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Biologie moléculaire de la cellule	a chaleur par des r actions qui ordonnent les mol cules que la cellule contient. La chaleur lib r e augmente le d sordre dans l'environnement autour de la cellule (repr sent par des fl ches dentel es et des mol cules d form es, indiquant une augmentation des mouvements mol culaires caus e par la chaleur). En cons quence, la deuxi me loi de la thermodynamique, qui stipule que la quantit de d sordre dans l'univers doit toujours augmenter, est satisfaite lorsque la cellule grandit et se divise. Pour une discussion d taill e, voir les panneaux 2-7 (pp. 102-103). La chaleur est lib r e pour tirer de l' nergie potentielle FOOR 1 en raison de la position nergie cin tique nergie thermique deux hydrog ne oxyg ne gaz vibrations rapides et chaleur dispers e vers les mol cules de gaz rotations mol culaires de deux mol cules d'eau nouvellement form es afin de distinguer le m tabolisme d'une cellule de la combustion inutile de carburant dans un incendie. Plus loin, nous illustrons comment ce couplage se produit. Pour l'instant, il suffit de reconna tre qu'un lien direct entre la combustion contr l e des mol cules alimentaires et la g n ration de l'ordre biologique est n cessaire pour que les cellules cr ent et maintiennent un lot d'ordre dans un univers tendant vers le chaos. Les cellules obtiennent de l' nergie par l'oxydation de mol cules organiques Toutes les cellules animales et v g tales sont aliment es par l' nergie stock e dans les liaisons chimiques des mol cules organiques, qu'il s'agisse de sucres qu'une plante a photosynth tis s comme nourriture pour elle-m me ou du m lange de grosses et de petites mol cules qu'un animal a mang . Les organismes doivent extraire cette nergie sous une forme utilisable pour vivre, cro tre et se reproduire. Chez les plantes comme chez les animaux, l' nergie est extraite des mol cules alimentaires par un processus d'oxydation progressive, ou combustion contr l e. L'atmosph re terrestre contient une grande quantit d'oxyg ne, et en pr sence d'oxyg ne, la forme de carbone la plus stable sur le plan nerg tique est le CO2 et celle de l'hydrog ne Figure 2 17 Quelques interconversions entre diff rentes formes d' nergie. Toutes les formes d' nergie sont, en principe, interconvertibles. Dans tous ces processus, la quantit totale d' nergie est conserv e. Ainsi, par exemple, partir de la hauteur et du poids de la brique en (1), nous pouvons pr dire exactement la quantit de chaleur qui sera lib r e lorsqu'elle frappera le sol. dans (2), notez que la grande quantit d' nergie de liaison chimique lib r e lors de la formation de l'eau est initialement convertie en mouvements thermiques tr s rapides dans les deux nouvelles mol cules d'eau ; Mais les collisions avec d'autres mol cules r partissent presque instantan ment cette nergie cin tique uniform ment dans tout l'environnement (transfert de chaleur), ce qui rend les nouvelles mol cules indiscernables de toutes les autres. est H2O. Une cellule est donc capable d'obtenir de l' nergie partir de sucres ou d'autres mol cules organiques en permettant leurs atomes de carbone et d'hydrog ne de se combiner avec l'oxyg ne pour produire respectivement du CO2 et de l'H2O, un processus appel respiration a robie. La photosynth se (discut e en d tail au chapitre 14) et la respiration sont des processus compl mentaires (Figure 2 18). Cela signifie que les transactions entre les plantes et les animaux ne sont pas toutes sens unique. Les plantes, les animaux et les micro-organismes existent ensemble sur cette plan te depuis si longtemps que beaucoup d'entre eux sont devenus une partie essentielle de l'environnement des autres. L'oxyg ne lib r par la photosynth se est consomm lors de la combustion des mol cules organiques lors de la respiration a robie. Et certaines des mol cules de CO2 qui sont aujourd'hui fix es en mol cules organiques par photosynth se dans une feuille verte ont t hier lib r es dans l'atmosph re par la respiration d'un animal ou par la respiration d'un champignon ou d'une bact rie d composant la mati re organique morte. Nous voyons donc que l'utilisation du carbone forme un norme cycle qui implique la biosph re (tous les organismes vivants sur Terre) dans son ensemble (Figure 2-19). De m me, les atomes d'azote, Le phosphore et le soufre se d placent entre les mondes vivant et non vivant selon des cycles impliquant des plantes, des animaux, des champignons et des bact ries. La cellule n'oxyde pas les mol cules organiques en une seule tape, comme cela se produit lorsque des mati res organiques sont br l es dans un incendie. Gr ce l'utilisation de catalyseurs enzymatiques, le m tabolisme fait passer ces mol cules par un grand nombre de r actions qui n'impliquent que rarement l'ajout direct d'oxyg ne. Avant d'examiner certaines de ces r actions et leur but, nous discutons de ce que l'on entend par le processus d'oxydation. Figure 2 18 La photosynth se et la respiration en tant que processus compl ment
Biologie moléculaire de la cellule	aires dans le monde vivant. La photosynth se convertit l' nergie lectromagn tique de la lumi re du soleil en nergie de liaison chimique dans les sucres et autres mol cules organiques. les plantes, les algues et les cyanobact ries obtiennent les atomes de carbone dont elles ont besoin cette fin partir du CO2 atmosph rique et de l'hydrog ne de l'eau, lib rant ainsi du gaz O2 comme sous-produit. Les mol cules organiques produites par la photosynth se servent leur tour de nourriture d'autres organismes. beaucoup de ces organismes effectuent une respiration a robie, un processus qui utilise l'O2 pour former du CO2 partir des m mes atomes de carbone qui avaient t absorb s sous forme de CO2 et convertis en sucres par photosynth se. Ce faisant, les organismes qui respirent obtiennent l' nergie de liaison chimique dont ils ont besoin pour survivre. On pense que les premi res cellules de la Terre n' taient capables ni de photosynth se ni de respiration (voir le chapitre 14). Cependant, la photosynth se a d pr c der la respiration sur Terre, car il existe des preuves solides que des milliards d'ann es de photosynth se ont t n cessaires avant que l'O2 ne soit lib r en quantit suffisante pour cr er une atmosph re riche en ce gaz. (L'atmosph re terrestre contient actuellement 20 % d'o2.) HUMUS ET MATI RE ORGANIQUE DISSOUTE S DIMENTS ET COMBUSTIBLES FOSSILES RESPIRATION PHOTOSYNTH SE CHA NE ALIMENTAIRE CO2 DANS L'ATMOSPH RE ET L'EAU PLANTES, ALGUES, BACT RIES ANIMAUX Figure 2 19 Le cycle du carbone. Les atomes de carbone individuels sont incorpor s dans les mol cules organiques du monde vivant par l'activit photosynth tique des bact ries, des algues et des plantes. Ils se transmettent aux animaux, aux micro-organismes et aux mati res organiques dans le sol et les oc ans selon des trajectoires cycliques. Le CO2 est renvoy dans l'atmosph re lorsque les mol cules organiques sont oxyd es par les cellules ou br l es par l'homme comme carburants. Chapitre 2 : La chimie cellulaire et les enzymes bio nerg tiques abaissent les barri res d' nergie d'activation qui bloquent les r actions chimiques Consid rez la r action papier + O2 fum e + cendres + chaleur + CO2 + H2O Une fois enflamm , le papier br le facilement, lib rant dans l'atmosph re la fois de l' nergie sous forme de chaleur et d'eau et de dioxyde de carbone sous forme de gaz. La r action est irr versible, puisque la fum e et les cendres ne r cup rent jamais spontan ment ces entit s de l'atmosph re chauff e et ne se reconstituent pas en papier. Lorsque le papier br le, son nergie chimique est dissip e sous forme de chaleur, non pas perdue dans l'univers, puisque l' nergie ne peut jamais tre cr e ou d truite, mais irr m diablement dispers e dans les mouvements thermiques al atoires chaotiques des mol cules. Dans le m me temps, les atomes et les mol cules du papier se dispersent et se d sordonnent. Dans le langage de la thermodynamique, il y a eu une perte d' nergie libre ; c'est- -dire d' nergie qui peut tre exploit e pour effectuer un travail ou entra ner des r actions chimiques. Cette perte refl te une r duction de l'ordre dans la fa on dont l' nergie et les mol cules taient stock es dans le papier. Nous discuterons bient t plus en d tail de l' nergie libre, mais le principe g n ral est assez clair intuitivement : les r actions chimiques ne se d roulent spontan ment que dans la direction qui conduit une perte d' nergie libre. En d'autres termes, la direction spontan e de toute r action est la direction qui descend, alors qu'une r action descendante est une r action nerg tiquement favorable. Bien que la forme de carbone la plus favorable nerg tiquement dans des conditions ordinaires soit le CO2, et que celle de l'hydrog ne soit H2O, un organisme vivant ne dispara t pas dans une bouff e de fum e, et le livre en papier dans vos mains n' clate pas en flammes. C'est parce que les mol cules la fois dans l'organisme vivant et dans le livre sont dans un tat relativement stable, et elles ne peuvent pas tre chang es un tat d' nergie inf rieure sans un apport d' nergie : en d'autres termes, une mol cule a besoin d' nergie d'activation un coup de pied par-dessus une barri re d' nergie avant de pouvoir subir une r action chimique qui le laisse dans un tat plus stable (Figure 2 21). Dans le cas d'un livre en feu, l' nergie d'activation peut tre fournie par la chaleur d'une allumette allum e. Pour les mol cules de la solution aqueuse l'int rieur d'une cellule, le coup de fouet est d livr par une collision al atoire inhabituellement nergique avec les mol cules environnantes collisions qui deviennent plus violentes mesure que la temp rature augmente. La chimie d'une cellule vivante est troitement contr l e, car le franchissement des barri res nerg tiques est grandement facilit par une classe sp cialis e de prot ines : les enzymes. Chaque enzyme se lie troitement une ou plusieurs mol cules, appel es substrats, et les maint
Biologie moléculaire de la cellule	ient d'une mani re qui r duit consid rablement l' nergie d'activation d'une r action chimique particuli re que les substrats li s peuvent subir. Une substance qui peut r duire l' nergie d'activation d'une r action est appel e catalyseur ; Les catalyseurs augmentent la vitesse des r actions chimiques parce qu'ils permettent une proportion beaucoup plus importante des collisions al atoires avec les mol cules environnantes de projeter les substrats par-dessus la barri re d' nergie, comme illustr dans la figure 2-22. Les enzymes sont parmi les catalyseurs les plus efficaces Figure 2 21 Le principe important de l' nergie d'activation. (a) Le compos Y (un r actif) est dans un tat relativement stable, et de l' nergie est n cessaire pour le convertir en compos X (un produit), m me si X a un niveau d' nergie global inf rieur celui de Y. Cette conversion n'aura donc pas lieu moins que le compos Y ne puisse acqu rir suffisamment d' nergie d'activation ( nergie a moins nergie b) de son environnement pour subir la r action qui le convertit en compos X. Cette nergie peut tre fournie par le biais d'une collision inhabituellement nerg tique avec d'autres mol cules. pour la r action inverse, X Y, l' nergie d'activation sera d plus rarement. les nergies d'activation sont toujours positives ; Notons cependant que le changement d' nergie total pour l' nergie connue : certains sont capables d'acc l rer les r actions par des facteurs de 1014 ou plus. Les enzymes permettent ainsi des r actions qui ne se produiraient pas autrement de se d rouler rapidement des temp ratures normales. Une enzyme ne peut pas changer le point d' quilibre d'une r action. La raison est simple : lorsqu'une enzyme (ou n'importe quel catalyseur) abaisse l' nergie d'activation de la r action Y X, elle r duit n cessairement galement l' nergie d'activation de la r action X Y exactement de la m me quantit (voir Figure 2-21). Les r actions avant et arri re seront donc acc l r es par le m me facteur par une enzyme, et le point d' quilibre de la r action sera inchang (Figure 2 23). Ainsi, quelle que soit l'acc l ration d'une r action par une enzyme, elle ne peut pas changer de direction. Malgr la limitation ci-dessus, les enzymes dirigent toutes les r actions dans les cellules travers des voies de r action sp cifiques. En effet, les enzymes sont la fois tr s s lectives et tr s pr cises, ne catalysant g n ralement qu'une seule r action particuli re. En d'autres termes, chaque enzyme abaisse s lectivement l' nergie d'activation d'une seule des nombreuses r actions chimiques possibles que ses mol cules de substrat li es pourraient subir. De cette fa on, des ensembles d'enzymes peuvent diriger chacune des nombreuses mol cules diff rentes d'une cellule le long d'une voie de r action particuli re (Figure 2 24). Le succ s des organismes vivants est attribuable la capacit d'une cellule fabriquer des enzymes de nombreux types, chacune ayant des propri t s pr cis ment sp cifi es. Chaque enzyme Figure 2 23 Les enzymes ne peuvent pas changer le point d' quilibre des r actions. Les enzymes, comme tous les catalyseurs, acc l rent les vitesses avant et arri re d'une r action par le m me facteur. Par cons quent, pour les r actions catalys es et non catalys es pr sent es ici, le nombre de mol cules subissant la transition X Y est gal au nombre de mol cules subissant la transition Y X lorsque le rapport entre les mol cules Y et X mol cules est de 3 1. En d'autres termes, les deux r actions atteignent l' quilibre exactement au m me point. Figure 2 22 : la r duction de l' nergie d'activation augmente consid rablement la probabilit d'une r action. tout instant, une population de mol cules de substrat identiques aura une gamme d' nergies, distribu es comme indiqu sur le graphique. Les nergies variables proviennent de collisions avec les mol cules environnantes, ce qui fait que les mol cules du substrat se tr moussent, vibrent et tournent. Pour qu'une mol cule subisse une r action chimique, l' nergie de la mol cule doit d passer la barri re d' nergie d'activation de cette r action (lignes pointill es). Pour la plupart des r actions biologiques, cela ne se produit presque jamais sans catalyse enzymatique. M me avec la catalyse enzymatique, les mol cules du substrat doivent subir une collision particuli rement nerg tique pour r agir (zone ombr e en rouge). L'augmentation de la temp rature augmentera galement le nombre de mol cules ayant suffisamment d' nergie pour surmonter l'activation l' nergie n cessaire une r action ; mais contrairement la catalyse enzymatique, cet effet n'est pas s lectif, acc l rant toutes les r actions (film 2.2). Figure 2 24 Diriger les mol cules du substrat travers une voie de r action sp cifique par catalyse enzymatique. Une mol cule de substrat dans une cellule (boule verte) est convertie en une mol cule diff rente (boule bleue) au moyen d'une s rie de r actions catalys es par des enzymes. Com
Biologie moléculaire de la cellule	me indiqu (encadr jaune), plusieurs r actions sont nerg tiquement favorables chaque tape, mais une seule est catalys e par chaque enzyme. Des ensembles d'enzymes d terminent ainsi la voie de r action exacte suivie par chaque mol cule l'int rieur de la cellule. a une forme unique contenant un site actif, une poche ou un sillon dans l'enzyme dans lequel seuls des substrats particuliers s'ins rent (Figure 2 25). Comme tous les autres catalyseurs, les mol cules enzymatiques elles-m mes restent inchang es apr s avoir particip une r action et peuvent donc fonctionner encore et encore. Dans le chapitre 3, nous abordons plus en d tail le fonctionnement des enzymes. comment les enzymes trouvent leurs substrats : l' norme rapidit des mouvements mol culaires Une enzyme catalyse souvent la r action de milliers de mol cules de substrat chaque seconde. Cela signifie qu'il doit tre capable de lier une nouvelle mol cule de substrat en une fraction de milliseconde. Mais les enzymes et leurs substrats sont pr sents en nombre relativement faible dans une cellule. Comment se trouvent-ils si vite ? Une liaison rapide est possible parce que les mouvements caus s par l' nergie thermique sont extr mement rapides au niveau mol culaire. Ces mouvements mol culaires peuvent tre class s en trois types : (1) le mouvement d'une mol cule d'un endroit un autre (mouvement de translation), (2) le mouvement rapide d'avant en arri re d'atomes li s de mani re covalente les uns par rapport aux autres (vibrations), et (3) les rotations. Tous ces mouvements aident rapprocher les surfaces des mol cules en interaction. Les vitesses des mouvements mol culaires peuvent tre mesur es par une vari t de techniques spectroscopiques. Une grande prot ine globulaire culbute constamment, tournant autour de son axe environ un million de fois par seconde. Les mol cules sont galement en mouvement de translation constant, ce qui les am ne explorer tr s efficacement l'espace l'int rieur de la cellule en se promenant travers celui-ci un processus appel diffusion. De cette fa on, chaque mol cule d'une cellule entre en collision avec un grand nombre d'autres mol cules chaque seconde. Lorsque les mol cules d'un liquide entrent en collision et rebondissent les unes sur les autres, une mol cule individuelle se d place d'abord dans un sens, puis dans un autre, sa trajectoire constituant une marche al atoire (Figure 2 26). Dans une telle marche, la distance nette moyenne parcourue par chaque mol cule ( vol d'oiseau) partir de son point de d part est proportionnelle la racine carr e du temps impliqu : c'est- -dire, s'il faut 1 seconde en moyenne une mol cule pour parcourir 1 m, il faut 4 secondes pour parcourir 2 m, 100 secondes pour parcourir 10 m, et ainsi de suite. L'int rieur d'une cellule est tr s fr quent (figures 2 27). N anmoins, des exp riences dans lesquelles des colorants fluorescents et d'autres mol cules marqu es sont inject s dans des cellules montrent que de petites mol cules organiques diffusent travers le gel aqueux du cytosol pr s de Figure 2 25 Comment fonctionnent les enzymes. Chaque enzyme a un site actif auquel une ou plusieurs mol cules de substrat se lient, formant un complexe enzyme-substrat. Une r action se produit sur le site actif, produisant un complexe enzyme-produit. Le produit est ensuite lib r , ce qui permet l'enzyme de se lier d'autres mol cules de substrat. aussi rapidement qu'ils le font dans l'eau. Une petite mol cule organique, par exemple, ne prend qu'environ un cinqui me de seconde en moyenne pour diffuser une distance de 10 m. La diffusion est donc un moyen efficace pour les petites mol cules de se d placer sur les distances limit es dans la cellule (une cellule animale typique mesure 15 m de diam tre). tant donn que les enzymes se d placent plus lentement que les substrats dans les cellules, nous pouvons les consid rer comme immobiles. Le taux de rencontre de chaque mol cule enzymatique avec son substrat d pendra de la concentration de la mol cule de substrat. Par exemple, certains substrats abondants sont pr sents une concentration de 0,5 mM. Comme la taille de l'eau pure est de 55,5 M, il n'y a qu'environ une mol cule de substrat dans la cellule pour 105 mol cules d'eau. N anmoins, le site actif d'une mol cule enzymatique qui se lie ce substrat sera bombard d'environ 500 000 collisions al atoires avec la mol cule de substrat par seconde. (Pour une concentration de substrat dix fois inf rieure, le nombre de collisions tombe 50 000 par seconde, et ainsi de suite.) Une collision al atoire entre le site actif d'une enzyme et la surface correspondante de sa mol cule de substrat conduit souvent imm diatement la formation d'un complexe enzyme-substrat. Une r action au cours de laquelle une liaison covalente est rompue ou form e peut maintenant se produire extr mement rapidement. Lorsque l'on appr cie la rapidit avec laquelle les mol cules se d placent et r agissent,
Biologie moléculaire de la cellule	les taux observ s de catalyse enzymatique ne semblent pas si tonnants. Deux mol cules qui sont maintenues ensemble par des liaisons non covalentes peuvent galement se dissocier. Les multiples liaisons non covalentes faibles qu'ils forment les uns avec les autres persisteront jusqu' ce qu'un mouvement thermique al atoire provoque la s paration des deux mol cules. En g n ral, plus la liaison de l'enzyme et du substrat est forte, plus leur taux de dissociation est lent. En revanche, chaque fois que deux mol cules en collision ont des surfaces mal adapt es, elles forment peu de liaisons non covalentes et l' nergie totale d'association sera n gligeable par rapport celle du mouvement thermique. Dans ce cas, les deux mol cules se dissocient aussi rapidement qu'elles se sont r unies, emp chant ainsi les associations incorrectes et ind sirables entre des mol cules mal appari es, par exemple entre une enzyme et le mauvais substrat. La variation d' nergie libre d'une r action, G, d termine si elle peut se produire spontan ment Bien que les enzymes acc l rent les r actions, elles ne peuvent pas elles seules forcer des r actions nerg tiquement d favorables se produire. En termes d'analogie avec l'eau, les enzymes ne peuvent pas elles seules faire couler l'eau en mont e. C'est pourtant ce que les cellules doivent faire pour cro tre et se diviser : elles doivent construire des mol cules hautement ordonn es et riches en nergie partir de mol cules petites et simples. Nous verrons que cela se fait par le biais d'enzymes qui couplent directement des r actions nerg tiquement favorables, qui lib rent de l' nergie et produisent de la chaleur, des r actions nerg tiquement d favorables, qui produisent un ordre biologique. Qu'entendent les biologistes cellulaires par l'expression nerg tiquement favorable et comment cela peut-il tre quantifi ? Selon la deuxi me loi de la thermodynamique, l'univers tend vers le d sordre maximal (plus grande entropie ou plus grande probabilit ). Ainsi, une r action chimique ne peut se produire spontan ment que si elle entra ne une augmentation nette du d sordre de l'univers (voir Figure 2-16). Ce d sordre de l'univers peut tre exprim de la mani re la plus commode en termes d' nergie libre d'un syst me, un concept que nous avons abord plus t t. L' nergie libre, G, est une expression de l' nergie disponible pour effectuer un travail, par exemple, le travail de conduite de r actions chimiques. La valeur de G n'a d'int r t que lorsqu'un syst me subit un changement, not G (delta G). Le changement de G est essentiel car, comme expliqu dans les panneaux 2 7 (p. 102 et 103), G est une mesure directe de la Figure 2 27 La structure du cytoplasme. Le dessin est approximativement l' chelle et met l'accent sur l'encombrement dans le cytoplasme. seules les macromol cules sont repr sent es : les ARN sont repr sent s en bleu, les ribosomes en vert et les prot ines en rouge. Les enzymes et autres macromol cules se diffusent relativement lentement dans le cytoplasme, en partie parce qu'elles interagissent avec de nombreuses autres macromol cules ; les petites mol cules, en revanche, se diffusent presque aussi rapidement que dans l'eau (vid o 2.4). (adapt de D.s. Goodsell, Trends Biochem. Sci. 16:203-206, 1991. Avec l'autorisation d'elsevier.) Figure 2 26 : une marche al atoire. Les mol cules en solution se d placent de mani re al atoire en raison des secousses continuelles qu'elles re oivent lors des collisions avec d'autres mol cules. Ce mouvement permet aux petites mol cules de diffuser rapidement d'une partie de la cellule une autre, comme d crit dans le texte (film 2.3). quantit de d sordre cr e dans l'univers lorsqu'une r action a lieu. Les r actions nerg tiquement favorables, par d finition, sont celles qui diminuent l' nergie libre ; en d'autres termes, ils ont un G n gatif et d sorganisent l'univers (Figure 2 28). Un exemple de r action nerg tiquement favorable l' chelle macroscopique est la r action par laquelle un le ressort comprim se d tend jusqu' un tat d tendu, lib rant son nergie lastique stock e sous forme de chaleur dans son environnement ; Un exemple l' chelle microscopique est la dissolution du sel dans l'eau. l'inverse, les r actions nerg tiquement d favorables avec un G positif, comme la jonction de deux acides amin s pour former une liaison peptidique, cr ent elles seules de l'ordre dans l'univers. Par cons quent, ces r actions ne peuvent avoir lieu que si elles sont coupl es une seconde r action avec un G n gatif si grand que le G du processus global est n gatif (Figure 2 29). La concentration des r actifs influence le changement d' nergie libre et la direction d'une r action Comme nous venons de le d crire, une r action Y X ira dans la direction Y X lorsque la variation d' nergie libre associ e, G, est n gative, de m me qu'un ressort tendu laiss lui-m me se d tendra et perdra son nergie emmagasin e dans son
Biologie moléculaire de la cellule	environnement sous forme de chaleur. Pour une r action chimique, cependant, G d pend non seulement de l' nergie stock e dans chaque mol cule individuelle, mais aussi des concentrations des mol cules dans le m lange r actionnel. Rappelez-vous que G refl te la mesure dans laquelle une r action cr e un tat plus d sordonn , en d'autres termes, plus probable, de l'univers. Si l'on se souvient de notre analogie avec la pi ce de monnaie, il est tr s probable qu'une pi ce de monnaie passe de l'orientation de la t te celle de la queue si une bo te qui bouge contient 90 t tes et 10 queues, mais c'est un v nement moins probable si la bo te a 10 t tes et 90 queues. Il en va de m me pour une r action chimique. Pour une r action r versible Y X, un grand exc s de Y sur X aura tendance entra ner la r action dans la direction Y X. Par cons quent, mesure que le rapport de Y X augmente, le G devient plus n gatif pour la transition Y X (et plus positif pour la transition X Y). La quantit de diff rence de concentration n cessaire pour compenser une diminution donn e de l' nergie de liaison chimique (et la lib ration de chaleur qui l'accompagne) n'est pas intuitivement vidente. la fin du XIXe si cle, la relation a t d termin e par une analyse thermodynamique qui permet de s parer les parties d pendantes de la concentration et les parties ind pendantes de la concentration du changement d' nergie libre, comme nous le d crivons ci-dessous. Le changement d' nergie libre standard, G , permet de comparer l' nergie de diff rentes r actions tant donn que G d pend des concentrations des mol cules dans le m lange r actionnel un moment donn , ce n'est pas une valeur particuli rement utile pour comparer les nergies relatives de diff rents types de r actions. Pour placer les r actions sur une base comparable, nous devons nous tourner vers la variation standard de l' nergie libre d'une r action, G . Le G est la variation de l' nergie libre dans des conditions standard, d finies comme celles o les concentrations de tous les r actifs sont fix es la m me valeur fixe de 1 mole/litre. Ainsi d fini, G ne d pend que des caract res intrins ques des mol cules r actives. Pour la r action simple Y X 37 C, G est li G comme suit : o G est en kilojoules par mole, [Y] et [X] d signent les concentrations de Y et X en moles/litre, ln est le logarithme n p rien, et RT est le produit de la constante des gaz, R, et de la temp rature absolue, T. 37 C, RT = 2,58 J mole 1. (Une mole est compos e de 6 1023 mol cules d'une substance.) Un grand nombre de donn es thermodynamiques ont t collect es, ce qui a permis de d terminer la variation standard de l' nergie libre, G , pour les r actions m taboliques importantes d'une cellule. Compte tenu de ces valeurs G , combin es des informations suppl mentaires sur les concentrations de m tabolites et les voies de r action, il est possible de pr dire quantitativement le d roulement de la plupart des r actions biologiques. L' nergie libre de Y est sup rieure l' nergie libre de X. Par cons quent, G < 0, et le d sordre nerg tique de l'univers augmente. Favorable pendant la r action. X. Si la r action X Y s'est produit, G serait > 0, et l'univers NERG TIQUEMENT R ACTION ordonn e. Cette r action ne peut se produire que si elle est coupl e une seconde r action nerg tiquement favorable Figure 2 28 La distinction entre les r actions nerg tiquement favorables et nerg tiquement d favorables. la r action nerg tiquement d favorable X Y est entra n par la r action nerg tiquement favorable C D, car la variation nette d' nergie libre pour la paire de r actions coupl es est inf rieure z ro Figure 2 29 Comment le couplage r actionnel est utilis pour provoquer des r actions nerg tiquement d favorables. POUR LA R ACTION NERG TIQUEMENT FAVORABLE Y X, Figure 2 30 quilibre chimique. Lorsqu'une r action atteint l' quilibre, les flux avant et arri re des mol cules en r action sont gaux et oppos s. lorsque X et Y sont des concentrations gales, [Y] = [X], la formation de X est nerg tiquement favoris e. En d'autres termes, le G de Y X est n gatif et le G de X Y est positif. Mais cause des bombardements thermiques, il y aura toujours un certain X qui se convertira en Y. Ainsi, pour chaque mol cule individuelle, la conversion de Y en X se produira souvent. La conversion de X en Y se produira moins souvent que la transition Y X, car elle n cessite une collision plus nerg tique. Par cons quent, le rapport entre les mol cules X et Y augmentera avec le temps FINALEMENT, il y aura un exc s suffisamment important de X sur Y pour compenser peine la lenteur de X Y, de sorte que le nombre de mol cules Y converties en X mol cules chaque seconde soit exactement gal au nombre de mol cules X converties en mol cules Y chaque seconde. ce stade, la r action sera l' quilibre. l' quilibre, il n'y a pas de changement net dans le rapport de Y X
Biologie moléculaire de la cellule	, et le G pour les r actions avant et arri re est nul. La constante d' quilibre et G sont facilement d riv es l'une de l'autre L'examen de l' quation ci-dessus r v le que le G est gal la valeur de G lorsque les concentrations de Y et X sont gales. Mais au fur et mesure qu'une r action favorable se produit, les concentrations des produits augmenteront mesure que la concentration des substrats diminuera. Ce changement dans les concentrations relatives fera que [X]/[Y] deviendra de plus en plus grand, rendant le G initialement favorable de moins en moins n gatif (le logarithme d'un nombre x est positif pour x > 1, n gatif pour x < 1 et z ro pour x =1). Finalement, lorsque G = 0, un quilibre chimique sera atteint ; ici, il n'y a pas de changement net de l' nergie libre pour conduire la r action dans un sens ou dans l'autre, dans la mesure o l'effet de concentration quilibre simplement la pouss e donn e la r action par G . En cons quence, le rapport produit/substrat atteint une valeur constante l' quilibre chimique (Figure 2 30). Nous pouvons d finir la constante d' quilibre, K, pour la r action Y X o [X] est la concentration du produit et [Y] est la concentration du r actif l' quilibre. Si l'on se souvient que G = G + RT ln [X]/[Y], et que G = 0 l' quilibre, on voit que 37 C, o RT = 2,58, l' quation d' quilibre est donc : G = 2,58 ln K En convertissant cette quation du logarithme n p rien (ln) au logarithme en base 10 (log) plus couramment utilis , nous obtenons G = 5,94 log K L' quation ci-dessus r v le comment le rapport d' quilibre de X Y (exprim comme la constante d' quilibre, K) d pend du caract re intrins que des mol cules, (exprim dans la valeur de G en kilojoules par mole). Notez que pour chaque diff rence de 5,94 kJ/mole d' nergie libre 37 C, la constante d' quilibre change d'un facteur 10 (tableau 2 2). Ainsi, plus une r action est nerg tiquement favorable, plus le produit s'accumulera si la r action se poursuit jusqu' l' quilibre. Plus g n ralement, pour une r action qui comporte plusieurs r actifs et produits, tels que A + B C + D, Les concentrations des deux r actifs et des deux produits sont multipli es parce que la vitesse de la r action directe d pend de la collision de A et B et la vitesse de la r action inverse d pend de la collision de C et D. Ainsi, 37 C, G = 5,94 log o G est exprim en kilojoules par mole, et [A], [B], [C] et [D] d signent les concentrations des r actifs et des produits en moles/litre. Les changements d' nergie libre des r actions coupl es sont additifs Nous avons soulign que les r actions d favorables peuvent tre coupl es des r actions favorables pour faire avancer les r actions d favorables (voir Figure 2-29). En termes thermodynamiques, cela est possible parce que la variation globale d' nergie libre pour un ensemble de r actions coupl es est la somme des variations d' nergie libre dans chacune de ses tapes composantes. Consid rons, titre d'exemple simple, deux r actions s quentielles X Y et Y Z dont les valeurs G sont respectivement +5 et 13 kJ/mole. Si ces deux r actions se produisent s quentiellement, le G de la r action coupl e sera de 8 kJ/mole. Cela signifie que, dans des conditions appropri es, la r action d favorable X Y peut tre entra n e par la r action favorable Y Z, condition que cette deuxi me r action suive la premi re. Par exemple, plusieurs des r actions de la longue voie qui convertit les sucres en CO2 et H2O ont des valeurs positives de G . Mais le chemin se poursuit n anmoins parce que le G total pour la s rie de r actions s quentielles a une grande valeur n gative. La formation d'un chemin s quentiel n'est pas ad quate de nombreuses fins. Souvent, le chemin souhait est simplement X Y, sans conversion suppl mentaire de Y en un autre produit. Heureusement, il existe d'autres fa ons plus g n rales d'utiliser les enzymes pour coupler les r actions entre elles. Celles-ci impliquent souvent les mol cules porteuses activ es dont nous parlerons ci-dessous. Les mol cules porteuses activ es sont essentielles la biosynth se L' nergie lib r e par l'oxydation des mol cules alimentaires doit tre stock e temporairement avant de pouvoir tre canalis e dans la construction des nombreuses autres mol cules n cessaires la cellule. Dans la plupart des cas, l' nergie est stock e sous forme d' nergie de liaison chimique dans un petit ensemble de mol cules porteuses activ es, qui contiennent une ou plusieurs liaisons covalentes riches en nergie. Ces mol cules diffusent rapidement dans toute la cellule et transportent ainsi leur nergie de liaison des sites de production d' nergie vers les sites o l' nergie sera utilis e pour la biosynth se et d'autres activit s cellulaires (Figure 2-31). Les transporteurs activ s stockent l' nergie sous une forme facilement changeable, soit sous forme de groupe chimique facilement transf rable, soit sous forme d' lectrons m
Biologie moléculaire de la cellule	aintenus un niveau d' nergie lev , et ils peuvent jouer un double r le de source d' nergie et de groupes chimiques dans les r actions biosynth tiques. Pour des raisons historiques, ces mol cules sont aussi parfois appel es coenzymes. Les plus importantes des mol cules porteuses activ es sont l'ATP et deux mol cules troitement li es l'une l'autre, le NADH et le NADPH. Les cellules utilisent un tel porteur activ mol cules comme de l'argent pour payer des r actions qui ne pourraient pas avoir lieu autrement. La formation d'un porteur activ est coupl e une r action nerg tiquement favorable Les m canismes de couplage n cessitent des enzymes et sont fondamentaux pour toutes les transactions nerg tiques de la cellule. La nature d'une r action coupl e est illustr e par une analogie m canique dans la figure 2-32, dans laquelle une r action chimique nerg tiquement favorable est repr sent e par des rochers tombant d'une falaise. L' nergie des chutes de pierres serait normalement enti rement gaspill e sous forme de chaleur g n r e par le frottement lorsque les pierres touchent le sol (voir le diagramme de la brique tombante dans la figure 2-17). Cependant, si l'on fait preuve d'une conception soign e, une partie de cette nergie pourrait tre utilis e pour entra ner une roue aubes qui soul ve un seau d'eau (figures 2 32B). Parce que les rochers ne peuvent maintenant atteindre le sol qu'apr s avoir d plac la roue aubes, nous disons que la r action nerg tiquement favorable de la chute de pierres a t directement coupl e la r action nerg tiquement d favorable du soul vement du seau d'eau. Notez que, comme une partie de l' nergie est utilis e pour effectuer le travail dans la figure 2-32B, les roches frappent le sol avec moins de vitesse que dans la figure 2-32A, et en cons quence, moins d' nergie est dissip e sous forme de chaleur. Des processus similaires se produisent dans les cellules, o les enzymes jouent le r le de la roue aubes. Par des m canismes que nous aborderons plus loin dans ce chapitre, les enzymes couplent un Figure 2 31 Transfert d' nergie et r le des transporteurs activ s dans le m tabolisme. En servant de navettes nerg tiques, les mol cules porteuses activ es remplissent leur fonction d'interm diaires qui relient la d composition des mol cules alimentaires et la lib ration d' nergie (catabolisme) la biosynth se nergivore de petites et grandes mol cules organiques (anabolisme). Figure 2 32 : un mod le m canique illustrant le principe des r actions chimiques coupl es. La r action spontan e illustr e en (a) pourrait servir d'analogie pour l'oxydation directe du glucose en Co2 et h2o, qui ne produit que de la chaleur. en (B), la m me r action est coupl e une seconde r action ; Cette seconde r action est analogue la synth se de mol cules porteuses activ es. L' nergie produite en (B) est sous une forme plus utile qu'en (a) et peut tre utilis e pour entra ner une vari t de r actions autrement d favorables nerg tiquement (C). r action nerg tiquement favorable, telle que l'oxydation des denr es alimentaires, une r action nerg tiquement d favorable, telle que la g n ration d'une mol cule porteuse activ e. Dans cet exemple, la quantit de chaleur lib r e par la r action d'oxydation est r duite exactement de la quantit d' nergie stock e dans les liaisons covalentes riches en nergie de la mol cule porteuse activ e. Et la mol cule porteuse activ e capte un paquet d' nergie d'une taille suffisante pour alimenter une r action chimique ailleurs dans la cellule. L'aTp est la mol cule porteuse activ e la plus largement utilis e Le plus important et le plus polyvalent des transporteurs activ s dans les cellules est l'ATP (ad nosine triphosphate). Tout comme l' nergie stock e dans le seau d'eau sur lev de la figure 2-32B peut entra ner une grande vari t de machines hydrauliques, l'ATP est un magasin d' nergie pratique et polyvalent, ou une monnaie, utilis e pour entra ner une vari t de r actions chimiques dans les cellules. L'ATP est synth tis dans une r action de phosphorylation nerg tiquement d favorable dans laquelle un groupe phosphate est ajout l'ADP (ad nosine diphosphate). Lorsque n cessaire, l'ATP c de son paquet d' nergie par son hydrolyse nerg tiquement favorable l'ADP et au phosphate inorganique (Figure 2 33). L'ADP r g n r est alors disponible pour tre utilis pour un autre cycle de la r action de phosphorylation qui forme l'ATP. La r action nerg tiquement favorable de l'hydrolyse de l'ATP est coupl e de nombreuses r actions autrement d favorables par lesquelles d'autres mol cules sont synth tis es. Beaucoup de ces r actions coupl es impliquent le transfert du phosphate terminal de l'ATP une autre mol cule, comme l'illustre la r action de phosphorylation de la figure 2-34. En tant que vecteur activ le plus abondant dans les cellules, l'ATP est la principale monnaie d' nergie. Pour ne donner que deux exemples, il fournit de l' nergie de nom
