importante lorsque ces canaux sont ouverts en réponse à des événements synaptiques brefs ou des PA. Malgré tout, ces résultats peuvent varier selon les conditions expérimentales526. Dans tous les cas, les différentes études montrent que les canaux Cav3. 1 et 3. 2 possèdent des caractéristiques très proches (contrairement au canal Cav3. 3), seule la déinactivation (passage de l'état inactivé { fermé) permet de différencier les 3 isoformes (137 ms pour Cav3. 1, 448 ms pour Cav3. 2 et 260 ms pour Cav3. 3) (Figure 16)530. Figure 16 : Profil électrophysiologique des canaux de type T. A) Courants générés par les isoformes humaines de Cav3. 1 (1G), Cav3. 2 (1H) et Cav3. 3 (1I) lors d'une dépolarisation de -110mV à - 35mV pour Cav3. 1 et Cav3. 2 et - 25mV pour Cav3. 3. B) Relation courant-voltage (courbe I-V) des différentes sous-unités de canaux T. C) Courbes d'activation et d'inactivation des différentes sous-unités de canaux T. On observe vers -60mV un courant persistant dit de fenêtre pour les trois isoformes. D'après Chemin et coll. 2002. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? b. Rôles dans l'influx nerveux - Déclenchement de PA : du fait de leurs propriétés vues précédemment ({ l'exception de Cav3. 3), ces canaux peuvent contribuer { l'excitabilité neuronale en agissant sur l'amplification transitoire des potentiels dépolarisants ou potentiels postsynaptiques excitateurs (PPSE). Ces PPSE sont induits, par exemple, par des canaux détecteurs (TRPV1, ASIC) et permettent au neurone d'atteindre le taux de dépolarisation nécessaire au déclenchement des PA, par l'intermédiaire de l'ouverture des canaux sodiques532. - Bouffées de PA : leurs différentes cinétiques électrophysiologiques font que les canaux de type T répondent différemment à des trains de PA. Cav3. 1 et Cav3. 2 seraient plutôt responsables de décharges de PA en bouffées courtes du fait de leur inactivation rapide, Cav3. 3 au contraire serait impliqué dans les bouffées plus longues530, 533, 534 (Figure 17). - Génération d'ondes électriques (ou oscillation) : beaucoup d'études ont démontré l'implication des canaux T dans la génération d'ondes électriques, principalement au niveau des neurones thalamo-corticaux, lors de la phase de sommeil à ondes lentes526, 535. Cette oscillation s'explique comme suit : l'activation des canaux de type T déclenche un PA. Lors de l'hyperpolarisation subséquente, les canaux T sont inactivés et par la même occasion déclenche l'ouverture des canaux HCN ce qui dépolarise le neurone pour revenir au potentiel de repos. C'est lors de cette dépolarisation (-70 mV) que les canaux T vont être de nouveau activés et par conséquent réenclencher un PA536. - Transmission synaptique : deux études récentes ont montré une implication pré-synaptique des canaux T dans la transmission du message nerveux. En effet, les canaux T agiraient sur la fiabilité de la transmission synaptique en tant que régulateur au niveau supraspinal et spinal537, 538. - Propagation du PA : une étude, non encore publiée par l'équipe du Dr. E. Bourinet, semble montrer également un rôle des canaux de type T (Cav3. 2) dans la propagation des PA. En effet, la mise en contact d'un inhibiteur des canaux T (TTA-A2) avec le nerf sciatique en préparation nerf- peau, réduit la propagation des PA suite à une stimulation de la peau innervée par ce même nerf (François et coll, en rédaction). LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? Figure 17 : Participation des canaux calciques de type T aux potentiels d'action. A) Contribution des courants calciques de type T lors d'un potentiel d'action neuronal. Les isoformes 1G et 1H (Cav3. 1 et Cav3. 2) se différencient de l'isoforme 1I (Cav3. 3) de par leurs contributions qui perdurent plus longtemps lors de la phase de repolarisation. B) Contribution des différents courants calciques de type T lors d'un train de PAs déclenché dans des cellules de Purkinje. Les isoformes 1G et 1H (Cav3. 1 et Cav3. 2) présentent des courants qui s'épuisent rapidement alors que l'isoforme 1I (Cav3. 3) permet une entrée de calcium stable tout au long de la stimulation. D'après Chemin et coll. 2002. c. Pharmacologie Un des défis majeur dans l'étude des rôles des canaux ioniques est la production d'antagonistes ou agonistes spécifiques d'un canal ionique sans agir sur d'autres membres. i. Ions métalliques Les ions métalliques ont été utilisés pour bloquer les canaux calciques dès 1975539 et plus tard le cadmium fut utilisé pour bloquer spécifiquement les canaux calciques HVA494. Malheureusement, il existe peu d'ions capables de différencier les canaux HVA des LVA et encore moins les LVA entre eux. Actuellement, seuls les ions nickel, cuivre et zinc sont couramment utilisés pour distinguer les canaux LVA des HVA voir les LVA entre eux. Le nickel possède une IC50 de 250 M pour Cav3. 1, 12 M pour Cav3. 2 et 216 M pour Cav3. 3 alors qu'elle est supérieure { 500 M pour les HVA (hors type R, IC50 : 50 M). Le nickel est ainsi largement considéré et utilisé comme un inhibiteur des canaux Cav3. 2540. Les ions cuivre et zinc permettent de distinguer les canaux Cav3. 1, Cav3. 2 et Cav3. 3 entre eux (respectivement IC50 Cav3. 1 : 22 et 135 M ; Cav3. 2 0, 9 et 23 M ; Cav3. 3 : 26 et 470 pour le LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? zinc et le cuivre). De plus, le zinc augmente fortement le temps de déactivation du Cav3. 3 alors qu'aucun effet n'est observé pour les autres isoformes de canaux T520, 541, 542. Cette propriété peut être utilisée pour isoler les courants Cav3. 3 parmi les courants T. ii. Les toxines En pharmacologie, l'utilisation de toxines d'origine naturelle pour leurs actions biologiques est courante. La toxine la plus connue est la toxine botulique qui est une protéase détruisant le complexe SNARE empêchant ainsi la libération d'acétylcholine au niveau des synapses induisant une paralysie flasque. Concernant les canaux ioniques, la toxine la plus utilisée est la tétrodotoxine (TTX). Cette toxine est issue de la famille de poissons ayant donné son nom, les Tetraodontidae (tétraotodon) mais également de certaines espèces de crapauds et de pieuvres (pieuvres à anneaux bleus). La tétrodotoxine est un inhibiteur de certains canaux sodiques et va conduire au blocage de la génération des PA. Très récemment, cette toxine fut utilisée en clinique dans le traitement de la douleur cancéreuse avec des résultats prometteurs543. Dans la famille des canaux calciques, il existe deux toxines inhibitrices des canaux HVA, l'-agatoxine et l'-conotoxine respectivement isolées de venin d'araignées et de mollusques marins. L'-agatoxine de type IIIA et IVA possède une activité inhibitrice spécifique des canaux de type P/Q au niveau pré-synaptique ce qui bloquerait le relargage des neurotransmetteurs544. L'- conotoxine, quant à elle, est un inhibiteur des canaux de type N possédant un fort pouvoir antalgique, 100 à 1000 fois plus puissant que la morphine545, 546, ce qui a conduit à la mise sur le marché du ziconotide (Prialt) uniquement en utilisation hospitalière par administration intrathécale dans le traitement des douleurs chroniques intenses. Actuellement, il n'existe qu'une seule toxine, originaire du scorpion, qui bloque les canaux de type T : la kurtoxine547 avec une IC50 de l'ordre du nanomolaire. Malheureusement, pour cette même dose, il a été montré une action inhibitrice sur les canaux HVA548. Ainsi, il n'existe { l'heure actuelle aucune toxine spécifique des canaux de type T. iii. Molécules endogènes L'acide lipoïque a été décrit comme modulateur négatif des canaux de type T, notamment le membre Cav3. 2, par oxydation549. De manière plus intéressante, pour mes travaux de thèse, il a été démontré que les arachidonic-related compounds , tels que l'anandamide, LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? possédaient une action inhibitrice, entre autres, sur les canaux de type T467. Ces deux molécules, par leur inhibition notamment du membre Cav3. 2, ont été décrites comme des molécules antalgiques endogènes, ce qui pourrait expliquer un mécanisme supplémentaire d'action du paracétamol via l'AM404. iv. Molécules de synthèse Pour pallier à ce manque de spécificité et de choix des molécules antagonistes des canaux T, les entreprises pharmaceutiques ont produit de nouvelles molécules avec plus ou moins de succès. Voyons l'arsenal de molécules non spécifiques et spécifiques que nous possédons actuellement pour l'étude des canaux de type T. Non spécifiques - Dihydropyridines : famille de molécules dérivant de la pyridine et utilisée en tant que bloqueur calcique dans le traitement de l'hypertension. Quelques membres de cette famille sont capables de bloquer les canaux T tout aussi bien que les canaux L550, 551. - Mibéfradil : produit et mis sur le marché par les laboratoires Roche en 1997, cette molécule, vendue sous le nom de Posicor, serait le premier inhibiteur spécifique des canaux de type T. Le mibéfradil est prescrit pour le traitement de l'hypertension et l'angine de poitrine mais seulement après un an de mise sur le marché, Roche le retira suite à des interactions avec le cytochrome P450 et deux décès par tachycardies ventriculaires. Malgré la soit disant spécificité du mibéfradil pour les canaux T, de nombreuses études ont montré un effet inhibiteur sur les canaux calciques HVA, sodiques, potassiques et chlorures526, 552554. De plus, les effets hypertenseurs observés seraient dus { l'action sur les canaux HVA de type L555. - L'éthosuximide : antiépileptique pour le traitement des épilepsies de petit mal, commercialisé par Pfizer sous le nom de Zarontin en France (1960). C'est actuellement un des antagonistes non spécifiques des canaux de type T le plus utilisé avec le mibéfradil dans les études pré-cliniques. L'éthosuximide possède un fort pouvoir antalgique notamment sur les douleurs neuropathiques chez l'animal556559. A de fortes doses in vitro cette molécule agirait sur d'autres canaux ioniques. Malgré cela, nous verrons par la suite dans mes travaux de thèse que cet effet antalgique passerait spécifiquement par les canaux Cav3. 2. Suite à ces données précliniques nous avons mis LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? en place, dans le cadre de cette thèse, un projet clinique sur l'utilisation de l'éthosuximide dans le traitement des douleurs neuropathiques traumatiques. Spécifiques Plusieurs équipes se sont penchées sur la conception de molécules antagonistes spécifiques des canaux de type T. Actuellement, les molécules découvertes sont dites spécifiques Cav3 mais rien n'empêche que dans quelques années, d'autres cibles soient trouvées, ce qui nous pousse à prendre ces résultats avec précautions. Malgré tout, le profil d'action de ces nouvelles molécules sur les canaux T semble être plus spécifique que pour les anciennes grâce aux nouvelles techniques de criblage disponibles. Parmi ces molécules nous comptons la famille des TTAs développée en 1998 par le laboratoire Merck. Les TTAs (T Type Antagonist) sont des dérivés des piperidines560. La famille des TTAs se compose des TTA-A, des TTA-P et des TTA-Q. Les TTA-A et -P, notamment -A2 et -P2, sont de puissants inhibiteurs des canaux de type T (contrairement au TTA-Q qui serait un potentialisateur) avec une IC50 de l'ordre de la dizaine ou de la centaine de nanomolaires. La vérification de la sélectivité de ces molécules a été effectuée par technique de binding sur un panel de canaux ioniques et de divers récepteurs et toutes ces études aboutissent à la même conclusion : les TTAs possèdent une très grande sélectivité envers les canaux de type T560563. Actuellement, les TTA-A2 et -P2 restent les molécules antagonistes des canaux de type T les plus spécifiques. Plusieurs études ont été effectuées avec l'utilisation de ces molécules et reliées avec les canaux de type T, confirmant l'action des TTAs sur les canaux Cav3 d'un point de vue in vivo532, 538, 562566. Dans le cadre de mes travaux de thèse, nous avons utilisé la molécule TTA-A2 généreusement fournie par les laboratoires Merck par l'intermédiaire du Dr. Emmanuel Bourinet. L'avantage majeur de cette molécule est qu'elle est administrable par voie orale, qu'elle passe la BHE, qu'elle induit un effet antalgique chez l'animal et surtout qu'elle semble plus spécifique pour le Cav3. 2532 (Figures 18-19). LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? Figure 18 : Inhibition des canaux Cav3. 2 par le TTA-A2. A) Courbes dose réponses de TTA-A2 sur les courants Cav3. 2 (dépolarisations de 40 mV à une fréquence de 0, 1 Hz à partir des potentiels de maintien à 110 mV ou 75 mV). B) Gauche : traces de courant Cav3. 2 provoquées toutes les 100 ms (dépolarisation à partir de -75 mV à -40 mV), en conditions contrôles (ctrl) et en présence de 100 nM de TTA-A2. Droite : même conditions mais dépolarisation à partir de -110 mV à -40 mV). D'après François et coll. 2013. Figure 19 : Effet antalgique du TTA-A2 et spécificité sur Cav3. 2. L'effet du TTA-A2 (0, 3 ou 1 mg / kg per os) a été évaluée dans le test d'immersion de la queue à 46C et par le test de von Frey à 15, 30, 45, et 60 minutes après administration. A) L'administration de TTA-A2 augmente la latence de retrait de la patte chez les souris WT dans les deux doses utilisées. Contrairement aux souris KO CaV3. 2 (CaV3. 2 KO). B) Aire sous la courbe des expériences présentées en A). C) L'administration de TTA-A2 diminue le nombre de retrait de patte lors du test de von Frey (filament de 1, 4 g) chez les souris WT contrairement aux souris KO CaV3. 2 (CaV3. 2 KO). D) Aire sous la courbe des expériences présentées en C). D'après François et coll. 2013. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? d. Expression des canaux de type T Suite au clonage des isoformes Cav3, en 1999 une étude par hybridation in situ a permis de visualiser leur expression au niveau du système nerveux central et périphérique du rat567. Plus tard, ces résultats ont été confirmés par le projet Allen Brain Atlas chez la souris et l'Homme568. Ce qui est intéressant, c'est que l'on retrouve les canaux de type T pratiquement dans toutes les structures du système nerveux, de la périphérie { l'encéphale en passant par la moelle épinière. Il faut noter également que l'expression des canaux de type T n'est pas restreinte au système nerveux mais que plusieurs tissus les expriment comme le cœur, le muscle lisse, le rein et les tissus endocrines526, 569, 570. Au niveau du système nerveux et des structures impliquées dans la douleur, l'étude de Talley et coll. montre une expression très majoritaire du membre Cav3. 2 dans les neurones sensoriels des DRGs (avec une légère expression de Cav3. 3)567, 571. Au niveau médullaire, les canaux Cav3. 1 et 3. 2 sont exprimés de manière similaire dans les cornes dorsales et ventrales alors que Cav3. 3 y est absent567, 572, 573. Ces données expliquent pourquoi la plupart des études suivantes se sont intéressées principalement au membre Cav3. 2 au niveau des DRGs et de la ME dans les processus douloureux. Suite à ces données bibliographiques et dans le cadre de ces travaux de thèse, nous ne discuterons que de l'isoforme Cav3. 2 et de son implication dans la douleur dans la suite et fin de ce chapitre. e. Douleur et canaux Cav3. 2 Malgré leur profil électrophysiologique et d'expression bien documenté479, 494, 495, 567, les rôles physiologiques des canaux Cav3. 2 ainsi que la nature des neurones les exprimant restent encore mal connus et controversés. La première chose que l'on observe dans l'étude de Talley et coll. est que le canal Cav3. 2 est fortement exprimé dans des neurones de taille moyenne (30-40 m)567, neurones qui ont été identifiés par la suite comme des neurones D-Hair, innervant la base des poils de classe Down Hair 574, 575. En patch clamp ceci fut confirmé par la présence de courants de type T géants dans ces neurones576. Ces neurones font partie des fibres A LTM impliquées dans la mécanoperception. D'autres études montrent l'existence de canaux Cav3. 2 dans des neurones de plus petite taille (15-30 m) correspondant aux fibres C et A567, 577579. Malgré une densité de LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? courant beaucoup plus faible que dans les neurones D-Hair, l'étude de Coste et coll. en 2007 suggère également un rôle de ces canaux dans la mécanoperception579. Parallèlement à ces études de localisation, la génération de souris déficientes pour le gène Cav3. 2 a permis de mettre en évidence une très forte implication de ces canaux dans la perception douloureuse. En effet, les souris KO Cav3. 2 présentent une moindre réaction à des stimuli nociceptifs quelle que soit la modalité douloureuse testée580 (Figure 20). Résultat conforme à celui obtenu par l'équipe du Dr. E. Bourinet qui ont montré que l'inhibition spécifique des récepteurs Cav3. 2, { l'aide d'ARN antisens au niveau spinal, induit un effet antalgique chez le rat neuropathique581 (Figure 20). Ces études traduisent un rôle pronociceptif des canaux Cav3. 2. Par la suite, d'autres études ont confirmé son rôle dans la nociception538, 549, 582, 583. Beaucoup d'études se sont intéressées au potentiel thérapeutique de l'inhibition des canaux Cav3. 2 pour le traitement de la douleur, notamment neuropathique. L'inhibition de ces canaux, par diverses stratégies, entraine une diminution des symptômes douloureux (allodynie et hyperalgie) ainsi que de leur développement et leur maintenance dans divers modèles neuropathiques chez l'animal557, 581, 582, 584. Grace à la même collaboration, nous avons également démontré très récemment que les canaux Cav3. 2 étaient impliqués dans la douleur viscérale chez le rat (modèle butyrate)583 (Figure 20). Il faut noter également que beaucoup d'études retrouvent les mêmes résultats lorsque des inhibiteurs moins spécifiques des canaux Cav3. 2, comme l'éthosuximide, sont administrés chez l'animal556559. Ces données précliniques rendent l'inhibition des canaux Cav3. 2 et plus particulièrement l'éthosuximide, très prometteuse dans le traitement des douleurs neuropathiques chez l'Homme (Tableau 4). Tableau 4 : Tableau récapitulatif de l'effet antalgique de l'inhibition des canaux Cav3. 2 et de type-T. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? Figure 20 : Impact de l'inhibition des canaux Cav3. 2 sur la nociception en conditions saines et pathologiques. A) Effet sur la douleur mécanique d'une injection i. t. d'ARN antisens dirigés contre Cav3. 1 (rond noir), Cav3. 2 (triangle vers le bas) et Cav3. 3 (triangle vers le haut) chez le rat. Les animaux sont soumis au test de Randall et Selitto. Dans la figure de gauche les animaux sont sains alors que dans la figure de droite les animaux ont subi une constriction chronique du nerf sciatique. Dans les deux cas de figures les animaux ayant reçu les antisens Cav3. 2 ont un seuil de tolérance à la douleur beaucoup plus élevé. B) Effet sur la douleur colorectale d'une injection i. t. d'ARN antisens dirigés contre Cav3. 2 chez le rat. Les animaux sont soumis au test de distension colorectale. Ceci a été réalisé en condition normale (NaCl) ou en condition d'hypersensibilité colique (modèle butyrate). Les animaux ayant reçu les antisens Cav3. 2 récupèrent un seuil de tolérance normal et ne développent pas d'hypersensibilité colique. C) A gauche : Test du pincement de la queue sur des souris WT ( / ), ou KO Cav3. 2 (-/-). Le temps de latence des animaux à se lécher ou retirer la queue avec le pincement est évalué. A droite : Test de la plaque chaude à 52. 5C. Le temps de latence des animaux à retirer la patte de la plaque chaude est évalué. D) Comportement douloureux induit par le formol chez des souris WT ( / ), ou KO Cav3. 2 (-/-). A gauche : Les valeurs représentent le temps que passent les animaux { se lécher après injection de formol dans la patte (2% ; 10l). A droite : représentation du temps de léchage cumulé pendant la première phase (0-10 minutes) et la deuxième phase (10-60 minutes). D'après Bourinet et coll. 2005 ; Marger et coll. 2012 ; Choi et coll. 2007. Actuellement aucune n'étude ne s'est penchée sur l'implication des canaux Cav3. 2 dans un autre type de douleur chronique : les douleurs inflammatoires. C'est pour cela que dans le cadre de mes travaux de thèse je me suis intéressé à leur implication dans ce type de douleur. En parallèle à toutes ces études sur la modulation négative des canaux Cav3. 2, quelques études se sont intéressées à sa modulation positive par l'utilisation d'un agoniste très peu sélectif, le sulfite d'hydrogène (H2S). Ces études montrent que l'activation des canaux Cav3. 2 induit une hyperalgie585591. Le H2S, issu de la L-cystéine, agit sur le canal Cav3. 2 par réduction augmentant ainsi son activité. Le rôle proalgique du canal Cav3. 2 a également été montré par son niveau d'expression lors de pathologies douloureuses. En effet, en cas de neuropathie le canal Cav3. 2 voit l'expression de son ARNm, son adressage membranaire, et ses courants augmentés, ceci corrélé à la sensibilité à la douleur accrue582584, 592 (Figure 21). LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? Figure 21 : Modulation des courants Cav3. 2 en conditions pathologiques. A) Traces de courants calciques de type T dans des DRGs de rats en culture en condition contrôle (NaCl) ou après injection de butyrate dans le côlon. B) Traces d'un courant calcique de type T enregistrées dans des DRGs en culture de rats. Traces représentatives d'animaux contrôles, diabétiques, diabétiques ayant reçu les ARNs antisens Cav3. 2 et diabétiques ayant reçu les ARNs antisens contrôles. C) Traces d'un courant calcique de type T dans des DRGs en culture de rats. Traces représentatives d'animaux contrôles, diabétiques ayant un traitement { l'insuline, et diabétiques sans traitement. D'après Marger et coll. 2011 ; Messinger et coll. 2009. Il faut aussi noter que les canaux Cav3. 2 ne sont pas exclusivement exprimés en périphérie dans les DRGs mais aussi bien dans la ME (couche II-III, PKC ; François et coll. ; données non publiées) que dans certaines structures essentielles à la nociception au niveau du système nerveux central (PAG, données non publiées) (Figures 22-23), ce qui laissent penser à un rôle probable de ces canaux dans ces régions513, 593595. En effet, il existe des études dans la moelle épinière et dans le thalamus soulevant le rôle des canaux Cav3. 2 dans la nociception513, 538, 572, 578, 587, 596. Cependant il s'agit des seules informations disponibles { ce jour sur l'implication des canaux Cav3. 2 dans la nociception. L'identité des neurones exprimant les canaux Cav3. 2, leur implication dans l'excitabilité neuronale ainsi que leurs rôles au niveau spinal et supraspinal possèdent toujours des parts d'ombre. LES CANAUX CALCIQUES DE TYPE T : VERS UN NOUVEL AVENIR THERAPEUTIQUE ? Figure 22 : Expression spinal et périphérique des canaux de type T. A) Hybridation in situ des trois isoformes de la famille des canaux de type T dans la moelle épinière et B) dans des DRGs de rat. La première ligne correspond à la sonde Cav3. 1, la deuxième ligne Cav3. 2 et la troisième, Cav3. 3. C) Immunofluorescence de l'isoforme Cav3. 2 dans les DRGs (en haut, souris knock-in Cav3. 2-GFP, vert : GFP, rouge : PGP9. 5) et dans la moelle épinière (en bas, souris knock-in Cav3. 2-GFP, vert : GFP, rouge : IB4, bleu : PKC). Les canaux Cav3. 2 se retrouvent majoritairement au niveau des couches II-III avec une forte co-localisation avec la couche PKC et de manière plus faible avec IB4. D'après Talley et coll. 1999 et François et coll ; en rédaction. Figure 23 : Expression supraspinal des canaux de type T. A) Hybridation in-situ des trois isoformes de la famille des canaux de type T dans le cerveau de rat (Cav3. 1 en jaune, Cav3. 2 en rouge, Cav3. 3 en bleu). B) Hybridation in-situ de l'isoformes Cav3. 2 au niveau de la PAG. C) Immunofluorescence de l'isoforme Cav3. 2 au niveau de la PAG (vert : anticorps anti-GFP, souris knock-in Cav3. 2-GFP). D'après Talley et coll. 1999 et résultats non publiés. PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS V. PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS A. PROJET 1 : IMPLICATION DES CANAUX CAV3. 2 DANS L'EFFET ANTALGIQUE DU PARACETAMOL (ARTICLE 1) 1. Problématique Le projet initial de mes travaux de thèse porte sur la participation des canaux calciques de type T Cav3. 2 { l'effet antalgique du paracétamol. Pourquoi nous sommes nous orientés vers une relation Cav3. 2 paracétamol ? Pour cela, reprenons succinctement ce que nous avons appris au cours des chapitres précédents : - le paracétamol : nous avons vu qu'il s'agissait d'un pro-médicament devant être métabolisé successivement au niveau du foie en p-aminophénol puis spécifiquement au niveau cérébral en AM404 grâce { l'enzyme FAAH pour exercer son effet antalgique. - l'AM404, qui semble être le métabolite actif du paracétamol, fait partie d'une nouvelle famille de médiateurs lipidiques endogènes appelés arachidonic-related compounds . Certains lipides endogènes sont des activateurs des récepteurs aux vanilloïdes (TRPV1), récepteurs essentiels à l'effet antalgique du paracétamol100. De manière intéressante, les arachidonic-related compounds , injectés chez l'animal produisent un fort effet antalgique, dépendant des récepteurs TRPV1354, 356, 459, 460 (comme pour l'AM404)141 mais d'autres cibles leur sont attribuées. En effet, nous avons démontré que certains lipides endogènes sont capables de moduler négativement les canaux de type T (Cav3) pour induire une antalgie467. - les canaux Cav3. 2 : la famille des canaux de type T se compose de 3 membres (Cav3. 1, 3. 2 et 3. 3). Les canaux de type T sont localisés dans toutes les structures du système nerveux (périphérique et central). Le membre Cav3. 2 est le plus représenté dans ces structures, notamment au niveau des DRGs et de la ME567, 568, ce qui a poussé les équipes de recherche { s'intéresser d'avantage à cette cible. Comme énoncé dans les parties précédentes, le canal Cav3. 2, de par ses particularités électrophysiologiques et sa localisation, est très fortement impliqué dans la nociception. En effet, l'inhibition de ce canal soit par stratégie génétique (antisens, knock-out) ou pharmacologique (antagonistes) induit un fort effet antalgique chez l'animal580, 581. De plus, une étude récente que PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS nous avons effectué a montré que les canaux Cav3. 2 pouvaient être fortement inhibés par les arachidonic-related compounds ce qui pourrait expliquer leur effet antalgique467. Nous avons donc émis l'hypothèse que le paracétamol, via l'AM404, un arachidonic- related compounds , pouvait recruter les canaux Cav3. 2 pour permettre son effet antalgique. Voilà donc le départ et la base de mes travaux de thèse. 2. Objectifs L'objectif premier fut de démontrer une implication des canaux Cav3. 2 dans l'effet du paracétamol. Pour atteindre cet objectif, nous avons à disposition au laboratoire des souris invalidées pour le gène CACNA1H codant le canal Cav3. 2 (KO Cav3. 2) ainsi qu'un antagoniste spécifique des canaux Cav3. 2532, le TTA-A2, généreusement fournis par le Dr. Emmanuel Bourinet. L'effet antalgique du paracétamol fut testé chez les souris KO Cav3. 2 dans divers modèles nociceptifs et modalités douloureuses. Le paracétamol étant un antalgique d'action centrale, nous avons également évalué l'impact de l'inhibition des canaux Cav3. 2 par le TTA-A2, spécifiquement au niveau spinal (injection intrathécale, i. t. ) et supraspinal (injection intracérébroventriculaire, i. c. v. ) sur son effet antalgique, ceci dans diverses conditions expérimentales. Enfin, nous avons également testé l'effet antalgique de l'AM404 (i. c. v. ) chez les souris KO Cav3. 2, évaluant ainsi l'implication des canaux Cav3. 2 dans l'effet antalgique de l'AM404 administré au niveau supraspinal. L'objectif secondaire, parallèle au premier, fut de caractériser l'implication des canaux Cav3. 2 supraspinaux dans la nociception. En effet, de nombreuses études ont montré leur implication au niveau périphérique et spinal mais aucune au niveau supraspinal. L'administration de TTA-A2 par voie i. c. v. chez des souris sauvages et KO Cav3. 2 nous a permis de répondre à cette question. Enfin, le troisième et dernier objectif fut de comprendre les mécanismes sous-tendant l'implication des canaux Cav3. 2 dans l'effet antalgique du paracétamol. Pour cela, nous avons étudié l'action directe du paracétamol, du p-aminophénol et de l'AM404 sur les courants Cav3. 2 par la technique de patch clamp. Du fait de la nécessité absolue de la présence des récepteurs TRPV1 supraspinaux pour l'effet antalgique du paracétamol, nous nous sommes intéressés { la relation probable des canaux Cav3. 2 avec les récepteurs TRPV1. Pour cela, nous avons tout d'abord confirmé, par technique d'imagerie calcique, que le p-aminophénol devait être métabolisé par la FAAH pour activer les récepteurs TRPV1. En parallèle, nous avons confirmé, par la même technique que précédemment, l'unique étude355 montrant que l'AM404 était capable PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS d'activer directement les récepteurs TRPV1. Les bases conceptuelles étant posées et suite à une étude très récente de Comunanza597 ayant montré que l'activation du récepteur TRPV1 était capable d'inhiber fortement les courants de type T, nous avons donc vérifié l'interaction fonctionnelle entre le récepteur TRPV1 et le canal Cav3. 2. Ces études in vitro ont ensuite été couplées avec des expériences in vivo { l'aide de souris KO Cav3. 2 ou KO TRPV1 chez lesquelles nous avons évalué l'effet antalgique respectif de la capsaïcine (i. c. v. ) et du TTA-A2 (i. c. v. ). L'ensemble de nos travaux a permis l'émergence d'une hypothèse mécanistique originale mettant en jeu les canaux Cav3. 2 dans l'effet antalgique du paracétamol et ainsi de compléter un système déjà bien complexe. B. PROJET 2 : IMPLICATION DES CANAUX CAV3. 2 DANS LA DOULEUR INFLAMMATOIRE ET LES PROCESSUS ASSOCIÉS (ARTICLE 2) 1. Problématique Au cours du projet 1, dans lequel nous avons utilisé des modèles animaux de douleur inflammatoire, nous avons constaté une particularité intéressante des animaux KO Cav3. 2 : 1) ils ne présentent pas ou très peu de symptômes d'allodynie et d'hyperalgie associés aux douleurs inflammatoires, 2) ils présentent un développement œdémateux réduit suite { l'induction de l'inflammation. Au vu de ces résultats et du fait qu'aucune étude ne s'est penchée sur l'implication des canaux Cav3. 2 dans les douleurs inflammatoires (contrairement aux douleurs neuropathiques), nous avons donc évalué le rôle des canaux Cav3. 2 dans les douleurs inflammatoires et les processus associés. 2. Objectifs D'un point de vue comportemental, comme pour le projet 1, nous avons utilisé deux stratégies (KO Cav3. 2 et le TTA-A2). A l'aide de ces outils, nous avons étudié l'impact de l'inhibition des canaux Cav3. 2 sur le comportement douloureux et le développement œdémateux PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS en condition inflammatoire, permettant de répondre à la première question : les canaux Cav3. 2 sont-ils impliqués dans la douleur inflammatoire et le développement œdémateux ? Suite { l'observation d'un développement œdémateux diminué, la logique a voulu que nous nous orientions vers l'étude du mécanisme impliqué dans le développement de l'œdème en condition inflammatoire et sa relation avec les canaux Cav3. 2. Les acteurs principaux dans le développement œdémateux sont les cellules immunitaires dont majoritairement les macrophages par la sécrétion de nombreux médiateurs pro-inflammatoires. Plusieurs études récentes ont démontré que les canaux Cav3. 2 étaient impliqués dans les phénomènes d'exocytose des catécholamines par les cellules chromaffines570, 598601. Ainsi, l'hypothèse que nous avons émise est la suivante : les canaux Cav3. 2 seraient impliqués dans l'exocytose ou la production des médiateurs pro-inflammatoires par les macrophages. Pour répondre à cette question, la première étape fut de vérifier la présence des canaux Cav3. 2 sur les macrophages. Nous avons ensuite évalué la production des médiateurs pro-inflammatoires, in vivo et in vitro, par les macrophages avec ou sans inhibition des canaux Cav3. 2 (KO Cav3. 2 et TTA-A2). Nous avons également évalué, par divers paramètres et techniques, l'activation des macrophages en réponse à leur stimulation, ceci en fonction de la présence ou non des canaux Cav3. 2. Enfin, par une stratégie de souris chimériques, nous avons évalué l'impact de la délétion spécifique des canaux Cav3. 2 au niveau du système immunitaire sur la douleur inflammatoire et les processus associés. Ces études ont permis de valider le canal Cav3. 2 comme cible thérapeutique potentiel pour le traitement des douleurs inflammatoires. C. PROJET 3 : CANAUX DE TYPE T ET COMORBIDITES ASSOCIEES A LA DOULEUR INFLAMMATOIRE (ARTICLE 3) 1. Problématique Pour une grande partie des patients, les douleurs chroniques sont accompagnées d'anxiété et/ou de dépression qui contribuent à une détérioration de leur qualité de vie602606. En effet, la prévalence des désordres anxieux chez les patients atteints de douleur chronique est de 20% à 40%, alors qu'elle n'est que de 7% à 18% dans la population générale607, 608. De plus, les signes de dépression chez les patients sont estimés à plus de 50%609. Ces patients présentent ainsi deux à PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS trois fois plus de risques de développer une pathologie de cette nature610. Ainsi, une prise en charge inadaptée de la douleur peut avoir un impact négatif sur le développement de l'anxiété. Il est à noter également que des patients présentant des troubles anxieux auront un risque plus élevé de développer des douleurs chroniques611. Les troubles d'anxiété et de dépression sont très fréquents chez les patients douloureux chroniques en condition inflammatoire, telle que l'arthrite612, 613. De plus, les symptômes d'anxiété, associés { l'arthrite, ont été démontrés comme amplificateurs de la perception douloureuse614. Ainsi, un lien réciproque existerait entre douleur inflammatoire chronique et anxiété615, 616. La gestion efficace de la douleur inflammatoire chronique et de ses comorbidités peut nécessiter une combinaison de plusieurs médicaments (anti-inflammatoires non stéroïdiens, antirhumatismaux, antalgiques, anxiolytiques et antidépresseurs) pour atteindre le niveau souhaité de soulagement de la douleur et de réduction des comorbidités associées617619. Néanmoins, la polythérapie comporte le risque d'interactions médicamenteuses et d'effets indésirables618, 620, 621 pouvant diminuer le bénéfice espéré de la gestion de la douleur arthritique613. Ainsi, un réel besoin d'innovation thérapeutique est nécessaire pour limiter ces polythérapies et leurs effets indésirables. De par leur implication dans la douleur inflammatoire, les canaux Cav3. 2 semblent pouvoir être une cible d'intérêt et leur modulation une thérapeutique potentielle. Cependant il est au préalable indispensable d'évaluer l'impact de l'inhibition des canaux Cav3. 2 et plus largement des canaux de type T sur les comorbidités (anxiété et dépression) associées aux douleurs inflammatoires. 2. Objectifs L'objectif principal de cette étude fut de déterminer l'efficacité de l'inhibition des canaux de type T sur l'anxiété et la dépression développées dans le cas d'une douleur inflammatoire chronique. Aucune étude ne s'étant intéressée à l'impact de l'invalidation du gène codant le canal Cav3. 2 sur l'anxiété et la dépression en condition saine, nous avons tout d'abord phénotypé les souris KO Cav3. 2 vis-à-vis de ces deux aspects cognitifs. Nous avons également couplé à cela une évaluation pharmacologique de l'inhibition des canaux Cav3. 2, par le TTA-A2, et plus largement des canaux de type T, par l'éthosuximide, sur les phénomènes d'anxiété et de dépression. Cette première partie d'étude aura pour but d'évaluer l'impact de l'inhibition des canaux Cav3. 2 et de type T sur l'état émotionnel des souris en condition non douloureuse. PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS La douleur chronique produit des désordres émotionnels chez les patients et les animaux. Nous avons donc évalué l'effet de l'éthosuximide sur la douleur et les comorbidités associées aux pathologies inflammatoires. Pour cela, le modèle d'inflammation chronique par injection péri- articulaire de CFA dans la patte de l'animal a été choisi pour mimer une pathologie humaine : l'arthrite. L'arthrite est bien connue comme source d'anxiété et de dépression chez les patients atteints612, 622, 623. Cette étude permettra tout d'abord de rechercher chez l'animal des manifestations comportementales dans des tests considérés comme traduisant des états d'anxiété (open field, eleveted plus maze, novelty suppress feeding), ou de dépression (suspension par la queue, nage forcée, novelty suppress feeding). Ensuite, les effets antalgique, anxiolytique et antidépresseur potentiel de l'éthosuximide et du TTA-A2 ont été étudié. La finalité de cette étude nous orientera sur l'intérêt potentiel d'utiliser l'éthosuximide en clinique pour le traitement des douleurs chroniques inflammatoires et leurs comorbidités associées. D. PROJET CLINIQUE : ETUDE PILOTE EDONOT : EVALUATION DE L'EFFET DE L'ETHOSUXIMIDE CHEZ DES PATIENTS NEUROPATHIQUES D'ORIGINE TRAUMATIQUE 1. Problématique Actuellement deux antiépileptiques, la gabapentine (Neurontin) et la prégabaline (Lyrica) sont prioritairement prescrits en tant qu'antalgiques dans le traitement des douleurs neuropathiques. Ces composés possèdent le même mode d'action qui est l'inhibition de la sous- unité 2 des canaux calciques HVA624627. Malheureusement, ces composés ont un effet antalgique globalement limité et peuvent induire des effets indésirables628630. L'éthosuximide, autre antiépileptique, bloqueur des canaux de type T pourrait, comme évoqué plus haut, présenter un effet thérapeutique ou un ratio bénéfice / risque supérieur aux antiépileptiques utilisés habituellement pour le traitement des douleurs neuropathiques. Cette hypothèse repose sur plusieurs arguments : PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS - De nombreuses études précliniques ont démontré un effet anti-allodynique et anti-hyperalgique de l'éthosuximide dans divers modèles animaux de neuropathies douloureuses (traumatiques, métaboliques et chimio-induites)556559, 591. - L'éthosuximide est un vieux médicament (AMM en 1960) d'utilisation principalement pédiatrique et surtout ne possédant que peu d'effets indésirables notoires. - Son prix d'achat reste très faible, seulement 7, 50 euros pour un flacon de 200 ml (sirop). Ceci pourrait avoir l'avantage supplémentaire de réduire les dépenses du patient et de la sécurité sociale pour le traitement des douleurs neuropathiques. Ainsi, les résultats précliniques sont suffisants comme preuve de concept. Dans une démarche de recherche translationnelle, nos résultats : 1) Implication des canaux de type T Cav3. 2 dans l'effet antalgique du paracétamol ; 2) Implication des canaux de type T Cav3. 2 dans les douleurs chroniques neuropathiques581, 582, 584 et inflammatoires (voir Projet 2) ; et l'existence sur le marché d'un inhibiteur des canaux calciques de type T, nous a conduit à décider de réaliser une étude clinique pilote multicentrique nommée EDONOT (Ethosuximide et DOuleur Neuropathique d'Origine Traumatique) évaluant les effets de l'éthosuximide dans le traitement des douleurs neuropathiques d'origine traumatique. 2. Objectifs L'objectif principal sera d'évaluer l'efficacité antalgique de l'éthosuximide chez des patients douloureux neuropathiques d'origine traumatique. L'objectif secondaire sera d'évaluer l'impact de l'éthosuximide sur la qualité de vie et l'impression globale des patients vis-à-vis du traitement. Cette étude sera un essai thérapeutique pilote multicentrique. Les patients seront traités pendant 42 jours soit par l'éthosuximide soit par un sirop homéopathique inactif sur la douleur. Six centres investigateurs dont un centre coordonnateur participeront. Les critères d'évaluations seront les suivants : 1) le critère principal sera la différence () entre la moyenne de l'intensité douloureuse médiane évaluée quotidiennement par une échelle numérique simple (ENS) lors des 7 derniers jours précédant le début de l'étude (J0) et la visite de fin d'étude (J 42) : score ENS (J0) score ENS (J 42) ; 2) les critères secondaires seront : - Evaluation quotidienne de la douleur moyenne et maximale ressentie (ENS), - Evaluation de la douleur neuropathique par les questionnaires : Questionnaire d'Evaluation de la Douleur Neuropathique (QEDN) et Questionnaire Concis sur la Douleur (QCD), PROJETS SCIENTIFIQUES : PROBLEMATIQUES ET OBJECTIFS - Evaluation de la qualité de vie des patients par le questionnaire Medical Outcome Study Short Form 12 (MOS-SF12), - Evaluation de la qualité de sommeil par le questionnaire de Leeds, - Evaluation quotidienne de la qualité du sommeil et d'endormissement par ENS, - Evaluation de l'impression globale des patients sur le traitement par le questionnaire Patient's Global Impression of Change (PGIC). Le nombre de sujets nécessaire sera de 200 patients avec une puissance de 80% ( 0, 05 bilatérale ; 0, 20, 1, 0 ; 2, 5) et considérant les sorties d'étude { hauteur d'environ 10%, nous prévoyons de présélectionner 220 patients, soit 110 patients par groupe. L'étude se déroulera comme suit : - Recrutement : Les patients suivis dans leur centre référent pour le traitement de la douleur sont sélectionnés par les médecins du centre. Le médecin investigateur les contactera afin de leur présenter le but de l'étude et prendre rendez-vous pour l'inclusion. - Visite d'inclusion (J-6) : Remplissage des divers questionnaires et formulaires. - Début d'étude (J0) : Sept jours plus tard (J0), appel du patient pour quantifier l'intensité moyenne de sa douleur ressentie au cours des 7 derniers jours { l'aide d'une ENS depuis la visite d'inclusion (J-6). Suite à cela, le patient est inclus ou non puis randomisé. - Période de J0 à J 42 : Ambulatoire à domicile, la prise du traitement (2 prises journalières pendant les repas) sera faite selon une posologie croissante, le patient devra effectuer un remplissage quotidien du carnet de suivi (douleur, endormissement/sommeil et évènements indésirables) et des appels téléphoniques seront effectués tous les 4 jours par l'attaché de recherche clinique rattaché au projet pour le recueil des évènements indésirables et le rappel de la posologie. - Visite de suivi { J 42 et fin d'étude : Remplissage des divers questionnaires et formulaires et prise de sang pour un dosage plasmatique d'éthosuximide. RESULTATS ARTICLE 1 : Cav3. 2 calcium channels : the key protagonist of the supraspinal effect of acetaminophen (en révision) ARTICLE 1 VI. ARTICLE 1 : Cav3. 2 calcium channels : the key protagonist of the supraspinal effect of acetaminophen CANAUX CALCIQUES CAV3. 2 : L'ACTEUR CLE DE L'EFFET SURPASPINAL DU PARACETAMOL. N. Kerckhovea, b, C. Malleta, b, A. Françoisd, e, f, g, M. Boudesh, J. Chemind, e, f, g, T. Voetsh, E. Bourinetd, e, f, g, A. Allouia, b, A. Eschaliera, b, c Affiliations des auteurs : (a) Clermont Université, Laboratoire de Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la Douleur, Clermont- Ferrand, France, (b) Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 1107 NEURO-DOL, Clermont-Ferrand, France (c) Centre Hospitalier Universitaire Gabriel Montpied, Clermont-Ferrand, France, (d) Laboratories of Excellence, Ion Channel Science and Therapeutics, Institut de Génomique Fonctionnelle, 141 rue de la Cardonille, 34094 Montpellier, France, (e) CNRS UMR5203, Montpellier, France, (f) INSERM, U661, Montpellier, France, (g) IFR3 Universités Montpellier I&II, Montpellier, France, (h) Laboratory of Ion Channel Research, Department of Cellular and Molecular Medicine, KU Leuven, Leuven, Belgium. Correspondant : Alain Eschalier, alain. eschalier@udamail. fr, 33 (0)4 73 17 82 30, fax : 33 (0)4 73 27 71 62 A. RESUME Pour exercer son action antalgique, le paracétamol nécessite une métabolisation complexe pour produire un composé apparenté aux lipoaminoacides, spécifiquement au niveau cérébral, l'AM404, qui cible les récepteurs supraspinaux TRPV1. Les lipoaminoacides sont connus pour induire une antalgie par inhibition des canaux de type T (Cav3. 2). Dans cette étude, nous montrons que l'effet antinociceptif du paracétamol est perdu chez la souris lorsque les canaux Cav3. 2 supraspinaux sont inhibés. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse d'une relation supraspinale entre les canaux Cav3. 2 et les récepteurs TRPV1 supraspinaux, via l'AM404, pour induire l'effet antalgique du paracétamol. L'AM404 est capable d'activer le TRPV1 et d'inhiber faiblement le Cav3. 2. Fait intéressant, l'activation du TRPV1 induit une forte inhibition du courant Cav3. 2. Appuyant cela, l'administration intracérébroventriculaire d'AM404 ou de capsaïcine produit une antinociception qui ne se retrouve pas chez les souris KO Cav3. 2. Notre étude, pour la première fois, (1) fournit un mécanisme moléculaire de l'effet antinociceptif supraspinal du paracétamol, (2) identifie la relation entre TRPV1 et Cav3. 2 et (3) révèle l'inhibition supraspinal de Cav3. 2 comme une stratégie pharmacologique potentielle pour soulager la douleur. ARTICLE 1 B. INTRODUCTION Le paracétamol (acétyl-para-aminophénol ; AcAP) est l'antalgique et l'agent antipyrétique le plus largement utilisé à travers le monde. Néanmoins, son mécanisme antalgique reste insaisissable et son métabolisme est très complexe. Les études concernant les métabolites de l'AcAP se focalisent essentiellement sur leurs actions toxiques, notamment par les composés hépatotoxiques comme le p-benzoquinone (p-BQ) et le N-acétyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI). Récemment, nous avons proposé qu'une nouvelle voie métabolique, précédemment décrite par Hgesttt et coll. 30, serait impliquée dans son action antalgique. L'AcAP est métabolisé en p- aminophénol, qui est lui-même métabolisé dans le cerveau par l'enzyme FAAH (Fatty Acid Amide Hydrolase) en N-(4-hydroxy)-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenamide (AM404), qui est capable d'induire un effet antalgique chez l'animal100. Fait intéressant, ce métabolite actif est structurellement lié aux lipoaminoacides, une nouvelle classe de médiateurs lipidiques impliqués dans la modulation de la douleur206, 215. Les membres de la famille des lipoaminoacides, comme l'anandamide (N-arachidonoyl- éthanolamide) et le 2-AG (2-arachidonyl-glycérol), interagissent avec plusieurs cibles, y compris les récepteurs aux cannabinoïdes204, 313 et le récepteur TRPV1141, 206, 312, deux principaux acteurs impliqués dans la modulation de la douleur et dans l'action antalgique de l'AcAP100, 131. Mais curieusement, ces lipoaminoacides sont également capables d'inhiber fortement les canaux calciques de type T, en particulier le membre Cav3. 2, effet expliquant leur propriété antalgique467. Les canaux calciques de type T ont la caractéristique exclusive d'être activés par de faible dépolarisation, proche du potentiel de membrane au repos, leur conférant un rôle dans la modulation de l'excitabilité cellulaire526. Dans le système nerveux central, les canaux calciques de type T participent à l'épilepsie631, 632, aux décharges de potentiel d'action526, aux ondes lentes des phases du sommeil633 et à la perception douloureuse580, 581, 634. Trois canaux calciques de type T, Cav3. 1, Cav3. 2 et Cav3. 3, ont été décrits526. Parmi eux, les canaux Cav3. 2 sont exprimés dans les neurones de petits et moyens diamètres des ganglions de la racine dorsale (DRG), dans les couches superficielles de la corne dorsale de la moelle épinière et dans plusieurs structures du cerveau635. Chez l'animal sain et neuropathique, nous avons montré que l'inhibition des canaux Cav3. 2, par des antagonistes ou des oligonucléotides antisens, réduit les réactions nociceptives et l'hyperalgésie532, 581. Enfin, les souris knock-out Cav3. 2 affichent une déficience importante dans la ARTICLE 1 perception de la douleur, ceci dans plusieurs tests nociceptifs confirmant le rôle important de ce canal dans la nociception580. Considérant que l'AM404, composé proche des lipoaminoacides, est le métabolite actif de l'AcAP et que les lipoaminoacides sont capables d'inhiber les canaux Cav3. 2 pour moduler la nociception467, nous avons supposé que les canaux Cav3. 2 pourraient être impliqués dans le mécanisme d'action antalgique de l'AcAP. Dans cette étude, nous avons étudié cette implication des canaux Cav3. 2 en utilisant des stratégies génétiques (souris Cav3. 2 knock-out) et pharmacologiques (antagoniste Cav3, TTA-A2) chez des souris soumises à divers tests nociceptifs et conditions pathologiques. De plus, Zygmunt et coll. 141 ont montré que l'AM404 est également un agoniste TRPV1. Nous avons déjà démontré que le TRPV1 exprimé dans le cerveau est un acteur essentiel à l'action antalgique du paracétamol100. La double implication présumée du récepteur TRPV1 supraspinal et des canaux Cav3. 2 dans l'action de l'AcAP nous a amené à étudier l'interaction entre ces deux protagonistes. Cette collaboration potentielle a été étudiée par une approche comportementale en utilisant des souris génétiquement modifiées (souris Cav3. 2 ou TRPV1 knock-out) et par une stratégie pharmacologique (TTA-A2). Nous avons également utilisé des techniques d'électrophysiologie et d'imagerie calcique pour étudier le mécanisme de l'interaction fonctionnelle entre les canaux Cav3. 2 et les récepteurs TRPV1. Nos résultats démontrent, pour la première fois, que le canal Cav3. 2 supraspinal agit avec le récepteur TRPV1 pour soutenir l'action antalgique de l'AcAP et, par conséquent, devient une cible potentielle pour le développement de nouveaux antalgiques. C. RESULTATS 1. Le paracetamol échoue à produire un effet antalgique chez les KO Cav3. 2. Une dose de paracétamol (AcAP, 200 mg/kg, per os) ou de véhicule (solution saline) a été administrée à des souris KO Cav3. 2 (Cav3. 2-/-) et leurs littermates (Cav3. 2 / ). Différents tests nociceptifs mettant en jeu les trois stimuli fondamentaux (thermique, chimique et mécanique), ont été utilisés chez des animaux sains : immersion de la queue à 46C, formol (2, 5%, phase 1 : 0-5 min et phase 2 : 15-40 min) et test de von Frey (filament 1, 4 g). Chez les souris Cav3. 2 / , l'AcAP ARTICLE 1 augmente la latence de retrait de la queue dans le test d'immersion de la queue (véhicule : 7, 69 0, 60 s et AcAP : 16, 04 0, 49 s, p (Figure 24a). En outre, l'AcAP a diminué le nombre de retrait de la patte (PWR) dans le test de von Frey (véhicule : 3, 38 0, 18 PWR et AcAP : 2, 57 0, 20 PWR, p (Figure 24b) et le temps de léchage lors de la première phase (véhicule : 135 11 s et AcAP : 72 12 s, p et la deuxième phase (véhicule : 241 31 s et AcAP : 61 18 s, p du test au formol (Figure 24c). Dans les mêmes tests effectués chez les souris Cav3. 2-/-, l'AcAP n'est pas en mesure de modifier les scores douloureux comme obtenu chez les animaux témoins démontrant que l'action antalgique du paracétamol a été abolie lorsque le canal Cav3. 2 a été supprimé (Figures 24a, b et c). Des résultats similaires ont été obtenus dans le modèle de douleur inflammatoire induite par l'injection péri-articulaire d'adjuvant complet de Freund dans la patte arrière gauche (modèle CFA). En effet, l'hyperalgie thermique (véhicule : 3, 88 0, 23 s et AcAP : 10, 03 0, 75 s, p (Figure 24d) et mécanique (véhicule : 4, 5 0, 19 PWR et AcAP : 2, 13 0, 48 PWR, p (Figure 24e) ont été réduites par l'AcAP chez les animaux Cav3. 2 / , alors qu'il n'a produit aucun effet chez les souris Cav3. 2-/-. Comme montré précédemment580, l'invalidation des canaux Cav3. 2 atténue les réactions comportementales vis-à-vis de stimuli nocifs (ici mécanique et thermique principalement) (Figure 24). De ce fait, l'effet antalgique de l'AcAP pourrait être masqué par le phénotype hypoalgique manifesté par les souris Cav3. 2-/-, ce qui induirait un biais dans nos expériences. Nous avons donc évalué l'efficacité antalgique d'un autre antalgique (morphine, Mor, 2 mg/kg s. c. ). En accord avec la littérature467, 636, la morphine produit un effet antalgique significatif chez les souris Cav3. 2-/- et Cav3. 2 / dans les tests utilisés (immersion de la queue, von Frey et formol) chez des souris saines ou dans le modèle au CFA (immersion de la patte et von Frey) (Figure 24). Tous ces résultats identifient le nouveau rôle des canaux Cav3. 2 dans l'effet antalgique du paracétamol. ARTICLE 1 Figure 24 : Perte de l'effet antalgique du paracétamol chez les souris KO Cav3. 2. L'effet antalgique du paracétamol (AcAP, 200 mg/kg per os) a été évalué par : (a) immersion de la queue, (b, e) von Frey, (c) formol et (d) immersion de la patte chez des KO Cav3. 2 (Cav3. 2-/-) et WT (Cav3. 2 / ). L'immersion de la patte, de la queue et le test de von Frey ont été effectués 45 minutes après l'administration d'AcAP ou de morphine (Mor, 2 mg / kg s. c. ) et 20 minutes avant l'injection de formol. Pour le modèle de douleur inflammatoire, un modèle de monoarthrite a été induit par une injection péri-articulaire de CFA dans la patte arrière. L'immersion de patte et le test de von Frey ont été effectués 7 jours après l'injection CFA et 45 minutes après l'administration des drogues. Les valeurs de base ont été réalisées au jour 0 et le 7ème jour avant les injections des drogues (données non présentées). Le groupe Mor a été utilisé comme groupe témoin positif. Dans tous les tests et conditions, l'AcAP n'induit pas d'effet antalgique chez les souris Cav3. 2-/- . Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM (n 6-8). *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001 ; par rapport aux groupes véhicule. 2. Les canaux Cav3. 2 supraspinaux sont nécessaires { l'effet du paracétamol. Aucun consensus n'est établi concernant le site d'action de l'AcAP. Même si quelques auteurs déclarent un site d'action périphérique98, 108, 109, plusieurs autres équipe et nous même avons mis en relief plusieurs arguments en faveur pour d'un site d'action central96, 97, 100, 103, 131, 637. Dans ce même état d'esprit, nous avons émis l'hypothèse d'une implication des canaux Cav3. 2 supraspinaux dans l'effet antalgique de l'AcAP. Récemment, une nouvelle classe d'antagonistes des canaux calciques de type T (famille des TTAs) a été découverte561 et inclut le TTA-A2, le composé actuel le plus spécifique532. L'impact du TTA-A2, administré par voie i. c. v. , sur l'effet de ARTICLE 1 l'AcAP ou de la morphine, a été évalué pour déterminer l'implication des canaux Cav3. 