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Clairance de la créatinine de 31 à 60 ml/ min (créatininémie de 120 à 170 mol/ l) | EMEA_V3 | Medicinal |
Réaction de type maladie sérique | EMEA_V3 | Medicinal |
s u si on vous a diagnostiqué une hypertension artérielle qui n'est pas contrôlée par d'autres médicaments ; ou | EMEA_V3 | Medicinal |
Modifications de l'appareil génital du cobaye femelle après lésions stéréotaxiques de l'hypothalamus antérieur | WMT16 | Scientific |
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Sujets âgés : la pharmacocinétique, l' efficacité et la tolérance de l' amprénavir n' ont pas été étudiées chez les patients âgés de plus de 65 ans (voir rubrique 5. 2). | EMEA_V3 | Medicinal |
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CYTARABINE ACCORD 100 mg/ml, solution injectable ou pour perfusion - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 26/11/2020 CYTARABINE ACCORD 100 mg/ml, solution injectable ou pour perfusion Cytarabine. 100 mg Pour 1 ml de solution. Chaque flacon de 1 ml contient 100 mg de cytarabine. Chaque flacon de 5 ml contient 500 mg de cytarabine. Chaque flacon de 10 ml contient 1 g de cytarabine. Chaque flacon de 20 ml contient 2 g de cytarabine. Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Le produit est une solution transparente, incolore, pratiquement dépourvue de particules. pH : 7, 0 9, 5 Les recommandations posologiques peuvent être établies en fonction du poids corporel (mg/kg) ou de l'indice de masse corporelle (mg/m ). Les recommandations posologiques en fonction du poids corporel peuvent être converties en fonction de la surface corporelle au moyen des nomogrammes. 1. Induction de la rémission : La posologie et la fréquence d'administration du traitement d'induction varient en fonction du schéma utilisé. a) Traitement continu : Les schémas posologiques ci-après ont été utilisés pour le traitement continu dans l'induction de la rémission. i) Injection rapide : 2 mg/kg/jour constitue une dose initiale appropriée. Le traitement doit être administré pendant 10 jours, avec un contrôle quotidien des numérations sanguines. Si aucun effet anti-leucémique n'est noté et qu'aucune toxicité n'apparat, augmenter à 4 mg/kg/jour et maintenir le traitement à cette dose jusqu'à l'obtention d'une réponse thérapeutique ou l'apparition de toxicité. ii) 0, 5 1, 0 mg/kg/jour peut être administrée par perfusion d'une durée pouvant aller jusqu'à 24 heures. Les résultats des perfusions d'une heure sont satisfaisants chez la majorité des patients. Après 10 jours, cette dose quotidienne initiale peut être augmentée à 2 mg/kg/jour en fonction de la toxicité. Il convient de poursuivre le traitement jusqu'à l'apparition d'une toxicité ou d'une rémission. b) Traitement intermittent : Les schémas posologiques ci-après ont été utilisés pour le traitement intermittent dans l'induction de la rémission. i) 3-5 mg/kg/jour est administrée par voie intraveineuse chaque jour pendant cinq jours consécutifs. Après une période sans traitement de deux à neuf jours, un autre cycle de traitement est administré. Il convient de poursuivre le traitement jusqu'à l'apparition d'une toxicité ou d'une réponse thérapeutique. Les premiers signes d'amélioration médullaire ont été rapportés comme survenant entre 7 et 64 jours (28 jours en moyenne) après le début du traitement. En général, si un patient ne présente ni toxicité ni rémission après un essai correctement mené, il est recommandé d'être prudent lors de l'administration de doses plus fortes. En principe, les patients semblent tolérer les doses plus fortes lorsqu'elles sont administrées par injection intraveineuse rapide plutôt que par perfusion lente. Cette différence est due au métabolisme rapide de la cytarabine et en conséquence à la durée d'action courte de la dose élevée. ii) On a utilisé la cytarabine à la posologie de 100-200 mg/m /24 heures en perfusion continue pendant 5-7 jours en monothérapie ou en association avec d'autres cytostatiques dont, par exemple, une anthracycline. Il est possible d'administrer des cycles supplémentaires à intervalles de 2-4 semaines, jusqu'à l'obtention de la rémission ou le développement d'une toxicité inacceptable. 2. Traitement d'entretien : La posologie d'entretien et la fréquence d'administration dépendent du protocole utilisé. Les protocoles d'administration ci-après ont été utilisés pour le traitement continu après l'induction de la rémission. i) Les rémissions induites par la cytarabine ou par d'autres médicaments, peuvent être maintenues par injection intraveineuse ou sous-cutanée de 1 mg/kg une ou deux fois par semaine. Population pédiatrique Personnes âgées : Mode d'administration Anémie, leucopénie et thrombocytopénie d'étiologie non maligne (p. ex. aplasie médullaire) ; sauf si le médecin considère que ce traitement représente l'alternative la plus appropriée pour le patient. Mises en garde La cytarabine est un myélosuppresseur puissant. Le traitement doit être démarré avec prudence chez les patients présentant une myélosuppression préexistante iatrogène. Les patients qui reçoivent ce médicament doivent être sous surveillance médicale étroite et au cours du traitement d'induction, doivent avoir quotidiennement une numération leucocytaire et plaquettaire. Des examens de la moelle osseuse doivent être effectués fréquemment après la disparition des cellules blastiques du sang périphérique. Des équipements devront être disponibles pour la prise en charge des complications, potentiellement d'issue fatale, de myélosuppression (infection résultant d'une granulopénie et d'autres atteintes des défenses de l'organisme, et hémorragie secondaire à une thrombopénie). Des réactions anaphylactiques se sont produites avec un traitement par cytarabine. Un cas d'anaphylaxie ayant entrané un arrêt cardiopulmonaire aigu et ayant nécessité une réanimation a été rapporté. Ceci s'est produit immédiatement après l'administration intraveineuse de cytarabine. ont été rapportés après administration de schémas posologiques expérimentaux de cytarabine. Ces réactions incluent une toxicité cornéenne réversible ; une dysfonction cérébrale et cérébelleuse, généralement réversible ; une somnolence ; des convulsions ; une ulcération gastro-intestinale sévère, y compris une pneumatose kystique intestinale, entranant une péritonite ; une septicémie, un abcès du foie et un œdème pulmonaire. La cytarabine s'est avérée être carcinogène chez les animaux. La possibilité d'un effet similaire doit être prise en compte lorsqu'on prévoit la prise en charge à long terme d'un patient. Précautions d'emploi Les patients recevant de la cytarabine doivent être étroitement surveillés. Il est impératif de procéder à une numération plaquettaire et leucocytaire fréquente. Le traitement doit être suspendu ou modifié lorsque la myélosuppression induite par le médicament a entrané une chute du nombre de plaquettes en dessous de 50 000 ou du nombre de polynucléaires granulocytes en dessous de 1 000 par mm . Le nombre d'éléments figurés dans le sang périphérique peut continuer à diminuer après l'arrêt du médicament, et atteindre les valeurs les plus basses 5 à 7 jours après l'interruption du traitement. S'il est indiqué, le traitement peut être repris dès l'apparition de signes certains de récupération médullaire (sur des myélogrammes successifs). Des neuropathies périphériques motrices et sensitives après un traitement de consolidation à fortes doses de cytarabine, de daunorubicine et d'asparaginase ont été observées, chez des patients adultes souffrant de leucémie aigu non lymphoblastique. Les patients traités par de fortes doses de cytarabine doivent être surveillés pour vérifier l'absence d'apparition de neuropathie car une adaptation du schéma posologique peut être nécessaire pour éviter des troubles neurologiques irréversibles. Une toxicité pulmonaire sévère et parfois fatale, un syndrome de détresse respiratoire chez l'adulte et un œdème pulmonaire ont été observés après l'administration expérimentale de forte doses de cytarabine. Lorsque des doses intraveineuses sont administrées rapidement, les patients ont fréquemment des nausées et peuvent vomir pendant plusieurs heures après l'administration. Ce problème tend à être moins sévère lorsque le médicament est administré en perfusion. Une sensibilité abdominale (péritonite) et une colite guaïac positive, avec une neutropénie et une thrombocytopénie concomitantes, ont été rapportées chez des patients traités avec des doses conventionnelles de cytarabine en association avec d'autres médicaments. Les patients ont répondu à une prise en charge médicale non chirurgicale. Une paralysie ascendante progressive différée aboutissant au décès a été rapportée chez des enfants atteints de LMA après une administration intrathécale ou intraveineuse de cytarabine aux doses conventionelles, en association avec d'autres médicaments. Patients présentant une insuffisance hépatique préexistante Il convient de surveiller la fonction hépatique ainsi que la fonction rénale pendant le traitement par la cytarabine. Chez les patients présentant une insuffisance hépatique préexistante, la cytarabine doit être administrée avec la plus grande prudence. Une exploration régulière des fonctions médullaire, hépatique et rénale doit être effectuée chez les patients recevant de la cytarabine. Comme les autres médicaments cytotoxiques, la cytarabine peut induire une hyperuricémie secondaire à la lyse rapide des cellules néoplasiques. Le médecin devra surveiller le taux sanguin d'acide urique du patient et prendre les mesures pharmacologiques et de soutien éventuellement nécessaires pour contrôler ce problème. Vaccins/Effets immunosuppresseurs/Augmentation de la sensibilité aux infections. L'administration de vaccins vivants ou de vaccins vivants atténués à des patients immunodéprimés par des traitements de chimiothérapie tels que la cytarabine peut entraner des infections graves ou fatales. La vaccination par un vaccin vivant doit être évitée chez les patients recevant de la cytarabine. Des vaccins à virus tué ou inactivé peuvent être administrés ; cependant, la réponse à de tels vaccins peut être diminuée. Doses élevées Le risque d'effets secondaires sur le SNC est plus élevé chez les patients ayant déjà reçu un traitement du SNC comme une chimiothérapie intrathécale ou une radiothérapie. La transfusion concomitante de granulocytes doit être évitée car des cas d'insuffisance respiratoire sévère ont été rapportés. Des cas de cardiomyopathie entranant la mort ont été rapportés après l'administration d'un traitement expérimental à fortes doses par la cytarabine en association avec le cyclophosphamide, dans le cadre de la préparation à une greffe de moelle osseuse. La 5-fluorocytosine ne doit pas être administrée avec la cytarabine car l'efficacité thérapeutique de la 5-fluorocytosine est diminuée pendant ce type de thérapie. Digoxine Des diminutions réversibles des concentrations plasmatiques de digoxine à l'équilibre et de l'excrétion rénale des glucosides ont été observées chez les patients recevant de la bêta-acétyl digoxine et une chimiothérapie contenant du cyclophosphamide, de la vincristine et de la prednisone, associés ou non à la cytarabine ou à la procarbazine. Les concentrations plasmatiques de digitoxine à l'équilibre ne semblent pas modifiées. Par conséquent, la surveillance des concentrations plasmatiques de digoxine peut être indiquée chez les patients recevant des associations de chimiothérapies similaires. L'utilisation de digitoxine chez ces patients peut être considérée comme une alternative. Gentamicine Une étude entre la gentamicine et la cytarabine a montré un antagonisme lié à la cytarabine sur la sensibilité aux souches . Chez les patients sous cytarabine et traités par gentamycine pour une infection à une absence de réponse thérapeutique rapide peut indiquer la nécessité de réévaluer l'antibiothérapie. Utilisation de la cytarabine en monothérapie ou en association à d'autres médicaments immunosuppresseurs En raison des propriétés immunosuppressives de la cytarabine, les infections virales, bactériennes, fongiques, parasitaires ou saprophytes, en tout lieu du corps, peuvent être associées à l'utilisation de la cytarabine en monothérapie ou en association à d'autres médicaments immunosuppresseurs après l'administration de doses immunosuppressives affectant l'immunité cellulaire ou humorale. Ces infections peuvent être légères, mais aussi sévères et parfois mortelles. Grossesse La cytarabine est tératogène chez certaines espèces animales. L'utilisation de cytarabine chez les femmes enceintes ou susceptibles de l'être, ne doit être envisagée qu'après une prise en considération soigneuse des bénéfices et risques potentiels. Les femmes doivent utiliser une méthode contraceptive efficace pendant et jusqu'à 6 mois après le traitement. Ce produit ne doit normalement pas être administré à des femmes enceintes ou à des mères qui allaitent leur enfant. Fertilité Il n'a pas été mené d'études de fertilité visant à évaluer la toxicité de la cytarabine sur les fonctions de reproduction. Une suppression gonadique, entranant une aménorrhée ou une azoospermie, peut survenir chez les patient(e)s recevant le traitement par cytarabine, en particulier en association à des agents alkylants. En général, ces effets semblent être liés à la dose et à la durée du traitement, et ils peuvent être irréversibles (voir rubrique 4. 8). Étant donné le potentiel mutagène de la cytarabine, il doit être conseillé aux hommes traités sous traitement par la cytarabine et à leurs partenaires d'utiliser une méthode contraceptive efficace durant le traitement et pendant 6 mois après le traitement. Les effets indésirables suivants ont été rapportés en association avec le traitement à la cytarabine : Les fréquences des effets indésirables sont définies à l'aide de la convention suivante : Très fréquent ( 1/10) Fréquent ( 1/100 à Peu fréquent ( 1/1 000 à Rare ( 1/10 000 à 000) Très rare ( 000) Fréquence indéterminée (la fréquence ne peut pas être estimée à partir des données disponibles) Les effets indésirables de la cytarabine dépendent de la dose administrée. Les effets indésirables les plus fréquents sont de type gastro-intestinal. La cytarabine est toxique pour la moelle osseuse, et provoque des effets indésirables hématologiques. Infections et infestations : Peu fréquent : Affections hématologiques et du système lymphatique : Fréquent : anémie, mégaloblastose, leucopénie, thrombocytopénie. Fréquence indéterminée : réduction du nombre des réticulocytes. La sévérité de ces réactions dépend de la dose et de la fréquence de l'administration. Des modifications cellulaires sont à attendre au niveau de la morphologie de la moelle osseuse et des frottis de sang périphérique. Affections du système immunitaire : Peu fréquent : anaphylaxie. Fréquent : aux doses élevées, effet cérébelleux ou cérébral accompagné d'une détérioration du niveau de conscience, dysarthrie, nystagmus. Peu fréquent : céphalées, neuropathie périphérique. Fréquence indéterminée : toxicité neurale, névrite, sensation vertigineuse. Affections oculaires : Fréquent : conjonctivite hémorragique réversible (photophobie, sensation de brûlure, troubles visuels, augmentation du larmoiement), kératite. Fréquence indéterminée : conjonctivite (peut survenir de façon concomitante à un rash). Affections cardiaques : Peu fréquent : péricardite. Très rare : arythmies. Fréquence indéterminée : bradycardie sinusale. Affections respiratoires, thoraciques et médiastinales : Peu fréquent : pneumonie, dyspnée, maux de gorge. Affections gastro-intestinales : Fréquent : dysphagie, douleurs abdominales, nausées, vomissements, diarrhée, inflammation ou ulcération buccale/anale. Peu fréquent : œsophagite, ulcération œsophagienne, pneumatose kystique intestinale, colite nécrosante, péritonite. Fréquence indéterminée : pancréatite. Affections hépatobiliaires : Affections de la peau et du tissu sous-cutané : Fréquent : effets indésirables réversibles sur la peau tels qu'érythème, dermatite bulleuse, urticaire, vascularite, alopécie. Peu fréquent : ulcération cutanée, prurit. Très rare : hidradénite eccrine neutrophilique. Fréquence indéterminée : taches de rousseur, rash, s . Affections musculo-squelettiques et systémiques : Peu fréquent : myalgie, arthralgie. Affections du rein et des voies urinaires : Fréquent : insuffisance rénale, rétention urinaire. Troubles généraux et anomalies au site d'administration : Fréquent : fièvre, thrombophlébite au point d'injection. Peu fréquent : douleurs thoraciques. Syndrome de la cytarabine (Ara-C) : Fièvre, myalgie, douleur osseuse, douleur thoracique occasionnelle, exanthème, conjonctivite et nausées peuvent intervenir entre 6 et 12 heures après le début du traitement. Des corticostéroïdes peuvent être envisagés en prophylaxie et en traitement. Si ces derniers s'avèrent efficaces, le traitement par la cytarabine pourra être poursuivi. Septicémie, abcès du foie. Affections du système nerveux : Après un traitement par de forte doses de cytarabine, des symptômes de type cérébral ou cérébelleux tels que changements de la personnalité, des troubles de la vigilance, une dysarthrie, une ataxie, des tremblements, un nystagmus, des céphalées, une confusion, une somnolence, des étourdissements, un coma, des convulsions, etc. apparaissent chez 8 à 37 % des patients traités. Des neuropathies périphériques motrices et sensorielles ont également été rapportées avec un traitement à dose élevée. L'incidence chez les personnes âgées (> 55 ans) peut être encore plus élevée. Les autres facteurs prédisposants sont l'insuffisance hépatique et rénale, des antécédents de traitement du SNC (par ex. radiothérapie) et l'abus d'alcool. Les troubles du SNC sont, dans la plupart des cas, réversibles. Le risque de toxicité pour le SNC augmente si le traitement par la cytarabine administré par voie IV à fortes doses est associé à un autre traitement toxique pour le SNC tel qu'une radiothérapie ou un traitement à fortes doses. Eruption cutanée entranant une desquamation, alopécie. Des infections virales, bactériennes, fongiques, parasitaires ou saprophytes localisées à n'importe quel endroit du corps, peuvent être observées suite à l'administration de cytarabine à doses immunosuppressive, seule ou en association avec d'autres molécules immunosuppressives car elles affectent l'immunité cellulaire ou humorale. Ces infections peuvent être légères, mais elles peuvent aussi être sévères. Un syndrome lié à la cytarabine a été décrit. Il se caractérise par de la fièvre, une myalgie, des douleurs osseuses, plus rarement une douleur à la poitrine, une éruption maculo-papuleuse, une conjonctivite et des malaises. Il se produit en général dans les 6 et 12 heures après l'administration du médicament. Les corticostéroïdes auraient un effet bénéfique dans le traitement ou la prévention de ce syndrome. Si les symptômes de ce syndrome sont suffisamment sévères pour recourir aux corticostéroïdes, l'usage de ces derniers devrait être évalué avec la même importance que la poursuite du traitement par cytarabine. . Affections gastro-intestinales : Des réactions plus sévères peuvent apparatre en plus des autres symptômes fréquents, particulièrement après l'administration de fortes doses de cytarabine. Une perforation ou une nécrose intestinale avec un iléus et une péritonite ont été rapportées Des abcès hépatiques, une hépatomégalie, un syndrome de Budd-Chiari (thrombose veineuse hépatique) et une pancréatite ont été observés après un traitement à fortes doses. Affections respiratoires, thoraciques et médiastinales : Des signes cliniques tels que ceux présents dans l'œdème pulmonaire/le SDRA peuvent apparatre, particulièrement avec le traitement à forte dose. Cette réaction est probablement due à une lésion capillaire alvéolaire. Il est difficile de faire une évaluation des fréquences (déclarées de 10 à 26% dans diverses publications), étant donné que les patients concernés faisaient généralement une rechute, o d'autres facteurs peuvent contribuer à cette réaction. Autres : Suite au traitement par la cytarabine, une cardiomyopathie et une rhabdomyolyse ont été rapportées. Un cas d'anaphylaxie ayant entrané un arrêt cardiopulmonaire et ayant nécessité une réanimation a été rapporté. Ceci s'est produit immédiatement après l'administration intraveineuse de cytarabine. Les effets indésirables gastro-intestinaux sont réduits si la cytarabine est administrée en perfusion. Il est recommandé d'administrer des glucocorticoïdes locaux pour la prévention de la conjonctivite hémorragique. . Réactions systémiques attendues : myélosuppression, nausées, vomissements. Dans certains cas, une toxicité sévère pour la moelle épinière pouvant même entraner une quadriplégie et une paralysie, une encéphalopathie nécrosante, une cécité et d'autres neurotoxicités isolées ont été rapportées. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : . : arrêt du traitement, suivi par une prise en charge de la myélosuppression induite, par des transfusions de sang ou de plaquettes et l'administration d'antibiotiques, si nécessaire. La cytarabine peut être éliminée par hémodialyse. La cytarabine, un analogue nucléosidique de la pyrimidine, est un agent antinéoplasique, qui inhibe la synthèse de l'acide désoxyribonucléique, . Elle a également des propriétés antivirales et immunosuppressives. Des études détaillées sur le mécanisme de la cytotoxicité suggèrent que la principale action de la cytarabine est d'inhiber la synthèse de la désoxycytidine, par l'intermédiaire de mais une inhibition des kinases cytidyliques et l'intercalation du produit dans les acides nucléiques pourraient jouer un rôle dans ses effets cytostatique et cytocides. eau pour préparations injectables. , et le succinate de prednisolone. Ce médicament ne doit pas être mélangé avec d'autres médicaments à l'exception de ceux mentionnés dans la rubrique 6. 6. 2 ans Stabilité après ouverture : la stabilité physico-chimique après ouverture a été démontrée dans une solution de chlorure de sodium pour préparation injectable (0, 9 % p/v) et dans une solution de dextrose (5% p/v) pour préparation injectable, jusqu'à 24 heures à une température ne dépassant pas à 25C, et jusqu'à 72 heures entre 2 et 8C. D'un point de vue microbiologique, le produit doit être utilisé immédiatement. En cas d'utilisation non immédiate, les durées et les conditions de conservation après ouverture relèvent de la responsabilité de l'utilisateur et ne dépassent généralement pas 24 heures entre 2 et 8C, sauf si la dilution a été effectuée dans des conditions contrôlées et aseptiques validées. Ne pas réfrigérer ni congeler. Pour 1 mL : La solution est contenue dans un flacon de 2 mL, en verre transparent de type I, muni d'un bouchon caoutchouc gris de 13 mm et serti d'une capsule de 13 mm, en aluminium bleue ou bleu-roi de type flip-off. Pour 5 mL : La solution est contenue dans un flacon de 5 mL, en verre transparent de type I, muni d'un bouchon caoutchouc gris de 20 mm et serti d'une capsule de 20 mm, en aluminium bleue ou bleu-roi de type flip-off. Pour 10 mL : La solution est contenue dans un flacon de 10 mL, en verre transparent de type I, muni d'un bouchon caoutchouc gris de 20 mm et serti d'une capsule de 20 mm, en aluminium bleue ou bleu-roi de type flip-off. Pour 20 mL : La solution est contenue dans un flacon de 20 mL, en verre transparent de type I, muni d'un bouchon caoutchouc gris de 20 mm et serti d'une capsule de 20 mm, en aluminium bleue ou bleu-roi de type flip-off. Pour 40 mL : La solution est contenue dans un flacon de 50 mL, en verre transparent de type I, muni d'un bouchon caoutchouc gris de 20 mm et serti d'une capsule de 20 mm, en aluminium bleu-roi, de type flip-off. Pour 50 mlL : La solution est contenue dans un flacon de 50 mL, en verre moulé transparent de type I, muni d'un bouchon caoutchouc gris de 20 mm et serti d'une capsule de 20 mm, en aluminium violette, de type flip-off. Présentations : 1 flacon de 1 mL, 5 flacons de 1 mL. 1 flacon de 5 mL, 5 flacons de 5 mL. 1 flacon de 10 mL. 1 flacon de 20 mL. 1 flacon de 40 mL. 1 flacon de 50 mL. Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées. Après ouverture, le contenu de chaque flacon doit être immédiatement utilisé. Éliminer tout contenu non utilisé. Les liquides de perfusion normalement utilisés pour la cytarabine sont : l'eau pour préparations injectables, les solutions salines à 0, 9 %, ou les solutions de dextrose à 5 % (voir rubrique 6. 3). Élimination et contamination : Placer dans un sac à déchets de haut risque (pour cytotoxiques) et incinérer à 1 100C. En cas de déversement, restreindre l'accès à la zone contaminée et utiliser une protection adéquate comprenant des gants et des lunettes de sécurité. Limiter l'étendue de la contamination et nettoyer la zone affectée avec du papier absorbant. Les déversements pourront également être traités avec de l'hypochlorite sodique à 5 %. La zone concernée par le déversement pourra également être lavée à grande eau. Placer le matériel contaminé dans un sac à déchets étanche pour cytotoxiques et incinérer à 1 100C. 34009 585 313 8 5 : 1 ml en flacon (verre). Bote de 1. 34009 585 314 4 6 : 1 ml en flacon (verre). Bote de 5. 34009 585 315 0 7 : 5 ml en flacon (verre). Bote de 1. 34009 585 316 7 5 : 5 ml en flacon (verre). Bote de 5. 34009 585 317 3 6 : 10 ml en flacon (verre). Bote de 1. 34009 585 319 6 5 : 20 ml en flacon (verre). Bote de 1. 34009 550 281 6 1 : 40 ml en flacon (verre). Bote de 1. 34009 550 281 7 8 : 50 ml en flacon (verre). Bote de 1. Sans objet. Liste I. Médicament réservé à l'usage hospitalier. Prescription réservée aux spécialistes en hématologie ou en médecine interne. | BDPM | Medicinal |
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Investigation de la pathogenèse du syndrome de détresse respiratoire aigu post-transfusionnel (TRALI) dans un modèle murin Sofiane Tariket To cite this version : Sofiane Tariket. Investigation de la pathogenèse du syndrome de détresse respiratoire aigu post- transfusionnel (TRALI) dans un modèle murin. Médecine humaine et pathologie. Université de Lyon, 2017. Français. NNT : 2017LYSES059. tel-02372517 HAL Id : tel-02372517 Submitted on 20 Nov 2019 HAL is a multi-disciplinary open access L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est archive for the deposit and dissemination of sci- destinée au dépôt et à la diffusion de documents entific research documents, whether they are pub- scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, lished or not. The documents may come from émanant des établissements d'enseignement et de teaching and research institutions in France or recherche français ou étrangers, des laboratoires abroad, or from public or private research centers. publics ou privés. N d'ordre NNT : 2017LYSES059 THESE de DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE LYON opérée au sein de (Université Jean-Monnet) Ecole Doctorale N EDSIS488 (Ecole doctorale Science, Ingénierie, Santé) Spécialité de doctorat : Biologie Cellulaire et Moléculaire Discipline : (Biologie, Médecine et Santé) Soutenue publiquement le 15/12/2017, par : Sofiane Tariket Investigation de la pathogenèse du syndrome de détresse respiratoire aigu post- transfusionnel (TRALI) dans un modèle murin Devant le jury composé de : Pr. BOURLET Thomas Université Jean-Monnet / GIMAP-EA3064 Président Dr. OURY Cécile Université de Liège / Département de cardiologie Rapporteur Dr. RITEAU Béatrice Université d'Aix-Marseille / UMR 1062 Rapporteur Dr. LEFRANÇAIS Emma Université de Toulouse III / IPBS Examinatrice Pr. GARRAUD Olivier Université de Lyon / Institut National de la Co-Directeur de thèse Transfusion Sanguine & GIMAP-EA3064 Dr. COGNASSE Fabrice Université de Lyon / Etablissement Français du Sang Directeur de thèse Auvergne-Rhône-Alpes & GIMAP-EA3064 N d'ordre NNT : 2017LYSES059 THESE de DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE LYON opérée au sein de (Université Jean-Monnet) Ecole Doctorale N EDSIS488 (Ecole doctorale Science, Ingénierie, Santé) Spécialité de doctorat : Biologie Cellulaire et Moléculaire Discipline : (Biologie, Médecine et Santé) Soutenue publiquement le 15/12/2017, par : Sofiane Tariket Investigation de la pathogenèse du syndrome de détresse respiratoire aigu post- transfusionnel (TRALI) dans un modèle murin Devant le jury composé de : Pr. BOURLET Thomas Université Jean-Monnet / GIMAP-EA3064 Président Dr. OURY Cécile Université de Liège / Département de cardiologie Rapporteur Dr. RITEAU Béatrice Université d'Aix-Marseille / UMR 1062 Rapporteur Dr. LEFRANÇAIS Emma Université de Toulouse III / IPBS Examinatrice Pr. GARRAUD Olivier Université de Lyon / Institut National de la Co-Directeur de thèse Transfusion Sanguine & GIMAP-EA3064 Dr. COGNASSE Fabrice Université de Lyon / Etablissement Français du Sang Directeur de thèse Auvergne-Rhône-Alpes & GIMAP-EA3064 La vie, c'est comme une bicyclette, il faut avancer pour ne pas perdre l'équilibre. Albert Einstein REMERCIEMENT En premier lieu, je tiens à remercier les différents membres du jury, Docteur Cécile Oury et Docteur Béatrice Riteau, d'avoir accepté d'évaluer ce travail. Merci également au Docteur Emma Lefrançais pour avoir pris le temps d'examiner mon mémoire de thèse. Merci au Professeur Thomas Bourlet pour la présidence de ce jury et, en particulier, pour son accueil en tant que Directeur au sein du laboratoire GIMAP-EA3064. Je remercie également l'Établissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes pour son soutien financier ainsi que l'ensemble du personnel que j'ai pu côtoyer durant ces 3 années. Je tiens aussi à remercier les donneurs de sang qui, en plus de l'importance de leur don, m'ont permis d'effectuer une partie de mes travaux. Je tiens en particulier à remercier mon Directeur de thèse, Docteur Fabrice Cognasse, pour toute l'aide, les conseils et le soutien qu'il m'a accordé au cours de ces 3 années. J'ai connu, grâce à vous, un enrichissement fort d'un point de vue scientifique et personnel. Merci également pour les opportunités pour lesquels vous avez œuvré, notamment le stage à Cambridge. Un sincère Merci à mon Co-Directeur de thèse, Professeur Olivier Garraud, pour votre confiance et votre encadrement des plus enrichissants. Je vous remercie pour la valorisation de mes travaux de thèse et toutes ses heures passées si précieuses que vous m'avez consacré. Je remercie le Professeur Bruno Pozzetto, Directeur du GIMAP-EA3064 lors de mes débuts de thèse, pour son accueil et son dévouement envers les étudiants. Merci également au Docteur Sandrine Laradi pour son soutien et son aide qu'elle a su me consacrer au cours de mes premiers pas en tant que stagiaire au sein de l'EFS et au cours de ma thèse. Je tiens également à remercier le Docteur Hind Hamzeh-Cognasse pour sa contribution scientifique considérable et sa gentillesse au quotidien. Enfin, je tenais à remercier le Docteur Antoine Prigent, qui a été le précurseur de cette aventure. J'aimerais aussi remercier le laboratoire NHS Blood and Transplant de Cambridge, qui m'a accueilli pendant presque 2 mois et m'a permis de perfectionner ces travaux de thèse. Merci tout particulièrement au Docteur José Guerrero et au Docteur Cédric Ghevaert, ainsi qu'à toute leur équipe pour leur accueil chaleureux et leur apport scientifique considérable. Merci aussi au laboratoire Plexan, notamment Priscilla et Ghislaine pour votre aide indispensable. Merci à tous les membres du laboratoire GIMAP-EA3064, qui ont permis faire rimer les mots Travail et Plaisir. Merci à Nico, Fabienne, Blandine, Alex (I er) et Alex (II), Amélie, Perrine, Kiki, Rémi, Eva, Fedy, Jocelyn, Sandrine, Sophie, Alice, Sylvie, Stéphane, Paul, Olivier, Séverine et Benji. Merci pour ces leçons de vie (éducation des enfants et du chat), ces blagues du niveau intellectuel propre au GIMAP et ce si bon et délicieux café (noir mais pas rouge). Ce travail n'aurait jamais pu être ce qu'il a été sans l'inestimable Plaquette Team . Merci à tous ses membres pour le soutien constant et sans faille, d'un point de vue scientifique et personnel. Merci à Charly, grâce à toi j'ai pu me forger une carapace impénétrable face aux attaques à venir. Merci à Marie-Ange, la gentillesse incarnée, quand tu ne fus pas influencée par ton colocataire de bureau. Merci à mes colocs. Caro, grâce à qui je sais maintenant apprécier les asperges et Adri, qui a été mon gourou de Game of Thrones. Tant de temps passé à vos côtés au laboratoire et même dans le monde. Ce fut un plaisir d'allier Science et amitié. Merci aux membres actuels et passés de Robespierre. Merci à Jocelyne pour la sagesse et la bienveillance que tu incarne. Merci à Chaker, de si bon conseil, sauf quand il s'agissait de magie. Enfin, je remercie également les anciens doctorants Paulin et Kim Anh, et les étudiants de l'EFS. Merci à mes deux compatriotes d'université, David et Clément. Depuis la licence jusqu'à la thèse nos parcours ont été parallèles. Un énorme merci à ma belle-famille. Merci Didier, alias Gogo-Gadjeto , pour ta gentillesse et ta générosité sans fin. Merci à Laurence pour votre douceur et votre bienveillance. Marine, la sœurette, merci pour tous ces bons moments partagés, tous ces délires qui font tellement de bien. Romain, le toulousain, merci (mais pas trop sinon tu vas prendre la grosse tête) pour cette complicité entre pièces rapportés. Merci également à tous les autres qui m'ont apporté tant de joie, Minou, Claude, Michelle, Leïdi, Dany, Coline, Fanny, Lucille, Lucas, Pierre et les autres. Merci à tous mes amis, mes frères, Toto, Jéjé, Clem, Yann, Sylvain, Bobo, Jim, Nini, Mehdi, Hadjou et Flo. Vous avez tous été une force pour moi, une famille, bien plus que des simples amis et je vous en remercie. Je remercie aussi toute ma famille, ma grand-mère, mon grand-père (repose en paix), mes oncles, tantes, cousin, cousines. J'espère que vous serez fière d'accueillir un nouveau docteur parmi vous. Un grand merci en particulier à mes deux sœurs, Assia et Melissa, pour avoir partagé une grande partie de ma vie. On arrive aux personnes qui me sont le plus chère. Merci Hichem, mon frère. On s'est chamaillé tant de fois, à mon plus grand plaisir. Je me retrouve tant en toi, même tempérament, personnalité et bêtise. Reste comme tu es et garde cette joie de vivre qui fait tant de bien aux gens qui t'entoure. À ma mère, une vraie guerrière. Tu nous as élevé seule, Hichem et moi. Tu es si forte. Cette réussite t'est entièrement dédiée et, je l'espère, t'apportera fierté et joie. Un merci ne suffira pas à te prouver toute ma reconnaissance, mais je te le dis quand même, Merci. La femme de ma vie, Manon, Nionion, ma chérie, la maman de Ness. Que dire Tu es arrivée dans ma vie et tu l'as bouleversée. Tu m'as fait découvrir tant de choses que je n'oublierai jamais. Tu as été mon carburant, ma force. Merci pour tout, ton soutien au cours de cette thèse et ces merveilleux moments gravés en moi pour toujours. Je t'aime RESUME : La transfusion sanguine permet de sauver des vies et réduit la morbidité pour un grand nombre de maladies et d'affections cliniques, mais elle n'est pas exempte de complications. Un incident néfaste lié à une transfusion, également appelé Effet Indésirable Receveur (EIR), est un incident défavorable survenant chez un patient pendant ou après une transfusion sanguine. Parmi eux, le TRALI est considéré comme l'une des réactions inflammatoires les plus critiques. Cette pathologie se développe généralement dans les 6 heures après transfusion. On en reconnat deux types, les TRALI immunologiques et les TRALI non-immunologiques. En France, les premiers sont presque entièrement prévenus par une politique de sécurité des produits sanguins, tandis que la fréquence des seconds augmente. La physiopathologie du TRALI reste mal connue. Tandis que certains y accordent une place importante aux plaquettes sanguines du patient transfusé, d'autres les considèrent comme pas réellement impliquées. Le but de ce travail de thèse a été, dans un premier temps, d'investiguer le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines conservées dans les concentrés plaquettaires et l'influence de cette inflammation sur l'endothélium vasculaire général. Ensuite, sera évalué le rôle des plaquettes sanguines de l'organisme, notamment par l'intermédiaire de leurs produits de sécrétion, dans la pathogénie de cette complication transfusionnelle. Pour cela, un ALI (mimant un TRALI) a été déclenché, dans un modèle in vivo, par une injection d'anticorps anti-CMH I chez des souris préalablement stimulées avec du LPS. L'ensemble de nos résultats confirme le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines, au sein des concentrés plaquettaires, pouvant probablement assumer l'entière responsabilité du déclenchement d'un TRALI non-immunologique, ainsi qu'un rôle secondaire des plaquettes sanguines de l'organisme, participant activement à l'amplification de la sévérité de la pathologie. Cette thèse s'inscrit dans la continuité logique des études menées, au sein du laboratoire GIMAP-EA3064, investiguant la place des plaquettes sanguines au sein de l'inflammation, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives dans la sécurité transfusionnelle. MOTS CLES : TRALI Transfusion Plaquettes Inflammation CD40L Sommaire Liste des abréviations . 1 Liste des figures . 5 Introduction générale. 7 La plaquette sanguine et le TRALI : de la poche à l'organisme . 7 Revue de la littérature . 19 Chapitre 1 La transfusion comme une frappe inflammatoire : connaissances et inconnus . 20 Chapitre 2 Transfusion-Related Acute Lung Injury : l'aspect clinique . 31 Section 1 Caractérisation du TRALI : la terminologie . 31 Section 2 Caractérisation du TRALI : la prévalence . 35 Section 3 Caractérisation du TRALI : la clinique . 36 Chapitre 3 Transfusion-Related Acute Lung Injury : transfusion, plaquettes et modificateurs de la réponse biologique (BRM) . 39 Mise à jour bibliographique . 52 I Section - Because their secretory capacity can cause immunological differences . 52 II Section - Several tracks already mentioned in TRALI . 54 Chapitre 4 Le rôle de signalisation du CD40 ligand dans la biologie plaquettaire et dans la transfusion de composants plaquettaires . 56 Mise à jour bibliographique . 80 I Section - CD40L and its receptors in inflammatory pathologies . 80 Chapitre 5 Hypothèse de l'atteinte multi-organes au cours d'un TRALI . 83 Section 1 Le pancréas . 83 I Physiopathologie de la pancréatite : les neutrophiles . 83 II Physiopathologie de la pancréatite : l'endothélium vasculaire . 85 III Physiopathologie de la pancréatite : les plaquettes . 86 IV Physiopathologie de la pancréatite : Le couple CD40/CD40L . 87 Section 2 Inflammation intestinale . 89 I Physiopathologie des MICI : les neutrophiles . 89 II Physiopathologie des MICI : l'endothélium vasculaire . 89 III Physiopathologie des MICI : les plaquettes . 90 IV Physiopathologie des MICI : le couple CD40/CD40L . 92 Section 3 Les autres organes . 93 I Les reins . 93 II Le foie . 94 Objectifs et problématique . 97 Résultats . 101 Manuscrit I : Modélisation de l'effet des surnageants de concentrés plaquettaires sur les cellules endothéliales : focus sur Endocan/ESM-1. 103 Manuscrit III : Les plaquettes régulent la sévérité de l'ALI induit expérimentalement par injection de LPS et d'anti-CMH I . 139 Manuscrit IV : La neutralisation du complexe protéique CD40/CD40L inhibe le développement d'œdème pulmonaire lésionnel induit dans un modèle murin par injection de lipopolysaccharide et d'anticorps anti-CMH I . 165 Manuscrit V : La neutralisation du complexe protéique CD40/CD40L protège les souris de l'atteinte pancréatique induite lors du développement du TRALI . 199 Discussion et perspectives . 223 Conclusion . 237 Références . 239 Annexes . 257 Liste des abréviations TG : -thromboglobuline GM-CSF : Granulocyte Macrophage Colony- Stimulating Factor Ang-1 : Angiogénine-1 GP : Glycoprotein ALI : Acute Lung Injury GPR13 : G-Protein coupled Receptor 13 (fractalkine) bFGF : basic Fibroblast Growth Factor GRO : Growth Regulated Protein BEACH : Beige and Cheadiak-Higashi RCH : Rectocolite Hémorragique BRM : Biological Response Modifier HGF : Hepatocyte Growth Factor Ca : Calcium HLA : Human Leukocyte Antigen CD : Cluster of Differentiation HMGB1 : HighMobility Group Box 1 CD40L : CD40 Ligand ICAM-1 : Intercellular Cell Adhesion Molecule-1 CD62E : E-Selectin IL : Interleukin CD62L : L-Selectin IP3 : Inositol-1, 4, 5-trisphosphate CD62P : P-Selectin JAM-C : Junctional Adhesion Molecule-C CINC : Cytokine-Induced Neutrophil Chemoattractant LBA : Lavage Broncho-Alvéolaire CMH : Complexe Majeur d'Histocompatibilité LFA-1 : Lymphocyte Function-Associated antigen-1 COX-1 : Cyclooxygenase-1 LPAM : Lymphocyte Peyer patch Adhesion Molecule CP : Concentrés Plaquettaires LPS : Lipopolysaccharide CRP : C Reactive Protein Mac-1 : Macrophage-1 antigen DAG : Diacylglycérol MadCAM-1 : Mucosal vascular Addressin Cell DAMP : Damage-Associated Molecular Pattern Adhesion Molecule-1 dTRALI : delayed TRALI MC : Maladie de Crohn EA : Elastase-1-Antitrypsin MCP-1 : Monocyte Chimoattractant Protein-1 EGF : Epidermal Growth Factor MICI : Maladies inflammatoires chroniques de EIR : Effet Indésirable Receveur l'intestin ENA-78 : Epithelial cell-derived Neutrophil- MIP-2 : Macrophage Inflammatory Protein-2 Activating peptide-78 MMP-9 : Metalloproteinase-9 EPCR : Endothelial Protein C Receptor MPO : Myeloperoxidase mtDNA : ADN mitochondrial sCD40L : soluble CD40L NBEAL2 : Neurobeachin-like protein 2 SDRA : Syndrome de Détresse Respiratoire NET : Neutrophil Extracellular Traps SNAP-23 : Synaptosomal-Associated Protein-23 NF-B : Nuclear Factor-B SNARE : Soluble N-éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein Receptor NLR : Neutrophil-Leukocyte Ratio sRAGE : soluble Receptor for Advanced Glycation oxLDL : oxidized Low-Density Lipoprotein End-products PAC-1 : Procaspase Activating Compound-1 TATC : Thrombin-Antithrombin Complex PAI-1 : Plasminogen Activator Inhibitor-1 TGF- : Transforming Growth Factor- PAMP : Pathogen-Associated Molecular Pattern Th : Lymphocytes T auxiliaire PAR-4 : Platelet protease-Activated Receptor-4 TLR : Toll-Like Receptor PF4 : Platelet Factor 4 TNF- : Tumor Necrosis Factor- PIP2 : Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate TRALI : Transfusion-Related Acute Lung Injury PMN : Polymorphonucléaires Tx : Thromboxane PSL : Produits Sanguins Labiles U : Constante inconnue pTRALI : possible TRALI VAMP-8 : Vesicle-Associated Membrane Protein-8 Rac-1 : Ras-related C3 botulinum toxin substrate-1 VCAM-1 : Vascular Cell Adhesion Molecule-1 RNFH : Réaction Fébrile Non-hémolytique VEGF-A : Vascular Endothelial Growth Factor-A ROS : Dérivé réactif de l'oxygène vWF : von Willebrand Factor S1P : Sphingosine-1-Phosphate WD40 : Répétitions en -transducine Liste des figures Tableau 1 : Evolution des cytokines inflammatoires chez les patients TRALI . 38 Figure 1 : Les définition des différents TRALI, inspiré de [15] et [16] . 32 Figure 2 : Premier modèle de seuil, d'après Middelburg et al. [22] . 33 Figure 3 : Deuxième modèle de seuil, d'après Middelburg et al. [22] . 34 Figure 4 : Troisième modèle de seuil, inspiré de Middelburg et al. [22] . 35 Figure 5 : Radiographie de poumons d'un patient ayant développé un TRALI, d'après Ilango et al. [37] . 37 Figure 6 : Physiopathologie de la pancréatite associée au déclenchement d'une détresse respiratoire . 88 Figure 7 : Pathophysiologie des MICI, d'après Neurath et al. [165] . 93 Figure 8 : Développement de la thèse . 99 Figure 9 : Influence d'endocan sur la transmigration leucocytaire . 104 Figure 10 : Implication de la protéine NBEAL2 dans le processus d'exocytose des granules- plaquettaires . 125 Introduction générale La plaquette sanguine et le TRALI : de la poche à l'organisme Revue soumise pour publication (Transfusion Clinique et Biologique) Special platelet edition Platelet and TRALI : from blood component to organism Sofiane Tariket1, 2, Caroline Sut1, 2, Olivier Garraud1, 3, Fabrice Cognasse1, 2, * Université de Lyon, GIMAP-EA3064, Saint-Etienne, France Établissement Français du Sang Rhône-Alpes-Auvergne, Saint-Etienne, France Institut National de la Transfusion Sanguine, Paris, France *Address for correspondence and reprint requests : Dr. Fabrice Cognasse, PhD-HDR, Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes and GIMAP-EA 3064, Université de Saint-Etienne, Etablissement Français du Sang Rhône-Alpes-Auvergne, 25 Boulevard Pasteur, 42100 Saint-Etienne. Telephone : 33 (0) 683975883 ; Fax : 33 (0) 477421486 ; E-mail : fabrice. cognasse@efs. sante. fr Conflict-of-interest disclosure : All other authors declare no competing financial interests. Running title : Platelets and inflammation Keywords : TRALI, Platelets, Transfusion, Inflammation, CD40/CD40L Abstract : Even though used systematically with leukocyte reduction, platelet transfusions still cause adverse reactions in recipients. They include Transfusion-Related Acute Lung Injury (TRALI), respiratory distress that occurs within six hours of the transfusion. The pathophysiology of this transfusion complication brings complex cellular communication into play. The role, particularly inflammatory, played by blood platelets in TRALI pathophysiology has been demonstrated, but is still under debate. Blood platelets play a role in inflammation, particularly via the CD40/CD40L (sCD40L) immunomodulator complex. In this study, we examine in particular the specific involvement of the CD40/CD40L (sCD40L) complex in the inflammatory pathogenesis of TRALI. This molecular complex could be a major target in a TRALI prevention strategy. Improving the conditions in which the platelet concentrates (PC) are prepared and stored would contribute to controlling partly the risks of non- immune TRALI. 1. Transfusion-Related Acute Lung Injury (TRALI) 1. 1. Introduction TRALI is described as the onset of respiratory distress that occurs within six hours of the transfusion. This complication is characterised by the occurrence of bilateral pulmonary oedema, qualified by the observation of a characteristic infiltrate. Several events are considered to be evocative of TRALI, including dyspnoea, tachypnea and hypoxia. Unlike non-lesional fluid overload, TRALI, which is a lesional oedema, is characterised by bilateral pulmonary infiltration, observed by chest X-ray and non-cardiogenic pulmonary oedema, defined by pulmonary blood pressure lower than 18 mm Hg or left arterial hypertension, and by a Pa02/Fi02 ratio less than 300 [1]. In 2015 in France, red blood cells (RBC) concentrates and platelet concentrates (PC), both labile blood products, are the most frequently involved in cases of TRALI with imputability of 1 to 3 (an incidence of approximately 0. 2 per 100, 000 RBC and 0. 3 per 100, 000 PC transfused). This transfusion complication represents 0. 32% of the serious adverse reactions occurring in recipients (sAR) [2]. Internationally, the impact of TRALI is estimated at 0. 08% and 15% of transfused patients [1]. 1. 2. Two-hits According to current consensus, the pathophysiology of TRALI is described as an inflammatory phenomenon characterised by two successive events or Two-hits. The first event, also called priming, results in a pre-activation of the polymorphonuclear (PMN) cells. This initial attack results in a change in the phenotypic profile of the central cells involved in the physiopathology of TRALI, such as endothelial cells, neutrophils and platelets. The expression of adhesion molecules on the surface of these same cells triggers an exacerbation of intercellular communication in a conducive environment, an inflammatory environment. This causes, in particular, increased expression of CD62P (P-Selectin), CD62E (E-Selectin) and ICAM-1 on the surface of endothelial cells and a change of expression notably of PSGL-1 and Mac-1 (called also 2-Integrin and CD11b/CD18) on the surface of neutrophils [3]. The second event is the step causing the induction of TRALI. It can be classified as two types : immune TRALI and non-immune TRALI. In the case of immune TRALI, the cause is mainly the infusion of pathogenic antibodies (more rarely, or even exceptionally, pre-formed antibodies). Three types of antibodies are mostly encountered : anti-HLA-I, anti-HLA II, and anti-HNA (mainly anti-HNA-3A). The mode of action of these antibodies may vary according to their target. Anti-HLA I antibodies, especially anti-HLA-A2, primarily target PMN. This direct activation allows the activation of neutrophils, and the adhesion and interaction of these antibodies on the surface of endothelial cells. Active neutrophils then migrate into the alveolar space. The uncontrolled production of reactive oxygen (ROS) and protease derivatives causes the development of pulmonary oedema [4]. Anti-HLA II antibodies interact specifically with monocytes and macrophages rather than neutrophils. Excessive production of proinflammatory Biological Response Modifiers (BRM) is essential for the activation and recruitment of neutrophils in the lungs [5]. Finally, anti-HNA antibody, particularly anti-HNA-3a, targets both neutrophils and endothelial cells by adhering directly to the CTL-2 protein (choline transport-like protein 2). The pulmonary attack is on two fronts ; the severity of this event is considered to be the most important [6]. One of the hypotheses that we propose is that the severity of immune TRALI could be dependent on the inflammatory condition of the PSL involved and not just the antibodies present (Figure 1 and 2). Figure 1 : Hypothetical involvement of PC and platelets in the severity of immune TRALI The immune TRALI trigger is dependent on the combination of anti-leukocyte antibodies, platelet concentrates and other PSL. The hypothesis focuses on the level of severity of immune TRALI dependent on the degree of inflammation of the PC and the degree of activation of the patient's blood platelets. These two parameters are particularly related to the BRM rate, such as sCD40L, secreted by platelets in the PC and/or in the patient. At the same time, the activation state of leukocytes and endothelial cells of the patient are considered in this hypothesis. The level of the activation threshold of immune TRALI could also be decreased according to the inflammatory degree of these three parameters. Figure 2 : Hypothetical involvement of PC and platelets in triggering and in the severity of non- immune TRALI The hypothesis is evoked for non-immune TRALI where the trigger is dependent on the degree of inflammation of the PC, the activation state of the patient's platelets and also the degree of activation of the neutrophils and endothelial cells. The severity of TRALI also depends on these three parameters. The first two parameters are particularly related to the BRM rate, such as sCD40L, secreted by platelets in the PC and in the patient. At the present time, non-immune TRALI is more discussed than immune TRALI in the scientific and medical community. Cases of TRALI without the observation of anti-leukocyte antibodies in patients are emerging [7] as are cases of non-observed TRALI in patients with a pathological past that is conducive to the development of Acute Lung Injury (ALI), transfused with PSL with anti-leukocyte antibodies [8]. A current question is based on the ability, or not, of proinflammatory BRM present in PSL - especially the PC in our research - to trigger TRALI [9]. This is based on the different correlations observed between the increase in the risk of triggering TRALI and the excessive release of proinflammatory BRM depending on the RBC storage time [10] and the PC [11, 12]. However, this theory is controversial, as several studies have shown the inefficiency of older RBC to trigger TRALI [11] and also in volunteers who previously received an injection of LPS (lipopolysaccharide) [13]. Regarding the PC, we are attempting to respond partly to this theory by focusing on the inflammatory impact of the PC on endothelial cells, which are cells central to TRALI. Could this cocktail of cytokines/chemokines bear full responsibility for the outbreak of non-immune TRALI (Figure 2) ? Could they also participate in the increase of the severity of immune TRALI (Figures 1) ? 2. TRALI and blood platelets : Development of animal models 2. 1. Inflammatory role of platelets In recent years, several controversial studies have addressed the involvement of platelets in the body in TRALI physiopathology. Platelets are recognised as both inflammatory and immune cells [14]. At the present time, their role is debated by the scientific community. Some support a protective impact of platelets in an inflammatory process through a recovery of the endothelial functions [15], while others evoke the contribution of platelets to the activation of inflammation [16]. Other parameters evoke an important role of platelets in inflammation. On their surface, platelets have inflammatory and immune receptors, such as Toll-like receptors (TLR), NLRP3 or SIGLEC [17]. Moreover, in the circulation, several proinflammatory BRM are released by platelets themselves. They have a secretory power that can stimulate and maintain an inflammatory condition in the body. Among these BRM are the proinflammatory soluble factors, such as sCD40L, RANTES and PF4 [3]. Finally, the action of platelets in the inflammatory process is probably through their ability to interact with various cells (immune or not). Platelets interact directly with endothelial cells and different leukocytes through the expression of adhesion molecules on the surface of these cells [18]. The problem described in the literature is the balance between the involvement of platelets in inflammation vs. in haemostasis. Indeed, if platelets are an inflammation stimulus, what is their specific role in TRALI (Figures 1 and 2) ? Finally, is their role in haemostasis too important to be able to block their activation at the expense of a haemorrhagic context ? 2. 2. Investigation of the role of platelets in TRALI : animal models To respond to this new hypothesis, several inhibition animal models have been developed to study TRALI and its inhibition potential. Anti-platelet treatment, such as Bulsufan, an anti-platelet serum, aspirin and 15-Epi-LXA4, seem conducive to the protection of mice in ALI models [16, 19-22]. Unlike these studies referring to the significant involvement of platelets in this pathology, others demonstrate that platelets are perhaps not central to TRALI. Indeed, in a recent study, mice treated with several platelet antagonists, such as aspirin, Clopidogrel or even JAQ1 (anti-GPVI mAb), nevertheless developed TRALI, accompanied by intense bleeding episodes [23]. All these differences open the field to new studies focusing on the real involvement of platelets in the transfusion complication. As mentioned in the paragraph above, several studies have defined the significant impact of the platelets during TRALI, notably through their ability to release multiple BRM. Several TRALI and ALI animal models targeting platelet proteins also seemed to be effective for the protection of these syndromes. Indeed, these animal models target soluble immunomodulator factors, such as sCD62P, RANTES, PF4 and -TG [16, 19, 20, 24, 25]. Among all these proinflammatory soluble factors, one stands out from others : sCD40L, secreted mainly by platelets [26], seems to be a key molecule in the induction and modulation of TRALI. This molecule allows platelet activation and interaction between platelets and immune system cells via an autocrine, paracrine and endocrine signal. Involvement of the CD40/CD40L complex, including immune cells, participates in the liberation of proinflammatory factors. The CD40/CD40L complex plays a leading role in the maintenance of the permeability of the endothelial wall of the blood capillaries and the expression of adhesion molecules, such as CD62E, ICAM-1 and VCAM-1 [27]. All these physiological elements are central to TRALI pathophysiology. Other parameters can evoke the influence of sCD40L in TRALI, and particularly during non-immune TRALI. Indeed, the release of platelet sCD40L is often correlated with the duration of storage of the pockets of blood products [28]. In an inflammatory and transfusion context such as TRALI, the implication of sCD40L has often been observed [29-31]. In addition, CD40L has already been correlated to the triggering of TRALI [32], although this is not consensual [33], and of ALI [34, 35]. Would the release of sCD40L, notably by platelets, be a risk factor for TRALI whose impact has long been underestimated (Figures 1 and 2) ? 3. Ways of exploring the involvement of platelets in TRALI or experimental ALI models 3. 1. Our research project Our investigations involve two directions : i) the influence of platelet secretion products in PC having induced an sAR on endothelial cells, which are central to TRALI, through an in vitro model and ii) the impact of these secretions (notably sCD40L) and blood platelets, in the regulation or the amplification of an inflammatory condition with a focus on ALI pathophysiology through an in vivo model. 3. 2. Inflammatory power of platelet concentrates having induced an sAR To answer the first hypotheses, we are developing an in vitro model to highlight the impact of the platelet BRM present in PC supernatants having induced an sAR, on the ability of endothelial cells to secrete proteins regulating their impermeability, notably by the assessment of Endocan production. Endocan is a protein regulating positively the impermeability of the endothelial cells and therefore it is essential to the preservation of their integrity [36]. We found significant expression of Endocan by endothelial cells that could be seen as a marker of the post-transfusional inflammatory response and could probably be extrapolated in ALI physiopathology (work accepted for publication). It would be interesting to assess the impact of the inflammatory status of these same PC directly on leukocytes, other cells central to ALI. We could test the hypothesis of a trigger and the severity of TRALI dependent on the inflammatory condition of the PC before transfusion (Figure 1 and 2). 3. 3. Inflammatory power of blood platelets : Their role in ALI We developed simultaneously an in vivo experimental model to evaluate the inflammatory power of blood platelets. In the first instance, we studied the inflammatory impact of platelet secretion in a murine model of systemically induced inflammation. For this, we used Nbeal2-/- mice. This murine model has platelets deficient in -granules and an inability to produce platelet BRM formed in these same granules, i. e. more than 300 elements [37]. Assessment of the inflammatory response to LPS injection in these mice could highlight the real involvement of platelets in inflammation (article in editing). Moreover, several protocols allow the study of platelet inhibition to evaluate the platelet activation cascades triggered during ALI. We can therefore model the inhibition of certain platelet activation pathways and assess the potential modulation of physiological disturbances observed during ALI, such as vascular permeabilization, pulmonary leukostasis or polymorphonuclear activation (work in progress). In addition to determining the precise role of platelets in ALI, we discuss the role of the CD40/CD40L (sCD40L) immune complex. Our work contributes to the understanding of the role of platelets and associated BRM in the PC during the induction of inflammatory sAR in transfused patients (including TRALI) as well as in the process of preparation and storage of platelet concentrates (work submitted for publication). We postulate that platelets present in the PC and in the patient play an important role in TRALI and post-transfusional inflammatory pathologies (Figures 1 and 2), beyond their haemostatic role. Targeting a platelet product more specifically, such as sCD40L, rather than general platelet inhibition could participate partly in the prevention of cases of TRALI and also other post-transfusional inflammatory reactions, such as multi-organ failure sometimes encountered during transfusion that can cause ALI (work submitted for publication). References 1. Vlaar, A. P. and N. P. Juffermans, Transfusion-related acute lung injury : a clinical review. Lancet, 2013. 382(9896) : p. 984-94. 2. ANSM, French Hemovigilance Activity Report 2015. 2016. 3. Tariket, S. , et al. , Transfusion-related acute lung injury : transfusion, platelets and biological response modifiers. Expert Rev Hematol, 2016 : p. 1-12. 4. Looney, M. R. , et al. , Neutrophils and their Fc gamma receptors are essential in a mouse model of transfusion-related acute lung injury. J Clin Invest, 2006. 116(6) : p. 1615-23. 5. 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Son existence a été pour la première fois évoquée dans les années 1950 [1, 2] et le terme TRALI a été utilisé pour la première fois par le Dr Popovsky, dès les années 1980 [3]. On décrit, depuis le début du 20ième siècle, cette pathologie comme une réaction pulmonaire aigu, l'ALI (Acute Lung Injury), qui se développe dans les 6 heures après transfusion de Produits Sanguins Labiles (PSL) [4]. Cependant, certains investigateurs évoquent des TRALI pouvant se déclarer jusqu'à 72h après la transfusion, parlant ainsi de delayed TRALI (dTRALI) (pour TRALI retardé) [5, 6]. Ce TRALI atypique est souvent corrélé avec des cofacteurs pathologiques comme le sepsis ou un traumatisme sévère. La physiopathologie serait liée à des médiateurs bioactifs plutôt que des anticorps anti-leucocytaires, contrairement au TRALI dit classique (voir revue Transfusion-related acute lung injury : transfusion, platelets and biological response modifiers page 38 [7]). Enfin, ces TRALI présenteraient un taux de mortalité accru (45% vs. 10%) [8]. Une dernière catégorie de TRALI est aujourd'hui envisagée, les possibles TRALI (pTRALI). De façon générale, la responsabilité des ALI n'est en aucun cas d'origine transfusionnelle contrairement au TRALI. Lorsque la cause de cette détresse respiratoire ne peut être clairement associée au processus de transfusion, bien que le patient ait connu un épisode transfusionnel, on parle alors de pTRALI [9-12] (Figure 1). Ce dernier terme est, à l'heure actuelle, encore débattu par la communauté transfusionnelle. En effet, certains souhaiteraient un changement de la nomenclature, utilisant le terme de possible syndrome de détresse respiratoire aigu (SDRA), car le pTRALI évoque, par son nom, une composante transfusionnelle alors qu'il pourrait simplement être dû à un facteur autre que la transfusion elle-même [13, 14]. Figure 1 : Les définition des différents TRALI, inspiré de [15] et [16] Aujourd'hui beaucoup de critères entrent en compte pour la définition du TRALI. La complexité du diagnostic est corrélée à tous les facteurs de risques, propres aux patients, évoqués dans la littérature. On peut, effectivement, citer une multitude de contextes pathologiques et interventionnels médicaux favorables au développement d'un TRALI. Les cancers hématologiques [17, 18], les maladies cardio-vasculaires [17], le sepsis [5, 18, 19], les transfusions massives [18, 20] et la ventilation mécanique [18] sont des facteurs de risques associés au TRALI. Dans un but de simplification du diagnostic du TRALI, plusieurs modèles théoriques, appelés modèles de seuil , ont alors été élaborés. On compte aujourd'hui trois modèles allant du plus simple au plus complexe. Le premier, proposé en 2007 par Bux et Sachs [21], n'inclut que l'activation des neutrophiles et de l'endothélium (essentiel à l'induction du TRALI voir revue Transfusion-related acute lung injury : transfusion, platelets and biological response modifiers page 38 [7]) induite selon la prédisposition du patient et selon l'impact inflammatoire de la transfusion. Dans ce modèle, une prédisposition importante du patient (par exemple un épisode septique passé sévère) nécessitera un pouvoir inflammatoire des PSL faible, c'est-à-dire avec des concentrations basses d'anticorps anti-leucocytaires et de Biological Response Modifiers (BRM) (Figure 2). Figure 2 : Premier modèle de seuil, d'après Middelburg et al. [22] Modèle de seuil du déclenchement du TRALI dépendant du niveau de prédisposition du patient transfusé et du pouvoir d'activation des neutrophiles et de l'endothélium par le produit transfusé. Les niveaux d'activation des deux paramètres cités sont compensatoires. Une forte prédisposition du patient (par exemple, un lourd passé pathologique) nécessite un pouvoir inflammatoire faible du produit sanguin transfusé. Le second modèle, d'abord évoqué en 1999 par Rosendaal dans un modèle de thrombus veineux [23], et, par la suite, rendu applicable au TRALI par Middelburg et Van der Bom en 2014 (Figure 3), utilise un principe plus complexe. Ici, les facteurs de risques sont différentiés selon leur impact sur le niveau d'activation des neutrophiles et de l'endothélium et selon leur répercussion dans le temps. Ces facteurs de risques peuvent être une entité pathologique, telle qu'une pneumonie ou un cancer hématologique, ou une intervention opératoire/médicale, par exemple une chirurgie cardiaque ou un premier épisode transfusionnel. Ces différents facteurs de risques sont, dans ce modèle, juxtaposables, permettant l'élévation du niveau d'activation des neutrophiles et de l'endothélium. Enfin, la transfusion, responsable du second-hit du TRALI, permettra l'induction de la pathologie susnommée. Figure 3 : Deuxième modèle de seuil, d'après Middelburg et al. [22] Modèle de seuil du déclenchement du TRALI dépendant de l'impact de la transfusion et de la pathologie pré- transfusionnelle du patient, en fonction du temps et du niveau d'activation des neutrophiles et de l'endothélium vasculaire. Tous les phénomènes sont juxtaposables. La sommation des différents niveaux d'activation, des neutrophiles et de l'endothélium, doit être suffisamment importante pour dépasser le seuil de déclenchement du TRALI. On voit ici que la transfusion sanguine peut être responsable à la fois du premier et du second évènement (Transfusion X et Y). Un dernier modèle a été présenté. Inspiré du modèle établi par Rothman, en 1976, dont le but était d'instaurer une logique épidémiologique applicable à toutes les maladies [24], Middelburg et Van der Bom ont présenté un dernier modèle de seuil incluant le paramètre U représentant la constante inconnue trop souvent décrite dans les différents cas de TRALI (Figure 4). Ici, on considère la sommation inflammatoire du passé pathologique du patient (cancer hématologique, sévère pneumonie, chirurgie cardiaque) et de la transfusion non suffisante au déclenchement du TRALI. Rentre alors en jeu la composante inconnue U dont l'impact suffira à dépasser le seuil de déclenchement du TRALI. Cette composante peut être génétique, ou simplement due à l'hygiène de vie du patient (consommation de nicotine, d'alcool). Figure 4 : Troisième modèle de seuil, inspiré de Middelburg et al. [22] Ce modèle représente la part de chaque paramètre sur l'induction du TRALI. Les notions de temps et d'effet sur l'inflammation ne sont pas mentionnées. Cependant, ce modèle inclut la variante inconnue U , représentant l'influence des caractéristiques propres aux patients. Finalement, le principal problème rencontré, par le corps médical transfuseur, est l'absence d'un consensus officialisant et simplifiant le diagnostic de ce syndrome. La frontière, entre TRALI et ALI, est actuellement mince, ce qui sous évalue la fréquence du premier. Section 2 Caractérisation du TRALI : la prévalence Le TRALI est décrit comme l'une des pathologies inflammatoires dont la mortalité est la plus élevée, mais avec une fréquence observée souvent très faible. Le rapport de l'ISTARE (base de données de la surveillance des Effets Indésirables Receveurs (EIR) associée aux dons de sang et à la transfusion des composés sanguins), publié en 2016 et regroupant des rapports d'hémovigilances de 25 pays entre 2006 et 2012, rapporte une fréquence d'EIR de 77, 5 pour 100 000 composés sanguins transfusés. Parmi eux, 25% (soit 19, 1 pour 100 000) sont dits sévères. Parmi ces réactions transfusionnelles, 349 décès ont été répertoriés dont 58% sont attribués à l'atteinte du système respiratoire. Le TRALI serait responsable de 32, 76% de ces décès liés au dysfonctionnement respiratoire. Au sein de ce rapport, le TRALI représente 1% de toutes les réactions et environ 4% des réactions dites sévères [25]. Dans des populations de patients transfusés, la fréquence du TRALI observée est très variable, pouvant aller de 0, 005% à 15%. Cette valeur dépend de plusieurs facteurs : i) la cohorte étudiée (facteurs de risques plus importants dans une population de patients septiques transfusés par rapport à la population générale des individus transfusés), ii) la période (évolution des processus de préparation des produits sanguins dans le temps par exemple, instauration de la leucoréduction dès 1998 en France [26]) et iii) la géolocalisation (la politique transfusionnelle diffère entre les pays). Par exemple, le rapport d'hémovigilance de l'année 2015 de France, publié en 2016, fait référence à 26 cas de TRALI pour 529 204 patients transfusés, soit 0, 005% [27]. A contrario, dans une population de 150 patients admis en unité de soins intensifs, de 2002 à 2008, pour hémorragie digestive, 22 patients ont déclaré un TRALI, soit 15% [28]. Ces résultats sont très variables et probablement sous-estimés du fait de l'absence d'un réel consensus sur le diagnostic et la terminologie du TRALI et de ses variantes (pTRALI, dTRALI). Certains ALI sont probablement des TRALI, mais faute de preuve pouvant les catégoriser tels quels, ils n'ont pas été catégorisés comme TRALI. Section 3 Caractérisation du TRALI : la clinique Le TRALI, sous toutes ses variantes, est caractérisé par différentes manifestations dont les principales sont la dyspnée, la tachypnée et l'hypoxémie. Parallèlement, plusieurs signes peuvent accompagner ces dernières, tels que des rougeurs, une tachycardie, de la fièvre, une hypothermie, une hypotension et, très rarement, une hypertension. Enfin, des infiltrats pulmonaires bilatéraux formés d'opacités alvéolaires cotonneuses plus ou moins confluentes, pouvant aller jusqu'à l'aspect de poumon blanc en champ de coton bilatéral sont observables par radiographie thoracique [16] (Figure 5). Une leucoagglutinine, présente chez les donneurs impliqués, est souvent corrélée au développement du TRALI [29]. Une étude comparative entre 89 cas de TRALI et 164 contrôles transfusés sans manifestation d'œdème pulmonaire a montré que le nombre de neutrophiles circulants accroit jusqu'à 48 heures après développement du TRALI [30]. Cependant, une leucopénie transitoire peut être observée dans certains cas de TRALI [31-33]. Cette numération cellulaire est aussi accompagnée d'une relocalisation pulmonaire des neutrophiles plus importante [34]. Le devenir des plaquettes sanguines semble différent. En effet, plusieurs cas de thrombopénie ont été rapportés dans la littérature et ce jusqu'à 6 heures après le début de la transfusion [35, 36]. De façon plus générale, au sein d'une cohorte de patients transfusés, la chute du compte plaquettaire semble être une conséquence à l'induction du TRALI [30]. Figure 5 : Radiographie de poumons d'un patient ayant développé un TRALI, d'après Ilango et al. [37] La manifestation d'un état inflammatoire, pré- et posttransfusionnel, chez les patients développant un TRALI est une conséquence quasiment inéluctable. Plusieurs études ont analysé la libération de facteurs solubles pro et/ou anti-inflammatoires circulants et pulmonaires chez des patients ayant déclaré un TRALI (Tableau 1). De façon générale, plusieurs de ces cytokines ont été mises en évidence chez des patients développant un ALI/SDRA, à la fois dans le compartiment pulmonaire, mais également périphérique. Nous pouvons effectivement citer l'IL- 1, TNF- (Tumor Necrosis Factor-), IL-8 ou encore IL-6 [38, 39]. Dans le cas plus précis des TRALI, la concentration des principales cytokines inflammatoires, telles qu'IL-6 [34, 40], IL-8 [30, 34, 40] ou IL-1 [34, 41] est le plus souvent augmentée, à la fois dans le compartiment vasculaire et pulmonaire. L'augmentation de cytokines anti-inflammatoires a aussi été constatée. C'est le cas d'IL-10 ou d'IL-1RA (antagoniste d'IL-1), ce qui évoque l'établissement d'une réponse protectrice de la part de l'organisme, dont le but est de réguler cet excès inflammatoire caractéristique du TRALI [30]. Tableau 1 : Evolution des cytokines inflammatoires chez les patients TRALI Vascular Pulmonary Vascular compartment Pulmonary compartment compartment compartment Pre- Post- Soluble Authors Populations Post-TRALI Evolution Final difference vs. control Final difference vs. control TRALI TRALI mediators Increase after surgery and don't change after IL-6 No difference Higher than control TRALI IL-8 Increase after surgery and decrease after TRALI No difference Higher than control IL-1 No change No difference Higher than control X X Vlaar Cardiac surgery patients X EA Increase after surgery and decrease after TRALI No difference Higher than control [34] TATC Increase after TRALI Higher than control Higher than control PAA Decrease after TRALI Lower than control Lower than control PAI-1 Higher than control IL-6 Increase after TRALI No difference IL-8 Increase after TRALI and pTRALI Higher than control Looney Transfused patients X X [30] IL-10 Increase after TRALI and pTRALI Higher than control IL1-RA Increase after TRALI Higher than control X sRAGE No difference No difference HMGB1 No difference S100A12 Higher than control but not significant Mller Cardiac surgery patients X IL-1 Positively correlated with S100A12 increase [41] IL-6 Positively correlated with S100A12 increase IL-8 Positively correlated with S100A12 increase TNF- Positively correlated with S100A12 increase Higher than control Higher than control (post- IL-6 Increase after TRALI (2. 7 fold increase) (pre-TRALI) TRALI) Higher than control Higher than control (post- IL-8 No change (pre-TRALI) TRALI) Roubinian Transfused patients X X IL-10 Increase after TRALI (1. 