Biologie moléculaire de la cellule	breuses pompes qui transportent des substances l'int rieur et l'ext rieur de la cellule (discut au chapitre 11), et il alimente les moteurs mol culaires qui permettent aux cellules musculaires de se contracter et aux cellules nerveuses de transporter des mat riaux d'une extr mit de leurs longs axones une autre (discut au chapitre 16). l' nergie stock e dans l'aTp est souvent exploit e pour joindre deux mol cules Nous avons d j discut d'une mani re dont une r action nerg tiquement favorable peut tre coupl e une r action nerg tiquement d favorable, X Y, de mani re lui permettre de se produire. Dans ce sch ma, une deuxi me enzyme catalyse la r action nerg tiquement favorable Y Z, attirant tous les X vers Y dans le processus. Mais lorsque le produit requis est Y et non Z, ce m canisme n'est pas utile. Figure 2 33 L'hydrolyse de l'aTP en aDP et en phosphate inorganique. Les deux phosphates les plus externes de l'aTp sont maintenus au reste de la mol cule par des liaisons phosphoanhydride haute nergie et sont facilement transf r s. comme indiqu , de l'eau peut tre ajout e l'aTp pour former de l'aDp et du phosphate inorganique (pi). l'hydrolyse du phosphate terminal de l'aTp donne entre 46 et 54 kJ/mole d' nergie utilisable, en fonction des conditions intracellulaires. Le grand G n gatif de cette r action provient de plusieurs facteurs : la lib ration du groupe phosphate terminal limine une r pulsion d favorable entre les charges n gatives adjacentes, et l'ion phosphate inorganique (pi) lib r est stabilis par r sonance et par la formation favorable de liaisons hydrog ne avec l'eau. Figure 2 34 : exemple de r action de transfert de phosphate. Parce qu'une liaison phosphoanhydride riche en nergie dans aTp est convertie en une liaison phosphoester, cette r action est nerg tiquement favorable, ayant un G n gatif important. Les r actions de ce type interviennent dans la synth se des phospholipides et dans les premi res tapes des r actions qui catabolisent les sucres. Une r action biosynth tique typique est une r action dans laquelle deux mol cules, A et B, sont r unies pour produire A-B dans la r action de condensation nerg tiquement d favorable Il existe une voie indirecte qui permet A-H et B-OH de former A-B, dans laquelle un couplage l'hydrolyse de l'ATP fait fonctionner la r action. Ici, l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP est d'abord utilis e pour convertir B-OH en un compos interm diaire de plus haute nergie, qui r agit ensuite directement avec A-H pour donner A-B. Le m canisme le plus simple possible implique le transfert d'un phosphate de l'ATP B-OH pour former B-O-PO3, auquel cas la voie r actionnelle ne contient que deux tapes : 1. 2.A H + B O PO3 A B + Pi R sultat net : B OH + ATP + A H A B + ADP + Pi La r action de condensation, qui en elle-m me est nerg tiquement d favorable, est forc e de se produire en tant directement coupl e l'hydrolyse de l'ATP dans une voie r actionnelle catalys e par une enzyme (Figure 2-35A). Une r action biosynth tique de ce type synth tise l'acide amin glutamine (Figure 2-35B). Nous verrons bient t que des m canismes similaires (mais plus complexes) sont galement utilis s pour produire presque toutes les grosses mol cules de la cellule. Figure 2 35 : un exemple d'une r action biosynth tique nerg tiquement d favorable provoqu e par l'hydrolyse de l'aTP. a) Illustration sch matique de la formation de a B dans la r action de condensation d crite dans le texte. (B) La biosynth se de l'acide amin commun glutamine partir de l'acide glutamique et de l'ammoniac. L'acide glutamique est d'abord converti en un interm diaire phosphoryl haute nergie (correspondant au compos B-o-po3 d crit dans le texte), qui r agit ensuite avec l'ammoniac (correspondant a-h) pour former de la glutamine. Dans cet exemple, les deux tapes se produisent la surface de la m me enzyme, la glutamine synth tase. Le les obligations sont ombr es en rouge ; Ici, comme ailleurs dans le livre, le symbole pi = hpo42 , et un p encercl jaune = po3 . naDh et naDph sont des porteurs d' lectrons importants D'autres mol cules porteuses activ es importantes participent aux r actions d'oxydor duction et font g n ralement partie des r actions coupl es dans les cellules. Ces porteurs activ s sont sp cialis s pour transporter des lectrons maintenus un niveau d' nergie lev (parfois appel s lectrons de haute nergie ) et des atomes d'hydrog ne. Les plus importants de ces transporteurs d' lectrons sont le NAD+ (nicotinamide ad nine dinucl otide) et la mol cule troitement apparent e NADP+ (nicotinamide ad nine dinucl otide phosphate). Chacun capte un paquet d' nergie correspondant deux lectrons plus un proton (H+), et ils sont ainsi convertis en NADH (nicotinamide ad nine dinucl otide r duit) et en NADPH (nicotinamide ad nine dinucl otide phosphate r duit), respectivement (Figure 2 36). Ces mol cules peuvent donc tre consid r es comme po
Biologie moléculaire de la cellule	rteuses d'ions hydrure (le H+ plus deux lectrons, ou H ). Comme l'ATP, le NADPH est un vecteur activ qui participe de nombreuses r actions biosynth tiques importantes qui seraient autrement d favorables sur le plan nerg tique. Le NADPH est produit selon le sch ma g n ral illustr la figure 2-36A. Au cours d'un ensemble sp cial de r actions cataboliques produisant de l' nergie, deux atomes d'hydrog ne sont retir s d'une mol cule de substrat. Les deux lectrons, mais un seul proton (c'est- -dire un ion hydrure, H ) sont ajout s au cycle nicotinamide du NADP+ pour former le NADPH ; le deuxi me proton (H+) est lib r en solution. Il s'agit d'une r action d'oxydor duction typique, dans laquelle le substrat est oxyd et le NADP+ est r duit. Le NADPH abandonne facilement l'ion hydrure qu'il transporte dans une r action d'oxydor duction ult rieure, car le cycle nicotinamide peut obtenir un arrangement plus stable des lectrons sans lui. Dans cette r action subs quente, qui Figure 2 36 NaDPH, un important vecteur d' lectrons. HC (a) naDph est produit dans des r actions du type g n ral illustr gauche, dans lesquelles deux atomes d'hydrog ne sont retir s d'un substrat. La forme oxyd e de la mol cule porteuse, naDp+, re oit un atome d'hydrog ne plus un lectron (un ion hydrure) ; Le proton (H+) de l'autre atome H est lib r dans la solution. tant donn que naDph maintient son ion hydrure dans une liaison haute nergie, l'ion hydrure peut facilement tre transf r d'autres mol cules, comme illustr droite. (B) et (C) Les structures de naDp+ et naDph. La partie de la mol cule naDp+ connue sous le nom de cycle nicotinamide accepte l'ion hydrure, h , formant naDph. Les mol cules naD+ et naDh ont une structure identique celle du naDp+ et du naDph, respectivement, sauf qu'elles n'ont pas le groupe phosphate indiqu . ce groupe phosphate est absent du NAD+ et le NADH r g n re le NADP+, c'est le NADPH qui s'oxyde et le substrat qui est r duit. Le NADPH est un donneur efficace de son ion hydrure d'autres mol cules pour la m me raison que l'ATP transf re facilement un phosphate : dans les deux cas, le transfert s'accompagne d'un important changement d' nergie libre n gatif. La figure 2 37 donne un exemple de l'utilisation du NADPH dans la biosynth se. Le groupe phosphate suppl mentaire du NADPH n'a aucun effet sur les propri t s de transfert d' lectrons du NADPH par rapport au NADH, tant loin de la r gion impliqu e dans le transfert d' lectrons (voir Figure 2-36C). Cependant, cela donne une mol cule de NADPH une forme l g rement diff rente de celle du NADH, ce qui permet au NADPH et au NADH de se lier en tant que substrats des ensembles d'enzymes compl tement diff rents. Ainsi, les deux types de transporteurs sont utilis s pour transf rer des lectrons (ou ions hydrure) entre deux ensembles diff rents de mol cules. Pourquoi devrait-il y avoir cette division du travail ? La r ponse r side dans la n cessit de r guler deux ensembles de r actions de transfert d' lectrons ind pendamment. Le NADPH fonctionne principalement avec des enzymes qui catalysent les r actions anaboliques, fournissant les lectrons de haute nergie n cessaires la synth se de mol cules biologiques riches en nergie. Le NADH, en revanche, joue un r le particulier en tant qu'interm diaire dans le syst me catabolique des r actions qui g n rent de l'ATP par l'oxydation des mol cules alimentaires, comme nous le verrons bient t. La gen se du NADH partir du NAD+, et du NADPH partir du NADP+, se produit par des voies diff rentes et est r gul e ind pendamment, de sorte que la cellule peut ajuster l'apport d' lectrons ces deux fins oppos es. l'int rieur de la cellule, le rapport NAD+/NADH est maintenu lev , tandis que le rapport NADP+/NADPH est maintenu faible. Cela fournit beaucoup de NAD+ pour agir comme agent oxydant et beaucoup de NADPH pour agir comme agent r ducteur (Figure 2-37B), comme requis pour leurs r les sp ciaux dans le catabolisme et l'anabolisme, respectivement. Il existe de nombreuses autres mol cules porteuses activ es dans les cellules D'autres transporteurs activ s captent et transportent galement un groupe chimique dans une liaison haute nergie facilement transf rable. Par exemple, la coenzyme A porte un Figure 2 37 Le NaDPH en tant qu'agent r ducteur. (a) La derni re tape de la voie de biosynth se menant au cholest rol. comme dans de nombreuses autres r actions biosynth tiques, la r duction de la liaison C=C est obtenue par le transfert d'un ion hydrure de la mol cule porteuse naDph, plus un proton (h+) de la solution. (B) Le maintien de niveaux lev s de naDph et de niveaux de naDh faibles modifie leurs affinit s pour les lectrons (voir panneau 14-1, p. 765). Cela fait que le naDph est un donneur d' lectrons (agent r ducteur) beaucoup plus fort que le naDh, et que le naD+ est donc un bien meilleur accepteur d' lectrons (agent oxydant) que le naDp+, comme indiqu . ac tyle dans une liaison th
Biologie moléculaire de la cellule	ioester, et sous cette forme activ e, est connu sous le nom d'ac tyl CoA (ac tyl coenzyme A). L'ac tyl-CoA (figures 2 38) est utilis pour ajouter deux unit s de carbone dans la biosynth se de mol cules plus grosses. Dans l'ac tyl CoA, comme dans les autres mol cules porteuses, le groupe transf rable ne constitue qu'une petite partie de la mol cule. Le reste se compose d'une grande portion organique qui sert de poign e pratique, facilitant la reconnaissance de la mol cule porteuse par des enzymes sp cifiques. Comme pour l'ac tylCoA, cette partie de la poign e contient tr s souvent un nucl otide (g n ralement de l'ad nosine), un fait curieux qui peut tre une relique d'un stade pr coce de l' volution. On pense actuellement que les principaux catalyseurs des premi res formes de vie avant l'ADN ou les prot ines taient les mol cules d'ARN (ou leurs proches parents), comme d crit au chapitre 6. Il est tentant de supposer que bon nombre des mol cules porteuses que nous trouvons aujourd'hui proviennent de ce monde d'ARN ant rieur, o leurs parties nucl otidiques auraient pu tre utiles pour les lier aux enzymes de l'ARN (ribozymes). Ainsi, l'ATP transf re le phosphate, le NADPH transf re les lectrons et l'hydrog ne, et l'ac tyl-CoA transf re les groupes ac tyle deux carbones. La FADH2 (flavine ad nine dinucl otide r duite) est utilis e comme le NADH dans les transferts d' lectrons et de protons (Figure 2 39). Les r actions d'autres mol cules porteuses activ es impliquent le transfert d'un groupe m thyle, carboxyle ou glucose pour les biosynth ses (tableau 2-3). Ces porteurs activ s Figure 2 38 La structure de l'importante mol cule porteuse activ e ac tyl Coa. Une maquette balle et b ton est repr sent e au-dessus de la structure. L'atome de soufre (jaune) forme une liaison thioester l'ac tate. Parce qu'il s'agit d'une liaison haute nergie, lib rant une grande quantit d' nergie libre lorsqu'elle est hydrolys e, la mol cule d'ac tate peut tre facilement transf r e d'autres mol cules. Figure 2 39 FaDH2 est un transporteur d'hydrog nes et d' lectrons de haute nergie, comme le NaDH et le NaDPH. (a) la structure de faDh2, avec ses atomes porteurs d'hydrog ne surlign s en jaune. (B) La formation de faDh2 partir de faD. sont g n r s dans des r actions coupl es l'hydrolyse de l'ATP, comme dans l'exemple de la figure 2-40. Par cons quent, l' nergie qui permet leurs groupes d' tre utilis s pour la biosynth se provient en fin de compte des r actions cataboliques qui g n rent l'ATP. Des processus similaires se produisent dans la synth se des tr s grosses mol cules de la cellule les acides nucl iques, les prot ines et les polysaccharides dont nous parlerons ci-dessous. La synth se des polym res biologiques est entra n e par l'hydrolyse de l'aTp Comme nous l'avons vu pr c demment, les macromol cules de la cellule constituent la majeure partie de sa masse s che (voir Figure 2-7). Ces mol cules sont constitu es de sous-unit s (ou monom res) qui sont li es entre elles dans une r action de condensation, dans laquelle les constituants d'une mol cule d'eau (OH plus H) sont limin s des deux r actifs. Par cons quent, la r action inverse la d composition des trois types de polym res se produit par l'ajout d'eau catalys par une enzyme (hydrolyse). Cette r action d'hydrolyse est nerg tiquement favorable, tandis que les r actions de biosynth se n cessitent un apport d' nergie (voir Figure 2 9). Les acides nucl iques (ADN et ARN), les prot ines et les polysaccharides sont tous des polym res produits par l'ajout r p t d'un monom re une extr mit d'une cha ne en croissance. Les r actions de synth se pour ces trois types de macromol cules sont d crites dans la figure 2-41. Comme indiqu , l' tape de condensation d pend dans chaque cas de l' nergie de l'hydrolyse du nucl oside triphosphate. Et pourtant, l'exception des acides nucl iques, il ne reste plus de groupes phosphate dans les mol cules du produit final. Comment les r actions qui lib rent l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP sont-elles coupl es la synth se des polym res ? Pour chaque type de macromol cule, il existe une voie catalys e par une enzyme qui ressemble celle d crite pr c demment pour la synth se de l'acide amin glutamine (voir Figure 2-35). Le principe est exactement le m me, en ce sens que le groupe OH qui Figure 2 40 : une r action de transfert de groupe carboxyle l'aide d'une mol cule porteuse activ e. La biotine carboxyl e est utilis e par l'enzyme pyruvate carboxylase pour transf rer un groupe carboxyle dans la production d'oxaloac tate, une mol cule n cessaire au cycle de l'acide citrique. La mol cule accepteuse de cette r action de transfert de groupe est le pyruvate. d'autres enzymes utilisent la biotine, une vitamine du complexe B, pour transf rer les groupes carboxyles d'autres mol cules accepteuses. notez que la synth se de la biotine carboxyl e n cessite de l' nergie d riv e de l'aTp, une caract ristique
Biologie moléculaire de la cellule	g n rale de nombreux transporteurs activ s. Figure 2 41 La synth se des polysaccharides, des prot ines et des acides nucl iques. La synth se de chaque type de polym re biologique implique la perte d'eau dans une r action de condensation. La consommation de nucl osides triphosphates haute nergie qui est n cessaire pour activer chaque monom re avant son ajout n'est pas repr sent e. en revanche, la r action inverse - la d gradation CH2OHOHOOHOHCH2OHOHOOHOHCH2OHOOHOHOOCH2OHOOHOHCH2OHOOHOHOOCH2OHOOHOHO HOOH(A)POLYSACCHARIDESglucoseglycogenglycogenH2 nergie du nucl oside hydrolyse du triphosphate HCROCNHHCRCOOHHHRHCCNOOHHCROCNHHCRCRHCCNOOHHOprot ine acide amin (C) PROT INES A OCH2OHOOOO_POC OCH2OHOHOHOPOG OOHOHCH2O_A OCH2OHOOOO_POC OCH2OHOOPOG OOHOHCH2O_H2O (B) ACIDES NUCL IQUES ARN nucl otide H2 nergie du nucl oside hydrolyse du triphosphate du nucl oside nergie du nucl oside hydrolyse du triphosphate Prot ine d'ARN des trois types de polym res - se produit par simple ajout d'eau (hydrolyse). tre limin dans la r action de condensation est d'abord activ en s'impliquant dans une liaison haute nergie avec une deuxi me mol cule. Cependant, les m canismes r els utilis s pour lier l'hydrolyse de l'ATP la synth se des prot ines et des polysaccharides sont plus complexes que ceux utilis s pour la synth se de la glutamine, car une s rie d'interm diaires de haute nergie est n cessaire pour g n rer la liaison finale de haute nergie qui est rompue pendant l' tape de condensation (discut e au chapitre 6 pour la synth se des prot ines). Chaque vecteur activ a des limites dans sa capacit provoquer une r action biosynth tique. Le G pour l'hydrolyse de l'ATP en ADP et en phosphate inorganique (Pi) d pend des concentrations de tous les r actifs, mais dans les conditions habituelles d'une cellule, il est compris entre 46 et 54 kJ/mole. En principe, cette r action d'hydrolyse pourrait entra ner une r action d favorable avec une G de, peut- tre, +40 kJ/mole, condition qu'une voie de r action appropri e soit disponible. Pour certaines r actions biosynth tiques, cependant, m me -50 kJ/mole ne fournit pas une force motrice suffisante. Dans ces cas, le trajet de l'hydrolyse de l'ATP peut tre modifi de sorte qu'il produit initialement de l'AMP et du pyrophosphate (PPi), qui est lui-m me hydrolys lors d'une tape ult rieure (Figure 2 42). L'ensemble du processus permet d'obtenir une variation totale de l' nergie libre d'environ 100 kJ/mole. Un type important de r action biosynth tique qui est pilot de cette mani re est la synth se d'acides nucl iques (polynucl otides) partir de nucl osides triphosphates, comme illustr sur le c t droit de la figure 2-43. Notez que les r actions de condensation r p titives qui produisent des macromol cules peuvent tre orient es de deux mani res, donnant lieu soit la polym risation de la t te, soit la polym risation de la queue des monom res. Dans ce que l'on appelle la polym risation de la t te, la liaison r active n cessaire la r action de condensation est port e l'extr mit de la Figure 2 43 La synth se d'un polynucl otide, RNa ou DNa, est un processus en plusieurs tapes pilot par l'hydrolyse aTP. dans un premier temps, un nucl oside monophosphate est activ par le transfert s quentiel des groupes phosphate terminaux de deux mol cules d'aTp. L'interm diaire de haute nergie form , un nucl oside triphosphate, existe l' tat libre en solution jusqu' ce qu'il r agisse avec l'extr mit croissante d'un ARN ou une cha ne d'ADN avec lib ration de pyrophosphate. L'hydrolyse de ce dernier en phosphate inorganique est tr s favorable et contribue stimuler la r action globale dans le sens de la synth se des polynucl otides. pour plus de d tails, voir le chapitre 5. Figure 2 42 une voie alternative d'hydrolyse aTP, dans laquelle le pyrophosphate est d'abord form puis hydrolys . Cette route lib re environ deux fois plus d' nergie libre (environ -100 kJ/mole) que la r action montr e pr c demment sur la figure 2-33, et elle forme amp au lieu d'aDp. (a) Dans les deux r actions d'hydrolyse successives, les atomes d'oxyg ne des mol cules d'eau participantes sont retenus dans les produits, comme indiqu , tandis que les atomes d'hydrog ne se dissocient pour former des ions hydrog ne libres (H+, non repr sent ). (B) r sum de la r action globale. POLYM RISATION DE LA T TE (p. ex., PROT INES, ACIDES GRAS) POLYM RISATION DE LA QUEUE (p. ex., ADN, ARN, POLYSACCHARIDES) polym re en croissance, et il doit donc tre r g n r chaque fois qu'un monom re est ajout . Dans ce cas, chaque monom re apporte avec lui la liaison r active qui sera utilis e pour ajouter le monom re suivant dans la s rie. Dans la polym risation de la queue, la liaison r active port e par chaque monom re est utilis e imm diatement pour son propre ajout (Figure 2 44). Nous verrons dans les chapitres suivants que ces deux types de polym risation sont utilis s. La synth se des polynucl otides et de certain
Biologie moléculaire de la cellule	s polysaccharides simples se produit par polym risation de la queue, par exemple, tandis que la synth se des prot ines se produit par un processus de polym risation de la t te. Les cellules vivantes ont besoin de cr er et de maintenir l'ordre en elles-m mes pour survivre et se d velopper. Cela n'est possible thermodynamiquement qu'en raison d'un apport continu d' nergie, dont une partie doit tre lib r e des cellules vers leur environnement sous forme de chaleur qui perturbe l'environnement. Les seules r actions chimiques possibles sont celles qui augmentent la quantit totale de d sordre dans l'univers. La variation d' nergie libre pour une r action, G, mesure ce trouble, et elle doit tre inf rieure z ro pour qu'une r action se d roule spontan ment. Cette G d pend la fois des propri t s intrins ques des mol cules r actives et de leurs concentrations, et elle peut tre calcul e partir de ces concentrations si la constante d' quilibre (K) de la r action ou sa variation standard d' nergie libre, G , est connue. L' nergie n cessaire la vie provient en fin de compte du rayonnement lectromagn tique du soleil, qui entra ne la formation de mol cules organiques dans les organismes photosynth tiques tels que les plantes vertes. Les animaux obtiennent leur nergie en mangeant des mol cules organiques et en les oxydant dans une s rie de r actions catalys es par des enzymes qui sont coupl es la formation d'ATP une monnaie d' nergie commune toutes les cellules. Pour rendre possible la g n ration continue d'ordre dans les cellules, des r actions nerg tiquement favorables, telles que l'hydrolyse de l'ATP, sont coupl es des r actions nerg tiquement d favorables. Dans la biosynth se des macromol cules, l'ATP est utilis pour former des interm diaires phosphoryl s r actifs. Parce que la r action nerg tiquement d favorable de la biosynth se devient maintenant nerg tiquement favorable, on dit que l'hydrolyse de l'ATP est l'origine de la r action. Les mol cules polym res telles que les prot ines, les acides nucl iques et les polysaccharides sont assembl es partir de de petites mol cules pr curseurs activ es par des r actions de condensation r p titives qui sont entra n es de cette mani re. D'autres mol cules r actives, appel es transporteurs activ s ou coenzymes, transf rent d'autres groupes chimiques au cours de la biosynth se : le NADPH transf re l'hydrog ne sous forme de proton plus deux lectrons (un ion hydrure), par exemple, tandis que l'ac tyl-CoA transf re un groupe ac tyle. L'apport constant d' nergie dont les cellules ont besoin pour g n rer et maintenir l'ordre biologique qui les maintient en vie provient de l' nergie de liaison chimique dans les mol cules alimentaires. Les prot ines, les lipides et les polysaccharides qui constituent la plupart des aliments que nous mangeons doivent tre d compos s en mol cules plus petites avant que nos cellules ne puissent les utiliser, soit Figure 2 44 L'orientation des interm diaires actifs dans les r actions de condensation r p titives qui forment les polym res biologiques. La croissance de la t te des polym res est compar e son alternative, la croissance de la queue. Comme indiqu , ces deux m canismes sont utilis s pour produire diff rents types de macromol cules biologiques. comme source d' nergie ou comme l ments constitutifs d'autres mol cules. La digestion enzymatique d compose les grosses mol cules polym res des aliments en leurs sous-unit s monom res : les prot ines en acides amin s, les polysaccharides en sucres et les graisses en acides gras et en glyc rol. Apr s la digestion, les petites mol cules organiques d riv es des aliments p n trent dans le cytosol des cellules, o commence leur oxydation progressive. Les sucres sont des mol cules de carburant particuli rement importantes, et ils sont oxyd s par petites tapes contr l es en dioxyde de carbone (CO2) et en eau (Figure 2-45). Dans cette section, nous retra ons les principales tapes de la d composition, ou catabolisme, des sucres et montrons comment ils produisent de l'ATP, du NADH et d'autres mol cules porteuses activ es dans les cellules animales. Une voie tr s similaire fonctionne galement chez les plantes, les champignons et de nombreuses bact ries. Comme nous le verrons, l'oxydation des acides gras est tout aussi importante pour les cellules. D'autres mol cules, telles que les prot ines, peuvent galement servir de sources d' nergie lorsqu'elles sont achemin es par des voies enzymatiques appropri es. La glycolyse est une voie centrale de production d'aTp Le principal processus d'oxydation des sucres est la s quence de r actions connue sous le nom de glycolyse du grec glukus, doux , et lusis, rupture . La glycolyse produit de l'ATP sans l'implication de l'oxyg ne mol culaire (gaz O2). Il est pr sent dans le cytosol de la plupart des cellules, y compris de nombreux micro-organismes ana robies. La glycolyse a probablement volu t t dans l'histoire de la vie, a
Biologie moléculaire de la cellule	vant que les organismes photosynth tiques n'introduisent de l'oxyg ne dans l'atmosph re. Au cours de la glycolyse, une mol cule de glucose avec six atomes de carbone est convertie en deux mol cules de pyruvate, chacune contenant trois atomes de carbone. Pour chaque mol cule de glucose, deux mol cules d'ATP sont hydrolys es pour fournir de l' nergie aux premi res tapes, mais quatre mol cules d'ATP sont produites dans les tapes ult rieures. A la fin de la glycolyse, il y a donc un gain net de deux mol cules d'ATP pour chaque mol cule de glucose d compos e. Deux mol cules du porteur activ NADH sont galement produites. La voie glycolytique est d crite dans la figure 2-46 et montr e plus en d tail dans le panneau 2-8 (pp. 104-105) et la vid o 2.5. La glycolyse implique une s quence de 10 r actions distinctes, chacune produisant un interm diaire de sucre diff rent et chacune catalys e par une enzyme diff rente. Comme la plupart des enzymes, celles-ci ont des noms se terminant par ase, tels que isom rase et d shydrog nase, pour indiquer le type de r action qu'elles catalysent. Bien qu'aucun oxyg ne mol culaire ne soit utilis dans la glycolyse, l'oxydation se produit, en ce sens que les lectrons sont limin s par le NAD+ (produisant le NADH) de certains des carbones d riv s de la mol cule de glucose. La nature par tapes du processus lib re l' nergie d'oxydation en petits paquets, de sorte qu'une grande partie de celle-ci peut tre stock e dans des mol cules porteuses activ es plut t que d' tre enti rement lib r e sous forme de chaleur (voir Figure 2-45). Ainsi, une partie de l' nergie lib r e par l'oxydation entra ne la synth se directe des mol cules d'ATP partir de l'ADP et du Pi, et une partie reste avec les lectrons dans le porteur d' lectrons NADH. Figure 2 45 Repr sentation sch matique de l'oxydation contr l e par tapes du sucre dans une cellule, par rapport la combustion ordinaire. a) si le sucre tait oxyd en CO2 et en h2o en une seule tape, il lib rerait une quantit d' nergie beaucoup plus importante que celle qui pourrait tre captur e des fins utiles. (B) dans la cellule, les enzymes catalysent l'oxydation via une s rie de petites tapes au cours desquelles l' nergie libre est transf r e dans des paquets de taille appropri e vers des mol cules porteuses, le plus souvent aTp et naDh. chaque tape, une enzyme contr le la r action en r duisant la barri re d' nergie d'activation qui doit tre surmont e avant que la r action sp cifique puisse se produire. L' nergie libre totale lib r e est exactement la m me en (a) et (B). grande nergie d'activation surmont e par la chaleur d'un FR Toute l' nergie libre est lib r e sous forme de chaleur ; aucun n'est stock Deux mol cules de NADH se forment par mol cule de glucose au cours de la glycolyse. Dans les organismes a robies, ces mol cules de NADH donnent leurs lectrons la cha ne de transport d' lectrons d crite au chapitre 14, et le NAD+ form partir du NADH est nouveau utilis pour la glycolyse (voir l' tape 6 dans le panneau 2-8, pp. 104-105). les fermentations produisent de l'aTp en l'absence d'oxyg ne Pour la plupart des cellules animales et v g tales, la glycolyse n'est qu'un pr lude l' tape finale de la d gradation des mol cules alimentaires. Dans ces cellules, le pyruvate form par la glycolyse est rapidement transport dans les mitochondries, o il est converti en CO2 plus ac tylCoA, dont le groupe ac tyle est ensuite compl tement oxyd en CO2 et H2O. En revanche, pour de nombreux organismes ana robies, qui n'utilisent pas d'oxyg ne mol culaire et peuvent cro tre et se diviser sans lui, la glycolyse est la principale source d'ATP de la cellule. Certains tissus animaux, tels que les muscles squelettiques, peuvent galement continuer fonctionner lorsque l'oxyg ne mol culaire est limit . Dans ces conditions ana robies, les lectrons pyruvate et NADH restent dans le cytosol. Le pyruvate est converti en produits excr t s par la cellule, par exemple en thanol et en CO2 dans les levures utilis es dans le brassage et la fabrication du pain, ou en lactate dans les muscles. Dans ce processus, le NADH abandonne ses lectrons et est reconverti en NAD+. Cette r g n ration du NAD+ est n cessaire pour maintenir les r actions de glycolyse (Figure 2 47). Les voies de production d' nergie comme celles-ci, dans lesquelles les mol cules organiques donnent et acceptent des lectrons (et qui sont souvent, comme dans ces cas, ana robies), sont appel es une mol cule de glucose OH tre du fructose 1,6 sucre six atomes de carbone en deux sucres trois atomes de carbone TAPE 5 deux mol cules de glyc rald hyde Figure 2 46 un aper u de la glycolyse. Chacune des 10 tapes illustr es est catalys e par une enzyme diff rente. Notez que l' tape 4 divise un sucre six atomes de carbone en deux sucres trois atomes de carbone, de sorte que le nombre de mol cules chaque tape apr s cela double. Comme indiqu , l' tape 6 commence la phase de g n
Biologie moléculaire de la cellule	ration d' nergie de la glycolyse. Parce que deux mol cules d'aTp sont hydrolys es au d but, la phase d'investissement nerg tique, la glycolyse entra ne la synth se nette de 2 mol cules d'aTp et de 2 mol cules de naDh par mol cule de glucose (voir aussi le panneau 2-8). Figure 2 47 Deux voies de d gradation ana robie du pyruvate. (a) Lorsqu'il n'y a pas assez d'oxyg ne, par exemple dans une cellule musculaire subissant une contraction vigoureuse, le pyruvate produit par la glycolyse est converti en lactate comme indiqu . Cette r action r g n re le naD+ consomm l' tape 6 de la glycolyse, mais l'ensemble de la voie produit beaucoup moins d' nergie globalement que l'oxydation compl te. (B) chez certains organismes qui peuvent cro tre en ana robie, tels que les levures, le pyruvate est R g n ration C convertie par l'ac tald hyde en dioxyde de carbone et en thanol. encore une fois, cette voie CO HCOH r g n re le naD+ partir du naDh, comme n cessaire pour permettre la glycolyse de se poursuivre. Les points a) et B sont des exemples de fermentations. fermentations. L' tude des fermentations commercialement importantes effectu es par les levures a inspir une grande partie de la biochimie ancienne. Les travaux du XIXe si cle ont conduit en 1896 la reconnaissance alors surprenante que ces processus pouvaient tre tudi s en dehors des organismes vivants, dans des extraits cellulaires. Cette d couverte r volutionnaire a finalement permis de diss quer et d' tudier chacune des r actions individuelles du processus de fermentation. L'assemblage de la voie glycolytique compl te dans les ann es 1930 a t un triomphe majeur de la biochimie, et il a t rapidement suivi par la reconnaissance du r le central de l'ATP dans les processus cellulaires. La glycolyse illustre comment les enzymes couplent l'oxydation et le stockage de l' nergie La formation d'ATP au cours de la glycolyse fournit une d monstration particuli rement claire de la fa on dont les enzymes associent des r actions nerg tiquement d favorables des r actions favorables, entra nant ainsi les nombreuses r actions chimiques qui rendent la vie possible. Deux r actions centrales dans la glycolyse ( tapes 6 et 7) convertissent le glyc rald hyde 3-phosphate (un ald hyde) en 3-phosphoglyc rate (un acide carboxylique ; voir panel 2-8, pp. 104-105), oxydant ainsi un groupe ald hyde en un groupe acide carboxylique. La r action globale lib re suffisamment d' nergie libre pour convertir une mol cule d'ADP en ATP et pour transf rer deux lectrons (et un proton) de l'ald hyde au NAD+ pour former le NADH, tout en lib rant suffisamment de chaleur dans l'environnement pour rendre la r action globale nerg tiquement favorable ( G pour la r action globale est de -12,5 kJ/mole). La figure 2-48 d crit cet exploit remarquable de r cup ration d' nergie. Les r actions chimiques sont guid es avec pr cision par deux enzymes auxquelles le sucre s'interf re Une liaison covalente de courte dur e se forme entre le glyc rald hyde 3-phosphate et le groupe -SH d'une cha ne lat rale cyst ine de l'enzyme glyc rald hyde 3-phosphate d shydrog nase. L'enzyme se lie galement de mani re non covalente au NAD+. Le glyc rald hyde 3-phosphate est oxyd lorsque l'enzyme retire un atome d'hydrog ne (jaune) et le transf re, avec un lectron, au NAD+, formant ainsi du NADH (voir Figure 2-37). Une partie de l' nergie + H+ lib r e par l'oxydation de l'ald hyde est ainsi stock e dans le NADH, et une partie est stock e dans le phosphate haute teneur en glyc rald hyde 3- de l'enzyme CO. Une mol cule de phosphate inorganique haute nergie d place la liaison phosphate thioesterphosphate haute nergie pour cr er du 1,3-bisphospho-glyc rate, qui contient une liaison phosphate haute nergie. 1,3-bisphosphoglyc rateLe groupe phosphate haute nergie est transf r l'ADP pour former l'ATP. L'oxydation d'un ald hyde en acide carboxylique lib re de l' nergie, dont une grande partie est captur e dans les supports activ s ATP et NADH. Figure 2 48 Stockage de l' nergie dans les tapes 6 et 7 de la glycolyse. (a) l' tape 6, l'enzyme glyc rald hyde 3-phosphate d shydrog nase couple l'oxydation nerg tiquement favorable d'un ald hyde la formation nerg tiquement d favorable d'une liaison phosphate haute nergie. en m me temps, il permet de stocker l' nergie dans le naDh. La formation de la liaison phosphate haute nergie est entra n e par la r action d'oxydation, et l'enzyme agit ainsi comme le coupleur de la roue aubes sur la figure 2-32B. l' tape 7, la liaison phosphate haute nergie nouvellement form e dans le 1,3-bisphosphoglyc rate est transf r e l'aDp, formant une mol cule d'aTp et laissant un groupe acide carboxylique libre sur le sucre oxyd . La partie de la mol cule qui subit un changement est ombr en bleu ; Le reste de la mol cule reste inchang tout au long de ces r actions. (B) r sum de la modification chimique globale produite par les r actions 6 et 7.