2 supraspinaux dans leurs effets antalgiques, à la fois chez des souris saines et dans un contexte inflammatoire (modèle CFA). La première observation fut que l'injection de TTA-A2 (12 g, i. c. v. ) induit un effet antinociceptif durant la phase 1 (véhicule : 109 8 s et TTA-A2 : 72 7 s, p < 0, 01) et la phase 2 (véhicule : 193 18 s et TTA-A2 : 93 20 s, p < 0, 01) du test au formol (Figure 25a) et dans le test de von Frey (véhicule : 3, 9 0, 4 PWR et TTA-A2 : 2, 6 0, 2 PWR, p < 0, 01) (Figure 25b), sans induire d'effet sédatif (Figure supplémentaire S1). Ces résultats indiquent, pour la première fois, que l'inhibition supraspinale des canaux Cav3. 2 peut spécifiquement réduire le comportement douloureux en réponse à une stimulation nocive. Ensuite, chez des souris soumises aux tests du formol (Figure 25a) et de von Frey (Figure 25b), la co-administration de TTA- A2 (i. c. v. ) et d'AcAP (per os) ne produit pas d'effet antalgique significativement différent en comparaison de l'effet du TTA-A2 et de l'AcAP seul (Figures 25a et b). A contrario, la co- administration de TTA-A2 ou de morphine (1 mg/kg, s. c. ) produit un effet antalgique significativement plus prononcé que l'effet de ces mêmes drogues injectées seules (Figures 25a et b). Ces résultats montrent que les canaux Cav3. 2 supraspinaux sont impliqués dans l'effet antalgique du paracetamol alors qu'ils ne le sont pas dans celui de la morphine. En parallèle, l'action spécifique du TTA-A2 sur les canaux Cav3. 2 a été testée par l'évaluation de son effet antalgique par voie i. c. v. chez les souris Cav3. 2-/- dans le test au formol. Aucun effet antalgique du TTA-A2 n'a été observé dans la phase 1 (véhicule : 68 9 s et TTA-A2 : 56 14 s) et dans la phase 2 (véhicule : 106 12 s et TTA-A2 : 109 23 s) (Figure supplémentaire S2), confirmant l'action spécifique de ce composé sur les canaux Cav3. 2. Les canaux Cav3. 2 sont également exprimés dans la moelle épinière567 et l'antalgie induite par l'AcAP implique des récepteurs spinaux97, 98, 101, 306. Une potentielle implication des canaux Cav3. 2 spinaux dans l'action de l'AcAP a été étudiée par l'évaluation de son effet antalgique chez des animaux sauvages soumis au test du formol et traités par du TTA-A2 (12 g, i. t. ). Le TTA-A2 induit un effet antalgique dans la phase 1 (véhicule : 106 12 s et TTA-A2 : 65 9 s, p < 0, 001) et la phase 2 (véhicule : 255 19 s et TTA-A2 : 119 29 s, p < 0, 001) du test au formol (Fig. 29c), confirmant que l'inhibition spinal des canaux Cav3. 2 induit une antalgie581. De manière intéressante, la co-administration de TTA-A2 avec l'AcAP (200 mg/kg, p. o. ) induit un effet antalgique significativement plus fort que les deux produits injectés seuls. Le même résultat est obtenu avec la co-administration de morphine (1 mg/kg, s. c. ) et de TTA-A2 (Fig. 27c). Cette expérience a démontré que les canaux Cav3. 2 spinaux n'étaient pas impliqués dans l'effet antalgique de l'AcAP (et de la morphine). ARTICLE 1 Ensemble, ces résultats démontrent que les canaux Cav3. 2 supraspinaux (et non spinaux) sont essentiels { l'effet antalgique de l'AcAP. De plus, ils montrent que l'inhibition spécifique des canaux Cav3. 2 au niveau supraspinal et spinal induit un effet antalgique. Figure 25 : Les canaux Cav3. 2 supraspinaux sont impliqués dans l'effet antalgique du paracétamol. L'implication des canaux Cav3. 2 supraspinaux dans l'effet du paracétamol a été spécifiquement étudié par l'inhibition cérébrale (a, b) et spinale (c) des canaux Cav3. 2. Les injections i. c. v. ou i. t. de TTA-A2 ont été réalisées et leur impact, sur l'effet antalgique du paracétamol, évalué. L'effet de la co-administration de TTA-A2 (5 g / 2 l i. c. v. et 5 g / 5 l i. t. ) et de paracétamol (AcAP ; 200 mg/kg per os) ou de morphine (Mor ; 1 mg / kg s. c. ) a été évalué dans : (a, c) le test du formol et (b) de von Frey. Ces tests ont été effectués respectivement 20 et 45 minutes après les injections des drogues. Le TTA-A2, l'AcAP et la Mor produisent une antalgie dans les deux tests. La co-administration de TTA-A2 AcAP n'affiche pas d'effet antalgique supérieur à l'AcAP seul lors de l'injection i. c. v. de TTA-A2 contrairement { l'injection i. t. La co- administration de TTA-A2 Mor par rapport à la Mor seule provoque un effet antalgique fort que ce soit lors d'une injection i. c. v. et i. t. de TTA-A2. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM (n 6-8). *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, P comparé au groupe véhicule ; , p < 0, 05 ; , p < 0, 01 ; , p < 0, 001 comparé au groupe TTA-A2 Mor. 3. L'AM404, requiert les canaux Cav3. 2 pour induire son effet antalgique Une nouvelle voie métabolique du paracétamol a été récemment découverte30. Après ingestion, le paracétamol est métabolisé en p-aminophénol dans le foie. Ce composé est associé dans le cerveau avec l'acide arachidonique par l'enzyme fatty-acid-amine-hydrolase (FAAH) qui donne naissance { l'AM40430. L'AM404 a été montré comme responsable de l'effet antalgique de l'AcAP131 et appartenant à la famille des endocannabinoïdes, qui inclut l'anandamide, capable d'activer les récepteurs TRPV1459 et d'inhiber les courants Cav3. 2467. Pour démontrer un potentiel lien in vivo entre l'AM404 et les canaux Cav3. 2, l'effet antalgique de l'AM404 (2 g, i. c. v. ) a été évalué chez des souris Cav3. 2-/- and Cav3. 2 / . ARTICLE 1 L'injection d'AM404 induit un effet antalgique chez les souris Cav3. 2 / dans la première phase du test au formol (véhicule : 85 10 s et AM404 : 47 10 s ; p < 0, 01) (Figure 26a) et dans le test de von Frey, 7 jours après l'injection péri-articulaire de CFA (véhicule : 4, 86 0, 14 PWR et AM404 : 2, 75 0, 31 PWR ; p < 0, 01) (Figure 26b). Dans les mêmes tests, aucune action antalgique de l'injection i. c. v. d'AM404 n'a été observée chez les souris Cav3. 2-/- (Figure 26). Figure 26 : Les canaux Cav3. 2 sont inhibés par l'AM404 et sont essentiel { son action antalgique. La relation entre L'AM404 et les canaux Cav3. 2 a été évaluée par une approche in vitro (whole-cell patch clamp) et in vivo (formol et von Frey). Dans les tests de comportements, l'effet antalgique de l'AM404 (2 g / 2 l, i. c. v. ) a été évalué dans (a) la phase 1 du test au formol et (b) dans le test de von Frey chez des animaux Cav3. 2-/- et Cav3. 2 / . Ces tests ont été effectués 10 minutes après l'injection d'AM404. Dans tous les tests, l'AM404 ne produit pas d'antalgie chez les souris Cav3. 2-/- contrairement aux souris Cav3. 2 / . (c) Courbe dose-réponse de l'AM404 sur les courants Cav3. 2 (n 6-8, losanges ouverts). Les courants ont été provoqués par une dépolarisation de -75 mV à -30 mV (durée 200 ms) appliquée toutes les 5 s. L'AM404 est capable d'inhiber partiellement et faiblement les courants Cav3. 2 (EC50 13, 67 M). Le paracétamol (cercle plein) et le p-aminophénol (carré plein) sont presque inactifs dans des conditions similaires (inhibition à 100 M : 8 2% et de 10, 5 2, 5% respectivement pour le paracétamol et le p-aminophénol). Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM (n 6-8). Nous avons, en plus, examiné sur culture de neurones de DRG l'action de l'AM404 sur les courants Cav3. 2 par la méthode du whole-cell patch clamp . Contrairement au paracétamol et au p-aminophénol, qui n'inhibent pas les courants Cav3. 2, l'AM404 inhibe faiblement ces courants avec une forte EC50 13, 67 M (Figure 26c), en comparaison de l'inhibiteur TTA-A2 (EC50 8, 99 nM)532. Ces résultats démontrent une faible action directe de l'AM404 sur les canaux Cav3. 2. 4. Récepteur TRPV1 et canal Cav3. 2 : preuve d'une relation fonctionnelle. Comme précédemment évoqué, l'AM404 est aussi connu comme étant un agoniste TRPV1355. Dans une étude précédente, nous avons démontré que l'AcAP, via l'AM404, activait les récepteurs TRPV1 supraspinaux pour induire son effet antalgique100. Utilisant la technique ARTICLE 1 d'imagerie calcique sur des cellules HEK transfectées avec ou sans le récepteurs TRPV1, nous avons montré que l'AM404 (10 M) induisait une forte entrée de calcium intracellulaire dépendante du TRPV1 (Figure 27a). L'AM404 est aussi efficace que la capsaïcine (0, 5 M) et induit une réponse dans toutes les cellules capsaïcine sensibles. Dans ces conditions, nous avons aussi démontré que le p-aminophénol (10 M) induisait une mobilisation du calcium, bien que moins efficacement que l'AM404 ou la capsaïcine (Figure 27b). Cet effet résulte de l'effet local de la production d'AM404 (transformation du p-aminophénol par les cellules HEK qui expriment constitutivement la FAAH638). En effet, l'effet du p-aminophénol est perdu après un traitement avec un inhibiteur de la FAAH (PMSF, 10 M ; Figure 27b). Comme après une application directe exogène d'AM404, la mobilisation calcique observée dépend du TRPV1, comme démontré par son inhibition si association du p-aminophénol avec l'antagoniste TRPV1 (capsazépine, CAPZ, 20 M ; Figure 27b, Figure supplémentaire SI 3) ou de cellules non transfectées avec le récepteur TRPV1 (Figure 27b). Ces expériences confirment que l'AM404 est capable d'activer le TRPV1 et que, comme suggéré par nos précédents résultats in vivo100, le p-aminophénol a besoin d'être métabolisé par la FAAH (en AM404) pour activer ce récepteur. Le fait que les récepteurs TRPV1 et les canaux Cav3. 2 soient impliqués dans l'action antalgique du paracétamol et de son métabolite actif, l'AM404, nous amène { étudier le potentiel lien fonctionnel entre ces deux protéines. Pour cela, l'effet de l'activation supraspinale des récepteurs TRPV1 est étudié par l'utilisation d'injection de capsaïcine (Cap, 10 g i. c. v. ) chez des souris Cav3. 2-/- et Cav3. 2 / dans le test au formol et de von Frey en condition saine ou inflammatoire (modèle CFA). Nous avons tout d'abord démontré que l'effet antalgique induit par la capsaïcine impliquait spécifiquement le récepteur TRPV1 en montrant l'inhibition totale de cet effet en présence de capsazépine (CAPZ, 10 g i. c. v. ) (Figure supplémentaire S4). De plus, alors que chez des souris Cav3. 2 / une injection supraspinal de capsaïcine induit un effet antalgique dans la première (véhicule : 88 9 s et Cap : 42 13 s, p < 0, 01) et la seconde phase (véhicule : 231 24 s et Cap : 127 30 s, p < 0, 05) du test au formol (Figure 28a) et dans le test de von Frey (véhicule : 4, 86 0, 14 PWR et Cap : 2, 5 0, 46 PWR, p < 0, 01) (Figure 28b), nous avons montré que la capsaïcine n'avait aucun effet antalgique chez les souris Cav3. 2-/- (Figures 28a, b). Inversement, l'effet antalgique de l'injection i. c. v. de TTA-A2 est maintenu chez des souris KO TRPV1 (TRPV1-/-) dans la première (véhicule : 92 11 s et TTA-A2 : 34 7 s, p < 0, 001) et la seconde phase (véhicule : 145 17 s et TTA-A2 : 58 9 s, p < 0, 01) du test au formol (Figure 28c). ARTICLE 1 Figure 27 : L'AM404 et la métabolisation du p-aminophénol dépendante de la FAAH sont des activateurs du TRPV1. (a) Évolution dans le temps de l'élévation du calcium intracellulaire dans les cellules HEK transfectées avec (traces noires, n 18) ou sans le récepteur TRPV1 (traces grises, n 17) montrant que l'application de capsaïcine (0, 5 M) ou d'AM404 (10 M) suscite une élévation de calcium intracellulaire médiée par l'activation du TRPV1. Le PMSF (10 M) a été appliqué dans toutes les expériences afin de bloquer la dégradation de l'AM404 par la FAAH. L'élévation intracellulaire de calcium lors de l'application de 50 M d'ATP { la fin du protocole indique que toutes les cellules (contrôle et TRPV1 transfectées) ont été effectivement chargées avec la sonde sensible au calcium Fura2. (b) L'application du p-aminophénol augmente le rapport Fura2 340/380 dans les cellules HEK293 exprimant le TRPV1, contrairement aux cellules non transfectées, ou en présence de l'antagoniste de la FAAH, le PMSF (10 M). Ces résultats révèlent que l'effet antalgique induit par l'activation supraspinale des récepteurs TRPV1 nécessite les canaux Cav3. 2 et suggèrent que ces deux protagonistes pourraient être impliqués séquentiellement. En effet, la perte de l'effet antalgique de la capsaïcine chez les Cav3. 2-/- et le maintien de celui du TTA-A2 chez les souris TRPV1-/- suggère que les canaux Cav3. 2 seraient localisés en aval des récepteurs TRPV1 et inhibés après l'activation du TRPV1, par exemple par l'AM404. ARTICLE 1 Figure 28 : Relation entre le canal Cav3. 2 et le récepteur TRPV1. L'effet antalgique de la capsaïcine (CAP, 10 g / 2 g, i. c. v. ) a été évalué dans le test (a) au formol (2, 5%) et (b) de von Frey chez des souris Cav3. 2-/- et Cav3. 2 / . L'effet antalgique du TTA-A2 (5 g / 2 M, i. c. v. ) a été évalué dans (c) le test au formol chez des souris TRPV1-/- et leurs littermates sauvages (TRPV1 / ). Ces tests ont été effectués 10 minutes après l'injection de capsaïcine ou de TTA-A2. Dans tous les tests, la capsaïcine n'a pas réussi à produire une antalgie chez les souris Cav3. 2-/- contrairement aux souris Cav3. 2 / . Le TTA-A2 a gardé son effet antalgique chez les souris TRPV1-/-. (d) Représentation des traces de courants Cav3. 2 évoqués par une dépolarisation de -75 mV à 75 mV (200 ms), en conditions de contrôle (trace noire) et pendant le lavage de 1 M de capsaïcine (trace grise) sur cellule HEK exprimant le Cav3. 2 seul. L'évolution du courant maximal entrant évoqué par la rampe de dépolarisation au cours de la durée de l'expérience est tracée sur la partie inférieure. Les points de temps étiquetés comme (1) et (2) correspondent à la courbe contrôle et wash cap respectivement. (e) Même représentation que pour (d) cette fois pour une cellule HEK exprimant le canal Cav3. 2 et le TRPV1. Notez que dans ce cas, le courant Cav3. 2 est presque aboli après stimulation du TRPV1 par la capsaïcine (2). (f) Moyenne de l'inhibition des courants Cav3. 2 après application de capsaïcine 1 M avec co-expression de TRPV1 (histogramme noir) ou non (histogramme blanc). Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM (n 6-8). *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001 par rapport aux groupes véhicules (comportement) ou avec ou sans TRPV1 (électrophysiologie). Par conséquent, in vitro, nous avons utilisé des cellules HEK recombinantes exprimant de façon stable les canaux Cav3. 2 et transfectées avec ou sans les récepteurs TRPV1 pour tester les effets de son activation sur les courants Cav3. 2. Les courants ont été enregistrés à partir d'un potentiel de maintien de -75 mV pour être proche des potentiels de repos normaux des neurones. Ceci permet de maintenir les canaux de type T dans un état partiellement inactivé ce qui les rend ARTICLE 1 préférentiellement sensibles aux modulations pharmacologiques467, 532. En outre, nous avons utilisé un protocole de rampe (-75 à 75 mV) pour visualiser simultanément les relations courant / tension exprimées par les canaux Cav3. 2 et les récepteurs TRPV1 (en cas de co-expression). Dans ces conditions, la capsaïcine a un effet inhibiteur limité et entièrement réversible sur l'activité des canaux Cav3. 2 en l'absence de TRPV1 (Figure 28d). En revanche, lorsque les récepteurs TRPV1 sont co-exprimés, les courants Cav3. 2 sont puissamment inhibés lors de l'application de capsaïcine (Figure 28e). A noter que l'inhibition par la capsaïcine était presque irréversible même après lavage. L'activité basale des récepteurs TRPV1 masque les courants Cav3. 2 lors de l'application de capsaïcine, de ce fait, il n'était pas possible de tracer l'amplitude du courant de type T lors de l'application de la drogue. En revanche, l'activation du récepteur TRPV1 conduit à une relation linéaire courant / tension et à l'augmentation des courants entrants et sortants à -75 et 75 mV (présenté dans la Figure complémentaire S5). Ces expériences montrent que la capsaïcine évoque un courant seulement lorsque le TRPV1 est exprimé. Toutes ces expériences mises en commun ont montré que la capsaïcine était capable d'induire une inhibition des canaux Cav3. 2 via l'activation des récepteurs TRPV1 (Figure 28f). Enfin, chez des cellules HEK exprimant fortement les récepteurs TRPV1, le récepteur TRPV1 possède une activité tonique évidente observée lors des enregistrements. Dans ces cellules, l'activité des canaux Cav3. 2 était indétectable suggérant leur inhibition tonique par l'activité basale des récepteurs TRPV1 dans l'incubateur de culture cellulaire. D. MATERIELS ET METHODES 1. Animaux Des souris knock-out Cav3. 2 (Cav3. 2-/-, 20-25 g, mâle) et TRPV1 (TRPV1-/-, 20-25 g, mâle), à l'origine générées respectivement par Chen CC et coll. 639 et Caterina et coll. 428, et leurs littermates sauvages (Cav3. 2 / , TRPV1 / , 20-25 g, mâle) ont été utilisées. Toutes les expériences ont été effectuées avec l'approbation du Comité d'éthique pour l'expérimentation animale (CEMEA Auvergne ; nr : CE 53-12, CE 112-12, CE 24 à 11, CE 13 10) et par le Comité d'éthique du IASP. Les animaux ont été logés dans des conditions environnementales contrôlées (21-22C, 55% d'humidité) et maintenus sous un cycle lumière / obscurité 12 / 12 h. La nourriture et l'eau étaient disponibles ad libitum. Les animaux ont été euthanasiés au CO2. ARTICLE 1 2. Etudes comportementales Les animaux ont été habitués aux tests et / ou { l'enceinte du test avant l'expérimentation. L'expérimentation et l'administration des drogues ont été effectuées en aveugle du génotype des souris et des traitements. L'administration des drogues a été réalisée par une autre personne que l'expérimentateur. a. Immersion de la patte et de la queue Les souris ont été habituées à la manipulation pendant trois jours, une semaine avant le test. La queue ou la patte de la souris est immergée dans de l'eau chaude (46C). La latence de réponse à la stimulation thermique, traduite par une flexion vigoureuse de la queue ou de la patte, a été mesurée trois fois et moyennée. Le cut-off est de 30 secondes, après quoi le membre immergé a été retiré du bain indépendamment de la réponse. b. Test au formol Les souris ont été acclimatées à la chambre en plexiglas (30 cm x 30 cm x 30 cm) pendant au moins 30 minutes avant le test. Le formol (20 l, 2, 5% de formol dans une solution saline) a été injecté par voie intraplantaire au niveau la patte arrière. Le comportement de douleur spontanée (léchage) a été enregistré au cours des deux phases nociceptives typiques : de 0 à 5 min (phase 1) et de 15 à 40 min (phase 2) après injection de formol comme précédemment décrit100. Pour les expériences avec l'AM404, seule la phase 1 a été étudiée en raison de la dégradation rapide de l'AM404100. c. Test de von Frey Les souris ont été placées dans des compartiments individuels sur le dessus d'une surface grillagée et ensuite laissées en acclimatation pendant une heure avant le test. Les seuils de douleur ont été évalués par le filament von Frey calibré à 1, 4 g (Bioseb, France). Ce dernier a été pressé perpendiculairement cinq fois contre le milieu patte et maintenu pendant 3 secondes. Une réponse douloureuse a été notée seulement quand la patte est retirée ou léchée et un score de réponse à la douleur (0-5) est déterminé. d. Induction du modèle de monoarthrite Cinq microlitres d'adjuvant complet de Freund (CFA, Difco Laboratories, Detroit, Etats-Unis)640 ont été injectés au niveau des deux côtés de l'articulation de la cheville gauche de la souris sous anesthésie brève (halothane/N2O/O2). Les seuils de retrait de patte suite à une stimulation thermique et mécanique ont été déterminés avant et 7 jours après l'injection de CFA ou de véhicule. 3. Électrophysiologie a. Culture cellulaire et enregistrements électrophysiologiques Les DRG ont été disséqués à partir de souris C57BL/6J mâles adultes et une suspension cellulaire a été obtenue suite à une dissociation enzymatique et mécanique. Les enregistrements en whole-cell patch- clamp ont été réalisés 3-28 h de culture sur des neurones de taille moyenne avec un phénotype rosette précédemment décrit532. Pour l'enregistrement des courants calciques, une solution extracellulaire contenant (en mM) : 2 CaCl2, 100 TEACL, 2 NaCl, 1 MgCl2, 40 choline Cl, 5 glucose, 5 4AP (pH à 7, 4 avec ARTICLE 1 TEAOH ~ 330 mOsM). Les pipettes avec une résistance de 1-1, 5 Mohm ont été remplies avec une solution interne contenant (en mM) : 110 CsCl, 3 MgCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 3 Mg-ATP, GTP 0, 6 (pH à 7, 4 avec CsOH, ~ 300 mOsM). Tous les enregistrements ont été filtrés à 5 kHz en utilisant un amplificateur 200B Axopatch (Axon Instrument). Les données ont été enregistrées à l'aide du logiciel pClamp10 (Instrument Axon) et analysées par le logiciel Prism Graphpad. Les cellules HEK exprimant de façon stable la séquence Cav3. 2 humaine ont été utilisées comme précédemment descrit532 et ont été transfectées avec des plasmides d'expression de la GFP seul ou avec un mélange de GFP-TRPV1 en utilisant JetPEI. b. Imagerie calcique Les cellules humaines embryonnaires de rein, HEK293T, ont été cultivées dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% (v/v) de sérum humain, 2 mM de L-glutamine, 2 unités/ml de pénicilline et 2 mg/ml de streptomycine à 37C avec une humidité contrôlée dans un incubateur avec 10% de CO2. Les HEK293T ont été transfectées de façon transitoire avec le TRPV1 humain en utilisant le vecteur Mirus 293 (Mirus Corporation, Madison, WI, USA). Afin de déterminer si les cellules ont été transfectées, la capsaïcine (1 M) a été utilisée à la fin de chaque expérience. Les cellules qui ne répondent pas à la capsaïcine, ont été utilisés comme témoins. Les cellules ont été chargées avec 2 M Fura-2 acetoxymethyl ester pendant 30 minutes à 37C. La concentration intracellulaire de calcium a été contrôlée par le rapport des signaux de fluorescence mesurés lors de l'éclairage alternatif à 340 et 380 nm, en utilisant un système MT-10 d'illumination et le logiciel Cell^M (Olympus). La solution de bain contient (en mm) 145 NaCl, KCl 5, 2 CaCl2, 1, 5 MgCl2, 10 HEPES, 10 D- glucose, pH 7, 4 tamponnée avec du NaOH. Comme les cellules HEK expriment la FAAH494, une enzyme qui dégrade l'AM404, les expériences de la figure 29a ont été effectuées en présence d'un inhibiteur de la FAAH (PMSF, 10 M). 4. Analyses statistiques Les données sont exprimées en moyenne SEM et analysées en utilisant le logiciel SigmaStats 3. 5. Les données ont été testées pour la normalité et l'égalité des variances. Les mesures ont été comparées par le test ANOVA à deux voies ou par le test de Kruskal-Wallis ou Friedman dans le cas des données qui ne suivent pas la loi normale. Les comparaisons post hoc ont été réalisées par la méthode de Bonferroni. Les valeurs de p sont considérées comme statistiquement significatives. ARTICLE 1 E. INFORMATIONS SUPPLEMENTAIRES Figure S1 : L'antalgie induite par l'injection supraspinale de TTA-A2 passe spécifiquement par les canaux Cav3. 2. Pour vérifier la spécificité du TTA-A2 pour les canaux Cav3. 2, le test au formol a été réalisé sur des souris Cav3. 2-/- avec ou sans injection de TTA-A2 (5 g / 2 l, i. c. v. , T15min). Conformément à nos résultats précédents532, le TTA-A2 n'induit pas d'action antalgique chez les souris Cav3. 2-/-. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM (n 6-8). Figure S2 : L'inhibition pharmacologique (TTA-A2) ou génétique (Cav3. 2-/-) des canaux Cav3. 2 n'induit pas d'effet sédatif. Pour vérifier le potentiel effet sédatif de l'administration i. c. v. de TTA-A2 et de l'invalidation des canaux Cav3. 2, un test d'actimétrie a été utilisé (a) chez des souris recevant du TTA-A2 (5 g / 2 l, i. c. v. , T15min) et (b) chez des souris Cav3. 2-/-. Dans les deux cas, l'inhibition des canaux Cav3. 2 n'induit pas d'effet sédatif. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM (n 6-8). ARTICLE 1 Figure S3 : L'influx intracellulaire de calcium induit par le p-aminophénol dépend du TRPV1. Pour vérifier l'action spécifique des métabolites du p-aminophénol sur les récepteurs TRPV1, l'imagerie calcique en cellules HEK293 exprimant le TRPV1 a été faite en présence de p-aminophénol (10 M) et de capsazépine (20 M). L'activation des TRPV1 par les métabolites du p-aminophénol (voir figure 29b) est abolie en présence de capsazépine. Figure S4 : L'antalgie induit par l'injection supraspinale de capsaïcine est dépendante du TRPV1. Pour vérifier la spécificité de la capsaïcine vis à vis des TRPV1 supraspinaux, le test au formol a été réalisé chez des souris recevant la capsaïcine (30 g / 2 l, i. c. v. , 10min avant injection de formol) avec ou sans capsazépine (3 g / 2 l, i. c. v. ). Le blocage spécifique de TRPV1 par la capsazépine inhibe l'antalgie induite par la capsaïcine. Les données sont présentées sous forme de moyenne SEM (n 6-8). *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 001 comparé au groupe véhicule. ARTICLE 1 Figure S5 : Les courants TRPV1 évoqués par la capsaïcine sont uniquement présents dans les cellules transfectées avec le TRPV1. (a) Traces de courants évoqués représentatifs (200 ms, rampes de dépolarisation de-75 mV à 75 mV) dans des conditions contrôles (trace contrôle) et lors de l'application de 1 M de capsaïcine (trace Cap. ) et le wash de 1 M de capsaïcine (Wash Cap. trace) sur une cellule HEK exprimant le Cav3. 2 seul (même cellule que dans la figure 30d). (b) une représentation identique avec une cellule HEK exprimant le Cav3. 2 et le TRPV1 (même cellule que dans la figure 30e). Notez que la capsaïcine évoque des courants entrants lors de potentiels en dessous de zéro mV et de grands courants sortants à des potentiels positifs. ARTICLE 1 F. RESULTATS COMPLEMENTAIRES NON PUBLIÉS Figure 29 : L'activation des canaux Cav3. 2 supraspinaux par le NaSH induit une hyperalgie. L'effet, sur la perception douloureuse, de l'activation des canaux Cav3. 2 supraspinaux a été évalué par le test du formol (phase 1 { cause de la dégradation rapide du NaSH) chez des souris Cav3. 2 / et Cav3. 2-/-. L'activation des canaux Cav3. 2 est permise grâce à l'injection i. c. v. de NaSH (3 nmol / 2 l, donneur de H2S). L'injection de NaSH est effectuée 10 min avant le test. Les données sont présentées en moyenne SEM (n 6-8). *, p < 0, 01 ; par rapport aux groupes véhicules. Figure 30 : L'effet antalgique du p-aminophénol est perdu chez les souris KO Cav3. 2. L'effet antalgique du p- aminophénol est évalué dans le test (A) au formol (2. 5%), (B) de von Frey (filament de 1. 4g) et (C) d'immersion de la queue (46C). Le p-aminophénol est administré à la dose de 30 mg/kg i. p. et les tests sont effectués 20 (A) et 45 min (B, C) après injection. Les données sont présentées en moyenne SEM (n 6-8). *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; par rapport aux groupes véhicules. ARTICLE 1 Figure 31 : L'antalgie induite par l'activation des récepteurs CB1 nécessite les canaux Cav3. 2. L'effet antalgique de l'activation des CB1, par l'administration d'ACEA (5 mg/kg, i. p. ), a été évalué dans les tests (A) de von Frey (filament de 1, 4g) et (B) d'immersion de la queue (46C) chez des souris Cav3. 2 / et Cav3. 2-/-. Les données sont présentées en moyenne SEM (n 6-8). *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; par rapport aux groupes véhicules. Figure 32 : L'antalgie induite par le TTA-A2 implique les voies sérotoninergiques. L'impact de la déplétion en sérotonine de l'organisme sur l'effet antalgique du TTA-A2 (5 g / 2 l, i. c. v. , 10min avant injection de formol) a été évalué dans le test au formol (2, 5%) chez des souris WT. La déplétion en sérotonine est permise par l'injection journalière durant 4 jours de parachlorophénylalanine (100 mg/kg i. p. , PCPA). Les données sont présentées en moyenne SEM (n 6-8). *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001. ARTICLE 1 Figure 33 : L'effet antalgique de la dipyrone est conservé chez les animaux KO Cav3. 2. L'étude de l'effet antalgique de la dipyrone (50 mg/kg i. p. ) chez les souris Cav3. 2-/- a été évalué par le test au formol (2, 5%). L'injection de dipyrone est effectuée 20 min avant le test. Les données sont présentées en moyenne SEM (n 6-8). *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001 par rapport aux groupes véhicules. G. DISCUSSION / PERSPECTIVES 1. Cav3. 2 supraspinaux et perception douloureuse Le TTA-A2, administré seul, par voie supraspinale ou spinale, induit un effet antalgique (Figure 25), sans affecter la locomotion (Figure S1). Ces résultats, en accord avec l'antalgie observée chez les souris Cav3. 2-/-580 et suite { l'injection intrathécale d'antisens Cav3. 2581, ont confirmé l'implication des canaux Cav3. 2 dans la nociception au niveau de ces deux sites. Ces résultats sont { mettre en miroir avec ceux que nous avons également obtenu lors d'une activation supraspinale des canaux Cav3. 2 par l'injection i. c. v. de NaSH (Figure 29). Le NaSH est un donneur de H2S, composé considéré dans de nombreux travaux comme activateur des canaux Cav3. 2 par un mécanisme d'oxydo-réduction641. En totale concordance avec les résultats précédents587591, la modulation positive des canaux Cav3. 2 supraspinaux par le NaSH induit un effet hyperalgique chez l'animal dans le test au formol. Ce dernier résultat reste à être complété et vérifié, du fait de la faible spécificité du H2S vis-à-vis du canal Cav3. 2642644, mais il semble ARTICLE 1 corroborer le fait d'une implication des canaux Cav3. 2 supraspinaux dans la modulation de la perception douloureuse. Ces résultats apportent la confirmation du rôle des canaux Cav3. 2 dans la nociception et démontrent pour la première fois une implication des canaux Cav3. 2 supraspinaux dans la modulation de la perception douloureuse. Ces données nouvelles posent de nouvelles questions qui restent à élucider. Les canaux Cav3. 2 sont exprimés tout au long du système nerveux périphérique et central635. Pour mieux cerner l'implication des canaux Cav3. 2 dans la nociception, selon leur localisation, il serait intéressant d'évaluer l'invalidation génétique du gène CACNA1H codant pour le canal Cav3. 2 spécifiquement au niveau des nocicepteurs (périphérie), de la moelle épinière (spinal) et du cerveau (supraspinal) dans la nociception. Pour cela plusieurs stratégies existent : 1) L'administration d'antagonistes spécifiques Cav3. 2 dans ces différents compartiments. Nous avons déj{ démontré que l'inhibition des canaux Cav3. 2 au niveau supraspinal (TTA-A2) et spinal (TTA-A2 et antisens581) induisait une antalgie. Leur participation périphérique reste à être évaluée, l'injection de TTA-A2 par voie intraplantaire serait une bonne stratégie pour étudier l'impact de l'inhibition périphérique des canaux Cav3. 2 sur la douleur. 2) Différents antagonistes des canaux de type T tels que l'éthosuximide591, 594, le mibefradil587, 588 et le NNC590 ont été utilisés pour étudier le rôle de ces canaux, mais aucun d'entre eux n'est très spécifiques. Récemment, une nouvelle classe de molécules a été conçue, appelée TTA, qui présente une spécificité majeure pour les canaux de type T645, 646 et le TTA-A2 est présenté comme l'antagoniste le plus spécifique du canal Cav3. 2. Nous avons déjà démontré que son effet sur les canaux Cav3. 2 est supérieure à celui sur Cav3. 1 et Cav3. 3 (EC50 Cav3. 1 : 100 nM ; Cav3. 2 : 9 nM ; Cav3. 3 : 30 nM)532 et que son effet antalgique (après administration systémique) été perdu chez les souris Cav3. 2-/-532. Pour pallier ce biais, l'utilisation de souris knock-out conditionnel semble toute désignée. Ces souris ont l'avantage d'être invalidées pour le canal Cav3. 2 de manière tissu ou type cellulaire spécifique grâce au système Cre-Lox (Figure 34). Dans ce système, le gène Cav3. 2 est floxé , c'est-à-dire qu'il possède deux sites Lox l'entourant. Ces sites Lox sont des sites de restriction pour l'enzyme Cre-recombinase, qui, en cas de présence dans le tissu pourra éliminer le gène cible. Ainsi, l'invalidation génétique spécifique est dépendante de la présence de la Cre-recombinase dans le tissu ou le type cellulaire voulu. Pour sélectionner le tissu ou le type ARTICLE 1 cellulaire souhaité (par exemple les nocicepteurs), le gène codant la Cre-recombinase est mis sous l'influence d'un promoteur activé spécifiquement dans le tissu ou le type cellulaire ciblé (ici Nav1. 8 pour les nocicepteurs). La génération des souris KO conditionnel dans les nocicepteurs se fait par croisement entre les souris Nav1. 8-Cre et les souris Cav3. 2-Lox. Ainsi, ces souris exprimeront la Cre-recombinase dans les nocicepteurs ce qui invalidera le gène du canal Cav3. 2 floxé . L'équipe du Dr. Bourinet possèdent cette souris KO conditionnel dans les nocicepteurs et sont actuellement en train d'étudier son impact sur la nociception. 3) Une dernière stratégie utilisable cette fois pour la partie supraspinale, qui est identique au système Cre-Lox, serait d'utiliser des virus exprimant la Cre-recombinase et de les injecter spécifiquement dans des zones du cerveau de souris Cav3. 2-Lox afin d'invalider spécifiquement le canal Cav3. 2 dans ces zones. Cette stratégie permettrait d'évaluer le rôle des canaux Cav3. 2, exprimés dans diverses zones supraspinales, dans la nociception. Figure 34 : Représentation simplifiée de la génération de souris knock-out conditionnel (système Cre-Lox). ARTICLE 1 2. Cav3. 2 et paracétamol La perte de l'effet du paracétamol, ainsi que celui du p-aminophénol (Figure 30), chez les souris Cav3. 2-/-, tout en étant efficace chez leurs congénères sauvages quelles que soient les conditions expérimentales, suggère que les canaux Cav3. 2 sont nécessaires à l'action antalgique du paracétamol non seulement dans la nociception aigu mais aussi dans une situation inflammatoire. Cette participation pourrait être remise en question en raison de la diminution de la réponse comportementale des souris Cav3. 2-/- vis à vis des stimuli nocifs, cependant, nous avons démontré à l'aide de la morphine, voire de la dipyrone, qu'une antalgie supplémentaire pouvait se produire chez ces souris. Ainsi, la perte de l'effet du paracétamol peut clairement être liée à la suppression du canal Cav3. 2. De plus, les effets antalgiques du paracétamol et de la morphine peuvent être clairement distingués. Toutefois, ces résultats ne sont pas informatifs sur la localisation, dans le système nerveux central, des voies impliquées dans l'effet du paracétamol. Le site d'action du paracétamol est encore un sujet de débat. Certains auteurs ont montré un site d'action périphérique98, 108, 109 tandis qu'une action centrale a été démontrée par d'autres96, 97, 100, 103, 131, 637. Nous avons déjà démontré que des récepteurs de la moelle épinière (5- HT)131 et du cerveau (CB1, TRPV1)100, 131 étaient impliqués dans l'action du paracétamol chez l'animal et éventuellement chez des volontaires sains96, 97. Les canaux Cav3. 2 sont situés tout au long du système nerveux, notamment au niveau des couches superficielles de la moelle épinière (couches II-III, résultats non publiés, François et coll. )494, 635 et dans différents noyaux du cerveau : l'hypothalamus, le thalamus, l'amygdale, l'hippocampe, le mésencéphale et le cortex635. L'utilisation du TTA-A2 par injections i. c. v. chez des souris Cav3. 2-/- nous a confirmé cette notion. Sur la base de ces données, la perte de l'effet du paracétamol administré par voie orale après l'injection i. c. v. de TTA-A2 démontre une implication des canaux Cav3. 2 supraspinaux, contrairement à ceux de la moelle épinière, comme le montre l'absence d'effet inhibiteur du TTA- A2 sur l'antalgie induite par le paracétamol. Cette démonstration d'un site supraspinal d'action du paracétamol est en accord avec notre précédent travail montrant l'implication des récepteurs supraspinaux TRPV1100 dans l'antalgie induite par le paracétamol. Il est également en accord avec les résultats obtenus chez des volontaires sains montrant une activation des voies inhibitrices bulbospinales par le paracétamol97. Ces résultats confirment une fois de plus que le paracétamol peut être considéré comme un médicament antalgique à action centrale. En effet, il semble capable d'agir sur des cibles supraspinales, comme les canaux Cav3. 2 et les récepteurs TRPV1, pour, in fine, activer les voies bulbospinales inhibitrices, tandis qu'au niveau spinal d'autres ARTICLE 1 acteurs pourraient être impliqués tels que les récepteurs 5-HT98, 99, 103, 136, 304, 306 ou, comme montré plus récemment, les récepteurs TRPA1 et adénosine A198, 101. En conclusion, nous venons de démontré l'implication purement centrale d'un nouvel acteur dans l'effet antalgique du paracétamol. Ceci confirme, une fois de plus, le paracétamol comme un antalgique central. Afin de mieux comprendre l'interaction entre le paracétamol et les canaux Cav3. 2, il serait intéressant de visualiser le ou les lieux de cette interaction. Pour cela il faudrait étudier l'expression supraspinale des canaux Cav3. 2. Faute d'anticorps anti-Cav3. 2 fiables à ce jour, peu d'alternative s'offre { nous. Néanmoins, l'utilisation de souris knock-in dite Cav3. 2-GFP qui possèdent la particularité d'exprimer le canal Cav3. 2 couplé à la protéine fluorescente GFP, tout en gardant la fonctionnalité du canal, nous permettrait de visualiser son expression dans n'importe quel tissus. Cette souche de souris nous sera disponible prochainement via le Dr. Emmanuel Bourinet. Une autre alternative serait l'hybridation in situ, que nous mettons au point actuellement, sachant que cette technique ne montrera que l'expression de l'ARN messager et non de la protéine du canal Cav3. 2. Ensuite, afin de valider d'un point de vue comportemental l'implication de ces zones d'expression du canal Cav3. 2 dans la nociception, il serait envisageable d'inhiber le canal Cav3. 2 dans les zones d'intérêts, { l'aide d'injection intra-nucléaire de TTA-A2 ou de KO conditionnel (système Cre-Lox, souris ou virus, décrit précédemment). Parallèlement { l'étude de l'expression du canal Cav3. 2, il est primordial d'étudier les zones cérébrales mises en jeu par le paracétamol pour exercer son effet antalgique. Pour répondre à cette question, l'utilisation de la technique d'IRM fonctionnelle chez l'animal et l'Homme est toute désignée. Suite à la découverte des zones mises en jeu, l'évaluation de l'effet antalgique du paracétamol lors du blocage (antagoniste, KO conditionnel) de ces différents acteurs (TRPV1, CB1 et Cav3. 2) dans les différentes zones d'intérêt pourrait répondre d'un point de vue comportemental à cette question. 3. Les canaux Cav3. 2 et l'AM404 Les résultats antérieurs ont montré que l'action centrale du paracétamol implique son métabolite, le p-aminophénol, transformé dans le cerveau en AM40430. Ainsi, nous avons supposé que la relation observée entre le paracétamol et les canaux Cav3. 2 serait indirecte et impliquerait ARTICLE 1 l'AM404, un composé apparenté aux lipoaminoacides. L'implication des canaux Cav3. 2 supraspinaux dans l'action antinociceptive de l'AM404 a été montrée in vivo. L'AM404, injecté par voie i. c. v. , produit un effet antalgique chez les souris Cav3. 2 / mais pas chez les Cav3. 2-/- (Figure 26) dans les deux tests nociceptifs utilisés. Ces résultats mettent en évidence un lien fonctionnel entre l'AM404 et les canaux Cav3. 2, ceci de manière similaire aux observations antérieures faites avec les lipoaminoacides tels que l'anandamide, certains acides gras polyinsaturés ou le N-acyl-éthanolamide. Ces composés sont des bloqueurs des canaux calciques de type T647649, et plus particulièrement le composé endogène N-arachidonoyl-glycine (NaGly) qui est le plus puissant inhibiteur Cav3. 2467. Fait intéressant, l'effet antalgique du NaGly chez l'animal est abolie chez les souris Cav3. 2-/-206, 467. L'ensemble des résultats de ces études montrent que l'effet antalgique de ces lipoaminoacides s'effectue par une inhibition des canaux Cav3. 2. En est- il de même avec l'AM404 ? L'AM404 induit une inhibition des courants Cav3. 2 des neurones D-Hair de DRG (Figure 26) qui n'expriment pas les canaux TRPV1650. Toutefois, cette inhibition est faible et partielle par rapport aux autres inhibitions induites par les lipoaminoacides comme celui que nous décrivions précédemment467. Ceci remet en cause l'implication d'un effet inhibiteur direct de l'AM404 sur les canaux Cav3. 2 dans son action antalgique. 4. Relation fonctionnelle entre canaux Cav3. 2 et récepteurs TRPV1 Notre récente démonstration de la nécessité de l'activation des récepteurs TRPV1 supraspinaux par l'AM404 pour que l'action antalgique du paracétamol100 se manifeste, suggère un lien entre AM404, récepteur TRPV1 et canal Cav3. 2. Par conséquent, une inhibition indirecte des canaux Cav3. 2 par l'AM404 à travers l'activation des TRPV1 a été soupçonnée. Nous avons d'abord confirmé, par technique d'imagerie calcique, la capacité de l'AM404 à activer le récepteur TRPV1 comme précédemment démontré par Zygmunt et coll. 141. Parallèlement, nous avons mis en évidence le fait que le p-aminophénol est capable d'activer indirectement le récepteur TRPV1, ceci de manière dépendante de la FAAH (Figure 27). Ces deux résultats confirment que la métabolisation du p-aminophénol, par la FAAH en AM404, est nécessaire pour activer le récepteur TRPV1. Ensuite, la capacité de l'activation des récepteurs TRPV1 à inhiber les canaux Cav3. 2 a été démontrée par des expériences d'électrophysiologie in vitro en cellules HEK (Figure 27). Dépourvue de tout effet inhibiteur direct sur les canaux Cav3. 2, la capsaïcine inhibe fortement les courants Cav3. 2 lorsque les cellules ont été co-transfectées avec les canaux Cav3. 2 et les récepteurs TRPV1. Ceci démontre la capacité de l'activation des récepteurs TRPV1 à inhiber les ARTICLE 1 canaux Cav3. 2 (Figure 28). Cet effet est très sensible puisque l'activité tonique basale des récepteurs TRPV1 est également suffisante pour réduire le courant Cav3. 2. Cet effet n'est pas sans rappeler les conclusions décrivant une inhibition des courants de type T par l'activation des TRPV1 dans les neurones sensoriels connus pour exprimer le canal Cav3. 2 597. Nous démontrons ici même ce même constat en prouvant la nécessité de l'expression de ces deux acteurs, probablement situés dans un voisinage proche, pour permettre cette régulation. Surtout, nous montrons que cette inhibition peut être obtenue avec des niveaux physiologiques de calcium extracellulaire, contrairement au précédent rapport de Comunanza et coll. 597, suggérant que cette modulation est susceptible de se produire in vivo. L'hypothèse énoncée pour expliquer le mécanisme impliqué dans cette modulation est une régulation calcique. En effet, l'arrivée massive d'ions calcium après activation des récepteurs TRPV1 pourrait inhiber les canaux Cav3. 2 à travers l'activation de kinases (pour revue569, 651), telles que PTK652, PKA653655, PKC656 et ROCK657 et donc, in fine, diminuer l'excitabilité neuronale. L'étape suivante a consisté à démontrer ce lien fonctionnel dans la modulation supraspinale de la douleur. L'injection intracérébrale de capsaïcine induit une antalgie chez les souris Cav3. 2 / dans tous les tests nociceptifs. Cet effet n'a pas été observé chez les souris Cav3. 2- /- . Les canaux Cav3. 2 sont donc nécessaires à l'effet antalgique des agonistes TRPV1, ici, la capsaïcine ou l'AM404 administrés par voie i. c. v. Cependant, la réciproque ne s'applique pas, l'action antalgique d'une injection i. c. v. de TTA-A2 reste inchangée chez les souris TRPV1-/-. Pris ensemble, ces résultats démontrent que la capsaïcine et l'AM404 induisent une antalgie par l'inhibition des canaux Cav3. 2 dépendante de l'activation supraspinale du TRPV1. Cela explique pourquoi l'effet antinociceptif du paracétamol a été inhibé par l'injection i. c. v. d'antagoniste des récepteurs TRPV1 et d'un inhibiteur Cav3. 2 comme le TTA-A2. L'implication des récepteurs TRPV1 supraspinaux est en accord avec la littérature montrant que l'activation du TRPV1 supraspinal induit un effet antalgique (pour revue658). Ainsi, nous avons démontré un lien fonctionnel, in vivo, entre les récepteurs TRPV1 et les canaux calciques Cav3. 2 impliqué dans l'antalgie induite par la capsaïcine et le paracétamol. Le point faisant défaut dans cette étude est l'absence de preuve formelle d'une co- localisation tissulaire et cellulaire des canaux Cav3. 2 et TRPV1. Le fait de ne pas avoir à disposition des anticorps fiables (marquages chez les souris KO) ne nous a pas permis de mettre cela en évidence. Nous ne pouvons supposer cela qu'indirectement. En effet, si nous prenons par exemple la PAG, plusieurs études ont montré que les récepteurs TRPV1 étaient exprimés de façon ARTICLE 1 faible au niveau de la VL-PAG (ventrolatérale-PAG)441. En ce qui concerne le canal Cav3. 2, une expression au niveau de la VL-PAG a également été démontrée soit par hybridation in situ567, 568 soit par immunofluorescence { l'aide de souris knock-in Cav3. 2-GFP (François et coll. , données non publiées). Par extrapolation, nous pouvons émettre l'hypothèse que ces deux acteurs soient co- exprimés au niveau cellulaire. Les souris knock-in Cav3. 2-GFP, décrite précédemment, qui nous permettrons de visualiser l'expression protéique des canaux Cav3. 2 que nous pourrons coupler { la détection de l'expression des récepteurs TRPV1 dans la PAG et le cerveau en général. En attendant d'avoir les outils pour vérifier cette hypothèse, des études de co-hybridation in situ sont en cours au laboratoire. Suite aux résultats montrant que l'effet activateur indirect du p-aminophénol sur les récepteurs TRPV1 était dépendant de la FAAH, nous avons supposé une implication de l'AM404. Pour valider cette hypothèse, le dosage de la production d'AM404 suite { l'application de p- aminophénol apportera la réponse à cette question. Nous possédons au laboratoire le matériel de spectrophotométrie de masse pour effectuer ce dosage. Un autre point est l'utilisation du PMSF comme inhibiteur de la FAAH. Il a été récemment montré que le PMSF n'était pas spécifique de la FAAH659. L'utilisation d'inhibiteur plus spécifique comme l'URB597347 et l'URB937660 permettrait de confirmer et valider nos résultats. Nos résultats ont démontré une relation entre les récepteurs TRPV1 et les canaux Cav3. 2. L'hypothèse mécanistique énoncée est une régulation calcique incluant l'action de kinases sur le canal Cav3. 2. Pour répondre à cette hypothèse, la même expérience électrophysiologique, ayant montré cette interaction fonctionnelle, devrait être faite en en absence de calcium dans le milieu extracellulaire (condition calcium free). Si l'absence d'effet sur le courant Cav3. 2, suite { l'activation des récepteurs TRPV1, est observée cela validera l'implication du calcium dans ce phénomène. En ce qui concerne la mise en jeu des kinases, l'étude de la phosphorylation du canal Cav3. 2 suite { l'activation du récepteur TRPV1 peut répondre { la question. Malheureusement, faute d'anticorps, cette perspective semble lointaine. 5. Canaux Cav3. 2 et récepteurs CB1 Au début de mes travaux de thèse, suite à l'observation de l'implication des canaux Cav3. 2 dans l'effet antalgique du paracétamol, nous avons voulu évaluer les relations que pouvait entretenir le canal Cav3. 2 avec les deux autres protagonistes, CB1 et TRPV1, précédemment démontré comme indispensables { l'effet du paracétamol. L'orientation première fut la relation avec le récepteur TRPV1 du fait de l'action directe de l'AM404 sur ce récepteur et de l'abolition de ARTICLE 1 l'action antalgique de l'AM404 chez les souris KO TRPV1100. Parallèlement à ces travaux, une expérience sur la relation CB1 / Cav3. 2 a néanmoins été réalisée. Celle-ci a consisté à évaluer l'effet antalgique de l'ACEA (agoniste CB1) par voie systémique chez les animaux KO Cav3. 2 dans le test d'immersion de la queue et le test de von Frey. Dans les deux tests utilisés l'ACEA produit un effet antalgique non retrouvé chez les animaux KO Cav3. 2 (Figure 31). Ce résultat suggère un lien, comme le récepteur TRPV1, entre les canaux Cav3. 2 et les récepteurs CB1 dans l'antalgie induite par un agoniste CB1. Dans la PAG, le TRPV1 et le CB1 travaillent de concert pour induire leurs effets antalgiques lors de leur activation230, 454. Le récepteur CB1 semble ainsi sensibiliser le récepteur TRPV1 lui permettant d'être activé par ses agonistes endogènes (endovanilloïdes et endocannabinoïdes). De plus, le canal CB1, via son couplage aux protéines Gi/o (pour revue661), serait capable d'inhiber les canaux de type T si l'on en croit les nombreuses études démontrant un effet inhibiteur des protéines Gi/o sur les canaux de type T526, 569, 657, 662. Ainsi, il ne semble pas si aberrent qu'un lien fonctionnel existe entre les canaux Cav3. 2 et le récepteur CB1 dans les mécanismes antalgiques. Néanmoins, il a été montré que l'ACEA n'était pas spécifique du récepteur CB1 et qu'il était capable d'activer les récepteurs TRPV1663 pouvant expliquer son inefficacité chez les KO Cav3. 2. Pour répondre à cette interrogation de manière plus probante, l'utilisation d'un agoniste CB1 spécifique, comme le WIN55, 212-2664 serait une bonne approche. Enfin, un point important qui n'a pas encore était évalué mais sur lequel repose une partie de nos hypothèses est la relation CB1 / AM404 et anandamide dans l'effet antalgique du paracétamol. En effet, l'hypothèse avancée, par les études de Mallet et coll. 100, 131, est un effet inhibiteur de l'AM404 sur la FAAH qui conduirait { une augmentation de taux d'anandamide cérébral ce qui activerai les récepteurs TRPV1 / CB1 et induirait l'effet antalgique du paracétamol. L'inhibition de la FAAH par l'AM404, ainsi que l'augmentation du taux d'anandamide suite { cette inhibition n'est plus { démontrer. Reste { savoir si cela est le cas lors d'une administration systémique de paracétamol. Pour cela, il faudrait doser par spectrophotométrie de masse le taux d'endocannabinoïde cérébral en présence ou en absence de paracétamol. L'augmentation du taux d'endocannabinoïde cérébral suite { l'administration de paracétamol soutiendrait d'autant plus notre hypothèse. Surtout qu'une étude récente a déj{ montrée que l'injection systémique d'AM404 induisait une augmentation cérébrale de 2-AG665. 6. Canaux Cav3. 2 et voies descendantes sérotoninergiques Suite { l'implication des voies sérotoninergiques descendantes dans l'effet du paracétamol décrite dans la littérature97, 131, nous avons évalué l'activation potentielle de cette ARTICLE 1 voie lors de l'inhibition du canal Cav3. 2 supraspinal. Pour cela, nous avons déplété la sérotonine systémique par injections répétées de p-chlorophenylalanine (PCPA) chez des souris sauvages et l'effet antalgique du TTA-A2 par voie i. c. v. a été évalué chez ces animaux. Le résultat obtenu dans le test au formol montre une perte de l'effet antalgique du TTA-A2 lors d'une déplétion en sérotonine (Figure 32). Ce résultat suggère que l'effet antalgique induit par l'inhibition des canaux Cav3. 2 supraspinaux nécessite les voies sérotoninergiques descendantes. Ce résultat montre indirectement que les canaux Cav3. 2 sont exprimés dans des structures cérébrales reliées aux voies descendantes sérotoninergiques et viens totalement s'imbriquer dans la relation paracétamol et voies sérotoninergiques. Néanmoins, pour valider ce lien, il faudrait compléter ces résultats par l'étude de l'impact du blocage des récepteurs à la sérotonine spinaux sur l'effet antalgique du TTA-A2. Enfin, aucune augmentation de sérotonine spinale, suite à l'administration de paracétamol, n'a été retrouvée83. Malgré cela, il faudrait réitérer un dosage plus précis de la sérotonine (intra- et extracellulaire) suite { l'administration de paracétamol, d'AM404 et de TTA-A2, { l'aide de la technique de microdialyse qui est beaucoup plus fine, afin de valider nos hypothèses. Quel serait le mécanisme mis en jeu pour activer les voies sérotoninergiques descendantes ? Question intéressante quand on sait que l'inhibition des canaux Cav3. 2 induit une diminution de l'excitabilité neuronale. Par conséquent, comment une inhibition neuronale peut induire une activation d'une zone cérébrale (ici la PAG) ? L'hypothèse que nous allons énoncer repose sur plusieurs études récentes montrant que (Figure 34a, b) : 1) A l'état basal, la PAG possède un tonus GABAergique fort666, ce qui la garde dans un état d'inhibition ou du moins de non activation. 2) L'activation de la PAG par l'activation du récepteur TRPV1 suite à l'injection de capsaïcine dans la VL-PAG induit une production de glutamate et une augmentation de l'activité des cellules OFF de la RVM229. Ceci laisse supposer que le récepteur TRPV1, au sein de la PAG, est exprimé préférentiellement par les neurones glutamatergiques ; 3) l'activation du TRPV1 induit un relargage de glutamate qui va activer les récepteurs postsynaptiques mGluR5667 et ceci est inhibé en présence d'un bloqueur des mGluR668 ; 4) l'activation des mGluR induit un relargage rétrograde de 2-AG dans la fente synaptique qui va venir activer les récepteurs CB1 pré-synaptiques667, 669671 ; ARTICLE 1 5) l'activation du CB1 pré-synaptique diminue préférentiellement le relargage de GABA dans la fente synaptique pour trois raisons probables : - une plus forte densité de récepteurs CB1 sur les terminaisons inhibitrices (i-CB1) par rapport aux terminaisons excitatrices (e-CB1)672 ; - les e-CB1 sont moins sensibles aux endocannabinoïdes que les i-CB1673 ; - la dégradation et la recapture des endocannabinoïdes les empêchent sélectivement d'atteindre les fibres excitatrices674. L'ensemble de ces mécanismes contribuent à la diminution du tonus GABAergique de la PAG et mène à sa désinhibition666. L'activation (désinhibition) de la PAG entrainera une activation de la RVM et des voies sérotoninergiques descendantes. Ainsi, l'activation des neurones de la RVM, suite { l'activation du TRPV1 de la PAG, serait due { une levée d'inhibition par les neurones présynaptiques GABAergiques et à une activation des neurones glutamatergiques (Figure 34a, b). Maintenant comment pouvons-nous intégrer le canal Cav3. 2 dans ce système ? Nous savons que l'activation du récepteur TRPV1 inhibe le canal Cav3. 2, que l'activation du CB1 via la protéine Gi/o pourrait inhiber les canaux Cav3. 2526, 569, 657, 662 et que le 2-AG serait aussi potentiellement capable de le moduler négativement. Nous savons également que les canaux Cav3. 2 sont exprimés de manière présynaptique dans la moelle épinère538, donc probablement au niveau cérébral également. Ainsi, si nous supposons que le canal Cav3. 2 est préférentiellement exprimé par les neurones présynaptiques GABAergiques, l'activation des récepteurs TRPV1 et CB1, respectivement, par l'AM404 et le 2-AG141, 667, 669671, suite { l'administration de paracétamol, vont potentiellement pouvoir inhiber les canaux Cav3. 2. Il ne faut pas exclure le fait de la probabilité que l'AM404 et le 2-AG puissent également inhiber directement le canal Cav3. 