75 fold increase) No difference No difference [40] TNF- No change No difference No difference GM-CSF No change No difference No difference Kapur Transfused orthopedic X CRP Higher than control [42] surgery patients Kapur Transfused patients X IL-10 No difference [43] Chapitre 3 Transfusion-Related Acute Lung Injury : transfusion, plaquettes et modificateurs de la réponse biologique (BRM) Les plaquettes sanguines sont des cellules de l'inflammation [44], bien que la seule fonction qui leur a été longtemps accordée fût un rôle dans l'hémostase et la thrombose. Le but de cette revue est de mettre en évidence le rôle inflammatoire des plaquettes sanguines celles présentes dans les concentrés plaquettaires et celles présentes dans l'organisme et leur possible influence dans le développement d'un œdème pulmonaire aigu transfusionnel, le TRALI. Dans un premier temps, les différentes hypothèses émises sur la physiopathologie du TRALI immunologique vous seront présentés. Ensuite, l'hypothèse reposant sur une induction de second-hit du TRALI non immunologique régulée par les BRM secrétés par les plaquettes pendant la conservation des concentrés plaquettaires (CP) sera évoquée. Finalement, le rôle des plaquettes de l'organisme au sein de la physiopathologie des TRALI immunologiques et non- immunologiques sera discuté, en particulier au sein de modèles expérimentaux. Ce travail de synthèse ayant été publié en 2016, une mise à jour bibliographique figure à la suite de cette revue pour référer de l'avancée des recherches se concentrant sur l'impact i) des médiateurs solubles des concentrés plaquettaires sur l'endothélium vasculaire et iv) des plaquettes sanguines de l'organisme sur le devenir de l'ALI/TRALI. Erratum Transfusion-related acute lung injury : transfusion, platelets and biological response modifiers : ICAM-1 exprimé à la surface de l'endothélium et Mac-1 (2 intégrine ou CD11b/CD18) exprimé à la surface des neutrophiles. Mise à jour bibliographique I Section - Because their secretory capacity can cause immunological differences Les plaquettes des CP sont capables de sécréter un arsenal de médiateurs solubles pouvant ainsi modifier le devenir des cellules de l'inflammation, telles que les leucocytes. Cette libération de BRM peut également agir directement sur l'endothélium vasculaire, élément clé dans la physiopathologie du TRALI, comme vu dans la revue ci-dessus ( Transfusion-related acute lung injury : transfusion, platelets and biological response modifiers page 38 [7]). Les plaquettes secrètent tout un panel de BRM pro-inflammatoires, durant le stockage des concentrés plaquettaires, pouvant induire l'activation des cellules endothéliales et ainsi promouvoir la migration des leucocytes directement à travers cette barrière vasculaire ou, au contraire, renforcer l'intégrité de l'endothélium. Durant le stockage des CP issus d'aphérèse ou de mélange de CP, la concentration en microparticules plaquettaires et en sCD40L est augmentée. Dans un modèle in vitro, ces produits induisent une dégradation directe et indirecte (via l'activité des polymorphonucléaires (PMN) de l'endothélium [45]. La concentration en sCD40L dans les CP est positivement corrélée avec le risque d'induction d'EIR, résultat observé dans une nouvelle étude, menée par notre équipe, avec près de 10 000 échantillons de CP [46]. Une seconde étude a pu démontrer que la stimulation des cellules endothéliales, in vitro, avec des surnageants de CP augmentait l'activité inflammatoire de ces dernières, caractérisée notamment par une plus forte libération de médiateurs solubles, tels qu'IL-6, IL-8 ou encore GRO (Growth Regulated Oncogene ), et aussi par une amélioration de la transmigration des neutrophiles à travers cette barrière endothéliale. Ces effets étaient plus amplifiés lorsque les cellules endothéliales étaient préalablement stimulées avec du lipopolysaccharide (LPS) [47]. Un nouveau facteur soluble secrété directement par les plaquettes et ayant un impact sur l'état d'activation de l'endothélium est actuellement ciblé comme possible inducteur de réactions inflammatoires transfusionnelles, l'ADN mitochondrial (mtDNA), considéré comme un motif moléculaire associé aux dégâts cellulaires (DAMPs). On retrouve dans le cytoplasme des plaquettes quiescentes environ 4 mitochondries ; ces mitochondries peuvent être relocalisées dans les pseudopodes plaquettaires, puis libérées dans le milieu, sous forme libre ou complexées aux microparticules, après stimulation. Une fois libérée, ces mitochondries sont hydrolysées par la phospholipase A2-IIa (sPLA2-IIA) ce qui permet la libération de son ADN qui peut alors se fixer directement sur les neutrophiles et promouvoir leur interaction avec la paroi vasculaire [48]. Lors du stockage des CP, la libération de l'ADN mitochondrial est plus importante dans les CP impliqués dans les EIR, et cela de la même manière que d'autres facteurs pro-inflammatoires, tels que le sCD40L et l'IL13, [49] mais également dans les CP impliqués dans des cas de TRALI humains [50]. L'absence de corrélation entre la concentration d'ADN mitochondrial et des facteurs solubles plaquettaires montre probablement des mécanismes de libération plaquettaire différents après activation [49]. L'ADN mitochondrial a un impact direct sur la perméabilité de l'endothélium. Une étude in vitro observe une augmentation de la perméabilité des cellules endothéliales artérielles pulmonaires humaines induite directement par l'ADN mitochondrial ou indirectement via les PMN. En effet, l'ADN mitochondrial permet la fixation des PMN avec les cellules endothéliales, corrélée avec une expression de l' intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) plus importante ainsi qu'une communication améliorée entre ces deux types cellulaires [51]. Ce médiateur de l'inflammation peut également être un stimulus direct aux PMN. De façon in vitro, l'ADN mitochondrial et les mitochondries entières ont la capacité d'activer directement les basophiles, les monocytes et les neutrophiles [50]. Les plaquettes sont donc potentiellement capables d'induire un état inflammatoire propice au développement d'un ALI de par leur capacité à secréter de l'ADN mitochondrial, molécule ayant une influence directe sur l'endothélium vasculaire et les PMN. Plusieurs études ont démontré que l'ADN mitochondrial peut participer à l'induction d'une atteinte pulmonaire dans des modèles murins [52-54]. On observe donc un potentiel d'activation et de dégradation de l'endothélium non négligeable des CP. Cependant, la libération de cytokines/chimiokines plaquettaires pendant le stockage des CP peut également avoir un impact dans le maintien de l'intégrité vasculaire. La concentration en facteurs de croissance dans les concentrés plaquettaires peut être augmentée après une stimulation de ces derniers avec de la thrombine ou du calcium. La conséquence de cette stimulation est une prolifération importante des cellules endothéliales. Cela permet d'envisager un effet important de la transfusion de CP sur le maintien de l'intégrité vasculaire [55, 56]. Les CP sont donc capables d'induire à la fois une activité inflammatoire des cellules endothéliales mais également leur détérioration, accentuant la perméabilité de la paroi vasculaire aux cellules de l'inflammation. L'un des buts de cette thèse est de déterminer l'impact des composés produits lors du stockage des CP, spécialement ceux associés à un EIR, pour tenter de déterminer leur pouvoir inflammatoire. Nous nous intéresserons notamment à la libération d'Endocan par les cellules endothéliales, protéine normalement impliquée dans la sauvegarde de l'imperméabilité de la couche endothéliale mais sa forte libération a souvent été utilisée comme marqueur pathologique [57-63] (voir manuscrit I). II Section - Several tracks already mentioned in TRALI A l'heure actuelle, l'implication des plaquettes sanguines de l'organisme dans la physiopathologie de l'ALI/TRALI fait débat. L'influence des plaquettes sanguines, plus particulièrement via la production de microparticules, dans des cas d'ALI/SDRA chez l'homme a été récemment évoquée. Les observations étaient différentes au niveau circulant par rapport à l'espace alvéolaire. Une augmentation importante du nombre de microparticules pulmonaires a d'abord été observée chez des patients développant un ALI/SDRA non cardiogénique comparés à des patients présentant un œdème pulmonaire cardiogénique [64]. En revanche, des niveaux circulants plus bas ont été constatés chez des patients avec un ALI/SDRA non cardiogénique comparé à des patients n'ayant pas développé de SDRA mais présentant des facteurs de risques liés à cette pathologie [65]. D'autres études évoquent un rôle pro-inflammatoire plaquettaire capable de promouvoir le développement de l'ALI/SDRA et du TRALI. Chez l'homme, deux méta-analyses ont révélé un effet bénéfique des traitements antiplaquettaires sur le devenir d'ALI/SDRA, notamment par une diminution drastique de la mortalité. Ici, les drogues plaquettaires utilisées étaient l'aspirine, le clopidogrel, la ticlopidine, le cilostazol, le dipyridamole, l'anagrélide et la persantine [66, 67]. L'inhibition de l'expression de certains facteurs plaquettaires, tels que la - thromboglobuline (-TG) et le facteur plaquettaire 4 (PF4), dans un modèle murin d'ALI, induit par injection trachéale d'acide chloridrique, semble protectrice face au développement de cette pathologie. Cela était représenté par une diminution du score de l'ALI, des protéines totales détectées dans les lavages broncho-alvéolaires (LBA) et de l'infiltrat au niveau du parenchyme pulmonaire [68]. L'aspirine, qui est un inhibiteur de l'activation plaquettaire ciblant le système COX-1 (Cyclooxygénase-1), prévient entièrement le développement d'un ALI induit par stimulation des voies aérodynamiques avec du LPS dans un modèle murin. A la fois le recrutement pulmonaire des neutrophiles, la formation des Neutrophil Extracellular Traps (NET) phénomène cellulaire caractérisé par une extravasion de la chromatine des neutrophiles dans le milieu extracellulaire [69] et le développement de l'œdème pulmonaire sont inhibés. Cependant, l'utilisation du tirofiban, antagoniste non peptidique du récepteur GPIIb/IIIa plaquettaire (récepteur du fibrinogène et du facteur de von Willebrand (vWF), ne semblait pas prévenir les symptômes liés au déclenchement de l'ALI [70]. De plus, dans un modèle murin du TRALI, dont le priming est induit par une injection de LPS et le second-hit par transfusion de plaquettes murines en fonction de leur temps de stockage, la pathologie se manifeste avec une sévérité dépendante du temps de stockage des plaquettes [71], démontrant un impact non négligeable des sécrétions plaquettaires dans l'amplification de la physiopathologie inflammatoire du TRALI expérimental. Finalement, une étude a mis en place plusieurs traitements à base de drogues antiplaquettaires dans un modèle murin du TRALI établi par injection de LPS, par voie intrapéritonéale, 24 heures avant l'injection d'anticorps anti-CMH I (Complexe Majeur d'Histocompatibilité I), par voie intraveineuse. Le but a été d'induire une thrombopénie et d'utiliser des traitements antiplaquettaires à base d'aspirine, de clopidogrel et d'anticorps anti- CD36, préalablement à l'induction de la lésion pulmonaire. Aucun de ces traitements n'a permis l'inhibition du développement de l'œdème pulmonaire. Au contraire, cette étude postule sur un rôle plaquettaire dans le maintien de l'intégrité vasculaire et donc un rôle antagoniste au développement du TRALI [72]. Au regard de débats scientifiques concernant le rôle des plaquettes sanguines de l'hôte dans le développant des œdèmes pulmonaires lésionnels, l'un des objectifs de cette thèse est de comprendre, au mieux, le réel rôle plaquettaire dans l'induction de l'ALI/TRALI (voir manuscrit III). Chapitre 4 Le rôle de signalisation du CD40 ligand dans la biologie plaquettaire et dans la transfusion de composants plaquettaires La revue que nous avons écrite (ci-après) permet d'introduire le rôle du complexe CD40/CD40L, et du sCD40L notamment plaquettaire, du point de vue de la transfusion et de l'inflammation. Ce travail de synthèse ayant été publié en 2014, une mise à jour bibliographique est proposée à sa suite, pour contextualiser les hypothèses du rôle de ce complexe immun dans la physiopathologie de l'ALI/TRALI. Erratum The signaling role of CD40 ligand in platelet biology and in platelet component transfusion : Lors de la rédaction de cette revue nous affirmions que The role of 51 as a receptor for CD40L in 51-expressing-cells has not yet been investigated . Cependant, depuis 2015, une étude a investigué le rôle de l'IIb3 et l'51 plaquettaire dans la capture du sCD40L. L'activation des plaquettes induite par stimulus via le sCD40L est entièrement inhibée lors de la neutralisation de l'IIb3 et l'51. Bloquer d'autres intégrines plaquettaires telles que l'21 et l'V3 ne prévient pas l'activation des plaquettes par le sCD40L, prouvant ainsi que les intégrines IIb3 et 51 sont les premières impliquées dans une réponse au stimulus via le sCD40L [73]. Mise à jour bibliographique I Section - CD40L and its receptors in inflammatory pathologies Le CD40L, notamment plaquettaire, participe au déclenchement et au maintien d'un état inflammatoire en agissant sur plusieurs fronts ; directement sur l'endothélium ou sur les leucocytes ou au travers d'un signal auto et paracrine propre aux plaquettes. Dans notre revue the signaling role of CD40 ligand in platelet biology and in platelet component transfusion page 55 [74], nous signalons que la communication des cellules circulantes avec l'endothélium, via le couple immun CD40/CD40L, participe à un changement d'état d'activation des cellules endothéliales favorable au développement de plusieurs pathologies, notamment inflammatoires, telles que le TRALI. Depuis, de nouvelles études ont investigué le rôle de ce complexe protéique dans la régulation de l'activité vasculaire. La production de médiateurs solubles depuis l'endothélium est aussi dépendante du complexe formé entre le CD40 de l'endothélium et le CD40L membranaire ou soluble des plaquettes. Ainsi, le monocyte chimoattractant protein-1 (MCP-1), qui participe à l'amplification de la perméabilité vasculaire et le recrutement des cellules immunitaires et inflammatoires [75], voit sa production augmentée après interaction du CD40 endothélial et du CD40L plaquettaire [76]. Le vWF est lui aussi produit par l'endothélium dépendamment de l'interaction de son CD40 membranaire avec son ligand plaquettaire, le CD40L. Cette interaction régule positivement l'internalisation du calcium par l'endothélium ce qui amplifiera l'exposition du vWF par ces mêmes cellules. La conséquence sera donc la mise en place d'un rétrocontrôle positif amplificateur de l'agrégation plaquettaire à la paroi vasculaire, favorisant la captation et la diapédèse des leucocytes [77]. Le recrutement des globules blancs par l'endothélium vasculaire peut également être favorisé par l'expression de la fractalkine chémokine transmembranaire, elle aussi dépendamment de la complexification du CD40 et du CD40L. Les leucocytes positifs en GPR13 (G-Protein Coupled Receptor 13) récepteur à la fractalkine pourront alors fixer cette barrière vasculaire [78]. Le CD40L plaquettaire participe également à une augmentation du risque thrombotique en favorisant l'interaction des plaquettes avec l'endothélium et leur agrégation [79-83]. Ces résultats évoquent un impact non négligeable du CD40L plaquettaire dans des complications thrombotiques et inflammatoires. L'impact du complexe protéique CD40/CD40L n'est pas exclusif aux cellules endothéliales, comme décrit, en 2014, dans notre revue the signaling role of CD40 ligand in platelet biology and in platelet component transfusion page 55 [74] . Effectivement, ce couple immun impact directement le devenir des leucocytes. La protéine CD40L, notamment plaquettaire, peut fixer le récepteur Macrophage-1 antigen (Mac-1), présent à la surface des neutrophiles, et ainsi initier la migration de ces derniers depuis le compartiment sanguin jusqu'à la zone enflammée. La communication entre ces deux types cellulaires peut directement être établie via le complexe CD40 des neutrophiles et CD40L des plaquettes, ce qui engendra une cascade de signalisant amplifiant l'interaction des neutrophiles avec l'endothélium [84]. L'isoforme soluble du CD40L membranaire plaquettaire amplifie également la communication entre les neutrophiles et les plaquettes, en stimulant l'expression de Mac-1 à la surface des neutrophiles, pour finalement accrotre la production de dérivés de l'oxygène, les ROS, depuis ces derniers [85, 86]. Cette interaction préétablie entre les plaquettes et les neutrophiles peut être responsable d'une amplification de la production de sCD40L par les plaquettes et donc auto-promouvoir leur complexification avec les cellules immunes ou non immunes (comme les cellules endothéliales) exprimant le CD40 [87]. Certains évoquent également un rôle inhibiteur de l'intégrine plaquettaire GPIIb/IIIa dans la promotion d'une interaction entre les plaquettes et les leucocytes via, entre autres, l'expression du CD40L plaquettaire [88]. Les plaquettes, qui expriment également le CD40 [89], l'utilisent pour la formation de complexes directement avec d'autres cellules telles que les cellules dendritiques, les monocytes et les neutrophiles. La neutralisation/inhibition de ce récepteur plaquettaire limite la triple communication entre les plaquettes, l'endothélium et les leucocytes, limitant également la transmigration leucocytaire et plaquettaire, à travers la paroi vasculaire [90]. Dans des situations pathologiques, telles que le sepsis dont certains modèles animaux proposent une physiopathologie proche de celle de certains TRALI expérimentaux, l'influence du sCD40L plaquettaire sur les neutrophiles a largement été investiguée. Le clivage du CD40L plaquettaire, contrôlé par l'activité de la métalloprotéinases-9 (MMP-9) [91] et le transducteur de signal Ras-related C3 botulinum toxin substrate-1 (Rac-1) [92], amplifie drastiquement l'expression de Mac-1 à la surface des neutrophiles et, par conséquent, leur infiltration pulmonaire [93, 94]. L'utilisation de la simvastatine, capable de réduire significativement les concentrations plasmatiques du sCD40L, confirme l'implication du sCD40L dans la migration des neutrophiles dans les poumons lors d'un sepsis murin induit par ligature et ponction du ccum [95]. Le même constat a été fait dans d'autres pathologies inflammatoires confirmant une fois de plus une influence considérable du CD40L plaquettaire dans l'activation et le recrutement des leucocytes jusqu'à la zone enflammée [96, 97]. Dans des modèles murins d'ALI, le rôle du couple CD40/CD40L a déjà été évoqué mais sa cascade d'activation n'a jamais été entièrement investiguée. La transcription de l'ARNm du CD40 et son affinité avec le facteur de transcription Nuclear Factor- B (NF-B) sont significativement augmentées lors de l'induction d'un ALI par injection in vivo de LPS [98]. L'inhibition du complexe CD40/CD40L protège du développement de l'ALI dans plusieurs modèles animaux, induit par endotoxémie [99], ischémie-reperfusion [100], hyperventilation [101] ou radiation [102]. Cette protection est associée à une diminution des concentrations protéiques au niveau pulmonaire en TNF-, IL-1 et Macrophage Inflammatory Protein-2 (MIP-2) ainsi qu'une diminution de l'activité de la MMP-9 et une augmentation de la perméabilité vasculaire. L'influence du complexe CD40/CD40L n'a cependant jamais été réellement prouvée dans le TRALI et même écartée dans un modèle murin one-hit de la pathologie [103]. En effet, ce modèle murin utilise une simple injection d'anti-CMH I, inducteur de l'œdème pulmonaire, de 4, 5 mg/kg alors que le modèle murin du TRALI, légitiment validé par la communauté scientifique, est celui proposé par le Dr Looney reposant sur l'hypothèse du two-hit avec une première injection de LPS suivie d'une seconde injection d'anticorps anti-CMH I à 1 mg/kg [104]. Tous ces résultats sont évocateurs d'une influence du complexe CD40/CD40L sur l'aggravation de l'état inflammatoire induit préalablement par un agent extérieur de stress infectieux ou stérile (comme peut l'être l'acte transfusionnel). Cela nous amène donc à suspecter un rôle important de ce couple immun dans la physiopathologie du TRALI humain. Chapitre 5 Hypothèse de l'atteinte multi-organes au cours d'un TRALI Section 1 Le pancréas I Physiopathologie de la pancréatite : les neutrophiles Tout comme les poumons, le pancréas peut être la cible de réactions inflammatoires pathologiques, on parle alors de pancréatite. Actuellement, la phase aigu de cette pathologie est la plus connue et son état chronique nécessite une investigation plus approfondie [105]. La pancréatite aigu est caractérisée par l'apparition d'un œdème pancréatique, d'une nécrose du tissu adipeux, d'une protéolyse pancréatique, d'hémorragies pancréatiques et d'une réaction inflammatoire aigu [106]. Chez l'homme, l'aspect inflammatoire des pancréatites a été investigué depuis déjà plusieurs années, malgré la diversité de ses causes et donc de sa physiopathologie. La concentration de plusieurs cytokines inflammatoires, telles qu'IL-1 [107], IL-6 [108, 109], IL-8 [110, 111] ou encore IL-18 [112], a été positivement corrélée en lien avec la caractérisation de différentes pancréatites aigus ou chroniques. Plusieurs études expérimentales évoquent un lien étroit entre pancréatite et ALI. Dans un premier temps, l'induction d'une pancréatite aigu par administration de céruléine ou d'acides aminés, dans plusieurs modèles murins, est corrélée avec une atteinte pulmonaire, caractérisée par une migration des neutrophiles, un infiltrat pulmonaire, une congestion alvéolaire et des phénomènes hémorragiques [113, 114]. Une activité importante des neutrophiles au niveau pulmonaire, caractérisée par une libération excessive de myéloperoxidase (MPO), a aussi plusieurs fois été évoquée suite à l'induction expérimentale d'une pancréatite aigu [114, 115]. De façon plus générale, l'induction d'une pancréatite aigu, dans un modèle murin, induit le développement d'un ALI qui se manifeste par des signes d'insuffisance respiratoire, un ratio entre le poids des poumons et du corps important (caractéristique d'un œdème pulmonaire) et enfin un score d'atteinte pulmonaire croissant avec le temps d'exposition à l'inducteur pathologique [116]. Tout comme le TRALI, en particulier, et l'ALI, en général, les neutrophiles semblent jouer un rôle primordial dans l'induction, le maintien et l'aggravation de certaines pancréatites, selon un point de vue expérimental [117, 118]. D'après plusieurs études, la déplétion totale des neutrophiles, notamment par l'utilisation d'un sérum anti-neutrophile, attenue considérablement la sévérité de certaines pancréatites, au sein de plusieurs modèles animaux, et permet également la protection des poumons contre le développement d'un ALI [119-121]. En effet, ici les neutrophiles sont considérés comme les cellules principalement responsables de cette pathologie. Après induction expérimentale d'une pancréatite, déclenchée par administration d'acides aminés ou de taurocholate, on retrouve une infiltration des neutrophiles significative à la fois dans les poumons, mais surtout dans le pancréas, dépendamment de la production de PF4, selon une étude [122], mais aussi, hypothétiquement, de l'expression accrue de la protéine Mac-1 à la surface des neutrophiles selon d'autres auteurs [123]. Une récente théorie évoque une capacité qu'ont les neutrophiles, dans le cas d'une pancréatite associée à une atteinte pulmonaire déclenchée par des injections successives de céruléine et de LPS, à migrer dans une première zone, le pancréas, puis, après un retour au niveau circulant, d'effectuer une nouvelle migration dans un second tissu, les poumons. Ce mécanisme est appelé migration transendothéliale inverse et est régulé par l'expression de la molécule junctional adhesion molecules C (JAM- C) [124] (Figure 6). Finalement, cette infiltration tissulaire des neutrophiles est permise par l'expression de plusieurs protéines de surfaces, telles que Mac-1 et la L-sélectine (CD62L) sur les neutrophiles [125], la protéine lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) sur les leucocytes [126] et ICAM-1 à la surface des cellules endothéliales [127]. La conséquence finale de cette migration tissulaire excessive est la libération des ROS responsable de la dégradation cellulaire [128], elle-même responsable d'un signal paracrine alimentant la nécrose cellulaire pancréatique [129]. Finalement, les neutrophiles semblent aussi participer à la dégradation pancréatique, lors de certaines pancréatites humaines ou expérimentalement induites [130], par la formation des NET, dont le rôle principal est antimicrobien [131]. En effet, tout d'abord la quantité des NET semble augmentée chez les patients atteints de pancréatite, dépendamment de la sévérité. De plus, dans un modèle murin de pancréatite aigu, l'utilisation de DNase I, inhibiteur de la formation des NET, prévient entièrement le développement de la pancréatite induit par injection rétrograde de taurocholate de sodium à 5% [130]. L'activation des neutrophiles ne participe pas seulement à la migration de ces derniers dans le tissu enflammé, mais permettrait également la dégradation directe de l'endothélium vasculaire [132]. Enfin, le rôle des neutrophiles dans certaines pancréatites semble d'une telle ampleur que certains proposent l'utilisation du ratio entre le nombre des neutrophiles et des leucocytes circulants (appelé NLR) comme marqueur de la pathologie [133]. On retrouve donc, au sein de plusieurs modèles animaux de la pancréatite, une physiopathologie principalement orchestrée par les neutrophiles circulants et migratoires, proposant des caractéristiques similaires à celles observées dans plusieurs ALI également expérimentaux. II Physiopathologie de la pancréatite : l'endothélium vasculaire Comme décrit précédemment, l'endothélium participe au recrutement et à la migration des leucocytes, phénomènes souvent observés par le rolling des leucocytes, lors de pancréatites expérimentales [134, 135]. Cette barrière endothéliale régule la migration des neutrophiles, notamment via l'expression de JAM-C [124] et d'ICAM-1 [127, 136]. Cependant, certaines études évoquent une protection pulmonaire plutôt que pancréatique quant à la neutralisation de l'expression d'ICAM-1 des cellules endothéliales dans des cas de pancréatite expérimentale associée à des lésions pulmonaires. La neutralisation de la P-sélectine (CD62P) de l'endothélium est, quant à elle, protectrice de l'atteinte pulmonaire mais également de l'atteinte pancréatique [137]. L'utilisation de plusieurs protéines solubles en tant que marqueur de la sévérité de la pathologie, chez l'homme, a été proposée. On peut citer l'ICAM-1 soluble [138], la E-sélectine (CD62E) soluble, l'IL-6 [139], la thombomoduline soluble (sTM) [140], le vWF ou encore la forme soluble du récepteur endothelial protein C receptor (EPCR) [141], évoquant ainsi une implication des cellules endothéliales dans cette physiopathologie. Durant le développement d'une pancréatite aigu murine, induit par l'utilisation de céruléine, les observations microscopiques de la barrière endothéliale montrent un changement de cette dernière, caractérisé par une augmentation de la perméabilité et de l'adhérence des leucocytes [142]. L'apoptose des cellules endothéliales, notamment dans les capillaires pulmonaires, est également augmentée suite à l'administration d'acide taurocholique dans un modèle murin [143] ainsi que leur dégradation, in vitro, induite par l'activité des neutrophiles de patients diagnostiqués avec une pancréatite aigu [132]. La réduction de la densité capillaire dans les zones proches des nécroses pancréatiques a aussi été démontrée [144, 145]. La diminution progressive de l'expression de CD105 et de sa complexification avec le transforming growth factor-1 (TGF-1) et -3 (TGF-3), chez l'homme, évoque une atteinte de la fonction angiogénique de l'endothélium vasculaire, lors d'une pancréatite [146]. La dégradation de l'endothélium vasculaire, suite à l'induction de certaines pancréatites expérimentales, n'est pas exclusive aux zones pancréatiques et/ou pulmonaires mais c'est également le cas de l'endothélium des capillaires intestinaux, dont la perméabilité est également augmentée [147, 148]. Selon plusieurs résultats, observés dans divers modèles expérimentaux de pancréatite, on retrouve une implication des cellules endothéliales en tant que cellules promotrices du recrutement et de la migration des leucocytes dans la zone cible mais également entant que cible directe de l'activité des leucocytes. III Physiopathologie de la pancréatite : les plaquettes Un rôle des plaquettes sanguines dans la physiopathogénie de certaines pancréatites expérimentales a été proposé. Plusieurs modèles murins d'induction d'une pancréatite et de traitements antiplaquettaires ont tenté de mettre en lumière la responsabilité des plaquettes sanguines. Une thrombopénie induite par l'injection d'anticorps anti-GPIb prévient le développement de la pancréatite aigu, induite par injection intrapéritonéale de céruléine, et ce corrélé avec une diminution de l'expression de Mac-1 sur les neutrophiles, de la production de la chimiokine MIP-2 protéine chimioattractante des neutrophiles et de l'infiltration des neutrophiles dans le pancréas et donc de la libération de MPO dans ce même tissu [149]. Les plaquettes sanguines participent également par leur capacité à communiquer avec les cellules centrales à la physiopathologie de certains modèles animaux de la pancréatite. Leur activité est significativement augmentée lors de l'induction de la pathologie et est la cause d'une communication accrue avec l'endothélium vasculaire [145, 150, 151]. La formation de complexes entre les neutrophiles et les plaquettes est aussi observée [134]. Cette mécanistique est notamment rendue possible par l'expression du CD62P à la surface des plaquettes permettant leur adhésion à la paroi vasculaire [135] et influençant ainsi la captation et la migration des leucocytes dans le tissu pancréatique [152]. Chez l'homme, les observations du devenir des plaquettes sanguines lors du diagnostic de diverses pancréatites diffèrent. Certains mentionnent une élévation du compte plaquettaire dans un cas précis de pancréatite sévère, durant ses différentes phases de développement, observée sur 20 jours après admission d'urgence en soins intensif [153]. De façon plus générale, la comparaison de patients ayant manifesté une pancréatite œdémateuse biliaire avec des contrôles montre une diminution significative du compte plaquettaire associée à une augmentation de leur volume [154], caractéristique de l'activation des plaquettes [155]. L'augmentation de l'activation plaquettaire est confirmée, par une seconde étude, par la mesure de l'expression du CD62P à la surface des plaquettes sanguines et la production circulante du PF4, dépendamment de la sévérité de la pancréatite. Cependant, le compte plaquettaire évolue dans le sens d'une augmentation lors du développement d'une pancréatite aigu sévère [156], contrairement à l'étude précédente [154]. Des observations décrites dans une revue rétrospective, impliquant de patients admis à l'hôpital pour pancréatite aigu entre 2007 et 2011 ont encore été différentes. Ici, le compte plaquettaire ne change pas entre ces patients et leurs contrôles et, contrairement aux études précédentes, le volume plaquettaire moyen diminue avec le développement de la pancréatite aigu [157]. Même si les scientifiques semblent s'accorder sur un rôle important des plaquettes sanguines pendant une atteinte inflammatoire du pancréas, leur fonction est encore mal comprise. IV Physiopathologie de la pancréatite : Le couple CD40/CD40L Le rôle du couple immun CD40/CD40L n'est pas encore entièrement compris dans le cadre des pancréatites. A l'heure actuelle, son implication reste débattue. En 2001, une étude a investigué le rôle du CD40L dans la physiopathogénie de la pancréatite aigu, induite par administration de céruléine au sein d'un modèle murin. Cette étude se concentre sur le CD40L membranaire des lymphocytes T et le CD40 membranaire des monocytes. Dans un premier temps, l'expression du CD40 au niveau pancréatique et pulmonaire diminuait après injection de l'agent responsable de l'induction de la pancréatite chez les souris sauvages et CD40L-/-. Le développement de la pancréatite aigu était inhibé lorsque les souris étaient déficientes pour l'expression du CD40L. En effet, il a été observé une diminution de la production d'amylase, de l'infiltrat pancréatique, de la production du MPO pancréatique et de la nécrose des cellules du pancréas, 4h et 12h après induction de la pathologie. L'atteinte pulmonaire, notamment caractérisée par des observations histologiques et la mesure de l'infiltrat pulmonaire, était elle aussi inhibée [158]. Une seconde étude a démontré que le traitement à base de leptine réduit significativement la sévérité de la pancréatite, également induite par injection de céruléine, corrélé avec une diminution de l'expression du CD40 dans les tissus cibles, le pancréas et les poumons [159]. Finalement, une étude in vitro, analysant l'impact du CD40 membranaire d'une lignée cellulaire pancréatique et du CD40L membranaire de fibroblastes transfectés dans un conditionnement proche d'une pancréatite, démontre que le complexe CD40/CD40L permet d'amplifier l'activité cellulaire au niveau pancréatique, se manifestant par une libération excessive de médiateurs pro-inflammatoires tels que TNF- et IL-1 [160]. Cependant, en 2011, une étude a investigué l'impact d'une déficience en CD40L des cellules sur le développement de la pancréatite aigu. Les résultats étaient alors différents de ceux évoqués ci-dessus. L'induction de cette pancréatite par injection de taurocholate et de céruléine n'était pas inhibée dans leur modèle murin CD40L-/-. La concentration d'amylase plasmatique, la production du MPO pulmonaire et pancréatique et du MIP-2 pancréatique ainsi que le score histologique, reflétant l'atteinte du pancréas, n'étaient pas diminués chez les souris knock-out . Les comptes cellulaires n'étaient, eux aussi, pas impactés. Les souris déficientes en CD40L présentaient un taux plaquettaire identique, une diminution du nombre de polymorphonucléaires et des mononucléaires comparés aux souris contrôles de la pathologie [161]. Chez l'homme, seul des dosages du sCD40L ont été réalisés et certains proposent l'utilisation de la concentration de cette molécule comme marqueur de prédiction du développement d'une pancréatite sévère [162]. En conclusion, nous constatons une étroite relation entre la pancréatite et l'ALI, démontrée grâce à plusieurs modèles animaux, tous deux orchestrés par une implication significative des neutrophiles, de l'endothélium et des plaquettes sanguines. Nous proposons ainsi un schéma hypothétique de la physiopathologie de la pancréatite associée au développement de l'ALI représenté par la figure 6. Figure 6 : Physiopathologie de la pancréatite associée au déclenchement d'une détresse respiratoire Une première agression du pancréas, responsable du développement de la pancréatite, va induire une libération de médiateurs solubles activateurs de l'inflammation et attractifs des neutrophiles. Une communication étroite entre les neutrophiles, les plaquettes circulantes et l'endothélium vasculaire va être établie. L'infiltration excessive des neutrophiles dans le pancréas conclura la dégradation de ce dernier. Dans un second temps, les neutrophiles ayant migré dans le pancréas vont être recrutés dans l'espace alvéolaire. Ce mécanisme est rendu possible par l'expression de JAM-C de la part de l'endothélium qui permet la mise en place de la migration transendothéliale inverse . Finalement, ce mécanisme est la cause du développement d'un ALI. Section 2 Inflammation intestinale I Physiopathologie des MICI : les neutrophiles L'intestin peut également être une cible lors de certaines pathologies inflammatoires et immunitaires d'étiologie multiple et proposant donc une mécanistique complexe. C'est notamment le cas des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Dans cette catégorie on retrouve principalement la rectocolite hémorragique (RCH) et la maladie de Crohn (MC) [163]. La physiopathologie actuellement décrite pour les MICI repose principalement sur une dérégulation générale du système immunitaire, notamment via les lymphocytes T auxiliaires Th2 et Th17 pour les RCH et Th1 et Th17 pour les MC. Une infection bactérienne va induire une réponse de l'immunité innée, dans un premier temps, par l'intermédiaire des macrophages et des neutrophiles. Cette réponse primaire sera, ensuite, la cause d'une activation du système immunitaire adaptatif activatrice des lymphocytes T auxiliaires [164, 165] (Figure 7). Le rôle des neutrophiles, pouvant être parmi les premières cellules impliquées suite à l'activation de l'immunité innée lors d'une MICI, est mal connu [163]. Certains ont décrit une activation des neutrophiles, dans des modèles expérimentaux de RCH induit par administration de dextran sulfate sodium (DSS), dépendante de la sécrétion de cytokines et de chimiokines depuis les cellules inflammatoires, telles que le KC équivalent de l'IL-8 humain, le MIP-2 ou encore l' Epithelial-derived Neutrophil-Activating peptide-78 (ENA-78) [166-168], ou même l'IL-8 chez des patients ayant manifesté une MICI, d'origine diverse [169, 170]. Suite à l'activation des leucocytes, l'expression de molécules d'adhésion à leur surface, par exemple CD11b, Mac-1 et ICAM-2, observée dans des cas de RCH, ou CD11a, CD11c, ICAM-1, et ICAM-3, associée à différents cas de MC, va être augmentée ce qui permettra alors l'établissement d'une communication étroite avec l'endothélium et promouvoir la migration des neutrophiles jusqu'au tissu intestinal [171]. Ce phénomène est à l'initiative de dommages oxydatifs dans la zone intestinale, observée chez des patients diagnostiqués pour des MICI [172], et donc aboutir à une dégradation tissulaire [173]. Enfin, les neutrophiles agissent également via la formation de NET dans ces pathologies, observée chez des patients, reflétant ainsi une activité exagérée et nocive des neutrophiles [174]. II Physiopathologie des MICI : l'endothélium vasculaire L'atteinte de l'intégralité vasculaire est aussi une clé dans le déclenchement et donc la résolution des MICI [175]. Lors de la manifestation d'une MICI, chez certains patients ou dans différents modèles expérimentaux, l'endothélium vasculaire augmente sa capacité à réagir avec les leucocytes, caractérisée notamment par la présentation de protéines membranaires, telles qu'ICAM-1 et la vascular cell adhesion protein-1 (VCAM-1) capables de former un complexe avec la protéine CD11a/CD18 des leucocytes [176-178] ou encore l'expression de la mucosal vascular addressin cell adhesion molecule-1 (MAdCAM-1) qui peut interagir avec la lymphocyte Peyer patch adhesion molecule (LPAM ou intégrine 47) des leucocytes [179]. L'expression du CD40 membranaire a aussi été observée à la surface de l'endothélium amplifiant ainsi le recrutement des leucocytes. Dans un modèle murin d'inflammation du colon induit par administration de DSS, la déplétion en CD40 et CD40L diminue considérablement le recrutement des leucocytes, mais également des plaquettes sanguines, au niveau de l'intestin enflammé [180]. La perméabilité de l'endothélium vasculaire semble également augmentée lors d'une RCH, après injection d'iodoacetamide et de DSS dans deux modèles animaux distincts, corrélée avec l'augmentation de la dégradation de ce même endothélium, justifiant donc l'amplification du recrutement leucocytaire au niveau intestinal [181]. Enfin, plusieurs marqueurs solubles, produits par l'endothélium, sont augmentés dans le sérum des patients avec des réactions inflammatoires intestinales. On peut notamment citer une augmentation de la concentration soluble du CD62E [182], d'ICAM-1 [182, 183], de VEGF-A, du basic fibroblast growth factor (bFGF), de l'endothelin-1 [184], de l'angiogénine [185] ou encore de l'angiopoïetine [186]. III Physiopathologie des MICI : les plaquettes Finalement, le rôle des plaquettes sanguines dans les réactions inflammatoires intestinales a largement été investigué [187-190]. Les plaquettes sanguines agissent selon deux fronts. La première approche va dans le sens d'une augmentation de la fonction thrombotique des plaquettes tandis que la seconde approche ira dans le sens d'une activité inflammatoire prépondérante lors de cette pathologie [189]. Ces mécanismes semblent dépendant l'un de l'autre. Dans un premier temps, plusieurs preuves du rôle thrombotique des plaquettes ont été évoquées chez l'homme et dans des modèles murins, après déclaration d'une MICI. Au sein d'une population de patients présentant une RCH, une augmentation de l'expression plaquettaire de l'intégrine a2GPI a été observée [191]. Cette intégrine est principalement impliquée dans la formation du thrombus [192]. L'augmentation de l'expression de la protéine CD36 a aussi été évoquée chez des patients avec une MICI [193], augmentant ainsi le risque potentiel thrombotique [194, 195]. En effet, le CD36 plaquettaire est sensible aux lipoprotéines à basse densité oxydées (oxLDL). Cette interaction hypersensibilise les plaquettes à l'ADP et promeut donc leur agrégation [196]. L'utilisation d'un modèle murin a démontré que la déficience en CD36 bloque l'agrégation plaquettaire [197]. De façon globale, le pouvoir d'agrégation plaquettaire est plus élevé dans la population de patients diagnostiqués pour une MICI que dans une population saine [198]. Le risque important d'agrégation lors d'une MICI a aussi été prouvé à l'aide de plusieurs modèles animaux. La production d'IL-6, facteur pro-inflammatoire sécrété par une multitude de cellules, favorise la formation de thrombus orchestrée par les plaquettes sanguines, suite à l'induction expérimentale d'une RCH par administration de DSS [199]. Finalement, ces thrombus peuvent également se former directement dans la circulation lymphatique. En effet, une étude a démontré que l'activation plaquettaire induite lors d'une inflammation intestinale, provoquée par une injection de DSS dans un modèle murin, peut induire la migration des plaquettes sanguines jusqu'au système lymphatique pour inhiber le développement de ce dernier en inhibant la prolifération des cellules endothéliales et la lymphangiogenèse normalement induite par l'inflammation. La conséquence de ce processus réside en un déclin de la capacité de ce système lymphatique à réduire la formation des cellules inflammatoires, qui seront responsables d'une dégradation tissulaire [200]. Le rôle plaquettaire, d'un point de vue inflammatoire, lors de certaines MICI expérimentaux et humains a aussi été investigué. Tout d'abord, la numération plaquettaire semble être souvent augmentée après le diagnostic d'une MICI chez des patients [201-203]. A contrario, la présence des plaquettes réticulées est diminuée, reflétant ainsi un déficit dans la thrombopoïèse orchestrée par les mégacaryocytes, car ces plaquettes sont dites immatures et de novo [203]. L'état d'activation plaquettaire est lui aussi généralement augmenté suite au déclenchement de certaines pathologies inflammatoires intestinales. L'augmentation de ce paramètre est souvent mesurée par la quantification du CD62P membranaire aux plaquettes sanguines ou soluble [201, 204-207]. Le PF4 peut également être utilisé comme marqueur d'activité plaquettaire, ainsi ce paramètre a été positivement corrélé avec la manifestation d'une RCH chez des patients [208]. Cependant, la mesure du volume plaquettaire moyen, marqueur d'une activité plaquettaire importante [155], est plus souvent diminuée en lien avec les MICI chez l'homme [201-204, 209]. La diminution de ce volume plaquettaire moyen reste, à l'heure actuelle, incomprise, mais certains évoquent la possibilité d'une migration favorisée des plaquettes larges, dans le tissu enflammé, expliquant ainsi le faible volume des plaquettes circulantes [210]. Le niveau de cette activation plaquettaire peut aussi être évalué par la mesure de la production plaquettaire de sCD40L [206, 211-213], production principalement assurée par les plaquettes [89], ou de la thromboxane B2 (TxB2) [211]. La conséquence de cette activité plaquettaire excessive est une amplification de l'activation des leucocytes [214], de la communication cellulaire entre les plaquettes et les leucocytes [180, 206, 214-216], de l'expression de molécules d'adhésion à la surface de l'endothélium et de la sécrétion de molécules chimioattractives des neutrophiles [217], de la migration des leucocytes au niveau de la muqueuse intestinale [207] et enfin de la production de réactifs responsables de lésions tissulaires [214]. Finalement, le rôle immunomodulateur des plaquettes au sein des différentes pathologies inflammatoires intestinales mérite une investigation fondamentale plus approfondie comme, par exemple, l'utilisation de drogues antiplaquettaires, car, à l'heure actuelle, seule une étude, in vivo, a tenté de résoudre les complications liées au développement d'une MICI dans un modèle murin avec l'agent clopidogrel. On peut noter un effet protecteur de ce traitement face au développement de la RCH associé à la diminution de l'activité des neutrophiles [218]. IV Physiopathologie des MICI : le couple CD40/CD40L Parallèlement à l'activité des plaquettes, l'implication du CD40L, notamment plaquettaire, et de son récepteur le CD40 ont également été étudiés au cours de certaines MICI humains et expérimentaux. Dans un premier temps, l'expression du CD40 membranaire dans les tissus lésés [219, 220] et le CD40L à la surface des plaquettes [212] est sensiblement augmentée après manifestation d'une MICI chez l'homme. Cette même expression est élevée également dans le système vasculaire du côlon proximal et distal suite à l'induction d'une RCH expérimentale associée à l'administration de DSS. L'utilisation de souris déficiente en CD40 et CD40L démontre une protection contre le déclenchement de cette RCH, associée à une réduction de la production de MPO par les neutrophiles et l'interaction des plaquettes avec l'endothélium et les leucocytes, interaction plus dépendante du CD40L que du CD40 [180]. Le couple CD40/CD40L semble également avoir un impact direct sur les cellules endothéliales, dans le cadre des MICI diagnostiquées chez des patients ou au détours d'études in vitro, en limitant la production de VEGF, d'IL-8, du hepatocyte growth factor (HGF), ainsi que l'expression d'ICAM-1, de VCAM-1 et de l'angiogenèse [217, 220, 221]. En conclusion, Le recrutement des neutrophiles dans la zone enflammée, investigué grâce à des modèles expérimentaux ou observé chez des patients diagnostiqués pour une MICI, sera dépendant d'une mécanistique ciblant l'endothélium vasculaire et les plaquettes sanguines. Un recrutement non contrôlé des neutrophiles pourrait donc participer à l'amplification de la dégradation tissulaire, accentuée par une libération importante des ROS, d'enzymes et la formation de NET. Ces paramètres ont également été évoqués au sein de la physiopathologie de plusieurs modèles animaux du TRALI. Nous pouvons donc émettre l'hypothèse d'une atteinte multi-organes lors d'un TRALI, ciblant notamment l'intestin. Figure 7 : Pathophysiologie des MICI, d'après Neurath et al. [165] Suite à une infection bactérienne ciblant la zone intestinale, une première réponse sera établie dont le but est de lutter directement contre le pathogène. Cette réponse innée sera orchestrée par les macrophages et les neutrophiles. Par la suite, à plus long terme, le système adaptatif sera responsable de l'activité inflammatoire excessive dans l'intestin enflammé. Section 3 Les autres organes I Les reins D'autres organes peuvent également être sujets à des pathologies inflammatoires régulées par une mécanistique cellulaire présentant plusieurs points communs à celle observée au sein d'ALI expérimentaux. On peut, par exemple, citer l'insuffisance rénale aigu dont une inflammation excessive semble être l'une des causes principales de cette pathologie [222-224]. Ici, le mécanisme, induit expérimentalement, par exemple par ischémie-reperfusion, réside en une induction non contrôlée d'un état inflammatoire [225]. Un panel de médiateurs solubles sont produits lors de cette pathologie favorisant ainsi l'activation et l'attraction des cellules immunitaires et inflammatoires, on peut notamment citer l'IL-1, l'IL-6, le TNF-, le MIP-2 ou encore l'IL-8 [226-230]. L'augmentation de la production de composés pro-inflammatoires réside en un accroissement du recrutement, de l'activation et de l'infiltration des neutrophiles jusqu'aux reins enflammés, observé dans des modèles murins [231], mais également chez l'homme [232]. Cette mécanistique est régulée par l'expression de molécules d'adhésion à la surface de l'endothélium, comme ICAM-1 [233], et à la surface des leucocytes, comme LFA-1 [234]. La résultante finale de cette leucostase est une libération des ROS et de protéases au niveau rénal responsable de la dégradation tubulaire. Cela implique donc un rôle important des leucocytes et de l'endothélium dans l'induction et l'amplification de certaines insuffisances rénales aigus induites expérimentalement. Le rôle des plaquettes sanguines a également été investigué. L'état d'activation de ces cellules est sensiblement augmenté lors de l'induction de cette pathologie, dans différents modèles animaux résultants d'une ischémie-reperfusion ou d'une ligature-ponction caecale, caractérisé par une augmentation de l'expression du CD62P et de la procaspase activating compound-1 (PAC-1) membranaire. Cette activation permet l'augmentation de la communication des plaquettes avec les leucocytes, favorisant notamment la formation des NET ainsi que la migration des neutrophiles dans la zone lésée [235-237]. II Le foie Plusieurs pathologies inflammatoires peuvent cibler le foie. Pour investiguer la part inflammatoire de ces pathologies, plusieurs modèles animaux d'atteinte du foie ont été utilisés, tels qu'une lésion hépatique induite par ischémie-reperfusion, par endotoxémie et par toxicité à l'alcool, à l'acetaminophène et à l'-naphthyl-isothiocyanate [238], ainsi que suite à une cholestase obstructive [239]. L'un des principaux paramètres inflammatoires observé, grâce à ces différents modèles expérimentaux, lors d'une atteinte du foie est une infiltration des neutrophiles dans le parenchyme de ce tissu [240], notamment via l'expression de Mac-1 à la surface des neutrophiles [241]. Lors d'une lésion au niveau du foie, les cellules hépatiques peuvent sécréter un panel de cytokines et de chimiokines formant un gradient attractif accentuant la migration des neutrophiles dans ce tissu comme le MIP-2 [242-244], le KC [242, 244], la cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC) [243, 245], l'ENA-78 [246] et, hypothétiquement, MCP-1 jusqu'à l'ors décrit uniquement comme chimioattractant des monocytes [247] et des médiateurs solubles activateurs des neutrophiles, tels que le TNF- [243, 244, 248, 249] et l'IL-1 [244, 249]. La conséquence de cette activation réside en une amplification de la communication cellulaire, notamment entre les neutrophiles et l'endothélium vasculaire. En effet, l'expression de Mac-1 est sensiblement augmentée à la surface des neutrophiles [239, 241, 250-252], ainsi qu'ICAM-1 [250, 253-255] à la membrane des cellules endothéliales, particulièrement dans la zone sinusoïdale du foie. Finalement, la production des ROS par les neutrophiles ayant migré sera la résultante caractéristique de l'atteinte du foie et sa dégradation, par exemple lorsqu'elle est induite expérimentalement par ischémie-reperfusion [256]. Les plaquettes participent également à l'amélioration de l'infiltration des leucocytes, et donc des neutrophiles, lors de certaines atteintes inflammatoires du foie, mais principalement via une exacerbation de la communication avec l'endothélium sinusoïdal qui participera à une libération de facteurs attractif des leucocytes [257]. Dans un premier temps, une séquestration plaquettaire a été observée au niveau de l'endothélium sinusoïdal lors d'inductions expérimentales d'une hépatite virale [258-261]. Ces plaquettes fixées grâce à l'expression des intégrines GPIIb/IIIa et V3 va permettre la production de chimiokines attractantes des neutrophiles, par exemple IL-8 et MCP-1 [262]. L'inhibition plaquettaire par l'utilisation du clopidogrel semble protéger les souris d'une atteinte inflammatoire du foie induite par l'-naphthyl-isothiocyanate, caractérisée notamment par la diminution de l'infiltration des neutrophiles [263]. La migration des leucocytes, dans un modèle murin d'ischémie-reperfusion, est aussi altérée lors de l'inhibition plaquettaire par l'utilisation d'anticorps anti-GPIIb/IIIa, qui est une intégrine, récepteur du fibrinogène et du vWF, et d'anticorps anti-CD62P [264]. Ces phénomènes inflammatoires touchant ces différents organes sont semblables à ceux observés dans différents modèles expérimentaux d'ALI permettant ainsi d'émettre l'hypothèse d'un impact non exclusif aux poumons lors d'un TRALI mais probablement aussi des organes plus profonds, particulièrement le pancréas. Suite à la transfusion des composés sanguins pouvant induire un TRALI, nous émettons l'hypothèse que les poumons seraient la principale cible des anticorps anti-leucocytaires et BRM transfusés ainsi que des premières cellules circulantes activées par ces mêmes réactifs. Les organes plus profonds, tels que le pancréas, seraient donc une cible secondaire dont l'atteinte serait dépendante du pouvoir inflammatoire du second-hit du TRALI, la transfusion. Objectifs et problématique Actuellement, le TRALI est considéré comme l'une des pathologies transfusionnelles les plus critiques, notamment en termes de mortalité. En France, les TRALI dits immunologiques, provoqués par la présence d'anticorps anti-leucocytaires, tels que les anti-HLA de classe I et II ou les anti-HNA, dans les PSL, sont désormais assez bien prévenus. Cela est notamment dû aux différentes prédispositions prises dans les centres de transfusion consistant en un dépistage amélioré des anticorps anti-leucocytaires, à une régulation importante des donneurs exclusion des femmes ayant connues un épisode de grossesse récent et étant donc une source importante d'anticorps anti-HLA, aux changements des processus de préparation des différents PSL par exemple le remplacement d'une partie du plasma des concentrés plaquettaires par une solution de conservation plaquettaire additive, etc Cependant, la seconde catégorie, les TRALI dits non- immunologiques, notamment induis par transfusion de médiateurs solubles pro-inflammatoires, connaissent une croissance numérique non négligeable, malgré le changement de la politique transfusionnelle [265]. De plus, le sous-diagnostic des TRALI non-immunologiques, souvent considérés comme des SDRA, décroit l'occurrence de ces derniers. Mieux comprendre la physiopathologie du TRALI, qu'il soit immunologique ou non, permettrait, à l'avenir de prévenir entièrement son développement. Ces connaissances fondamentales et mécanistiques pourraient être extrapolées à d'autres pathologies inflammatoires, telles que l'ALI, les SDRA, les pathologies transfusionnelles inflammatoires, le sepsis, la pancréatite et autres. Au cours de cette thèse, nous émettons l'hypothèse que la fonction inflammatoire des plaquettes sanguines des concentrés plaquettaires ou au sein de l'organisme pourrait expliquer, en partie, le développement des TRALI non-immunologiques, en particulier suite aux transfusions des concentrés plaquettaires, mais également, partiellement, la sévérité des TRALI immunologiques. Pour répondre à cette hypothèse nous avons abordé cette problématique selon plusieurs points de vue (figure 8) : i) qu'elle est le réel impact inflammatoire des productions des concentrés plaquettaires sur le devenir de l'intégrité vasculaire, paramètre clé lors du développement du TRALI ? ii) Qu'elle est la place des plaquettes sanguines de l'organisme dans l'induction, le maintien et/ou la régulation de l'inflammation, d'un point de vue général ? iii) et contextualisé dans un modèle murin du TRALI ? iv) qu'elle est l'influence du couple CD40/CD40L, dont le rôle du sCD40L, produit majoritairement par les plaquettes, est agoniste de la forme membranaire, sur la sévérité du TRALI induit immunologiquement dans un modèle murin ? v) et enfin, la place de ce même couple protéique sur l'atteinte multi-organes, si elle existe, lors d'un TRALI ? Figure 8 : Développement de la thèse Résultats Manuscrit I : Modélisation de l'effet des surnageants de concentrés plaquettaires sur les cellules endothéliales : focus sur Endocan/ESM-1 Modeling the effect of platelet concentrate supernatants on endothelial cells : focus on Endocan/ESM-1 Article sous presse dans Transfusion Endocan est une glycoprotéine exprimée par l'endothélium vasculaire dont le rôle est de maintenir l'intégrité de la paroi vasculaire et en assurer son imperméabilité face aux composés sanguins. Après libération, endocan peut se fixer aux récepteurs leucocytaires des globules blancs préalablement adhérés aux cellules endothéliales par le complexe LFA-1/ICAM-1, limitant ainsi leur transmigration à travers la barrière endothéliale (Figure 9) [266]. Lors de certaines réactions inflammatoires, cet endothélium vasculaire peut être lésé et, par le relâchement de ces jonctions serrées, permettre une leucostase améliorée [59, 60]. La libération d'encodan est donc augmentée dans le but de contrer l'atteinte de l'endothélium vasculaire. Figure 9 : Influence d'endocan sur la transmigration leucocytaire Endocan est produit par les cellules endothéliales. Son rôle est de maintenir l'intégrité de la paroi vasculaire. Ainsi, endocan limite l'infiltration des leucocytes dans le tissu adjacent. Son influence peut être limitée de deux principales manières ; soit par une production limitée de la part des cellules endothéliales, soit par l'action de la cathepsine G, produite par les neutrophiles, capable de cliver endocan en plusieurs fragments et inhibant sa fonction première. Au cours de ce travail de thèse, le but était de mettre en évidence l'influence inflammatoire des composés présents dans les milieux de conservation des concentrés plaquettaires associés au développement de réactions transfusionnelles sur l'endothélium vasculaire et d'évaluer la libération d'endocan depuis ce dernier. Nous avons pu observer une exacerbation de l'état inflammatoire des cellules endothéliales caractérisé par une libération plus importante de médiateurs solubles comme IL-6, mais également endocan, lorsque ces cellules sont stimulées avec des surnageants de CP liés à des réactions transfusionnelles par rapport à des surnageants de CP sans lien pathologique avec le receveur. Cette production endothéliale est corrélée avec une prolifération cellulaire réduite et une apoptose plus accrue. Ainsi, comme pour d'autres pathologies inflammatoires, nous pourrions envisager la mesure de la concentration plasmatique d'endocan comme un marqueur précoce de la lésion inflammatoire de l'endothélium et donc de réactions transfusionnelles inflammatoires. Modelling the effect of platelet concentrate supernatants on endothelial cells : focus on Endocan/ESM- Sofiane Tariket1, 2, Caroline Sut1, 2, Charles-Antoine Arthaud1, Marie-Ange Eyraud1, Astrid Meneveaux1, Sandrine Laradi1, 2, Hind Hamzeh-Cognasse2, Olivier Garraud2, 3, Fabrice Cognasse1, 2 Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes, Saint-Etienne, France Université de Lyon, GIMAP-EA3064, Saint Etienne, France Institut National de la Transfusion Sanguine (INTS), Paris, France *Address for correspondence and reprint requests : Dr. Fabrice Cognasse, PhD, Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes and GIMAP-EA 3064, Université de Saint-Etienne. Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes, 25 Boulevard Pasteur, 42100 Saint-Etienne. Telephone : 33 (0) 683975883 ; Fax : 33 (0) 477421486 ; E-mail : fabrice. cognasse@efs. sante. fr Keywords : platelets ; ESM-1/Endocan ; inflammation ; transfusion ; serious adverse events Running title : Platelets and inflammation The authors declare that they have no conflict of interest. Word count : 1682 ; Abstract : 243 ; References : 25 ; Figures : 3 ; Tables : 0 Abstract Background : Platelets are prone to activation and the release of Biological Response Modifiers (BRMs) under storage conditions. The transfusion inflammatory reaction in the vascular compartment involves endothelial cell activation due to cell-cell interactions and BRMs infused with the blood products. ESM-1/Endocan is a proteoglycan secreted by endothelial cells under the control of proinflammatory cytokines. Objectives : We aimed to measure Endocan activity in supernatants of platelet components (PCs), implicated in Serious Adverse Reactions (SARs) or not (no. AR), sampled at different stages during storage. Materials and Methods : Platelet function, by quantification of soluble CD62P, and their ability to produce endocan were assessed. Functional testing of PC supernatants was performed on EA. hy926 endothelial cells in vitro by exposing them to PC supernatants from each group (no. AR or SARs) ; EA. hy926 activation was evaluated by their production of IL-6 and Endocan. Results : Platelet endocan secretion was not induced in response to platelet surface molecule agonists, and no significant correlation was observed between sCD62P and endocan concentration after platelet activation. However, we observed a significant increase in the secretion of IL-6 and endocan following EA. hy926 activation by all PC supernatants. IL-6 and endocan secretion were significantly higher for cells stimulated with SAR than those stimulated with no. AR PC supernatants, as well as cell apoptosis. Conclusion : The correlation between the secretion of endocan and that of IL-6 by endothelial cells suggests that endocan can be used as a predictive marker of inflammation for the quality assessment of transfusion grade platelets. Introduction Endocan (also known as endothelial cell-specific molecule-1, ESM-1) is involved in the pathophysiology of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, cancer, cardiovascular disease, hypertension, chronic kidney disease, and sepsis. 1-9 It is a proteoglycan involved in cell adhesion, migration, proliferation, and neovascularization2 and is released by damaged vascular endothelium in response to inflammatory cytokines and pro-angiogenic stimuli. Endocan expression appears to be pro-inflammatory, in association with VEGF or TNF-. 8, 10-12 These properties led us to explore whether there is a possible link between endocan expression and inflammatory platelet components (PCs), as PCs are frequently associated with inflammatory responses in patients. 13 Biological response modifiers (BRMs), secreted by platelets in PCs during storage, play a role in serious adverse events (SARs) associated with transfusion. Previous reports have shown that transfusion inflammatory reactions in the vascular compartment involves endothelial cell activation and BRMs present in the blood products, particularly those present in platelet components. 14 Identification of variations in the levels of BRM in PCs during the process of preparation and/or storage is therefore seminal to avoid or, at least, limit occurrences of transfusion associated SARs. Investigation of endothelial cell physiology upon exposure to various PC supernatants should aid our understanding of the pathophysiological mechanisms of endothelial cell activation during transfusion associated SARs. Here, we aimed to decipher the state of endothelial activation in vitro, focusing on the secretion of IL-6 and endocan upon exposure to PC supernatants sampled at various times during storage (up to five days), that were or were not involved in transfusion-associated SARs. Methods Platelet component preparation PCs were collected from either single donor by apheresis (SDA) or from whole blood. SDA platelets were collected on cell separators using citrate dextrose-A with Trima Accel (Gambro BCT, Lakewood, CO, USA) or MCS (Haemonetics, Braintree, MA, USA). All PCs were automatically resuspended in 35% autologous donor plasma and 65% platelet additive solution (PAS-C ; InterSol, Fenwal, la Châtre, France ; or SSP1TM ; MacoPharma, Mouveaux, France). 13 Whole blood PCs were prepared as pooled buffy coats from five whole blood collections, using the Optipress device with top and bottom separation (Baxter Healthcare Corporation, La Chatre, France) and platelet additive solution (i. e. , PAS-C ; Fenwal, La Châtre, France ; or PAS-E ; MacoPharma, Mouveaux, France) with a mean range of 35% residual plasma. Pooled PCs were leukoreduced by filtration. 15 PCs were stored at 22C 2C with gentle rotation and shaking on a flat agitator (60 rpm) for a maximum of 5 days (after collection was completed) before being issued for transfusion. PC supernatants were collected after centrifugation (1, 500 rpm ; 10 min) and stored as frozen stocks in aliquots at 80C. We collected 55% of the supernatants, tested in the present study, from apheresis PCs and 45% from buffy coats. Transfusions were conducted as part of routine care in nearby university clinics ; clinic physicians report SARs according to French regulations and laws, ascribing SARs to a pathological category, such as allergic transfusion reaction (ATR), febrile non-haemolytic transfusion reaction (FNHTR), acute haemolytic transfusion reactions (AHTR), etc. 16 Among the PCs associated with SARs, 63% were associated with FNHTRs, 26% with AHTR, and 11% with ATR. Upon occurrence of SAR, clinics agreed to provide a platelet component sample if some was leftover, as part of a collaborative research program. For this study, PC supernatant from clinical transfusions where no adverse reaction was experienced (No. AR), stored for the same period of time and harvested using the same collection processor, were selected to match each reported SAR sample. Platelet stimulation Platelet endocan secretion was tested on Platelet-rich plasma (PRP). Peripheral blood was collected from healthy donors in endotoxin-free 3. 2% sodium citrate tubes (Vacutainer, Becton-Dickinson, San Jose, CA). PRP was prepared by centrifuging the blood at 1, 500 rpm for 10 min at room temperature. PRP samples were separated and then stimulated with thrombin receptor stimulating peptide (TRAP ; 5 g/ml) or collagen (20 g/ml) (Sigma Aldrich, Saint-Louis). PRP supernatants were collected after centrifugation (1, 500 rpm ; 10 min) and stored as frozen stocks in aliquots at 80C. Platelet membrane protein expression was analysed through flow cytometry after stimulation. Platelets were recognized using FITC-anti-CD41 mAb and membrane CD62P expression was measured using APC-anti-CD62P mAb (BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA). Soluble endocan (Lunginnov, Lille, France) and soluble CD62P (R&D systems, Lille, France) were quantified in PRP supernatants by ELISA, according to the manufacturer's instructions. Absorbance at 450 nm was determined with an ELISA reader (Tecan, Mnnedorf, Switzerland). EA. hy926 endothelial cells preparation Functional testing of cell supernatants on EA. hy926 immortalized endothelial cell lines is a commonly used in vitro model for endothelium studies of various processes connected with its functions17. The human endothelial hybrid cell line EA. hy926 was obtained by fusion of primary umbilical vein endothelial cells with the human lung carcinoma cell line A459/8 (ATCC #CRL-2922). EA. hy926 cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) High Glucose containing 10% foetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin, 1% non-essential amino acids, and 0. 1% ciprofloxacin (Sigma-Aldrich, Saint- Louis) and then incubated at 37C in a humidified atmosphere in 5% CO2 until the cell monolayer reached confluence. Functional testing of PC supernatants on EA. hy926 endothelial cells The cells were exposed to PC supernatants from each group (no. AR or SARs) for 1, 6 or 24h. Neutral medium was used as a negative control. EA. hy926-cell proliferation was evaluated under PC supernatant stimulation, using an MTT Cell Proliferation Assay kit (ATCC, Manassas, USA). Briefly, after EA. hy926-cell stimulation, MTT reagent was added in each well and incubated for 3 hours. Next, detergent reagent was added in each well for 2 hours. Finally, absorbance was read at 570 nm. Evaluation of cell proliferation was deduced from blank wells. Flow cytometry process was used to evaluate ICAM-1 expression and death cell under PC supernatant stimulation. After stimulation, cells were incubated with FITC-anti- CD105 mAb, PE-anti-ICAM-1 mAb and 7AAD reagent. Finally, EA. hy926-cell activation was evaluated to test for secretion of IL-6 and endocan. 18 Soluble endocan (Lunginnov, Lille, France) and IL-6 (R&D systems, Lille, France) were quantified in EA. hy926 and PC supernatants by ELISA, according to the manufacturer's instructions. Absorbance at 450 nm was determined with an ELISA reader (Tecan, Mnnedorf, Switzerland). Statistical tests Statistical analyses were performed using GraphPad Prism 5 software (Graph ad, La Jolla, USA). One way ANOVA test and Bonferroni post-hoc test were used when Kolmogorov-Smirnov normality test passed. Kruskal-Wallis test and the Dunn's post-hoc test were used when Kolmogorov-Smirnov normality test failed. Correlations were assessed using Spearman's test. P-values were considered to be significant when < 0. 05 for all tests : * < 0. 05 ; * < 0. 01 ; * < 0. 001. Results Platelet activation does not induce endocan release We determined whether normal platelets can release endocan (and sCD62P as a control) following 30- min of stimulation with TRAP or collagen, the canonical agonists of platelet surface molecule engagement. TRAP or collagen platelet activation resulted in a 1. 5 and 1. 3-fold increase in sCD62P levels, respectively (respectively, p < 0. 001 and p < 0. 05) (Fig. 1A). There was no significant endocan release after activation of platelets by TRAP or collagen, relative to baseline levels (Fig. 1B). There was also no significant correlation between sCD62P and endocan concentrations after platelet activation (Fig. 1C). Thus, endocan secretion was not induced in platelets in response to agonists, suggesting that it is not stored inside platelet granules. Endothelial cells proliferation and activation under supernatants from PCs (no. AR or SAR) Firstly, EA. hy926 cell proliferation was evaluated after 1, 6 and 24 hours upon PC supernatant stimulation. From 1 hour to 24 hours, there was a moderate decrease in EA. hy926 cell viability and proliferation though still significantly higher under no. AR PC versus SAP PC supernatant stimulation (Fig. 2A). To confirm the reduction in cell proliferation, we then evaluated cell apoptotic state, in the same conditions. The rate of 7AAD positive cells, representing cell death, was greatly increased after 6 hours of PC supernatant stimulation. Nevertheless, such results evoked a more significant apoptotic induction of EA. hy926 cells at 24 hours under SAR PC supernatant stimulation than within the no. AR group (Fig. 2B). Cell proliferation and cell death were significantly and negatively correlated for each sample (Fig. 2D). Finally, ICAM-1 expression increases from 1 hour to 24 hours of stimulation. However, no difference was noted between no. AR and SAR PC supernatant stimulation (Fig. 2E). Bioactivity of supernatants from PCs (no. AR or SAR) on endothelial cells and endocan release We next assessed the bioactivity of supernatants from PCs associated, or not, with SARs using the human endothelial hybrid cell line EA. hy926. IL-6 is a classical activation marker of endothelial cells ; 18 Endocan has never been investigated as an endothelial cell activation marker nor been found to be associated with SARs. IL-6 (Fig. 3A) and endocan (Fig. 3B) secretion were significantly higher for EA. hy926 cells stimulated with SAR than those stimulated with the no. AR PC supernatants. This was true for cells stimulated for 6 or 24 h for IL-6, and 24 h for endocan. 19 Incubation of EA. hy926 cells with PC supernatants for 24 h induced a 1. 97 and 3. 24-fold increase in IL-6 levels (Fig. 3A) and an 8. 6 and 10. 04- fold increase in endocan levels (Fig. 3B) for the no. AR and SAR supernatants, respectively. We, next, investigated the bioactivity of the no. AR and SAR PC supernatants aged 03 [0-3[ or 3-5 [3-5] days on EA. hy926 cells by measuring IL-6 and endocan secretion after 6 or 24 h exposure to the supernatant. IL-6 (Fig. 3C, D) and endocan (Fig. 3E, F) secretion were significantly higher for cells stimulated with SAR than those stimulated with the no. AR PC supernatants, regardless of the time in storage. Nevertheless, no difference was observed depending on SAR type (supplemental data). There was a significant correlation between IL-6 and endocan secretion after 6 (Fig. 3G) and 24 h (Fig. 3H) of EA. hy926 cell activation. This correlation was higher after 24 h than 6 h (r 0. 3064 vs. 0. 2444, respectively). Discussion Several BRMs, including cytokines, chemokines, mitochondrial DNA, and soluble glycoproteins, increase during the storage of PCs and are associated with SARs. 13, 20-25 However, the mechanisms by which platelet transfusions induce SARs are complex and not completely understood. We used an in vitro model of endothelial cell stimulation to evaluate the participation of endocan secretion in inflammatory transfusion reactions. The main finding was the influence of supernatants from PCs associated with SARs on endocan secretion. We firstly showed that SAR implicated-PCs affected more significantly the endothelial cell proliferation and viability than the no. AR PC supernatants (Fig 2A, B, C and D). Nevertheless, endothelial cell activation seemed to be higher after the SAR PC supernatant stimulation, as evidenced by IL-6 enhance production (Fig. 3A, C and D) ; however ICAM-1 expression remain unaffected (Fig. 2E). Endocan secretion by endothelial cells significantly correlated with stimulation. 9 SAR PC supernatants induced the secretion of significantly higher levels of endocan than no. AR PC supernatants. We also observed this difference regardless of storage time. These results are in agreement with studies of various inflammatory disorders. 4, 6, 9, 26 Furthermore, LPS injection of human volunteers has been shown to increase the level of endocan after 2 hours. 1 Endocan secretion has also been positively correlated with the secretion of other pro-inflammatory cytokines, such as TNF- and IL-1. 26 Endocan is a soluble proteoglycan that is secreted by endothelial cells in response to proinflammatory cytokines, LPS, or angiogenic factors. 9 Although the role of endocan has not been completely elucidated, several reports have shown that an increase in the production of proinflammatory cytokines by endothelial cells enhances microvascular permeability and modulates leukocyte migration. 5, 27 In a mouse model, endocan drives leukocyte extravasation similar to that observed for certain acute respiratory distress syndromes, such as TRALI. 12 Several studies suggest that endocan levels can predict pathologies such as ARDS, 3, 4 sepsis, 9 and cancer. 8, 28, 29 Supernatants from PCs that led to SARs in patients display pro-inflammatory profiles that can promote endocan and IL-6 secretion by endothelial cells. IL-6 is a proinflammatory marker of endothelial cell activation. However, this inflammatory change seems to be associated with a reduction in cell viability and an increase in cell death rather than proliferation functions. This data are in keeping with findings in TRALI, i. e. , an increase vascular permeability due to inflammation driven by several mechanisms, 30 of which BRMs, or bacterial moieties, or pathogenic antibodies, or combinations of the above. The correlation between the secretion of endocan and that of IL-6 by endothelial cells suggests that endocan can be used, along with other inflammatory cytokines, as a marker of inflammation, in particular transfusion-associated inflammation. It is likely that the association between endocan and SARs is mediated through endothelial dysfunction. Future studies are required to investigate the direct relationship between endocan and endothelial function. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge the blood donors. We would like to thank the medical staff and personnel of the Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhone-Alpes, Saint-Etienne, France for their technical support throughout our studies. This work was supported by grants from the French National Blood Service EFS (Grant APR), France ; the Association for Research in Transfusion (ART), Paris, France ; the Agence Nationale de la Sécurité et du Médicament et des produits de santé (ANSM - AAP-2012-011, Reference 2012S055) ; and the Association Les Amis de Rémi Savigneux, France. Authors' contributions ST, CS, CAA, MAE, and AM performed the experiments and analysed the data. ST, SL, HHC, OG, and FC conceived and designed the experiments, analysed the data and wrote the paper. All authors read and approved the final manuscript. References 1. Cox LA, van Eijk LT, Ramakers BP, Dorresteijn MJ, Gerretsen J, Kox M, Pickkers P. 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Tariket S, Sut C, Hamzeh-Cognasse H, Laradi S, Pozzetto B, Garraud O, Cognasse F. Transfusion- related acute lung injury : transfusion, platelets and biological response modifiers. Expert Rev Hematol 2016 : 1-12. Figure 1 : sCD62P and endocan secretion following platelet stimulation Membrane CD62P on platelet and sCD62P production in platelet-rich plasma (PRP) supernatants were respectively determined by flow cytometry and ELISA assay (A). The quantity of endocan in PRP supernatants was determined by ELISA assay (B). Correlation between the mean of sCD62P and endocan secretion following stimulation was evaluated (C). Data are presented as the mean (n 8). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 ; and *p < 0. 001 represent the difference relative to the unstimulated group. Figure 2 : Endothelial cell activation and proliferation under PC supernatant stimulation EA. hy926 cell proliferation, using MTT Cell Proliferation Assay (A), and EA. hy926 cell apoptosis, using 7AAD DNA fluorescent intercalant (B), were evaluated. 7AAD fluorescence was presented under flow cytometry histogram (C). Correlation between cell proliferation fold increase and 7AAD positive cells was statistically measured for each sample (n 237) (D). ICAM-1 expression on EA. hy926 cell membrane was evaluated, using flow cytometry analysis (E). Data are presented as the mean. Groups were separated into SAR (n 19) and no. AR (n 60). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 ; and *p < 0. 001 represent the difference between no. AR and SAR groups. Figure 3 : Secretion of IL-6 and endocan by endothelial cells following stimulation with PC supernatants The quantity of IL-6 (A, C and D) and endocan (B, E and F) in endothelial cell medium of culture was determined by ELISA assay. Groups were first separated into SAR (n 19) and no. AR (n 57) (A and B). Groups were then formed according to whether or not they were associates with SARs and storage time (C, D, E and F) ; SARs ([0-3[, n 5 ; [3-5], n 14) or no. AR ([0-3[, n 37 ; [3-5], n 20). Correlation between IL-6 and endocan secretion for each sample after 6 (G) or 24 h of stimulation (H) (n 76). Data are presented as the mean of fold increase values (A, B, C, D, E and F) and as the direct value of fold increase (G and H). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent the difference relative to no. AR group. Fig 1. B C Fig 2. A B D E Fig 3. A B C D E F G H Supplemental table 1 : Secretion of IL-6 and endocan by endothelial cells following stimulation with SAR type-associated PC supernatants The table represents IL-6 and endocan fold increase expression determined by ELISA assay. Groups were split depending of SAR type, No. AR (n 57), FNHTR (n 12), AHTR (n 5) and ATR (n 2). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent the difference relative to the No. AR group. IL-6 (fold increase) Endocan (fold increase) 1 hour 6 hours 24 hours 1 hour 6 hours 24 hours No. AR 0, 49 0, 06 0, 48 0, 04 1, 60 0, 10 0, 78 0, 02 1, 68 0, 05 8, 46 0, 15 (n 57) FNHTR 0, 35 0, 14 1, 59 0, 24 * 3, 165 0, 22 * 0, 88 0, 04 2, 05 0, 19 9, 97 0, 23 * (n 12) AHTR 0, 54 0, 41 1, 44 0, 25 * 3, 46 0, 65 * 1, 03 0, 08 1, 87 0, 19 10, 16 0, 34 * (n 5) ATR 1, 5 0, 90 1, 35 0, 15 3, 04 0, 47 0, 94 0, 08 2, 07 0, 66 10, 18 0, 16 (n 2) Manuscrit II : La déficience plaquettaire en granules- change la réponse inflammatoire induite par l'injection systémique de lipopolysaccharide chez les souris Platelet -granule deficiency changes the inflammatory response induced under systemic lipopolysaccharide injection in mice Article soumis dans Journal of Thrombosis and Haemostasis Lors de l'inflammation, les plaquettes sanguines ont la capacité de produire une multitude de médiateurs solubles dont le rôle peut être pro-thrombotique, régulateur de l'activité des cellules voisines, mais également pro-inflammatoire. Ces produits de sécrétion sont stockés dans les granules plaquettaires qui existent sous 3 types, les lysosomes, les granules- et les granules-. La majorité des médiateurs solubles plaquettaires composent les granules- [267]. Dans ce travail de thèse, nous avons investigué la place des sécrétions plaquettaires dans le maintien, l'amplification et la régulation de l'inflammation en utilisant un modèle de souris Nbeal2 déficientes. Le processus d'extravasion des granules- repose sur une mécanistique très complexe. Lors de l'activation plaquettaire, la formation de la phospholipase C induit le clivage de la phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate (PIP2) en inositol-1, 4, 5-trisphosphate (IP3) et diacylglycérol (DAG), ce qui va amplifier le signal calcium (Ca ) dépendent [268]. C'est alors que se met en place l'exocytose vésiculaire plaquettaire sous linfluence d'une mécanistique moléculaire complexe : A l'état quiescent, la protéine Sec1 est complexée avec la syntaxine-4, exprimée sur la membrane plaquettaire, inhibant ainsi l'interaction entre les Soluble N- éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor (SNARE) vésiculaires et membranaires. Sous stimulation, se met alors en place l'amarrage, première étape de l'exocytose. Les vSNARE vésiculaires et les tSNARE membranaires entrent en fusion. C'est plus précisément VAMP-8 à la surface de la vésicule qui se lie au SNAP-23 membranaire. La dernière étape, aussi appelée la fusion, repose sur la séparation de la protéine Sec1 et la syntaxine-4, préalablement complexées, qui permet alors le renforcement de l'interaction entre la vesicle-associated membrane protein-8 (VAMP-8) et la synaptosomal-associated protein-23 (SNAP-23) et ainsi la fusion finale de la vésicule plaquettaire avec sa membrane [269]. La place du gène Nbeal2, dans cette mécanistique, permet de faire l'intermédiaire entre le signal ON , dépendant de PIP2 et IP3, et la fusion des vésicules à la membrane, dépendante des SNARE (Figure 10). La protéine neurobeachin-like protein 2, ou NBEAL2, est composée d'une multitude de domaines glycoprotéiques comme les Beige and Cheadiak-Higashi (BEACH) et des répétitions en - transducine (WD40), qui sont des domaines de la famille des lectines, et plus précisément des concanavaline A (ConA), dont le rôle est de recruter les protéines à la membrane cellulaire, telles que les SNARE [270]. En induisant une déficience du gène Nbeal2 chez des souris C57BL6, nous avons pu prévenir la fusion des granules- avec la membrane plaquettaire et donc la libération de ses composées granulaires. La biogenèse des granules- était également impactée. La réponse inflammatoire, suite à une injection systémique de LPS, présentait un profil différent, lorsqu'il était comparé à celui des souris sauvage. En effet, l'aspect anti-inflammatoire semble prépondérant lorsque les souris présentent des plaquettes circulantes déficientes en production granulaire-. Figure 10 : Implication de la protéine NBEAL2 dans le processus d'exocytose des granules- plaquettaires Sous stimulus, après liaison du ligand à son récepteur plaquettaire, une cascade d'activation se met en place. La phospholipase C permet la conversion de la PIP2 en IP3 et DAG, ce qui va permettre l'instauration d'un signal d'activation Ca dépendant. Ce processus induira la biogenèse et le transport des granules- jusqu'à la membrane plaquettaire. Cette étape est alors régie par une mécanistique dépendante de la protéine NBEAL2 dont le rôle est d'attirer les granules plaquettaires jusqu'à la membrane dépendamment des SNARE vésiculaires et membranaires. Platelet -Granules Modulate the Inflammatory Response Under Systemic LPS Injection in Mice Tariket, S. 1, 2, Guerrero, J. A. 3, 4, Garraud, O. 1, 5, Ghevaert, C 3, 5, Cognasse, F. 1, 2 Université de Lyon, GIMAP-EA3064, Saint-Etienne, France Établissement Français du Sang Rhône-Alpes-Auvergne, Saint-Etienne, France Department of Haematology, University of Cambridge and NHS Blood and Transplant, Long Road, Cambridge, CB2 0PT, UK National Health Service Blood and Transplant, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, UK. Institut National de la Transfusion Sanguine, Paris, France *Address for correspondence and reprint requests : Dr. Fabrice Cognasse, Etablissement Français du Sang, Auvergne-Rhône-Alpes & Université de Lyon, GIMAP-EA3064, Faculté de Médecine, 10 rue de la Marandière - 42270 St Priest en Jarez, France. Tel. : 33 4 77 42 14 67 ; Fax : 33 4 77 42 14 86 ; E-mail address : fabrice. cognasse@univ-st-etienne. fr Running Title : Platelet inflammation Key words : Platelets, Inflammation, NBEAL2, Soluble mediators, CD40L Word count : 1760 ; Abstract : 150 ; References : 28 ; Figures : 3 ; Tables : 1 Abstract Beyond their role in haemostasis and thrombosis, platelets are also important mediators of inflammation by the release of hundreds of factors stored in their -granules. Mutations in Nbeal2 cause gray platelet syndrome (GPS) characterised by the lack of platelet -granules. This study aims to evaluate the immunological (pro-inflammatory) effects of platelet -granules using Nbeal2-/- mice, the mouse model of GPS. Systemic inflammation was induced by intravenous injection of lipopolysaccharide (LPS). The lack of Nbeal2 significantly reduced the recruitment of circulating neutrophils and monocytes. The control of inflammation, evaluated by the production of anti- inflammatory cytokines, appeared to be greater in Nbeal2-/- mice compared with controls. Conversely, the production of certain inflammatory-soluble mediators known to characterize normal platelet secretion, such as sCD40L, was decreased under experimental inflammation in Nbeal2-/- mice. These results show that -granules play a direct role in platelet-mediated inflammation balance, confirming the need to further investigate platelet-associated inflammatory pathophysiology. Introduction Platelets are anucleated secretory cells that circulate in blood and are mostly characterised by their role in haemostasis and thrombosis [1]. However, platelets have also been recognised as mediators of inflammation and immunity [2]. Platelets and their progenitors, megakaryocytes (MKs), express surface receptors that can initiate/propagate inflammatory responses such as Toll-like receptor- 4 (TLR-4), TLR-2 and TLR-9 [3] and numerous cytokine and chemokine receptors that are essential in cell migration and communication [4]. Platelets also display sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin (Siglec) receptors and specifically Siglec-7, which play a key role in immunity [5]. Platelets contain three main types of granules, including -granules, -granules and lysosomes whose contents are differentially released upon activation *6 . Of the three types, the -granules are the most abundant, containing hundreds of proteins with diverse biological roles, including inflammation [7]. Therefore, the role of platelets in inflammation is not limited to the expression of the multiple aforementioned receptors that primarily sense pathogens, relying also on inflammatory soluble factors stored in the -granules and released upon secretion [8], such as CD62P, CD40L, platelet factor 4 (PF4), MIP-1, RANTES and IL-1. The majority of soluble factors stored in -granules are proinflammatory [9], however, many studies also suggest platelets have an anti-inflammatory role. Indeed, higher levels of tumour necrosis factor- (TNF-), IL-6 and interferon- (IFN-) have been observed in sera and plasma in the absence of platelets [10-12]. Furthermore, platelets can regulate the inflammatory response of blood neutrophils by influencing the expression of macrophage receptor-1 (Mac-1) on their surface, notably through platelet integrin GPIb-IX exposure [12]. The balance between the pro- and anti-inflammatory factors stored in the -granules and the platelet response through the TLR and chemokine receptors should thus determine the overall role of platelets in inflammation. Gray platelet syndrome (GPS) is a rare platelet bleeding disorder caused by loss of function mutations in NBEAL2 and characterised by a low platelet count, a lack of platelet -granules and early myelofibrosis. Deletion of its murine ortholog, Nbeal2, recapitulates all major features of GPS. Mouse Nbeal2-/- platelets have a significant decrease, or an almost complete absence, in -granule proteins such as PF4, vWF and P-selectin [13-15] with a potential imbalance of inflammation. In fact, Nbeal2-/- mice have increased susceptibility to bacterial and viral infection [16]. The objective was therefore to investigate the effect of platelet -granule content on the amplification or down- regulation of LPS-induced systemic inflammation in Nbeal2-/- mice, to reveal the pro- and anti- inflammatory balance. Material and methods Mice Adult, male, C57BL6 mice between 8 and 13 weeks old were used. For each experiment, a minimum of 6 mice were used. The mice were randomly distributed into different groups (PBS wild type [WT] vs. LPS WT vs. PBS Nbeal2-/- vs. LPS Nbeal2-/-). This research was performed under the Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Amendment Regulations 2012, following an ethical review by the University of Cambridge Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB). LPS Challenge Mice were intravenously (i. v. ) injected with LPS extracted from Escherichia coli (0111) (Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA) used at 10 mg/kg, or with PBS (control). Mice were monitored for 5 hours. The surviving mice were then euthanized in a carbon dioxide chamber and blood was collected in acid citrate-dextrose (ACD) (Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA). Cell Counting Blood was collected in ACD solution. Full blood counts were measured using a scil Vet abc instrument (scil Vet abc, Montpellier, France). Plasma was obtained by centrifugation and frozen at - 80C until used. Inflammatory Soluble Factors and Platelet Biological Response Modifiers Immunoassay The mouse biological response modifier (BRM) magnetic 16-plex kit (IL-1, bFGF, IL-10, IL-13, IL-6, IL- 12, IL-17, GM-CSF, IL-5, IL-1, IFN-, TNF-, IL-2, IP-10, MIG and IL-4) (ThermoFisher, Waltham, USA), magnetic 5-plex kit (KC, MCP-1, MIP-1, RANTES and VEGF) and magnetic simplex kit (sCD40L) (Merck Millipore, Billerica, USA) were used according to the manufacturers' instructions. The reading was taken through the Luminex 200TM (Luminex, Austin, USA). Statistical Tests Statistical analyses were performed using GraphPad Prism 5 software (GraphPad, San Diego, USA). P- values were calculated using a 2-tailed unpaired T test, a one-way ANOVA and a Bonferroni post-hoc test when the Kolmogorov-Smirnov normality test was passed. P-values were calculated using a 2- tailed Mann-Whitney test, a Kruskal-Wallis test, a one-way ANOVA and Dunn's post-hoc test when the Kolmogorov-Smirnov normality test failed. A p-value was considered significant when it was < 0. 05 for all tests. Using *, and # < 0. 05 ; *, and # < 0. 01 ; *, and # < 0. 001 symbols. Results and Discussion Inflammatory Cell Recruitment Changes Dependent upon NBEAL2 Protein Expression Firstly, the circulating cell count revealed a significant 3- and 4- fold increase in the neutrophil and monocyte counts respectively, in Nbeal2-/- mice compared with control mice. The effect of LPS intravenous injection was then assessed demonstrating that LPS injection significantly increased the number of monocytes and reduced the number of platelets and circulating lymphocytes in both WT and Nbeal2-/- mice. Reciprocally, the number of neutrophils significantly increased in WT mice after LPS injection, but not in Nbeal2-/- mice (Figure 1, A). The fold change of the cell populations before and after LPS injection revealed a significant increase in the neutrophil and monocyte counts in control animals compared with Nbeal2-/- mice (Figure 1, B). These results show that Nbeal2-/- mice mobilise leukocytes (neutrophils and monocytes) less efficiently than WT mice following LPS-induced systemic inflammation. A likely explanation for this is that Nbeal2-/- mice have a limited capacity for secreting pro-inflammatory mediators capable of synergising at the systemic level. Indeed, it has already been shown that platelets, by the release of a multitude of soluble mediators contained in the -granules, play an essential role in attracting and capturing leukocytes [9]. An Anti-Inflammatory Pattern is Revealed in Nbeal2-/- Mice after LPS Injection The purpose was to evaluate the influence of platelet secretion on inflammation evaluated through cytokine/chemokine production from inflammatory cells. The concentrations of 15 cytokines/chemokines were therefore measured with pro- and anti-inflammatory function, in WT and Nbeal2-/- mice challenged systematically by LPS. Under the baseline condition (i. e. , PBS injection), levels of IL-10, an anti-inflammatory BRM [17], were only higher in WT mice compared with Nbeal2-/- mice. Systemic LPS injection induced a significant increase in 10 pro-inflammatory soluble factors in both WT and Nbeal2-/- mice, including IL-6, IL-12, GM-CSF, IL-5, IL-1, IFN-, TNF-, IL-2, IP-10 and MIG. Only the level of IL-17 was significantly higher in Nbeal2-/- mice than in control mice under LPS- induced inflammation. With regard to anti-inflammatory BRMs (IL-10 [17], IL-13 and IL-4 [18-20]), higher levels were only observed in Nbeal2-/- mice after LPS systemic injection (Figure 2, A and Table 1), which correlated with their fold-increase (Figure 2, B). In summary, under systemic inflammatory conditions, Nbeal2-/- mice show a more sustained anti-inflammatory response normally hidden or limited in WT animals. These results could therefore support the possibility that the secretion of platelet -granule products can change the secretory pattern of inflammatory cells and balance pro- and anti-inflammatory BRMs and, overall, inflammation. Circulating Blood Cells Compensate for the Decrease in Pro-inflammatory Platelet-released factors in Nbeal2-/- Mice, Except for sCD40L. Under systemic inflammatory conditions, several soluble pro-inflammatory factors are secreted by platelets and other cells such as leukocytes and endothelial cells. For instance, platelets and other blood and vascular cells secrete BRMs such as IL-1, KC, MCP-1, MIP-1, RANTES, VEGF and sCD40L under physiological conditions and, to a greater degree, upon stimulation. While sustained production of IL-1 *21 , KC *22 , MCP-1 [23], MIP-1 *24 , RANTES *23 and VEGF *25 is a common feature of platelets and other cells, sCD40L is mostly secreted by platelets [26]. It was therefore investigated whether the lack of platelet secretion, particularly for these seven soluble factors, could be compensated by other blood cells in Nbeal2-/- mice. Concentrations of IL-1, KC, MCP-1, MIP-1, RANTES and VEGF, measured in blood plasma, were significantly increased after stimulation induced by LPS injection in both wild type and Nbeal2-/- mice (Figure 3, A and Table 1). These results indicate that other inflammatory blood cells have a potential compensatory capacity for secretion. However, sCD40L followed a different pattern as observed by a 2. 