Biologie moléculaire de la cellule	sont troitement li s. Comme d taill dans la figure 2-48, la premi re enzyme (glyc rald hyde 3-phosphate d shydrog nase) forme une liaison covalente de courte dur e avec l'ald hyde par le biais d'un groupe -SH r actif sur l'enzyme, et catalyse son oxydation par le NAD+ dans cet tat attach . La liaison enzyme-substrat r active est ensuite d plac e par un ion phosphate inorganique pour produire un interm diaire phosphate haute nergie, qui est lib r par l'enzyme. Cet interm diaire se lie la deuxi me enzyme (phosphoglyc rate kinase), qui catalyse le transfert nerg tiquement favorable du phosphate haute nergie qui vient d' tre cr vers l'ADP, formant de l'ATP et compl tant le processus d'oxydation d'un ald hyde en acide carboxylique. Notez que l' nergie d'oxydation de la liaison C-H l' tape 6 entra ne la formation de NADH et d'une liaison phosphate haute nergie. La rupture de la liaison haute nergie entra ne alors la formation d'ATP. Nous avons montr ce processus d'oxydation particulier en d tail car il fournit un exemple clair de stockage d' nergie m di par des enzymes par des r actions coupl es (Figure 2-49). Les tapes 6 et 7 sont les seules r actions de la glycolyse qui cr ent une liaison phosphate haute nergie directement partir du phosphate inorganique. En tant que tels, ils repr sentent le rendement net de deux mol cules d'ATP et de deux mol cules de NADH par mol cule de glucose (voir panel 2-8, pp. 104-105). Comme nous venons de le voir, l'ATP peut tre form facilement partir de l'ADP lorsqu'un interm diaire r actionnel est form avec une liaison phosphate d' nergie sup rieure la liaison phosphate terminale de l'ATP. Les liaisons phosphate peuvent tre command es en nergie en comparant la variation standard d' nergie libre ( G ) pour la rupture de chaque liaison par hydrolyse. La figure 2-50 compare les liaisons phosphoanhydride de haute nergie dans l'ATP avec l' nergie de certaines autres liaisons phosphate, dont plusieurs sont g n r es pendant la glycolyse. Tous les organismes ont besoin de maintenir un rapport ATP/ADP lev pour maintenir l'ordre biologique dans leurs cellules. Pourtant, les animaux n'ont qu'un acc s p riodique la nourriture, et les plantes doivent survivre toute la nuit sans soleil, lorsqu'elles sont incapables de produire du sucre partir de la photosynth se. Pour cette raison, les plantes et les animaux convertissent les sucres et les graisses en formes sp ciales de stockage (Figure 2 51). Pour compenser les longues p riodes de je ne, les animaux stockent les acides gras sous forme de gouttelettes de graisse compos es de triacylglyc rols insolubles dans l'eau ( galement appel s triglyc rides). Les triacylglyc rols chez les animaux sont principalement stock s dans le cytoplasme de cellules adipeuses sp cialis es appel es adipocytes. Pour un stockage plus court terme, le sucre est stock sous forme de glucose 1,3-bisphosphoglyc rate formation de l'hydrolyse de la liaison haute nergie liaison haute nergie LA VARIATION D' NERGIE TOTALE pour l' tape 6 suivie de l' tape 7 est favorable -12,5 kJ/mole Figure 2 49 Vue sch matique des r actions coupl es qui forment le NaDH et l'aTP dans les tapes 6 et 7 de la glycolyse. L' nergie d'oxydation de la liaison C-h entra ne la formation de naDh et d'une liaison phosphate haute nergie. La rupture de la liaison haute nergie entra ne alors la formation d'aTp. liaison l'anhydride de carbone liaison au phosphate type de liaison phosphate 61,9 kJ (voir panneau 2 8, p. 104 105) par exemple, 1,3-bisphosphoglyc rate 49,0 kJ (voir panneau 2 8) 40 cr atine phosphate (transporteur activ qui 43,0 kJ stocke l' nergie dans le muscle) par exemple, ATP lorsqu'il est hydrolys 30,6 kJ ADP 20 par exemple, glucose 6-phosphate 17,5 kJ (voir panneau 2 8) exemples sp cifiques montrant le changement d' nergie libre standard ( G ) pour l'hydrolyse du phosphate obligation Figure 2 50 Les liaisons phosphate ont des nergies diff rentes. Des exemples de diff rents types de liaisons phosphat es avec leurs sites d'hydrolyse sont pr sent s dans les mol cules repr sent es gauche. Ceux qui commencent avec un atome de carbone gris ne montrent qu'une partie d'une mol cule. Des exemples de mol cules contenant de telles liaisons sont donn s sur le droite, avec le changement standard d' nergie libre pour l'hydrolyse en kilojoules. Le transfert d'un groupe phosphate d'une mol cule une autre est nerg tiquement favorable si la variation d' nergie libre ( G) pour l'hydrolyse de la liaison phosphate de la premi re mol cule est plus n gative que celle pour l'hydrolyse de la liaison phosphate dans la seconde. Ainsi, dans des conditions standard, un groupe phosphate est facilement transf r du 1,3-bisphosphoglyc rate l'aDp pour former l'aTp. (Les conditions standard ne concernent souvent pas les cellules vivantes, o les concentrations relatives de r actifs et de produits influenceront le changement r el de
Biologie moléculaire de la cellule	l' nergie libre.) La r action d'hydrolyse peut tre consid r e comme le transfert du groupe phosphate dans l'eau. sous-unit s du glycog ne polysaccharidique ramifi , qui est pr sent sous forme de petits granules dans le cytoplasme de nombreuses cellules, y compris le foie et les muscles. La synth se et la d gradation du glycog ne sont rapidement r gul es en fonction des besoins. Lorsque les cellules ont besoin de plus d'ATP qu'elles ne peuvent g n rer partir des mol cules alimentaires absorb es dans la circulation sanguine, elles d composent le glycog ne dans une r action qui produit du glucose 1-phosphate, qui est rapidement converti en glucose 6-phosphate pour la glycolyse (Figure 2-52). Quantitativement, les graisses sont beaucoup plus importantes que le glycog ne en tant que r serve d' nergie pour les animaux, probablement parce qu'elles permettent un stockage plus efficace. L'oxydation d'un gramme de graisse lib re environ deux fois plus d' nergie que l'oxydation d'un gramme de glycog ne. De plus, le glycog ne diff re de la graisse en ce qu'il lie une grande quantit d'eau, ce qui produit une diff rence de six fois dans la masse r elle de glycog ne n cessaire pour stocker la m me quantit d' nergie que la graisse. Un adulte moyen stocke suffisamment de glycog ne Figure 2 51 Le stockage des sucres et des graisses dans les cellules animales et v g tales. a) Les structures de l'amidon et du glycog ne, la forme de stockage des sucres chez les plantes et les animaux, respectivement. Les deux sont des polym res de stockage du sucre glucose et ne diff rent que par la fr quence des points de d rivation. Il y a beaucoup plus de branches dans le glycog ne que dans l'amidon. (B) une micrographie lectronique de granules de glycog ne dans le cytoplasme d'une cellule h patique. (C) une coupe mince d'un chloroplaste d'une cellule v g tale, montrant les granules d'amidon et les lipides (gouttelettes de graisse) qui se sont accumul s la suite des biosynth ses qui s'y produisent. (D) des gouttelettes de graisse (color es en rouge) commen ant s'accumuler dans les cellules graisseuses en d veloppement d'un animal. (B, avec l'aimable autorisation de Robert fletterick et Daniel s. ami ; C, avec la permission de K. plaskitt ; D, avec l'aimable autorisation de Ronald M. Evans et Peter Totonoz.) pour seulement environ une journ e d'activit s normales, mais suffisamment de graisse pour durer pr s d'un mois. Si notre principal r servoir de carburant devait tre transport sous forme de glycog ne au lieu de graisse, le poids corporel augmenterait en moyenne d'environ 60 livres. Le sucre et l'ATP n cessaires aux cellules v g tales sont en grande partie produits dans des organites distincts : les sucres dans les chloroplastes (les organites sp cialis s dans la photosynth se), 2 Figure 2 52 Comment les sucres sont produits partir du glycog ne. Les sous-unit s du glucose sont lib r es du glycog ne par l'enzyme glycog ne phosphorylase. Cela produit du glucose 1-phosphate, qui est rapidement converti en glucose 6-phosphate pour la glycolyse OH. Figure 2 53 Quelques graines de plantes qui servent d'aliments importants pour les humains. Le ma s, les noix et les pois contiennent tous de riches r serves d'amidon et de graisse qui fournissent au jeune embryon de plante dans la graine de l' nergie et des l ments constitutifs pour la biosynth se. (Avec l'aimable autorisation de la fondation John Innes.) et l'ATP dans les mitochondries. Bien que les plantes produisent des quantit s abondantes d'ATP et de NADPH dans leurs chloroplastes, cet organite est isol du reste de sa cellule v g tale par une membrane imperm able aux deux types de mol cules porteuses activ es. De plus, la plante contient de nombreuses cellules, telles que celles des racines, qui n'ont pas de chloroplastes et ne peuvent donc pas produire leurs propres sucres. Ainsi, les sucres sont export s des chloroplastes vers les mitochondries pr sentes dans toutes les cellules de la plante. La majeure partie de l'ATP n cessaire au m tabolisme g n ral des cellules v g tales est synth tis e dans ces mitochondries, en utilisant exactement les m mes voies pour la d gradation oxydative des sucres que dans les organismes non photosynth tiques ; cet ATP est ensuite transmis au reste de la cellule (voir Figure 14 42). Pendant les p riodes d'exc s de capacit photosynth tique au cours de la journ e, les chloroplastes convertissent une partie des sucres qu'ils fabriquent en graisses et en amidon, un polym re de glucose analogue au glycog ne des animaux. Les graisses des plantes sont des triacyl-glyc rols (triglyc rides), tout comme les graisses des animaux, et ne diff rent que par les types de acides gras qui pr dominent. La graisse et l'amidon sont tous deux stock s l'int rieur du chloroplaste jusqu' ce qu'ils soient n cessaires l'oxydation nerg tique pendant les p riodes d'obscurit (voir Figure 2-51C). Les embryons l'int rieur des graines de plantes doivent vivre
Biologie moléculaire de la cellule	sur des sources d' nergie stock es pendant une p riode prolong e, jusqu' ce qu'ils germent et produisent des feuilles qui peuvent r colter l' nergie de la lumi re du soleil. Pour cette raison, les graines de plantes contiennent souvent des quantit s particuli rement importantes de graisses et d'amidon, ce qui en fait une source de nourriture majeure pour les animaux, y compris nous-m mes (Figure 2 53). Apr s un repas, la majeure partie de l' nergie dont un animal a besoin provient des sucres obtenus partir des aliments. Les sucres en exc s, le cas ch ant, sont utilis s pour reconstituer les r serves de glycog ne puis es ou pour synth tiser les graisses en tant que r serve de nourriture. Mais bient t, la graisse stock e dans le tissu adipeux est mise en jeu, et le matin apr s un je ne nocturne, l'oxydation des acides gras g n re la majeure partie de l'ATP dont nous avons besoin. Un faible taux de glucose dans le sang d clenche la d gradation des graisses pour la production d' nergie. Comme l'illustre la figure 2-54, les triacylglyc rols stock s dans les gouttelettes de graisse dans les adipocytes sont hydrolys s pour produire des acides gras et du glyc rol, et les acides gras lib r s sont transf r s aux cellules du corps par la circulation sanguine. Alors que les animaux convertissent facilement les sucres en graisses, ils ne peuvent pas convertir les acides gras en sucres. Au lieu de cela, les acides gras sont oxyd s directement. les sucres et les graisses sont tous deux d grad s en ac tyl Coa dans les mitochondries Dans le m tabolisme a robie, le pyruvate qui a t produit par la glycolyse partir des sucres dans le cytosol est transport dans les mitochondries des cellules eucaryotes. L , il est rapidement d carboxyl par un complexe g ant de trois enzymes, appel complexe pyruvate d shydrog nase. Les produits de la d carboxylation du pyruvate sont une mol cule de CO2 (un d chet), une mol cule de NADH et de l'ac tylCoA (voir panneau 2-9). Les acides gras import s de la circulation sanguine sont d plac s vers les mitochondries, o toute leur oxydation a lieu (Figure 2 55). Chaque mol cule d'acide gras (sous la forme de la mol cule activ e d'acyle gras CoA) est compl tement d compos e par un cycle de r actions qui coupe deux carbones la fois de son extr mit carboxyle, g n rant une mol cule d'ac tyl CoA pour chaque tour du cycle. Une mol cule de NADH et une mol cule de FADH2 sont galement produites dans ce processus (Figure 2 56). Les sucres et les graisses sont les principales sources d' nergie pour la plupart des organismes non photosynth tiques, y compris les humains. Cependant, la majeure partie de l' nergie utile qui peut tre extraite de l'oxydation des deux types d'aliments reste stock e dans les mol cules d'ac tyl-CoA produites par les deux types de r actions que nous venons de d crire. Le cycle des r actions de l'acide citrique, dans lequel le groupe ac tyle ( COCH3) de l'ac tylCoA est oxyd en CO2 et H2O, est donc central dans le m tabolisme nerg tique des organismes a robies. Chez les eucaryotes, ces r actions ont toutes lieu dans les mitochondries. Il ne faut donc pas s' tonner de d couvrir que la mitochondrie est le lieu o la majeure partie de l'ATP est produite dans les cellules animales. En revanche, les bact ries a robies effectuent toutes leurs r actions, y compris le cycle de l'acide citrique, dans un seul compartiment, le cytosol. Le cycle de l'acide citrique g n re du naDh en oxydant les groupes ac tyle en CO2 Au XIXe si cle, les biologistes ont remarqu qu'en l'absence d'air, les cellules produisent de l'acide lactique (par exemple, dans le muscle) ou de l' thanol (par exemple, dans la levure), tandis qu'en sa pr sence, elles consomment de l'O2 et produisent du CO2 et de l'H2O. Les efforts visant d finir les voies du m tabolisme a robie se sont finalement concentr s sur l'oxydation du pyruvate et ont conduit en 1937 la d couverte du cycle de l'acide citrique, galement connu sous le nom de Figure 2 54 Comment les graisses stock es sont mobilis es pour la production d' nergie chez les animaux. Un faible taux de glucose dans le sang d clenche l'hydrolyse des mol cules de triacylglyc rol dans les gouttelettes de graisse en acides gras libres et en glyc rol. Ces acides gras p n trent dans la circulation sanguine, o ils se lient l'albumine s rique, une prot ine sanguine abondante. Transporteurs sp ciaux d'acides gras dans la membrane plasmique des cellules qui oxydent les acides gras, tels que les cellules musculaires, passent ensuite ces acides gras dans le cytosol, partir duquel ils sont d plac s vers les mitochondries pour la production d' nergie. Figure 2 55 Voies de production d'ac tyl Coa partir de sucres et de graisses. La mitochondrie des cellules eucaryotes est l'endroit o l'ac tyl Coa est produit partir des deux types de mol cules alimentaires majeures. c'est donc l'endroit o se produisent la plupart des r actions d'oxydation de la cellule et o
Biologie moléculaire de la cellule	la majeure partie de son aTp est fabriqu e. Les acides amin s (non illustr s) peuvent galement p n trer dans les mitochondries, pour y tre convertis en ac tyl Coa ou en un autre interm diaire du cycle de l'acide citrique. La structure et la fonction des mitochondries sont discut es en d tail au chapitre 14. cycle de l'acide tricarboxylique ou cycle de Krebs. Le cycle de l'acide citrique repr sente environ les deux tiers de l'oxydation totale des compos s carbon s dans la plupart des cellules, et ses principaux produits finaux sont le CO2 et les lectrons de haute nergie sous forme de NADH. Le CO2 est lib r sous forme de d chet, tandis que les lectrons de haute nergie du NADH sont transmis une cha ne de transport d' lectrons li e une membrane (discut e au chapitre 14), se combinant ventuellement avec l'O2 pour produire de l'H2O. Le cycle de l'acide citrique lui-m me n'utilise pas d'O2 gazeux (il utilise des atomes d'oxyg ne de H2O). Mais le cycle a besoin d'O2 dans les r actions ult rieures pour le maintenir. En effet, il n'y a pas d'autre moyen efficace pour le NADH de se d barrasser de ses lectrons et donc de r g n rer le NAD+ n cessaire. Le cycle de l'acide citrique se d roule l'int rieur des mitochondries dans les cellules eucaryotes. Il entra ne l'oxydation compl te des atomes de carbone des groupes ac tyle dans l'ac tylCoA, les convertissant en CO2. Mais le groupe ac tyle n'est pas oxyd directement. Au lieu de cela, ce groupe est transf r de l'ac tyl-CoA une mol cule plus grande quatre atomes de carbone, l'oxaloac tate, pour former l'acide tricarboxylique six atomes de carbone, l'acide citrique, qui donne son nom au cycle de r actions qui suit. La mol cule d'acide citrique est ensuite progressivement oxyd e, ce qui permet d'exploiter l' nergie de cette oxydation pour produire des mol cules porteuses activ es riches en nergie. La cha ne de huit r actions forme un cycle parce qu' la fin, l'oxaloac tate est r g n r et entre dans un nouveau tournant du cycle, comme le montre le sch ma de la figure 2-57. Jusqu' pr sent, nous n'avons discut que d'un seul des trois types de mol cules porteuses activ es qui sont produites par le cycle de l'acide citrique ; NADH, la forme r duite du syst me porteur d' lectrons NAD+/NADH (voir Figure 2 36). En plus des trois mol cules de NADH, chaque tour du cycle produit galement une mol cule de FADH2 (flavine ad nine dinucl otide r duite) partir de FAD (voir Figure 2-39), et une mol cule du ribonucl oside triphosphate GTP partir du GDP. La structure de GTP est illustr e la figure 2-58. Le GTP est un proche parent de l'ATP, et le transfert de son groupe phosphate terminal l'ADP produit une mol cule d'ATP dans chaque cycle. Comme nous le verrons bient t, l' nergie stock e dans les lectrons facilement transf r s du NADH et de la FADH2 sera ensuite utilis e pour la production d'ATP par le reste de l'acyle gras de la queue d'hydrocarbure CoA raccourci de deux carbones Figure 2 56 L'oxydation des acides gras en ac tyl Coa. (a) micrographie lectronique d'une gouttelette lipidique dans le cytoplasme. (B) La structure des graisses. Les graisses sont des triacylglyc rols. La partie glyc rol, laquelle trois acides gras sont li s par des liaisons esters, est repr sent e en bleu. Les graisses sont insolubles dans l'eau et forment de grosses gouttelettes lipidiques dans les cellules adipeuses sp cialis es (adipocytes) dans lesquelles elles sont stock es. (C) Le cycle d'oxydation des acides gras. Le cycle est catalys par une s rie de quatre enzymes dans les mitochondries. chaque tour du cycle raccourcit la cha ne d'acides gras de deux atomes de carbone (en rouge) et g n re une mol cule d'ac tyl Coa et une mol cule de naDh et une mol cule de faDh2. (a, avec l'aimable autorisation de Daniel s. friend.) R SULTAT NET : UN TOUR DU CYCLE PRODUIT TROIS MOL CULES DE NADH, UNE MOL CULE DE GTP ET UNE MOL CULE DE FADH2, ET LIB RE DEUX MOL CULES DE CO2 DU PROCESSUS DE PHOSPHORYLATION OXYDATIVE, LA SEULE TAPE DU CATABOLISME OXYDATIF DES DENR ES ALIMENTAIRES QUI N CESSITE DIRECTEMENT DE L'OXYG NE GAZEUX (O2) DE L'ATMOSPH RE. Les panneaux 2 9 (p. 106 107) et le film 2.6 pr sentent le cycle complet de l'acide citrique. De l'eau, plut t que L'oxyg ne mol culaire fournit les atomes d'oxyg ne suppl mentaires n cessaires la fabrication du CO2 partir des groupes ac tyle entrant dans le cycle de l'acide citrique. Comme illustr dans le panneau, trois mol cules d'eau sont divis es dans chaque cycle, et les atomes d'oxyg ne de certaines d'entre elles sont finalement utilis s pour produire du CO2. En plus du pyruvate et des acides gras, certains acides amin s passent du cytosol aux mitochondries, o ils sont galement convertis en ac tyl-CoA ou en l'un des autres interm diaires du cycle de l'acide citrique. Ainsi, dans la cellule eucaryote, la mitochondrie est le centre vers lequel m nent tous les processus de production d' nergie, qu'ils commencent par les
Biologie moléculaire de la cellule	sucres, les graisses ou les prot ines. Le cycle de l'acide citrique et la glycolyse servent galement de points de d part pour d'importantes r actions de biosynth se en produisant des interm diaires vitaux contenant du carbone, tels que l'oxaloac tate et le -c toglutarate. Certaines de ces substances produites par le catabolisme sont transf r es des mitochondries au cytosol, o elles servent dans les r actions anaboliques en tant que pr curseurs de la synth se de nombreuses mol cules essentielles, telles que les acides amin s (Figure 2-59). Le transport d' lectrons entra ne la synth se de la majorit de l'aTp dans la plupart des cellules La majeure partie de l' nergie chimique est lib r e lors de la derni re tape de la d gradation d'une mol cule alimentaire. Dans ce processus final, le NADH et le FADH2 transf rent les lectrons qu'ils ont gagn s lors de l'oxydation de mol cules organiques d'origine alimentaire la cha ne de transport d' lectrons, qui est int gr e dans la membrane interne de la mitochondrie (voir Figure 14-10). Au fur et mesure que les lectrons passent le long de cette longue cha ne de mol cules accepteuses et donneuses d' lectrons sp cialis es, ils tombent dans des tats d' nergie successivement inf rieurs. L' nergie lib r e par les lectrons dans ce processus pompe les ions H+ (protons) travers la membrane, du compartiment mitochondrial le plus interne (la matrice) l'espace intermembranaire (puis au cytosol), g n rant un gradient d'ions H+ (Figure 2-60). Ce gradient sert de source d' nergie majeure pour les cellules, tant exploit comme une batterie pour entra ner une vari t de r actions n cessitant de l' nergie. La plus importante de ces r actions est la g n ration d'ATP par la phosphorylation de l'ADP. Figure 2 57 Aper u simple du cycle de l'acide citrique. La r action de l'ac tyl Coa avec l'oxaloac tate commence le cycle en produisant du citrate (acide citrique). chaque tour du cycle, deux mol cules de CO2 sont produites sous forme de d chets, plus trois mol cules de naDh, une mol cule de GTp et une mol cule de faDh2. Le nombre d'atomes de carbone dans chaque interm diaire est indiqu dans une case jaune. Pour plus de d tails, voir les panneaux 2-9 (pp. 106-107). o Figure 2 58 La structure de GTP. GTp et GDp sont des parents proches de aTp et aDp, respectivement. la fin de cette s rie de transferts d' lectrons, les lectrons sont transmis des mol cules d'oxyg ne gazeux (O2) qui se sont diffus es dans la mitochondrie, qui se combinent simultan ment avec les protons (H+) de la solution environnante pour produire de l'eau. Les lectrons ont maintenant atteint un niveau d' nergie faible et toute l' nergie disponible a t extraite de la mol cule alimentaire oxyd e. Ce processus, appel phosphorylation oxydative (Figure 2-61), se produit galement dans la membrane plasmique des bact ries. En tant que l'une des r alisations les plus remarquables de l' volution cellulaire, c'est un sujet central du chapitre 14. Au total, l'oxydation compl te d'une mol cule de glucose en H2O et CO2 est utilis e par la cellule pour produire environ 30 mol cules d'ATP. En revanche, seules 2 mol cules d'ATP sont produites par mol cule de glucose par glycolyse seule. les acides amin s et les nucl otides font partie du cycle de l'azote Jusqu' pr sent, nous nous sommes principalement concentr s sur le m tabolisme des glucides et n'avons pas encore consid r le m tabolisme de l'azote ou du soufre. Ces deux l ments sont des constituants importants des macromol cules biologiques. Passage des atomes d'azote et de soufre Figure 2 59 La glycolyse et le cycle de l'acide citrique fournissent les pr curseurs n cessaires la synth se de nombreuses mol cules biologiques importantes. Les acides amin s, les nucl otides, les lipides, les sucres et d'autres mol cules, pr sent s ici sous forme de produits, servent leur tour de pr curseurs pour les nombreuses macromol cules de la cellule. Chaque fl che noire dans ce diagramme indique une seule r action catalys e par une enzyme ; Les fl ches rouges repr sentent g n ralement des voies comportant de nombreuses tapes qui sont n cessaires la production des produits indiqu s. D'un compos l'autre et entre les organismes et leur environnement dans une s rie de cycles r versibles. Bien que l'azote mol culaire soit abondant dans l'atmosph re terrestre, l'azote est chimiquement non r actif sous forme de gaz. Seules quelques esp ces vivantes sont capables de l'incorporer dans des mol cules organiques, un processus appel fixation de l'azote. La fixation de l'azote se produit dans certains micro-organismes et par certains processus g ophysiques, tels que la d charge de foudre. Elle est essentielle la biosph re dans son ensemble, car sans elle, la vie ne pourrait exister sur cette plan te. Cependant, seule une petite fraction des compos s azot s dans les organismes d'aujourd'hui est due des produits frais de fixation de l'azote de l'atmosph re. La plupa
Biologie moléculaire de la cellule	rt de l'azote organique circule depuis un certain temps, passant d'un organisme vivant un autre. Ainsi, on peut dire que les r actions actuelles de fixation de l'azote remplissent une fonction d' appoint pour l'approvisionnement total en azote. Les vert br s re oivent pratiquement tout leur azote de leur apport alimentaire en prot ines et en acides nucl iques. Dans le corps, ces macromol cules sont d compos es en acides amin s et en composants des nucl otides, et l'azote qu'elles contiennent est utilis pour produire de nouvelles prot ines et acides nucl iques, ou d'autres mol cules. Environ la moiti des 20 acides amin s pr sents dans les prot ines sont des acides amin s essentiels pour les vert br s (Figure 2-62), ce qui signifie qu'ils ne peuvent pas tre synth tis s partir d'autres ingr dients de l'alimentation. Les autres acides amin s peuvent tre synth tis s de cette mani re, en utilisant une vari t de mati res premi res, y compris des interm diaires du cycle de l'acide citrique. Les acides amin s essentiels sont fabriqu s par les plantes et d'autres organismes, g n ralement par des voies longues et co teuses en nergie qui ont t perdues au cours de l' volution des vert br s. Les nucl otides n cessaires la fabrication de l'ARN et de l'ADN peuvent tre synth tis s l'aide de voies de biosynth se sp cialis es. Tous les azotes contenus dans les bases puriques et pyrimidines (ainsi que certains des carbones) sont d riv s des acides amin s abondants que sont la glutamine, l'acide aspartique et la glycine, tandis que les sucres ribose et d soxyribose sont d riv s du glucose. Il n'y a pas de nucl otides essentiels qui doivent tre fournis dans l'alimentation. Les acides amin s non utilis s dans la biosynth se peuvent tre oxyd s pour g n rer de l' nergie m tabolique. La plupart de leurs atomes de carbone et d'hydrog ne finissent par former du CO2 ou du H2O, tandis que leurs atomes d'azote sont transport s sous diverses formes et finissent par appara tre sous forme d'ur e, qui est excr t e. Chaque acide amin est trait diff remment, et toute une constellation de r actions enzymatiques existe pour leur catabolisme. Le soufre est abondant sur Terre sous sa forme la plus oxyd e, le sulfate (SO42 ). Pour tre utile la vie, le sulfate doit tre r duit en sulfure (S2 ), l' tat d'oxydation du soufre n cessaire la synth se de mol cules biologiques essentielles, y compris les acides amin s m thionine et cyst ine, la coenzyme A (voir figure 2 39) et les centres fer-soufre essentiels au transport des lectrons (voir figure 14 16). Le processus de r duction du soufre commence chez les bact ries, les champignons et les plantes, o un groupe sp cial d'enzymes utilise l'ATP et le pouvoir r ducteur pour cr er une voie d'assimilation du sulfate. Les humains et les autres animaux ne peuvent pas r duire les sulfates et doivent donc acqu rir le soufre dont ils ont besoin pour leur m tabolisme dans les aliments qu'ils consomment. Figure 2 60 La g n ration d'un gradient H+ travers une membrane par des r actions de transport d' lectrons. un lectron maintenu dans un tat de haute nergie (d riv , par exemple, de l'oxydation d'un m tabolite) est transmis s quentiellement par les porteurs A, B et C vers un tat d' nergie inf rieur. sur ce sch ma, le porteur B est dispos dans la membrane de telle sorte qu'il absorbe h+ d'un c t et le lib re de l'autre c t au passage de l' lectron. Le r sultat est un gradient h+. comme nous l'avons vu au chapitre 14, ce gradient est une forme importante de nergie qui est exploit e par d'autres prot ines membranaires pour entra ner la formation d'aTp (pour un exemple r el, voir la figure 14-21). Figure 2 61 Les derni res tapes de l'oxydation des mol cules alimentaires. les mol cules de naDh et faDh2 (faDh2 n'est pas repr sent ) sont produites par le cycle de l'acide citrique. Ces transporteurs activ s donnent des lectrons de haute nergie qui sont finalement utilis s pour r duire l'oxyg ne gazeux en eau. une grande partie de l' nergie lib r e lors du transfert de ces lectrons le long d'une cha ne de transfert d' lectrons dans la membrane interne mitochondriale (ou dans la membrane plasmique des bact ries) est exploit e pour entra ner la synth se de l'aTp, d'o le nom de phosphorylation oxydative (discut au chapitre 14). le m tabolisme est hautement organis et r gul On se fait une id e de la complexit d'une cellule en tant que machine chimique partir de la relation entre la glycolyse et le cycle de l'acide citrique et les autres voies m taboliques esquiss es dans les figures 2-63. Ce graphique ne repr sente qu'une partie des voies enzymatiques d'une cellule humaine. Il est vident que notre discussion sur le m tabolisme cellulaire n'a port que sur une infime fraction du vaste domaine de la chimie cellulaire. Toutes ces r actions se produisent dans une cellule de moins de 0,1 mm de diam tre, et chacune n cessite une enzyme diff rente. Comme le montre claire
Biologie moléculaire de la cellule	ment la figure 2-63, la m me mol cule peut souvent faire partie de nombreuses voies diff rentes. Le pyruvate, par exemple, est un substrat pour une demi-douzaine d'enzymes diff rentes ou plus, chacune d'entre elles le modifiant chimiquement d'une mani re diff rente. Une enzyme convertit le pyruvate en ac tyl-CoA, une autre en oxaloac tate ; Une troisi me enzyme transforme le pyruvate en alanine, un quatri me en lactate, et ainsi de suite. Toutes ces diff rentes voies sont en concurrence pour la m me mol cule de pyruvate, et des comp titions similaires pour des milliers d'autres petites mol cules se d roulent en m me temps. La situation est encore plus compliqu e dans un organisme multicellulaire. Diff rents types de cellules n cessiteront en g n ral des ensembles d'enzymes quelque peu diff rents. Et diff rents tissus apportent des contributions distinctes la chimie de l'organisme dans son ensemble. En plus des diff rences dans les produits sp cialis s tels que les hormones ou les anticorps, il existe des diff rences significatives dans les voies m taboliques communes entre les diff rents types de cellules d'un m me organisme. Bien que pratiquement toutes les cellules contiennent les enzymes de la glycolyse, du cycle de l'acide citrique, de la synth se et de la d gradation des lipides et du m tabolisme des acides amin s, les niveaux de ces processus requis dans diff rents tissus ne sont pas les m mes. Par exemple, les cellules nerveuses, qui sont probablement les cellules les plus pointilleuses du corps, ne conservent presque aucune r serve de glycog ne ou d'acides gras et d pendent presque enti rement d'une constante Figure 2 62 Les neuf acides amin s essentiels. Ceux-ci ne peuvent pas tre synth tis s par les cellules humaines et doivent donc tre fournis dans l'alimentation. Figure 2 63 La glycolyse et le cycle de l'acide citrique sont au centre d'un ensemble labor de voies m taboliques dans les cellules humaines. Quelque 2000 r actions m taboliques sont repr sent es sch matiquement avec les r actions de la glycolyse et du cycle de l'acide citrique en rouge. De nombreuses autres r actions m nent soit ces deux voies centrales d livrant de petites mol cules cataboliser avec la production d' nergie soit l'ext rieur et fournissant ainsi des compos s carbon s des fins de biosynth se. (Adapt avec la permission des laboratoires Kanehisa.) Apport de glucose par la circulation sanguine. En revanche, les cellules h patiques fournissent du glucose WhaT We Don'T KnoW contractant activement les cellules musculaires et recyclent l'acide lactique produit par les cellules musculaires en glucose. Tous les types de cellules ont leurs traits m taboliques distinctifs, et La chimiosmose a-t-elle pr c d une coop ration extensive l' tat normal, ainsi qu'en r ponse au stress et la fermentation comme source de famine. On pourrait penser que l'ensemble du syst me aurait besoin d' tre si finement quilibr en nergie, ou qu'il aurait fait une forme d'ancing que tout bouleversement mineur, comme un changement temporaire dans l'apport alimentaire, la fermentation viendrait en premier, comme cela avait t d sastreux. assum depuis de nombreuses ann es ? En fait, l' quilibre m tabolique d'une cellule est tonnamment stable. Chaque fois que l' quilibre est perturb , la cellule r agit de mani re r tablir l' quilibre. tat initial. La cellule peut s'adapter Quel est le nombre minimum de et continuer fonctionner pendant la famine ou la maladie. Des mutations de toutes sortes, des composants n cessaires pour gagner sa vie peuvent endommager ou m me liminer des voies de r action particuli res, et pourtant, fournir une cellule partir de z ro ? Comment pourrions-nous le savoir ? que certaines exigences minimales sont remplies la cellule survit. Il le fait parce qu'un r seau labor de m canismes de contr le r gule et coordonne les vitesses de toutes ses r actions. Ces contr les reposent, en fin de compte, sur les capacit s remarquables des prot ines changer de forme et de chimie en r ponse des changements en plus de la seule connue sur terre (et d crite dans ce chapitre) ? Lorsque leur environnement imm diat. Les principes qui sous-tendent la construction des grandes mol cules de d pistage de la vie sur d'autres plan tes, telles que les prot ines, et la chimie derri re leur r gulation seront notre prochaine pr occupation. Faut-il chercher ? La chimie partag e l'int rieur de toutes les mol cules de glucose et d'autres mol cules alimentaires sont d compos es par des cellules vivantes d'oxydation contr l e par tapes, un indice pour d chiffrer la fourniture d' nergie chimique sous forme d'ATP et de NADH. Il y a trois ensembles principaux d'environnement sur terre o la premi re des r actions qui agissent en s rie, les produits de chacune tant le mat riau de d part des cellules ? par exemple, que faire ensuite : la glycolyse (qui se produit dans le cytosol), le cycle de l'acide citrique (c
Biologie moléculaire de la cellule	hez le mitochon - pourrions-nous conclure du rapport lev K+/na+ universellement partag , du ph neutre, de la matrice driale), et de la phosphorylation oxydative (sur le m m mitochondrial interne et le r le central des phosphates ? brane). Les produits interm diaires de la glycolyse et du cycle de l'acide citrique sont utilis s la fois comme sources d' nergie m tabolique et pour produire de nombreuses petites mol cules utilis es comme mati res premi res pour la biosynth se. Les cellules stockent des mol cules de sucre sous forme de glycog ne chez les animaux et d'amidon chez les plantes ; Les plantes et les animaux utilisent galement largement les graisses comme r serve de nourriture. Ces mat riaux de stockage constituent leur tour une source majeure de nourriture pour les humains, avec les prot ines qui constituent la majorit de la masse s che de la plupart des cellules dans les aliments que nous mangeons. Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas. Discutez des probl mes suivants. 2 1 Une solution de 10 8 M de HCl a un pH de 8. 2 8 On dit que la chimie organique des cellules vivantes est sp ciale pour deux raisons : elle se produit dans un environnement aqueux2 2 La plupart des interactions entre les macromol cules sont l'origine de r actions tr s complexes. pourrait tre m di e tout aussi bien par des liaisons covalentes que par Mais pensez-vous que c'est vraiment si diff rent des liaisons non covalentes ? La chimie organique r alis e dans les meilleurs laboratoires du monde ? Pourquoi ou pourquoi pas ? 2 3 Les animaux et les plantes utilisent l'oxydation pour extraire de l' nergie des mol cules alimentaires. 2 9 La masse mol culaire de l' thanol (CH3CH2OH) est de 46 et sa masse volumique est de 0,789 g/cm3. 2 4 Si une oxydation se produit dans une r action, il doit s'agir de a. Quelle est la molarit de l' thanol dans la bi re qui est de 5% accompagn e d'une r duction. thanol en volume ? [La teneur en alcool de la bi re varie d'environ 4 % (bi re l g re) 8 % (bi re brune).] 2 5 Lien entre la r action nerg tiquement d favorable A b. La limite l gale pour le taux d'alcool mie d'un conducteur B une seconde, r action favorable B C d placera le varie, mais 80 mg d' thanol pour 100 ml de sang (g n ralement une constante d' quilibre pour la premi re r action. appel un taux d'alcool mie de 0,08) est typique. Quoi 2 6 Le crit re permettant de d terminer si une r action produit est la molarit de l' thanol chez une personne cette limite l gale ? spontan ment est G et non G , parce que G prend en C. Le nombre de bouteilles de 12 oz (355 ml) de bi re 5 % qui pourraient expliquer les concentrations des substrats et des produits. Une personne de 70 kg boit et reste en dessous de la limite l gale ? Une personne de 70 kg contient environ 40 litres d'eau. Ignorez les 2 7 L'oxyg ne consomm lors de l'oxydation du glu-m tabolisme de l' thanol, et supposez que la teneur en eau des cellules animales est renvoy e sous forme de CO2 dans l'atmosph re. de la personne reste constante. Activit (% du maximum) D. L' thanol est m tabolis un taux constant d'environ 120 mg par heure et par kg de poids corporel, quelle que soit sa concentration. Si une personne de 70 kg avait une glyc mie deux fois sup rieure la limite l gale (160 mg/100 ml), combien de temps faudrait-il pour que son taux d'alcool mie tombe sous la limite l gale ? 2 10 Une cha ne lat rale d'histidine est connue pour jouer un r le important dans le m canisme catalytique d'une enzyme ; Cependant, il n'est pas clair si l'histidine est n cessaire l' tat proton (charg ) ou non proton (non charg ). Pour r pondre cette question, vous mesurez l'activit enzymatique sur une plage de pH, avec les r sultats pr sent s la figure Q2 1. Quelle forme d'histidine est n cessaire l'activit enzymatique ? Activit en fonction du pH (probl me 2 10). 2 11 Les trois mol cules de la figure Q2 2 contiennent les sept groupes r actifs les plus courants en biologie. La plupart des mol cules de la cellule sont construites partir de ces groupes fonctionnels. Indiquez et nommez les groupes fonctionnels de ces mol cules. O Figure Q2 2 Trois mol cules qui illustrent les sept groupes fonctionnels les plus courants en biologie (probl me 2 11). 1,3-bisphosphoglyc rate et O Le pyruvate sont des interm diaires dans la glycolyse et la cyst ine est un acide amin . 1,3-bisphosphoglyc rate pyruvate cyst ine 2 12 La diffusion semble lente et sur les distances quotidiennes, elle l'est mais l' chelle d'une cellule, elle est tr s rapide. La vitesse instantan e moyenne d'une particule en solution, c'est- -dire la vitesse entre les collisions tr s fr quentes, est o k = 1,38 10 16 g cm2/K sec2, T = temp rature en K (37 C est 310 K) et m = masse en g/mol cule. Calculez la vitesse instantan e d'une mol cule d'eau (masse mol culaire = 18 daltons), d'une mol cule de glucose (masse mol culaire = 180 daltons) et d'un