2, sans passer par les récepteurs TRPV1 et CB1. Conjointement, ceci pourrait amener { l'inhibition préférentielle des neurones GABAergique, participant ainsi à la désinhibition de la PAG (Figure 34a, c). ARTICLE 1 Figure 34 : Modèle proposé de la dépression de la transmission GABAergique induite par la capsaïcine et le paracétamol dans la vlPAG conduisant finalement à l'activation des voies inhibitrices et diminuant la douleur. Le schéma montre les synapses GABAergiques (à droite) et glutamatergiques (à gauche) dans un neurone de la vlPAG avant (A) et après (B) traitement à la capsaïcine ou (C) au paracétamol. La capsaïcine ou l'AM404 et les endocannabinoïdes activent les récepteurs TRPV1 situés sur les terminaisons glutamatergiques pour faciliter la libération de glutamate, qui active ensuite les récepteurs post-synaptiques mGlu5 (mGluR5) et ensuite, couplés par la protéine Gq, stimule la phospholipase C (PLC) pour donner le diacylglycérol (DAG), qui est ensuite déacétylé par la DAG lipase (DAGL) en 2 arachidonolyglycerol (2-AG), un endocannabinoïde. Le 2-AG agit en tant que messager rétrograde pour activer les récepteurs CB1 présynaptiques (CB1) situés sur les terminaisons GABAergiques. Associé à cela, l'activation des récepteurs TRPV1 et CB1 des terminaisons GABAergiques, ainsi que l'action directe des endocannabinoïdes, vont venir inhiber le canal Cav3. 2. Pris ensemble, ces mécanismes vont inhiber la libération de GABA. L'inhibition de la transmission GABAergique (désinhibition) dans la vlPAG va activer les voies inhibitrices descendantes de la douleur et réduire les réponses nociceptives. Modifié d'après Liao et coll. 2011. D'autant plus qu'il a été montré une implication des canaux de type T dans le contrôle des neurones GABAergiques au niveau de la PAG675. Dans tous les cas, de nombreuses interrogations persistent et de nombreuses expériences seront nécessaires pour démêler les mécanismes supraspinaux mis en jeu. Et la première chose à faire pour vérifier cette hypothèse serait d'étudier le type de neurones de la PAG exprimant les canaux Cav3. 2 : sont-ils glutamatergiques ? GABAergiques ? Les deux ? Expriment-ils TRPV1 et CB1 ? Les souris knock-in Cav3. 2-GFP seront un bon outil pour essayer de répondre à cette question. 7. Canaux Cav3. 2 et autres antalgiques Nous venons de voir que les canaux Cav3. 2 participaient { l'effet antalgique du paracétamol, en plus de cela, nous avons évalué l'effet de la morphine sur les animaux invalidés pour le gène CACNA1H codant pour le canal Cav3. 2. Les résultats obtenus dans diverses modalités ARTICLE 1 douloureuse et conditions pathologiques ont montré que la morphine maintenait son effet antalgique chez ces souris (Kerckhove et coll. en révision), laissant supposer une implication des canaux Cav3. 2 uniquement dans certains types de mécanismes antalgiques, comme celui du paracétamol. Pour apporter des arguments supplémentaires { cette hypothèse, l'effet de la dipyrone, un antalgique possédant un mécanisme d'action différent de la morphine et du paracétamol*, a été évalué également chez des souris KO Cav3. 2. Dans le test au formol, l'effet antalgique de la dipyrone observé chez les animaux sauvages est retrouvé de manière similaire chez les animaux KO Cav3. 2 (Figure 33), ce qui va dans le sens d'une participation des canaux Cav3. 2 aux mécanismes d'action spécifiquement à certains types d'antalgiques. D'autres antalgiques, comme des AINS de référence, serait également { évaluer chez les souris KO Cav3. 2. 8. Conclusion Pour conclure, nous avons identifié les canaux Cav3. 2 supraspinaux comme de nouvelles cibles pour l'antalgie induite par le paracétamol. Nous avons placé ces canaux avec deux acteurs précédemment montrés pour être impliqués dans l'action du paracétamol : l'AM404 et les récepteurs TRPV1. Les présents résultats nous ont amené à compléter les événements séquentiels que nous avons précédemment proposés100, 131 pour expliquer le mécanisme d'action du paracétamol : métabolisme en p-aminophénol (dans le foie) puis en AM404 dans le cerveau (grâce à l'enzyme FAAH) qui induit une activation des récepteurs TRPV1 supraspinaux (liés avec les récepteurs CB1) qui induit à son tour une inhibition des canaux Cav3. 2 induisant l'effet antalgique du paracétamol. D'autres études sont nécessaires pour élucider le lien entre l'inhibition des canaux Cav3. 2 supraspinaux et l'activation des voies inhibitrices bulbospinal impliqués dans l'effet antalgique du paracétamol97, 103, 131. Enfin, nous avons mis en évidence les canaux calciques Cav3. 2 supraspinaux en tant qu'acteurs importants dans la modulation de la douleur et apparaissent donc comme une cible prometteuse et intéressante pour le traitement de la douleur * La Dipyrone se comporte comme un AINS mais les mécanismes d'action mis en jeux semblent différents et restent encore flous676679 RESULTATS ARTICLE 2 : Cav3. 2 calcium channels are involved in inflammatory pain and associated process (En rédaction) ARTICLE 2 VII. ARTICLE 2 : Cav3. 2 channels are involved in inflammatory pain and associated process A. INTRODUCTION La douleur reste le symptôme le plus délétère chez les patients souffrant de douleur inflammatoire chronique comme l'arthrite ou d'importantes lésions post-chirurgicales. La douleur inflammatoire à un impact conséquent, non seulement, sur le bien-être physique et mental des patients mais aussi en termes économiques. L'altération de la qualité de vie est bien reconnue602, 606 mais les coûts économiques restent significatifs que ce soit directement (p. ex. coût des soins) ou indirectement (p. ex. diminution de la productivité professionnelle680 (Source : Datamonitor forecast ; MIDAS sales data ; IMS Health, March 2010). La majorité de ces patients rapportent une diminution partielle ou nulle de leur douleur par les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), ou dans le cas contraire, avec des effets indésirables importants conduisant à une limitation ou { l'arrêt de leur traitement. En effet, les effets bénéfiques de ces médicaments sont contrebalancés, { long terme, par d'importants effets indésirables comme les ulcérations gastriques ou les dysfonctions cardiovasculaires dû { l'action inhibitrice concomitante des fonctions homéostatiques des prostanoïdes681683. Ainsi, il est important d'avoir de meilleurs antalgiques pour traiter les symptômes des patients souffrant de douleurs chroniques inflammatoires. Aujourd'hui, les mécanismes physiopathologiques sous-tendant les phénomènes de douleurs inflammatoires sont bien documentés. Ces phénomènes sont principalement médiés par les médiateurs pro-inflammatoires tels que les cytokines, les prostaglandines et les facteurs de croissance684686. Les médiateurs pro-inflammatoires sont produit par les cellules épithéliales, les lymphocytes et majoritairement par les macrophages suite à leur activation par un pathogène, des médiateurs pro-inflammatoires ou des molécules antigéniques. Le rôle principal de ces médiateurs est la mise en place et le maintien de la réponse immunitaire mais ils induisent également une sensibilisation des fibres nerveuses afférentes primaires conduisant aux phénomènes d'allodynie et d'hyperalgie observés lors d'une douleur inflammatoire684686. En effet, les cytokines (bradykinines et interleukines), les prostaglandines (PGE2) et les facteurs de croissance (TNF- et NGF) sont capables de sensibiliser les nocicepteurs via leurs récepteurs ARTICLE 2 spécifiques et induire une perception douloureuse exacerbée684686. Durant les premières étapes de la réaction inflammatoire, les médiateurs pro-inflammatoires modifient la sensibilité de leurs récepteurs et diminuent les seuils d'activation des canaux ioniques, comme le TRPV1, ASIC et P2X exprimés par les nocicepteurs684686. A long terme, ces changements, incluant des évènements transcriptionnels par les cytokines et les facteurs de croissance, résultent en une augmentation de la production de leurs récepteurs, des canaux ioniques et des neurotransmetteurs centraux684 . Les mécanismes impliqués dans cette réponse biologiques sont nombreux et complexes mais, de manière intéressante, tous ces phénomènes font intervenir le calcium. Les variations de la concentration cytosolique en calcium sont principalement fixées par le potentiel membranaire de repos et l'équilibre des flux calciques par les canaux calciques voltage dépendant687689. De plus, de nombreux canaux calciques ont été identifiés comme impliqués dans la libération des neurotransmetteurs et les dépolarisations membranaires des neurones474. Les canaux calciques voltage dépendant sont divisés en 2 groupes dépendant de leurs seuils d'activation : les canaux de haut seuil (type L, P / Q, N et R) et de bas seuil (type T) d'activation. En comparaison des canaux { haut seuil d'activation, les canaux de type T sont activés pour des potentiels membranaires proches du potentiel de repos et s'inactivent plus rapidement474. Trois gènes (CACNA1G, CACNA1H et CACNA1I) codent les canaux de type T respectivement appelés Cav3. 1, Cav3. 2 et Cav3. 3474. Les récentes découvertes suggèrent une importance des canaux de type T, et plus particulièrement l'isoforme Cav3. 2, dans la nociception périphérique, conduisant { la possibilité que leur modulation soit un potentiel thérapeutique dans le traitement des douleurs aigus532, 580 et chroniques581, 582, 584. Les études de ces 20 dernières années ont bien défini leur rôles fonctionnels dans : les low-threshold spikes , les oscillations de calcium cellulaires, les contractions musculaires, la sécrétion hormonale, la croissance, la différenciation et la prolifération cellulaire526, 570, 690, 691. Les canaux de type T sont maintenant bien connus pour participer { l'activité pacemaker cardiaque, à la génération des ondes lentes du sommeil, à l'épilepsie, { la fertilisation, au contrôle du tonus vasculaire, { l'hypertrophie cardiaque et { la nociception. A cause de ces rôles physiologiques, les canaux de type T sont décrit comme d'importantes cibles de régulation neuronales et cardiaques692, 693. Dans la nociception, il a été rapporté que l'inhibition génétique ou pharmacologique des canaux de type T réduisait l'hypersensibilité mécanique et thermique induite par une lésion nerveuse périphérique chez le rat557, 558. Dans l'étude de Bourinet et coll. 581, seuls les oligonucléotides antisens ciblant l'ARNm Cav3. 2 sont efficaces pour diminuer l'hypersensibilité thermique et mécanique dans un modèle de neuropathie chez le rat. De plus, les souris knock-out Cav3. 2 montrent une diminution de leur perception douloureuse en réponse à des stimulations ARTICLE 2 aigus580 ou dans divers modèles de douleurs neuropathiques581, 582, 584, suggérant que les canaux de type T et principalement l'isoforme Cav3. 2 sont cruciaux dans la nociception. Cependant, l'implication des canaux Cav3. 2 dans la douleur inflammatoire reste très peu documentée. Seule une étude a démontré que les souris knock-out Cav3. 2 présentaient une diminution de la perception douloureuse dans la phase 2 du test au formol 580. Une autre étude a également démontré l'effet antalgique d'un bloqueur de canaux de type T dans le test au formol694. Ceci suggérant une potentielle implication de ces canaux dans la douleur inflammatoire. En parallèle, de nombreuses études ont montré que les canaux Cav3. 2 participaient aux phénomènes d'exocytose. En effet, l'équipe de Carbone a démontré que l'inhibition des canaux Cav3. 2 diminuait l'exocytose des cellules chromaffines 570, 598, 600, 601. Ces résultats supposent que les canaux Cav3. 2 pourraient posséder les mêmes capacités dans d'autres types cellulaires et potentiellement dans les processus de sécrétion des médiateurs pro- inflammatoires, qui sont calcium-dépendant. Dans cette étude, l'implication des canaux Cav3. 2 dans les phénomènes inflammatoires et la douleur associée a été étudiée dans le modèle inflammatoire à la carragénine chez des souris déficientes pour le canal Cav3. 2. Nous avons démontré que les canaux Cav3. 2 participaient activement { la douleur inflammatoire et au développement œdémateux par la modulation de l'activation des macrophages et de la production des médiateurs pro-inflammatoires. Cette étude met en lumière les canaux Cav3. 2 comme une cible potentielle dans le traitement de la douleur et de l'inflammation. B. RESULTATS Les canaux calciques Cav3. 2 participent aux phénomènes douloureux associés { l'inflammation tissulaire. Les canaux calciques Cav3. 2 sont très impliqués dans la perception douloureuse, dans le développement et le maintien de la douleur neuropathique581, 582, 584. En accord avec ces données, la participation des canaux Cav3. 2 à la douleur inflammatoire a été évaluée { l'aide de souris invalidées pour le gène CACNA1H codant pour la protéine Cav3. 2 (Cav3. 2 KO). Deux modèles d'inflammation ont été étudiés, un modèle dit sub-chronique par injection intraplantaire d'une solution de carragénine 3% et un modèle chronique mimant la monoarthrite par injection périarticulaire de CFA. La douleur mécanique et le développement œdémateux sont évalués avant (T0, J0) puis à T2h, 4h, 6h, 8h et 24h ou J7 près l'induction respective de l'inflammation par la ARTICLE 2 carragénine et le CFA. L'état douloureux est évalué chez des souris Cav3. 2 KO et comparé à celui de leur littermates (WT) { l'aide du test de von Frey permettant de mesurer les symptômes d'allodynie et d'hyperalgie mécanique associés { l'inflammation. Les souris Cav3. 2 KO ne développent pas d'allodynie (Figure 35a) ni d'hyperalgie (Figure 35b) tactile en condition inflammatoire contrairement aux souris WT dans le modèle à la carragénine. Des résultats similaires ont été obtenus pour le modèle au CFA (Figure supplémentaire S1 a, b). Pour évaluer l'état inflammatoire des animaux, le développement œdémateux et la production de médiateurs inflammatoires furent observés par mesure au pied à coulisse de la taille de l'œdème (Figure 35c) et par dosage ELISA, au niveau de l'œdème et du plasma des médiateurs pro-inflammatoires (Figure 36). Les résultats obtenus montrent un développement œdémateux présent chez les souris Cav3. 2 KO mais diminué d'environ 15% en comparaison aux souris WT (T6h ; Cav3. 2 KO : 47, 32 2, 78% et WT : 63, 07 5, 97% d'augmentation de l'épaisseur de la patte). Des résultats similaires ont été obtenus pour le modèle au CFA (Figure supplémentaire S1 c). Figure 35 : Les canaux calciques Cav3. 2 sont impliqués dans le développement des symptômes d'allodynie et d'hyperalgie tactile et de l'œdème associés { l'inflammation. L'impact de l'invalidation du gène codant le canal Cav3. 2 sur la douleur inflammatoire (modèle carragénine) et le développement œdémateux a été évalué par le test de von Frey et par mesure de l'œdème chez des animaux knock-out Cav3. 2 (Cav3. 2-/-) et leur littermates sauvages (Cav3. 2 / ). L'allodynie et l'hyperalgie tactile ont été respectivement évaluées par les filaments de von Frey exerçant une pression de 0, 04 g et 1, 4 g. Les mesures ont été effectuées à 0, 2, 4, 6 8 et 24 h après injection intraplantaire de carragénine 3%. a) Allodynie mécanique, b) hyperalgie mécanique, c) mesure de l'œdème, d-f) aires sous la courbe respectivement des figures a, b et c. Les données sont représentées en moyennes (n 8) SEM. *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001, en comparaison des groupes véhicules respectifs. ARTICLE 2 En ce qui concerne la production des médiateurs pro-inflammatoires (il-6, il-1, TNF- et PGE2), en corrélation avec le développement œdémateux et l'état douloureux, les souris Cav3. 2 KO présentent une production de ces médiateurs fortement diminuée (T4h après induction de l'inflammation { la carragénine) en comparaison aux animaux WT, que ce soit au niveau systémique pour l'il-6 (Figure 36a) ou tissulaire (Figure 36b) pour tous les médiateurs. Ces résultats suggèrent que les canaux Cav3. 2 participent au développement des symptômes douloureux mais, de manière plus intéressante, également { l'état œdémateux et { la production des médiateurs inflammatoires lors d'une inflammation tissulaire, ce qui n'a encore jamais était décrit jusqu'{ l'heure actuelle. Figure 36 : Les animaux knock-out Cav3. 2 produisent moins de médiateurs pro-inflammatoires en réponse à une inflammation. L'impact de l'invalidation du gène codant le canal Cav3. 2 sur la production des médiateurs pro- inflammatoires en contexte inflammatoire (modèle carragénine, 4h après induction) a été évalué par dosage ELISA chez des animaux knock-out Cav3. 2 (Cav3. 2-/-) et leur littermates sauvages (Cav3. 2 / ). Les médiateurs pro- inflammatoires ont été dosés au niveau plasmatique pour l'il-6 et au niveau de l'œdème pour l'il-6, le TNF-, l'il-1 et la PGE2. a) il-6 plasmatique, b) il-6 œdème, c) TNF- œdème, d) il-1, e) PGE2 œdème. Les données sont représentées en moyennes (n 8) SEM. *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001, en comparaison des groupes Cav3. 2 / . Les canaux Cav3. 2 exprimés par les cellules immunitaires participent au développement œdémateux. Suite { l'implication des canaux Cav3. 2 dans le développement œdémateux et la production des médiateurs inflammatoires, les acteurs impliquant les canaux Cav3. 2 dans ces processus inflammatoires ont été étudiés. Les acteurs majoritaires impliqués dans le développement de l'œdème et la production de médiateurs pro-inflammatoires sont les cellules immunitaires dont principalement les macrophages. L'expression des canaux Cav3. 2 au niveau des macrophages ainsi que l'implication spécifique de ces canaux au niveau des cellules immunitaires dans les phénomènes douloureux et inflammatoires (œdème) ont donc été étudiées. Les résultats obtenus, à partir de culture cellulaire de bone marrow derived macrophages ARTICLE 2 (BMDM), montrent pour la première fois une expression d'ARNm d'un canal voltage dépendant, ici Cav3. 2, par ce type cellulaire, ceci étant validé par l'expression nulle chez des BMDM Cav3. 2 KO (Figure 37). Figure 37 : Les macrophages expriment les canaux calciques Cav3. 2. L'étude de l'expression des canaux Cav3. 2 dans les macrophages a été effectuée par RT-q-PCR { partir de macrophage dérivés de la moelle osseuse d'animaux Cav3. 2-/- et Cav3. 2 / . Les données sont représentées en moyennes (n 3) SEM. *, p < 0, 05 , en comparaison du groupe Cav3. 2 / . Ainsi, l'évaluation de l'implication des canaux Cav3. 2 spécifiquement au niveau du système immunitaire dans les phénomènes inflammatoires (œdème et douleur) fut faite par la génération de souris chimériques. Ces souris sont soit invalidées pour le gène codant le canal Cav3. 2 au niveau du système immunitaire (Recipient Donor -), soit invalidées dans la totalité du corps sauf pour le système immunitaire (Recipient - Donor ). L'état douloureux et œdémateux de ces souris chimériques est évalué 4h après l'injection intraplantaire de carragénine. Les résultats obtenus montrent, au niveau de la perception douloureuse, que le fait de rendre fonctionnel les canaux Cav3. 2 du système immunitaire chez des souris Cav3. 2 KO restaure partiellement les symptômes d'allodynie et d'hyperalgie mécanique (Figure 38a), alors que curieusement la réciproque n'est pas retrouvée. Ce résultat démontre que les canaux Cav3. 2 exprimés par les cellules immunitaires sont suffisants mais non essentiels à la génération des symptômes douloureux associés à l'inflammation. En ce qui concerne l'état œdémateux, par la même technique de mesure que précédemment, l'absence des canaux Cav3. 2 spécifiquement au niveau immunitaire réduit, de manière équivalente aux souris Cav3. 2 KO, le développement œdémateux et, inversement, l'œdème est restauré dans le cas des souris Cav3. 2 KO ayant un système immunitaire WT (Figure 38b). Ce dernier résultat démontre une implication des canaux Cav3. 2 spécifiquement au niveau immunitaire dans le développement œdémateux (environ 20% de la taille de l'œdème), ceci expliquant le phénotype présenté par les souris Cav3. 2 KO en condition inflammatoire. ARTICLE 2 Figure 38 : Les canaux Cav3. 2 exprimés par les cellules immunitaires participent au développement œdémateux et { la douleur inflammatoire. L'étude de la participation des canaux Cav3. 2 exprimés par les cellules immunitaires au développement œdémateux et { l'hypersensibilité mécanique inflammatoire (modèle carragénine), a été permise grâce aux souris chimériques exprimant ou non le canal Cav3. 2 au niveau des cellules immunitaires et/ou dans les neurones. La mesure du développement œdémateux et le test de von Frey ont été effectués avant (histogramme blanc) et 4h après injection intraplantaire de carragénine 3% (histogramme noir). a) développement œdémateux, b) test de von Frey, allodynie (filament de 0, 04 g), c) test de von Frey, hyperalgie (filament de 1, 4 g). Donor : souris donneuse de moelle osseuse, Recipient : souris transplantée ; Cav3. 2 / and - Cav3. 2-/-. Les données sont représentées en moyennes (n 8) SEM. *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001. Les canaux calciques Cav3. 2 sont essentiels à l'activation des macrophages. A la vue des résultats précédents et le fait que de nombreuses études ont démontré l'implication des canaux Cav3. 2 dans les processus de production et d'exocytose des catécholamines570, nous nous sommes orientés vers l'hypothèse d'une implication des canaux Cav3. 2 dans le phénomène d'activation macrophagique. Par étude in vitro sur culture de BMDM, issu d'animaux WT et Cav3. 2 KO, l'activation des macrophages a été étudiée par stimulation au LPS (20 ng/ml). Suite à cette stimulation, le dosage par technique ELISA, de la production de médiateurs pro-inflammatoires dans le surnageant de culture a été effectué. Les résultats obtenus, similaires à ceux obtenu in vivo dans l'œdème, montrent que les macrophages Cav3. 2 KO produisent moins de médiateurs pro-inflammatoires (il-6, il-1 et TNF-) en réponse au LPS en comparaison aux macrophages sauvages (Figure 39). Figure 39 : Les canaux Cav3. 2 participent à la production des médiateurs pro-inflammatoires par les macrophages en réponse au LPS. La participation des canaux Cav3. 2 à la production des médiateurs pro- inflammatoires par les macrophages a été déterminée par dosage ELISA de la production d'il-6, d'il-1 et de TNF- dans le milieu de culture des macrophages suite à leur activation. Les macrophages de souris Cav3. 2-/- et Cav3. 2 / d'origine myéloïde ont été activés par contact avec du LPS (20 ng/ml) durant 24h. a) il-6, b) il- 1, c) TNF-. Les données sont représentées en moyennes (n 8) SEM. *, p < 0. 05 ; *, p < 0, 001 , en comparaison des groupes Cav3. 2 / . ARTICLE 2 Suite à leur activation, l'étude de la morphologie des macrophages, par marquage immunofluorescence de l'actine par la phalloïdine, a montré un gonflement ( swelling ) cellulaire des macrophages WT traduisant la forte production cytoplasmique de médiateurs inflammatoires contrairement aux macrophages Cav3. 2 KO qui ne présentent aucun signe morphologique d'activation (Figure 40). Ces deux résultats suggèrent une implication des canaux Cav3. 2 dans l'activation des macrophages et donc dans la production des médiateurs pro-inflammatoires, en réponse au LPS. Les canaux Cav3. 2 étant des canaux calciques et que le calcium est un élément majeur à l'activation des macrophages, l'étude des influx de calcium intracellulaire par imagerie calcique a été effectuée sur une culture de BMDM Cav3. 2 KO et WT, ceci en présence de LPS. Les résultats observés montrent que seulement 6 cellules sur 122 répondent au LPS dans le cas de BMDM Cav3. 2 KO contrairement aux WT o 44 cellules sur 127 répondent (Figure 41). Ce dernier résultat traduit l'implication majeure des canaux Cav3. 2 dans les influx calciques des macrophages nécessaire à leur activation. Au final, par ces différentes approches, les canaux Cav3. 2 semblent être fortement impliqués dans les phénomènes d'activation macrophagique. Figure 40 : Les canaux Cav3. 2 participent { l'activation des macrophages en réponse au LPS. La participation des canaux Cav3. 2 { l'activation des macrophages a été déterminée de manière morphologique par immunofluorescence. Les macrophages de souris Cav3. 2-/- et Cav3. 2 / d'origine myéloïde ont été activés par contact avec du LPS (20 ng/ml) durant 24h. a) La morphologie des macrophages a été étudiée par marquage de l'actine grâce { la toxine phalloïdine (rouge) et du noyau (DAPI, Bleu), b) l'aire des cellules a été mesurée et représentée en unité arbitraire (a. u. ), le nombre de cellules comptabilisées est représenté en bas des histogrammes. Les données sont représentées en moyennes (n 3) SEM. *, p < 0, 001 , en comparaison des groupes sans LPS. ARTICLE 2 Figure 41 : Les canaux Cav3. 2 participent { l'entrée de calcium intracellulaire lors de l'activation des macrophages en réponse au LPS. La participation des canaux Cav3. 2 aux influx calciques lors de l'activation des macrophages a été évaluée par imagerie calcique sur des macrophages Cav3. 2-/- et Cav3. 2 / issus de moelle osseuse et activés par du LPS (20 ng/ml). L'enregistrement des influx calciques ont été effectués pendant 5 min en contact du LPS. Les données sont représentées en moyennes (n 3) SEM. *, p < 0, 01 , en comparaison du groupe Cav3. 2 / . C. INFORMATIONS SUPPLEMENTAIRES Figure S1 : Les canaux calciques Cav3. 2 sont impliqués dans le développement des symptômes d'allodynie et d'hyperalgie tactile et de l'œdème associés { l'inflammation chronique. L'impact de l'invalidation du gène codant le canal Cav3. 2 sur la douleur inflammatoire chronique (modèle monoarthrite, CFA) et le développement œdémateux ont été évalués par le test de von Frey et par mesure de l'œdème chez des animaux knock-out Cav3. 2 (Cav3. 2-/-) et leur littermates sauvages (Cav3. 2 / ). L'allodynie et l'hyperalgie tactile ont été respectivement évaluées par les filaments de von Frey exerçant une pression de 0, 04 g et 1, 4 g. Les mesures ont été effectuées à J0 et J7 après injection péri- articulaire de CFA. a) Allodynie mécanique, b) hyperalgie mécanique, c) mesure de l'œdème. Les données sont représentées en moyennes (n 8) SEM. *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001. ARTICLE 2 Figure S2 : Génération des souris chimériques. D. RESULTATS COMPLÉMENTAIRES NON PUBLIES Figure 42 : L'éthosuximide induit un effet antalgique et anti-inflammatoire dans le test au formol. L'impact de l'éthosuximide (100, 200 et 300 mg/kg, i. p. ) sur la douleur aigu (phase 1) et inflammatoire (phase 2) et le développement œdémateux (mesure de l'œdème) ont été évalués par le test au formol chez des animaux sauvages. La douleur a été évaluée par le chronométrage du temps de léchage de la patte durant les deux phases typiques de comportement douloureux associées au test du formol (phase 1 : 0-5 min et phase 2 : 15-40 min). L'injection d'éthosuximide a été effectuée 20 min avant l'injection intraplantaire de formol 2, 5%. a) phase 1, b) phase 2, c) mesure de l'œdème (40 min après formol). Les données sont représentées en moyennes SEM. *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001, en comparaison des groupes véhicules. ARTICLE 2 Figure 43 : L'éthosuximide induit un effet antalgique et anti-inflammatoire dans le modèle carragénine. L'impact de l'éthosuximide (200 mg/kg, i. p. , T30min) sur la douleur inflammatoire sub-chronique (modèle carragénine) et le développement œdémateux ont été évalués par le test de von Frey et par mesure de l'œdème chez des animaux sauvages. L'allodynie et l'hyperalgie tactile ont été respectivement évaluées par les filaments de von Frey exerçant une pression de 0, 04 g et 1, 4 g. Les mesures ont été effectuées à 4h après injection intraplantaire de carragénine 3%. a) Allodynie mécanique, b) hyperalgie mécanique, c) mesure de l'œdème. Les données sont représentées en moyennes SEM. *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001, en comparaison des groupes véhicules. Figure 44 : L'effet antinociceptif de l'éthosuximide nécessite les canaux Cav3. 2. L'implication des canaux Cav3. 2 dans l'action de l'éthosuximide (200 mg/kg, i. p. ) sur la douleur a été évalué par le test au formol (phase 2) chez des animaux Cav3. 2-/- et Cav3. 2 / . La douleur a été évaluée par le chronométrage du temps de léchage de la patte durant la deuxième phase de comportement douloureux associée au test du formol (phase 2 : 15-40 min). L'injection d'éthosuximide a été effectuée 20 min avant l'injection intraplantaire de formol 2, 5%. Les données sont représentées en moyennes SEM. *, p < 0, 05 ; en comparaison des groupes véhicules. Figure 45 : Le TTA-A2 induit un effet antalgique dans le modèle carragénine. L'impact du TTA-A2 (0, 1 mg/kg, it. pl. et 1 mg/kg per os, T15min) sur la douleur inflammatoire sub-chronique (modèle carragénine) a été évalué par le test de von Frey chez des animaux sauvages. L'allodynie et l'hyperalgie tactile ont été respectivement évaluées par les filaments de von Frey exerçant une pression de 0, 04 g et 1, 4 g. Les mesures ont été effectuées à 4h après injection intraplantaire de carragénine 3%. a) Effet périphérique, b) effet systémique. Les données sont représentées en moyennes SEM. *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001, en comparaison des groupes véhicules. ARTICLE 2 E. MATERIELS ET METHODES 1. Animaux Les souris knock-out Cav3. 2 (Cav3. 2-/-) et leur littermates sauvages (Cav3. 2 / ) ont été élevés à l'Université d'Auvergne (Clermont-Ferrand, France) en conditions environnementales contrôlées (21-22 C, 55% d'humidité) et maintenus sous un cycle lumière / obscurité 12/12h. La nourriture et l'eau étaient disponibles ad libitum. Les souris Cav3. 2-/- ont été initialement générées par Chen CC et al. 639. Pour toutes les expériences, les souris mâles de 20-25g ont été utilisées et euthanasiées par CO2. Toutes les expériences ont été effectuées avec l'approbation du Comité pour les questions de recherche et d'éthique en expérimentation animale (CEMEA Auvergne ; nr : CE 55 - 12, CE 112 - 12, CE 07 - 08) et du Comité d'éthique du IASP. 2. Modèle Carragénine L'inflammation sub-aigu de la patte a été induite par une injection intraplantaire de 20 l de sérum physiologique / 3% -carragénine (Sigma-Aldrich, France). Les seuils douloureux de base ont été effectués avant l'injection carragénine. Les tests de comportement ont été réalisés à 2h, 4h, 6h, 8h et 24h, pour les expériences avec les souris Cav3. 2-/-, et 4h après l'induction de l'inflammation, pour les souris traitées avec le composé TTA-A2 (Merck laboratoires, Pennsylvanie, USA). Toutes les expériences in vitro ont été réalisées 4h après l'injection de carragénine. 3. Test de von Frey Les souris ont été habituées aux tests avant le jour de l'expérimentation. L'expérimentateur et les administrations des drogues étaient en aveugles vis à vis du génotype des souris et des traitements. L'administration des drogues a été réalisée par une tierce personne que l'expérimentateur. Le jour du test comportemental, les souris sont placées dans des compartiments individuels au-dessus d'une surface métallique grillagée et laissées en acclimatation pendant une heure. Les seuils de réponse nociceptive ont été évalués avec les filaments de von Frey calibrés de 0, 04 g et 1, 4 g (Bioseb, France). Ces derniers ont été pressés perpendiculairement à cinq reprises contre le milieu patte et maintenus pendant 3 s. Une réponse douloureuse positive a été notée si la patte a été retirée et un score de douleur (0-5) a été déterminé. 4. Culture de macrophages issus de moelle osseuse (BMDM) Les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) ont été préparés et cultivés comme décrit précédemment695. Brièvement, les fémurs et tibia des souris ont été vidés de leur moelle osseuse avec du milieu DMEM. La suspension cellulaire obtenue a été ensuite mise en culture à hauteur de 10 6 cellules / ml. Les cellules ont été cultivées et différenciées en BMDM en utilisant un milieu DMEM supplémenté avec 10% SVF, 1% glutamine, 1% antibiotique (néomycine) et 50% de surnageant de culture de cellule L929, contenant le facteur de différenciation macrophagique (M-CSF). Pour les expériences in vitro, les BMDM ont été cultivés au moins 5 jours avant d'être stimulés par du LPS en milieu de culture sans SVF. ARTICLE 2 5. ELISA Les productions de cytokines (IL-1, IL-6, TNF-) et de PGE2 ont été évaluées par le test ELISA. Tous les kits ELISA sont des kits DUOSET de R & D Systems (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA). Les tests ont été effectués selon le protocole du fabricant. Les doses minimales détectables étaient de 15. 6 pg / ml pour IL-1, PGE2 et l'IL-6 et 31 pg / ml pour TNF-. 6. Mesure et culture d'œdème L'évolution de l'œdème de la patte induit par injection intraplantaire de carragénine a été mesurée pendant 24 heures à l'aide d'un pied à coulisse. Pour la mise en culture, l'œdème (30 mg de tissu / souris) a été retiré quatre heures après injection de carragénine et cultivé dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de SVF inactivé à la chaleur, 1% de glutamine et 1% d'antibiotique (néomycine). Après 24h, le milieu est récolté et le surnageant utilisé pour quantifier les facteurs pro-inflammatoires par ELISA. 7. Immunocytochimie L'Alexa Fluor 546 Phalloidin et l'anticorps de rat anti-F4/80 de souris ont été utilisés aux dilutions indiquées par les fournisseurs : Phalloidin (5/200, Invitrogen) et F4/80 (1/500, ABD Serotec). Les BMDM ont été étalés sur des lamelles et ont été fixés pendant 5 min avec du paraformaldéhyde 4% dans du PBS. Après trois lavages en PBS, les cellules ont été incubées 1 h avec du PBS-3%BSA pour la saturation. Les cellules ont été perméabilisées dans du PBS contenant 0, 3% de Triton X-100 pendant 15 min à température ambiante et, après lavages, ont été incubées 2h à température ambiante avec l'anticorps F4/80 dilué dans du PBS-3% BSA. Après trois lavages en PBS, les BMDM ont été incubés pendant 1h avec l'anticorps secondaire approprié. Ensuite, les cellules ont été incubées pendant 20 min avec la toxine Phalloidin dans du PBS-3% BSA. Enfin, les BMDM ont été montées entre lames et lamelles et observés. Les acquisitions d'image ont été réalisées avec l'Axio Scope A1 (Zeiss). La mesure des aires cellulaires a été effectuée par le logiciel ImageJ (National Institutes of Health). 8. Imagerie Calcique L'effet du traitement au TTA-A2 et l'implication des canaux Cav3. 2 sur les concentrations de Ca2 intracellulaire ont été évalués en enregistrant les changements de concentration en Ca2 cytoplasmique en utilisant la sonde fluorescente Fura-2 sur une culture de BMDM purifiés à partir de souris Cav3. 2-/- et leur littermates sauvages . Les cellules ont été chargées avec 2 M de Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2/AM, Invitrogen), dans une solution d'enregistrement saline / 0, 5% BSA (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM de CaCl2, MgCl2 2 mM, glucose 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7. 4). Après une heure d'incubation à température ambiante, les cellules ont été lavées trois fois et ensuite stimulées par du LPS ou LPS TTA-A2. Le système d'imagerie Metafluor (Molecular Devices) a été utilisé pour l'acquisition de la fluorescence et l'analyse des cellules individuelles. La fluorescence détectée avec une caméra CCD sous le contrôle du logiciel Metafluor. Les images ont été acquises toutes les deux secondes. 9. Souris chimériques Pour la génération de souris chimérique au niveau de la moelle osseuse 696, des souris Cav3. 2-/- et leur littermates (WT) ont été irradiées avec une dose totale de 10 Gy (1Gy / min) par le X-RAD 320 irradiateur ARTICLE 2 (320kV, 45mAmp, Precision X-RAY Inc. Brandford-CT) à la plate-forme PAVIRMA (Clermont-Ferrand, France). Les souris ont reçues par la veine de la queue une injection intraveineuse de 100 l de DMEM avec 107 cellules de moelle osseuse extraites de souris Cav3. 2 / ou Cav3. 2-/- immédiatement après l'irradiation (Figure S2). Au cours de deux semaines après l'irradiation, l'eau de consommation des animaux a été complétée avec 2 mg / ml de néomycine. Huit semaines après la transplantation, les souris chimériques ont été utilisées pour les expériences. 10. RT-q-PCR L'ARN a été isolé en utilisant le kit RNeasy Mini (Qiagen) selon les instructions du fabricant, y compris une étape d'incubation à la DNase de 15 min. L'ARN purifié a été quantifié en mesurant l'absorbance 260 nm (A260) avec le spectrophotomètre Epoch (Biotek) et la qualité a été évaluée par l'analyse des rapports A260/A280 et A260/A230. L'intégrité des échantillons d'ARN a été confirmée par électrophorèse sur gel d'agarose 1, 5%. Avant l'analyse de PCR quantitative, 1 mg d'ARN total a été soumis à une transcription inverse avec MultiScribe transcriptase inverse (Applied Biosystems) dans un volume de 20 l, en utilisant la procédure du fournisseur. La PCR a été effectuée en utilisant un Mastercycler ep realplex (Eppendorf). Tous les échantillons ont été analysés en triple dans un volume final de 6, 3 l contenant 1, 3 l d'ADNc au 1/40e, amorces à 0, 5 M, 3 mM de MgCl2 et un mélange réactionnel de LightCycler Fast-Start SYBR Green (Roche), selon le protocole du fabricant. Avant la PCR, une étape d'activation de l'enzyme de 5 minutes a été effectuée à 95C. Le protocole de la PCR a consisté en 10 s de dénaturation à 95C, 10 s { la température d'hybridation (62C) et 10 s d'élongation à 72C pendant 60 cycles. La température d'hybridation optimale a été déterminée préliminairement par gradient PCR. Les séquences des amorces utilisées étaient les suivantes : ACACAACGTGAGCCTCTCTG (forward) et AGCAGTGTGACCAGGATTCG (reverse) pour Cav3. 2 (NM 021415. 4, 8, 240 bp) et TCCAGGCTTTGGGCATCA (forward) et CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA (reverse) pour 36B4 (NM 007475. 5, 1, 360 bp). La spécificité d'amplification a été évaluée par l'analyse des courbes de fusion et les produits de PCR ont été évalués sur un gel d'agarose à 1, 5% pour confirmer la taille des amplicons. Les amorces ont été conçues sur -des séquences d'intron adjacents pour empêcher la contamination génomique. Les quantités relatives d'ADNc de Cav3. 2 et 36B4 ont été calculées en fonction du seuil de cycle des échantillons à l'aide d'une courbe de concentration d'étalonnage construite avec une dilution en série 1/10-1/640 d'un mélange d'ADNc total. Pour chaque échantillon, la quantité relative d'ADNc Cav3. 2 a été normalisée par la quantité d'ADNc 36B4. 11. Analyses Statistiques Les données sont exprimées en moyenne SEM et analysées en utilisant le logiciel SigmaStats 3. 5. Les données ont été testées pour la normalité et l'égalité des variances. Les mesures ont été comparées par le test de Student (échantillon indépendant) ou par test de Mann-Whitney en cas de données qui ne passaient pas la loi normale ou l'égalité des variances. Les mesures multiples ont été comparées par une une ANOVA à deux voies ou par le test de Kruskal-Wallis ou Friedman en cas de données qui n'étaient pas distribuées selon une loi normale. Les comparaisons post hoc ont été réalisées par la méthode de Bonferroni. Les valeurs de p étaient considérées comme statistiquement significatives. ARTICLE 2 F. DISCUSSION / PERSPECTIVES 1. Implication des canaux Cav3. 2 dans la douleur inflammatoire L'implication des canaux Cav3. 2 dans la perception et le développement des douleurs inflammatoires a été évaluée grâce au modèle murin de douleur inflammatoire induite par injection intraplantaire d'une solution de carragénine 3%. Le modèle a été induit chez des souris invalidées pour le gène codant le canal Cav3. 2 et leurs congénères sauvages. L'hypersensibilité douloureuse inflammatoire a été évaluée par le test de von Frey à différents temps après induction de l'inflammation. Les résultats que nous avons obtenus montrent que les animaux sauvages développent les symptômes d'allodynie et d'hyperalgie tactile, suite { l'injection de carragénine, avec une acmé à 6h. Les symptômes d'hypersensibilités douloureuses sont totalement absents chez les animaux knock-out Cav3. 2 (même résultats obtenu dans le modèle CFA, Figure S1 et lors de l'administration de TTA-A2, Figure 45). Ainsi, les canaux Cav3. 2 semblent être cruciaux dans la perception douloureuse en contexte inflammatoire. Ce résultat est en accord avec la littérature qui a montré la forte implication des canaux Cav3. 2 dans la perception douloureuse aigu532, 580 et chronique neuropathique581, 582, 584. Comme pour nos résultats, l'inhibition des canaux Cav3. 2 (antisens) abolit totalement les symptômes d'hypersensibilité douloureuse associés aux douleurs neuropathiques traumatiques581, 582 et les souris invalidées pour le canal Cav3. 2 ne développent pas ces symptômes d'hypersensibilité dans le cas d'une neuropathie métabolique584. L'implication des canaux Cav3. 2 dans l'excitabilité neuronale et le relargage des neurotransmetteurs explique surement la diminution drastique de la perception douloureuse quel que soit le contexte pathologique. En effet, l'absence des canaux Cav3. 2 dans le système nerveux pourrait rendre les neurones moins excitables et moins prompt à répondre aux stimulations algogènes522, 526. Nos résultats confirment l'implication des canaux Cav3. 2 dans la perception douloureuse, ceci dans un contexte pathologique nouveau qui est l'inflammation. De ce fait, l'inhibition des canaux Cav3. 2 semble être une bonne voie pour de nouvelles thérapeutiques antidouleur. ARTICLE 2 2. Implication des canaux Cav3. 2 dans le développement œdémateux L'hypersensibilité inflammatoire est induite par les médiateurs pro-inflammatoires libérés par divers types cellulaires (cellules épithéliales, lymphocytes, macrophages) recrutés au site inflammatoire, se traduisant notamment par le développement d'un œdème. La libération de ces médiateurs pro-inflammatoires va venir sensibiliser les nocicepteurs et induire les phénomènes d'hypersensibilités douloureuses (pour revue684, 685, 697). Du fait du phénotype exhibé par les souris knock-out Cav3. 2 qui ne développent aucun des symptômes d'hypersensibilités douloureuses, nous nous sommes intéressés également aux paramètres inflammatoires (œdème et production des médiateurs pro-inflammatoires) de ces souris. Pour cela, le développement œdémateux a été évalué { différents temps après induction de l'inflammation par la carragénine. Les résultats obtenus montrent un développement œdémateux chez les animaux sauvages, avec une acmé { 6h, mais qui est diminué ( 20%) chez les animaux knock-out Cav3. 2 (mêmes résultats obtenus dans le modèle CFA, Figure S1). Suite à cette observation, la production des médiateurs inflammatoires, au niveau plasmatique et périphérique (œdème) a été évaluée. Les résultats montrent que la production des médiateurs pro-inflammatoires (il-6, il-1, TNF- et PGE2) est fortement diminuée chez les animaux knock-out Cav3. 2 en comparaison d'animaux sauvages. Ces résultats novateurs montrent pour la première fois une implication de canaux calciques voltage dépendant dans le développement œdémateux et la production des médiateurs pro- inflammatoires. Ces résultats sont en accord avec une étude plus récente ayant montré que l'inhibition des canaux sodiques voltage dépendant TTX-S par la neurotoxine anntoxine698 diminuait l'œdème et la production du médiateur pro-inflammatoire, TNF-, dans le modèle carragénine699. 3. Les canaux Cav3. 2 exprimés par les cellules immunitaires interviennent dans le développement œdémateux Les résultats précédents ont montré l'incapacité des souris knock-out Cav3. 2 à produire des médiateurs pro-inflammatoires en contexte inflammatoire. L'impact de cette insuffisance est un œdème moins important et une douleur inflammatoire réduite. Les cellules majoritairement impliquées dans la production des médiateurs pro-inflammatoires et le développement de ARTICLE 2 l'œdème au niveau périphérique sont les macrophages. Nous avons par conséquent émis l'hypothèse d'une implication des canaux Cav3. 2 dans leur activation. L'expression du canal Cav3. 2 dans les macrophages a été montrée par RT-q-PCR à partir d'ARNm de macrophages issus de la moelle osseuse. Suite à la confirmation de la présence des canaux Cav3. 2 dans les macrophages, l'évaluation de leur implication spécifique dans le développement œdémateux et la douleur inflammatoire a été étudiée. Le phénotype des animaux knock-out Cav3. 2 en contexte inflammatoire peut être dû à l'effet conjoint de leur absence au niveau neuronal (effet antinociceptif) et au niveau immunitaire (effet anti- inflammatoire). Pour répondre à cette question et évaluer la part de chacun dans ces phénomènes, une approche innovante fut choisie : la génération de souris chimériques. Les souris chimériques ont la particularité de posséder un génotype différent selon le tissu étudié. Dans notre cas, les souris chimériques expriment soit le canal Cav3. 2 uniquement au niveau des cellules immunitaires, soit dans la totalité de l'organisme { l'exception des cellules immunitaires. Ainsi, l'impact de la présence ou non des canaux Cav3. 2 spécifiquement dans les cellules immunitaires, incluant les macrophages, sur l'hypersensibilité douloureuse et le développement œdémateux a été possible. Les résultats obtenus dans le modèle carragénine nous montrent que les canaux Cav3. 2 exprimés par les cellules immunitaires sont impliqués dans le développement œdémateux et dans une moindre mesure dans l'hypersensibilité douloureuse. En effet, l'absence des canaux Cav3. 2 au niveau des cellules immunitaires réduit le développement œdémateux, { hauteur de 20%, comme observé chez les animaux knock-out Cav3. 2. De plus, la transplantation de cellules immunitaires exprimant les canaux Cav3. 2 chez des animaux knock-out Cav3. 2 restaure totalement le développement œdémateux, comme observé chez des animaux sauvages. Ainsi, nous avons démontré une implication des canaux Cav3. 2 spécifiquement exprimés par les cellules immunitaires dans le développement œdémateux. D'un point de vue douloureux, la réciproque n'est pas observée. En effet, l'absence des canaux Cav3. 2 uniquement au niveau des cellules immunitaires ne modifie pas les symptômes d'allodynie et d'hyperalgie tactiles en conditions inflammatoires. Par contre, les animaux knock-out Cav3. 2 ayant été transplantés par des cellules immunitaires exprimant le canal Cav3. 2 redéveloppent des symptômes d'allodynie et d'hyperalgie tactiles. Ces résultats pris ensemble montrent que les canaux Cav3. 2 exprimés par les cellules immunitaires participent activement au développement œdémateux et sont suffisants, mais néanmoins non primordiaux, { l'induction de l'hypersensibilité douloureuse induite par l'inflammation. ARTICLE 2 La discordance de résultats observée au niveau de l'hypersensibilité douloureuse peut s'expliquer par plusieurs points : 1) la transplantation de cellules immunitaires exprimant le canal Cav3. 2 chez l'animal knock-out Cav3. 2 est suffisante pour permettre une réaction inflammatoire adaptée et par conséquent induire les symptômes d'hypersensibilité associés ; 2) l'absence seule des canaux Cav3. 2 au niveau des cellules immunitaires n'est pas suffisante pour inhiber l'hypersensibilité douloureuse. D'autres mécanismes peuvent intervenir dans les processus inflammatoires, par exemple, le phénomène d'inflammation neurogène. En effet, l'inflammation neurogène est un processus neuronal qui intervient lors d'une inflammation. Les neurones, suite à leur activation et sensibilisation par les médiateurs pro-inflammatoires locaux, vont produire en réponse des substances algogènes telles que la substance P et le CGRP. Ces deux substances vont activer et sensibiliser les neurones aux alentours du site inflammatoire, participant ainsi aux phénomènes d'extension territoriale et d'hypersensibilité douloureuse associées { l'inflammation. L'absence de retour total de l'hypersensibilité douloureuse chez des animaux knock-out Cav3. 2 transplantés par des cellules immunitaires exprimant le canal Cav3. 2 peut s'expliquer par une absence ou une diminution du phénomène d'inflammation neurogène du fait que l'absence des canaux Cav3. 2 au niveau neuronal réduit l'excitabilité neuronale et donc leur réponse aux médiateurs pro-inflammatoires ; 3) la dissociation observée entre œdème et douleur n'est pas aberrante. En effet, le robenacoxib (inhibiteur COX-2) induit chez le rat inflammé (modèle carragénine) un effet anti-œdémateux pour des doses de 0, 3, 1, 3 et 10 mg/kg alors que les animaux n'ont pas de variations de leur état douloureux, état qui diminue seulement pour une dose 30 mg/kg700. Une autre étude a également montré une non-corrélation entre œdème et douleur chez l'animal. Cette étude montre que dans le modèle au formol chez le rat, la solution concentrée à 2, 5% de formol induit un comportement douloureux plus important que les solutions à 5 et 10% et que, a contrario, la solution à 2, 5% induit un œdème plus petit que les autres solutions701. Enfin, une troisième étude montre les mêmes observations lors de l'utilisation de chlomipramine (antidépresseur et anxiolytique)702. Néanmoins, plusieurs études restent à être effectuées pour élucider ces phénomènes. 4. Les canaux Cav3. 2 participent { l'activation des macrophages Suite { ces diverses observations (œdème et production des facteurs pro-inflammatoires diminués, expression du canal Cav3. 2 par les macrophages), nous avons émis l'hypothèse d'une ARTICLE 2 implication des canaux Cav3. 2 dans l'activation des macrophages. Pour cela, nous avons évalué l'activation macrophagique par différentes approches : 1) une approche par dosage ELISA des médiateurs pro-inflammatoires produits in vitro par des macrophages activés par le LPS ; 2) une approche immunohistochimique par étude de la morphologie ( swelling ) des macrophages activés et 3) une approche par imagerie calcique pour l'étude des influx de calcium caractéristiques d'une activation macrophagique. Les résultats obtenus montrent que dans ces trois approches, l'absence des canaux Cav3. 2 diminue drastiquement l'activation des macrophages en réponse au LPS. En effet, les macrophages knock-out Cav3. 2 produisent moins de médiateurs pro-inflammatoires, ne montrent aucune morphologie de swelling caractéristique de leur activation et enfin, ne présentent que peu d'influx calciques en réponse au LPS. Tous ces résultats réunis montrent la nécessité des canaux Cav3. 2 { l'activation des macrophages en réponse au LPS. Afin d'explorer les mécanismes impliqués dans ce phénomène, il serait intéressant d'étudier les voies intracellulaires d'activations des macrophages, dont notamment la voie principale NFB-iB, qui sont toutes dépendantes de la concentration intracellulaire en calcium. Un autre point { vérifier serait l'expression des récepteurs au LPS (récepteurs Toll Like Receptor) dans les macrophages knock-out Cav3. 2. En effet, il se pourrait que la non-réponse des macrophages face au LPS soit due { l'absence d'expression des récepteurs TLR, phénomène compensatoire dû au knock-out ou lors du développement. Il serait également intéressant de valider la nécessité du calcium { l'activation des macrophages en effectuant la même expérience d'imagerie calcique mais cette fois en milieu calcium free . Enfin, pour valider l'implication spécifique des canaux Cav3. 2 au niveau des macrophages, une étude de l'expression protéique du canal est { envisager, ainsi que l'utilisation de souris knock-out Cav3. 2 conditionnel spécifiquement au niveau des macrophages et d'observer leur comportement douloureux en contexte inflammatoire. Au final, nos résultats ont montré un important potentiel thérapeutique de l'inhibition des canaux Cav3. 2 pour le traitement de l'inflammation. 5. Ethosuximide et douleurs inflammatoires Comme énoncé précédemment, l'éthosuximide est un antiépileptique prescrit pour le traitement des épilepsies de type petit mal. Beaucoup de travaux précliniques ont démontré son ARTICLE 2 efficacité antalgique sur les douleurs neuropathiques556559, 584, 591, 703. L'éthosuximide est décrit comme un antagoniste non spécifique des canaux de type T, dont le canal Cav3. 2. Nous avons montré précédemment l'implication de ce canal dans la douleur inflammatoire et l'inflammation. De plus, aucune étude n'a évaluée son potentiel antalgique dans les douleurs chroniques inflammatoires. De ce fait, nous avons étudié l'effet antalgique et anti-inflammatoire de l'éthosuximide chez l'animal, par les mêmes techniques que précédemment (modèle inflammatoire, von Frey et prise de la taille de l'œdème). Les résultats obtenus montrent un effet anti-allodynique et anti-hyperalgique de l'éthosuximide dans 3 modèles de douleur inflammatoire : subaigu (formol), subchronique (carragénine) et chronique (CFA, voir projet 3), et ceci pour une dose non sédative. L'évaluation du développement œdémateux a également montré un effet anti-œdémateux de l'ethosuximide, plus prononcé dans le modèle carragénine. Ainsi, nous avons montré, pour la première fois, l'efficacité antinociceptive et anti- inflammatoire de l'éthosuximide. Ajouté { son effet bénéfique sur les douleurs neuropathiques, nos résultats confirment le réel potentiel thérapeutique de son utilisation clinique pour le traitement de la douleur chronique. D'un point de vue mécanistique, la spécificité d'action de l'éthosuximide sur les canaux de type T et plus particulièrement Cav3. 2, a été évaluée dans le test au formol chez des animaux knock-out Cav3. 2. Les données obtenues ont montré que l'ethosuximide perdait son effet antalgique chez ces animaux. Cela semble supposer que l'effet antalgique de l'éthosuximide passerait spécifiquement par la modulation des canaux Cav3. 2. Néanmoins, de plus amples études, dans d'autres modèles inflammatoires, sur le développement œdémateux sont { effectuer. 6. Conclusion En conclusion, nous avons démontré pour la première fois une implication des canaux Cav3. 2 dans la douleur de type inflammatoire et également dans les processus inflammatoires. Nous avons aussi mis en évidence l'efficacité antinociceptive et anti-inflammatoire de l'éthosuximide sur les douleurs inflammatoires. Nos résultats mettent en lumière l'inhibition des canaux Cav3. 