5-fold increase in its levels in PBS-injected Nbeal2-/- mice when compared to control animals (Figure 3, A and Table 1). This production may be due to the excessive inflammatory activity of megakaryocytes already observed in Nbeal2-/- mice (indeed this is the case for MIP-1 *13 ). Moreover, -granules are generated in megakaryocytes, but not retained during their maturation ; it can therefore be postulated that immature megakaryocytes can secrete sCD40L contained in their -granules [13]. Lastly, this raised concentration of sCD40L, evidenced in non-stimulated Nbeal2-/- mice, is likely to partially explain the high baseline count of circulating neutrophils and monocytes (Figure 1, A). Indeed, CD40L, and its agonist form sCD40L, typically participate in leukocyte recruitment notably by binding leukocyte CD40 and Mac-1 receptors [27]. Under inflammation induced through LPS intravenous injection, sCD40L levels increased in WT mice in contrast to Nbeal2-/- mice (Figure 3, B), which seems to correlate with the limitation of neutrophil and monocyte recruitment in control (as shown in Figure 1, B). The secretion of certain platelet BRMs, such as sCD62P, vWF, PF4 and fibrinogen, is indeed reduced in Nbeal2-/- mice [13-15], what may contribute to the observed increase in the anti-inflammatory profile of these mice (Figure 2, B). In summary, platelet -granule content is implicated in the inflammatory process [9]. In this study, a comparable pro-inflammatory cytokine/chemokine secretion pattern was observed in Nbeal2-gene deficiency and wild type conditions, except for sCD40L secretion. Nevertheless, the anti- inflammatory profile was greater when mice lacked -granules and were stimulated with intravenous LPS. These observations are consistent with a recent study showing that the lack of NBEAL2 protein expression in mice increases their sensitivity to bacterial infection [16]. Furthermore, this mouse model is protected against thrombosis complication [14], and both ourselves and others have proposed that sepsis and coagulation are linked to platelet and neutrophil inflammatory secretion [28]. In conclusion, this study has expanded knowledge on the fine-tuning role of anti- versus pro- inflammatory functions of platelets via -granule secretion deficiency, broadening our understanding of systemic inflammation (such as can be caused by sepsis) and how the platelet functions can be balanced, to limit both excess pro-coagulant and pro-inflammatory pathology. Reference 1. Broos, K. , et al. , Platelets at work in primary hemostasis. Blood Rev, 2011. 25(4) : p. 155-67. 2. 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Data are presented as mean (n 6 - 9). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent differences between Nbeal2-/- groups. p < 0. 05 ; p < 0. 01 and p < 0. 001 represent differences between wild type groups. #p < 0. 05 ; #p < 0. 01 and #p < 0. 001 represent differences between PBS groups. p < 0. 05 ; p < 0. 01 and p < 0. 001 represent differences between LPS groups. Figure 2 : Proinflammatory pattern evaluation of mouse soluble factors The rate of soluble factors in mouse blood was measured for each group of mice. The unit is pg/ml (A). Difference of fold increase between LPS WT and Nbeal2-/- mice, according to the associated mean of control group, for IL-10, IL-13, IL-17 and IL-4 was compared (B). Data are presented as mean (n 6 - 9). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent differences between Nbeal2-/- groups. p < 0. 05 ; p < 0. 01 and p < 0. 001 represent differences between wild type groups. #p < 0. 05 ; #p < 0. 01 # and p < 0. 001 represent differences between PBS groups. p < 0. 05 ; p < 0. 01 and p < 0. 001 represent differences between LPS groups. Figure 3 : Platelet soluble factors assay The rate of 6 soluble factors secreted notably from platelet in mouse blood was measured for each group of mice. The unit is pg/ml (A). Difference of fold increase between LPS WT and Nbeal2-/- mice, according to the associated mean of control group, for sCD40L was compared (B). Data are presented as mean (n 6 - 8). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent differences between Nbeal2-/- groups. p < 0. 05 ; p < 0. 01 and p < 0. 001 represent differences between wild type groups. #p < 0. 05 ; #p < 0. 01 and #p < 0. 001 represent differences between PBS groups. p < 0. 05 ; p < 0. 01 and p < 0. 001 represent differences between LPS groups. Table 1 : Values representation of the soluble factors evaluations Values quantification of each soluble factor in plasma was determined through multiplex assay for each group of mice. The unit is pg/ml. Data are presented as mean SEM (n 6 9). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent differences between Nbeal2-/- groups. p < 0. 05 ; p < 0. 01 and p < 0. 001 represent differences between wild type groups. #p < 0. 05 ; # p < 0. 01 and # p < 0. 001 represent differences between PBS groups. No difference was observed between LPS groups. -/- -/- p-value PBS WT PBS Nbeal2 LPS WT LPS Nbeal2 symbol bFGF 144. 29 55. 04 90. 61 19. 93 104. 67 19. 75 164. 71 66. 61 * IL-1 64. 86 17. 30 62. 05 17. 42 290. 35 40. 82 293. 78 64. 20 * IL-10 351. 20 185. 54 65. 74 24. 46 431. 90 142. 41 490. 79 293. 82 # IL-13 61. 89 18. 39 45. 81 13. 68 85. 07 23. 62 91. 93 20. 80 * * IL-6 57. 50 20. 57 62. 66 57. 32 41752. 00 15259. 62 41295. 70 19058. 35 * IL-12 63. 19 8. 98 73. 74 23. 88 742. 91 266. 31 746. 19 437. 51 IL-17 2. 62 1. 65 1. 45 1. 10 17. 26 12. 22 24. 39 17. 05 * * GM-CSF 12. 23 5. 47 4. 90 0. 31 81. 25 18. 74 74. 17 18. 57 IL-5 59. 02 36. 87 12. 82 3. 37 417. 85 71. 15 271. 65 77. 84 * IL-1 1. 67 0. 38 1. 40 0. 23 20. 60 14. 60 19. 28 9. 30 * IFN- 52. 46 28. 58 22. 92 18. 98 866. 40 496. 46 761. 59 511. 26 * TNF- 15. 80 9. 77 7. 51 5. 66 410. 75 63. 25 403. 07 162. 51 * IL-2 11. 33 2. 81 7. 06 1. 86 35. 04 5. 67 33. 40 4. 27 * IP-10 39. 43 13. 98 36. 14 6. 25 8911. 97 2241. 85 9673. 37 4528. 40 * MIG 157. 17 30. 59 123. 60 38. 18 101899. 66 32534. 36 100400. 95 35539. 99 IL-4 51. 55 21. 95 20. 21 4. 36 75. 91 11. 47 91. 32 29. 51 * * KC 140. 09 78. 44 292. 41 230. 32 12455. 28 418. 95 13141. 09 2113. 74 * MCP-1 38. 39 11. 31 70. 24 35. 87 13718. 63 2553. 77 18277. 49 3738. 30 * MIP-1 59. 62 38. 13 36. 32 4. 31 1279. 17 745. 14 1154. 02 500. 22 * RANTES 23. 42 6. 19 52. 85 25. 47 6961. 41 4197. 66 9727. 42 5734. 19 * VEGF 3. 60 0. 77 3. 38 0. 73 10. 90 3. 90 10. 36 2. 93 sCD40L 138. 27 38. 84 331. 12 108. 81 322, 14 88, 72 293. 33 74. 19 # Manuscrit III : Les plaquettes régulent la sévérité de l'ALI induit expérimentalement par injection de LPS et d'anti- CMH I Platelets limit the severity of an experimental ALI induced by injection of LPS and anti-MHC I Etude en cours Comme vue en introduction, le rôle des plaquettes dans le TRALI est très débattu. Le but de ce travail de thèse est d'apporter plus d'informations aux détours de plusieurs manipulations, in vivo et in vitro, sur la réelle place de la plaquette sanguine dans la physiopathologie du TRALI. Pour tenter de répondre à cette question, nous avons utilisé un modèle murin de l'ALI induit par injection successive de LPS et d'anticorps anti-CMH I. Le LPS a pour rôle de mimer l'étape du priming , généralement induit par le passé pathologique du patient développant un TRALI, et les anticorps anti-CMH I ont pour but d'activer les cellules inflammatoires préalablement stimulées avec l'injection du LPS [104]. Différentes drogues antiplaquettaires ont alors été utilisées, telles que des anticorps anti-GPIb ou du ML354 (inhibiteur du récepteur PAR-4 plaquettaire). Des stimulations, in vitro, ont permis d'évaluer la réponse plaquettaire sous l'influence des différents stimuli utilisés dans le modèle in vivo. Les résultats présentés ci-dessous ne sont que préliminaires et nécessitent donc des analyses plus approfondies, avant publication. Cependant, un début de réponse peut être envisagé grâce aux premières expériences. En effet, on remarque que l'inhibition ou la déplétion plaquettaire ne prévient pas efficacement le développement du TRALI induit expérimentalement, mais la sévérité de cette pathologie est significativement réduite. Suite à ces résultats, nous envisageons d'investiguer, expérimentalement, le rôle des plaquettes produites directement dans l'interstitium pulmonaire sur la pathogénie du TRALI, cellules qui ne sont pas déplétées lors de l'induction expérimentale de la thrombopénie [271]. De plus, on observe une activation des plaquettes sanguines suite à une stimulation, in vitro, combinée avec du LPS et des anticorps anti- CMH I. Dans le but de compléter cette étude, nous prévoyons d'analyser, le plus précisément possible, la cascade d'activation plaquettaire, si elle existe, lors de la fixation des anticorps anti- CMH I sur son antigène internalisé et présenté par les plaquettes [272, 273]. Cette étude est présentée sous forme de publication scientifique bien que les travaux ne soient pas aboutis Les plaquettes régulent la sévérité de l'ALI induit expérimentalement par injection de LPS et d'anti- CMH I Sofiane Tariket1, 2, Charles-Antoine Arthaud2, Marie-Ange Eyraud2, Sandrine Laradi1, 2, Thomas Bourlet1, Philippe Berthelot1, Hind Hamzeh-Cognasse1, Olivier Garraud1, 3, Fabrice Cognasse1, 2 Université de Lyon, GIMAP-EA3064, Saint-Etienne, France Établissement Français du Sang Rhône-Alpes-Auvergne, Saint-Etienne, France Institut National de Transfusion Sanguine (INTS), Paris, France Résumé La lésion pulmonaire aigu transfusionnelle (TRALI) est une complication rare mais potentiellement grave. La physiopathologie de cette complication n'est pas encore consensuelle pour la communauté scientifique, notamment en ce qui concerne un rôle particulier pour les plaquettes sanguines dans le développement du TRALI. Cette étude a comme principal objectif d'investiguer la participation des plaquettes dans un modèle expérimental murin dans lequel un ALI a été induit par des injections successives de lipopolysaccharide et d'anticorps anti-CMH I. L'injection d'anticorps anti-GPIb, initiateur d'une déplétion plaquettaire, et de ML354, molécule inhibitrice de la voie d'activation du récepteur PAR-4, ont été administrés à des souris BALB/c 30 min avant l'induction de l'ALI. La déplétion plaquettaire induite par anticorps réduit la sévérité de la lésion pulmonaire aigu, sans néanmoins la prévenir totalement. En revanche, le traitement à base de ML354 n'a montré aucun effet expérimental aux conditions d'utilisation. Enfin, nous avons observé, in vitro, une influence directe du LPS couplé aux anticorps anti-CMH I sur l'activation plaquettaire. Ces résultats permettent de consolider les connaissances de la pathogénie du TRALI pour, finalement, en réduire son occurrence par un management personnalisé des patients dits à risque. Introduction Le TRALI (Transfusion-Related Acute Lung Injury) est considéré comme l'une des réactions transfusionnelles inflammatoires les plus critiques [1]. On décrit le TRALI selon deux types, en fonction de sa physiopathologie ; le TRALI dit immunologique, dont le déclenchement dépend de la transfusion d'anticorps anti-leucocytaires, tels que les anti-HLA de classe I et II ou les anti-HNA ; et le TRALI dit non-immunologique, dont l'induction est dépendante de la présence de médiateurs solubles pro-inflammatoires en l'absence d'anticorps anti-leucocytaires détectables dans les produits sanguins labiles transfusés *2 . Actuellement, le rôle de l'activité des leucocytes et de l'endothélium vasculaire dans la pathogénie du TRALI n'est pas remis en question *3, 4 . Cependant, le rôle des plaquettes sanguines dans la constitution physiopathologique du TRALI reste encore à définir. Le TRALI est considéré comme une pathologie transfusionnelle inflammatoire. Il est donc une conséquence d'une hyperactivité de cellules de l'inflammation à l'interface vasculaire et endothéliale pulmonaire [5]. La fonction plaquettaire a été, pendant longtemps, uniquement dédiée à la thrombose et l'hémostase, mais la communauté scientifique s'accorde à lui attribuer une fonction en tant que cellule de l'immunité et de l'inflammation *6 . En effet, les plaquettes sanguines participent à l'inflammation. Elles possèdent un pouvoir sécrétoire pro-inflammatoire non négligeable, notamment par l'exocytose de leurs différents granules *7, 8 . Elles expriment également une multitude de récepteurs sensibles aux signaux de danger comme de nombreuses cellules de l'immunité innée, tels que les Toll-Like Receptors (TLR) [9, 10]. Enfin, elles participent activement à l'induction, le maintien, l'amplification *11-13] mais aussi la régulation [14-17] du processus inflammatoire en interagissant directement avec d'autres cellules, notamment les neutrophiles. Ces fonctions plaquettaires, ainsi décrites, pourraient théoriquement être soit délétères, soit protectrices dans le développement d'un ALI. Pour explorer l'une ou l'autre hypothèse, nous avons reproduit un modèle murin d'œdème lésionnel pulmonaire induit par injection successive de lipopolysaccharide (LPS) et d'anticorps anti-CMH I, équivalent du HLA de classe I chez l'homme, modèle considéré actuellement reproductible et homogène [18], et nous avons cherché à inhiber les plaquettes des souris avant de déclencher l'ALI. Comprendre au mieux la place des plaquettes sanguines dans la physiopathologie d'un ALI visant à modéliser un TRALI pourrait permettre un meilleur management des patients à risques. Matériels et méthodes Approbation de l'étude L'utilisation des animaux a été autorisée par le Comité d'éthique du Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche (numéro d'agrément : CU14N11). Souris Des souris mâles BALB/c sauvages (8-12 semaines) ont été fournies par Charles River (Charles River, Wilmington, USA). Les expériences ont utilisé 8 souris par groupe. Expérimentation animale Des souris mâles H2Kd BALB/c ont été pré-stimulées par injection intrapéritonéale (ip) de lipopolysaccharide (LPS ; 0. 1 mg/kg, extrait d'Escherichia Coli 0111 ; InvivoGen, San Diego, USA), 24 heures avant l'injection intraveineuse (iv) d'anticorps anti-CMH I monoclonaux (mAb 34-1-2s, 1 mg/kg, H2Kd, IgG2a, ), ou de contrôle isotypique IgG2a, (eBioscience, San Diego, USA). Les souris ont été traitées, par voie intraveineuse, avec un anticorps anti-GPIb polyclonal (pAb anti-GPIb, 2 mg/kg, IgG) ou son contrôle isotypique IgG (Abcam, Cambridge, USA), ou par voie intrapéritonéale, avec du ML354 (1-Methyl-5-nitro-3-phenyl-1H-indole-2-methanol, 4 mg/kg) (Tocris, Lille, France) ou du DMSO (1%) (Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA), 30 min avant injection des anticorps anti-CMH I ou de l'anticorps contrôle (Figure 1). Une solution contenant de la kétamine (100 mg / kg) et de la xylazine (10 mg / kg) a été administrée lorsque les souris paraissaient moribondes ou après 2 heures. Les poumons des souris ont été recueillis et placés dans du paraformaldéhyde à 4% (Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA) pendant la nuit. Développement de l'ALI et évaluation de l'œdème pulmonaire lésionnel La température des souris a été mesurée à l'aide d'une sonde rectale et d'un thermomètre numérique (Bioseb, Pinellas Park, USA), avant injection de l'anti-CMH I puis toutes les 10 min pendant 2 h ou jusqu'au sacrifice des souris. Les taux de survie des souris ont été évalués sur les 2 heures de l'expérimentation. L'ALI a été évalué en utilisant un score du comportement des souris et un score de lésion pulmonaire macroscopique (Tableaux 1 et 2). Le rapport poids des poumons/poids du corps a été calculé. Les lavages bronchoalvéolaires (LBA) ont été obtenus par cathétérisation de la trachée. Un lavage a été effectué en utilisant une injection de 1 ml de PBS froid. Les cellules des LBA ont été centrifugées à 491 g pendant 10 minutes et remises en suspension dans du PBS. Les plaquettes des LBA ont été énumérées en utilisant un analyseur hématologique MS4 (Melet Schloesing Laboratoires, Osny, France). La concentration en protéines totales dans les LBA a été évaluée par le dosage de Bradford. Le nombre de cellules dans le sang périphérique et le volume plaquettaire moyen (MPV) ont été déterminés par le MS4. La ponction intracardiaque a été réalisée avec une aiguille de calibre 25G et une solution de citrate-dextrose anticoagulante (ACD) (Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA). Les injections dans veine caudale ont été réalisées à l'aide d'une aiguille de calibre 30G. Sections pulmonaires Les poumons ont été incorporés dans du composé OCT (CML, Nemours, France) et placés sur l'azote liquide pour induire une solidification rapide. Des coupes de 8 m ont été préparées à l'aide d'un microtome cryostat (Leica Microsystem, Nanterre, France). H&E staining and immunohistochemistry L'épaisseur pulmonaire et l'accumulation de fluide périvasculaire ont été évaluées après coloration H&E. Pour l'immunohistochimie, l'activité endogène de la péroxidase a été bloquée par une première incubation avec 0, 3% d'H2O2. Un sérum d'albumine bovine (BSA, 3%) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) a été utilisé pour prévenir une hybridation aspécifique des anticorps. Les coupes de poumons ont été incubées 1 h avec des anticorps anti-CD41 monoclonaux (MWReg30, 2. 5 g/ml) ou des anticorps anti-Ly6G monoclonaux (1A8, 5 g/ml ; BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). Ensuite, ces coupes ont été incubées avec des anticorps secondaires anti-rat monoclonaux biotinylés (G15- 337, 5 g/ml ; BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) pendant 30 min, suivi par une incubation avec de la streptavidine pré-diluée et du 3, 3-Diaminobenzidine. Finalement, les coupes histologiques pulmonaires ont été colorées par des bains successifs dans de l'hématoxyline, de l'alcool (95%, 100%) et du xylène (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA). Les observations ont été faites avec un microscope Nikon Eclipse Ti-S, une caméra Nikon DS-RI2 et un logiciel Nikon NIS-Elements (Nikon, Champigny sur Marne, France). Les images ont été traitées avec le logiciel Image J [19]. Evaluation de l'activation plaquettaire ex vivo Du sang a été récupéré sur 20 souris. Après centrifugation à 100 g pendant 8 min, le PRP (Platelet- Rich Plasma) a été récupéré. Tous les PRP ont alors été poolés et stimulés pendant 1 h sous différentes conditions ; non stimulées (PBS), exposées à l'anti-CMH I (1 g ; 2. 5 g ; 25 g), au LPS (1 g ; 2. 5 g ; 12. 5 g), à l'anti-CMH I et au LPS (respectivement, 25 g ; 2. 5 g) et à un agoniste au récepteur PAR-4 (AYPGKF ; 10 g) (Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA). Les PRP ont finalement été centrifugés à 491 g pendant 10 min pour récupérer les surnageants. Des dosages des concentrations du PF4 ont été réalisés (Mouse CXCL4/PF4 DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, USA) selon les instructions du fabricant. Evaluation de l'agrégation plaquettaire ex vivo Les PRP ont été récupérés sur 20 souris et poolés de la même manière que décrite au-dessus. L agrégation plaquettaire a été évaluée, à l'aide de l'agrégomètre plaquettaire TA-4V (Stago, Asnière sur seine, France), sous différents stimuli ; non stimulée (PBS) ; stimulée par l'anti-CMH I (25 g), le LPS (2. 5 g ; 12. 5 g), l'anti-CMH I et le LPS (respectivement, 25 g ; 2. 5 g) et l'agoniste au récepteur PAR-4 (AYPGKF ; 10 g). Analyses statistiques Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 5 (Graph ad, San Diego, USA). Une analyse statistique de type ANOVA avec correction de Bonferroni post-hoc a été utilisée pour comparer plus de deux groupes de données avec une distribution normale. Le test de Kruskal-Wallis et les tests post-hoc de Dunn ont été appliqués pour des comparaisons entre des données non distribuées normalement. Les scores de l'ALI et la température ont été statistiquement analysés en utilisant une analyse de variance bidirectionnelle. Les valeurs de P étaient considérées comme significatives. Résultats La déplétion plaquettaire limite la sévérité de l'œdème pulmonaire lésionnel induit par injection d'anti-CMH I Dans un premier temps, le but de ce travail est d'évaluer, par l'utilisation de drogues antiplaquettaires, la fonction des plaquettes au sein de la mécanistique de l'ALI. Le modèle murin utilisé repose sur deux injections successives de LPS et d'anticorps anti-CMH I, séparées de 24 heures. Les souris contrôles n'auront connu qu'une simple injection de LPS, par voie péritonéale. Enfin, les souris traitées ont subi une injection, par voie intraveineuse, d'anticorps anti-GPIb, pour induire une déplétion plaquettaire 30 minutes avant l'induction de l'ALI (Figure 1, A). Finalement, les souris ont été suivies pendant 2 heures. Les premiers résultats démontrent une protection contre le développement de l'ALI, suite à l'utilisation des anticorps anti-GPIb. En effet, nous pouvons constater une réduction de la mortalité, d'environ 90% chez les souris modèles de l'ALI contre 40% après déplétion plaquettaire (Figure 2, A). La température, qui est utilisée comme un marqueur du choc pathologique, ne montre, cependant, aucune amélioration. Les souris, à la fois du groupe ALI mais également du groupe traité, présentent une chute de la température jusqu'à 6C à partir de 30 minutes (Figure 2, B). Finalement, l'évaluation du score pathologique de l'ALI (Tableau 1) et de celui reflétant l'état macroscopique des poumons (Tableau 2) évoque une amélioration significative de l'état général des souris. Cependant, ces deux scores restent significativement plus élevés chez les souris traitées avec des anticorps anti-GPIb par rapport au groupe des souris contrôles *LPS] (Figure 2, C et D). L'analyse spécifique du développement de l'œdème pulmonaire, évalué par le ratio du poids des poumons et des souris et de la concentration en protéines totales dans les LBA, démontre une sévérité moindre lorsque les souris sont préalablement injectées avec un anticorps anti-GPIb. En revanche, ces deux paramètres restent significativement plus importants dans le groupe des souris [LPS anti-CMH I anti-GPIb par rapport aux contrôles *LPS (Figure 3, A et B). Finalement, ce traitement ne prévient pas entièrement le développement de la lésion pulmonaire, observée par une infiltration pulmonaire importante évalué par coloration H&E (Figure 3, C). La déplétion plaquettaire augmente le compte des plaquettes au niveau pulmonaire mais réduit celui des neutrophiles. L'analyse du compte cellulaire montre que les souris ayant subi une injection préalable d'anticorps anti-GPIb présente le taux le plus faible de plaquettes circulantes, en moyenne 167, 5. 10 6/l pour le groupe [LPS anti-CMH I anti-GPIb , 285, 9. 106/l pour le groupe [LPS anti-CMH I] et 639. 106/l pour le groupe [LPS]. Cependant, le taux de leucocytes circulants, en particulier les neutrophiles, ne semble pas impacté par l'induction de l'ALI après déplétion plaquettaire (Figure 4, A). L'activation des plaquettes, au niveau périphérique et dans les LBA, est similaire entre les groupes [LPS anti- CMH I] et [LPS anti-CMH I anti-GPIb (Figure 4, B et D). Le taux de plaquettes détecté dans les LBA est significativement plus important dans le groupe [LPS anti-CMH I anti-GPIb par rapport au groupe [LPS anti-CMH I], lui-même proposant une infiltration plaquettaire significativement augmentée comparée aux souris contrôle (Figure 4, C). Ces résultats sont confirmés par l'analyse immunohistologique des plaquettes (CD41) dans les tissus pulmonaires (Figure 4, E). Cette même technique démontre une légère réduction de la migration des neutrophiles (Ly6G) dans l'interstitium pulmonaire lors de la déplétion des plaquettes circulantes des souris (Figure 4, F). La voie d'activation des plaquettes n'est pas dépendante du récepteur PAR-4 Les souris ont été préalablement traitées avec une injection, par voie intrapéritonéale, de ML354 (inhibiteur du récepteur PAR-4), 30 min avant l'induction expérimentale de la lésion pulmonaire, provoquée par l'administration d'anticorps anti-CMH I (Figure 1, B). Aucun effet significatif n'a été constaté, suite à cette inhibition, ni sur la survie (Figure 5, A), la température (Figure 5, B), le score pathologique (Figure 5, C) et de l'atteinte pulmonaire (Figure 5, D), le développement de l'œdème pulmonaire (Figure 6) ou la numération et activation cellulaire au niveau périphérique et des LBA (Figure 7). Les plaquettes sanguines sont sensibles au LPS, et au stimulus combiné du LPS et des anti-CMH I Les plaquettes circulantes de souris, n'ayant connu aucun stimulus, ont été récupérées, sous forme de PRP, et stimulées avec plusieurs réactifs testant l'activation et l'agrégation plaquettaire. Nous avons observé une augmentation significative de la production de PF4, marqueur de l'activité des plaquettes *15 , et de l'agrégation plaquettaire après stimulation avec un agoniste du récepteur PAR- 4 (AYPGKF). La stimulation des plaquettes avec des concentrations importantes en LPS (12. 5 g) induit une libération importante de PF4, similaire à la stimulation avec AYPGKF. Enfin, la combinaison des stimuli LPS et anti-CMH I, aux concentrations suboptimales, a également augmenté la concentration de PF4 libérée par les plaquettes (Figure 8, A). En revanche, seule la stimulation avec l'agoniste au récepteur PAR-4 a permis une augmentation de l'agrégation plaquettaire (Figure 8, B). Discussion La participation des plaquettes sanguines de l'individu dans la genèse d'un TRALI est encore très débattue. Pendant que certains évoquent un rôle non négligeable des plaquettes du patient au sein de la pathogénie de cet œdème lésionnel pulmonaire transfusionnel *20-24], certains les considèrent comme facultatives, voire inutiles *25, 26 . Au cours de cette étude, nous avons évalué l'activité plaquettaire dans la physiopathologie d'un ALI expérimental mimant le TRALI, en apportant un traitement antiplaquettaire ; le modèle murin de l'ALI était induit par injection d'anticorps anti-CMH I à des souris préalablement prédisposées par une injection de LPS. Nous avons objectivé une inhibition limitée du développement de l'ALI (Figures 2 et 3), après l'injection d'anticorps anti-GPIb, résultat intermédiaire entre les études démontrant une protection totale lors de la déplétion plaquettaire [23] et celles observant une absence de prévention de la lésion pulmonaire *25 . La protection totale, d'abord observée en 2009 *23 , peut être justifiée par l'utilisation d'un sérum antiplaquettaire ayant probablement eu un impact sur les leucocytes. Une autre étude [25], ayant induit une thrombopénie sévère chez des souris génétiquement modifiées, rapporte une mort importante des souris probablement en lien avec un syndrome hémorragique induit et pas nécessairement la conséquence de l'ALI. Notre étude rapporte également une augmentation importante du nombre de plaquettes dans les LBA et l'interstitium pulmonaire (Figure 4, C et E), avec une moyenne de leur volume faible (Figure 4, D), après la déplétion des plaquettes circulantes. Ces derniers résultats peuvent probablement s'expliquer, en partie, par la thrombopoïèse plaquettaire pulmonaire décrite récemment [27], qui pourrait être, hypothétiquement, compensatoire de la thrombopénie induite en participant à la synthèse de nouvelles plaquettes. Ces résultats peuvent alors justifier la limite de protection lors de la déplétion des plaquettes circulantes. En effet, notre étude propose une sévérité limitée, mais pas entièrement résolue, tandis que deux premières études n'observaient aucun changement, lors de l'induction de l'ALI suite à la déplétion plaquettaire *25, 26 . Aucune preuve n'a été apportée, dans ces précédentes études, sur l'inhibition des plaquettes nouvellement synthétisées dans l'interstitium pulmonaire. Nous émettons ainsi l'hypothèse que l'activité des plaquettes sanguines présentes et produites dans les poumons peut prendre le relais de celle des plaquettes périphériques déplétées, lors d'un ALI. Finalement, nous avons tenté de déterminer les cascades d'activation des plaquettes sanguines lors de l'induction expérimentale de l'ALI. Dans un premier temps, nous n'observions aucune protection contre le développement de l'ALI après inhibition du récepteur PAR-4 (Figure 5, 6 et 7). Cependant, nous pouvons constater que les plaquettes sont sensibles à de fort taux de LPS seul, prouvé par une libération augmentée de PF4, ou à une combinaison de LPS et d'anti-CMH I à des dosages proches de ceux utilisés dans notre modèle murin de l'ALI (Figure 8, A). Cependant, ces différents stimuli ne semblent pas impacter leur pouvoir d'agrégation (Figure 8, B). Ainsi, grâce à ces résultats, nous pouvons noter que les plaquettes circulantes sont également une cible des stimuli utilisés dans notre modèle murin pathologique. L'effet agoniste observé lors de la stimulation au LPS peut s'expliquer par le fait que les plaquettes expriment différents TLR à leur surface, notamment le TLR4 [10]. En revanche, de nouvelles investigations ont besoin d'être menées pour comprendre quel effet pourrait avoir les anticorps anti-leucocytaires directement sur les plaquettes, car ces dernières ont la capacité d'internaliser le CMH I, produit par les autres cellules immunitaires, et ensuite l'exprimer à leur surface [28, 29]. Finalement, cette étude pourrait apporter une compréhension significative concernant la physiopathologie du TRALI et, ainsi, permettre un management personnalisé des patients transfusés à risques. Références : 1. ANSM, French Haemovigilance Activity Report 2015. 2016. 2. Alvarez, P. , et al. , Transfusion-Related Acute Lung Injured (TRALI) : Current Concepts. Open Respir Med J, 2015. 9 : p. 92-6. 3. Peters, A. L. , D. Van Stein, and A. P. Vlaar, Antibody-mediated transfusion-related acute lung injury ; from discovery to prevention. Br J Haematol, 2015. 4. Peters, A. 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Tableaux Tableau 1 : Evaluation du comportement des souris Paramètre ID animale Score Apparence Normal 1 Manque général de toilettage 2 Piloérection, décharges oculaires et nasales fraches 3 Piloérection, courbure 4 Au-dessus et les yeux à moitié fermés 5 Comportement naturel Normal 0 Changements mineurs 1 Moins mobile et isolé, mais alerte 2 Agité ou très calme, pas alerte 3 Etat d'hydratation Normal 0 Test de pincement cutané anormal 5 Signe clinique Fréquence respiratoire normale 0 Légers changements, fréquence seulement augmentée 1 Augmentation de la fréquence avec respiration abdominale 2 Diminution de la fréquence avec respiration abdominale 2 Respiration abdominale marquée et cyanose 3 Comportement provoqué Normal 0 Dépression mineure ou réponse exagérée 1 Changement modéré du comportement attendu 2 Très faible et précomateuse 3 Total 0-19 Tableau 2 : Evaluation de la dégradation macroscopique des poumons Score atteinte poumons Observations 1 Entièrement rose et Sec 2 Très peu de taches (10 % X 30 %) et Sec 3 Quelques taches sombres (30 % < X 50 %) et peu humide 4 Beaucoup de taches sombre (50 % < X 75 %) et humide 5 Presque entièrement sombre (X > 75 %) et très humide Figures Figure 1 : Evaluation des symptômes des souris Le protocole expérimental, in vivo, est présenté ici. Les souris sont préalablement stimulées avec une injection intrapéritonéale de LPS, à 0. 1 mg/kg, 24 heures avec l'induction de l'ALI par injection intraveineuse d'anticorps anti-CMH I. Les souris sont traitées soit avec des anticorps anti-GPIb à 2 mg/kg, responsable de la déplétion plaquettaire (A), soit avec le ML354 à 4 mg/kg, inhibiteur de la voie d'activation PAR-4 (B). Les souris sont suivies pendant 2 h. Figure 2 : Evaluation des symptômes des souris après déplétion plaquettaire Les courbes de survie (A), la température rectale (B), le score du changement comportemental des souris (/19) (C) et le score de l'atteinte macroscopique des poumons (/5) (D) ont été mesurés. Les valeurs sont représentées en moyenne SEM (n 16 25). *p < 0. 05, *p < 0. 01, et *p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-CMH I] ; p < 0. 05, p < 0. 01, et p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS anti-CMH I] et [LPS anti-CMH I anti- GPIb ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, et #p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-MHC I anti- GPIb . Figure 3 : Caractérisation de l'œdème pulmonaire après déplétion plaquettaire Le ratio entre le poids des poumons et des souris (A) et la concentration en protéines totales dans les LBA (B) ont été mesurés. La microarchitecture pulmonaire est présentée après coloration H&E pour chaque groupe de souris (Grossissement original x400). Barre d'échelle, 50 m (C). Les valeurs sont représentées en moyenne SEM (n 8 15). *p < 0. 05, *p < 0. 01, et *p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-CMH I] ; p < 0. 05, p < 0. 01, et p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS anti-CMH I] et [LPS anti-CMH I anti-GPIb ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, et #p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-MHC I anti- GPIb . Figure 4 : Evaluation cellulaire après déplétion plaquettaire L'évaluation du compte cellulaire, au niveau périphérique, pour les plaquettes, les leucocytes, les neutrophiles et les monocytes a été réalisé (A). Le volume plaquettaire moyen a été évalué pour les plaquettes circulantes (B). La numération plaquettaire a été réalisée dans les LBA (C). Le volume plaquettaire moyen a été évalué pour les plaquettes pulmonaires (D). Les valeurs sont représentées en moyenne SEM (n 8 25). *p < 0. 05, *p < 0. 01, et *p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-CMH I] ; p < 0. 05, p < 0. 01, et p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS anti-CMH I] et [LPS anti-CMH I anti-GPIb ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, et #p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-MHC I anti- GPIb . La coloration immunohistochimique de l'interstitium pulmonaire a été utilisée pour mesurer l'infiltration plaquettaire (E) et des neutrophiles (F) (Grossissement original x400). Barre d'échelle, 50 m. Figure 5 : Evaluation des symptômes des souris après inhibition du récepteur PAR-4 Les courbes de survie (A), la température rectale (B), le score du changement comportemental des souris (/19) (C) et le score de l'atteinte macroscopique des poumons (/5) (D) ont été mesurés. Les valeurs sont représentées en moyenne SEM (n 15 25). *p < 0. 05, *p < 0. 01, et *p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-CMH I] ; p < 0. 05, p < 0. 01, et p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS anti-CMH I] et [LPS anti-CMH I ML354] ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, et #p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-MHC I ML354]. Figure 6 : Caractérisation de l'œdème pulmonaire après inhibition du récepteur PAR-4 Le ratio entre le poids des poumons et des souris (A) et la concentration en protéines totales dans les LBA (B) ont été mesurés. La microarchitecture pulmonaire est présentée après coloration H&E pour chaque groupe de souris (Grossissement original x400). Barre d'échelle, 50 m (C). Les valeurs sont représentées en moyenne SEM (n 8). *p < 0. 05, *p < 0. 01, et *p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-CMH I] ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, et # p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-MHC I ML354]. Figure 7 : Evaluation cellulaire après inhibition du récepteur PAR-4 L'évaluation du compte cellulaire, au niveau périphérique, pour les plaquettes, les leucocytes, les neutrophiles et les monocytes a été réalisé (A). Le volume plaquettaire moyen a été évalué pour les plaquettes circulantes (B). La numération plaquettaire a été réalisée dans les LBA (C). Le volume plaquettaire moyen a été évalué pour les plaquettes pulmonaires (D). Les valeurs sont représentées en moyenne SEM (n 8 25). *p < 0. 05, *p < 0. 01, et *p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-CMH I] ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, et #p < 0. 001 représentes les différences entre les groupes [LPS] et [LPS anti-MHC I ML354]. Figure 8 : Activité plaquettaire sous différents stimuli L'activation des plaquettes, isolées dans les PRP, a été évaluée par la mesure de la concentration du PF4 (A) et l'agrégation plaquettaire (B) sous différents stimuli. Les valeurs sont représentées en moyenne SEM (n 5 10). *p < 0. 05, *p < 0. 01, et *p < 0. 001 représentes les différences par rapport au groupe non stimulé (NS). Figure 1 : Evaluation des symptômes des souris A B C D Figure 2 : Evaluation des symptômes des souris après déplétion plaquettaire A B C LPS LPS anti-CMH I LPS anti-CMH I anti-GPIb Figure 3 : Caractérisation de l'œdème pulmonaire après déplétion plaquettaire A B C D LPS Anti-MHC I Anti- E LPS LPS Anti-MHC I GPIb CD41 Ly6G Figure 4 : Evaluation cellulaire après déplétion plaquettaire A B C D Figure 5 : Evaluation des symptômes des souris après inhibition du récepteur PAR-4 A B C LPS LPS anti-CMH I LPS anti-CMH I ML354 Figure 6 : Caractérisation de l'œdème pulmonaire après inhibition du récepteur PAR-4 A B C D Figure 7 : Evaluation cellulaire après inhibition du récepteur PAR-4 A B Figure 8 : Activité plaquettaire sous différents stimuli Supplemental figure 1 : Agrégation plaquettaire A B C D E F Représentation des profils d'agrégation en fonction des stimulations. Chaque profil représente un échantillon caractéristique de chaque stimulation ; NS (A), anti-CMH I - 25 g (B), LPS - 2. 5 g (C), LPS - 12. 5 g (D), anti-CMH I - 25 g LPS - 2. 5 g (E), PAR-4 - 10 g (F). Manuscrit IV : La neutralisation du complexe protéique CD40/CD40L inhibe le développement d'œdème pulmonaire lésionnel induit dans un modèle murin par injection de lipopolysaccharide et d'anticorps anti-CMH I The neutralization of CD40/CD40L complex inhibits Acute Lung Injury development in a mouse model induced through lipopolysaccharide and anti-MHC I mAb injection Article soumis dans Critical Care Comme vu précédemment, le TRALI propose une pathogénie très complexe mettant en jeu diverses cellules de l'inflammation, telles que les neutrophiles, les plaquettes et les cellules endothéliales [104, 274-276]. Certains évoquent même l'implication d'autres cellules, c'est le cas des monocytes [277] ou des macrophages pulmonaires [278]. Même si aucun consensus actuel n'a validé les vraies cellules impliquées (neutrophiles vs monocytes vs macrophages pulmonaires vs plaquettes sanguines), un point commun existe entre toutes ces cellules, l'implication du complexe protéique CD40/CD40L. Les plaquettes sanguines, par la production d'environ 95% du CD40L soluble, agoniste à la forme membranaire, sont au cœur d'une physiopathologie dépendant du couple CD40/CD40L [89]. Ce couple immun participe activement à l'établissement de l'immunité innée, adaptative et, de façon plus générale, de l'inflammation [74]. En ciblant ce complexe protéique, nous avons donc émis l'hypothèse d'une inhibition de l'ALI, induit dans un modèle murin par des injections successives de LPS et d'anticorps anti-CMH I. Plutôt que l'activation cellulaire, c'est la migration des neutrophiles et des plaquettes sanguines, depuis le compartiment vasculaire jusqu'à l'espace alvéolaire qui a été ciblée. En effet, dans le compartiment sanguin, l'inflammation n'est pas limitée, sous traitement à base d'anticorps anti-CD40L neutralisant, mais l'activité des neutrophiles et des plaquettes au niveau pulmonaire est sensiblement réduite. L'inhibition du couple CD40/CD40L semble, au cours de cette étude, avoir également un impact sur les monocytes, paramètre qui mériterait une investigation plus approfondie. Cette étude met en avant un rôle trop longtemps sous-estimé du complexe protéique CD40/CD40L dans la physiopathologie du TRALI. The CD40L/CD40 pathway is central in Acute Lung Injury physiopathology : evidence in an experimental mouse model of transfusion-related acute lung injury Sofiane Tariket, 1, 2 Hind Hamzeh-Cognasse, 1 Charles-Antoine Arthaud, 2 Thomas Bourlet, 1 Philippe Berthelot, 1 Sandrine Laradi, 1, 2 Olivier Garraud, 1, 3 and Fabrice Cognasse1, 2 Université de Lyon, GIMAP-EA3064, Saint-Etienne, France ; 2Établissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes, Saint-Etienne, France ; 3Institut National de la Transfusion Sanguine, Paris, France Address for correspondence and reprint requests : Dr. F. Cognasse (PhD), Université de Lyon, GIMAP-EA3064, Faculté de Médecine, 10 rue de la Marandière - 42270 St Priest en Jarez France. Tel. : 33 4 77 42 14 67 ; Fax : 33 4 77 42 14 86 ; E-mail address : fabrice. cognasse@univ-st-etienne. fr Short Title : Role for CD40/CD40L in immune acute lung injury Text word count : 4153 Abstract word count : 213 References : 52 Figures : 6 Tables : 1 Abstract Platelet transfusions can cause adverse reactions in their recipients, including transfusion-related acute lung injury (TRALI), a type of respiratory distress that occurs within 6 h of transfusion. The pathophysiology of TRALI depends on a number of signaling pathways and the role played by blood platelets remains controversial. Platelets are important in inflammation, particularly via the immunomodulator complex CD40/CD40L. Here, we studied the specific function of the CD40/CD40L complex in regulating an experimental ALI model that mimics TRALI. A mouse model of immune ALI was triggered by injection of LPS and an anti-MHC I antibody, and the effect of injection of a neutralizing anti-CD40L antibody before induction of ALI investigated. The characteristics of ALI were decreased body temperature, pulmonary lesions, and immune cell infiltration into the alveolar space. Pulmonary infiltration was evaluated by blood counts of specific immune cells and their detection in lung sections. Inhibition of the CD40/CD40L immunomodulator complex significantly reduced cellular communication and the development of pulmonary edema. Hence, our results indicate that targeting of the CD40/CD40L complex could be an important method to prevent ALI/TRALI. We conclude that improvement of the conditions under which platelet concentrates are prepared and stored would assist in control of the risk of TRALI and may provide the clinical safety and effectiveness of platelet transfusion. Introduction There are two main etiologies of respiratory distress in transfusion. The first is transfusion associated circulatory overload (TACO), which is characterized by hydrostatic pulmonary edema and increased left arterial pressure. Conversely, the development of permeability pulmonary edema, accompanied by hypotension, indicates transfusion related acute lung Injury (TRALI), including mild or atypical forms, referred to as possible-TRALI (pTRALI) [1]. The incidence of typical TRALI can be greatly reduced by the removal of plasma-rich blood components, which include anti-MHC class I or class II [2]. Moreover, the substitution of platelet concentrate (PC) plasma with platelet additive solution also led to a marked reduction in inflammatory complications in general, and TRALI in particular [3]. Nevertheless, cases of pTRALI and TRALI continue to be reported, since this pathology appears to be affected not only by the transfusion product, but also by patient characteristics [4]. A two-hit model has been proposed for the classical form of TRALI *5 , whereby inflammatory conditions present in some transfused recipients strongly predispose them to the development of pathology, resulting in changes to the phenotypes of inflammatory cells, such as neutrophils, platelets, and endothelial cells [6, 7] ; this is the priming event. The second hit results from transfusion of anti-leukocyte antibodies [8] and/or soluble mediators [9] present in blood. A mouse model was proposed, in 2009, to mimic the hypothesis of the two-hit pathophysiology of human TRALI [10]. This experimental TRALI is based on a first injection of LPS, to reproduce the priming step, followed by an intravenous injection of anti-MHC I mAb, to induce pulmonary edema. CD40 is a membrane protein found on many immune and inflammatory cells, and CD40 ligand (CD40L) is also expressed on the surface of various immune cells [11]. Soluble CD40L (sCD40L) is an agonist of CD40L, 95% of which is secreted by platelets [12] ; it is derived either from alternative mRNA splicing of CD40L or after cleavage of the CD40L protein by MMP2 [13]. The interaction between CD40 and CD40L is central to numerous innate and adaptive immune functions [14], and to many pathologies [15] ; the CD40/CD40L complex is considered pro-inflammatory [13] and sCD40L appears to impact transfusion reactions and to accumulate with time in storage, particularly in PC [16-19]. Several factors justify interest in sCD40L in the context of TRALI. First, from a transfusion perspective, sCD40L levels correlate with PC storage time [20, 21]. Blumberg et al. demonstrated that transfusion, febrile, and allergic reactions were significantly correlated with high levels of sCD40L in PC [22]. Nevertheless, the role of the CD40/CD40L complex in TRALI is controversial. Some reports unequivocally indicate its involvement [23] while others deny such claims [24]. Second, this molecular complex, which is pivotal in both innate and adaptive immunity [13], is often implicated in other forms of ALI, such as sepsis [25-28]. Such pathology depends on : (i) the formation of a cellular tri-complexes of neutrophils, endothelial cells, and platelets ; (ii) transmigration of neutrophils and platelets into the alveolar space ; and (iii) pulmonary complications [29]. Further, significant levels of sCD40L are observed in TRALI-implicated PCs and in the plasma of 67% of TRALI patients post- reaction [23]. Finally, in three animal models of ALI, induced by hyperventilation [30], radiation [31], or following endotoxemia [32], pathophysiology appeared to be CD40/CD40L dependent. Given the severity of TRALI and the continued use of transfusions for severely affected patients, risk reduction strategies targeting key molecules, including serum sCD40L, represent a potential route to improvement of this condition. Here we investigated sCD40L as a therapeutic target in a mouse two-hit acute lung injury (ALI)/TRALI model. We identified a central role for CD40/CD40L in both intercellular communication and the migration of polymorphonuclear cells into the alveolar space, a phenomenon key to the induction of TRALI. Further, we demonstrate that inhibition of CD40/CD40L was effective in preventing pulmonary edema. Materials and methods Study approval Animal use was by the authorization of the Ethics Committee of the French Ministry of Higher Education and Research (approval number : CU14N11). Mice Male BALB/c wild-type mice (812 weeks old) were purchased from Charles River (Charles River, Wilmington, USA). Experiments used 4 mice per group. Experimental groups were : PBS *baseline ; LPS [control] ; LPS Anti-MHC I mAb [ALI model] ; LPS Anti-MHC I mAb neutralizing anti-CD40L mAb [treated mice] ; and LPS Anti-CD40L mAb [treatment control]. Animal experiments Male H2Kd BALB/c mice were primed by intraperitoneal (i. p. ) injection of lipopolysaccharide (LPS, 0. 1 mg/kg, extracted from Escherichia Coli 0111 ; InvivoGen, San Diego, USA), 24 h before challenge with intravenous (i. v. ) anti-MHC I monoclonal antibody (mAb 34-1-2s ; 1 mg/kg ; H2Kd ; IgG2a, ) or IgG2a, isotype control (eBM2a) (eBioscience, San Diego, USA). Mice in the treatment group were intravenously administered with 4 mg/kg anti-CD40L mAb (MR1) or IgG3, Isotype control (E36-239) (BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA) 30 min prior to challenge with anti-MHC I mAb or isotype control (Figure S1). Ketamine (100 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg) were administered when mice appeared moribund or after 2 h. After death, mouse lungs were collected and placed in 4% paraformaldehyde (Sigma Aldrich, Saint-Louis, USA) overnight. TRALI development and edema evaluation Mouse temperatures were measured using a rectal probe and digital thermometer (Bioseb, Pinellas Park, USA), prior to anti-MHC I injection and then every 10 min for 2 h, or until death. Mouse survival rates were evaluated for 2 h and at 48 h following treatment. First set of mice were used to calculate wet lung to body weight ratio. Other set of mice were used to obtain bronchial lavage fluid (BAL) through a tracheotomy with a 25-gauge catheter before the pneumonectomy. Lavage was conducted using a 1 ml injection of cold PBS flushed back three times. BAL cells were centrifuged at 491 g for 10 min and resuspended in PBS. BAL platelets were enumerated using an MS4 Hematology Analyzer (Melet Schloesing Laboratoires, Osny, France). BAL total proteins were evaluated by Bradford assay. Peripheral-blood cell number and MPV were determined using the MS4. Intracardiac puncture was conducted with a 25-gauge needle and anticoagulant citrate-dextrose solution (Sigma Aldrich, Saint- Louis, USA). Tail vein injections used a 30-gauge needle. Plasma samples were collected and stored. The BAL platelet ratio was calculated as follows : ( ) Lung sections Lungs, for which no BAL has been performed, were embedded in OCT compound (CML, Nemours, France), placed over liquid nitrogen to induce rapid solidification. For hematoxylin and eosin (H&E) staining (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA), immunohistochemistry, and immunofluorescence, 8 m sections were prepared using a cryostat microtome (Leica Microsystem, Nanterre, France). H&E staining and immunohistochemistry Pulmonary cellular exudate area was evaluated through stereological assessment, as previously described [33], after H&E staining. For immunohistochemistry, endogenous peroxidase activity was blocked with 0. 3% H2O2. Bovine serum albumin (BSA, 3%) (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA) was used to block nonspecific hybridization, sections were incubated for 1 h with anti-CD41 mAb (MWReg30, 2. 5 g/ml) or anti-Ly6G mAb (1A8, 5 g/ml ; BD Biosciences, Franklin Lakes, USA). Sections were then incubated with biotinylated secondary anti-rat mAb (G15-337, 5 g/ml ; BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) for 30 min, followed by pre-diluted streptavidin and 3, 3-Diaminobenzidine. Sections were counterstained by successive immersion in hematoxylin, alcohol (95%, 100%) and xylene (Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA). Observations were made with a Nikon Eclipse Ti-S microscope, Nikon DS-RI2 camera and Nikon NIS-Elements software (Nikon, Champigny sur Marne, France). Images were processed with Image J software [34]. Immunoassays MPO and PF4 (Mouse Myeloperoxidase DuoSet ELISA and Mouse CXCL4/PF4 DuoSet ELISA, R&D Systems, Minneapolis, USA) were measured in plasma and BAL according to the manufacturer's instructions. Plasma IL-6, MIP-2 (Mouse IL-6 DuoSet ELISA and Mouse CXCL2/MIP-2 DuoSet ELISA R&D Systems, Minneapolis, USA), and sCD40L (Mouse TH17 Magnetic Bead Panel Multiplex Assay, Merck Millipore, Billerica, USA) were measured according to manufacturer's instructions. NETs were evaluated in mouse plasma by ELISA as previously described [35]. Values for soluble NET formation are expressed as percentage increase in absorbance above control, calculated as follows : ( ) ( ) Neutrophil-platelet aggregate (NPA) assay Immediately following whole blood collection, flow cytometry was used to evaluate NPA formation. PE-anti-CD45 mAb (30-F11) and APC-anti-Ly6G mAb (1A8) (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) were used to identify neutrophils. FITC-anti-CD41 mAb (MWReg30) was used to identify platelets among the CD45/Ly6G neutrophil population ; a positive FITC signal in this population was considered to indicate NPA. Analysis was performed using FACSCANTO II (BD Biosciences, Franklin Lakes, USA) and FlowJo software (FlowJo, Ashland, USA). Phenotypic characterization of neutrophils Neutrophils were identified in whole blood using PE-anti-CD45 mAb (30-F11) and APC-anti-Ly-6G mAb (1A8). Neutrophil surface Mac-1 (CD18) and CD40 were identified with FITC-anti-CD18 mAb (M18/2) and Pacific BlueTM-anti-CD40 mAb (3/23) (BioLegend, San Diego, USA). Flow cytometry and software analysis were as described above. Immunofluorescence assays Pulmonary-interstitial co-localization of platelets and neutrophils was by direct immunofluorescence. Pulmonary sections were blocked with 10% BSA and incubated with anti-CD41 mAb (MWReg30, 1 g/ml ; Abcam, Cambridge, USA) and anti-Ly6G mAb (1A8, 5 g/ml) simultaneously for 1 h in a humidified chamber. Next, secondary Alexa fluor 488-anti-rabbit mAb (2 g/ml) and Cy5-anti-rat mAb (5 g/ml ; Abcam, Cambridge, USA) were added for 1 h. Nuclei were stained with 4', 6- diamidino-2-phenylindole (DAPI). Images and overlay were treated with Image J software [34]. Statistical analyses Statistical analyses were performed using GraphPad Prism 5 software (Graph ad, San Diego, USA). Unpaired Student's t-tests were used for comparisons between two groups if the data were normally distributed (as determined by Kolmogorov-Smirnov test), with Mann Whitney tests applied for non- normally distributed data. ANOVA with post-hoc Bonferroni correction was used for comparisons among more than two groups of data with normal distribution, with the Kruskal-Wallis and Dunn's post-hoc tests applied for comparisons among non-normally distributed data. Temperature and mouse ALI scores over 48 h were calculated using two-way analysis of variance. Correlations were by Spearman's test. P-values < 0. 05 were considered significant. Results Anti-CD40L monoclonal antibody prevented pulmonary edema in the TRALI mouse model Injection of anti-MHC I (H2kd) mAb in Balb/c mice, conditioned by prior (24 h) LPS injection, resulted in mortality of 60% of animals within 2 h. LPS injection alone had no effect on mortality at 2 h. Treatment with anti-CD40L neutralizing antibody 30 min prior to anti-MHC I injection completely prevented mortality at 2 h (Figure 1A). Mice in the [LPS anti-MHC I] group, which mimicked TRALI, were hypothermic, with rectal temperatures approximately 8C below those of both [PBS] and [LPS] control group mice. Injection of anti-CD40L neutralizing antibody, 30 min before anti-MHC I antibody, maintained normothermia. The mean temperature reduction in [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mice was -3C between 2050 min, and in the last hour the difference was < -2C and not significantly different from controls (Figure 1B). Transfusion ALIs, particularly ALI lesions, are characterized by pulmonary edema. Pulmonary edema was more pronounced in the [LPS anti-MHC I] group than in [LPS] control group. The injection of anti-MHC I after priming with LPS induced a dramatic deterioration of the lungs, as visualized by their violet color and moist appearance, suggestive of pulmonary infiltration (Figure 1C). In contrast, the general appearance of the lungs in [LPS anti- MHC I anti-CD40L] mice was equivalent to that of [LPS] controls (Figure 1C). Significant increases were observed in wet lung mass/body mass ratio and total protein in bronchoalveolar lavage (BAL) in [LPS anti-MHC I] mice compared with [LPS] controls (p < 0. 001), while treatment with intravenous anti-CD40L significantly reduced these two parameters (Figure 1DE). H&E staining of the pulmonary interstitium revealed pulmonary infiltration, evidenced by pulmonary cellular exudate, in [LPS anti- MHC I] mice, while the pulmonary parenchyma of [LPS] controls and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] treated mice showed no evidence of infiltration (Figure 1F ; quantified in Figure 1G). These results suggest that prophylactic injection of anti-CD40L neutralizing antibodies could prevent pulmonary edema triggered by treatment with LPS and anti-MHC I and consequently the development of ALI in this model of TRALI. Anti-CD40L reduces lung infiltration by circulating leukocytes and platelets Levels of circulating platelets were slightly reduced after LPS injection, and subsequent anti-MHC I injection significantly exacerbated this thrombocytopenia (p < 0. 001). Administration of anti-CD40L prior to anti-MHC I injection significantly limited the severity of the thrombocytopenia (p < 0. 05), although platelet levels remained significantly lower compared with untreated controls (p < 0. 001) (Figure 2A). LPS injection alone produced a modest increase in platelets in BAL. After anti-MCH I lesional induction, the BAL platelet level increased by approximately 2. 6 times on average as compared to the [LPS] control group. Prior Injection of anti-CD40L, significantly reduced the platelet infiltrate (p < 0. 01) (Figure 2B). Circulating levels of leukocytes, particularly neutrophils, increased significantly following LPS injection (p < 0. 05), and subsequent treatment with anti-MHC I normalized the number of neutrophils ; moreover, injection of anti-CD40L did not alter baseline neutrophil levels observed in ALI mice. LPS injection induced a significant elevation in monocytes (p < 0. 05), which was maintained following injection of anti-MHC I antibodies (p < 0. 01) ; however, levels decreased on injection with the anti-CD40L antibody, returning to basal levels (PBS control) (Figure 2C). In parallel, examination of the pulmonary parenchyma showed a greater infiltration of platelets and neutrophils in [LPS] mice than in the [PBS] control group. The addition of anti-MHC I amplified the infiltration whereas the injection of anti-CD40L [LPS anti-MHC I anti-CD40L] decreased and normalized levels of platelets (Figure 2D) and neutrophils (Figure 2E). Platelet proportion in BAL samples, considered partly migratory, were increased in [LPS anti-MHC I] mice compared with [LPS] control and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] treated groups, and were significantly higher in [LPS anti-MHC I anti-CD40L] group (41. 34%) compared with [LPS] mice (17. 74%) (p < 0. 001) (Figure 2F). Blood platelet numbers were significantly and negatively correlated with BAL platelet levels (p < 0. 0001 and Pearson r -0. 6339) (Figure 2G). Hence, injection of anti-CD40L antibody considerably affected platelet and leukocyte levels in the pulmonary parenchyma, possibly because of cellular migration/relocation coupled with pulmonary thrombopoiesis [36]. Anti-CD40L antibody limits neutrophil and platelet activation induced by LPS and anti-MHC I antibody to a limited extent in blood and sustainably in lungs The levels of activated neutrophils and platelets were evaluated by measuring myeloperoxidase (MPO) [37] and platelet factor-4 (PF4) [38], respectively. Concentrations of MPO (Figure 3A) and PF4 (Figure 3B) were considerably increased in [LPS anti-MHC I] mice compared with [LPS] controls in both plasma and BAL. Anti-CD40L reduced levels of PF4 in the blood and of FP4 and MPO in BAL, 1. 9-, 33-, and 3. 5-fold, respectively (Figure 3AB). Mean platelet volume (MPV), a characteristic of platelet activation [39], was evaluated to assess the pathophysiological involvement of platelets in ALI. An increase in MPV in [LPS anti-MHC I] versus [LPS] mice was observed in blood, but not BAL, where basal MPV was high. Anti-CD40L antibodies neutralized MPV increases in the blood, with levels equivalent to those observed after treatment with LPS alone ; however, anti-CD40L antibody treatment also led to a further increase in MPV in the lungs compared with [LPS anti-MHC I] mice (Figure 3C). To confirm BAL platelet activation in [LPS anti-MHC I] mice, the concentration of thromboxane B2 (TxB2) was measured. The levels of TxB2 in [LPS anti-MHC I] mice were elevated compared with both control [LPS] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mice (Figure 3D), consistent with the results of PF4 assessment (Figure 3B). TxB2 was only measured in BAL, because the sampling method precluded its measurement in blood. Hence, our results indicate that platelet activation is reduced by anti-CD40L, in both blood and lungs. In contrast, neutrophil activation was apparently irreversible in the blood, despite the inhibition of the CD40/CD40L immune complex (sCD40L). Effect of anti-CD40L on levels of NPA in blood and lung : importance of Mac-1 Levels of NPA formation were evaluated in this model of ALI, since their presence is a pathogenic risk factor for both sepsis and ALI [40]. After LPS injection, levels of NPA relative to the neutrophil population were 3%, and injection of anti-MHC I [LPS anti-MHC I] and anti-CD40L [LPS anti-MHC I anti-CD40L] antibodies led to significant decreases (p < 0. 001), to approximately 35% and 11%, respectively. Furthermore, NPA level was significantly reduced in neutralizing anti-CD40L treated mice compared to anti-MHC I induced ALI mice (p < 0. 01) (Figure 4A). Neutrophil extracellular traps (NETs), comprised of platelets and neutrophils [35], were also evaluated. NETosis is particularly increased in the presence of gram-negative bacteria or LPS [41]. NETs were considerably reduced in blood from [LPS anti-MHC I anti-CD40L] compared with [LPS anti-MHC I] mice (Figure 4B). Moreover, levels of neutrophil surface Macrophage-1 antigen (Mac-1) and CD40 were examined following treatment with anti-CD40L antibody. The mean fluorescence index (MFI) for Mac-1 differed considerably among groups and was 1. 4 and 2 times higher in [LPS anti-MHC I] mice compared with [LPS] and [LPS anti-MHC I antiCD40L] mice, respectively. Similarly, levels of CD40 were significantly higher in [LPS anti-MHC I] mice (p < 0. 05) (Figure 4C). A positive and significant correlation was observed between Mac-1 and CD40 expression (Pearson r 0. 7463 and p 0. 0002 ; Figure 4D). Immunofluorescence detection of platelets (CD41) and neutrophils (Ly6G) indicated higher levels of their co-localization in the interstitium in [LPS anti-MHC I] compared with [LPS] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mice (Figure 4E). These observations were consistent with the observed reduction in platelet and neutrophil infiltration following treatment with anti-CD40L antibodies (Figure 2DE). The pulmonary inflammation created by LPS and anti-MHC I injection resolves after 48 h, following parenteral injection of anti-CD40L In this model of ALI, local/regional inflammation was evaluated by measurement of IL-6 and macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) in plasma from the different groups of mice. Both IL-6 and MIP-2 increased by approximately 2- and 3-fold, respectively, compared with controls after LPS and anti-MHC I administration and injection of anti-CD40L did not influence their levels (Figure 5AB ; Table 1). sCD40L levels in plasma were altered by injection of anti-CD40L in [LPS anti-MHC I] mice (Figure 5C ; Table 1). Inflammation was evaluated 48 h after challenge with anti-MHC I in [LPS anti- MHC I anti-CD40L] mice, in comparison with 'baseline' mice (injected with PBS). The aim was to evaluate whether recovery could be considered complete, i. e. equivalent to the basal levels measured in mice that have never undergone an inflammatory stimulus. [LPS anti-MHC I] mice were not included in this experiment because they were too affected and sacrificed in agreement with the ethic committee (approval number : CU14N11). At 48 h follow-up, [LPS anti-MHC I anti- CD40L] mice all survived (Figure S6), whereas only 40% of [LPS anti-MHCI] mice survived after 2 h (Figure 1A). In [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mice, platelet (Figure 6A), total leukocyte (Figure 6C), and monocyte (Figure 6E) counts returned to baseline after 48 h in blood, as did the platelet count in BAL (Figure 6B). The difference in neutrophil counts persisted, with significantly fewer circulating neutrophils relative to [PBS] mice (p < 0. 01) (Figure 6D). Using these same mice, we re-evaluated levels of IL-6, MIP-2, and MPO. Despite a two-fold increase in MPO levels in [LPS anti-MHC I anti- CD40L] compared with [PBS] mice at 48 h, the increases in these three cytokines tended to recede after 2 h (Figure 6FH). In conclusion, in the short term anti-CD40L antibody did not appear to resolve the inflammation induced by anti-MHC I antibody ; however, 48 h after anti-MHC I antibody injection, inhibition of CD40/CD40L complex formation appeared to almost completely resolve the consequences of anti-MHC I antibody administration. Discussion The incidence of immune post-transfusional, particularly lesional, respiratory distress has decreased because of improved selection of donors and donations ; however, the increase occurrence of non- immune TRALI after transfusions of blood components [42], which contains few pathogenic mediators, highlights the need to better understand ALIs. Moreover, lesional edema and overload take various forms, particularly in patients subject to critical (intensive) care protocols. For improved management of these patients, a better model of lesion pathophysiology is required. To develop a preventive treatment for TRALI, we used a mouse model to determine the role of the CD40/CD40L complex in ALI/TRALI pathophysiology. Anti-CD40L reduced pulmonary edema (Figures 1), platelet activation in blood and infiltrated tissues (Figure 3BD), cellular pulmonary relocation (Figure 2DE, 4E) and neutrophil activity in the lungs (Figure 3A). Anti-CD40L also appeared to limit intercellular communication, particularly between neutrophils and platelets, evidenced by decreases in NPA formation and NETs (Figure 4AB), which correlated with low Mac-1 expression on neutrophils (Figure 4C). Follow-up of treated mice showed almost complete recovery following CD40/CD40L inhibition (Figure 6). The main limitation of this treatment was that inflammation wasn't prevented following the injection of anti-CD40L (Figures 2AC, 5). Our data suggest a protective role of neutralizing anti-CD40L mAb to prevent pulmonary edema formation. These findings do not accord with previous observation investigating the influence of CD40/CD40L complex in a one-hit mouse model of TRALI. Treatments with ciglitazone and neutralizing anti-CD40L do not prevent TRALI development in mice [24]. Nevertheless, the used mouse model was different than the one used in our study, considered as the reference mouse model of TRALI *10 . Effectively, the used mouse model consisted to a one-hit model of TRALI with a single anti-MHC I injection at 4. 5 mg/kg, whereas we used a two-hit mouse model more representative of the recognized two-hit hypothesis of human TRALI *8 . This difference may explain the absence of protection against the development of TRALI observed in our study during the inhibition of the CD40/CD40L interaction. Our data suggest that anti-CD40L mAb inhibits neutrophil migration, rather than activating or regulating inflammation in ALI/TRALI in mice. These results are consistent with reports demonstrating the direct impact of antibodies on CD40/CD40L complex inhibition, via Mac-1 on the neutrophil surface [28, 43, 44]. Mac-1 is directly involved in neutrophil migration [45], cellular interactions between neutrophils and platelets via the Mac-1/GPIb complex [46], and communication between neutrophils and endothelial cells [44, 45]. The interaction between platelets and neutrophils may be responsible for amplified platelet sCD40L production, promoting complex formation [47]. Platelet-secreted sCD40L induces chemokine release by endothelial cells, promoting neutrophil attachment and migration in the alveolar space, conditioned by TRALI [48]. sCD40L also influences platelet activation and migration into the alveolar space. Since platelets are an important source of sCD40L and CD40 membrane protein [12], autocrine and paracrine positive feedback would be expected to amplify platelet and (indirectly) neutrophil transmigration, during TRALI onset. Indeed, the involvement of platelets in TRALI has previously been postulated [10, 49]. Neutrophil migration from the blood to the lungs may be dependent on platelet activation, since the close communication between these two cell types enhances neutrophil migration [35, 50]. Notably, the lungs are a significant source of thrombopoiesis in mice, similar to the bone marrow [36]. The changes in BAL platelet levels observed in this study are consistent with both ALI/TRALI-related platelet and neutrophil migration and compensatory pulmonary thrombopoiesis due to ALI-induced thrombocytopenia. In support of this hypothesis, MPV, a platelet activation marker [39], decreased in BAL of mice injected with anti-MHC I (Figure 3C). This may be due to high levels of pulmonary production of new platelets, which would be less likely to be activated and, therefore, lower in volume (Figure S4). The main limitations of this study are : lack of direct visualization of platelet and neutrophil relocation from the vasculature to the lung parenchyma ; lack of direct measurement of communication between neutrophils and endothelial cells, a key parameter in the extravasation of neutrophils to the alveolar space [45] ; and lack of distinction between platelets recruited from the periphery and those produced locally, in the lungs. Our study did not explore monocytes in depth, only their numbers ; although a previous study demonstrated that 34-1-2s anti-MHC I antibody can directly activate this cell type [51]. ALI, and TRALI in particular, likely involves various cell types in addition to neutrophils. Our study shows a regulation of neutrophil and platelet activity under neutralizing anti-CD40L mAb, but this treatment may also prevent other inflammatory cell activity participating in TRALI development. Indeed, several studies mentioned other cells, with the capacity to expose CD40 and/or CD40L on their surface, implicated in some experimental TRALI pathophysiology, like dendritic cells [37], T regulatory lymphocytes [37], pulmonary macrophages [52] and monocytes [51]. Our data address the reversibility of several events that are considered characteristic of ALI and TRALI during lesion development (second hit) ; however, we anticipate that better understanding of patient risk factors and the first-hit of TRALI could suggest prophylactic and curative treatments. Identification of patients at risk for ALI will enable preemptive personalized treatments, facilitating both improved patient management and cost reduction. Overall, our data indicate that improvement of the conditions under which platelet concentrates are prepared and stored to reduce sCD40L levels could help to control of the risk of TRALI. Author contributions ST, FC and OG devised the study hypothesis and wrote the manuscript. ST and FC designed the protocol and trained personnel. ST and CAA collected samples, performed the experiments and statistical analyses. SL and HHC participated in all steps of the process and reviewed the manuscript. Conflicts of Interest None of the authors declare any conflicts of interest. Acknowledgments We are grateful to MA Eyraud and Astrid Meneveaux for their contributions to the original data. We would also like to thank the facility technical staff of the University of Saint-Etienne PLEXAN. This work was supported by grants from the French Blood Establishment (Grant APR), France ; the Agence Nationale de la Sécurité et du Médicament et des Produits de Santé (ANSM - AAP-2012-011, Reference 2012S055) ; the Academic Research Community-1 of the Auvergne-Rhône-Alpes Region ; the French Agence Nationale de la Recherche (ANR-12-JSV1-0012-01) ; and the Association Les Amis de Rémi Savigneux, France. References 1. Roubinian NH, Looney MR, Keating S, Kor DJ, Lowell CA, Gajic O, Hubmayr R, Gropper M, Koenigsberg M, Wilson GA et al : Differentiating pulmonary transfusion reactions using recipient and transfusion factors. Transfusion 2017. 2. P'Ng S S, Hughes AS, Cooney JP : A case report of transfusion-related acute lung injury during plasma exchange therapy for thrombotic thrombocytopenia purpura. 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Data are presented as means SEM (n 410). *p < 0. 01 and *p < 0. 001 indicate significant differences compared with the [LPS] group. #p < 0. 001 indicates a significant difference compared with the [LPS anti-MHC I anti-CD40L] group. Experimental group Plasma IL-6 (pg/ml) Plasma MIP-2 Plasma sCD40L (pg/ml) (pg/ml) PBS 22. 92 0. 38 29. 64 0. 49 144. 38 0. 72 LPS 26. 80 1. 72 32. 00 1. 81 162. 95 1. 03 , # LPS Anti-MHC I 58. 26 9. 43* 97. 25 22. 48* 365. 03 2. 15* LPS Anti-MHC I Anti-CD40L 47. 58 5. 52* 91. 75 23. 86* 223. 75 5. 82 LPS Anti-CD40L 28. 71 1. 717 36. 43 2. 59 157. 10 1. 60 Figure Legends Figure 1. Evaluation of ALI development. Survival curves (A) and rectal temperatures (B) were measured for each experimental group. The general appearance of the lungs (C) is represented for each group of mice. Wet lung to body weight ratio (D) and BAL total protein concentration (E) were measured for each group of mice. Lung microarchitecture is presented after H&E staining (F) for each group of mice (Original magnification x400). Scale bar, 50 m. Pulmonary cellular exudate area was measured in ratio to the microscopic field (G). Data are presented as means SEM (n 410). *p < 0. 05, *p < 0. 01, and *p < 0. 001 indicate differences between the [LPS] and [LPS anti-MHC I] groups ; p < 0. 05, p < 0. 01, and p < 0. 001 indicate differences between the [LPS] and [LPS anti- MHC I anti-CD40L] groups ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, and #p < 0. 001 indicate differences between the [LPS anti-MHC I] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] groups. Figure 2. Evaluation of cell migration. Numbers of platelets in peripheral blood (A) and BAL (B), and of leukocytes, neutrophils, and monocytes in peripheral blood (C) were measured for each group of mice. Immunohistochemistry staining characteristic of platelet (CD41) (D) and neutrophil (Ly6G) (E) infiltration in the lungs are presented for each mouse group (Original magnification x400). Scale bar, 50 m. Blood and BAL platelet proportions are presented for each group of mice (F). Data are presented as means (n 410). p < 0. 05, p < 0. 01, and p < 0. 001 indicate differences between the [PBS] and [LPS] groups ; *p < 0. 05, *p < 0. 01, and *p < 0. 001 indicate differences between the [LPS] and [LPS anti-MHC I] groups ; p < 0. 05, p < 0. 01, and p < 0. 001 indicate differences between the [LPS] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] groups ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, and #p < 0. 001 indicate differences between the [LPS anti-MHC I] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] groups. Correlation between blood and BAL platelet levels (G) was evaluated for all mice (n 38). Spearman's correlation and the coefficient of determination are represented by r and r, respectively, and p < 0. 05 was considered statistically significant. Figure 3. Evaluation of neutrophil and platelet activation. Quantification of MPO (A) and PF4 (B) in both plasma and BAL. MPV, in whole blood and BAL (C), was determined by MS4 analysis for each group of mice. TxB2 in BAL (D) was evaluated by ELISA for each group of mice. Data are presented as means SEM (n 410). *p < 0. 05, *p < 0. 01, and *p < 0. 001 indicate differences between the [LPS] and [LPS anti-MHC I] groups ; p < 0. 05, p < 0. 01, and p < 0. 001 indicate differences between the [LPS] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] groups ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, and #p < 0. 001 indicate differences between the [LPS anti-MHC I] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] groups. Figure 4. Evaluation of neutrophil and platelet interaction. The proportion of blood NPA in neutrophil populations (A) was determined by flow cytometric analysis for each group of mice. The percent NET increase in blood (B) was evaluated by immunoassay for each mouse group. Mac-1 and CD40 MFI values for circulating neutrophils (C) are presented for each mouse group. Data are presented as means SEM (n 29). *p < 0. 05, *p < 0. 01, and *p < 0. 001 indicate differences between the [LPS] and [LPS anti-MHC I] groups ; and #p < 0. 05, #p < 0. 01, and #p < 0. 001 indicate differences between the [LPS anti-MHC I] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] groups. Correlation between Mac-1 and CD40 expression (D) was tested using data from all mice. Data are presented as MFI values for each mouse (n 19). Spearman's correlation and the coefficient of determination are indicated by r and r, respectively, and p < 0. 05 was considered statistically significant. Immunofluorescence was used to evaluate co-localization of neutrophils and platelets in the pulmonary interstitium (E) for each group of mice. DAPI (blue, laser exposition 100ms/14V), Alexa fluor 488 (green, laser exposition 1s/31. 4V), and Cy5 (red, laser exposition 30s/64V), represent nuclei, CD41 and Ly6G, respectively. Overlays were applied using these fluorescence signals (Original magnification x600). Scale bar 20 m. Figure 5. Evaluation of inflammation 2 h after treatment. Levels of IL-6 (A), MIP-2 (B), and sCD40L (C) in plasma were evaluated by immunoassay for each group of mice. Data are presented as means (n 410). *p < 0. 05, *p < 0. 01, and *p < 0. 001 indicate differences between the [LPS] and [LPS anti-MHC I] groups ; p < 0. 05, p < 0. 01, and p < 0. 001 indicate differences between the [LPS] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] groups ; and #p < 0. 05, # p < 0. 01, and # p < 0. 001 indicate differences between the [LPS anti-MHC I] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] groups. Figure 6. Changes in mouse status 48 h after treatment. Blood (A) and BAL (B) platelets, blood leukocytes (C), neutrophils (D), and monocytes (E) were compared between [PBS] and [LPS anti- MHC I anti-CD40L] groups at 2 h and evaluated in other [PBS] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mice after 48 h. Plasma IL-6 (F), MIP-2 (G), and MPO (H) were compared between [PBS] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mice after 2 h and evaluated in other [PBS] and [LPS anti-MHC I anti- CD40L] mice after 48 h by immunoassay. Data are presented as means (n 410). *p < 0. 05, *p < 0. 01, and *p < 0. 001. Figure 1 D E LPS Anti-MHC I C PBS LPS LPS Anti-MHC I Anti-CD40L LPS Anti-CD40L F PBS LPS LPS Anti-MHC I LPS Anti-MHC I Anti-CD40L LPS Anti-CD40L G Figure 2 A B C PBS LPS LPS Anti-MHC I LPS Anti-MHC I Anti-CD40L LPS Anti-CD40L CD41 Ly6G F G Figure 3 A B C D Figure 4 A B C D LPS PBS Anti-CD40L LPS LPS Anti-MHC I Anti-CD40L LPS Anti-MHC I Figure 5 A B Figure 6 A B C D E F G H Supplemental data Figures Figure S1 : TRALI experimentation The different injections performed during the TRALI mouse study are presented. PBS or LPS (at 0. 1 mg/kg) was injected, intraperitoneally, 24 hours before isotype control or anti-MHC I mAb (at 1 mg/kg) intravenous injection. The injection of isotype control or neutralizing anti-CD40L mAb (at 4 mg/kg) was performed, intravenously, 30 minutes prior to isotype control or anti-MHC I mAb intravenous administration. Figure S2 : Pulmonary hemorrhage Pulmonary hemorrhage was observed, after H&E staining, exclusively in the [LPS Anti-MHC I] group. Red blood cells were infiltrated in the lung interstitium, around the pulmonary artery (observation x400). Scale bar 50 m. Figure S3 : Fluid excretion In more than 95 % of [LPS anti-MHC I] mice, fluid was found directly in the trachea whereas this phenomenon was observed only exceptionally (< 1 %) in the [LPS anti-MHC I anti-CD40L] group. The black area indicates the trachea, and the blue area indicates fluid. Figure S4 : BAL MPV evaluation Correlation was tested between BAL platelet count and BAL MPV, including all mice (n 38). Spearman's correlation and the coefficient of determination are represented respectively by r and r symbols and p < 0. 05 is considered statistically significant. BAL platelet count and BAL MPV are significantly and negatively correlated (p < 0. 0001 and r -0. 7374) (A). An overlay of a BAL [LPS], [LPS anti-MHC I] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mouse MS4 platelet histogram is represented. We hypothesize that the dotted line represents de novo platelets and the full line is characteristic of migrated and activated platelets. In this histogram, [LPS] mouse MPV is 8. 4 fL, [LPS anti-MHC I] mouse MPV is 6. 7 fL and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mouse MPV is 7. 5 fL (B). These results show that de novo platelets from the lungs presumably compensate for peripheral blood thrombocytopenia, particularly in the [LPS anti-MHC I] mice and to a lesser extent, due to the limited but persistent thrombocytopenia, in the [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mice. Figure S5 : NPA, Mac-1 and CD40 cytometry process The cytometry process is presented. NPA frequency was evaluated directly in the CD45 /Ly6G neutrophil population via a FITC-anti-CD41 mAb fluorescence signal (A). Mac-1 MFI was evaluated directly in the CD45 /Ly6G neutrophil population via a FITC-anti-Mac-1 mAb fluorescence signal (B). CD40 MFI was evaluated directly in the CD45 /Ly6G neutrophil population via a Pacific Blue TM-anti- CD40 mAb fluorescence signal (C). The red spectrum represented a [LPS anti-MHC I] mouse and the blue spectrum represents a [LPS anti-MHC I anti-CD40L] mouse. Figure S6 : Survival rate after 48 hours The mortality percentage is represented for the [PBS] and [LPS anti-MHC I anti-CD40L] groups over 48 hours. No survival difference was observed between these two groups after 48 hours. Manuscrit V : La neutralisation du complexe protéique CD40/CD40L protège les souris de l'atteinte pancréatique induite lors du développement du TRALI The inhibition of CD40/CD40L complex protects mice against TRALI-induced pancreas degradation Article soumis dans Respiratory Research Le TRALI est considéré comme l'une des réactions transfusionnelles avec la mortalité la plus élevée [27]. Cette pathologie est caractérisée par une atteinte pulmonaire sévère justifiant ce fort taux de mortalité. La pathogénie du TRALI se rapproche de celle de plusieurs pathologies inflammatoires, telles que la pancréatite ou encore les pathologies inflammatoires de l'intestin. La physiopathologie du TRALI repose sur l'activation de plusieurs cellules de l'inflammation initiant la migration, dans l'espace alvéolaire, de ces mêmes cellules [16]. Lors de la pancréatite une mécanistique similaire, orchestrée par la migration des neutrophiles dans le tissu lésé, peut-être observée [279]. Nous émettons l'hypothèse que lors de l'induction du TRALI, des organes plus profonds, tels que le pancréas, peuvent être une cible secondaire. Parce que les deux pathogénies, celle de la pancréatite et du TRALI, sont étroitement liées, nous émettons également l'hypothèse d'une implication du couple protéique CD40/CD40L dans l'amplification de la pancréatite induite suite au développement d'un TRALI (implication préalablement démontrée dans le manuscrit IV de ce travail de thèse). . En utilisant, ici, un modèle animal de l'ALI, induit par injection successive de LPS et d'anticorps anti-CMH I, et un traitement préventif à base d'anticorps anti-CD40L, nous avons pu démontrer que l'atteinte pancréatique, observée dans notre modèle pathologique, est sensiblement prévenue lors de l'inhibition du complexe immun CD40/CD40L. Inhibition of the CD40/CD40L complex protects mice against TRALI-induced pancreas degradation Sofiane Tariket1, 2, Charles-Antoine Arthaud2, Sandrine Laradi1, 2, Thomas Bourlet1, Philippe Berthelot1, Hind Hamzeh-Cognasse1, Olivier Garraud1, 3, Fabrice Cognasse1, 2 Université de Lyon, GIMAP-EA3064, Saint-Etienne, France Établissement Français du Sang Rhône-Alpes-Auvergne, Saint-Etienne, France Institut National de Transfusion Sanguine (INTS), Paris, France *Address for correspondence and reprint requests : Dr Fabrice Cognasse, PhD, Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes and GIMAP-EA 3064, Université de Saint-Etienne. Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes, 25 Boulevard Pasteur, 42100 Saint-Etienne. Telephone : 33 (0) 683975883 ; Fax : 33 (0) 477421486 ; E-mail : fabrice. cognasse@efs. sante. fr Keywords : TRALI, CD40/CD40L, pancreas, lung, inflammation Running title : TRALI and pancreas The authors declare that they have no conflicts of interest. Word count : 2, 368 ; Abstract : 182 ; References : 61 ; Figures : 5 ; Tables : 0 ; Supplemental figure : 0 ; Supplemental table : 4 ABSTRACT : Acute lung injury is a severe complication of transfusion. In a previous study, we saw that inhibition of the CD40/CD40L complex allowed restoration of ALI lesions in an experimental mouse model. This study focused on pancreas-associated injury development during experimental ALI pathogenesis and its limitation through CD40/CD40L complex inhibition. An ALI mouse model was established through intraperitoneal lipopolysaccharide and intravenous anti-MHC I mAb injection. Pre-emption of lesions was achieved with intravenous injection of neutralizing anti-CD40L mAb, 30 minutes prior to the trigger, i. e. , anti-MHC I mAb, administration. Histology and immunoassay analyses were used to evaluate pancreas lesions. ALI development induced significant degradation of the lungs and pancreas and was associated with pancreas lesions. Different scores were established showing more severe injury to the pancreas in TRALI conditions ; however injury was significantly reduced through CD40/CD40L complex inhibition. This study supports the idea that several organs are exposed during ALI development, and particularly when such experimental ALI aims at mimicking transfusion- associated ALI (TRALI) ; nevertheless, preventive treatment inhibiting CD40/CD40L (sCD40L) complex formation provides protection from lung disease and also disease of other organs, like pancreas. Abbreviations : TRALI : Transfusion-Related Acute Lung Injury INTRODUCTION Transfusion-related acute lung injury (TRALI) is acute lung injury (ALI) that occasionally occurs within 6 hours of blood component transfusion. Development of pulmonary edema is associated with dyspnea, tachypnea and hypoxia (1). The consequences of this respiratory risk are significant. TRALI is associated with a high mortality rate (16. 