Biologie moléculaire de la cellule	e mol cule de myoglobine (masse mol culaire = 15 000 daltons) 37 C. Juste pour le plaisir, convertissez ces nombres en kilom tres/heure. Avant de faire des calculs, essayez de deviner si les mol cules se d placent un rythme lent (<1 km/h), une marche facile (5 km/h) ou un sprint record (40 km/h). 2 13 La polym risation des sous-unit s de tubuline en microtubules se produit avec une augmentation de l'ordre des sous-unit s. Pourtant, la polym risation de la tubuline se produit avec une augmentation de l'entropie (diminution de l'ordre). Comment est-ce possible ? 2 14 Un humain adulte de 70 kg (154 lb) pourrait couvrir tous ses besoins nerg tiques pendant une journ e en mangeant 3 moles de glucose (540 g). (Nous ne le recommandons pas.) Chaque mol cule de glucose g n re 30 mol cules d'ATP lorsqu'elle est oxyd e en CO2. La concentration d'ATP est maintenue dans les cellules environ 2 mM, et un adulte de 70 kg a environ 25 litres de liquide intracellulaire. tant donn que la concentration d'ATP reste constante dans les cellules, calculez combien de fois par jour, en moyenne, chaque mol cule d'ATP dans le corps est hydrolys e et resynth tis e. 2 15 En supposant qu'il y a 5 1013 cellules dans le corps humain et que l'ATP se retourne un rythme de 109 mol cules d'ATP par minute dans chaque cellule, combien de watts le corps humain consomme-t-il ? (Un watt est un joule par seconde.) Supposons que l'hydrolyse de l'ATP donne 50 kJ/mole. 2 16 Une barre chocolat e SnickersTM (65 g, 1360 kJ) fournit-elle suffisamment d' nergie pour grimper de Zermatt (1660 m d'altitude) au sommet du Cervin (4478 m, figures Q2 3), ou devez-vous vous arr ter la cabane H rnli (3260 m) pour en manger une autre ? Imaginez que vous et votre quipement avez une masse de 75 kg et que tout votre travail est effectu contre la gravit (c'est- -dire que vous ne faites que grimper tout droit). Rappelez-vous de votre cours d'introduction la physique que o g est l'acc l ration due la gravit (9,8 m/sec2). Un joule correspond 1 kg m2/sec2. Quelles hypoth ses faites ici sous-estimeront grandement la quantit de bonbons dont vous avez besoin ? Figure Q2 3 Le Cervin (probl me 2 16). (Avec l'aimable autorisation de Zermatt Tourism.) 2 17 En l'absence d'oxyg ne, les cellules consomment du glucose un rythme lev et r gulier. Lorsque de l'oxyg ne est ajout , la consommation de glucose chute pr cipitamment et est ensuite maintenue un taux plus faible. Pourquoi le glucose est-il consomm un taux lev en l'absence d'oxyg ne et un taux faible en sa pr sence ? PaNel 2 1 : Liaisons et groupes chimiques couramment rencontr s dans les mol cules biologiques Le carbone a un r le unique dans la cellule en raison de sa capacit former de fortes liaisons covalentes avec d'autres anneaux d'arbres ramifi s, des atomes de carbone. C'est ainsi que les atomes de carbone peuvent se joindre pour former : aussi crit comme aussi crit comme aussi crit comme Une liaison covalente se forme lorsque deux atomes se rapprochent l'un de l'autre et partagent un ou plusieurs de leurs lectrons. Dans une seule liaison combin e de carbone et d'hydrog ne, un lectron de chacun des deux atomes est partag ; Pour former une double liaison stable, un total de quatre lectrons sont partag s. compos s (ou groupes chimiques)Chaque atome forme un grand nombre de liaisons covalentes dans un appel hydrocarbure. Il s'agit d'une disposition spatiale d finie. Par exemple, le carbone forme quatre liaisons non polaires, ne forment pas de liaisons simples dispos es t tra driquement, tandis que l'azote forme des liaisons hydrog ne, et sont trois liaisons simples et l'oxyg ne forme deux liaisons simples dispos es g n ralement insolubles dans l'eau. comme indiqu ci-dessous.ne peut pas tourner librement HH autour de l'axe de liaison. Cette restriction est uneLes doubles liaisons existent et ont une disposition spatiale diff rente.influence majeure sur la forme tridimensionnelle de nombreuses macromol cules. Groupe m thyle du m thane La cha ne carbon e peut inclure des doubles liaisons altern es dans des liaisons annulaires. Si ceux-ci sont sur le carbone alternatif, cela peut g n rer une structure tr s stable. Les atomes de CH2, les lectrons de liaison, se d placent l'int rieur de la mol cule, stabilisant la structure par un ph nom ne appel r sonance CH2. HH H, HH, la v rit est que quelque part entre H2C, ces deux structures HH sont souvent crites comme faisant partie de la queue d'hydrocarbures d'une mol cule d'acide gras De nombreux compos s biologiques contiennent un carbone Les amines et les amides sont deux exemples importants de liaison un oxyg ne. Par exemple, les compos s contenant un carbone li un azote. alcool H Les amines dans l'eau se combinent avec un ion H+ pour devenir Le OH est appel un charg positivement. groupe hydroxyle. Les amides sont form s en combinant un acide et un an. Contrairement aux amines, les amides so
Biologie moléculaire de la cellule	nt d charg s dans l'eau. groupe carbonyle. c tone C Un exemple est la liaison peptidique qui relie les acides amin s d'une prot ine. acide carboxylique O Le COOH est appel un Groupe carboxyle C. Dans l'eau H, cela perd un ion H+ pour L'azote OH est galement pr sent dans plusieurs compos s cycliques, y compris devenir -COO. Constituants importants des acides nucl iques : purines et pyrimidines. esters Les esters sont form s par une r action de condensation entre un acide et un alcool. GROUPE SULFHYDRYLE Le C SH est appel groupe sulfhydryle. Dans l'acide amin cyst ine, le groupe sulfhydryle peut exister sous forme r duite, C SH ou plus rarement sous une forme oxyd e, pontage crois , CSSC PHOSPHATES Le phosphate inorganique est un ion stable form partir d'esters de phosphate qui peuvent se former entre un phosphate et un groupe hydroxyle libre. acide phosphorique, H3PO4. Il s' crit aussi Pi . Les groupes phosphate sont souvent attach s aux prot ines de cette mani re. aussi _ __ crit comme HOPO C OHHOPO C OPO H2O La combinaison d'un groupe phosphate et d'un groupe carboxyle, ou de deux ou plusieurs groupes phosphate, donne un anhydride acide. Parce que les compos s de ce type sont facilement hydrolys s dans la cellule, on dit parfois qu'ils contiennent une liaison haute nergie . _ aussi crit comme __ aussi crit comme mol cules telles que ATPPaNel 2 2 : L'eau et son influence sur le comportement des mol cules biologiques Deux atomes, reli s par une liaison covalente, peuvent exercer des attractions diff rentes car les mol cules d'eau rejoignent transitoirement les lectrons de la liaison. Dans de tels cas, la liaison est polaire, avec une extr mit dans un r seau li l'hydrog ne. M me 37 C, l g rement charg n gativement ( ) et l'autre l g rement charg positivement ( +). 15 % des mol cules d'eau sont li es quatre autres dans un assemblage de courte dur e connu sous le nom de cluster fickering . Bien qu'une mol cule d'eau ait une charge neutre globale (ayant le m me nombre d' lectrons et de protons), les lectrons sont distribu s de mani re asym trique, ce qui rend la mol cule polaire. La nature coh sive de l'eau provient des noyaux d'hydrog ne, laissant ces noyaux avec une petite charge positive nette. L'exc s de densit lectronique sur l'atome d'oxyg ne cr e des propri t s faiblement n gatives, telles qu'une tension superficielle lev e, des r gions aux deux autres coins d'un t tra dre imaginaire. chaleur sp cifique et chaleur de vaporisation. Parce qu'elles sont polaris es, deux mol cules H2O adjacentes + peuvent former une liaison hydrog ne H H, une liaison connue sous le nom de liaison hydrog ne H 0,17 nm. Les liaisons hydrog ne n'ont qu'environ 1/20 de la force O H O 2 + d'une liaison covalente. H H 0,10 nmLes liaisons hydrog ne sont les plus fortes lorsque la liaison hydrog ne liaison covalenteles trois atomes se trouvent en ligne droite. + Les substances qui se dissolvent facilement dans l'eau sont dites hydrophiles. Ce sont des mol cules qui contiennent une pr pond rance compos e d'ions ou de mol cules polaires qui attirent les mol cules d'eau travers des liaisons non polaires sont g n ralement insolubles dans les effets de charge lectrique. Les mol cules d'eau entourent chaque ion ou mol cule polaire de l'eau et sont dites hydrophobes. C'est la surface d'une substance solide et transportez-la en solution. vrai, en particulier, des hydrocarbures, qui H contient de nombreuses liaisons C-H. Les mol cules d'eau ne sont pas attir es par de telles mol cules et donc O ont peu tendance les entourer et H OH les transporte en solution. Les substances ioniques telles que le chlorure de sodium H se dissolvent parce que les mol cules d'eau sont C attir par les substances polaires positives (Na+) ou n gatives telles que l'ur e HO (Cl_) de chaque ion. se dissolvent parce que leurs mol cules HH HH forment des liaisons hydrog ne avec les mol cules d'eau environnantes OO HH. De nombreuses substances, telles que le sucre m nager, se dissolvent dans l'eau. C'est- -dire que leurs mol cules se s parent les unes des autres, chacune tant entour e de mol cules d'eau. Lorsqu'une substance se dissout dans un liquide, le m lange est appel solution. La substance dissoute (dans ce cas, le sucre dissout le sucre) est le solut , et le liquide qui fait la dissolution (dans ce cas, l'eau) est le solvant. L'eau est un excellent solvant pour de nombreuses substances en raison de ses liaisons polaires. De nombreux acides importants dans la cellule ne sont que partiellement dissoci s, et ce sont donc des acides faibles - par exemple, le groupe carboxyle (-COOH), qui se dissocie pour donner un ion hydrog ne en solution. (acide faible) Notez qu'il s'agit d'une r action r versible. L'acidit d'une solution est d termin e par la concentration d'ions H+ qu'elle poss de. Pour plus de commodit , nous utilisons l' chelle de pH, o H+ conc. moles/litre Les ions hydrog ne charg s
Biologie moléculaire de la cellule	positivement (H+) peuvent se d placer spontan ment d'une mol cule d'eau une autre, cr ant ainsi deux esp ces ioniques. ion hydronium (l'eau agissant comme une base faible) souvent crit comme : Ion hydroxyle H2O (l'eau agissant comme un acide faible) Comme le processus est rapidement r versible, les ions hydrog ne font continuellement la navette entre les mol cules d'eau. L'eau pure contient une concentration l' tat d' quilibre d'ions hydrog ne et d'ions hydroxyles (tous deux de 10 7 M). Les substances qui r duisent le nombre d'ions hydrog ne en solution sont appel es bases. Certaines bases, comme l'ammoniac, se combinent directement avec les ions hydrog ne. D'autres bases, telles que l'hydroxyde de sodium, r duisent indirectement le nombre d'ions H+, en produisant des ions OH qui se combinent ensuite directement avec les ions H+ pour former H2O. De nombreuses bases pr sentes dans les cellules sont partiellement associ es aux ions H+ et sont appel es bases faibles. C'est le cas des compos s qui contiennent un groupe amino ( NH2), qui a une faible tendance accepter de mani re r versible un ion H+ de l'eau, augmentant ainsi la quantit d'ions OH libres. PaNel 2 3 : Les principaux types de liaisons non covalentes faibles qui maintiennent les macromol cules ensemble Les mol cules organiques peuvent interagir avec d'autres mol cules par le biais de trois types de forces d'attraction courte port e appel es liaisons non covalentes : les attractions de van der Waals, les attractions lectrostatiques et les liaisons hydrog ne. La r pulsion des groupes hydrophobes par l'eau est galement importante pour le repliement des macromol cules biologiques. Les liaisons chimiques non covalentes faibles ont moins de 1/20 de la r sistance d'une liaison covalente forte. Ils ne sont suffisamment solides pour fournir une liaison tanche que lorsque beaucoup d'entre eux sont form s simultan ment. Comme nous l'avons d j d crit pour l'eau (voir les panneaux 2 et 2), les liaisons hydrog ne se forment lorsqu'un atome d'hydrog ne est (g n ralement de l'oxyg ne ou de l'azote). Les liaisons hydrog ne sont plus fortes lorsque les trois atomes sont en ligne droite :Exemples dans les macromol cules : ensemble. Ceux-ci stabilisent la structure des prot ines repli es. Deux bases, G et C, sont li es l'hydrog ne dans une double h lice d'ADNa. Si deux atomes sont trop proches l'un de l'autre, ils se repoussent tr s fortement. Pour cette raison, un atome peut souvent tre trait comme une sph re avec un rayon fxed. La taille caract ristique de chaque atome est sp cifi e par un rayon de van der Waals unique. La distance de contact entre deux atomes li s de mani re non covalente est la somme de leurs rayons de van der Waals. 0,12 nm 0,2 nm 0,15 nm 0,14 nm rayon rayon de tr s courtes distances, deux atomes quelconques pr sentent une faible interaction de liaison en raison de leurs charges lectriques fuctuantes. Les deux atomes seront ainsi attir s l'un vers l'autre jusqu' ce que la distance entre leurs noyaux soit approximativement gale la somme de leurs rayons de van der Waals. Bien qu'elles soient individuellement tr s faibles, les attractions de van der Waals peuvent devenir importantes lorsque deux surfaces macromol culaires sont tr s proches l'une de l'autre, car de nombreux atomes sont impliqu s. Notez que lorsque deux atomes forment une liaison covalente, les centres des deux atomes (les deux noyaux atomiques) sont beaucoup plus proches que la somme des deux rayons de van der Waals. Ainsi, 0,4 nm 0,15 nm 0,13 nm Toutes les mol cules qui peuvent former des liaisons hydrog ne les unes avec les autres peuvent alternativement former des liaisons hydrog ne avec les mol cules d'eau. En raison de cette comp tition avec les mol cules d'eau, les liaisons hydrog ne form es entre deux mol cules dissoutes dans l'eau sont relativement faibles. L'eau force les groupes hydrophobes se rassembler, car cela minimise leurs effets perturbateurs sur le r seau d'eau li l'hydrog ne. Groupes hydrophobes organis s On dit parfois que les H ensemble sont maintenus ensemble par des liaisons hydrophobes , m me si les L'attraction apparente est en fait caus e par une r pulsion de l'eau. Les forces d'attraction se produisent la fois entre les groupes enti rement charg s (liaison ionique) et entre les groupes partiellement charg s sur les mol cules polaires. La force d'attraction entre les deux charges, + et , diminue rapidement mesure que la distance entre les charges augmente. En l'absence d'eau, les forces lectrostatiques sont tr s fortes. Ils sont responsables de la r sistance de min raux tels que le marbre et l'agate, et de la formation de cristaux dans le sel de table commun, NaCl. un cristal de sel, NaCl Les groupes charg s sont prot g s par leurs interactions avec les mol cules d'eau. Les attractions lectrostatiques sont donc assez faibles dans l'eau. De m me, les ions en solution peuvent se regrouper
Biologie moléculaire de la cellule	autour de groupes charg s et affaiblir davantage ces attractions. Bien qu'elles soient affaiblies par l'eau et le sel, les attractions lectrostatiques sont tr s importantes dans les syst mes biologiques. Par exemple, une enzyme qui se lie un substrat charg positivement aura souvent une cha ne lat rale d'acides amin s charg e n gativement l'endroit appropri . PaNel 2 4 : un aper u de certains des types de sucres couramment trouv s dans les cellules Les monosaccharides ont g n ralement la formule g n rale (CH2O) n, o n peut tre 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, et ont deux ou plusieurs groupes hydroxyles. Ils contiennent soit un groupe ald hyde ( ) et sont appel s aldoses, soit un groupe c tone ( ) et sont appel s c toses. MONOSACCHARIDESC O C O H Dans une solution aqueuse, le groupe ald hyde ou c tone d'un sucre De nombreux monosaccharides ne diff rent que par l'agencement spatialLa mol cule a tendance r agir avec un groupe hydroxyle du m me nombre d'atomes, c'est- -dire qu'ils sont isom res. Par exemple, glucose,mol cule, fermant ainsi la mol cule en un anneau. Le galactose et le mannose ont la m me formule (C6H12O6) mais diff rent dans l'arrangement des groupes autour d'un ou deux atomes de carbone. propri t s chimiques des sucres. Mais ils sont reconnus par des enzymes et d'autres prot ines et peuvent donc avoir un num ro majeur 5CH2OH. effets biologiques. ET LIENS Le groupe hydroxyle sur le carbone qui porte l'ald hyde ou la c tone peut rapidement changer d'une position l'autre. Ces deux positions sont appel es et . D s qu'un sucre est li un autre, la forme ou est congel e. OH O OH O hydroxyle hydroxyle CH2OH NH2 H O OH OH OH HO glucosamine CH2OH O OH OH HO CH3 O NH C H N-ac tylglucosamine C O OH OH acide glucuronique O CH2OH HO O OH OH CH2OH OH HOCH2 HO CH2OH HO OH CH2OH OH HOCH2 HO H O + saccharose glucose fructoseDISACCHARIDES Le carbone qui transporte l'ald hyde ou la c tone peut r agir avec n'importe quel groupe hydroxyle sur une seconde mol cule de sucre pour former un disaccharide. La liaison est appel e liaison glycosidique. Les trois disaccharides courants sont le maltose (glucose + glucose), le lactose (galactose + glucose), le saccharose (glucose + fructose), la r action formant le saccharose est illustr e ici. H2O O O O O OLIGOSACCHARIDES ET POLYSACCHARIDES De grandes mol cules lin aires et ramifi es peuvent tre fabriqu es partir de simples sous-unit s de sucre r p titives. Les cha nes courtes sont appel es oligosaccharides, tandis que les cha nes longues sont appel es polysaccharides. Le glycog ne, par exemple, est un polysaccharide compos enti rement d'unit s de glucose assembl es. points de d rivation glycog ne CH2OH NH O CH2OH O CH2OH O OH OH O O O HO CH3 O Dans de nombreux cas, une s quence de sucre n'est pas r p titive. De nombreuses mol cules diff rentes sont possibles. Ces oligosaccharides complexes sont G n ralement li des prot ines ou des lipides, comme l'est cet oligosaccharide, qui fait partie d'une mol cule de surface cellulaire qui d finit un groupe sanguin particulier. OLIGOSACCHARIDES COMPLEXES C O CH3 C O CH3 D RIV S DU SUCRE Les groupes hydroxyles d'un monosaccharide simple tel que le glucose peuvent tre remplac s par d'autres groupes. Par exemple, 97 Les acides gras sont stock s sous forme de r serve d' nergie (graisses et huiles) par une liaison ester au glyc rol pour former des triacylglyc rols, galement appel s triglyc rides. H2COCOHCOCOH2COCOH2COHHCOHH2COHglyc rol TRIACYLGLYC ROLS Ce sont des acides carboxyliques avec de longues queues d'hydrocarbures. COOHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3COOHCH2CH2CH2CH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2COOHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CHCHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3 CH3acide st arique (C18) acide palmitique (C16) acide ol ique (C18) ACIDES GRAS COMMUNS OOCacide t arique Cette double liaison est rigide et cr e un pli dans la cha ne. Le reste de la cha ne est libre de tourner autour des autres liaisons C-C. GROUPE OCARBOXYLE O_OCOOCNOCCHIf libre, le groupe carboxyle d'un acide gras sera ionis . Mais le plus souvent, il est li d'autres groupes pour former des esters ou des amides. PHOSPHOLIPIDES CH2CHCH2PO_OOOhydrophobic queues d'acides gras structure g n rale d'un phospholipide OOCoacide ol ique mod le de vol spatial squelette de carbone t te hydrophile choline Dans les phospholipides, deux des groupes OH du glyc rol sont li s aux acides gras, tandis que le troisi me groupe OH est li l'acide phosphorique. Le phosphate est en outre li l'un des nombreux petits groupes polaires, tels que la choline. mod le spatial de la phospholipide phosphatidylcholine Il existe des centaines de types diff rents d'acides gras. Certains ont une ou plusieurs doubles liaisons dans leur queue d'hydrocarbure et sont dits insatur s. Les acides gras sans double liaison sont satur s. Les phospholipides sont les principaux constituants des membranes cellulaires. INSATUR S SATUR S 98 PaNel 2 5 : Acides gras et
Biologie moléculaire de la cellule	autres lipides Les acides gras ont une t te hydrophile et une queue hydrophobe. Dans l'eau, ils peuvent former une surface flm ou former de petites micelles. Leurs d riv s peuvent former des agr gats plus grands maintenus ensemble par des forces hydrophobes : les triacylglyc rols (triglyc rides) peuvent former de grosses gouttelettes de graisse sph riques dans le cytoplasme cellulaire. Les phospholipides et les glycolipides forment des bicouches lipidiques auto-obturantes qui sont la base de toutes les membranes cellulaires. Polym res micellaires longue cha ne de 200 nm ou plus d'isopr ne O AUTRES LIPIDES Les lipides sont d finis comme des mol cules insolubles dans l'eau dans les cellules qui sont solubles dans les solvants organiques. Deux autres types courants de lipides sont les st ro des et les polyisopr no des. Les deux sont fabriqu s partir d'unit s d'isopr ne. CH3CCHCH2CH2isopr ne ST RO DES Les st ro des ont une structure commune plusieurs anneaux. GLYCOLIPIDES Comme les phospholipides, ces compos s sont compos s d'une r gion hydrophobe, contenant deux longues queues d'hydrocarbures et d'une r gion polaire, qui contient un ou plusieurs sucres et, contrairement aux phospholipides, pas de phosphate. CCCH2HNHOHHOCOsugar, un glycolipide simple, phosphate d'Hdolichol, utilis pour transporter les sucres activ s dans la synth se membranaire des glycoprot ines et de certains polysaccharides, le galactose BASES Les bases sont des compos s cycliques contenant de l'azote, soit des pyrimidines, soit des purines. CCCHCNHNHOOCCHCNHNONH2H3CCCHCNHNHOOHCHCUCTuracilcytosinethymineN N 1 2 3 4 5 6 N N 1 2 3 4 5 6N N 7 8 9 O N N H C C C N NH2 HC N N H C C C CH N N HC NH2 ad nine guanine A G PYRIMIDINE PURINE 100 PaNel 2 6 : une tude des nucl otides NUCL OTIDESUn nucl otide se compose d'une base contenant de l'azote, d'un sucre carbon fve et d'un ou plusieurs groupes phosphate. HHONH2OCH2OHOHBASE SUCRE PHOSPHATE Les nucl otides sont les sous-unit s des acides nucl iques. Le phosphate produit un nucl otide charg n gativement. PHOSPHATES Les phosphates sont normalement li s l'hydroxyle C5 du sucre ribose ou d soxyribose (d sign 5'). Les monophosphates, les diphosphates et les triphosphates sont courants. La base est li e au m me carbone (C1) que celui utilis dans les liaisons sucre-sucre. SUCRES Chaque carbone num rot sur le sucre d'un nucl otide est suivi d'une marque premi re ; par cons quent, on parle du carbone 5-premier , etc. OH OH O H H HOCH2 OH H H OH H H H HOCH2 OH H H PENTOSE A FVE-CARBONE SUCRE O 4' 3' 2' 1' C 5' deux types sont utilis s -D-ribose utilis dans l'acide ribonucl ique -D-2-d soxyribose utilis dans l'acide d soxyribonucl ique NOMENCLATURE Un nucl oside ou nucl otide est nomm d'apr s sa base azot e. BASE ad nine, guanine, cytosine, uracile, thymine, NUCL OSIDE, ad nosine, guanosine, cytidine, uridine, thymidine ABBR. A G C U T Les abr viations d'une seule lettre sont utilis es diversement comme abr viation pour (1) la base seule, (2) le nucl oside ou (3) le nucl otide entier - le contexte indiquera g n ralement clairement laquelle des trois entit s est vis e. Lorsque le contexte n'est pas suffisant, nous ajouterons les termes base , nucl oside , nucl otide ou, comme dans les exemples ci-dessous, utiliserons le code nucl otidique complet 3 lettres. AMP dAMP UDP ATP = AD NOSINE MONOPHOSPHATE = d soxyad nosine monophosphate = uridine diphosphate = ad nosine triphosphate sucre base base BASE + SUCRE = BASE NUCL OSIDIQUE + SUCRE + PHOSPHATE = ACIDES NUCL OTIDIQUES NUCL OTIDES Les nucl otides sont reli s entre eux par une liaison phosphodiester entre les atomes de carbone 5' et 3' pour former des acides nucl iques. La s quence lin aire de nucl otides dans une cha ne d'acides nucl iques est g n ralement abr g e par un code d'une lettre, tel que A G C T T A C A, avec l'extr mit 5' de la cha ne gauche. OOHbase de sucre CH2OO OPO+OOHsugarbaseCH2H2OOO OPOOsugarbaseCH2OO OPOOsugarbase CH2PO OOO5'OH3'3' fin de la cha ne 3'5'phosphodiester linkage 5' fin de la cha ne exemple : ADN OO OPOO POOOO LES PONUCL OTIDES ONT DE NOMBREUSES AUTRES FONCTIONS OCH2NNNNNH2OHOH1 Ils transportent de l' nergie chimique dans leurs liaisons phosphoanhydride facilement hydrolys es. OOO POCH2NNNNNH2OH2 Ils se combinent avec d'autres groupes pour former des coenzymes. OO POOCCCCNCCCNCCHSOOHHHHHHHHHHHHHHHH3exemple : coenzyme A (CoA) CH33 Ils sont utilis s comme mol cules de signalisation sp cifiques dans la cellule. OOO POCH2NNNNNH2OOHexemple : liaisons phosphoanhydride AMP cycliques (cAMP) exemple : ATP (ou ) OPO O OATPP se d roulent dans les cellules uniquement parce qu'elles sont coupl es des r actions tr s favorables qui les entra nent. La question de savoir s'il s'agit d'une dynamique de r action qui est n cessaire pour comprendre ce qu'est l' nergie libre et pourquoi elle est si importante pour les cellules. L' NERGIE LIB R E PAR LES CHANGEMENTS DE LIAISON CHIMIQUE EST CONVERTIE
Biologie moléculaire de la cellule	EN CHALEUR des collisions mol culaires qui chauffent d'abord les parois de la bo te puis le monde ext rieur (repr sent par la mer dans notre exemple). la fin, le syst me revient sa temp rature initiale, moment o toute l' nergie de liaison chimique lib r e dans la bo te a t convertie en nergie thermique et transf r e hors de la bo te vers l'environnement. Selon la premi re loi, la variation de l' nergie dans la bo te ( Ebox, que nous d signerons E) doit tre gale et oppos e la quantit d' nergie thermique transf r e, que nous d signerons par h : c'est- -dire, E = _h. Ainsi, l' nergie contenue dans la bo te (E) diminue lorsque la chaleur quitte le syst me. E peut galement changer au cours d'une r action la suite d'un travail effectu sur le monde ext rieur. Par exemple, supposons qu'il y ait une l g re augmentation du volume ( V) de la bo te au cours d'une r action. tant donn que les parois de la bo te doivent r sister la pression constante (P) de l'environnement pour se dilater, cela fonctionne sur le monde ext rieur et n cessite de l' nergie. L' nergie utilis e est P( V), ce qui, selon la premi re loi, doit diminuer l' nergie dans la bo te (E) de la m me quantit . Dans la plupart des r actions, l' nergie des liaisons chimiques est convertie la fois en travail et en chaleur. L'enthalpie (H) est une fonction composite qui comprend les deux (H = E + PV). Pour tre rigoureux, c'est la variation d'enthalpie (H) dans un syst me ferm , et non la variation d' nergie, qui est gale la chaleur transf r e au monde ext rieur lors d'une r action. Les r actions dans lesquelles H diminue lib rent de la chaleur dans l'environnement et sont dites exothermiques , tandis que les r actions dans lesquelles H augmente absorbent la chaleur de l'environnement et sont dites endothermiques . Ainsi, _h = H. Cependant, le changement de volume est n gligeable dans la plupart des r actions biologiques, donc une bonne approximation. Un syst me ferm est d fini comme une collection de mol cules qui n' change pas de mati re avec le reste de l'univers (par exemple, la cellule dans une bo te illustr e ci-dessus). Tout syst me de ce type contiendra des mol cules d' nergie totale E. Cette nergie sera distribu e de diverses mani res : certaines sous forme d' nergie de translation des mol cules, d'autres sous forme d' nergies vibratoires et de rotation, mais la plupart sous forme d' nergies de liaison entre les atomes individuels qui composent les mol cules. Supposons qu'une r action se produise dans le syst me. La premi re loi de la thermodynamique impose une contrainte sur les types de r actions possibles : elle stipule que dans tout processus, L' nergie totale de l'univers reste constante. Par exemple, supposons que la r action A B se produise quelque part dans la bo te et lib re une grande quantit d' nergie de liaison chimique. Cette nergie va d'abord augmenter l'intensit des mouvements mol culaires (translationnels, vibratoires et rotationnels) dans le syst me, ce qui quivaut augmenter sa temp rature. Cependant, ces mouvements accrus seront bient t transf r s hors du syst me par une s rie _h = H = E BO TE CELLULE UNIVERS MARIN ~ LA DEUXI ME LOI DE LA THERMODYNAMIQUE Consid rons un conteneur dans lequel 1000 pi ces sont toutes couch es t te haute. Si le r cipient est secou vigoureusement, en soumettant les pi ces aux types de mouvements al atoires que toutes les mol cules subissent en raison de leurs collisions fr quentes avec d'autres mol cules, on se retrouvera avec environ la moiti des pi ces orient es t te vers le bas. La raison de cette r orientation est qu'il n'y a qu'une seule fa on de r tablir l' tat ordonn d'origine des pi ces (chaque pi ce doit tre plac e la t te vers le haut), alors qu'il existe de nombreuses fa ons diff rentes (environ 10298) d'atteindre un tat d sordonn dans lequel il y a un m lange gal de face et de queue ; En fait, il y a plus de fa ons d'atteindre un tat 50-50 que d'atteindre n'importe quel autre tat. Chaque tat a une probabilit d'occurrence qui est proportionnelle au nombre de fa ons dont il peut tre r alis . La deuxi me loi de la thermodynamique stipule que les syst mes changeront spontan ment d' tats de faible probabilit des tats de probabilit plus lev e . Puisque les tats de faible probabilit sont plus ordonn s que les tats de forte probabilit , la deuxi me loi peut tre r it r e : l'univers change constamment de mani re devenir plus d sordonn . L'ENTROPIE, S La deuxi me loi (mais pas la premi re) permet de pr dire la direction d'une r action particuli re. Mais pour qu'elle soit utile cet effet, il faut une mesure commode de la probabilit ou, de mani re quivalente, du degr de d sordre d'un tat. L'entropie (S) est une telle mesure. Il s'agit d'une fonction logarithmique de la probabilit telle que la variation de l'entropie ( S) qui se produit lorsque la r action A B convertit une mole de A en une mole de B o
Biologie moléculaire de la cellule	pA et pB sont les probabilit s des deux tats A et B, R est la constante des gaz (8,31 J K 1 mole_1), et S est mesur en unit s d'entropie (eu). Dans notre premier exemple de 1000 pi ces, la probabilit relative de toutes les faces ( tat A) par rapport aux demi-faces et aux demi-queues ( tat B) est gale au rapport du nombre de fa ons diff rentes dont les deux r sultats peuvent tre obtenus. On peut calculer que pA = 1 et pB = 1000 ! (500 ! x 500 !) = 10299. Par cons quent, la variation d'entropie pour la r orientation des pi ces lorsque leur contenant est vigoureusement secou et qu'un m lange gal de t tes et de queues est obtenu est de R In (10298), soit environ 1370 eu par mole de tels conteneurs (6 x 1023 conteneurs). Nous voyons que, parce que S d fini ci-dessus est positif pour le passage de l' tat A l' tat B (pB /pA > 1), les r actions avec une forte augmentation de S (c'est- -dire pour laquelle S > 0) sont favoris es et se produiront spontan ment. Comme nous l'avons vu au chapitre 2, l' nergie thermique provoque l'agitation al atoire des mol cules. Parce que le transfert de chaleur d'un syst me clos son environnement augmente le nombre d'arrangements diff rents que les mol cules du monde ext rieur peuvent avoir, il augmente leur entropie. On peut montrer que la lib ration d'une quantit d termin e d' nergie thermique a un effet perturbateur plus important basse temp rature qu' haute temp rature, et que la valeur de S pour l'environnement, telle que d finie ci-dessus ( Ssea), est pr cis ment gale h, la quantit de chaleur transf r e l'environnement par le syst me, divis e par la temp rature absolue (T ) : L' NERGIE LIBRE DE GIBBS, G Lorsqu'il s'agit d'un syst me biologique ferm , on aimerait avoir un moyen simple de pr dire si une r action donn e se produira spontan ment ou non dans le syst me. Nous avons vu que la question cruciale est de savoir si la variation d'entropie de l'univers est positive ou n gative lorsque cette r action se produit. Dans notre syst me id alis , la cellule dans une bo te, il y a deux composantes distinctes du changement d'entropie de l'univers le changement d'entropie pour le syst me enferm dans la bo te et le changement d'entropie pour la mer environnante et les deux doivent tre additionn s avant qu'une pr diction puisse tre faite. Par exemple, il est possible qu'une r action absorbe de la chaleur et diminue ainsi l'entropie de la mer ( Ssea < 0) et en m me temps de provoquer un tel degr de d sordre l'int rieur de la bo te ( Sbox > 0) que le total Suniverse = Ssea + Sbox est sup rieur 0. Dans ce cas, la r action se produira spontan ment, m me si la mer c de de la chaleur la bo te pendant la r action. Un exemple d'un tel La r action est la dissolution du chlorure de sodium dans un b cher contenant de l'eau (la bo te ), qui est un processus spontan m me si la temp rature de l'eau baisse lorsque le sel passe en solution. Les chimistes ont jug utile de d finir un certain nombre de nouvelles fonctions composites qui d crivent des combinaisons de propri t s physiques d'un syst me. Les propri t s qui peuvent tre combin es comprennent la temp rature (T), la pression (P), le volume (V), l' nergie (E) et l'entropie (S). L'enthalpie (H) est l'une de ces fonctions compos es. Mais de loin la fonction composite la plus utile pour les biologistes est l' nergie libre de Gibbs, G. Il sert de dispositif de comptabilit qui permet de d duire le changement d'entropie de l'univers r sultant d'une r action chimique dans la bo te, tout en vitant toute consid ration s par e du changement d'entropie dans la mer. La d finition de G est o , pour une bo te de volume V, H est l'enthalpie d crite ci-dessus (E + PV), T est la temp rature absolue et S est l'entropie. Chacune de ces quantit s ne s'applique qu' l'int rieur de la bo te. La variation de l' nergie libre au cours d'une r action dans la bo te (le G des produits moins le G des mat riaux de d part) est not e G et, comme nous allons maintenant le d montrer, c'est une mesure directe de la quantit de d sordre qui est cr e dans l'univers lorsque la r action se produit. G = H _ TS temp rature constante, la variation de l' nergie libre ( G) au cours d'une r action est gale H _ T S. Si l'on se souvient que H = _h, la chaleur absorb e par la mer, nous avons _ G = _ H + T S _ G = h + T S, donc _ G/T = h/T + S Mais h/T est gal la variation d'entropie de la mer ( Ssea), et le S dans l' quation ci-dessus est Sbox. Par cons quent, _ G/T = Ssea + Sbox = Suniverse Nous concluons que le changement d' nergie libre est une mesure directe du changement d'entropie de l'univers. Une r action se d roulera dans la direction qui fait que la variation de l' nergie libre (G) est inf rieure z ro, car dans ce cas, il y aura une variation d'entropie positive dans l'univers lorsque la r action se produira. Pour un ensemble complexe de r actions coupl es impliquant de nombreuses mol cules di
Biologie moléculaire de la cellule	ff rentes, la variation totale de l' nergie libre peut tre calcul e simplement en additionnant les nergies libres de toutes les diff rentes esp ces mol culaires apr s la r action et en comparant cette valeur avec la somme des nergies libres avant la r action ; Pour les substances courantes, les valeurs d' nergie libre requises peuvent tre trouv es dans les tableaux publi s. De cette fa on, on peut pr dire la direction d'une r action et ainsi v rifier facilement la faisabilit de tout m canisme propos . Ainsi, par exemple, partir des valeurs observ es pour l'amplitude du gradient de protons lectrochimiques travers la membrane mitochondriale interne et le G pour l'hydrolyse de l'ATP l'int rieur de la mitochondrie, on peut tre certain que l'ATP synthase n cessite le passage de plus d'un proton pour chaque mol cule d'ATP qu'elle synth tise. La valeur de G pour une r action est une mesure directe de la distance entre la r action et l' quilibre. La grande valeur n gative de l'hydrolyse de l'ATP dans une cellule ne fait que refl ter le fait que les cellules maintiennent la r action d'hydrolyse de l'ATP jusqu' 10 ordres de grandeur de l' quilibre. Si une r action atteint l' quilibre, G = 0, la r action se d roule alors des rythmes exactement gaux dans le sens avant et arri re. Pour l'hydrolyse de l'ATP, l' quilibre est atteint lorsque la grande majorit de l'ATP a t hydrolys e, comme c'est le cas dans une cellule morte. CH2OHOOHOHOHHOglucoseCH2OH+OOHOHOHHOglucose 6-phosphate + + + hexokinase CH2OOOHOHOHHOglucose 6-phosphate fructose 6-phosphate (forme cyclique) (forme cyclique) (forme circulaire) (forme ouverte) 1 1 2 2 3 4 5 6 6 OHCCHOHCHOHCHOHCHOHCH2O3 4 5 (forme cha ne ouverte) 1 1 2 2 6 CCHOHCHOHCHOHCH2OCH2OH334455phosphoglucoseisosomeraseOH2CCH2OHOHOOHOH6+H+++phospho fructokinaseOH2CCH2OHOHOOHOHOH2COHOOHOHOHGlucose est phosphoryl e par l'ATP pour former un phosphate de sucre. La charge n gative du phosphate emp che le passage du phosphate de sucre travers la membrane plasmique, pi geant le glucose l'int rieur de la cellule. Le sucre six atomes de carbone est cliv pour produire deux mol cules trois atomes de carbone. Seul le glyc rald hyde 3-phosphate peut proc der imm diatement la glycolyse. Un r arrangement facilement r versible de la structure chimique (isom risation) d place l'oxyg ne carbonyle du carbone 1 au carbone 2, formant une c tose partir d'un sucre aldose. (Voir la partie 2-3, p. 70-71.) Le nouveau groupe hydroxyle sur le carbone 1 est phosphoryl par l'ATP, en pr paration de la formation de deux phosphates de sucre trois atomes de carbone. L'entr e des sucres dans la glycolyse est contr l e cette tape, par la r gulation de l'enzyme phosphofructokinase. fructose 6-phosphate fructose 1,6-bisphosphate + (forme cyclique) OHCCHOHaldolase (forme cha ne ouverte) CCHOHCHOHCHOHCH2OCH2OOCCHOHHCH2OCH2OOOH2CCH2OOHOOHOHfructose 1,6-bisphosphate dihydroxyac tone phosphate glyc rald hyde 3-phosphate OFour chaque tape, la partie de la mol cule qui subit un changement est ombrag e en bleu, et le nom de l'enzyme qui catalyse la r action est dans une bo te jaune. ATPATPADPADPP P P P P P CH2OStep 1 tape 2 tape 3 tape 4 104 PaNel 2 8 : D tails des 10 tapes de la glycolyse + + nolase phosphoglyc rate mutase + OO CCHOHCH2O3-phosphoglyc rate OO CCHOCH2OH2-phosphoglyc rate OO CCHOCH2OH2-phosphoglyc rate OO CCOCH2H2Ophospho nolpyruvate OO CCOCH2phospho nolpyruvate OO CCOCH3pyruvate + phosphoglyc rate kinaseOCCHOHCH2O1,3-bisphosphoglyc rate + OO CCHOHCH2O3-phosphoglyc rate Les deux mol cules du glyc rald hyde 3-phosphate sont oxyd es. La phase de g n ration d' nergie de la glycolyse commence, lorsque le NADH et une nouvelle liaison entre l'anhydride de haute nergie et le phosphate se forment (voir la figure 13-5). H++ ++ glyc rald hyde 3-phosphate d shydrog naseOHCCHOHCH2Oglyc rald hyde 3-phosphate OOCCHOHCH2O1,3-bisphosphoglyc rate H++ Le transfert l'ADP du groupe phosphate haute nergie qui a t g n r l' tape 6 forme l'ATP. La liaison restante entre l'ester phosphate et le 3-phosphoglyc rate, qui a une nergie libre d'hydrolyse relativement faible, est d plac e du carbone 3 au carbone 2 pour former du 2-phosphoglyc rate. L' limination de l'eau du 2-phosphoglyc rate cr e une liaison phosphate d' nol haute nergie. Le transfert l'ADP du groupe phosphate haute nergie qui a t g n r l' tape 9 forme l'ATP, compl tant la glycolyse. + pyruvate kinase 1 2 3 ATPADPATPADPNADHNAD+Pi P P P P OStep 6 tape 7 tape 8 tape 9 tape 10 105 En plus du pyruvate, les produits nets sont deux mol cules de glucose, deux mol cules d'ATP et deux mol cules de NADH. du pyruvate tape 2 Une isom risation COO Une fois que l'enzyme a retir un proton du groupe CH3 sur l'ac tyl-CoA, le CH2 charg n gativement forme une liaison avec un carbone carbonyle d'oxaloac tate. La perte ult rieure par hydrolyse de la coenzyme A (HS-CoA) fait fortement avancer la r action. ac tyl CoA S-