2 et l'utilisation de l'éthosuximide comme une nouvelle thérapeutique potentielle dans le traitement des douleurs inflammatoires. RESULTATS ARTICLE 3 : Canaux calciques de type T et comorbidités associées à la douleur inflammatoire (En rédaction) ARTICLE 3 VIII. ARTICLE 3 : Canaux de type T et comorbidités associées à la douleur inflammatoire. A. INTRODUCTION Pour une grande partie des patients, les douleurs chroniques sont accompagnées d'anxiété et/ou de dépression qui contribuent à une détérioration de leur qualité de vie602606. En effet, la prévalence des désordres anxieux chez les patients atteints de douleur chronique s'élève de 20% à 40%, alors qu'ils ne sont que de 7% à 18% dans la population générale 607, 608. De plus, les signes de dépression chez les patients sont estimés à plus de 50%609. Ces patients douloureux présentent ainsi deux à trois fois plus de chance de développer une pathologie de cette nature610. Ainsi, une prise en charge inadaptée de la douleur peut avoir un impact négatif sur le développement de l'anxiété et de la dépression. Il est à noter également que des patients présentant des troubles anxieux auront un risque plus élevé de développer des douleurs chroniques611. Les troubles d'anxiété et de dépression sont très fréquents chez les patients douloureux chroniques en condition inflammatoire, telle que l'arthrite612, 613. De plus, les symptômes d'anxiété, associé { l'arthrite, ont été démontrés comme amplificateur de la perception douloureuse 614. Ainsi, un maintien mutuel existerait entre douleur inflammatoire chronique et anxiété615, 616. La gestion efficace de la douleur inflammatoire chronique et de ses comorbidités nécessite une combinaison de plusieurs médicaments (anti-inflammatoires non stéroïdiens, antirhumatismaux, antalgiques, anxiolytiques et antidépresseurs) pour atteindre le niveau souhaité de soulagement de la douleur et de réduction des comorbidités associées (perte de sommeil, anxiété et dépression)617619. Néanmoins, la polythérapie comporte le risque d'interactions médicamenteuses et d'effets indésirables618, 620, 621 pouvant diminuer l'efficacité de la gestion de la douleur arthritique613. Ainsi, un réel besoin d'innovation thérapeutique est nécessaire pour limiter ces polythérapies et leurs effets indésirables. Ces dernières années, de nombreux travaux se sont intéressés { l'étude des canaux ioniques dans la nociception pour répondre à cette problématique de santé publique. Récemment, une classe de canaux calciques encore peu étudiée, les canaux calciques de type T, semblent émerger comme une cible prometteuse. ARTICLE 3 Les canaux calciques de type T possèdent la particularité de s'activer pour de très faibles dépolarisations proches du potentiel membranaire de repos530. Cette capacité leur permet de jouer un rôle dans l'excitabilité neuronale. Ils sont exprimés dans la totalité du système nerveux périphérique et central635. L'isoforme Cav3. 2 est la plus exprimée au niveau des neurones des DRG de petits et moyens diamètres et des couches superficielles de la moelle épinière571, 635. Partant de ce constat, la communauté scientifique s'est intéressée à son rôle potentiel dans la nociception. Plusieurs études ont démontré le rôle important de l'isoforme Cav3. 2 dans la nociception aigu532, 580 et chronique neuropathique581, 582, 584. Actuellement, il n'existe pas d'antagoniste spécifique des canaux calcique de type T. Néanmoins, l'éthosuximide est très largement utilisé comme bloqueur non spécifique dans de nombreuses études. L'éthosuximide produit un effet antalgique chez l'animal en contexte sain704 et neuropathique556559, 591. De manière intéressante, l'éthosuximide est commercialisé en Europe en tant qu'antiépileptique pour le traitement des épilepsies de petit mal. Plusieurs antiépileptiques, comme la prégabaline et la gabapentine, sont largement utilisés dans le traitement des douleurs chroniques, comme les douleurs neuropathiques, et de leurs comorbidités associées. Pour toutes ces raisons, nous avons jugé intéressant d'analyser le phénotype des animaux knock-out Cav3. 2 et l'effet de l'éthosuximide sur les phénomènes d'anxiété et de dépression liés aux douleurs chroniques inflammatoires. B. RESULTATS Pour évaluer l'implication des canaux calciques de type T dans les comorbidités associées aux douleurs inflammatoires chroniques, nous avons en premier lieu étudié l'impact de l'inhibition du canal Cav3. 2 par invalidation génique (knock-out Cav3. 2) ou par un antagoniste spécifique (TTA-A2) sur les composantes d'anxiété et de dépression. Pour cela, trois tests évaluant l'anxiété ( elevated plus maze , open field et novelty suppress feeding (modalité anxieuse) (Figure 44) ainsi que trois évaluant la dépression ( tail suspension , forced swimming et novelty suppress feeding (modalité dépressive) (Figure 45) ont été effectués chez les animaux en contexte sain. ARTICLE 3 Figure 44 : L'inhibition des canaux Cav3. 2 induit un phénotype anxieux. Pour évaluer l'impact de l'inhibition des canaux Cav3. 2 chez des souris Cav3. 2-/- (a, c, e) ou recevant du TTA-A2 (1 mg/kg, per os, T15min) (b, d, f) sur l'anxiété, les tests elevated plus maze , open field et novelty suppress feeding (modalité anxieuse) ont été utilisés. La latence de première entrée en zone anxiogène et le temps total passé en zone anxiogène ont été évalués. a, b) elevated plus maze ; c, d) open field ; e, f) novelty suppress feeding . Les données sont représentées en moyenne SEM. *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 01 ; *, p < 0, 001, en comparaison des groupes véhicule (VEH) ou Cav3. 2 / . ARTICLE 3 Figure 45 : L'inhibition des canaux Cav3. 2 n'induit pas de phénomènes de dépression. Pour évaluer l'impact de l'absence des canaux Cav3. 2 chez des souris Cav3. 2-/- (a, c, e) ou recevant du TTA-A2 (1 mg/kg, per os, T15min) (b, d, f) sur la dépression, les tests tail suspension , forced swimming et novelty suppress feeding (modalité dépressive) ont été utilisés. La latence de première immobilisation et le temps total d'immobilité ainsi que la latence pour se nourrir ont été évaluées. a, b) Tail suspension ; c, d) forced swimming ; e, f) novelty suppress feeding . Les données sont représentées en moyenne SEM en comparaison des groupes véhicule (VEH) ou Cav3. 2 / . Les souris invalidées pour le gène codant le canal Cav3. 2 ne montrent aucune différence concernant la locomotion, les réflexes moteurs ou la force musculaire par rapport à des souris sauvages (Figure supplémentaire S1). Ces résultats sont importants puisqu'en cas d'atteinte locomotrice ou musculaire ou de la réactivité, les tests évaluant l'anxiété ou la dépression (basés sur une réaction locomotrice) n'auraient pas pu être possibles. Les tests évaluant l'anxiété ont montré que les souris Cav3. 2-/-, ou recevant du TTA-A2, développaient une anxiété par rapport aux souris sauvages ou recevant du véhicule (Figures 44). A contrario, concernant la dépression, les animaux Cav3. 2-/- ou recevant du TTA-A2 n'ont pas montré de différence par rapport aux animaux sauvages ou recevant du véhicule (Figures 45). Les animaux Cav3. 2-/- présentent ainsi un phénotype anxieux et non dépressif. Ceci est un résultat innovant puisque aucune donnée dans la littérature n'avait encore montré ce phénotype. ARTICLE 3 Figure 46 : L'éthosuximide induit un effet anxiolytique chez l'animal sain. Pour évaluer l'impact de l'éthosuximide (ETH, 200 mg/kg, i. p. , T30min) sur l'anxiété, les tests elevated plus maze , open field et novelty suppress feeding (modalité anxieuse) ont été utilisés. La latence de première entrée en zone anxiogène et le temps total passé en zone anxiogène ont été évalués. a, b) elevated plus maze ; c, d) open field ; e, f) novelty suppress feeding . Les données sont représentées en moyenne SEM. *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 001, en comparaison des groupes véhicule (VEH). Par la suite, nous avons également évalué l'effet de l'éthosuximide cette fois en contexte sain et inflammatoire (modèle CFA). Cela nous a permis de caractériser l'impact de l'éthosuximide sur le développement de l'anxiété et la dépression, suite { une douleur chronique inflammatoire chez l'animal. Pour répondre { cette question, les mêmes tests évaluant l'anxiété (Figures 46 et 49) et la dépression (Figure 47) ont été utilisés en contexte sain (Figures 46 et 47) et inflammatoire (Figure 49). Parallèlement, nous avons également étudié l'effet antalgique de l'éthosuximide sur la douleur inflammatoire (Figure 48). Figure 47 : L'éthosuximide induit un effet antidépresseur chez l'animal sain. Pour évaluer l'impact de l'éthosuximide (ETH, 200 mg/kg, i. p. , T30min) sur la dépression, les tests tail suspension , forced swimming et novelty suppress feeding (modalité dépressive) ont été utilisés. La latence de première immobilisation et le temps total d'immobilité ainsi que la latence pour se nourrir ont été évaluées. a) Tail suspension ; b) forced swimming ; c) novelty suppress feeding . Les données sont représentées en moyenne SEM. *, p < 0, 05, en comparaison des groupes véhicule (VEH). ARTICLE 3 Figure 48 : L'éthosuximide induit un effet anti- allodynique et anti-hyperalgique en contexte inflammatoire. Pour évaluer l'impact de l'éthosuximide (ETH, 200 mg/kg, i. p. , T30min) sur la douleur inflammatoire (modèle CFA, 14 jours après injection péri-articulaire de CFA), le test de von Frey a été utilisé pour évaluer les symptômes d'allodynie (filament de 0, 04 g) et d'hyperalgie (filament de 1, 4 g). Les scores de réponses douloureuses suite aux 5 stimulations mécaniques, pour chaque filament, ont été évalués. Les données sont représentées en moyenne SEM. *, p < 0, 05, en comparaison des groupes véhicule (VEH). Figure 49 : L'éthosuximide induit un effet anxiolytique chez l'animal en contexte inflammatoire. Pour évaluer l'impact de l'éthosuximide (ETH, 200 mg/kg, i. p. , T30min) sur l'anxiété développée lors d'une douleur chronique inflammatoire (modèle CFA, 14 jours après injection péri-articulaire de CFA), les tests elevated plus maze , open field et novelty suppress feeding (modalité anxieuse) ont été utilisés. La latence de première entrée en zone anxiogène et le temps total passé en zone anxiogène ont été évalués. a, b) elevated plus maze ; c, d) open field ; e) novelty suppress feeding . Les données sont représentées en moyenne SEM. *, p < 0, 05 ; *, p < 0, 001, en comparaison des groupes véhicule ; $, p < 0, 01, en comparaison des groupes respectifs avant CFA. ARTICLE 3 Les résultats obtenus montrent que l'éthosuximide, contrairement au souris Cav3. 2-/- ou recevant du TTA-A2, induit un effet anxiolytique et antidépresseur que ce soit en contexte sain ou inflammatoire. L'éthosuximide produit également un effet anti-allodynique et anti-hyperalgique lors d'une inflammation chronique (modèle CFA). Les résultats suggèrent que l'éthosuximide agit comme un antalgique, un anxiolytique et un antidépresseur en condition de douleur inflammatoire chronique, ce qui appuis d'autant plus son potentiel thérapeutique dans ce type de douleur. C. MATERIELS ET METHODES 1. Animaux Les animaux utilisés pour les expérimentations sont des souris de souche C57BL/6 invalidées pour le gène codant le canal calcique Cav3. 2 (Cav3. 2-/-), initialement générées par Chen et ses collaborateurs (Chen et coll. , 2003) et leurs littermates sauvages (Cav3. 2 / ). Ce sont des mâles pesant de 25 à 30 g, stabulés dans l'Unité de Stabulation Animale des facultés de Médecine et de Pharmacie, animalerie EOPS (Exempt d'Organisme Pathogène Spécifique). Les paramètres environnementaux de la salle de stabulation sont contrôlés (température : 22 2C, hydrométrie : 50% et éclairage cyclique jour/nuit : 12 heures). Les souris ont un accès libre { l'eau ainsi qu'{ la nourriture. L'expérimentation animale est pratiquée selon la législation européenne (Directives du Conseil de l'Europe 86/6669/EEC du 24 novembre 1986) et selon les recommandations éthiques pour l'expérimentation animale de l'IASP. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale-Auvergne (CEMEA-Auvergne). 2. Produits L'éthosuximide (SigmaAldrich, France), administré par voie intrapéritonéale (i. p. ) à la concentration de 200 mg/kg, est reconstitué dans une solution aqueuse de sérum physiologique (NaCl 0, 9%). L'adjuvant complet de Freund (CFA) est constitué de mycobacterium butyricum (DIFCO Laboratories) dissout dans de l'huile de paraffine et dans du sérum physiologique (NaCl 0, 9 %). La solution est autoclavée 20 minutes à 120C. 3. Comportements a. Modèle monoarthrite (CFA) Cinq microlitres d'adjuvant complet de Freund (CFA, Difco Laboratories, Detroit, Etats-Unis)640 ont été injectés au niveau des deux côtés de l'articulation de la cheville gauche de la souris sous anesthésie brève (halothane/N2O/O2). Les seuils de retrait de patte suite à une stimulation thermique et mécanique ont été déterminés avant et 14 jours après l'injection de CFA ou de véhicule. ARTICLE 3 b. Test de von Frey Les souris ont été placées dans des compartiments individuels sur le dessus d'une surface grillagée et ensuite laissées en acclimatation pendant une heure avant le test. Les seuils de douleur ont été évalués par le filament von Frey calibré à 1, 4 g (Bioseb, France). Ce dernier a été pressé perpendiculairement cinq fois contre le milieu patte et maintenu pendant 3 secondes. Une réponse douloureuse a été notée seulement quand la patte est retirée ou léchée et un score de réponse à la douleur (0-5) est déterminé. c. Grip test Un indicateur de force avec une grille métallique carrée spécifique de souris (Bioseb, France) (6 6 cm) a été utilisé pour mesurer la force de préhension des membres antérieurs, semblable à Rafael et coll. 2000705. Brièvement, les souris ont été soigneusement placées à l'avant de la grille métallique et laissées s'agripper avec les deux pattes de devant. Une fois la prise créée, la force de grip maximum a été enregistré (en grammes). Pour chaque animal, 3 mesures (1 min d'intervalle) ont été prises pour obtenir une valeur moyenne de la force maximale de préhension. d. Rotarod Ce test permet d'évaluer la coordination motrice et l'équilibre de l'animal. L'appareil (Bioseb) comporte un cylindre de 3 cm de diamètre. La latence entre le moment o l'animal est placé sur le cylindre et le moment o il tombe du cylindre est mesurée grâce à un système de bascule qui est actionné lorsque l'animal tombe du cylindre et stoppe le chronomètre. Ce test comporte une phase de conditionnement/apprentissage précédant le test. Cette phase comporte 3 étapes : 1 minute sur le cylindre arrêté ; 10 minutes de repos, une minute sur le cylindre avec une rotation de 4 RPM ; 10 minutes de repos et une minute sur le cylindre avec une rotation de 4 RPM. Trente minutes après la phase de conditionnement, le test débute : l'animal est déposé sur le cylindre en rotation de 4 RPM et qui accélère progressivement jusqu'{ un maximum de 50 RPM ( 1 RPM toutes les 8 secondes). La durée maximale de l'essai est de 5 minutes. Le deuxième essai est effectué 30 minutes après le premier. La moyenne des 2 temps passés sur le cylindre pour les 2 essais est réalisée. e. Open field Le test se compose d'une arène en plastique opaque (46 x 46 x 35 cm) située dans une pièce éclairée de façon homogène. Cette arène est subdivisée en 2 grandes zones virtuelles : le centre (anxiogène) et la périphérie (non anxiogène). Le temps passé au centre de l'arène est caractéristique de l'anxiété des animaux. L'animal est placé, seul, dans un angle de l'arène durant une période de 15 minutes. Les déplacements de l'animal sont enregistrés par une caméra et le temps passé dans chaque zone est déterminé grâce au logiciel Ethovision (Noldus). f. Elevated plus maze L'appareil est constitué de 2 bras ouverts (sans paroi latérale, zone anxiogène) (38 x 6 cm) et de 2 bras fermés (parois latérales de 17 cm de hauteur, zone non anxiogène) perpendiculaires reliés par une plateforme centrale (6 x 6 cm), le tout surélevé par rapport au sol (50 cm). Le test s'effectue dans une pièce éclairée de façon homogène. Le temps passé dans les bras ouverts est caractéristique de l'anxiété des animaux. L'animal est placé seul au centre du labyrinthe la tête en direction d'un bras fermé durant une ARTICLE 3 période de 5 minutes. Une caméra filme les déplacements de l'animal et le temps passé dans chaque bras est déterminé par le logiciel Ethovision (Noldus). g. Tail suspension test Les animaux sont suspendus par le milieu de la queue par un fil. La latence de première immobilisation ainsi que le temps total d'immobilité sont chronométrés durant 5 minutes. Une latence de première immobilité courte et un temps d'immobilité long sont témoins d'un état dépressif. h. Forced swimming test L'animal est placé dans un bécher de 16 cm de diamètre et 25 cm de profondeur rempli avec 10 cm d'eau tiède (22-25C) pendant 6 minutes. La latence de première immobilisation ainsi que le temps total d'immobilité sont chronométrés. Une latence de première immobilité courte et un temps d'immobilité long sont témoins d'un état dépressif. i. Novelty suppress feedeing test Ce test induit une situation de motivations conflictuelles chez l'animal, entre celle de se nourrir et la peur de s'aventurer au centre de l'arène fortement éclairé (zone anxiogène). L'animal, privé de nourriture depuis 24 heures, est placé au début de l'expérimentation dans un coin d'une arène de 46 x46 cm face contre la paroi pendant une période de 5 minutes. Au centre de cette arène est placé un ramequin rempli de nourriture qui est éclairé par une lumière forte. Les temps mis par l'animal pour aller manger (paramètre évaluant la dépression) et aller au centre de l'arène (paramètre évaluant l'anxiété) sont mesurés. 4. Analyses Statistiques Les données sont exprimées en moyenne SEM et analysées en utilisant le logiciel SigmaStats 3. 5. Les données ont été testées pour la normalité et l'égalité des variances. Les mesures ont été comparées par le test de Student (échantillon indépendant) ou par test de Mann-Whitney en cas de données qui ne passaient pas la loi normale ou l'égalité des variances. Les mesures multiples ont été comparées par une une ANOVA à deux voies ou par le test de Kruskal-Wallis ou Friedman en cas de données qui n'étaient pas distribuées selon une loi normale. Les comparaisons post hoc ont été réalisées par la méthode de Bonferroni. Les valeurs de p étaient considérées comme statistiquement significatives. ARTICLE 3 D. INFORMATIONS SUPPLEMENTAIRES Figure S1 : Les animaux knock-out Cav3. 2 ne présentent pas de phénotype anormal. La locomotion et les fonctions réflexes et autonomes ont été évaluées respectivement par le test du (a) rotarod, (b) touch escape response et (c) du grip test. E. DISCUSSION / PERSPECTIVES Les patients souffrant de douleurs chroniques subissent une altération de leur qualité de vie et sont sujets { des comorbidités telles que l'anxiété ou la dépression602606. Malgré le fait que de nombreux symptômes liés { l'anxiété et la dépression chez l'Homme ne soit pas reproductible chez l'animal, de nombreux tests comportementaux sont efficaces dans la prédiction des activités anxiolytique et antidépressive des drogues. Nous avons ici utilisé six de ces tests pour évaluer l'impact de l'inhibition des canaux calciques de type T dans l'anxiété et la dépression, engendrées par une douleur chronique inflammatoire. 1. Implication du canal Cav3. 2 dans l'anxiété et la dépression en contexte sain Les phénomènes d'anxiété et de dépression font intervenir de nombreux systèmes : moteur, sensoriel, immunitaire, cardiovasculaire et bien entendu neuronal. Ceci rend d'autant plus complexe la compréhension des mécanismes mis en jeu dans ces phénomènes. D'un point de vue neuronal, de nombreuses structures cérébrales ont été démontrées comme participant à la modulation de l'anxiété et de la dépression. Les principales structures sont l'amygdale, l'hypothalamus, le cortex préfrontal et frontal, le thalamus, le cortex cingulaire, le noyau ARTICLE 3 accumbens, le septum latéral, la PAG et l'hypothalamus médian (pour revue706). Les voies neuronales impliquées dans ces structures et participant { la modulation de l'anxiété et de la dépression sont multiples. Néanmoins, il existe 3 voies principales : GABAergique, monoaminergique et sérotoninergique (pour revue706). Les canaux calciques voltages dépendant { haut seuil d'activation sont connus pour être exprimés dans les structures précédemment citées, o ils participent à la modulation des voies neuronales GABAergiques, monoaminergiques et sérotoninergiques707713. Ces résultats ont été corrélés in vivo par l'action anxiolytique des inhibiteurs calciques, tels que la prégabaline et la gabapentine chez l'Homme714716. Peu d'études se sont intéressées aux canaux calciques de type T dans les phénomènes d'anxiété et de dépression. Pourtant, ils sont largement exprimés dans les structures cérébrales impliquées635. De plus, deux études ont démontré un lien entre dépression717, réponse au stress718 et canaux calciques de type T. Le manque d'information sur l'implication des canaux de type T et plus spécifiquement des canaux Cav3. 2 dans la modulation de l'anxiété et de la dépression nous ont poussé { réaliser cette étude. Les premiers résultats que nous avons obtenu montrent que les souris invalidées pour le gène codant le canal Cav3. 2 ou recevant du TTA-A2 (antagoniste Cav3. 2) présentent une forte anxiété en comparaison de leurs congénères sauvages ou recevant du véhicule. Ces données confirment pour la première fois, d'un point de vue comportemental, l'implication des canaux de type T (Cav3. 2) dans la modulation de l'anxiété. A contrario, aucun effet sur la dépression n'a été observé. De plus amples études restent néanmoins à être effectuées pour démêler les mécanismes mettant en jeu les canaux Cav3. 2 dans les phénomènes d'anxiété. Nous savons, suite { l'étude de Talley et coll. 635, que les canaux Cav3. 2 sont exprimés dans de nombreuses structures impliquées dans la modulation de l'anxiété. Il serait intéressant de valider, d'un point de vue protéique, l'expression du canal Cav3. 2 (souris Cav3. 2-GFP) dans ces différentes zones. De plus, deux études ont montré une implication des canaux Cav3. 2 dans la transmission GABAergique au niveau spinal538, 719. Par conséquent, l'étude de la modulation des voies neuronales supraspinales (GABAergiques, monoaminergiques, sérotoninergiques), impliqués dans la modulation de l'anxiété, suite à un stress chez les animaux knock-out Cav3. 2 en comparaison à des animaux sauvages semblent être une voie intéressante pour répondre aux mécanismes neuronaux mettant en jeu les canaux Cav3. 2 dans l'anxiété. ARTICLE 3 2. Effet anxiolytique et antidépresseur de l'éthosuximide en contexte inflammatoire Les antiépileptiques, tels que la prégabaline et la gabapentine, sont décrit comme possédant un effet antalgique en contexte de douleurs chroniques et un effet bénéfique sur les comorbidités (anxiété, dépression) associées. L'éthosuximide, un antiépileptique ne possédant pas le même mécanisme d'action que la prégabaline et la gabapentine, n'a fait l'œuvre d'aucune étude sur son potentiel antinociceptif, anxiolytique et antidépresseur dans le cadre des douleurs chroniques inflammatoires. Pour cela, nous avons étudié l'effet de l'éthosuximide sur l'anxiété et la dépression associées à une douleur inflammatoire chronique, grâce au modèle de monoarthrite induit par l'injection péri-articulaire de CFA. Ce modèle possède l'avantage de présenter une douleur inflammatoire chronique et de développer des symptômes relatifs à l'anxiété et la dépression720. Uniquement la stratégie pharmacologique a été appliquée ici puisque les animaux invalidés pour le gène codant le canal calcique Cav3. 2 ne développent aucune douleur inflammatoire et donc aucun symptôme associé (voir projet 2). L'évaluation de l'anxiété et de la dépression par différents tests a montré un effet anxiolytique et antidépresseur de l'éthosuximide en contexte sain (Figures 46 et 47) et anxiolytique en contexte inflammatoire (Figures 49). De plus, l'éthosuximide induit un effet anti- allodynique et anti-hyperalgique dans le modèle CFA. Ces résultats démontrent que l'éthosuximide, comme d'autres antiépileptiques, est capable d'induire non seulement un effet antalgique mais également anxiolytique et antidépresseur en contexte douloureux. Cela rend l'éthosuximide très intéressant pour le traitement des douleurs chroniques et les comorbidités associées. De plus, plusieurs études ont démontré l'effet antinociceptif de l'éthosuximide en contexte neuropathique556559, 591. Ainsi, pour compléter et confirmer ces résultats, l'étude de l'effet anxiolytique et antidépresseur de l'éthosuximide sur les douleurs neuropathiques reste { être effectuée. Cependant, l'inhibition pharmacologique des canaux calciques de type T par l'éthosuximide entrane sur l'anxiété un effet opposé { celui observé avec les animaux knock-out Cav3. 2 ou recevant du TTA-A2. Ces différences peuvent s'expliquer par les phénomènes de compensation qui se mettent en place lors d'une inactivation génétique. En effet, des modifications se traduisant par l'augmentation ou la diminution de l'expression d'autres gènes durant le développement embryonnaire peuvent être observé et par conséquent faire varier le comportement ou la physiologie de l'animal. Par exemple, dans le cas des souris knock-out Cav3. 2, ARTICLE 3 une compensation par les membres Cav3. 1 et Cav3. 3 peut être envisagée. Un autre point, plus facile à vérifier, pouvant expliquer les résultats discordants est la non spécificité de l'éthosuximide vis-à-vis du canal Cav3. 2. En effet, l'éthosuximide est présenté comme un inhibiteur non spécifique des canaux calcique de type T. Ainsi, l'éthosuximide peut potentiellement agir sur les deux autres membres des canaux de type T : Cav3. 1 et Cav3. 3. En effet, l'éthosuximide possède une IC50 de 3 mol/l et de 51 mol/l respectivement pour Cav3. 1 et Cav3. 3 alors qu'elle est de 23, 7 mol/l pour Cav3. 2635, 721. De plus, les canaux Cav3. 1 sont les canaux de type T prédominants dans les neurones thalamiques635, et sont proposés comme cible thérapeutique de l'éthosuximide dans le traitement des crises d'épilepsies de petit mal631, 722. Pour valider cette hypothèse, l'effet sur l'anxiété de l'éthosuximide doit être évalué chez les animaux knock-out Cav3. 2. Enfin, si l'on s'intéresse un peu plus en détail { l'étude de Talley et coll. 635, on s'aperçois que l'expression des canaux de type T varie dans les structures cérébrales selon le membre étudié. Ainsi, dans les zones cérébrales impliquées dans l'anxiété, le canal Cav3. 1 est majoritairement plus exprimé que les autres membres (Cav3. 2 et Cav3. 3) (Tableau 5). Ceci pourrait expliquer l'effet opposé de l'éthosuximide, qui pourrait mobiliser le canal Cav3. 1 dans son effet anxiolytique. Le phénotypage des souris knock-out Cav3. 1 et l'effet de l'éthosuximide, chez ces souris, sur la dépression et l'anxiété serait une bonne piste pour y répondre. Enfin, comme pour les souris knock-out Cav3. 2, l'étude des mécanismes mis en jeu dans l'effet anxiolytique et antidépresseur de l'éthosuximide en contexte de douleurs chroniques, pourrait être évalué par l'étude de la modulation des voies neuronales impliquées dans ces phénomènes (GABAergique, monoaminergique, sérotoninergique) ainsi que par l'étude, par exemple, de la neurogénèse hyppocampique dans un contexte dépressif723, comme cela a été fait pour le canal potassique Trek-1724. Tableau 5 : Tableau représentatif de l'expression des canaux de type T dans les zones cérébrales impliquées dans l'anxiété et la dépression. très forte expression ; forte expression ; expression modéré ; faible expression ; - pas d'expression. D'après Talley et coll. 1999. ARTICLE 3 Il faut noter également que l'anxiété et la dépression ne sont pas les seuls symptômes de comorbidités, la dégradation de la qualité du sommeil en fait également partie et tiens une part importante dans la dégradation de la qualité de vie des patients. L'étude de l'efficacité de l'éthosuximide sur la qualité du sommeil est à envisager. 3. Conclusion Notre étude a démontré pour la première fois le potentiel thérapeutique de l'éthosuximide dans le traitement des comorbidités (anxiété et dépression) associées aux douleurs chroniques inflammatoires. PROJECT CLINIQUE : EDONOT PROJET CLINIQUE EDONOT : Ethosuximide et DOuleur Neuropathique d'Origine Traumatique PROJECT CLINIQUE : EDONOT IX. PROJET CLINIQUE EDONOT : Ethosuximide et DOuleur Neuropathique d'Origine Traumatique Evaluation de l'efficacité de l'éthosuximide dans le traitement de douleurs neuropathiques d'origine traumatique Essai thérapeutique pilote, multicentrique, randomisé, en double aveugle, contrôlé versus homéopathie Titre abrégé : EDONOT Version : 1 en date du : Code promoteur : N EudraCT ou n d'enregistrement ANSM : PROMOTEUR : C. H. U. de Clermont-Ferrand 58 Rue de Montalembert, 63003 Clermont-Ferrand Investigateur coordonnateur : Pr Claude DUBRAY CPC / CIC - Inserm 501 CHU Gabriel-Montpied, 63000 Clermont-Ferrand claude. dubray@udamail. fr 04 73 17 84 12 Co-Investigateurs : Pr. Alain ESCHALIER Dr. Christian DUALE UMR INSERM / UdA 1107 NEURO-DOL CPC - CIC / Inserm-501 - Bât3C CHU Gabriel-Montpied, Service de Pharmacologie- UMR INSERM / UdA 1107 NEURO-DOL Toxicologie 63000 Clermont-Ferrand CHU Gabriel-Montpied, 63000 Clermont-Ferrand Dr. Pascale PICARD Dr. Jean-Bernard CAILLET CETD, CHU Gabriel-Montpied, 63000 Clermont-Ferrand CETD, Hôpital Neurologique, 69500 Bron Dr. Laurent BALP Dr. Gérard MICK Centre Hospitalier, 39016 Lons Le Saunier Centre Hospitalier, 38506 Voiron Dr. Eric SALVAT Dr. Julien NIZARD CETD, Hôpital Civil, 67091 Strasbourg CETD, Hôpital Lannec, 44093 Nantes Méthodologiste / Statisticien : Collaborateurs scientifiques : Chouki CHENAF / Dr. Christophe MALLET / Nicolas KERCKHOVE/ Dr. Frédéric LIBERT / Dr. Damien Bruno PEREIRA RICHARD DRCI, CHU de Clermont-Ferrand UMR Inserm / UdA 1107 NEURO-DOL 63000 Clermont-Ferrand CHU Gabriel-Montpied, Service de Pharmacologie 63000 Clermont-Ferrand Lieux de réalisation de l'étude : CPC / CIC - Inserm-501 / CETD Clermont-Ferrand, Bron, Voiron, Nantes, Strasbourg, Lons Le Saunier PROJECT CLINIQUE : EDONOT A. RESUME TITRE DE L'ÉTUDE : Évaluation de l'efficacité de l'éthosuximide dans le traitement des douleurs neuropathiques d'origine traumatique. Etude pilote, multicentrique, randomisée, en double aveugle, contrôlée versus homéopathie. CONTEXTE : La douleur demeure le symptôme le plus délétère pour les patients souffrant de syndrome douloureux neuropathique. Un pourcentage important de ces patients déclarent n'avoir que peu ou pas de soulagement avec les antalgiques courants, spécifiques ou non à la douleur neuropathique. BUT DE L'ÉTUDE : Evaluer l'efficacité antalgique et sur la qualité de vie de l'éthosuximide, ajouté au traitement de fond, chez des patients douloureux neuropathiques d'origine traumatique. DESCRIPTION DE L'ÉTUDE : Essai thérapeutique pilote multicentrique évaluant l'efficacité de l'éthosuximide chez les patients douloureux neuropathiques. Ils seront traités pendant 42 jours soit par l'éthosuximide soit par le sirop homéopathique inactif sur la douleur. NOMBRE DE CENTRES : 6 centres investigateurs dont 1 centre coordonnateur Centres investigateurs : CPC / CIC Inserm-501 / CETD de Clermont-Ferrand ; CETD de Bron ; CETD de Voiron ; CETD de Lons Le Saunier ; CETD de Strasbourg, CETD de Nantes Centre coordinateur : CPC / CIC Inserm-501 / CETD de Clermont-Ferrand OBJECTIFS DE L'ÉTUDE : Objectif principal : Evaluation de l'efficacité antalgique de l'éthosuximide chez des patients douloureux neuropathiques d'origine traumatique. PROJECT CLINIQUE : EDONOT Objectifs secondaires : Impact de l'éthosuximide sur la douleur neuropathique, la qualité de vie, l'endormissement, le sommeil et de l'impression globale des patients vis-à-vis du traitement. CRITÈRES D'ÉVALUATION : Critère principal : Différence () entre la moyenne de l'intensité douloureuse médiane évaluée quotidiennement par une ENS lors des 7 derniers jours précédant le début de l'étude (J0) et la visite de fin d'étude (J 42) : score ENS (J0) score ENS (J 42) Critères secondaires : - Evaluation quotidienne de la douleur moyenne et maximale ressentie par ENS, - Evaluation de la douleur neuropathique par les questionnaires QEDN et QCD, - Evaluation de la qualité de vie des patients par le questionnaire MOS-SF 12, - Evaluation de la qualité de sommeil par le questionnaire de Leeds, - Evaluation quotidienne de la qualité du sommeil et d'endormissement par ENS, - Evaluation de l'impression globale des patients sur le traitement par le questionnaire PGIC. CRITÈRES D'INCLUSION : Age 18 ans, Neuropathie traumatique ou post-chirurgicale hors amputations avec DN4 4 et critères IASP positifs, ENS Douleur 4, ALAT, ASAT, PAL, GGT normale, créatinine hématocrite > 38%, Patients affiliés au régime de la Sécurité Sociale française, Patients dont le consentement libre et éclairé a été recueilli. CRITÈRES DE NON INCLUSION : Grossesse ou allaitement, Neuropathie diabétique, post-zostérienne, cancéreuse ou chimio-induite, Patients avec une intolérance au glucose, Antécédents médicaux et chirurgicaux incompatibles avec l'étude, Antécédents de maladies rénales, hépatiques, Dépendance { l'alcool et/ou aux stupéfiants, PROJECT CLINIQUE : EDONOT Prise d'antiépileptiques de la famille des carboxamides, et éthosuximide Usage de millepertuis, Allergie aux succinimides (éthosuximide, méthsuximide, phensuximide), Troubles psychotiques, Patients épileptiques, Patients en période d'exclusion, ou total d'indemnités autorisées dépassé, Patients bénéficiant d'une mesure de protection légale (curatelle, tutelle). NOMBRE DE SUJETS NÉCESSAIRE : Le nombre de sujets nécessaire sera de 200 patients avec une puissance de 80% ( 0, 05 bilatérale ; 0, 20, 1, 0 ; 2, 5) et considérant les sorties d'étude { hauteur d'environ 10%, nous prévoyons de présélectionner 220patients628, 725, soit 110 patients par groupe. DÉROULEMENT DE L'ÉTUDE : Recrutement Les patients suivis dans leur centre référent pour le traitement de la douleur sont sélectionnés par les médecins du centre. Le médecin investigateur les contactera afin de leur présenter le but de l'étude et prendre rendez-vous pour l'inclusion. Visite d'Inclusion (J-6) - Accueil au centre investigateur par l'investigateur, - Explications de l'étude (objectifs, organisation, contraintes, questionnaires), - Signature du consentement, - Examen clinique pour évaluation de la douleur neuropathique DN4 et critères IASP 2011 positifs, - Prélèvement sanguin (NFS, ALAT, ASAT, PAL, GGT, créatinine, -HCG), - Remplissage des questionnaires (Leeds, MOS SF-12, QEDN, QCD, DN4), - Remise du traitement et des documents annexes (carnet de suivi, EIG) Début d'étude (J0) - Sept jours plus tard (J0), appel du patient pour quantifier l'intensité moyenne de sa douleur ressentie au cours des 7 derniers jours { l'aide d'une échelle numérique simple (ENS). - Inclusion ou non et rappel des détails de l'étude. - Randomisation PROJECT CLINIQUE : EDONOT Période de J0 à J 42 : Ambulatoire à domicile - Prise du traitement (2 prises journalières pendant les repas) selon posologie croissante, - Remplissage quotidien du carnet de suivi (douleur, endormissement/sommeil et EI), - Appel téléphonique tous les 4 jours par l'ARC rattaché au projet pour recueille des EI, et rappel de la posologie. Visite de suivi { J 42 et fin d'étude - Accueil du patient au centre investigateur par l'ARC, - Restitution des unités thérapeutiques vides et non finies, - Entretien avec l'investigateur et restitution du carnet de suivi, - Evaluation de la douleur moyenne au cours des 7 derniers jours par ENS et examen clinique, - Remplissage des questionnaires (QEDN, QCD, MOS SF-12, Leeds et PGIC), - Prélèvement sanguin pour dosage de l'éthosuximide, - Fin de l'étude. B. RATIONNEL DE L'ETUDE / JUSTIFICATION SCIENTIFIQUE 1. Dernier état des connaissances scientifiques Introduction Actuellement, il est établi que les canaux calciques dépendant du voltage modulent la perception douloureuse du fait d'une influence sur la transmission et l'excitabilité neuronales. Dans le passé, l'attention s'est portée sur la modulation des canaux calciques { haut seuil d'activation. Plus récemment, un intérêt scientifique s'est révélé vis-à-vis des canaux { bas seuils d'activation dits canaux de type T. Les données de la littérature démontrent une implication importante de ces canaux dans la physiologie de la nociception. Les traitements antalgiques disponibles restent inefficaces chez certains patients présentant des douleurs chroniques (neuropathiques, inflammatoires) et induisent souvent des effets indésirables délétères. Ainsi, l'utilisation clinique d'inhibiteurs sélectifs des canaux de type T pourrait non seulement aider au développement de nouvelles thérapies pour le traitement des douleurs neuropathique, dont la prévalence est estimée à 5-8%726732 , mais également avoir un impact pharmaco-économique du fait du PROJECT CLINIQUE : EDONOT faible prix de vente de leur inhibiteur actuellement disponible, le Zarontin (7, 52 Euros pour 200 ml de sirop à 250 mg / 5 ml). Canaux de type T et douleur Les canaux calciques dépendant du voltage sont classés en deux grandes familles sur la base du potentiel de membrane470 : les canaux { haut seuil d'activation et les canaux { bas seuil d'activation. Le clonage de la sous-unité alpha-1 des canaux de type T a démontré l'existence d'au moins 3 sous-types : alpha-1G (Cav3. 1)518, alpha-1H (Cav3. 2)519 et alpha-1I (Cav3. 3)520. Ces canaux calciques possèdent une unique propriété en termes d'excitabilité neuronale526, 690. Les canaux de type T peuvent être activés par une faible dépolarisation de la membrane cellulaire. Au niveau des neurones, cette capacité leur confère une implication dans différents processus neurophysiologiques : initiation de bouffées de potentiels d'action, entrée intracellulaire de calcium, libération de neurotransmetteurs, amplification des faibles signaux dendritiques. Plusieurs études in vitro et in vivo ont identifié diverses fonctions des canaux de type T, notamment leur implication dans la nociception, ainsi que la contribution de ces canaux dans le développement des douleurs aigus et neuropathiques581, 703. L'inhibition de ces canaux par diverses stratégies expérimentales (génétique et pharmacologique) induit un effet antalgique pour différents types de modalités douloureuses et dans divers contextes pathologiques, les composés utilisés pour étudier les canaux de type T étant l'éthosuximide722et le mibéfradil733. Actuellement, seul l'éthosuximide est utilisé en clinique, dont l'indication thérapeutique est le traitement des épilepsies de type Petit Mal Absences. 2. Etat des lieux des connaissances sur l'expérimentation préclinique Ethosuximide et douleurs neuropathiques L'éthosuximide est utilisé en clinique dans le cadre du traitement des épilepsies de type Petit Mal Absences, mais, à ce jour, ne possède pas d'indication dans le traitement de la douleur. Considérant le rôle des canaux calciques de type T, plusieurs études se sont intéressées { l'effet de l'éthosuximide sur la douleur, notamment la douleur neuropathique. Ainsi, plusieurs études précliniques ont montré que cette molécule produisait un effet antalgique important et réduisait les symptômes douloureux liés { ce type de douleur suggérant l'importance des canaux de type T dans l'initiation et le maintien de la douleur neuropathique. PROJECT CLINIQUE : EDONOT Neuropathies traumatiques L'éthosuximide possède une propriété antalgique modérée chez des rats sains634 mais supprime complètement les symptômes douloureux de type neuropathique induits par ligature du nerf sciatique chez le rat557. Dans le modèle animal de neuropathie traumatique induite par ligature du nerf spinal, Dogrul et coll. ont démontré que l'injection systémique d'éthosuximide supprimait également les symptômes douloureux de type neuropathique chez le rat557. Neuropathie chimio-induite (par agent anticancéreux) De nombreux médicaments cytotoxiques sont susceptibles d'induire des douleurs neuropathiques, ce qui limite leur utilisation en chimiothérapie anticancéreuse. Flatters et Bennett ont montré que l'injection systémique d'éthosuximide soulageait l'allodynie mécanique et thermique au froid chez des rats ayant reçu un traitement par anticancéreux (paclitaxel ou vincristine)556. Des résultats similaires ont été constatés dans le modèle de neuropathie induit par l'oxaliplatine 559. De plus, l'utilisation chronique d'éthosuximide dans ce type de modèle n'induit pas de phénomène de tolérance. Neuropathie diabétique Actuellement, aucune étude préclinique n'a évalué le bénéfice potentiel de l'utilisation de l'éthosuximide dans le cadre de la neuropathie diabétique, modèle de référence des essais cliniques. En revanche, deux études précliniques ont montré une relation entre canaux de type T (Cav3. 2) et neuropathie diabétique. En effet, les animaux knock-out pour Cav3. 2584ou recevant des RNA antisens anti-Cav3. 2582ne développent pas d'allodynie ni d'hyperalgie induite par une neuropathie diabétique. Synthèse Ainsi, les bloqueurs des canaux de type T possèdent un intérêt majeur pour le développement de nouveaux traitements symptomatiques de la douleur neuropathique. Il est particulièrement intéressant de noter qu'en Europe, ce type de médicament est disponible sur le marché et qu'il est assorti d'une très bonne tolérance clinique. Il est important de mentionner que malgré toutes ces données précliniques, aucune étude clinique n'a été publiée { ce jour concernant l'efficacité antalgique de l'éthosuximide chez des patients présentant des douleurs neuropathiques. Les arguments précliniques d'efficacité antalgique et l'absence d'évaluation clinique constituent le rationnel pour conduire un premier essai thérapeutique pilote visant { évaluer le bénéfice potentiel de l'utilisation de l'éthosuximide dans la prise en charge de la douleur neuropathique. La démonstration d'une efficacité clinique permettrait d'enrichir la palette thérapeutique. PROJECT CLINIQUE : EDONOT Exposé des hypothèses et des objectifs La douleur demeure le symptôme le plus délétère pour les patients souffrant d'un syndrome douloureux neuropathique. De nombreux patients présentant une douleur neuropathique déclarent peu ou pas de soulagement avec les antalgiques disponibles actuellement. Sur la base d'arguments précliniques robustes, le blocage des canaux calciques de type T par l'éthosuximide pourrait permettre de réduire des symptômes douloureux neuropathiques. Ceci constitue l'hypothèse de la présente étude. L'objectif de l'étude sera d'évaluer l'efficacité de l'éthosuximide, administré en ajout au traitement en cours de la douleur neuropathique, sur les symptômes douloureux et la qualité de vie chez des patients présentant des douleurs neuropathiques d'origine traumatique, comparativement { un groupe contrôle. 3. Retombées attendues Cette étude devrait permettre : - d'apporter une confirmation (ou non) des données précliniques sur le potentiel antalgique obtenue. - si tel est le cas, les résultats de cet essai clinique permettraient : d'enrichir la palette thérapeutique du traitement des douleurs neuropathiques, avec une nouvelle molécule ayant un mécanisme d'action original de poursuivre les recherches pour ouvrir l'utilisation de cette molécule vers d'autres types de douleurs réfractaires aux traitements habituels de potentiellement réduire le coût du traitement de la douleur neuropathique chez les patients répondeurs C. MEDICAMENT A L'ETUDE 1. Description du traitement Zarontin (Pfizer) : le principe actif est l'éthosuximide. C'est un antiépileptique, inhibiteur des canaux de type T. Il vise à faire disparatre les crises d'épilepsie ou au moins à les diminuer en fréquence ou en intensité. Il est actif sur les absences (petit mal) et utilisé seul ou en association avec un autre antiépileptique, dans le traitement des épilepsies généralisées. PROJECT CLINIQUE : EDONOT Stodal (Laboratoire Boiron) : sirop homéopathique indiqué dans le traitement de la toux des laboratoires Boiron. Dans cette étude, le choix du sirop homéopathique comme placebo est justifié par plusieurs arguments : - Il possède les mêmes caractéristiques que le Zarontin : forme pharmaceutique sirop, flacon de même couleur et de même volume, même godet doseur. Ces similitudes sont fondamentales pour respecter le double aveugle. - C'est un traitement qui ne possède aucune indication dans la prise en charge de la douleur. C'est un produit traditionnellement utilisé dans le traitement de la toux. Il s'agit d'un traitement homéopathique et, de ce point de vu, comme l'attestent de nombreuses revues cliniques internationales de référence, son efficacité est superposable à celle d'un placebo734736. Par conséquent, il est légitime d'utiliser ce produit en tant que placebo inactif sur la douleur. - Néanmoins, si selon certaines convictions, le produit homéopathique possède un effet thérapeutique, cela augmentera la rigueur de notre analyse de l'effet de l'éthosuximide en cas de résultats positifs significatifs. 2. Posologie, modalités d'administration et durée du traitement Groupe Éthosuximide : Le produit utilisé est le Zarontin 250 mg / 5 ml sirop. Il sera administré tous les jours en deux prises matin et soir durant les repas pendant 42 jours. Selon le RCP, la posologie sera augmentée très progressivement de 250 mg (5 ml) tous les 4 jours jusqu'{ atteinte de la posologie efficace se situant à 20 mg / kg / jour soit 1500 mg / jour. Tous les patients devront impérativement suivre cette posologie même en cas d'apparition d'effets indésirables mineurs ou d'effets positifs. Administration : sirop par voie orale { l'aide d'un godet-doseur gradué à 2, 5 ml, 5 ml, 10 ml et 15 ml. Durée du traitement : 42 jours. Prise par palier : 500 mg / j pendant 4 jours, 750 mg / j pendant 4 jours, 1000 mg / j pendant 4 jours, 1250 mg / j pendant 4 jours, 1500 mg / j pendant 22 jours (fin de l'étude). Palier 1 : 10 ml de Zarontin (500 mg / jour) pendant 4 jours à prendre en deux prises : - le matin 5 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml ; - le soir 5 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml Palier 2 : 15 ml de Zarontin (750 mg / jour) pendant 4 jours à prendre en deux prises : - le matin 7, 5 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml ; - le soir 7, 5 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml PROJECT CLINIQUE : EDONOT Palier 3 : 20 ml de Zarontin (1000 mg / jour) pendant 4 jours à prendre en deux prises : - le matin 10 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml ; - le soir 10 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml Palier 4 : 25 ml de Zarontin (1250 mg / jour) pendant 4 jours à prendre en deux prises : - le matin 12, 5 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml ; - le soir 12, 5 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml Palier 5 : 30 ml de Zarontin (1500 mg / jour) pendant 4 jours à prendre en deux prises : - le matin 15 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml ; - le soir 15 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml Plateau : 30 ml de Zarontin (1500 mg / jour) pendant 22 jours à prendre en deux prises : - le matin 15 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml ; - le soir 15 ml de Zarontin 250 mg / 5 ml Groupe homéopathie : Produit utilisé : Stodal, sirop homéopathique indiqué pour le traitement de la toux des laboratoires Boiron. Pris durant la totalité de l'étude, soit 42 jours, avec les modalités d'administration équivalentes au groupe Éthosuximide. ANNEXES CONCLUSION GENERALE CONCLUSION GENERALE X. CONCLUSION GENERALE Mes travaux de thèse ont démontré trois choses : 1) Le canal calcique Cav3. 2, connu pour son implication dans la perception douloureuse, est également impliqué dans le mécanisme d'action du paracétamol pour permettre son effet antalgique. L'étude des mécanismes biologiques impliquant les canaux Cav3. 2 dans l'effet du paracétamol a montré que seuls les canaux Cav3. 2 au niveau cérébral étaient mobilisés et qu'ils agissaient de concert avec les récepteurs TRPV1. Indirectement, nous avons aussi démontré l'implication des canaux Cav3. 2 cérébraux dans la modulation de la perception douloureuse. 2) L'effet antalgique de l'inhibition des canaux Cav3. 2 a été montré dans les douleurs aigus et neuropathiques. Ici, nous avons démontré son rôle dans les douleurs inflammatoires. De manière plus intéressante, nous avons montré que l'inhibition des canaux Cav3. 2 induisait également un effet anti- inflammatoire passant par l'inhibition de l'activation des macrophages se traduisant par un développement œdémateux et une production des médiateurs pro-inflammatoires diminués. 3) L'éthosuximide, un antiépileptique commercialisé sous le nom de Zarontin, est prescrit pour le traitement des épilepsies de petit mal. Son efficacité antinociceptive a été démontrée dans les douleurs chroniques neuropathiques chez l'animal. Néanmoins, aucune étude clinique n'a évaluée cet effet antinociceptif sur des patients douloureux chroniques. De plus, aucune étude ne s'est intéressée { son efficacité antinociceptive dans les douleurs chroniques inflammatoires. Partant de ce constat et suite à nos études, nous avons démontré l'effet antinociceptif de l'éthosuximide sur les douleurs inflammatoires et également un effet anti-inflammatoire. De plus, nous avons montré un effet bénéfique sur les comorbidités associées aux douleurs inflammatoires (anxiété et dépression). En conclusion, tous ces résultats ont mis en lumière le potentiel thérapeutique fort de l'inhibition des canaux Cav3. 2, et plus largement des canaux calciques de type T, pour le traitement de la douleur. S'appuyant sur les données précliniques et sur la chance de posséder sur le marché un inhibiteur des canaux de type T (éthosuximide), nous avons entrepris la mise en place d'une étude clinique évaluant l'efficacité antalgique de l'éthosuximide chez des patients neuropathiques douloureux chroniques. Une seconde étude clinique verra le jour également sur l'évaluation de l'efficacité antalgique de l'éthosuximide chez des patients présentant des douleurs ostéoarticulaires de type arthrose et arthrite. CONCLUSION GENERALE ANNEXES ANNEXES ANNEXES ANNEXES XI. ANNEXES ANNEXE 1 : ARTICLE 1 Title : Cav3. 2 calcium channels : the key protagonist of the supraspinal effect of acetaminophen. a, b a, b d, e, f, g h d, e, f, g h d, e, f, g a, b N. Kerckhove , C. Mallet , A. François , M. Boudes , J. Chemin , T. Voets , E. Bourinet , A. Alloui , A. a, b, c Eschalier Author affiliation : (a) Clermont Université, Laboratoire de Pharmacologie Fondamentale et Clinique de la Douleur, Clermont-Ferrand, France, (b) Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Unité 1107 NEURO-DOL, Clermont-Ferrand, France (c) Centre Hospitalier Universitaire Gabriel Montpied, Clermont-Ferrand, France, (d) Laboratories of Excellence, Ion Channel Science and Therapeutics, Institut de Génomique Fonctionnelle, 141 rue de la Cardonille, 34094 Montpellier, France, (e) CNRS UMR5203, Montpellier, France, (f) INSERM, U661, Montpellier, France, (g) IFR3 Universités Montpellier I&II, Montpellier, France, (h) Laboratory of Ion Channel Research, Department of Cellular and Molecular Medicine, KU Leuven, Leuven, Belgium. Corresponding author : Alain Eschalier, alain. eschalier@udamail. fr, 33 (0)4 73 17 82 30, fax : 33 (0)4 73 27 71 62 ABSTRACT To exert analgesic action, acetaminophen requires complex metabolization to produce a brain specific lipoaminoacid compound, AM404, which targets central TRPV1 receptors. Lipoaminoacids are also known to induce analgesia through T-type channel inhibition (Cav3. 2). In this study we show that the antinociceptive effect of acetaminophen is lost in mice when supraspinal Cav3. 2 channels are inhibited. Therefore, we hypothesized a relationship between supraspinal Cav3. 2 and TRPV1, via AM404, which mediates the analgesic effect of acetaminophen. AM404 is able to activate TRPV1 and weakly inhibits Cav3. 2. Interestingly, activation of TRPV1 induces a strong inhibition of Cav3. 2 current. Supporting this, intracerebroventricular administration of AM404 or capsaicin produces antinociception that is lost in Cav3. 2/ mice. Our study, for the first time, (1) provides a molecular mechanism for the supraspinal antinociceptive effect of acetaminophen, (2) identifies the relationship between TRPV1 and Cav3. 2 and (3) discloses supraspinal Cav3. 2 inhibition as a potential pharmacological strategy to alleviate pain. ANNEXES INTRODUCTION Acetaminophen (acetyl-para-aminophenol ; AcAP), is a widely used analgesic and antipyretic agent. Nevertheless, its analgesic mechanism remains elusive and its metabolism is complex. Several studies on AcAP metabolites have largely focused on their toxic actions, notably by hepatotoxic compounds like p- benzoquinone (p-BQ) and N-acetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI). Recently, we have proposed that a new metabolic pathway, previously described by Hgesttt et al. 30, would be involved in its analgesic action. AcAP is metabolized to p-aminophenol, which is itself metabolized in the brain by the fatty acid amide hydrolase (FAAH) to N-(4-hydroxyphenyl)-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenamide (AM404), which is able to induce analgesia100. Interestingly, this active metabolite is structurally related to lipoaminoacids, a new class of signaling molecules involved in pain modulation206, 215. Members of the lipoaminoacid family, such as anandamide (N-arachidonoyl ethanolamide) and 2- AG (2-arachidonylglycerol), interact with several targets including cannabinoid204, 313 and TRPV1 receptors141, 206, 312, two main actors involved in pain modulation and in the analgesic action of AcAP 100, 131. But interestingly, lipoaminoacids are also able to strongly inhibit T-type calcium channels, especially the Cav3. 2 member, an effect which mediates their analgesic property467. T-type calcium channels have the exclusive characteristic to be activated by weak depolarization close to the resting membrane potential conferring them a role of cell excitability modulator526. In the central nervous system, T-type calcium channels participate in epilepsy631, 632, spontaneous firing526, slow- wave sleep633 and pain perception580, 581, 634. Three T-type calcium channels, Cav3. 1, Cav3. 2, and Cav3. 3, have been described526. Among them, Cav3. 2 channels are expressed in small and medium-diameter neurons of the dorsal root ganglion (DRG), in the dorsal horn superficial lamin and in several brain structures567. In naive and neuropathic animals, we have shown that Cav3. 2 inhibition by antagonists or oligonucleotide antisenses reduced nociceptive reactions and hyperalgesia, respectively532, 581. Finally, Cav3. 2 knock-out mice display severe impairment in pain perception in several pain tests confirming the strong role of this channel in nociception580. Considering that the AM404 lipoaminoacid was the active metabolite of AcAP30 and that lipoaminoacids were able to inhibit Cav3. 2 channels, which modulate nociception and pain467, we hypothesized that Cav3. 