5%), reported between 2007 and 2008, according to French Hemovigilance (ANSM) (2). TRALI is generally considered to be the result of a two-hit mechanism (3). An inflammatory condition in the patient as well as severe disease induces pre-activation of polymorphonuclear cells that are prone to migrate to the lung epithelium (4). This step results in exacerbation of membrane molecule adhesion expression on several cell types such as neutrophils, platelets and endothelial cells (5). The second event is triggered by anti-leukocyte antibodies and/or biological response modifiers (BRMs) present in the transfused blood component(s). Antibodies may be anti-HLA class I and II or anti-HNA (6). These different agents lead to PMN activation and migration in the alveolar space, aided by an increase in microvascular permeability (7). The reference TRALI mouse model used in this study was proposed by Looney et al. The principle is based on mouse priming with intraperitoneal injection of lipopolysaccharides (LPS) 24 hours prior to the challenge intravenous anti-MHC I mAb injection (8). The LPS injection provokes an inflammatory state in mice but without direct induction of ALI development, contrary to alternate LPS-induced ALI mouse models (9, 10). Under inflammatory conditions, particularly in ALI, there is exacerbation of communications between circulating neutrophils and endothelial cells with expression of adhesion molecules such as E-selectin, P-selectin and ICAM1 on endothelial cells and PSGL-1, L-selectin, Mac-1 on neutrophils (11). This phenomenon is not exclusive to the lung capillary endothelium. Pancreas (12, 13), gut (14, 15), liver (16) and also kidney (17) can be the targets of inflammatory injury, as shown in several experimental mouse models, and are adhesion molecule expression-dependent which can be associated with inflammatory cell infiltration in inflamed tissue. These pathophysiological features evoke a narrow border between lung involvement, observed during ALI, and multi-organ injury. Neutrophil transmigration, determining the severity of ALI and pancreatitis pathogenesis, seems to be regulated through CD40/CD40L intercommunication (18-20). The interaction between CD40 and CD40L plays a proinflammatory role alongside involvement of costimulation in the innate and adaptive immune system ; it is dysregulated in certain types of cancer (21) and autoimmune diseases (22). CD40 is predominant on the antigen-presenting cell surface. CD40L is expressed on the membrane of different immune cells. However, the soluble and agonist form of CD40L is secreted in 95% of cases by platelets (23). This immune mediator seems to be significantly involved in transfusion reaction as it is regulated during platelet concentrate storage (24). The CD40/CD40L protein complex has been, for a long time, a way of resolving ALI as experimentally tested in many mouse models (25-27). We recently provided evidence of neutralization of the CD40/CD40L complex to protect mice from ALI development (article submitted for publication). This study reports on pancreas dysfunction during ALI pathogenesis and on the involvement of the CD40/CD40L immune complex. We hypothesized that using preventive injection of neutralizing anti- CD40L mAb in a mouse model of ALI, both lung and associated organ (i. e. , pancreas) degradation would be limited, offering interesting avenues for furthering understanding of transfusion-associated pathophysiology and for managing high-risk patients. MATERIALS AND METHODS Study approval The animals were authorized for handling by the Ethics Committee and the French Ministry of Higher Education and Research (approval number : CU14N11). Mice Male BALB/c WT mice were purchased from Charles River (Charles River, Wilmington, USA). All experiments were conducted using mice between 8- and 12-weeks-old. For each experiment, a minimum of 4 mice was used. The mice were randomly divided into different groups (PBS [baseline] vs. LPS [study control] vs. LPS Anti-MHC I mAb [ALI model] vs. LPS Anti-MHC I mAb neutralizing anti-CD40L mAb [treated mice] vs. LPS Anti-CD40L mAb [treatment control]). Animal experimentation Male H2Kd BALB/C mice were primed with i. p. LPS injection, extracted from Escherichia Coli (0111) (InvivoGen, San Diego, USA), at 0. 1 mg/kg 24 hours prior to challenge with i. v. anti-MHC I mAb (34-1-2s) (H2Kd ; IgG2a, ) or IgG2a, isotype control (eBM2a) (eBioscience, San Diego, USA) injection at 1 mg/kg. Mice were pretreated, 30 minutes prior to challenge with anti-MHC I mAb or IgG2a, isotype control, with intravenous anti-CD40L mAb (MR1) or IgG3, Isotype control (E36-239) (BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA) administration at 4 mg/kg (Figure 1). Intracardiac puncture was performed using a 25-gauge sterile needle and 100 l of ACD anticoagulant (Sigma Aldrich, Saint- Louis, USA). The tail vein injections were performed using a 30-gauge sterile needle. Anaesthesia combined intraperitoneal ketamine (100 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg) administration when mice appeared moribund or after 2 hours. After death, BAL was performed by cannulating the trachea with a 25-gauge catheter and using a 1 ml injection of cold PBS flushed back three times. The lungs and pancreas of the mice were collected and placed in 4% paraformaldehyde (Sigma Aldrich, Saint- Louis, USA) overnight. Pulmonary edema evaluation Rectal temperature was measured with a rectal probe and a digital thermometer (Bioseb, Pinellas Park, USA), once prior to anti-MHC I mAb injection and then every 10 minutes for 2 hours or until death. Mouse survival rate was evaluated over 2 hours. Extravascular lung water was measured using lung to body weight ratio. The BAL was centrifuged at 491 g for 10 minutes. On the BAL supernatant, the Bradford technique was used to test total proteins in the lungs. Plasma samples were collected and stored after centrifugation at 491 g for 10 minutes. Pancreatitis evaluation A histological score was used to evaluate development of pancreatitis, as previously described (28). Briefly, pancreatic edema, necrosis, hemorrhage and leukocyte infiltration were evaluated by microscopic observation. The score was determined between 0, representing no parameter observation, and 4, representing maximal severity. The pancreatitis histological score criteria were shown in supplemental tables 1-4. Finally, pancreatic lipase and amylase (CliniSciences, Nanterre, France) were measured in plasma according to the manufacturer's instructions to evaluate pancreas injury. Inclusions and sections The pancreas and lungs were collected and placed in paraformaldehyde at 4% for 24 hours. They were then embalmed in OCT (CML, Nemours, France). The cryomolds of OCT were placed over liquid nitrogen to induce rapid OCT solidification. The OCT cryomolds were stored at -80C. 8 m sections were produced using the cryostat microtome (Leica Microsystem, Nanterre, France). Lungs and pancreas sections were stained according to the H&E protocol (Sigma-Aldrich, Saint Louis). Microscopic observations were carried out using the Nikon DS-RI2 camera and Nikon NIS-Elements software (Nikon, Tokyo, Japan). Statistic tests Statistical analyses were performed using GraphPad Prism 5 software (Graph ad, San Diego, USA). ANOVA with post-hoc Bonferroni correction was used for comparisons among more than two groups of data with normal distribution, with the Kruskal-Wallis and Dunn's post-hoc tests applied for comparisons among non-normally distributed data. Temperature and mouse ALI scores over 48 h were calculated using two-way analysis of variance. P-values < 0. 05 were considered significant. RESULTS Successive injection of LPS and anti-MHC I antibodies induces ALI development in mice Initially, we observed a drastic decrease in the survival rate of mice that developed ALI (30%), which was not observed in the [PBS] and [LPS] groups (Figure 2, A). Rectal temperature measurement in the mice, a characteristic of pathological shock, demonstrated a severe and rapid decrease following injection of the anti-MHC I antibodies in the mice primed with LPS. The drop in temperature occurred from the first 20 minutes to reach around 30C after 40 minutes and until the end of the experiment. No significant temperature loss was measured in the [PBS] and [LPS] mice (Figure 2, B). Development of pulmonary edema was evaluated according to two parameters ; the ratio between the weight of the lungs and the mice and total protein concentration in the BAL. These two tests were significantly increased in [LPS anti-MHC I] mice compared to [PBS] and [LPS] mice (p < 0. 001) (Figure 2, C and D). Finally, H&E staining confirmed the increase in pulmonary infiltration in mice mimicking TRALI compared to the two control groups (Figure 2, E). Pancreas is one of the secondary targets in a mouse model of ALI Histological evaluation of pancreatitis, by H&E staining, showed significant tissue degradation in LPS- primed mice injected with anti-MHC I antibodies compared to mice without anti-MHC I antibody injection (Figure 3, A). These findings are correlated with histological pancreatitis scores, characterized by an increase in pancreatic edema (Figure 3, B), necrosis (Figure 3, C) and hemorrhage amplification (Figure 3, D). However, pancreas leukocyte infiltration is slightly increased during development of ALI, significant only compared to the [PBS] group (Figure 3, E). Plasma pancreatic lipase and amylase release was significantly increased after anti-MHC I antibody injection ([PBS], p [LPS], p (Figure 3, F and G). Neutralizing anti-CD40L mAb injection protects mice from experimental ALI development Firstly, we observed inhibition of ALI development following injection of neutralizing anti-CD40L antibodies, 30 minutes before administration of anti-MHC I antibodies. The survival rate dropped to 25% after the 2-hour experiment. In the group of mice treated with neutralizing anti-CD40L antibodies, we found a maximum rate of 100% (Figure 4, A). Rectal temperature was also used as a marker of pathological shock. While the mice in the [LPS anti-MHC I] group exhibited a drop in temperature to around 29C after 2 hours, injection of neutralizing anti-CD40L antibodies prevented this drop. In fact, body temperature was significantly higher at each interval compared to the [LPS anti-MHC I] mice. A decrease of around 2C was observed in the first 80 minutes followed by a return to normal levels (> 36C) in the last hour (Figure 4, B). Preventive injection of neutralizing anti-CD40L antibodies significantly limits the increase, normally observed in the case of anti-MHC I injection- induced-ALI, in the lung to body weight ratio and total protein concentration in the BAL (Figure 4, C and D). These results are confirmed by evaluation of pulmonary infiltration after H&E staining of lung sections (Figure 4, E). Pancreas injury, during experimental ALI, is prevented with neutralizing anti-CD40L mAb treatment Firstly, histological analysis of the pancreas showed increased injury associated with ALI development in mice (Figure 5, A). Pancreatic edema, necrosis and hemorrhage were significantly more severe in the [LPS anti-MHC I] group than in the treated mice (p < 0. 05) (Figure 5, B, C and D). However, leukocyte infiltration is equivalent between the two groups, justified by weak detection of leucocytes in the pancreas following the successive injection of LPS and anti-MHC I antibodies in mice mimicking TRALI (Figure 5, E). Evaluation of pancreatic dysfunction, characterized by significant release of pancreatic lipase and amylase in the plasma, suggests inhibition of ALI induced-pancreatitis following injection of neutralizing anti-CD40L antibodies (Figure 5, F and G). DISCUSSION To some extent, this model aims to reproduce TRALI experimentally. Indeed, this model relies on circulating inflammatory cell activation by a bacterial mediator, LPS, i. e. , the initiator, and the formation of an immune complex using anti-MHC I antibodies, i. e. , the trigger. This activation regulates migration of leukocytes from the blood compartment to the alveolar space, a key parameter of TRALI. This study describes, for the first time, multiple organ damage in an animal model of ALI induced by LPS and anti-MHC I antibody injection Histological evaluation of pancreatic lesions and the measurement of plasma soluble markers, reflecting degradation of the tissue, suggested multiple organ injury occurred in this murine model of ALI (Figure 4 and 5). In this model, development of the pathology is dependent on hyper-activation of the inflammatory state of the mice (29). Moreover, such an inflammatory response is observed in other pathologies, notably during pancreatitis (30, 31). Indeed, during acute pancreatitis, migration of neutrophils into the pancreatic tissue is amplified (12, 32-34). Migration involves several adhesion molecules expressed on the neutrophil surface, such as Mac-1, CD62L or LFA-1 (35, 36). Pancreatic leukostasis is also dependent on the activity of the endothelium which, during exacerbated inflammation, expresses ICAM-1 and JAM-C on its surface, which can then bind to neutrophils and cause them to transmigrate (37-39). Similarly to TRALI, platelets appear to play a significant role in the induction of pancreatitis. Several observations indicate increased platelet activity in the above- mentioned pathology (40-42). They also participate in neutrophil activation, migration and complex formation with themselves (43, 44). Therefore, pancreatitis appears to share certain pathophysiological features similar to that of ALI/TRALI. Some findings, indeed, evoke a narrow frontier between pancreatitis and ALI (45-48). Secondly, we were able to demonstrate overall protection of the lungs following CD40/CD40L immune complex inhibition (Figures 2 and 3). We investigated the role of this immune complex, CD40/CD40L, because, within transfusion reactions, sCD40L is involved due to its increased concentration during storage of platelet components (49, 50) and its direct impact in febrile and allergic transfusion reactions (51). The interaction between CD40L and its ligand, CD40L, plays a seminal role in cellular communication, especially between platelets, neutrophils and endothelial cells (52). Under the influence of this protein complex, neutrophils significantly increased the expression of Mac-1, a membrane protein involved in cellular communication and neutrophil leukostasis (18-20, 53). In different conditions, the CD40/CD40L protein complex contributes to vascular dysfunction (54), to the expression of adhesion molecules (55-57), to the production of inflammatory soluble mediators (55, 58-60), to leukocyte and platelet adhesion to the vascular wall (20, 52, 61, 62) and, lastly, to the migration of these attached cells. By blocking some of these mechanisms, development of ALI is therefore inhibited, thus protecting the lungs from the induction of respiratory distress and the pancreas from acute pancreatitis. These results suggest multiple organ injury in ALI/TRALI, at least under experimental conditions, which may explain morbidity and even mortality. Pulmonary insult is still the main consequence and often the cause of patient death ; however a multi-organ target would decrease the chances of patient survival. Other organs such as the intestine, liver or kidneys deserve further investigation during ALI. This investigation confirms that ALI/TRALI can either be prevented or reversed ; it also provides interesting clues as to understanding of the hyper inflammation state induced in pancreatitis and possible therapeutic avenues. Acknowledgements The authors extend their thanks to the personnel at PLEXAN for their technical support on the animal models throughout our studies. This work was supported by grants from the Association Les Amis de Rémi. , the Agence Nationale de la Recherche (ANR), reference ANR-12-JSV1-0012-01. and the French National Agency for Medicines and Health Products Safety (ANSM - AAP-2012-011, Reference 2012S055). REFERENCES 1. Vlaar AP, Juffermans NP. Transfusion-related acute lung injury : a clinical review. Lancet 2013 ; 382 : 984-994. 2. Ozier Y, Muller JY, Mertes PM, Renaudier P, Aguilon P, Canivet N, Fabrigli P, Rebibo D, Tazerout M, Trophilme C, Willaert B, Caldani C. Transfusion-related acute lung injury : reports to the French Hemovigilance Network 2007 through 2008. Transfusion 2011 ; 51 : 2102-2110. 3. Silliman CC. The two-event model of transfusion-related acute lung injury. Critical care medicine 2006 ; 34 : S124-131. 4. Middelburg RA, van der Bom JG. Transfusion-related acute lung injury not a two-hit, but a multicausal model. Transfusion 2014. 5. Doerschuk CM. Mechanisms of leukocyte sequestration in inflamed lungs. 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Experimental treatment firstly involved intraperitoneal injection of LPS (E. coli 0111) at 0. 1 mg/kg followed by neutralizing anti-CD40L mAb (MR1) intravenous injection at 4 mg/kg, 30 minutes prior to intravenous anti-MHC I mAb (34-1-2s) at 1 mg/kg. Mice were followed-up for 2 hours after anti-MHC I mAb injection (B). A B C D E PBS LPS LPS Anti-MHC I Figure 2 : Anti-MHC I mAb injection induces ALI development Survival curve (A) and rectal temperature (B) were measured. Wet lung to dry lung ratio (C) and BAL protein concentration (D) were evaluated to represent pulmonary edema. Data are given as the mean SEM (n 8). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent differences between [PBS] and [LPS anti-MHC I] groups. #p < 0. 05 ; #p < 0. 01 and #p < 0. 001 represent differences between [LPS] and [LPS anti-MHC I] groups. Lung microarchitecture was observed after H&E staining (observation x400) (E). Scale bar : 50 m. A PBS LPS LPS Anti-MHC I B C D E F G Figure 3 : Anti-MHC I mAb injection induces pancreatitis development Pancreatic microarchitecture is represented through H&E staining (observation x400) (A). Scale bar : 50 m. Pancreatic edema (B), necrosis (C), hemorrhage (D) and leukocyte infiltration (E) were determined through pancreatic histological score criteria. Immunoassay of plasma pancreatic lipoprotein lipase (F) and amylase (G) was performed to evaluate pancreatic dysfunction. Data are given as the mean SEM (n 6 - 8). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent differences between [PBS] and [LPS anti-MHC I] groups. #p < 0. 05 ; # p < 0. 01 and # p < 0. 001 represent differences between [LPS] and [LPS anti-MHC I] groups. A B C D E LPS Anti-MHC I LPS Anti-CD40L Anti-MHC I LPS Anti-CD40L Figure 4 : Anti-CD40L mAb injection protects from ALI development Survival curve (A) and rectal temperature (B) were measured for each group of mice. Wet lung to dry lung ratio (C) and BAL protein concentration (D) were evaluated to represent pulmonary edema development. Data are presented as mean SEM (n 8). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent differences between [LPS anti-MHC I] and [LPS Anti-MHC I Anti-CD40L] groups. #p < 0. 05 ; #p < 0. 01 and # p < 0. 001 represent differences between [LPS anti-MHC I] and [LPS Anti- CD40L] groups. p < 0. 05 ; p < 0. 01 and p < 0. 001 represent differences between [LPS anti-MHC I Anti-CD40L] and [LPS Anti-CD40L] groups. Lung microarchitecture was observed after H&E staining (observation x400) (E). Scale bar : 50 m. LPS Anti-CD40L A LPS Anti-MHC I Anti-MHC I LPS Anti-CD40L B C D E F G Figure 5 : Anti-CD40L mAb injection protects from ALI development Pancreatic microarchitecture is represented through H&E staining (observation x400) (A). Scale bar : 50 m. Pancreatic edema (B), necrosis (C), hemorrhage (D) and leukocyte infiltration (E) were determined through pancreatic histological score criteria. Immunoassay of plasma pancreatic lipoprotein lipase (F) and amylase (G) was performed to evaluate pancreatic dysfunction. Data are given as the mean SEM (n 6 - 8). *p < 0. 05 ; *p < 0. 01 and *p < 0. 001 represent differences between [LPS anti-MHC I] and [LPS Anti-MHC I Anti-CD40L] groups. #p < 0. 05 ; #p < 0. 01 and #p < 0. 001 represent differences between [LPS anti-MHC I] and [LPS Anti-CD40L] groups. SUPPLEMENTAL DATA Supplemental table 1 : Pancreatic edema score Edema 0 Absent 0. 5 Focal expansion of interlobar septae 1 Diffuse expansion of interlobar septae 1. 5 Same as 1 focal expansion of interlobular septae 2 Same as 1 diffuse expansion of interlobular septae 2. 5 Same as 2 focal expansion of interacinar septae 3 Same as 2 diffuse expansion of interacinar septae 3. 5 Same as 3 focal expansion of intercellular spaces 4 Same as 3 diffuse expansion of intercellular spaces Supplemental table 2 : Pancreatic necrosis score Acinar necrosis 0 Absent 0. 5 Focal occurrence of 1-4 necrotic cells/HPF 1 Diffuse occurrence of 1-4 necrotic cells/HPF 1. 5 Same as 1 focal occurrence of 5-10 necrotic cells/HPF 2 Diffuse occurrence of 5-10 necrotic cells/HPF 2. 5 Same as 2 focal occurrence of 11-16 necrotic cells/HPF Diffuse occurrence of 1 1-16 necrotic cells/HPF (foci of confluent necrosis) 3. 5 Same as 3 focal occurrence of > 16 necrotic cells/HPF 4 > 16 necrotic cells/HPF (Extensive confluent necrosis) Supplemental table 3 : Pancreatic hemorrhage score Hemorrhage and fat necrosis 0 Absent 0. 5 1 focus 1 2 foci 1. 5 3 foci 2 4 foci 2. 5 5 foci 3 6 foci 3. 5 7 foci 4 8 foci Supplemental table 4 : Pancreatic leukocyte infiltration score Inflammation and perivascular infiltrate 0 0-1 intralobular or perivascular leukocytes/ HPF 0. 5 2-5 intralobular or perivascular leukocytes/ HPF 1 6-10 intralobular or perivascular leukocytes/ HPF 1. 5 11-15 intralobular or perivascular leukocytes/ HPF 2 16-20 intralobular or perivascular leukocytes/ HPF 2. 5 21-25 intralobular or perivascular leukocytes/ HPF 3 26-30 intralobular or perivascular leukocytes/ HPF 3. 5 >30 leukocytes/HPF or focal microabscesses 4 >35 leukocytes/HPF or confluent microabscesses Discussion et perspectives Lors de la transfusion sanguine, plusieurs types de réactions peuvent survenir chez le receveur. On parle alors d'effets indésirables receveurs ou EIR [280]. Parmi ces différentes réactions, 4 sont considérées comme inflammatoires aigus ou subaigus, c'est le cas des réactions fébriles non-hémolytiques (RFNH), des réactions allergiques, des hypotensions et des TRALI [281]. D'après le dernier rapport d'hémovigilance de France, ces réactions représentent 43, 95% des EIR déclarés en 2015, indépendamment du type de produit transfusé. Les plaquettes sanguines jouent un rôle prépondérant lors du déclenchement et le devenir de ces complications transfusionnelles, selon deux points de vue : i) depuis les concentrés plaquettaires, o elles ont la capacité de produire une multitude de médiateurs solubles inflammatoires, ii) et directement au sein de l'organisme, o elles participeront activement à l'activation, le maintien et l'amplification de l'état inflammatoire induit lors de ces pathologies. Ce travail de thèse est construit au regard de ces deux points de vue. Tout d'abord nous voulons évaluer le potentiel inflammatoire des concentrés plaquettaires, ayant induit un EIR ou non, sur l'un des principaux types cellulaires protagonistes lors de l'inflammation, l'endothélium vasculaire. Puis, par une approche in vivo, nous avons voulu investiguer l'influence des plaquettes sanguines au sein de l'organisme sur le développement de l'inflammation, tout d'abord dans un contexte général, lors d'une inflammation induite par voie systémique, puis dans un cas particulier, celui du TRALI. les CP peuvent être impliqués dans le déclenchement de ces différentes réactions transfusionnelles inflammatoires [27]. Les RFNH résultent d'une activation des cellules inflammatoires orchestrée par la présence d'anticorps anti-leucocytaires et de médiateurs solubles pro-inflammatoires [282]. Ces médiateurs solubles peuvent aussi être responsables de l'induction des réactions allergiques transfusionnelles lorsqu'ils se fixent sur les cellules cibles que sont les mastocytes ou les basophiles, on parle alors de voie indépendante des allergènes [283]. La physiopathologie des réactions transfusionnelles hypotensives est mal connue. A l'heure actuelle, l'origine du déclenchement de cette complication est accordée aux médiateurs solubles présents dans les PSL, et en particulier à la bradykinine [284]. Enfin, le TRALI est considéré comme la réaction transfusionnelle inflammatoire la plus sévère, mais aussi la plus rare. Cette pathologie peut être induite par des anticorps anti-leucocytaires, c'est le cas des TRALI immunologiques, mais aussi par des médiateurs solubles présents dans les PSL, on parle alors de TRALI non- immunologique [285, 286]. Les CP sont donc des coupables tout désignés. En effet, la multitude de médiateurs solubles secrétés pendant le stockage de ces PSL peut-être responsable du déclenchement de ces différents EIR. On retrouve des BRM pouvant activer directement les leucocytes, tels qu'IL-1, IL-7, IL-8, RANTES, ENA-78 mais également des médiateurs solubles ciblant l'endothélium vasculaire, par exemple IL-6, les microparticules plaquettaires, TNF-, le facteur de croissance épidermique (EGF), sCD40L ou encore VEGF [7]. Notre équipe à même déjà démontré que la prédisposition génétique de certains donneurs de sang, notamment la présence de certains polymorphismes dans la région promotrice du gène CD40L, pouvait amplifier le niveau d'expression de la protéine [287]. Ainsi, certains PSL seraient plus susceptibles d'induire un EIR inflammatoire que d'autres. L'inflammation est souvent décrite vis-à-vis des leucocytes mais l'endothélium vasculaire est lui aussi un protagoniste non négligeable. Ce dernier est une cible privilégiée des BRM retrouvés dans les CP. C'est pourquoi, au cours de cette thèse, nous avons voulu évaluer le potentiel inflammatoire des productions des CP sur les cellules endothéliales, cellules cibles lors des EIR. Peu d'études ont déjà évalué le potentiel des sécrétions des CP à activer l'endothélium. Une première étude a démontré, in vitro, que les composés présents dans les surnageants des CP, poolés ou issues d'aphérèse, agissent sur la production de médiateurs solubles de la part des cellules endothéliales et favorisent la migration des leucocytes à travers cette dernière [47]. Une seconde équipe, par l'utilisation de modèles in vitro et in vivo, a observé que les plaquettes humaines conservées 5 jours ont un potentiel protecteur contre l'induction de la perméabilité vasculaire moindre par rapport aux plaquettes stockées seulement 1 jours, à 22 ou 4C [288, 289]. Nous apportons donc un point de vue original par l'évaluation de l'impact des médiateurs solubles présents dans les surnageants des CP, ayant induit un EIR ou non et en fonction du temps de stockage, sur le devenir inflammatoire des cellules endothéliales. Nous avons, en effet, pu démontrer que les CP ayant induit un EIR présentent un potentiel inflammatoire plus important que leurs contrôles. L'impact direct sur les cellules endothéliales, caractérisé par une production massive d'endocan et d'IL-6, peut-être corrélé avec les différentes réactions inflammatoires transfusionnelles et en particulier avec le TRALI dont l'atteinte de l'endothélium vasculaire est le paramètre clé lors de l'induction de cette pathologie [290]. En effet, lors du TRALI, la perméabilité vasculaire induite sera un paramètre inéluctable quant à la migration des leucocytes dans l'espace alvéolaire et donc au développement de l'œdème pulmonaire [16]. C'est la raison pour laquelle nous nous sommes intéressés à la production d'endocan par les cellules endothéliales. Effectivement, endocan participe au maintien de l'intégrité vasculaire. Il a un rôle protecteur pour l'endothélium vasculaire contre une agression liée à l'inflammation. Endocan présente une activité anti-inflammatoire. En effet, il est inhibiteur de la cascade d'activation endothéliale dépendamment de l'intégrine leucocytaire, LFA-1 [291]. En empêchant l'entrée des leucocytes dans les tissus interstitiels, endocan réduit l'inflammation, est serait donc un inhibiteur potentiel du TRALI. Sa sécrétion est positivement corrélée avec le développement de nombreuses pathologies inflammatoires, telles que la pneumonie, le SDRA, les cancers, les maladies cardiovasculaires, les maladies chroniques rénales et le sepsis [59-63, 292-295]. La libération excessive d'endocan peut donc être considérée comme un signal d'alerte lors d'un choc pathologique, référant à une tentative de défense de l'endothélium vasculaire à l'encontre d'un signal de stress inflammatoire. Au cours de notre première étude, nous avons démontré que les productions des CP impliqués dans les EIR ont un impact néfaste sur le devenir de l'endothélium. La réponse inflammatoire est augmentée, démontré par une sécrétion endothéliale accrue d'IL-6. Cependant, ce changement inflammatoire semble être associé à une réduction de la viabilité cellulaire et à une augmentation de la mort cellulaire plutôt que des fonctions pro- angiogéniques. Cette réponse cellulaire est corrélée avec une importante libération du facteur de maintien de l'intégrité vasculaire qu'est endocan. Endocan peut donc être utilisé comme un marqueur prédictif du développement d'une pathologie inflammatoire après transfusion sanguine, notamment lors d'un TRALI, évoquant ainsi un signal d'alerte référant de l'atteinte de l'endothélium vasculaire. Ces résultats font suites aux premières études publiées par notre équipe caractérisant le profil inflammatoire des CP ayant induit un EIR. En effet, on retrouve des productions excessives de plusieurs cytokines pro-inflammatoires dans ces CP pouvant justifier le développement d'EIR inflammatoires, par exemple sCD40L, IL-13, MIP-1, Ox40L ou encore IL-27 [46, 296, 297]. Suite à notre étude, il serait alors intéressant d'évaluer l'impact des CP impliqués dans des EIR directement sur les populations leucocytaires, apportant un point de vue sur l'inflammation plus complet. Il faut également limiter l'extrapolation de nos résultats sur les cas de TRALI, car dans nos échantillons, aucun surnageant de CP n'était associé à un cas de lésion pulmonaire aigu. Le rôle des plaquettes sanguines dans les pathologies inflammatoires transfusionnelles n'est pas seulement exclusif aux différents produits sanguins labiles, mais peut également concerner les plaquettes sanguines présentes chez les receveurs des PSL. Pendant longtemps, le rôle physiologique plaquettaire a été limité à la thrombose et l'hémostase. Cependant, depuis quelques années, la communauté scientifique s'accorde à donner une nouvelle fonction aux plaquettes sanguines en tant que cellules de l'inflammation [298]. Les plaquettes sanguines présentent un panel de récepteurs de l'inflammation, capable de capter les signaux d'agression extérieure et être ainsi au premier front de l'inflammation. En effet, ces cellules expriment des toll-like receptors (TLR) à leur surface, mais également de façon intracellulaire, ce qui les rends sensibles aux motifs moléculaires associés aux pathogènes, les PAMP [273, 299, 300]. Sont référencés, aussi, plusieurs récepteurs aux compléments et aux immunoglobulines [301]. Les plaquettes sanguines sont, de plus, activables par des stimuli protéiques divers. Nous pouvons, par exemple, citer les récepteurs IL-1R et IL-8R [302]. Une fois activées, les plaquettes sanguines produisent, via leurs différents granules, un cocktail de cytokines/chimiokines stimulant les différentes cellules de l'inflammation [267]. Ce cocktail comprend des chimiokines et des cytokines ciblant les monocytes (PF4, RANTES, MIP-1, CD40L) mais également les neutrophiles (PF4, NAP-2, GRO-, ENA-78, CD40L) [44]. Malgré ces différentes compétences cellulaires énumérées, l'indécision persiste quant à leur réelle implication au sein d'un processus inflammatoire : sont-elles régulatrices ou promotrices de l'inflammation ? Ou n'ont-elles qu'un rôle exclusivement antihémorragique ? Plusieurs travaux évoquent des preuves d'un rôle plaquettaire limitant la réponse inflammatoire des différentes cellules impliquées. La perméabilisation de l'endothélium vasculaire est considérée comme une étape souvent inéluctable lors d'une inflammation excessive, notamment observée lors de TRALI expérimentaux [7]. Depuis les années 1990, les plaquettes ont été caractérisées comme cellules préservatrices de l'intégrité vasculaire, et donc limitant la fuite et la migration des cellules inflammatoires dans les tissus ciblés [303-309]. La transfusion de plaquettes issues de souris sauvages à des souris thrombopéniques, sous pathologies inflammatoires induites, limite l'hémorragie liée à l'inflammation et restaure l'intégrité de l'endothélium vasculaire [310-313]. Certains évoquent même une réparation plaquettaire des brèches endothéliales induites par les neutrophiles [313]. Cette fonction protectrice est appelée thrombose inflammatoire plaquettaire. Elle est notamment supportée par une production de facteurs stabilisateurs de l'intégrité vasculaire tels que la sphingosine-1-phosphate (S1P) [314, 315] ou l'angiopoiétine-1 (Ang-1) [316]. Ce rôle régulateur ne fait pas l'unanimité. En effet, notamment dans des contextes inflammatoires pulmonaires, plusieurs preuves évoquant une contribution certaine des plaquettes quant à l'amplification de la perméabilité des capillaires sanguins émergent [317-321]. La thrombopénie induite a souvent été corrélée à une amélioration de l'intégrité de la paroi vasculaire, limitant ainsi la diapédèse, dans plusieurs modèles pathologiques murins comme le sepsis [322, 323], l'ALI [104, 323] et même le TRALI [104]. Nous avons préalablement cité certains médiateurs solubles secrétés par les plaquettes pouvant accrotre l'imperméabilité vasculaire, notamment S1P et Ang-1, mais les plaquettes contiennent, au sein de leurs granules, d'autres médiateurs solubles dont le rôle est opposé aux derniers nommés. C'est le cas de l'histamine [324], la thromboxane A2 (TxA2) [323] ou l'IL-1 [325]. Les plaquettes peuvent également participer de façon indirecte à la dégradation des cellules endothéliales dans un contexte inflammatoire. Les productions plaquettaires peuvent stimuler l'activité délétère des leucocytes, notamment les neutrophiles, sur l'endothélium vasculaire [326]. Cela nous amène à évoquer un second point de vue renforçant l'hypothèse que les plaquettes participent à l'amplification de l'inflammation et ont donc un rôle néfaste dans certaines pathologies inflammatoires. Le second point de vue susnommé est l'interaction et l'influence directe des plaquettes sanguines sur d'autres cellules de l'inflammation, les leucocytes. Cette communication étroite entre les plaquettes et les leucocytes circulants est régie selon plusieurs mécanismes moléculaires. L'un des plus investigués est le couple protéique CD62P/PSGL-1 [84, 327]. Cette interaction cellulaire est plus secondairement dépendante des couples CD40L/CD40 et GPIb/Mac-1 [84, 328]. Le recrutement cellulaire est bidirectionnel, c'est-à-dire que les leucocytes adhérant à l'endothélium peuvent recruter les plaquettes sanguines circulantes [329-332], comme les plaquettes sanguines fixées à la paroi vasculaire peuvent elles aussi participer au recrutement des leucocytes [333-336]. Ces complexes cellulaires ont été observés directement dans la circulation sanguine générale lors de pathologies inflammatoires humaines [337-341] et murines [323, 342], mais également dans les capillaires sanguins des organes enflammés ou dans des zones tissulaires, par exemple les poumons [343, 344]. Les conséquences d'une communication étroite entre les plaquettes et les différents leucocytes circulants se manifestent par une expression accrue de molécules d'adhésion à la surface de ces derniers facilitant ainsi leur transmigration [84, 335, 345- 348], notamment jusqu'à l'espace alvéolaire lors de TRALI expérimentaux [7], mais également par une dégranulation leucocytaire, par la production des ROS et par une modification de l'activité vasculaire [44]. Finalement, les plaquettes sanguines interagissent avec les neutrophiles et participent ainsi à la NETose, phénomène essentiel lors de la mise en place d'une réponse antibactérienne de l'organisme. Ce mécanisme est caractérisé par une libération de la chromatine nucléaire décondensée dans l'espace extracellulaire couplée à des agents antimicrobiens [131, 349]. Cependant, lors de certaines pathologies inflammatoires, une NETose non régulée peut contribuer au développement de complications pulmonaires, notamment observées dans le cas de TRALI expérimentaux [275]. Le but de notre second manuscrit de ce travail de thèse était d'investiguer la place des plaquettes sanguines, au vu de leur production de BRM, dans un contexte inflammatoire. Plus particulièrement, évaluer l'impact des productions plaquettaires contenues dans les granules-, in vivo, sur le maintien, la régulation et/ou l'amplification de l'inflammation induite par injection systémique de LPS. Pour cela, nous avons utilisé un modèle transgénique de souris déficientes pour le gène Nbeal2. Cette manipulation génétique réduit significativement la biogenèse des granules- tout en changeant l'aspect plaquettaire, présentant un profil plus volumineux, et en réduisant leur compte circulant [350]. En limitant la sécrétion plaquettaire, dans l'absolu, aucune différence n'a pu être observée à propos du compte des cellules inflammatoires, ainsi que dans les concentrations cytokiniques/chimiokiniques finales. Cela a déjà été observé dans une première étude, dont le modèle animal proposait une inhibition de la biogenèse à la fois de granules- mais également des granules- plaquettaires. Cette étude évoquait alors un effet prépondérant des productions plaquettaires sur le processus hémostatique et thrombotique plutôt qu'inflammatoire [351]. C'est, cependant, le profil d'évolution qui a été affecté. En effet, en limitant la production plaquettaire nous avons pu observer un impact direct sur la mise en place d'une réponse anti- inflammatoire plus importante. Le recrutement des leucocytes, spécialement les neutrophiles et les monocytes, était limité, la production de cytokines anti-inflammatoires, comme IL-10, IL-4 et IL-13, était amplifiée et la sécrétion de certains médiateurs solubles pro-inflammatoires était inhibée, c'était le cas du sCD40L. Ces principales différences sont plutôt dues à des taux importants basaux observés. Cependant, ces résultats ne peuvent pas entièrement être attribués à l'absence des granules- plaquettaires car, en effet, les souris Nbeal2-/- présentent également une atteinte granulaire des autres cellules, telles que les neutrophiles et les cellules NK [352]. En conclusion, cette étude démontre que les plaquettes sanguines participeraient activement, tout en étant sur un plan secondaire, au maintien et à l'amplification de l'inflammation, dans un contexte inflammatoire induit, plutôt que dans la résolution de cet état. De futurs travaux de recherche, notamment au sein d'un modèle murin ciblant exclusivement les granules plaquettaires, pourraient apporter une réelle réponse sur le rôle des plaquettes sanguines dans l'inflammation. Finalement, dans un contexte pathologique inflammatoire, comme le TRALI, on peut émettre l'hypothèse que les plaquettes sanguines participent activement à l'augmentation de la sévérité de cette pathologie, mais reste secondaire au regard des autres cellules centrales que sont les leucocytes et les cellules endothéliales. Certaines équipes ont déjà tenté de répondre à cette question : quel est le rôle des plaquettes sanguines lors du développement du TRALI ? Comme cité auparavant, des éléments de réponses doivent être apportés selon plusieurs points de vue : i) le rôle des plaquettes conservées dans les produits sanguins labiles, ii) et le rôle inflammatoire de ces mêmes plaquettes via leur interaction avec l'endothélium et les leucocytes, leur production protéique, leur migration pulmonaire ou encore leur biogénèse pulmonaire. A l'heure actuelle, plusieurs études démontrent un potentiel inflammatoire des CP suffisant pour être responsable du second-hit du TRALI non-immunologique. Certains ont d'abord évalué, in vitro, l'influence directe des CP, en fonction du temps de stockage, sur l'activité des PMN. Les CP stockés 5 jours présentent un impact direct sur le métabolisme oxydatif des neutrophiles, phénomène extrapolable au TRALI [353]. Une partie des médiateurs solubles présents dans ces CP a déjà été ciblée comme potentiellement responsable de cette activité des neutrophiles. En effet, la production massive de microparticules plaquettaires et de sCD40L serait en partie responsable [86, 354]. L'implication du VEGF plaquettaire a aussi été évoquée, mais son implication serait au détriment de l'imperméabilité vasculaire, plutôt que pour l'activation directe des PMN [355]. Finalement, de façon plus concrète, de nombreux modèles animaux ont démontré que les CP âgés et leur production plasmatique peuvent endosser l'entière responsabilité du second-hit du TRALI [71, 356-358]. Ces résultats, en corrélation avec notre première étude démontrant l'impact inflammatoire des CP impliqués dans des réactions transfusionnelles, prouvent que les plaquettes transfusées présentent un potentiel pro-inflammatoire non négligeable et sont, probablement, à l'origine du déclenchement de certains TRALI non-immunologiques. L'investigation du rôle des productions plaquettaires dans les PSL en tant qu'inducteurs potentiel d'une partie des TRALI non-immunologiques nécessite encore des études plus approfondies, mais, à l'heure actuelle, peu de doute persiste. Le second champ d'investigation se concentrant sur une influence, directe ou indirecte, des plaquettes de l'organisme au sein de la physiopathologie du TRALI est plus débattu. Pour répondre de la façon la plus précise possible à cette interrogation, plusieurs thérapies antiplaquettaires ont alors été rapportées dans la littérature. Les premiers à réellement proposer des preuves d'une implication active des plaquettes sanguines dans la pathogenèse du TRALI expérimental sont Looney et al. en 2009 [104]. Au sein de cette étude, l'induction de la lésion pulmonaire a été réalisée par une double injection de LPS et d'anticorps anti-CMH I, l'équivalent murin du HLA I humain responsable de la majorité des TRALI jusqu'alors déclarés [285]. Ce modèle animal est devenu le modèle animal référence du TRALI, malgré ces limites. Cette équipe a donc été la première à avoir observé une chute du compte plaquettaire lors de l'induction expérimentale du TRALI associée avec une migration accentuée des plaquettes sanguines dans l'espace alvéolaire. L'utilisation d'un sérum antiplaquettaire et d'aspirine, dont le rôle est, entre autres, inhibiteur de l'activation plaquettaire [359], a alors démontré une protection contre le développement de ce même TRALI, caractérisé par une survie maximale et une infiltration pulmonaire limitée [104]. Suite à cela, plusieurs études ont alors consolidé ces preuves, en utilisant le même modèle animal. L'aspirine, mais également son produit final, la 15-epi-lipoxine, connue pour avoir un rôle direct sur les plaquettes sanguines [359], semblent réduire efficacement la sévérité de l'ALI expérimentalement induit par l'administration intratrachéale de LPS [343]. La principale limite de ce traitement est qu'il n'a pas une influence exclusive aux plaquettes mais également sur l'endothélium vasculaire [360]. L'inhibition des protéines membranaires plaquettaires semble également être une piste de résolution du TRALI. C'est le cas du CD62P, dont la neutralisation protège les souris d'un développement du TRALI induit par des injections systémiques de LPS et d'anti-CMH I [361]. Cette molécule, comme l'intégrine GPIb ou encore le CD40L, semble participer à la formation de complexe entre les plaquettes et les neutrophiles, participant ainsi à l'amplification de la transmigration de ces derniers [84]. Certains proposent que la modulation de la communication neutro-plaquettaire soit une piste thérapeutique pour la prévention du TRALI [274, 275]. Chez l'homme, peu d'investigations ont réellement été menées en ce qui concerne la place des plaquettes dans la physiopathologie du TRALI. Cependant, sans de réelles preuves scientifiques, une étude évoque la possibilité d'une induction retardée du TRALI par des anticorps spécifiquement dirigés contre les plaquettes sanguines. En effet, dans un rapport de cas, une patiente aurait déclaré un TRALI retardé, associé à de forts taux d'anticorps inhibiteurs de l'activité plaquettaire dans son sérum et à la présence d'anticorps anti-leucocytaires. Les auteurs conclus que l'inhibition plaquettaire, chez cette patiente, aurait retardé le développement du TRALI, évoquant ainsi un rôle plaquettaire dans l'amplification du niveau d'activation des leucocytes. Leur hypothèse repose sur une accentuation de l'activité des leucocytes, particulièrement des neutrophiles, suite à la libération de médiateurs solubles plaquettaires, tels qu'IL-8 et ENA-78, inhibée chez cette patiente [362]. Enfin, une découverte récente permet d'envisager une fonction pulmonaire des plaquettes probablement sous-estimée. Effectivement, une étude a démontré qu'il existe une thrombopoïèse pulmonaire murine, responsable de la formation de plus de 50% des plaquettes circulantes [271]. Cette découverte permet d'envisager une participation des plaquettes au sein des pathologies pulmonaires. A l'encontre de toutes ses études, plusieurs preuves émergent quant à une implication inexistante des plaquettes dans la physiopathologie de l'ALI induit dans le même modèle murin cité au-dessus, c'est-à-dire par injection successive de LPS et d'anti-CMH I. En effet, la déplétion des plaquettes sanguines, induite génétiquement ou par injection d'anticorps, ainsi que l'inhibition de l'activité plaquettaire, notamment par l'utilisation d'aspirine, de clopidogrel ou d'anticorps anti-CD36, protéine membranaire des plaquettes participant à leur fonction thrombotique [363], ne préviennent pas le développement de l'ALI [278] et manifeste un état hémorragique délétère [72]. Au cours de cette thèse de sciences de la vie et de la santé, nous avons souhaité répondre en partie à cette interrogation (manuscrit III). Notre étude apporte un début de réponse à ce débat. L'inhibition de l'activité plaquettaire, en fixant le récepteur platelet protease-activated receptor-4 (PAR-4) par injection intrapéritonéale de ML354, n'a en aucun cas apportée des preuves d'une amélioration de l'état des souris après induction de la lésion pulmonaire. Cependant, la déplétion presque totale des plaquettes circulantes, réalisée par une injection préemptive d'anticorps anti-GPIb, n'est pas suffisante à prévenir systématiquement le développement de l'œdème pulmonaire induit par la double injection de LPS et d'anticorps anti- CMH I, mais en a réduit significativement sa sévérité. Afin d'approfondir notre démarche, nous avons également évalué l'impact des stimuli utilisés dans notre modèle in vivo d'induction de l'ALI, c'est-à-dire le modèle double-hit par injection de LPS et d'anticorps anti-CMH I, directement sur les plaquettes de souris non préalablement stimulées, dans un modèle in vitro. Le LPS utilisé à une dose supérieure de celle administrée dans notre modèle in vivo de l'ALI semble avoir un effet sur l'activité plaquettaire, notamment sur la production de médiateurs solubles, tels que le PF4, plutôt que sur l'agrégation de ces dernières. La combinaison de LPS et d'anti-CMH I, à des concentrations n'ayant aucun impact seul sur l'activation des plaquettes, a également influencé la sécrétion du PF4 plaquettaire. En revanche, même à des doses significativement plus élevées que celle utilisée dans notre modèle murin du TRALI, les anticorps anti-CMH I seuls n'ont jamais favorisé l'activation des plaquettes, dans notre modèle in vitro. Il est connu que les plaquettes peuvent présenter à leur surface des fragments de l'antigène CMH de classe I, mais ces résidus moléculaires ne sont pas produits, de novo, par les plaquettes. En effet, c'est au travers d'un processus d'internalisation des antigènes CMH I, préalablement produits par d'autres cellules de l'immunité dans le plasma, que les plaquettes sanguines sont capables d'exhiber cette protéine [273, 364-366]. La fixation des anticorps anti-CMH I directement sur sa cible plaquettaire n'a donc surement aucun impact suffisamment important pour induire une cascade d'activation des plaquettes. Aussi, nos résultats ne semblent pas prendre clairement parti pour une implication directe des plaquettes dans la physiopathologie du TRALI, ni pour leur exclusion. En effet, nos premiers travaux sont en emphases avec une participation des plaquettes sanguines plutôt dans l'augmentation du degré de sévérité de ce TRALI expérimental, précédemment décrit, plutôt qu'une pathogénie entièrement dépendante d'une contribution plaquettaire. Enfin, l'utilisation de notre modèle de souris thrombopénique, déplétion induite par injection d'anticorps anti-GPIb, évoque des résultats en faveur de la thrombopoïèse pulmonaire, déjà décrite dans une étude récemment publiée [271]. En effet, nous observions une augmentation importante du nombre de plaquettes présentent dans les lavages bronchoalvéoalaires et l'interstitium pulmonaire chez les souris avec une thrombopénie induite de façon préemptive à l'induction de la lésion pulmonaire. Ces observations semblent évocatrices d'une thrombopoïèse pulmonaire compensatrice de la thrombopénie périphérique induite expérimentalement. Ce phénomène physiologique peut surement, à lui seul, justifier l'absence de protection observée dans plusieurs modèles murins de l'ALI après induction de la thrombopénie [72, 278]. Notre étude, valorisée dans le manuscrit III, nécessite des compléments d'information et un approfondissement certain. À l'avenir, nous envisageons de mieux caractériser les plaquettes produites directement dans l'interstitium pulmonaire pour tenter d'élaborer un nouveau modèle animal de l'ALI/TRALI ciblant en particulier les plaquettes issues de la thrombopoïèse pulmonaire et ainsi apporter un regard innovant sur l'implication des plaquettes dans cette physiopathologie. Les plaquettes sanguines semblent avoir un rôle très complexe lors de certains processus inflammatoires. Comme cité préalablement, elles possèdent un potentiel de sécrétion et d'expression protéique pouvant agir sur plusieurs fronts. Elles participent au maintien de l'intégrité vasculaire [303-309], mais peuvent également amplifier les réactions inflammatoires pathologiques [104, 322, 323]. En conséquence, nous avons émis l'hypothèse que cibler un produit plaquettaire, au rôle pléiotropique, serait une voie à envisager plutôt qu'une inhibition plaquettaire totale. Nous avons donc choisi de cibler le couple protéique CD40/CD40L pour plusieurs raisons : les plaquettes sanguines sont responsables de la production de plus de 95% du CD40L soluble (sCD40L) dans le plasma, dont la fonction est agoniste à la forme membranaire [89]. L'implication du couple protéique CD40/CD40L a été démontrée dans plusieurs modèles murins de l'ALI [99-102]. Des taux importants de sCD40L ont été corrélés avec le déclenchement de plusieurs pathologies transfusionnelles [367-370]. Enfin, ce complexe immun participe à la communication intercellulaire entre l'endothélium vasculaire, les leucocytes et les plaquettes sanguines [84]. En 2011, une première étude a investigué le rôle du couple CD40/CD40L dans la physiopathologie d'un TRALI expérimental et n'a pu démontrer aucune amélioration de l'état des souris lors de la neutralisation de ce complexe protéique par l'utilisation d'anticorps anti-CD40L et de ciglitazone, inhibant l'expression du CD40L plaquettaire [371]. La principale limite de cette étude était l'utilisation d'un modèle murin peu représentatif de l'hypothèse validée du two-hit du TRALI humain. En effet, ce modèle repose sur une simple injection d'anticorps anti-CMH I à 4, 5 mg/kg responsable de la lésion pulmonaire [103]. De plus, l'utilisation d'une telle concentration dans notre modèle murin reposant sur l'hypothèse de la double frappe (LPS et anti-CMH I) réduit considérablement la survie des souris. Lors de la validation du modèle murin du two-hit , Looney et al. ont démontré qu'aucune souris ne survie plus de 45 minutes, sur les deux heures de l'expérimentation, avec une concentration à 4, 5 mg/kg [104]. Dans notre laboratoire, l'utilisation d'une concentration de plus de 3 mg/kg a été écartée du fait de n'avoir observé aucune survie (n 5) au-delà de 30 minutes (données non publiées). Finalement, suite à cette étude proposée par Tuinman et al. [103] l'investigation du complexe protéique CD40/CD40L au sein de la pathogénie du TRALI a été longtemps reléguée au second plan. Au cours de ma thèse, nous avons de nouveau étudié la place de ce couple immun dans le modèle murin du TRALI, aujourd'hui internationalement reconnu, avec l'induction du second- hit à 1 mg/kg. Nous avons ainsi pu démontrer que la neutralisation préemptive de l'interaction du CD40 avec son ligand, le CD40L membranaire et soluble, prévient le développement d'une lésion pulmonaire dans notre modèle murin. Cette inhibition passe notamment par une réduction significative de la migration des cellules effectrices, que sont les neutrophiles, dans l'espace alvéolaire. Cette limitation de la leucostase des neutrophiles est corrélée avec une diminution importante de l'expression de Mac-1 et de CD40 à leur surface et une réduction de la complexification des neutrophiles avec les plaquettes circulantes, ces dernières étant moins activées lors de l'injection de ce traitement. Nous constations, cependant, un état inflammatoire systémique non régulé malgré l'utilisation de ce traitement. Seule la communication cellulaire semblait directement impactée. Plusieurs champs méritent d'être plus investigués, en lien avec cette étude. En effet, nous n'avons pas étudié l'influence d'un tel traitement sur l'endothélium vasculaire, les monocytes, ou encore les macrophages pulmonaires. Il serait également intéressant d'évaluer l'effet d'une injection de sCD40L recombinant en tant que second-hit du TRALI, dans ce même modèle animal. Finalement, ce complexe immun, étant au cœur d'une communication cellulaire importante entre plusieurs cellules de l'inflammation [74], pourrait être impliqué dans plusieurs pathologies inflammatoires ou auto-immunes. L'établissement de futurs traitements, ciblant particulièrement ces protéines, pourrait permettre de mettre en place une régulation de plusieurs pathologies sans pour autant être délétère pour un type cellulaire précis, par exemple les plaquettes sanguines, et donc impacter la physiologie cellulaire naturelle du patient. Un constat original a pu être fait au cours de cette thèse. En effet, nous avons observé, au sein de notre modèle animal, une atteinte des organes autres que les poumons. Nous avons notamment investigué l'atteinte du pancréas au cours du développement d'une lésion pulmonaire suite à l'injection successive de LPS et d'anticorps anti-CMH I au sein de notre modèle murin. Cette étude a été réalisée suite aux différents travaux présentant des points communs dans la physiopathologie de certains modèles expérimentaux de la pancréatite et celle décrite dans notre modèle animal du TRALI, impliquant les neutrophiles [117, 118], l'endothélium vasculaire [134, 135] et les plaquettes sanguines [149]. Certains ont également évoqué un lien évident entre l'atteinte du pancréas et le développement de lésion pulmonaire, lors d'une pancréatite expérimentale, qu'elle soit induite par injection intrapéritonéale de céruléine et de LPS ou de L- arginine [113, 114]. De plus, l'implication du couple protéique CD40/CD40L a également été démontrée dans des modèles murins de pancréatite avec atteinte pulmonaire [158], en lien avec notre manuscrit IV. Tous ces paramètres nous ont conduit à investiguer le développement d'une pancréatite suite à l'injection d'anticorps anti-CMH I chez les souris préalablement stimulées avec une injection intrapéritonéale de LPS. Nous avons ainsi pu démontrer que le développement de l'ALI, dans ce modèle, était associé à une atteinte pancréatique, blessure limitée lors de l'utilisation d'anticorps anti-CD40L neutralisant de façon préemptive. Cependant, cette pancréatite semblait être modérée par rapport à une induction directe de cette pathologie, notamment observée par l'évaluation du score pathologique. L'évaluation de l'infiltration des leucocytes dans le tissu pancréatique n'a pas permis de dénombrer un taux important de neutrophiles dans le cas des souris mimant un TRALI par rapport aux autres groupes. Nous émettons ainsi l'hypothèse que lors du TRALI, chez l'homme, une atteinte des différents organes profonds, tels que le pancréas, peut justifier le fort taux de mortalité associé à cette pathologie. C'est probablement lors d'un TRALI sévère que les autres organes seront alors affectés à un degré similaire à celui des poumons. Cette étude mérite une investigation plus poussée, notamment en ciblant plus spécifiquement les leucocytes, les plaquettes et l'endothélium vasculaire des capillaires pancréatiques pour mieux en comprendre la mécanistique. Actuellement, nous menons une investigation sur le devenir des autres organes, tels que l'intestin, après l'induction expérimentale de la lésion pulmonaire, au sein de notre modèle animal. Un suivi des organes, autres que les poumons, lors de complications lésionnelles pulmonaires après transfusion sanguine pourrait permettre de prévenir, de façon plus prolifique, la mortalité liée à cette réaction transfusionnelle. Conclusion Les réactions transfusionnelles inflammatoires sont loin d'être comprise sur le plan mécanistique. En France, le TRALI immunologique connait une réduction significative de sa fréquence. Cela est notamment dû à l'instauration des différentes précautions transfusionnelles. C'est le second type, le TRALI non-immunologique, qui connait une progression importante. Il est donc essentiel de comprendre encore mieux la physiopathologie de cette réaction transfusionnelle. Ces travaux de thèse apportent de nouvelles preuves quant au rôle des plaquettes sanguines dans le processus inflammatoire et particulièrement au sein du TRALI expérimental. En effet, nous constations une fonction plutôt pro- qu'anti-inflammatoire des plaquettes, notamment régulée par la libération de ces facteurs solubles contenus dans les granules-, en particulier pour le sCD40L. La principale limite de cette thèse est l'utilisation d'un modèle murin se rapprochant des caractéristiques du TRALI, mais ne prenant pas en considération la variable transfusionnelle, c'est-à-dire l'hétérogénéité des donneurs, des produits sanguins labiles transfusés et des receveurs. De plus, ces résultats, hormis le premier manuscrit, ne sont applicables qu'aux souris et nécessitent de nouvelles investigations chez l'homme, car la physiopathologie du TRALI humain est mal connue et toujours débattue. En effet, la diversité des TRALI humains diagnostiqués est telle que la mécanistique cellulaire les régulant ne peut être seulement extrapolée depuis des modèles in vivo et in vitro expérimentaux. Finalement, de meilleures connaissances sur l'impact des procédures de préparation des différents produits sanguins labiles, ainsi qu'un meilleur management des patients à risque, pourrait réduire, à l'avenir, l'occurrence des réactions transfusionnelles inflammatoires, en particulier les TRALI non-immunologiques. Références 1. Brittingham, T. E. , Immunologic studies on leukocytes. Vox Sang, 1957. 2(4) : p. 242-8. 2. Barnard, R. D. , Indiscriminate transfusion : a critique of case reports illustrating hypersensitivity reactions. N Y State J Med, 1951. 51(20) : p. 2399-402. 3. Popovsky, M. A. , M. D. Abel, and S. B. Moore, Transfusion-related acute lung injury associated with passive transfer of antileukocyte antibodies. Am Rev Respir Dis, 1983. 128(1) : p. 185-9. 4. Kopko, P. M. , et al. , Transfusion-related acute lung injury : report of a clinical look-back investigation. JAMA, 2002. 287(15) : p. 1968-71. 5. 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Annexes Participation aux études : 1. Sut C, Tariket S, Cognasse F, Garraud O. Determination of predictors of severity for recipient adverse reactions during platelet product transfusions. Transfusion Clinique et Biologique. 2017 2. Sut C, Tariket S, Chou ML, Garraud O, Laradi S, Hamzeh-Cognasse H, Seghatchian J, Burnouf T, Cognasse F. Duration of red blood cell storage and inflammatory marker generation. Blood transfusion. 2017 3. Aloui C, Prigent A, Tariket S, Sut C, Fagan J, Cognasse F, Chakroun T, Garraud O, Laradi S. Levels of human platelet-derived soluble CD40 ligand depend on haplotypes of CD40LG-CD40-ITGA2. Scientifique Report. 2016 Communications orales : 1. Tariket S, Arthaud CA, Garraud O, Cognasse F. La neutralisation de complexe CD40/CD40L inhibe le développement du TRALI, induit par du lipopolysaccharide combiné à un anticorps anti-CMH I, dans un modèle de souris. 28ème congrès de la Société Française de Transfusion Sanguines (SFTS). Bordeaux, France. 2. Tariket S, Arthaud CA, Garraud O, Cognasse F. La neutralisation de complexe CD40/CD40L inhibe le développement du TRALI, induit par du lipopolysaccharide combiné à un anticorps anti-CMH I, dans un modèle de souris. International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH). Berlin, Allemagne. 2017 3. Tariket S, Arthaud CA, Garraud O, Cognasse F. Investigation de la pathogenèse du syndrome de détresse respiratoire aigu post-transfusionnel (TRALI) dans un modèle murin. 17ème Journées stéphanoises de cytométrie, imagerie cellulaire et tissulaire (Cytima). Andrézieux-Bouthéon, France. 2016 Communications affichées : 1. Tariket S, Sut C, Arthaud CA, Eyraud MA, Laradi S, Hamzah-Cognasse H, Garraud O, Cognasse F. Modeling the effect of platelet concentrate supernatants on endothelial cells : focus on Endocan/ESM-1. 28ème congrès de la Société Française de Transfusion Sanguines (SFTS). Bordeaux, France. 2017 2. Tariket S, Sut C, Arthaud CA, Eyraud MA, Laradi S, Hamzah-Cognasse H, Garraud O, Cognasse F. Modeling the effect of platelet concentrate supernatants on endothelial cells : focus on Endocan/ESM-1. 27th regional congress of the International Society of Blood Transfusion (ISBT). Copenhage, Danemark. 2017 3. Tariket S, Sut C, Arthaud CA, Eyraud MA, Laradi S, Hamzah-Cognasse H, Garraud O, Cognasse F. Modeling the effect of platelet concentrate supernatants on endothelial cells : focus on Endocan/ESM-1. 28ème congrès de la Société Française de Transfusion Sanguines (SFTS). Bordeaux, France. 2017 4. Tariket S, Meneveaux A, Arthaud CA, Garraud O, Cognasse F. Investigation de la pathogenèse du syndrome de détresse respiratoire post-transfusionnelle (TRALI) dans un modèle murin. Journée de l'Académie de Médecine. Saint-Etienne, France. 2016 5. Tariket S, Meneveaux A, Arthaud CA, Garraud O, Cognasse F. Investigation de la pathogenèse du syndrome de détresse respiratoire post-transfusionnelle (TRALI) dans un modèle murin. Journée de l'Institut Fédératif de Recherche en Sciences et Ingénierie de la Santé (IFRESIS). Saint-Etienne, France. 2016 Investigation de la pathogenèse du syndrome de détresse respiratoire aigu post- transfusionnel (TRALI) dans un modèle murin RESUME : La transfusion sanguine permet de sauver des vies et réduit la morbidité pour un grand nombre de maladies et d'affections cliniques, mais elle n'est pas exempte de complications. Un incident néfaste lié à une transfusion, également appelé Effet Indésirable Receveur (EIR), est un incident défavorable survenant chez un patient pendant ou après une transfusion sanguine. Parmi eux, le TRALI est considéré comme l'une des réactions inflammatoires les plus critiques. Cette pathologie se développe généralement dans les 6 heures après transfusion. On en reconnat deux types, les TRALI immunologiques et les TRALI non-immunologiques. En France, les premiers sont presque entièrement prévenus par une politique de sécurité des produits sanguins, tandis que la fréquence des seconds augmente. La physiopathologie du TRALI reste mal connue. Tandis que certains y accordent une place importante aux plaquettes sanguines du patient transfusé, d'autres les considèrent comme pas réellement impliquées. Le but de ce travail de thèse a été, dans un premier temps, d'investiguer le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines conservées dans les concentrés plaquettaires et l'influence de cette inflammation sur l'endothélium vasculaire général. Ensuite, sera évalué le rôle des plaquettes sanguines de l'organisme, notamment par l'intermédiaire de leurs produits de sécrétion, dans la pathogénie de cette complication transfusionnelle. Pour cela, un ALI (mimant un TRALI) a été déclenché, dans un modèle in vivo, par une injection d'anticorps anti-CMH I chez des souris préalablement stimulées avec du LPS. L'ensemble de nos résultats confirme le potentiel inflammatoire des plaquettes sanguines, au sein des concentrés plaquettaires, pouvant probablement assumer l'entière responsabilité du déclenchement d'un TRALI non- immunologique, ainsi qu'un rôle secondaire des plaquettes sanguines de l'organisme, participant activement à l'amplification de la sévérité de la pathologie. Cette thèse s'inscrit dans la continuité logique des études menées, au sein du laboratoire GIMAP-EA3064, investiguant la place des plaquettes sanguines au sein de l'inflammation, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives dans la sécurité transfusionnelle. MOTS CLES : TRALI Transfusion Plaquettes Inflammation CD40L Investigation of the pathogenesis of Transfusion-Related Acute Lung Injury (TRALI) in a mouse model ABSTRACT : Blood transfusion saves lives and reduces morbidity for many diseases and clinical conditions, but it is not without complications. A transfusion-related adverse event, also known as the Adverse Reaction (AR), is an incident occurring in a patient during or after a blood transfusion. Among them, TRALI is considered as one of the most critical inflammatory reactions. This pathology usually occurs within 6 hours after transfusion. Two types are recognized : immune TRALI and non-immune TRALI. In France, the first is almost completely prevented by a blood product safety policy, while the frequency of the second increases. The pathophysiology of TRALI remains poorly understood. While some scientists give an important function of patient blood platelets, others consider them dispensable. The aim of this thesis was, first, to investigate the inflammatory potential of blood platelets stored in platelet concentrates and its impact on the general vascular endothelium. Next, the role of patient blood platelets, including their secretory products, in the pathogenesis of this transfusion complication will be evaluated. For it, an ALI (mimicking a TRALI) was triggered, in an in vivo model, by an injection of anti-MHC I antibody in mice previously stimulated with LPS. Our results confirm the inflammatory potential of blood platelets in platelet concentrates, which can probably assume the entire responsibility for triggering a non-immune TRALI, and a secondary role for patient blood platelets in the amplification of the severity of this pathology. This thesis is the continuity of studies conducted in the laboratory GIMAP-EA3064, investigating the function of blood platelets in inflammation, thus opening up new perspectives in transfusion safety. KEYWORDS : TRALI Transfusion Platelets Inflammation CD40L | HAL | Scientific |
Qualification opérationnelle du système informatique d'un dépôt de sang et de ses échanges de données | WMT16 | Scientific |
Synthèse personnes handicapées Recommandations de bonnes pratiques professionnelles Juillet 2013 Cette recommandation de bonnes pratiques professionnelles (RBPP) L'accompagnement à la santé s'inscrit dans le programme de travail de l'Anesm au titre du pro- de la personne handicapée gramme 7 la qualité de vie. Elle s'adresse à l'ensemble des éta- L'objectif de cette recommandation est d'encourager le développement de pratiques blissements et services sociaux et et d'organisations au sein des établissements et services sociaux et médico-sociaux médico-sociaux qui accompagnent susceptibles d'améliorer l'accompagnement à la santé et le parcours de soins des per- sonnes handicapées. les personnes handicapées (en- fants, adolescents et adultes)1. En La recommandation s'appuie sur une conception large du soin, et englobe : effet, les structures qui ne sont la promotion de la santé ; pas médicalisées sont elles aussi les soins préventifs, curatifs, de réadaptation et palliatifs (tant somatiques que psy- confrontées à des problématiques chiques) 2 ; de santé. Elles pourront trou- la coordination des soins. ver, dans cette recommandation, Cette recommandation intègre la dimension santé dans la démarche médico-sociale des repères pour les aider à penser d'accompagnement global, en ne la traitant pas à part , mais au contraire comme faisant pleinement partie du projet personnalisé et du projet d'établissement ou de cette question et répondre à des service, dans une approche inclusive visant l'autonomie des personnes. situations concrètes. La démarche de cette recommandation confère une place centrale aux droits et aux Chaque équipe et structure utilise- attentes de l'usager. ra toutefois cette recommandation Elle se décline en quatre parties : de façon différente en fonction de La participation de la personne au volet soins de son projet personnalisé ses missions, de son projet, de ses La promotion de la santé moyens financiers, de ses moyens La cohérence, la continuité et la permanence des soins autour de la personne en matière d'éducation à la santé, La formation et le soutien des professionnels de prévention, de prestations ou de coordination des soins mais aussi des partenariats noués ou envisagés. 1 Définition du handicap dans la loi du 11 février 2005 (article L. 114 du CASF) : Constitue un handicap, au sens de la présente loi, toute limitation d'activité ou restriction de participation à la vie en société subie dans son environnement par une personne en raison d'une altération substantielle, durable ou définitive d'une ou plusieurs fonctions physiques, sensorielles, mentales, cognitives ou psychiques, d'un polyhandicap ou d'un trouble de santé invalidant. 2 Les actions de prévention ont pour objectif de prévenir les complications des maladies chroniques et d'éviter autant que faire ce peut des événements aigus intercurrents. Les soins curatifs ont pour objectif de guérir les affections curables et générant une fluctuation plus ou moins importante de l'état de santé de la personne. Les soins de réadaptation ont pour objectif d'aider la personne à utiliser au mieux toutes ses potentialités et ressources quand elle ne peut les mettre en œuvre elle-même spontanément. Les soins palliatifs, en complémentarité des soins cités ci-dessus, ont pour objectif de soulager les douleurs physiques et les autres symptômes, mais aussi de prendre en compte la souffrance psychologique, sociale et spirituelle de la personne. Les soins palliatifs terminaux ont pour objectif le confort de la personne à la toute fin de sa vie. SYNTHÈSE L'accompagnement à la santé de la personne handicapée 1 1 LA PARTICIPATION DE LA PERSONNE En impliquant la personne dans l'évaluation réalisée et en lui expliquant le sens de cette évaluation. AU VOLET SOINS DE SON PROJET En sollicitant la personne (et le cas échéant ses proches) afin PERSONNALISE qu'elle participe, si elle le désire, à un entretien ou une réunion consacrée à son projet personnalisé. Informer la personne handicapée sur ses droits liés à la santé et l'organisation mise en place pour Reconnatre la place des proches dans toutes les en faciliter l'exercice étapes de construction du volet soins du projet En exposant à la personne, à son représentant légal et à ses personnalisé proches, les droits liés à sa santé tout au long de l'accompa- En identifiant clairement le rôle et la place des proches dans gnement, sur des supports adaptés, à des moments oppor- l'accompagnement de la personne. tuns, tout en tenant compte du niveau de compréhension de la personne ainsi que de ses facultés d'attention et d'écoute. En facilitant l'implication des proches. En expliquant à la personne, à son représentant légal et à ses En accompagnant les proches dans leur recherche d'informa- proches, la manière dont la structure s'est organisée pour per- tion et de soutien. mettre la mise en œuvre des droits liés à la santé. En précisant à la personne, à son représentant légal et à ses Impliquer la personne dans les décisions liées proches, la participation financière éventuelle qui lui sera à sa santé demandée, au regard des dispositions réglementaires exis- Dans toutes les situations, et notamment concernant : tantes et des aides qu'elle peut solliciter. les soins, les consultations, les examens et les interventions médicales ; Favoriser l'accès de la personne aux informations l'usage et l'acquisition d'une aide technique. sur sa santé et préciser avec elle leurs modalités de partage Analyser et accompagner les prises de risques En rendant accessibles à la personne les données de santé la de la personne et son refus des soins concernant. En posant clairement les responsabilités de chacun dans les En aidant, si elle le souhaite, la personne (et le cas échéant son risques que veut prendre la personne. représentant légal) à être vectrice des informations retraçant En expliquant à la personne et à ses proches les conséquences son parcours. éventuelles du refus. En informant la personne du caractère confidentiel de ses don- En permettant à la personne d'en parler avec une personne nées de santé et des règles de partage d'informations. ayant expérimenté le même type de situation, en lui présen- En expliquant à la personne les modalités d'accès aux diffé- tant les alternatives envisageables et en l'informant de son rents volets de son projet personnalisé. droit à changer d'avis. En notifiant les limites éventuelles de partage des informations En formalisant dans le dossier de la personne les informations, fixées par la personne. les décisions et les conditions de suivi concernant la prise de risque négociée avec elle, ou son refus des soins. Co-construire avec la personne le volet soins de son projet personnalisé En favorisant l'expression par la personne de ses attentes et préférences par la mise à disposition d'espaces d'échanges, le recueil de ses attentes au regard de l'ensemble du projet person- nalisé, une aide (si nécessaire) à la formulation de ses attentes, l'identification des points de satisfaction et d'insatisfaction rela- tifs à son accompagnement médical et paramédical. En s'appuyant, pour l'évaluation des besoins et des poten- tialités de la personne, sur les informations déjà existantes concernant sa santé. SYNTHÈSE L'accompagnement à la santé de la personne handicapée 2 2 LA PROMOTION DE LA SANTÉ 3 LA COHÉRENCE, LA CONTINUITÉ ET LA PERMANENCE DES SOINS Développer des modalités d'intervention permettant AUTOUR DE LA PERSONNE aux personnes handicapées de mieux appréhender leur santé Formaliser dans le projet d'établissement En travaillant avec les personnes accompagnées sur la connais- ou de service les principales ressources dont sance de leur corps et de ses transformations. dispose la structure et celles dont elle a besoin En adaptant et construisant des programmes d'éducation à la pour accompagner la santé des personnes santé en équipe interdisciplinaire, avec les personnes accom- En y définissant un objectif global d'accompagnement à la pagnées et le cas échéant leurs proches, et avec l'appui de santé et d'accès aux soins conjuguant les soins préventifs, partenaires qualifiés. curatifs, de réadaptation et palliatifs. En y précisant : les possibilités et les limites d'accompagnement Prévenir et gérer les risques liés à la santé médical et paramédical de la structure et du territoire ; les Concernant les vaccinations et dépistages modalités d'intervention, de coopération et de partage d'in- En organisant des actions de vaccination et dépistage en cohé- formations ; le plan de formation ; les missions spécifiques, les rence avec les besoins identifiés. critères d'admissions et les modalités de fonctionnement des différentes structures auxquelles les personnes accompagnées En informant les personnes concernées sur les raisons et peuvent avoir besoin de faire appel. les modalités de mise en œuvre de ces actions. En élaborant et révisant ce projet d'établissement ou de service Concernant les risques de handicaps ajoutés et l'aggravation avec les professionnels soignants et non soignants de la struc- de l'état de santé ture, les usagers, leurs représentants légaux et leurs proches En anticipant les risques de handicaps ajoutés et l'aggravation ainsi que, si possible, les partenaires de santé. de l'état de santé au niveau individuel (projet personnalisé) En l'ajustant au regard des rapports d'activités médicales, de la et au niveau collectif (public accueilli par la structure). démarche d'évaluation interne, de l'offre de soins du territoire En diffusant les recommandations de bonnes pratiques pro- et de l'évaluation qui est faite des nouvelles technologies et de fessionnelles liées à la santé et en facilitant leur appropriation. la télémédecine. Concernant la douleur Coordonner les soins avec les autres dimensions En améliorant la prévention, l'évaluation et la prise en charge de l'accompagnement dans le cadre du projet de la douleur. personnalisé, y compris lors des situations E n impliquant, dans cette amélioration, tous les acteurs médicales aigus accompagnant la personne, et pas uniquement les profession- En informant les professionnels non soignants et les bénévoles nels de santé de la structure. impliqués dans le projet personnalisé de la personne des pré- Concernant la souffrance psychique cautions à prendre concernant sa santé. En facilitant le repérage et la prise en charge de la souffrance En construisant des aménagements possibles afin de permettre psychique par la mise à disposition des coordonnées d'un spé- à la personne de poursuivre son projet de vie. cialiste, la sensibilisation et la formation des professionnels, En évaluant et adaptant les réponses lors de chaque réunion la mise en place de temps d'échange entre professionnels ou d'équipe interdisciplinaire. avec la personne accompagnée, l'évaluation interdisciplinaire, En tenant compte de la variabilité des potentialités de la per- la formalisation de procédure, le développement de partena- sonne dans son accompagnement global. riats, la concertation avec les proches. Concernant les comportements-problèmes Inscrire l'établissement ou le service dans le paysage En recherchant en équipe interdisciplinaire, et le cas échéant partenarial avec l'aide d'autres structures et personnes ressources, les En identifiant l'ensemble des partenaires du territoire et en se causes somatiques, psychiques et environnementales possibles faisant connatre d'eux par l'intermédiaire de rencontres pré- des comportements-problèmes . sentant la structure ou permettant des retours d'expérience, et E n recherchant des réponses aux comportements-pro- par l'intermédiaire de structures ressources du territoire. blèmes et en les évaluant. En recensant et formalisant dans un annuaire les partenariats établis ou possibles. Concernant les travailleurs handicapés En entretenant les liens partenariaux notamment concernant En améliorant la connaissance et la gestion des risques liés à les urgences médicales, les hospitalisations, les partenaires la santé des travailleurs en Esat et des travailleurs handicapés impliqués dans des périodes de transition entre l'enfance et accompagnés par un SAVS, un Samsah ou un Sessad Pro. l'âge adulte ainsi que ceux facilitant l'accompagnement des situations d'avancée en âge, de vieillissement et de fin de vie. SYNTHÈSE L'accompagnement à la santé de la personne handicapée 3 En favorisant la formalisation des partenariats au moyen de Renforcer les compétences des professionnels conventions. sur les problématiques de santé des personnes En clarifiant le rôle de chacun (notamment en déterminant accompagnées avec les partenaires ayant des missions communes ou simi- laires la place de chacun dans la coordination des interventions Par la formation de soins). En facilitant la participation régulière des professionnels de En s'appuyant sur les liens privilégiés que peuvent construire la structure à des formations sur les particularités médicales les professionnels de la structure avec les partenaires pour des publics accompagnés et sur les évolutions récentes des renforcer les échanges et le bon déroulement de l'accompa- connaissances scientifiques et des méthodes d'intervention s'y gnement. rapportant. En construisant si possible des partenariats facilitant l'accès En formant notamment les professionnels à l'utilisation des à une couverture sociale/mutuelle permettant une prise en outils utilisés par la structure pour le repérage et l'analyse de la charge adaptée des dépenses de santé. douleur, des situations de souffrance psychique et des com- portements-problèmes . En organisant ou en participant à des temps d'échange, de suivi et de coordination avec les partenaires de santé tout en Par le biais des échanges interinstitutionnels proposant des supports d'informations et/ou en utilisant les En facilitant les échanges avec les organismes gestionnaires, les supports proposés par les partenaires. équipes expertes ressources et les divers partenaires. En mettant en place une fiche de liaison permettant un échange En accueillant des élèves-stagiaires dans la structure. d'informations entre la personne, la structure l'accompagnant et la MDPH. En favorisant les échanges entre professionnels exerçant au sein de structures différentes et amenés à travailler ensemble autour de projets communs. 4 LA FORMATION ET LE SOUTIEN Valoriser les compétences acquises et encourager DES PROFESSIONNELS l'analyse des pratiques En favorisant le partage et la diffusion des formations suivies Former les professionnels aux droits liés à la santé par les professionnels de la structure. des personnes accompagnées et à leurs modalités En évaluant ces formations dans le cadre de la démarche de mise en œuvre d'évaluation interne. En diffusant à tous les professionnels de la structure les docu- En favorisant le retour d'expérience des professionnels qui ont ments remis aux usagers et en favorisant leur analyse collec- participé à des échanges institutionnels. tive et régulière. En organisant des réunions d'équipe de partage et de réflexion En sensibilisant l'ensemble des professionnels aux droits liés à sur les pratiques. la santé des personnes accompagnées. En organisant un soutien des équipes au sein d'instances de En s'assurant que les modalités de mise en œuvre de ces droits réflexion collectives et régulières. sont connues de tous. En élaborant et diffusant des documents repères facilement Encourager une dynamique d'ouverture à des appropriables par les professionnels. actions de recherche En favorisant la participation de tous les professionnels à une En mobilisant les équipes dans des démarches de recherche- instance de réflexion éthique portant sur ces questions. action, en collaboration avec les organismes de recherche dans un cadre conventionnel. Renforcer les compétences permettant En construisant une méthodologie dans laquelle le discours aux professionnels de communiquer et l'expertise de la personne peuvent être entendus et pris en avec les personnes accompagnées compte dans la construction du cadre d'analyse. En présentant à tous les professionnels le volet communication En capitalisant et diffusant les apports de ces actions. du projet d'établissement. En rappelant aux professionnels de se mettre dans une position d'écoute, d'empathie et de disponibilité vis-à-vis des personnes accompagnées. En formant les professionnels aux spécificités et aux outils de la communication avec les personnes handicapées, ainsi qu'à l'observation des personnes accompagnées. Anesm 53 boulevard Ornano - Pleyad 3 - 93200 Saint-Denis T 01 48 13 91 00 Toutes les publications de l'Anesm sont téléchargeables SYNTHÈSE L'accompagnement à la santé de la personne handicapée 4 | HAS | Scientific |
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La psychologie physiologique est une autre branche des neurosciences comportementales (psychologie biologique) qui étudie les mécanismes neurologiques de la perception et du comportement à travers une manipulation cérébrale directe des cobayes (animaux). Contrairement aux autres branches de la psychologie biologique, le but principal de la recherche dans la psychologie physiologique est le développement de théories des relations cerveau-comportement. D'une manière alternative, elle est appelée psychophysiologie et également neurosciences cognitives.
Un exemple de psychologie physiologique est l'étude du rôle de l'hippocampe dans la compréhension et la mémoire. L'hippocampe peut être chirurgicalement retiré du cerveau d'un cobaye (rat de laboratoire) et suivi d'un test de mémoire par ce même cobaye.