Biologie moléculaire de la cellule	citryl-CoA citrateoxaloac tate COO COO OOCCSCoAcitrate synthase CH3CH2H2OOCSCoACH2COO COO CHOCH2CH2COO COO COO CCH2CoAHSH+CoAHO+++Les d tails de ces huit tapes sont pr sent s ci-dessous. Dans cette partie du panneau, pour chaque tape, la partie de la mol cule qui subit un changement est ombr e en bleu, et le nom de l'enzyme qui catalyse la r action est dans une bo te jaune. CH2COO COO COO CHOCH2H2OH2OH2OCH2CO2CO2CO2COO COO COO HCCHHOCH2COO COO COCH2CH2COO COO CH2CHCOO COO CHHOHCCOO COO CH2COO COCH2SCoAOCH3SCoAacetyl CoA coenzyme A HSCoAHSHSCoAHSCoAHSCoACH2OCCOO COO CH2OOCCOO COO COO CH2CH3Cnext cycle + tape 1 tape 2 tape 3 tape 4 tape 6 tape 7 tape 8 tape 5 citrate (6C) isocitrate (6C) succinyl CoA (4C) succinate (4C) fumarate (4C) malate (4C) oxaloac tate (4C) oxaloac tate (4C) pyruvate -c toglutarate (5C) + H+ + H+ + H+ + H+ (2C) CYCLE DE L'ACIDE CITRIQUE cycle complet de l'acide citrique. Les deux carbones de l'ac tyl-CoA qui entrent dans ce tour du cycle (ombr s en rouge) seront convertis en CO2 dans les tours suivants du cycle : ce sont les deux carbones ombr s en bleu qui sont convertis en CO2 dans ce cycle. CGTPGDPNADHNADHNADHNAD+NAD+NAD+Pi FADFADH2 tape 1 106 PaNel 2 9 : La r action NADHNAD+ du cycle complet de l'acide citrique, dans laquelle l'eau est ajout e l'aconitase, d place le groupe hydroxyle d'un atome de carbone son voisin. Dans la premi re des quatre tapes d'oxydation du cycle, le carbone porteur du groupe hydroxyle est converti en un groupe carbonyle. Le produit imm diat est instable, perdant du CO2 tout en restant li l'enzyme. Le complexe c toglutarate d shydrog nase ressemble beaucoup au grand complexe enzymatique qui convertit le pyruvate en ac tyl CoA, le complexe pyruvate d shydrog nase de la figure 13-10. Il catalyse galement une oxydation qui produit du NADH, du CO2 et une liaison thioester haute nergie avec la coenzyme A (CoA). Une mol cule de phosphate issue d'une solution d place le CoA, formant une liaison phosphate haute nergie avec le succinate. Ce phosphate est ensuite transmis au PIB pour former le GTP. (Chez les bact ries et les plantes, l'ATP se forme la place.) Dans la troisi me tape d'oxydation du cycle, le FAD accepte deux atomes d'hydrog ne du succinate. L'ajout d'eau au fumarate place un groupe hydroxyle c t d'un carbone carbonyle. COO COO HOHHHHCCCisocitrate isocitrate d shydrog nase CO2COO COO COO HHHOCCCoxalosuccinate interm diaire COO + H+ H+ H+COO COO HHHHOCCC - c toglutarate succinate d shydrog nase COO COO HHHHCCsuccinate COO COO HHCCfumarate fumase COO COO HOHHHCCmalate COO COO HHCCfumarate H2O -c toglutarate d shydrog nase complexe CO2 + H+ COO COO HHHHOCCC -c toglutarate COO HHHHOCCCsuccinyl-CoA HSCoASCoA+ H2OCOO HHHHOCCCsuccinyl-CoA SCoACOO COO HHHHCCsuccinate HSCoA+ succinyl-CoA synth tase GTPGDPFADNADHFADH2NAD+NADHNAD+Pi tape 3 tape 4 tape 5 tape 6 tape 7 107 tape 8 Dans la derni re des quatre tapes de d shydrog naseoxydation du malate dans le cycle, le carbone portant le groupe hydroxyle est converti en un groupe carbonyle, r g n rant l'oxaloac tate + H+ n cessaire l' tape 1. ROUCOULER Berg Jm, Tymoczko Jl & stryer l (2011) Biochimie, 7e d. new York : Wh freeman. Garrett Rh & Grisham Cm (2012) Biochimie, 5e d. philadelphie : Thomson Brooks/Cole. moran la, horton hR, scrimgeour G & perry m (2011) principes de biochimie, 5e d. Upper saddle River, nJ : prentice hall. nelson Dl & Cox mm (2012) lehninger principles of Biochemistry, 6e d. new York : Worth. van holde Ke, Johnson WC & ho ps (2005) principes de biochimie physique, 2e d. Upper saddle River, nJ : prentice hall. Van Vranken D & Weiss G (2013) introduction la chimie bioorganique et la biologie chimique. New York : Garland science. Voet D, Voet JG & pratt Cm (2012) fundamentals of Biochemistry, 4e d. new York : Wiley.The Chemical Components of a Cell atkins pW (2003) molecules, 2e d. new York : Wh freeman. Baldwin Rl (2014) La coquille d'hydratation dynamique restaure l'explication de Kauzmann de 1959 sur la fa on dont le facteur hydrophobe entra ne le repliement des prot ines. Proc. Natl Acad. Sci. tats-Unis 111, 13052 13056. Bloomfield Va, Crothers Dm & Tinoco i (2000) Acides nucl iques : structures, propri t s et fonctions. sausalito, Ca : Livres de sciences universitaires. Branden C & Tooze J (1999) introduction la structure des prot ines, 2e d. New York : Garland science.de Duve C (2005) singularit s : rep res sur les chemins de la vie. Cambridge : Presses de l'Universit de Cambridge. Dowhan W (1997) Base mol culaire de la diversit des phospholipides membranaires : pourquoi y a-t-il tant de lipides ? Annu. R v. Biochem. 66, 199 232. eisenberg D & Kauzmann W (1969) La structure et les propri t s de Eau. Oxford : Oxford University Press. franks f (1993) Eau. Cambridge : Soci t royale de chimie. henderson lJ (1927) La forme de l'environnement, 1958 d. Boston, ma : Beacon. neidhardt fC, ingraham Jl & schaechter m
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Biologie moléculaire de la cellule	ntiellement des prot ines. Les prot ines constituent la majeure partie de la masse s che d'une cellule. Ils ne sont pas seulement les l ments constitutifs de la cellule ; Ils ex cutent galement la majorit des fonctions de la cellule. Ainsi, les prot ines qui sont des enzymes fournissent les surfaces mol culaires complexes l'int rieur d'une cellule qui catalysent ses nombreuses r actions chimiques. Les prot ines int gr es dans la membrane plasmique forment des canaux et des pompes qui contr lent le passage de petites mol cules dans et hors de la cellule. D'autres prot ines transportent des messages d'une cellule une autre, ou agissent comme des int grateurs de signaux qui relaient des ensembles de signaux vers l'int rieur de la membrane plasmique vers le noyau cellulaire. D'autres encore servent de minuscules machines mol culaires avec des pi ces mobiles : la kin sine, par exemple, propulse les organites travers le cytoplasme ; La topoisom rase peut d m ler les mol cules d'ADN nou es. D'autres prot ines sp cialis es agissent comme des anticorps, des toxines, des hormones, des mol cules d'antigel, des fibres lastiques, des cordes ou des sources de luminescence. Avant que nous puissions esp rer Comprendre comment fonctionnent les g nes, comment les muscles se contractent, comment les nerfs conduisent l' lectricit , comment les embryons se d veloppent ou comment notre corps fonctionne, nous devons atteindre une compr hension profonde des prot ines. D'un point de vue chimique, les prot ines sont de loin les mol cules les plus complexes sur le plan structurel et fonctionnellement sophistiqu es connues. Ce n'est peut- tre pas surprenant, une fois que nous r alisons que la structure et la chimie de chaque prot ine ont t d velopp es et affin es au cours de milliards d'ann es d'histoire volutive. Les calculs th oriques des g n ticiens des populations r v lent que, sur des p riodes d' volution, un avantage s lectif tonnamment faible est suffisant pour provoquer la propagation d'une s quence prot ique modifi e au hasard dans une population d'organismes. Pourtant, m me pour les experts, la remarquable polyvalence des prot ines peut sembler vraiment tonnante. Dans cette section, nous examinons comment l'emplacement de chaque acide amin dans la longue cha ne d'acides amin s qui forme une prot ine d termine sa forme tridimensionnelle. Plus loin dans le chapitre, nous utiliserons cette compr hension de la structure des prot ines au niveau atomique pour d crire comment la forme pr cise de chaque mol cule de prot ine d termine sa fonction dans une cellule. La forme d'une prot ine est sp cifi e par sa s quence d'acides amin s Il y a 20 acides amin s diff rents dans les prot ines qui sont cod s directement dans l'ADN d'un organisme, chacun avec des propri t s chimiques diff rentes. Une mol cule de prot ine est constitu e d'une longue cha ne non ramifi e de ces acides amin s, chacun li son voisin par une liaison peptidique covalente. Les prot ines sont donc galement appel es polypeptides. Chaque type de prot ine a une s quence unique d'acides amin s, et il y a plusieurs milliers de prot ines diff rentes dans une cellule. La s quence r p titive d'atomes le long du c ur de la cha ne polypeptidique est appel e squelette polypeptidique. Attach es cette cha ne r p titive se trouvent les parties des acides amin s qui ne sont pas impliqu es dans la formation d'une liaison peptidique et qui donnent chaque acide amin ses propri t s uniques : les 20 cha nes lat rales d'acides amin s diff rentes (Figure 3 1). Certaines de ces cha nes lat rales sont non polaires et hydrophobes Figure 3 1 Les composants d'une prot ine. Une prot ine est constitu e d'un squelette polypeptidique avec des cha nes lat rales attach es. Chaque type de prot ine diff re par sa s quence et son nombre d'acides amin s ; Par cons quent, c'est la s quence des cha nes lat rales chimiquement diff rentes qui rend chaque prot ine distincte. Les deux extr mit s d'une cha ne polypeptidique sont chimiquement diff rentes : l'extr mit portant le groupe amino libre (NH3+, galement crit NH2) est l'extr mit amino terminale, ou N-terminale, et celle portant le groupe carboxyle libre (COO , galement crit COOH) est l'extr mit carboxyle ou C-terminale. La s quence d'acides amin s d'une prot ine est toujours pr sent e dans la direction N- -C, en lisant de gauche droite. ( craignant l'eau ), d'autres sont charg s n gativement ou positivement, certains forment facilement des liaisons covalentes, et ainsi de suite. Le panneau 3-1 (pp. 112-113) montre leurs structures atomiques et la figure 3-2 r pertorie leurs abr viations. Comme nous l'avons vu au chapitre 2, les atomes se comportent presque comme s'ils taient des sph res dures avec un rayon d fini (leur rayon de van der Waals). L'exigence qu'il n'y ait pas deux atomes qui se chevauchent et d'autres contraintes limitent les angles de liaison possibles dans une cha ne polypeptidique (Figure 3-3)
Biologie moléculaire de la cellule	, limitant consid rablement les arrangements tridimensionnels possibles (ou conformations) des atomes. N anmoins, une longue cha ne flexible telle qu'une prot ine peut encore se plier d'un nombre norme de fa ons. Le repliement d'une cha ne prot ique est galement d termin par de nombreux ensembles diff rents de liaisons non covalentes faibles qui se forment entre une partie de la cha ne et une autre. Ceux-ci impliquent des atomes dans le squelette polypeptidique, ainsi que des atomes dans les cha nes lat rales d'acides amin s. Il existe trois types de ces liaisons faibles : les liaisons hydrog ne, les attractions lectrostatiques et les attractions de van der Waals, comme expliqu au chapitre 2 (voir p. 44). Les liaisons non covalentes individuelles sont 30 300 fois plus faibles que les liaisons covalentes typiques qui cr ent des Mol cules. Mais de nombreuses liaisons faibles agissant en parall le peuvent maintenir troitement deux r gions d'une cha ne polypeptidique ensemble. De cette fa on, la force combin e d'un grand nombre de ces liaisons non covalentes d termine la stabilit de chaque forme pli e (Figure 3-4). Figure 3 2 Les 20 acides amin s que l'on trouve couramment dans les prot ines. Chaque acide amin a une abr viation de trois lettres et une abr viation d'une lettre. Il existe un nombre gal de cha nes lat rales polaires et non polaires ; cependant, certaines cha nes lat rales r pertori es ici comme polaires sont suffisamment grandes pour avoir des propri t s non polaires (par exemple, Tyr, Thr, Arg, Lys). Pour les structures atomiques, voir le panneau 3-1 (pp. 112-113). Figure 3 3 Limitations st riques des angles de liaison dans une cha ne polypeptidique 180. (A) Chaque acide amin apporte trois liaisons (rouge) l' pine dorsale 180 0 +180 de la cha ne. La liaison peptidique est plane (ombrage gris) et ne permet pas la rotation. En revanche, la rotation peut se produire autour de la liaison C -C, dont l'angle de rotation est appel psi ( ), et autour de la liaison N-C , dont l'angle de rotation gauche est appel phi ( ). Par convention, un groupe R est souvent utilis pour d signer l'h lice d'une cha ne lat rale d'acides amin s (cercles violets). (B) La conformation des atomes de la cha ne principale dans une prot ine est d termin e par une paire de et angles pour chaque acide amin ; En raison des collisions st riques entre les atomes au sein de chaque acide amin , la plupart des paires possibles de et d'angles ne se produisent pas. Dans ce graphique dit de Ramachandran, chaque point repr sente une paire d'angles observ e dans une prot ine. Les trois groupes de points diff remment ombrag s refl tent trois structures secondaires diff rentes trouv es plusieurs reprises dans les prot ines, comme d crit dans le texte. (B, d'apr s J. Richardson, Adv. Prot. Chem. 34:174-175, 1981. Academic Press.) Une quatri me force faible, une force d'agr gation hydrophobe, joue galement un r le central dans la d termination de la forme d'une prot ine. Comme d crit au chapitre 2, les mol cules hydrophobes, y compris les cha nes lat rales non polaires de certains acides amin s, ont tendance tre forc es ensemble dans un environnement aqueux afin de minimiser leur effet perturbateur sur le r seau de mol cules d'eau li es l'hydrog ne (voir panneau 2-2, pp. 92-93). Par cons quent, un facteur important r gissant le repliement de toute prot ine est Figure 3 4 Trois types de liaisons non covalentes aident les prot ines se replier. Bien qu'un seul de ces liens soit assez faible, beaucoup d'entre eux agissent ensemble pour cr er un arrangement de liaison fort, comme dans l'exemple montr . Comme dans la figure pr c dente, R est utilis comme d signation g n rale pour une cha ne lat rale d'acides amin s. 112 Panel 3 1 : Les 20 acides amin s pr sents dans les prot ines L'ATOME DE CARBONE est asym trique, ce qui permet d'obtenir deux images miroir (ou st r o-) La formule g n rale d'un acide amin est celle des isom res, L et D. -atome de carbone R est g n ralement l'une des 20 cha nes lat rales diff rentes. pH 7, les groupes amino et carboxyle sont ionis s. Les prot ines sont constitu es exclusivement d'acides amin s L. Les acides amin s sont g n ralement reli s entre eux par une liaison amide, liaison peptidique : les quatre atomes de chaque bo te grise forment un rigide appel liaison peptidique. unit planaire. Il n'y a pas de rotation autour de la liaison C-N. Les prot ines aminoor carboxylor sont de longs polym res N-terminus HO CH2 HH C-terminus d'acides amin s li s par + liaisons peptidiques, et ils sont toujours crits avec le CH2H O CH N-terminus vers la gauche. La s quence de ce tripeptide C est histidine-cyst ine-valine. HN CHCes deux liaisons simples permettent la rotation, de sorte que les longues cha nes d'acides amin s sont tr s flexibles. Les acides amin s communs (Lys ou K) (Arg ou R) (His ou H) sont regroup s selon que leurs cha nes lat rales sont CH2 Ce grou
Biologie moléculaire de la cellule	pe est CH2 tr s basique CH2 parce que son NH Ces azotes ont des abr viations d'une et d'une lettre. NH3 est stabilis par C une affnit relativement faible pour une r sonance. +H2N NH2 H+ et ne sont que partiellement positifs Ainsi : alanine = Ala = A pH neutre.alanine valine acide aspartique acide glutamique (Ala, ou A) (Val, ou V) (Asp, ou D) (Glu, ou E) C O O (Leu ou L) asparagine glutamine proline ph nylalanine (Asn ou N) (Gln ou Q) (Pro ou P) (Phhe ou F) m thionine tryptophane (Met ou M) (Trp ou W) Bien que l'amide N ne soit pas charg un pH neutre, il est polaire. (Ser, ou S) (Thr, ou T) (Tyr, ou Y) (Gly, ou G) (Cys, ou C)Le groupe -OH est polar.in prot ines. La cha ne lat rale polaire sur la r gion centrale hydrophobe l'ext rieur de la mol cule contient des cha nes lat rales non polaires peut former des liaisons de cha nes lat rales d'hydrog ne l'eau la distribution de ses acides amin s polaires et non polaires. Les cha nes lat rales non polaires (hydrophobes) d'une prot ine appartenant des acides amin s tels que la ph nylalanine, la leucine, la valine et le tryptophane ont tendance se regrouper l'int rieur de la mol cule (tout comme les gouttelettes d'huile hydrophobes se regroupent dans l'eau pour former une grosse gouttelette). Cela leur permet d' viter tout contact avec l'eau qui les entoure l'int rieur d'une cellule. En revanche, les groupes polaires, tels que ceux appartenant l'arginine, la glutamine et l'histidine, ont tendance s'organiser pr s de l'ext rieur de la mol cule, o ils peuvent former des liaisons hydrog ne avec l'eau et avec d'autres mol cules polaires (Figure 3-5). Les acides amin s polaires enfouis dans la prot ine sont g n ralement li s l'hydrog ne d'autres acides amin s polaires ou au squelette polypeptidique. Les prot ines se replient dans une conformation de plus faible nergie la suite de toutes ces interactions, la plupart des prot ines ont une structure tridimensionnelle particuli re, qui est d termin e par l'ordre des acides amin s dans sa cha ne. La structure repli e finale, ou conformation, de toute cha ne polypeptidique est g n ralement celle qui minimise son nergie libre. Des biologistes ont tudi le repliement des prot ines dans un tube essai l'aide de prot ines hautement purifi es. Le traitement avec certains solvants, qui perturbent les interactions non covalentes qui maintiennent la cha ne repli e ensemble, d plie ou d nature une prot ine. Ce traitement convertit la prot ine en une cha ne polypeptidique flexible qui a perdu sa forme naturelle. Lorsque le solvant d naturant est limin , la prot ine se replie souvent spontan ment, ou se renature, dans sa conformation d'origine. Cela indique que la s quence d'acides amin s contient toutes les informations n cessaires pour sp cifier la forme tridimensionnelle d'une prot ine, un point critique pour comprendre la biologie cellulaire. La plupart des prot ines se replient en une seule conformation stable. Cependant, cette conformation change l g rement lorsque la prot ine interagit avec d'autres mol cules de la cellule. Ce changement de forme est souvent crucial pour la fonction de la prot ine, comme nous le verrons plus loin. Bien qu'une cha ne prot ique puisse se replier dans sa conformation correcte sans aide ext rieure, dans une cellule vivante Les prot ines appel es chaperons mol culaires aident souvent au repliement des prot ines. Les chaperons mol culaires se lient des cha nes polypeptidiques partiellement repli es et les aident progresser le long de la voie de repliement la plus favorable nerg tiquement. Dans les conditions d'encombrement du cytoplasme, des chaperons sont n cessaires pour emp cher les r gions hydrophobes temporairement expos es dans les cha nes prot iques nouvellement synth tis es de s'associer les unes aux autres pour former des agr gats de prot ines (voir p. 355). Cependant, la forme tridimensionnelle finale de la prot ine est toujours sp cifi e par sa s quence d'acides amin s : les chaperons rendent simplement l'atteinte de l' tat pli plus fiable. Figure 3 5 Comment une prot ine se replie en une conformation compacte. Les cha nes lat rales d'acides amin s polaires ont tendance se trouver l'ext rieur de la prot ine, o elles peuvent interagir avec l'eau ; Les cha nes lat rales d'acides amin s non polaires sont enterr es l'int rieur, formant un noyau hydrophobe d'atomes serr s qui sont cach s de l'eau. Dans ce sch ma sch matique, la prot ine ne contient qu'environ 35 acides amin s. Figure 3 6 Quatre repr sentations d crivant la structure d'un petit domaine prot ique. Construit partir d'une cha ne de 100 acides amin s, le domaine SH2 fait partie de nombreuses prot ines diff rentes (voir, par exemple, la figure 3-61). Ici, la structure du domaine SH2 est repr sent e sous la forme (A) d'un mod le de squelette polypeptidique, (B) d'un mod le de ruban, (C) d'un mod le de fil qui inclut les cha nes lat rales d'acides amin s, et (D) d'u
Biologie moléculaire de la cellule	n mod le de remplissage d'espace (Vid o 3.1). Ces images sont color es de mani re permettre de suivre la cha ne polypeptidique de son extr mit N-terminale (violette) son extr mit C-terminale (rouge) (code PDB : 1SHA). Les prot ines se pr sentent sous une grande vari t de formes, et la plupart ont une longueur comprise entre 50 et 2000 acides amin s. Les grandes prot ines sont g n ralement constitu es de plusieurs domaines prot iques distincts, c'est- -dire d'unit s structurelles qui se replient plus ou moins ind pendamment les unes des autres, comme nous le verrons ci-dessous. La structure d'un domaine, m me petit, est complexe, et pour plus de clart , plusieurs repr sentations diff rentes sont conventionnellement utilis es, chacune mettant l'accent sur des caract ristiques distinctes. titre d'exemple, la figure 3-6 pr sente quatre repr sentations d'un domaine prot ique appel SH2, une structure pr sente dans de nombreuses prot ines diff rentes dans les cellules eucaryotes et impliqu e dans la signalisation cellulaire (voir la figure 15-46). Les descriptions des structures prot iques sont facilit es par le fait que les prot ines sont construites partir de combinaisons de plusieurs motifs structurels communs, comme nous le verrons ci-dessous. L'h lice et la feuille de sont des motifs de pliage courants Lorsque nous comparons les structures tridimensionnelles de nombreuses mol cules de prot ines diff rentes, il devient clair que, bien que la conformation globale de chaque prot ine soit unique, deux mod les de repliement r guliers se trouvent souvent en leur sein. Les deux motifs ont t d couverts il y a plus de 60 ans partir d' tudes sur les cheveux et la soie. Le premier motif de pliage avoir t d couvert, appel h lice , a t trouv dans la prot ine -k ratine, qui est abondante dans la peau et ses d riv s, tels que les cheveux, les ongles et les cornes. Dans l'ann e qui a suivi la d couverte de l'h lice , une deuxi me structure pliss e, appel e feuille de , a t trouv e dans la prot ine fibro ne, le principal constituant de la soie. Ces deux motifs sont particuli rement courants car ils r sultent d'une liaison hydrog ne entre les groupes N-H et C=O dans le squelette polypeptidique, sans impliquer les cha nes lat rales des acides amin s. Ainsi, bien qu'incompatibles avec certaines cha nes lat rales d'acides amin s, de nombreuses s quences d'acides amin s diff rentes peuvent les former. Dans chaque cas, la cha ne prot ique adopte une conformation r guli re et r p titive. La figure 3-7 illustre les structures d taill es de ces deux conformations importantes, qui, dans les mod les de rubans de prot ines, sont repr sent es par un ruban h lico dal et par un ensemble de fl ches align es, respectivement. 0,54 nm R R H Liaison hydrog ne acide amin cha ne lat rale azote carbone peptide liaison oxyg ne (C) (D) 0,7 nm Figure 3 7 La conformation r guli re du squelette polypeptidique dans l'h lice et la feuille . L'h lice est repr sent e en (A) et (B). Le N H de chaque liaison peptidique est li l'hydrog ne au C=O d'un Liaison peptidique voisine situ e quatre liaisons peptidiques dans la m me cha ne. Notez que tous les groupes N H pointent vers le haut dans ce sch ma et que tous les groupes C=O pointent vers le bas (vers l'extr mit C-terminale) ; cela donne une polarit l'h lice, l'extr mit C-terminale ayant une charge n gative partielle et l'extr mit N-terminale une charge positive partielle (Vid o 3.2). La feuille est illustr e en (C) et (D). Dans cet exemple, les cha nes peptidiques adjacentes s'ex cutent dans des directions oppos es (antiparall les). La liaison hydrog ne entre les liaisons peptidiques de diff rents brins maintient les cha nes polypeptidiques individuelles (brins) ensemble dans une feuille , et les cha nes lat rales d'acides amin s de chaque brin se projettent alternativement au-dessus et au-dessous du plan de la feuille (Vid o 3.3). (A) et (C) montrent tous les atomes du squelette polypeptidique, mais les cha nes lat rales des acides amin s sont tronqu es et d sign es par R. En revanche, (B) et (D) ne montrent que les atomes de squelette de carbone et d'azote. Les noyaux de nombreuses prot ines contiennent de vastes r gions de feuille. Comme le montre la figure 3-8, ces feuillets peuvent se former soit partir de segments voisins du squelette polypeptidique qui se d roulent dans la m me orientation (cha nes parall les), soit partir d'un squelette polypeptidique qui se replie d'avant en arri re sur lui-m me, chaque section de la cha ne se d pla ant dans la direction oppos e celle de ses voisins imm diats (cha nes antiparall les). Les deux types de feuilles de produisent une structure tr s rigide, maintenue ensemble par des liaisons hydrog ne qui relient les liaisons peptidiques dans les cha nes voisines (voir Figure 3-7C). Une h lice est g n r e lorsqu'une seule cha ne polypeptidique se tord sur elle-m me pour former un cylindre rigid
Biologie moléculaire de la cellule	e. Une liaison hydrog ne se forme entre une liaison peptidique sur quatre, reliant le C=O d'une liaison peptidique la liaison N-H d'une autre (voir Figure 3-7A). Cela donne lieu une h lice r guli re avec un tour complet tous les 3,6 acides amin s. Le domaine prot ique SH2 illustr la figure 3-6 contient deux h lices , ainsi qu'une feuille de antiparall le trois brins. Les r gions de h lice sont abondantes dans les prot ines situ es dans les membranes cellulaires, telles que les prot ines de transport et les r cepteurs. Comme nous l'expliquons au chapitre 10, les parties d'une prot ine transmembranaire qui traversent la bicouche lipidique se croisent g n ralement sous forme h lices compos es en grande partie d'acides amin s avec des cha nes lat rales non polaires. Le squelette polypeptidique, qui est hydrophile, est li l'hydrog ne sur lui-m me dans l'h lice et prot g de l'environnement lipidique hydrophobe de la membrane par ses cha nes lat rales non polaires saillantes (voir aussi Figure 3-75A). Dans d'autres prot ines, h lices s'enroulent les unes autour des autres pour former une structure particuli rement stable, connue sous le nom de bobine enroul e. Cette structure peut se former lorsque les deux (ou dans certains cas, trois ou quatre) h lices ont la plupart de leurs cha nes lat rales non polaires (hydrophobes) d'un c t , de sorte qu'elles peuvent se tordre l'une autour de l'autre avec ces cha nes lat rales tourn es vers l'int rieur (Figure 3 9). De longues bobines enroul es en forme de b tonnets fournissent le cadre structurel de nombreuses prot ines allong es. Des exemples sont la -k ratine, qui forme les fibres intracellulaires qui renforcent la couche externe de la peau et ses appendices, et les mol cules de myosine responsables de la contraction musculaire. M me une petite mol cule de prot ine est construite partir de milliers d'atomes li s entre eux par des liaisons covalentes et non covalentes orient es avec pr cision. Les biologistes sont aid s visualiser ces structures extr mement compliqu es par divers affichages tridimensionnels graphiques et informatiques. Le site de ressources pour les tudiants qui accompagne ce livre contient des images g n r es par ordinateur de prot ines s lectionn es, affich es et tourn es l' cran dans une vari t de formats. Les scientifiques distinguent quatre niveaux d'organisation dans la structure d'une prot ine. La s quence d'acides amin s est connue sous le nom de structure primaire. Des tron ons de cha ne polypeptidique qui forment h lices et feuillets constituent la structure secondaire de la prot ine. L'organisation tridimensionnelle compl te d'une cha ne polypeptidique est parfois appel e structure tertiaire, et si une mol cule prot ique particuli re est form e comme un complexe de plus d'une cha ne polypeptidique, la structure compl te est d sign e comme la structure quaternaire. L' tude de la conformation, de la fonction et de l' volution des prot ines a galement r v l l'importance centrale d'une unit d'organisation distincte de ces quatre. Il s'agit du domaine prot ique, une sous-structure produite par n'importe quelle partie contigu d'une cha ne polypeptidique qui peut se replier ind pendamment du reste de la prot ine en un Structure compacte et stable. Un domaine contient g n ralement entre 40 et 350 acides amin s, et c'est l'unit modulaire partir de laquelle de nombreuses prot ines plus grandes sont construites. Les diff rents domaines d'une prot ine sont souvent associ s diff rentes fonctions. La figure 3-10 montre un exemple : la prot ine kinase Src, qui fonctionne dans les voies de signalisation l'int rieur des cellules de vert br s (Src se prononce sarc ). Cette bande prot ique d'h lices hydrophobes s'enroule les unes autour des autres pour minimiser l'exposition des cha nes lat rales d'acides amin s hydrophobes l'environnement aqueux 0,5 nm Figure 3 8 Deux types de structures de feuilles . (A) Une feuille de antiparall le (voir Figure 3 7C). (B) Une feuille de parall le. Ces deux structures sont courantes dans les prot ines. Figure 3 9 : une bobine enroul e. (A) Une seule h lice , avec des cha nes lat rales successives d'acides amin s tiquet es en une s quence septuple, abcdefg (de bas en haut). Les acides amin s a et d dans une telle s quence se trouvent proximit les uns des autres sur la surface du cylindre, formant une bande (verte) qui s'enroule lentement autour de l'h lice . Les prot ines qui forment des bobines enroul es ont g n ralement des acides amin s non polaires aux positions a et d . Par cons quent, comme le montre (B), les deux h lices peuvent s'enrouler l'une autour de l'autre, les cha nes lat rales non polaires de l'une h lice interagissant avec les cha nes lat rales non polaires de l'autre. (C) La structure atomique d'une bobine enroul e d termin e par cristallographie aux rayons X. Le squelette h lico dal alpha est repr sent en ro
Biologie moléculaire de la cellule	uge et les cha nes lat rales non polaires en vert, tandis que les cha nes lat rales d'acides amin s plus hydrophiles, illustr es en gris, sont laiss es expos es l'environnement aqueux (vid o 3.4). (Code PDB : 3NMD.) est consid r comme ayant trois domaines : les domaines SH2 et SH3 ont des r les r gulateurs, tandis que le domaine C-terminal est responsable de l'activit catalytique de la kinase. Plus loin dans le chapitre, nous reviendrons sur cette prot ine, afin d'expliquer comment les prot ines peuvent former des commutateurs mol culaires qui transmettent des informations travers les cellules. La figure 3-11 pr sente des mod les en ruban de trois domaines prot iques organis s diff remment. Comme l'illustrent ces exemples, le noyau central d'un domaine peut tre construit partir de h lices, de feuilles ou de diverses combinaisons de ces deux l ments de pliage fondamentaux. Les plus petites mol cules de prot ines ne contiennent qu'un seul domaine, tandis que les prot ines plus grandes peuvent contenir plusieurs dizaines de domaines, souvent reli s les uns aux autres par de courtes longueurs relativement peu structur es de cha ne polypeptidique qui peuvent agir comme des charni res flexibles entre les domaines. Quelques-unes des nombreuses cha nes polypeptidiques possibles seront utiles aux cellules tant donn que chacun des 20 acides amin s est chimiquement distinct et que chacun peut, en principe, se trouver n'importe quelle position d'une cha ne prot ique, il y a 20 20 20 20 = 160 000 cha nes polypeptidiques possibles diff rentes de quatre acides amin s, ou 20n cha nes polypeptidiques diff rentes possibles de quatre acides amin s. Pour une longueur de prot ine typique d'environ 300 acides amin s, une cellule pourrait th oriquement fabriquer plus de 10390 (20300) cha nes polypeptidiques diff rentes. C'est un nombre si norme que pour produire une seule mol cule de chaque type, il faudrait beaucoup plus d'atomes qu'il n'en existe dans l'univers. Seule une tr s petite fraction de ce vaste ensemble de cha nes polypeptidiques imaginables adopterait une conformation tridimensionnelle stable selon certaines estimations, moins Figure 3 10 : une prot ine form e partir de plusieurs domaines. Dans la prot ine Src repr sent e, un domaine C-terminal deux lobes (jaune et orange) forme une enzyme prot ine kinase, tandis que les domaines SH2 et SH3 remplissent des fonctions r gulatrices. (A) Un mod le en ruban, avec substrat ATP en rouge. (B) Un mod le de remplissage d'espace, avec substrat ATP en rouge. Notez que le site qui se lie l'ATP est positionn l'interface des deux lobes qui forment la kinase. La structure du domaine SH2 a t illustr e la figure 3-6. (Code PDB : 2SRC.) Figure 3 11 Mod les en ruban de trois domaines prot iques diff rents. (A) Cytochrome b562, une prot ine domaine unique impliqu e dans le transport des lectrons dans les mitochondries. Cette prot ine est compos e presque enti rement de h lices. (B) Le domaine de liaison au NAD de l'enzyme lactique d shydrog nase, qui est compos d'un m lange d'h lices et de feuillets parall les. (C) Le domaine variable d'une cha ne l g re d'immunoglobuline (anticorps), compos e d'un sandwich de deux feuillets de antiparall les. Dans ces exemples, les h lices sont indiqu es en vert, tandis que les brins organis s en feuilles sont signal s par des fl ches rouges. Notez comment la cha ne polypeptidique se d place g n ralement d'avant en arri re sur l'ensemble du domaine, ne faisant des virages brusques qu' la surface de la prot ine (vid o 3.5). Ce sont les r gions de boucle saillantes (jaune) qui forment souvent les sites de liaison pour d'autres mol cules. (Adapt de dessins avec l'aimable autorisation de Jane Richardson.) qu'un sur un milliard. Et pourtant, la majorit des prot ines pr sentes dans les cellules adoptent des conformations uniques et stables. Comment est-ce possible ? La r ponse se trouve dans la s lection naturelle. Il est peu probable qu'une prot ine dont la structure et l'activit biochimique sont impr visibles et variables contribue la survie d'une cellule qui la contient. De telles prot ines auraient donc t limin es par la s lection naturelle par le processus d'essais et d'erreurs extr mement long qui sous-tend l' volution biologique. Parce que l' volution a s lectionn la fonction des prot ines dans les organismes vivants, la s quence d'acides amin s de la plupart des prot ines actuelles est telle qu'une seule conformation est stable. De plus, cette conformation a ses propri t s chimiques finement ajust es pour permettre la prot ine d'effectuer une fonction catalytique ou structurelle particuli re dans la cellule. Les prot ines sont construites avec une telle pr cision que le changement de quelques atomes dans un acide amin peut parfois perturber la structure de la mol cule enti re si gravement que toute fonction est perdue. Et, comme nous le verrons plus loin dans ce chapitre, lo
Biologie moléculaire de la cellule	rsque certains accidents rares de mauvais repliement de prot ines se produisent, les r sultats peuvent tre d sastreux pour les organismes qui les contiennent. Une fois qu'une prot ine avait volu et s' tait repli e en une conformation stable avec des propri t s utiles, sa structure pouvait tre modifi e au cours de l' volution pour lui permettre de remplir de nouvelles fonctions. Ce processus a t consid rablement acc l r par des m canismes g n tiques qui dupliquent parfois des g nes, permettant une copie de g ne d' voluer ind pendamment pour remplir une nouvelle fonction (discut e au chapitre 4). Ce type d' v nement s'est produit tr s souvent dans le pass ; En cons quence, de nombreuses prot ines actuelles peuvent tre regroup es en familles de prot ines, chaque membre de la famille ayant une s quence d'acides amin s et une conformation tridimensionnelle qui ressemblent celles des autres membres de la famille. Consid rez, par exemple, les prot ases s rine, une grande famille d'enzymes de clivage des prot ines (prot olytiques) qui comprend les enzymes digestives chymotrypsine, trypsine et lastase, et plusieurs prot ases impliqu es dans la coagulation du sang. Lorsque les parties prot ases de deux de ces enzymes sont compar es, on constate que certaines parties de leurs s quences d'acides amin s correspondent. La similitude de leurs conformations tridimensionnelles est encore plus frappante : la plupart des torsions d taill es de leurs cha nes polypeptidiques, qui comptent plusieurs centaines d'acides amin s, sont pratiquement identiques (Figure 3-12). Les nombreuses prot ases s rine diff rentes ont n anmoins des activit s enzymatiques distinctes, chacune clivant diff rentes prot ines ou les liaisons peptidiques entre diff rents types d'acides amin s. Chacun remplit donc une fonction distincte dans un organisme. L'histoire que nous avons racont e pour les prot ases s rine pourrait se r p ter pour des centaines d'autres familles de prot ines. En g n ral, la structure des diff rents membres d'un Figure 3 12 : comparaison des conformations de deux prot ases s rine. Les conformations de l' pine dorsale de l' lastase et de la chymotrypsine. Bien que seuls les acides amin s de la cha ne polypeptidique ombr e en vert soient identiques dans les deux prot ines, les deux conformations sont tr s similaires presque partout. Le site actif de chaque enzyme est entour en rouge ; C'est l que les liaisons peptidiques des prot ines qui servent de substrats sont li es et cliv es par hydrolyse. Les prot ases s rine tirent leur nom de l'acide amin s rine, dont la cha ne lat rale fait partie du site actif de chaque enzyme et participe directement la r action de clivage. Les deux points sur le c t droit de la mol cule de chymotrypsine marquent les nouvelles extr mit s cr es lorsque cette enzyme coupe sa propre colonne vert brale. Figure 3 13 Comparaison d'une classe de domaines de liaison l'ADN, appel s hom omains, dans une paire de prot ines de deux organismes s par s par plus d'un milliard d'ann es d' volution. (A) Un mod le de ruban du structure commune aux deux prot ines. (B) Une trace des positions du -carbone. Les structures tridimensionnelles montr es ont t d termin es par cristallographie aux rayons X pour la prot ine 2 de la levure (vert) et la prot ine engraill e de la drosophile (rouge). (C) Une comparaison des s quences d'acides amin s pour la r gion des prot ines illustr es en (A) et (B). Des points noirs marquent les sites avec des acides amin s identiques. Les points orange indiquent la position d'un insert trois acides amin s dans la prot ine 2. (Adapt de C. Wolberger et al., Cell 67:517-528, 1991. Avec l'autorisation d'Elsevier.) La famille des prot ines a t plus conserv e que la s quence d'acides amin s. Dans de nombreux cas, les s quences d'acides amin s ont diverg un point tel que nous ne pouvons pas tre certains d'une relation familiale entre deux prot ines sans d terminer leurs structures tridimensionnelles. La prot ine 2 de la levure et la prot ine engraill e de la drosophile, par exemple, sont toutes deux des prot ines r gulatrices de g nes de la famille des hom odomaines (discut es au chapitre 7). Parce qu'ils ne sont identiques que dans 17 de leurs 60 r sidus d'acides amin s, leur relation n'est devenue certaine qu'en comparant leurs structures tridimensionnelles (Figure 3-13). De nombreux exemples similaires montrent que deux prot ines ayant plus de 25 % d'identit dans leurs s quences d'acides amin s partagent g n ralement la m me structure globale. Les diff rents membres d'une grande famille de prot ines ont souvent des fonctions distinctes. Certains des changements d'acides amin s qui rendent les membres d'une famille diff rents ont sans aucun doute t s lectionn s au cours de l' volution parce qu'ils ont entra n des changements utiles dans l'activit biologique, donnant aux membres de la famille les diff rentes propri t s fonctionnelles qu'ils ont