2 channels could be involved in the mechanism of the analgesic action of AcAP. In this study, we have investigated the involvement of Cav3. 2 channels in this effect using genetic (Cav3. 2 knock-out mice) and pharmacological (Cav3 antagonist, TTA-A2) strategies in rodents submitted to various nociceptive tests and pathological conditions. Interestingly, Zygmunt et al. 141 have shown that AM404 is also a TRPV1 agonist. We previously demonstrated that brain TRPV1 was an essential actor for the analgesic action of acetaminophen100. The suspected dual involvement of brain TRPV1 receptor and Cav3. 2 channels in AcAP action lets us investigate ANNEXES the interaction between these two protagonists. This potential interaction was studied with a behavioral approach by using genetically modified mice (Cav3. 2 or TRPV1 knock-out mice) and a pharmacological strategy (TTA-A2). We have also used electrophysiological and calcium imaging technics to investigate the mechanism of the functional interaction between Cav3. 2 channels and TRPV1 receptors. Overall, our results demonstrate, for the first time, that the supraspinal Cav3. 2 T-type calcium channel works with TRPV1 receptor to support the analgesic action of AcAP and consequently highlights them as potential targets for the development of new analgesics. RESULTS Acetaminophen fails to produce an analgesic effect in Cav3. 2 knock-out mice. A single dose of acetaminophen (AcAP, 200 mg/kg per os) or vehicle (saline) was administered in Cav3. 2 knock-out mice (Cav3. 2-/-) and their littermates (Cav3. 2 / ). Different pain tests, using the three fundamental stimuli (thermal, chemical and mechanical), were used in naive animals : tail immersion at 46C, formalin (2. 5%, phase 1 : 0-5 min and phase 2 : 15-40 min) and von Frey tests. In Cav3. 2 / mice, acetaminophen (AcAP) increased the tail withdrawal latency in the tail immersion test (vehicle : 7. 69 0. 60 s and AcAP : 16. 04 0. 49 s ; P < 0. 001) (Fig. 1a). Moreover, acetaminophen decreased the paw withdrawal incidence (PWR) in the von Frey test (vehicle : 3. 38 0. 18 PWR and AcAP : 2. 57 0. 20 PWR ; P < 0. 01) (Fig. 1b) and the licking time of the first phase (vehicle : 135 11 s and AcAP : 72 12 s ; P < 0. 001) and the second phase (vehicle : 241 31 s and AcAP : 61 18 s ; P < 0. 001) of the formalin test (Fig. 1c). In the same tests performed in Cav3. 2-/- mice, acetaminophen was not able to modify scores obtained in control animals demonstrating that the analgesic action of acetaminophen was abolished when the Cav3. 2 channel was deleted (Fig. 1a, b and c). A similar result was obtained in a model of inflammatory pain induced by a peri-articular injection of Complete Freund Adjuvant in the left hindpaw (CFA model). Both thermal (vehicle : 3. 88 0. 23 s and AcAP : 10. 03 0. 75 s ; P < 0. 05) (Fig. 1d) and mechanical hyperalgesia (vehicle : 4. 5 0. 19 PWR and AcAP : 2. 13 0. 48 PWR ; P < 0. 01) (Fig. 1e) were reduced by acetaminophen in Cav3. 2 / , while it did not produce any effect in Cav3. 2-/- mice. As previously shown580, deletion of the Cav3. 2 channel attenuates reactions to several noxious stimuli (here mainly heat and mechanical ones) (Fig. 1). Thus, the analgesic effect of acetaminophen might be masked by the Cav3. 2-/- mouse hypoalgesic phenotype, introducing a bias in our experiments. We thus verified whether another analgesic drug (morphine, 2 mg/kg s. c. ) could be effective in Cav3. 2-/- mice. In accordance with the literature467, 636, morphine produced a significant analgesic effect in Cav3. 2-/- mice in all tests used (Fig. 1) either in naive mice (tail immersion, von Frey and formalin tests) or in the CFA model (paw immersion and von Frey tests). ANNEXES All these findings identify the novel role of Cav3. 2 calcium channels in supporting the analgesic action of acetaminophen. Supraspinal Cav3. 2 calcium channels are needed for acetaminophen-induced analgesia. No consensus is fully established concerning the site of action of acetaminophen. Even if some authors have indicated a peripheral action site98, 108, 109, we and others developed evidence for a central action site96, 97, 100, 103, 131, 637. With that in mind, we hypothesized that supraspinal Cav3. 2 calcium channels would be involved in the analgesic effect of acetaminophen. Recently, a new class of T-type antagonists (TTA family) has been discovered561 and which includes TTA-A2, currently the most specific compound 532 . The influence of TTA- A2, administered by intracerebroventricular (i. c. v. ) route, on the effect of acetaminophen or morphine was assessed in order to determine the involvement of supraspinal Cav3. 2 calcium channels in their analgesic action in both naive mice and in an inflammatory context (CFA model). The first observation was that TTA- A2 (12 g, i. c. v. ) injection induced an antinociceptive effect in the first phase (vehicle : 109 8 s and TTA-A2 : 72 7 s ; P < 0. 01) and the second phase (vehicle : 193 18 s and TTA-A2 : 93 20 s ; P < 0. 01) of the formalin test (Fig. 2a) and in the von Frey test (vehicle : 3. 9 0. 4 PWR and TTA-A2 : 2. 6 0. 2 PWR ; P < 0. 01) (Fig. 2b) without inducing a sedative effect (Supplementary Fig. S1). This result indicates, for the first time, that the inhibition of supraspinal Cav3. 2 calcium channels can specifically reduce the reaction to noxious stimuli. Secondly, in mice submitted to the formalin (Fig. 2a) or the von Frey (Fig. 2b) tests, co-administration of TTA-A2 (i. c. v. ) and acetaminophen (200 mg/kg, p. o. ) produced an effect not significantly different compared to the effect of acetaminophen or TTA-A2 alone (Fig. 2a). On the contrary, co-administration of TTA-A2 (i. c. v. ) and morphine (1 mg/kg, s. c. ) produced a significantly more pronounced analgesic action than the effect of the same drugs administered alone (Fig. 2a, b). These results show that supraspinal Cav3. 2 calcium channels are involved in the analgesic action of acetaminophen, yet they are not involved in morphine analgesic action. In parallel, specific action of TTA-A2 on Cav3. 2 subtype channels was tested by assessing the analgesic effect of TTA-A2 i. c. v. -injected in Cav3. 2-/- mice in the formalin test. No analgesic action of TTA-A2 was observed in the first phase (vehicle : 68 9 s and TTA-A2 : 56 14 s) nor in the second phase (vehicle : 106 12 s and TTA-A2 : 109 23 s) (Supplementary fig. S2), confirming the specific action of this compound on Cav3. 2. Cav3. 2 calcium channels are also expressed in the spinal cord567 and acetaminophen-induced analgesia involves spinal actors97, 101, 306. A possible involvement of the spinal Cav3. 2 calcium channels in acetaminophen action has been investigated by assessing its analgesic action in wild type mice submitted to the formalin test and treated with TTA-A2 (12 g, i. t. ). TTA-A2 induced an analgesic effect in the first phase (vehicle : 106 12 s and TTA-A2 : 65 9 s, P < 0. 001) and the second phase (vehicle : 255 19 s and TTA-A2 : 119 29 s, P < 0. 001) of the formalin test (Fig. 2c). Interestingly, co-administration of TTA-A2 (12 ANNEXES g, i. t. ) and acetaminophen (200 mg/kg, p. o. ) induced a significantly higher analgesic effect than both drugs administered alone. The same result was found with morphine (1 mg/kg, s. c. ) and TTA-A2 (12 g, i. t. ) co- administration (Fig. 2c). This experiment demonstrated that spinal Cav3. 2 channels are not involved in acetaminophen (or morphine-) induced analgesia. All together, these results demonstrate that supraspinal but not spinal Cav3. 2 channels are essential for the analgesic effect of acetaminophen. Moreover, they show that specific supraspinal or spinal inhibition of Cav3. 2 calcium channels induce analgesia. AM404, the active metabolite of acetaminophen, required Cav3. 2 channels to mediate its analgesic effect. A new acetaminophen metabolism pathway was recently discovered30. After oral ingestion, acetaminophen is metabolized to p-aminophenol in the liver. This compound is associated in brain with arachidonic acid by the fatty-acid-amine-hydrolase (FAAH) enzyme which gives rise to AM404. AM404 has been shown to mediate the analgesic effect of acetaminophen131 and belongs to the endocannabinoid family, that includes, anandamide which activates TRPV1 receptors459 and inhibits Cav3. 2 calcium currents467. To demonstrate the potential link between AM404 and Cav3. 2 calcium channels in vivo, the analgesic effect of AM404 (2 g, i. c. v. ) was assessed in Cav3. 2-/- and Cav3. 2 / mice. AM404 injection induced an analgesic effect in Cav3. 2 / mice in the first phase of the formalin test (vehicle : 85 10 s and AM404 : 47 10 s ; P < 0. 01) (Fig. 3a) and in the von Frey test, 7 days after peri-articular CFA injection (vehicle : 4. 86 0. 14 PWR and AM404 : 2. 75 0. 31 PWR ; P < 0. 01) (Fig. 3b). In the same tests, no analgesic action of i. c. v. administered AM404 was observed in Cav3. 2-/- mice (Fig. 3). We further examined in DRG neurons the action of AM404 on Cav3. 2 current in a whole-cell patch clamp method. Contrary to acetaminophen and p-aminophenol which did not inhibit Cav3. 2 current, AM404 weakly inhibits Cav3. 2 current, with a high EC 50 13. 67 M (Fig. 3c), compared to the antagonist, TTA-A2 (EC50 8. 99 nM)532. These results demonstrate a weak inhibitory action of AM404 on Cav3. 2 calcium channels. TRPV1 receptor and Cav3. 2 channel : evidence of a functional relationship. As previously evoked, AM404 is also known as a TRPV1 agonist141. In a previous study, we demonstrated that acetaminophen, via AM404, activated supraspinal TRPV1 receptors to induce its analgesic effect100. Using a calcium imaging method on HEK cells transfected with or without the TRPV1 receptor, we showed that AM404 (10 M) induced a large intracellular calcium increase dependent on the TRPV1 receptor (Fig. 4a). AM404 (10 M) was as efficient as capsaicin (0. 5 M) and elicited a response in all capsaicin responding cells. In these experimental conditions, we further demonstrated that p-aminophenol (10 M) induced a calcium mobilization, albeit much smaller and slower than AM404 or capsaicin (Fig. 4b). This effect resulted from the action of locally produced AM404 (transformation of p-aminophenol by HEK expressed FAAH). Indeed effect of p- aminophenol application was lost after a treatment with a FAAH inhibitor (PMSF, 10 M ; Fig. 4b). As for ANNEXES direct application of exogenous AM404, the observed intracellular calcium mobilization depends on TRPV1, as demonstrated by the use of the TRPV1 antagonist (capsazepin, CAPZ, 20 M ; Fig. 4b, SI 3) or the lack of response in cells that were not transfected with the TRPV1 receptor (Fig. 4b). These experiments confirm that AM404 is able to activate TRPV1 receptors and that, as suggested by our previous in vivo results100, p- aminophenol needs to be metabolized by FAAH (into AM404) in order to activate these receptors. The fact that TPRV1 receptors and Cav3. 2 channels were involved in the action of acetaminophen and its active metabolite, AM404, led us to investigate a putative functional link between them. For that purpose, the effect of brain TRPV1 activation was studied using capsaicin injection (Cap, 10 g i. c. v. ) in Cav3. 2-/- and Cav3. 2 / mice via the formalin and von Frey tests in naive mice and in the CFA-model. We first demonstrated that the analgesic effect of capsaicin involved TRPV1 receptors by showing its total inhibition by the specific antagonist, capsazepin (CAPZ, 10 g i. c. v. ) (Fig. S4). Then, while in Cav3. 2 / mice, a supraspinal injection of capsaicin elicited an analgesic effect in the first (vehicle : 88 9 s and Cap : 42 13 s, P < 0. 01) and second phase (vehicle : 231 24 s and Cap : 127 30 s, P < 0. 05) of the formalin test (Fig. 5a) and in the von Frey test (vehicle : 4. 86 0. 14 PWR and Cap : 2. 5 0. 46 PWR, P < 0. 01) (Fig. 5b) we showed that capsaicin (10 g i. c. v. ) had no effect in Cav3. 2-/- mice (Fig. 5a, b). Conversely, the analgesic effect of i. c. v. administered TTA-A2 was maintained in TRPV1 knock-out mice (TRPV1-/-) in the first (vehicle : 92 11 s and TTA-A2 : 34 7 s, P < 0. 001) and second (vehicle 145 17 s and TTA-A2 : 58 9 s, P < 0. 01) phases of the formalin test (Fig. 5c). Taken together, these results revealed that the analgesic effect induced by an activation of supraspinal TRPV1 receptors needs Cav3. 2 calcium channels and suggests that these two protagonists could be involved sequentially. Indeed both the analgesic effect of capsaicin lost in Cav3. 2-/- mice and the maintained effect of TTA-A2 in TRPV1-/- mice suggests that Cav3. 2 would be located downstream of TRPV1 and inhibited after TRPV1 activation, e. g. by AM404. Accordingly, in vitro we used HEK cells stably expressing recombinant Cav3. 2 channels and transfected with or without TRPV1 to test the effects of Cav3. 2 activation. Currents were recorded from a holding potential of -75mV in order to be close to the normal resting potentials of neurons. This maintains the T-type channels in a partially inactivated state that is often preferentially sensitive to pharmacological modulations467, 532. Furthermore, we used a voltage ramp protocol (-75 to 75mV) to visualize concurrently the current/voltage relationships of expressed Cav3. 2 and TRPV1 (when co-expressed). In these conditions, capsaicin has a limited and fully reversible inhibitory effect on Cav3. 2 channel activity in the absence of co- expressed TRPV1 (Fig. 5d). In contrast, when TRPV1 channels are co-expressed, Cav3. 2 mediated currents are potently inhibited by capsaicin application (Fig. 5e). Furthermore, the inhibition was almost irreversible even upon capsaicin washout. Since TRPV1 activity masks Cav3. 2 currents during capsaicin application, it was not possible to plot the T-type current amplitude during the drug application. In contrast, TRPV1 activation led to a linear current/voltage relationship and augmentation of inward and outward currents at ANNEXES -75 and 75mV (presented in supplementary Fig S5). It shows that capsaicin evokes a current only when TRPV1 is expressed. Pooled experiments showed that capsaicin mediated Cav3. 2 inhibition depends on TrpV1 activation (Fig. 5f). In high TRPV1 expressing cells, TRPV1 has a tonic activity that was evident from recordings just after establishment of whole cell recording. In these cells, Cav3. 2 activity was undetectable suggesting their tonic inhibition by basal TRPV1 activity in the cell culture incubator. DISCUSSION Using different in vitro (patch clamp, calcium imaging) and in vivo (different pain tests and models) experiments with a rigorous methodology (blind experiments by the same experimenter, randomized treatments, method of equal blocks to limit uncontrollable environmental factors), we demonstrated that : 1) supraspinal Cav3. 2 channels are involved in acetaminophen analgesic action ; 2) supraspinal Cav3. 2 channels modulate pain perception and 3) a functional relationship between TRPV1 receptors and Cav3. 2 channels mediates the analgesic action of acetaminophen. The loss of acetaminophen effect in Cav3. 2-/- mice, while effective in wild-type littermates regardless of the experimental conditions, suggests that Cav3. 2 channels are needed for the analgesic action of acetaminophen not only in acute nociception but also in inflammatory situations. This involvement might be questioned due to the reduced response of Cav3. 2-/- to noxious stimuli, however, we have demonstrated by using morphine that an additional analgesia could happen in these mice. Thus the loss of the acetaminophen effect can clearly be linked to Cav3. 2 channel deletion and, acetaminophen and morphine mediated analgesia can be clearly distinguished. However these results are not informative in localizing, within the CNS, the channels involved in the effect of acetaminophen. The site of action of acetaminophen is still a matter of debate. Some authors showed a peripheral action site98, 108, 109 while central one was shown by others96, 97, 100, 103, 131, 637. We previously demonstrated that spinal131 and brain100 receptors were involved in the action of acetaminophen in animals and possibly in healthy volunteers too96. Cav3. 2 channels are widely located in the body. Notably, Cav3. 2 channels are expressed in the spinal cord494, 567 and in different nuclei in the brain : hypothalamus, thalamus, amygdala, hippocampus, midbrain, and cortex567. Various T-type channel antagonists such as ethosuximide591, 594, mibefradil587, 588, NNC590 have been used to explore the role of these channels but none of them are highly specific. Recently, a new class of molecules has been designed, called TTA compounds, which presents major specificity for T-type channels645, 646 and a body of evidence placed TTA-A2 as the most specific antagonist of Cav3. 2 subtype channels. We previously demonstrated that its effect on T-type channels was greater on Cav3. 2 than on Cav3. 1 and Cav3. 3 (EC50 Cav3. 1 : 100 nM ; Cav3. 2 : 9 nM ; Cav3. 3 : 30 nM)532 and that its analgesic effect (after systemic administration) was lost in Cav3. 2-/- mice532. Using i. c. v. injections we confirmed this notion here and moreover we further show that Cav3. 2 inhibition in the CNS mediates ANNEXES analgesic effects. Based on this data, the loss of an effect of orally administered acetaminophen after i. c. v. injection of TTA-A2 demonstrated an involvement of supraspinal Cav3. 2 channels but not spinal channels, as shown by the lack of an occluding effect of i. t. TTA-A2 on acetaminophen-induced analgesia. This demonstration of a supraspinal site of action of acetaminophen agrees with our previous work showing the involvement of supraspinal TRPV1100 receptors in acetaminophen-induced analgesia. It also agrees with results obtained in healthy volunteers showing an activation of inhibitory bulbospinal pathways by acetaminophen97. These results confirm once again that acetaminophen can be considered as a centrally acting analgesic drug. It is able to act on supraspinal targets, among them Cav3. 2 channels and TRPV1 receptors, to activate inhibitory bulbo-spinal pathways, while at the spinal level other actors could be involved such as 5-HT receptors98, 99, 103, 136, 304, 306 or as more recently shown, TRPA1 and A1 adenosine receptors98, 101. Incidentally, it is interesting to note that TTA-A2, administered alone either supra-spinally or spinally, induced analgesia, without affecting locomotion. These results, in line with the analgesia observed in Cav3. 2-/- mice (present and Choi et al. study580), confirmed that Cav3. 2 calcium channels are tonically involved in nociception at these two sites to modulate pain. Regarding the mechanism of the supraspinal involvement of Cav3. 2 by acetaminophen, previous results have shown that the central action of acetaminophen involves metabolites30, namely p- aminophenol, transformed in the brain into AM404. Thus, we hypothesized that the observed relationship between acetaminophen and Cav3. 2 channels is indirect through AM404, a lipoaminoacid related compound30. The involvement of supraspinal Cav3. 2 channels in the AM404 antinociceptive action was shown in vivo. AM404, i. c. v. -injected, produced an analgesic effect in Cav3. 2 / but not in Cav3. 2-/- mice in the two tests used. These results demonstrate a functional link between AM404 and Cav3. 2 channels, which has been similarly shown for lipoaminoacids such as anandamide, some polyunsaturated fatty acids or N-acyl ethanolamide, which are T-type calcium channel blockers647649, and for endogenous N- arachidonoyl glycine (NAGly) a more potent Cav3. 2 inhibitor467. Interestingly, NAGly promotes an analgesic effect in animals206, 467 which is abolished in Cav3. 2-/- mice467, suggesting that an inhibition of Cav3. 2 could support its analgesic effect. The same mechanism can be evoked for AM404. Indeed, AM404 induced an inhibition of native Cav3. 2 mediated T-type currents in D-hair DRG neuron subtypes that do not express TRPV1 channels. However, this inhibition was weak and partial compared to other lipoaminoacid mediated inhibition such as one that we previously described with NAGly467, which questions the involvement of this direct inhibitory effect in the analgesic action of AM404 observed in vivo. Our recent demonstration that AM404-induced activation of brain TRPV1 channels was needed for the analgesic action of acetaminophen100 suggested a link between AM404, TRPV1 and Cav3. 2. Accordingly, an indirect inhibition of Cav3. 2 channels by AM404 through its activation of TRPV1 was suspected. We first ANNEXES confirmed, using a calcium imaging assay, the ability of AM404 to activate TRPV1 as previously demonstrated by Zygmunt et al. 141. The ability of TRPV1 activation to inhibit Cav3. 2 channels was then demonstrated with electrophysiology experiments in vitro in HEK cells. Devoid of any direct inhibitory effect on Cav3. 2 channels, capsaicin strongly inhibited Cav3. 2 currents when cells were co-transfected with the channels and TRPV1 receptors, which demonstrated the ability of TRPV1 activation to inhibit Cav3. 2 channels. This effect is very sensitive since the basal tonic activity of TRPV1 was also effective in reducing Cav3. 2. This effect is reminiscent of findings in rat sensory neurons, known to express Cav3. 2, describing an inhibition of T-type currents by TRPV1 mediated action597. We similarly demonstrate this pathway here by demonstrating the minimal necessity of the two channels being expressed together, likely located in a close vicinity, to observe the regulation. Importantly, we further show that this inhibition can be obtained with physiological levels of extracellular calcium, in contrary to the previous report from Comunanza et al. 597, suggesting that this modulation is likely to occur in vivo. The hypothesis stated to explain the mechanism involved in this modulation is a calcium regulation. Indeed, massive influx of calcium ions after TRPV1 activation could inhibit Cav3. 2 channels through the activation of kinases (for review651), such as PTK652, PKA653655, PKC656 and ROCK657 and therefore decrease neuronal excitability. The next step was to demonstrate this functional link in pain supraspinal modulation. Intracerebroventricular injection of capsaicin induced analgesia in Cav3. 2 / mice in all the nociceptive tests. This effect was not observed in Cav3. 2-/- mice. Cav3. 2 channels are thus needed for the analgesic effect of the TRPV1 agonists, capsaicin or AM404. However, the reciprocal does not apply, the analgesic action of i. c. v. -injected TTA-A2 was unchanged in TRPV1-/- mice compared to littermates. Taken together, these results demonstrate that the agonist of TRPV1 and AM404 induces analgesia through a supraspinal TRPV1- dependent Cav3. 2 current inhibition. That explains why the antinociceptive effect of acetaminophen was inhibited both by i. c. v. TRPV1 receptor antagonist100 and the Cav3. 2 inhibitor TTA-A2. The involvement of supraspinal TRPV1 receptors are in line with literature showing that activation of brain TRPV1 induces an analgesic effect (for review658). Thus, we have demonstrated a functional link, in vivo, between TRPV1 receptors and Cav3. 2 calcium channels that is implicated in capsaicin- or acetaminophen-induced analgesia. To conclude, we have identified brain Cav3. 2 channels as a novel targets for the analgesia induced by acetaminophen. We positioned these channels with two actors previously shown to be involved in the action of acetaminophen : AM404, its bioactive metabolite, and TRPV1 receptors. The present results led us to complete the sequential events we previously proposed100, 131 to explain the mechanism of action of acetaminophen : metabolism of p-aminophenol (in the liver) and AM404 in brain (thanks to FAAH) which induces an activation of brain TRPV1 (linked with CB1 receptors) which in turn induces a Cav3. 2 inhibition presently shown to participate in the analgesic effect of acetaminophen. Further studies are needed to ANNEXES elucidate the link between brain Cav3. 2 inhibition and activation of inhibitory bulbospinal pathways involved in the analgesic effect of acetaminophen97, 103, 131. Finally, we highlighted supraspinal Cav3. 2 calcium channels as an important actor for pain modulation which appears as a promising and interesting target for the treatment of pain. MATERIALS AND METHODS Animals. Cav3. 2 knock-out mice (Cav3. 2-/-, 20-25 g, male), TRPV1 knock-out mice (TRPV1-/-, 20-25 g, male), originally generated by Chen CC et al. 639 and Caterina et al. 428 respectively, and their wild type littermates (Cav3. 2 / , TRPV1 / , 20-25 g, male) were used. All animals and experiments were performed with approval by the Committee for Research and Ethical Issues of the IASP and the Institutional Ethic Committee for animal experiments (CEMEA Auvergne ; nr : CE 53 - 12, CE 112 - 12, CE 24 - 11, CE 13 - 10). Animals were housed under controlled environmental conditions (21 - 22C ; 55% humidity) and kept under a 12/12h light/dark cycle. Food and water were available ad libitum. Animals were euthanized by cervical dislocation or CO2. Behavioral Studies. Animals were habituated to the testing environment before baseline testing. The experimenter and drug administration were blinded to the genotype of the mice and the treatments. Drug administration was performed a person other than the experimenter. Tail and paw immersion tests. Mice were habituated to handling for three days a week prior to testing. The mouse tail or paw was immersed in warm water (46C). Latency to respond to the heat stimulus with a tail or paw vigorous flexion were measured three times and averaged. The cutoff time was 30 seconds, after which the tail was removed from the bath regardless of response. Formalin test. Mice were allowed to acclimate to a Plexiglas chamber (30 cm x 30 cm x 30 cm) for at least 30 minutes before testing. Formalin (20 l, 2. 5% formalin in saline) was injected into the plantar surface of one hind paw. Spontaneous pain behavior (licking) was recorded during the two typical nociceptive phases : from 0 to 5 min (phase I) and from 15 to 40 min (phase II) after formalin injection as previously described100. For AM404 experiments, only phase 1 was studied due to the fast degradation of AM404100. Von Frey test. Mice were placed in individual compartments on top of a wire surface and allowed to acclimatize for one hour before testing. Withdrawal thresholds were assessed with the 1. 4 g calibrated von Frey filament (Bioseb, France). The latter was pressed perpendicularly five times against the mid paw and held for 3 seconds. A positive response was noted if the paw was withdrawn or licked and a pain response score (from 0 to 5) was determined. Monoarthritis Induction. Five microliters of complete Freund adjuvant (CFA, DIFCO Laboratories, Detroit, USA)640 was injected into both sides of the left ankle joint of mice under brief halothane/N2O/O2 anesthesia. Thermal and mechanical paw thresholds were determined before and 7 days after CFA or vehicle injection. Electrophysiology Cell culture and electrophysiological recordings. Lumbar DRGs with attached roots were dissected from adult male C57BL/6J mice and single cell suspension was obtained following an enzymatic and mechanical dissociation. Whole cell patch-clamp recordings were performed 328 h after plating on medium sized DRG neurons with a rosette phenotype as previously described532. For recording calcium current, the extracellular solution contained (in mM) : 2 CaCl2, 100 TEACl, 2 NaCl, 1 MgCl2, 40 Choline Cl, 5 Glucose, 5 4AP (pH to 7, 4 with TEAOH~330 mOsM). Pipettes with a resistance of 1-1. 5 Mohm were filled with an internal solution containing (in mM) : 110 CsCl, 3 MgCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 3 Mg-ATP, 0, 6 GTP (pH to 7, 4 ANNEXES with CsOH, ~300 mOsM). All recordings were filtered at 5 kHz using an Axopatch 200B amplifier (Axon instrument). Data was recorded using a pClamp10 (Axon Instrument) and Graphpad Prism software. HEK cells stably expressing the human Cav3. 2 sequence were used as previously described532 and were transfected with GFP alone or with a mix of TRPV1 and GFP expression plasmids using JetPEI. Calcium imaging. Human embryonic kidney cells, HEK293T, were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% (v/v) human serum, 2 mM L-glutamine, 2 units/ml penicillin and 2 mg/ml streptomycin at 37C in a humidity controlled incubator with 10% CO2. HEK293T cells were transiently transfected with human TRPV1 using Mirus TransIT-293 (Mirus Corporation ; Madison, WI, USA). To determine if the cells were transfected, capsaicin (1 M) was used at the end of each experiment. Cells which did not-respond to capsaicin were used as controls. Cells were loaded with 2 M Fura-2 acetoxymethyl ester for 30 minutes at 37C. The intracellular concentration was monitored as the ratio of fluorescence signals measured upon alternating illumination at 340 and 380 nm, using an MT-10 illumination system and the Cell^M software (Olympus). Bath solution contained (in mM) 145 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1. 5 MgCl2, 10 HEPES, 10 D-Glucose, pH 7. 4 buffered with NaOH. As HEK cells express FAAH, an enzyme494 which degrades AM404, the experiments of figure 4a have been performed in the presence of a FAAH inhibitor (PMSF, 10M). Statistical Analysis. Data is expressed as mean SEM and recorded using SigmaStats 3. 5 software. Data was tested for normality and for equal variance. Multiple measurements were compared by one-way or two-way ANOVA or by Kruskal-Wallis test in the case of data that was not normally distributed. The post hoc comparisons were performed by the Bonferroni method. Values of P < 0. 05 were considered statistically significant. ACKNOWLEDGMENTS We are grateful to Dr. V. Uebele (Merck and Co. , Inc. ) for the TTA-A2 molecule, to Dr. K. Campbell for the Cav3. 2 KO mice, and to Dr. Perez Reyez for the Cav3. 2 stable cell line and cDNA. This work was supported in by Grants from the Research Foundation Flanders (FWO) Grants G0565. 07 and G0686. 09 and the Research Council of KULeuven Grants GOA 2009/07, EF/95/010 and TRPLe, the ANR (ANR-09-MNPS-037), the Institut UPSA de la Douleur and the AFM (AFM-12-PainT). M. Boudes is a Marie Curie experienced researcher. N. Kerckhove is supported by fellowships from the European Fund for Regional Economic Development (FEDER) and regional council of Auvergne. A. François is supported by fellowships from the French ministry of research and education the AFM. AUTHOR CONTRIBUTIONS Conceived and designed the experiments : NK CM AF MB AE EB. Performed the experiments : NK AF MB EB. Analyzed the data : NK CM AF EB MB AA. Wrote the paper : NK CM TV MB EB AE ADDITIONAL INFORMATION The authors declare that no competing financial interests concerning this work. ANNEXES LEGENDS FOR FIGURES Figure 1 I Acetaminophen fails to induce analgesic effect in Cav3. 2 knock-out. The analgesic effect of acetaminophen (AcAP, 200 mg/kg per os) was assessed in : (a) tail immersion, (b, e) von Frey, (c) formalin and (d) paw immersion tests in Cav3. 2 knock-out (Cav3. 2-/-) and their wild-type littermates (Cav3. 2 / ). Tail, paw immersion and von Frey tests were performed 45 minutes after acetaminophen or morphine administration and 20 minutes before formalin injection. For the inflammatory pain model, a monoarthritic model was induced by a peri-articular injection of CFA in the hindpaw. Paw immersion and von Frey tests were performed at day 7 after CFA injection and 45 minutes after drug administration. Baselines were performed at Day 0 and Day 7 before drug injections (data not shown). Morphine (Mor, 2 mg/kg subcutaneous) groups have been used as positive control groups. In all tests and conditions, acetaminophen lacks its analgesic effect in Cav3. 2-/- mice. Data is presented as mean SEM (n 68). *, P < 0. 05 ; *, P < 0. 01 ; *, P < 0. 001 ; compared to vehicle groups. Figure 2 I Supraspinal Cav3. 2 channels are involved in acetaminophen analgesic effect. The supraspinal Cav3. 2 calcium channels involvement in acetaminophen was investigated specifically by Cav3. 2 block in brain (a, b) and spinal cord (c). TTA-A2 intracerebroventricular (i. c. v. ) or intrathecal (i. t. ) injections were performed and challenged with acetaminophen analgesic effect. TTA-A2 (5 g/2 l i. c. v. and 5 g/5 l i. t. ), acetaminophen (AcAP ; 200 mg/kg p. o. ), morphine (Mor ; 1 mg/kg s. c. ) and co-administrations effect were assessed in : (a, c) formalin and (b) von Frey tests. These tests were performed 20 and 45 minutes after drugs injections, respectively. TTA-A2, AcAP and Mor produced analgesia in formalin and von Frey tests. TTA-A2 AcAP co-administrations did not display a greater analgesic effect than AcAP when TTA-A2 i. c. v. injection was performed whereas i. t. injection did. TTA-A2 Mor co-administration compared to Mor elicits a stronger analgesic effect in TTA-A2 i. c. v. and i. t. injections. Data is presented as mean SEM (n 68). *, P < 0. 05 ; *, P < 0. 01 ; *, P < 0. 001 compared to vehicle group ; , P < 0. 05 ; , P < 0. 01 ; , P < 0. 001 compared to TTA-A2 Mor co-administration group. Figure 3 I Cav3. 2 calcium channels are inhibited by AM404 and essential for AM404-induced analgesia. AM404 and Cav3. 2 calcium channels relationship was assessed by in vitro (whole cell patch clamp) and in vivo (formalin and von Frey test) approaches. In behaviors tests, the AM404 analgesic effect (2 g/2 l i. c. v. ) was assessed in (a) formalin phase 1 and (b) von Frey tests in Cav3. 2-/- and Cav3. 2 / mice. These tests were performed 10 minutes after AM404 injection. In all tests, AM404 failed to produce analgesia in Cav3. 2-/- while it was effective in Cav3. 2 / mice. (c) Dose-response curve of AM404 in Cav3. 2 current (n 68, open diamonds). Currents were elicited by a depolarization at -30 mV (200 ms duration) applied every 5 s from -75 mV. AM404 is able to partially and weakly inhibit Cav3. 2 currents (EC 50 13. 67 M). Acetaminophen (filled circle) and p-aminophenol (filled square) are almost inactive in similar conditions (inhibition at 100 M : 8 2% and 10. 5 2. 5% for AcAP and P-aminophenol respectively). Data is presented as mean SEM (n 68). *, P < 0. 05 ; *, P < 0. 01 compared to vehicle groups. Figure 4 I AM404 and FAAH dependent metabolization of p-aminophenol are TRPV1 activators. (a) Time course of intracellular calcium elevation in HEK cells transfected with (black traces, n 18) or without (gray traces, n 17) TRPV1 receptors showing that application of capsaicin (0. 5M) or AM404 (10 M) elicits elevations of intracellular calcium mediated by TRPV1 activation. PMSF was applied in all experiments to block the degradation of AM404 by FAAH. These experiments were performed in the presence of 10 M PMSF. Intracellular calcium elevation upon application of 50 M ATP at the end of the protocol shows that ANNEXES all the cells (Control and TRPV1 transfected) were effectively loaded with the Fura2 calcium sensitive probe. (b) Application of p-aminophenol evokes Fura2 340/380 ratio in HEK293 cells expressing TRPV1, but not in untransfected cells or in the presence of the FAAH antagonist, PMSF (10 M). Figure 5 I Relationship between Cav3. 2 channel and TRPV1 receptor. The capsaicin analgesic effect (Cap, 10 g/2 l i. c. v. ) was assessed in (a) formalin (2. 5%) and (b) von Frey tests in Cav3. 2-/- and Cav3. 2 / mice. TTA-A2 analgesic effect (5 g/2 l i. c. v. ) was assessed in (c) formalin test in TRPV1 knock-out mice (TRPV1-/-) and their wild type littermates (TRPV1 / ). These tests were performed 10 minutes after Cap or TTA-A2 injection. In all tests, Cap failed to produce analgesia in Cav3. 2-/- while it was effective in Cav3. 2 / mice. TTA-A2 kept its analgesic effect in TRPV1-/- mice. (d) Representative Cav3. 2 current traces evoked by 200 ms depolarization ramps from -75mV to 75mV, under control conditions (black trace) and during the washout of 1 M capsaicin (gray trace) on a typical HEK cell expressing Cav3. 2 alone. Evolution of the maximal inward current evoked by the depolarizing ramp during the time course of the experiment is plotted on the bottom part. The time points labeled as (1) and (2) correspond to the upper control and wash traces respectively. (e) Same representation as in (d) for a typical HEK cell expressing Cav3. 2 and TRPV1. Note that in this case the Cav3. 2 mediated current is nearly abolished after capsaicin stimulation of TRPV1. (f) Mean Cav3. 2 inhibition mediated after 1 M capsaicin application when TRPV1 is coexpressed (black bar) or not (open bar). Data is presented as mean SEM (n 68). *, P < 0. 05 ; *, P < 0. 01 ; *, P < 0. 001 compared to vehicle groups (behavior) or with or without TRPV1 (electrophysiology). ANNEXES FIGURES ANNEXES ANNEXES ANNEXES Supplementary informations ANNEXES ANNEXES Figure S1 I Cav3. 2 blocks by TTA-A2 or in Cav3. 2-/- mice do not display a sedative effect. To verify the potential sedative effect of the supraspinal administration of TTA-A2 or of the Cav3. 2 knock-out, an actimetry test was performed (a) in mice receiving TTA-A2 and (b) in Cav3. 2-/- mice. In both cases, block of Cav3. 2 channels does not induce a sedative effect. Data is presented as mean SEM (n 68). Figure S2 I Supraspinal TTA-A2-induced analgesia acts specifically throughout Cav3. 2 channels. To verify the specificity of TTA-A2 to the Cav3. 2 channels, the formalin test was performed in Cav3. 2-/- mice with or without injection of TTA-A2 (5 g/2 l i. c. v. ). Consistent with our previous results19, TTA-A2 does not display an analgesic action in Cav3. 2-/- mice. Data is presented as mean SEM (n 68). Figure S3 I Intracellular calcium influx induced by p-aminophenol is TRPV1 dependent. To verify the specificity of action of the metabolites of p-aminophenol in TRPV1 receptor, calcium imaging in HEK293 cells expressing TRPV1 was performed with p-aminophenol (10 M) and capsazepin (20 M). TRPV1 activation by the metabolites of p-aminophenol is inhibited in the presence of capsazepin. Figure S4 I Supraspinal Capsaicin-induced analgesia is TRPV1 dependent. To verify the specificity of capsaicin to TRPV1 in brain, the formalin test was performed in mice receiving capsaicin (30 g/2 l i. c. v. ) with or without capsazepin (3 g/2 l i. c. v. ). Specific block of TRPV1 by capsazepin inhibits capsaicin- induced analgesia. Data is presented as mean SEM (n 68). *, P < 0. 05 ; *, P < 0. 001 compared to vehicle group. ANNEXES Figure S5 I Capsaicin evokes TRPV1 mediated currents only in cells transfected with TRPV1. (a) Representative current traces evoked by 200 ms depolarization ramps from -75mV to 75mV, under control conditions (control trace) and during application of 1M capsaicin (Cap. trace) and in the washout of 1 M capsaicin (Wash Cap. trace) on a typical HEK cell expressing Cav3. 2 alone (same cell as in figure 5d). (b) Identical representation for a typical HEK cell expressing Cav3. 2 and TRPV1 (same cell as in figure 5e). Note that capsaicin evokes a typical current-voltage relation with inward currents below zero mV and large outward currents at positive potentials. ANNEXES ANNEXE 2 : SCHEMA DE L'ETUDE CLINIQUE EDONOT ANNEXES ANNEXE 3 : TABLEAU DES EVALUATIONS POUR UN SUJET ANNEXES ANNEXE 4 : CARNET DE SUIVI ANNEXES ANNEXES 5 : ABREVIATIONS 2-AG : 2-ArachidonoylGlycerol NAGly : N-ArachydonoylGlycine 5, 7-DHT : 5, 7-DiHydroxyTryptamine NAPE-PLD : N-Acyl PhosphatidylEthanolamine-spécifique 5-HT : 5-HydroxyTriptamine (sérotonine) Phospholipase D AArG : 1-Acyl-2-ArachidonoylGlycérol NAPQI : N-Acetyl-P-BenzoQuinone Imine ABHD4 : , -HyDrolase 4 NArPE : N-ACEA : Arachidonyl-2'-ChloroEthylAmide, CB1 activateur Nav : canaux sodiques AINS : Anti-Inflamatoires Non Stéroïdiens NMDA : N-Methyl-D-Aspartate AM251 : CB1 inhibiteur p. o. : per os AM404 : N-arachidonoylaminophenol P2X : Purinergic receptor 2X AMM : Autorisation de Mise sur le Marché p38 : protein 38 AMPc : Adénosine MonoPhosphate cyclique PA : Potentiel d'Action AMT : Anandamide Membrane Transporter PAG : PeriAqueductal Gray ARC : Assistant en Recherche Clinique PCPA : Para-ChloroPhenylAlanine ASIC : Acid Sensing Ionic Channel PF-04457845 : FAAH inhibiteur BHE : Barrière Hémato Encéphalique PGE2 : ProstaGlandine E2 Cav : canaux calciques PGs : Prostaglandines CB1/2 : Récepteurs aux cannabinoïdes 1 et 2 PLC : PhosphoLipase C CCI : Chronic Constriction Injury PMSF : PhenylMethaneSulfonylFluoride, FAAH inhibiteur CETD : Centre d'Etude et de Traitement de la Douleur PPAR et : Peroxisome Proliferator-Activated Receptor CGRP : Calcitonin Gene Related Peptide et CIC : Centre d'Investigation Clinique PPSE : Potentiel PostSynaptique Excitateur COX : CycloOXygénase PPSI : Potentiel PostSynaptique Inhibiteur DAGL / : DiAcylGlycérol Lipase / PTPN22 : Protéine Tyrosine Phosphatase N22 DRGs : Dorsal Root Ganglions QCD : Questionnaire Concis Douleur EDONOT : Ethosuximide et DOuleur Neuropathique QEDN : Questionnaire Evaluant les Douleurs d'Origine Traumatique Neuropathiques EI(G) : Evénements Indésirables (Graves) RCPG : Récepteur couplé aux protéines G ENS : Echelle Numérique Simple RTK : Récepteur Tyrosine Kinase ERK1 et 2 : Extracellular signal-Regulated Kinases 1 et 2 RT-Q-PCR : Reverse Transcription Quantitative Polymerase FAAH : Fatty Acid Amide Hydrolase Chain Reaction FAPs : Fibres Afférentes Primaires RTX : ResiniferaToXin FDA : Food and Drug Administration RVM : Rostro Ventral Medulla FR122047 : COX-1 inhibteur SB705498 : TRPV1 inhibiteur GABA : Gamma-AminoButyric Acid SN / SNC : Sytème Nerveux / Système Nerveux Central GDE1 : Glycérophospho-DiEstérase 1 SNARE : Soluble NSF Attachment Protein REceptor GPR55 : G Protein-coupled Receptor 55 SNI : Sciatic Nerve Injury HCN : Hyperpolarization-activated Cyclic Nucleotide SNL : Sciatic Nerve Ligature HEK : Human Embryonic Kidney SR141716A : Rimonabant, CB1 inhibiteur HVA : High Voltage Activated TBX2 : ThromBoXane 2 i. c. v. : intracérébroventriculaire Tmax : Temps maximal d'effet i. p. : intrapéritonéale TRP : Transient Receptor Potential i. v. : intraveineuse TRPA : Transient Receptor Potential Ankyrin IASP : International Association for the Study of Pain TRPA1 : Transient Receptor Potential Ankyrin 1 IBS : Irritable Bowel Syndrom TRPM : Transient Receptor Potential Melastatin JNK : c-Jun N-terminal Kinases TRPML : Transient Receptor Potential MucoLipin JZL184 : MAGL inhibiteur TRPP : Transient Receptor Potential Polycystin KO : Knock-Out TRPV : Transient Receptor Potential Vanilloide Kv : canaux potassiques TRPV1 : Transient Receptor Potential Vanilloide 1 LPS : LipoPolySaccharide TTAs : T Type Antagonist LTM : Long Term Memory TTX : TétrodoToXine LVA : Low Voltage Activated URB597 : FAAH inhibiteur lysoPLD : LysoPhosphoLipase-D URB602 : MAGL inhibiteur MAGL : MonoAcylGlycerol Lipase WAY100635 : 5-HT1A inhibiteur MAPK : Mitogen- Activated Protein Kinases WIN55, 212-2 : CB1 activateur ME : Moelle Epinière WOMAC : Western Ontario and McMaster Universities MOS-SF12 : Medical Outcome Study Short Form12 Arthritis Index NADA : N-ArachidonoylDopAmine WT : Wild Type NAEA : N-ArachydonoylEthanolAmine 9-THC : 9-TétraHydroCannabinol REFERENCES REFERENCES XII. 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Les endométrites subaigus et chroniques latentes non spécifiques ; leur retentissement sur la maturation de l'endomètre | WMT16 | Scientific |
Des raticides interdits en France à l'origine de décès et d'intoxications graves chez des enfants Magali Labadie, Jérôme Langrand, Rachel Pages To cite this version : Magali Labadie, Jérôme Langrand, Rachel Pages. Des raticides interdits en France à l'origine de décès et d'intoxications graves chez des enfants. Vigil'Anses, Anses, 2021, pp. 8-10. hal-03447014 HAL Id : hal-03447014 Submitted on 24 Nov 2021 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Vigilance des produits biocides et des intrants du végétal Des raticides interdits en France à l'origine de décès et d'intoxications graves chez des enfants L'Anses a été alertée du décès de deux très jeunes enfants suite à l'ingestion d'un raticide chinois d'importation inter- dit en France, dont l'usage semble pourtant répandu en Guyane française. L'analyse du produit a montré la pré- sence d'une substance jamais autorisée en France, le mo- nofluoroacétate de sodium, et non de bromadiolone comme indiqué sur l'emballage. D'autres cas d'intoxication avec des raticides vendus dans ce même emballage ont été rapportés aux Centres antipoison ces cinq dernières an- nées, dont deux cas d'intoxication sévère chez de jeunes enfants. Ce n'est pas la première fois que des décès sont causés par des produits interdits. L'Anses et les Centres antipoison alertent les consommateurs sur le danger de ces produits, et recommandent de n'utiliser que des produits autorisés en France et de respecter leurs conditions d'em- ploi. L'alerte En avril 2021, l'Anses a été informée par le réseau des Centres antipoison de la survenue en métropole du décès de deux en- fants âgés d'un an après absorption d'un raticide rapporté de Guyane. Les enfants avaient ingéré des aliments imbibés du produit posés à même le sol. Le produit en cause était un raticide fabriqué en Chine, intro- duit illégalement du Suriname vers la Guyane. Les indications présentes sur l'emballage du produit étaient écrites en chinois et ont nécessité le recours à un traducteur pour confirmer que le produit était un raticide et que l'emballage indiquait la seule présence de bromadiolone, concentrée à 0, 5 %. La bromadio- lone est un anticoagulant dont l'utilisation est strictement en- cadrée en France, et dont les présentations sous forme de liquides concentrés à 0, 5 % (comme dans ce cas) sont aujour- d'hui interdites et étaient, avant leur interdiction, réservées aux professionnels de la dératisation. Toutefois, une intoxica- tion par la bromadiolone, substance à toxicité retardée, ne pouvait expliquer des décès aussi rapides. L'analyse du produit dans un laboratoire expert, a mis en évidence l'absence de bromadiolone ou d'autres raticides de la famille des anti- vitamine K (AVK), et la présence de monofluoroacétate so- dique, substance non autorisée en France. Sa toxicité aigu est redoutable : l'ingestion d'une quantité même faible peut provoquer le décès d'un adulte, et a fortio- ri d'une personne de petit poids comme un enfant. En Guyane, sur la période du 1er janvier 2017 au 30 août 2021, 32 cas d'exposition à des produits raticides aux embal- lages semblables à celui du produit ayant occasionné les deux décès mentionnés plus haut ont été rapportés aux Centres antipoison. Les personnes concernées étaient essen- tiellement de jeunes enfants (médiane de 2, 4 ans). L'usager avait imbibé des denrées alimentaires avec le produit dans plusieurs cas. Parmi ces intoxications, on trouvait deux cas de gravité forte (PSS3) chez des enfants de deux ans, évoca- teurs d'une toxicité neurologique et cardiaque, quatre de gravité moyenne (PSS2), trois de gravité faible (PSS1) et 24 cas asymptomatiques (PSS0). Ceci suggère que ces produits raticides fabriqués en Chine peuvent contenir des substances actives différentes de celles mentionnées sur l'emballage. Certains contiennent vraisem- blablement un AVK car certains patients présentaient une baisse du taux de prothrombine, marqueur caractéristique de l'action de cet anticoagulant. Les intoxications avec signes neurologiques (convulsions notamment) évoquaient plutôt la présence d'une substance neurotoxique (strychnine, fluo- roacétate, alphachloralose). 1. La gravité clinique a été évaluée selon la méthode de toxicovigilance de gravité adaptée du Poisoning Severity Score (PSS) pour les in- toxications aigus. Persson HE, Sjberg GK, Haines JA, Pronczuk de Garbino J. Poisoning severity score. Grading of acute poisoning. J Toxicol Clin Toxicol. 1998 ; 36(3) : 205-13. 2. Substance aves des propriétés anticoagulantes. Vigil'Anses n15 Le bulletin des vigilances de l'Anses Novembre 2021 1 Vigilance des produits biocides et des intrants du végétal Les produits contenant des AVK sous forme de liquides con- centrés sont interdits à la vente au public (accès réservés aux professionnels), et les produits à base de bromadiolone desti- nés au public sont uniquement des appâts solides contenant au maximum 25 ppm de substance active (soit une concen- tration de 25 mg/kg) et un agent amérisant3. De même, les différents rodenticides neurotoxiques susceptibles d'avoir occasionné certaines de ces intoxications sont très encadrés par la réglementation car ils peuvent entrainer des intoxica- tions accidentelles sévères, même pour de faibles quantités ingérées, chez l'enfant et l'adulte. Seuls les appâts contenant de l'alphachloralose et un agent amérisant sont autorisés à la vente au grand public. Le Centre antipoison de Paris4 a signalé ces cas à l'Office cen- tral de lutte contre les atteintes à l'environnement et à la santé publique (OCLAESP), à l'Agence régionale de santé (ARS) de Guyane, et au ministère de la Santé du Suriname afin de les alerter sur la dangerosité de ce produit et le risque associé d'intoxication accidentelle sévère. Des cas similaires déjà rapportés aux Centres antipoison Ce n'est malheureusement pas la première fois qu'un drame de ce type se produit en France. Il y a quelques années, deux jeunes enfants ainsi qu'une jeune femme de 20 ans avaient inhalé les vapeurs d'un produit interdit, le CELPHOS, après qu'il ait été appliqué dans leur chambre pour lutter contre des punaises de lit. Un des enfants en était décédé. Le pro- duit en cause, d'importation illégale, avait été acheté sur un marché français. Il contenait des phosphures d'aluminium à l'origine de l'intoxication. D'une manière générale, la lutte contre les nuisibles tels que rongeurs, insectes, punaises de lit, ou autres est difficile, en particulier parce que des résistances aux produits classiques se développent. Cela pousse une population désarmée à acheter sur des marchés parallèles (sur internet ou à des ven- deurs à la sauvette) des produits interdits contenant des substances particulièrement dangereuses, sans qu'elle ne soit informée du danger. Le risque persistant d'intoxication par des produits interdits a déjà été identifié interdites en France rapportées aux Centres antipoison avait montré que ces produits étaient pourtant utilisés. Il pouvait s'agir soit de stockage à la maison d'anciens produits après leur interdiction soit d'un usage frauduleux par importation illégale à partir des pays frontaliers o ils étaient commercia- lisés (telle que l'introduction en Guyane de produits en pro- venance du Suriname). Un total de 408 cas d'expositions (symptomatiques ou non) avait été enregistré par le réseau des Centres antipoison sur la période de 2012 à 2016, dont 62 % étaient accidentels. Les substances le plus souvent incriminées étaient le dichlorvos, le paraquat et l'aldicarbe. La provenance des produits avait pu être obtenue pour 60 cas (14, 7 %), dont 30 précisaient un stockage à la maison d'anciens produits et 30 une importa- tion illégale. Parmi les 408 cas d'exposition identifiés, 21 pa- tients étaient décédés (tous observés dans le cadre d'une conduite suicidaire) et 51 cas avaient eu des symptômes sé- vères ou mettant en jeu leur pronostic vital [1][2]. Les résultats de l'étude Pesti'home [3] sur les usages des pes- ticides à domicile, publiés par l'Anses en 2019, montraient que plus d'un quart des ménages avait dans leur stock au moins un produit de protection des plantes interdit à la vente. Par ailleurs, l'Anses recommandait de ne pas jeter à la poubelle ni vider dans l'évier les produits phytopharmaceu- tiques anciens, usagés ou interdits mais de les déposer à la déchetterie ou à l'endroit prévu par la mairie, la communauté de communes ou d'agglomération. Conclusion et recommandations Ces drames illustrent l'extrême dangerosité de produits qui peuvent être efficaces pour lutter contre des nuisibles mais qui sont interdits en France en raison de leur toxicité. La réglementation et les contrôles mis en place en Europe permettent de sécuriser les produits biocides et phytophar- maceutiques présents sur le marché et leur utilisation. A con- trario, les produits interdits sont soit des produits qui n'ont jamais été mis sur le marché car il n'était pas possible de ga- rantir un usage sans risque, soit des produits retirés du mar- ché du fait de nouvelles données scientifiques sur leur toxici- té. Une étude de toxicovigilance sur les intoxications aux pro- duits phytopharmaceutiques5 à base de substances actives 3. Les agents amérisants sont des substances ajoutées à un produit pour lui donner un goût amer et prévenir l'ingestion. 4. La réponse téléphonique à l'urgence, pour la Guyane est assurée par le Centre antipoison de Paris. 5. Les produits phytopharmaceutiques sont des préparations destinées à protéger les végétaux et les produits de culture (exemple : insecti- cide, herbicides etc. ). Vigil'Anses n15 Le bulletin des vigilances de l'Anses Novembre 2021 2 Vigilance des produits biocides et des intrants du végétal Pour éviter ce type d'accident, il faut rappeler au consomma- teur qu'il ne doit pas utiliser de produits interdits, qu'ils soient ramenés de l'étranger, achetés sur internet ou à des vendeurs à la sauvette. Pour ne pas risquer d'acheter un pro- duit contenant une substance interdite sans le savoir, le con- sommateur doit privilégier l'achat de ce type de produit dans un circuit conventionnel (commerces, grandes surfaces, ma- gasins spécialisés). La composition exacte, les indications et mentions de sécurité doivent figurer sur la boite et être im- pérativement écrites en français. Tout autre situation doit alerter sur le risque qu'il s'agisse d'un produit non autorisé en France et donc dangereux. Par ailleurs, même pour des produits autorisés en France, il reste fondamental de respecter les conditions d'emploi men- tionnées sur l'emballage. Enfin, les enfants représentent une population particulièrement vulnérable en raison de leur petit poids (les doses toxiques sont plus facilement atteintes même avec une faible quantité ingérée), de leur incapacité à percevoir le risque et de leur propension à tout mettre à la bouche. C'est la raison pour laquelle il est essentiel de les empêcher d'avoir accès aux produits toxiques (raticides, in- secticides mais aussi produits ménagers, pastilles de lessive, etc. ). Magali LABADIE (Centre antipoison de Bordeaux), Jérôme LANGRAND (Centre antipoison de Paris) et Rachel PAGES (Anses) Produits phytopharmaceutiques et biocides : cinq recommandations pour le public Acheter uniquement des produits dans des circuits conventionnels (supermarché, magasins spécialisés, etc. ) Faire appel à des entreprises spécialisées (entreprises de dératisation, etc. ) en cas d'échec de traitement Tenir les produits hors de portée des enfants Acheter des produits avec des instructions écrites en français Respecter les conditions d'emploi mentionnées sur l'emballage Références bibliographiques : [1] Rambourg M-O. 2019. Quand des produits phytopharmaceutiques non autorisés restent en circulation. Vigil'Anses 7, p. 8- 10. [2] Anses. 2019. Rapport d'étude : Expositions à des produits phytopharmaceutiques à base de substances actives non auto- risées en France métropolitaine et dans les départements et régions et collectivités d'outremer. Maisons-Alfort, 52p. [3] Anses. 2019. Rapport d'étude. Recommandations de l'Anses. Etudes Pesti'Home : Enquête nationale sur les utilisations domestiques de pesticides. Maisons-Alfort, 282p. Vigil'Anses n15 Le bulletin des vigilances de l'Anses Novembre 2021 3 | HAL | Scientific |