Références
Lien interne
Psychophysique
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MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par JACQUET THIBAULT Pour l'obtention du Diplôme de l'École Pratique des Hautes Études Evaluation de nano-objets pour le ciblage et la thérapie des cancers. Soutenu le 11/12/2017 devant le jury suivant : Dr. Rossel Mireille Président Pr. Righini Christian Tuteur scientifique Dr. Frachet Véronique Tuteur pédagogique Dr. Marquette Christel Rapporteur Dr. Favier Arnaud Examinateur Mémoire préparé sous la direction de : Pr. RIGHINI Christian Clinique Universitaire d'ORL-Pôle TCCR Hôpital Albert Michallon Institut pour l'Avancée des Biosciences, unité Inserm UJF/U1209 Boulevard de la Chantourne 38700 Grenoble et de : Dr. FRACHET Véronique UMR S 1209/UMR 5309 Bâtiment Jean Roget, domaine de la Merci BP170 La Tronche, 38042 Grenoble Cedex Résumé La détection précoce est un enjeu de taille dans le traitement des cancers. Elle permettrait une prise en charge plus rapide et une thérapie plus efficace. Une des approches pour améliorer la détection précoce est l'imagerie optique et le ciblage de récepteurs tumoraux comme l'intégrine v3 qui est un des récepteurs les plus couramment utilisé pour l'imagerie optique in vivo et le ciblage tumoral. Ce récepteur est largement exprimé en surface des cellules endothéliales des néo-vaisseaux tumoraux et de certains types de cellules tumorales y compris des VADS. Le RAFT-c[RGD]4 (Regioselectively Addressable Functionalized Template-arginine- glycineaspartic acid) est une molécule qui cible l'intégrine v3 sur les néo vaisseaux et les cellules tumorales. Il est un bon outil de ciblage tumoral. Dans la cadre de ce travail de recherche, nous avons étudié l'apport de la présentation multivalente du RAFT-c[RGD]4 sur le ciblage de l'intégrine v3. Dans une approche thérapeutique nous avons également étudié l'efficacité d'une nanoparticule radiossensibilisante, la nanoparticule AGuIX. La radiothérapie est l'un des modalités référence dans le traitement du cancer, cependant elle présente des limites ; irradiation des tissus sains, effets secondaires. Mots clés : Cancers des VADS ; Radiothérapie ; Nanoparticules ; Macromolécules ciblantes ; RAFT-c[RGD]4 Table des matières Résumé . 2 Introduction . 10 I. Développement de nouvelles stratégies innovantes pour le diagnostic et le traitement des cancers . 12 1. 2. L'angiogenèse . 12 L'angiogenèse tumorale . 13 II. Les nanoparticules . 17 1. 2. 3. Ciblage de la tumeur . 18 Applications des nanoparticules . 20 Les nanoparticules radiosensibilisantes . 21 III. Les cancers des Voies Aéro-digestives Supérieures . 24 1. 2. 3. Généralités . 24 Les facteurs de risques . 25 Prise en charge des cancers des VADS . 26 Matériel et méthodes . 28 I. La culture cellulaire . 28 1. 2. 3. 4. 5. 6. Lignée CAL33-LUC . 28 Lignées Hek293-(1) et Hek293-(3) . 28 Lignées M21 et M21L . 28 Lignée U87MG . 29 Le maintien des cellules en culture . 29 Congélation et décongélation . 29 II. Les différentes molécules étudiées . 30 1. 2. Les conjugués peptidiques . 30 Les nanoparticules AGuIX . 32 III. Les modèles animaux . 34 2 1. 2. 3. Anesthésie des souris . 34 Le modèle VADS . 35 Le modèle U87MG sous cutané. . 37 IV. L'imagerie Optique . 38 1. 2. L'imagerie de Bioluminescence . 38 L'imagerie de fluorescence . 42 V. Evaluations biologiques ex-vivo . 43 1. 2. 3. Tests d'inhibition de l'adhésion cellulaire . 43 Etude in cellulo par microscopie confocale . 45 Etude par cytométrie en flux. . 46 VI. Evaluations biologiques in vivo des nanoparticules AGuIX . 49 1) 2) 3) 4) 5. Biodistribution des conjugués . 49 Cinétique sanguine des conjugués chez la souris . 49 L'exérèse chirurgicale des tumeurs . 50 Irradiation des tumeurs Cal33-luc . 51 Histologie. 53 Résultats . 55 I. Evaluations biologiques des conjugués linéaires polymère-clusters peptidiques . 55 1. Evaluation de l'affinité pour les intégrines v3 lors de tests d'inhibition de l'adhésion cellulaire . 55 2. 3. 4. 5. Etude microscopique des conjugués polymère-clusters Raft(cRGD)4 fluorescents . 59 Etude par cytométrie en flux . 63 Etude du comportement des conjugués in vivo . 67 Conclusion sur l'évaluation biologique des conjugués linéaires . 73 II. Evaluations biologiques in vivo des nanoparticules AGuIX. 74 1. 2. Etudes de la biodistribution des AGuIX . 74 Étude de l'efficacité thérapeutique des nanoparticules en tant qu'agents radiosensibilisants. . 78 3 3. Conclusion sur les effets in vivo de la nanoparticule AGuIX. . 87 III. Discussion et perspectives . 88 1. 2. Synthèse de macromolécules ciblant l'angiogenèse. . 88 Evaluation de la nanoparticule AGuIX . 89 Bibliographie. 91 4 Liste des figures FIGURE 1 : LES GRANDES ETAPES DE L'ANGIOGENESE PAR BOURGEONNEMENT . 12 FIGURE 2 : REPRESENTATION SCHEMATIQUE DES CHANGEMENTS DE CONFORMATION DE L'INTEGRINE V3 . 14 FIGURE 3 : STRUCTURE DU RAFT-RGD ET DU CRGD. (10) . 16 FIGURE 4 : COMPARAISON DE L'ORDRE DE GRANDEUR DES NANOPARTICULES ET DES CONSTITUANTS BIOLOGIQUES (11). . 17 FIGURE 5 : REPRESENTATION DE LA COMPLEMENTARITE DES CIBLAGES PASSIF ET ACTIF (19). . 20 FIGURE 6 : PRINCIPE DE L'UTILISATION D'AGENTS RADIOSENSIBILISANTS POUR LA RADIOTHERAPIE . 22 FIGURE 7 : COMPARAISON DU COEFFICIENT D'ABSORPTION DE L'ENERGIE DE MASSES DES PHOTONS, POUR LE GADOLINIUM ET LES TISSUS MOUS. ADAPTE DE HUBBELL ET SELTZER (30, 31). . 23 FIGURE 8 : LES VOIES AERODIGESTIVES SUPERIEURS . 24 FIGURE 9 : REPRESENTATION SCHEMATIQUE DE LA STRUCTURE DES CONJUGUES LINEAIRES FLUORESCENTS POLYMERE-CLUSTERS PEPTIDIQUES. . 31 FIGURE 10 : REPRESENTATION SCHEMATIQUE DES NANOPARTICULES AGUIX. . 33 FIGURE 11 : SYSTEME D'ANESTHESIE GAZEUSE . 34 FIGURE 12 : SUIVI DE LA CROISSANCE TUMORALE PAR IMAGERIE DE BIOLUMINESCENCE IN VIVO APRES IMPLANTATION SOUS CUTANEE DES CELLULES CAL33-LUC AU NIVEAU DU FLANC DE LA SOURIS. . 36 FIGURE 13 : (A) PRELEVEMENT D'UNE TUMEUR CAL33-LUC SOUS-CUTANEE ET REALISATION DES COPEAUX TUMORAUX. (B) IMPLANTATION INTRA-JUGALE D'UN COPEAU DE TUMEUR CAL33-LUC ET TUMEUR ORTHOTOPIQUE DEVELOPPEE AU NIVEAU DE LA JOUE (FLECHE). . 36 FIGURE 14 : SUIVI DE LA CROISSANCE TUMORALE PAR IMAGERIE DE BIOLUMINESCENCE IN VIVO APRES IMPLANTATION DE COPEAUX TUMORAUX AU NIVEAU DE LA JOUE DE LA SOURIS. . 37 FIGURE 15 : SCHEMA DE L'OXYDATION DE LA LUCIFERINE EN OXYLUCIFERINE . 38 FIGURE 16 : PRINCIPE DE L'IMAGERIE OPTIQUE DE BIOLUMINESCENCE. . 39 FIGURE 17 : SYSTEME D'IMAGERIE IVIS KINETIC (CALIPER LIFE SCIENCE) . 40 FIGURE 18 : CINETIQUE DU SIGNAL DE BIOLUMINESCENCE APRES INJECTION INTRA PERITONEALE DE LUCIFERINE. . 40 FIGURE 19 : IMAGES OBTENUES APRES ACQUISITION EN BIOLUMINESCENCE SUR L'IVIS KINETIC. . 41 FIGURE 20 : CREATION DE ROI AVEC LE LOGICIEL LIVING IMAGE (CALIPER LIFE SCIENCES) . 41 FIGURE 21 : (A) CE DIAGRAMME ILLUSTRE LES DIFFERENTES TRANSITIONS ELECTRONIQUES ET LES DIFFERENTS PHENOMENES DE DESEXCITATIONS POSSIBLES. (B) SPECTRE DE FLUORESCENCE D'UNE MOLECULE AVEC SON SPECTRE D'EXCITATION ET D'EMISSION DE FLUORESCENCE. . 42 FIGURE 22 : SCHEMA DES PRINCIPALES ETAPES DU TEST D'INHIBITION DE L'ADHESION DES CELLULES HEK293-3 A LA VITRONECTINE. . 44 FIGURE 23 : SCHEMA DES PRINCIPALES ETAPES DU TEST D'INHIBITION DE L'ADHESION DES CELLULES HEK293-3 A LA VITRONECTINE. . 45 FIGURE 24 : SCHEMA DU PRINCIPE DE LA CYTOMETRIE EN FLUX . 47 FIGURE 25 : CYTOMETRE ACCURI C6. (56) . 48 FIGURE 26 : EXERESE D'UNE TUMEUR ORTHOTOPIQUE. . 50 FIGURE 27 : EXERESE D'UNE TUMEUR ORTHOTOPIQUE. . 50 FIGURE 28 : SOURIS PLACEE DANS L'IRRADIATEUR PETIT ANIMAL. LA ZONE ECLAIREE CORRESPOND AU CHAMP D'IRRADIATION. . 52 FIGURE 29 : CRYOMICROTOME LEICA CM3050 S. . 53 5 FIGURE 30 : POURCENTAGE DE CELLULES ADHERENTES EN FONCTION DE LA CONCENTRATION EN CLUSTER RAFT(CRGD)4 POUR LE CLUSTER SEUL ET POUR LES DIFFERENTS CONJUGUES 1, 2, 3 ET 4. . 56 FIGURE 31 : COMPARAISON DES IC50 EN RAFT(CRGD)4 (A) ET EN CONJUGUE (C) ET DES EFFICACITES RELATIVES EN RAFT(CRGD)4 (B) ET EN CONJUGUE (D). 58 FIGURE 32 : IMAGES DE MICROSCOPIE CONFOCALE (PLAN A MI-EPAISSEUR DES CELLULES) PERMETTANT LA COMPARAISON DU MARQUAGE DES LIGNEES CELLULAIRES HEK293(3), HEK293(1), M21 ET M21L PAR LES CONJUGUES 5 ET 7 ET LE RAFT(CRGD)4 FLUORESCENTS A TROIS CONCENTRATIONS : 10 M, 1M ET 0. 1M . 61 FIGURE 33 : AGRANDISSEMENT D'UNE CELLULE HEK3 MARQUEE PAR LE CONJUGUE 5 A UNE CONCENTRATION DE 1 M. . 62 FIGURE 34 : HISTOGRAMME COMPARANT LES CONJUGUES 5 ET 7 PORTEUR DE CY5. 5 (NON SULFONATEES) ET LE RAFT(CRGD)4-CY5. 5 TETRASULFONATES. CHAQUE GRAPHIQUE REPRESENTE LA QUANTITE DE CELLULES EN FONCTION DE L'INTENSITE DE FLUORESCENCE MESUREE POUR CHACUNE D'ENTRE ELLES. . 64 FIGURE 35 : HISTOGRAMME COMPARANT LES CONJUGUES 6 ET 8 PORTEURS DE CY5. 5 TETRASULFONATES ET LE RAFT(CRGD)4-CY5. 5 TETRASULFONATES, CHAQUE GRAPHIQUE REPRESENTE LA QUANTITE DE CELLULES EN FONCTION DE L'INTENSITE DE FLUORESCENCE MESUREE POUR CHACUNE D'ENTRE ELLES. . 66 FIGURE 36 : DIAGRAMME DE L'INTENSITE DE FLUORESCENCE DES DIFFERENTS CONJUGUES PEPTIDIQUES. . 68 FIGURE 37 : A) BIODISTRIBUTION IN VIVO DES CONJUGUES CHEZ LA SOURIS NUDE PORTANT UNE TUMEUR U87MG. LES IMAGES DE FLUORESCENCE (500 MS DE TEMPS D'INTEGRATION, LE CONTRASTE FIXE ENTRE 1784-11015) SONT OBTENUES A 1H, 3H, 5H ET 24H APRES INJECTION INTRAVEINEUSE DES CONJUGUES. B) BIODISTRIBUTION EX VIVO DANS LES ORGANES A 24H. LES ROI SONT DEFINIES SUR LES ORGANES EXTRAITS AFIN DE QUANTIFIER LA QUANTITE DE PHOTONS EMIS PAR PIXEL APRES UNE EXPOSITION DE 500 MS . 69 FIGURE 38 : COURBES REPRESENTATIVES DU POURCENTAGE DE FLUORESCENCE EN FONCTION DU TEMPS, AVEC LA FLUORESCENCE A 15 MINUTES COMME VALEUR REFERENCE. . 71 FIGURE 39 : COURBES REPRESENTATIVES DU POURCENTAGE DE FLUORESCENCE EN FONCTION DU TEMPS, AVEC LA FLUORESCENCE A 15 MINUTES COMME VALEUR REFERENCE. . 72 FIGURE 40 : BIODISTRIBUTION DES AGUIX-CY5. 5 CHEZ LA SOURIS NUDE PORTANT UNE TUMEUR ORTHOTOPIQUE CAL33-LUC LUC. . 75 FIGURE 41 : BIODISTRIBUTION IN VIVO DES AGUIX-CY5. 5 CHEZ LA SOURIS NUDE PORTANT UNE TUMEUR ORTHOTOPIQUE SQ20B. . 76 FIGURE 42 : LOCALISATION DES NANOPARTICULES FLUORESCENTES SUR LES COUPES CONGELEES DE TUMEURS CAL33-LUC-LUC A DIFFERENTS TEMPS APRES L'ADMINISTRATION INTRAVEINEUSE (AGUIX-CY5. 5, 200 L A [GD3 ] ~ 20 MMOL / L). . 77 FIGURE 43 : PROTOCOLE D'IRRADIATION DES TUMEURS DANS UN MODELE DE CANCER DES VADS . 78 FIGURE 44 : COURBES DE CROISSANCE TUMORALE CHEZ DES SOURIS PORTEUSES DE TUMEURS CAL33-LUC . 79 FIGURE 45 : COURBES DE SURVIE CHEZ DES SOURIS PORTEUSES DE TUMEURS CAL33-LUC . 80 FIGURE 46 : PROTOCOLE EXPERIMENTAL D'IRRADIATION. . 81 FIGURE 47 : COURBES DE CROISSANCE TUMORALE CHEZ DES SOURIS PORTEUSES DE TUMEURS CAL33-LUC. . 83 FIGURE 48 : COURBES DU SIGNAL DE BIOLUMINESCENCE CHEZ DES SOURIS PORTEUSES DE TUMEURS CAL33-LUC . 85 FIGURE 49 : COURBES DE SURVIE CHEZ DES SOURIS PORTEUSES DE TUMEURS CAL33-LUC . 86 6 Liste des Tableaux TABLEAU 1 : LES DIFFERENTS CONJUGUES PEPTIDIQUES TESTES. . 31 TABLEAU 2 : COMPARAISON DES VALEURS DE IC50 EXPRIMEES EN RAFT(CRGD)4 ET EN CONJUGUE. . 57 TABLEAU 3 : RECAPITULATIFS DES CARACTERISTIQUES DES CONJUGUES LINEAIRES FLUORESCENTS POLYMERE-RAFT(CRGD)4. . 59 TABLEAU 4 : NIVEAU D'EXPRESSION RELATIF DES INTEGRINES V3 ET V1 EN FONCTION DES LIGNEES CELLULAIRES . 60 Liste des abréviations ADN : Acide DésoxyriboNucléiques AMP : Adénosine MonoPhosphate 7 Ang-1 : Angiopoïétine-2 Ang-2 : Angiopoïétine-2 ARN : Acide RiboNucléiques ATP : Adénosine TriPhosphate BSA : Albumine Sérine Bovine Ca : Calcium CAL : Centre Antoine Lacassagne CCD : Charge Coupled Device CE : Cellules Endothéliales Cy5. 5 : Cyanine 5. 5 DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO : DiMéthylSulfOxyde EBV : Epstein-Barr virus EMCCD : Electron Multiplying Charge Coupled Device EPR : Enhanced Permeability and Retention HPV : Human papillomavirus IC50 : Concentration Inhibitrice médiane IMRT : RadiotThérapie avec Modulation d'Intensité IRM : Imagerie à Résonance Magnétiqu IT : Intra Tumorale IV : IntraVeineuse KeV : Kilo électron Volte LUC : Luciférase MEC : Matrice Extracellulaire 8 MeV : Mega électron Volte Mg : Magnésium NAM : N-acétyl-muramique NMRI : Naval Medical Research Institute O. C. T : Optimal Cutting temperature ORL : Oto-rhino-laryngologie PBS : Phosphate Buffered Saline PDGF : Platelet Derived growth Factor PEG : PolyEthylène Glycol PSM : Poste de Sécurité Microbien RAFT : Regioselectively Addressable Functionalized Template RGD : Arginine-Glycine-Acide aspartique RMN : Résonance Magnétique Nucléaire ROI : Region d'Intérêt RPM : Rotation Par Minute RT : RadioThérapie SVF : Sérum de Veau Foetal TEP : Tomographie par Emission de Positons TEMP : Tomographie par Emission MonoPhotonique TGF-1 : Transforming Growth Factor VADS : Voies Aéro-Digestives Supérieur VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor Z : Numéro atomique 9 Introduction A l'heure actuelle, la cancérologie fait face à un double enjeu : améliorer le diagnostic précoce des tumeurs et développer de nouvelles thérapies ciblées. La détection précoce des cancers est primordiale pour permettre une thérapie efficace. En effet, aux stades précoces, le nombre de cellules tumorales à éradiquer est relativement faible et ces cellules ne possèdent pas toutes les anomalies génétiques qui leur permettront de s'adapter et de résister aux traitements. A l'heure actuelle, le diagnostic des cancers repose sur des techniques d'imagerie traditionnelles et sur la détection de marqueurs tumoraux circulants. Ces derniers, secrétés en grande quantité par les cellules tumorales, ne présentent pas de spécificité absolue, mais permettent de suspecter la présence d'un cancer. Les techniques d'imagerie utilisées, la radiographie (rayons X), l'échographie (ultra-sons), l'IRM (résonance magnétique), les techniques nucléaires (radioactivité) et l'endoscopie sont des méthodes adaptées et performantes pour la détection de tumeurs de quelques millimètres. Malgré les récents progrès réalisés pour ses différents moyens de traitements, la chirurgie demeure la thérapeutique pivot du traitement de la majorité des tumeurs solides. L'exérèse de la tumeur primaire est efficace pour les petits foyers tumoraux sans métastases. Cependant, elle reste problématique car l'élimination de l'intégralité des cellules tumorales et la prévention de la dissémination lors de l'opération chirurgicale peuvent être difficiles. Toujours pour les traitements locaux, la radiothérapie, basée sur l'utilisation de rayonnements ionisants (X, alpha, beta ou gamma) est également utilisée pour le traitement anti-tumoral, mais pose le problème de la toxicité des rayonnements ionisants sur les tissus sains environnants. Enfin, les chimiothérapies agissent sur toutes les cellules qui prolifèrent. Elles sont très efficaces, mais ne sont pas sélectives des cellules tumorales et sont à l'origine de nombreux effets secondaires (toxicité hématologique, cardiaque, gonadique, digestive, alopécie). Dans cette optique de détection et de traitement précoce des cancers, des peptides ciblant la néo- angiogenèse ont été développés comme le motif RGD qui fera l'objet de cette étude. Le but du projet est d'évaluer l'apport de la présentation multivalente du cluster Raft(cRGD)4 sur l'affinité du conjugué pour les intégrines v3 fortement exprimées lors de la néo-vascularisation. Cette étude est réalisée sur une série de conjugués linéaires à nombre variable de clusters peptidiques Raft(cRGD)4. 10 L'étude in vitro sera faite sur des cellules rénales embryonnaires HekB1 et HekB3, l'évaluation in vivo sera faite sur des souris nude porteuses de tumeurs sous-cutanées U87MG (glioblastome humain). Nous montrerons également l'intérêt de l'utilisation de nanoparticules théranostiques à base de Gadolinium (AGuIX) pour la prise en charge diagnostique et thérapeutique des cancers des Voies- Aéro-Digestives Supérieures (VADS). L'étude et la validation de nouvelles molécules thérapeutiques ou de nouvelles techniques chirurgicales pour le traitement des cancers des VADS nécessite un modèle animal approprié. Ce modèle doit être représentatif de la maladie et reproductible afin de s'approcher au plus près de la réalité clinique. Nous réaliserons donc les études sur le modèle orthotopique de cancers des VADS développé et validé au sein de l'équipe (1). 11 I. Développement de nouvelles stratégies innovantes pour le diagnostic et le traitement des cancers 1. L'angiogenèse Le processus d'angiogenèse est le développement de nouveaux capillaires à partir du réseau vasculaire préexistant, c'est un phénomène physiologique normal de formation de vaisseaux sanguins, notamment lors du développement embryonnaire, qui devient un processus pathologique essentiel pour la croissance des tumeurs et la dissémination des métastases. L'angiogenèse peut se développer selon deux procédés : par bourgeonnement (figure 1) ou par intussusception, c'est à dire par scission des vaisseaux existants. Figure 1 : Les grandes étapes de l'angiogenèse par bourgeonnement L'angiogenèse par bourgeonnement suit différentes étapes. L'activation des cellules endothéliales quiescentes par des facteurs angiogéniques entrane la dégradation locale de la membrane basale et de la matrice extracellulaire environnante par les protéases. Cette première étape n'est possible qu'après la perte de contact entre les cellules endothéliales et les péricytes. Pour cela, VEGF (Vascular 12 Endothelial Growth Factor) et Ang-2 (Angiopoïétine-2) sécrétés par les cellules endothéliales activées, conduisent à l'augmentation de la perméabilité vasculaire et à la perte de contact entre les cellules. Les cellules endothéliales produisent alors les protéases qui dégradent la lame basale puis migrent en direction du stimulus angiogénique par chimiotactisme et prolifèrent sous l'activation du couple VEGF / VEGF-R1. Enfin, elles se différencient en une structure de type capillaire dépourvu de cellules périvasculaires. Celles-ci sont alors recrutées par TGF-1 (transforming growth factor ), PDGF (platelet derived growth factor) et Ang-1 pour former un réseau vasculaire fonctionnel irriguant les zones en développement. 2. L'angiogenèse tumorale De la même manière que l'organisme, la tumeur a besoin d'apports spécifiques pour se développer. Pour croitre jusqu'à 1 à 2 mm3, les cellules tumorales reçoivent l'oxygène par diffusion passive. Au- delà de cette taille, cet apport devient insuffisant, provoquant alors un manque d'oxygénation. Cette hypoxie demeure un puissant activateur du phénomène d'angiogenèse (2). La néo-angiogenèse tumorale est reconnue comme une étape critique indispensable au développement, à la survie et à la dissémination des tumeurs cancéreuses. Les nouveaux vaisseaux vont non seulement permettre l'apport nécessaire en nutriments et en oxygène pour le développement de la tumeur mais également le passage de cellules malignes dans la circulation sanguine. La néo-angiogenèse tumorale peut être décrite de manière simplifiée comme une succession d'étapes similaires à celles de l'angiogenèse physiologique. La divergence principale concerne la maturation des vaisseaux. i 1) Intégrine v3 : une cible de choix Les intégrines sont des récepteurs d'adhérence cellulaire, c'est-à-dire des protéines transmembranaires dont l'une des extrémités interagit en général avec des protéines de la matrice extracellulaire, l'autre extrémité interagissant avec des constituants intracellulaires, notamment des molécules de signalisation contrôlant la migration, la survie, la prolifération et la différenciation. 13 Les intégrines sont constituées de deux sous-unités et . Chaque sous-unité possède une courte région cytoplasmique, une région transmembranaire ainsi qu'une région extra-cellulaire. Cette dernière présente la particularité de suivre une structure en V o chaque sous unité est repliée (Figure 2). Il s'agit d'une conformation physiologique de faible affinité dans laquelle la liaison avec un ligand entraine un changement de conformation : l'intégrine se déploie et présente un état physiologique de haute affinité (3). Figure 2 : Représentation schématique des changements de conformation de l'intégrine v3 Forme inactive : conformation physiologique de faible affinité ; Forme active : conformation physiologique de haute affinité. (3) L'intégrine v3 n'est pas ou faiblement exprimée dans la plupart des tissus. Seules certaines régions osseuses, l'endomètre (au milieu du cycle menstruel), le placenta, les sites inflammatoires et les tumeurs invasives révèlent de hauts niveaux d'expression. Ces derniers ont été mis en évidence spécifiquement sur l'endothélium des vaisseaux en formation dans différents modèles d'angiogenèse. L'intégrine V3 est surexprimée par la néo-vascularisation et certaines cellules tumorales (plus de 100 000 intégrines par cellule) par rapport aux tissus normaux (moins de 10 000 intégrines par cellule). Cette différence d'expression fait de ce récepteur membranaire une cible particulièrement intéressante pour le ciblage de l'angiogenèse tumorale et peut permettre de délivrer des agents thérapeutiques tout en diminuant leurs toxicités sur les cellules saines. 14 La plupart des intégrines comme l'intégrine V3 servent de lien entre le cytosquelette et la matrice extracellulaire (MEC) en se liant à la fibronectine, la laminine et certains récepteurs de la famille des immunoglobulines. Cette fixation se fait grâce à une séquence peptidique constituée de trois acides aminés : Arginine-Glycine-Acide aspartique (RGD). La séquence RGD est conservée dans tous les ligands de l'intégrine V3. 2) Le motif RGD Ce peptide RGD représente un composé clef pour cibler et suivre l'expression de l'intégrine V3, que ce soit dans les cellules tumorales ou endothéliales durant la néoangiogenèse (4). Des optimisations de la séquence RGD ont été apportées afin de procurer aux ligands une meilleure stabilité, affinité et spécificité. Ainsi la cyclisation du RGD (cRGD) est couramment utilisée pour améliorer les propriétés de fixation en donnant une rigidité à la structure (Figure 3). Cela permet également de rendre le peptide moins sujet aux dégradations chimiques. De nombreuses équipes ont démontré l'utilité du cRGD : Gerlag et al. ont utilisé le cRGD dans un modèle murin d'inflammation articulaire ce qui a permis une diminution de l'inflammation par greffage d'un dimère d'heptapeptide proapoptotique (5) Avraamides et al. ont montré que le peptide cRGD PEGylé marqué avec du 18F ou du 64Cu permet la détection, par imagerie, de tumeurs mammaires xénogreffés à partir d'une taille de 1. 5mm de diamètre (6). Des ligands présentant des motifs cRGD multimériques ont également été décrits. Cette approche permet une meilleure affinité des molécules et une amélioration du ciblage. En effet l'internalisation du cRGD monovalent peut se faire indépendamment des voies d'endocytose alors que le cRGD multivalent induit une endocytose dépendante des intégrines (4, 7). Dans cette optique, une plateforme peptidique RAFT (Regioselectively Addressable Functionalized Template) sur laquelle quatre séquences cRGD sont greffées a été développée au laboratoire (Figure 3). Cette association permet une meilleure affinité pour les intégrines ainsi qu'une présence prolongée de la molécule dans le sang, due à l'augmentation de la taille qui diminue la filtration glomérulaire rénale. 15 Cela entraine une augmentation du temps de demi-vie plasmatique et augmente la probabilité de fixation de la molécule sur son récepteur (8). Cette molécule présente également un second domaine qui va permettre son couplage avec différentes molécules de marquage ou à visées thérapeutiques. Le RAFT-c[RGD]4 est un excellent outil théranostique car il présente une bonne pharmacocinétique et une forte capacité de ciblage des tumeurs primaires ou métastasées après injection systémique. Ainsi, le couplage RAFT-c[RGD]4 avec un fluorophore permet d'obtenir un outil puissant de diagnostic tumoral10 alors que son couplage avec un peptide pro-apoptotique fait de lui un outil de choix pour la thérapie anti cancéreuse (9). Le motif décapeptide RAFT (surligné en rouge) soutient 4 motifs c(RGD) (surlignés en vert) Figure 3 : Structure du RAFT-RGD et du cRGD. (10) 3) Utilisation de macromolécules ciblantes La reconnaissance moléculaire est à la base de tous les systèmes vivants. Elle implique des interactions étroites entre deux entités (souvent de type ligand/récepteur) qui résultent de leur complémentarité fonctionnelle, chimique et/ou géométrique. La force et la réversibilité de ces interactions jouent un rôle important sur la modulation et la régulation des phénomènes biologiques. La sélectivité et la stabilité de la reconnaissance ligand/récepteur peuvent être renforcées par des interactions multivalentes. 16 Pour les systèmes biologiques, une affinité de reconnaissance élevée résulte le plus souvent de multiples interactions faibles (interactions multivalentes) plutôt que d'un nombre restreint d'interactions très fortes. Les interactions multiples permettent d'induire des réponses biologiques spécifiques qui n'ont pas lieu dans le cas d'un contact monovalent. Afin de présenter les ligands de ciblage de manière multivalente, plusieurs types de support peuvent être utilisés. De nombreuses structures allant de l'échelle moléculaire à l'échelle nanométrique et disposant de caractéristiques variables peuvent être envisagées. Selon la nature du système, l'effecteur à délivrer peut-être soit directement greffé par liaison covalente (ex : polymère, micelle, dendrimère), soit encapsulé à l'intérieur d'une cavité (ex : liposomes, certaines particules polymères). II. Les nanoparticules Le terme nanoparticule englobe une multitude d'objets de formes et de tailles extrêmement variées. Une nanoparticule est un objet, peu importe la forme, dont au moins une de ses dimensions est comprise entre 1 et 100 nanomètres (11). C'est cette taille extrêmement faible, qui fait des nano-objets, des outils très intéressants pour le domaine biomédical. En effet, ces objets sont du même ordre de grandeur que les biomolécules et plus petits que les cellules (Figure 4) Figure 4 : Comparaison de l'ordre de grandeur des nanoparticules et des constituants biologiques (11). 17 1. Ciblage de la tumeur Le ciblage tumoral peut être assuré par des molécules reconnaissant des anomalies caractéristiques des cellules tumorales (antigènes cellulaires, récepteurs membranaires) ou de son environnement (néo- vascularisation tumorale). Ces ligands permettent d'améliorer les propriétés de pharmaco-guidage des systèmes de vectorisation assurant le transport ciblé des molécules effectrices 1) Ciblage tumoral passif : effet EPR Les anomalies anatomiques et physiopathologiques des tissus tumoraux, en particulier la perméabilité vasculaire accrue et le faible drainage lymphatique, permettent le développement de stratégies plus efficaces en termes de ciblage des tumeurs. En effet, la structure anormale des vaisseaux engendre une fuite importante des composés plasmatiques, ce qui permet aux macromolécules et nanoparticules de diffuser dans la tumeur. De plus, du fait de la déficience de drainage lymphatique dans les tissus tumoraux, les composés plasmatiques s'accumulent dans la tumeur (12). Ce phénomène, appelé effet EPR (Enhanced Permeability and Retention) et décrit il y a une vingtaine d'années, est mis à profit pour permettre l'accumulation sélective de macromolécules au sein des tumeurs solides. Il est ainsi possible, en un à deux jours, d'atteindre de fortes concentrations locales en principe actif, supérieures à celles obtenues dans les tissus sains (13). L'effet EPR est devenu un élément essentiel, pris en compte pour le développement des nouvelles thérapies anti-tumorales. Le ciblage passif nécessite l'utilisation de systèmes stables, non agrégés, furtifs et présentant un temps de circulation suffisamment long pour conduire à l'accumulation du système dans les tumeurs. L'effet EPR est prédominant pour les composés de poids moléculaire supérieur à 40 kDa, il nécessite aussi que les composés aient une taille qui ne dépasse pas la taille de pores des vaisseaux perméabilisés (entre 380 et 780 nm) (14, 15) et qui ne soit pas trop petite. En effet, l'effet EPR est négligeable pour les petites molécules qui peuvent se redistribuer dans la circulation sanguine par diffusion et/ou convection et sont éliminées préférentiellement par voie rénale (16). Enfin, l'effet EPR est influencé par la taille de la tumeur, avec un meilleur effet EPR dans les tumeurs de petite taille, probablement lié à une meilleure densité de vaisseaux par rapport aux tumeurs de grande taille présentant une région avasculaire. 18 2) Ciblage tumoral actif : les cibles tumorales En plus de l'accumulation passive par effet EPR, un ciblage actif des tumeurs peut être réalisé par greffage d'un motif de ciblage sur les molécules d'intérêt ou sur les vecteurs (Figure 5). La cible doit être accessible c'est-à-dire qu'elle doit être exprimée à la surface des cellules et si possible être en contact avec la circulation sanguine. Elle doit être également spécifique de la zone tumorale ou y être exprimée plus fortement que dans les autres tissus. Le ligand choisi pour ce ciblage doit avoir une grande sélectivité ainsi qu'une forte affinité pour sa cible pour éviter tout ciblage non spécifique. Les cellules tumorales expriment de nombreux récepteurs à leur surface constituant des cibles potentielles. Ainsi, l'utilisation d'anticorps ciblant par exemple, les récepteurs CD20 (lymphome de Hodgkin), CD25 (lymphome à cellules T) ou CD33 (leucémie myéloïde aige), a permis de délivrer des radionucléides (Zevalin), des immunotoxines (Ontak) et des antibiotiques anti-tumoraux (Mylotarg) de manière sélective dans les cellules tumorales. Le grand nombre d'études précliniques réalisées sur le ciblage actif des tumeurs a permis de faire émerger différents principes généraux. Dans la majorité des cas, les nanoparticules ciblant des récepteurs surexprimés à la surface des cellules tumorales améliorent l'efficacité anti-tumorale, en augmentant leur internalisation cellulaire plutôt qu'en augmentant l'accumulation tumorale (17, 18). L'accessibilité des récepteurs à la surface des vaisseaux a conduit au développement de nombreuses thérapies ciblant les cellules endothéliales tumorales. 19 Figure 5 : Représentation de la complémentarité des ciblages passif et actif (19). Ciblage passif de molécules dans les cellules tumorales, via l'effet EPR ; Ciblage actif de molécules par vecteur fonctionnalisé, via le ciblage de récepteurs (sur)exprimés sur les cellules tumorales. 2. Applications des nanoparticules L'utilisation des nanoparticules pour la détection et le traitement de pathologies ouvre un nouveau domaine de recherche. L'un des terrains d'application le plus prometteur, et aussi le plus avancé actuellement, est la délivrance de médicaments ( drug delivery en anglais), et en particulier le développement de thérapies ciblées pour l'oncologie. En effet, véhiculer les molécules anticancéreuses par des nanoparticules permet d'augmenter l'accumulation et donc la libération locale au niveau des tumeurs. De nombreuses nanoparticules sont actuellement en cours d'études précliniques ou cliniques pour la délivrance de médicaments. Il s'agit principalement de liposomes encapsulant des molécules hydrophiles et de nanoparticules solides à base de lipides, de protéines ou de polymères biodégradables encapsulant des molécules lipophiles, par exemple, l'encapsulation de 5-fluoro-uracile dans des particules polymériques (20). La délivrance de médicaments concerne principalement des molécules chimiques (principes actifs) mais elle englobe également les agents thérapeutiques biologiques comme les protéines, les peptides et également l'ADN ou l'ARN pour les thérapies géniques (2123). Les nanoparticules peuvent 20 également être utilisées pour d'autres types de thérapies comme la radiothérapie, la thermothérapie ou la thérapie photodynamique. Dans le cadre d'une utilisation en radiothérapie, les nanoparticules peuvent soit véhiculer une source radioactive et cibler la zone d'intérêt (24), soit être utilisées comme agents radiosensibilisants, comme c'est le cas des nanoparticules d'or ou d'oxyde de Gadolinium pour une irradiation par rayons X (10 ; 25). La thermothérapie ou hyperthermie consiste à provoquer, par un signal extérieur (magnétique ou laser, par exemple), un échauffement local par activation des nanoparticules situées dans la zone à traiter, de manière à ce que l'énergie dissipée soit suffisante pour élever la température de quelques degrés (autour de 45C), et permettre la destruction des cellules. Cette thérapie fait intervenir des nanoparticules magnétiques (26, 27) ou des nanoparticules d'or (28). Enfin, la thérapie photodynamique est basée sur l'utilisation d'agents photo-sensibilisateurs capables de produire de l'oxygène singulet et des radicaux libres après absorption d'un rayonnement lumineux, conduisant à la destruction des cellules. Les nanoparticules jouent un rôle de transporteur en véhiculant le photo-sensibilisateur dans la zone d'intérêt (29). 3. Les nanoparticules radiosensibilisantes Le principe de la radiothérapie repose sur l'utilisation de rayonnements ionisants pour détruire les cellules cancéreuses. Les rayonnements ionisants se présentent sous la forme d'un faisceau d'ondes ou de particules suffisamment énergétiques pour ôter les électrons de leur enveloppe électronique : c'est l'ionisation. Les rayons déposent leur énergie dans les cellules des tissus à travers lesquels ils passent. L'énergie déposée peut détruire les cellules cancéreuses ou causer des modifications génétiques provoquant la mort de la cellule. Le rayonnement ionisant agit sur les tissus en trois étapes : la première est physique, la seconde physicochimique et la dernière biologique. L'étape physique est de très courte durée (10-13 s). Elle fait référence aux ionisations et aux excitations moléculaires suite au dépôt d'énergie lors du passage du rayon. Cette phase est suivie par une étape physicochimique pouvant durer de quelques secondes à quelques minutes. Les molécules ionisées ou excitées réagissent entre elles et avec les molécules environnantes. Enfin, lors de l'étape biologique, les rayonnements ionisants altèrent la structure des macromolécules, provoquant la perturbation des fonctions principales de la vie cellulaire. Cette phase peut s'étaler sur plusieurs mois. 21 La RT est essentiellement limitée dans sa capacité à fournir des doses thérapeutiques pour le volume de la tumeur, tout en minimisant les dommages aux tissus sains environnants. De nombreuses solutions ont été proposées pour remédier à ce problème, tombant globalement en deux catégories principales : La mise en œuvre de techniques de RT de pointe permettant de moduler l'intensité du rayonnement [radiothérapie avec modulation d'intensité (IMRT)] en vue d'adapter plus précisément la dose à la cible tumorale. Le développement d'une nouvelle génération d'agents thérapeutiques qui sensibilisent les cellules aux rayonnements ionisants (radiosensibilisateurs) en améliorant la dose d'efficacité avec leur haute densité et leur numéro atomique élevé (Z) comme nous l'avons vu précédemment. Cette stratégie revient à augmenter sélectivement l'efficacité de la radiothérapie dans les tissus tumoraux et à épargner les tissus sains environnants à condition d'accumuler les agents radiosensibilisants dans la tumeur (Figure 6). Le principe physique repose sur le fait que l'absorption du rayonnement par les nanoparticules produit une émission en cascade d'électrons secondaires (électrons Auger et photoélectrons) pouvant causer de manière directe ou indirecte des dégâts importants aux cellules cancéreuses. Figure 6 : Principe de l'utilisation d'agents radiosensibilisants pour la radiothérapie (Journées Nationales en Nanosciences et Nanotechnologies 2012) Les dégâts directs proviendraient de l'interaction du rayonnement secondaire directement avec les brins d'ADN, provoquant ainsi des cassures. Cependant, l'accès au noyau cellulaire par les nanoparticules est difficile à envisager en raison de la très faible taille des pores nucléaires. Les dégâts indirects proviennent d'espèces extrêmement réactives, les radicaux, qui sont créés suite à l'interaction du rayonnement secondaire et des nanoparticules ionisées avec l'eau (qui est le constituant cellulaire principal). Les espèces formées sont principalement le radical hydroxyle HO, qui est un 22 oxydant puissant, et le radical hydrogène (H) qui est un réducteur puissant. Ces radicaux peuvent réagir entre eux ou avec le dioxygène, donnant ainsi l'ion radicalaire superoxyde O2-, ou encore le peroxyde d'hydrogène H2O2. Ces espèces très agressives interagissent ensuite avec les biomolécules pour causer des dégâts importants, souvent irréversibles. Lorsque la concentration en agents radiosensibilisants est maximale au sein du volume tumoral à traiter et minimale au niveau des tissus sains, le volume cible peut alors être irradié par des rayons X. Les agents de contraste à base d'éléments à haut numéro atomique comme l'iode (Z 53) et le gadolinium (Z 64) présentent une forte probabilité d'interaction de photons de basse énergie par effet photoélectrique. Les premières démonstrations de l'efficacité de nanoparticules d'or, en termes de sélectivité de la tumeur et d'efficacité de la radiosensibilisation ont été réalisées en 2004 (25). Par la suite, des modèles prédictifs de l'effet radiosensibilisant basés sur le coefficient d'absorption des éléments à haut numéro atomique comparé au tissu mou ont été développés. Ces modèles mettent en évidence deux effets majeurs : pour une énergie inférieure à 150 KeV, l'effet photoélectrique prévaut (électrons Auger) et induit un coefficient d'absorption d'énergie de masse plus élevé et donc une radiosensibilisation plus importante pour les éléments de haut numéro atomique. Pour des énergies plus hautes comme 6 MeV, l'effet Compton est prédominant et le coefficient d'absorption est similaire pour les deux tissus (Figure 7). Figure 7 : Comparaison du coefficient d'absorption de l'énergie de masses des photons, pour le gadolinium et les tissus mous. Adapté de Hubbell et Seltzer (30, 31). 23 Ces nano-objets présentent l'avantage de regrouper une grande concentration du même élément au sein d'un même objet, contribuant à l'effet radiosensibilisant, tout en étant aisément fonctionnalisables soit par des polymères, principalement pour améliorer leur furtivité, soit par des ligands biologiques permettant un ciblage spécifique de récepteurs cellulaires. III. Les cancers des Voies Aéro-digestives Supérieures 1. Généralités Le cancer des voies aérodigestives supérieures (VADS) est le cinquième cancer le plus fréquent en France. En 2012, on estime à près de 14 638 nouveaux cas de cancers des VADS dont plus de 74 % chez les hommes, et à 4 098 décès dont 80% chez les hommes, liés à ces cancers (D'après l'institut national du cancer). Au niveau mondial, on compte près de 650 000 nouveaux cas chaque année avec plus de 350 000 décès (39, 40). Figure 8 : Les voies aérodigestives supérieurs D'après la Ligue Nationale Contre le Cancer. 24 Dans plus de 95 % des cas, ces cancers sont des carcinomes de type épidermoïde, c'est-à-dire des cancers développés au niveau de la muqueuse qui tapisse ces organes. On distingue deux groupes principaux de tumeurs (Figure 8) : Les cancers de la partie supérieure de l'appareil digestif, qui s'étend des lèvres à l'œsophage. Les cancers de la partie supérieure de l'appareil respiratoire, qui s'étend des narines jusqu'à la trachée qui conduit l'air dans les poumons. Les cancers des VADS sont le plus souvent liés à une consommation excessive de tabac et/ou d'alcool. Cependant, certains sont associés à une exposition à des composés nocifs dans un cadre professionnel. 2. Les facteurs de risques La consommation de boissons alcoolisées et de tabac forme les deux facteurs de risque les plus importants impliqués dans la survenue de ces cancers. Le risque augmente en fonction de la dose consommée. On estime que 54 à 87 % des cancers des VADS, sont liés au tabac. Chez les fumeurs exclusifs, le risque de cancer concerne plus particulièrement le larynx. Le risque de cancer est majoré chez les personnes associant consommation de tabac et d'alcool. Chez ces personnes, ce sont principalement des cancers de la cavité buccale, de l'oropharynx et de l'hypopharynx qui se développent. D'autres facteurs de risques entrent en compte dans les cancers des voies aéro-digestives supérieures : des prédispositions génétiques ont été mises en évidence (41) ainsi que des causes infectieuses. Deux types d'infections virales augmentent le risque de survenue de cancer ORL : L'Epstein-Barr virus (EBV) transmissible essentiellement par la salive est reconnu comme facteur de risque de cancer du nasopharynx. Il s'agit d'un cancer rare en France, mais 25 fois plus fréquent dans certaines régions du globe comme l'Afrique du Nord, ou l'Asie du sud. Depuis quelques années, les preuves s'accumulent sur le rôle du papillomavirus (HPV), en particulier dans l'augmentation du risque de cancer de la cavité buccale et de l'oropharynx. Ce 25 virus, sexuellement transmissible, est déjà connu pour son rôle dans le développement du cancer du col de l'utérus (42). 3. Prise en charge des cancers des VADS 1. Diagnostique et bilan pré-thérapeutique Situées au carrefour des voies digestives et respiratoires, les tumeurs des VADS sont délicates à prendre en charge car l'équipe médicale doit proposer un traitement offrant la meilleure efficacité possible tout en limitant au maximum ses conséquences sur l'aspect physique ainsi que sur le fonctionnement normal de la région. Le protocole de traitement est déterminé selon le stade de la tumeur. Il est établi à la suite du bilan clinique et tient compte de la classification TNM et de l'état général du patient. Les trois lettres symbolisent la propagation de la maladie cancéreuse sur le site de la tumeur primitive (T), dans les ganglions lymphatiques voisins (N pour node en anglais) et à distance pour d'éventuelles métastases (M). 2. Le traitement des cancers VADS Le traitement des cancers des VADS fait face aux mêmes problématiques que celles décrites dans l'introduction. Actuellement, il repose sur la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie, tandis qu'apparat la perspective de leur adjoindre des traitements ciblés. Le traitement des cancers des VADS à un stade avancé, fait appel à plusieurs de ces techniques diversement associées. Les associations optimales sont loin d'être établies actuellement, d'autant que la diversité des localisations topographiques tumorales complique l'établissement de protocoles évaluant de façon pertinente les différentes stratégies disponibles. 3. La Radiothérapie des cancers VADS Comme énoncé précédemment, la radiothérapie est un traitement locorégional qui permet une action directe sur la zone tumorale et sa périphérie, ainsi que sur les ganglions lymphatiques. La radiothérapie est utilisée dans les cas précoces de cancer ne nécessitant pas de chirurgie o en cas de refus de la chirurgie par le patient atteint de cancer des VADS. Elle est également utilisée en postopératoire en fonction des critères histologiques défavorables dont l'exérèse incomplète de la tumeur et la présence de plusieurs ganglions cervicaux envahis. Le rôle de la radiothérapie dans ces situations est de diminuer les risques de rechute locale après chirurgie (4345). 26 Malgré son efficacité, la radiothérapie présente plusieurs effets secondaires, des érythèmes cutanés ou des nausées et vomissements peuvent survenir durant la période de traitement. Certains effets secondaires à long terme ou effets secondaires tardifs peuvent apparaitre longtemps après la fin du traitement mais ils restent exceptionnels. L'utilisation de nouvelles molécules/nanoparticules radiossensibilisantes pourraient augmenter l'efficacité de la radiothérapie tout en diminuant la dose de radiation administrée au patient et par la suite réduire les effets indésirables (36, 46). 27 Matériel et méthodes I. La culture cellulaire 1. Lignée CAL33-LUC Cette lignée est obtenue à partir d'un carcinome épidermoïde humain de la langue (CAL33), les cellules ont ensuite été infectées avec un rétrovirus afin d'insérer stablement le gène de la luciférase. Cette transfection permet de pouvoir les visualiser en imagerie de bioluminescence. Les cellules ont un temps de doublement de 43 heures. La lignée cellulaire CAL33-LUC nous a été fournie gracieusement par le Dr. Alexandre Bozec (Service Oto-rhino-laryngologie et chirurgie de la Face et du Cou, Centre Antoine Lacassagne, Nice). Cette lignée a été isolée en culture et caractérisée au sein de ce centre (47). 2. Lignées Hek293-(1) et Hek293-(3) Les cellules Hek293-(1) et Hek293-(3) sont des cellules rénales embryonnaires humaines issues de la lignée Hek293 (ATCC CRL-1573). Elles ont été respectivement modifiées pour surexprimer les sous-unités 1 et 3 des intégrines. La culture de ces cellules nécessite l'ajout d'un antibiotique : la G418 (Geneticin) qui est couramment utilisé pour sélectionner des cellules génétiquement modifiées. 3. Lignées M21 et M21L La lignée M21 est dérivée d'un mélanome humain exprimant l'intégrine v3. Les cellules M21-L sont issues de la lignée M21 et ont été sélectionnées par cytométrie en flux pour leur faible niveau d'expression de l'intégrine v3. 28 4. Lignée U87MG Cette lignée cellulaire est une lignée issue de glioblastome humain exprimant l'intégrine v3. Cette lignée est fréquemment utilisée au laboratoire pour les implantations sous cutanées car elle possède un bon effet EPR (ATCC HTB-14). 5. Le maintien des cellules en culture La culture cellulaire se fait sous poste de sécurité microbien de type 2 (PSM 2) à flux laminaire pour un maintien de la stérilité et une protection de la manipulation, du manipulateur et de l'environnement. Les cellules sont maintenues en culture en milieu complet contenant du sérum de vœux fœtal 10% (v/v) (préalablement décomplémenté pendant 30 minutes à 56C). Elles sont conservées en atmosphère humide dans une étuve à 37C en présence de 5% de CO2. Lors de chaque passage, soit 2 fois par semaine, les cellules sont décollées à la trypsine puis centrifugées et remises en culture au 1/10ème dans du milieu neuf. 6. Congélation et décongélation I. Congélation Les cellules à congeler doivent impérativement se trouver dans leur phase exponentielle de croissance. En effet, la congélation provoquant un certain stress pour les cellules, il est nécessaire de les congeler dans les meilleures conditions possibles afin de minimiser ce stress et ainsi maximiser leur récupération et survie ultérieures. Les cellules sont trypsinées, comptées puis centrifugées 5 minutes à 1200 rpm. Le surnageant est éliminé et le culot de cellules ainsi formé est remis en suspension avec une solution contenant 90% de sérum de veaux foetal et 10% de DMSO. Le DMSO est un cryoprotecteur empêchant la formation de cristaux au sein des cellules lors de la congélation et donc la mort cellulaire. Nous réalisons ensuite des aliquots en cryotubes qui seront placés une nuit à -80C dans une bote de congélation permettant une descente en température très lente puis dans un conteneur d'azote liquide à -196C pour une conservation longue durée. 29 II. Décongélation A l'inverse de la congélation, qui doit être lente, la décongélation doit être le plus rapide possible. Pour cela, les cellules sont sorties de l'azote, décongelées pendant environ une minute dans un bain-marie à 37C puis rincées avec 40 ml de milieu pour éliminer le DMSO. Une centrifugation de 5 minutes à 1200 rpm est ensuite réalisée, le surnageant est éliminé, puis les cellules sont remises en suspension dans du milieu complet et mises en culture dans une flasque. II. Les différentes molécules étudiées 1. Les conjugués peptidiques Différents types de sondes polymères ayant les caractéristiques suivantes ont été étudiées au cours de ce travail : - fluorescentes dans le rouge lointain/proche infrarouge et de brillance élevée pour permettre une détection en profondeur dans les tissus biologiques. - de taille nanométrique contrôlée (quelques nm à 200 nm) pour favoriser leur accumulation au niveau des tumeurs. L'utilisation de la polymérisation radicalaire contrôlée RAFT permettra de faire varier les paramètres comme la taille et l'architecture des sondes de manière relativement précise afin d'obtenir des résultats biologiques reproductibles. - présentant une multivalence à deux niveaux, c'est-à-dire présentant plusieurs clusters tétraédriques de ligands peptidiques (Raft(cRGD)4), pour améliorer l'affinité et l'internalisation des sondes dans les cellules sur-exprimant les intégrines V3. Une série de conjugués linéaires (Figure 9) à base de copolymères réactifs P(NAM-stat-NAS) et d'un nombre variable de clusters peptidiques Raft(cRGD)4 a été synthétisée afin d'évaluer l'apport de la présentation multivalente du cluster Raft(cRGD)4 sur l'affinité du conjugué pour les intégrines v3. Ce polymère a été synthétisé par l'équipe d'Arnaud Favier au sein du Laboratoire Joliot-Curie, à l'ENS de Lyon. Au total, huit composés ont été testés (Tableau 1). 30 Tableau 1 : Les différents conjugués peptidiques testés. Mn : Masse molaire moyenne en nombre du conjugué (après couplage et post-traitement) ; np visé : nombre moyen de Raft(cRGD)4 par chane souhaité (en supposant un rendement de couplage du Raft(cRGD)4 d'environ 60 %) ; np : nombre moyen de Raft(cRGD)4 par chane déterminé par RMN 1H ; nf : nombre moyen de fluorophores par chane déterminé par CES/UV-visible. Figure 9 : Représentation schématique de la structure des conjugués linéaires fluorescents polymère-clusters peptidiques. 31 2. Les nanoparticules AGuIX Les nanoparticules à base de Gadolinium présentent diverses propriétés qui en font des candidates prometteuses pour des applications médicales. En effet, le gadolinium est un métal de numéro atomique élevé (z 64). Il est l'élément le plus largement utilisé pour l'IRM en tant qu'agent de contraste paramagnétique. Comme décrit précédemment, son haut numéro atomique lui confère un fort pouvoir d'absorption des rayons ionisant, comme les rayons X. Ces nanoparticules peuvent donc être visualisées par IRM. De plus, elles peuvent être utilisées comme agent radio-sensibilisant. En vue de ces applications, il est nécessaire d'obtenir des nanoparticules ayant une biodistribution optimale, notamment en modulant leur fonctionnalisation de surface. L'équipe Cancer Targets and Experimental Therapeutics de l'Institut for Advanced Biosciences (INSERM U1209) en collaboration avec le CHU de Grenoble (service d'oto-rhino-laryngologie et chirurgie cervico-faciale, Hôpital Albert Michalon) travaille depuis plusieurs années sur l'identification de cibles diagnostiques et thérapeutiques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le cancer du poumon et des VADS. Elle développe notamment des approches théranostiques, combinant le diagnostic et la thérapie des tumeurs avec l'utilisation de nanoparticules à base de Gadolinium. Ces nanoparticules AGuIX ont été développées par la start-up Nano-H. Elles ont été développées par l'intermédiaire d'un processus top-down original, cette approche consiste à concevoir le sujet d'études ou le produit dans les grandes lignes, puis, à s'intéresser à des détails de plus en plus fins. Elles sont composées d'une matrice de polysiloxane portant des espèces chélateurs de DOTA (1, 4, 7, 10-tétraazacyclododécane-1, 4, 7, 10-acide tétraacétique) à la surface. Les ligands DOTA chélatent les ions Gd3 , ce qui permet leur utilisation comme agent de contraste en IRM (3032). Les ligands DOTA peuvent également complexer un radionucléide pour réaliser la tomographie par émission de positons (TEP) et la tomographie par émission monophotonique (TEMP). Des fonctions amines primaires permettent facilement la conjugaison de fluorophores à la matrice de polysiloxane pour les études d'imagerie de fluorescence : un fluorophore proche infrarouge (la cyanine 5, 5) est greffé sur les nanoparticules pour permettre l'imagerie de fluorescence. Cette nanoparticule à base de gadolinium présente des propriétés de radiosensibilisation élevées in vivo et in vitro, dues à leur nombre atomique élevé (33, 34), qui en font un agent thérapeutique 32 prometteur pour la radiothérapie (33, 35, 36). En dépit d'une clairance rénale rapide en raison de leur petite taille ( nm), ces particules s'accumulent de manière significative dans les tumeurs par un ciblage passif (effet EPR) (31, 32). Un ciblage actif peut être combiné au ciblage passif, par le greffage à la surface des nanoparticules ; de ligands c[RGD]. Il devrait fournir une accumulation plus efficace de ces particules dans la tumeur (37, 38). Figure 10 : Représentation schématique des nanoparticules AGuIX. D'après 33 III. Les modèles animaux Dans le cadre de notre protocole d'expérimentation animale, nous avons utilisé des souris NMRI-Nude femelles (Janvier Labs). Cette lignée de souris a été obtenue suite à une mutation entrainant une absence ou une atrophie du thymus. Les souris sont donc immunodéficientes ce qui permet le développement de tumeurs de cellules humaines sans rejet par la souris. De plus, la souris Nude ne possède pas de poils ce qui permet une utilisation plus aisée en imagerie optique. L'utilisation des animaux dans le cadre d'un protocole de recherche en cancérologie est soumise à une réglementation stricte. Le protocole a été validé par le Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. Cela consiste principalement en une analyse des éventuelles méthodes alternatives, de la réduction du nombre d'animaux et enfin de la prise en charge de la douleur de l'animal et des points limites menant au sacrifice (règle des 3 R , Remplacer, Réduire et Raffiner (48). Plus généralement, il faut que les bénéfices apportés par les manipulations soient supérieurs aux risques encourus par les animaux. 1. Anesthésie des souris Il existe deux possibilités d'anesthésier les souris : l'anesthésie gazeuse ou chimique. Anesthésie gazeuse (Figure 11) : Elle consiste à faire respirer à l'animal de l'isoflurane gazeux. L'isoflurane est un agent anesthésique volatil de la famille des éthers halogénés. L'anesthésie se fait soit dans un masque, soit dans une bote ventilée. L'induction de l'anesthésie est réalisée dans la boite à induction avec 3% d'isoflurane dans l'air et un débit de 1, 5 L/minute puis maintenue sur masque avec 1, 5% d'isoflurane et un débit à 0, 2 L/minute a) cuve d'isoflurane et branchement ; b) boite à induction ; c) masque d'anesthésie. Figure 11 : Système d'anesthésie gazeuse 34 Anesthésie chimique : il s'agit d'une injection intrapéritonéale d'une solution de Médétomidine/Kétamine (100l pour 10 g de souris. Cette solution est préparée à partir de Dormilan (médétimidine, sédatif, 1mg/ml), Kétamidor (kétamine, anésthésique, 100mg/ml). Au cours de l'anesthésie, la température corporelle des animaux est maintenue à l'aide d'un tapis chauffant. 2. Le modèle VADS L'étude et la validation de nouvelles molécules thérapeutiques ou de nouvelles techniques chirurgicales pour le traitement des cancers des VADS nécessitent un modèle animal approprié. Ce modèle doit être représentatif de la maladie et reproductible afin de s'approcher au plus près de la réalité clinique. Plusieurs modèles murins pour l'étude des cancers des VADS ont été décrits dans la littérature. Le modèle le plus rudimentaire consiste en une injection sous-cutanée de cellules tumorales. Mais ce modèle ne permet pas un développement tumoral des cellules cancéreuses au sein de leur environnement natif, ce qui le rend peu représentatif des cancers des VADS chez l'être humain. Des modèles orthotopiques ont donc été mis au point afin de recréer les interactions entres les cellules et leur environnement naturel. Le premier modèle utilise l'exposition répétée d'agents carcinogènes au niveau de la cavité buccale. L'avantage de ces modèles est que les tumeurs peuvent se développer chez des souris immunocompétentes relativement facilement, notamment en introduisant l'agent chimique dans l'eau de boisson. Cependant, l'induction est longue (12 à 34 semaines) et une faible reproductibilité spatiale est observée, ce qui rend ces modèles inutilisables pour des essais thérapeutiques (49, 50). Un autre moyen pour développer des cancers des VADS chez une souris consiste à réaliser une xénogreffe orthotopique. Des cellules sont ainsi implantées au niveau du plancher buccal ou de la langue chez des souris immunodéficientes. Ceci permet le développement de tumeurs tout en évitant le phénomène de rejet. Ce modèle présente néanmoins un inconvénient majeur. En effet, du fait de la rapide croissance tumorale, les souris ne peuvent s'alimenter correctement et doivent être sacrifiées au bout de 10 à 12 jours après implantation (49, 51). Cette courte durée ne permet donc pas l'étude à long terme de nouvelles molécules thérapeutiques. Pour cela un modèle orthotopique des cancers VADS a été développé au laboratoire. Il se déroule en deux étapes décrites ci-dessous, premièrement nous implantons des cellules CAL33-LUC en sous cutanée puis en intra jugale de copeaux issus de ces tumeurs sous cutanées. 35 1) Croissance sous cutanée Dans un premier temps, une implantation sous cutanées de cellules CAL33-LUC est réalisée. Elle consiste en l'injection de 5. 106 cellules CAL33-LUC reprisent dans 200L de PBS. Figure 12 : Suivi de la croissance tumorale par imagerie de bioluminescence in vivo après implantation sous cutanée des cellules CAL33-LUC au niveau du flanc de la souris. 2) Croissance Orthotopique Dans un second temps, après 15 jours de croissance sous cutanée, les souris sont sacrifiées et la tumeur est prélevée, des copeaux tumoraux d'environ 0, 5mm sont réalisés et implantés dans la face interne de la joue d'une souris saine. A B Figure 13 : (A) Prélèvement d'une tumeur CAL33-LUC sous-cutanée et réalisation des copeaux tumoraux. (B) Implantation intra-jugale d'un copeau de tumeur CAL33-LUC et tumeur orthotopique développée au niveau de la joue (flèche). Un suivi est ensuite réalisé sur ces souris par imagerie de bioluminescence. Le suivi en bioluminescence nous permet de montrer que le développement des tumeurs orthotopiques est très reproductible. 36 Figure 14 : Suivi de la croissance tumorale par imagerie de bioluminescence in vivo après implantation de copeaux tumoraux au niveau de la joue de la souris. Le développement de ce modèle a été réalisé au laboratoire par Clément Millet et le Docteur Ihab Attallah. Les implantations intra-jugales ont été réalisées par Raphale Quatre et Ihab Attallah, chirurgiens ORL du CHU de Grenoble. 3. Le modèle U87MG sous cutané. Les cellules U87MG de glioblastome humain (4 millions dans 200l) sont injectées en sous-cutanée sur le flanc des souris Nude anesthésiées par voie gazeuse. Les souris sont observées quotidiennement. Deux à trois fois par semaine, elles sont pesées et le volume tumoral est mesuré à l'aide d'un pied à coulisse. Calcul du volume tumoral : V : volume ; L : longueur ; l : largeur Si une perte de poids supérieure à 20 % est observée ou si l'animal montre des signes de souffrance (isolement, prostration), l'euthanasie de l'animal est réalisée par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse. De même, l'euthanasie est réalisée si des signes de nécrose cutanée à la surface de la tumeur apparaissent et/ou si le volume tumoral atteint 1500 mm3. 37 V L x l 2 x 0. 52 IV. L'imagerie Optique 1. L'imagerie de Bioluminescence La bioluminescence est la production et l'émission de lumière par un organisme vivant résultant de la dégradation d'un substrat, la luciférine, par son enzyme, la luciférase. Il existe plusieurs combinaisons luciférase/luciférine qui sont issues de divers organismes animaux ou végétaux. La réaction la plus utilisée en imagerie biophotonique, catalysée par la luciférase, est l'activation de la luciférine avec formation de luciférine adénylate liée à l'enzyme. Cette réaction est réversible et libère le pyrophosphate inorganique. La luciférine adénylate formée est oxydée par l'oxygène moléculaire et donne un peroxyde très instable, l'oxyluciférine, qui va rapidement se cycliser après une libération d'AMP. Cette molécule, dans un état électronique excité, retourne à l'état stable par une réaction de décarboxylation. Cette réaction va entraner l'émission d'un photon lumineux, dont la longueur d'onde dépend de la structure du complexe luciférine-luciférase (pic d'émission à 560 nm dans le système de la luciole), et former du CO2. L'enzyme se libère ensuite pour catalyser une autre réaction (52). Figure 15 : Schéma de l'oxydation de la luciférine en oxyluciférine Le génie génétique a permis l'isolement du gène de la luciférase (gène luc) et son insertion dans des bactéries, des virus ou dans des cellules eucaryotes (cellules tumorales pour la recherche en oncologie ou encore cellules embryonnaires pour développer des souris transgéniques). La bioluminescence est fréquemment utilisée pour suivre des phénomènes biologiques tels que le développement tumoral. En effet, les cellules tumorales modifiées expriment stablement le gène de la 38 luciférase puis sont implantées chez les animaux. Dans ces modèles bioluminescents de cancer, l'émission de lumière est corrélée à l'expression du gène luc et, par extrapolation, au nombre de cellules tumorales exprimant le gène. Figure 16 : Principe de l'imagerie optique de bioluminescence. Des cellules dans le modèle animal expriment l'enzyme de la luciférase. L'injection du substrat approprié (la luciférine) permet la mise en œuvre d'une réaction enzymatique. Cette réaction entraine l'émission de lumière détectée par une caméra CCD (Charge Coupled Device) refroidie. Une image est ainsi produite (53). Cette technique est donc un procédé de choix pour la caractérisation de modèles tumoraux chez la souris, pour la détection précoce du développement tumoral primaire ainsi que le suivi longitudinal de l'apparition de métastases. 1) Suivi de la croissance tumorale par Imagerie de bioluminescence IVIS Kinetic Ce système est composé de 3 parties (Figure 17) : un botier hermétique contenant une caméra, une source lumineuse et un masque d'anesthésie, un système d'anesthésie contrôlant notamment le pourcentage en air et en isoflurane. Enfin, l'acquisition et l'analyse d'images s'effectue avec le logiciel Living Image, ce logiciel contrôle également la caméra. 39 Botier hermétique (flèche blanche) contenant une caméra, une source lumineuse ; système d'anesthésie (flèche rouge) ; Figure 17 : Système d'imagerie IVIS Kinetic (Caliper Life Science) ordinateur de contrôle (flèche bleue). Une acquisition en bioluminescence se déroule de la façon suivante : la souris reçoit une injection intrapéritonéale de 300 l d'une solution de luciférine à 10 M (soit 150 mg/kg). Le signal de bioluminescence augmente à partir de l'injection pour atteindre son maximum au bout de 5 minutes (Figure 18) et sera stable pendant environ 15 minutes. Il faut donc réaliser l'acquisition entre 5 et 20 minutes après injection de luciférase afin d'obtenir un signal homogène tout au long de la cinétique. Figure 18 : Cinétique du signal de bioluminescence après injection intra péritonéale de luciférine. De plus, il est important que l'animal soit éveillé pendant 5 minutes environ après l'injection de luciférine afin que la réaction puisse avoir lieu. En effet, l'ATP étant nécessaire à la réaction, si l'animal est endormi, la quantité d'ATP sera plus faible et la réaction prendra donc plus de temps. La souris est ensuite placée sous anesthésie gazeuse et l'acquisition de l'imagerie en bioluminescence est réalisée. La partie optique de l'IVIS Kinetic est composée d'une caméra EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) de 13, 3 mm, permettant l'acquisition d'un champ de 1024x1024 pixels de 13 microns de largeur. 40 Celle-ci est refroidit à -80C permettant de réduire le bruit électronique. 2) Quantification des images Lors de l'acquisition, le logiciel génère deux images, une image en noir et blanc et une image correspondant au signal de bioluminescence. Le logiciel va ensuite réaliser une superposition automatique des deux images en utilisant le meilleur réglage de contraste possible. Cette image superposée présente le signal luminescent en fausses couleurs. Il réattribue pour cela à chaque valeur de niveaux de gris de l'image brute une fausse couleur prédéterminée (Figure 19). Figure 19 : Images obtenues après acquisition en bioluminescence sur l'IVIS Kinetic. a) Image brute du signal luminescent ; b) image brute en noir et blanc ; c) superposition des deux images précédentes avec signal luminescent en fausses couleurs. A partir de cette image en fausses couleurs, des régions d'intérêts (ROI : Regions Of Interest) sont dessinées afin de quantifier le signal de bioluminescence. Les résultats sont exprimés en photons par seconde (p/s/cm2/sr), après soustraction automatique du bruit de fond. Pour chaque image, le logiciel rapporte la valeur quantifiée au temps d'exposition pour homogénéiser le signal si le temps d'exposition varie entre deux acquisitions. Figure 20 : Création de ROI avec le logiciel Living Image (Caliper Life Sciences) La tumeur (rond plein) et le bruit de fond (rond pointillée). 41 En parallèle les tumeurs sont suivies par mesure au pied à coulisse dès leur apparition macroscopique. 2. L'imagerie de fluorescence La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par l'excitation d'une molécule (généralement par absorption d'un photon) immédiatement suivie d'une émission spontanée. Une molécule fluorescente (fluorophore ou fluorochrome) peut absorber l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) ce qui entraine son excitation à des niveaux vibrationnels élevés. Le retour à l'état fondamental s'effectue par conversion interne puis par l'émission de photons correspondant à la fluorescence (lumière d'émission). La particularité de la fluorescence est que la longueur d'onde d'émission est supérieure à la longueur d'onde d'excitation. C'est ce qu'on appelle le déplacement de Stockes. L'énergie étant inversement proportionnelle à la longueur d'onde, l'énergie émise sera plus faible que l'énergie d'excitation (figure 21). Figure 21 : (A) Ce diagramme illustre les différentes transitions électroniques et les différents phénomènes de désexcitations possibles. (B) Spectre de fluorescence d'une molécule avec son spectre d'excitation et d'émission de fluorescence. L'imagerie de fluorescence in vivo présente une très forte sensibilité ( pmol) qui permet de visualiser des phénomènes moléculaires de façon non invasive chez le petit animal vivant. C'est une imagerie en temps réel qui permet le suivi in vivo. Par contre cette approche 2D est qualitative et semi quantitative. 42 Cette technique est peu couteuse tant pour l'achat des équipements que pour le fonctionnement qui ne nécessite pas d'infrastructure particulière. Les applications précliniques chez le petit animal sont multiples : études pharmacocinétiques de biodistribution de nouveaux composés thérapeutiques, recherche et développement de nouveaux biomarqueurs. Il existe également des applications cliniques chez l'homme dans des contextes o l'épaisseur des tissus à traverser est modérée : pour le diagnostic du cancer du sein ou de la prostate, en endoscopie pour la détection de polypes précancéreux dans le colon, en per opératoire pour la détection du ganglion sentinelle ou encore pour assister le geste chirurgical de résection tumorale. V. Evaluations biologiques ex-vivo 1. Tests d'inhibition de l'adhésion cellulaire Ce test d'inhibition de l'adhésion cellulaire a pour but de mesurer la capacité des conjugués à bloquer les intégrines v3 des cellules (HEK293-3), leur interdisant ainsi de se fixer sur leur ligand naturel, la vitronectine. Une couche de vitronectine (5g/ml) est déposée pour tapisser le fond du puits (plaque 96 puits) et incubée pendant 1h. Les puits sont alors lavés et une solution de BSA 3% (Albumine de Sérum Bovin) est incubée pendant 1h : elle sert à bloquer les interactions non-spécifiques des intégrines avec le plastique non couvert de vitronectine (Figure 22). 43 Figure 22 : Schéma des principales étapes du test d'inhibition de l'adhésion des cellules HEK293-3 à la vitronectine. Les composés à tester sont co-incubés pendant 30 minutes à 37C en présence de cellules HEK293-3 (25 000 cellules par puits) dans du PBS complémenté en Ca2 /Mg2 . Les cellules et les composés restés en suspension sont ensuite éliminés par lavage au PBS. Les cellules adhérant à la vitronectine sont fixées à l'éthanol absolu avant d'être colorées avec du bleu de méthylène. Après lavage, les cellules sont lysées avec une solution d'acide chlorhydrique a 0, 1 M. L'intensité de la coloration bleue de chaque puits (lecteur de D. O. ) est proportionnelle au nombre de cellules adhérant à la vitronectine. La lecture de l'absorbance se fait à 620 nm. En comparant les résultats obtenus avec les puits de la condition témoin (cellules seules sans composé) et ceux obtenus en présence de conjugué, il est alors possible de déterminer un pourcentage d'inhibition de l'adhésion des cellules HEK293-3. Pour chaque concentration testée, le test de compétition est réalisé trois fois. 44 2. Etude in cellulo par microscopie confocale 1) Principe de la microscopie confocale Un microscope confocal est un microscope optique qui a la propriété de réaliser des images de très faible profondeur de champ (environ 400 nm) appelées sections optiques . Ses sections optiques sont obtenues en éliminant la lumière provenant de coupes optiques supérieures et inférieures au plan focal. En positionnant le plan focal de l'objectif à différents niveaux de profondeur dans l'échantillon, il est possible de réaliser des séries d'images à partir desquelles nous pouvons obtenir une représentation tridimensionnelle de l'objet. L'objet n'est donc pas directement observé par l'utilisateur ; celui-ci voit une image recomposée par ordinateur. Le microscope confocal fonctionne en lumière réfléchie ou en fluorescence. La plupart du temps, un laser est utilisé comme source de lumière. On parle alors de microscope confocal à balayage laser. Figure 23 : Schéma des principales étapes du test d'inhibition de l'adhésion des cellules HEK293-3 à la vitronectine. 45 2) Observation qualitative sur la morphologie des cellules et l'internalisation des conjugués peptidiques L'utilisation de la microscopie confocale nous a permis de localiser les conjugués fluorescents lorsqu'ils sont incubés avec différents types cellulaires et d'évaluer s'ils interagissent avec les cellules et s'ils sont internalisés. En effet, la liaison au ligand multivalent peut engendrer des phénomènes cellulaires comme l'endocytose (54) et le cluster Raft(cRGD)4 a des propriétés d'internalisation récepteurs-dépendante (4, 58). Les cellules sont cultivées dans des plaques 16 puits dans lesquelles sont déposées des lamelles de verre. Une fois que les cellules ont adhéré à la lamelle, elles sont incubés 30 minutes à 37C en présence du composé (à 3 concentrations : 0, 1 ; 1 et 10 M) dans du PBS Ca2 /Mg2 . Apres rinçage, les cellules sont fixées et leur ADN nucléaire marqué avec du colorant de Hoechst (Sigma). Apres rinçage, les lamelles sont déposées sur des lames de microscopie et les cellules sont observées au microscope confocal (Microscope confocal multiparamétrique LSM710 Logiciel ZEISS). 3. Etude par cytométrie en flux. 1. Principe de la cytométrie en flux La cytométrie en flux permet de mesurer certaines caractéristiques individuelles de cellules présentes dans une suspension comme leur taille, granulosité ainsi que l'intensité de fluorescence en cas de marquage. L'analyse consiste à faire passer une à une des cellules en suspension entrainées par un flux liquide devant un ou plusieurs faisceaux lasers. Les signaux émis par chacune de ces cellules sont alors filtrés puis collectés grâce à des détecteurs ce qui permet, après traitement du signal, la détermination des différents paramètres cités précédemment. Dans notre cas la cytométrie permet d'évaluer la liaison des polymères peptidiques fluorescents sur les cellules exprimant plus ou moins l'intégrine v3. 46 Figure 24 : Schéma du principe de la cytométrie en flux Documents de J. Paul Robinson Purdue University 2. Préparation des échantillons Les cellules sont trypsinées puis centrifugées 5 minutes à 1200 rpm. Après un rinçage à l'aide de PBS contenant 1 mM de Ca2 et de Mg2 (PBS ), 106 cellules par condition sont incubées 30 minutes en présence de 200 l d'une solution de peptides dilués dans du PBS à la concentration désirée (1 M, 5 M ou 10 M), dans l'obscurité et à 37C. Après 2 rinçages avec du PBS et une centrifugation de 5 minutes à 1200 rpm, le culot cellulaire est repris dans 500l de PBS et les cellules sont analysées sur le cytomètre en flux. 47 3. Accuri C6 Toutes les analyses de cytométrie en flux ont été réalisées sur l'Accuri C6 (BD Biosciences) (Figure 25). Figure 25 : Cytomètre Accuri C6. (56) Cet appareil à l'avantage d'être extrêmement compact et très simple d'utilisation grâce à son logiciel Cflow Plus qui permet le contrôle de l'instrument, la création de données statistiques et l'analyse des résultats. L'Accuri C6 est composé de 6 détecteurs distincts, les deux premiers concernent les paramètres de taille et de granularité et quatre concernent la fluorescence. Pour nos acquisitions nous utiliserons les réglages suivant : Laser 640 nm : FL4 : filtre passe bande : 675/25nm L'Accuri C6 fait partie de la plateforme de cytométrie en flux de l'Institut pour l'Avancée des Biosciences et est contrôlé chaque jour à l'aide de billes commerciales. Ces billes fluorescentes permettent de vérifier la calibration de l'appareil, notamment le débit (en événements par secondes (eps) la taille, la granulométrie et la fluorescence détectée par le cytomètre. 48 VI. Evaluations biologiques in vivo des nanoparticules AGuIX 1) Biodistribution des conjugués Cette étude permet d'évaluer la biodistribution des conjugués, et ainsi de définir leurs voies d'élimination ainsi que leur capacité à s'accumuler dans les tumeurs. Après anesthésie gazeuse de la souris, les conjugués sont injectées par voie intraveineuse (IV) dans la veine de la queue des souris (200L). Les images de fluorescence ont été effectuées avant injection et à différents temps après l'injection (30min, 1h, 3h, 5h, 24h). Les souris sont éclairées par une lumière monochromatique à 660 nm, la fluorescence réémise passe par un filtre (passe-haut à 665nm), puis est captée par la caméra (Hamamatsu OrcaIIBT-512G), préalablement refroidie à -70C. Les images sont analysées à l'aide du logiciel Wasabi (Hamamatsu). Après 24h, les souris sont sacrifiées et les organes extraits sont imagés afin de réaliser une évaluation semi-quantitative de la fluorescence dans les organes ex vivo. 2) Cinétique sanguine des conjugués chez la souris Avant injection chez la souris, une gamme de fluorescence des conjugués peptidiques est réalisée sous une caméra CCD (caméra Hamamatsu OrcaIIBT-512G) avec une lumière d'excitation à 660 nm et un filtre passe haut 665 nm pour capter la lumière d'émission. Une injection intraveineuse des conjugués est réalisée sur 3 souris par composé. Les prélèvements sanguins sont effectués en entaillant légèrement le bout de la queue des souris. Ces prélèvements sont effectués à différents temps (15min, 30min 1h, 2h, 3h, 5h, 7h, 24h). Le sang est centrifugé et une goutte de sérum est prélevée pour être imagée (de la même manière que la gamme). 49 3) L'exérèse chirurgicale des tumeurs 19 jours après les implantations orthotopiques, le Dr. Quatre procède à leur explantation macroscopiquement. Tout d'abord les souris sont anesthésiées chimiquement. Une incision est effectuée sur la partie externe de la joue puis la tumeur est prélevée (Figure 26). Figure 26 : Exérèse d'une tumeur orthotopique. L'incision est ensuite suturée à l'aide de fils résorbables (Figure 27). Afin de prévenir la douleur entrainée par l'opération chirurgicale, une injection sous-cutanée de buprénorphine (0. 1 mg/kg) est réalisée. a) juste après exérèse complète ; b) 4 à 7j après exérèse complète d'une tumeur orthotopique. Figure 27 : Exérèse d'une tumeur orthotopique. La souris est complètement cicatrisée 4 à 7 jours après l'explantation de la tumeur. 50 4) Irradiation des tumeurs Cal33-luc 1) Protocole d'irradiation des tumeurs primaires de cancer VADS Pour l'administration intra-tumorale, les souris ont reçu une injection de 40 l d'une solution AGuIX ([Gd3 ] ~ 100 mM) directement dans la tumeur, et pour l'injection intraveineuse, 200 l d'une solution AGuIX ([Gd3 ] ~ 50 mM) ont été injectées dans la veine caudale. Elles sont anesthésiées chimiquement par injection de 100L/g d'une solution de Médétomidine/Kétamine décrite précédemment. Le premier protocole est réalisé sur une tumeur orthotopique primaire. Suite à l'étude de la biodistribution des particules dans différents modèles des cancers des voies aérodigestives, le modèle Cal33-Luc a été sélectionné car nous obtenons un ratio de signal tumeur/peau important. Avant le traitement, le volume de la tumeur a été évalué à l'aide d'un pied à coulisse et les souris ont été randomisées en 5 groupes en fonction du volume tumoral : Groupe témoin (n 10, administration des nanoparticules par voie intraveineuse n 5 ou intra- tumorale n 5), Irradiation seule (aucune administration de particules irradiation) (n 11) Irradiation 1 h après l'administration intra-tumorale d'AGuIX (n 11), Irradiation 5 h après l'administration intraveineuse d'AGuIX (n 11), Irradiation 24 h après l'administration intraveineuse d'AGuIX (n 11) La première irradiation est réalisée 12 jours après l'implantation orthotopique à une seule dose de 10 grays (Gy). La zone d'irradiation a été calibrée par un dosimètre, le flux d'irradiation étant de 1, 58 Gy/minutes pour atteindre une irradiation de 10 Gy nous avons donc irradié les tumeurs pendant 5, 3 minutes. Au vu des résultats, une seconde irradiation à 5 Gy est délivrée 34 jours après l'implantation de la tumeur. 51 2) Protocole d'irradiation des rechutes tumorales. 19 jours après les implantations orthotopique des tumeurs Cal33-Luc, la chirurgie d'exérèse tumorale est réalisée. La cicatrisation et la rechute tumorale sont survit. L'irradiation a été réalisée 22 jours après l'exérèse chirurgicale pour permettre la rechute tumorale chez la majorité des souris tout en limitant la taille des tumeurs. Ce paramètre est pris en compte pour que la distribution des particules soit optimale. En effet, lorsque la tumeur grossit, elle risque de devenir nécrotique et moins vascularisée en son centre. Une dose de 10 Gy est délivrée. Après injection de 200 l d'une solution d'AGuIX ([Gd3 ] à 50 mM) dans la veine caudale de la souris, les souris sont anesthésiées chimiquement par injection de 100L/g d'une solution de Médétomidine/Kétamine décrite précédemment. L'irradiation est réalisée 15 minutes après l'injection des nanoparticules. Pour l'étude de l'efficacité thérapeutique des nanoparticules en tant qu'agent radiosensibilisants lors de la rechute tumorale, les souris ont été réparties en 3 groupes : Groupe Contrôle (sans irradiation) n 10 Irradiation seule n 13 Injection IV AGuIX Irradiation n 13 La zone d'irradiation a été calibrée par un dosimètre, le flux d'irradiation est mesuré 3 fois et est définit en Gy/minutes. Pour atteindre la dose d'irradiation souhaitée, nous avons donc irradié les tumeurs pendant plusieurs minutes. La radiothérapie a été réalisée sur le site de l'ESRF, sur un irradiateur petit animal. (Figure 28) Figure 28 : Souris placée dans l'irradiateur petit animal. La zone éclairée correspond au champ d'irradiation. 52 5. Histologie 1) Inclusion et congélation Directement après le prélèvement, les échantillons sont inclus dans du Tissue-Tek O. C. T. (Optimal Cutting temperature). Il s'agit d'une formulation de glycols et résines solubles dans l'eau permettant la coupe des tissus congelés. Une fois le tissu entièrement recouvert d'O. C. T, l'échantillon est placé sur de la carboglace pour une descente en température très lente. Cela aura pour effet une meilleure préservation de l'intégrité tissulaire. Les tissus inclus en O. C. T seront conservés à -80C jusqu'à leur utilisation. 2) Coupes au cryostat Les échantillons congelés sont coupés au cryostat Leica CM3050 S (Figure 29) à -20C à une épaisseur de 7 m. L'échantillon est fixé sur le porte-objet à l'aide d'O. C. T liquide et les coupes sont réalisées et déposées sur des lames. Après une nuit à température ambiante, les lames sont conservées à -20C dans une bote hermétique. Figure 29 : Cryomicrotome Leica CM3050 S. 53 3) Marquage Hématoxyline & Éosine L'hématoxyline colore le noyau en violet, l'éosine colore le cytoplasme en rouge permettant ainsi de visualiser la structure tissulaire et de discriminer tissus sains et tumoraux. La coloration est réalisée grâce à des bains d'hématoxyline et d'éosine, 3 minutes pour chaque colorant. Un lavage à l'eau courante est effectué après chaque coloration. Pour finir, les lames sont fixées dans 2 bains successifs d'alcool (éthanol 100) puis un bain de xylène qui permettra le montage des lames. Le montage des coupes entre lames et lamelles est fait à l'aide d'un liquide de montage (Merckoglass). Après séchage, la lame sera prête à être observée au microscope 54 Résultats I. Evaluations biologiques des conjugués linéaires polymère-clusters peptidiques La synthèse de macromolécules ciblantes est une piste importante dans la recherche de nouveaux traitements anticancéreux. Dans ce contexte, une première partie de mon projet a consisté à à nous caractériser et l'évaluer biologiquement in vitro et in vivo différents types de sondes polymères (pour la description précise, voir partie II, 1). Les évaluations biologiques ont tout d'abord pour objectif de déterminer si les clusters peptidiques Raft(cRGD)4 conservent leur affinité pour les intégrines v3 après leur couplage sur les chanes polymères, et d'évaluer l'influence du nombre moyen de clusters peptidiques par chaine (np) sur cette affinité. Pour cela, les quatre conjugués polymère-clusters non fluorescents (Tableau 2) ont été confrontés au cluster Raft(cRGD)4 seul lors d'un test d'inhibition de l'adhésion cellulaire. Dans un second temps, nous avons cherché à déterminer si les conjugués avaient la capacité de s'internaliser de manière sélective dans des cellules sur-exprimant les intégrines v3. Ainsi, les conjugués polymère-clusters fluorescents (Tableau 4) ont été comparés au cluster peptidique Raft(cRGD)4 seul (marqué par la Cyanine5. 5 tétrasulfonatée) par microscopie confocale et cytométrie en flux sur plusieurs lignées cellulaires. 1. Evaluation de l'affinité pour les intégrines v3 lors de tests d'inhibition de l'adhésion cellulaire Les quatre conjugués polymère-peptide non fluorescents 1, 2, 3 et 4 (Tableau 1) comportant en moyenne respectivement 1, 5 ; 4, 2 ; 5, 9 et 0 clusters Raft(cRGD)4 par chane ont été comparés au cluster Raft(cRGD)4 seul pour évaluer leur affinité envers les intégrines v3. Pour cela, des tests d'inhibition de l'adhésion cellulaire ont été réalisés. Ils consistent à mesurer la capacité des conjugués synthétiques à bloquer les intégrines v3 des cellules, leur interdisant ainsi de se fixer sur leur ligand naturel, la vitronectine (les cellules utilisées sont des cellules humaines embryonnaires du rein, HEK293-3). 55 Chaque composé a été évalué à 9 concentrations différentes en cluster Raft(cRGD)4 comprises entre 0, 1 et 10 000 nmol. L-1 (nM) Il est très important de noter que ce sont des concentrations exprimées en cluster peptidique Raft(cRGD)4 et non des concentrations en conjugués. Par exemple, pour être à concentration équivalente en cluster Raft(cRGD)4, le conjugué polymère Raft(cRGD)4 porteur de 4, 2 Raft(cRGD)4 par chaine en moyenne est testé à des concentrations en composé 4, 2 fois moindre que le cluster Raft(cRGD)4 seul. Figure 30 : Pourcentage de cellules adhérentes en fonction de la concentration en cluster Raft(cRGD)4 pour le cluster seul et pour les différents conjugués 1, 2, 3 et 4. 56 Si les conjugués peptidiques testés ont une affinité avec les intégrines v3, une diminution du pourcentage de cellules adhérentes à la vitronectine est alors observée lorsque la concentration du conjugués augmente. Cette affinité est d'autant plus importante que la diminution se produit à des concentrations faibles. Pour mieux comparer quantitativement les différents composés, on note la concentration IC50 (en anglais inhibition concentration ) en cluster Raft(cRGD)4, à laquelle 50 % de l'adhésion cellulaire sur la vitronectine est inhibée. Par ailleurs, la concentration IC50 en conjugué est obtenue en divisant la valeur précédente par np. Lors de ces évaluations biologiques, il est indispensable de vérifier que les interactions entre les conjugués et les cellules sont bien dues au couple Raft(cRGD)4/intégrine V3, autrement dit que le polymère n'induit pas d'interaction non spécifique. Ainsi, pour le conjugué 4 (qui ne comporte pas de cluster peptidique), le pourcentage de cellules adhérentes reste proche de 100 % sur toute la gamme de concentrations testées (aucune valeur d'IC50 ne peut être déterminée dans ce cas). Le polymère n'induit donc pas d'interaction non spécifique avec les intégrines v3 et les cellules. Tableau 2 : Comparaison des valeurs de IC50 exprimées en Raft(cRGD)4 et en conjugué. * La densité moyenne est égale à np divisé par le DPn du squelette polymère (modèle de chaine complètement étirée). IC50 en Raft(cRGD)4 : concentration en cluster nécessaire pour inhiber 50 % de l'adhésion cellulaire à la vitronectine ; IC50 en conjugué : concentration en conjugué nécessaire pour inhiber 50 % de l'adhésion cellulaire à la vitronectine ; Efficacité relative (exprimée soit en concentration en Raft(cRGD)4, soit en concentration en conjugué) : IC50 du cluster Raft(cRGD)4 seul divise par l'IC50 du conjugué X ; np : nombre moyen de clusters Raft(cRGD)4 par chaine polymère. 57 0 5 C I 0 5 C I Figure 31 : Comparaison des IC50 en Raft(cRGD)4 (A) et en conjugué (C) et des efficacités relatives en Raft(cRGD)4 (B) et en conjugué (D). Le cluster Raft(cRGD)4 seul fait office de référence pour cette étude et les conjugués peptidiques sont comparés selon deux aspects principaux : l'affinité par conjugué quantifiée par l'IC50 en conjugué et l'affinité par Raft(cRGD)4 quantifiée par l'IC50 en Raft(cRGD)4. Le conjugué 2 (np 4, 2) présente la meilleure efficacité pour se lier aux intégrines v3 suivi par le conjugué 3 (np 5, 9) puis par le Raft(cRGD)4 seul et pour finir le conjugué 1 (np 1, 5). Les conjugués 2 et 3 ont respectivement une efficacité 23 et 11 fois plus élevée que le cluster Raft(cRGD)4 seul, alors que le conjugué 1 est 1, 6 fois moins efficace. De la même manière, si l'on se réfère aux IC50 en clusters peptidiques, les clusters Raft(cRGD)4 portés par le conjugué 2 se lient plus efficacement aux intégrines que ceux du conjugué 3 eux-mêmes plus efficacement qu'un cluster Raft(cRGD)4 libre (IC50 respectivement 5, 6 et 1, 9 fois inférieures). Les clusters Raft(cRGD)4 portés par le conjugué 1 possèdent la moins bonne efficacité (IC50 environ 2, 4 fois plus élevée que le Raft(cRGD)4 libre). 58 Pour la suite des évaluations, un fluorophore est greffé sur les polymères. La nature du fluorophore peut avoir une influence sur la conformation spatiale du conjugué. Pour cela, deux fluorophores différents sont greffés sur les différents polymères : une Cyanine 5. 5 classique et une Cyanine 5. 5 tetrasulfonatée. Les groupements sulfonates ajoutés modifient la charge des polymères et peuvent influer sur le comportement du composé. 2. Etude microscopique des conjugués polymère-clusters Raft(cRGD)4 fluorescents Au vu des résultats du test d'inhibition de l'adhésion cellulaire, le conjugué 2 (np 4, 2) a été choisi pour la suite de l'étude. Sur la base de ce conjugué, différents polymères peptidiques greffés avec un fluorophore ont été synthétisés. Deux fluorophores sont testés ; une cyanine 5. 5 et une cyanine 5. 