Biologie moléculaire de la cellule	aujourd'hui. Mais de nombreux autres changements d'acides amin s sont effectivement neutres , n'ayant ni effet b n fique ni effet dommageable sur la structure de base et la fonction de la prot ine. De plus, puisque la mutation est un processus al atoire, il doit galement y avoir eu de nombreux changements d l t res qui ont suffisamment alt r la structure tridimensionnelle de ces prot ines pour leur nuire. De telles prot ines d fectueuses auraient t perdues chaque fois que les organismes individuels qui les fabriquaient taient suffisamment d savantag s pour tre limin s par la s lection naturelle. Les familles de prot ines sont facilement reconnues lorsque le g nome de n'importe quel organisme est s quenc ; par exemple, la d termination de la s quence d'ADN de l'ensemble du g nome humain a r v l que nous contenons environ 21 000 g nes codant pour des prot ines. (Notez toutefois qu' la suite de l' pissage alternatif de l'ARN, les cellules humaines peuvent produire beaucoup plus de 21 000 prot ines diff rentes, comme nous l'expliquerons au chapitre 6.) Gr ce des comparaisons de s quences, nous pouvons attribuer les produits d'au moins 40 % de nos g nes codant pour des prot ines des structures prot iques connues, appartenant plus de 500 familles de prot ines diff rentes. La plupart des prot ines de chaque famille ont volu pour remplir des fonctions quelque peu diff rentes, comme pour les enzymes lastase et chymotrypsine illustr es pr c demment dans la figure 3-12. Comme expliqu au chapitre 1 (voir figure 1-21), ceux-ci sont parfois appel s paralogues pour les distinguer des nombreuses prot ines correspondantes dans diff rents organismes (orthologues, tels que l' lastase de souris et humaine). Comme d crit au chapitre 8, gr ce aux puissantes techniques de cristallographie aux rayons X et de r sonance magn tique nucl aire (RMN), nous connaissons maintenant les formes tridimensionnelles, ou conformations, de plus de 100 000 prot ines. En comparant soigneusement les conformations de ces prot ines, les biologistes structuraux (c'est- -dire les experts de la structure des mol cules biologiques) ont conclu qu'il existe un nombre limit de fa ons dont les domaines prot iques se replient dans la nature peut- tre aussi peu que 2000, si l'on consid re tous les organismes. Pour la plupart de ces soi-disant repliements prot iques, des structures repr sentatives ont t d termin es. La base de donn es actuelle de s quences prot iques connues contient plus de vingt millions d'entr es, et elle se d veloppe tr s rapidement mesure que de plus en plus de g nomes sont s quenc s, r v lant un grand nombre de nouveaux g nes qui codent pour des prot ines. La taille des polypeptides cod s varie consid rablement, allant de 6 acides amin s une gigantesque prot ine de 33 000 acides amin s. Les comparaisons de prot ines sont importantes car les structures apparent es impliquent souvent des fonctions li es. De nombreuses ann es d'exp rimentation peuvent tre sauv es en d couvrant qu'une nouvelle prot ine a une similitude de s quence d'acides amin s avec une prot ine de fonction connue. De telles relations de s quence, par exemple, ont d'abord indiqu que certains g nes qui font que les cellules de mammif res deviennent canc reuses codent pour des prot ines kinases (discut es au chapitre 20). Comme indiqu pr c demment, la plupart des prot ines sont compos es d'une s rie de domaines prot iques, dans lesquels diff rents Les r gions de la cha ne polypeptidique se plient ind pendamment pour former des structures compactes. On pense que ces prot ines multidomaines proviennent de l'assemblage accidentel des s quences d'ADN qui codent pour chaque domaine, cr ant ainsi un nouveau g ne. Dans un processus volutif appel m lange de domaines, de nombreuses grandes prot ines ont volu en assemblant des domaines pr existants dans de nouvelles combinaisons (Figure 3 14). De nouvelles surfaces de liaison ont souvent t cr es la juxtaposition de domaines, et de nombreux sites fonctionnels o les prot ines se lient de petites mol cules se trouvent cet endroit. Un sous-ensemble de domaines prot iques a t particuli rement mobile au cours de l' volution ; Ceux-ci semblent avoir des structures particuli rement polyvalentes et sont parfois appel s modules prot iques. La structure de l'un d'entre eux, le domaine SH2, a t illustr e la figure 3-6. Trois autres domaines prot iques abondants sont illustr s dans la figure 3-15. Chacun des domaines repr sent s a une structure centrale stable form e de brins de feuilles de , d'o d passent des boucles moins ordonn es de cha ne polypeptidique. Les boucles sont id alement situ es pour former des sites de liaison pour d'autres mol cules, comme le d montre le pli de l'immunoglobuline, qui constitue la base des mol cules d'anticorps. De tels domaines bas s sur des feuilles ont peut- tre atteint leur succ s volutif parce qu'ils fournissent un cadre pratique pour la g n rati
Biologie moléculaire de la cellule	on de nouveaux sites de liaison pour les ligands, ne n cessitant que de petits changements leurs boucles saillantes (voir Figure 3 42). Figure 3 14 Brassage de domaine. Un remaniement important de blocs de s quences prot iques (domaines prot iques) s'est produit au cours de l' volution des prot ines. Les parties d'une prot ine d sign es par la m me forme et la m me couleur dans ce diagramme sont li es au cours de l' volution. Les prot ases s rine comme la chymotrypsine sont form es partir de deux domaines (brun). Dans les trois autres prot ases pr sent es, qui sont tr s r gul es et plus sp cialis es, ces deux domaines prot ases sont connect s un ou plusieurs domaines similaires des domaines trouv s dans le facteur de croissance pidermique (EGF ; en vert), une prot ine de liaison au calcium (en jaune), ou un domaine kringle (en bleu). La chymotrypsine est illustr e aux figures 3 12. Figure 3 15 Les structures tridimensionnelles de trois domaines prot iques couramment utilis s. Dans ces diagrammes en ruban, les brins de feuille sont repr sent s par des fl ches et les extr mit s C Nand sont indiqu es par des sph res rouges. Il existe de nombreux autres modules de ce type dans la nature. (Adapt de M. Baron, D.G. Norman et I.D. Campbell, Trends Biochem. Sci. 16:13 17, 1991, avec la permission d'Elsevier, et D.J. Leahy et al., Science 258:987 991, 1992, avec la permission de l'AAAS.) Figure 3 16 : une structure tendue form e partir d'une s rie de domaines prot iques. Quatre domaines de la fibronectine de type 3 (voir Figure 3-15) de la mol cule de matrice extracellulaire fibronectine sont illustr s dans (A) des mod les de ruban et (B) de remplissage d'espace. (Adapt de D.J. Leahy, I. Aukhil et H.P. Erickson, Cell 84:155-164, 1996. Avec l'autorisation d'Elsevier.) Une deuxi me caract ristique de ces domaines prot iques qui explique leur utilit est la facilit avec laquelle ils peuvent tre int gr s dans d'autres prot ines. Deux des trois domaines illustr s la figure 3-15 ont leurs extr mit s Nand C- terminales aux p les oppos s du domaine. Lorsque l'ADN codant pour un tel domaine subit une duplication en tandem, ce qui n'est pas inhabituel dans l' volution des g nomes (discut au chapitre 4), les domaines dupliqu s avec cet arrangement en ligne peuvent tre facilement li s en s rie pour former des structures tendues, soit avec eux-m mes, soit avec d'autres domaines en ligne (Figure 3-16). Les structures tendues rigides compos es d'une s rie de domaines sont particuli rement fr quentes dans les mol cules de la matrice extracellulaire et dans les parties extracellulaires des prot ines r ceptrices de surface cellulaire. D'autres domaines fr quemment utilis s, y compris le domaine kringle illustr la figure 3-15 et le domaine SH2, sont de type plug-in , avec leurs extr mit s C Nand proches les unes des autres. Apr s des r arrangements g nomiques, ces domaines sont g n ralement log s sous la forme d'une insertion dans une r gion de boucle d'une deuxi me prot ine. Une comparaison de la fr quence relative d'utilisation du domaine chez diff rents eucaryotes r v le que, pour de nombreux Dans des domaines communs, tels que les prot ines kinases, cette fr quence est similaire chez des organismes aussi divers que les levures, les plantes, les vers, les mouches et les humains. Mais il existe quelques exceptions notables, telles que le domaine de reconnaissance de l'antig ne du Complexe majeur d'histocompatibilit (CMH) (voir Figure 24-36) qui est pr sent en 57 copies chez l'homme, mais absent dans les quatre autres organismes que nous venons de mentionner. De tels domaines ont des fonctions sp cialis es qui ne sont pas partag es avec les autres eucaryotes ; On suppose qu'ils ont t fortement s lectionn s au cours de l' volution r cente pour produire les multiples copies observ es. De m me, le domaine SH2 montre une augmentation inhabituelle de son nombre chez les eucaryotes sup rieurs ; On pourrait supposer que ces domaines sont particuli rement utiles pour la multicellularit . Certaines paires de domaines se trouvent ensemble dans de nombreuses prot ines Nous pouvons construire un grand tableau affichant l'utilisation du domaine pour chaque organisme dont la s quence g nomique est connue. Par exemple, le g nome humain contient les s quences d'ADN d'environ 1000 domaines d'immunoglobulines, 500 domaines de prot ines kinases, 250 hom odomaines de liaison l'ADN, 300 domaines SH3 et 120 domaines SH2. De plus, nous constatons que plus des deux tiers de toutes les prot ines sont constitu es de deux domaines ou plus, et que les m mes paires de domaines apparaissent de mani re r p t e dans le m me arrangement relatif dans une prot ine. Bien que la moiti de toutes les familles de domaines soient communes aux arch es, aux bact ries et aux eucaryotes, seulement environ 5 % des combinaisons de deux domaines sont partag es de la m me mani re. Ce mod le sugg re que la plupart des p
Biologie moléculaire de la cellule	rot ines contenant des combinaisons deux domaines particuli rement utiles sont apparues par brassage de domaines relativement tard dans l' volution. Le g nome humain code pour un ensemble complexe de prot ines, r v lant que beaucoup de choses restent inconnues Le r sultat du s quen age du g nome humain a t surprenant, car il r v le que nos chromosomes ne contiennent qu'environ 21 000 g nes codant pour des prot ines. Sur la base de ce seul nombre, il semblerait que nous ne soyons pas plus complexes que la minuscule herbe moutarde, Arabidopsis, et seulement environ 1,3 fois plus complexes qu'un ver n matode. Les s quences g nomiques r v lent galement que les vert br s ont h rit de presque tous leurs domaines prot iques des invert br s, avec seulement 7% des domaines humains identifi s tant sp cifiques aux vert br s. Chacune de nos prot ines est cependant en moyenne plus compliqu e (Figure 3 17). Le remaniement des domaines au cours de l' volution des vert br s a donn naissance de nombreux nouveaux Figure 3 17 Structure du domaine d'un groupe de prot ines apparent es au cours de l' volution dont on pense qu'elles ont une fonction similaire. En g n ral, les prot ines des organismes plus complexes, tels que les humains, ont tendance contenir des domaines suppl mentaires, comme c'est le cas pour la prot ine de liaison l'ADN compar e ici. combinaisons de domaines prot iques, de sorte qu'il y a pr s de deux fois plus de combinaisons de domaines trouv es dans les prot ines humaines que dans un ver ou une mouche. Ainsi, par exemple, le domaine de la s rine prot ase semblable celui de la trypsine est li au moins 18 autres types de domaines prot iques dans les prot ines humaines, alors qu'il se trouve joint de mani re covalente seulement 5 domaines diff rents chez le ver. Cette vari t suppl mentaire de nos prot ines augmente consid rablement la gamme d'interactions prot ine-prot ine possibles (voir Figure 3-79), mais on ne sait pas comment elle contribue faire de nous des humains. La complexit des organismes vivants est stup fiante, et il est assez d cevant de noter que nous manquons actuellement de la moindre indication de ce que pourrait tre la fonction de plus de 10 000 des prot ines qui ont t identifi es jusqu' pr sent en examinant le g nome humain. Il y a certainement d' normes d fis relever pour la prochaine g n ration de biologistes cellulaires, et les myst res fascinants ne manquent pas r soudre. Les m mes liaisons non covalentes faibles qui permettent une cha ne prot ique de se replier dans une conformation sp cifique permettent galement aux prot ines de se lier les unes aux autres pour produire des structures plus grandes dans la cellule. Toute r gion de la surface d'une prot ine qui peut interagir avec une autre mol cule par le biais d'ensembles de liaisons non covalentes est appel e un site de liaison. Une prot ine peut contenir des sites de liaison pour diverses mol cules, grandes et petites. Si un site de liaison reconna t le la surface d'une deuxi me prot ine, la liaison serr e de deux cha nes polypeptidiques repli es ce site cr e une mol cule prot ique plus grande avec une g om trie d finie avec pr cision. Chaque cha ne polypeptidique d'une telle prot ine est appel e sous-unit prot ique. Dans le cas le plus simple, deux cha nes polypeptidiques repli es identiques se lient l'une l'autre dans un arrangement t te t te , formant un complexe sym trique de deux sous-unit s prot iques (un dim re) maintenues ensemble par des interactions entre deux sites de liaison identiques. La prot ine r pressive Cro, une prot ine r gulatrice des g nes viraux qui se lie l'ADN pour d sactiver des g nes viraux sp cifiques dans une cellule bact rienne infect e, en est un exemple (Figure 3 18). Les cellules contiennent de nombreux autres types de complexes prot iques sym triques, form s partir de plusieurs copies d'une seule cha ne polypeptidique (par exemple, voir la figure 3-20 ci-dessous). De nombreuses prot ines dans les cellules contiennent deux ou plusieurs types de cha nes polypeptidiques. L'h moglobine, la prot ine qui transporte l'oxyg ne dans les globules rouges, contient deux sous-unit s identiques de -globine et deux sous-unit s identiques de -globine, dispos es sym triquement (Figure 3 19). De telles prot ines multisous-unitaires sont tr s courantes dans les cellules, et elles peuvent tre tr s grandes (Vid o 3.6). La plupart des prot ines dont nous avons discut jusqu' pr sent sont des prot ines globulaires, dans lesquelles la cha ne polypeptidique se replie en une forme compacte comme une boule la surface irr guli re. Certaines de ces mol cules prot iques peuvent n anmoins s'assembler pour former des filaments qui peuvent s' tendre sur toute la longueur d'une cellule. Plus simplement, une longue cha ne de mol cules prot iques identiques peut tre construite si chaque mol cule a une liaison Figure 3 18 Deux sous-unit s prot iques identiques se l
Biologie moléculaire de la cellule	iant pour former un dim re prot ique sym trique. La prot ine r pressive Cro du bact riophage lambda se lie l'ADN pour d sactiver un sous-ensemble sp cifique de g nes viraux. Ses deux sous-unit s identiques se lient t te t te, maintenues ensemble par une combinaison de forces hydrophobes (en bleu) et d'un ensemble de liaisons hydrog ne (r gion en jaune). (Adapt de D.H. Ohlendorf, D.E. Tronrud et B.W. Matthews, J. Mol. Biol. 280:129-136, 1998. Avec la permission d'Academic Press.) Figure 3 19 : une prot ine form e comme un assemblage sym trique l'aide de deux sous-unit s diff rentes. L'h moglobine est une prot ine abondante dans les globules rouges qui contient deux copies de -globine (vert) et deux copies de -globine (bleu). Chacune de ces quatre cha nes polypeptidiques contient une mol cule d'h me (rouge), qui est le site qui lie l'oxyg ne (O2). Ainsi, chaque mol cule d'h moglobine dans le sang transporte quatre mol cules d'oxyg ne. (Code PDB : 2DHB.) Figure 3 20 Assemblages de prot ines. (A) Une prot ine avec un seul site de liaison peut (A) former un dim re avec une autre prot ine identique. (B) Des prot ines identiques avec deux sites de liaison diff rents assembl s librement forment souvent un long filament h lico dal. (C) Si les deux sous-unit s de liaison sont dispos es de mani re appropri e l'une par rapport l'autre, les sous-unit s prot iques peuvent former un anneau ferm au lieu d'une h lice. (Pour un exemple de A, voir Figures 3 18 ; pour un exemple de B, voir la figure 3-21 ; pour des exemples de C, voir les figures 5-14 et 14-31.) site compl mentaire une autre r gion de la surface de la m me mol cule (Figure 3 20). Un filament d'actine, par exemple, est une longue structure h lico dale produite partir de nombreuses mol cules de la prot ine actine (Figure 3 21). L'actine est une prot ine globulaire tr s abondante dans les cellules eucaryotes, o elle forme l'un des principaux syst mes filamentaires du cytosquelette (discut au chapitre 16). Nous rencontrerons de nombreuses structures h lico dales dans ce livre. Pourquoi une h lice est-elle une structure si courante en biologie ? Comme nous l'avons vu, les structures biologiques sont souvent form es en liant des sous-unit s similaires en longues cha nes r p titives. Si toutes les sous-unit s sont identiques, les sous-unit s voisines de la cha ne peuvent souvent s'embo ter d'une seule mani re, en ajustant leurs positions relatives pour minimiser l' nergie libre du contact entre elles. En cons quence, chaque sous-unit est positionn e exactement de la m me mani re par rapport la suivante, de sorte que la sous-unit 3 s'adapte la sous-unit 2 de la m me mani re que la sous-unit 2 s'adapte la sous-unit 1, et ainsi de suite. Comme il est tr s rare que les sous-unit s se rejoignent en ligne droite, cette disposition aboutit g n ralement une h lice, une structure r guli re qui ressemble un escalier en colima on, comme l'illustre la figure 3 22. Selon la torsion de l'escalier, on dit qu'une h lice est soit droiti re, soit gaucher (voir Figure 3 22E). La maniabilit n'est pas affect e par le retournement de l'h lice, mais elle est invers e si l'h lice se refl te dans le miroir. L'observation selon laquelle les h lices se produisent couramment dans les structures biologiques est vraie, que les sous-unit s soient de petites mol cules li es entre elles par des liaisons covalentes (par exemple, les acides amin s d'une h lice ) ou de grandes mol cules de prot ines li es par des forces non covalentes (par exemple, les mol cules d'actine dans les filaments d'actine). Ce n'est pas surprenant. Une h lice est une structure sans exception, et elle est g n r e simplement en pla ant de nombreuses sous-unit s similaires les unes c t des autres, chacune dans la m me relation strictement r p t e la pr c dente, c'est- -dire avec une rotation fixe suivie d'une translation fixe le long de l'axe de l'h lice, comme dans un escalier en colima on. De nombreuses mol cules de prot ines ont des formes allong es et fibreuses Les enzymes ont tendance tre des prot ines globulaires : m me si beaucoup sont grandes et compliqu es, avec plusieurs sous-unit s, la plupart ont une forme arrondie. Sur la figure 3-21, nous avons vu qu'une prot ine globulaire peut galement s'associer pour former de longs filaments. Mais il existe galement des fonctions qui n cessitent que chaque mol cule de prot ine individuelle s' tende sur une grande distance. Ces prot ines ont g n ralement une structure tridimensionnelle allong e relativement simple et sont commun ment appel es prot ines fibreuses. Une grande famille de prot ines fibreuses intracellulaires est constitu e de -k ratine, introduite lorsque nous avons pr sent la h lice, et de ses parents. Les filaments de k ratine sont extr mement stables et sont le principal composant des structures longue dur e de vie telles que les cheveux, la corne et les ongles. Une mol cule de -k ratine est un dim r
Biologie moléculaire de la cellule	e de deux sous-unit s identiques, les longues h lices de chaque sous-unit formant une bobine enroul e (voir Figure 3-9). Les r gions enroul es sont coiff es chaque extr mit par des domaines globulaires contenant des sites de liaison. Cela permet cette classe de prot ines de s'assembler en filaments interm diaires en forme de corde, un composant important du cytosquelette qui cr e le cadre structurel interne de la cellule (voir Figure 16-67). Les prot ines fibreuses sont particuli rement abondantes l'ext rieur de la cellule, o elles constituent un composant principal de la matrice extracellulaire semblable un gel qui aide lier des collections de cellules pour former des tissus. Les cellules s cr tent des prot ines de la matrice extracellulaire dans leur environnement, o elles s'assemblent souvent en feuilles ou en longues fibrilles. Le collag ne est la plus abondante de ces prot ines dans les tissus animaux. Une mol cule de collag ne se compose de trois longues cha nes polypeptidiques, chacune contenant l'amin non polaire Figure 3 21 filaments d'actine. (A) Micrographies lectroniques transmission de filaments d'actine color s n gativement. (B) L'arrangement h lico dal des mol cules d'actine dans un filament d'actine. (A, avec l'aimable autorisation de Roger Craig.) Figure 3 22 Quelques propri t s d'une h lice. (A-D) Une h lice se forme lorsqu'une s rie de sous-unit s se lient les unes aux autres de mani re r guli re. En bas, chacune de ces h lices est vue directement au-dessus de l'h lice et comporte deux (A), trois (B) et six (C et D) sous-unit s par tour h lico dal. Notez que l'h lice de (D) a un chemin plus large que celui de (C), mais le m me nombre de sous-unit s par tour. (E) Comme discut dans le texte, une h lice peut tre droiti re ou gaucher. titre de r f rence, il est utile de rappeler que les vis m talliques standard, qui s'ins rent lorsqu'elles sont tourn es dans le sens des aiguilles d'une montre, sont pour droitiers. Notez qu'une h lice conserve la m me main lorsqu'elle est retourn e. (Code PDB : 2DHB.) Glycine acide toutes les trois positions. Cette structure r guli re permet aux cha nes de s'enrouler les unes autour des autres pour g n rer une longue h lice triple r guli re (Figure 3 23A). De nombreuses mol cules de collag ne se lient ensuite les unes aux autres c te c te et de bout en bout pour cr er de longs r seaux qui se chevauchent, g n rant ainsi les fibrilles de collag ne extr mement r sistantes qui donnent aux tissus conjonctifs leur r sistance la traction, comme d crit au chapitre 19. Les prot ines contiennent une quantit tonnamment lev e de cha nes polypeptidiques intrins quement d sordonn es On sait depuis longtemps que, contrairement au collag ne, une autre prot ine abondante dans la matrice extracellulaire, l' lastine, est form e sous la forme d'un polypeptide hautement d sordonn . Ce trouble est essentiel la fonction de l' lastine. Ses cha nes polypeptidiques relativement l ches et non structur es sont r ticul es de mani re covalente une section courte de collag ne de 50 nm : mol cule de collag ne fbrill, 300 nm 1,5 nm 1,5 nm Figure 3 23 Collag ne et lastine. (A) Le collag ne est une triple h lice form e de trois cha nes prot iques tendues qui s'enroulent les unes autour des autres (en bas). De nombreuses mol cules de collag ne en forme de b tonnets sont r ticul es dans l'espace extracellulaire pour former des fibrilles de collag ne non extensibles (en haut) qui ont la r sistance la traction de l'acier. La bande sur la fibrille de collag ne est caus e par la disposition r p titive r guli re des mol cules de collag ne l'int rieur de la fibrille. (B) Les cha nes polypeptidiques d' lastine sont r ticul es ensemble dans l'espace extracellulaire pour former des fibres lastiques caoutchouteuses. Chaque mol cule d' lastine se d roule en une conformation plus tendue lorsque la fibre est tir e et recule spontan ment d s que la force d' tirement est rel ch e. La r ticulation dans l'espace extracellulaire mentionn e cr e des liaisons covalentes entre les cha nes lat rales de la lysine, mais la chimie est diff rente pour le collag ne et l' lastine. produire un maillage lastique semblable du caoutchouc qui peut tre tir de mani re r versible d'une conformation une autre, comme illustr la figure 3-23B. Les fibres lastiques qui en r sultent permettent la peau et d'autres tissus, tels que les art res et les poumons, de s' tirer et de reculer sans se d chirer. Les r gions intrins quement d sordonn es des prot ines sont fr quentes dans la nature et elles ont des fonctions importantes l'int rieur des cellules. Comme nous l'avons d j vu, les prot ines ont souvent des boucles de cha ne polypeptidique qui d passent de la r gion centrale d'un domaine prot ique pour se lier d'autres mol cules. Certaines de ces boucles restent largement non structur es jusqu' ce qu'elles se lient une mol cule cible, n'adoptant une conformati
Biologie moléculaire de la cellule	on repli e sp cifique que lorsque cette autre mol cule est li e. De nombreuses prot ines taient galement connues pour avoir des queues intrins quement d sordonn es l'une ou l'autre extr mit d'un domaine structur (voir, par exemple, les histones dans les figures 4-24). Mais l' tendue d'une telle structure d sordonn e n'est devenue claire que lorsque les g nomes ont t s quenc s. Cela a permis d'utiliser des m thodes bioinformatiques pour analyser les s quences d'acides amin s cod es par les g nes, en recherchant des r gions d sordonn es en fonction de leur hydrophobicit exceptionnellement faible et de leur charge nette relativement lev e. En combinant ces r sultats avec d'autres donn es, on pense maintenant que peut- tre un quart de toutes les prot ines eucaryotes peuvent adopter des structures qui sont pour la plupart d sordonn es, fluctuant rapidement entre de nombreuses conformations diff rentes. Beaucoup de ces r gions intrins quement d sordonn es contiennent des s quences r p t es d'acides amin s. Que font ces r gions d sordonn es ? Certaines fonctions connues sont illustr es dans la figure 3-24. L'une des fonctions pr dominantes est de former des sites de liaison sp cifiques pour d'autres mol cules de prot ines qui sont de haute sp cificit , mais qui sont facilement modifi es par la phosphorylation des prot ines, la d phosphorylation des prot ines ou toute autre modification covalente d clench e par des v nements de signalisation cellulaire (Figure 3 24A et B). Nous verrons, par exemple, que l'enzyme ARN polym rase eucaryote qui produit les ARNm contient une longue queue C-terminale non structur e qui est modifi e de mani re covalente au fur et mesure de la synth se de son ARN, attirant ainsi d'autres prot ines sp cifiques vers le complexe de transcription diff rents moments (voir Figure 6-22). Et cette queue non structur e interagit avec un autre type de domaine de faible complexit lorsque l'ARN polym rase est recrut e sur les sites sp cifiques de l'ADN o elle commence la synth se. Comme l'illustre la figure 3-24C, une r gion non structur e peut galement servir de lien pour maintenir deux domaines prot iques proximit imm diate afin de faciliter leur interaction. Par exemple, c'est cette fonction d'attache qui permet aux substrats de se d placer entre les sites actifs dans de grands complexes multienzymatiques (voir Figure 3-54). Une fonction d'attache similaire permet de grandes prot ines d' chafaudage avec plusieurs sites de liaison aux prot ines de concentrer des ensembles de prot ines en interaction, augmentant la fois les vitesses de r action et confinant leur r action un site particulier dans une cellule (voir Figure 3 78). Comme l' lastine, d'autres prot ines ont une fonction qui n cessite directement qu'elles restent en grande partie non structur es. Ainsi, un grand nombre de cha nes prot iques d sordonn es proximit imm diate peut cr er des micro-r gions de consistance g latineuse l'int rieur de la cellule qui limitent la diffusion. Par exemple, les nucl oporines abondantes qui recouvrent la surface interne du complexe de pores nucl aires forment un r seau de bobines al atoires (Figure 3-24) qui est essentiel pour le transport nucl aire s lectif (voir Figure 12-8). Figure 3 24 Quelques fonctions importantes pour les s quences de prot ines intrins quement d sordonn es. (A) Les r gions non structur es de la cha ne polypeptidique forment souvent des sites de liaison pour d'autres prot ines. Bien que ces v nements de liaison soient d'une grande sp cificit , ils sont souvent de faible affinit en raison du co t en nergie libre du pliage du partenaire normalement d pli (et ils sont donc facilement r versibles). (B) Les r gions non structur es peuvent tre facilement modifi es de mani re covalente pour changer leurs pr f rences de liaison, et elles sont donc fr quemment impliqu es dans les processus de signalisation cellulaire. Dans ce sch ma, plusieurs sites de phosphorylation des prot ines sont indiqu s. (C) Les r gions non structur es cr ent fr quemment des attaches qui maintiennent les domaines prot iques en interaction proximit . (D) Un r seau dense de prot ines non structur es peut former une barri re de diffusion, comme le font les nucl oporines pour le pore nucl aire. Figure 3 25 Liaisons disulfure. Des liaisons disulfure covalentes se forment entre les cha nes lat rales adjacentes de cyst ine. Ces r ticulations peuvent relier soit deux parties d'une m me cha ne polypeptidique, soit deux cha nes polypeptidiques diff rentes. tant donn que l' nergie n cessaire pour rompre une liaison covalente est beaucoup plus grande que l' nergie n cessaire pour rompre m me un ensemble complet de liaisons non covalentes (voir tableau 2-1, p. 45), une liaison disulfure peut avoir un effet stabilisateur majeur sur une prot ine (vid o 3.7). De nombreuses mol cules de prot ines sont soit attach es l'ext rieur de la membrane plasmique d'une cellule, soit s cr
Biologie moléculaire de la cellule	t es dans le cadre de la matrice extracellulaire. Toutes ces prot ines sont directement expos es des conditions extracellulaires. Pour aider maintenir leurs structures, les cha nes polypeptidiques de ces prot ines sont souvent stabilis es par des liaisons crois es covalentes. Ces liaisons peuvent soit lier deux acides amin s dans la m me prot ine, soit connecter diff rentes cha nes polypeptidiques dans une prot ine multi-sous-unit s. Bien qu'il en existe de nombreux autres types, les liaisons crois es les plus courantes dans les prot ines sont les liaisons covalentes soufre-soufre. Ces liaisons disulfure ( galement appel es liaisons S-S) se forment lorsque les cellules pr parent des prot ines nouvellement synth tis es pour l'exportation. Comme d crit au chapitre 12, leur formation est catalys e dans le r ticulum endoplasmique par une enzyme qui relie ensemble deux paires de groupes -SH de cha nes lat rales de cyst ine qui sont adjacentes dans la prot ine repli e (Figure 3-25). Les liaisons disulfure ne modifient pas la conformation d'une prot ine, mais agissent plut t comme des agrafes atomiques pour renforcer sa conformation la plus favoris e. Par exemple, le lysozyme, une enzyme pr sente dans les larmes qui dissout les parois cellulaires bact riennes, conserve longtemps son activit antibact rienne parce qu'il est stabilis par de telles r ticulations. Les liaisons disulfure ne se forment g n ralement pas dans le cytosol, o une forte concentration d'agents r ducteurs convertit les liaisons S-S en groupes cyst ine-SH. Apparemment, les prot ines n'ont pas besoin de ce type de renforcement dans l'environnement relativement doux l'int rieur de la cellule. Les mol cules de prot ines servent souvent de sous-unit s pour l'assemblage de grandes structures Les m mes principes qui permettent une mol cule de prot ine de s'associer elle-m me pour former des anneaux ou un long filament fonctionnent galement pour g n rer des structures beaucoup plus grandes form es partir d'un ensemble de macromol cules diff rentes, telles que des complexes enzymatiques, des ribosomes, des virus et des membranes. Ces grands objets ne sont pas constitu s de mol cules uniques, g antes et li es de mani re covalente. Au lieu de cela, ils sont form s par l'assemblage non covalent de nombreuses mol cules fabriqu es s par ment, qui servent de sous-unit s de la structure finale. L'utilisation de sous-unit s plus petites pour construire des structures plus grandes pr sente plusieurs avantages : 1. Une grande structure construite partir d'une ou de quelques sous-unit s plus petites r p titives ne n cessite qu'une petite quantit d'informations g n tiques. 2. L'assemblage et le d sassemblage peuvent tre des processus r versibles facilement contr l s, car les sous-unit s s'associent par de multiples liaisons d' nergie relativement faible. 3. Les erreurs dans la synth se de la structure peuvent tre plus facilement vit es, car les m canismes de correction peuvent fonctionner au cours de l'assemblage pour exclure les sous-unit s malform es. Certaines sous-unit s prot iques s'assemblent en feuilles plates dans lesquelles les sous-unit s sont dispos es selon des motifs hexagonaux. Des prot ines membranaires sp cialis es sont parfois dispos es de cette fa on en bicouches lipidiques. Avec un l ger changement dans la g om trie des sous-unit s individuelles, une feuille hexagonale peut tre convertie en tube (Figure 3 26) ou, avec d'autres modifications, en une sph re creuse. Les tubes et les sph res prot iques qui se lient des mol cules d'ARN et d'ADN sp cifiques leur int rieur forment les enveloppes des virus. La formation de structures ferm es, telles que des anneaux, des tubes ou des sph res, offre une stabilit suppl mentaire car elle augmente le nombre de liaisons entre les sous-unit s prot iques. De plus, tant donn qu'une telle structure est cr e par des interactions coop ratives mutuellement d pendantes entre les sous-unit s, un changement relativement faible qui affecte chaque sous-unit individuellement peut provoquer l'assemblage ou le d sassemblage de la structure. Ces principes sont illustr s de mani re spectaculaire dans l'enveloppe prot ique ou la capside de nombreux virus simples, qui prend la forme d'une sph re creuse bas e sur un icosa dre (Figure 3-27). Les capsides sont souvent constitu es de centaines de sous-unit s prot iques identiques qui entourent et prot gent l'acide nucl ique viral (Figure 3-28). La prot ine d'une telle capside doit avoir une structure particuli rement adaptable : non seulement elle doit tablir plusieurs types de contacts diff rents pour cr er la sph re, mais elle doit galement modifier cet arrangement pour laisser sortir l'acide nucl ique afin d'initier la r plication virale une fois que le virus a p n tr dans une cellule. De nombreuses structures dans les cellules sont capables de s'auto-assembler L'information n cessaire la formation d'un grand nombre d'assemblages co