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Introduction Les crises d'épilepsie sont caractérisées par des décharges paroxystiques initiées par un réseau (réseau épileptogène) distribué dans différentes structures cérébrales liées par des connexions dynamiques et anormalement facilitées L'identification de ce réseau, chez un patient donné, conduit à la définition d'un geste chirurgical optimal, c'est-à-dire limitant la taille de la résection de la région d'origine des crises à la plus réduite possible Les décharges paroxystiques sont multidirectionnelles, elles peuvent emprunter plusieurs voies de propagation et peuvent déclencher l'excitation de structures secondaires Les fonctions cognitives sont associées à la mise en jeu coordonnée de plusieurs régions cérébrales intégrant à la fois des phénomènes locaux et globaux Si les méthodes de traitement du signal proposent aujourd'hui des approches conduisant à mieux définir les concepts complexes de zones irritative et épileptogène [5] ainsi que ceux de topographie (o est la source du signal ? ) et de synchronie (ces deux signaux sont-ils synchrones, donc reflétant une connectivité fonctionnelle ? ) [6], les éléments de réponse apportés s'attachent souvent à ne quantifier qu'une partie des informations contenues dans ces signaux Ces méthodes s'appuient généralement sur une approche descendante et rendent difficilement compte de la dynamique des interactions entre structures cérébrales impliquées dans les processus épileptiques Le problème de l'analyse de la propagation de l'activité épileptique est difficile à solutionner avec ces approches car le système doit faire face à des situations variables et imprévisibles (crises d'épilepsie) Ce problème est abordé ici par un système distribué coopératif et La première génération des systèmes distribués apparat au milieu des années 1970 avec le développement de l'intelligence artificielle distribuée (IAD) Cette génération est caractérisée par une distribution des connaissances et des traitements tout en conservant un contrôle centralisé Les plus importantes contributions furent celles d'Erman et Roth Hayes avec Hearsay II, un système de reconnaissance de la parole, celles de Lesser et d'Acteurs de Hewitt Les systèmes de deuxième génération, apparus aux années 1990, apportent la décentralisa-tion du contrôle, la réutilisabilité et les agents autonomes coopé-ratifs , et Le système distribué coopératif repose sur un formalisme agent qui vise à organiser et contrôler les traitements, à assurer leur coordination en intégrant au mieux les spécificités de chaque traitement afin de faire émerger les combinaisons d'intérêt entre régions cérébrales explorées On espère ainsi grâce à l'analyse par agent, une meilleure adaptabilité aux changements erratiques du signal et une gestion efficace de la complexité (par approche locale) C'est alors le contrôle Contrôle intelligent dans le traitement vectoriel des signaux épileptiques : approche expérimentale multi-agents dologique entreprise est alors exposée en détails dans la troisième partie qui présente la plateforme expérimentale du système multi-agents (SMA) dédié à l'analyse des signaux SEEG Le quatrième paragraphe discute des résultats expérimentaux obtenus et les compare à l'analyse clinique traditionnelle faite par le clinicien et la dernière partie propose une discussion des bénéfices attendus de cette approche originale dans l'analyse des signaux SEEG et élargit le questionnement sur le monitoring des patients épileptiques Cadre formel de l'étude Ce paragraphe pose le problème traité dans un contexte plus général de l'analyse de la propagation de l'activité épileptique, il transpose ensuite ce problème de traitement vectoriel des signaux SEEG en une approche coopérative organisée par un SMA dédié Le problème doit pouvoir être mieux pris en compte par l'association d'une approche locale et d'une vision globale intégrant la coopération entre les structures cérébrales mises en jeu L'analyse, le contrôle et le suivi de l'évolution de ces structures nécessitent une analyse dynamique, automatique, vectorielle et globale de tous les signaux enregistrés durant les crises Cette approche d'analyse globale devrait entrainer une caractérisation mieux ciblée des événements paroxystiques Car leur organisation se manifeste dans les signaux de profondeur par des dynamiques spatio-temporelles brèves et reproductibles formées de plusieurs structures cérébrales interconnectées et distribuées dans le cerveau Une analyse vectorielle et située, basée sur une approche combinée (traitement du signal et SMA), des signaux épileptiques, sur toutes les voies enregistrées lors de l'exploration pré-chirurgicale est proposée pour décrire l'organisation spatio-temporelle des crises Position du problème Les crises d'épilepsie sont caractérisées par des connexions qui s'organisent et se réorganisent sous forme des groupes de structure cérébrale en très forte communication Ces organisations évoluent, apparaissent, se renforcent, s'affaiblissent et disparaissent Étudier l'ensemble de ces influences, les localiser, les quantifier et les mettre en relation pose ici la question de la résolution d'un problème très complexe et de nature distribuée La notion de groupe étiquette un ensemble de structures cérébrales en mutuelles interactions La notion de réseau épi-leptogène développée par le professeur Chauvel consacre l'existence d'une coopération entre aires cérébrales dans le déclen-chement de la crise Il est aussi admis que le cerveau déve-loppe ses activités normales et pathologiques de manière répar-tie sur un mode partiellement hiérarchique Il parat judicieux de se poser la question de la dynamique de ce réseau en termes d'une succession de comportement produit par les interactions entre groupes de structures cérébrales Les questions fondamentales que pose ce travail sont celles-ci Q1) Quelles sont les premières structures qui se déclenchent en placeholder formula Démarche méthodologique Afin Communication et coopération entre agents Pour communiquer, les agents sont dotés d'un langage de communication commun comme standard La communication est directe, elle se fait par des échanges de messages asynchrones de deux manières différentes : (1) soit d'agent à agent (point à point) identifiés par leurs adresses (AgentAdress), (2) soit par diffusion sélective (multicasting) à tous les agents appartenant à un même groupe Les différents aspects coopératifs exploités dans ce travail concernent la coopération confrontative par fusion pour faire face aux incertitudes dans les prises de déci-sion et la coopération par priorité pour la sélection d'un leader par groupe homogène Lorsqu'ils sont activés, les agents signaux sont regroupés quand ils présentent des propriétés individuelles similaires dans chaque structure cérébrale Pour cela, chaque agent signal dispose de trois bases locales détaillées ci-dessous : B1) Base B 1 , elle contient la liste des attractions de l'agent signal c'est-à-dire les agents accointants avec lesquels il désire former un groupe homogène car les liens de similarité sont forts B2) Base B 2 , elle renferme la liste des répulsions de l'agent signal c'est-à-dire les agents avec qui les liens de similarité ne sont pas possibles (différences flagrantes) B3) Base Mise en oeuvre et approche algorithmique L'algorithmie signal comprend l'analyse spectrale, et les coefficients d'intercorrélation linéaire et non linéaire L'analyse spectrale évalue l'énergie en sous bandes étudiées dans l'ensemble des signaux Elle est calculée à partir de la méthode du périodogramme (équation 1) o x k, m (n) représente le signal tronqué, la valeur k fixe le nombre m de section différente du signal, k, m ( f ) est le périodogramme de la section de numéro m, k ( f ) est le périodogrmme moyenné et F FT désigne la transformée de Fourier rapide placeholder formula placeholder formula O e ik est l'énergie dans la bande k 0 k 0 et e iT repré-sente l'énergie totale du signal dans la bande T E ik est le pourcentage de l'énergie totale dans la bande k placeholder formula placeholder formula placeholder formula Le remplissage des bases locales entre deux agents suit les règles suivantes : R1) S k est inscrit dans les attractions (base B 1 ) de S i lorsque la distance euclidienne entre leurs propriétés individuelles est placeholder formula placeholder formula Le lien retenu entre deux structures porte sur la valeur la plus élevée du coefficient entre les élus de la structure explorée C'est l'étude de l'évolution de qui va traduire la dynamique spatio-temporelle de la crise analysée en matérialisant la dynamique des modifications organisationnelles Pour répondre au i) nous avons mis en place une approche basée sur l'élection d'un agent leader, représentant une entité homogène Des graphes de couplage inter-structures ainsi que l'étude des dynamiques inter-graphes apportent des réponses aux points iii) et iv) alors que des éléments de structuration en réseau orientent sur la typologie des crises et plus particulièrement sur la classification des crises d'épilepsie partielles du lobe temporal (v) Les résultats de la méthodologie sont présentés en détails sur 4 patients souffrant d'une épilepsie du lobe temporal Les seuils expérimentaux pour le paramétrage de la méthode sont dynamiquement fixés de manière à réunir progressivement les agents suivant les critères d'attraction et de répulsion Ils sont évalués par rapport au pourcentage de l'énergie totale du signal A 20 % de l'énergie totale, R 80 %, G 50 % et e 20 % Résultats expérimentaux Résultats de la sélection des agents signaux d'intérêt Une des difficultés de notre stratégie de contrôle est de matri-ser le volume de données à traiter à chaque instant La classification collaborative multicritère traitement du signal 2007 volume 24 numéro 6 455 Contrôle intelligent dans le traitement vectoriel des signaux épileptiques : approche expérimentale multi-agents Analyse des nappes spatio-temporo-spectrales Afin de dégager des éléments pertinents d'analyse pour répondre aux points ii), iii) et iv) la plateforme développée permet d'élaborer au travers de l'agent observateur une repré-sentation complète de la crise sous forme de nappe spatiotemporo-spectrale colorée Cette nappe renseigne clairement sur la cartographie des activités de fréquence essentielles dans toute analyse de crise d'épilepsie Elle met en évi-dence l'étendue des activités paroxystiques tout en fournissant une vision globale des zones cérébrales singulièrement impliquées dans les processus pathologiques Analyse des graphes de couplage inter-structures La crise étant ainsi marquée par les nappes (paragraphe précé-dent), la plateforme SMA produit également, au cours du processus d'analyse des graphes des couplages inter-structures symbolisant les liens entre structures explorées Ces liens sont représentés par les relations de similarité (noeuds du graphe) qui sont mis en évidence dans notre étude par un jeu de couleurs qui codent l'activité de fréquence dominante dans la structure C'est-à-dire celle du leader du groupe dominant dans la structure On considère qu'un groupe est dominant dans une structure lorsqu'il compte le plus grand nombre d'agents signaux Le degré de couplage est caractérisé par la mesure de relation linaire ou non entre les combinaisons de paire de voies repré-sentées par des leaders La figure 7 donne un exemple de repré-sentation des graphes à différents instants d'une crise du lobe temporal du patient P1 Elle montre que les structures impliquées dans les processus épileptiques se réorganisent au cours des différentes phases de la propagation des activités critiques Elle décrit également de manière tout à fait réaliste l'organisation du réseau des structures cérébrales qui coopèrent dans l'initiation, dans les phases de propagation et de diffusion de l'activité paroxystique C'est ainsi que la mesure des distances euclidiennes entre graphes successifs nous a permis de quantifier et 456 traitement du signal 2007 volume 24 numéro 6 Contrôle intelligent dans le traitement vectoriel des signaux épileptiques : approche expérimentale multi-agents de caractériser la dynamique des modifications organisationnelles Des graphes très proches durant les phases intercritiques, symbolisés par de faible distance entre graphes successifs sont observés On note des différences significatives aux instants de transition entre les différentes phases, et enfin des oscillations plus ou moins stables durant chaque phase viennent renseigner sur les synchronisations inter-structures Les éléments de structuration des réseaux Muni des informations produites par les paragraphes précédents et en tenant compte de la configuration globale des agents signaux , des séquences d'activation, de leur durée ainsi que de la chronologie des événements critiques mis en jeu, la plateforme SMA produit finalement des éléments d'interprétation et de typologie de la crise analysée, son ordonnancement, l'instant Conclusion Références Contrôle intelligent dans le traitement vectoriel des signaux épileptiques : approche expérimentale multi-agents Abel Kinié | ISTEX | Scientific |
Observations sur l'intérêt du dosage des sulfoconjugués urinaires pour la diagnose des intoxications professionnelles par les hydrocarbures benzéniques | WMT16 | Scientific |
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Le traitement par l'association Humira/ méthotrexate était cliniquement et statistiquement supérieur au méthotrexate (p < 0, 001) et à Humira en monothérapie (p < 0, 001) dans l'obtention d'un état d'activité basse de la maladie pour les patients chez qui une polyarthrite rhumatoïde modérée à sévère avait été récemment diagnostiquée. | EMEA_V3 | Medicinal |
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Introduction Le traumatisme crânien induit des lésions primaires et secondaires Les lésions primaires résultent directement de la transmission d'énergie à l'encéphale et sont constituées À l'inverse, les lésions secondaires sont progressives et se prolongent pendant plusieurs mois ou années dans des régions sélectivement vulnérables Les mécanismes responsables de l'évolution des lésions secondaires se caractérisent par des changements métaboliques et biochimiques faisant appel à une induction et à une libération de facteurs endogènes délétères et/ou protecteurs Ces mécanismes parmi lesquels la voie du monoxyde d'azote (NO), l'infiltration des polymorphonucléaires (PMN), la libération de cytokines pro-inflammatoires et le stress oxydant participent au développement d'une inflammation cérébrale impliquée dans la constitution de l'œdème cérébral, des lésions de la barrière hématoencéphalique et de la mort cellulaire Dès lors, la découverte de nouvelles molécules capables de limiter expérimentalement les effets délétères de la neuro-inflammation devrait offrir des perspectives d'espoir dans l'élaboration d'un traitement pharmacologique destiné à améliorer le pronostic des patients traumatisés crânien graves Traumatisme crânien et inflammation cérébrale Le traumatisme crânien est à l'origine de l'activation de plusieurs mécanismes biochimiques complexes et intriqués La libération massive et précoce de glutamate en réponse à une dépolarisation neuronale présynaptique provoque l'activation des récepteurs ionotropiques de type -amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionate (AMPA) et N-méthyl-D-aspartate (NMDA) conduisant à un afflux intracellulaire de sodium, d'eau et de calcium L'accumulation intracellulaire d'eau et de sodium contribue à la formation de l'œdème cérébral cytotoxique, l'afflux de calcium active les voies de signalisation impliquant des enzymes Ca 2 dépendantes (NO-synthases, phospholipases, endonucléases, protéases) Ces processus s'accompagnent de modification de l'expression de familles de gènes dont certains sont responsables de l'intégrité de l'homéostasie cellulaire mais d'autres, à l'inverse contribuent à la mort cellulaire Parmi ces familles de gènes activés au décours d'une agression cérébrale aigu, nombreux sont ceux qui participent au développement et à la pérennisation d'un état inflammatoire local L'expression de gènes et de protéines de l'inflammation est altérée précocement après le traumatisme et perdure tout au long du développement des lésions secondaires traumatiques Cette réaction inflammatoire se traduit par l'expression de médiateurs pro-inflammatoires comme les cytokines et les chimiokines (le facteur de nécrose tumorale [TNF], les interleukines 1, 8, 6, 10, MCP-1), des molécules d'adhésion (ICAM et p-sélectine), et des facteurs du complément par les neurones et les cellules immunitaires résidentes mais également par les neutrophiles et les monocytesmacrophages de la périphérie qui infiltrent le parenchyme cérébral Antagonistes glutamatergiques Les efforts de recherche dans la découverte de molécules neuroprotectrices dans les suites d'une agression cérébrale se sont initialement tournés vers les antagonistes glutamatergiques : antagonistes pharmacologiques des récepteurs de type NMDA, et des récepteurs non NMDA Les résultats prometteurs obtenus expérimentalement se sont poursuivis par le développement d'études cliniques : Antagonistes compétitifs du récepteur NMDA Le Selfotel (CGS 19755, Ciba-Geigy ) Le Selfotel (CGS 19755, Ciba-Geigy ), après avoir démontré son efficacité chez l'animal , a été le premier antagoniste compétitif du récepteur NMDA à être testé en phase III chez l'homme Deux essais cliniques multicentriques de phase III ont été conduits et 860 patients ont été inclus avant que l'étude ne soit prématurément arrêtée en raison de la mise en évidence d'une surmortalité dans le groupe de patients recevant le Selfotel Le D-CPP-ene (D-3-(2-carboxypiperazine-4-yl)propenyl-1-phosphonic acid, EAA494, Sandoz ) Le D-CPP-ene (D-3-(2-carboxypiperazine-4-yl)propenyl-1-phosphonic acid, EAA494, Sandoz ) a fait l'objet d'une étude clinique de phase III L'essai incluant 920 patients, reposait sur une première administration dans les 12 heures suivant le traumatisme puis deux administrations par jour pendant cinq jours, sans permettre de mettre en évidence un bénéfice clinique Antagonistes non compétitifs du récepteur NMDA Le cerestat (CNS 1102, Aptiganel, Cambridge Neuroscience) Le cérestat (CNS 1102, Aptiganel, Cambridge Neuroscience) agit sur le site de fixation du magnésium du récepteur NMDA lorsque ce dernier est activé par des concentrations élevées de glutamate Un essai de phase III a été mis en place dans 70 centres en Europe et aux États-Unis incluant 512 patients ayant subi un traumatisme crânien grave L'analyse intermédiaire de cette étude n'a pas mis en évidence d'effet bénéfique Autres antagonistes du récepteur NMDA L'éliprodil (SL 82. 0715, Synthélabo ) L'éliprodil (SL 82. 0715, Synthélabo ) est un antagoniste glutamatergique agissant sur le site des polyamides du récepteur NMDA L'analyse statistique de l'étude de phase II n'a pas montré d'amélioration neurologique Cependant une analyse en sous-groupe a mis en évidence une diminution de l'œdème cérébral Un essai de phase III a été entrepris et n'a pas montré d'effet bénéfique dans le traitement du TC Le CP 101-606 (Pfizer ) Le CP 101-606 (Pfizer ) est le plus récent de cette catégorie et présente beaucoup moins d'effets indésirables que les autres molécules de cette classe Expérimentalement, le CP 101-606 diminue l'œdème cérébral et atténue les déficits neurologiques moteurs et cognitifs L'essai de phase II incluant 400 patients a montré des effets bénéfiques et pas d'effets indésirables Les essais de phase III sont maintenant terminés mais les données ne sont pas communiquées Le dexanabinol (HU 211, Pharmos ) Le dexanabinol (HU 211, Pharmos ) est un inhibiteur non compétitif des récepteurs NMDA, un piégeur de radicaux libres, un antioxydant et un inhibiteur du TNF Les premières données expérimentales suggéraient que son utilisation pouvait s'opposer aux lésions de la barrière hématoencéphalique, à la formation de l'œdème cérébral, et diminuer le déficit neurologique dans un modèle de traumatisme crânien Néanmoins l'essai de phase III n'a pas permis de conclure à une efficacité de ce composé en clinique Le riluzole Le riluzole, substance capable d'inhiber la libération du glutamate, serait potentiellement utile Cet agent a en effet montré qu'il est capable de réduire les déficits neurologiques moteur et cognitif ainsi que l'œdème et le volume de lésion des modèles expérimentaux de traumatisme crânien Pour expliquer l'échec des stratégies neuroprotectrices visant la cible glutamatergique dans les essais cliniques, Ikonomidou et Turski émettent l'hypothèse que les effets neurotoxiques du glutamate ne surviennent qu'à la phase très précoce du traumatisme Secondairement, le glutamate serait essentiel à la régénération cellulaire Ainsi son inhibition, positive à la phase aigu serait contrebalancée par ses effets délétères à la phase de régénération Après l'échec de la cible glutamatergique , une des approches dans la recherche de stratégies thérapeutiques permettant l'amélioration du pronostic des patients traumatisés crâniens graves, s'est orientée vers la modulation de la réaction inflammatoire post-traumatique en s'intéressant entre autres à la voie du monoxyde d'azotes, aux cytokines et au stress oxydant La voie du monoxyde d'azote Le monoxyde d'azote (NO) est une molécule physiologique Le NO est un radical libre produit de la catalyse enzymatique de son substrat la L-arginine, par les NO-synthases (NOS) dont on dénombre trois isoformes : la NOS 1 ou NOS neuronale, la NOS 2 ou NOS inductible et la NOS 3 ou NOS endothéliale En grande quantité, le NO peut se combiner avec les anions O 2 formant les anions peroxynitrites ONOO hautement toxiques et participer au développement du stress oxydant et nitrosant Les données expérimentales font état d'une production accrue de NO dans les suites immédiates du traumatisme crânien Chez l'homme, des mesures indirectes permettent également de penser que les concentrations cérébrales de NO seraient fortement augmentées et corrélées à la sévérité du traumatisme Pour ces raisons, l'inhibition des NOS a été envisagée comme stratégie neuroprotectrice L'inhibition non sélective et précoce des trois NOS par le L-NAME, n'améliore pas le déficit neurologique, ni ne réduit le volume de lésion, en revanche, elle aggrave l'hypertension intracrânienne et augmente la mortalité chez le rat Dès lors, il convient de s'intéresser au rôle joué par chacune des trois NOS dans les perturbations biochimiques post-traumatiques Les effets du NO produit par la NOS 3 dans la régulation du tonus vasculaire plaident en faveur de son caractère bénéfique L'activation de la NOS 3 par la L-arginine conduit à une amélioration du débit sanguin cérébral et à une réduction du volume de la lésion après traumatisme crânien chez l'animal Le rôle délétère de l'activation de la NOS 1 parat être relativement clair L'administration d'un inhibiteur sélectif de la NOS 1 (7-NI) réduit le déficit neurologique après traumatisme crânien chez l'animal Les effets de l'inhibition de la NOS 2 restent controversés Utilisée dans des modèles expérimentaux de traumatisme crânien, l'aminoguanidine, un inhibiteur préférentiel de la NOS 2 , réduit la perte neuronale , le volume de la lésion et le nombre de cellules apoptotiques Le 1400W, autre inhibiteur sélectif de la NOS 2 permet également une réduction du volume de la lésion traumatique chez le rat Enfin, les souris invalidées pour le gène de la NOS 2 (ko NOS 2 , NOS 2 / ) ont un volume de lésion réduit par rapport aux souris wild-type 48 heures après lésion cérébrale cryogénique L'ensemble de ces données suggère que l'activation de la NOS 2 est délétère à la suite du traumatisme crânien Cependant, l'équipe de Sinz a observé que les souris ko NOS 2 présentent un déficit cognitif supérieur à celui des animaux sauvages après traumatisme crânien Elle a également montré qu'un traitement par l'aminoguanidine ou le L-NIL, deux inhibiteurs préférentiels de la NOS 2 , augmente le déficit cognitif après traumatisme crânien chez le rat Enfin, il a été mis en évidence chez des souris ko NOS 2 , une augmentation de la consommation d'ascorbate 72 heures après un impact cortical contrôlé, suggérant un effet antioxydant bénéfique du NO libéré par la NOS 2 Ainsi, le rôle du NO produit par la NOS 2 dans les conséquences physiopathologiques du traumatisme crânien reste à préciser Cytokines La complexité de la biologie de cette famille réside dans le grand nombre de ses membres, la multiplicité de ses mécanismes d'actions et la variété de leurs effets Le TNF s'est présenté comme puissant médiateur de l'inflammation cérébrale Expérimentalement, l'injection in situ de TNF provoque une neuro-inflammation, des lésions de la barrière hématoencéphalique et l'infiltration cérébrale de polymorphonucléaires de la périphérie dont les effets peuvent êtres atténués par l'administration d'anticorps neutralisants anti-TNF L'utilisation de modèles animaux a révélé des concentrations de TNF encéphalique précocement élevées après le traumatisme Chez l'homme les dosages plasmatiques et rachidiens de TNF ont également montré des valeurs augmentées Ces cytokines participent au développement de la réaction inflammatoire post-traumatique dont les effets semblent temps dépendants En effet, les conséquences d'un traumatisme crânien chez des souris n'exprimant pas le TNF différent selon que l'étude est effectuée aux temps précoces (premiers jours) ou tardifs (premières semaines) illustrant l'opposition entre des phénomènes inflammatoires initiaux délétères et des mécanismes de régénération, d'astrogliose et de neuroprotection survenant à distance Cette dualité de la réponse inflammatoire post-traumatique impliquant le TNF pourrait constituer une explication à l'échec des thérapeutiques anti-TNF en clinique malgré des résultats expérimentaux encourageants Stress oxydant Dans les conditions physiologiques, il existe un équilibre dynamique entre la génération des radicaux libres et leur dégradation grâce à un système antioxydant Lors d'une surproduction de radicaux libres le système antioxydant est dépassé et inactivé : le stress oxydant conduit à des phénomènes de peroxydation lipidique, oxydation de groupes chimiques fonctionnels protéiques et enzymatiques, atteintes et cassures de l'ADN Après un traumatisme crânien, l'augmentation des concentrations intracellulaires de calcium, de phospholipase A 2 et l'activation des monoamines oxydases (MAO), de la COX-2, et des NOS, vont contribuer à la formation de radicaux libres et au développement d'un stress oxydant post-traumatique dans les minutes qui suivent l'agression cérébrale Il existe également des arguments en faveur de la persistance d'un stress oxydant chez l'homme : Cernak et al ont montré une augmentation de la concentration en malondialdéhyde, utilisé comme marqueur de la peroxydation lipidique, pendant au moins sept jours après traumatisme crânien De nombreuses approches antiradicalaires libres ont été étudiées aussi bien en expérimentation animale qu'en clinique Le mésylate de tirilazad (aminostéroïde antioxydant), la mélatonine, l'-phényl-N-tert-butyl-nitrone (PBN), le MDL 74, 180 (2, 3-dihydro-2, 2, 4, 6, 7-pentamethyl-3-(4-methylpiperazino)-methyl-1-benzofuran-5-oldihydrochloride), l'-tocophérol et le polyéthylène glycol conjugué à la SOD (PEG-SOD) se sont révélés neuroprotecteurs dans des modèles expérimentaux de traumatisme crânien confirmant ainsi le rôle délétère du stress oxydant À ce jour, deux composés le PEG-SOD et le mésylate de tirilazad ont fait l'objet d'études cliniques Le PEG-SOD, une superoxide dismutase qui a été conjuguée à du polyéthylène glycol, est un chélateur de radicaux libres Le PEG-SOD a montré des effets bénéfiques dans des modèles expérimentaux d'ischémie cérébrale et de traumatisme crânien Lors d'un essai de phase II, l'utilisation du PEG-SOD été associée à des effets bénéfiques sur la pression intracrânienne Néanmoins, ces résultats n'ont pas été confirmés par l'étude multicentrique de phase III entreprise auprès de 463 patients traumatisés crâniens graves Le tirilazad (Freedox , Pharmacia-Upjohn) avait également fait preuve d'effets bénéfiques en termes de mortalité et de récupération neurologique dans différents modèles expérimentaux de traumatismes crâniens mais son expérimentation clinique n'a pas permis de conclure à son efficacité corticostéroïdes Les propriétés anti-inflammatoires des corticostéroïdes reposent sur l'inhibition de la peroxydation et de l'hydrolyse lipidiques Des effets sur le maintien d'un métabolisme énergétique aérobie, sur l'accumulation intracellulaire de calcium et sur la préservation du débit sanguin cérébral leur ont également été attribués Des données expérimentales plaident en faveur d'une action neuroprotectrice des corticostéroïdes dans des modèles de traumatisme crânien En revanche, les données cliniques sont plus contrastées Une revue systématique de 18 essais randomisés rapportait une réduction du risque absolu de décès de 1, 8 % chez les patients recevant des corticostéroïdes après traumatisme crânien Dernièrement la méthylprednisolone a fait l'objet d'une étude internationale multicentrique (CRASH trial : corticosteroid randomisation after significant head injury trial ) visant à évaluer l'effet de son administration à forte dose (2 g en une heure suivie d'une perfusion de 0, 4 g/h pendant 48 heures) sur la mortalité Après inclusion de 10 008 patients traumatisés crâniens (modérés à sévères) les analyses intermédiaires ont fait ressortir que le risque de décès était augmenté dans le groupe corticostéroïdes Si l'administration précoce et systématique de corticostéroïdes à tout patient victime d'un traumatisme crânien qu'il soit modéré ou grave ne permet pas d'amélioration clinique, il n'est pas exclu que ce traitement anti-inflammatoire puisse bénéficier à des sous-groupes de patients Conclusion La réaction inflammatoire post-traumatique semble être un phénomène complexe rassemblant des voies d'activation intriquées et pour certaines autoentretenues Une plus grande connaissance de ces phénomènes biochimiques devrait nous permettre de mieux préciser dans quelle mesure l'inhibition de certaines de ces voies peut revêtir un caractère protecteur ou au contraire délétère Les recherches futures devront très probablement se pencher sur les interactions des différents mécanismes pro-inflammatoires afin d'envisager la pertinence de l'inhibition pharmacologique concomitante de plusieurs d'entre elles. | ISTEX | Scientific |
Rickettsia conorii est une bactérie Gram-négative intracellulaire obligatoire.
N'entranant chez le chien qu'une affection inapparente, Rickettsia conorii est transmise à l'homme par la piqûre de la tique du chien, Rhipicephalus sanguineus, hôte intermédiaire et vecteur, déterminant chez lui une fièvre exanthématique du groupe des fièvres boutonneuses : la fièvre boutonneuse méditerranéenne.
Distribution géographique et importance
La bactérie Rickettsia conorii est présente sur le pourtour du bassin méditerranéen et en particulier dans le Sud de la France o elle provoquait en été le typhus des vendanges . Elle existe aussi en Asie Mineure, en Afrique, du bassin congolais au Kenya ( typhus du Kenya ) , en Inde et au Pakistan, .
Rickettsia conorii est absent aux Amériques, en Australie et dans le Pacifique, mais des cas importés par retour de voyage de pays endémiques sont possibles, .
Bien que pénible pour le malade, la maladie provoquée était considérée historiquement comme relativement bénigne (mortalité inférieure à 2 %), mais les formes graves sont en augmentation depuis les années 1990 (mortalité pouvant dépasser les 3 %, jusqu'à 6% et plus).
Comme pour Rickettsia rickettsii, l'antibiothérapie amoindrit les symptômes et raccourcit l'évolution et la convalescence.
Clinique
Après une incubation muette d'une semaine en moyenne, l'invasion peut être progressive, de type pseudo-grippal, ou brutale, avec frissons, fatigue, maux de tête, courbatures et fièvre à 39 - 39, 5 C en quelques heures.
A la période d'état, on retrouve la triade symptomatique : fièvre, exanthème et tache noire (escarre d'inoculation).
la fièvre se maintient à 40 C mais avec des rémissions matinales de 7 à 8 dixièmes de degré,
la tache noire , croûtelle noirâtre de 5 à 8 mm de diamètre, escarre au point d'inoculation, est à rechercher aux zones d'élection : membres inférieurs, plis de l'aine, scrotum et verge, cou et oreilles. Elle est accompagnée d'une grosse adénopathie satellite douloureuse,
l'exanthème n'apparat qu'au 6e jour, aux membres et au tronc, puis se généralise, par poussées successives, atteignant aussi bien le cuir chevelu et la face que la paume des mains et la plante des pieds. Le malade présente donc simultanément tous les stades évolutifs, depuis la macule rose, rouge puis cuivrée, jusqu'aux papulo-nodules du volume d'un pois appelés boutons (terme médicalement impropre mais d'usage consacré avec l'appellation fièvre boutonneuse).
De plus, le malade souffre de violents maux de tête, sa nuque est raide, il a de la photophobie, des insomnies et des bouffées délirantes.
Après 10 à 12 jours, la fièvre tombe, une crise urinaire importante se déclenche, l'exanthème et la croûtelle de la tache noire disparaissent en laissant des taches pigmentées.
Le malade guérit, mais au prix d'une convalescence pénible avec asthénie prolongée.
Diagnostic
Le diagnostic clinique est facile en zone d'endémie mais, ailleurs, la confusion avec la grippe est courante.
Le laboratoire, du fait de l'immunité croisée, ne peut que dire fièvre du groupe boutonneux , après agglutination de proteus X2.
Le diagnostic moléculaire est possible sur le sérum ou la biopsie cutanée avec des sondes spécifiques pour la RT-PCR voire le séquençage avec les gènes cibles suivants :
ompA : gène codant l' outer membrane protein A - protéine membranaire spécifique des rickettsies du groupe boutonneux.
ompB : gène codant l' outer membrane protein B - protéine membranaire existant chez toutes les espèces de rickettsie.
gltA : gène codant la citrate synthétase.
Les techniques génomiques distinguent plusieurs sous-espèces de R. conorii, dont les principales sont :
R. conorii conorii, agent de la fièvre boutonneuse méditerranéenne (pourtour de la méditerranée, Europe centrale et du sud, Afrique du Nord et sub-saharienne) ;
R. conorii israelensis, agent de la fièvre boutonneuse israélienne (méditerranée orientale).
R. conorii caspia, agent de la fièvre d'Astrakhan (région de la mer caspienne).
R. conorii indica, agent du typhus indien à tiques (Inde et Pakistan).
Traitement
Le chloramphénicol était le traitement de choix en 1980 mais actuellement la doxycycline est le traitement de référence pour une durée conditionnée par l'évolution clinique.
Notes et références
Articles connexes
Rickettsia
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Le traitement des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées avec un laser Er : YAG et les ciments verres ionomères hautes viscosites Paul Gazan To cite this version : Paul Gazan. Le traitement des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées avec un laser Er : YAG et les ciments verres ionomères hautes viscosites. Médecine humaine et pathologie. 2019. dumas-02389729 HAL Id : dumas-02389729 Submitted on 2 Dec 2019 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. UNIVERSITÉ NICE-SOPHIA ANTIPOLIS FACULTÉ DE CHIRURGIE DENTAIRE 24 Avenue des Diables Bleus, 06357 Nice Cedex 04 LE TRAITEMENT DES LESIONS CARIEUSES RADICULAIRES CHEZ LES PERSONNES ÂGEES AVEC UN LASER Er : YAG ET LES CIMENTS VERRES IONOMERES HAUTES VISCOSITES Année 2019 Thèse n42-57-19-25 THÈSE Présentée et publiquement soutenue devant la Faculté de Chirurgie Dentaire de Nice Le jeudi 11 juillet 2019 par Monsieur Paul GAZAN Né le 28 03 1992 à Versailles Pour obtenir le grade de : DOCTEUR EN CHIRURGIE DENTAIRE (Diplôme d'État) Examinateurs : Madame le Professeur Madame le Docteur Monsieur le Docteur Monsieur le Docteur Madame le Docteur Claire LASSAUZAY Nathalie BRULAT Eric LEFORESTIER Thomas GEMMI Elisabetta MERIGO Président du jury Directeur de thèse Assesseur Assesseur Membre invité 1 2 REMERCIEMENTS A Madame le Professeur Claire LASSAUZAY Docteur en Chirurgie Dentaire Professeur des Universités - Praticien hospitalier Je vous remercie de me faire l'honneur de présider le jury de ma thèse. Au cours de nos années d'étude, j'ai pu bénéficier de vos précieux conseils et de la richesse de vos enseignements, notamment en prothèse amovible partielle. Je vous remercie de votre encadrement et votre aide dans la réalisation de ce travail. Veuillez trouver dans ce travail, l'expression de tout mon respect et de ma profonde estime. A Madame le Docteur Nathalie BRULAT-BOUCHARD Docteur en Chirurgie Dentaire Matre de Conférence des Universités - Praticien hospitalier Je vous remercie de m'avoir proposé ce sujet de thèse et d'en avoir accepté la direction. Je souhaite vous exprimer ma profonde gratitude pour votre gentillesse durant toutes ces années sur le plan professionnel et personnel. Ce fut un immense privilège d'évoluer à vos côtés et je vous en serai éternellement reconnaissant. En espérant que cette thèse soit à la hauteur de vos attentes, soyez assurée de l'expression de ma plus grande gratitude et de tout mon respect. A Monsieur le Docteur Eric LEFORESTIER Docteur en Chirurgie Dentaire Maitre de Conférence des Universités Praticien Hospitalier Je vous remercie de l'honneur que vous me faites en acceptant de siéger au sein de ce jury de thèse. Je vous suis très reconnaissant pour l'enseignement que vous m'avez transmis durant toutes ces année, en clinique comme à la faculté. Votre sérieux, votre implication dans le métier et votre gentillesse ont grandement participé à rendre ces études agréables et passionnantes. Veillez recevoir l'assurance de ma gratitude et l'expression de mes profonds remerciements. 3 Je vous remercie d'avoir accepté de juger de mon travail. Votre enthousiasme, votre gentillesse, votre patience sont autant de qualités que j'ai pu apprécier durant toutes ces années. Je vous suis particulièrement reconnaissant pour votre soutien et votre implication en clinique qui m'ont permis de progresser dans le métier et dans la gestion de certains cas cliniques. Ce fut un immense plaisir d'avoir travaillé à vos côtés. Je vous prie de trouver dans ce travail l'expression de ma sincère gratitude. A Madame le Docteur Elisabetta MERIGO Docteur en Chirurgie Dentaire Assistant Hospitalo-Universitaire Praticien Hospitalier A Monsieur le Docteur Thomas GEMMI Docteur en Chirurgie Dentaire Assistant Hospitalo-Universitaire Praticien Hospitalier Je vous remercie d'avoir accepté mon invitation à cette soutenance de thèse. Votre enthousiasme et votre gentillesse sont des qualités que j'ai pu apprécier durant l'année o j'ai pu vous côtoyer en clinique. Je vous prie de trouver dans ce travail l'expression de toute ma gratitude et de mon profond respect. 4 Table des matières INTRODUCTION . 7 BUT DE L'ETUDE . 8 MATERIEL ET METHODES . 8 I) Le patient âgé . 9 Les caractéristiques physiologiques de la personne âgée . 9 1) 2) Les caractéristiques du patient âgé dépendant . 10 2. 1 Etat de santé générale de la personne âgée dépendante . 10 2. 2 La cavité buccale de la personne âgée dépendante . 11 3) La lésion carieuse radiculaire . 13 II) Les matériaux de restauration des lésions carieuses radiculaires . 15 1) Cahier des charges . 15 2) 3) Les matériaux de restaurations des lésions carieuses radiculaires . 16 Les Ciments Verres Ionomères (CVI) . 16 3. 1 Prise du CVI . 16 3. 2 Etanchéité des CVI . 17 3. 3 Propriétés mécaniques . 19 3. 4 Propriétés biologiques . 19 3. 5 Propriétés optiques . 20 3. 6 Récapitulatif des avantages et des inconvénients des CVI . 21 3. 7 Les Ciments Verres Ionomères Modifiés par Adjonction de Résine (CVIMAR) et les Ciments Verres Ionomères à Haute Viscosité (CVIHV). 21 III) Les différents moyens d'éviction des lésions carieuses radiculaires . 23 La technique chimique : le Carisolv . 23 1) 2) 3) 4) 5) La technique conventionnelle . 24 La technique atraumatique . 24 La sono-abrasion . 26 Les lasers . 27 5. 1 . Généralités sur le laser 27 5. 2 . Indication du laser dans les thérapeutiques dentaires 30 5. 3 . Le laser Er : YAG 31 5. 3. 1 . Fonctionnement du laser Er : YAG 31 5 5. 3. 2 . Interaction du laser Er : YAG avec les tissus dentaires 32 5. 3. 3 . Aspect microscopique des tissus dentaires après irradiation au laser Er : YAG 33 IV) Discussion . 35 1) Etude des matériaux de restauration utilisés dans la restauration des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées dépendantes . 35 2) Comparaison des différentes méthodes d'éviction carieuse chez la personne âgée dépendante. 36 V) Présentation de deux cas cliniques . 39 Protocole clinique . 39 1) 2) Présentation des cas cliniques . 39 2. 1 Cas clinique 1 . 40 2. 2 Cas clinique 2 . 41 CONCLUSION. 42 BIBLIOGRAPHIE . 44 LISTE DES FIGURES . 51 LISTE DES TABLEAUX . 52 6 INTRODUCTION L'Organisation Mondiale de la Santé définit la personne âgée comme étant une personne dont l'âge est supérieur ou égal à 65 ans (1). Dans le monde, la population âgée de plus de 65 ans était de 506 millions en 2008 et pourrait atteindre 1, 4 milliard en 2040 (2). En France o l'espérance de vie est élevée (85, 3 ans pour les femmes et 79, 5 ans pour les hommes en 2017) (3), les soins aux personnes âgées constituent un problème de santé publique ainsi qu'un défi futur pour le personnel de santé. En 2019, l'INSEE recense environ 13, 5 millions de personnes âgées de plus de 65 ans contre 9, 5 millions en 2000. Certaines personnes âgées nécessitent une prise en charge adaptée à leur état de santé général et à leur capacité à coopérer pendant les soins, parfois limitée en fonction de leur degré d'autonomie. D'autres, atteintes de troubles cognitifs, peuvent même s'opposer aux soins qui leur sont prodigués. Leur compliance aux rendez-vous est souvent limitée. Ces personnes âgées présentent un état de santé bucco-dentaire fortement dégradé pouvant être lié à un brossage des dents mal conduit, ou mal réalisé par le personnel soignant. Après avoir exposé les effets du vieillissement chez la personne âgée, les différents facteurs amenant à un état bucco-dentaire dégradé des personnes âgées dépendantes seront décrits. Selon l'INSEE, la dépendance d'une personne âgée est définie comme un état durable de la personnes entrainant des incapacités et requérant des aides pour réaliser des actes de la vie quotidienne (4). L'hygiène bucco-dentaire des patients âgés dépendants est souvent insatisfaisante et ils présentent un nombre plus important de lésions carieuses, et notamment de lésions carieuses radiculaires (5). Après avoir décrit les différents moyens de restauration des lésions carieuses radiculaires et les différents moyens d'éviction de ces lésions chez les patients âgés dépendants, une approche thérapeutique en utilisant le laser Er : YAG pour les personnes âgées dépendantes sera proposée. 7 BUT DE L'ETUDE L'approche thérapeutique proposée s'efforcera de répondre aux trois questions suivantes : - Les CVIHV sont-ils les biomatériaux adéquats pour restaurer des lésions carieuses radiculaires après irradiation par laser Er : YAG ? - Le laser Er : YAG constitue-t-il une alternative thérapeutique avantageuse chez les personnes âgées dépendantes ? - Le laser Er : YAG est-il efficace sur la dentine sclérotique ? MATERIEL ET METHODES La recherche dans la littérature sur Google Scholar, PubMed et Cochrane des articles traitant des personnes âgées dépendantes, présentant des lésions carieuses radiculaires traitées à l'aide du laser Er : YAG et restaurées avec un Ciment Verre Ionomère Haute Viscosité (CVIHV) n'a donné aucun résultat (avec les mots-clés suivants : Glass Ionomer Cement, elderly , root caries, Er : YAG laser). Puis la recherche a été élargie en prenant en compte les mots-clés suivants : - GIC, Er : YAG laser, root caries : 1 article - Root caries, elderly, GIC : 5 articles - ART, elderly, root caries : 12 articles 8 I) Le patient âgé 1) Les caractéristiques physiologiques de la personne âgée Le vieillissement physiologique se définit comme l'ensemble des modifications se produisant au cours du vieillissement de l'individu, en dehors de toute maladie. Il s'agit d'une involution des différents systèmes qui touche le corps dans son ensemble et induit une limitation de l'adaptation de l'organisme à une nouvelle situation mettant en jeu les réserves fonctionnelles comme le stress, l'effort ou encore la maladie. (6) Certaines capacités sont amoindries chez les personnes âgées. En effet, la capacité respiratoire est souvent diminuée, due en partie à des tassements vertébraux, ou à une augmentation de la rigidité thoracique (7). Les articulations présentent une tendance à l'ankylose (7). C'est un processus physiologique qui intervient à tous les niveaux, aussi bien tissulaire que cellulaire. La masse de tissu fibreux augmente, ainsi que la masse grasse alors que la masse maigre diminue, augmentant ainsi le risque de déshydratation et de déséquilibre électrolytique chez la personne âgée (7). Certains tissus sont remodelés : le myocarde s'épaissit et se rigidifie, les artères se rigidifient par augmentation du collagène et diminution de l'élastine (c'est le phénomène d'artériosclérose). Les sensibilités olfactives, auditives et gustatives sont également amoindries chez les personnes âgées. Certaines capacités cérébrales sont également affectées : la mémoire immédiate et la capacité à l'apprentissage sont diminuées. Avec le vieillissement, de multiples changements concernant l'immunité se produisent et sont à l'origine d'une immunodépression acquise (8). Les personnes âgées peuvent présenter des difficultés à se déplacer, mais aussi à supporter une longue séance de soins (9). Elles nécessitent donc une prise en charge rapide afin de limiter le temps au fauteuil, avec un plateau technique adapté et du personnel de santé formé en gériatrie (9). Au niveau de la cavité buccale, le nombre de patients âgés dentés est en augmentation (10). L'organe dentaire, durant la sénescence, subit des modifications. Les patients présentent une usure dentaire physiologique : l'émail, sous l'effet de l'attrition, subit une usure lente (7). Le tissu amélaire est hyperminéralisé et peut être à l'origine d'une cario-résistance (7). Une sclérose dentinaire par apposition de dentine péritubulaire se produit (7). Il en résulte une augmentation de la dureté, une diminution de la perméabilité et une diminution de la sensibilité 9 dentinaire (7). La cavité pulpaire se réduit progressivement en volume, conséquence directe de l'apposition physiologique de dentine secondaire en périphérie de la chambre pulpaire. Les patients présentent souvent une récession parodontale généralisée, laissant apparaitre la partie coronaire de la racine et des espaces interdentaires plus importants (7). 2) Les caractéristiques du patient âgé dépendant 2. 1 Etat de santé générale de la personne âgée dépendante Une personne âgée dépendante est une personne de plus de 65 ans, ne pouvant plus vivre par elle-même à cause d'un déficit moteur et/ou cognitif (9). Un certain nombre de pathologies touche plus particulièrement les personnes âgées et peuvent être à l'origine de leur perte d'autonomie (7). Ce sont des pathologies comme les affections dégénératives du système nerveux central (Alzheimer, Parkinson), les pathologies vasculaires cérébrales, les maladies dépressives ou encore les arthropathies (7). Ces patients sont souvent polymédiqués et présentent des risques infectieux, médicamenteux ou hémorragiques qu'il convient de déterminer avant de les prendre en charge. Un risque est défini comme un évènement dommageable dont la survenance est incertaine, et se trouve donc associé à une notion d'incertitude. On définit trois types de risques en odontologie (11) : - Le risque infectieux. Chez les personnes âgées dépendantes, le système immunitaire est moins efficace (8) - Le risque médicamenteux. Le nombre de médicaments avec lesquels sont traités les patients âgés dépendants augmente le risque d'entrainer des effets secondaires voire indésirables par interaction médicamenteuse (11) - Le risque hémorragique. Parmi les nombreux médicaments que sont susceptibles de prendre les patients âgés dépendants, les anticoagulants ou les anti-agrégants plaquettaires sont à prendre en compte lorsqu'un acte invasif doit être réalisé (11). Chacun de ces risques doit être identifié par le praticien qui devra ensuite juger s'il dispose de la capacité, du matériel et de l'aide nécessaire pour soigner de façon sûre son patient. 10 2. 2 La cavité buccale de la personne âgée dépendante Le maintien d'une bonne hygiène bucco-dentaire est nécessaire car elle contribue à un bon coefficient masticatoire (9). Ce coefficient attribue une note entre 1 et 5 à chaque dent à condition qu'elle ait un antagoniste (0 quand une dent est absente) (12). Plus il est élevé, plus la mastication est efficace. Un coefficient masticatoire élevé participe à une bonne alimentation, au maintien d'un confort dans la vie quotidienne et à un meilleur état de santé général. Chez les patients ayant toute leurs dents sur l'arcade, il est de 100. Lorsque ce coefficient est inférieur ou égal à 70, la mastication est considérée comme inefficace (13). En revanche, une cavité buccale en mauvais état peut avoir des répercussions sur l'état de santé général. En effet, une santé bucco-dentaire dégradée peut conduire à la naissance de foyers infectieux dans la cavité buccale qui peuvent entrainer des bactéries dans le système respiratoire (14, 15) ou cardiovasculaire (16). Une cavité buccale dégradée peut également conduire à des carences, une malnutrition (17) ou entrainer des problèmes d'élocution pouvant conduire à une isolation sociale ou familiale (18). Par exemple, l'étude menée par Prêcheur et Chevalier, 2014, met en évidence la prévalence élevée de la dénutrition chez les personnes âgées dépendantes de plus de 70 ans (19). La dénutrition augmente le risque de chutes, de handicap, de maladies infectieuses, d'escarres, de dépression, d'institutionnalisation, ainsi que la mortalité (20, 21, 22, 23). Or, la dénutrition peut être liée à un état bucco-dentaire dégradé : douleurs buccales, sécheresse buccale, caries non traitées, mobilités dentaires, édentement et port de prothèses inadaptées (24, 25, 26). Chez les patients dénutris, le coefficient masticatoire est d'environ 48 (9). L'ensemble de ces facteurs entraine des difficultés pour mastiquer et pour déglutir, et peut donc amener à une diminution des apports nutritionnels. La Société Française de Gériatrie et Gérontologie dresse un constat alarmant sur l'état de santé bucco-dentaire des patients résidant en institution, montrant ainsi que (27, 28, 29, 30, 31, 32) : - La toilette de la cavité buccale est un acte essentiel dans la réduction du risque infectieux, en particulier pulmonaire - La perte d'autonomie partielle ou totale des patients pour les actes de la vie quotidienne est un facteur important. En effet, environ 2/3 d'entre eux ont besoin des soignants pour effectuer leur hygiène bucco-dentaire et le nettoyage de leurs prothèses amovibles. Or, on constate également que le personnel soignant accorde peu de temps à l'hygiène bucco-dentaire des résidents 11 - La majorité des résidents a une hygiène buccale insuffisante et un besoin de soins dentaires, l'état parodontal est mauvais, en rapport avec la présence d'une plaque bactérienne et de tartre. Deux études (33, 34) dressent un constat sur l'hygiène bucco-dentaire et la nécessité de traitements chez des patients résidant en institution ou à l'hôpital. Les auteurs constatent qu'environ 40% des patients ont une hygiène bucco-dentaire et prothétique satisfaisante. De plus, plus la personne est dépendante pour la toilette de la cavité buccale, plus l'hygiène est insatisfaisante (33). Parmi cette population : 70% présentent au moins une lésion carieuse (34), 26. 9% sont édentées (33) et 29, 1% d'entre eux ont une halitose (33). La majeure partie des résidents portent des prothèses amovibles, dont 33, 4% sont inadaptées (33). L'ensemble de ces facteurs augmente le risque de développer des lésions carieuses radiculaires. Ce sont des lésions multifactorielles qui proviennent d'une absence d'hygiène bucco-dentaire. Chi et al. , 2013, ont dressé une liste des facteurs de risque des caries radiculaires (35, 36). L'âge, la profondeur des poches parodontales et la surface radiculaire exposée au milieu buccal entrainent un risque accru d'apparition de lésions carieuses radiculaires (35). Une hyposialie, une alimentation riche en sucres, le tabac, une mauvaise hygiène bucco-dentaire, le port de prothèses amovibles et des visites peu fréquentes chez le dentiste sont également des facteurs qui augmentent l'apparition des lésions carieuses radiculaires (35). Un facteur aggravant du patient âgé dépendant est l'hyposialie. Elle se définit comme une diminution du flux salivaire et se rencontre fréquemment chez les personnes polymédiquées, en particulier chez celles prenant des psychotropes ou sous des traitements médicaux particuliers (prise de bétabloquants, chimiothérapie, radiothérapie) (37). Elle contribue à l'apparition de lésions carieuses radiculaires. 