5 tétrasulfonatée. Tableau 3 : Récapitulatifs des caractéristiques des conjugués linéaires fluorescents polymère-Raft(cRGD)4. Mn : Masse molaire moyenne en nombre du conjugué ; np : nombre moyen de Raft(cRGD)4 par conjugué déterminé par RMN 1H ; nf : nombre moyen de fluorophores par conjugué déterminé par CES/UV-visible. Les conjugués 5 et 7 sont comparés au cluster Raft(cRGD)4 également fluorescent sur 4 lignées cellulaires choisies pour les intégrines qu'elles expriment : Hek3, Hek1, M21 et M21L. Tout comme les cellules Hek3, les cellules M21 expriment les intégrines v3 mais dans une moindre mesure (Tableau 4). Au contraire, les cellules Hek1 et M21L n'expriment pas (ou très faiblement) les intégrines v3, mais expriment les intégrines v1. Le conjugué fluorescent 7, ne comporte pas de cluster peptidique et sert de contrôle. Il est en effet indispensable de démontrer que les interactions observées avec les cellules sont induites par le couple cluster Raft(cRGD)4/intégrine v3 et non par des interactions non spécifiques entre le polymère fluorescent et les cellules. 59 Tableau 4 : Niveau d'expression relatif des intégrines v3 et v1 en fonction des lignées cellulaires Niveau d'expression : - faible ; moyen ; élevé ; très élevé. 1) Evaluation de la spécificité et de la sélectivité des conjugués dans les différents types cellulaires. Les conjugués étant greffés avec un fluorophore, l'utilisation de la microscopie confocale nous permet de visualiser les conjugués lorsqu'ils sont incubés avec différents types cellulaires et d'évaluer s'ils interagissent avec les cellules et s'ils sont internalisés. Les images fluorescence ont été normalisés, rendant comparable le marquage des différentes cellules (Figure 32). 60 Figure 32 : Images de microscopie confocale (plan à mi-épaisseur des cellules) permettant la comparaison du marquage des lignées cellulaires Hek293(3), Hek293(1), M21 et M21L par les conjugués 5 et 7 et le Raft(cRGD)4 fluorescents a trois concentrations : 10 M, 1M et 0. 1M 61 Comparaison des conjugués 5 et 7 : Le conjugué 5 se lie à la lignée cellulaire Hek3. Le conjugué 7 sans peptide (contrôle) ne marque pas les cellules quelles que soient les lignées, sauf pour la concentration de 10 M o le marquage est très léger et diffus. Ces résultats montrent qu'il y a peu d'interactions aspécifiques et que ces polymères fluorescents sont faiblement internalisés (par endocytose par exemple) en absence du cluster Raft(cRGD)4, au contraire de ce qui a pu être observé par le passé avec d'autres conjugués polymère- chromophore basés sur des squelettes polymères du même type mais comportant des chromophores non chargés. Cela confirme que la nature des chromophores ainsi que le post-traitement des polymères jouent un rôle important quant au comportement des conjugués in vitro Ainsi, il semble que le marquage des cellules par le conjugué 5 soit dû à la présence des Raft(cRGD)4 et soit donc spécifique. Comparaison du conjugué 5 et du Raft(cRGD)4 : Globalement, le conjugué 5 marque très préférentiellement la lignée Hek3 qui exprime le plus l'intégrine v3. On observe un marquage diffus du cytoplasme associé à un marquage beaucoup plus intense (constitué de points très brillants, plus proches du noyau) qui pourrait correspondre à du conjugué internalisé au sein de vésicules endosomales. La lignée M21 est aussi marquée de manière légèrement plus importante que les lignées M21L et Hek1 ce qui va aussi dans le sens d'un accroissement du marquage avec l'augmentation de la présence de l'intégrine v3 en surface des cellules. Figure 33 : Agrandissement d'une cellule Hek3 marquée par le conjugué 5 à une concentration de 1 M. 62 A concentration équivalente, le conjugué 5 conduit à une intensité de marquage plus importante que le cluster Raft(cRGD)4. Deux hypothèses peuvent expliquer cette observation : - le conjugué 5 porteur de plusieurs fluorophores (3, 6 par chaine en moyenne) est intrinsèquement plus brillant que le Raft(cRGD)4 qui n'en porte qu'un. - le conjugué 5 a une meilleure affinité que le cluster Raft(cRGD)4 pour les intégrines v3, ce qui induit une internalisation et un marquage des cellules plus importants. Cette étude ne permet pas de dire s'il s'agit plutôt de l'une ou l'autre des hypothèses ou d'une combinaison des deux. Pour cela, il faudrait disposer d'un conjugué avec à la fois une affinité pour les intégrines v3 identique à celle du conjugué 5 et une brillance identique à celle du Raft(cRGD)4 seul. Pour la concentration la plus importante de 10 M (concentration supérieure à celle généralement utilisée in vitro (0, 1 - 1 M) ou in vivo chez le petit animal (1 à 2 M), le cluster Raft(cRGD)4 est sélectif en ne marquant que les lignées Hek3 et M21 qui sur-expriment l'intégrine v3. En revanche, le conjugué 5 marque toutes les lignées cellulaires même s'il montre une très nette préférence pour les lignées Hek3 et M21. Comme discuté ci-dessus, il est difficile de savoir si ces observations sont dues à une moins bonne sélectivité des conjugués ou à leur brillance plus importante que le cluster Raft(cRGD)4 libre qui permet de les détecter/visualiser à des concentrations plus faibles. D'autre part, il faut rappeler que les cycles RGD ont une affinité pour les intégrines v3 qui est 100 fois plus importante que pour les autres intégrines reconnaissant la séquence RGD comme ligand. Ainsi, il n'est pas impossible qu'une faible quantité de conjugué puisse être internalisée par des cellules présentant très peu d'intégrines v3 mais éventuellement beaucoup d'autres intégrines, comme les lignées M21L et Hek1. 3. Etude par cytométrie en flux Deux séries d'analyses ont été effectuées : la première avec les conjugués 5 et 7 porteurs de Cyanine5. 5 (sans charges sulfonates) et la seconde avec les conjugués 6 et 8 porteurs de Cyanine5. 5 tetrasulfonatée. Les conjugués peptidiques ont été testés à deux concentrations : 0, 1 M et 1 M. 1) Evaluation des conjugués 5 et 7 Quelle que soit la lignée cellulaire, le conjugué 7 (ne portant pas de peptide) n'induit pas de marquage (à 0, 1 M) ou très peu (à 1 M). Le conjugué 5 marque préférentiellement les lignées cellulaires exprimant l'intégrine v3. Par conséquent, il semble que le marquage engendré par le conjugué 5 soit spécifique car il résulte de la présence des clusters Raft(cRGD)4 sur le conjugué. 63 Figure 34 : Histogramme comparant les conjugués 5 et 7 porteur de cy5. 5 (non sulfonatées) et le Raft(cRGD)4-Cy5. 5 tétrasulfonates. Chaque graphique représente la quantité de cellules en fonction de l'intensité de fluorescence mesurée pour chacune d'entre elles. 64 A 1 M, le conjugué 5 marque toutes les lignées cellulaires, avec un marquage préférentiel pour les cellules Hek293(3). Le conjugué 7 marque lui aussi toutes les lignées ; cela signifie que ce marquage n'est pas significatif de l'affinité du Raft(cRGD)4 pour les intégrines v3. Pour la concentration 0, 1 M, le conjugué 5 et le cluster Raft(cRGD)4 marquent tous les deux les lignées Hek293(3) et M21, avec un marquage plus important pour la lignée Hek293(3) ce qui est en accord avec un niveau de surexpression de l'intégrine V3 plus important pour cette lignée. Comme attendu, le conjugué 5 ne marque pas la lignée M21L mais marque un peu la lignée Hek293(1). A cette concentration le conjugué 7 n'a pas d'affinité pour les cellules ce qui confirme de l'interaction du Raft(cRGD)4 et des intégrines dans le cas du conjugué 5. 2) Evaluation des conjugués 6 et 8 La deuxième série permet de comparer les conjugués 6 et 8 porteurs de Cy5. 5 tétrasulfonates au cluster Raft(cRGD)4 également marqué par la Cy5. 5 tétrasulfonates (Figure 35). Il est ainsi possible d'avoir un premier aperçu de l'influence de la charge électrostatique des fluorophores couplés sur les conjugués polymériques. Dans cette étude, une nouvelle lignée est étudiée, la lignée U87MG (cellules de glioblastome). Cette lignée a été choisi en vue de passer aux études in vivo. En effet, les cellules U87MG présentent un bon effet EPR accompagné d'une bonne expression des intégrines 3 tout en restant à un niveau physiologique . 65 Figure 35 : Histogramme comparant les conjugués 6 et 8 porteurs de cy5. 5 tétrasulfonatés et le Raft(cRGD)4-Cy5. 5 tétrasulfonatés, Chaque graphique représente la quantité de cellules en fonction de l'intensité de fluorescence mesurée pour chacune d'entre elles. 66 Pour les deux séries, les conjugués peptidiques ont un comportement similaire. Les résultats semblent légèrement meilleurs à la concentration 0, 1 M pour laquelle le conjugué 6 induit moins de marquage non spécifique pour Hek293(1) que le conjugué 8 et davantage de marquage que le cluster Raft(cRGD)4. Pour la lignée U87MG, le marquage par les différents conjugués peptidiques est très proche de celui observé pour la lignée M21 et moins important que pour la lignée Hek293(3). Ceci est en accord avec le fait que la lignée Hek293(3) surexprime davantage l'intégrine V3 que les lignées M21 et U87MG. De la même manière que les lignées M21 et Hek293(3), pour la lignée U87MG, le conjugué 6 induit un marquage supérieur au Raft(cRGD)4 à 0, 1 M alors qu'ils ont un comportement très proche à 1 M. 4. Etude du comportement des conjugués in vivo L'évaluation in vivo des conjugués peptidiques est réalisée sur les conjugués marqués à la Cy5. 5 et Cy5. 5 sulfonatée. Cela permet d'évaluer les différences de distribution et les différents niveaux de fluorescence des conjugués en fonction de la présence ou non de charges sulfonates et de groupements Raft-(cRGD)4. La gamme de fluorescence réalisée sous l'appareil d'imagerie après dépôt d'une goutte de conjugué montre que les conjugués ont un niveau de fluorescence différent à concentrations égales (Figure 36). En effet si l'on compare les conjugués 5 et 6 entre eux ou les conjugués 7 et 8, les polymères avec la Cy5. 5 sulfonatée semblent plus fluorescents que les polymères Cy5. 5. De même si on compare les conjugués 5 et 7 ou 6 et 8, nous observons qu'en présence de Raft(RGD), le niveau de fluorescence des conjugués semble plus faible. 67 Figure 36 : Diagramme de l'intensité de fluorescence des différents conjugués peptidiques. Suite à cette gamme de fluorescence des conjugués peptidiques, nous avons choisi la concentration à 10 M pour l'injection in vivo. Les conjugués peptidiques sont injectés à concentrations égales en conjugués malgré leurs fluorescences différentes ex vivo. Trois souris par composés sont injectées en intraveineuse avec 200L de solution à 10M. Les souris sont imagées sur le flanc et sur le ventre pour avoir une vue d'ensemble de la distribution du conjugué peptidique dans les organes. 68 A Flanc droit B Figure 37 : A) Biodistribution in vivo des conjugués chez la souris nude portant une tumeur U87MG. Les images de fluorescence (500 ms de temps d'intégration, le contraste fixé entre 1784-11015) sont obtenues à 1h, 3h, 5h et 24h après injection intraveineuse des conjugués. B) Biodistribution ex vivo dans les organes à 24h. Les ROI sont définies sur les organes extraits afin de quantifier la quantité de photons émis par pixel après une exposition de 500 ms 69 Après analyse des images in vivo, nous observons une distribution hétérogène des composés. Des différences de fluorescence dans le corps de la souris ainsi que des différences au niveau de l'accumulation dans les organes et dans les voies d'élimination sont observées. (Figure 37) Cette observation est confirmée par les mesures de fluorescence des organes ex vivo. En effet on observe une différence de distribution des conjugués avec une cyanine sulfonatée ou non. Les conjugués greffés avec une Cy5. 5 sulfonatée semblent induire une clairance rénale puis une élimination par la vessie alors que les conjugués avec une Cy5. 5 classique sont éliminés par la voie hépatique. Nous observons également une intensité de fluorescence plus faible des conjugués sulfonatés dans les organes à 24h, ce qui traduit une rétention plus faible du composé dans les organes. En effet, lorsque l'on compare l'intensité du signal de fluorescence dans les tumeurs 24 post-injection (Figure 37), nous constatons que les conjugués non sulfonatés ont un signal plus fort dans la tumeur mais sont moins spécifiques, car une forte accumulation dans d'autres organes comme les intestins, le foie, et la peau est constatée. Pour les conjugués sulfonatés le signal dans la tumeur est plus faible, ce qui est dû à une meilleure élimination. Cette élimination rapide est bénéfique puisqu'elle permet une rétention passive plus faible dans les autres organes et donc une accumulation plus spécifique dans la tumeur. Pour confirmer nos observations, une cinétique sanguine a été réalisée. Les composés sont cette fois injectés à des concentrations différentes pour avoir la même intensité de fluorescence. Les conjugués avec la Cy5. 5 sulfonatée sont donc injectés à concentration plus faible car à concentration équivalente ils sont plus fluorescents. Après le premier prélèvement, 15 minutes après l'injection, on constate que les niveaux de fluorescence sont différents malgré leur étalonnage. La fluorescence est exprimée en pourcentage, avec l'intensité de fluorescence mesurée à 15 minutes comme valeur de référence. Nous avons choisi de comparer les différents conjugués en fonction de la présence ou non de Raft(cRGD)4 et de la nature de la cyanine 5. 5. Pour cela différentes courbes du pourcentage de fluorescence en fonction du temps ont été tracées (Figure 38). 70 Figure 38 : Courbes représentatives du pourcentage de fluorescence en fonction du temps, avec la fluorescence à 15 minutes comme valeur référence. Dans cette expérience, en comparant les conjugués porteurs de Raft(RGD), nous observons que le groupement peptidique a un effet sur la vitesse d'élimination du conjugué peptidique. Les conjugués porteurs de Raft(RGD) comme les conjugués 5 et 6 ont une élimination plus rapide. Il en est de même pour les composés portant une cyanine sulfonatée, les conjugués 6 et 8 montrent une élimination de la fluorescence plus rapide que les conjugués 5 et 7 qui n'ont pas de charges sulfonâtes. 71 Figure 39 : Courbes représentatives du pourcentage de fluorescence en fonction du temps, avec la fluorescence à 15 minutes comme valeur référence. La décroissance de la fluorescence sanguine n'est pas similaire pour chaque composé. Nous observons différentes pentes correspondant à différentes voies d'élimination de la circulation sanguine. Cette cinétique sanguine nous montre que les conjugués ont une élimination bien différente en fonction de leur composition. Le conjugué 6 qui est greffé avec du Raft(cRGD)4 et une cyanine sulfonatée présente une élimination rapide du système sanguin. Son temps de demi-vie est d'environ 24 minutes et après 2h le conjugué est très peu détecté dans le sang. Le conjugué 5 greffé avec du Raft(cRGD)4 et une cyanine sans sulfonate et le conjugué 8 greffé avec une cyanine 5. 5 sulfonatée ont une cinétique assez similaire, leurs temps de demi vie est respectivement de 2h24 pour le conjugué 5 et 3h24 pour le conjugué 8. Ils sont tous les deux détectables très longtemps dans l'organisme. Le conjugué 8 est toujours présent 24h après injection. Le conjugué 7 greffé avec une cyanine sans sulfonate reste très longtemps circulant dans le corps. Son temps de demi-vie est de 6h24. Environ 20% du signal injecté est toujours détectable 24h après l'injection, ce qui montre que ce conjugué reste circulant beaucoup plus longtemps que les autres. 72 5. Conclusion sur l'évaluation biologique des conjugués linéaires L'évaluation de l'affinité pour les intégrines v3 a permis de montrer que la présentation multivalente de Raft(cRGD)4 par les conjugués polymère-clusters permet d'obtenir une affinité accrue pour les intégrines v3 non seulement par conjugué mais également par Raft(cRGD)4. Le conjugué 2 (avec 4, 2 Raft(cRGD)4 par chaine en moyenne) présente la meilleure affinité. Les observations de microscopie confocale ont permis de montrer, comme cela avait déjà été observé pour le Raft(cRGD)4, que le conjugué 5 (polymère portant 4 molécules Raft(cRGD)4 Cy5. 5) est internalisé. Il induit un marquage plus important que le Raft(cRGD)4 à concentration équivalente et son marquage est spécifique. Le conjugué 5 induit un marquage très préférentiel des cellules sur- exprimant l'intégrine v3 même s'il semble légèrement moins sélectif que le Raft(cRGD)4 car on observe un marquage des cellules n'exprimant pas l'intégrine v3. Ces observations ont été confirmées par l'analyse de cytométrie en flux, celle-ci montre que les conjugués 5 et 6 greffés avec 4 clusters Raft(cRGD)4 marquent spécifiquement les cellules v3 positives comparativement au conjugués 7 et 8 (sans Raft(cRGD)4). Les observations concernant la moins bonne sélectivité du conjugué 5 sont confirmées par cette analyse de cytométrie en flux. L'étude in vivo nous montre une distribution dans l'organisme et une élimination très hétérogène des différents composés en fonction de leur composition. La nature de la cyanine semble avoir une influence sur la voie d'élimination et la rétention du conjugué dans les organes comme le montre la biodistribution ainsi que la quantification ex vivo sur les organes à 24h. Les composés avec une cyanine sulfonatée sont préférentiellement éliminés par voie rénale et sont moins retenus dans les organes tandis que les conjugués Cy5. 5 sont dégradé par le foie. Cette différence de rétention dans les organes entraine une différence de spécificité pour la tumeur. Les composés Cy5. 5 sulonatées ont une élimination rapide qui est bénéfique puisqu'elle permet une rétention passive plus faible dans les autres organes et donc une accumulation plus spécifique dans la tumeur. La cinétique sanguine confirme cette différence de vitesse d'élimination. Dans cette étude nous observons un effet du Raft(cRGD)4 et de la cyanine sur le temps de demi-vie du conjugué dans l'organisme. En effet le Raft(cRGD)4 et la Cy5. 5 sulfonatée induisent, indépendamment, une élimination accrue du composé. 73 II. Evaluations biologiques in vivo des nanoparticules AGuIX. Les évaluations biologiques ont tout d'abord pour objectif de déterminer si les nanoparticules AGuIX s'accumulent dans la tumeur après injection intra veineuse dans un modèle orthotopique de cancer des VADS décris plus tôt. Dans un second temps, nous avons cherché à évaluer le pouvoir thérapeutique des nanoparticules en association avec la radiothérapie. Le suivit de la croissance tumorale est effectuée par mesure au pied à coulisse et l'étude du signal de bioluminescence. 1. Etudes de la biodistribution des AGuIX Dans les deux cas, in vivo et ex vivo, les images de fluorescence ont montré des profils similaires. Après injection intraveineuse, les nanoparticules AGuIX-Cy5. 5 sont distribuées dans l'ensemble du corps et ont été rapidement filtrées par les reins avant l'élimination finale dans la vessie, comme représenté sur la (Figure 40. a) La majorité des nanoparticules ont été éliminées par les reins et une accumulation hépatique faible a été observée. En outre, un signal fluorescent a été détecté dans les tumeurs orthotopiques CAL33-LUC à partir du premier temps de mesure (30 minutes) et jusqu'à 24 heures après l'injection. Le maximum du rapport de fluorescence tumorale / cutanée a été observé 5 h après l'administration intraveineuse de AGuIX et persiste 24 heures après, comme le montre la Figure 40. c. 74 c b Figure 40 : Biodistribution des AGuIX-Cy5. 5 chez la souris nude portant une tumeur orthotopique CAL33-LUC Luc. a) Les images de fluorescence (200 ms de temps d'intégration, le contraste fixe entre 1787 et 5848) sont obtenues à 30 minutes, 1h30, 3h, 5h et 24h après injection intraveineuse des AGuIX-Cy5. 5 (200 L, [Gd3 ] ~ 20 mmol / L). b) Biodistribution dans les organes à différents temps après injection des AGuIX-Cy5. 5. Les ROI sont définies sur les organes extraits afin de quantifier la quantité de photons émis par pixel après une exposition de 500 ms. c) Ratio du signal de fluorescence de la tumeur sur le signal de fluorescence de la peau à différents temps après injection un temps d'exposition de 500 ms sur la position ventrale. 75 L'accumulation des AGuIX-Cy5. 5 dans la tumeur a ensuite été évaluée dans un autre modèle de tumeur orthotopique de cancer des VADS (SQ20B) développé en utilisant le même protocole d'implantation que le modèle CAL33-Luc. L'injection d'AGuIX Cy5. 5 et les images de fluorescence ont été effectuées en utilisant le même protocole. Une biodistribution similaire a été observée avec une clairance rénale rapide, suivie par l'élimination des nanoparticules dans les urines (Figure 41 a et b). L'accumulation passive dans les tumeurs a été détectée dans ce modèle après 30 minutes avec un maximum de taux de fluorescence tumeur / peau à 24 h après l'injection intraveineuse (Figure 41 c). Figure 41 : Biodistribution in vivo des AGuIX-Cy5. 5 chez la souris nude portant une tumeur orthotopique SQ20B. 76 Bien que modeste, la présence des nanoparticules au sein des tumeurs CAL33-Luc a également été validée en microscopie de fluorescence. Les nanoparticules sont majoritairement présentes à la périphérie des tumeurs. 1h30 et 5h après l'injection, le signal fluorescent correspondant à la présence des nanoparticules est punctiforme, alors qu'à 24h, il est plus diffus et semble être localisé dans le cytoplasme des cellules. 1h30 5h 24h Figure 42 : Localisation des nanoparticules fluorescentes sur les coupes congelées de tumeurs CAL33-LUC-Luc à différents temps après l'administration intraveineuse (AGuIX-Cy5. 5, 200 l à [Gd3 ] ~ 20 mmol / L). Les tumeurs ont été observées par microscopie à fluorescence (en bleu : coloration DAPI des noyaux ; en rouge : signaux de fluorescence correspondant à la Cy5. 5, donc aux nanoparticules). 77 2. Étude de l'efficacité thérapeutique des nanoparticules en tant qu'agents radiosensibilisants. 1) Effet de la nanoparticule sur une tumeur primaire de cancer des VADS On injecte 200 l d'une solution d'AGuIX ([Gd3 ] à 50 mM), l'irradiation est réalisée 15 minutes après l'injection des nanoparticules, à 10 Gy. L'accumulation des nanoparticules AGuIX-Cy5. 5 dans les tumeurs après injection intraveineuse a suggéré qu'un effet de radiosensibilisation pourrait être obtenu. Des souris porteuses de tumeurs orthotopiques CAL33-Luc ont donc été soumises à un protocole de radiothérapie conventionnelle après injection intra-tumorale ou intraveineuse d'AGuIX. Figure 43 : protocole d'irradiation des tumeurs dans un modèle de cancer des VADS Pendant le suivi, le groupe contrôle a montré une croissance tumorale progressive et constante. En revanche, dans tous les groupes irradiés, avec ou sans administration d'AGuIX, un ralentissement de la progression de la tumeur a été observé après la première radiothérapie avec une phase de stabilisation pendant 7 jours. Ensuite, une lente progression du volume de la tumeur a été observée, sans aucune différence entre les différents groupes traités (figure 44). Nous avons donc décidé d'effectuer un deuxième traitement au jour 34 avec injection des nanoparticules et une dose unique de 5 Gy. Le taux de survie est évalué pour chaque groupe. A un stade tumoral avancé, les souris sont euthanasiées quand elles présentent les signes cliniques tels qu'une perte de poids 20% et/ou un volume tumoral 600 mm3. 78 a b Figure 44 : Courbes de croissance tumorale chez des souris porteuses de tumeurs CAL33-Luc ; sans traitement (bleu, n 10) traitées par irradiation seule (rouge, n 11) traitées par irradiation 24 heures après l'injection intraveineuse de AGuIX (violet, n 11), traitées par une irradiation 5 heures après l'injection intraveineuse de AGuIX (turquoise, n 11) et traitées par irradiation 1 h après l'injection intra-tumorale de AGuIX (vert, n 11). L'irradiation a été effectuée au jour 12 et le jour 34 à 10 et 5 Gy respectivement. a ; surveillance du volume de la tumeur mesurée avec un pied à coulisse. b ; élargissement de la surveillance du volume tumoral mesurée avec un pied à coulisse entre les deux irradiations (lignes rouges). 79 En dépit de la deuxième irradiation, le volume de la tumeur a augmenté constamment dans chaque groupe irradié. A partir du jour 53, le groupe de souris traitées avec une irradiation 5 heures après l'administration d'AGuIX présente une augmentation de la croissance de la tumeur par rapport aux autres groupes irradiés. Il n'y a pas de différence dans la progression tumorale entre les autres groupes irradiés pendant les 60 premiers jours. Néanmoins, à partir du jour 64, 30 jours après la seconde irradiation, une croissance plus lente de la tumeur dans le groupe irradié 24h après l'administration AGuIX est observé, par rapport aux groupes irradiés seul et irradiés 1h après l'administration intra- tumorale AGuIX. Le volume tumoral a même commencé à diminuer légèrement dans ce groupe à partir du jour 69. Cependant, ces différences entre les groupes ne sont pas significatives (figure 45). Figure 45 : Courbes de survie chez des souris porteuses de tumeurs CAL33-LUC ; sans traitement (bleu, n 10) traité par irradiation seule (rouge, n 11) traité par irradiation 24 heures après l'injection intraveineuse de AGuIX (violet, n 11), traité par une irradiation 5 heures après l'injection intraveineuse de AGuIX (turquoise, n 11) et traité par irradiation 1 h après l'injection intra-tumorale de AGuIX (vert, n 11). L'irradiation a été effectuée au jour 12 et le jour 34 à 10 et 5 Gy respectivement. La médiane de survie présentée par le groupe contrôle était de 35 jours et il a été étendu à 62 jours dans le groupe irradié 24h après l'injection AGuIX intraveineuse, et à 58 jours dans les trois autres groupes (figure 45). L'irradiation, dans tous les groupes traités, induit une augmentation de la durée de vie d'environ 170% (p comparé au groupe témoin, mais aucune augmentation significative de la durée de vie entre les groupes irradiés n'a été observée. 80 La surveillance des tumeurs a été faite trois fois par semaine en utilisant le pied à coulisse et une fois par semaine par échographie et imagerie par bioluminescence. Les mesures obtenues à partir des différents examens ont été similaires. Nous avons utilisé des images échographiques en tant que norme pour la mesure du volume de la tumeur pour valider les mesures obtenues avec le pied à coulisse. Suite à cette expérience et dans le souci de se rapprocher le plus de la problématique clinique des cancers des VADS, l'étude de l'efficacité thérapeutique des AGuIX a été faite sur une rechute tumorale après exérèse macroscopique de la tumeur. 2) Effet de la nanoparticule sur la rechute d'une tumeur primaire de cancer VADS Après injection de 200 l d'une solution d'AGuIX ([Gd3 ] à 50 mM) dans la veine caudale de la souris, les souris sont anesthésiées chimiquement par injection de 100L/g d'une solution de Médétomidine/Kétamine décrite précédemment. L'irradiation est réalisée 15 minutes après l'injection des nanoparticules, à 10 Gy. Les souris ont été randomisées en fonction du volume tumoral au moment de l'irradiation. Figure 46 : Protocole expérimental d'irradiation. 81 Après irradiation, le volume tumoral est suivi par mesures au pied à coulisse et par mesure de bioluminescence. Pendant le suivi, le groupe contrôle a montré une rechute tumorale précoce et une progression rapide de la croissance tumorale. 100 jours après la chirurgie, 9 souris sur 10 ont rechutées. Dans le groupe irradié, sans administration de nanoparticules AGuIX, la rechute tumorale apparait quelques jours après la chirurgie comme dans le cas des souris contrôle, mais un ralentissement de la progression de la tumeur est observé. 100 jours après la chirurgie, 7 souris sur 13 ont rechutées. Le groupe traité par irradiation après injection d'AGuIX semble montrer une rechute tumorale plus tardive ainsi qu'une croissance tumorale légèrement moins rapide. 100 jours après la chirurgie, 5 souris sur 13 ont rechutées (figure 47). 82 Figure 47 : Courbes de croissance tumorale chez des souris porteuses de tumeurs CAL33-LUC. 83 Le suivi en bioluminescence montre, pour la courbe contrôle, une augmentation très nette du signal, similaire à celui de l'augmentation du volume tumoral. Pour les groupes irradiés le signal de bioluminescence est également corrélé à la croissance tumorale ; le signal semble plus faible comparativement à une tumeur contrôle de même taille. Cela peut s'interpréter comme une différence physiologique au sein de la tumeur. L'irradiation après injection de nanoparticules induit possiblement plus de mort cellulaire à l'intérieur de la tumeur, le signal de bioluminescence étant dépendant du métabolisme ou plus particulièrement de la production d'ATP et du niveau d'oxygène (Figure 14). (Figure 48) 84 Figure 48 : Courbes du signal de bioluminescence chez des souris porteuses de tumeurs CAL33-LUC 85 Figure 49 : Courbes de survie chez des souris porteuses de tumeurs CAL33-LUC On appelle survie 50% le moment o 50% des souris du groupe ont été euthanasiées. Cette survie est déterminée par une courbe de type Caplan-Meier (ci dessus) La durée médiane de survie présentée par le groupe contrôle était de 57 jours et il a été étendu à 75 jours dans le groupe irradié sans injection d'AGuIX, contre 196 jours dans le groupe irradié avec injection d'AGuIX 15 minutes avant irradiation. L'irradiation, induit une augmentation de la survie d'environ 131% comparé au groupe témoin. L'irradiation avec l'injection de nanoparticules AGuIX ([Gd3 ] à 50 mM), induit une augmentation de la médiane de survie d'environ 344% par rapport au groupe témoin. (Figure 49) Au vue de l'évolution de la rechute tumorale qui n'apparait pas chez les dernières souris, et par souci de bien-être animal, le suivi des souris a été stoppé 280 jours après la chirurgie. Dans les différents groupes suivis, toutes les souris du groupe contrôle ont eu une rechute tumorale, 1 souris du groupe ayant reçu comme traitement une dose d'irradiation n'as pas rechuté et 5 souris du groupe traité avec la nanoparticule AGuIX restent sans rechute tumorale à la fin de notre étude. 86 3. Conclusion sur les effets in vivo de la nanoparticule AGuIX. Pour ce qui est de la distribution dans l'organisme, la nanoparticule AGuIX présente un profil optimal pour une injection in vivo. En effet sa petite taille permet une bonne clairance rénale, comme observé dans l'étude de biodistribution. Ce résultat est très important. L'effet radiosensibilisant des nanoparticules sur les tumeurs primaires de cancers des VADS n'est pas observé. L'effet de la radiothérapie sur la croissance tumorale est bien confirmé mais il n'y a aucune différence entre une irradiation seule o combinée à l'injection de nanoparticules. La voie d'inoculation de la nanoparticule n'a pas d'effet non plus. L'injection intra-tumorale était supposée augmenter la quantité de nanoparticules au sein de la tumeur comparativement à l'injection intraveineuse, et ainsi accroitre l'effet de la radiothérapie. Or aucune différence de l'effet de l'irradiation n'a été observée. Dans le cas de l'injection d'AGuIX sur la rechute tumorale, les effets sont très satisfaisants. Nous observons un effet de la nanoparticule sur la vitesse de croissance tumorale ainsi que sur le signal de bioluminescence qui indique une mort cellulaire intra-tumorale accrue. L'étude de la survie 50% montre aussi que la nanoparticule induit une augmentation de cette survie de 344% par rapport aux souris sans traitement et de 261% comparativement aux souris irradiées. 87 III. Discussion et perspectives 1. Synthèse de macromolécules ciblant l'angiogenèse. Pour cette étude, des sondes polymères fluorescentes ont été élaborées afin de cibler l'angiogenèse tumorale. Pour cela, des systèmes de ciblage multivalents à deux niveaux ont été développés en combinant les polymères avec des clusters de ligands peptidiques Raft(cRGD)4. Ces polymères peptidiques présentent 4 ligands RGD cycliques, capables de se lier sélectivement et avec une très forte affinité à l'intégrine V3, protéine transmembranaire surexprimée à la surface de cellules du microenvironnement tumoral dans un grand nombre de cancers. De manière très intéressante, les premières évaluations biologiques in vitro ont montré que les conjugués présentant plusieurs clusters Raft(cRGD)4 le long de la chaine polymère (soit 2 niveaux de multivalence) possèdent une affinité vis-à-vis des intégrines V3 supérieure à celle du cluster Raft(cRGD)4 libre, (que la concentration soit exprimée vis-à-vis du conjugué ou des clusters Raft(cRGD)4). Lors des essais in vitro d'inhibition de l'adhésion cellulaire à la vitronectine, il a été montré que la présentation multivalente des clusters peptidiques le long de la chaine polymère permet d'augmenter considérablement cette affinité (un conjugué porteur de 4 clusters par chaine en moyenne a une affinité 23 fois supérieure à celle du cluster seul). Cette amélioration significative a été attribuée à l'augmentation de la concentration locale en motifs cRGD, L'utilisation de la microscopie confocale et de la cytométrie en flux a permis la mise en évidence de l'internalisation des conjugués fluorescents et du marquage préférentiel des cellules exprimant l'intégrine V3 (plus important que le cluster Raft(cRGD)4 libre a concentration équivalente). Cette augmentation du marquage provient d'une part de la brillance plus importante des conjugués et d'autre part d'une plus grande affinité pour les intégrines V3. La sélectivité des conjugués semble proche de celle observée pour le cluster Raft(cRGD)4. Ce travail a fait l'objet d'une publication dans le journal Bioconjugate Chemistry (57). Au niveau de l'étude in vivo, comme attendu, la composition du polymère peptidique modifie sa distribution et sa rétention dans l'organisme. Cette différence de rétention dans les organes entraine une différence de spécificité pour la tumeur, les conjugués Cy5. 5 sulfonatés ont une élimination rapide qui est bénéfique puisqu'elle permet une rétention passive plus faible dans les autres organes et donc une accumulation plus spécifique dans la tumeur. 88 La cinétique sanguine confirme cette différence de vitesse d'élimination. Dans cette étude, nous observons un effet du Raft(cRGD)4 et de la cyanine sur le temps de demi-vie du conjugué dans l'organisme. En effet le Raft(cRGD)4 et la Cy5. 5 sulfonatée induisent, indépendamment, une élimination accrue du conjugué. Le conjugué 5 et le conjugué 6 semblent intéressants pour une injection in vivo et le ciblage spécifique des cellules tumorales. En effet ils présentent une bonne sélectivité ainsi qu'une élimination rapide, la différence des deux polymères se situant au niveau de la voie d'évacuation : conjugué 5 suit principalement la voie rénale, tandis-que le conjugué 6 est lui éliminé par la voie hépatique et induit une légère accumulation dans les autres organes. L'étude devra être complétée avec des conjugués contrôles porteurs de Raft(cRAD)4 pour confirmer la spécificité de l'interaction due au motif RGD. Il serait également intéressant d'explorer une gamme de conjugués plus vaste, notamment en augmentant la taille du copolymère et/ou le nombre moyen de clusters Raft(cRGD)4 par chaine afin de mieux étudier l'influence de la densité en cluster peptidique le long de la chaine polymère, sur l'affinité envers les intégrines v3. 2. Evaluation de la nanoparticule AGuIX Le traitement des cancers des VADS repose actuellement sur la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. Le traitement des cancers des VADS à un stade avancé, fait appel à plusieurs de ces techniques diversement associées. L'objectif de cette étude est de développer une nanoparticule théranostique qui permettrait d'allier au sein d'un seul et même objet des agents d'imagerie et de thérapie. La nanoparticule AGuIX montre de bons résultats dans ces applications. En effet, elle permet un bon ciblage de la tumeur grâce à une bonne distribution dans l'organisme et une bonne accumulation passive tumeur. D'un point de vue thérapeutique la nanoparticule est également très intéressante. La particule n'a pas montré d'efficacité dans le cas d'un traitement d'une tumeur primaire par radiothérapie. Mais dans le cas du traitement par radiothérapie lors de la rechute tumorale, la nanoparticule montre un effet sur la croissance des tumeurs et sur la fréquence des rechutes. 89 Cette nanoparticule est donc un bon outil pour l'association de la chirurgie et de la radiothérapie postopératoire en fonction des critères histologiques défavorables dont l'exérèse incomplète de la tumeur. Il serait intéressant de réaliser à nouveau cette étude avec une particule greffé avec un Raft(cRGD)4, ce qui permettrai une meilleur rétention au sein de la tumeur. Cela permettrait de trouvé un temps plus optimal pour la radiothérapie c'est-à-dire un temps o la quantité de particule dans les organes sains est la plus faible tout en conservant une quantité nécessaire dans la tumeur la tumeur reste suffisante. Cela permettrait également de diminuer la dose de rayons délivré pour un effet thérapeutique similaire. 90 Bibliographie 1. Atallah I, Milet C, Henry M, Josserand V, Reyt E, Coll J-L, et al. 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These original conjugates bear two levels of multivalency. They are prepared by covalent coupling of a controlled number of tetrameric cRGD peptide clusters along a well-dened copolymer synthesized by RAFT polymerization. The presence of multiple copies of peptide clusters on the same polymer backbone resulted in a much-higher relative potency than the free cluster reference. Thanks to the polymultivalency, up to 2 orders of magnitude potency enhancement was reached in a competitive cell adhesion assay (nanomolar-range IC50 values). In addition, confocal microscopy and ow cytometry demonstrated that uorescent polymultivalent conjugates (emitting in the far-red/near- infrared region) were able to specically and selectively label cells expressing 3-integrin, the natural receptor of cRGD. v B iospecic molecular recognition plays a pivotal role in many life processes and often relies on the multivalent interactions between ligands and their target receptors. 1 For several years now, the concept of multivalency has been taken over by chemists to design a wide range of multivalent ligands consisting of several monovalent ligands grafted onto a multifunctional scaold for diagnostic and therapeutic applications. 2 target As reported by Kiessling et al. , multivalent ligands can through various mechanisms, interact with their including chelating, subsite binding, statistical rebinding, steric stabilization. and clustering eects. 3 Considering ligand systems either soluble or dispersible in water, two categories can be distinguished depending on the size of the scaold. On the one hand, a large number of clusters of ligands have been prepared from dierent low-molecular-weight scaolds (ca. 000 g mol1) such as saccharides, cyclens, linear and cyclic peptide and peptoids, porphyrins, cyclodextrins, and calixarenes. These clusters have demonstrated an enhanced avidity and selectivity in comparison with the corresponding for monovalent is governed by characteristics such as valency, rigidity and spatial organization. On the other hand, a large number of conjugates ligand. Their interaction with the target their target have been prepared by grafting multiple copies of monovalent ligands on larger scaolds including polymers, dendrimers, and organic and inorganic nanoparticles as well as self-assemblies, liposomes, and viruses. Structural and physicochemical proper- ties of these conjugates, such as size, shape and type of scaold, nature, and density and accessibility of the ligands, were proven to be key parameters for their eciency in biological media. Some of these systems have been used to obtain so-called super-selective targeting properties. 4 To further increase biospecicity, it would be relevant to develop bio-inspired conjugates bearing two levels of multi- valency, i. e. , combining a large multifunctional scaold (rst level of multivalency) and multiple clusters of ligands (second level of multivalency). 5 To our knowledge, there have been very few systems described in the literature. They exclusively refer to nanoparticles or micelles, functionalized with carbohydrate ligand dendrons. Gillies et al. 6 compared nanoparticles functionalized with dendritic and nondendritric displays of mannose. Similarly, Stenzel et al. 7 compared polymer micelles Received : Revised : Published : August 2, 2017 June 26, 2017 July 27, 2017 2017 American Chemical Society 2241 DOI : 10. 1021/acs. bioconjchem. 7b00362 Bioconjugate Chem. 2017, 28, 22412245 Bioconjugate Chemistry presenting at the surface either glycodendrons (eight glucose residues per dendron) or linear glycopolymer blocks (each bearing, on average, nine glucose residues). Moreover, Davis et al. 8 introduced glyco-dendri-protein nanoparticles with a so- called nested polyvalency that were able to potently block viral infections. In all those cases, the two-level multivalent glyconanoparticles demonstrated an enhanced avidity for their targets. In this study, we designed and evaluated a new class of macromolecular conjugates that can be termed polymultiva- lent ligands. They combine a water-soluble, multifunctional, and exible polymer chain and several ligand clusters (here, peptide clusters with four cyclic RGD ligands consisting of ArgGlyAspDPheLys, named cRGD) (Figure 1). As introduced by Ringsdorf, 9 polymer chains represent an important scaold family, enabling the preparation of a wide array of bioactive conjugates. Communication cluster) could be discriminated from the one at a larger scale (provided by the grafted surface). 16d Several cRGD peptide clusters were covalently bound along a well-dened reactive copolymer. Poly(N-acryloylmorpholine statN-acryloxysuccinimide), poly(NAMstatNAS) (Figure 1A), was synthesized by reversible additionfragmentation chain transfer (RAFT) controlled radical polymerization17 using a previously optimized procedure. 18 In addition to the inherent advantages of RAFT polymerization, this copolymer exhibits several interesting features. First, NAM units ensure good water solubility and biocompatibility. Poly(N-acryloyl- morpholine) indeed exhibits similar properties to polyethylene glycol (PEG), known to limit nonspecic biointeractions. 19 Moreover, NAS units provide lateral reactive groups (activated esters) that are regularly distributed along the polymer backbone at the chosen 60/40 mol % NAM/NAS azeotropic composition. 18a Due to the size of the cRGD peptide cluster (ca. 4 500 gmol1), a 60 kg mol1 copolymer backbone was selected to bind several clusters while limiting the eects of steric hindrance on the coupling yield. The conjugation of a controlled number of clusters was achieved by reacting the amine group of the lysine side chain of the peptide cluster with the activated ester functions of the copolymer, resulting in stable amide bonds. Finally, the remaining activated ester functions were capped with a hydrophilic moiety, amino- ethylmorpholine (AEM) (Scheme S1). for the bioassays, In addition to a copolymer bearing no peptide cluster used as three polymerpeptide cluster control conjugates (named polymercluster below) were prepared with an increasing average number of clusters per conjugate (ncluster 1. 5, 4. 2, and 5. 9, respectively) (Table 1, left). Because all of the conjugates were highly soluble in aqueous media, they could be thoroughly puried by dialysis. To quantify the coupling yield, ncluster and to check the eciency of the purication procedure, the puried conjugates were characterized using both 1H NMR (500 MHz) and Table 1. Characteristics and IC50 Values of the Various PolymerPeptide Cluster Conjugates (Left) and Characteristics of the Fluorescent Conjugates (Right) conjugate free cluster C0 C1. 5 C4. 2 C5. 9 a (g Mn mol1) 4 447 62 100 76 500 77 900 84 300 b ncluster 1 0 1. 5 4. 2 5. 9 uorescent conjugate free clusterg C0Cy5. 5h C0SulfoCy5. 5g C4. 2Cy5. 5h C4. 8SulfoCy5. 5g c (nM cluster) IC50 [relative potency]e 190 30 [1] none [0] 440 70 [0. 4] 33 5 [5. 6] 100 20 [1. 9] a (g mol1) Mn 5 454 63 900 65 800 79 900 83 800 IC50 d (nM conjugate) [relative potency]e 190 30 [1] none [0] 290 50 [0. 6] 8 1 [23] 17 4 [11] f nf 1 3. 1 3. 7 3. 6 3. 7 b ncluster 1 0 0 4. 2 4. 8 aMn : number-average molecular weight. bncluster : average number of peptide clusters per conjugate determined by 1H NMR. cValues expressed in molar concentration of peptide cluster. dValues expressed in molar concentration of conjugate (peptide cluster concentration/ ncluster). eRelative potency is calculated by dividing the IC50 value of the free peptide cluster by one of the polymerpeptide cluster conjugates. fnf : average number of dyes per polymer chain determined by SEC UV. 13 gLabeled with SulfoCy5. 5. hLabeled with Cy5. 5. 2242 DOI : 10. 1021/acs. bioconjchem. 7b00362 Bioconjugate Chem. 2017, 28, 22412245 Figure 1. (A) Structure of the reactive copolymer, the tetravalent cRGD peptide cluster, and the cyanine 5. 5 dyes. (B) Structure and schematic representation of the polymultivalent conjugates. RGD, and especially cRGD, 10 peptides are particularly attractive because they exhibit a high anity for integrins actively involved in processes such as cell adhesion and physiological and tumor angiogenesis. 11 These ligands were shown to eciently bind integrins both in vitro and in vivo and are now being clinically evaluated. 12a RGD ligands are widely used for the targeted delivery of several types of drugs and diagnostic agents and the impact of their multivalent presentation has clearly been established. 12b The tetravalent cRGD peptide cluster used in this study (Figure 1A) was prepared from a cyclodecapeptide platform that displays, in a spatially controlled manner, (i) a clustered ligand domain for integrin recognition and, on the opposite side, (ii) a lysine primary amine group enabling the regioselective conjugation with dierent types of entities. 14, 15 Thanks to the constrained multivalency, such a peptide cluster has already demonstrated a higher avidity for 3 integrins v (increased statistical rebinding eects) than the corresponding monovalent cRGD peptide. 14, 16 Negative controls with cRAD peptide clusters ensured that integrin recognition was specic. 14 In addition, the benet of the tetrameric cluster compared to the monomeric ligand was conrmed on grafted surfaces. 16c, d The multivalent eect at a 1 nm length scale (provided by the Bioconjugate Chemistry Communication Figure 2. (A) Typical 1H DOSY NMR spectrum of a puried polymerpeptide cluster conjugate (D2OCD3CN, 70 : 30, v/v, 500 MHz, 298 K) showing aligned peptide and polymer signals at a diusion coecient of D 14 m2 s1. Peptide cluster peaks (shift range highlighted in red) partially overlap polymer backbone peaks (shift range highlighted in blue). (B) Relative potency (calculated by dividing the IC50 value of the free peptide cluster by the one of the polymerpeptide cluster conjugate for the various conjugates) expressed either in terms of peptide cluster ncluster ; see also Table 1 and the Supporting concentration, Ccluster (blue), or in terms of conjugate concentration, Cconj (red), with Ccluster Cconj Information. (C) Schematic representation of possible interactions between a polymultivalent polymerpeptide cluster conjugate and a 3- integrin-presenting target : panels i and ii illustrate the increased statistical rebinding eect, and panel iii illustrates the ability of a polymultivalent conjugate to bind several integrins. Dotted boxes : zoomed-in region showing cRGDintegrin interaction. (D) Cell labeling quantied by ow cytometry : Mean uorescence intensity of HEK3 (blue histograms) and HEK1 (red histograms) cells after incubation with the free cluster, the copolymer without cluster C0SulfoCy5. 5, and the polymerpeptide cluster conjugate C4. 8SulfoCy5. 5 at 0. 1 M (peptide cluster concentration). exc 640 nm. Inserts : Confocal microscopy images of HEK3 cells labeled with the free cluster (left) and the conjugate Ctrl : control with cells only ; C4. 2Cy5. 5 (right) at 0. 1 M (peptide cluster concentration). Dyes (red, exc 405 nm). Scale bar : 20 m. See also the Supporting Information. exc 633 nm), nuclei (blue, v diusion-ordered NMR spectroscopy (1H DOSY NMR) (see the Supporting Information). 1H DOSY NMR is indeed able to discriminate peptide clusters bound along the polymer chain from free peptide clusters (Figure 2A). The coupling was conrmed as the peptide cluster, and the polymer signals appeared aligned at a same diusion coecient (14 m2 s1), signicantly lower than the one of the free peptide clusters (131 m2 s1, Figure S3). Moreover, no signal corresponding to the the purication free cluster was detected, procedure was very ecient. The polymultivalent polymercluster conjugates were then evaluated in vitro in comparison with the free peptide cluster reference. The ability of the various conjugates to interact with investigated in a competitive cell adhesion assay against vitronectin, the natural integrins. 20 The inhibition of HEK3 cell ligand of adhesion onto vitronectin-coated plates was quantied in the presence of increasing concentrations of conjugates from 0. 1 to 10 000 nM (Figure S4 ; each data point was acquired in triplicates). 3-positive cells (HEK3) was rst indicating that v 3 v These assays provided several important insights (Table 1, left and Figure 2B). As expected, there were no nonspecic interactions between the polymer backbone and the integrins. The copolymer C0 without peptide (ncluster 0) did not inhibit cell adhesion (Figure S5). Inhibition of cell adhesion was exclusively observed with the polymercluster conjugates. For conjugate C1. 5 with ncluster 1. 5 (IC50 400 nM), the relative potency was lower than for the free cluster (IC50 200 nM) (Table 1, left). This is probably due to steric eects because the polymer chain may limit the accessibility of the lateral peptide cluster (Scheme S2). However, further increasing ncluster resulted in a signicant decrease of the IC50 value and, thus, in a much-higher integrin binding eciency and relative potency. The polymultivalent conjugate C4. 2 with ncluster 4. 2 oered the best compromise (C5. 9 conjugate with ncluster 5. 9 exhibited a slightly higher IC50 value probably due to crowding eects). The inhibition of cell adhesion was eective for C4. 2 concentrations as low as 10 nM. Interestingly, each individual peptide cluster within the C4. 2 conjugate exhibited a relative potency 6-fold higher than the free peptide cluster. Considering the relative potency of the conjugate itself, it was 23-fold higher compared to the same reference. This remarkable result was attributed to several synergetic eects originating from the polymultivalent structure of the 2243 DOI : 10. 1021/acs. bioconjchem. 7b00362 Bioconjugate Chem. 2017, 28, 22412245 the cell Bioconjugate Chemistry polymercluster conjugate. Statistical rebinding eects3 in- crease with the local concentration of cRGD. Rebinding may occur with cRGD from the polymer chain (Figure 2C, i) and within the peptide cluster (Figure 2C, ii). Moreover, stabiliza- tion of the conjugate-cell interaction is increased by the ability of the conjugate to bind several integrins (Figure 2C, iii). It is important to note that this cooperative (or zip) eect greatly contributes to the enhanced avidity and may favor integrin clustering at surface (see also the Supporting Information) Additional investigations using confocal uorescence micros- copy and ow cytometry were then conducted. Polymer cluster conjugates were labeled (Scheme S1) with two dierent amino-modied cyanine5. 5 dyes, Cy5. 5 and SulfoCy5. 5, following a previously described procedure. 13 SulfoCy5. 5 diers from Cy5. 5 by the presence of four sulfonate groups on the chromophore (Figure 1A), but both exhibit a similar uorescence emission in the far-red/near-infrared ranges 700 nm). A pair of uorescent polymercluster ( conjugates, C4. 2Cy5. 5 and C4. 8SulfoCy5. 5, were synthe- sized as well as two reference copolymers without peptide clusters, C0Cy5. 5 and C0SulfoCy5. 5, for the in cellulo studies (Table 1, right). em max v 3 and v 3-positive cells, To examine the specicity and the selectivity of the interaction with the four uorescent conjugates and the free peptide cluster (labeled with SulfoCy5. 5) were incubated with either HEK3 or HEK1 cells, respectively, over-expressing 1 integrins. The v results obtained by both confocal microscopy and ow cytometry experiments were in good agreement (Figures 2D, S8, and S9). In addition, no signicant dierence was noticed between the conjugates labeled with Cy5. 5 or SulfoCy5. 5 dyes. First, cell labeling was highly specic. HEK3 cells were very eciently labeled by the polymercluster conjugates C4. 2 Cy5. 5 and C4. 8SulfoCy5. 5, whereas no labeling was observed with the reference conjugates without peptide cluster (C0 Cy5. 5 and C0SulfoCy5. 5). There were no nonspecic interactions with the uorescent polymers whatever the dye (with or without sulfonate negative charges). In addition, we observed that the cells tended to detach from the microscopy the polymercluster coverslips only in the presence of conjugates. Because cell-surface integrins are actively involved in adhesion mechanisms, this is an important proof that cRGD peptideintegrin interactions occurred and that, for each conjugate, the cRGD motifs are still functional. As seen by confocal microscopy, cell labeling was not restricted to the cell surface but rather distributed in the cytoplasm. This is of particular targeted delivery applications. Compared to the free peptide cluster, the labeling intensity of the HEK3 cells, and thus, the labeling sensitivity were signicantly enhanced with the polymercluster conjugates. two dierent This can be ascribed to a combination of parameters, with the higher brightness of the polymer conjugates that bear multiple dyes per chain compared to the free cluster (bearing only one dye) (see the Supporting Information) and the higher binding eciency to 3 integrins v of the polymer conjugates thanks to their polymultivalency. importance for Finally, comparison of the results with HEK3 and HEK1 cells indicated that the labeling was also selective. Labeling intensity was systematically higher for HEK3 cells (expressing more 3 integrins) than for HEK1 cells. These results were v consistent with those obtained with other cells lines expressing various levels of 3 integrins, the M21 and M21L pair of v Communication melanoma cell glioblastoma cell line (Figure S9). lines, and the integrin-positive U87MG In conclusion, we have designed a new class of highly potent polymultivalent ligands that are very versatile. They could give rise in the future to various engineered systems such as random coils, single-chain nanoparticles, or larger assemblies. These biocompatible conjugates hold great promise for the vectorization of various kinds of diagnostic and/or therapeutic entities (attachment can be performed through a wide range of strategies) toward 3-integrin-rich environments. For in- v stance, the conjugates can be applied as biospecic uorescent probes to study various biological processes involving v 3 integrins, both in vitro and in vivo. Futhermore, they may be used for the early diagnosis and the treatment of a large number of cancer tumors that over-express 3 integrins, especially v because of their associated neo-angiogenesis. ASSOCIATED CONTENT *S Supporting Information The Supporting Information is available free of charge on the ACS Publications website at DOI : 10. 1021/acs. bioconj- chem. 7b00362. Detailed experimental and analytical details. Tables on peptide cluster characteristic data, average chain length, and a comparison of spectrophysical properties. Figures showing conjugate synthesis pathways, NMR data, cell adhesion inhibition, steric eects, rebinding eects, polymultivalent conjugates, SEC/UV chromatograms, emission spectra, and cell labeling. (PDF) structural considerations, statistical AUTHOR INFORMATION Corresponding Authors *E-mail : arnaud. favier@univ-lyon1. fr. *E-mail : jean-luc. coll@univ-grenoble-alpes. fr. *E-mail : didier. boturyn@univ-grenoble-alpes. fr. ORCID Arnaud Favier : 0000-0002-7482-7874 Notes The authors declare no competing nancial interest. ACKNOWLEDGMENTS to Cristina Cepraga for the synthesis of We are grateful poly(NAMstatNAS) copolymer ; the ICMG Chemistry Nanobio Platform, Grenoble, for support on peptide synthesis ; Alexei Grichine, Jacques Mazzega, and Mylene Pezet from the MicroCell imaging facility of IAB, Grenoble, for their technical help ; the NMR Polymer Center of Institut de Chimie de Lyon (ICL, FR5223) ; and Carlos Baleizao and José-Paulo Farinha (CQFM, Instituto Tecnico Superior, Lisbon, Portugal) for the absorption and uorescence emission spectra. We also thank Région Rhône-Alpes (ARC1 Santé) and La Ligue contre le Cancer, Comité du Rhône for nancial support. D. D. acknowledges a PhD grant from the French Ministry of Research and Education. REFERENCES (1) Mammen, M. , Choi, S. -K. , and Whitesides, G. M. 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Cet article présente les faits marquants de l'année 1870 en santé et médecine.
Événements
30 septembre : pillage de l'École impériale du Service de santé militaire de Strasbourg par les troupes allemandes et fin de cette école créée 14 ans plus tôt.
Charles Daremberg inaugure à Paris la première chaire d'histoire de la médecine créée en France.
Le Médecin-inspecteur baron Larrey est médecin en chef de l'armée du Rhin et donc intégré à l'État-major.
Décès
28 novembre : mort du peintre impressionniste Frédéric Bazille (né en 1841) qui a fait des études de médecine sans en obtenir le titre. Il meurt face à l'armée prussienne à la bataille de Beaune-la-Rolande.
Références
Portail de la médecine Portail des années 1870 | WIKIPEDIA | Wiki |
Grippe A : le calme avant la tempête ? | WMT16 | Scientific |
Efficacité clinique La tolérance et l' efficacité de Nexavar ont été étudiées chez des patients atteints de carcinome hépatocellulaire (HCC) et chez des patients atteints de carcinome rénal avancé (RCC). | EMEA_V3 | Medicinal |
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Le statocyste est un organe de l'équilibre sensible à la gravité chez les invertébrés (Cnidaires, Cténophores, Bilatériens) et chez les plantes. Il comprend au moins un statolithe solide entouré de cellules ciliées (cils sensoriel).
Le statolithe roule suivant la position de l'organisme et va cogner contre les cils sensoriels, ce qui permet à l'organisme d'évaluer sa position pour retrouver l'horizontale.
On trouve ce type de système chez certains invertébrés comme les cnidaires et les cténaires par exemple. Chez l'Homme, l'utricule et le saccule de l'oreille interne sont considérés comme des statocystes spécialisés.
Notes et références
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95% ; 47 à 72) et de 53% (I. C. | EMEA_V3 | Medicinal |
Des effets sur le cycle œstral ont été observés à des doses correspondant à 5 fois l'exposition thérapeutique chez l'homme. | EMEA_V3 | Medicinal |
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Un cas de pneumopathie interstitielle rapporté sous atorvastatine (Tahor) : synthèse des cas publiés sous statines | WMT16 | Scientific |
Les Uropterygiinae sont une sous-famille des murènes ou Muraenidae.
Liste des genres
Selon ITIS (20 janvier 2019) et World Register of Marine Species (20 janvier 2019) :
genre Anarchias Jordan & Starks in Jordan & Seale, 1906
genre Channomuraena Richardson, 1848
genre Cirrimaxilla Chen & Shao, 1995
genre Scuticaria Jordan & Snyder, 1901
genre Uropterygius Rppell, 1838
Notes et références
Références taxinomiques
(fr + en) ITIS : Uropterygiinae (consulté le 20 janvier 2019)
(en) NCBI : Uropterygiinae (taxons inclus) (consulté le 20 janvier 2019)
(en) WoRMS : Uropterygiinae Fowler, 1925 (+ liste genres + liste espèces) (consulté le 20 janvier 2019)
Portail de l'ichtyologie | WIKIPEDIA | Wiki |
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MEMOIRE Pour l'obtention du Certificat de Capacité en Orthophonie Préparé au sein du Département d'Orthophonie, UFR Santé, Université de Rouen Normandie Élaboration et pré-validation d'un questionnaire parental de dépistage des troubles de l'oralité secondaire chez des ex- prématurés à 8 mois pour une prise en charge orthophonique précoce Présenté et soutenu par Rébecca D'AMORE Mémoire professionnel Mémoire soutenu publiquement le 25 juin 2021 devant le jury composé de Nom, prénom Qualité DM, ou président jury ou membre jury Mme Marie TERRIER Orthophoniste Directrice de mémoire Dr Stéphane RONDEAU Neuropédiatre Mme Marie PLAZIAT-LECROQ Orthophoniste Mémoire dirigé par Marie TERRIER Président du jury de soutenance Membre du jury de soutenance REMERCIEMENTS Tout d'abord, je tiens à adresser de grands remerciements à Marie, qui m'a épaulée et soutenue durant tout ce projet. Vous qui m'avez transmis vos connaissances théoriques et cliniques avec tant de bienveillance. Merci pour vos relectures et conseils si précieux. J'ai hâte de démarrer mon chemin professionnel à vos côtés ! Mes remerciements se tournent à présent vers Dr Stéphane Rondeau, qui me fait l'honneur de présider mon jury de soutenance, ainsi que vers Mme Marie Plaziat-Lecroq, auprès de qui j'ai été formée en stage et qui me fait le plaisir d'être membre de mon jury. À tous les deux, merci pour l'intérêt porté à mon travail. Je remercie également toutes les personnes qui ont permis la mise en place de ce projet : les familles ayant participé à l'étude, les examinatrices qui y ont apporté leur expertise, Mmes Marie Nkouka-Bakher, Caroline Dubois-Levasseur, Sophie Radi, Marie Plaziat-Lecroq, Orlane Duhamel et Aude Charollais. Mais aussi, merci à ma marraine d'études, Hortense, qui m'a encouragée et guidée pour reprendre la suite de son travail. Et pour finir, à Justine, ma binôme et amie, qui, pendant toute l'année, m'a apporté grand soutien et réconfort : merci encore pour ton humour, ta bonne humeur et pour nos échanges tant personnels que professionnels. embelli ma vie d'étudiante. Merci pour tous ces excellents moments inoubliables. pour ton soutien sans faille. À Manon, ma sœur de cœur : merci pour être devenue bien plus qu'une simple amie, Aussi, je remercie mes amies et futures collègues, alias les cœurs qui ont tant À la traductrice en or que tu es, merci Steffy ! À vous, mes parents ; je tiens tout particulièrement à vous remercier pour votre écoute, votre soutien, pour m'avoir toujours motivée et épaulée. Enfin, j'adresse d'immenses remerciements à Guillaume, et à sa famille. Merci d'avoir été mon pilier durant ces études, merci pour tous nos fous rires et heureux moments passés ainsi qu'à venir. Également, merci pour ton aide précieuse dans l'analyse statistique de ce travail et pour tes nombreux conseils avisés. TABLE DES MATIÈRES INTRODUCTION . 1 PARTIE THÉORIQUE . 2 VUE D'ENSEMBLE SUR LA NOTION D'ORALITE . 2 Les oralités, introduction . 2 Oralité alimentaire . 2 Liens entre oralité verbale et oralité alimentaire . 3 Focus sur l'oralité alimentaire primaire . 4 Anatomie et embryogenèse : développement sensori-moteur intra-utérin . 4 Le nouveau-né et l'oralité : coordination succion-déglutition-respiration et réflexes oraux . 7 L'oralité alimentaire secondaire . 9 Définition . 9 Liens avec l'oralité primaire . 9 FOCUS SUR L'ORALITE ALIMENTAIRE SECONDAIRE . 10 Diversification alimentaire : aspects anatomiques et physio-moteurs . 10 Notion d'intégration neurosensorielle . 11 LES TROUBLES DE L'ORALITE ALIMENTAIRE (TOA) . 12 Appellations, définition et étiologies . 12 Facteurs de risque . 13 Focus sur les troubles de l'intégration neurosensorielle . 14 Diagnostic au sein d'un bilan orthophonique . 14 LA PREMATURITE . 16 Définition de l'OMS et données épidémiologiques . 16 Différents degrés de prématurité . 16 Parcours de soins précoce de l'enfant prématuré . 17 Prise en soins en service de néonatalogie . 17 Soins de développement . 17 Conséquences de la prématurité sur le bébé à court et long termes . 19 Prématurité et troubles de l'oralité . 20 Intérêt d'une intervention orthophonique précoce. 22 PROBLEMATIQUE ET HYPOTHESES . 23 PROBLEMATIQUE . 23 HYPOTHESES . 24 PARTIE METHODE ET RESULTATS . 26 METHODE. 26 Population . 26 Inclusion à notre étude . 26 Exclusion . 26 Matériel. 27 Élaboration du questionnaire parental . 27 Procédure . 28 Soumission des questionnaires et remplissage . 28 Création de la base de données . 30 Retour aux parents et proposition de rendez-vous . 30 Passations de bilans orthophoniques . 31 Pré-validation de l'outil . 32 Cohérence interne . 33 Validité d'apparence et de contenu : soumission à un panel d'experts . 33 Sensibilité des items . 34 Validité contre-critère . 34 RESULTATS . 35 Répartition de la population . 35 Cohérence interne . 37 Processus de validité d'apparence et de contenu . 37 Validité d'apparence . 37 Validité de contenu . 38 Sensibilité des items . 38 Sensibilité des items constituant le score global . 38 Sensibilité des items non compris dans le score global . 51 Validité contre-critère . 59 PARTIE DISCUSSION . 61 ANALYSE DES HYPOTHESES DE CETTE ETUDE . 61 Hypothèse 1 : Les premières analyses de validation et de fiabilité sont propices à l'acceptabilité de l'outil. . 61 Sous-hypothèse 1 : Le questionnaire a une bonne corrélation inter-items. 61 Sous-hypothèse 2 : Le questionnaire a une bonne validité d'apparence et de contenu selon les professionnels interrogés, sensibilisés aux TOA. . 61 Sous-hypothèse 3 : Le questionnaire a une bonne sensibilité : il est composé d'items permettant de discriminer les nourrissons avec haut risques de TOA, des nourrissons sans difficulté. . 63 Sous-hypothèse 4 : La cohérence du diagnostic renforce la validité du questionnaire. 67 Hypothèse 2 : La forme d'administration du questionnaire est à ce jour satisfaisante. . 68 CRITIQUES METHODOLOGIQUES . 70 Points d'appui . 70 Points à renforcer et optimisation du questionnaire . 71 EFFETS DE LA PRISE EN SOINS PRECOCE . 72 Apports de cette étude au regard de la précédente . 72 Apports de cette étude pour la pratique orthophonique. 73 CONCLUSION. 76 REFERENCES . 77 ANNEXES . 84 TABLE DES ACRONYMES AG Âge Gestationnel GPE Gastrostomie Percutanée Endoscopique INS Intégration Neuro Sensorielle NE Nutrition Entérale NGAP Nomenclature Générale des Actes Professionnels NP Nutrition Parentérale OMS Organisation Mondiale de la Santé RGO Reflux Gastro-Œsophagien SA Semaines d'Aménorrhée SNG Sonde Naso-Gastrique SOF Stimulations Oro-Faciales SOOF Stimulations Olfactives Oro-Faciales TND Trouble du Neuro-Développement TOA Troubles de l'Oralité Alimentaire TABLES DES FIGURES Figure 1 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, première partie. . 28 Figure 2 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, seconde partie. . 29 Figure 3 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, troisième partie. . 30 Figure 4 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, quatrième partie. . 31 Figure 5 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, cinquième et dernière partie. . 32 Figure 6 : Répartition de la population selon les niveaux de prématurité en pourcentage. . 35 Figure 7 : Répartition de la population selon le sexe. . 35 Figure 8 : Répartition de la population selon le mode de réponse au questionnaire en pourcentage. . 36 Figure 9 : Répartition de la population selon l'âge lors du questionnaire alimentaire en pourcentage. . 36 Figure 10 : Item Rot - répartition en pourcentage par groupe. . 39 Figure 11 : Item Haleine - répartition en pourcentage par groupe. . 39 Figure 12 : Item Toux en position allongée - répartition en pourcentage par groupe. . 40 Figure 13 : Item Stridor - répartition en pourcentage par groupe. . 40 Figure 14 : Item Réflexe nauséeux- répartition en pourcentage par groupe. . 41 Figure 15 : Item Vomissement - répartition en pourcentage par groupe. . 42 Figure 16 : Item Grimace - répartition en pourcentage par groupe. . 42 Figure 17 : Item Douleur / inconfort - répartition en pourcentage par groupe. . 43 Figure 18 : Item Pleur - répartition en pourcentage par groupe. . 44 Figure 19 : Item Toux lors de la prise alimentaire - répartition en pourcentage par groupe. . 44 Figure 20 : Item Refus - répartition en pourcentage par groupe. . 45 Figure 21 : Item Protrusion - répartition en pourcentage par groupe. . 46 Figure 22 : Item Signes de gêne lors des soins du visage - répartition en pourcentage par groupe. . 47 Figure 23 : Item Signes de gêne lors du shampoing - répartition en pourcentage par groupe. . 47 Figure 24 : Item Signes de gêne lors du contact avec certaines textures - répartition en pourcentage par groupe. . 48 Figure 25 : Item Signes de gêne si l'enfant a les mains sales - répartition en pourcentage par groupe. . 49 Figure 26 : Item Inquiétude - répartition en pourcentage par groupe. . 50 Figure 27 : Item Déplaisir - répartition en pourcentage par groupe. . 50 Figure 28 : Item Traitement contre les RGO - répartition en pourcentage par groupe. . 51 Figure 29 : Item Acceptation de la cuiller - répartition en pourcentage par groupe. . 52 Figure 30 : Item Préférence entre pots fait maison et pots industriels - répartition en pourcentage par groupe. . 53 Figure 31 : Item Essai des morceaux - répartition en pourcentage par groupe. . 53 Figure 32 : Item Toucher la nourriture avec les doigts - répartition en pourcentage par groupe. . 54 Figure 33 : Item L'enfant tient sa tête sans osciller - répartition en pourcentage par groupe. . 55 Figure 34 : Item Tenue assise - répartition en pourcentage par groupe. . 55 Figure 35 : Item Préhension manuelle d'objets - répartition en pourcentage par groupe. . 56 Figure 36 : Item Suivi psychomoteur - répartition en pourcentage par groupe. . 56 Figure 37 : Item Durée de la prise alimentaire - répartition en pourcentage par groupe. . 57 Figure 38 : Item Quantité ingérée au biberon - répartition en pourcentage par groupe. . 57 Figure 39 : Item Quantité ingérée à la cuiller - répartition en pourcentage par groupe. . 58 Figure 40 : Comparaison des scores au questionnaire de dépistage et du résultat au bilan orthophonique. . 60 TABLE DES ILLUSTRATIONS Illustration 1 : La bouche, carrefour anatomique du verbe et de l'aliment (Thibault, 2015) . 3 Illustration 2 : Schéma récapitulant les SOF qui peuvent être proposées dans les services néonatalogie (Haddad et al. , 2015). . 18 TABLE DES ANNEXES Annexe 1 - Questionnaire parental de dépistage des TOA secondaires à 8 mois d'âge réel . 84 Annexe 2 - Modèle du mail d'envoi des questionnaires . 86 Annexe 3 - Listing de gestion des envois des questionnaires . 87 Annexe 4 - Tableur : base de données des réponses au questionnaire parental . 88 Annexe 5 - Courrier envoyé aux familles pour proposer les rendez-vous de bilan orthophonique . 89 Annexe 6 - Grille d'observation du développement de l'oralité alimentaire chez un bébé de moins de 18 mois . 90 Annexe 7 - Grille de validité d'apparence et de contenu, soumise à un panel d'experts en TOA . 94 Annexe 8 : Compte-rendu de bilan orthophonique de J. 104 Annexe 9 : Compte-rendu de bilan orthophonique de M. . 109 Annexe 10 : Compte-rendu de bilan orthophonique de R. . 114 Annexe 11 : Compte-rendu de bilan orthophonique de H. . 118 Annexe 12 : Compte-rendu de bilan orthophonique de I. . 122 Annexe 13 : Compte-rendu de bilan orthophonique de L. . 126 Annexe 14 : Compte-rendu de bilan orthophonique de D. . 130 Annexe 15 : Compte-rendu de bilan orthophonique de K. . 132 Annexe 16 : Compte-rendu de bilan orthophonique de Is. . 134 Annexe 17 : Version révisée du questionnaire parental de dépistage des TOA secondaires à 8 mois d'âge réel. . 139 2 INTRODUCTION Ancestralement, plusieurs domaines actuellement précisés dans nos actes professionnels figuraient sous le terme les oralités : articulation, parole, langage, communication, alimentation. C'est depuis la refonte de la nomenclature par l'avenant 16 en avril 2018 que la profession d'orthophoniste a élargi son champ de compétences à l'évaluation et à la prise en soins des Troubles de l'Oralité Alimentaire (TOA). Il n'en est pas moins le résultat de nombreuses années d'intérêt des professionnels sur les difficultés alimentaires des jeunes enfants en lien avec des fragilités sensori-motrices. En effet, les orthophonistes, qui s'occupent et prennent en soin les maux de la sphère oro-faciale se sont interrogés sur les succions contraintes, mais aussi sur les diversifications alimentaires compliquées ou sur le passage aux morceaux impossible chez certains enfants, amenant avec leur réflexion des axes de recherche clinique intéressants. Par ailleurs, les orthophonistes se sont aussi penchés sur la question de l'oralité alimentaire chez l'adulte, et notamment chez la personne âgée. Effectivement, les âges extrêmes de la vie questionnent et suscitent l'intérêt comme leur vulnérabilité qui en découle. C'est pourquoi mêler l'oralité alimentaire à la question de la prématurité fut un sujet de recherche fréquemment traité ces vingt dernières années, et notamment parce que c'est une population qui fréquente largement les consultations orthophoniques. De par les recherches, les bébés prématurés ayant des TOA aussi appelés maintenant troubles alimentaires pédiatriques (Goday et al. , 2019) sont mieux analysés dans leur dynamique globale, diagnostiqués et pris en soins. En effet, dans les services, les équipes paramédicales pluridisciplinaires orchestrées par des médecins se sont attelées à améliorer la qualité de vie des enfants nés trop tôt en agissant notamment sur le plaisir oral tout en préservant les apports caloriques par voie entérale par exemple. Pour autant, la prise en soins orthophoniques demeure le plus souvent trop tardive. Ainsi, intégrer le dépistage précoce de TOA au parcours de soins parat primordial pour un meilleur suivi par la suite. 1 PARTIE THÉORIQUE VUE D'ENSEMBLE SUR LA NOTION D'ORALITE Les oralités, introduction La définition étymologique d'oralité, qui se fait par la bouche , est liée à la définition psychanalytique du terme, en lien avec le stade oral décrit par Freud. Ce stade est le premier du développement selon l'auteur autrichien qui attribue au stade oral le fait que le bébé apprivoise le monde par la bouche et qu'il prenne du plaisir en s'alimentant et en découvrant sa cavité buccale. Cette notion issue de la psychanalyse a bien évolué et a laissé place à de nouveaux usages du mot. Aujourd'hui, l'oralité est définie, comme étant le Caractère oral de la parole, d'un discours, d'un fait littéraire, etc. , ou encore le Caractère d'une civilisation qui s'exprime par la seule tradition orale. , et l' Ensemble des caractéristiques du stade oral. (Oralité, s. d. ). Ce terme est notamment employé par les orthophonistes, médecins généralistes et pédiatres pour décrire les fonctions attribuées à la bouche. L'oralité est donc multiple : elle regroupe les vocalises, cris, le langage d'une manière plus générale via la parole, mais aussi l'alimentation, la déglutition, la succion, la respiration etc. (Brin-Henry et al. , 2018). Toutes ces fonctions ont été scindées en deux notions que sont l'oralité alimentaire et l'oralité verbale. Oralité alimentaire L'oralité alimentaire se divise elle-même en deux temps : l'oralité primaire, réflexe et l'oralité secondaire, corticale. L'oralité primaire, qui débute in utero, et qui se poursuit jusqu'aux 4 à 6 mois du nourrisson, est une oralité involontaire, automatique, réflexe, régie par le tronc cérébral. Aucune praxie volontaire n'est mise en jeu à ce stade développemental. Alors que l'oralité secondaire, elle, engage des processus neurologiques volontaires, non automatiques. Une commande motrice est nécessaire, ordonnée par le cortex frontal moteur ainsi que par le faisceau cortico-géniculé. 2 Certains admettent que l'oralité alimentaire est rythmée en trois temps et s'accordent à dire qu'une oralité tertiaire débute entre 30 et 36 mois chez le jeune enfant. Celle-ci est définie comme étant une oralité empreinte de cognitions et de représentations de l'alimentation. L'oralité tertiaire ou oralité cognitive envisage que ce ne sont plus seulement les expériences sensori-motrices ou l'étayage parental qui sculptent le plaisir de manger. En effet, s'y ajoutent les représentations mentales construites autour de l'alimentation, sous-tendues par une cognition plus élaborée (Levavasseur, 2017). Liens entre oralité verbale et oralité alimentaire Selon C. Thibault l'oralité est fondatrice de l'être . Comme ci-précédemment vu dans la définition, l'oralité comprend une notion importante qui est celle du langage oral. L'oralité alimentaire et l'oralité verbale se développent simultanément : la cavité buccale se partage donc, entre autres, les fonctions de communiquer et de se nourrir, ce que C. Thibault décrit dans son schéma la bouche, carrefour anatomique du verbe et de l'aliment (Thibault, 2015). Illustration 1 : La bouche, carrefour anatomique du verbe et de l'aliment (Thibault, 2015) Des liens intrinsèques entre oralité alimentaire et langage sont établis dans la littérature : l'oralité verbale et l'oralité alimentaire utilisent les mêmes voies anatomiques, mais le sens est inversé. En effet, l'oralité alimentaire emprunte le chemin de la bouche à l'intestin en passant par le pharynx alors que l'oralité verbale suit ce chemin : d'abord depuis le poumon en passant par le larynx puis le pharynx pour arriver dans la bouche (Couly, 2017). Si les 3 oralités utilisent des structures anatomiques semblables, elles activent également des réseaux de neurones situés dans la même zone cérébrale et précisément au niveau du cortex moteur frontal (Couly, 2020). De surcrot, des relations ont été établies entre le besoin primaire de manger (ce qui est décrit alors dans l'oralité primaire et cette notion de réflexe) et celui, tout aussi instinctif, de communiquer verbalement. Après l'oralité réflexe, l'oralité alimentaire secondaire, elle cortiquée (mouvements praxiques volontaires), se développe parallèlement au langage verbal articulé. Les expériences sensori-motrices vécues chez le tout petit lors de l'alimentation façonnent la construction de l'oralité verbale. De plus, des aspects interactifs sont communs à l'alimentation et à la communication verbale : la proxémique (positionnement face à face), le regard, la gestualité, les productions vocales et verbales (Puch et al. , 2004). Pour finir, alimentation et langage sont deux champs de compétence appartenant à la pratique orthophonique. Ainsi, l'orthophoniste se doit, lorsqu'il reçoit une plainte pour l'un ou pour l'autre, d'investiguer systématiquement les deux. Focus sur l'oralité alimentaire primaire Anatomie et embryogenèse : développement sensori-moteur intra-utérin L'oralité primaire ou oralité réflexe se développe dès la vie intra-utérine, c'est l'oralité fœtale. Initialement, la face est formée d'une cavité primitive bucconasale. Puis, la bouche commence à se former en tant qu'entité propre pendant le 2ème mois de gestation : elle est à l'état de stomadum, espace hypersensoriel. Effectivement, le stomadum détient de nombreux récepteurs sensoriels aux nerfs crâniens V, VII bis et IX, qui régissent la transmission de signaux jusqu'au tronc cérébral. Il est établi que le tronc cérébral joue un rôle déterminant dans l'oralité primaire (Abadie et al. , 1999). En parallèle du développement buccal, on voit apparatre le réflexe de Hooker, vers la 10ème semaine : l'embryon, en explorant ses mains, va les porter à la bouche, ce qui va entrainer l'ouverture réflexe de celle-ci ainsi qu'une protrusion linguale, automatique également. L'activité branchio-motrice fœtale précoce amène la formation du voile du palais et permet à la langue de s'horizontaliser. C'est aussi le 4 moment de la succion réflexe : les cellules neuronales de la substance réticulée bulbo- pontique reçoivent des signaux et émettent en réponse des efférences motrices de succion. Ici, les nerfs VII (pour la motricité des lèvres), XII (celle de la langue) et IX (celle du voile palatin) sont engagés. Donc, dès le 3ème mois de gestation, la sensori-motricité est en place (Couly, 2017). La succion précède le phénomène de déglutition : ces deux fonctions sont contrôlées par des arcs réflexes qui sont liés. Effectivement, la déglutition résulte également de l'action d'une zone bulbaire. De fait, dès la 11ème semaine embryonnaire, les premières déglutitions fœtales (exclusivement du liquide amniotique) apparaissent. Également, dès la 12ème semaine de gestation les mouvements de déglutition et de succion seront efficaces, fonctionnels et une coordination de l'enchainement des deux sera observable (Senez, 2015). Ainsi, à ce moment précis, le fœtus déglutit fréquemment du liquide amniotique, soit environ 0, 5 litres sur une durée de 24 heures (Couly, 2017). Comme le précise Couly, la déglutition, fonction très archaïque, a un rôle morphogénétique : déglutir induit que la langue fait des mouvements de propulsion et de rétropulsion, nécessaires pour la construction mandibulaire. Un défaut de ces mouvements fœtaux automatiques pourrait entrainer des malformations morphologiques (rétrognathie ou prognathie). Entre la 22ème et 24ème SA, une rétrognathie peut être observable grâce à une échographie de profil, ce qui signerait des séquences succions-déglutitions pauvres et donc une oralité défectueuse. Cette recherche est faite lors de la seconde échographie obligatoire pour le suivi de grossesse, nommée échographie morphologique , afin de mener à bien les investigations anténatales d'éventuelles pathologies (comme la séquence de Pierre Robin, par exemple). En parallèle du développement de la motricité involontaire impliquée dans l'oralité d'ingestion primaire, la sensorialité se façonne et s'étoffe également précocement et ce, dès la vie fœtale. De fait, les systèmes sensoriels, multiples, se développent en plusieurs étapes successives étayées par les interactions du bébé et de son environnement. Les systèmes somesthésique et vestibulaire sont stimulés fréquemment pendant toute la durée de la grossesse. En effet, les stimulations tactiles, somesthésiques sont précoces : dès le commencement et jusqu'à la naissance le bébé sera en contact permanent avec le liquide amniotique qui l'entoure, ainsi qu'avec l'enveloppe utérine, mais il touche également ses mains, ses pieds Les récepteurs sensoriels buccaux ont été observés chez les bébés dès le 5 second mois de gestation (vers 7-8 SA), puis, dès la 11ème semaine, il y en aura sur les mains et pieds. Ils apparaitront sur jambes et bras dès la 15ème semaine de gestation. Les sollicitations vestibulaires demeurent riches et sont rythmées par tous les mouvements de la mère, mais également ceux du bébé (Lecanuet et al. , 1996). Pour ce qui est de la nociception, la littérature n'est pas au clair sur les réponses à des stimuli nociceptifs : une étude a mis en avant un changement du rythme cardiaque lors d'un prélèvement de sang au niveau du cuir chevelu (Clark, et al. , 1982). Le système chimiosensoriel, comprenant l'odorat et le goût, se développe de manière extrêmement précoce dès 12 SA, période à laquelle les papilles gustatives se forment. Elles seront matures à 13 SA. La stimulation chimique principale est portée par le LA, qui transporte les parfums et goûts des aliments mangés par la mère, avalé fréquemment par le bébé. Il y a une transmission précoce des informations chimiosensorielles de la mère au fœtus : les nourrissons préfèreront les odeurs des aliments ingérés par leur mère pendant la grossesse (Schaal, 2000). A noter que le système olfactif, indissociable de celui du goût, étale son développement de la 1ère à la 20ème semaine de gestation. L'audition, elle, commence son développement durant le dernier trimestre de la grossesse. L'ouïe n'est pas mature à la naissance, elle continue de se développer jusqu'aux 2 ans de l'enfant, au moins. Les études électro-physiologiques ont démontré une précocité de la transmission du signal sonore via les voies auditives dans le tronc cérébral. Entre 24 et 26 semaines d'âge gestationnel, il est admis que la cochlée est fonctionnelle. A partir de 30 semaines AG, ont été observées des réactions motrices et cardiaques aux bruits. Ces réponses se spécifient en fin de grossesse (entre 36 et 38 semaines d'AG) : elles diffèrent selon l'intensité, la fréquence de la stimulation. Également, différentes études ont prouvé que le fœtus pouvait discriminer deux fréquences, deux notes de musique et deux voix contrastées et qu'il peut traiter les différences de spectres. Toutefois, les objets d'étude s'axent préférentiellement sur les réponses à des stimulations auditives maternelles (Granier-Deferre et al. , 2011). En parallèle, les perceptions visuelles se développent, bien que les stimulations visuelles soient limitées in utero. Les vésicules optiques, prémices de la rétine, sont observables vers 30 jours de gestation et celle-ci se développe jusqu'au 4ème mois. Le processus de maturation de l'œil continue jusqu'en post-natal. Peu d'études ont mis en exergue des réponses de la part du fœtus à des stimuli visuels : une agitation motrice serait observable après une exposition de vingt minutes à de la lumière. 