Biologie moléculaire de la cellule	mplexes de macromol cules dans les cellules doit tre contenue dans les sous-unit s elles-m mes, car les sous-unit s purifi es peuvent s'assembler spontan ment dans la structure finale dans les conditions appropri es. Le premier grand agr gat macromol culaire capable de s'auto-assembler partir de ses composants a t le virus de la mosa que du tabac (TMV). Ce virus est un long b tonnet dans lequel un cylindre de prot ine est dispos autour d'un noyau d'ARN h lico dal (Figure 3-29). Si les sous-unit s dissoci es de l'ARN et de la prot ine sont m lang es en solution, elles se recombinent pour former des particules virales pleinement actives. Le processus d'assemblage est tonnamment complexe et comprend la formation de doubles anneaux de prot ines, qui servent d'interm diaires qui s'ajoutent la couche virale en croissance. Un autre agr gat macromol culaire complexe qui peut se r assembler partir de ses composants est le ribosome bact rien. Cette structure est compos e d'environ 55 mol cules de prot ines diff rentes et de 3 mol cules d'ARNr diff rentes. L'incubation d'un m lange de composants individuels dans des conditions appropri es dans un tube essai les am ne reformer spontan ment la structure d'origine. Plus important encore, ces ribosomes reconstitu s sont capables de catalyser la synth se des prot ines. Comme on pouvait s'y attendre, le r assemblage des ribosomes suit une voie sp cifique : une fois que certaines prot ines se sont li es l'ARN, ce complexe est ensuite reconnu par d'autres prot ines, et ainsi de suite, jusqu' ce que la structure soit compl te. On ne sait toujours pas comment certains des processus d'auto-assemblage les plus labor s sont r glement s. De nombreuses structures de la cellule, par exemple, semblent avoir une longueur d finie avec pr cision, plusieurs fois sup rieure celle des macromol cules qui les composent. La mani re dont une telle d termination de la longueur est obtenue est dans de nombreux cas un myst re. Dans Figure 3 26 : Les sous-unit s prot iques uniques forment des assemblages prot iques qui comportent plusieurs contacts prot ine-prot ine. Des sous-unit s de prot ines globulaires emball es hexagonalement sont montr es ici, formant soit des feuilles plates, soit des tubes. En g n ral, de telles grandes structures ne sont pas consid r es comme des mol cules uniques. Au lieu de cela, comme le filament d'actine d crit pr c demment, ils sont consid r s comme des assemblages form s de nombreuses mol cules diff rentes. Figure 3 27 La capside prot ique d'un virus. La structure de la capside du virus simien SV40 a t d termin e par cristallographie aux rayons X et, comme pour les capsides de nombreux autres virus, elle est connue dans les d tails atomiques. (Avec l'aimable autorisation de Robert Grant, Stephan Crainic et James M. Hogle.) Prot ine de capside Particule monom re virale intacte repr sent e par (90 dim res) Le cas le plus simple, une prot ine noyau long ou une autre macromol cule fournit un chafaudage qui d termine l' tendue de l'assemblage final. C'est le m canisme qui d termine la longueur de la particule TMV, o la cha ne d'ARN fournit le noyau. De m me, on pense qu'une prot ine centrale interagissant avec l'actine d termine la longueur des filaments minces dans le muscle. Figure 3 28 La structure d'un virus sph rique. Dans les virus, de nombreuses copies d'une seule sous-unit prot ique s'embo tent souvent pour cr er une coquille sph rique (une capside). Cette capside renferme le g nome viral, compos soit d'ARN, soit d'ADN (voir aussi Figure 3 27). Pour des raisons g om triques, pas plus de 60 sous-unit s identiques ne peuvent s'empaqueter de mani re pr cis ment sym trique. Cependant, si de l g res irr gularit s sont autoris es, plus de sous-unit s peuvent tre utilis es pour produire une capside plus grande qui conserve la sym trie icosa drique. Le virus du rabougrissement buissonnant de la tomate (TBSV) montr ici, par exemple, est un virus sph rique d'environ 33 nm de diam tre form de 180 copies identiques d'une prot ine de capside de 386 acides amin s et d'un g nome d'ARN de 4500 nucl otides. Pour construire une capside aussi grande, la prot ine doit tre capable de s'int grer dans trois environnements quelque peu diff rents. Cela n cessite trois conformit s l g rement diff rentes, chacune d'entre elles tant de couleur diff rente dans la particule virale montr e ici. Le chemin postul de l'assemblage est montr ; La structure tridimensionnelle pr cise a t d termin e par diffraction des rayons X. (Avec l'aimable autorisation de Steve Harrison.) Figure 3 29 Structure du virus de la mosa que du tabac (TMV). (A) Une micrographie lectronique de la particule virale, qui se compose d'une seule longue mol cule d'ARN enferm e dans une enveloppe prot ique cylindrique compos e de sous-unit s prot iques identiques. (B) Un mod le montrant une partie de la structure de TMV. Une mol cule d'ARN simple brin de 6395 nucl otides est emba
Biologie moléculaire de la cellule	ll e dans une enveloppe h lico dale construite partir de 2130 copies d'une prot ine d'enveloppe de 158 acides amin s de long. Des particules virales enti rement infectieuses peuvent s'auto-assembler dans un tube essai partir de mol cules d'ARN et de prot ines purifi es. (A, avec l'aimable autorisation de Robley Williams ; B, avec l'aimable autorisation de Richard J. Feldmann.) Figure 3 30 Clivage prot olytique dans l'assemblage de l'insuline. L'insuline, l'hormone polypeptidique, ne peut pas se reformer spontan ment et efficacement si ses liaisons disulfure sont rompues. Il est synth tis sous la forme d'une prot ine plus grosse (proinsuline) qui est cliv e par une enzyme prot olytique apr s que la cha ne prot ique s'est repli e dans une forme sp cifique. L'excision d'une partie de la cha ne polypeptidique de proinsuline limine une partie de l'information n cessaire pour que la prot ine se replie spontan ment dans sa conformation normale. Une fois que l'insuline a t d natur e et que ses deux cha nes polypeptidiques se sont s par es, sa capacit se r assembler est perdue. Les facteurs d'assemblage contribuent souvent la formation de structures biologiques complexes Toutes les structures cellulaires maintenues ensemble par des liaisons non covalentes ne s'auto-assemblent pas. Un cil, ou une myofibrille d'une cellule musculaire, par exemple, ne peut pas se former spontan ment partir d'une solution de ses macromol cules composantes. Dans ces cas, une partie des informations d'assemblage est fournie par des enzymes sp ciales et d'autres prot ines qui remplissent la fonction de matrices, servant de facteurs d'assemblage qui guident la construction mais ne participent pas la structure finale assembl e. M me les structures relativement simples peuvent manquer de certains des ingr dients n cessaires leur propre assemblage. Dans la formation de certains virus bact riens, par exemple, la t te, qui est compos e de nombreuses copies d'une seule sous-unit prot ique, est assembl e sur un chafaudage temporaire compos d'une seconde prot ine qui est produit par le virus. Parce que la deuxi me prot ine est absente de la particule virale finale, la structure de la t te ne peut pas se r assembler spontan ment une fois qu'elle a t d mont e. D'autres exemples sont connus dans lesquels le clivage prot olytique est une tape essentielle et irr versible dans le processus d'assemblage normal. C'est m me le cas pour certains petits assemblages prot iques, notamment la prot ine structurelle collag ne et l'hormone insuline (Figure 3-30). D'apr s ces exemples relativement simples, il semble certain que l'assemblage d'une structure aussi complexe qu'un cil impliquera un ordre temporel et spatial qui est conf r par de nombreux autres composants. Une classe sp ciale de structures prot iques, utilis es pour certaines fonctions cellulaires normales, peut galement contribuer aux maladies humaines lorsqu'elle n'est pas contr l e. Il s'agit d'agr gats stables et autopropagateurs en feuille de appel s fibrilles amylo des. Ces fibrilles sont construites partir d'une s rie de cha nes polypeptidiques identiques qui se superposent les unes sur les autres pour cr er un empilement continu de feuilles de , les brins tant orient s perpendiculairement l'axe des fibrilles pour former un filament b ta crois (Figure 3-31). En r gle g n rale, des centaines de monom res s'agr gent pour former une structure fibreuse non ramifi e de plusieurs microm tres de long et de 5 15 nm de largeur. Une fraction tonnamment importante de prot ines a le potentiel de former de telles structures, car le segment court de la cha ne polypeptidique qui forme l' pine de la fibrille peut avoir une vari t de s quences diff rentes et suivre l'un des chemins diff rents (Figure 3-32). Cependant, tr s peu de prot ines formeront r ellement cette structure l'int rieur des cellules. Chez l'homme normal, les m canismes de contr le de la qualit r gissant les prot ines diminuent progressivement avec l' ge, permettant parfois aux prot ines normales de former des agr gats pathologiques. Les agr gats de prot ines peuvent tre lib r s des cellules mortes et s'accumuler sous forme d'amylo de dans la matrice extracellulaire. Dans les cas extr mes, l'accumulation de ces fibrilles amylo des l'int rieur des cellules peut tuer les cellules et endommager les tissus. Parce que le cerveau est compos d'un ensemble tr s organis de cellules nerveuses qui ne peuvent pas se r g n rer, le cerveau est particuli rement vuln rable ce type de dommages cumulatifs. Ainsi, bien que les fibrilles amylo des puissent se former dans diff rents tissus et soient connues pour provoquer des pathologies plusieurs endroits du corps, les pathologies amylo des les plus graves sont les maladies neurod g n ratives. Par exemple, on pense que la formation anormale de fibrilles amylo des tr s stables joue un r le causal central dans les maladies d'Alzheimer et de Parkinson. Les
Biologie moléculaire de la cellule	maladies prions sont un type particulier de ces pathologies. Elles ont acquis une notori t particuli re car, contrairement la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer, les maladies prions peuvent se propager d'un organisme un autre, condition que le deuxi me organisme mange un S S S S S S S SH SH SH repliement sp cifique stabilis par des liaisons disulfde reliant le peptide supprim , laissant une r duction compl te de la mol cule d'insuline deux cha nes s pare irr versiblement les deux cha nes Figure 3 31 Structure d taill e du noyau d'une fibrille amylo de. L' pine b ta crois e de la fibrille amylo de est form e par un peptide de sept acides amin s de la prot ine Sup35, un prion de levure largement tudi . Constitu e de la s quence glycine-asparagine-asparagine-glutamine-asparaginetyrosine (GNNQQNY), sa structure a t d termin e par cristallographie aux rayons X. Bien que les pines b ta crois es d'autres amylo des soient similaires, tant compos es de deux longues feuilles de maintenues ensemble par une fermeture clair st rique , diff rentes structures d taill es sont observ es en fonction de la courte s quence peptidique impliqu e. (A) Une moiti du dos est illustr e. Ici, une structure standard en feuillet parall le (voir p. 116) est maintenue ensemble par un ensemble de liaisons hydrog ne entre deux cha nes lat rales plus des liaisons hydrog ne entre deux atomes de squelette, comme illustr (atomes d'oxyg ne en rouge et atomes d'azote en bleu). Notez que dans cet exemple, les peptides adjacents sont exactement en registre. Bien que seules cinq couches soient repr sent es (chaque couche est repr sent e par une fl che), la structure r elle s' tendrait sur plusieurs dizaines de milliers de couches dans le plan du papier. (B) L'ensemble de la colonne vert brale crois e. Une seconde feuille de identique est associ e la premi re pour former un motif deux feuilles qui s' tend sur toute la longueur de la fibrille. (C) Vue de la colonne vert brale compl te en (B) depuis le haut. Les cha nes lat rales troitement interdigit es forment une jonction serr e et exempte d'eau connue sous le nom de fermeture clair st rique. (Avec l'aimable autorisation de David Eisenberg et Michael Sawaya, UCLA ; d'apr s R. Nelson et al., Nature 435:773-778, 2005. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) tissu contenant l'agr gat de prot ines. Un ensemble de les maladies apparent es la tremblante chez les moutons, la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ) chez les humains, le Kuru chez les humains et l'enc phalopathie spongiforme bovine (ESB) chez les bovins sont caus es par une forme agr g e mal repli e d'une prot ine particuli re appel e PrP (pour prot ine prion). La PrP est normalement situ e sur la surface externe de la membrane plasmique, plus particuli rement dans les neurones, et elle a la malheureuse propri t de former des fibrilles amylo des qui sont infectieuses parce qu'elles convertissent des mol cules normalement repli es de la PrP en la m me forme pathologique (Figure 3-33). Cette propri t cr e une boucle de r troaction positive qui propage la forme anormale de la PrP, appel e PrP, et permet la conformation pathologique de se propager rapidement d'une cellule l'autre dans le cerveau, provoquant finalement la mort. Il peut tre dangereux de manger les tissus d'animaux qui contiennent de la PrP, comme en t moigne la propagation de l'ESB (commun ment appel e maladie de la vache folle ) du b tail l'homme. Heureusement, en l'absence de PrP*, la PrP est extraordinairement difficile convertir en sa forme anormale. Un h r dit prot ique uniquement troitement li a t observ dans les cellules de levure. La capacit d' tudier les prot ines infectieuses dans la levure a clarifi une autre caract ristique remarquable des prions. Ces mol cules de prot ines peuvent former plusieurs types de fibrilles amylo des distinctement diff rents partir de la m me cha ne polypeptidique. De plus, chaque type d'agr gat peut tre infectieux, for ant les mol cules de prot ines normales adopter le m me type de structure anormale. Ainsi, plusieurs souches diff rentes de particules infectieuses peuvent provenir d'une m me cha ne polypeptidique. Figure 3 32 La structure d'une fibrille amylo de. (A) Sch ma de principe de la structure d'une fibrille amylo de form e par l'agr gation d'une prot ine. Seule la colonne vert brale crois e d'une fibrille amylo de ressemble la structure illustr e sur la figure 3-31. (B) Une vue en coupe d'une structure propos e pour la fibrille amylo de qui peut tre form e dans un tube essai par l'enzyme ribonucl ase A, illustrant comment le noyau de la fibrille form par un court segment se rapporte au reste de la structure. Micrographie lectronique de fibrilles amylo des. (A, d'apr s L. Esposito, C. Pedone et L. Vitagliano, Proc. Natl Acad. Sci. USA 103:11533 11538, 2006 ; B, d'apr s S. Sambashivan et al., Nature 437:266-269, 2005
Biologie moléculaire de la cellule	; C, avec l'aimable autorisation de David Eisenberg.) Figure 3 33 Les agr gats prot iques sp ciaux qui causent les maladies prions. (A) Illustration sch matique du type de changement conformationnel de la prot ine PrP (prot ine prion) qui produit du mat riel pour une fibrille amylo de. (B) La nature auto-infectieuse de l'agr gation des prot ines qui est au c ur des maladies prions. La PrP est tr s inhabituelle car la version mal repli e de la prot ine, appel e PrP, induit la prot ine PrP normale avec laquelle elle entre en contact pour changer sa conformation, comme indiqu . Les fibrilles amylo des ont d'abord t tudi es parce qu'elles causent des maladies. Mais on sait maintenant que le m me type de structure est exploit par les cellules des fins utiles. Les cellules eucaryotes, par exemple, stockent de nombreuses hormones peptidiques et prot iques diff rentes qu'elles s cr tent dans des granules s cr toires sp cialis s, qui emballent une forte concentration de leur cargaison dans des noyaux denses structure r guli re (voir Figure 13-65). Nous savons maintenant que ces noyaux structur s sont constitu s de fibrilles amylo des, qui dans ce cas ont une structure qui les fait se dissoudre pour lib rer une cargaison soluble apr s avoir t s cr t es par exocytose l'ext rieur de la cellule (Figure 3 34A). De nombreuses bact ries utilisent la structure amylo de d'une mani re tr s diff rente, s cr tant des prot ines qui forment de longues fibrilles amylo des qui se projettent de l'ext rieur de la cellule et qui aident lier les voisins bact riens en biofilms (Figure 3-34B). Parce que ces biofilms aident les bact ries survivre dans des environnements d favorables (y compris chez les humains trait s aux antibiotiques), de nouveaux m dicaments qui perturbent sp cifiquement les r seaux fibreux form s par les amylo des bact riennes sont prometteurs pour traiter les infections humaines. Jusqu' r cemment, on pensait que les amylo des ayant des fonctions utiles taient soit confin es l'int rieur de v sicules sp cialis es, soit exprim es l'ext rieur des cellules, comme le montre la figure 3-34. Cependant, de nouvelles exp riences r v lent qu'un grand nombre de domaines de faible complexit peuvent former des fibres amylo des qui ont des r les fonctionnels la fois dans le noyau cellulaire et dans le cytoplasme cellulaire. Ces domaines sont normalement non structur s et consistent en des tron ons de s quence d'acides amin s qui peuvent couvrir des centaines d'acides amin s, tout en ne contenant qu'un petit sous-ensemble des 20 acides amin s diff rents. Contrairement l'amylo de associ e la maladie dans les figures 3 33, ces structures nouvellement d couvertes sont maintenues ensemble par des liaisons non covalentes plus faibles et se dissocient facilement en r ponse des signaux, d'o leur nom d'amylo des r versibles. De nombreuses prot ines avec de tels domaines contiennent galement un ensemble diff rent de domaines qui se lient d'autres mol cules de prot ines ou d'ARN sp cifiques. Ainsi, leur agr gation contr l e Golgi : sous-unit de matrice amylo de citerne citerne, sous-unit fbril de fbril (A), la prot ine prion peut adopter une forme anormale et mal repli e, normale Prp anormale forme prion prot ine de la prot ine PrP (Prp) (B) prot ine mal repli e peut induire la formation d'agr gats de prot ines, la conversion de plus de PrP en forme de fbril mal repli cr e un agr gat stable de prot ine amylo de fbril sous forme de fbril amylo de Figure 3 34 Deux fonctions normales pour les fibrilles amylo des. (A) Dans les cellules eucaryotes, la cargaison de prot ines peut tre tr s dens ment emball e dans des v sicules s cr toires et stock e jusqu' ce que des signaux provoquent une lib ration de cette cargaison par exocytose. Par exemple, les prot ines et les hormones peptidiques du syst me endocrinien, telles que le glucagon et la calcitonine, sont stock es efficacement sous forme de fibrilles amylo des courtes, qui se dissocient lorsqu'elles atteignent l'ext rieur de la cellule. (B) Les bact ries produisent des fibrilles amylo des leur surface en s cr tant les prot ines pr curseurs ; Ces fibrilles cr ent ensuite des biofilms qui se lient entre eux et aident prot ger un grand nombre de bact ries individuelles. prot ine soluble avec tiquette fuorescente verte hnRNPA2 t/2 = 10,1 minPROT INE SOLUBLE REMPLAC E PAR UN TAMPON hnRNPA1 t/2 = 3,6 min 0,5 1 2 3 5 101520304560la dissociation de la prot ine verte du temps apr s le lavage du gel est mesur e par microscope fuorescence (A) en fonction du temps (B) Figure 3 35 Mesure de l'association entre les amylo des r versibles . (A) Dispositif exp rimental. Les domaines formant des fibres partir de prot ines contenant un domaine de faible complexit ont t produits en grande quantit en clonant la s quence d'ADN qui les code dans un plasmide d'E. coli afin de permettre la surproduction de ce domaine (voir p. 483). Apr s que ces
Biologie moléculaire de la cellule	domaines prot iques aient t purifi s par chromatographie d'affinit , une minuscule gouttelette de solution concentr e de l'un des domaines (ici le domaine FUS de faible complexit ) a t d pos e sur une bo te de microscope et laiss e g lifier. Le gel a ensuite t tremp dans une solution dilu e d'un domaine de faible complexit marqu par fluorescence partir de la m me prot ine ou d'une prot ine diff rente, rendant le gel fluorescent. Apr s avoir remplac la solution prot ique dilu e par un tampon, la force relative de liaison des diff rents domaines les uns aux autres a pu tre mesur e par la d croissance de la fluorescence, comme indiqu . b) R sultats. Le domaine de faible complexit de la prot ine FUS se lie plus troitement lui-m me qu'il ne le fait aux domaines de faible complexit des prot ines hnRNPA1 ou hnRNPA2. Une exp rience distincte r v le que ces trois prot ines diff rentes de liaison l'ARN s'associent en formant des fibrilles amylo des mixtes. (Adapt de M.Kato et al., Cellule 149 : 753-767, 2012). dans la cellule peut former un hydrogel qui attire ces mol cules et d'autres mol cules dans des structures ponctu es appel es corps intracellulaires, ou granules. Des ARNm sp cifiques peuvent tre s questr s dans de tels granules, o ils sont stock s jusqu' ce qu'ils soient mis disposition par un d sassemblage contr l de la structure amylo de centrale qui les maintient ensemble. Consid rons la prot ine FUS, une prot ine nucl aire essentielle qui joue un r le dans la transcription, le traitement et le transport de mol cules d'ARNm sp cifiques. Plus de 80 % de son domaine C-terminal de deux cents acides amin s est compos de seulement quatre acides amin s : la glycine, la s rine, la glutamine et la tyrosine. Ce domaine de faible complexit est attach plusieurs autres domaines qui se lient aux mol cules d'ARN. des concentrations suffisamment lev es dans un tube essai, il forme un hydrogel qui s'associera soit lui-m me, soit aux domaines de faible complexit d'autres prot ines. Comme l'illustre l'exp rience de la figure 3-35, bien que diff rents domaines de faible complexit se lient les uns aux autres, les interactions homotypiques semblent tre de la plus grande affinit (d'o la faible domaine de la complexit se lie le plus troitement lui-m me). D'autres exp riences r v lent que les liaisons homotypiques et h t rotypiques sont m di es par une structure centrale en formant des fibrilles amylo des, et que ces structures se lient d'autres types de s quences r p t es de la mani re indiqu e dans la figure 3-36. Beaucoup de ces interactions semblent tre contr l es par la phosphorylation des cha nes lat rales de s rine chez l'un ou les deux partenaires en interaction. Cependant, il reste encore beaucoup apprendre sur ces structures nouvellement d couvertes et les r les vari s qu'elles jouent dans la biologie cellulaire des cellules eucaryotes. prot ine domaine de faible complexit : site de liaison de l' pine crois e b ta faible pour d'autres prot ines avec des s quences r p t es ou pour des mol cules d'ARN Figure 3 36 Un type de complexe form par des amylo des r versibles. La structure montr e est bas e sur l'interaction observ e de l'ARN polym rase avec un domaine de faible complexit d'une prot ine qui r gule la transcription de l'ADN. (Adapt de I. Kwon et al., Cell 155:1049-1060, 2013.) La s quence d'acides amin s d'une mol cule prot ique d termine sa conformation tridimensionnelle. Les interactions non covalentes entre les diff rentes parties de la cha ne polypeptidique stabilisent sa structure pliss e. Les acides amin s avec des cha nes lat rales hydrophobes ont tendance se regrouper l'int rieur de la mol cule, et les interactions locales de liaisons hydrog ne entre les liaisons peptidiques voisines donnent naissance des h lices et des feuillets . Les r gions de s quence d'acides amin s connues sous le nom de domaines sont les unit s modulaires partir desquelles de nombreuses prot ines sont construites. Ces domaines contiennent g n ralement 40 350 acides amin s, souvent pli s en une forme globulaire. Les petites prot ines ne sont g n ralement constitu es que d'un seul domaine, tandis que les grandes prot ines sont form es de plusieurs domaines li s entre eux par diff rentes longueurs de cha ne polypeptidique, dont certaines peuvent tre relativement d sordonn es. Au fur et mesure que les prot ines ont volu , les domaines ont t modifi s et combin s avec d'autres domaines pour construire un grand nombre de nouvelles prot ines. Les prot ines sont rassembl es en structures plus grandes par les m mes forces non covalentes qui d terminent le repliement des prot ines. Les prot ines avec des sites de liaison pour leur propre surface peuvent s'assembler en dim res, en anneaux ferm s, en coquilles sph riques ou en polym res h lico daux. La fibrille amylo de est une longue structure non ramifi e assembl e par un agr gat r p titif de feuilles de
Biologie moléculaire de la cellule	. Bien que certains m langes de prot ines et d'acides nucl iques puissent s'assembler spontan ment en structures complexes dans un tube essai, toutes les structures de la cellule ne sont pas capables de se r assembler spontan ment apr s avoir t dissoci es en leurs composants, car de nombreux processus d'assemblage biologique impliquent des facteurs d'assemblage qui ne sont pas pr sents dans la structure finale. Nous avons vu que chaque type de prot ine est constitu d'une s quence pr cise d'acides amin s qui lui permet de se replier dans une forme tridimensionnelle particuli re, ou conformation. Mais les prot ines ne sont pas des morceaux rigides de mati re. Ils ont souvent des pi ces mobiles con ues avec pr cision dont les actions m caniques sont coupl es des v nements chimiques. C'est ce couplage de la chimie et du mouvement qui donne aux prot ines les capacit s extraordinaires qui sous-tendent les processus dynamiques dans les cellules vivantes. Dans cette section, nous expliquons comment les prot ines se lient d'autres mol cules s lectionn es et comment l'activit d'une prot ine d pend de cette liaison. Nous montrons que la capacit de se lier d'autres mol cules permet aux prot ines d'agir comme des catalyseurs, des r cepteurs de signaux, des interrupteurs, des moteurs ou de minuscules pompes. Les exemples que nous abordons dans ce chapitre n' puisent en aucun cas le vaste r pertoire fonctionnel des prot ines. Vous rencontrerez les fonctions sp cialis es de nombreuses autres prot ines ailleurs dans ce livre, bas es sur des principes similaires. Toutes les prot ines se lient d'autres mol cules L'interaction physique d'une mol cule de prot ine avec d'autres mol cules d termine ses propri t s biologiques. Ainsi, les anticorps se fixent aux virus ou aux bact ries pour les marquer en vue de leur destruction, l'enzyme hexokinase se lie glucose et ATP afin de catalyser une r action entre eux, les mol cules d'actine se lient les unes aux autres pour s'assembler en filaments d'actine, et ainsi de suite. En effet, toutes les prot ines se collent, ou se lient, d'autres mol cules. Dans certains cas, cette liaison est tr s serr e ; chez d'autres, elle est faible et de courte dur e. Mais la liaison fait toujours preuve d'une grande sp cificit , dans le sens o chaque mol cule de prot ine peut g n ralement se lier une seule ou quelques mol cules parmi les milliers de types diff rents qu'elle rencontre. La substance li e par la prot ine, qu'il s'agisse d'un ion, d'une petite mol cule ou d'une macromol cule telle qu'une autre prot ine, est appel e ligand de cette prot ine (du mot latin ligare, qui signifie lier ). La capacit d'une prot ine se lier s lectivement et avec une grande affinit un ligand d pend de la formation d'un ensemble de liaisons non covalentes faibles liaisons hydrog ne, attractions lectrostatiques et attractions de van der Waals ainsi que d'interactions hydrophobes favorables (voir panneau 2-3, pp. 94-95). Parce que chaque liaison individuelle est faible, une liaison efficace ne se produit que lorsque plusieurs de ces liaisons se forment simultan ment. Une telle liaison n'est possible que si les contours de surface de la mol cule de ligand s'adaptent tr s troitement la prot ine, l'adaptant comme une main dans un gant (Figure 3 37). La r gion d'une prot ine qui s'associe un ligand, connue sous le nom de site de liaison du ligand, consiste g n ralement en une cavit la surface de la prot ine form e par un arrangement particulier d'acides amin s. Ces acides amin s peuvent appartenir diff rentes parties de la cha ne polypeptidique qui sont rassembl es lorsque la prot ine se replie (Figure 3-38). Des r gions distinctes de la surface de la prot ine fournissent g n ralement des sites de liaison pour diff rents ligands, permettant l'activit de la prot ine d' tre r gul e, comme nous le verrons plus tard. Et d'autres parties de la prot ine agissent comme une poign e pour positionner la prot ine dans la cellule un exemple est le domaine SH2 discut pr c demment, qui d place souvent une prot ine le contenant vers des sites intracellulaires particuliers en r ponse des signaux. Bien que les atomes enfouis l'int rieur de la prot ine n'aient pas de contact direct avec le ligand, ils forment la trame qui donne la surface ses contours et ses propri t s chimiques et m caniques. M me de petits changements dans les acides amin s l'int rieur d'une mol cule de prot ine peuvent changer sa forme tridimensionnelle suffisamment pour d truire un site de liaison la surface. La conformation superficielle d'une prot ine d termine sa chimie Les capacit s chimiques impressionnantes des prot ines exigent souvent que les groupes chimiques leur surface interagissent de mani re am liorer la r activit chimique d'une ou plusieurs cha nes lat rales d'acides amin s. Ces interactions se r partissent en deux cat gories principales. Tout d'abord, l'interaction des parties vo
Biologie moléculaire de la cellule	isines de la cha ne polypeptidique peut restreindre l'acc s des mol cules d'eau aux sites de liaison des ligands de cette prot ine. Parce que les mol cules d'eau forment facilement des liaisons hydrog ne qui peuvent entrer en comp tition avec les ligands pour les sites Figure 3 37 La liaison s lective d'une prot ine une autre mol cule. De nombreuses liaisons faibles sont n cessaires pour permettre une prot ine de se lier troitement une deuxi me mol cule, ou ligand. Un ligand doit donc s'ins rer pr cis ment dans le site de liaison d'une prot ine, comme une main dans un gant, afin qu'un grand nombre de liaisons non covalentes se forment entre la prot ine et le ligand. a) Sch ma ; (B) mod le de remplissage d'espace. (Code PDB : 1G6N.) Figure 3 38 Le site de liaison d'une prot ine. (A) Le repliement de la cha ne polypeptidique cr e g n ralement une crevasse ou une cavit la surface de la prot ine. Cette crevasse contient un ensemble de cha nes lat rales d'acides amin s dispos es de telle mani re qu'elles ne peuvent former des liaisons non covalentes qu'avec certains ligands. (B) Un gros plan d'un site de liaison r el, montrant les liaisons hydrog ne et les interactions lectrostatiques form es entre une prot ine et son ligand. Dans cet exemple, une mol cule d'AMP cyclique est le ligand li . la surface de la prot ine, un ligand formera des liaisons hydrog ne plus serr es (et des interactions lectrostatiques) avec une prot ine si les mol cules d'eau sont tenues l' cart. Il pourrait tre difficile d'imaginer un m canisme qui exclurait une mol cule aussi petite que l'eau de la surface d'une prot ine sans affecter l'acc s du ligand lui-m me. Cependant, en raison de la forte tendance des mol cules d'eau former des liaisons hydrog ne eau-eau, les mol cules d'eau existent dans un grand r seau de liaisons hydrog ne (voir panneau 2-2, pp. 92-93). En effet, une prot ine peut maintenir un site de liaison au ligand sec, augmentant ainsi la r activit de ce site, car il est nerg tiquement d favorable pour que les mol cules d'eau individuelles se d tachent de ce r seau, comme elles doivent le faire pour atteindre une crevasse la surface d'une prot ine. Deuxi mement, le regroupement des cha nes lat rales d'acides amin s polaires voisines peut modifier leur r activit . Si le repliement des prot ines force ensemble un certain nombre de cha nes lat rales charg es n gativement contre leur r pulsion mutuelle, par exemple, l'affinit du site pour un ion charg positivement est consid rablement augment e. De plus, lorsque les cha nes lat rales d'acides amin s interagissent les unes avec les autres par le biais de liaisons hydrog ne, des groupes normalement non r actifs (tels que le CH2OH sur la s rine illustr la figure 3-39) peuvent devenir r actifs, ce qui permet de les utiliser pour cr er ou d faire des liaisons covalentes s lectionn es. La surface de chaque mol cule de prot ine a donc une r activit chimique unique qui d pend non seulement des cha nes lat rales d'acides amin s expos es, mais aussi de leur orientation exacte les unes par rapport aux autres. Pour cette raison, deux conformations l g rement diff rentes d'une m me mol cule de prot ine peuvent diff rer consid rablement dans leur chimie. Comme nous l'avons d crit pr c demment, les s quences g nomiques nous permettent de regrouper de nombreux domaines des prot ines en familles qui montrent des preuves claires de leur volution partir d'un anc tre commun. Les structures tridimensionnelles des membres d'une m me famille de domaines sont remarquablement similaires. Par exemple, m me lorsque l'identit de la s quence d'acides amin s tombe 25 %, les atomes de squelette d'un domaine peuvent suivre un repliement prot ique commun moins de 0,2 nanom tre (2 ). Nous pouvons utiliser une m thode appel e tra age volutif pour identifier les sites d'un domaine prot ique qui sont les plus cruciaux pour la fonction du domaine. Les sites qui se lient d'autres mol cules sont les plus susceptibles d' tre maintenus, inchang s au fur et mesure de l' volution des organismes. Ainsi, dans cette m thode, les acides amin s qui sont inchang s, ou presque inchang s, dans tous les membres connus de la famille des prot ines sont cartographi s sur un mod le de la structure tridimensionnelle d'un membre de la famille. Lorsque cela est fait, les positions les plus invariantes forment souvent un ou plusieurs amas la surface de la prot ine, comme illustr dans la figure 3-40A pour le domaine SH2 d crit pr c demment (voir figure 3-6). Ces grappes correspondent g n ralement des sites de liaison de ligands. Le domaine SH2 a pour fonction de lier deux prot ines ensemble. Il lie la prot ine qui le contient une seconde prot ine qui contient une cha ne lat rale de tyrosine phosphoryl e dans un contexte de s quence d'acides amin s sp cifique, comme le montre la figure 3-40B. Les acides amin s situ s au site de liaison du polypeptide phosphoryl ont t les plus len
Biologie moléculaire de la cellule	ts changer au cours du long processus volutif qui a produit Figure 3 39 : un acide amin inhabituellement r actif au site actif d'une enzyme. Cet exemple est la triade catalytique Asp-His-Ser que l'on trouve dans la chymotrypsine, l' lastase et d'autres prot ases s rine (voir Figure 3-12). La cha ne lat rale de l'acide aspartique (Asp) induit l'histidine (His) liminer le proton d'une s rine particuli re (Ser). Cela active la s rine et lui permet de former une liaison covalente avec un substrat enzymatique, hydrolysant une liaison peptidique. Les nombreuses circonvolutions de la cha ne polypeptidique sont omises ici. la grande famille SH2 de domaines de reconnaissance peptidique. La mutation est un processus al atoire ; La survie ne l'est pas. Ainsi, la s lection naturelle (mutation al atoire suivie d'une survie non al atoire) produit la conservation de la s quence en liminant pr f rentiellement les organismes dont les domaines SH2 sont modifi s d'une mani re qui inactive le site de liaison SH2, d truisant ainsi la fonction SH2. Le s quen age du g nome a r v l un grand nombre de prot ines dont les fonctions sont inconnues. Une fois qu'une structure tridimensionnelle a t d termin e pour un membre d'une famille de prot ines, le tra age volutif Permet aux biologistes de d terminer les sites de liaison des membres de cette famille, ce qui constitue un point de d part utile pour d chiffrer la fonction des prot ines. Les prot ines se lient d'autres prot ines par plusieurs types d'interfaces Les prot ines peuvent se lier d'autres prot ines de plusieurs fa ons. Dans de nombreux cas, une partie de la surface d'une prot ine entre en contact avec une boucle tendue de cha ne polypeptidique (une cha ne ) sur une deuxi me prot ine (Figure 3-41A). Une telle interaction surface-cha ne, par exemple, permet au domaine SH2 de reconna tre une boucle polypeptidique phosphoryl e sur une seconde prot ine, comme nous venons de le d crire, et elle permet galement une prot ine kinase de reconna tre les prot ines qu'elle va phosphoryler (voir ci-dessous). Un deuxi me type d'interface prot ine-prot ine se forme lorsque deux h lices , une de chaque prot ine, s'apparient pour former une bobine enroul e (Figure 3-41B). Ce type d'interface prot ique se trouve dans plusieurs familles de prot ines r gulatrices de g nes, comme nous l'avons vu au chapitre 7. Cependant, la fa on la plus courante pour les prot ines d'interagir est l'appariement pr cis d'une surface rigide avec celle d'une autre (Figure 3-41C). De telles interactions peuvent tre tr s troites, car un grand nombre de liaisons faibles peuvent se former entre deux surfaces qui s'accordent bien. Pour la m me raison, de telles interactions surface-surface peuvent tre extr mement sp cifiques, permettant une prot ine de s lectionner un seul partenaire parmi les milliers de prot ines diff rentes pr sentes dans une cellule. Figure 3 40 La m thode de trace volutive appliqu e au domaine SH2. Vues de face et de dos d'un mod le de remplissage d'espace du domaine SH2, avec des acides amin s conserv s au cours de l' volution la surface de la prot ine de couleur jaune, et ceux plus vers l'int rieur de la prot ine de couleur rouge. (B) La structure d'un domaine SH2 sp cifique avec son polypeptide li . Ici, les acides amin s situ s moins de 0,4 nm du ligand li sont color s en bleu. Les deux acides amin s cl s du ligand sont jaunes et les autres sont violets. Notez le degr lev de correspondance entre et (B). (Adapt de O. Lichtarge, H.R. Bourne et F.E. Cohen, J. Mol. Biol. 257:342-358, 1996. Avec l'autorisation d'Elsevier ; Codes PDB : 1SPR, 1SPS.) Figure 3 41 Trois fa ons dont deux prot ines peuvent se lier l'une l'autre. Seules les parties en interaction des deux prot ines sont repr sent es. (A) Une surface rigide sur une prot ine peut se lier une boucle tendue de cha ne polypeptidique (une cha ne ) sur une deuxi me prot ine. (B) Deux h lices peuvent se lier ensemble pour former une bobine enroul e. (C) Deux surfaces rigides compl mentaires lient souvent deux prot ines ensemble. Les interactions de liaison peuvent galement impliquer l'appariement de brins (voir, par exemple, la figure 3-18). boucles hypervariables domaine variable de la cha ne l g re (VL) (B) domaine constant de la cha ne l g re (CL) liaison disulfde COOH NH2 S S S S S SS SSSSSSSSSVL CL VH CH1CH1 CH2 CH3 Figure 3 42 une mol cule d'anticorps. Une mol cule d'anticorps typique est en forme de Y et a deux sites de liaison identiques pour son antig ne, un sur chaque bras du Y. Comme expliqu au chapitre 24, la prot ine est compos e de quatre cha nes polypeptidiques (deux cha nes lourdes identiques et deux cha nes l g res identiques et plus petites) maintenues ensemble par des liaisons disulfure. Chaque cha ne est fabriqu e Toutes les prot ines doivent se lier des ligands particuliers pour remplir leurs diverses fonctions. La famille des anticorps se distingue par