12 3) La lésion carieuse radiculaire Entre 1990 et 2010, il a été estimé que 35% de la population générale présentait au moins une carie non traitée sur une dent permanente (38). Une carie non soignée peut entrainer des douleurs voire des pertes dentaires, impactant fortement les fonctions de l'appareil manducateur et la qualité de vie (39). En France, le maintien d'une bonne hygiène bucco-dentaire chez les personnes âgées et d'une efficacité masticatoire correcte constituent des enjeux de santé publique (9). Une baisse significative de l'édentement chez les personnes âgées a été observée ces dernières années (38), conséquence d'une prévention plus efficace et d'une amélioration des plateaux techniques, et donc une augmentation du nombre de dents en présence sur l'arcade. La plupart des lésions carieuses chez les personnes âgées se situent sur les racines dentaires exposées (39). Bien que limitées en nombre, différentes études montrent que la prévalence des lésions carieuses radiculaires est élevée chez les personnes âgées de plus de 65 ans, mais également qu'elle augmente avec l'âge. Par exemple, la prévalence des lésions carieuses radiculaires parmi la population des Etats-Unis est de 46% chez les plus de 65 ans, contre 30, 8% chez les 50-64 ans et 1, 4% chez les 20-34 ans (39). Les lésions carieuses radiculaires sont des lésions chroniques et progressives. Elles se caractérisent par un état de surface irrégulier et mou situé au niveau de la jonction amélo- cémentaire (40). Nyvad et Fejerskov, 1998, décrivent deux phases dans le développement de la lésion carieuse radiculaire (41). D'une part, la lésion active : de couleur jaune ou marron claire, le tissu est crayeux au sondage et il peut y avoir ou non une cavitation. D'autre part, la lésion arrêtée : de couleur marron ou noire foncée, la surface est dure. Ces lésions présentent deux types de difficultés dans leur prise en charge. D'une part, des difficultés liées au substrat en présence (42). L'agression du complexe pulpo-dentinaire conduit à la formation d'une dentine réactionnelle et/ou réparatrice, zones réfractaires au collage. Deux études (43, 44) ont mis en évidence deux types de tissus : le substrat sus-jacent à la dentine sclérotique, et la dentine sclérotique. Le premier est composé de trois couches réfractaires au collage : une zone de surface non minéralisée et composée de colonies bactériennes, une zone de matrice intermicrobienne minéralisée, et une zone hyperminéralisée de subsurface. Quant à la dentine sclérotique, elle se caractérise par une oblitération partielle ou complète du réseau de tubuli, conséquence d'une apposition de dentine péritubulaire. L'hyperminéralisation des tissus 13 modifie la structure du treillis collagénique, ce qui va réduire l'épaisseur de la couche hybride et diminuer en nombre et en longueur les brides de résine. D'autre part, des difficultés liées à la situation de la lésion (44). Elles peuvent être sous- gingivales, limitant la visibilité et l'accès à l'instrumentation. Cette localisation précise rend plus compliquée la mise en place d'un champ opératoire étanche, nécessaire à l'utilisation de certains matériaux de restauration. C'est au niveau des restaurations cervicales que le facteur cavitaire est le plus élevé (on le situe autour de 5), ce qui est défavorable à l'obtention d'un collage optimal. En effet, Feilzer de Gee et al. , 1987, ont défini le terme de facteur C pour facteur cavitaire (45). Ils ont ainsi déterminé l'interrelation entre le nombre de surfaces collées et le nombre de surfaces non collées, ce qui leur a permis d'expliquer le développement des contraintes subies par les matériaux composites lors de leur polymérisation, en fonction du dessin cavitaire et du nombre de parois collées. Plus le facteur C est élevé, plus le matériau subit des stress de polymérisation importants au niveau des interfaces. 14 II) Les matériaux de restauration des lésions carieuses radiculaires La zone cervicale est soumise à d'importantes contraintes. La théorie de l'abfraction suggère que les forces de flexion sont importantes au niveau cervical (46). Un matériau de restauration des pertes de substances cervicales se doit d'être dur pour résister à l'érosion et flexible afin de résister aux forces de flexion. C'est également une zone o le tissu dentinaire est plus présent quantitativement que le tissu amélaire. Il faut donc un matériau avec une forte adhésion aux tissus dentaires. 1) Cahier des charges Idéalement, le matériau pour les restaurations directes des lésions carieuses radiculaires devrait présenter les caractéristiques suivantes (47, 48) : - Adhésion suffisamment forte à la dentine radiculaire - Résistance à la flexion - Résistance à la compression - Résistance à la traction - Propriété cariostatique prévenant la formation de caries secondaires - Biocompatible - Compatibilité avec un syndrome sec - Résistance à la corrosion - Durée de vie suffisamment élevée - Facilité à être manipulé et à être mis en place - Suffisamment esthétique - Prix peu élevé 15 2) Les matériaux de restaurations des lésions carieuses radiculaires Il existe plusieurs matériaux pour restaurer les lésions carieuses radiculaires. L'amalgame a l'avantage d'être facile à manipuler et ne nécessite pas obligatoirement d'isolation. Il possède de bonnes propriétés mécaniques. En revanche, il est non bioactif (il ne relargue par de fluor) et inesthétique. Il ne possède aucune propriété d'adhésion, c'est pour cela qu'il est nécessaire de réaliser des artifices architecturaux au détriment des tissus sains. S'il était utilisé il y a une dizaine d'années, il est maintenant souvent remplacé par des matériaux tels que les résines composites ou les Ciments Verres Ionomères (CVI). Toutefois, il s'agit du matériau de restauration directe sur lequel le recul est le plus important et qui a la durée de vie la plus longue des matériaux actuels (moyenne de 14 à 20 ans) (49). Les résines composites sont plus difficiles à manipuler. Elles possèdent de bonnes propriétés mécaniques et de bonnes propriétés d'adhésion aux tissus dentaires minéralisés. Elles nécessitent toutefois une isolation parfaite afin que le collage soit effectué dans des conditions optimales. Ce biomatériau n'est pas bioactif, mais il présente de bonnes propriétés optiques, ce qui fait des résines composites les biomatériaux indiqués lorsque des critères esthétiques rentrent en jeu. La durée de vie des résines composites se situe en moyenne autour de 8, 5 ans (50). 3) Les Ciments Verres Ionomères (CVI) Il existe trois catégories de CVI : les CVI traditionnels, les CVI modifiés par Adjonction de Résine (CVIMAR) et les CVI à Haute Viscosité. Les CVI sont faciles à manipuler, bioactifs et ne nécessitent pas obligatoirement d'isolation. Ils possèdent un potentiel d'adhésion aux structures dentaires légèrement contaminées. S'ils restent moins esthétiques que les résines composites, ils sont bien plus esthétiques que les amalgames. Leurs propriétés mécaniques sont faibles, ce qui contre-indique leur utilisation quand il existe un contact occlusal. Leur durée de vie est faible comparée à celle des autres matériaux : de 3 à 5 ans pour les CVI traditionnels. (51). 3. 1 Prise du CVI Ce sont des ciments polyalkénoates, composés de particules de fluoro-alumino-silicates (FAS) qui sont broyées sous forme de fine poudre et décomposées ensuite par attaque acide. Cette poudre est principalement constituée de trois éléments dans des proportions différentes : 16 Figure 1 : composition de la poudre de FAS l'alumine (AlO), la silice (SiO) et la fluorite (CaF). Les autres composants servent principalement à conférer au CVI d'autres propriétés (transparence, radio-opacité) (tableau 1). Les CVI sont issus d'une réaction acide-base. La base correspond à la poudre de FAS, et le liquide à l'acide polyacrylique. La réaction forme un polysel entourant les particules de verres n'ayant pas complétement réagi. Les ions H de l'acide attaquent les particules de FAS, libérant ainsi des ions Ca et Al pour former un ciment constitué du corps des particules. Ces particules sont engainées d'un gel de silice, au sein d'une matrice de polyanions unis par des ponts ioniques. La réaction de prise des CVI se fait de manière chémopolymérisable lorsque la poudre et le liquide sont mélangés. Elle peut également se réaliser de manière dual , c'est-à- dire avec une composante chémopolymérisable et photopolymérisable. Tableau 1 : Composition de la poudre de FAS Source : Les ciments verres ionomères à haute viscosité. Biomatériaux Cliniques. 3. 2 Etanchéité des CVI 3. 2. 1 Adhésion intrinsèque L'adhésion des CVI à la dentine et à l'émail est réalisée par une composante physico-chimique intrinsèque au CVI (il n'est donc pas nécessaire d'utiliser un adhésif comme on le ferait dans le cas de restaurations composites), et par une composante mécanique (adhésion micromécanique). Il se crée une zone de double échange à l'interface dent/CVI entre les charges négatives des polyacides (chaines COO) de la matrice et les charges positives de l'hydroxyapatite (ions calcium Ca). Au niveau dentinaire, l'adhésion est assurée par des liaisons hydrogènes avec le collagène de la dentine (figure 1). 17 Cependant, même si les CVI possèdent une adhésion intrinsèque à la dent, l'utilisation d'un acide polyacrylique à 10% ou 20% pendant quinze secondes pour prétraiter la surface de la dent permet d'optimiser l'adhésion à la dent (tableau 2). Figure 1 : Mécanisme d'adhésion chimique aux tissus dentaires Sans prétraitement l'acide polyacrylique Avec l'acide polyacrylique prétraitement à à Email 3-6 MPa 6-7 MPa Dentine 2-4 MPa 4-6 MPa Tableau 2 : Valeurs d'adhérence des CVI aux tissus dentaires Source : Les Ciments Verres Ionomères. Société Francophone de biomatériaux dentaires. L'étanchéité est une des propriétés fondamentales des matériaux de restauration coronaire. Il convient de distinguer l'étanchéité immédiate de l'étanchéité médiate (52). 3. 2. 2 Etanchéité immédiate Elle se définit comme l'étanchéité obtenue directement lors de la mise en œuvre du matériau de restauration en bouche. Elle dépend de plusieurs facteurs : - L'adhésion. Un matériau adhérant fortement à la dent (comme c'est le cas pour le CVI) est plus étanche. - Les variations dimensionnelles. Si le matériau se contracte pendant sa réaction de prise, les forces issues de ces contraintes peuvent se transmettre à l'interface et donc entrainer 18 une perte d'étanchéité. Dans le cas du CVI, la rétraction est assez faible (de l'ordre de 3 à 5%), entrainant donc peu de répercussions sur l'interface. - De la mise en œuvre du matériau. Même s'il est plus tolérant à l'humidité que le sont les résines composites, le CVI contient un composant (le sel de polyacrylate de Ca) sensible à l'humidité. L'eau provenant du milieu buccal peut hydrolyser ce sel, il en résultera une perte significative de sa cohésion, et donc de l'étanchéité du matériau - L'action de la déshydratation. La déshydratation du CVI durant la phase initiale de réaction de prise provoque une contraction importante du matériau entrainant l'apparition de microfissures au sein du CVI. Le CVI sera donc plus fragile et moins étanche 3. 2. 3 Etanchéité médiate Aussi appelée étanchéité retardée, elle se définit comme l'étanchéité caractérisant le matériau lorsque que celui-ci est soumis aux sollicitations physiques, chimiques et mécaniques de la cavité buccale. Elle est dépendante de plusieurs facteurs. D'une part, le coefficient de dilatation thermique : une trop grande différence entre le coefficient de dilatation thermique du matériau de restauration et celui de la dent peut entrainer un choc thermique, favorable à une perte d'étanchéité. Celui du CVI étant de 11. 10/C, il est assez proche de celui de l'émail (11. 10/C) et de la dentine (8. 10/C). Il existe donc peu de risques qu'il se créé un choc thermique pouvant nuire à l'étanchéité du CVI. D'autre part, la résistance à l'usure. Le problème ne se pose pas pour les CVI dans la mesure o leur utilisation dans les zones de sollicitations occlusales est déconseillée. Des contraintes occlusales sur le matériau peuvent entrainer l'apparition de microfissures au sein de la matrice. 3. 3 Propriétés mécaniques Compte tenu des très faibles propriétés mécaniques des CVI, ceux-ci sont déconseillés dans les zones o il existe des contacts occlusaux directs. En effet, leur résistance à la flexion, l'abrasion et la compression sont trop faibles pour être utilisé dans ces zones, sauf en cas de temporisation. 3. 4 Propriétés biologiques 3. 4. 1 Toxicité La toxicité d'un matériau sur la pulpe dépend directement de l'étanchéité que celui-ci offre au niveau des limites de la cavité. De ce point de vue, les CVI garantissent une bonne étanchéité, 19 et donc une très bonne tolérance pulpaire. De plus, le prétraitement de surface à l'acide polyacrylique n'élimine pas la totalité de la boue dentinaire, il est donc assez rare d'observer des sensibilités post-opératoires après la mise en place de CVI. La toxicité d'un matériau sur le parodonte dépend de son état de surface. Même si les CVI sont difficiles à polir, ils n'en restent pas moins compatibles avec une bonne santé parodontale. C'est un avantage non négligeable pour ce matériau dans la mesure o il est utilisé dans les restaurations cervicales. 3. 4. 2 Bioactivité Les CVI libèrent des ions fluorures dans la salive et vers la dent, pendant et après leur réaction de prise. Le pic de libération des ions fluor est atteint quelques heures après leur mise en place. La libération des ions fluorures présente certains avantages. En effet, les ions fluors possèdent un caractère antibactérien, ils augmentent la résistance à la solubilité des tissus dentaires en milieu acide, et permettent également la reminéralisation des tissus partiellement déminéralisés. De plus, les ions fluors adsorbés à la surface des tissus dentaires entrainent un abaissement de la tension superficielle de l'émail, et donc un potentiel moindre pour l'adhésion de la plaque bactérienne. Les CVI peuvent à la fois se recharger et relarguer les ions fluors. 3. 5 Propriétés optiques Même si les diverses améliorations qu'ont connu les CVI ont eu pour but d'homogénéiser l'indice de réfraction entre le CVI et la matrice, les propriétés optiques des CVI sont à ce jour bien loin de celles que peuvent proposer les résines composites. La qualité de surface joue un rôle prépondérant dans les propriétés optiques des matériaux de restauration. Or, les CVI sont constitués de particules de verres de plusieurs dizaines de microns, rendant la finition de ce matériau difficile, et donc ses propriétés optiques faibles. 20 3. 6 Récapitulatif des avantages et des inconvénients des CVI Avantages des CVI Inconvénients des CVI - Adhésions aux structures dentaires, même légèrement contaminées - Relargage de Fluor - Aucune toxicité sur la pulpe ou le parodonte - Bonne étanchéité médiate et immédiate - - Propriétés optiques moyennes - Propriétés mécaniques très faibles : les CVI sont contre-indiqués dans les Isolation non obligatoire zones o il existe des contacts occlusaux - Polissage différé - Peu résistant à moyen terme dans une bouche sèche (patients avec xérostomie) Tableau 3 : Avantages et inconvénients des ciments verres 3. 7 Les Ciments Verres Ionomères Modifiés par Adjonction de Résine (CVIMAR) et les Ciments Verres Ionomères à Haute Viscosité (CVIHV) Les CVIMAR et les CVIHV sont actuellement largement utilisés en dentisterie et ont été créés dans le but d'améliorer les principaux défauts des CVI traditionnels. Si leurs propriétés mécaniques restent plus faibles que celles des résines composites, les propriétés optiques ont été améliorées. Ils peuvent également être polis lors de la séance de leur mise en place. Ils possèdent une viscosité accrue, dans le but d'améliorer leurs propriétés physiques et leur facilité de manipulation. Pour cela, leur poudre est composée de particules de verre plus fines, avec parfois l'addition de très petites particules et d'acide polyacrylique anhydre de haut poids moléculaire. Leur liquide renferme un polyacide de concentration et/ou poids moléculaire supérieur. L'une des propriétés les plus intéressantes des CVIHV est leur capacité à adhérer aux tissus dentaires calcifiés, tissus dentaires que l'on retrouve particulièrement chez les personnes âgées. Toutefois, leur adhérence mesurée par des essais en traction/compression, avec ou sans conditionnement à l'acide polyacrylique, reste inférieure à celle des résines composites. Mais leur coefficient d'expansion thermique avoisinant celui de la dent et leur faible contraction de 21 prise confèrent une bonne aptitude au scellement marginal, avec un joint durable et un faible taux de micro-infiltrations. Cette adhésion chimique spontanée permet une préservation tissulaire, en comparaison aux amalgames qui nécessitent des cavités rétentives (53). Elle permet également une adhésion accrue sur la dentine hyperminéralisée (53). Par ailleurs, les CVIHV ont une résistance à l'usure supérieure à celle des CVIMAR ou des CVI. L'utilisation de la couche renforçatrice y contribue beaucoup car elle est constituée de monomères multifonctionnels hautement réactifs permettant d'améliorer les propriétés mécaniques. Les CVIHV sont des biomatériaux biocompatibles ne contenant ni mercure, ni Bisphenol A glycerolate dimethacrylate (Bis-GMA). Ils sont également bioactifs et prodiguent une action anti-cariogénique avec le relargage d'ions fluorures. Cette libération se produit essentiellement les jours suivant la pose, puis décrot avec le temps. Toutefois, lors d'apports en fluorures, ils peuvent se recharger et en relarguer ultérieurement. Leur mise en œuvre est facile. En effet, leur réaction de prise uniquement chimique permet leur mise en place en un seul incrément (comparé à une résine composite) et leur rapidité de prise contribue aussi à faire gagner du temps. La bonne tolérance à leur mise en œuvre, et notamment à l'humidité (en raison de leur grande hydrophilie), leur permet un placement sans champ opératoire. L'esthétique des CVIHV (surtout les plus récents) est bien plus satisfaisante que celle des CVI, CVIMAR. Elle reste toutefois inférieure à celle des composites. Pour résumer, voici les principaux avantages qu'offrent les CVIHV par rapport aux CVI et CVIMAR (53) : - Une viscosité accrue permettant une manipulation plus aisée et des propriétés physiques améliorées - Une mise en œuvre plus rapide - Des propriétés esthétiques améliorées - Une meilleure résistance à la traction et à la compression, permettant leur utilisation dans des secteurs o il existe des charges occlusales - Une meilleure résistance à l'usure permise par la couche renforçatrice - Une meilleure résistance à l'abrasion due aux particules plus fines et à leur meilleure distribution dans la matrice - Leur durée de vie est plus importante : entre 6 et 8 ans 22 lésions carieuses III) Les différents moyens d'éviction des radiculaires Plusieurs possibilités d'éviction du tissu carieux des lésions cervicales sont possibles : la technique chimique, la technique conventionnelle avec des fraises en carbures de tungstène ou en céramiques, la technique atraumatique avec l'instrumentation manuelle, le laser ou la sono- abrasion (54). 1) La technique chimique : le Carisolv Il s'agit d'un mélange de deux gels. Un gel contenant trois acides aminés (leucine, lysine et acide glutamique) et auxquels s'ajoutent de l'hydroxyde de sodium, du chlorure de sodium et du carboxyméthylcellulose et un second gel constitué d'hypochlorite de sodium à 0. 95%. L'ensemble, une fois mélangé, permet d'obtenir un gel incolore qui élimine spécifiquement la dentine infectée. Au microscope électronique à balayage, la surface dentinaire obtenue est rugueuse avec des globules de boue dentinaire. On observe également de nombreux tubuli ouverts. La surface ainsi obtenue est la plus apte au collage de toutes les techniques d'éviction existantes (lorsque l'on ne prend pas en compte un conditionnement préalable et obligatoire des tissus dentaires). C'est une technique de choix dans la dentisterie non invasive. L'inconvénient majeur de cette technique réside dans le temps de travail très long : 12 minutes. Carisolv 23 2) La technique conventionnelle La technique conventionnelle consiste en l'utilisation de l'instrumentation rotative (turbines avec fraises diamantées et/ou contre-angles avec fraises en carbure de tungstène ou céramiques) pour enlever les lésions carieuses. Au microscope électronique à balayage, la surface dentinaire obtenue est rugueuse et recouverte de débris éparpillés. Les tubulis dentinaires sont tous oblitérés, ce qui rend obligatoire le conditionnement des tissus préalable à la mise en place d'un système adhésif afin de garantir une adhésion optimale. C'est la technique la plus utilisée par les praticiens car elle est simple, efficace, fiable, reproductible et rapide. Elle nécessite néanmoins l'utilisation de spray et l'application d'une pression modérée par le praticien afin d'éviter l'échauffement des tissus dentaires. L'anesthésie est souvent requise pour l'éviction du tissu carieux du fait de la perméabilité dentinaire. Les patients rapportent également une nuisance sonore liée au bruit de la turbine ou du contre-angle. Fraise en céramique montée sur turbine 3) La technique atraumatique Fraises diamantées La technique atraumatique (ou ART pour Atraumatic Restorative Treatment en anglais) est une méthode alternative dans laquelle la lésion carieuse est éliminée à l'aide d'instruments manuels et o la cavité est restaurée à l'aide de biomatériaux adhésifs (comme le CVI) (55, 56) ; Elle est très utilisée dans les pays du tiers-monde ou lors de missions humanitaires car sa mise en œuvre ne nécessite pas d'électricité ou d'équipements lourds (compresseur ou laser). 24 Excavateur L'avantage de cette technique réside dans le fait que seule la dentine infectée est éliminée : la cavité est donc préparée selon la forme de la lésion carieuse (57). Elle ne peut être réalisée que si les caractéristiques suivantes sont respectées (58) : extension de la lésion jusqu'au tissu dentinaire, capacité du tissu à être éliminé à l'aide d'instruments manuels (excavateurs), absence d'épisodes douloureux, absence d'exposition pulpaire et absence de fistule. Au microscope électronique à balayage, la surface dentinaire est recouverte de boue dentinaire (smear layer). Il est nécessaire de conditionner les tissus dentaires afin d'éliminer cette boue dentinaire réfractaire à un collage optimal. Elle présente plusieurs avantages immédiats : l'anesthésie n'est pas forcément nécessaire, un équipement hydraulique et électrique n'est pas requis, les coûts en matériel sont fortement réduits et les patients sont généralement moins anxieux. Mais elle présente également des inconvénients inhérents au matériau de restauration (le CVI) : impossibilité de polissage due à l'absence d'instruments rotatifs, faible résistance du matériau aux fluides oraux, risque de fracture du matériau ou risque de rétraction, esthétique limitée. Les études montrent toutefois un taux de survie satisfaisant des restaurations réalisées selon une technique atraumatique. (59, 60, 61, 62). Une étude menée par Hu et al. , 2005, et portant sur quinze patients présentant une hyposialie après avoir subi une radiothérapie, a chercheé à déterminer s'il existait une différence significative dans le taux de survie de restaurations radiculaires réalisées soit selon la méthode conventionnelle, soit selon la méthode atraumatique. Les auteurs ont montré qu'il n'existait pas 25 de différence significative dans le taux de survie à vingt-quatre mois entre les soins réalisés en technique conventionnelle et ceux réalisés en technique atraumatique (63). Deux autres études ont comparé le taux de survie des restaurations des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées selon qu'elles soient réalisées avec la méthode atraumatique ou avec la méthode conventionnelle (64, 65). Les deux études ont conclu qu'il n'existe pas de différence significative dans le taux de survie des restaurations réalisées selon l'une ou l'autre des méthodes. L'étude de De Cruz et al. , 2016 (64) sur les causes d'échecs des restaurations à 6 mois, lorsque celles-ci n'étaient plus considérées comme satisfaisantes ou qu'elles étaient à reprendre. Ils ont supposé que les facteurs suivants aient pu entrainer des échecs de restaurations : maitrise de la technique par l'opérateur, biomatériau utilisé, mauvaise hygiène bucco-dentaire, présence importante de plaque (65, 66). Ils ont également estimé que la non-coopération des patients ainsi que leur incapacité à maintenir une hygiène bucco-dentaire correcte (67), surtout chez ceux résidant en institution, constituaient des causes supplémentaires d'échec. L'étude de De Mata et al, 2015, (68) a évalué le ressenti des patients par rapport à la technique conventionnelle ou atraumatique. En effet, l'anxiété liée aux soins dentaires est un motif de renoncement aux soins (68, 69, 70). Au total, environ 70% des patients ont préféré la technique atraumatique car elle permet de s'affranchir de l'anesthésie, des vibrations et des nuisances sonores inhérentes à l'utilisation de l'instrumentation rotative. 4) La sono-abrasion Ce procédé a pour principe de projeter des particules d'alumine de 27 m ou de 50 m sur le substrat amélo- dentinaire à très grande vitesse par un flux d'air comprimé. Il est réservé aux caries occlusales superficielles car il ne permet pas l'élimination en profondeur de la dentine ramollie. De plus, les projections sont particulièrement importantes avec ce type de technique. Inserts pour sono-abrasion 26 5) Les lasers 5. 1 Généralités sur le laser La lumière est un phénomène physique correspondant à un transport d'énergie sans transport de matière. C'est un phénomène électromagnétique de nature ondulatoire et corpusculaire. Un phénomène ondulatoire car la lumière se propage comme une onde, et un phénomène corpusculaire car la lumière est composée de particules appelées les photons. Un photon est un corpuscule, un quantum d'énergie dont le flux constitue le rayonnement électromagnétique. La lumière dite visible (c'est-à-dire celle perçue par l'œil humain) correspond aux ondes électromagnétiques du spectre visible dont les longueurs d'ondes sont comprises entre 400 nm (violet) et 800 nm (rouge) (figure 2). Figure 2 : Spectre électromagnétique de la lumière visible Source : , une onde électromagnétique Du point de vue atomique il existe trois réactions photoniques possibles : - Le phénomène d'absorption. L'atome absorbe un photon et un de ses électrons passe au niveau d'énergie supérieur. L'atome est alors dans un état qualifié d'excité - Le phénomène d'émission spontanée. Un atome excité retombe spontanément à un état stable et émet un photon (et donc de la lumière) lorsque l'électron, qui avait changé de niveau d'énergie, revient à son niveau d'énergie initial - Le phénomène d'émission stimulée. Un photon incident pendant la désexcitation d'un atome provoque l'émission d'un autre photon possédant les mêmes caractéristiques (longueur d'onde, direction et phase) que celui qui était présent au départ. On obtient alors deux photons identiques, qui sont dans un même état vibratoire. C'est cette interaction qui est à l'origine de la création de la lumière laser. 27 Lorsqu'un rayonnement électromagnétique atteint un objet, certaines longueurs d'ondes sont absorbées par l'objet et d'autres sont réfléchies. Si la matière n'est pas totalement opaque (c'est- à-dire qu'elle n'absorbe pas complètement les rayonnements électromagnétiques), alors elle va transmettre les rayons dans un second milieu de propagation. On distingue donc plusieurs phénomènes (figure 3) : - La réflexion, les rayonnements sont renvoyés par la matière. La réflexion est dite spéculaire lorsque l'angle d'incidence est égal à l'angle de réflexion. - La réfraction, les rayonnements passent à travers la matière et sont transmis d'un premier milieu de propagation (d'o provient le rayon incident) à un second milieu de propagation (o est transmis le rayon réfracté). On parle de réfraction diffuse lorsque le rayon incident se sépare en une multitude de rayons dans le second milieu de propagation, et de réfraction parfaite lorsqu'on n'a qu'un seul rayon dans le second milieu de propagation. - L'absorption, la matière va emmagasiner le rayonnement électromagnétique, et les atomes passent en état excité , entrainant ensuite l'émission d'un photon. - La diffusion. Il s'agit de la réflexion des rayons lorsque le matériau n'est pas une surface plane ou lorsque que le rayonnement traverse un milieu rempli de particules en suspension (exemple de la diffusion de la lumière solaire à travers des gouttelettes d'eau permettant de voir les couleurs de l'arc en ciel). Dans ce cas, l'angle d'incidence du rayonnement est différent des angles de réflexion. La réflexion n'est donc pas spéculaire. Figure 3 : Schéma des interactions lumière-matériau 28 La construction d'un laser comporte trois éléments principaux : - Une cavité optique résonnante (cavité de Fabry-Perrot) - Un milieu émetteur (gaz, solide, liquide) - Une source de pompage pour créer une inversion de population dans le milieu d'émission Le principe de création de la lumière laser est le suivant (figure 6) : 1. Excitation des photons du milieu 2. Déclenchement de l'émission stimulée de photons 3. Accumulation du rayonnement entre deux surfaces réfléchissantes qui forment une cavité résonante 4. Libération du rayonnement sous forme de faisceau Figure 4 : schéma du principe d'un laser Source : Les lasers en odontologie Pour cela, le laser possède un réservoir d'électrons associé à une source excitante qui pompe les électrons à de hauts niveaux d'énergie. Dans un deuxième temps, un photon est injecté dans le milieu, produisant ainsi un deuxième photon identique (pendant la désexcitation d'un photon). Ces deux photons produisent à leur tour deux autres photons identiques pendant la désexcitation de deux électrons de deux autres atomes. La réaction se poursuit ainsi, il se crée une réaction en chaine. Deux miroirs, dont l'un semi-réfléchissant, se renvoient les photons émis. Ainsi, la lumière se densifie à chaque passage jusqu'à ce qu'elle soit libérée par le miroir semi-réfléchissant à l'extrémité du dispositif. La lumière laser présente des caractéristiques spécifiques : - Elle est monochromatique. Les lasers émettent en général sur une seule longueur d'onde (ex : le laser Er : YAG émet à 2940 nm) - Sa divergence est très faible 29 - Cohérence spatiale. Il s'agit de la propriété spécifique du laser, tous les points rayonnants élémentaires de sa surface émissive émettent en phase, en raison du principe de l'émission stimulée associée à la présence d'une cavité résonnante - Cohérence temporelle. Pour une source classique, la cohérence est d'environ 1 mm pendant lesquels les photons peuvent être en phase. Dans le cas des lasers, la cohérence peut atteindre des centaines de centimètres, voire des centaines de mètres. Un laser présente également les caractéristiques suivantes : - La puissance de sortie d'un laser se mesure en Watt - L'énergie de sortie d'un laser se mesure en Joule (1 Joule correspond à l'exposition à une puissance de 1 Watt pendant 1 seconde) - La fluence d'un laser est l'énergie mesurée sur une surface de 1 cm : elle est égale à 1 Watt par seconde par cm et s'exprime en J/cm Il existe trois modes d'émission : - Emission continue. Elle tend à disparaitre dans la chirurgie laser mais reste l'émission de certains lasers CO2 - Emission pulsée. Il s'agit du mode le plus utilisé en chirurgie. Il permet de connaitre précisément la quantité d'énergie de chaque tir laser, quantité qui joue un rôle apprécié dans la notion de reproductibilité des traitements. Cette émission peut être contrôlée à chaque tir dans sa durée et sa puissance. Grâce à ces nouvelles techniques contrôlant la durée de chaque pulse ainsi que la puissance répartie pendant toute la durée du pulse, certains lasers comme le Nd : YAG long pulse peuvent maintenant permettre une chirurgie allant des tâches pigmentaires au traitement vasculaire, de l'épilation au photo- rajeunissement. - Mode déclenché. C'est le mode de fonctionnement des lasers dits Q-switch qui délivrent une puissance de crête très élevée (pouvant atteindre plusieurs gigawatts dans le domaine médical, sur des temps de l'ordre de quelques nanosecondes) 5. 2 Indication du laser dans les thérapeutiques dentaires Le laser a fait son apparition dans les thérapeutiques médicales au milieu du XIXe siècle et a connu depuis un essor considérable. Les différents types de laser peuvent aujourd'hui être utilisés dans la majorité des disciplines dentaires (pédodontie, endodontie, orthodontie, prothèse, chirurgie, parodontie, dentisterie restauratrice). 30 Il existe plusieurs types de laser : - Laser CO. Le milieu utilisé est un mélange gazeux de dioxyde de carbone, diazote, dihydrogène et hélium. Le rayonnement obtenu comporte de nombreuses raies dans les longueurs d'onde 9, 4. 10 nm et 10, 6. 10 nm. Il est principalement utilisé en remplacement de la lame froide en chirurgie - Laser Nd : YAG. Il s'agit d'un laser à milieu solide qui utilise un grenat d'yttrium aluminium dopé au néodyme. Il émet essentiellement dans les bandes des 1, 064. 10 nm et des 1, 32. 10 nm. - Laser Er : YAG. Il s'agit d'un laser à milieu solide qui utilise un grenat d'yttrium aluminium dopé à l'erbium et qui émet un rayonnement de 2, 94. 10 nm. Il est utilisé aussi bien sur les tissus durs que sur les tissus mous - Laser diode. C'est un laser semi-conducteur dont la longueur d'onde dépend de la diode électroluminescente utilisée. On trouve des lasers émettant dans des bandes de longueur d'onde entre 0, 66. 10 nm et 0, 98. 10 nm. 5. 3 Le laser Er : YAG 5. 3. 1 Fonctionnement du laser Er : YAG Le laser Er : YAG a une longueur d'onde de 2, 94. 10 nm, il émet donc dans l'infrarouge moyen (figure 5). Son milieu actif est composé d'un grenat d'yttrium et aluminium (YAlO) dopé ions erbium (Er). Le pompage est obtenu grâce à un flash lumineux très intense correspondant à une bande d'ions Er incorporée au cristal. Figure 5 : Spectre d'absorption de l'eau et de l'hydroxyapatite Source : Er : YAG laser and conservative dentistry. EMC Stomatologie. 31 Son principal intérêt réside dans son mode de fonctionnement. En effet, le laser Er : YAG fonctionne selon un mode pulsé, permettant de faire varier la puissance émise au cours du temps (figure 6). Cette notion permet d'introduire trois paramètres : l'énergie d'une impulsion, la fréquence d'émission des impulsions et la durée d'une impulsion. Figure 6 : Mode continu et mode impulsionnel Source Er : YAG laser and conservative dentistry. EMC Stomatologie. Pour une efficacité optimale d'élimination des tissus dentaires, il est nécessaire de respecter une distance focale de 9 à 15 mm du tissu ciblé. Une distance focale supérieure à 15 mm ou inférieure à 9 mm se traduira inévitablement par une réduction de l'efficacité d'ablation. 5. 3. 2 Interaction du laser Er : YAG avec les tissus dentaires Le laser Er : YAG, par la spécificité de sa longueur d'onde peut être utilisé dans différents cas : - L'exérèse de tumeurs bénignes, tumeurs vasculaires ou encore lésions pré-cancéreuses - Eviction carieuse et préparation de cavités en dentisterie restauratrice - Coiffage pulpaire et pulpotomie : réalisés à l'aide d'un laser Er : YAG en gardant le spray air mais en enlevant le spray eau, permettant ainsi une hémostase correcte (300C) (71). L'intérêt de l'utilisation du laser Er : YAG en dentisterie restauratrice résulte dans la propriété d'absorption du rayonnement laser émis par deux composants principaux des tissus dentaires minéralisés : l'eau et l'hydroxyapatite. Le laser Er : YAG émet à une longueur d'onde de 2, 94. 10 nm, ce qui correspond au pic d'absorption, le rayonnement est totalement absorbé par les molécules d'eau (HO) et partiellement absorbé par les molécules d'hydroxyapatite (Ca(PO)OH). Cette différence 32 d'absorption entre les deux composants explique pourquoi l'élimination des tissus dentinaires est plus rapide que celle des tissus amélaires. L'émail et la dentine sont éliminés par un effet thermomécanique : après avoir absorbé la rayonnement émis par le laser Er : YAG, les molécules d'eau et d'hydroxyapatite sont vaporisées de manière continue, sous la forme de microexplosions audibles par le praticien et le patient. 5. 3. 3 Aspect microscopique des tissus dentaires après irradiation au laser Er : YAG Les aspects des tissus dentinaires et amélaires après une irradiation au laser Er : YAG sont les suivants : - Au niveau de l'émail, la surface est irrégulière, semblable à la surface amélaire après mordançage acide. L'ablation par irradiation laser se fait sans distinction entre substance intra-prismatique et substance inter-prismatique. Ainsi, la structure des prismes n'est pas identifiable. - Au niveau de la dentine, les observations réalisées au microscope électronique à balayages (MEB) montrent une absence de boue dentinaire, des tubuli ouverts et des micro-irrégularités. La surface présente des irrégularités par élimination plus importante de la dentine intertubulaire, plus riche en eau. L'aspect est ainsi stratifié. Cet aspect pseudo-mordançé de l'émail a conduit un certain nombre d'auteurs et de praticiens à considérer que l'utilisation du laser Er : YAG seul suffisait pour conditionner la surface amélaire avant de recevoir un collage, et que l'on pouvait donc s'affranchir du mordançage acide (72). Dans le but de vérifier cette hypothèse, des études ont été menées pour savoir comment obtenir la meilleure étanchéité possible. Les résultats ont montré que les pertes d'étanchéité étaient nettement plus importantes lorsque l'on utilisait le laser seul que lorsque l'on traitait la surface avec un acide orthophosphorique (après préparation à la fraise ou irradiation laser) (73). 33 Figure 7 : Observation des tissus dentaires minéralisés soumis à l'action du laser Er : YAG (microscope électronique à balayage). A. Aspect de l'émail après irradiation au laser Er : YAG B. Aspect de la dentine après irradiation au laser Er : YAG Source : Er : YAG laser and conservative dentistry. EMC Stomatologie. Méthode utilisée Etat de surface dentinaire Technique chimique Présence de globules de boue dentinaire de l'ordre de 60 m Technique conventionnelle Présence de boue dentinaire. Les tubuli sont tous oblitérés Technique manuelle Surface dentinaire recouverte de boue dentinaire. Les tubulis ouverts sont très rares Sono-abrasion Laser Er : YAG Surface entièrement recouverte de boue dentinaire Absence de boue dentinaire. Tubuli ouverts Tableau 4 : Etat des surfaces dentinaires obtenues selon différentes méthodes (73) Source : Dentisterie restauratrice a minima. EMC (Elsevier SAS, Paris) 34 IV) Discussion 1) Etude des matériaux de restauration utilisés dans la restauration des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées dépendantes Les patient âgés dépendants ont un nombre de lésions carieuses radiculaires important (5). Certains, en institution, ne peuvent plus assurer seuls le maintien d'une hygiène bucco-dentaire correcte. Dans ce contexte, le matériau ou biomatériau de restauration sera idéalement étanche et si possible bioactif afin de prévenir au mieux l'apparition de caries secondaires. Il doit également être facile à manipuler et pouvoir être poli dans la séance pour limiter au maximum le temps au fauteuil. Les CVIHV constituent donc le matériau de choix pour la restauration des lésions de classe V de Black chez les personnes âgées dépendantes. En effet, ce biomatériau répond à l'ensemble des critères précités. Bien qu'ayant la durée de vie la plus longue des matériaux de restauration directe, l'amalgame est moins utilisé aujourd'hui dans la mesure o il ne possède aucune propriété d'adhésion. Quant aux résines composites, elles nécessitent une isolation parfaite pour que le collage soit réalisé dans des conditions optimales. Or, il est compliqué d'obtenir un champ opératoire étanche lorsque la limite de la cavité est sous-gingivale, de plus chez des patients parfois peu coopérants. Une revue de la littérature menée par Amer et Kolker, 2013, a présenté les différents moyens de restauration des lésions carieuses radiculaires chez les patients dépendants (47). Ils concluent que si les amalgames étaient largement utilisés il y a une dizaine d'années, les restaurations au CVI, CVIMAR ou résines composites ont été les biomatériaux les plus fréquemment utilisés ces dernières années pour les restaurations des lésions carieuses radiculaires. Deux études, similaires dans leurs méthodes (58, 59) ont évalué le comportement de différents biomatériaux (résine composite, CVI, CVIMAR) utilisés pour des restaurations de classe V chez des patients présentant des lésions carieuses radiculaires. Chez les patients qui ont pu maintenir une bonne hygiène bucco-dentaire, la différence du taux de survie entre les trois types de biomatériau n'était pas statistiquement significative. En revanche, chez les patients n'ayant pas pu assurer une bonne hygiène bucco-dentaire, les évaluateurs ont observé l'apparition de caries secondaires plus fréquentes au niveau des restaurations composites qu'au niveau des restaurations réalisées avec un CVI ou un CVIMAR. Ce résultat est également observé dans l'étude de Hu et al. , 2005, et portant sur la comparaison entre méthode conventionnelle et 35 méthode atraumatique (62). L'apparition des CVIHV a permis une augmentation des propriétés d'adhésion en comparaison avec les CVIMAR et les CVI traditionnels (53). Les CVIHV permettent notamment une meilleur adhésion à la dentine sclérotique, que l'on retrouve chez les personnes âgées (53). Par conséquent, ce biomatériau semble être le plus apte à la restauration des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées. 2) Comparaison des différentes méthodes d'éviction carieuse chez la personne âgée dépendante La technique d'éviction des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées dépendantes doit respecter un maximum de conditions propres à la réalisation de soins dentaires. Elle doit par exemple permettre de limiter au maximum le temps du patient au fauteuil. Les patients âgés ont également plus de mal à déglutir normalement. Tout risque de projection d'eau ou de particules est susceptible d'entrainer une fausse route. Enfin, elle doit être sans risque pour les muqueuses afin d'empêcher les blessures iatrogènes sur ces-dernières, et ce d'autant plus que certains patients peuvent être susceptibles de mouvements involontaires dus à leur(s) pathologie(s) (comme la maladie de Parkinson par exemple). Il est également intéressant que, pour le confort du patient, la technique s'affranchisse des sources anxiogènes que sont les nuisances sonores et l'utilisation de l'anesthésie, lorsque cela est possible. Ces différents critères permettent d'éliminer certaines des techniques d'éviction carieuse citées. En effet, si le traitement chimique avec le Carisolv est une technique de choix dans la dentisterie non invasive, son temps de travail de douze minutes est trop long et constitue donc un inconvénient majeur chez les personnes âgées dépendantes. Par ailleurs, la méthode d'éviction par sono abrasion sous spray est responsable d'un nombre important de projections, ce qui augmente considérablement le risque de fausses routes. De plus, la sono-abrasion est majoritairement utilisée pour des lésions carieuses superficielles (73). Si la méthode conventionnelle reste efficace, l'approche atraumatique est intéressante dans la mesure o elle ne nécessite pas d'équipements lourds (fauteuil, unit), ce qui est souvent le cas dans des institutions gériatriques ou des EHPAD (74). Par ailleurs, elle ne nécessite pas obligatoirement le recours à une anesthésie locale ou loco-régionale. Les études de comparaison de l'éviction du laser Er : YAG avec d'autres techniques, ainsi que les essais cliniques du laser Er : YAG sur les patients sont peu nombreux. Les études sont souvent réalisées in vitro et les essais concernent surtout la pédodontie. Pourtant, les personnes âgées dépendantes constituent une branche de la population difficile à soigner qui nécessite une approche particulière. La recherche dans la littérature sur Google Scholar et PubMed des 36 articles traitant des personnes âgées dépendantes, présentant des lésions carieuses radiculaires traitées à l'aide du laser Er : YAG et restaurées avec un CVIHV n'a donné aucun résultat ; Certaines études (75, 76, 77) montrent que l'utilisation du laser Er : YAG, par son mode de fonctionnement, présente un certain nombre d'avantages similaires aux techniques atraumatiques : absence de pression grâce au no contact , absence de douleur due à la très faible élévation de température dans la chambre pulpaire et aux très courtes durées d'impulsion, anesthésie locale ou loco-régionale non obligatoire, diminution des nuisances sonores, désinfection du site visé et non blessant pour les muqueuses. Il s'agit aujourd'hui d'une technique efficace. En revanche, l'utilisation obligatoire du spray augmente le risque de fausses routes, surtout chez les patients âgés dépendants. Plusieurs études ont comparé, in vitro, les techniques d'éviction carieuse par laser Er : YAG avec les techniques conventionnelles ou les techniques atraumatiques. C'est le cas de l'étude menée par Aoki et al. , 1998, qui a comparé l'efficacité du laser Er : YAG sur des lésions carieuses radiculaires avec une méthode conventionnelle (78). L'étude a été réalisé in vitro sur 31 dents permanentes extraites et présentant une lésion carieuse radiculaire. Les auteurs ont évalué les paramètres suivants : le temps nécessaire à l'éviction de la lésion carieuse, l'histologie des tissus préparés selon les deux méthodes, les tissus préparés à l'aide d'un microscope électronique à balayage (MEB), la dureté du tissu dentinaire. Ils ont conclu que le laser Er : YAG était aussi efficace que la technique conventionnelle dans l'éviction des lésions carieuses. Toutefois, le temps de travail était plus long. Une étude menée par Juntavee et al. , 2013, a comparé in vitro deux méthodes de préparation de cavités : la technique atraumatique et le laser Er : YAG (79). Pour cela, ils ont sélectionné 60 molaires temporaires extraites et présentant une lésion carieuse sur la face occlusale. Les auteurs ont conclu qu'il n'existait pas de différence statistiquement significative dans le temps de préparation entre la méthode atraumatique et l'éviction carieuse par laser Er : YAG. Le laser Er : YAG semble apte à éliminer les tissus dentaires minéralisés, mais aussi la dentine sclérotique (80). Une autre étude publiée par Matsumoto et al. , 2007, s'est intéressée à l'opinion des patients concernant le bruit et la douleur ressentie durant le traitement par laser Er : YAG de lésions carieuses primaires sur dents vivantes, chez des patients adultes sains (77). Ils ont également évalué la réussite du traitement jusqu'à 3 mois post-opératoires après la réalisation des soins. Les résultats ont montré que 80% des patients n'ont ressenti aucune douleur et n'ont pas eu 37 besoin d'anesthésie. Plus de 93% d'entre eux n'ont pas été dérangés par d'éventuelles nuisances sonores. Au total, l'efficacité globale du traitement par laser Er : YAG a été calculée comme étant très satisfaisante dans 80% des cas traités. Ce résultat rejoint celui publié par l'équipe de Zhegova et al. , 2015, sur 44 adolescents âgés de 16 à 18 ans (81). En effet, les patients ayant été soignés à l'aide de la méthode conventionnelle rapportent l'absence de douleur ou un léger inconfort dans 47, 72% des cas, et une douleur modérée ou sévère dans 52, 27% des cas. En revanche, 100% des patients qui ont été traités avec le laser Er : YAG n'ont ressenti aucune douleur, ou seulement un léger inconfort. Les auteurs ont également établi une moyenne du temps opératoire moyen réalisé de 1, 6 mn pour les cavités de classe I, et une moyenne de 29 secondes pour des cavités de classe III/IV/V de Black. Cette technique d'éviction est donc aujourd'hui aussi rapide que la méthode conventionnelle. 38 V) Présentation de deux cas cliniques 1) Protocole clinique Des patients âgés dépendants ont été pris en charge au Centre Hospitalo-Universitaire de Nice, pendant la période universitaire 2017/2018. L'objectif était de réaliser des soins chez les personnes âgées, souvent peu coopérantes et ayant du mal à maintenir une hygiène bucco- dentaire correcte. Le but était de soigner le patient en respectant le gradient thérapeutique en proposant une technique, fiable, rapide, confortable, non anxiogène pour le patient. Le traitement proposé était l'éviction carieuse par laser Er : YAG et restauration à l'aide d'un CVIHV. Le succès du traitement a été évalué en fonction de différents critères. Tout d'abord, le traitement de la lésion carieuse par laser Er : YAG a été réalisable dans l'ensemble des situations cliniques rencontrées. La durée de la séance ne devait pas excéder une heure ou moins. Ils devaient être si possible réalisés sans anesthésies pour le confort du patient et rapide afin de limiter le temps du patient au fauteuil. 2) Présentation des cas cliniques Le laser utilisé était le laser Er : YAG Fotona Fidelis Plus. Les paramètres du laser ont été préalablement définis. Pour l'émail : une puissance de 8. 00 W, une énergie de 400 mJ, une fréquence de 20 Hz et une fluence de 35 J/cm. Pour la dentine : une puissance de 4. 00 W, une énergie de 200 mJ, une fréquence de 20 Hz et une fluence de 17 J/cm. Réglage du laser Er : YAG pour l'éviction de l'émail Réglage du laser Er : YAG pour l'éviction des tissus dentinaires 39 Cas clinique 1 La patiente était âgée de 83 ans, et a subi trois accidents vasculaires cérébraux. Elle présentait d'importants problèmes pour se déplacer et était également anxieuse vis-à-vis des soins dentaires. Son hygiène bucco-dentaire était insatisfaisante. Elle présentait une importante lésion carieuse au niveau de 43. Restauration après polissage Polissage et finition après mise en place d'un CVIHV (Riva Light Cure SDI) Lésion carieuse initiale Eviction de la lésion carieuse avec le laser Er : YAG Le traitement a été réalisé en une seule séance, de moins d'une heure. La patiente s'est montrée coopérante lorsque le laser Er : YAG était utilisé et elle était légèrement anxieuse lorsque le contre-angle était utilisé lors d'autres séances, ce qui laisse supposer que la diminution des bruits et des vibrations inhérente à l'utilisation du laser est plus confortable pour la patiente. Toutefois, une anesthésie locale a dû être réalisée. 40 2. 2 Cas clinique 2 Le patient était un homme de 83 ans atteint de la maladie d'Alzheimer, au stade modérée. Il présentait une lésion carieuse radiculaire en distal de 42. Lésion carieuse initiale Eviction de la lésion carieuse avec le laser Er : YAG Le traitement a pu être réalisé en moins d'une heure, en une seule séance. Le patient s'est montré coopérant tout le long du traitement. Dans ce cas, le patient a semblé être confortable durant toute la séance, et aucune anesthésie n'a été réalisée. Restauration au CVIHV (IonoStar Plus Voco) après polissage 41 CONCLUSION Les soins aux personnes âgées dépendantes constituent aujourd'hui une spécificité. Ce sont souvent des personnes dont l'hygiène bucco-dentaire est insatisfaisante. Dans un contexte o l'approche de la dentisterie est de plus en plus conservatrice, il faut s'assurer de préserver et de soigner les dents présentes chez les patients âgés dépendants. La technique choisie revêt donc une importance cruciale car elle doit répondre à des critères précis en présentant le moins d'inconvénients possibles. Elle doit être fiable, rapide, efficace et confortable pour le patient. Le traitement des lésions carieuses radiculaires avec le laser Er : YAG et les CVIHV peut être un traitement répondant à la majorité des critères établis. L'éviction carieuse est rapide et fiable. Les sources anxiogènes tels que le recours à l'anesthésie ou les nuisances sonores sont limitées. En revanche, l'utilisation obligatoire du spray augmente le risque de fausses routes. Les CVIHV semblent être les biomatériaux les mieux adaptés à la restauration des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées dépendantes. Ils sont en effet étanches par leurs propriétés d'adhésion, bioactif par le relargage de fluor, et peuvent être polis dans la même séance que la prise du matériau (limitant ainsi le nombre de rendez-vous). Ces deux propriétés empêcheraient l'apparition de lésions carieuses secondaires, surtout parmi une population qui ne peut pas assurer une hygiène bucco-dentaire satisfaisante. L'utilisation du laser et des CVIHV dans les deux cas cliniques présentés ont montré leur intérêt dans le traitement des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées dépendantes. Toutefois, des études protocolisées doivent être mises en place pour évaluer l'intérêt de cette méthode. 42 43 BIBLIOGRAPHIE 1. Proposed working definition of an older person in Africa for the MDS Project : 2. KINSELLA K, HE W. U. S. Census Bureau, International Population Reports, P95/09-1. An Aging World : 2008. Washington, DC : U. S. Government Printing Office, 2009. 3. TEF, édition 2018 INSEE références. 4. TEF, édition 2014 INSEE références. 5. TAN HP, LO EC, DYSON JE, LUO Y, CORBET EF. A randomized trial on root caries prevention in elders. Journal of Dental Research. 2010 Oct ; 89(10) : 1086-90. 6. BEAUCHET O, BERRUT G. Gait and dual task : definition, interest an perspectives in the elderly. Psychologie et neuropsychiatrie du vieillissement. 2006 Sep ; 4(3) : 215-25. 7. BOCHELEN A. 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Journal of IMAB. 2015 Jan- Mar ; 21(1) : 699-704. 50 LISTE DES FIGURES Figure 1 : Mécanisme d'adhésion chimique aux tissus dentaires Figure 2 : Spectre électromagnétique de la lumière visible Figure 3 : Schéma des interactions lumière-matériau Figure 4 : Schéma du principe d'un laser Figure 5 : Spectre d'absorption de l'eau et de l'hydroxyapatite Figure 6 : Mode continu et mode impulsionnel Figure 7 : Observation des tissus dentaires minéralisés soumis à l'action du laser Er : YAG (microscope électronique à balayage). 51 LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Composition de la poudre de FAS Tableau 2 : Valeurs d'adhérence des CVI aux tissus dentaires Tableau 3 : Avantages et inconvénients des ciments verres ionomères Tableau 4 : Etat des surfaces dentinaires obtenues selon différentes méthodes 52 Serment d'Hippocrate En présence des Matres de cette Faculté, de mes chers condisciples, devant l'effigie d'Hippocrate, Je promets et je jure, au nom de l'Etre Suprême, d'être fidèle aux lois de l'Honneur et de la probité dans l'exercice de La Médecine Dentaire. Je donnerai mes soins gratuits à l'indigent et n'exigerai jamais un salaire au-dessus de mon travail, je ne participerai à aucun partage clandestin d'honoraires. Admis dans l'intérieur des maisons, mes yeux ne verront pas ce qui se passe, ma langue taira les secrets qui me seront confiés et mon état ne servira pas à corrompre les mœurs ni à favoriser le crime. Je ne permettrai pas que des considérations de religion, de nation, de race, de parti ou de classe sociale viennent s'interposer entre mon Devoir et mon patient. Je garderai le respect absolu de la vie humaine dès sa conception. Même sous la menace, je n'admettrai pas de faire usage de mes connaissances médicales contre les lois de l'Humanité. Respectueux et reconnaissant envers les Matres, je rendrai à leurs enfants l'instruction que j'ai reçue de leurs pères. Que les hommes m'accordent leur estime si je suis fidèle à mes promesses, Que je sois couvert d'opprobre et méprisé de mes confrères si j'y manque. 53 Approbation Improbation Vu, Nice, le Les opinions émises par les dissertations présentées, doivent être considérées comme propres à leurs auteurs, sans aucune approbation ou improbation de la Faculté de Chirurgie dentaire (1). Lu et approuvé, Le Président du jury, Professeur Claire LASSAUZAY (1) Les exemplaires destinés à la bibliothèque doivent être obligatoirement signés par le Doyen et par le Président du Jury. Le Doyen de la Faculté de Chirurgie Dentaire de l'UNS Professeur Laurence LUPI 54 Paul GAZAN LE TRAITEMENT DES LESIONS CARIEUSES RADICULAIRES CHEZ LES PERSONNES ÂGEES AVEC UN LASER Er : YAG ET LES CIMENTS VERRES IONOMERES HAUTES VISCOSITES Thèse : Chirurgie Dentaire, Nice, 2019, n42-57-19-25 Directeur de thèse : Dr BRULAT Mots-clés : patient âgé, patient âgé dépendant, CVIHV, laser Er : YAG, lésions carieuses radiculaires. Résumé : La hausse du nombre de patients âgés dépendants constitue un enjeu de santé publique. En effet, l'amélioration des plateaux techniques et de la prévention a permis de conserver un nombre de dents plus important sur l'arcade chez les patients âgés dépendants. Par conséquent, le nombre de lésions carieuses radiculaires chez ces patients a également augmenté. Il convient donc de soigner ces patients en respectant le gradient thérapeutique et les contraintes liés à un patient peu coopérant. Après avoir fait l'état des différents moyens d'éviction des lésions carieuses radiculaires chez les personnes âgées dépendantes ainsi que la restauration des cavités à l'aide des ciments verres ionomères, une approche thérapeutique par laser Er : YAG et une restauration des cavités obtenues avec un ciment verre ionomère à haute viscosité est proposée. Le propos est illustré par la présentation de deux cas cliniques réalisés au Centre Hospitalo- Universitaire de Saint-Roch. 55 | HAL | Scientific |