6 Il est évident que les recherches scientifiques ont essayé au maxima de décrire les systèmes sensoriels un à un pour comprendre au mieux leur développement et fonctionnement. Néanmoins, il est primordial de considérer une interaction de tous ces sens qui fonctionnent et qui sont activés simultanément : le bébé reçoit des stimuli traités alors par plusieurs sens. La multimodalité, soit le traitement d'une stimulation de manière plurisensorielle, est déjà intégrée chez le bébé, dès l'état fœtal. La multisensorialité est une notion phare de la pratique orthophonique notamment : la multiplication des canaux d'entrée rend les stimuli porteurs de sens, fréquents et cohérents, ce qui améliore les comportements. Le fœtus entraine donc, dès le commencement de la gestation, tous ses sens ainsi que la séquence réflexe et involontaire qu'est l'enchanement succion-déglutition pour que celle-ci soit prête à la naissance afin d'envisager la succion nutritive au sein ou au biberon. Si la séquence succion-déglutition était auparavant suffisante, arrive vers 30 SA une troisième fonction qui se coordonne aux deux autres. En effet, la séquence, agrandie, devient un enchanement praxique volontaire : succion-déglutition-respiration, indispensable pour la succion nutritive du nouveau-né. La motricité intra-fœtale se développe donc jusqu'à la fin de la gestation. Ainsi, un bébé qui natrait avant cette période charnière n'aurait pas acquis cette compétence et aurait besoin d'une nutrition entérale afin de pallier les difficultés. Le nouveau-né et l'oralité : coordination succion-déglutition-respiration et réflexes oraux L'oralité alimentaire primaire, qui commence son développement in utero, se poursuit donc dans la vie extra-utérine. Pendant la période de gestation, les succions pré-natales, comme vu ci-précédemment, ont plusieurs rôles comme le développement maxillo-facial, l'alimentation, les découvertes sensorielles notamment gustatives (lors de déglutition du LA). Chez le nouveau-né, il y a présence du réflexe de succion, qui détient toujours les mêmes fonctions auxquelles s'ajoutent un rôle social et une dimension d'attachement (lien mère-enfant), puisqu'en effet, les tétées, moments de succion nutritive, sont propices à un rapprochement, à des contacts visuels et à une communication entre les deux êtres qui se découvrent peu à peu. Le réflexe de succion est déclenché dès qu'un doigt ou une tétine est introduit dans la bouche. Toutefois, sont distinguées : la succion nutritive et la succion non-nutritive. La succion à visée nutritive s'inscrit dans une séquence en trois temps, présente dès les dernières semaines de gestation : 7 la coordination succion-déglutition-respiration. Ainsi, lorsqu'il a faim, le nouveau-né place sa bouche sur le mamelon ou sur la tétine, selon le mode d'alimentation choisi, et mobilise des schèmes moteurs oro-faciaux extrêmement fins : il met sa langue en forme de gouttière et fait de nombreux mouvements mandibulaires en alternant ouverture et fermeture verticale. Quand ces mouvements rythmés, ou encore bursts , qui caractérisent la succion nutritive, sont terminés, le lait sort du biberon ou du sein. C'est alors que démarre la phase orale de la déglutition : lait en bouche, le nourrisson va propulser ce bolus en arrière de la bouche. Le bol alimentaire poursuit alors son trajet vers l'oropharynx. C'est à ce moment précis que le temps pharyngien débute et que la ventilation s'arrête : ce moment d'apnée caractérisé par l'inhibition des voies respiratoires avec l'ouverture du sphincter supérieur de l'œsophage demeure succinct puisque la séquence s'enchane très rapidement. Le lait continue son trajet et la respiration reprend lorsqu'il arrive dans l'œsophage (temps œsophagien de la déglutition) (Senez, 2015). La succion non-nutritive, à l'instar de la succion nutritive, se déroule en rafales, ponctuées de périodes de pauses ou de repos . En revanche, les deux mécanismes diffèrent en ce sens que les temps de rafales sont plus rapides lors de la succion non nutritive (Lecanuet, 2002). Cette dernière est réflexe et est observée préférentiellement en fin de repas : au fur et à mesure, apportant apaisement, réconfort, sécurité, protection, elle devient volontaire. En plus du réflexe de succion, le nouveau-né présente d'autres réflexes oraux à la naissance comme celui des points cardinaux : en réponse à un stimulus tactile sur la joue ou sur la commissure labiale, le nourrisson tourne sa tête du côté de ce stimulus en émettant un rictus. Il va de pair avec le réflexe de fouissement, indispensable pour que le bébé trouve le sein afin de se nourrir : en réponse à une stimulation tactile, le nourrisson oriente sa bouche vers la source nourricière. L'automatisme d'orientation de la langue se base sur le même principe que le réflexe précédent : si un des deux côtés des bords de la langue proche de l'apex est stimulé, alors la langue s'oriente vers cet endroit. Deux autres réflexes de défense ont été décrits : le réflexe de toux, qui consiste à expectorer afin de dégager les voies aériennes supérieures menacées par un corps étranger ainsi que le réflexe nauséeux physiologique, en réponse à une irritation gustative, tactile ou olfactive qui peut être conditionnée par des stimuli visuels ou psychiques. Ces automatismes oraux réflexes sont archaïques, primitifs et s'inscrivent au sein de d'autres réflexes de base comme le réflexe de Moro, ou la marche automatique du nouveau-né, par 8 exemple. Ils rendent compte d'une maturation cérébrale en indiquant que le système nerveux est fonctionnel. Au fur et à mesure que le nourrisson grandit, les mouvements deviennent volontaires, à l'instar de l'oralité primaire qui évolue pour laisser place à une oralité alimentaire secondaire, sous-tendue par une commande volontaire et non plus réflexe. L'oralité alimentaire secondaire Définition L'oralité secondaire succède à l'oralité primaire : elle démarre lors de l'ajout de l'alimentation orale solide via la cuiller le plus souvent, en complément du lait. Les réflexes archaïques disparaissent progressivement, à l'exception du réflexe de toux dont les voies cérébrales ne se corticalisent pas puisqu'il demeure un réflexe de défense tout au long de la vie. Ainsi, progressivement, le nourrisson acquiert des schèmes praxiques volontaires contrôlés par le cortex frontal moteur. Le passage de la succion-déglutition réflexe à une alimentation engageant une mastication volontaire est rythmée par de nombreux changements. Effectivement, arrivent des stimuli sensoriels nouveaux comme la couleur de l'aliment, sa texture, sa consistance, son goût, sa température, conjugués à l'utilisation inédite de la cuiller, outil qui apporte lui aussi de nouvelles sensations somesthésiques. Également, le nouvel outil que l'on propose aux bébés pour les nourrir demande une adaptation de leur part, notamment dans les patterns bucco-moteurs engagés pour l'utiliser : les praxies utilisées pour manger à la cuiller diffèrent des schémas moteurs de succion réflexe. Cette adaptation demeure longue car, les praxies masticatoires ne seront matures qu'entre 4 et 6 ans. Liens avec l'oralité primaire L'oralité secondaire coexiste avec l'oralité primaire : le bébé pour qui la diversification alimentaire a démarré, demeure alimenté par du lait (au biberon ou au sein). Ainsi, durant cette période, et donc avant le retrait du lait (en poudre ou maternel), le bébé alterne entre la succion-déglutition réflexe et la déglutition volontaire. Cette double stratégie laissera place entière à la praxie de déglutition ensuite, qui s'accompagnera de mouvements masticatoires. 9 La littérature recense quelques études qui se sont intéressées à la corrélation entre la qualité de l'oralité primaire et celle de l'oralité secondaire. Par exemple, une équipe finlandaise a observé l'évolution des schèmes moteurs chez des bébés prématurés entre succion et alimentation solide. Les résultats de cette étude montrent que les schémas de succion précoce n'étaient pas prédictifs du développement ultérieur de l'alimentation sur le plan moteur, bien que certains sujets de la cohorte présentaient des difficultés sensorielles à certaines textures (Trl, et al. , 2012). Pour autant, cette présente recherche demeure biaisée puisqu'elle n'a pas eu recours à des outils fiables de diagnostic. Une autre étude, plus récente, menée par une équipe allemande, a également mis en exergue que les schémas de succion ne sont pas prédictifs du développement ultérieur de l'alimentation chez les nouveau-nés prématurés en bonne santé. En effet, après avoir évalué les schémas de succion à 34, 37 et 44 semaines d'âges post-menstruel, l'alimentation à la cuiller à 6, 9 et 12 mois d'âge post-menstruel et la mastication à 9, 12 et 24 mois d'âge post-menstruel, tous les sujets de l'étude n'ont pas démontré une progression stable de leurs habiletés motrices orales. La qualité des habitudes de succion n'était pas associée à la réalisation du niveau de compétence de l'alimentation assistée à la cuillère ou à la mastication (Hbl et al. , 2020). Si aujourd'hui ce sujet intéresse de plus en plus les équipes de recherche, les études restent peu puissantes de par la taille des échantillons, offrent uniquement des tendances et non des résultats totalement fiables. Le seul élément qui demeure une certitude reste les changements de schèmes sensori-moteurs entranés par l'oralité secondaire par rapport à la succion exclusive. FOCUS SUR L'ORALITE ALIMENTAIRE SECONDAIRE Diversification alimentaire : aspects anatomiques et physio-moteurs Si la période optimale d'introduction d'aliments non lactés n'a pas toujours fait consensus, certaines recommandations s'offrent tout de même aux parents concernés. Ainsi, selon l'OMS, au-delà des 6 mois de vie de l'enfant, le lait adapté au nourrisson, qu'il soit maternel ou déshydraté, n'a plus les propriétés suffisantes pour répondre aux besoins nutritionnels du la Santé, 2020). De fait, à cette période jeune enfant (Organisation Mondiale de développementale clé, on ajoute au lait une alimentation de complément. Ainsi, vient le 10 passage de l'oralité primaire (succion) à l'oralité secondaire (mouvements masticatoires), aussi appelée diversification alimentaire, qui débute autour des 4 mois de vie révolus d'un nourrisson, selon les recommandations françaises (Ameli, 2019a). Il est donc admis qu'entre 4 et 6 mois, les oralités primaires et secondaires commencent à coexister et ces deux stratégies perdureront jusqu'aux deux ans de l'enfant en moyenne dans nos sociétés occidentales pour ne laisser place par la suite qu'à une alimentation principalement solide (Thibault, 2017). La diversification alimentaire constitue un élément phare en matière d'oralité puisqu'elle met en jeu de multiples changements procéduraux pour se nourrir en demeurant une étape d'adaptation physio-motrice, sensorielle et psychologique importante : des schèmes moteurs différents sont mis en jeu, la posture corporelle diffère, l'outil introduit en bouche se distingue du biberon ou du mamelon, arrive la découverte de textures et de goûts différents, l'aspect social est modifié puisque l'aidant se présente désormais face au bébé et la cuiller unit les deux protagonistes des repas Au début de la diversification alimentaire, les enfants n'abandonnent pas de suite la succion : les aliments solides sont tétés, tout en gardant la même procédure pour la déglutition (Abadie et al. , 1999). Puis, les schèmes praxiques conscients de la mastication se mettront doucement en place à la fin de la première année de vie du nourrisson. Afin de mener à bien les séquences de mouvements requises lors du passage à la cuiller, les cortex visuel et frontal doivent être matures : la coordination oculo-motrice est requise, ce qui est facilité par l'installation assise permise grâce à un tonus axial et une tenue de la tête correcte, vers 4 mois et demi d'âge développemental. S'ensuit naturellement l'éruption des dents temporaires, communément appelées dents de lait , aux alentours de 6 à 7 mois. Jusqu'aux 3 ans de l'enfant, la denture déciduale s'installe chez l'enfant qui pourra alors mastiquer plus aisément les aliments en morceaux. Notion d'intégration neurosensorielle Le paragraphe précédent énumère les nombreuses adaptations de l'enfant lors du passage à la nourriture solide. Néanmoins, focalisons-nous sur la sensorialité et plus particulièrement sur le concept récent d'intégration neurosensorielle. Décrite dans un premier temps à la fin du siècle dernier par A. J. Ayres, ergothérapeute, l'intégration sensorielle fait référence à une modulation graduelle, adaptative des 11 comportements générés par des stimulations sensorielles (McIntosh et al. , 1999). En somme, l'humain est face à un processus cognitif complexe d'ajustements qui sont physiologiques et comportementaux en réponse à des sensations : les systèmes sympathique (gestion de la réaction de fuite entre autres) et parasympathique (gestion du retour au calme après une émotion vive) y sont engagés. L'intégration sensorielle comprend la coordination et le traitement de toutes les informations sensorielles importantes de l'événement, puis l'ajustement du comportement en fonction de ce traitement. Notons que les réactions aux stimulations sensorielles sont omniprésentes et multimodales dans le quotidien d'un enfant, et même dans celui d'un adulte. Certains auteurs s'accordent à dire qu'aux 5 sens connus de tous, à savoir l'ouïe, l'odorat, la vue, le toucher (ici appelé somesthésie) et le goût, s'additionnent le sens vestibulaire, la proprioception, la nociception, le sens vibratoire, la thermoception Le passage à la cuiller est intrinsèquement lié à ces concepts d'intégration et de modulation neurosensorielle. Effectivement, si manger est une situation multisensorielle dès le début de la vie, la multimodalité se majore lors de la diversification alimentaire : le lait avait sensiblement un goût et une température identique, ce qui n'est plus le cas des purées par exemple. Davantage de stimuli à traiter en une bouchée, s'accompagnant d'un nouvel outil qui amène avec lui de nouvel propriétés somesthésiques, motrices (bouche qui se positionne différemment, préhension qui se distingue de celle du biberon) mais aussi d'une nouvelle installation (aidant désormais face à l'enfant, position assise). Il parat donc évident qu'une sensorialité troublée va engendrer des difficultés lors de la phase orale de l'alimentation. LES TROUBLES DE L'ORALITE ALIMENTAIRE (TOA) Appellations, définition et étiologies La littérature scientifique à ce propos relate plusieurs termes à ce que l'on appellera ici TOA. Si C. Senez parle d'aversions alimentaires d'origine sensorielle (Senez, 2015) et que d'autres auteurs évoquent une dysoralité sensorielle comme étant un trouble du comportement alimentaire (Thibault, 2017), tous mettent en exergue l'aspect d'une sensorialité fragilisée. Si C. Thibault évoque que les troubles du comportement alimentaire 12 sont secondaires à une pathologie digestive ou à une pathologie extradigestive ou encore à des anomalies congénitales ou acquises de la déglutition, il est à bannir l'idée que les TOA n'existent qu'à la suite de causes organiques. En effet, le TOA peut être défini comme étant une difficulté d'alimentation per os pouvant être entrainée par des facteurs organiques cités ci-avant mais aussi par des causes (Thibault, 2017) : - neurologiques (encéphalopathies, dans le cadre d'un polyhandicap), - psycho-comportementales, - post-traumatiques (privation de stimulations oro-faciales -SOF- entrainée par la prématurité, la réanimation, les pathologies du tube digestif amenant l'obligation d'une alimentation par voie entérale ou parentérale), sensorielles (troubles de l'intégration neurosensorielle que nous avons déjà évoqués). Facteurs de risque - Cliniquement, sont retrouvés bon nombre de signes cliniques communs chez les patients présentant des TOA. Cependant, la littérature scientifique reste peu conséquente à ce propos : peu d'études mettant en avant des critères de vulnérabilité (Couillien, 2019) existent. C'est pourquoi, force est de constater que nous nous basons sur l'expérience clinique des orthophonistes et autres professionnels amenés à soigner ou prendre en charge des patients ayant des TOA. Ainsi, si l'on se focalise sur les critères de vulnérabilité ayant été significatifs dans cette étude, nous pouvons déjà évoquer (Couillien, 2019) : - - le RGO, défini comme étant la remontée d'une partie ou de l'entièreté du contenu gastrique par l'œsophage en passant par le cardia (Ameli, 2020) causant alors des brûlures qui peuvent fortement gêner le bébé pour manger, pouvant entrainer des régurgitations acides, des éructations fréquentes, un hoquet, une toux pouvant être accentuée par la position allongée o le liquide remontera davantage. Le RGO touche environ 8% des enfants et demeure très fréquent chez les adultes (entre 20 à 40%) (Molkhou, 2005). Ainsi, le RGO est un des premiers éléments recherchés (à objectiver, ou à écarter) lors de l'examen clinique de l'orthophoniste, les douleurs provoquées pouvant contraindre fortement l'alimentation orale. les soins envahissants la sphère oro-faciale, comme la présence d'une SNG par exemple, 13 - - les troubles de la déglutition la présence de troubles sensoriels chez l'un des parents. Cette étude avait rejeté la prématurité comme étant un facteur de risque à la dysoralité sensorielle mais celle-ci entrainant, de fait, un passage dans un service de néonatalogie et donc, pour la plupart, des soins envahissants, on retiendra qu'il faut tout de même interroger sur le terme de la naissance et en tenir compte. Focus sur les troubles de l'intégration neurosensorielle Le TOA se distingue d'autres troubles du comportement alimentaire à l'instar de la néophobie alimentaire, physiologique, ou de l'anorexie, pouvant être psychogène, post-traumatique ou autre, par son étiologie d'origine en partie sensorielle. En effet, comme énoncé auparavant, le mécanisme d'intégration neurosensorielle se trouve au cœur de l'oralité alimentaire. C'est le processus d'habituation qui est lié à cette intégration neurosensorielle et qui, donc, peut être défaillant. En effet, on peut observer chez certains enfants des sur-réactions à certaines stimulations sensorielles provoquant des réponses trop vives émotionnellement et donc inadaptées ; c'est l'hypersensibilité. A l'inverse, on objectivera une hyposensibilité lorsque la réaction comportementale à un stimulus sensoriel est absente ou présente selon un seuil d'activation très élevé. Diagnostic au sein d'un bilan orthophonique Depuis avril 2018, la NGAP prévoit le diagnostic et la prise en soins des troubles de l'oralité au sein du champ de compétences des orthophonistes. C'est donc de leur devoir d'évaluer et de rééduquer ces dysfonctionnements. Bien que la recherche sur ce pan du travail de l'orthophoniste ne demeure que peu élargie, il est d'ores et déjà possible d'élaborer un protocole de bilan pour évaluer et examiner les jeunes enfants afin d'objectiver le TOA. Pour débuter, comme dans tout bilan orthophonique, se déroule l'entretien anamnestique. A la recherche de signes cliniques précis, que l'on retrouvera notamment dans le questionnaire parental, pour repérer un éventuel RGO, des antécédents familiaux, des antécédents médicaux ou chirurgicaux ayant pu affecter la zone oro-faciale, d'éventuels marqueurs de 14 dysfonctionnements sensori-moteurs etc. , l'orthophoniste interview les parents, et l'enfant quand il peut répondre. Également, dans les éléments recherchés par le praticien en quête de comprendre le profil du patient, on pensera à d'autres facteurs prédisposant comme un réflexe hypernauséeux, un déplaisir notable pour l'enfant à manger, des quantités ingérées réduites, des refus ostentatoires (cris, gestes, grimaces). Le thérapeute retracera l'histoire de la maladie, mais aussi le développement précoce du patient depuis sa naissance et même avant celle-ci : des interrogations sur la grossesse, l'accouchement, les suites de couches, les premiers apprentissages (marche, langage, propreté) seront soumises aux parents. De plus, on s'attachera à revenir sur l'alimentation dès la naissance : comment se déroulait-elle ? comment l'enfant était-il nourri ? . A noter tout de même que l'orthophoniste reçoit une famille (patient, parents) dans le cadre de ces difficultés lors de l'alimentation mais n'omet pas d'investiguer les aspects langagiers (oralité verbale) et communicatifs, intrinsèquement liés à l'oralité alimentaire comme vu précédemment. L'intégralité de ces données récoltées et de l'observation active de l'orthophoniste qui a déjà pu repérer l'étayage parental, le comportement du patient, l'aspect externe de sa face (respiration, déglutition, schèmes praxiques de la parole, morphologie faciale et notamment mandibulaire avec le repérage d'une prognathie ou d'une rétrognathie) va guider l'examen clinique qui suivra l'anamnèse. Effectivement, à défaut de posséder un protocole normé pour détecter les TOA, l'orthophoniste va procéder à un examen clinique et fonctionnel dans le but de rechercher une gêne organique dans un premier temps : observation de la zone oro-faciale de l'enfant (en externe, puis en interne) afin de qualifier les aspects anatomiques des organes buccaux et supra-laryngés (voile du palais, amygdales). L'examen se poursuit avec l'évaluation de la motricité et de la sensorialité du patient : d'un point de vue général, on propose des activités manuelles au patient, mais également de toucher des textures etc. et d'un point de vue plus spécifique à l'oralité alimentaire, on procède à des essais alimentaires. A cette étape, l'orthophoniste recherche des indicateurs de fragilité motrice : schèmes masticatoires, déglutition efficace et des indicateurs de fragilité sensorielle avec un repérage d'hyper ou d'hypo sensibilité, de réflexe hypernauséeux, de refus ou de gêne Le bilan d'oralité doit également explorer l'étayage parental, ce qu'E. Levavasseur appelle pilier environnemental (Levavasseur, 2017). En effet, il demeure primordial de saisir les comportements familiaux et de comprendre la dynamique familiale car on sait que les 15 difficultés alimentaires vont causer de grandes tensions intra-familiales. Ainsi, le bilan est déjà la première étape de prise en soins des TOA puisque à l'issue de celui-ci, l'orthophoniste se doit d'expliquer aux parents comment aider leur enfant, le développement de l'alimentation, les fragilités sensori-motrices éventuelles et les points d'appui, mais également de réorienter vers des professionnels concernés si la cause organique nécessite une prise en charge annexe. LA PREMATURITE Définition de l'OMS et données épidémiologiques Une naissance est communément dite prématurée lorsque le bébé nait vivant avant 37 SA, sachant que le terme d'une gestation humaine se situe à 41 SA (Organisation Mondiale de la Santé, 2018). Chaque année naissent prématurément environ 15 millions de bébés selon l'OMS, soit l'équivalent d'1 naissance sur 10. Ce nombre ne cesse de crotre année après année, ce qui représente environ 5 à 7% des naissances en Europe selon une étude de 2002 (Goldenberg, 2002). Notons par ailleurs qu'en 2015 la prématurité causait environ 1 million de décès par an (Ameli. fr, 2020). Selon des données épidémiologiques récentes, des facteurs de risque à la naissance prématurée ont été objectivés tels qu'un antécédent de naissance prématurée, une grossesse tardive tout comme être une jeune maman, être célibataire ou ne pas vivre avec son conjoint, avoir été peu scolarisé ou appartenir à un faible niveau socio-économique, le surpoids, le stress, être fumeur, entre autres (Wen et al. , 2004). Sont également mis en avant comme facteur de risque à une mortalité ou morbidité néonatale suivant une naissance prématurée : la grossesse gémellaire, la pré-éclampsie, le petit poids à la naissance, la rupture prématurée des membranes Les causes les plus généralement retrouvées sont donc : les grossesses plurielles, les anomalies anatomiques de l'utérus ou du placenta, les infections génitales et urinaires, mais aussi la grippe par exemple (Ameli. fr, 2019). Cette source ajoute d'autres causes, moins fréquentes, telles que le diabète gestationnel ou l'hypertension artérielle gravidique infections générales comme les Différents degrés de prématurité 16 Sont admises trois sous-catégories de prématurité (Organisation Mondiale de la Santé, 2018) : la prématurité extrême (< 28 SA) ; la grande prématurité (entre 28 et 32 SA) ; la prématurité moyenne, voire tardive (entre 32 et 37 SA). A noter, qu'en France, la limite de viabilité est de 22 SA. En termes de poids la limite est à 500 grammes. Parcours de soins précoce de l'enfant prématuré Prise en soins en service de néonatalogie Lorsqu'a lieu une naissance prématurée, la prise en soins du bébé se poursuit en service de néonatalogie. Ce service spécialisé dans le suivi des nouveau-nés prématurés, entre autres, n'existe que dans les maternités de niveau II et de niveau III. A savoir que les bébés nés avant 32 SA ne seront pris en charge que dans les maternités de niveau III. L'unité de néonatalogie est composée d'une équipe compétente et habiletée à dispenser les soins particuliers que nécessitent les nouveau-nés prématurés : pédiatres, infirmières puéricultrices et auxiliaires de puériculture prennent donc soin de ces bébés très vulnérables qui sont alors généralement placés en couveuse (Mpedia, 2016). La fragilité de l'enfant né prématurément entraine de nombreuses complications. Ainsi, les soins dispensés sont multiples : aide matérielle pour délivrer de l'oxygène comme aide à la respiration (intubation, lunettes à oxygène, masque sur le nez), une nutrition entérale (NE) ou parentérale (NP) afin de pallier les carences nutritives et la perte de poids, un placement en couveuse pour obtenir une température corporelle assez chaude mais également pour que le bébé se développe dans un environnement aseptisé afin d'amoindrir les risques d'infections. Également sont pratiqués des examens médicaux : échographie, électroencéphalogramme, examen clinique du pédiatre etc. afin d'observer l'évolution du développement du tout petit (Mpedia, 2019). Soins de développement Ayant pour but d'accompagner le développement pondéral, cognitif et psychomoteur, les services de néonatalogie ont eu à cœur d'intégrer des protocoles particuliers dont la maxime est d'accompagner les enfants en suivant leurs rythmes intra-individuels suivant les domaines. 17 Alors, depuis quelques dizaines années maintenant, les maternités prodiguent les soins de développement décrits par André Bullinger, encore appelés soins de soutien au développement ou même soins de soutien au développement psychomoteur par d'autres auteurs. Par conséquent, les services de néonatalogie proposent des soins sensori- moteurs qui ont pour objectif d'adapter l'environnement : repérage des situations dystimulantes pour les éviter ou les adapter, intégrer les soins sensorimoteurs dans les projets de soins (adaptation des postures en flexion, prodiguer des SOF), favoriser l'alliance avec l'enfant au cours des soins et soutenir la relation parentale (Kloeckner, 2008). Les SOOF sont également monnaie courante dans les unités de néonatalogie. Elles consistent à stimuler la bouche avec quelques gouttes de lait, par exemple, et ont pour fonction d'accélérer le passage à l'alimentation orale après la SNG (Fucile et al. , 2002) et d'accrotre la vitesse de maturation des schèmes de succion (Fucile et al. , 2007). L'intérêt est donc grandissant d'utiliser ces stimulations, qui ne sont autres que de légères pressions appuyées par contact tactile, puisqu'elles exercent les réflexes oro-faciaux et ont de réels bénéfices sur l'autonomie alimentaire en plus d'améliorer la qualité de la succion. Récemment, des chercheurs ont voulu définir plus précisément la fenêtre développement opportune pour proposer ces stimulations olfactives : ont été proposées à un groupe de nourrissons prématurés (nés entre 28 et 33 SA) soit des stimulations avec du lait maternel (groupe contrôle) soit des stimulations factices (eau) pour le groupe dit témoin . Cette étude randomisée a mis en avant qu'une période optimale pourrait exister afin de mettre les SOOF en place : les bébés nés avant 31 SA qui ont reçu du lait maternel comme stimulations ont appris à se nourrir avant les nourrissons témoins puis, l'impact des stimulations au lait maternel est significativement différent entre les nourrissons nés avant ou après 31 SA (Davidso et al. , 2019). Illustration 2 : Schéma récapitulant les SOF qui peuvent être proposées dans les services néonatalogie (Haddad et al. , 2015). 18 Les SOOF ne sont pas les seules stimulations faciales : on parlera alors de SOF lorsqu'on stimule l'oralité sans pour autant y intégrer systématiquement des odeurs. Ayant toujours comme objectif ultime de solliciter positivement la sphère orale du bébé, les SOF sont axées sur la posture : favoriser le regroupement de son corps (fouissement) avec les mains près de l'orifice buccal. En position fœtale le nouveau-né sera dans une position mêlant confort et sécurité. Aussi, dans le cadre des SOF et afin de maintenir les compétences orales du bébé malgré l'alimentation entérale, est proposée une petite quantité d'alimentation per os à l'heure du repas. Puis, les aides à la succion font aussi partie intégrante des SOF. Existe aussi le NIDCAP (Newborn Individualized Developmental Care and Assessment Program), développé par Als, au sein duquel les parents sont également intégrés pendant les soins et sont invités à pratiquer le peau à peau par exemple. Le peau à peau réduit le stress (Mrelius et al. , 2016) et a des effets positifs sur le développement cérébral de l'enfant (Butruille et al. , 2017). Ce projet individualisé et spécialisé pour les bébés prématurés a aidé également à la réduction des sur-stimulations et des stimulations nocives dans les services. Pour résumer, inclure les familles aux soins et les soutenir puis les réconforter pour faciliter la mise en place de la relation parents-enfants ainsi que la proposition de stratégies comportementales (posture en enveloppement, peau à peau, mise au sein pour succions nutritive et non nutritive) et de stratégies environnementales (nuisances sonores et autres stimuli sensoriels nocifs et nuisants limités) sont largement pris en compte dans les services que fréquentent les nourrissons prématurés (néonatalogie). Ces pratiques sont également mises en place dans certaines unités Kangourou qui peuvent accueillir mère et enfant fragile(s) nécessitant une attention et des soins particuliers. Conséquences de la prématurité sur le bébé à court et long termes La naissance prématurée entrainant une immaturité anatomo-physiologique va avoir, de fait, des conséquences à court, moyen et long terme selon les cas de figure. Effectivement, à la naissance, à l'instar du développement de la sphère oro-faciale ralenti, l'immaturité de plusieurs organes est notable. Notamment, on peut noter un retard neurologique, cardio- respiratoire, pondéral, digestif, métabolique, sensoriel etc. Il est donc nécessaire voire vital de mettre en place une prise en soins adaptée à ces jeunes bébés. 19 Les séquelles peuvent être plus ou moins sévères : trouble du développement moteur (allant de la paralysie cérébrale, entrainant un handicap moteur lourd, au trouble neuromoteur mineur comme le trouble de la coordination par exemple), trouble neuro-développemental ou autres difficultés cognitives et/ou comportementales, des courbes staturo-pondérales écartées de la norme Comme dit ci-avant, la prématurité est reconnue comme étant un facteur de risque important de TND comme les handicaps intellectuels, les troubles de la communication, entre autres (Haute Autorité de Santé, 2020b). Des chercheurs observant les conséquences de la prématurité ont également avancé qu'une grande prématurité était un facteur de risque important de troubles du langage oral : notamment que la compréhension orale et que la composante phonologique étaient fortement impactées (Charollais et al. , 2010). De plus, il est également admis que la prématurité est un facteur de risque de troubles alimentaires, comme nous le verrons ci-après, et également de contraintes attentionnelles, mnésiques, praxiques, neuro-visuelles, exécutives, sensorielles (Marret et al. , 2015). Par ailleurs, ces troubles peuvent coexister et s'influencer les profils psycho- comportementaux, médicaux et cognitifs complexes et donc les prises en charge multiples, ce qui justifie une pluridisciplinarité de prise en soins nécessitant une communication entre tous les acteurs de celle-ci. La prise en charge multidisciplinaire et précoce est d'autant plus justifiée qu'il a été prouvé que les difficultés cognitives entrainaient des difficultés scolaires. les autres rendant les uns Prématurité et troubles de l'oralité Certains auteurs ont eu à cœur de répertorier quels étaient les profils d'enfants concernés par les troubles alimentaires. Ainsi, la prématurité est clairement apparue comme étant un facteur de risque de troubles de l'oralité alimentaire : dans l'étude, sur les 700 participants, il y avait une nette surreprésentation des bébés nés avant 37 SA (Rommel et al. , 2003). Les recherches EPIPAGE ont également avancé des propos concomitants cette étude : les prématurés sont plus sélectifs et présentent davantage de réflexes nauséeux ou de vomissements lors de la prise alimentaire. Il est évident qu'en surcrot d'une immaturité anatomo-physiologique, les soins prodigués en service de néonatalogie peuvent être délétères pour le développement oro-myo-facial extra- utérin. L'enfant né prématurément ne pourra pas boire au sein ou au biberon puisque la 20 coordination succion-respiration-déglutition n'est pas efficiente. Alors, malgré la mise en place des soins de développement, qui contribuent à soutenir le développement de l'oralité, des stimulations négatives persistent lors de leur passage en néonatalogie : - présence d'une nutrition entérale (NE) envahissant la sphère orale du petit pour tous les bébés nés avant 34 SA, - manque de fréquence et de cohérence de stimulations, en étant, a fortiori, séparé des parents puisqu'en couveuse et donc soigné par de multiples personnes (voix, odeurs différentes, etc. ) - La NE est envisagée dans le cadre d'une naissance prématurée dans le cas o la courbe staturo-pondérale est anormale : cette technique d'alimentation artificielle vient assouvir les besoins nutritifs des enfants qui ne peuvent se sustenter via la bouche pour cause d'immaturation physiologique de l'organe buccal ayant entrainé une contrainte sensorielle ou une dysphagie avec contrainte fonctionnelle avérée. La NE peut être assurée par une SNG (sonde reliée au tube digestif via le nez), par une GPE (sonde directement reliée directement à l'estomac via une stomie, orifice sur la paroi abdominale) ou par une jéjunostomie (stomie également, mais la sonde est, dans ce cas, reliée à l'intestin). Lorsque le tube digestif est non fonctionnel, aucune technique de NE n'est envisageable : l'enfant est donc nourri par NP (l'alimentation transite directement dans la circulation du sang via un système en intra- veineux). Ces techniques engendrent une baisse voire un total arrêt de l'alimentation orale et contraignent donc le développement de l'INS pouvant entrainer une hypersensibilité endo- buccale. Parallèlement, le développement praxique est aussi mis à mal puisqu'il ne sera pas soutenu par les patterns moteurs de la succion, s'ils ne sont pas entrainés. Il demeure donc primordial de maintenir une succion non-nutritive et de stimuler la zone oro-faciale via les soins de développement comme dit ci-avant, même si les apports caloriques suffisants sont amenés par une NE ou NP afin d'éviter la dénutrition. Des chercheurs ont également prouvé que la durée du respirateur artificiel pouvait impacter la qualité de succion, le plaisir de manger, les praxies de la bouche et même l'éclosion du langage chez des enfants prématurés réanimés (Delfosse et al. , 2006). 21 Intérêt d'une intervention orthophonique précoce Il parat donc indispensable d'intervenir de manière extrêmement précoce lorsque l'on sait que les premiers facteurs de risque de TOA arrivent dès la naissance et dès la prise en soins en néonatalogie. L'intervention orthophonique précoce est essentielle : si elle ne prend pas la forme habituelle des prises en soins orthophoniques avec des séances en présentiel afin de faire un travail avec l'enfant, elle peut se présenter comme une guidance ou un accompagnement parental. D'autant plus dans un contexte anxieux de naissance prématurée, les parents, souvent demandeurs de conseils, il est incontournable de prévenir d'éventuelles difficultés alimentaires. La guidance est d'autant plus importante que les parents, meilleurs connaisseurs de leur enfant, sont actifs dans le soin et leur rôle est alors sublimé. Notre rôle en tant qu'orthophoniste dans cette prise en charge précoce est d'apporter nos connaissances en matière d'alimentation et d'aspects sensori-moteurs tout en ayant conscience que les parents ont une connaissance pointue du fonctionnement de l'enfant. Ainsi, en prémices d'un quelconque accompagnement, l'orthophoniste se doit de mener un bilan complet comprenant un entretien anamnestique puis une évaluation des aspects organiques, sensoriels, environnementaux et moteurs en observant l'enfant lors d'un repas et son étayage parental En intervenant de manière ultra-précoce, les stimuli sensoriels nocifs sont moins fréquents et donc les stimulations fréquentes, cohérentes et positives modifient l'INS. Ainsi, les réactions comportementales en réponse à ces stimuli sont plus adaptées. De même, si l'intervention orthophonique précoce est mise en place, alors les praxies bucco-faciales seront moins contraintes : des sollicitations orales (succion non-nutritive par exemple) seront maintenues, soutenant le développement moteur et ainsi favorisant l'apprentissage de praxies utiles pour l'articulation et pour le langage oral. Pour finir, l'enjeu est de taille puisqu'une oralité contrainte et non soignée va durer et l'oralité cognitive, comme vu ci-avant, va prendre le relai. Il faut donc profiter de la grande plasticité cérébrale dans la première année de vie et jusqu'aux 2 ans de l'enfant : cette fenêtre de développement est propice à rétablir de la cohérence. Lorsque l'oralité tertiaire arrive, l'implicite n'est plus en supériorité : les enfants sont cognitivement capables de refuser, les représentations négatives de la nourriture seront plus difficiles à effacer, et l'INS sera contrainte depuis déjà trop de temps. Une intervention orthophonique sera encore possible, 22 évidemment mais les effets délétères de mauvaises représentations de l'alimentation entrainent une prise en charge plus longue et o l'enfant devient l'acteur principal, avec, en parallèle un accompagnement parental toujours préconisé. PROBLEMATIQUE ET HYPOTHESES PROBLEMATIQUE Il est admis aujourd'hui que le système complexe et multimodal de la sensori- motricité, très en lien avec notre alimentation, se développe très précocement, in utero, et que son développement se poursuit jusqu'à la fin de la grossesse afin que toutes les fonctions soient matures et fonctionnelles. Ainsi, une arrivée précoce à la vie extra-utérine prive le nourrisson d'une partie des expériences motrices et multisensorielles importantes in utero (Griffith et al. , 2018). Le nourrisson prématuré est admis à la naissance en service de néonatalogie au sein duquel des soins vitaux mais envahissants lui sont prodigués : intubation, SNG, sur-stimulations visuelles (lumières, passants), auditives (bruits des machines en réanimation, de nombreuses voix et pas uniquement celles des parents), en plus d'une séparation parentale. Ainsi, le bébé prématuré est beaucoup plus vulnérable et la modification des schèmes de développement sensoriels et moteurs peuvent avoir des conséquences à long terme (troubles des apprentissages, retards de croissance) mais aussi des conséquences plus à court terme (incapacité d'ingérer per os, par exemple). Notamment, la prématurité a des conséquences inéluctables sur l'oralité alimentaire. Effectivement, le fait d'être réanimé et donc intubé à la naissance, peut causer des troubles de l'oralité comme le précisent certains auteurs (Delfosse et al. , 2006). Il est donc cohérent de créer un questionnaire parental de dépistage d'un éventuel trouble de l'oralité chez des ex-prématurés qui sont davantage à risque de développer des difficultés alimentaires. Également, il est intéressant de le faire si tôt dans le développement du bébé pour promouvoir l'intervention orthophonique précoce en oralité ( Early Intervention , 2008) qui a des effets considérables sur la récupération et sur la modification de la trajectoire développementale. De plus, agir de manière extrêmement précoce contourne 23 la problématique de l'oralité dite cognitive (Levavasseur, 2017). C'est donc pour ces raisons qu'un questionnaire de dépistage de trouble de l'oralité alimentaire 1 mois post- hospitalisation en service de néonatalogie a été administré. A noter tout de même que, dans la pratique orthophonique, il est commun de voir se présenter des familles qui relatent des difficultés dans l'oralité secondaire pour leur enfant, c'est-à-dire, à compter de la diversification alimentaire et plus spécifiquement du passage aux morceaux, moment charnière pour les familles. La mise en place d'un questionnaire parental de dépistage précoce d'un éventuel trouble de l'oralité secondaire parat alors indispensable. Comme il est établi scientifiquement qu'une naissance prématurée est un facteur de risque de TOA, l'étude portera sur des enfants ex-prématurés, à 8 mois d'âge réel. Ils seront les mêmes que ceux interrogés à 1 mois post-hospitalisation. Il apparat nécessaire de réévaluer ceux qui n'étaient pas à risque lors de l'oralité alimentaire primaire car une étude scientifique très récente a démontré que les bonnes compétences en succion (lors de l'oralité d'ingestion primaire) n'étaient pas prédictives de bonnes compétences de mastication ou d'alimentation à la cuiller chez des ex-prématurés en bonne santé (Hbl et al. , 2020). Ainsi, l'apprentissage spécifique des schèmes moteurs engagés dans l'alimentation orale à la cuiller (lors de la diversification alimentaire donc) pourrait être plus prédicteur et pourrait avoir un plus grand impact sur les compétences motrices orales comme la mastication, que les compétences précoces de succion. Comme l'avait montré Sheppard, l'apprentissage moteur demeure une donnée probante pour améliorer les habiletés motrices (Sheppard, 2008). Tout comme il apparat évident d'apporter un suivi et de réévaluer également les bébés pour qui une suspicion de TOA avait été apposée pour observer si les difficultés perdurent ou si elles ont changé suite au passage à la cuiller par exemple. Notre problématique est alors la suivante : Une grille parentale à 8 mois d'âge réel en service de néonatalogie serait-elle un outil efficace pour dépister les troubles de l'oralité alimentaire secondaires chez des ex-prématurés ? HYPOTHESES Hypothèse 1 : Les premières analyses de validation et de fiabilité sont propices à l'acceptabilité de l'outil. Sous-hypothèse 1 : Le questionnaire a une bonne corrélation inter-items. 24 Sous hypothèse 2 : Le questionnaire a une bonne validité d'apparence et de contenu selon les professionnels interrogés, sensibilisés aux TOA. Sous-hypothèse 3 : Le questionnaire a une bonne sensibilité : il est composé d'items permettant de discriminer les nourrissons avec haut risques de TOA, des nourrissons sans difficulté. Sous-hypothèse 4 : La cohérence du diagnostic renforce la validité du questionnaire. Hypothèse 2 : La forme d'administration du questionnaire est à ce jour satisfaisante. 25 PARTIE METHODE ET RESULTATS METHODE Population La population retenue pour notre étude faisant suite à la recherche effectuée également au sein du CHU de Rouen en 2019-2020 (Cugnet, 2020) a été sélectionnée selon des critères précis qui suivront. Inclusion à notre étude Critères d'inclusion qui doivent être respectés à l'unanimité : - ex-prématurés (pas de critère de degré de prématurité en revanche), - nés au CHU de Rouen, - ayant entre 8 mois et 12 mois d'âge réel, - ayant auparavant participé à la recherche précédente : réponse au questionnaire parental à 1 mois post-hospitalisation (Cugnet, 2020) 49 réponses ont été récoltées dans l'étude précédente, représentant une cohorte de 49 enfants prématurés à des degrés différents, tous nés au CHU de Rouen et sans trouble neurodéveloppemental objectivé. Cette cohorte était composée de 24 filles et de 25 garçons. L'objectif étant ici d'essayer de conserver l'ensemble des primo-répondants. Exclusion Si au moins 1 des critères suivants est relevé, l'enfant a été exclu de notre étude - naissance à terme - enfants prématurés avec troubles congénitaux particuliers (pathologie syndromique, polyhandicap ou tout autre trouble neurodéveloppemental) - enfants prématurés transférés dans un autre centre hospitalier ou une autre clinique 26 - enfants contactés lors de la première étude mais n'ayant pas donné suite au premier questionnaire (Cugnet, 2020) - enfants décédés entre la première étude et la nôtre Matériel Élaboration du questionnaire parental Selon Kessen, personne d'autre que le parent attentif ne peut mieux connatre les changements subtils qui ont lieu dans le monde de l'enfant et de son comportement [] . Il paraissait donc probant de sonder les parents qui vivent en permanence avec l'enfant évalué. Ils connaissent son rythme de vie, peuvent aisément observer des changements, évolutions. Ils sont en mesure d'observer des comportements récurrents mais aussi certains plus rares (Camaioni et al. , 1991). Il semble évident que le questionnaire devait être le plus clair, compréhensible et facile d'accès en plus d'être court, tout en étant sensible au maximum afin de dépister une dysoralité alimentaire. En effet, les familles multiplient les consultations dans le cadre de la naissance prématurée de leur enfant, il demeurait donc important que le questionnaire soit simple et sensible tout en limitant les inquiétudes des parents. C'est ainsi que l'outil (Annexe 1) a vu le jour, après la conception qui s'est déroulée de novembre 2019 à mai 2020. Le questionnaire parental résulte d'un travail d'analyse des données littéraires scientifiques actuelles, des résultats aux deux dernières études précédant celle-ci et menées par Mme Couillien (Couillien, 2019) qui a mis en évidence des facteurs de risque de TOA et par Mme Cugnet (Cugnet, 2020) qui avait élaboré un questionnaire parental analysant le développement de l'alimentation en phase d'oralité primaire chez des enfants nés prématurément et qui a mis en exergue des critères solides mais aussi des biais, sur lesquels notre outil s'appuie donc a fortiori. Ainsi, le questionnaire s'articule autour de 5 domaines très importants à observer pour le dépistage d'une dysoralité alimentaire : l'observation d'un RGO, représentant un facteur prédicteur important comme dit ci-avant ; 27 l'observation des indices de rejet durant l'alimentation, qui pourraient donner un indice sur l'évitement de situation d'alimentation ; l'observation du déroulement du passage à la diversification alimentaire, donnant des informations sur d'éventuelles difficultés aux changements d'outils, d'installation et de textures ; l'observation des aspects sensori-moteurs, décrits précédemment comme étant une des causes majeures à la présence d'un TOA ; l'observation quantitative et qualitative du déroulement de l'alimentation . L'évaluation de ces domaines est établie selon une échelle de Likert. Ainsi, nous demandions aux parents de juger de la fréquence des comportements proposés (items) : 0 : jamais observé ; 1 : peu observé ; 2 : parfois observé ; 3 : souvent observé ; 4 : toujours observé. Nous avons choisi de partir sur le même format de réponse qu'avait choisi Mme Cugnet sur le précédent questionnaire puisque les parents y étaient déjà familiarisés. Nous avons tout de même fait varier le mode de réponse puisque l'échelle de Likert ne se prêtait pas à tous nos items. Donc, des réponses binaires OUI/NON ont été proposées, ainsi que des réponses sous formes de check-list ou d'expression plus libre, qui seront analysées sous forme qualitative. Nov. 2019 Mai 2020 Figure 1 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, première partie. Procédure Soumission des questionnaires et remplissage 28 A la suite de la phase de création, la récolte des données a pu démarrer, en juin 2020. Les parents devaient remplir ce questionnaire renseignant le développement alimentaire de leur enfant à ses 8 mois d'âge réel. Ainsi, le premier contact avec chaque famille se faisait aux 8 mois de leur enfant. A la différence du premier questionnaire envoyé par voie postale, dans notre étude, les questionnaires ont été, le plus souvent, proposés par téléphone en première intention. Si les parents ne répondaient pas, ils étaient recontactés par le même mode de communication maximum 15 jours après. Lorsqu'ils n'étaient pas disponibles pour répondre, nous convenions ensemble d'un autre rendez-vous téléphonique ou alors d'autres préféraient recevoir le questionnaire par mail afin de le remplir seuls, à tête plus reposée ou avec leur conjoint(e). Dans le mail (Annexe 2), nous précisions à nouveau l'intérêt de remplir la grille et nous informions que nous restions disponibles pour quelque question qu'il soit. La durée du remplissage selon cette modalité était d'environ 4 minutes. Par contact téléphonique, la durée moyenne d'un appel était d'environ 20 minutes : les parents en profitaient pour nous interroger et se renseigner, demander des conseils et attendaient des réponses précises. Notre rôle était d'informer, de répondre aux questions, sans les alarmer ou inquiéter. C'est d'ailleurs ce canal qui a été préférentiellement choisi. Nous tenions un listing (Annexe 3) en y mettant les dates du premier contact, et les dates des éventuelles relances et en y précisant les disponibilités ou non des parents s'ils nous en avaient fait part. Nov. 2019 Mai 2020 Juin Oct. 2020 Figure 2 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, seconde partie. 29 Création de la base de données Après réception des questionnaires dûment remplis, nous avons élaboré une base de données. Le but était de centraliser les données au sein d'un tableur (Annexe 4) afin de faciliter item du questionnaire était référencé dans le tableur en colonne et chaque sujet était inscrit en ligne. Les identités des membres de la population ont été anonymisées et chaque répondant a donc un numéro. l'analyse statistique qui se déroulerait par ailleurs. Ainsi, chaque Nov. 2019 Mai 2020 Juin Oct. 2020 Figure 3 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, troisième partie. Retour aux parents et proposition de rendez-vous Après avoir récolté la quasi-totalité des réponses, nous avons choisi de recontacter l'ensemble de la cohorte pour proposer un rendez-vous (Annexe 5). Le choix de recontacter tout le monde était évident : prouver que le questionnaire est sensible pour dépister un TOA en objectivant, à l'aide d'un bilan orthophonique, le diagnostic concomitant mais aussi en corrélant des résultats normaux à un questionnaire avec un bilan orthophonique sans pose de diagnostic de TOA. Ainsi, début octobre 2020, nous avons envoyé un mail à notre population. N'ayant obtenu que 3 réponses, nous avons opté pour une relance quelques semaines après, nous permettant de fixer 4 rencontres de plus. Les évaluations orthophoniques se sont donc déroulées d'octobre 2020 à fin janvier 2021. 30 Nov. 2019 Mai 2020 Juin Oct. 2020 Oct. 2020 Nov. 2020 Figure 4 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, quatrième partie. Passations de bilans orthophoniques Au préalablement fixés avec les familles par échanges de courriel ou d'appels téléphoniques, les rendez-vous de bilan orthophonique se déroulaient au CAMSP du CHU de Rouen avec une collègue étudiante en orthophonie qui observait le versant langagier des bébés, sous la supervision d'une orthophoniste. Nous recevions le ou les parents ou bien un parent accompagné d'un proche, avec l'enfant et nous expliquions la démarche. Le but étant ici de faire le point sur le développement global du bébé (versant alimentation de mon côté et versant communicatif-langagier pour mon homologue) et de répondre aux questions en apportant des réponses professionnelles et en réorientant si les interrogations n'étaient pas à notre portée ou sortaient de notre champ de compétences. Chacune des 9 passations durait entre 1 et 2 heures et se déroulaient ainsi : -Temps de rencontre et d'échange autour du développement global avec un recueil d'informations anamnestiques importantes pour la pose du diagnostic -Testing avec observations sensori-motrices globales grâce à du matériel adapté, explorations de la sphère oro-buccale, essais alimentaires -Restitution aux parents : retour des observations, pose du diagnostic avec perspectives de prises en soins (conseils de guidance parentale), réponse aux questions. La trame du bilan était la même pour tous les bébés présents. Les bilans étalonnés n'existant pas pour évaluer les aspects sensori-moteurs et alimentaires, nous avons élaboré une grille d'observation (Annexe 6) dont les items répertoriés ont été développés dans la partie 31 théorique comme étant des explorations importantes à faire lorsque nous sommes à la recherche d'un TOA. Cette grille permet une lecture globale du développement de l'enfant selon 4 axes : aspect sensoriel, aspect moteur, aspect environnemental, aspect organique (Levavasseur, 2017). Cet outil est purement clinique, n'est en rien validé scientifiquement, et ne fait donc l'objet d'aucun étalonnage. A la suite des évaluations orthophoniques, et après échanges professionnels avec l'autre étudiante, la grille d'observation était remise au propre et faisait office de compte-rendu de bilan. Validé par l'orthophoniste diplômée, ce compte-rendu de bilan était envoyé aux parents le souhaitant. Par ailleurs, 2 sujets de la cohorte ont été orientés vers le CAMSP par leur pédiatre et ont donc bénéficié de plusieurs bilans au sein de cette structure, dont un bilan orthophonique. De fait, nous avons 9 bébés qui ont bénéficié du questionnaire et de l'évaluation orthophonique en tout et pour tout. Nov. 2019 Mai 2020 Juin Oct. 2020 Oct. 2020 Nov. 2020 Oct. 2020 Fév. 2021 Figure 5 : Schéma explicatif des étapes de la méthode, cinquième et dernière partie. Pré-validation de l'outil Au sein du processus de validation de l'outil, plusieurs caractéristiques psychométriques doivent être vérifiées : la cohérence interne ou encore appelée fidélité, la validité d'apparence et de contenu, la sensibilité des items du questionnaire ainsi que la validité contre-critère. Pour ce faire, nous utiliserons le Logiciel R comme logiciel statistique après avoir entré la base de données correspondant aux données des questionnaires au préalablement anonymisés. 32 Cohérence interne Afin d'évaluer la sous-hypothèse 1, et donc de mesurer la fidélité, le coefficient de Cronbach a été utilisé. Ce dernier étant largement répandu dans la construction de test ou d'outil d'évaluation depuis sa théorisation en 1951. Le coefficient de corrélation de Cronbach peut être utilisé pour différents types d'items, nul besoin que ceux-ci soient dichotomiques, et a pour fonction de déterminer les indices d'homogénéité des items d'un outil (Cronbach, 1951). Plus cet indicateur est proche de 1, meilleure est la cohérence interne et donc mieux est mesurée la dimension attendue. Il est communément admis qu'à partir d'un coefficient de Cronbach supérieur à 0. 7 la cohésion interne est dite acceptable (Peterson, 1995). Validité d'apparence et de contenu : soumission à un panel d'experts Intégré au processus de pré-validation du questionnaire, nous avons voulu savoir si, aux yeux d'experts prenant en charge des patients ayant des TOA, l'outil présentait une apparence convenable et un contenu approprié. Donc, nous avons élaboré une grille (Annexe 7) à destination de plusieurs spécialistes du domaine des TOA : une neuropédiatre, une pédiatre, une diététicienne et trois orthophonistes ont constitué le panel d'experts et ont évalué l'apparence et le contenu du questionnaire parental. Ces grilles d'évaluation ont donc été soumises à 6 professionnelles de santé formées à l'évaluation et la prise en charge des enfants avec des dysoralités alimentaires et feront l'objet d'une évaluation quantitative. Plus en détails, les jurées ont noté, selon une échelle de Likert, dans un premier temps l'apparence de la grille, ce qui évalue la forme de l'outil : la longueur du questionnaire parental, les modalités de réponse, la clarté et la simplicité de chaque item. Dans un second et dernier temps, c'est le fond de l'outil qui a été soumis à une évaluation de la part de notre jury : la pertinence de chaque domaine et puis de chaque item. Pour apprécier la validité d'apparence et de contenu, nous ferons une analyse quantitative en calculant différents indices : en premier lieu des indices de validité d'apparence (I-ICV clarté et I-ICV simplicité), puis, un indice de validité de contenu (I-ICV pertinence). Ces indices sont jugés valides lorsqu'ils sont égaux ou supérieurs à 0. 78 (Polit et al. 2007). Ensuite, nous ferons une analyse qualitative en traitant les remarques et commentaires des différentes jurées. 33 Sensibilité des items Ici, nous voulons déterminer quels items sont plus à même de dépister des TOA. En premier lieu, nous allons fixer un seuil pathologique, qui nous permettra de scinder notre population en 2 groupes distincts : le groupe de sujets ayant obtenu un score inférieur au score dit pathologique, qui est donc à faible risque de TOA et l'autre qui regroupe les répondants pour lesquels leur score est supérieur ou égal au seuil fixé et qui sont donc à risque de TOA. Ensuite, nous ferons une analyse statistique plus fine pour comparer ces deux groupes et alors déterminer quels items sont sensibles (et donc importants à conserver) et lesquels le sont moins ou pas du tout. Pour chaque item, nous ferons une analyse de la répartition des réponses entre les 2 groupes. Validité contre-critère Pour pré-valider notre questionnaire, à visée de dépistage, il est important de le corréler à un diagnostic. Comme précisé en amont, le diagnostic sera clinique (les données chiffrées, étalonnées n'étant pas disponibles dans ce champ de compétences de l'orthophonie). Ainsi, la validité contre-critère sera considérée comme étant bonne si le résultat au bilan orthophonique (la présence objectivée d'un trouble ou non) converge vers le même résultat obtenu au questionnaire de dépistage (score supérieur ou égal au score pathologique). En pratique, la conclusion du compte-rendu de bilan orthophonique sera donc corrélée avec le score obtenu au questionnaire de dépistage du même enfant : les statistiques seront uniquement qualitatives au vu de la faible population ayant bénéficié d'une évaluation orthophonique (n 9). En effet, aucun test statistique ne pourra être mené à bien. Nous nous attèlerons à décrire les résultats obtenus en y faisant figurer les pourcentages de vrais négatifs, vrais positifs, faux négatifs et faux positifs. 34 RESULTATS Répartition de la population Après avoir proposé le questionnaire aux 49 répondants de l'étude précédente, nous avons récolté 43 réponses. Il est donc important de mettre en avant que la perte de sujets est moindre : 1 enfant a été exclu de l'étude puisque décédé et les 5 autres n'ont pas fait suite à nos appels et mails pour la récolte des données. Alors, nous allons observer de plus près notre population d'étude. Figure 6 : Répartition de la population selon les niveaux de prématurité en pourcentage. La population est assez homogène quant aux différents niveaux de prématurité, avec une légère surreprésentation du degré de prématurité moyenne. Figure 7 : Répartition de la population selon le sexe. De même, l'homogénéité est notable en termes de répartition de la population selon le sexe, avec un peu plus de filles (23) que de garçons (20). 35 Figure 8 : Répartition de la population selon le mode de réponse au questionnaire en pourcentage. Une majorité des familles, soit 25 sur 43 répondants, a choisi de répondre directement au questionnaire par téléphone, contre 16 qui ont préféré y répondre par courriel. 2 questionnaires ont été remplis en physique, en consultation de bilan orthophonique, au CAMSP. Nous avons remarqué que la préférence de répondre au téléphone résidait dans la possibilité d'avoir un échange, ce qui permettait aux parents de poser leurs questions et d'avoir un interlocuteur. Il est vrai que les parents d'enfants qui débutent leur vie avec un parcours de soins conséquent pour la plupart, ont besoin d'être rassurés. Quant à la position de l'étudiante : il fallait rester fidèle au questionnaire en n'orientant pas les réponses et en respectant à la lettre les intitulés. Si des interrogations émanaient des parents pendant la passation du questionnaire, la discussion et les réponses aux questions étaient plutôt amenées ensuite afin de biaiser au minimum leurs ressentis. Les familles qui préféraient répondre ultérieurement par courriel étaient souvent en manque de temps à l'instant de l'appel ou en manque de réponses aux items du questionnaire et formulaient qu'ils avaient besoin de le remplir posément avec leur conjoint et non immédiatement. Figure 9 : Répartition de la population selon l'âge lors du questionnaire alimentaire en pourcentage. 36 La grande majorité des bébés avaient donc bien 8 mois lors de la passation du questionnaire (soit 33 des sujets). 9 bébés avaient entre 9 mois et 9 mois 31 jours et 1 avait plus de 10 mois. Cohérence interne Afin de constituer un score global permettant d'établir un seuil pathologique par la suite, nous avons décidé d'y intégrer la plupart des items cotés de 0 à 4. Les variables binaires OUI/NON et les variables à réponse libre ou à check-list (date de naissance, terme, niveau de prématurité, âge lors du questionnaire, poids à la naissance, poids actuel, type(s) de nutrition actuel(s), sexe, traitement contre les reflux, préférence commerce/maison, acceptation des morceaux, acceptation de cuiller, durée des repas, maintien de la tête, tenue de la station assise, préhension d'objets dans ses mains, suivi psychomoteur) ainsi que les 3 items ( l'enfant touche-t-il les aliments avec ses doigts ? , quantité prise au biberon et quantité prise à la cuiller ) ne rentrent pas en compte dans le score global. Ainsi, sur les 18 items constituant le score global, le coefficient de Cronbach calculé est égal à 0, 75, ce qui nous permet d'objectiver une bonne cohérence interne du questionnaire. Processus de validité d'apparence et de contenu Validité d'apparence La moyenne des variables évaluant la clarté des items du questionnaire parental est à 3, 7/4. Ainsi, l'indice I-CVI CLARTÉ 0, 93. Les items jugés les moins clairs avec une note moyenne à 3, 33/4 sont Votre enfant tient-il assis ? et Votre enfant tient-il sa tête sans osciller ? La moyenne des variables évaluant la simplicité des items du questionnaire parental est à 3, 6/4. Ainsi, l'indice I-CVI SIMPLICITÉ 0, 92. Les items jugés les moins pertinents avec des notes moyennes allant de 3, 5/4 à 3, 6/4 sont STRIDOR , Votre enfant a-t-il une préférence marquée pour les petits pots du commerce/les pots fait-maison ? ou Accepte-t-il les deux indifféremment ? , Votre enfant 37 accepte-t-il les morceaux ? , Quels types de morceaux accepte-il le cas échéant ? , Votre enfant est-il gêné pendant le shampoing ? , Votre enfant est-il gêné quand il a les mains sales ? , Votre enfant tient-il sa tête sans osciller ? , La prise alimentaire est source de déplaisir pour votre enfant ? , La prise alimentaire dure environ , Quelle est la quantité ingérée par prise ? . Validité de contenu La moyenne des variables évaluant la pertinence des items du questionnaire parental est à 3, 8/4. Ainsi, l'indice I-CVI PERTINENCE 0, 96. Les 2 items jugés les moins pertinents avec des notes moyennes à 3, 2/4 sont ROT et HALEINE . Sensibilité des items Tout d'abord, nous avons calculé un score global sur les 18 variables qui seront nommées items constituant le score global uniquement. Ce score global pouvant être d'un maximum de 72 et d'un minimum de 0. A savoir que, plus il est élevé, plus le risque de TOA est important. Ainsi, nous avons fixé un seuil pathologique à score global > 16. En-deçà de score global 16 , les enfants étaient dits sans difficultés notables . De ce score seuil, nous avons donc pu constituer 2 groupes : d'une part les bébés sans difficultés notables qui sont 31 en tout, et d'autre part, les bébés à risque de développer un TOA qui sont au nombre de 12. Ainsi, afin de savoir quels items sont les plus significatifs, nous allons exposer les résultats des 2 groupes pour chaque item du questionnaire. Les graphiques figureront en pourcentage, ce qui demeure plus parlant au vu du déséquilibre du nombre de sujets dans chaque groupe. Sensibilité des items constituant le score global 1) RGO ou signes de RGO - ROT 38 Figure 10 : Item Rot - répartition en pourcentage par groupe. Pour cet item, dans la population sans difficultés notables, on observe que 12, 9% des nourrissons ne réalisent jamais de rots en dehors des repas ; 12, 9% en réalisent peu ; 29, 03% en réalisent parfois ; 22, 58% en réalisent souvent ; 22, 58% en réalisent toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, aucun n'en réalise jamais ou peu ; 33, 33% en réalisent parfois ; 33, 33% en réalisent souvent et 33, 33% en réalisent toujours. Les résultats montrent p-value 0, 05, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux groupes et que l'item est statistiquement discriminant. - HALEINE Figure 11 : Item Haleine - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 87, 1% des bébés n'ont jamais une mauvaise haleine d'après leurs parents ; aucun n'a peu de mauvaise haleine ; 9, 68% ont parfois mauvaise haleine ; 3, 23% ont souvent mauvaise haleine. Dans la population à risque de développer un TOA, 83, 33% des bébés n'ont jamais une mauvaise haleine d'après leurs parents ; 8, 33% ont peu de mauvaise haleine ; 8, 33% ont 39 parfois une mauvaise haleine ; aucun n'a souvent une mauvaise haleine. Dans les 2 groupes, aucun bébé n'a toujours une mauvaise haleine. Les résultats montrent p-value 0, 87, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - TOUX Figure 12 : Item Toux en position allongée - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 32, 26% des bébés ne toussent jamais d'après leurs parents ; 32, 26% des bébés toussent peu ; 29, 03% toussent parfois ; 6, 45% toussent souvent et aucun ne tousse toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 16, 67% des bébés ne toussent jamais ; 16, 67% toussent peu ; 41, 67% toussent parfois 16, 67% toussent souvent et 8, 33% toussent toujours. Les résultats montrent p-value 0, 04, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. - STRIDOR Figure 13 : Item Stridor - répartition en pourcentage par groupe. 40 Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 83, 87% des bébés n'ont jamais de stridor d'après leurs parents ; 9, 68% ont peu de stridor ; 3, 23% ont parfois un stridor ; 3, 23% ont souvent un stridor et aucun n'en a toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 35% des bébés n'ont jamais de stridor d'après leurs parents ; 25% ont peu de stridor ; aucun bébé n'a parfois un stridor ; 16, 67% ont souvent un stridor et 33, 33% ont toujours un stridor. Les résultats montrent p-value 0, 00, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. Conclusion : Pour cette première partie, traitant des marqueurs de RGO, les items les plus significatifs statistiquement sont ROT , TOUX et STRIDOR . L'item HALEINE , au vu du test utilisé mais aussi, plus qualitativement si nous observons le graphique qui est peu évocateur d'une différence entre les 2 groupes, n'est pas discriminant. 2) Indices de rejet durant l'alimentation - REFLEXE NAUSEEUX Figure 14 : Item Réflexe nauséeux- répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 51, 61% des bébés n'ont jamais de réflexe nauséeux pendant l'alimentation ; 25, 81% ont peu de réflexe nauséeux pendant l'alimentation ; 22, 58% ont parfois un réflexe nauséeux pendant l'alimentation et aucun n'en a toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 33, 33% des bébés n'ont jamais de réflexe nauséeux pendant l'alimentation ; 33, 33% ont peu de réflexe nauséeux pendant l'alimentation ; 25% en ont parfois et 8, 33% en ont toujours. Aucun bébé de la cohorte (qu'il soit à risque de TOA ou sans difficultés notables) n'a souvent de réflexe nauséeux pendant l'alimentation. 41 Les résultats montrent p-value 0, 16, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - VOMISSEMENT Figure 15 : Item Vomissement - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 87, 1% des bébés n'ont jamais de vomissement pendant l'alimentation ; 9, 68% ont peu de vomissement pendant l'alimentation ; 3, 23% en ont parfois. Dans la population à risque de développer un TOA, 66, 67% des bébés n'ont jamais de vomissement pendant l'alimentation ; 8, 33% ont peu de vomissement pendant l'alimentation ; 25% en ont parfois. Aucun bébé de la cohorte (qu'il soit à risque de TOA ou sans difficultés notables) n'a souvent ou toujours un vomissement pendant l'alimentation. Les résultats montrent p-value 0, 14, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - GRIMACE Figure 16 : Item Grimace - répartition en pourcentage par groupe. 42 Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 45, 16% des bébés ne font jamais de grimaces pendant l'alimentation ; 41, 94% en font peu ; 9, 68% en font parfois ; 3, 23% en font souvent et aucun n'en fait toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 16, 67% des bébés ne font jamais de grimaces pendant l'alimentation ; 16, 67% en font peu ; 41, 67 % en font parfois ; 16, 67% en font souvent et 8, 33% en font toujours. Les résultats montrent p-value 0, 00, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. - SIGNE DE DOULEUR/D'INCONFORT Figure 17 : Item Douleur / inconfort - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 80, 65% des bébés ne montrent jamais de signes de douleur ou d'inconfort pendant l'alimentation ; 16, 13% montrent peu de signes de douleur ou d'inconfort pendant l'alimentation ; 3, 23% en montrent parfois ; et aucun n'en fait souvent ou toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 50% des bébés ne montrent jamais de signes de douleur ou d'inconfort pendant l'alimentation ; 33, 33% en montrent peu ; aucun n'en montre parfois ; 16, 67% montrent souvent des signes de douleur ou d'inconfort pendant l'alimentation et aucun n'en montre toujours. Les résultats montrent p-value 0, 09, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. 43 - PLEUR Figure 18 : Item Pleur - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 61, 29% des bébés ne pleurent jamais pendant l'alimentation ; 29, 03% pleurent peu pendant l'alimentation ; 6, 45% pleurent parfois pendant la prise alimentaire ; 3, 23% pleurent souvent pendant l'alimentation. Dans la population à risque de développer un TOA, 50% des bébés ne pleurent jamais pendant l'alimentation ; 25% pleurent peu pendant la prise alimentaire ; 8, 33% pleurent parfois pendant l'alimentation ; 16, 67% pleurent souvent pendant l'alimentation. Aucun bébé de la cohorte (qu'il soit à risque de TOA ou sans difficultés notables) ne pleure toujours pendant la prise alimentaire. Les résultats montrent p-value 0, 19, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - TOUX (lors de la prise alimentaire) Figure 19 : Item Toux lors de la prise alimentaire - répartition en pourcentage par groupe. 44 Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 80, 65% des bébés ne toussent jamais pendant l'alimentation ; 16, 13% toussent peu pendant l'alimentation ; 3, 23% toussent parfois pendant la prise alimentaire. Dans la population à risque de développer un TOA, 58, 33% des bébés ne toussent jamais pendant l'alimentation ; 25% toussent peu pendant la prise alimentaire ; 16, 67% toussent parfois pendant l'alimentation. Aucun sujet de la cohorte (qu'il soit sans difficultés notables ou à risque de développer un TOA) ne tousse souvent ou toujours pendant qu'il mange. Les résultats montrent p-value 0, 08, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - REFUS Figure 20 : Item Refus - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 48, 39% des bébés ne montrent jamais de signes de refus pendant l'alimentation ; 29, 03% montrent peu de signes de refus pendant l'alimentation ; 19, 35% montrent parfois des signes de refus pendant l'alimentation ; 3, 23% montrent souvent des signes de refus pendant l'alimentation et aucun n'en montre toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 8, 33% des bébés ne montrent jamais de signes de refus pendant l'alimentation ; 25% montrent peu de signes de refus pendant l'alimentation ; 25% montrent parfois des signes de refus pendant l'alimentation ; 16, 67% montrent souvent des signes de refus pendant l'alimentation et 25% en montrent toujours. Les résultats montrent p-value 0, 00, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. 45 - LANGUE QUI REPOUSSE LA CUILLER Figure 21 : Item Protrusion - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 77, 42% des bébés ne montrent jamais de signes de protrusion linguale pendant l'alimentation ; 12, 9% en montrent ; 6, 45% en montrent parfois ; 3, 23% en montrent souvent et aucun n'en montre toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 41, 67% des bébés ne montrent jamais de signes de protrusion linguale pendant l'alimentation ; aucun ne montre peu de signes de protrusion linguale pendant qu'il mange ; 25% en montrent parfois ; 16, 67% en montrent souvent et 16, 67% en montrent toujours. Pour cet item, les résultats montrent p- value 0, 02, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. Les résultats montrent p-value 0, 02, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. Conclusion : Pour cette seconde partie, mettant en lumière les indices de rejet durant l'alimentation, les items les plus significatifs statistiquement sont GRIMACE , REFUS et PROTRUSION . Les items REFLEXE NAUSEEUX , VOMISSEMENT , SIGNE DE DOULEUR/D'INCONFORT , PLEUR , et TOUX pendant la prise alimentaire , ne sont statistiquement pas discriminants. Les propos seront nuancés dans la discussion. 3) Aspects sensori-moteurs - VOTRE ENFANT EST GÊNÉ PENDANT LES SOINS DU VISAGE ? 46 Figure 22 : Item Signes de gêne lors des soins du visage - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 51, 61% des bébés ne montrent jamais de signes de gêne lors des soins du visage ; 6, 45% en montrent peu ; 16, 13% en montrent parfois ; 12, 9% en montrent souvent et 12, 9% en montrent toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 8, 33% ne montrent jamais de signes de gêne lors des soins du visage ; 8, 33% en montrent peu ; 25% en montrent parfois ; 25% en montrent souvent et 33, 33% en montrent toujours. Les résultats montrent p-value 0, 01, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. - VOTRE ENFANT EST GÊNÉ PENDANT LE SHAMPOING ? Figure 23 : Item Signes de gêne lors du shampoing - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 83, 87% des bébés ne montrent jamais de signes de gêne pendant le shampoing ; 6, 45% en montrent peu ; 6, 45% en montrent parfois ; aucun n'en montre souvent et 3, 23% en montrent toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 63, 64% des bébés ne montrent 47 jamais de signes de gêne pendant le shampoing ; 18, 18% en montrent peu ; 9, 09% en montrent parfois ; aucun n'en montre souvent et 9, 09% en montrent toujours. Les résultats montrent p-value 0, 25, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - VOTRE ENFANT EST GÊNÉ S'IL EST EN CONTACT AVEC CERTAINES TEXTURES ? Figure 24 : Item Signes de gêne lors du contact avec certaines textures - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 100% des bébés ne montrent jamais de signes de gêne lorsqu'il est en contact avec des textures particulières ; aucun n'en montre peu, parfois, souvent ou toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 60% des bébés ne montrent jamais de signes de gêne lorsqu'il est en contact avec des textures particulières ; 20% en montrent peu ; 10% en montrent parfois ; aucun n'en montre souvent et 10% en montrent toujours. Les résultats montrent p-value 0, 09, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - VOTRE ENFANT EST GÊNÉ QUAND IL A LES MAINS SALES ? 48 Figure 25 : Item Signes de gêne si l'enfant a les mains sales - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 100% des bébés ne montrent jamais de signes de gêne lorsqu'il a les mains sales ; aucun n'en montre peu, parfois, souvent ou toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 66, 67% des bébés ne montrent jamais de signes de gêne lorsqu'ils ont les mains sales ; 16, 67% en montrent peu ; 8, 33% en montrent parfois ; 8, 33% en montrent souvent et aucun n'en montre toujours. Les résultats montrent p-value 0, 00, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. Conclusion : Pour cette troisième partie, mettant en exergue les aspects sensori-moteurs, les items les plus significatifs statistiquement sont GÊNE PENDANT LES SOINS DU VISAGE , et GÊNE QUAND LES MAINS SONT SALES . Les items GÊNE LORS DU SHAMPOING , et GÊNE LORS DU TOUCHER DE TEXTURES ne sont statistiquement pas discriminants. Les propos seront nuancés dans la discussion. 4) Observations de du déroulement de l'alimentation - LA PRISE ALIMENTAIRE EST-ELLE UNE SOURCE D'INQUIÉTUDE POUR VOUS ? 49 Figure 26 : Item Inquiétude - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 83, 87% des parents ne sont jamais inquiets vis-à-vis de l'alimentation de leur enfant ; 9, 68% sont peu inquiets, 6, 45% sont parfois inquiets, et aucun parent de ce groupe ne rapporte être souvent ou toujours inquiet. Dans la population à risque de développer un TOA, 50% des parents ne sont jamais inquiets vis-à-vis de l'alimentation de leur enfant ; 8, 33% sont peu inquiets ; 33, 33% sont parfois inquiets ; 8, 33% sont souvent inquiets et aucun n'est toujours inquiet. Les résultats montrent p-value 0, 04, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. - LA PRISE ALIMENTAIRE EST-ELLE UNE SOURCE DE DÉPLAISIR POUR VOTRE ENFANT ? Figure 27 : Item Déplaisir - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 93, 55% des bébés ne ressentent jamais de déplaisir lors de la prise alimentaire ; 6, 45% ressentent peu de déplaisir lorsqu'ils mangent, aucun ne ressent parfois, souvent ou toujours 50 de déplaisir en mangeant. Dans la population à risque de développer un TOA, 66, 67% des bébés ne ressentent jamais de déplaisir lors de la prise alimentaire ; aucun n'en ressent peu ; 25% ressentent parfois du déplaisir en mangeant ; aucun n'en ressent souvent et 8, 33% ressentent toujours un déplaisir en mangeant. Les résultats montrent p-value 0, 07, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. Conclusion : Pour cette dernière partie, qui traitait de l'observation du déroulement de la prise alimentaire, l'item le plus significatif statistiquement est INQUIÉTUDE DES PARENTS . L'item DÉPLAISIR DE L'ENFANT n'est statistiquement pas discriminant. Les propos seront nuancés dans la discussion. Sensibilité des items non compris dans le score global 1) RGO ou signes de RGO - TRAITEMENT CONTRE LE RGO Figure 28 : Item Traitement contre les RGO - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 58, 06% des bébés n'ont pas eu de traitement contre le RGO ; aucun n'en a eu parfois ; 3, 23% en ont eu pendant 1 semaine ; 9, 68% des bébés ont eu un traitement contre le RGO pendant 1 mois et 29, 03% en ont eu pendant plusieurs mois. Dans la population à risque de développer un TOA, 41, 67 des bébés n'ont pas eu de traitement contre le RGO ; 16, 67% en ont parfois eu ; aucun n'en a eu pendant 1 semaine ou pendant 1 mois et 41, 67% en ont eu pendant plusieurs mois. 51 Les résultats montrent p-value 0, 11, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. Conclusion : Pour cette première partie, traitant des marqueurs de RGO, l'item présent n'est pas discriminant au vu des statistiques. Ce propos sera discuté ensuite. 2) Diversification alimentaire - VOTRE ENFANT ACCEPTE-T-IL LA CUILLER ? Figure 29 : Item Acceptation de la cuiller - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant que tous les bébés appartenant au groupe sans difficultés notables acceptent la cuiller. Dans la population à risque de développer un TOA, 83, 33% des bébés acceptent la cuiller contre 16, 67% qui ne l'acceptent pas. Les résultats montrent p-value 0, 13, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - A-T-IL UNE PRÉFÉRENCE MARQUÉE POUR LES PETITS POTS DU COMMERCE ET/OU LES POTS FAIT-MAISON ? 52 Figure 30 : Item Préférence entre pots fait maison et pots industriels - répartition en pourcentage par groupe. En observant les résultats à cet item, nous pouvons admettre que, dans la population sans difficultés notables, 29, 03% des bébés préfèrent les petits pots du commerce, 35, 48% préfèrent les pots fait-maison et 35, 48% n'ont pas de préférence entre les 2 types de pots. Dans la population à risque de TOA, 9, 09% préfèrent les pots du commerce, 9, 09% préfèrent les pots fait-maison et 81, 82% n'ont pas de préférence notable. Les résultats montrent p-value 0, 03, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. - AVEZ-VOUS DÉJÀ ESSAYÉ DE PROPOSER DES MORCEAUX À VOTRE ENFANT ? Figure 31 : Item Essai des morceaux - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, chez les bébés sans difficultés notables, 48, 39% de leurs parents n'avaient pas proposé de morceaux contre 51, 61% qui leur avaient proposé. Chez les bébés à risque de TOA, 66, 67% de leurs parents n'avaient pas proposé et 33, 33% avaient proposé. 53 Les résultats montrent p-value 0, 46, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. Conclusion : Pour cette seconde partie, mettant en lumière le déroulé de la diversification alimentaire, l'item le plus significatif statistiquement est PRÉFÉRENCE ENTRE POTS FAIT- MAISON ET POTS INDUSTRIELS . Les items ACCEPTATION DE LA CUILLER , et ESSAI DES MORCEAUX ne sont statistiquement pas discriminants. Les propos seront nuancés dans la discussion. 3) Aspects sensori-moteurs - VOTRE ENFANT TOUCHE-T-IL LA NOURRITURE AVEC SES DOIGTS ? Figure 32 : Item Toucher la nourriture avec les doigts - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, que 9, 68% des bébés ne touchent jamais la nourriture avec leurs doigts ; aucun ne le fait peu ; 22, 58% le font parfois ; 16, 13% le font souvent et 51, 61% le font toujours. Dans la population à risque de développer un TOA, 8, 33% des bébés ne touchent jamais la nourriture avec leurs doigts ; 8, 33% le font peu ; 8, 33% le font parfois ; 25% le font souvent et 50% le font toujours. Les résultats montrent p-value 1, 00, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - VOTRE ENFANT TIENT-IL SA TÊTE SANS OSCILLER ? 54 Figure 33 : Item L'enfant tient sa tête sans osciller - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, chez les bébés sans difficultés notables, 93, 55% tiennent leur tête sans osciller contre 6, 45% qui ne le font pas. En revanche, tous les bébés à risque de TOA, tiennent leur tête sans osciller. Les résultats montrent p-value 0, 93, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - VOTRE ENFANT TIENT-IL ASSIS ? Figure 34 : Item Tenue assise - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, chez les bébés sans difficultés notables, 35, 48% tiennent assis contre 64, 52% qui ne le font pas. Chez les bébés à risque de TOA, 50% tiennent assis et 50% ne tiennent pas assis. Les résultats montrent p-value 0, 60, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. 55 - VOTRE ENFANT TIENT-IL DES OBJETS DANS SES MAINS ? Figure 35 : Item Préhension manuelle d'objets - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats montrent que l'entièreté de la cohorte a acquis la préhension manuelle d'objets, quel que soit le groupe apparent (à risque de TOA/sans difficultés notables). Les résultats montrent p-value 0, 00, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. - VOTRE ENFANT A-T-IL BÉNÉFICIÉ D'UN SUIVI PSYCHOMOTEUR ? Figure 36 : Item Suivi psychomoteur - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, chez les bébés sans difficultés notables, 12, 9% ont déjà consulté en psychomotricité contre 87, 1% qui n'ont jamais consulté chez un psychomotricien. Chez les bébés à risque de TOA, 8, 33% ont déjà vu un psychomotricien contre 91, 67% qui n'en ont jamais vu. Les résultats montrent p-value 1, 00, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. 56 Conclusion : Pour cette troisième partie, mettant en exergue les aspects sensori-moteur, l'item le plus significatif statistiquement est PRÉHENSION D'UN OBJET . Les items TOUCHE LA NOURRITURE AVEC SES DOIGTS , TIENT SA TÊTE , TIENT ASSIS et SUIVI PSYCHOMOTEUR ne sont statistiquement pas discriminants. Les propos seront nuancés dans la discussion. 4) Observations du déroulement de l'alimentation - DURÉE DE LA PRISE ALIMENTAIRE Figure 37 : Item Durée de la prise alimentaire - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, chez les bébés sans difficultés notables, 96, 77% prennent entre 15 et 30 minutes par repas contre 3, 23% qui prennent entre 30 minutes et 1 heure pour s'alimenter. Chez les bébés à risque de TOA, 75% mangent entre 15 et 30 minutes contre 25% qui prennent entre 30 minutes et 1 heure pour manger. Les résultats montrent p-value 0, 04, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. - QUANTITÉ INGÉRÉE LORS DE LA PRISE ALIMENTAIRE AU BIBERON Figure 38 : Item Quantité ingérée au biberon - répartition en pourcentage par groupe. 57 Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, qu'aucun des bébés n'ingère rien/quasiment rien ou un quart de la portion proposée au biberon, 3, 23% ingèrent la moitié de la portion proposée ; 22, 58% ingèrent les trois quarts de la portion proposée et 74, 19% ingèrent la totalité de la portion proposée. Dans la population à risque de développer un TOA, aucun des bébés n'ingère rien/quasiment rien ou un quart de la portion proposée, 10% ingèrent la moitié de la portion proposée ; 40% ingèrent les trois quarts de la portion proposée et 50% ingèrent la totalité de la portion proposée. Les résultats montrent p-value 0, 15, ce qui prouve qu'il n'existe pas de différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item n'est donc pas statistiquement discriminant. - QUANTITÉ INGÉRÉE LORS DE LA PRISE ALIMENTAIRE À LA CUILLER Figure 39 : Item Quantité ingérée à la cuiller - répartition en pourcentage par groupe. Les résultats à cet item mettent en avant, dans la population sans difficultés notables, qu'aucun des bébés n'ingère rien/quasiment rien ou un quart de la portion proposée à la cuiller, 6, 45% ingèrent la moitié de la portion proposée ; 16, 13% ingèrent les trois quarts de la portion proposée et 77, 42% ingèrent la totalité de la portion proposée. Dans la population à risque de développer un TOA, 25% des bébés n'ingèrent rien/quasiment rien ; 16, 67% ingèrent un quart de la portion proposé, 8, 33% ingèrent la moitié de la portion proposée ; 50% ingèrent les trois quarts de la portion proposée et aucun n'ingère la totalité de la portion proposée. Les résultats montrent p-value 0, 00, ce qui prouve qu'il existe une différence significative entre les réponses des deux populations et que l'item est statistiquement discriminant. 58 Conclusion : Pour cette dernière partie, mettant en exergue les observations du déroulement de l'alimentation, les items les plus significatifs sont DURÉE DE LA PRISE ALIMENTAIRE et QUANTITÉ INGÉRÉE À LA CUILLER . L'item QUANTITÉ INGÉRÉE AU BIBERON n'est statistiquement pas discriminant. Les propos seront nuancés dans la discussion. Validité contre-critère Nous avons donc pu corréler les scores du questionnaire aux résultats du bilan de 9 enfants : 7 enfants reçus en bilan et évalués en binôme avec une autre étudiante, et 2 enfants dont l'évaluation a été menée par une orthophoniste, comme expliqué auparavant. La répartition de la population dépistée à qui nous avons soumis un diagnostic peut se scinder en 4 types : les vrais négatifs sont les sujets pour qui le questionnaire de dépistage était sain , soit ayant peu de risques d'être porteur de troubles, ce qui est confirmé par le bilan qui écarte la présence d'un TOA. les vrais positifs sont les sujets pour qui le questionnaire de dépistage était à risque de développer un TOA , ce qui est confirmé par le diagnostic posé en fin de bilan. les faux négatifs sont les sujets pour qui le questionnaire de dépistage était sain , soit ayant peu de risques d'être porteur de troubles, ce qui est malheureusement remis en cause par le bilan qui atteste la présence d'un TOA. les faux positifs sont les sujets pour qui le questionnaire de dépistage était à risque de développer un TOA , ce qui est infirmé par le bilan qui écarte la présence d'un TOA. A noter que, pour le tableau ci-après, la mention 0 correspond à un enfant dit sain lors du questionnaire de dépistage ou du bilan et que la mention 1 correspond à un enfant dit à risque de développer un TOA lors du questionnaire de dépistage et pathologique lors du bilan. 59 Figure 40 : Comparaison des scores au questionnaire de dépistage et du résultat au bilan orthophonique. Afin de lire de manière optimale ce tableau, dans lequel il faut croiser les données, nous avons fait parler les chiffres en ces termes : 83. 3% étaient dits sains grâce au questionnaire de dépistage et le sont réellement suite au bilan (vrais négatifs). 16. 7% étaient dits sains grâce au questionnaire de dépistage et sont finalement porteurs de TOA (pathologiques) après le bilan. En d'autres termes, il y a un faux négatif (sur les 8 enfants vus en bilan). Donc, il y a 33. 3% des enfants pour qui le bilan révèle des troubles (pathologiques) alors que le questionnaire n'en avait pas suspecté. Il y a 100. 0% des enfants pour qui le bilan ne révèle pas de TOA qui étaient dits sains lors du questionnaire de dépistage. 0. 0% des enfants (soit aucun enfant) étaient dits à risque de développer un TOA grâce au questionnaire et ne le sont finalement pas suite au bilan. Il n'y a donc aucun faux positif. 100. 0% des enfants qui étaient dits à risque de développer un TOA grâce au questionnaire de dépistage l'étaient bel et bien suite au bilan (vrais positifs). 75. 0% des enfants pour qui le diagnostic de TOA a été posé après le bilan (soit 4 au total) étaient pathologiques lors du remplissage du questionnaire (3 enfants). Il n'y a pas (0. 0%) d'enfant pour qui le bilan n'a révélé aucun trouble alors que le questionnaire de dépistage en avait suspecté. Au total, 5 enfants sur 9 (soit 55. 5%) ne présentent pas de TOA contre 4 sur les 9 vus en bilan qui en sont porteurs (soit 44. 5%). 60 PARTIE DISCUSSION La discussion aura pour principal objectif de critiquer notre travail afin d'offrir une perspective d'amélioration du questionnaire. ANALYSE DES HYPOTHESES DE CETTE ETUDE Hypothèse 1 : Les premières analyses de validation et de fiabilité sont propices à l'acceptabilité de l'outil. Sous-hypothèse 1 : Le questionnaire a une bonne corrélation inter-items. Cette sous-hypothèse est validée, l'indice alpha de Cronbach étant supérieur à 0, 7. Ainsi, nous pouvons admettre que la corrélation inter-items est convenable, ce qui prouve que notre questionnaire dispose d'une cohérence interne satisfaisante et donc que la fidélité de l'outil est correcte. Sous-hypothèse 2 : Le questionnaire a une bonne validité d'apparence et de contenu selon les professionnels interrogés, sensibilisés aux TOA. Selon notre panel d'experts, notre outil a une bonne validité d'apparence et de contenu puisque tous les indices calcules sont supérieurs à 0, 78. Donc, cette sous-hypothèse est également validée. A noter tout de même que la population juge était constituée de 6 jurées, ce qui est suffisant statistiquement pour valider les indices, mais qui semble tout de même peu. Nous avions eu la volonté d'avoir plus de réponses et avions donc distribué le document de validité à 4 autres professionnels (2 neuro-pédiatres, 1 psychomotricienne et 1 ergothérapeute). Il aurait pu être intéressant d'avoir davantage de retours bien que ceux-ci nous apportent déjà des pistes d'amélioration. Nous allons donc détailler ce qui ressort des éléments qualitatifs des jurées. Tout d'abord, la nécessité d'interroger sur les intolérances aux protéines de lait de vache, élément vérifié dans 61 le dossier-patient et qui donc ne figurait pas sur l'outil, mais qui est absolument à vérifier comme le précise la jurée. Puis, demander si l'enfant a bénéficié ou bénéficie d'un suivi en kinésithérapie (puisque l'item choisi ne concernait que la psychomotricité). En effet, cet aspect devrait être ajouté comme le souligne à juste titre l'experte puisque nous nous sommes rendu compte, au cours des appels téléphoniques et des retours de questionnaires par mail, que beaucoup de parents indiquaient que le suivi en psychomotricité n'était pas en place mais que la prise en soins en kinésithérapie avait débutée. Effectivement, bon nombre d'enfants nés prématurément ont recours à la prise en soins en kinésithérapie et il a été prouvé que l'intervention précoce est essentielle au développement de la fonction motrice chez les nourrissons à risque (Coutinho et al. , 2014). Rappelons également que la fonction motrice en matière d'oralité alimentaire est incontournable. Ainsi, cette notion serait à prendre en compte. De plus, il nous a été conseillé d'étayer davantage les aspects sensoriels en contextualisant les prises alimentaires (les environnements : lieux, outils, schémas des repas et dynamique familiale sur les temps d'alimentation). Ces aspects, primordiaux pour déterminer la présence ou non du trouble, ont largement été traités lors du bilan (Annexe 6), ce qui nous paraissait plus logique puisque l'outil a pour objectif premier de dépister en étant concis et clair. Ces éléments demeurent incontournables et doivent être renseignés en bilan pour profiler les axes thérapeutiques et les moyens à mettre en œuvre pour intervenir. Enfin, une des expertes nous fait part de son questionnement personnel quant à l'ajout éventuel d'items évaluant les compétences socles (attention conjointe, mise en place du regard) afin d'écarter un doute de Trouble du Spectre de l'Autisme ou autre suspicion en lien avec un TOA . Ces aspects nous semblent évidemment incontournables pour la pose diagnostique et pour les mêmes raisons que celles évoquées avant, nous avions choisi de les réserver lors de l'évaluation orthophonique. Néanmoins, il est important de souligner que les TOA sont fréquents chez les patients porteurs de Trouble du Spectre de l'Autisme : sélectivité alimentaire (Sharp et al. , 2013) et dyssensorialité orale en lien avec des particularités sensorielles bien plus globales. En somme, la soumission de ce questionnaire de validité nous a permis de statuer sur la validité d'apparence et de contenu d'une manière statistique, mais nous a également permis de récolter des avis personnels et commentaires, sur des aspects plus qualitatifs. Notamment 62 grâce à ce questionnaire, nous allons pouvoir réintégrer de nouveaux items pertinents à notre outil dans la suite de la discussion. Sous-hypothèse 3 : Le questionnaire a une bonne sensibilité : il est composé d'items permettant de discriminer les nourrissons avec haut risques de TOA, des nourrissons sans difficulté. Débutons par faire un retour sur la partie traitant des marqueurs de RGO. Tout d'abord, comme précisé au début de notre étude, le RGO est fréquent chez les enfants nés prématurément. Plusieurs options afin de pallier ce trouble sont disponibles, la première étant les solutions médicamenteuses comme les traitements par Inhibiteurs de la Pompe à Protons tels que l'Inexium qui est recommandé par la HAS (Haute Autorité de Santé, 2020a) afin de réduire l'acidité de l'estomac ou les traitements protecteurs de la muqueuse œsophagienne tels que le Gaviscon . Ainsi, il nous paraissait primordial d'interroger sur la prise de médicaments au sein de l'outil. Pour autant, l'item TRAITEMENT CONTRE LE RGO n'apparat pas comme étant statistiquement discriminant. Néanmoins, nous choisirons tout de même de conserver l'évaluation de cet item mais, nous modifierons la modalité de réponse qui semble peu adaptée. Existent aussi des conseils alimentaires et nutritionnels, qui consistent en l'adaptation des repas ingérés, ce qui, dans le cas du bébé, amènera à choisir un lait anti-reflux ou un lait épaissi, option choisie en première intention par beaucoup de parents. En effet, lors de nos échanges avec les familles, plusieurs d'entre elles nous indiquent la prise de lait anti-reflux. Ainsi, il est intéressant que cet item puisse figurer dans les propositions d'optimisation de l'outil. A savoir qu'il existe également d'autres aménagements environnementaux pour limiter le RGO ou les conséquences de celui-ci comme les adaptations posturales (éviter les positions allongées après le repas puisqu'elles facilitent la remontée du lait). Donc, il parat capital d'interroger sur les signes évocateurs de RGO qui surviennent dans le quotidien puisque la non prise d'un traitement ou d'un lait anti-reflux n'exclut en rien l'hypothèse de reflux. Pour les signes de RGO, les items les plus significatifs statistiquement sont ROT , TOUX et STRIDOR . Si nous avons déjà rappelé auparavant l'importance de détecter la présence 63 éventuelle d'un RGO nous pouvons maintenant affirmer qu'il est tout à fait pertinent d'avoir introduit dans cet outil des signes évocateurs de RGO tels que la toux en position allongée, le rot et le stridor. A noter tout de même, comme l'ont justement mentionné la plupart des experts du jury de validité, que le stridor est à expliquer dans l'outil. D'ailleurs, lors des remplissages de questionnaire par téléphone, peu voire aucun parent ne connaissait ce terme qui nécessitait une définition pour que les parents prennent position quant à leur réponse. Maintes fois, cet item nous a semblé peu clair car peu compris par les parents et nous a donc questionné sur la nécessité de l'intégrer mais la littérature est claire à ce propos, le stridor est réellement un signe évocateur discriminant de RGO (Nierlson et al. , 1990) et donc il n'est pas recommandé de l'écarter. Pour finir sur les signes de RGO, nous avions aussi inséré l'item HALEINE qui apparat, au vu du test utilisé mais aussi, plus qualitativement si nous observons le graphique, comme étant non discriminant. Pour autant, la nécessité de garder cet item est claire et mise en avant par la corrélation entre halitose (mauvaise haleine) et RGO qui a été prouvée par la communauté scientifique (Moshkowitz et al. , 2007). A noter aussi que l'échantillon trop faible de notre population d'étude est certainement un biais à la mise en avant de l'halitose comme étant un signe évocateur de RGO. Poursuivons sur l'analyse des items traitant des signes de rejet alimentaire. Ceux qui apparaissent comme discriminants statistiquement sont GRIMACE , REFUS et PROTRUSION qui sont trois éléments retrouvés fréquemment en clinique lors des bilans orthophoniques et qui apparaissent donc très importants et à conserver. Pour ce qui est des cinq autres items, ils ne sont pas significatifs au vu des statistiques. Cependant, pour chacun des DE DOULEUR/D'INCONFORT , PLEUR , TOUX lors de la prise alimentaire , au regard des graphiques, nous pouvons observer qu'il y a plus de réponses du groupe susceptible de développer un TOA à partir de la note 2 parfois observé , ce qui prouve tout de même qu'il y a une légère tendance à ce que ce groupe présente ces signes. En effet, si nous nous référons à la clinique, puisque la littérature manque à ce propos, il est très fréquent que les parents nous rapportent des pleurs et des signes de douleur / d'inconfort pendant l'anamnèse ou même lors des passations de questionnaire au téléphone. Effectivement, à plusieurs reprises, des parents ont rapporté une agitation motrice, une excitation, des colères/pleurs 64 VOMISSEMENT NAUSÉEUX , items RÉFLEXE SIGNES lors des repas, signes interprétés à juste titre comme une demande d'arrêt ou un refus. Quant au réflexe hypernauséeux, qui consiste en l'inversion du processus de déglutition en réponse à une stimulation gustative ou odorante afin de ne pas avaler des substances qui gênent considérablement sur le plan sensoriel, il est très souvent rapporté dans les anamnèses ou visibles lors du testing orthophonique (Senez, 2004). A noter que, parfois, cette réaction exacerbée peut même aller jusqu'au vomissement ; c'est d'ailleurs ce que 25% du groupe d'enfants à risque de développer un TOA rapportent comme signe de refus qui survient parfois . Tous les signes de refus alimentaire insérés au questionnaire sont largement retrouvés en pratique clinique. Aussi, Senez écrit Alors, nous souhaitons garder l'intégralité des items dans la version optimisée du questionnaire. Continuons alors avec l'analyse critique des items traitant des aspects sensori-moteurs. Les items les plus significatifs statistiquement sont PRÉHENSION D'UN OBJET , GÊNE PENDANT LES SOINS DU VISAGE , et GÊNE QUAND LES MAINS SONT SALES . En plus de la preuve statistique, ces items sont fréquemment retrouvés en clinique comme étant des marqueurs importants de capacités sensori-motrices. Comme expliqué précédemment, les habiletés sensorielles et motrices sont au cœur de l'oralité alimentaire secondaire et méritent d'être investiguées en phase de dépistage. Approfondies et décrites en détails lors de l'évaluation orthophonique, ces facultés sensori-motrices constituent un axe thérapeutique primordial lors de la rééducation. Ainsi, il nous parat incontournable de garder ces items. Quant aux items TOUCHE LA NOURRITURE AVEC SES DOIGTS , TIENT SA TÊTE , TIENT ASSIS , SUIVI PSYCHOMOTEUR , GÊNE LORS DU SHAMPOING , et GÊNE LORS DU TOUCHER DE TEXTURES , ils ne sont statistiquement pas discriminants. Les items TIENT SA TÊTE , TIENT ASSIS et SUIVI PSYCHOMOTEUR ont montré des résultats incohérents : plus d'enfants considérés comme étant sans difficultés notables avaient un suivi psychomoteur et n'arrivaient pas à tenir assis ou à maintenir leur tête sans osciller. Ainsi, nous nous sommes questionnés sur la formulation de ces questions. Plusieurs jurés qui ont donné leur avis concernant la validité du questionnaire ont émis que les items TIENT SA TÊTE , TIENT ASSIS étaient moins clairs et moins simples que d'autres. Aussi, à plusieurs reprises, les parents interrogés se questionnaient sur la posture assise tient-il assis seul ? sans appui ? ou avec appui ? se met-il assis seul ? . Il faudrait donc préciser ces items pour le questionnaire optimisé. Les questionnements soulevés par les experts et les 65 l'enlever. Les parents pour l'item SUIVI PSYCHOMOTEUR sont les suivants : pourquoi ne pas interroger sur le suivi en kinésithérapie ? . Ainsi, puisque cet item ne nous semble pas révélateur de troubles potentiels, nous avons décidé de items GÊNE LORS DU SHAMPOING , GÊNE LORS DU TOUCHER DE TEXTURES seront conservés malgré le manque de preuves de significativité statistique puisque, si l'on regarde de manière subjective les graphiques, nous pouvons observer qu'aucun enfant sans difficultés notables n'a de gêne lors du shampoing alors qu'une partie des enfants à risque de développer un TOA en a et c'est le même constat pour les textures qui gênent davantage les enfants à risque. En lien avec la pratique orthophonique o ces constats sont manifestes, il nous parat donc judicieux d'interroger sur ces points. Quant à l'item TOUCHE LA NOURRITURE AVEC SES DOIGTS , nous ne pouvons tirer de conclusion sur ses résultats puisque sa formulation n'était pas uniformisée avec les autres. Nous garderons cet item en le modifiant, puisqu'il est largement observé lors des bilans orthophoniques. En effet, un enfant qui est gêné pour explorer sa nourriture tactilement présente des particularités sensorielles qui interrogent sur un potentiel trouble alimentaire. Si nous analysons maintenant les items mettant en exergue le déroulement alimentaire nous pouvons voir que les items les plus significatifs sont INQUIÉTUDE DES PARENTS , DURÉE DE LA PRISE ALIMENTAIRE et QUANTITÉ INGÉRÉE À LA CUILLER . Ils seront donc gardés. Les items DÉPLAISIR DE L'ENFANT et QUANTITÉ INGÉRÉE AU BIBERON ne sont statistiquement pas discriminants. Pourtant, ils seront conservés au sein du questionnaire puisque le déplaisir est un ressenti subjectif au même titre que l'inquiétude des parents et semble indispensable à prendre en compte notamment dans le suivi orthophonique. En effet, la gêne et/ou le déplaisir ressentis amènent une plainte qui, à cet âge, est rarement voire jamais exprimée par le patient lui-même. Donc, il est important, selon nous, de savoir que les repas et que impacts fonctionnels. De surcrot, connatre la quantité ingérée au biberon demeure intéressante pour la confronter qualitativement avec la quantité ingérée à la cuiller. Nous terminerons par émettre une critique des items concernant la diversification alimentaire. Statistiquement, l'item PRÉFÉRENCE ENTRE POTS FAIT-MAISON ET POTS INDUSTRIELS apparat comme étant significatif. Pourtant, si nous observons de plus près le 66 l'alimentation sont déplaisants pour essayer d'objectiver les graphique, la majorité des enfants à risque de TOA ne montre pas de préférence et une infime partie de ce groupe a une préférence marquée pour les pots industriels ou pour les pots fait- maison. Ce constat ne corrobore que peu avec la pratique orthophonique : de manière récurrente, les enfants pris en soins pour une dysoralité alimentaire préfèrent les petits pots industriels puisque leur texture, très lisse avec absence certaine de morceaux, ne va pas varier d'un repas à l'autre. Les purées fait-maison sont moins appréciées par ces enfants puisque la texture ne sera jamais exactement la même d'un repas à un autre et que la présence de morceaux moins lisses peut les gêner. Ainsi, cette question, pour laquelle nous ne retrouvons pas cette tendance classique des cabinets d'orthophonie, pourrait être supprimée. L'item ACCEPTATION DE LA CUILLER n'est pas statistiquement pas discriminant et a apporté bien des questionnements parentaux. Effectivement, lors des remplissages téléphoniques, les parents ne comprenaient pas toujours cette interrogation. Un des jurés du panel d'experts ayant objectivé la validité d'apparence et de contenu nous a aussi rapporté que cette question était moins claire. Ici, l'objectif était de savoir si la diversification alimentaire était bien tolérée par l'enfant selon le parent répondant. Ainsi, nous opterons plutôt pour la formule L'alimentation à la cuiller est-elle difficile selon vous ? dans la version optimisée du questionnaire. Quant à l'item ESSAI DES MORCEAUX , il demeure non significatif aux yeux des statistiques, même si la proportion de réponses NON est plus importante dans le groupe d'enfants à risque de développer un TOA. Cet item nous apporte assez peu d'éléments puisqu'il parat totalement évident que les enfants peu à l'aise avec l'alimentation diversifiée ne se sont pas vus goûter des morceaux. Ainsi, cet item n'a pas lieu de rester au sein du questionnaire. Sous-hypothèse 4 : La cohérence du diagnostic renforce la validité du questionnaire. Force est de constater que les rappels et relances sur la proposition de rendez-vous pour des bilans orthophoniques ont permis de rencontrer plus de patients que dans l'étude précédente, mais pas assez pour valider cette hypothèse qui est donc partiellement atteinte. En effet, il aurait fallu pouvoir voir les 43 enfants interrogés par questionnaire afin d'avoir une interprétation au maximum fiable des chiffres. Nous avons tout de même eu l'envie de mettre en place cette cohérence diagnostic/dépistage en invitant l'intégralité des sujets à se présenter à nous pour une évaluation orthophonique et pas seulement les bébés ayant été 67 détectés comme susceptibles de développer un TOA puisque nous avions à cœur de prouver que l'outil était capable de dépister un trouble et d'écarter un non trouble. Si nous observons de plus près la population qui a été vue en bilan nous pouvons voir que 4 enfants sont venus alors qu'ils avaient un score global < 16 les plaçant dans le groupe des bébés sans difficultés notables et que 5 enfants avaient été considérés comme susceptibles de développer un TOA, leur score global étant supérieur ou égal à 16. A noter tout de même qu'il y avait un faux négatif (enfant nommé J. ), comme précisé dans les résultats (Annexe 8). Cette notion amène donc une interrogation capitale : pourquoi accepter une rencontre si l'enfant semble manger sans encombre lors du remplissage du questionnaire ? Premier élément de réponse : la question de l'évolution de la plainte, qui est primordiale. En effet, si nous reprenons le cas du bébé dit faux-négatif, la maman accompagnatrice de J. , lors du rendez-vous nous a formulé une plainte alimentaire importante et a précisé qu'à la date du remplissage du questionnaire tout allait pour le mieux. De fait, l'écart de date entre la passation du questionnaire (les enfants avaient majoritairement entre 8 et 9 mois) et l'évaluation orthophonique (les enfants avaient plutôt 11 ou 12 mois d'âge réel) est un potentiel biais pour la validité contre-critère. Second élément de réponse à notre questionnement : le stress et l'angoisse dans lesquels vivent les parents d'enfants nés prématurément. Effectivement, plusieurs fois lors des rencontres avec les familles, lorsque nous demandons la raison de leur venue, elles répondent nous préférions nous assurer que tout allait bien, et si tel n'était pas le cas, nous préférons mettre en place des stratégies rapidement . C'était le cas des enfants nommés M. (Annexe 9), R. (Annexe 10), H. (Annexe 11), I. (Annexe 12) et L. (Annexe 13). Pour les enfants dont la plainte alimentaire était bien présente dès la passation du questionnaire et persistait, comme pour D. (Annexe 14), K. (Annexe 15), la raison de leur venue était, elle, plus claire et davantage ciblée. Pour le cas de l'enfant que l'on appellera Is. (Annexe 16) c'est l'inverse de J. , la plainte alimentaire était présente et importante aux 8 mois mais avait disparu lors de notre rencontre, qu'ils ont préféré maintenir pour pouvoir s'entretenir avec nous et poser leurs questions. Hypothèse 2 : La forme d'administration du questionnaire est à ce jour satisfaisante. 68 L'outil utilisé, construit au regard de la littérature et des besoins actuels de dépistage précoce afin d'améliorer la prise en soins des enfants porteurs de TOA, a été validé par l'équipe de jurées interrogées pour donner leurs avis quant à la clarté, la simplicité et la pertinence du questionnaire. Ainsi, à ce jour, la forme d'administration du questionnaire s'avère plutôt satisfaisante. Pour autant, il nous parat peu probable qu'il soit intégré au sein du service sous sa forme de passation actuelle. À noter également que les changements de formulation et les propositions d'ajouts ou de suppression d'items doivent aussi y être intégrés. Pour rappel, il a été soumis (par mail ou par téléphone) à des parents d'enfants nés prématurément à 8 mois d'âge réel, au moment de la diversification alimentaire. Dans tous les cas, la première intention de contact se faisait au téléphone et le taux de perte de sujets entre la cohorte de la première étude et la nôtre demeure assez faible (5 non-répondants et 1 enfant décédé), ce qui nous apporte un élément de réponse important : le contact en synchrone est plus apprécié et amène un taux de participation plus important. Pourtant, nous savons que les appels téléphoniques demeurent chronophages. Ainsi, nous avons réfléchi à optimiser cette passation de questionnaire tout en évitant la modalité asynchrone (mail ou courrier). Aussi, nous avons réfléchi à proposer ce questionnaire à des enfants légèrement plus âgés, au vu de leur prématurité, parfois très grande. Effectivement, parfois, nous appelions au tout début de la diversification alimentaire et les expériences à la cuiller étaient alors assez réduites. Donc, l'âge réel de 8 mois serait à revoir. De plus, nous nous sommes posé une question essentielle : comment faire passer ce questionnaire parental en systématique à tous les enfants prématurés du service ? Ainsi, en tenant compte des remarques qui viennent d'être évoquées, nous avons pensé à faire passer ce questionnaire à la visite pédiatrique systématique des 12 mois de l'enfant. Lors de ce rendez-vous, les auxiliaires puéricultrices du service ont été formées à proposer l'Inventaire Français du Développement Communicatif (Kern et al. , 2010), qui est également un questionnaire parental évaluant le développement langagier et communicatif du bébé de 8 à 30 mois. À l'instar de la passation de l'IFDC, notre outil pourrait être proposé aux familles. Au besoin, en cas d'illettrisme ou de barrière de la langue, par exemple, les auxiliaires de puériculture pourraient lire les items aux parents. Ainsi, le questionnaire d'alimentation serait administré à tous les enfants nés prématurément, puis, analysé par le pédiatre qui orienterait les familles vers un orthophoniste en libéral si nécessaire. Cette option nous parat être la plus 69 judicieuse, puisque finalement la mission de dépistage et d'intervention orthophonique précoces serait alors correctement remplie. CRITIQUES METHODOLOGIQUES Points d'appui D'après notre panel d'experts, l'outil conçu respecte ses engagements tant sur le fond que sur la forme : court et compréhensible, les professionnelles interrogées seraient favorables à la mise en place systématique de ce questionnaire en service de suivi des enfants prématurés. Son contenu est clair et simple, donc accessible à une majorité de personnes ; mais aussi ses items sont pertinents et permettent de mettre en avant les enfants avec des risques potentiels de TOA. Les avis de ces juges corroborent les résultats objectifs répertoriés avec 100% de vrais positifs et 1 faux négatif sur 9 enfants vus en bilan. Bien que les résultats doivent être pris avec prudence puisque le nombre d'enfants évalués demeure minime, nous soulignons que le bilan a pu être réalisé chez trois fois plus d'enfants que lors de la précédente étude. Au cours des échanges avec les parents, nous relevons également qu'ils ont fortement apprécié le suivi mis en place et les conseils prodigués. En restant disponible par mail ou par téléphone, les parents n'ont pas hésité à nous recontacter pour demander conseil, aussi bien après leur réponse au questionnaire qu'après les évaluations orthophoniques au besoin. En effet, les familles pour qui les enfants avaient été diagnostiqués et qui se sont vu prodiguer des conseils, ont été jointes ultérieurement au bilan pour suivre l'avancée, répondre aux éventuelles questions et craintes. Des rendez-vous de suivi ont même été proposés si nécessaire. La méthodologie mise en place permet de respecter l'engagement du dépistage et d'intervention précoces en appuyant cette dernière via la guidance parentale. Effectivement, l'idée de l'accompagnement parental est très intéressante pour les prises en soins de troubles alimentaires. Le but est de prodiguer des conseils parentaux adaptés et individualisés au profil de l'enfant. Ramsay en a listé quelques-uns et notamment, expliquer, en amont, les aspects physiologiques de l'alimentation et les étapes du processus alimentaire. Aussi, l'objectif est d'aider le cheminement d'acceptation du trouble : ce n'est pas volontairement que l'enfant refuse de se nourrir mais bien qu'il existe des contraintes organiques, motrices, sensorielles et/ou environnementales associées. Soumettre ces conseils 70 les parents dans et adaptations a pour but principal de réduire les tensions engendrées par le TOA (Ramsay, 2001). Pour prodiguer des conseils avisés aux patients lors de la restitution du bilan, nous nous sommes servis de plusieurs outils qui recensent des activités à faire au quotidien avec l'enfant, mais aussi des conseils d'adaptation de l'environnement (outils comme la cuiller, le siège notamment). Points à renforcer et optimisation du questionnaire Néanmoins, la méthodologie choisie comporte des limites. Premièrement, discutons de la méthodologie de passation des questionnaires. Le choix du canal de remplissage du questionnaire serait à lisser, et comme dit précédemment, la passation synchrone s'avère plus opportune (meilleure compréhension des questions, échanges si besoin et notamment début de l'accompagnement parental). Puis, nous rappelons l'apport considérable et intéressant du questionnaire de validité soumis au panel d'expertes mais nous devons admettre que nous avons été pris par le temps pour les envois. En effet, les enfants de la cohorte ayant 8 mois d'âge réel durant l'été 2020, nous n'avons pu soumettre le questionnaire de validité en amont des passations du questionnaire parental, alors que c'est ce qu'il aurait fallu faire afin de réajuster l'outil soumis à validation. Aussi, la décision de soumettre le questionnaire de validité en version papier remis en main propre ou par courriel n'était pas judicieux. La création de ce questionnaire sous format informatisé o les répondants peuvent le remplir instantanément aurait été préférable et aurait permis, d'après nous, un plus grand nombre de retours. Deuxièmement, la méthode versant statistique serait à améliorer. Le choix d'insérer plusieurs modalités de cotation n'a pas facilité l'exploration et l'analyse des données. De surcrot, et c'est un biais auparavant évoqué, la formulation des questions est à revoir. Pour finir, nous pouvons discuter la passation de ce questionnaire. Au vu de notre approche, il nous paraissait évident que tous les enfants devaient être vus à nouveau après le questionnaire pour le valider. Pour autant, un laps de temps trop important entre le questionnaire et l'évaluation orthophonique a été relevé comme étant une limite. Cependant, cet écueil pose question. Même si la passation du questionnaire pourrait se faire lors de la visite pédiatrique des 12 mois, le bilan orthophonique pourrait difficilement être fait 1 à 2 semaines après. En effet, malgré les créneaux d'urgence mis en place dans plusieurs cabinets 71 libéraux, le temps d'attente pour un bilan chez un orthophoniste dépasse régulièrement cette fourchette temporelle idéale pour corréler le questionnaire et le bilan. Au terme de ces critiques, nous avons donc révisé le questionnaire pour en créer un nouveau qui tient compte des éléments discutés (Annexe 17). EFFETS DE LA PRISE EN SOINS PRECOCE Apports de cette étude au regard de la précédente L'étude menée faisant suite au travail mené chez les mêmes enfants, nés prématurément, et interrogés 1 mois post-hospitalisation en service de néonatalogie, nous allons maintenant faire figurer les apports de la poursuite de la recherche. Dans l'étude précédente, la cohorte de 49 sujets comptabilisait 18 bébés à risque de développer un TOA, suspectés via le questionnaire (Cugnet, 2020). Parmi ce groupe, 3 avaient été reçus en bilan et nous les nommerons L. , T. et B. Après évaluation orthophonique, le diagnostic de TOA avait seulement été posé pour L. et T. Ainsi, l'étude avait mis en avant 2 vrais positifs et 1 faux positif. Parmi ces 3 enfants, dans notre travail actuel : L. est décédé, T. n'a pas répondu au questionnaire donc nous pouvons en conclure que la nécessité de suivi n'était pas importante et par conséquent, que le travail de guidance parentale mis en place a suffi, et B. poursuit son développement normal faisant partie du groupe sans risque de développer un TOA dans notre travail actuel. Il est d'une part possible qu'un suivi ait commencé avec un orthophoniste après le bilan, ce qui aurait entrané la non-réponse à notre questionnaire. D'autre part, nous pouvons supposer que notre recherche a permis de mettre en avant les bienfaits de l'accompagnement parental pour une famille. Effectivement, nous pouvons présager que les conseils prodigués dans le cadre de leur évaluation orthophonique leur ont permis d'être autonomes dans leur adaptation et qu'ils n'aient pas eu besoin de consulter à nouveau. En effet, la guidance parentale, et notamment la collaboration avec les parents est intéressante pour modifier la trajectoire développementale. Assurément, au-delà de prodiguer des informations aux aidants, d'échanger avec eux et de les écouter, nous pouvons les intégrer à la prise en soins en les rendant plus acteurs. Cette intervention se trouverait dans le second type d'accompagnement familial parmi les 3 qui sont référencées : 72 la collaboration avec les parents (Auzias et al. , 2011). Ainsi, les préconisations apportées par l'orthophoniste pour les parents élargissent les ressources à leur disposition ainsi que leur rôle : ils s'imprègnent des avis et de ce que fait le thérapeute en séance pour reproduire, dans le quotidien, les principes suggérés. Sur les 18 enfants dépistés comme étant à risque de développer un TOA primaire, 6 le sont toujours après interrogation de notre questionnaire d'oralité secondaire. Parmi ces 6, le diagnostic a été avancé pour 2 enfants, D. et K. , qui ont été évalués en bilan. Les 12 autres ne sont plus considérés comme étant à risque. Notre étude prouve donc le besoin de suivre ces enfants nés prématurément sur le moyen voire le long terme puisqu'ils multiplient les risques d'être porteurs de troubles. Aussi, sur les 31 enfants repérés comme étant sans difficultés notables durant la période d'oralité primaire, 5 ont été dépistés comme étant à risque de développer un TOA secondaire par le questionnaire. Parmi eux, un bébé, Is. , a été diagnostiqué avec un TOA suite à l'évaluation orthophonique. Ces observations corroborent la littérature récente qui admet que les bonnes compétences lors de l'oralité primaire (succion notamment) ne sont pas prédictives de bonnes compétences mastication ou d'alimentation à la cuiller chez des ex- prématurés en bonne santé (Hbl et al. , 2020). Donc, comme démontré par Sheppard, c'est l'apprentissage moteur, très spécifique dans l'oralité secondaire, qui serait davantage prédictif (Sheppard, 2008). Ainsi, à la lumière de nos résultats, il apparat principal de conserver l'évaluation de l'oralité secondaire puisque l'apparition de l'outil cuiller et de l'alimentation solide constituent des facteurs de risque de TOA, souvent repérés en clinique comme étant la plainte initiale. Apports de cette étude pour la pratique orthophonique Il est vrai, comme souligné ci-avant, que la plainte initiale des familles qui consultent l'orthophoniste pour des difficultés alimentaires demeure formulée fréquemment ainsi : la diversification alimentaire est difficile ou bien encore plus souvent mon enfant ne mange aucun morceau . Le but de ce travail était de déceler précocement les fragilités qui pourraient survenir chez des enfants nés prématurés afin de mettre en place une intervention orthophonique précoce, 73 notamment par le biais de la guidance parentale. Nous avons vu jusqu'alors que la nécessité de conserver un questionnaire à 1 mois post-hospitalisation n'était pas le plus opportun mais que dépister d'éventuelles fragilités sur l'oralité secondaire aux 12 mois de l'enfant paraissait plus significatif. Nous pouvons ajouter également que, dans la bote à outils de l'orthophoniste, il n'existe pas, à notre connaissance, de tests objectivant les difficultés alimentaires de manière étalonnée sur la tranche d'âge présentement concernée, ni d'outil de dépistage. Cependant, pour des jeunes enfants tout de même un peu plus âgés nous avons des outils type questionnaires à notre disposition pour étayer nos observations cliniques afin d'appuyer notre hypothèse diagnostique. Il existe notamment l'Inventaire du Développement de l'Enfant, dans sa version complète, qui est étalonné de 15 mois à 5 ans 11 mois. Dans ce questionnaire, les domaines qui nous intéressent sont autonomie , moteur global , moteur fin et développement général (Duyme et al. , 2011). Toutefois, aucune investigation des habiletés sensorielles ne figure dans ce test. Les aspects sensoriels pouvant être évalués via le Profil Sensoriel, étalonné de 3 ans à 10 ans 11 mois (Dunn, 2010). Ainsi, l'intérêt de créer un questionnaire de dépistage regroupant tous les domaines à investiguer en bilan et de l'administrer en systématique est multiple. Le premier apport est le fait de faire le dépistage de fragilités de manière tout à fait précoce afin de mettre en place le plus rapidement possible l'intervention orthophonique et de profiter de la grande plasticité cérébrale pour modifier les comportements le cas échéant. De plus, le fait de dépister lors du rendez-vous pédiatrique obligatoire des 12 mois est moins chronophage que de prévoir un entretien annexe pour faire le questionnaire si jamais la mise en place de soins orthophoniques n'était pas prégnante. Le deuxième avantage de cette passation fixée à 12 mois, en même temps que l'évaluation de la communication et du langage par l'IFDC, est de faire des liens entre oralité alimentaire et oralité verbale. En effet, ces deux fonctions sont intrinsèquement liées comme nous avons pu auparavant le préciser dans cet écrit mais aussi comme nous avons pu le voir lors des bilans d'évaluation orthophonique puisque nous investiguions les deux pans. Ce questionnaire parental semble donc un outil réellement intéressant et aidant pour la pratique orthophonique. Si nous prenons l'exemple d'un enfant prématuré qui consulterait aux environs de ses 24 mois en orthophonie parce qu'il refuse de manger les morceaux, nous pourrions avoir, au même titre que le résultat à l'IFDC, l'état de ses compétences sensori-motrices et de l'alimentation à 12 mois dans le dossier médical, ce 74 qui demeurerait d'une grande aide pour analyser le profil de ce patient et pour établir le diagnostic. Le lien avec le langage oral notamment amène donc des perspectives de poursuite d'étude. Effectivement, il pourrait être tout à fait avantageux de revoir les enfants de la cohorte pour évaluer leur langage oral à 2 ou 3 ans par exemple. D'autant plus que nous savons que les enfants nés prématurément sont plus à risque de troubles des apprentissages et notamment de trouble du développement du langage oral, et même de trouble spécifique du langage écrit, comme auparavant précisé dans cet écrit. Afin de conclure cette discussion, ce travail nous a grandement apporté dans l'élaboration de notre identité professionnelle en tant que future thérapeute et l'outil mis en place, bien que statistiquement peu robuste, a un grand intérêt clinique et pratique. Cette recherche nous a également permis d'automatiser notre expérience d'évaluation, de l'anamnèse à la restitution en passant par le testing. Puis, au détour des échanges avec les familles, mais aussi grâce aux avis critiques des professionnelles juges, et par l'optimisation de l'outil initialement créé, nous avons appris à mieux cerner la systémique de l'enfant prématuré ainsi que les conséquences de cette naissance pré-terme notamment sur le développement alimentaire mais aussi sur le développement communicatif, langagier et global. 75 CONCLUSION Si l'oralité alimentaire intéresse depuis deux décennies les équipes soignantes, notamment lorsqu'elle est en lien avec un public d'enfants prématurés, c'est parce qu'elle demeure un enjeu de santé publique important. Effectivement, afin de réduire les effets à long terme de la naissance prématurée et puisque ces enfants sont mieux pris en soins sur le plan médical, il est tout autant important que l'orthophonie s'insère dans la boucle. Donc, pour faciliter l'entrée de l'évaluation et des soins orthophoniques dans la prise en charge globale des bébés nés prématurément, l'outil créé s'avère intéressant. Effectivement, bien que peu robuste statistiquement, ce questionnaire parental a tout de même permis de distinguer des enfants dits sans difficultés notables des bébés dits à risque de développer un TOA, tendance confirmée par l'évaluation orthophonique avec pose de diagnostic, ce qui permet d'avancer le caractère correct de la pré-validation. Néanmoins, cet outil pourrait largement être amélioré, tant par sa passation, pouvant être proposée au rendez-vous pédiatrique des 12 mois, que par son contenu et notamment par sa cotation qui devrait être harmonisée. Proposer cet outil en physique permet de conserver les échanges enrichissants qui ont été menés par téléphone durant cette étude. Le début de l'accompagnement parental a pu débuter à ce moment tout en apaisant les familles car le contexte de prématurité engendre fréquemment de l'anxiété chez les parents notamment. Répondre aux questions et prodiguer des conseils en parallèle de l'outil de dépistage semble un format opportun. L'autre avantage primordial de ce questionnaire parental chez le tout petit est l'intervention précoce, ce qui est indispensable pour agir en ayant plus d'impact fonctionnel. Ainsi, il est capital que ce questionnaire fasse partie intégrante du parcours de soins des enfants nés prématurément, quel que soit leur degré de prématurité. 76 REFERENCES Abadie, V. , Champagnat, J. , Fortin, G. , et al. (1999). Succion-déglutition-ventilation et gènes du développement du tronc cérébral. Archives de Pédiatrie, 6(10), 10431047. Ameli. (2019). Alimentation du bébé : La diversification alimentaire. Disponible sur diversification-alimentaire Ameli. (2019). Anomalies du déroulement de la grossesse. 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Seminars in 83 ANNEXES Annexe 1 - Questionnaire parental de dépistage des TOA secondaires à 8 mois d'âge réel 84 85 Annexe 2 - Modèle du mail d'envoi des questionnaires 86 Annexe 3 - Listing de gestion des envois des questionnaires 87 Annexe 4 - Tableur : base de données des réponses au questionnaire parental 88 Annexe 5 - Courrier envoyé aux familles pour proposer les rendez-vous de bilan orthophonique 89 Annexe 6 - Grille d'observation du développement de l'oralité alimentaire chez un bébé de moins de 18 mois 90 91 92 93 Annexe 7 - Grille de validité d'apparence et de contenu, soumise à un panel d'experts en TOA 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 Annexe 8 : Compte-rendu de bilan orthophonique de J. 104 105 106 107 108 Annexe 9 : Compte-rendu de bilan orthophonique de M. . 109 110 111 112 113 Annexe 10 : Compte-rendu de bilan orthophonique de R. 114 115 116 117 Annexe 11 : Compte-rendu de bilan orthophonique de H. 118 119 120 121 Annexe 12 : Compte-rendu de bilan orthophonique de I. . 122 123 124 125 Annexe 13 : Compte-rendu de bilan orthophonique de L. . 126 127 128 129 Annexe 14 : Compte-rendu de bilan orthophonique de D. 130 131 Annexe 15 : Compte-rendu de bilan orthophonique de K. 132 133 Annexe 16 : Compte-rendu de bilan orthophonique de Is. 134 135 136 137 138 Annexe 17 : Version révisée du questionnaire parental de dépistage des TOA secondaires à 8 mois d'âge réel. 139 140 Élaboration et pré-validation d'un questionnaire parental de dépistage des troubles de l'oralité secondaire chez des ex-prématurés à 8 mois pour une prise en charge orthophonique précoce Présenté et soutenu par Rébecca D'AMORE Résumé Il est admis que les enfants prématurés, fréquentant les services de néonatalogie prodiguant des soins invasifs pouvant détériorer les habilités sensori-motrices de la sphère oro-faciale, demeurent alors plus à risque de troubles de l'oralité alimentaire (TOA). L'objectif de l'étude était de créer un outil de repérage des difficultés alimentaires précoces de ces enfants vulnérables. De fait, 43 familles d'enfants ex-prématurés ayant déjà reçu un questionnaire parental d'alimentation 1 mois après leur sortie d'hospitalisation ont reçu une nouvelle grille de dépistage des TOA secondaires à 8 mois d'âge réel, au moment de la diversification alimentaire. Puis, 9 enfants de la cohorte ont bénéficié d'un bilan afin d'évaluer objectivement leurs capacités sensori-motrices et alimentaires. L'évaluation orthophonique corrélée au questionnaire à visée de dépistage s'intègre dans le processus de pré-validation. Finalement, l'outil créé permet de dépister à bon escient les 12 sujets à risque de développer un TOA en les distinguant des 31 enfants sans difficultés notables. Néanmoins, le questionnaire pourrait être amélioré, notamment en étant fait passer en systématique à 12 mois lors du rendez-vous pédiatrique, ce qui amènerait des informations sur l'intégration des morceaux et permettrait de débuter efficacement l'accompagnement parental. Mots clés : oralité, trouble de l'oralité alimentaire, prématurité, diversification alimentaire, dépistage précoce, questionnaire parental Development and pre-validation of a parental screening questionnaire for secondary oral feeding disorders in ex-premature infants at 8 months for early speech therapy Summary It is well known that preterm infant, because of intensive cares undergone during their stay in neonatal service that might damage oral sensory-motors abilities, are more exposed to oral sensory feeding disorders. The purpose of the study is to create a tool designed to spot, among these vulnerable children, early feeding issues. Thus, after a first parental questionnaire about feeding received 1 month after the discharge from hospital, 43 families of preterm infant received a second screening of oral sensory feeding disorders at 8 months old, at time of the traditional spoon feeding. Then, 9 children of the cohort have been objectively assessed to measure their sensory-motor and feeding abilities. The speech-therapy assessment and the screening questionnaire have been included in the pre-validation process of the tool. Eventually, this tool allowed to spot 12 children with risks to develop oral sensory feeding disorders by distinguish them from 31 children without noteworthy issues. Nevertheless, the questionnaire could be improved, for example, by a systematic screening at 12 months, which could bring information on introduction of pieces and allow to start a parental guidance. oral feeding, oral sensory feeding disorders, prematurity, early screening, parental questionnaire Key words : Mémoire dirigé par Marie TERRIER 141 | HAL | Scientific |
DEPAKINE 400 mg/4 ml, préparation injectable pour voie I. V. - Résumé des caractéristiques du produit. ANSM - Mis à jour le : 22/03/2022 Ce médicament fait l'objet d'une surveillance supplémentaire qui permettra l'identification rapide de nouvelles informations relatives à la sécurité. Les professionnels de la santé déclarent tout effet indésirable suspecté. Voir rubrique 4. 8 pour les modalités de déclaration des effets indésirables. DEPAKINE 400 mg/4 ml, préparation injectable pour voie I. V. Valproate de sodium. 400 mg Pour 4 ml de solution reconstituée. Ce médicament contient du sodium (voir rubrique 4. 4). Pour la liste complète des excipients, voir rubrique 6. 1. Poudre et solvant pour solution injectable I. V. Après reconstitution : liquide limpide à légèrement opalescent. Traitement temporaire des épilepsies de l'adulte et de l'enfant, en relais de la forme orale lorsque celle-ci est temporairement inutilisable. (par exemple en prévision d'une intervention chirurgicale) : entre 4 et 6 heures après la dernière prise orale, administration intra-veineuse de valproate de sodium dans une solution injectable de chlorure de sodium à 9 pour mille : soit en perfusion continue sur 24 heures, soit de manière fractionnée en 4 perfusions d'une heure par jour, à la posologie antérieure (posologie habituelle moyenne de 20 à 30 mg/kg/jour). : injection intra-veineuse en 5 minutes d'un bolus de 15 mg/kg ; pratiquer ensuite un relais par une perfusion continue, avec un débit de 1 mg/kg/heure à adapter progressivement pour atteindre un taux sanguin d'acide valproïque autour de 75 mg/l. Ajuster ensuite le débit en fonction de l'évolution de la situation clinique. Dès l'arrêt de la perfusion, la reprise du traitement par la forme orale permettra d'assurer une compensation immédiate des quantités éliminées. Elle sera faite soit à la posologie antérieure soit après ajustement posologique. Apparence du produit après reconstitution : liquide limpide à légèrement opalescent. Patients atteints d'insuffisance rénale Chez les patients atteints d'insuffisance rénale, il peut s'avérer nécessaire de diminuer la posologie, et chez les patients sous hémodialyse, il pourra être nécessaire de l'augmenter. Le valproate de sodium est dialysable (voir la rubrique 4. 9). La posologie doit être modifiée selon la surveillance clinique du patient (voir la rubrique 4. 4). Femmes enceintes, sauf en cas d'absence d'alternative thérapeutique appropriée (voir rubriques 4. 4 et 4. 6). Femmes en âge de procréer, sauf si toutes les conditions du programme de prévention de la grossesse sont remplies (voir rubriques 4. 4 et 4. 6). Antécédent d'hypersensibilité au valproate, au divalproate, au valpromide ou à l'un des constituants du médicament. Hépatite aigu. Hépatite chronique. Antécédent personnel ou familial d'hépatite sévère, notamment médicamenteuse. Porphyrie hépatique. Patient ayant des troubles connus du cycle de l'urée (voir rubrique 4. 4). Le valproate est contre-indiqué chez les patients souffrant de troubles mitochondriaux connus, causés par des mutations du gène nucléaire codant l'enzyme mitochondriale polymérase (POLG), par ex. le syndrome d'Alpers-Huttenlocher, et chez les enfants de moins de deux ans suspectés d'avoir un trouble lié à la POLG (voir la rubrique 4. 4). Association au millepertuis (voir rubrique 4. 5). Mises en garde spéciales Convulsions aggravées Comme avec les autres antiépileptiques, la prise de valproate peut être suivie, au lieu d'une amélioration, d'une aggravation réversible de la fréquence et de la sévérité des convulsions (incluant l'état de mal épileptique) ou de l'apparition de nouveaux types de convulsions chez le patient. En cas de convulsions aggravées, il doit être recommandé au patient de consulter immédiatement son médecin (voir rubrique 4. 8). Ces convulsions sont à distinguer de celles qui peuvent survenir lors d'une interaction pharmacocinétique (voir rubrique 4. 5), d'une toxicité (hépatopathie ou encéphalopathie - voir rubriques 4. 4 et 4. 8) ou d'un surdosage. Ce médicament se transformant dans l'organisme en acide valproïque, il convient de ne pas l'associer à d'autres médicaments subissant cette même transformation afin d'éviter un surdosage en acide valproïque (par exemple : divalproate, valpromide). R q e de n o e u e o e L'administration doit être effectuée par voie strictement intraveineuse. Ne pas injecter par voie intramusculaire. Conditions de survenue Des atteintes hépatiques d'évolution sévère parfois mortelle ont été rapportées exceptionnellement. Les nourrissons et les jeunes enfants de moins de 3 ans présentant une épilepsie sévère et notamment une épilepsie associée à des lésions cérébrales, un retard psychique et (ou) une maladie métabolique ou dégénérative d'origine génétique, sont les plus exposés à ce risque. Au-delà de l'âge de 3 ans, l'incidence de survenue diminue de façon significative et décrot progressivement avec l'âge. Dans la grande majorité des cas, ces atteintes hépatiques ont été observées pendant les 6 premiers mois de traitement, le plus souvent entre la 2ème et la 12ème semaine et, généralement au cours de polythérapie antiépileptique. Signes évocateurs Le diagnostic précoce reste avant tout basé sur la clinique. En particulier, il convient de prendre en considération notamment chez les patients à risque (voir conditions de survenue) 2 types de manifestations qui peuvent précéder l'ictère : d'une part des signes généraux non spécifiques, généralement d'apparitions soudaines tels qu'asthénie, anorexie, abattement, somnolence, accompagnés parfois de vomissements répétés et de douleurs abdominales, d'autre part, une réapparition des crises épileptiques alors que le traitement est correctement suivi. Il est recommandé d'informer le patient, ou sa famille s'il s'agit d'un enfant, que l'apparition d'un tel tableau doit motiver aussitôt une consultation. Celle-ci comportera, outre l'examen clinique, la pratique immédiate d'un contrôle biologique des fonctions hépatiques. Détection Pendant les 6 premiers mois du traitement, une surveillance des fonctions hépatiques doit être périodiquement pratiquée. Parmi les examens classiques, les tests reflétant la synthèse protéique et notamment le TP (taux de prothrombine) sont les plus pertinents. La confirmation d'un taux de prothrombine anormalement bas, surtout s'il s'accompagne d'autres anomalies biologiques (diminution significative du fibrinogène et des facteurs de coagulation, augmentation de la bilirubine, élévation des transaminases - voir rubrique 4. 4), doit conduire à arrêter le traitement par ce médicament (ainsi que par prudence et s'ils sont co-prescrits, les dérivés salicylés, puisqu'ils utilisent la même voie métabolique). Pancréatite Des cas de pancréatites dont l'évolution est parfois mortelle ont été très rarement rapportés. Ils peuvent s'observer quels que soient l'âge et l'ancienneté du traitement, les jeunes enfants paraissant particulièrement exposés à ce risque. Les pancréatites d'évolution défavorable sont généralement observées chez le jeune enfant, ou chez les patients présentant une épilepsie sévère, des lésions cérébrales ou une polythérapie antiépileptique. Une insuffisance hépatique associée à la pancréatite augmente le risque d'évolution mortelle. En cas de syndrome douloureux abdominal aigu comme en cas de manifestations digestives à type de nausées, vomissements et/ou anorexie, il faut savoir évoquer le diagnostic de pancréatite et en cas d'élévations des enzymes pancréatiques, interrompre le traitement en mettant en place les mesures thérapeutiques alternatives qui s'imposent. Risque suicidaire Des idées et comportements suicidaires ont été rapportés chez des patients traités par des antiépileptiques dans plusieurs indications. Une méta-analyse d'essais randomisés, contrôlés versus placebo portant sur des antiépileptiques a également montré une légère augmentation du risque d'idées et de comportements suicidaires. Les causes de ce risque ne sont pas connues et les données disponibles n'excluent pas la possibilité d'une augmentation de ce risque pour le valproate. Par conséquent les patients doivent être étroitement surveillés pour tout signe d'idées et de comportements suicidaires et un traitement approprié doit être envisagé. Il doit être recommandé aux patients (et leur personnel soignant) de demander un avis médical en cas de survenue de signes d'idées et de comportements suicidaires. Patients présentant la maladie mitochondriale connue ou suspectée Le valproate peut déclencher ou aggraver des signes cliniques de la maladie mitochondriale sous-jacente causée par des mutations de l'ADN mitochondrial ainsi que du gène nucléaire codant l'enzyme mitochondriale polymérase gamma (POLG). Notamment, des cas d'insuffisance hépatique aigu induite par le valproate et des décès liés ont été signalés à un taux plus élevé chez les patients présentant des syndromes héréditaires neurométaboliques causés par des mutations du gène POLG, par ex. le syndrome d'Alpers-Huttenlocher. Des troubles liés à la POLG devraient être soupçonnés chez les patients présentant des antécédents familiaux ou des symptômes évoquant un trouble lié à la POLG, y compris, entre autres, une encéphalopathie inexpliquée, une épilepsie réfractaire (focale, myoclonique), un état de mal épileptique à la présentation, des retards développementaux, une régression psychomotrice, une neuropathie axonale sensitivo-motrice, une myopathie, une ataxie cérébelleuse, une ophthalmoplégie, ou une migraine compliquée avec aura occipitale. Pour une évaluation diagnostique de tels troubles, un test des mutations de la POLG devrait être effectué, conformément à la pratique clinique actuelle (voir la rubrique 4. 3). Interactions médicamenteuses La prise de ce médicament est déconseillée en association à la lamotrigine et aux pénems (voir rubrique 4. 5). Des troubles cognitifs ou extrapyramidaux peuvent être associés à une imagerie d'atrophie cérébrale. Un tel tableau clinique peut ainsi être confondu avec une pathologie de type démence ou maladie de Parkinson. Ces troubles sont réversibles à l'arrêt du traitement (voir rubrique 4. 8). Information liée à la présence de sodium Ce médicament contient 55 mg de sodium par flacon, ce qui équivaut à 2, 8% de l'apport alimentaire quotidien maximal recommandé par l'OMS de 2 g de sodium par adulte. En tenir compte chez les patients suivant un régime hyposodé strict. Pratiquer un contrôle biologique des fonctions hépatiques avant le début du traitement (voir rubrique 4. 3) puis une surveillance périodique pendant les 6 premiers mois, tout spécialement chez les patients à risque (voir rubrique 4. 4). Il est à souligner que comme avec la plupart des antiépileptiques on peut observer, notamment en début de traitement, une augmentation modérée, isolée et transitoire des transaminases, en l'absence de tout signe clinique. Dans ce cas, il est conseillé de pratiquer un bilan biologique plus complet (en particulier taux de prothrombine), de reconsidérer éventuellement la posologie et de réitérer les contrôles en fonction de l'évolution des paramètres. Chez l'enfant de moins de 3 ans, il est conseillé de n'utiliser le valproate qu'en monothérapie, après avoir évalué l'intérêt thérapeutique par rapport au risque d'hépatopathie et de pancréatite chez les patients de cette classe d'âge (voir rubrique 4. 4). Un examen hématologique (NFS incluant les plaquettes, temps de saignement et bilan de coagulation) est recommandé préalablement au traitement, puis à 15 jours et en fin de traitement, ainsi qu'avant une intervention chirurgicale et en cas d'hématomes ou de saignements spontanés (voir rubrique 4. 8). Chez l'enfant, éviter la prescription simultanée de dérivés salicylés compte tenu du risque d'hépatotoxicité (voir rubrique 4. 4) et du risque hémorragique. Chez l'insuffisant rénal, il convient de tenir compte de l'augmentation des concentrations sériques libres en acide valproïque et de diminuer la posologie en conséquence. Ce médicament est contre-indiqué chez les patients porteurs d'un déficit enzymatique du cycle de l'urée. Quelques cas d'hyperammoniémie associée à un état stuporeux ou à un coma ont été décrits chez ces patients (voir rubrique 4. 3). Chez les enfants présentant des antécédents hépatodigestifs inexpliqués (anorexie, vomissements, accès de cytolyse), accès de léthargie ou coma, retard mental ou en cas d'antécédents familiaux de décès néonatals ou dans l'enfance, des explorations métaboliques et notamment une ammoniémie à jeun et post-prandiale doivent être effectuées avant tout traitement par le valproate. Bien que ce médicament soit reconnu comme n'entranant qu'exceptionnellement des manifestations d'ordre immunologique, son utilisation chez un sujet présentant un lupus érythémateux disséminé devra être pesée en fonction du rapport bénéfice/risque. A l'instauration du traitement, les patients doivent être informés du risque de prise de poids et des mesures appropriées, essentiellement diététiques, qui doivent être adoptées pour minimiser celle-ci. L'excrétion du valproate est essentiellement urinaire, en partie sous forme de corps cétoniques, la recherche de cétonurie peut donner des faux positifs chez les patients diabétiques. Les patients ayant un déficit en carnitine palmitoyltransférase (CPT) de type II doivent être avertis du risque accru de rhabdomyolyse lors de la prise de valproate. La prise d'alcool est déconseillée pendant la durée du traitement par DEPAKINE. Millepertuis Risque de diminution des concentrations plasmatiques et de l'efficacité de l'anticonvulsivant. Lamotrigine Risque majoré des réactions cutanées graves (Syndrome de Lyell). Par ailleurs, augmentation des concentrations plasmatiques de lamotrigine (diminution de son métabolisme hépatique par le valproate de sodium). Si l'association s'avère nécessaire, surveillance clinique étroite. Pénems Risque de survenue de crises convulsives, par diminution rapide des concentrations plasmatiques de l'acide valproïque, pouvant devenir indétectables. Acetazolamide Augmentation de l'hyperammoniémie, avec risque accru d'encéphalopathie. Surveillance clinique et biologique régulière. Aztreonam Risque de survenue de crises convulsives, par diminution des concentrations plasmatiques de l'acide valproïque. Surveillance clinique, dosages plasmatiques et adaptation éventuelle de la posologie de l'anticonvulsivant pendant le traitement par l'anti-infectieux et après son arrêt. Carbamazépine Augmentation des concentrations plasmatiques du métabolite actif de la carbamazépine avec signes de surdosage. De plus, diminution des concentrations plasmatiques d'acide valproïque par augmentation de son métabolisme hépatique par la carbamazépine. Surveillance clinique, dosages plasmatiques et adaptation des posologies des deux anticonvulsivants. Felbamate Augmentation des concentrations plasmatiques de l'acide valproïque, avec risque de surdosage. Surveillance clinique, contrôle biologique et adaptation éventuelle de la posologie du valproate pendant le traitement par le felbamate et après son arrêt. Médicaments contenant des œstrogènes, y compris les contraceptifs hormonaux contenant des œstrogènes Les œstrogènes sont des inducteurs des isoformes de l'UDP-Glucuronosyl Transférase (UGT) impliquées dans la glucuro-conjugaison du valproate et peuvent augmenter sa clairance ; ceci pourrait entraner une diminution de la concentration sérique du valproate et potentiellement une diminution de son efficacité (voir rubrique 4. 4). Envisager une surveillance des concentrations sériques du valproate. A l'inverse, en raison de l'absence d'effet inducteur enzymatique, le valproate ne diminue pas l'efficacité des estroprogestatifs chez les femmes sous contraception hormonale. Métamizole Le métamizole peut diminuer les concentrations sériques de valproate lorsqu'il est co-administré, ce qui peut entraner une diminution potentielle de l'efficacité clinique du valproate. Surveillance de la réponse clinique (contrôle des crises ou contrôle de l'humeur) et envisager la surveillance des concentrations sériques de valproate, le cas échéant. Nimodipine (voie orale et par extrapolation, voie injectable) Risque d'augmentation des concentrations plasmatiques de la nimodipine de 50 %. Par conséquent, la posologie de la nimodipine doit être réduite en cas d'hypotension. Phénobarbital, et par extrapolation primidone Augmentation de l'hyperammoniémie, avec risque accru d'encéphalopathie. Surveillance clinique et biologique régulière. Phénytoïne, et par extrapolation fosphénytoïne Augmentation de l'hyperammoniémie, avec risque accru d'encéphalopathie. Surveillance clinique et biologique régulière. Propofol Possible augmentation des concentrations sanguines de propofol. Une réduction de la dose de propofol est à envisager en cas d'association avec le valproate. Rifampicine Risque de survenue de crises convulsives, par augmentation du métabolisme hépatique du valproate par la rifampicine. Surveillance clinique et biologique et adaptation éventuelle de la posologie de l'anticonvulsivant pendant le traitement par rifampicine et après son arrêt. Rufinamide Possible augmentation des concentrations de rufinamide, notamment chez l'enfant de moins de 30 kg. Chez l'enfant de moins de 30 kg : ne pas dépasser la dose totale de 600 mg/j après la période de titration. Topiramate Augmentation de l'hyperammoniémie, avec risque accru d'encéphalopathie. Surveillance clinique et biologique régulière. Zidovudine Risque d'augmentation des effets indésirables, notamment hématologiques, de la zidovudine par diminution de son métabolisme par l'acide valproïque. Surveillance clinique et biologique régulière. Un hémogramme à la recherche d'une anémie devrait être réalisé au cours des deux premiers mois de l'association. Zonisamide Augmentation de l'hyperammoniémie, avec risque accru d'encéphalopathie. Surveillance clinique et biologique régulière. Lithium DEPAKINE n'a pas d'effet sur la lithémie. Grossesse Une méta-analyse (incluant des registres et des études de cohortes) a montré qu'environ 11% des enfants nés de mères épileptiques traitées par le valproate en monothérapie pendant leur grossesse avaient des malformations congénitales majeures. Ceci est supérieur au risque de malformations majeures rencontré dans la population générale (environ 2-3 %). Le risque de malformations congénitales majeures chez les enfants exposés à une polythérapie d'antiépileptiques incluant le valproate est plus élevé que celui lié à une polythérapie d'antiépileptiques sans le valproate. Ce risque est dose-dépendant lors d'une monothérapie avec le valproate et les données disponibles suggèrent qu'il est dose-dépendant lors d'une polythérapie avec le valproate. Cependant, aucune dose seuil excluant ce risque n'a pu être déterminée. Les données disponibles montrent une incidence accrue de malformations mineures et majeures. Les malformations le plus souvent rencontrées incluent des anomalies de fermeture du tube neural (de l'ordre de 2 à 3 %), des dysmorphies faciales, des fentes labiales et fentes palatines, des craniosténoses, des malformations cardiaques, rénales et uro-génitales (notamment hypospadias), des malformations des membres (notamment aplasie bilatérale du radius) et des syndromes polymalformatifs touchant diverses parties du corps. L'exposition au valproate peut également entraner un déficit auditif ou une surdité due aux malformations de l'oreille et/ou du nez (effet secondaire) et/ou à la toxicité directe sur la fonction auditive. Les cas décrivent une surdité ou un déficit auditif unilatéral(e) et bilatéral(e). Les évolutions n'ont pas été rapportées pour tous les cas. Lorsque les évolutions sont rapportées, il n'y pas eu de rétablissement dans la majorité des cas. L'exposition au valproate peut entraner des malformations oculaires (notamment des colobomes et une microphtalmie), qui ont été rapportées conjointement à d'autres malformations congénitales. Ces malformations oculaires peuvent affecter la capacité visuelle. Les études mettent en évidence que le valproate entrane un risque accru des troubles neuro-développementaux chez les enfants exposés . Le risque de troubles neuro- développementaux (y compris l'autisme) semble dose-dépendant lorsque le valproate est utilisé en monothérapie mais les données disponibles ne permettent pas de déterminer une dose excluant ce risque. Lorsque le valproate est administré en polythérapie avec d'autres médicaments antiépileptiques pendant la grossesse, les risques de troubles neuro-développementaux chez l'enfant ont également été significativement augmentés par rapport à ceux de la population générale ou ceux nés de mères épileptiques non traitées. La période à risque de ces effets est incertaine et la possibilité d'un risque pendant toute la grossesse ne peut être exclue. Lorsque le valproate est administré en monothérapie, les études menées chez des enfants d'âge préscolaire exposés au valproate montrent que jusqu'à 30 à 40 % d'entre eux présentent des retards de développement dans la petite enfance, tels que des retards dans l'acquisition de la parole et de la marche, des capacités intellectuelles diminuées, des capacités verbales (parole et compréhension) diminuées ainsi que des troubles de la mémoire. Le quotient intellectuel (QI) mesuré chez des enfants d'âge scolaire (6 ans) exposés au valproate est en moyenne de 7 à 10 points inférieur à celui des enfants exposés à d'autres antiépileptiques. Bien que le rôle des facteurs confondants ne puisse être exclu, il est prouvé que cette diminution de QI observée chez les enfants exposés est indépendante du QI maternel. Les données sur l'évolution de ces troubles à long terme sont limitées. Les données disponibles provenant d'une étude basée sur la population montrent que les enfants exposés au valproate ont un risque accru de présenter des troubles du spectre de l'autisme (environ 3 fois plus fréquent) et d'autisme infantile (environ 5 fois plus fréquent), par rapport à la population non exposée dans l'étude. Des données disponibles provenant d'une autre étude basée sur la population montrent que les enfants exposés au valproate ont un risque accru de développer le trouble du déficit de l'attention/hyperactivité (TDAH) (environ 1, 5 fois plus fréquent), par rapport à la population non exposée dans l'étude. Femmes en âge de procréer Chez les femmes en âge de procréer, le traitement par DEPAKINE ne doit pas être utilisé sauf en cas d'inefficacité ou d'intolérance aux autres traitements. Si aucun autre traitement n'est possible, DEPAKINE ne peut être instauré qu'à condition de respecter le programme de prévention de la grossesse (voir rubrique 4. 4), notamment : qu'elles ne soient pas enceintes (test de grossesse plasmatique d'une sensibilité d'au moins 25 mUI/ml négatif à l'instauration du traitement et à intervalles réguliers pendant le traitement) ; qu'elles utilisent au moins une méthode de contraception efficace ; et qu'elles soient informées des risques liés à l'utilisation de valproate pendant la grossesse. Chez ces femmes, le rapport bénéfice-risque doit être réévalué attentivement et à intervalles réguliers au cours du traitement (au moins annuellement). Les médicaments contenant des œstrogènes, y compris les contraceptifs hormonaux contenant des œstrogènes, peuvent augmenter la clairance du valproate, ce qui pourrait entraner une diminution de la concentration sérique du valproate et potentiellement une diminution de son efficacité (voir rubriques 4. 4 et 4. 5). Si une grossesse est envisagée : Chez les femmes envisageant une grossesse, un médecin spécialiste expérimenté dans la prise en charge de l'épilepsie doit réévaluer le traitement par valproate et envisager l'ensemble des options thérapeutiques alternatives. Tous les efforts doivent être faits pour passer à un traitement alternatif approprié avant la conception et cela, avant que la contraception soit arrêtée (voir rubrique 4. 4). Si un changement de traitement est impossible, la patiente devra recevoir des conseils supplémentaires au regard des risques que le valproate présente pour l'enfant à natre afin de l'aider à prendre une décision éclairée concernant son projet familial. Une supplémentation en acide folique avant la grossesse et en début de grossesse pourrait diminuer le risque d'apparition d'anomalies du tube neural inhérent à toute grossesse. A titre d'information, les données disponibles ne mettent pas en évidence d'action préventive de l'acide folique sur les malformations liées au valproate. Femmes enceintes Le valproate utilisé dans le traitement de l'épilepsie est contre-indiqué pendant la grossesse, sauf en l'absence d'alternative thérapeutique appropriée (voir rubriques 4. 3 et 4. 4). En cas de grossesse chez une femme utilisant du valproate, celle-ci doit être immédiatement orientée vers un médecin spécialiste afin d'envisager l'ensemble des options thérapeutiques alternatives. Pendant la grossesse, les crises tonico-cloniques et l'état de mal épileptique avec hypoxie chez la mère peuvent entraner des conséquences graves voire fatales pour la mère et l'enfant à natre. Si, en cas de situations exceptionnelles, malgré les risques connus associés à l'utilisation de valproate pendant la grossesse, et après évaluation attentive des traitements alternatifs, le valproate devait absolument être maintenu pour contrôler l'épilepsie chez une femme enceinte : il est indispensable d'utiliser la dose minimale efficace libération prolongée pourrait être préférable aux autres formulations afin d'éviter les pics plasmatiques (voir rubrique 4. 2). Toutes les patientes dont la grossesse a été exposée au valproate ainsi que leurs partenaires doivent être orientés vers un médecin spécialisé ou expérimenté en tératologie pour évaluation et recevoir des conseils concernant la grossesse exposée : une surveillance prénatale spécialisée doit être instaurée en vue de détecter d'éventuelles anomalies touchant le tube neural ou d'autres malformations. Avant l'accouchement Pratiquer un bilan de coagulation comprenant notamment une numération plaquettaire, un dosage du fibrinogène et un temps de coagulation (Temps de Céphaline Activée : TCA) chez la mère avant l'accouchement. Risque chez le nouveau-né De très rares cas de syndrome hémorragique ont été rapportés chez les nouveau-nés de mères traitées par valproate pendant la grossesse. Ce syndrome hémorragique est lié à une thrombopénie, une hypofibrinogénémie et/ou une diminution des autres facteurs de coagulation. Une afibrinogénémie a également été rapportée et peut être fatale. Toutefois, ce syndrome doit être distingué du déficit en facteurs de la vitamine K induit par le phénobarbital et les inducteurs enzymatiques. Un bilan d'hémostase normal chez la mère ne permet pas d'éliminer des anomalies de l'hémostase chez le nouveau-né. Par conséquent, à la naissance, un bilan comprenant une numération plaquettaire, un dosage du fibrinogène, les tests et les facteurs de coagulation sera pratiqué chez les nouveau-nés. Des cas d'hypoglycémie ont été rapportés chez des nouveau-nés de mères traitées avec du valproate au cours du troisième trimestre de leur grossesse. Des cas d'hypothyroïdie ont été rapportés chez des nouveau-nés de mères traitées avec du valproate pendant la grossesse. Un syndrome de sevrage (en particulier agitation, irritabilité, hyperexcitabilité, nervosité, hyperkinésie, troubles du tonus, tremblements, convulsions et troubles de l'alimentation) peut survenir chez les nouveau-nés de mères traitées avec du valproate pendant le troisième trimestre de la grossesse. Suivi post-natal/chez l'enfant En cas d'exposition pendant la grossesse, un suivi rapproché du développement neurocomportemental de l'enfant est à instaurer et une prise en charge adaptée doit être mise en place au plus tôt en cas de nécessité. Allaitement Le valproate est excrété dans le lait maternel à une concentration comprise entre 1 % et 10 % des niveaux sériques maternels. Des troubles hématologiques ont été observés chez des nouveau-nés/nourrissons allaités par des femmes sous traitement (voir rubrique 4. 8). La décision d'interrompre l'allaitement ou de suspendre le traitement par DEPAKINE doit tenir compte du bénéfice de l'allaitement pour l'enfant et du bénéfice du traitement pour la femme. Fertilité Très fréquent ( 10 %) ; Fréquent ( 1 % - < 10 %) ; Peu fréquent ( 0, 1 % - < 1 %) ; Rare ( 0, 01 % - < 0, 1 %) ; Très rare (< 0, 01 %) ; Indéterminée (ne peut être estimée d'après les données disponibles). Affections congénitales, familiales et génétiques Malformations congénitales, troubles neuro-développementaux (voir rubriques 4. 4 et 4. 6). Affections hématologiques et du système lymphatique Fréquent : anémie, thrombopénie. Des cas de thrombopénie dose-dépendante, généralement de découverte systématique et sans retentissement clinique, ont été décrits. En cas de thrombopénie asymptomatique, si le taux de plaquettes et si le contrôle de la maladie le permettent, la seule diminution de posologie de ce médicament permet le plus souvent la régression de cette thrombopénie. Peu fréquent : leucopénie, pancytopénie. Rare : aplasie médullaire globale ou aplasie pure de la lignée rouge, agranulocytose, anémie macrocytaire, macrocytose. Investigations Fréquent : prises de poids*. Rare : diminution d'au moins un facteur de coagulation, tests de coagulation anormaux (tel que allongement du temps de prothrombine, allongement du temps de céphaline activée, allongement du temps de thrombine, augmentation de l'INR) (voir rubriques 4. 4 et 4. 6), déficit en vitamine B8 (biotine)/déficit en biotinidase. *les prises de poids étant un facteur de risque de survenue du syndrome des ovaires polykystiques, le poids des patientes doit faire l'objet d'une surveillance attentive (voir rubrique 4. 4). Affections du système nerveux Très fréquent : tremblements Fréquent : troubles extrapyramidaux*, stupeur*, sédation, convulsion*, troubles de la mémoire, céphalées, nystagmus, sensations nauséeuses ou vertigineuses Peu fréquent : coma*, encéphalopathie*, léthargie*, syndromes parkinsoniens réversibles*, ataxie, paresthésie Rare : diplopie, troubles cognitifs d'installation insidieuse et progressive (pouvant réaliser un tableau complet de syndrome démentiel) réversibles quelques semaines à quelques mois après l'arrêt du traitement* *Des cas d'états stuporeux ou de léthargie aboutissant parfois à un coma transitoire (encéphalopathie) sous valproate, ont été observés, régressant à l'arrêt du traitement ou à la diminution des doses. Ces états surviennent le plus souvent lors de polythérapies (phénobarbital ou topiramate en particulier) ou d'augmentation brusque des doses de valproate. *Ces symptômes peuvent être associés à une imagerie d'atrophie cérébrale. Affections de l'oreille et du labyrinthe Fréquent : pertes d'audition. Affections respiratoires, thoraciques et médiastinales Peu fréquent : épanchement pleural. Affections gastro-intestinales Très fréquent : nausées. Fréquent : vomissements, troubles gingivaux (principalement hyperplasie gingivale), stomatite, douleurs épigastriques, diarrhées qui peuvent survenir chez certains patients en début de traitement, mais qui cèdent en général au bout de quelques jours sans interruption du traitement. Peu fréquent : pancréatite dont l'évolution peut être fatale et qui nécessite un arrêt précoce du traitement (voir rubrique 4. 4). Affections du rein et des voies urinaires Fréquent : incontinence urinaire. Peu fréquent : insuffisance rénale. Rare : énurésie, néphrite tubulo-interstitielle, syndrome de Fanconi réversible. Affections de la peau et du tissu sous-cutané Fréquent : chute des cheveux passagère et/ou dose-dépendante, troubles de l'ongle et du lit de l'ongle. Peu fréquent : angiooedème, réactions cutanées, troubles capillaires (tels que texture anormale des cheveux, changements de la couleur des cheveux, pousse anormale des cheveux). Rare : syndrome de Lyell, syndrome de Stevens-Johnson, érythème polymorphe, syndrome DRESS (Drug Rash with Eosinophilia and Systemic Symptoms) ou syndrome d'hypersensibilité médicamenteuse. Affections endocriniennes Peu fréquent : syndrome de sécrétion inappropriée de l'hormone anti-diurétique (SIADH), hyperandrogénie (hirsutisme, virilisme, acné, alopécie de type androgénique, et/ou augmentation du taux d'hormones androgènes). Rare : hypothyroïdie (voir rubrique 4. 6). Troubles du métabolisme et de la nutrition Fréquent : hyponatrémie. Rare : hyperammoniémie* (voir rubrique 4. 4), obésité. *Une hyperammoniémie isolée et modérée sans modification des tests biologiques hépatiques peut être observée, surtout en cas de polythérapie, et ne doit pas faire interrompre le traitement. Toutefois, des cas d'hyperammoniémie avec symptômes neurologiques (pouvant aller jusqu'au coma) ont aussi été rapportés, nécessitant alors des investigations complémentaires (voir rubrique 4. 4). Tumeurs bénignes, malignes, et non précisées (incl. kystes et polypes) Rare : syndrome myélodysplasique. Affections vasculaires Fréquent : hémorragie (voir rubriques 4. 4 et 4. 8). Peu fréquent : vascularite cutanée, essentiellement vascularite leucocytoclasique. Troubles généraux et anomalies au site d'administration Peu fréquent : hypothermie, œdème périphérique non sévère. Indéterminée : risque de nécrose tissulaire locale en cas d'injections répétées. Affections hépatobiliaires Fréquent : hépatopathies (voir rubrique 4. 4). Affections des organes de reproduction et du sein Fréquent : irrégularités menstruelles. Peu fréquent : aménorrhées. Rare : troubles de la fertilité masculine, (voir rubrique 4. 6), ovaires polykystiques. Affections musculo-squelettiques et systémiques Peu fréquent : diminution de la densité minérale osseuse, ostéopénie, ostéoporose et fractures chez des patients traités au long cours par DEPAKINE. Le mode d'action de DEPAKINE sur le métabolisme osseux n'est pas connu. Rare : lupus érythémateux aigu disséminé (voir rubrique 4. 4), rhabdomyolyse (voir rubrique 4. 4). Affections psychiatriques Fréquent : état confusionnel, hallucinations, agressivité*, agitation*, troubles de l'attention*. Rare : comportement anormal*, hyperactivité psychomotrice*, difficultés d'apprentissage*. *Ces effets sont observés essentiellement dans la population pédiatrique. Population pédiatrique Le profil de sécurité du valproate dans la population pédiatrique est comparable à celui des adultes, mais certains effets indésirables sont plus graves ou sont principalement observés dans la population pédiatrique. Il existe un risque particulier d'atteinte hépatique sévère chez les nourrissons et les jeunes enfants, en particulier avant l'âge de 3 ans. Les jeunes enfants ont également un risque particulier de pancréatite. Ces risques diminuent avec l'âge (voir rubrique 4. 4). Les troubles psychiatriques tels que l'agressivité, l'agitation, les troubles de l'attention, les comportements anormaux, l'hyperactivité psychomotrice et les troubles d'apprentissage sont principalement observés dans la population pédiatrique. Déclaration des effets indésirables suspectés La déclaration des effets indésirables suspectés après autorisation du médicament est importante. Elle permet une surveillance continue du rapport bénéfice/risque du médicament. Les professionnels de santé déclarent tout effet indésirable suspecté via le système national de déclaration : Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé (ANSM) et réseau des Centres Régionaux de Pharmacovigilance - Site internet : Le tableau de l'intoxication aigu massive comporte habituellement un coma calme, plus ou moins profond, avec hypotonie musculaire, hyporéflexie, myosis, diminution de l'autonomie respiratoire, acidose métabolique, hypotension et collapsus/choc cardio-vasculaire. Quelques cas d'hypertension intracrânienne liée à un œdème cérébral ont été décrits. Les mesures à entreprendre en milieu hospitalier sont : évacuation gastrique si indiquée, maintien d'une diurèse efficace, surveillance cardiorespiratoire. Dans les cas très graves, on pratiquera éventuellement une épuration extra- rénale. Le pronostic de ces intoxications est généralement favorable, cependant quelques décès ont été rapportés. La présence de sodium dans les formulations contenant du valproate peut entrainer une hypernatrémie en cas de surdosage. Classe pharmacothérapeutique : ANTIEPILEPTIQUE, code ATC : N03AG01 Le valproate exerce ses effets pharmacologiques essentiellement au niveau du système nerveux central. Ces propriétés anticonvulsivantes s'exercent contre des types très variés de crises convulsives chez l'animal et d'épilepsies chez l'homme. Les études expérimentales et cliniques du valproate suggèrent deux types d'action anticonvulsivantes. Le premier est un effet pharmacologique direct en relation avec les concentrations en valproate du plasma et du cerveau. Le second est apparemment indirect et vraisemblablement en relation avec des métabolites du valproate persistant dans le cerveau ou avec des modifications des neurotransmetteurs ou avec des effets membranaires directs. L'hypothèse la plus généralement admise est l'hypothèse de l'acide gamma-aminobutyrique (GABA) dont le taux augmente après administration de valproate. Le valproate diminue la durée des phases intermédiaires de sommeil avec une augmentation concomitante de sommeil lent. Les différentes études pharmacocinétiques effectuées pour le valproate, ont montré que : La biodisponibilité sanguine du valproate après administration orale ou IV est proche de 100 %. Le volume de distribution est limité essentiellement au sang et aux liquides extra-cellulaires à échange rapide. Le valproate diffuse dans le L. C. R. et dans le cerveau. Passage de la barrière placentaire (voir rubrique 4. 6) : Le valproate traverse la barrière placentaire chez l'animal et chez l'Homme : chez l'animal, le valproate traverse le placenta, de manière similaire à l'Homme, chez l'Homme, plusieurs publications ont évalué la concentration du valproate dans le cordon ombilical des nouveau-nés à l'accouchement. La concentration sérique du valproate dans le cordon ombilical, représentant la concentration sérique du valproate chez les fœtus, était similaire ou légèrement supérieure à celle des mères. La demi-vie est de 15 à 17 heures. L'efficacité thérapeutique nécessite habituellement une concentration sérique minimale de 40-50 mg/l, avec une large fourchette comprise entre 40 et 100 mg/l. Si des taux plasmatiques supérieurs s'avèrent nécessaires, les bénéfices attendus doivent être pesés par rapport au risque de survenue d'effets indésirables en particulier dose-dépendants. Toutefois, des taux se maintenant au-delà de 150 mg/l nécessitent une réduction de la posologie. Par voie orale, la concentration plasmatique d'équilibre est atteinte en 3 à 4 jours ; avec la forme injectable, elle peut être atteinte en quelques minutes et maintenue par perfusion veineuse. La fixation protéique du valproate est très importante. Elle est dose-dépendante et saturable. La voie majeure du métabolisme du valproate est la glucuro-conjugaison (environ 40%), principalement via l'UGT1A6, l'UGT1A9 et l'UGT2B7. L'excrétion du valproate est essentiellement urinaire après métabolisation par glucuro-conjugaison et bêta-oxydation. La molécule de valproate est dialysable, mais l'hémodialyse ne touche que la fraction libre de valproate sanguin (environ 10 %). Le valproate n'est pas inducteur des enzymes impliquées dans le système métabolique du cytochrome P450 : contrairement à la plupart des autres antiépileptiques, il n'accélère pas de ce fait sa propre dégradation, ni celle d'autres substances telles que les œstroprogestatifs et les antivitamines K. Population pédiatrique A partir de l'âge de 10 ans, les enfants et les adolescents ont des clairances de valproate similaires à celles rapportées chez les adultes. Chez les patients pédiatriques de moins de 10 ans, la clairance systémique du valproate varie avec l'âge. Chez les nouveau-nés et les nourrissons jusqu'à l'âge de 2 mois, la clairance du valproate est diminuée par rapport à celle des adultes et elle est la plus faible immédiatement après la naissance. Dans une revue de la littérature scientifique, la demi-vie du valproate chez les nourrissons de moins de deux mois a montré une variabilité considérable allant de 1 à 67 heures. Chez les enfants âgés de 2 à 10 ans, la clairance du valproate est 50% plus élevée que chez les adultes Les études animales montrent que l'exposition in utéro au valproate entrane des altérations morphologiques et fonctionnelles du système auditif chez le rat et la souris. , le valproate n'a été mutagène ni dans les bactéries, ni dans les essais sur lymphome de souris et n'a pas induit de réparation de l'ADN dans les cultures primaires d'hépatocytes de rat. Cependant, , des résultats contradictoires ont été obtenus à des doses tératogènes selon la voie d'administration. Après administration orale, voie prédominante chez l'Homme, le valproate n'a induit ni d'aberrations chromosomiques dans la moelle osseuse de rat, ni d'effets létaux majeurs chez la souris. Une injection intrapéritonéale de valproate a augmenté les ruptures de brins d'ADN et les aberrations chromosomiques chez les rongeurs. De plus, une augmentation des échanges de chromatides sœurs chez les patients épileptiques exposés au valproate a été rapportée dans des études publiées comparée aux sujets sains non traités. Cependant, des résultats contradictoires ont été obtenus en comparant les données des patients épileptiques traités par valproate avec celles des patients épileptiques non traités. La pertinence clinique de ces conclusions sur l'ADN/chromosome n'est pas connue. Les données non cliniques issues des études conventionnelles de carcinogénicité ne révèlent aucun risque particulier pour l'Homme. Toxicité sur la reproduction Le valproate a induit des effets tératogènes (malformations de plusieurs systèmes d'organes) chez la souris, le rat et le lapin. Des anomalies comportementales ont été rapportées chez des descendants de première génération de souris et de rats après exposition . Certains changements de comportement ont également été observés dans la deuxième génération et ceux-ci étaient moins prononcés dans la troisième génération de souris après exposition aigu de la première génération à des doses tératogènes de valproate. Les mécanismes sous-jacents et la pertinence clinique de ces résultats ne sont pas connus. Chez les rats juvéniles, la diminution du poids des testicules n'a été observée qu'à des doses dépassant la dose maximale tolérée (à partir de 240 mg/kg/jour par voie intrapéritonéale ou intraveineuse) et sans modification histopathologique associée. Aucun effet sur les organes reproducteurs mâles n'a été observé aux doses tolérées (jusqu'à 90 mg/kg/jour). Au vu de ces données, les animaux juvéniles n'ont pas été jugés plus susceptibles que les adultes de présenter des troubles testiculaires. La pertinence clinique de ces résultats sur les testicules pour la population pédiatrique demeure inconnue. Lors d'une étude sur la fertilité chez les rats, l'administration de valproate à des doses allant jusqu'à 350 mg/kg/jour n'a pas altéré les performances de reproduction chez les mâles. Cependant, les troubles de la fertilité masculine ont été identifiés comme un effet indésirable chez l'Homme (voir les rubriques 4. 6 et 4. 8). : eau pour préparations injectables. En l'absence d'études de compatibilité, ce médicament ne doit pas être mélangé avec d'autres médicaments sauf ceux mentionnés référence en 4. 2. 3 ans Après ouverture/reconstitution/dilution : le produit doit être utilisé immédiatement. Poudre en flacon (verre incolore) 4 ml de solvant en ampoule (verre incolore). Bote de 1, 4 ou 80. Toutes les présentations peuvent ne pas être commercialisées SANOFI-AVENTIS FRANCE 82, AVENUE RASPAIL 94250 GENTILLY 34009 550 628 7 5 : Poudre en flacon (verre incolore) 4 ml de solvant en ampoule (verre incolore). Bote de 1. 34009 325 576 9 1 : Poudre en flacon (verre incolore) 4 ml de solvant en ampoule (verre incolore). Bote de 4. 34009 554 104 8 5 : Poudre en flacon (verre incolore) 4 ml de solvant en ampoule (verre incolore). Bote de 80. [à compléter ultérieurement par le titulaire] [à compléter ultérieurement par le titulaire] Sans objet. Sans objet. Liste II Enfants et adolescents de sexe féminin, femmes en âge de procréer et femmes enceintes : Prescription initiale annuelle réservée aux spécialistes en neurologie ou en pédiatrie. Renouvellement non restreint. Médicament nécessitant une surveillance particulière pendant le traitement : la prescription initiale nécessite préalablement le recueil de l'accord de soins de la patiente ; la délivrance ne peut se faire qu'après avoir vérifié que cet accord de soins a été recueilli. | BDPM | Medicinal |
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