L'analyse principale après 3 ans n'a atteint la significativité statistique pour aucun des critères d'évaluation prédéfinis. | EMEA_V3 | Medicinal |
Modification des processus cathodiques La vitesse de corrosion est imposée par la réaction partielle la plus lente (anodique ou cathodique) L'accélération des phénomènes de corrosion observée en présence d'un biofilm et l'augmentation de E corr peuvent être interprétées à partir des courbes intensité-potentiel En effet, cette augmentation de E corr peut être due à une modification de la branche anodique, c'est-à-dire à l'oxydation du métal Scotto et al ont montré que le courant de passivation n'évolue pas avec la formation du biofilm et attribuent cette augmentation de E corr à une amplification de la cinétique de la réaction cathodique La montre comment une modification de la branche cathodique peut entraner une augmentation de E corr D'un autre côté, le suivi du courant à potentiel imposé (0 mV/ECS) sur une élec-trode en acier inoxydable en eau de mer naturelle montre une augmentation de la densité du courant cathodique et vient, ainsi, confirmer les résultats de Scotto et al Depuis, de nombreuses études se sont focalisées sur la cinétique de réduction de l'oxygène comme étant le phénomène de base en corrosion aérobie Ces études ont mis en évidence le déplacement du maximum de L Évolution du potentiel de corrosion libre en fonction de la cinétique de la réaction cathodique Le schéma met en évidence une augmentation de E corr , lié à un accroissement de la vitesse de réduc-tion de l'oxygène (2), ou à l'addition d'une nouvelle réduction à celle de l'oxygène (3) Remarque : (1) est la branche cathodique au départ ; E 1 , E 2 et E 3 sont les valeurs de E corr correspondant respectivement aux cas (1), (2) et (3) la vague de réduction de l'oxygène vers des potentiels plus élevés (entre 0 et 300 mV/ ECS) et l'augmentation de l'amplitude du courant du palier de diffusion Certains auteurs ont évoqué la catalyse de la réduction de l'oxygène par un biofilm, formé sur un métal, comme le phénomène permettant d'expliquer l'augmentation de E corr Par contre, en corrosion anaérobie, il n'y a pas eu de travaux, à notre connaissance, qui ont étudié les processus cathodiques sur des aciers inoxydables Certains microbiologistes ont supposé que l'activité hydrogénase des bactéries sulfato-réductrices joue un rôle dans la réduction de l'hydrogène sur des aciers au carbone Ils ont suggéré que la dépolarisation cathodique était le moteur du phénomène de corrosion microbienne en présence des bactéries sulfat-réductrices Cette approche n'est pas en accord avec les fondements de la corrosion aqueuse Cependant, récemment des travaux ont montré que les hydrogénases pouvaient accélérer la réaction cathodique, ce qui sera développé ultérieurement Plusieurs mécanismes ont été proposés afin de mettre au clair l'action du biofilm sur la cinétique de réduction de l'oxygène D'après ce qu'il a été suggéré dans la littérature, on peut distinguer deux catégories de méca-nismes Les mécanismes dus à l'évolution du film passif Plusieurs auteurs ont constaté une évolution de la composition chimique de la couche passive d'un acier inoxydable couvert d'un biofilm, mais les résultats dépendent fortement de la population bactérienne En présence de bactéries sulfato-réductrices, Gonzalez et al et Geesey et al ont observé, dans le film passif de l'acier inoxydable, un épuisement relatif en fer et en chrome par rapport au nickel Ceci n'est pas observé dans le cas de bactéries anaérobies facultatives Les bactéries aérobies provoquent, d'après Pendyala et al , un enrichissement en chrome et un épuisement relatif en fer sans changement de concentration en nickel Une étude assez récente a montré un épaississement et une stratification des couches d'oxydes constituant le film passif du matériau immergé en eau de mer naturelle : les oxydes de fer trivalent migrent vers les couches externes du film passif, alors que la zone interne du film s'enrichit en chrome Cette modification entrane une accélération de la cinétique de réduction de l'oxygène, due à l'effet catalytique des ions Fe 3 sur la réaction Les mécanismes liés aux espèces présentes dans le biofilm Dans une première étape, on peut admettre que les micro-organismes sont susceptibles de consommer de l'oxygène pour leurs activités métaboliques a utilisé le glutaraldéhyde afin de comparer l'oxygène dissous présent à l'interface métal-eau de mer artificielle, dans un environnement biotique et abiotique La présence des micro-organismes, selon lui, provoque une baisse de la concentration en oxygène, de par sa consommation lors des processus méta-boliques La présence de glutaraldéhyde renverse la situation, et la teneur en oxygène après traitement est identique à celle du test abiotique Toutefois, lors d'une analyse d'un biofilm formé sur des aciers inoxydables en eau de mer naturelle, Scotto montre qu'il n'y a pas de relation directe entre la quantité de micro-organismes présents sur la surface métallique et l'augmentation de E corr , mais celle-ci semble être corrélée avec la quantité de substances extra-polymériques (hydrates de carbones et protéines extra-cellulaires) Récemment, certains auteurs se sont inté-ressés aux composés extracellulaires pré-sents dans le biofilm et notamment aux enzymes qui sont capables de catalyser des réactions liées, directement ou indirectement, aux phénomènes de biodégradation Mais l'aspect catalytique du biofilm, en corrosion microbienne, a été évoqué bien avant Scotto et al citent un rôle éventuel des enzymes, dans un biofilm, pour la première fois, sans en détailler les mécanismes impliqués D'autres expériences confirment ce rôle joué par les enzymes sur la variation de E corr , soit en inhibant l'action des enzymes par de l'azoture de sodium , soit en fixant les enzymes, supposées êtres présen-tes dans le biofilm, à la surface métallique par du glutaraldéhyde L'approche enzymatique, reste tout de même très peu abordée dans la littérature, mais nous pouvons mettre en évidence l'importance de cette approche dans les phé-nomènes électrochimiques observés Pour cela, nous avons classé les méca-nismes expliquant la modification des processus cathodiques par un biofilm, cités dans la littérature, selon trois catégories : Les mécanises liés à la formation intermé-diaire du peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2 ) Les mécanismes liés à la présence des mangano-bactéries Les mécanismes enzymatiques Les deux premières catégories concernent plutôt la corrosion aérobie, o la réaction cathodique est celle de la réduction de l'oxygène, la troisième catégorie peut inclure éga-lement des phénomènes de corrosion en conditions anaérobies Formation intermédiaire réaction (2) Le peroxyde d'hydrogène a, en effet, été détecté à plusieurs reprises dans les biofilms formés en milieu marin sur des aciers inoxydables ; la concentration généralement mesurée est de l'ordre de la millimole/Litre Cependant certains auteurs ont observé que pour déplacer le potentiel de corrosion libre des aciers inoxydables, la présence de peroxyde d'hydrogène avec une concentration de l'ordre de la millimole/Litre n'est pas suffisante, car il faut également un pH assez faible (2, 8 à 2, 9) et une concentration en oxygène dissous inférieure à 0, 5 ppm Jusqu'à ce stade rien ne permet d'affirmer que la formation intermédiaire de H 2 O 2 a un effet sur la cinétique de réduction de l'oxygène ou si la présence de ce produit dans le biofilm permet, seul, d'expliquer l'augmentation En effet, l'enzyme a été introduite de plusieurs manières : dans la solution (tampon phosphate, pH 8 avec 0, 15 M NaCl), immobilisée dans un film de glutaraldéhyde et de sérum albumine bovine, ou de Nafion, ou encore adsorbée par le DMSO (Dimethyl Sulfoxide) La présence de l'enzyme, que ce soit en solution, immobilisée ou adsorbée n'a pas affecté la cinétique de réduction de l'oxygène c'est-à-dire la réaction (1) Néanmoins, à des potentiels plus bas (entre -300 et -500 mV/ECS), la catalase provoque la consommation de la disproportion de H 2 O 2 en oxygène, soit la quantité de peroxyde qui s'est formée et qui n'a pas été réduite assez rapidement Ceci représente un nouvel apport d'oxygène (réaction 3), ce qui explique l'augmentation du courant cathodique Dans ce cas la réduction de l'oxygène est indirectement catalysée par l'enzyme Ce phénomène a été observé sur une électrode qui a subi un prétraitement électrochimique La représente le premier schéma de catalyse enzymatique proposé par Bergel et al Dans le cas o l'électrode n'a pas subi un prétraitement électrochimique, une augmentation du courant cathodique a été enregistrée lorsque l'enzyme est adsorbée par le DMSO Cette augmentation (d'environ 60 %) ne peut pas être expliquée selon le schéma de la figure 3 D'après ces auteurs, la catalase est, dans ce cas, capable d'assurer un transfert direct d'électrons avec l'électrode Les résultats de tous ces travaux [45-48] peuvent contribuer à la compréhension de l'aspect catalytique d'un biofilm et son effet sur la cinétique de réduction de l'oxygène Mais l'action de la catalase ne suffit pas, à elle seule, à expliquer l'amplification des processus cathodiques puisque l'augmentation de E corr n'est pas aussi élevée que celle notée en milieu naturel Rôle des mangano-bactéries En corrosion aérobie, l'amplification de la cinétique de la réaction cathodique, par les oxydes de manganèse liée à la présence des mangano-bactéries, est une hypothèse qui a été étudiée par plusieurs auteurs riches en manganèse sur des échantillons, en acier inoxydable AISI 316L, immergés en eau douce pendant 35 jours Ces dépôts sont associés à des colonies de bactéries mangano-oxydantes Le MnO 2 est formé à partir du manganèse ionique Mn 2 par les bacté-ries mangano-oxydantes Ensuite, la réduc-tion de ce dépôt se fait selon les deux réactions citées plus haut La repré-sente le mécanisme proposé par Olsen et al Ainsi, cette approche permet d'expliquer deux phénomènes importants : -D'une part, la réduction des oxydes de manganèse vient s'ajouter à celle de l'oxygène, ce qui provoque une élévation du courant cathodique et par conséquent une augmentation de E corr , -D'autre part, l'oxydation des ions Mn 2 , par les bactéries mangano-oxydantes, provoque une catalyse de la réduction de l'oxygène sans pour autant affecter la cinétique de la réaction cathodique Toutefois, l'effet électrochimique (augmentation de E corr ) ne peut être observé que si les oxydes de manganèse sont en contact élec-trique avec la surface du métal En effet, il a été démontré qu'en présence de plusieurs populations bactériennes, les mangano-bactéries poussent assez lentement et sont ainsi déplacées de la surface du métal par d'autres microorganismes qui se développent plus vite mais qui ne sont pas capables d'oxyder les ions manganèse Le modèle qui a permis de confirmer toutes ces constatations est basé sur l'utilisation de la Leptothrix discophora Il s'agit de bacté-ries à forte activité extracellulaire oxydante des ions Mn 2 Ces bactéries produisent une protéine extracellulaire qui est responsable de l'oxydation des ions manganèse D'après Adams et al , l'activité oxydante de ces bactéries montre certaines caractéristiques qui suggèrent qu'elle peut être enzymatique (température et pH optimaux) Adams et al [56] ont également isolé une protéine de la Leptothrix discophora et leurs résultats expéri-mentaux leur ont permis de conclure qu'au moins une partie de l'activité oxydante de Mn 2 dépend de cette protéine Une étude plus récente a permis d'isoler une enzyme qui est, d'après les auteurs, responsable de l'oxydation de Mn(II) en Mn(IV) Mécanismes enzymatiques Les travaux expérimentaux utilisant des enzymes pour des essais électrochimiques, en liaison avec la corrosion microbienne, restent très peu nombreux dans la littérature Ceci peut être dû à la difficulté d'adapter la manipulation des enzymes à des essais de corrosion De plus, les enzymes impliquées, directement ou indirectement, dans les phé-nomènes de corrosion microbienne sont très peu connues Pereira et al [57] ont procédé à une caractérisation des enzymes secrétées par des bactéries sulfato-réductrices et qui peuvent êtres impliquées dans des phénomènes de corrosion microbienne Les bactéries sulfato-réductrices ont fait l'objet de nombreuses études et il est géné-ralement admis que ce sont les bactéries qui causent le plus de dégâts pour les métaux et les alliages Les protéines qui ont été isolées par Pereira et al sont : L'hydrogénase Cytochrome c 3 Adenyl sulfate (APS) reductase Sulfite reductase À part l'hydrogénase (EC. 1. 12. 2. 1) qui a fait l'objet de quelques essais électrochimiques, dont les résultats seront présentés ultérieu-rement, les enzymes citées dans le travail de Pereira et al n'ont jamais été étudiées en corrosion microbienne Conditions aérobies En corrosion aérobie, l'enzyme la plus citée dans la littérature, est la glucose oxydase (EC. 1. 1. 3. 4) En reprenant les résul-tats de Scotto et al cités plus haut , les auteurs ont observé un lien entre l'augmentation de E corr et les exo-polysaccharides, mais ils ont montré que ceux-ci, seuls, ne suffisent pas à assurer l'effet électrochimique du biofilm Cette affirmation a été obtenue en réalisant des expériences à deux températures différentes : à 25 C à 40 C Les résultats montrent que l'augmentation de E corr n'a pas eu lieu à 40 C, alors que la quantité de micro-organismes et d'exo-polysaccharides à 25 C est égale à celle observée à 40 C Les différences entre 25 et 40 C rési-dent dans la taxonomie (classification des bactéries contenues dans le biofilm selon leur genre bactérien) et le spectre métaboli-que des bactéries présentes dans le biofilm ; celles-ci sécrètent des enzymes capables de catalyser la dégradation des sucres, avec formation de peroxyde d'hydrogène, si la température est égale à 25 C, et non à 40 C Un mécanisme mettant en cause des enzymes, et conduisant à la production de H 2 O 2 a été proposé par Amaya et al , et par Dupont et al : tout d'abord, un dépôt de substances organiques (nutriments) se forme à la surface du métal ; elles sont ensuite oxydées lors du processus méta-bolique des bactéries aérobies, mettant en jeu une enzyme de type oxydase retenue par les substances extra-polymériques du biofilm ; dans ces processus, des espèces d'oxygène actif comme le peroxyde d'hydrogène sont générées La réaction catalysée par la glucose oxydase est la suivante : placeholder formula glucose acide gluconique Un modèle au laboratoire basé sur la glucose oxydase a été testé Il a permis d'observer une augmentation de E corr similaire à celle enregistrée en milieu naturel Une eau de mer synthétique dite biochimique a été mise au point et a permis, en utilisant ce modèle enzymatique, de réaliser des essais de corrosion localisée (effet de crevasse ou piqûration) sur des aciers inoxydables afin d'obtenir des résultats plus reproductibles Il est à noter que ce modèle enzymatique proposé, aboutit à une catalyse de la réduc-tion de l'oxygène Ceci n'explique pas la modification des processus cathodiques puisque la réduction de l'oxygène, catalysée par l'enzyme, permet d'oxyder le glucose mais n'amplifie pas la réaction cathodique qui se fait sur le métal Le peroxyde d'hydrogène peut alors jouer un rôle important dans la modification des processus cathodiques en agissant comme un oxydant, et favoriser ainsi la présence d'une réaction cathodique supplémentaire Ceci peut expliquer l'augmentation de E corr et montre encore une fois le rôle que peut jouer ce produit dans un biofilm L'effet de H 2 O 2 seul, sur le potentiel de corrosion libre a été testé plusieurs fois mais le mode d'action qui permet d'expliquer les phénomènes électrochimi-ques engendrés par la présence de ce produit n'a pas été révélé [62] ont confirmé le rôle du peroxyde d'hydrogène dans un biofilm, formé en eau de mer naturelle à la surface d'un acier inoxydable AISI 316L, par l'utilisation de deux enzymes qui catalysent la dégradation de H 2 O 2 : la catalase et la peroxydase (EC. 1. 11. 1. 7) Conditions anaérobies En corrosion anaérobie, les seules enzymes citées dans littérature et qui ont fait l'objet de quelques essais électrochimiques sont les hydrogénases Bergel et al se sont intéressés à l'échange électronique entre l'hydrogénase et un acier inoxydable AISI 316L Des essais électrochimiques ont été réalisés en introduisant l'enzyme dans une solution de tampon phosphate (pH 8) Les auteurs proposent deux mécanismes pour expliquer l'effet catalytique sur le métal : Mécanisme 1 : Le proton est réduit élec-trochimiquement sur l'acier inoxydable et l'enzyme permet de catalyser la consommation de l'hydrogène produit Ce mécanisme correspond à la dépolarisation cathodique qui a été cité par certains dans la littérature avec des aciers au carbone Mais des essais avec des bactéries à hydrogénase { { Comportement des aciers inoxydables en eaux naturelles : modèle enzymatique Enzymatic mechanism in natural seawater négative, d'une part, et le fait que ce méca-nisme est à l'encontre des mécanismes de la corrosion aqueuse (assimilée à tord à un équilibre chimique), d'autre part, ont fait que cette théorie a été abandonnée Mécanisme 2 : il s'agit du mécanisme le plus probable, d'après les auteurs, et qui consiste à un transfert direct d'électrons entre l'hydrogénase et l'acier inoxydable Un travail plus récent , montre que l'hydrogénase est capable de catalyser directement la réaction cathodique de NAD ou de l'eau (ceci dépend du potentiel) ce qui confirme l'important rôle de ces enzymes en corrosion microbienne anaérobie Conclusion Ce document montre que les hypothèses présentées dans la littérature, concernant l'augmentation de E corr des aciers inoxydables en eaux naturelles, peuvent être abordées selon une nouvelle approche qui fait appel à la catalyse enzymatique dans un biofilm Les hydrogénases expliquent bien l'amplification de la réaction cathodique en conditions anaérobies, bien que le transfert d'électrons reste un point à éclaircir L'hypothèse des mangano-bactéries a été validée par de nombreux travaux mais aucun mécanisme enzymatique n'a été mis en évidence La catalyse enzymatique semble toutefois, jouer un rôle primordial dans l'activité oxydante de ces bactéries La seule enzyme référencée qui permet d'oxyder les ions manganèse est la manganèse peroxydase Cette enzyme est capable de catalyser la réaction suivante : 2Mn(II) 2H H 2 O 2 2Mn(III) H 2 O L'utilisation de cette enzyme en corrosion microbienne peut avoir des résultats utiles, étant donné la particularité de la réaction citée : elle permet à la fois l'oxydation de Mn 2 , et la consommation du peroxyde d'hydrogène Récemment il a été démontré que la réaction d'oxydation de Mn(II) en Mn(IV) provoquée par des mangano-bacté-ries nécessite la formation de Mn(III) comme intermédiaire instable Le rôle de H 2 O 2 est également cité plusieurs fois dans la littérature pour tenter d'expliquer certains comportements électro-chimiques des aciers inoxydables La pré-sence de ce produit est étroitement liée à la réduction de l'oxygène, qui est le phéno-mène de base en corrosion aérobie Cette liaison réside dans le fait qu'en présence d'un biofilm, la réaction cathodique (celle de la réduction de l'oxygène) se fait selon un processus à deux électrons, c'est-à-dire avec la formation de H 2 O 2 Plusieurs enzymes peuvent affecter cette réaction cathodique, et par conséquent le comportement électrochi-mique du métal, soit en produisant du peroxyde d'hydrogène (glucose oxydase) soit en le consommant (peroxydase, catalase) Toutefois, la catalase peut avoir un effet supplémentaire : elle permet à la fois de dégrader le peroxyde d'hydrogène et d'assurer un nouvel apport d'oxygène qui affectera encore une fois les processus cathodiques Références | ISTEX | Scientific |
En cas d' impossibilité elles pourront être réalisées dans la cuisse. | EMEA_V3 | Medicinal |
Lesions myocardiques au cours de la mucoviscidose | WMT16 | Scientific |
Chimiothérapie des réticulosarcomes. Résultats d'un essai contrôlé portant sur 60 malades | WMT16 | Scientific |
Les médecins-dentistes autrichiens et l'Union européenne | WMT16 | Scientific |
La chèvre rousse de Maradi : son exploitation et sa place dans l'économie et l'élevage de la République du Niger | WMT16 | Scientific |
Autour de quelques symptômes d'eugénisme | WMT16 | Scientific |
Les menages n'auront plus de chef | WMT16 | Scientific |
Vous devez prendre AMMONAPS et suivre un régime alimentaire à vie, sauf si vous bénéficiez d' une transplantation hépatique. | EMEA_V3 | Medicinal |
Protocole National de Diagnostic et de Soins (PNDS) Syndrome de Wolfram Argumentaire CALISSON MAOLYA OPHTARA Octobre 2019 Cet argumentaire a été élaboré par les centres de référence Calisson, Maolya, Ophtara. Il a servi de base à l'élaboration du PNDS du Syndrome de Wolfram. Le PNDS est téléchargeable sur le site du centre de référence Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Sommaire Liste des abréviations . 4 Préambule . 5 Argumentaire . 6 1. 1 Recommandations de bonne pratique 6 1. 2 Revue systématique de la littérature 7 1. 3 Etudes cliniques 9 Annexe 1. Recherche documentaire et sélection des articles . 14 Annexe 2. Liste des participants . 15 Annexe 3. Autre. 17 Références bibliographiques . Erreur ! Signet Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Liste des abréviations ALD Affection de Longue Durée AMM Autorisation de Mise sur le Marché PNDS Protocole National de Diagnostic et de Soins DI 1 Diabète de type I NO Neuropathie optique RE Réticulum endoplasmique SW Syndrome de Wolfram Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Préambule Le PNDS sur le Syndrome de Wolfram a été élaboré selon la Méthode d'élaboration d'un protocole national de diagnostic et de soins pour les maladies rares publiée par la Haute Autorité de Santé en 2012 (guide méthodologique disponible sur le site de la HAS : Le présent argumentaire comporte l'ensemble des données bibliographiques analysées pour la rédaction du PNDS. Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Argumentaire 1. 1 Recommandations de bonne pratique Tableau 1. Recommandations de bonne pratique Auteur, Objectif Stratégie de Recueil de l'avis Recueil Populations et Résultats (avec grade année, recherche des professionnels de l'avis techniques (ou des recommandations référence, pays bibliographique (non, oui, lesquels) des produits) si disponible) renseignée patients étudiées (oui/non)* (non, oui) Euro-WABB / Non Oui Non Wolfram de Critères diagnostics Wolfram type I et II Ophtalmologistes Prise en charge Syndrome Guideline Neurologues Development Endocrinologistes Group. Pédiatres April 28th 2014 Généticiens {13} Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 1. 2 Revue systématique de la littérature Tableau 2. Revues systématiques de la littérature Auteur, année, Objectif Stratégie de Critères de Populations et Critères Résultats et référence, pays recherche sélection des techniques (ou d'évaluation signification renseignée études produits) (oui/non)* étudiées Barrett TG Description clinique Oui Etudes Principalement Corrélation Présentation 1997 et génétique disponibles à UK génétique / clinique du SW l'époque nationwide clinique {5} study Grande Bretagne Cryns K Revue sur le gène Non Toutes les Données de la génotype / Fonction du gene WFS1 et les mutations dans littérature et phénotype WFS1 corrélations la littérature et d'une base de {2} sur WFS1 génotype / données USA phénotype mutation database Kumar S Description clinique, Non Etudes séries Données de la Présentation Présentation 2010 épidémiologique et disponibles littérature clinique clinique du SW I génétique et II {8] Comparaison avec le diabète de type I de l'enfant Tranebjaerg L, Décrire les Non Etudes Patients Corrélation Présentation des 1993 / 2009 pathologies disponibles à porteurs de génétique / pathologies liées associées à des l'époque mutations de clinique à WFS1 {14} mutations de WFS1 WFS1 Allemagne Diagnostics différentiels Kanim F. Description clinique, Non Etudes Données de la Corrélation Interêt particulier 2001 épidémiologique et disponibles à littérature génétique / sur les génétique l'époque clinique corrélations {18] génétique / Grande clinique / Bretagne psychiatrie par une équipe leader Domenech E Revue clinique et Non Revue de la Données de la Présentation Pas de nouveauté 2006 génétique littérature littérature génétique plus Refusé que clinique Espagne Ganie MA Revue clinique et Non Revue de la Données de la Présentation Pas de nouveauté 2009 génétique littérature littérature clinique et génétique Refusé Inde Rigoli L Revue du rôle des Non Etudes Données de la Effet des Permet de 2012 {4} gènes WFS1 et disponibles à littérature mutatons sur confirmer les Italie surtout CISD2 l'époque notamment sur l'animal données de neuro le rôle de CISD2 dégénérescence Heredia ML de Affiner la 412 patients de Etudes Données de la Age de début Nouvelle 2013 présentation clinique 49 études disponibles à littérature des symptômes classification et {45} du SW et établir des l'époque avec et génotype corrélations Espagne corrélations éléments génotype / génotype / cliniques et phénotype. phénotype génétique Critères diagnostiques. Artières- Décrire les Non Audiométrie Clinique et Validation de Sterkers techniques paraclinique propositions 2014 d'audiométrie pédiatrique {38} France Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Tableau 2. Revues systématiques de la littérature Auteur, année, Objectif Stratégie de Critères de Populations et Critères Résultats et recherche sélection des techniques (ou d'évaluation signification référence, pays renseignée études produits) (oui/non)* étudiées Wiener-Vacher Décrire les causes et Non Enfants avec Clinique et Validation de S. exploration des vertiges et paraclinique propositions 2016 vertiges de l'enfant techniques {41} d'exploration France Urano Décrire la clinique, la Non Principales Description et Données de Apport de 2016 prise en charge et études perspectives Washington données sur la les perspectives disponibles University prise en charge ; {11} thérapeutiques School of USA Medicine Delprat B 2018 Revue de la Non Données Patients en Physio Précise les {19} littérature et actuelles rapport avec la pathognie mécanismes France hypothèses physio cellulaires de SW physiopathogéniques pathognie * date de début et fin de la recherche, bases de données, mots clés renseignés Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 1. 3 Etudes cliniques Tableau 3. Etudes cliniques Auteur, Objectif Méthodologie, Population Intervention Critères de Résultats et année, niveau de preuve jugement signification référence, pays Utili R 1977 Etude de Retrospectif 19 of 1044 Surveillance Clinique (hépatite) Traitement dont le {55} Italie complications Fort patients et décès bénéfice doit être hépatiques du pesé Dantroène Chu P 1986 Description des Rétrospectif 1 patient Urographie Aspect clinique et Mégavessie et {35} Grande toubles urologiques Moyen intraveineuse radiologique mégauretère Bretagne du SW Thompson Description du Etude clinique 7 patients vasopressin Augmentation et Fréaquence plus CJ 1989 diabète insipide Faible secretion freination sous élevée que connu {43} Grande dans le SW stimulation Bretagne Chan CH Etude de Retrospectif 122 patients Surveillance Dosage des Risque hépatique 1990 {56} complications du Fort Etude histologique transaminases et lors du traitement USA Dantroène bilirubine Clinique Histologie Fernandez Etude des troubles Rétrospectif 1 patient Etude urologique Clinique Hypogonadisme Rodriguez A, urologiques et Faible et activité 1991 {42} andrologiques andrologique Espagne Thanos A Description des Rétrospectif 3 patients Observationnel Description Propositions 1992 {60} toubles urologiques Faible clinique clinique thérapeutiques Grèce du SW Leiva- Description des Etude clinique 5 patients Observationnel Description Atrophie olivo ponto Santana C toubles Faible (Clinique, PEV, clinique et cérébelleuse 1993 neurologiques du Scanner, 1 seule radiologique Refusé SW IRM) Espagne Barrett TG. Description clinique Rétrospectif 45 patients Observationnel Description Description du SW 1995 du SW de type I Bilans de Grande (Bilan clinique clinique, (âge permettant systématiques Bretagne oph, audio, radio, d'apparition des l'établissement de {1} uro, endocrino, manifestations). recommandations Angleterre Moyen psycho) Article de référence Monllor Description des Observationnel 2 patients Observationnel Descriptif clinique Analyse des Gisbert toubles urologiques Faible Imagerie des troubles 1996 du SW voies urinaires et urologiques Refusé etude urodynamique Espagne Genis D 1997 Description Observationnel Un patient Examen anatomo Descriptif et Confirmation des {17} histopathologique Moyen et histo corrélation données Espagne et corrélaton pathologique. radiologiques anatomo-clinique concernant l'atrophie du tronc cérébral et des nerfs optiques. Gabreels Etude des Eude post mortem 3 patients et Eude post mortem Résultats Le diabète insipide, BA1998 {44} mécanismes du et histochimique 2 contrôles et histochimique immunohistochimi est lié à la perte de Hollande diabète insipide ques neurones du noyau supra-optique, et défaut de séceations des précurseurs. Tekgul S Description des Etude clinique 14 patients Imagerie des Descriptif et Analyse des 1999 toubles urologiques Moyen voies urinaires corrélation troubles du SW supérieures et anatomo clinique urologiques {33} etude video Turquie urodynamique. Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Tableau 3. Etudes cliniques Auteur, Objectif Méthodologie, Population Intervention Critères de Résultats et année, niveau de preuve jugement signification référence, pays Galluzzi P Décrire une Observationnel 1 patient IRM cérébral Aspect en T2 Hypersignal du 1999 {31} anomalie IRM in- Moyen pondéré locus niger Italie vivo Anglada Description des Observationnel 4 patients etude video Descriptif Analyse des Curado FJ toubles urologiques Rétrospectif urodynamique paraclinique troubles 2000 Refusé du SW urologiques Moyen Espagne Castro FJ Décrire la Observationnel Un patient Observationnel Description Description de la 2000 {26} symptomatologie Rétrospectif ophtalmologique présence de Espagne ophtalmolgique cataracte chez les Moyen patients porteurs d'un SW Bekir NA Rapporter deux cas Observationnel 2 patients Observationnel Description Description de 2000 {27} de glaucome Rétrospectif ophtalmologique glaucome juvénile Turquie juvénile et et cataracte cataracte Gmez-Zaera Recherche Etude génétique 22 patients Annalyse par Mutations Desciption de M génétique dans une Fort de 16 familles SSCP et mutations 2001 Refusé population de SW séquencage Espagne Domènech E Recherche de Etude génétique 109 patients Recherche Présence de 18 mutations dans 2002 mutation WFS1 Moyen et 49 témoins génétique mutation les patients Refusé chez des patients saisn Espagne diabétiques et/ou sourds Martorell L Vérifier si une Etude génétique Deux Etude SSCP pour 6 variants trouvés. Pas d'argument 2003 mutation du gène Moyen groupes de rechercher des Seuls deux pour considérer que WFS1 prédispose patients variants étudiés WFS1 est un gène Refusé aux troubles génétiques et de suscpetibilité Espagne psychiatriques fréquence en psychiatrique psychiatrie Al-Till M 2002 Décrire les Rétrospectif 15 patients Examen Acuité visuelle, Pourcentage {28} anomalies Moyen ophtalmologique vision des d'anomalies Jourdanie ophtalmologiques clinique et couleurs, ophtalmologiques paraclinique angiographie à la dont certaines non fluorescéine décrites. Simsek E Décrire l'âgede Rétrospectif 9 patients pédiatrie, Diabète, diabète Retard de 2003 {34} début et la Bilans ophtalmologie, insipide, croissance et de Turquie fréquence des systématiques audiologie, croissance, puberté, fréquence anomalies du SW urologie et puberté, urologie, des troubles auditifs Fort biologie médicale, ophtalmologie, infracliniques. notamment FSH audition, IRM et LH. cérébral Pennings RJ Etude des données Rétrospectif 11 patients Audiogramme et Seuil Précise l'atteinte 2004 {16} audiovestibulaires Moyen SW et 17 bilan vestibulaire dans le SW Belgique de patients porteurs Wolfram et de sains porteurs sains Domènech E Diagnostic prénatal Observationnel 1 cas Diagnostic pré Mutation chez les 1er diagnostic 2004 du SW Génétique natal parents et prénatal {48} l'embryon Espagne Yusta B 2006 Role du GLP-1 Prospectif Souris Action du Dosage Action du GLP-1 {51} Canada Animal récepteur du GLP- Cano A 2007 Etude des Propspective 26 patients Biologie et Microalbuminurie Les complications {49} France complications WS clinique Ophtalmologie sont plus rares microvasculaires 52 patients ophtlmologique dans le SW que DI1 dans le DI1 Nickl-{30} Décrire des Observationnel 1 patient Examen clinique Etat clinique et Troubles du Jockschat T troubles du Rétrospectif et évolution sous comportemental comprtement 2008 comportement et traitement de la labiles et troubles Allemagne cognitifs glycémie cognitifs Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Tableau 3. Etudes cliniques Auteur, Objectif Méthodologie, Population Intervention Critères de Résultats et année, niveau de preuve jugement signification référence, pays (mnésiques). Akiyama M Vérifier si la perte Prospectif Souris wfs-/- Etude anatomo Test de résistance Les cellules b des 2009 {58} des cellules est Animal histochimique de à l'insuline souris wfs-/- sont Japon liée au stress du pancréas Apoptose des sensibles au stress RE et si la cellules du RE et à pioglitazone l'augmetnation des améliore la besoins en insuline. résistance à La pioglitazone l'insuline réduit ce stress. Hilson JB Description Etude Un patient Examen anatomo Descriptif et Confirmation de la 2009 histopathologique anatomopathologi et histo corrélation neuro {15} USA et corrélaton que pathologique anatomo clinique dégénérescence anatomo-clinique Moyen notamment ORL. Chaussenot Etude des troubles Observationnel 59 patients Observationnel Description Etude de reference A neurologiques et Fort français dont clinique sur les troubles 2010 correlation le dossier a Correlation neurologiques {6] genotype- été colligé au genotype- La plus grande France phenotype CHU de Nice phenotype série sur le sujet Mets RB Description d'une Observationnel et 2 patients et Observationnel Description Confirmation de la 2010 {25} fratrie de SW de revue de la leurs parents ophtalmologique clinique présence de type I avec littérature Revue de la cataracte chez les cataracte littérature patients porteurs Moyen d'un SW Labauge P Description de Rétrospectif 1 patient Bilan Déficits Description des 2010 {29} troubles Moyen neurologique et neurologiques et troubles cognitifs. France neurologiques et cognitif cognitifs cognitifs lors d'un IRM cérébra SW Kim JY 2011 Etude de Rétrospectif 243 patients Bilans hépatiques Transaminases, Les doses faibles {57} Corée du complications sanguins phosphatase de dantrolène ne sud hépatiques du alcaline, bilirubine sont pas toxiques. Dantroène Rohayem J Décrire la Rétrospectif 50 patients Observationnel NO, équilibre Pas de description 2011 Refusé progression du SW et 169 clinique diabétique, des signes Allemagne diabète et de la diabétiques (ophtalmologie, troubles cliniques neurodégénéresce neurologie, ORL, neurologiques, nce dans le SW et Urologie, urologiques, le diabète de type I endocrinologie) Analyse génétique Yuca SA Complications Observationnel Une fratrie Etude génétique Mutations Insuffisance rénale 2012 {35} rénales des Etude urologique génétiques par anomalie Fort Turquie troubles urinaires et et néphrologique Fonction rénale urologique. étude génétique Bababeygy Essai de Cas clinique 1 cas Observationnel Acuité visuelle et Essai d'un SR 2012 l'idébénone dans le OCT traitement usuel de Observationnel {59} USA SW NO héréditaire. Pickett KA Etude des troubles Prospectif 13 patients MiniBest Score Troubles de 2012 {39} de l'équilibre l'équilbres plus USA précoce Pickett KA Etude des troubles Prospectif 13 patients MiniBest Score Troubles de 2012 {40} de l'équilibre l'équilbres plus USA précoce Karzon RK Décrire la Etude clinique 11 patients Bilan ORL et Examen ORL, Précision sur 2013 {37} symptomatologie vestibulaire Audiogramme, l'évolution des Fort USA auditive et Réflexe vestibulo troubles ORL vestibulaire oculaire Marshall BA Description clinique Données tirées 18 patients Observationnel Age de début Complète et affine 2013 du SW de type I d'une étude Washington Bilan complet Description les données de {1} {7} clinique University (oph, audio, radio, clinique et USA longitudinale Wolfram uro, endocrino, paraclinique lors Syndrome psycho) de l'examen Fort International Registry website Ribiere Description des Etude prospective Par Questionnaire Description de Aarticles portant sur 2013 toubles urologiques de cohorte questionnaire Etude urologique manifestations les troubles Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Tableau 3. Etudes cliniques Auteur, Objectif Méthodologie, Population Intervention Critères de Résultats et année, niveau de preuve jugement signification référence, pays {32} du SW Fort : 33 patients urologiques urologiques dans France Etude 22 une grande série patients Gocmen R Analyse d'une IRM Image Un patient IRM Descriptif Confirme les 2014 cérébrale données d'imagerie {9] (atrophie des nerfs Turquie optiques et du tronc cérébral) Lu S 2014 Etude du role de la Etude biochimique Cellules Etude Epression de la La calpaine et ses {54} USA calpaine dans et cellulaire HEK293 immunohistochimi calpaine, voies d'activation l'apoptose des modifiées que prévention de sont des cellules et des avec SW II l'apoptose traitements neurones lors du potentiels SW II. Hoekel J, Décrire la Etude prospective 18 patients Examen Corrélation entre Définit des 2014 {24] symptomatologie Fort ophtalmologique les manifestations marqueurs USA ophtalmolgique clinique et cliniques ophtalmologiques précoce et paraclinique ophtalmologiques de sévéréité pour rechercher des (OCT) et l'échelle de des études marqueurs sévértié WURS ultérieures cliniques Zmysowska Etude de la Etude de registres 2568 DI1 Etude Diagnostic de SW A 2014 prévalence du SW Euro-WABB et dont 13 SW épidémiologique Refusé chez des enfants PolPeDiab Pologne porteurs de DI1 Mozzillo E Description clinique Observationnel Un cas Observationnel Descriptif Apport sur les 2014 {21} du SW de type II (Ophtalmologie et troubles Moyen Italie coagulaiton) hémorragiques du SW II Perrotta S Etude de l'étiologie Recherche 9 enfants Génétique Présence de Le SW est une 2015 Refusé de diabètes génétique dont 2 SW (Recherche de mutation étiologie du de Italie insipides centraux Fort mutations WFS1) diabète insipide précoces central précoce Zmyslowska Comparaison des Etude clinique 1er groupe OCT maclaire Valeur de Amincissement A 2015 {23} modifications de WFS1 n 10 l'épaisseur rétinien spécifique Fort Pologne l'épaisseur DID n 12 rétinienne des patients rétinienne dans 2 Témoin n 13 Wolfram groupes de patients 2è groupe (SW I et diabétique Porteur de type I) WFS1 n 12 Témoins n Galvez-Ruiz Description de la Observationnel 1 cas Comparaison Clinique Pas d'apport A. 2015 variabilité des NO avec un cas d' ophtalmologique Moyen Refusé héréditaires. atrophie optique Arabie dominante Saoudite Paris LP Etude des raions Observationnel et Un cas Observationnel Descriptif Apport sur 2016 génétiques de étude génétique (ophtalmologie) et l'absence de {22} USA l'absence d'atteinte génétique complications liées Moyen micro vasculaire au diabète Lugar HM Etude systématique Etude prospective 29 patients Observationnel Voxel-wise Description de 2016 neuro radiologique Fort Wolfram / 52 IRM cérébrale analysis methods l'évolution de {10} et évolution contrôles répétées tous les l'atrophie du tronc Contre groupes USA témoins (diabétiques ans pendant 1 à 4 cérébral dans le et non ans temps diabétiques) Washington University Danielpur L Etude du GLP1A Observationnel Cas clinique Observationnel Résultats Les mécanismes 2016 comme traitement (clinique) et étude in Etude in vitro sur cliniques et in vitro physiopathogéniqu Refusé du SW vitro modèle cellulaire es sont en faveur Israel avec inactivation d'un intérêt de de CISD2 GLP1A Grenier J Etude clinique et Rétrospective 48 patients Etude clinique et Acuité visuelle Différence de 2016 corrélation clinique et (20 SW et 28 génétique OCT sévérité des NO {63} génétique génétique NO non selon la forme France comparant des NO syndromique clinique Moyen Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Tableau 3. Etudes cliniques Auteur, Objectif Méthodologie, Population Intervention Critères de Résultats et année, niveau de preuve jugement signification référence, pays non syndromiques s ou syndromiques par mutation WFS1 Sedman T Rechercher si Prospectif Souris wfs-/-, Perfusion Sécrétion Efficaicté des 2016 {53} l'exenatide, un wfs /-, wfs / intrapérinonéale d'insuline, taux de dérivés du GLP-1 Animal Estonie agoniste des d'exenatide et glucose intra récepteurs du GLP- glipizide péritnoéal 1 et le glipizide peuvent traiter le diabète du SW Doty T 2017 Etude de l'activité Etude de qualité 31 Wolfram Questionnaire Score du Plus les symptômes Refusé USA des patients de vie 25 DI 1 Corrélé aux questionnaire sont importants Wolfram 29 contrôles symptômes plus l'activité diminue. Rouzier Etude du rôle du Observationnel Cas clinique Observationnel Patient versus Description d'un 2017 gène CISD2 sur la (clinique) et Etude du taux de controles cas de SW de type {19} mitochondrie et biochimique calcium sur II Europe descirption clinique fibroblastes d'un cas Kuba K Décrire une prise Descrption Présentation Prise en charge 2017 {61} en charge psychologique Allemagne psychologique pour patients atteints de pathologies chroniques Akturk HK Description clinique Observationnel Un cas Observationnel Affine les données 2017 {12} du SW de type II sur le SW II Moyen USA Wragg R Description des Rétrospectif 40 patients Etude clinique et Epreuve uro Affine les données 2018 toubles urologiques paraclinique dynamique mais peu de Refusé du SW de type I et données nouvelles Grande II Bretagne Toots M 2018 Etude de l'effet Prospectif Souris Traitement par Sécrétion Intérêt pour {52} Estonie d'unt raitement GLP-1 pendant 8 d'insuline, IPGTT, protéger les cellules Animal prolongé par GLP-1 jours glucagon, peptide pancréatiques chez le rat wfs C. Etude du stress oxydatif pancréatique Kondo M, Role du GLP-1 Prospectif Souris Action du Dosage Action du GLP-1 2018 {50} dans le SW récepteur du GLP- dans le SW Animal Japon 1 sur les cellules pancréatiques Duan L 2108 Description clinique Rétrospectif 6 patients Observationnel Descrption Pas d'apport Refusé du SW de type I Moyen Chine Bueno GE Description clinique Rétrospectif 50 patients Observationnel Présence d'une Importance du 2018 du SW de type I NO, d'un diabète, diabète de type I moyen {46} Espagne d'une surdité, de non auto immun troubles neurologiques Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Annexe 1. Recherche documentaire et sélection des articles Recherche documentaire Sources consultées Bases de données : Pubmed Période de recherche De 1985 jusqu'à 2018 Langues retenues Français, anglais, espagnol, polonais Mots clés utilisés Wolfram syndrome, WFS1 gene, DIDMOAD, diabetes melitus, optic neuropathy Nombre d'études recensées 76 Nombre d'études retenues 61 Critères de sélection des articles Des recommendations européennes sont disponibles, fournies par le groupe Euro-WABB dont sont membres les porteurs de ce PNDS. Mais, ces recommendations sont anciennes. Dans le cadre de ce PNDS, ces recommendations européennes ont été mises à jour à partir des données de la litérature. Pour la rédaction de ce PNDS, nous avons privilégié les articles cliniques et nous n'avons pas retenu les articles qui traitent de mécanismes physiopathogéniques ou de mécanismes génétiques dès lors qu'ils n'éclairent pas la présentation clinique ou la prise en charge diagnostic et thérapeutique des patients. Du fait de la rareté de la maladie, nous avons retenu les articles rétrospectifs présentant un nombre réduit de cas. Le choix de retenir ces articles s'est notamment imposé lorsque ces travaux présentent des manifestations cliniques avérées du syndrome de Wolfram, validées par la communauté médicale prenant en charge les patients porteurs d'un syndrome de Wolfram (workshop international régulier tous les 18 mois environ sous l'égide de l'Association du Syndrome de Wolfram) mais non nécessairement rapportées ailleurs. Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Annexe 2. Liste des participants Ce travail a été coordonné par Le Pr Christian HAMEL, Directeur du Centre de Référence MAOLYA, CHU de Montpellier Le Dr Annabelle CHAUSSENOT, Centre de référence Calisson, CHU de Nice, sous la direction du Pr Véronique Paquis Le Dr Christophe ORSSAUD Centre de référence OPHTARA, HEGP, 20, Rue Leblanc 75015 Paris, sous la direction du Pr Brémond Gignac Ont participé à l'élaboration du PNDS : Rédacteurs Pr Christian HAMEL, ophtalmologiste, Montpellier Dr Jean-Philippe BERTOCCHIO, physiologie, HEGP, Paris Dr Claudine BLANCHET, ORL, Montpellier Dr Annabelle CHAUSSENOT, généticienne, Nice Dr Marie COURBEBAISSE, médecin physiologiste, HEGP, Paris Dr Christophe ORSSAUD, ophtalmologiste, HEGP, Paris Dr Alina RADU, diabétologue, HEGP, Paris Pr Julia ROHAYEM, pédiatre, Muenster, Allemagne Pr Agathe ROUBERTIE, neuropédiatre, Montpellier Groupe de travail multidisciplinaire Pr Dominique BREMOND GIGNAC Pr Hélène DOLLFUS Pr Isabelle MEUNIER Pr Véronique PAQUIS Pr Tim BARRETT Pr Dominique BONNEAU Pr Eric FONTAINE Pr Christophe VERNY Pr Patrick YU WAI MAN Dr Sabine DEFOORT Dr Sandrine MARLIN Dr Valérie PELLETIER Dr Matthieu ROBERT Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Dr Cécile ROUZIER Mme Isabelle ROBIN Mme Marie ARCOUS Mme Nolwen LE FLOCH Mme Virginie PICARD Gestion des intérêts déclarés Tous les participants à l'élaboration du PNDS sur le syndrome de Wolfram ont rempli une déclaration d'intérêt disponible sur le le site internet du centre de référence Les déclarations d'intérêt ont été analysées et prises en compte, en vue d'éviter les conflits d'intérêts, conformément au guide HAS Guide des déclarations d'intérêts et de gestion des conflits d'intérêts (HAS, 2010). Modalités de concertation du groupe de travail multidisciplinaire Les réunions de concertation du groupe de travail multidisciplinaire ont eu lieu par internet. Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Annexe 3. Autre Adresses utiles Centres de référence : Adresses postales complètes sur le site de Sensgène. o Centre de référence des affections sensorielles d'origine génétique (MAOLYA, CHU de Montpellier) o Centre de référence des affections ophtalmologiques d'origine génétique (CARGO, CHU de Strasbourg) : cargo@chru-strasbourg. fr o Centre de référence des maladies mitochondriales (CALISSON, CHU de Nice) : o Centre de référence des surdités congénitales d'origine génétique (Hôpital Necker Enfants Malades, Paris) o Centre de Référence des maladies rares en ophtalmologie (OPHTARA. Necker Enfants Malades, Paris et Hôpital Européen Georges Pompidou, Paris) o Centre de références des dystrophies rétiniennes (Hôpital des 15/20, Paris) o Service d'Explorations de la Vision, CHU de Lille Association du Syndrome de Wolfram : Orphanet : EURO-WAAB : ARIBa : Equipe Relais Handicaps Rares dans votre région : regionaux-locaux/les-equipes-relais-handicaps-rares Centre des maladies rares en ophtalmologie / Octobre 2019 Références bibliographiques 1. Barrett TG, Bundey SE, Macleod AF. 14. Tranebjaerg L, Barrett T, Rendtorff ND. WFS1- Neurodegeneration and diabetes : UK nationwide study Related Disorders. In : Adam MP, Ardinger HH, Pagon of Wolfram (DIDMOAD) syndrome. Lancet (London, RA, et al. , editors. GeneReviews(R). Seattle (WA), England) 1995 ; 346(8988) : 1458-1463. 1993. 2. Cryns K, Sivakumaran TA, van den Ouweland, 15. Hilson JB, Merchant SN, Adams JC, Joseph Jody M W, et al. Mutational spectrum of the WFS1 gene JT. 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Méthodes de mesure du débit utérin ou placentaire | WMT16 | Scientific |
Par conséquent, les médicaments qui utilisent cette même voie métabolique ou qui modifient l' activité du cytochrome CYP3A4 peuvent entraner des modifications des paramètres pharmacocinétiques de l' amprénavir. | EMEA_V3 | Medicinal |
Facteurs de risque vasculaire et insuffisance rénale | WMT16 | Scientific |
Essais d'indiure la Essais d'indiure résistance au thiotepa de l'espéce Musc domestica | WMT16 | Scientific |
Responsabilité médicale de l'anatomopathologiste | WMT16 | Scientific |
Les insuffisances cardiaques aigus de la fibrillation auriculaire | WMT16 | Scientific |
Réalisation de l' injection | EMEA_V3 | Medicinal |
Localisation du calcium au niveau des chloroplastes de la feuille d'avoine (avena sativa l. ) par une méthode trace-autoradiographique à très haute résolution | WMT16 | Scientific |
Etude allergologique concernant une série de N-phényl-N'-alcoyl paraphénylène diamines | WMT16 | Scientific |
Prévention secondaire de l'infarctus myocardique par les bêta-bloquants | WMT16 | Scientific |
Prothèses totales de hanche après ostéotomie fémorale haute | WMT16 | Scientific |
De la perspective d' aidant naturel à celle de proche-soignant : un passage nécessaire | WMT16 | Scientific |
Fistules et kystes branchiaux auriculo-cervicaux à expression parotidienne | WMT16 | Scientific |
Les cancers oncocytaires de la thyroïde. Cancers à cellules de Hrthle | WMT16 | Scientific |
Les études chez l'animal montrent que l'administration de chlorhydrate de doxorubicine sous une formulation liposomale réduit l'éventualité de lésions par extravasation. | EMEA_V3 | Medicinal |
Dépistage des conductrices de l'hémophilie A par dosage comparatif de l'activité et de l'antigénicité facteur VIII | WMT16 | Scientific |
Validité de l'emploi de la thermodilution pour la mesure du débit coronaire. Etude sur modèle | WMT16 | Scientific |
Le syndrome irido-cornéo-endothélial. A propos d'une série de 7 cas | WMT16 | Scientific |
Porphyrie mixte ou variegata. Etude familiale | WMT16 | Scientific |
Mise en évidence de quelques enzymes dans le sperme de la carpe (Cyprinus carpio L. ) et de la truite (Salmo gairdnerii Richardson ) et dans le liquide coelomique de la truite | WMT16 | Scientific |
Recherches sur l'activité antimitotique dans la série des uréthanes. I. Ethyluréthane et uréthanes du glycol | WMT16 | Scientific |
489, 7 mg/ m) ; toutefois, cette manifestation a été rapportée chez certains patients pendant les premiers cycles de traitement. | EMEA_V3 | Medicinal |
Vers une psychiatrie sans violence | WMT16 | Scientific |
Ostéomyélite tuberculeuse du membre inférieur secondaire à une vaccination par le BCG SSI | WMT16 | Scientific |
Le principe actif de Tygacil, le tigecycline, est un antibiotique appartenant au groupe des glycylcyclines, qui sont similaires à la tétracycline. | EMEA_V3 | Medicinal |
Hépatite B et syphilis primo-secondaire. 3 observations | WMT16 | Scientific |
Ne prenez pas CIALIS en même temps que d'autres médicaments si votre médecin vous dit que vous ne devez pas le faire. | EMEA_V3 | Medicinal |
Le mérycisme chez l'adulte relève-t-il de la chirurgie ? Trois cas traités chirurgicalement | WMT16 | Scientific |
transaminases sériques supérieure à 3 fois la limite supérieure de la normale (> 3 N) (cf. rubrique 4. 4). | EMEA_V3 | Medicinal |
La prise en charge pluridisciplinaire du patient âgé victime d'un accident vasculaire cérébral | WMT16 | Scientific |
Ci-dessous, les effets indésirables rapportés/ observés par fréquence sont listés : | EMEA_V3 | Medicinal |
Les thrombocytoses réactionnelles et leur risque thrombotique | WMT16 | Scientific |
Chez les truies et cochettes : injection intramusculaire de 2 ml de vaccin par animal au niveau du cou, en arrière de l'oreille. | EMEA_V3 | Medicinal |
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