Biologie moléculaire de la cellule	sa capacit de liaison serr e et hautement s lective (discut e en d tail au chapitre 24). Les anticorps, ou immunoglobulines, sont des prot ines produites par le syst me immunitaire en r ponse des mol cules trang res, telles que celles la surface d'un micro-organisme envahisseur. Chaque anticorps se lie troitement un mol cule cible particuli re, inactivant ainsi directement la mol cule cible ou la marquant pour destruction. Un anticorps reconna t sa cible (appel e antig ne) avec une sp cificit remarquable. Parce qu'il y a potentiellement des milliards d'antig nes diff rents que les humains pourraient rencontrer, nous devons tre capables de produire des milliards d'anticorps diff rents. Les anticorps sont des mol cules en forme de Y avec deux sites de liaison identiques qui sont compl mentaires une petite partie de la surface de la mol cule d'antig ne. Un examen d taill des sites de liaison l'antig ne des anticorps r v le qu'ils sont form s de plusieurs boucles de cha ne polypeptidique qui d passent des extr mit s d'une paire de domaines prot iques troitement juxtapos s (Figure 3 42). Diff rents anticorps g n rent une norme diversit de sites de liaison l'antig ne en modifiant uniquement la longueur et la s quence d'acides amin s de ces boucles, sans alt rer la structure de base de la prot ine. Les boucles de ce type sont id ales pour saisir d'autres mol cules. Ils permettent un grand nombre de groupes chimiques d'entourer un ligand afin que la prot ine puisse s'y lier avec de nombreuses liaisons faibles. Pour cette raison, les boucles forment souvent les sites de liaison des ligands dans les prot ines. La constante d' quilibre mesure la force de liaison Les mol cules de la cellule se rencontrent tr s fr quemment en raison de leurs mouvements thermiques al atoires continus. Les mol cules en collision dont les surfaces correspondent mal forment peu de liaisons non covalentes les unes avec les autres, et les deux mol cules se dissocient aussi rapidement qu'elles se sont r unies. l'autre extr me, lorsque de nombreuses liaisons non covalentes se forment entre deux mol cules en collision, l'association peut persister pendant tr s longtemps (Figure 3-43). De fortes interactions se produisent dans les cellules chaque fois qu'une fonction biologique exige que les mol cules restent associ es pendant une longue p riode, par exemple, lorsqu'un groupe de mol cules d'ARN et de prot ines s'assemblent pour former une structure subcellulaire telle qu'un ribosome. de plusieurs domaines d'immunoglobulines diff rents, ici ombrag s en bleu ou en gris. Le site de liaison l'antig ne se forme l'endroit o un domaine variable cha ne lourde (VH) et un domaine variable cha ne l g re (VL) se rapprochent. Ce sont les domaines qui diff rent le plus dans leur s quence et leur structure chez diff rents anticorps. l'extr mit de chacun des deux bras de la mol cule d'anticorps, ces deux domaines forment des boucles qui se lient l'antig ne (voir la vid o 24.5). les surfaces des mol cules A et B, et A et C, sont mal assorties et ne sont capables de former que quelques liaisons faibles ; le mouvement thermique les s pare rapidement la mol cule A rencontre au hasard d'autres mol cules (B, C et D) les surfaces des mol cules A et D s'accordent bien et peuvent donc former suffisamment de liaisons faibles pour r sister aux secousses thermiques ; ils Nous pouvons mesurer la force avec laquelle deux mol cules quelconques se lient l'une l'autre. titre d'exemple, consid rons une population de mol cules d'anticorps identiques qui rencontre soudainement une population de ligands diffusant dans le liquide qui les entoure. intervalles fr quents, l'une des mol cules du ligand se heurte au site de liaison d'un anticorps et forme un complexe anticorps-ligand. La population de complexes anticorps-ligand va donc augmenter, mais non sans limite : au fil du temps, un second processus, dans lequel les complexes individuels se brisent en raison du mouvement induit thermiquement, deviendra de plus en plus important. Finalement, toute population de mol cules d'anticorps et de ligands atteindra un tat d' quilibre, ou quilibre, dans lequel le nombre d' v nements de liaison (association) par seconde est pr cis ment gal au nombre d' v nements de dissociation (voir Figure 2-30). partir des concentrations du ligand, de l'anticorps et du complexe anticorps-ligand l' quilibre, nous pouvons calculer une mesure pratique de la force de liaison la constante d' quilibre (K) (Figure 3 44A). Cette constante a t d crite en d tail au chapitre 2, o son lien avec les diff rences d' nergie libre a t d riv (voir p. 62). La constante d' quilibre d'une r action dans laquelle deux mol cules (A et B) se lient les unes aux autres pour former un complexe (AB) a des unit s de litres/mole, et la moiti des sites de liaison seront occup s par un ligand lorsque la concentration de ce ligand (en moles/litre) atteindra une val
Biologie moléculaire de la cellule	eur gale 1/K. Cette constante d' quilibre est d'autant plus grande que la force de liaison est grande, et c'est une mesure directe de la diff rence d' nergie libre entre les tats li et libre (Figure 3-44B). M me un changement reste li l'un l'autre Figure 3 43 Comment les liaisons non covalentes m dient les interactions entre les macromol cules (voir vid o 2.1). Figure 3 44 Relation entre la diff rence d' nergie libre standard ( G ) et la constante d' quilibre (K). (A) L' quilibre entre les mol cules A et B et le complexe AB est maintenu par un quilibre entre les deux r actions oppos es montr es dans les panneaux 1 et 2. Les mol cules A et B doivent entrer en collision pour r agir, et le taux d'association est donc proportionnel au produit de leurs concentrations individuelles [A] [B]. (Les crochets indiquent la concentration.) Comme le montre la planche 3, le rapport des constantes de vitesse pour les r actions d'association et de dissociation est gal la constante d' quilibre (K) pour la r action (voir aussi p. 63). (B) La constante d' quilibre dans le panneau 3 est celle pour la r action A + B AB, et plus sa valeur est grande, plus la liaison entre A et B est forte. Notez que pour chaque diminution de 5,91 kJ/mole de l' nergie libre standard, la constante d' quilibre augmente d'un facteur 10 37 C. La constante d' quilibre ici a des unit s de litres/mole ; pour les interactions de liaison simples, elle est galement appel e constante d'affinit ou constante d'association, not e Ka. L'inverse de Ka est appel dissociation 1 2 3 dissociation AB A + B taux de dissociation = constante de taux de dissociation concentration de AB taux de dissociation = koff [AB] association ABA + B taux d'association = constante de taux d'association concentration de A taux d'association = kon [A] [B] concentration de B L' QUILIBRE : taux d'association = taux de dissociation kon [A] [B] = koff [AB] [A][B] koff [AB] kon = = K = constante d' quilibre constante d' quilibre [A][B] [AB] = K(litres/mole) 1 10 102 103 104 105 106 107 108 109 1010 diff rence d' nergie libre standard de AB moins nergie libre de A + B (kJ/mole) 0 5,9 11,9 17,8 23,7 29,7 35,6 41,5 47,4 53,4 59,4 La relation entre les diff rences d' nergie libre standard ( G ) et les constantes d' quilibre (37 C) (A) (B) constante, Kd (en unit s de moles/litre). de quelques liaisons non covalentes peut avoir un effet frappant sur une interaction de liaison, comme le montre l'exemple de la figure 3-45. (Notez que la constante d' quilibre, telle que d finie ici, est galement connue sous le nom de constante d'association ou d'affinit , Ka.) Nous avons utilis le cas d'un anticorps se liant son ligand pour illustrer l'effet de la force de liaison sur l' tat d' quilibre, mais les m mes principes s'appliquent toute mol cule et son ligand. De nombreuses prot ines sont des enzymes qui, comme nous l'expliquons maintenant, se lient d'abord leurs ligands, puis catalysent la rupture ou la formation de liaisons covalentes dans ces mol cules. De nombreuses prot ines peuvent remplir leur fonction simplement en se liant une autre mol cule. Une mol cule d'actine, par exemple, n'a qu' s'associer d'autres mol cules d'actine pour former un filament. Il existe cependant d'autres prot ines pour lesquelles la liaison des ligands n'est qu'une premi re tape n cessaire leur fonction. C'est le cas de la grande et tr s importante classe de prot ines appel es enzymes. Comme d crit au chapitre 2, les enzymes sont des mol cules remarquables qui provoquent les transformations chimiques qui cr ent et d font les liaisons covalentes dans les cellules. Ils se lient un ou plusieurs ligands, appel s substrats, et les convertissent en un ou plusieurs produits chimiquement modifi s, le faisant encore et encore avec une rapidit tonnante. Les enzymes acc l rent les r actions, souvent d'un facteur d'un million ou plus, sans tre elles-m mes modifi es, c'est- -dire qu'elles agissent comme des catalyseurs qui permettent aux cellules de faire ou de rompre des liaisons covalentes de mani re contr l e. C'est la catalyse d'ensembles organis s de r actions chimiques par des enzymes qui cr e et maintient la cellule, rendant la vie possible. Nous pouvons regrouper les enzymes en classes fonctionnelles qui effectuent des r actions chimiques similaires (Tableau 3-1). Chaque type d'enzyme au sein d'une telle classe est tr s sp cifique, Figure 3 45 De petits changements dans le nombre de liaisons faibles peuvent avoir des effets drastiques sur une interaction de liaison. Cet exemple illustre l'effet dramatique de la pr sence ou de l'absence de quelques liaisons non covalentes faibles dans un contexte biologique. Consid rons 1000 mol cules de A et 1000 mol cules de B dans une cellule eucaryote. La concentration des deux sera d'environ 10 9 M. Si la constante d' quilibre (K ) pour A + B AB est de 1010, alors on peut calculer qu' l' quilibre, il y aura Si la constante
Biologie moléculaire de la cellule	d' quilibre est un peu plus faible 108, ce qui repr sente une perte de 11,9 kilojoules/mole d' nergie de liaison de l'exemple ci-dessus, ou 2 3 liaisons hydrog ne en moins, alors il y aura 270 mol cules A 270 mol cules B 730 mol cules AB 915 mol cules A 915 mol cules B 85 mol cules AB 0,5Vmax ne catalysant qu'un seul type de r action. Ainsi, l'hexokinase ajoute un groupe phosphate au D-glucose mais ignore son isom re optique L-glucose ; L'enzyme de coagulation sanguine thrombine coupe un type de prot ine sanguine entre une arginine particuli re et sa glycine adjacente et nulle part ailleurs, et ainsi de suite. Comme nous l'avons vu en d tail au chapitre 2, les enzymes travaillent en quipe, le produit d'une enzyme devenant le substrat de la suivante. Le r sultat est un r seau labor de voies m taboliques qui fournit de l' nergie la cellule et g n re les nombreuses mol cules grandes et petites dont la cellule a besoin (voir Figure 2-63). La liaison du substrat est la premi re tape de la catalyse enzymatique Pour une prot ine qui catalyse une r action chimique (une enzyme), la liaison de chaque mol cule de substrat la prot ine est un pr lude essentiel. Dans le cas le plus simple, si l'on d signe l'enzyme par E, le substrat par S et le produit par P, le chemin de r action de base est E + S ES EP E + P. Il y a une limite la quantit de substrat qu'une seule mol cule d'enzyme peut traiter dans un temps donn . Bien qu'une augmentation de la concentration du substrat augmente la vitesse laquelle le produit se forme, cette vitesse finit par atteindre une valeur maximale (Figure 3 46). ce stade, la mol cule enzymatique est satur e de substrat, et la vitesse de r action (Vmax) ne d pend que de la rapidit avec laquelle l'enzyme peut traiter la mol cule de substrat. Ce taux maximum divis par la concentration enzymatique est appel le chiffre de renouvellement. Les chiffres de renouvellement sont souvent d'environ 1000 mol cules de substrat trait es par seconde par mol cule enzymatique, bien que des chiffres de renouvellement compris entre 1 et 10 000 soient connus. L'autre param tre cin tique fr quemment utilis pour caract riser une enzyme est son Km, la concentration du substrat qui permet la r action de se d rouler la moiti de sa vitesse maximale (0,5 Vmax) (voir Figure 3 46). Une faible valeur Km signifie que l'enzyme atteint sa vitesse catalytique maximale une faible concentration de substrat et indique g n ralement que l'enzyme se lie tr s troitement son substrat, tandis qu'une valeur Km lev e correspond une liaison faible. Les m thodes utilis es pour caract riser les enzymes de cette mani re sont expliqu es dans le panneau 3-2 (pp. 142-143). Les enzymes atteignent des taux de r action chimique extr mement lev s, des taux bien plus lev s que pour n'importe quel catalyseur synth tique. Il y a plusieurs raisons cette efficacit . Tout d'abord, lorsque deux mol cules doivent r agir, l'enzyme augmente consid rablement la concentration locale de ces deux mol cules de substrat sur le site catalytique, en les maintenant dans la bonne orientation pour la r action qui doit suivre. Plus important encore, cependant, une partie de l' nergie de liaison contribue directement la catalyse. Les mol cules de substrat doivent passer par une s rie d' tats interm diaires de g om trie et de distribution d' lectrons modifi s avant de former les produits ultimes de la r action. L' nergie libre n cessaire pour atteindre l' tat interm diaire le plus instable, appel tat de transition, est connue sous le nom d' nergie d'activation de la r action, et c'est le principal d terminant de la vitesse de r action. Les enzymes ont une affinit beaucoup plus lev e pour l' tat de transition du substrat que pour la forme stable. vitesse de r action Figure 3 46 Cin tique enzymatique. La vitesse d'une r action enzymatique (V) augmente mesure que la concentration du substrat augmente jusqu' ce qu'une valeur maximale (Vmax) soit atteinte. ce stade, tous les sites de liaison au substrat sur les mol cules enzymatiques sont enti rement occup s, et la vitesse de r action est limit e par la vitesse du processus catalytique la surface de l'enzyme. Pour la plupart des enzymes, la concentration du substrat laquelle la vitesse de r action est de moiti - maximal (Km) est une mesure de la force de liaison du substrat, avec une grande valeur de Km correspondant une liaison faible. POURQUOI ANALYSER LA CIN TIQUE DES ENZYMES ? Les enzymes sont les catalyseurs les plus s lectifs et les plus puissants connus. La compr hension de leurs m canismes d taill s fournit un outil essentiel pour la d couverte de nouveaux m dicaments, pour la synth se industrielle grande chelle de produits chimiques utiles et pour appr cier la chimie des cellules et des organismes. Une tude d taill e des taux de r actions chimiques catalys es par une enzyme purifi e plus pr cis ment comment ces taux changent avec des changements
Biologie moléculaire de la cellule	dans des conditions telles que les concentrations de substrats, de produits, d'inhibiteurs et de ligands r gulateurs permet aux biochimistes de d terminer exactement comment chaque enzyme fonctionne. Par exemple, c'est ainsi que les r actions de glycolyse productrices d'ATP, illustr es pr c demment dans les figures 2 48, ont t d chiffr es, ce qui nous permet d'appr cier la raison d' tre de cette voie enzymatique critique. Dans ce panel, nous pr sentons l'important domaine de la cin tique enzymatique, qui a t indispensable pour obtenir une grande partie des connaissances d taill es que nous avons maintenant sur la chimie cellulaire. 142 Panel 3 2 : Quelques-unes des m thodes utilis es pour tudier les enzymes CIN TIQUE ENZYMATIQUE L' TAT STATIONNAIRE De nombreuses enzymes n'ont qu'un seul substrat, qu'elles lient puis traitent pour produire des produits selon le sch ma d crit dans la figure 3-50A. Dans ce cas, la r action s' crit comme Ici, nous avons suppos que la r action inverse, dans laquelle E + P se recombinent pour former EP puis ES, se produit si rarement que nous pouvons l'ignorer. Dans ce cas, il n'est pas n cessaire de repr senter EP, et nous pouvons exprimer la vitesse de la r action, connue sous le nom de vitesse, V, o [ES] est la concentration du complexe enzyme-substrat, et kcat est le nombre de renouvellement, une constante de vitesse dont la valeur est gale au nombre de mol cules de substrat trait es par mol cule d'enzyme chaque seconde. Mais comment la valeur de [ES] se rapporte-t-elle aux concentrations que nous connaissons directement, qui sont la concentration totale de l'enzyme, [Eo], et la concentration du substrat, [S] ? Lorsque l'enzyme et le substrat sont d'abord m lang s, la concentration [ES] augmente rapidement de z ro un niveau dit d' tat stationnaire, comme illustr ci-dessous. E + S E + P ES k1 k 1 kcat V = kcat [ES] cet tat stationnaire, [ES] est presque constant, de sorte que ou, puisque la concentration de l'enzyme libre, [E], est gale [Eo] [ES], en r arrangeant et en d d finissant la constante Km au fur et mesure que nous obtenons ou, en nous souvenant que V = kcat [ES], nous obtenons la c l bre quation de Michaelis-Menten Au fur et mesure que [S] est augment des niveaux de plus en plus lev s, essentiellement toute l'enzyme sera li e au substrat l' tat stationnaire ; ce stade, une vitesse de r action maximale, Vmax , sera atteinte o V = Vmax = kcat [Eo]. Ainsi, il est commode de r crire l' quation de Michaelis-Menten comme suit : taux de formation des ES k1 [E][S], taux de claquage des ES k 1 [ES] + kcat [ES] = k1 k 1 + kcat [ES] = [E][S] = [Eo] [ES] [S] k1 k 1 + kcat k1 k 1 + kcat Km + [S] kcat [Eo][S] [ES] = [eo][S] km + [S] V = km + [S] Vmax [S]V = Un graphique typique de V en fonction de [S] pour une enzyme qui suit la cin tique de Michaelis-Menten est illustr ci-dessous. Sur ce graphique, ni la valeur de Vmax ni celle de Km ne sont imm diatement claires. LA SIGNIFICATION DE Km, kcat et kcat /Km Comme d crit dans le texte, Km est une mesure approximative de l'affnit du substrat pour l'enzyme : elle est num riquement gale la concentration de [S] V = 0,5 Vmax. En g n ral, une valeur inf rieure de Km signifie une liaison de substrat plus serr e. En fait, dans les cas o kcat est beaucoup plus petit que k 1, le Km sera gal Kd, la constante de dissociation pour la liaison du substrat l'enzyme (Kd = 1/Ka ; voir Figure 3 44). Nous avons vu que k cat est le chiffre de renouvellement de l'enzyme. de tr s faibles concentrations de substrat, o 20 0 0 2 4 6 8 40 60 80 [S] mmole/litre Pour obtenir Vmax et Km partir de ces donn es, une double r ciproque [S] << Km, la majeure partie de l'enzyme est libre. Ainsi, nous pouvons penser [E] = [Eo], de sorte que l' quation de Michaelis-Menten devienne V = kcat/Km [E][S]. Ainsi, le rapport kcat/Km est quivalent la constante de vitesse pour la r action entre l'enzyme libre et le substrat libre. Une comparaison de kcat/Km pour la m me enzyme avec des substrats diff rents, ou pour deux enzymes avec leurs substrats diff rents, est largement utilis e comme mesure de l'efficacit enzymatique. Par souci de simplicit , dans ce groupe d'experts, nous avons discut des enzymes qui n'ont qu'un seul substrat, comme l'enzyme lysozyme d crite dans le texte (voir p. 144). La plupart des enzymes ont deux substrats, dont l'un est souvent un vecteur actif CERTAINES ENZYMES SONT LIMIT ES EN DIFFUSION Les valeurs de kcat, Km et kcat /Km pour une mol cule s lectionn e, telle que le NADH ou l'ATP. Une analyse similaire, mais plus complexe, est utilis e pour d terminer la cin tique de ces enzymes, ce qui permet de r v ler l'ordre de liaison du substrat et la pr sence d'interm diaires covalents le long de la voie. est souvent utilis , dans lequel l' quation de Michaelis-Menten a simplement t r arrang e, de sorte que 1/V peut tre trac en fonction de 1/ [S]. 1/V= + 1/ Vmax Km Vmax [S] 1 123468 1
Biologie moléculaire de la cellule	Vmax 0,01 0,02 0,03 0,04 pente = KM / Vmax 1/V (seconde/ mole) Les enzymes sont indiqu es ci-dessous : Parce qu'une enzyme et son substrat doivent entrer en collision avant de pouvoir r agir, kcat /Km a une valeur maximale possible qui est limit e par les taux de collision. Si chaque collision forme un complexe enzyme-substrat, on peut calculer partir de la th orie de la diffusion que kcat /Km sera compris entre 108 et 109 sec 1M 1, dans le cas o toutes les tapes suivantes se d roulent imm diatement. 0,25 0 0,25 0,5 0,75 1,0 0,5 fumarate de fumarase 8x102 5x10 6 1,6x108 catalase H2O2 4x107 1 4x107 ac tylcholinest rase ac tylcholine 1,4 x 104 9 x 10 5 1,6 x 108 substrat enzymatique Kcat (sec 1) kcat/Km (sec 1M 1) Km (M) Ainsi, il est affirm que des enzymes comme l'ac tylcholinest rase et la fumarase de 1 litre/mmole sont des enzymes parfaites , chaque enzyme ayant volu au point que presque chaque collision avec son substrat convertit le substrat en un produit. [S] km Figure 3 47 Acc l ration enzymatique des r actions chimiques en diminuant l' nergie d'activation. Il n'y a qu'un seul tat de transition dans cet exemple. Cependant, souvent, la r action non catalys e (A) et la r action catalys e par une enzyme (B) passent par une s rie d' tats de transition. Dans ce cas, c'est l' tat de transition avec l' nergie la plus lev e (ST et EST) qui d termine l' nergie d'activation et limite la vitesse de la r action. (S = substrat ; P = produit de la r action ; ES = complexe enzyme-substrat ; EP = complexe enzyme-produit.) Parce que cette liaison serr e r duit consid rablement l' nergie de l' tat de transition, l'enzyme acc l re consid rablement une r action particuli re en diminuant l' nergie d'activation requise (Figure 3 47). La figure 3-48 compare les taux de r action spontan e et les taux correspondants catalys s par des enzymes pour cinq enzymes. Les acc l rations de vitesse sont comprises entre 109 et 1023. Les enzymes ne se lient pas seulement troitement un tat de transition, elles contiennent galement des atomes positionn s avec pr cision qui modifient la distribution des lectrons dans les atomes qui participent directement la formation et la rupture des liaisons covalentes. Les liaisons peptidiques, par exemple, peuvent tre hydrolys es en l'absence d'une enzyme en exposant un polypeptide un acide fort ou une base forte. Cependant, les enzymes sont uniques en ce sens qu'elles peuvent utiliser simultan ment la catalyse acide et la catalyse basique, car le cadre rigide de la prot ine contraint les r sidus acides et basiques et les emp che de se combiner les uns avec les autres, comme ils le feraient en solution (Figure 3-49). L'ad quation entre une enzyme et son substrat doit tre pr cise. Un petit changement introduit par le g nie g n tique dans le site actif d'une enzyme peut donc avoir un effet profond. Le remplacement d'un acide glutamique par un acide aspartique dans une enzyme, par exemple, d cale la position de l'ion carboxylate catalytique de seulement 1 (environ le rayon d'un atome d'hydrog ne) ; Pourtant, cela suffit diminuer l'activit de l'enzyme mille fois. Pour d montrer comment les enzymes catalysent les r actions chimiques, nous examinons une enzyme qui agit comme un antibiotique naturel dans le blanc d' uf, la salive, les larmes et d'autres s cr tions. Lysozyme catalyse la coupe des cha nes polysaccharidiques dans les parois cellulaires des bact ries. La cellule bact rienne est sous la pression des forces osmotiques, et la coupure m me d'un petit nombre de ces cha nes provoque la rupture de la paroi cellulaire et l' clatement de la cellule. Prot ine relativement petite et stable qui peut tre facilement isol e en grande quantit , le lysozyme a t la premi re enzyme dont la structure a t d termin e dans les moindres d tails atomiques par cristallographie aux rayons X (au milieu des ann es 1960). La r action que catalyse le lysozyme est une hydrolyse : il ajoute une mol cule d'eau une seule liaison entre deux groupes sucres adjacents dans la cha ne polysaccharide, provoquant ainsi la rupture de la liaison (voir Figure 2-9). La r action est nerg tiquement favorable car l' nergie libre de la cha ne polysaccharidique sectionn e est une progression plus faible de l' nergie d'activation de la r action pour la r action catalys e Figure 3 48 Les acc l rations de vitesse caus es par cinq enzymes diff rentes. (Adapt de A. Radzicka et R. Wolfenden, Science 267:90-93, 1995.) catalyse. (A) Le d but de la r action non catalys e qui hydrolyse une liaison peptidique, avec un ombrage bleu utilis pour indiquer la distribution des lectrons dans l'eau et les liaisons carbonyles. (B) Un acide aime donner un proton (H+) d'autres atomes. En s'appariant avec l'oxyg ne carbonyle, un acide loigne les lectrons du carbone carbonyle, ce qui rend cet atome beaucoup plus attrayant pour l'oxyg ne lectron gatif d'une mol cule d'eau attaquante. (C) Une base aime prendre
Biologie moléculaire de la cellule	H+. En s'appariant l'hydrog ne de la mol cule d'eau attaquante, une base fait que la base catalyse les lectrons vers l'oxyg ne de l'eau, ce qui en fait un meilleur groupe d'attaque pour le carbone carbonyle. (D) En ayant de mani re appropri e que l' nergie libre de la cha ne intacte. Cependant, il existe une barri re d' nergie aux atomes positionn s sa surface, une r action enzymatique et une mol cule d'eau en collision ne peut rompre une liaison reliant deux sucres que si la mol cule de polysaccharide est d form e en une forme particuli re l' tat de transition dans lequel les atomes autour de la liaison ont une g om trie et une distribution d' lectrons modifi es. En raison de cette exigence, les collisions al atoires doivent fournir une tr s grande nergie d'activation pour que la r action ait lieu. Dans une solution aqueuse temp rature ambiante, l' nergie des collisions ne d passe presque jamais l' nergie d'activation. Le polysaccharide pur peut donc rester des ann es dans l'eau sans tre hydrolys un degr d tectable. Cette situation change radicalement lorsque le polysaccharide se lie au lysozyme. Le site actif du lysozyme, parce que son substrat est un polym re, est un long sillon qui contient six sucres li s en m me temps. D s que le polysaccharide se lie pour former un complexe enzyme-substrat, l'enzyme coupe le polysaccharide en ajoutant une mol cule d'eau travers l'une de ses liaisons sucre-sucre. Les cha nes de produits sont ensuite rapidement lib r es, lib rant l'enzyme pour d'autres cycles de r action (Figure 3 50). Une augmentation impressionnante du taux d'hydrolyse est possible parce que des conditions sont cr es dans le microenvironnement du site actif du lysozyme qui r duisent consid rablement l' nergie d'activation n cessaire l'hydrolyse. En particulier, le lysozyme d forme l'un des deux sucres reli s par la liaison rompre de sa conformation normale et la plus stable. Le lien rompre est galement maintenu proximit de deux acides amin s avec des cha nes lat rales acides (un acide glutamique et un acide aspartique) qui participent directement la r action. La figure 3-51 montre les trois tapes centrales de cette r action catalys e par voie enzymatique, qui se produit des millions de fois plus vite que l'hydrolyse non catalys e. D'autres enzymes utilisent des m canismes similaires pour r duire les nergies d'activation et acc l rer les r actions qu'elles catalysent. Dans les r actions impliquant deux r actifs ou plus, le site actif agit galement comme un mod le, ou moule, qui rassemble les substrats dans la bonne orientation pour qu'une r action se produise entre eux (Figure 3 52A). Comme nous l'avons vu pour le lysozyme, le site actif d'une enzyme contient des l ments positionn s avec pr cision qui peuvent effectuer la fois la catalyse acide et la catalyse basique. Figure 3 50 La r action catalys e par le lysozyme. (A) L'enzyme lysozyme (E) catalyse la coupe d'une cha ne polysaccharidique, qui est son substrat (S). L'enzyme se lie d'abord la cha ne pour former un complexe enzyme-substrat (ES), puis catalyse le clivage d'une liaison covalente sp cifique dans le squelette du polysaccharide, formant un complexe enzyme-produit (EP) qui se dissocie rapidement. La lib ration de la cha ne sectionn e (les produits P) laisse l'enzyme libre d'agir sur une autre mol cule de substrat. (B) Un mod le de remplissage d'espace de la mol cule de lysozyme li e une courte longueur de cha ne polysaccharidique avant le clivage (Vid o 3.8). (B, avec la permission de Richard J. Feldmann ; Code PDB : 3AB6.) Ce substrat est un oligosaccharide de six sucres, Les produits fnal sont un oligosaccharide de quatre sucres marqu s de A F. Seuls les sucres D et E sont repr sent s en d tail. ( gauche) et un disaccharide ( droite), produit par hydrolyse. Dans le complexe enzyme-substrat (ES), l'Asp52 a form une liaison covalente entre les forces enzymatiques du sucre D dans une tension de l'enzyme et l'atome de carbone C1 de la conformation du sucre D. Le Glu35 dans l'enzyme est Le Glu35 polarise ensuite une mol cule d'eau (rouge), positionn e pour servir d'acide qui attaque le de sorte que son oxyg ne peut facilement attaquer la liaison sucre-sucre adjacente C1 en donnant un atome de carbone proton et en d pla ant Asp52. (H+) au sucre E ; Asp52 est sur le point d'attaquer l'atome de carbone C1. atomes qui acc l rent une r action en utilisant des groupes charg s pour modifier la distribution des lectrons dans les substrats (Figure 3 52B). Et comme nous l'avons galement vu, lorsqu'un substrat se lie une enzyme, les liaisons dans le substrat sont souvent d form es, modifiant la forme du substrat. Ces changements, ainsi que les forces m caniques, entra nent un substrat vers un tat de transition particulier (Figure 3 52C). Enfin, l'instar du lysozyme, de nombreuses enzymes participent intimement la r action en formant transitoirement une liaison covalente entre le substrat et
Biologie moléculaire de la cellule	une cha ne lat rale de l'enzyme. Les tapes suivantes de la r action r tablissent la cha ne lat rale son tat d'origine, de sorte que l'enzyme reste inchang e apr s la r action (voir galement Figure 2 48). De petites mol cules troitement li es ajoutent des fonctions suppl mentaires aux prot ines Bien que nous ayons soulign la polyvalence des enzymes et des prot ines en g n ral en tant que cha nes d'acides amin s qui remplissent des fonctions remarquables, il existe de nombreux cas o les acides amin s en eux-m mes ne suffisent pas. Tout comme les humains La r action de la mol cule d'eau (rouge) compl te l'hydrolyse et ram ne l'enzyme son tat initial, formant le complexe enzyme-produit (EP) fnal. Figure 3 51 v nements au site actif du lysozyme. Les dessins en haut gauche et en haut droite montrent respectivement le substrat libre et les produits libres, tandis que les trois autres dessins montrent les v nements s quentiels au site actif de l'enzyme. Notez le changement de conformation du sucre D dans le complexe enzyme-substrat ; Ce changement de forme stabilise les tats de transition de type ionique oxocarb nium n cessaires la formation et l'hydrolyse de l'interm diaire covalent illustr dans le panneau du milieu. Il est galement possible qu'un interm diaire d'ion carbonium se forme l' tape 2, mais l'interm diaire covalent montr dans le panneau du milieu a t d tect avec un substrat synth tique (vid o 3.9). (Voir D.J. Vocadlo et al., Nature 412:835-838, 2001.) Figure 3 52 Quelques strat gies g n rales de catalyse enzymatique. (A) L'enzyme de maintien des substrats (A) se lie deux (B) liaison du substrat (C) L'enzyme s' tire ensemble dans un alignement pr cis. (B) Charger les mol cules de substrat et r organiser les enzymes stabilisation du substrat li des interm diaires de r action. les oriente pr cis ment vers les lectrons dans le substrat, la mol cule, le for ant encourager une r action cr er un n gatif partiel vers une transition (C) Appliquer des forces qui d forment les liaisons entre eux et les charges positives se produisent entre eux et l' tat de charges positives pour favoriser un substrat r actionnel pour augmenter le taux d'un particulier qui favorise une r action r actionnelle. utilisent des outils pour am liorer et tendre les capacit s de leurs mains, enzymes et autres prot ines utilisent souvent de petites mol cules non prot iques pour remplir des fonctions qui seraient difficiles ou impossibles faire avec des acides amin s seuls. Ainsi, les enzymes ont souvent une petite mol cule ou un atome m tallique troitement associ leur site actif qui aide leur fonction catalytique. La carboxypeptidase, par exemple, une enzyme qui coupe les cha nes polypeptidiques, porte un ion zinc troitement li dans son site actif. Lors du clivage d'une liaison peptidique par la carboxypeptidase, l'ion zinc forme une liaison transitoire avec l'un des atomes du substrat, facilitant ainsi la r action d'hydrolyse. Dans d'autres enzymes, une petite mol cule organique a un objectif similaire. Ces mol cules organiques sont souvent appel es coenzymes. Un exemple est la biotine, que l'on trouve dans les enzymes qui transf rent un groupe carboxylate (COO-) d'une mol cule une autre (voir Figure 2-40). La biotine participe ces r actions en formant une liaison covalente transitoire avec le groupe -COO- transf rer, tant mieux adapt cette fonction que n'importe lequel des acides amin s utilis s pour fabriquer les prot ines. Parce qu'elle ne peut pas tre synth tis e par l'homme, et doit donc tre apport e en petite quantit dans notre alimentation, la biotine est une vitamine. De nombreuses autres coenzymes sont soit des vitamines, soit des d riv s de vitamines (tableau 3-2). D'autres prot ines n cessitent galement fr quemment des adjuvants sp cifiques petites mol cules pour fonctionner correctement. Ainsi, la rhodopsine, qui est fabriqu e par les cellules photor ceptrices de la r tine, d tecte la lumi re au moyen d'une petite mol cule, r tinienne, int gr e dans la prot ine (Figure 3 53A). Le r tinal, qui est d riv de la vitamine A, change de forme lorsqu'il absorbe un photon de lumi re, et ce changement provoque le d clenchement par la prot ine d'une cascade de r actions enzymatiques qui conduisent finalement un signal lectrique transport vers le cerveau. Figure 3 53 R tinien et h me. (A) La structure de la r tine, la mol cule sensible la lumi re attach e la rhodopsine dans l' il. La structure repr sent e s'isom rise lorsqu'elle absorbe la lumi re. (B) La structure d'un groupe h mique. L'anneau h mique contenant du carbone est rouge et l'atome de fer en son centre est orange. Un groupe h me est troitement li chacune des quatre cha nes polypeptidiques de l'h moglobine, la prot ine porteuse d'oxyg ne dont la structure est illustr e la figure 3-19. Un autre exemple de prot ine avec une portion non prot ique est l'h moglobine (voir Figure 3-19). Chaq
Biologie moléculaire de la cellule	ue mol cule d'h moglobine porte quatre groupes h miques, des mol cules en forme d'anneau avec chacune un seul atome de fer central (Figure 3-53B). L'h me donne l'h moglobine (et au sang) sa couleur rouge. En se liant de mani re r versible l'oxyg ne gazeux par son atome de fer, l'h me permet l'h moglobine de capter l'oxyg ne dans les poumons et de le lib rer dans les tissus. Parfois, ces petites mol cules sont attach es de mani re covalente et permanente leur prot ine, devenant ainsi une partie int grante de la mol cule prot ique elle-m me. Nous verrons au chapitre 10 que les prot ines sont souvent ancr es aux membranes cellulaires par des mol cules lipidiques attach es de mani re covalente. Et les prot ines membranaires expos es la surface de la cellule, ainsi que les prot ines s cr t es l'ext rieur de la cellule, sont souvent modifi es par l'ajout covalent de sucres et d'oligosaccharides. Les complexes multienzymatiques aident augmenter le taux de m tabolisme cellulaire L'efficacit des enzymes dans l'acc l ration des r actions chimiques est cruciale pour le maintien de la vie. Les cellules, en effet, doivent lutter contre les processus in vitables de d composition qui, s'ils sont laiss s sans surveillance, provoquent la descente des macromol cules vers un d sordre de plus en plus grand. Si les taux de r actions souhaitables n' taient pas sup rieurs aux taux de r actions secondaires concurrentes, une cellule mourrait rapidement. Nous pouvons avoir une id e de la vitesse laquelle le m tabolisme cellulaire se d roule en mesurant le taux d'utilisation de l'ATP. Une cellule de mammif re typique retourne (c'est- -dire qu'elle hydrolyse et restaure par phosphorylation) l'ensemble de son pool d'ATP une fois toutes les 1 ou 2 minutes. Pour chaque cellule, ce renouvellement repr sente l'utilisation d'environ 107 mol cules d'ATP par seconde (ou, pour le corps humain, environ 1 gramme d'ATP par minute). Les taux de r actions dans les cellules sont rapides parce que la catalyse enzymatique est si efficace. Certaines enzymes sont devenues si efficaces qu'il n'y a aucune possibilit d'am lioration suppl mentaire. Le facteur qui limite la vitesse de r action n'est plus la vitesse d'action intrins que de l'enzyme ; c'est plut t la fr quence laquelle l'enzyme entre en collision avec son substrat. Une telle r action est dite limit e en diffusion (voir panneau 3-2, pp. 142-143). La quantit de produit produite par une enzyme d pendra de la concentration de l'enzyme et de son substrat. Pour qu'une s quence de r actions se produise extr mement rapidement, chaque interm diaire m tabolique et enzyme impliqu doit tre pr sent en forte concentration. Cependant, tant donn le grand nombre de r actions diff rentes effectu es par une cellule, il y a des limites aux concentrations qui peuvent tre atteintes. En fait, la plupart des m tabolites sont pr sents des concentrations micromolaires (10 6 M), et la plupart des concentrations d'enzymes sont beaucoup plus faibles. Comment est-il donc possible de maintenir des taux m taboliques tr s rapides ? La r ponse r side dans l'organisation spatiale des composants cellulaires. La cellule peut augmenter les vitesses de r action sans augmenter les concentrations de substrat en rassemblant les diff rentes enzymes impliqu es dans une s quence r actionnelle pour former un grand assemblage de prot ines connu sous le nom de complexe multienzymatique (Figure 3-54). Parce que cet assemblage est organis de mani re ce que le produit de l'enzyme A soit transmis directement l'enzyme B, et ainsi de suite, les taux de diffusion n'ont pas besoin d' tre limitants, m me lorsque les concentrations des substrats dans la cellule dans son ensemble sont tr s faibles. Il n'est donc peut- tre pas surprenant que de tels complexes enzymatiques soient tr s courants et qu'ils soient impliqu s dans presque tous les aspects du m tabolisme, y compris les processus g n tiques centraux de l'ADN, de l'ARN et de la synth se des prot ines. En fait, peu d'enzymes dans les cellules eucaryotes se diffusent librement en solution ; Au lieu de cela, la plupart semblent avoir d velopp des sites de liaison qui les concentrent avec d'autres prot ines de fonction apparent e dans des r gions particuli res de la cellule, augmentant ainsi le taux et l'efficacit des r actions qu'elles catalysent (voir p. 331). Les cellules eucaryotes ont encore un autre moyen d'augmenter le taux de r actions m taboliques : utiliser leurs syst mes membranaires intracellulaires. Ces membranes peuvent s parer des substrats particuliers et les enzymes qui agissent sur eux dans le m me compartiment entour d'une membrane, comme le r ticulum endoplasmique ou le noyau cellulaire. Si, par exemple, un compartiment occupe un total de 10 % du volume de TE2 2 2 1 1 4 4 5 21 4 5 3 3 3 domaines enzymatiques (C) (E) (D) etc.5 nm Domaine de terminaison du domaine cylique du transporteur C (TE) PYRUVATE D SHYDROG NASE COMPLEXE D'ACI
Biologie moléculaire de la cellule	DE GRAS SYNTHASE 3 1 20 nm Figure 3 54 Comment les r gions non structur es de la cha ne polypeptidique servant d'attaches permettent aux interm diaires de r action d' tre transmis d'un site actif un autre dans de grands complexes multienzymatiques. (A-C) L'acide gras synthase chez les mammif res. (A) L'emplacement de sept domaines prot iques ayant des activit s diff rentes dans cette prot ine de 270 kilodaltons. Les chiffres font r f rence l'ordre dans lequel chaque domaine enzymatique doit fonctionner pour compl ter chaque tape d'addition deux atomes de carbone. Apr s plusieurs cycles d'addition deux atomes de carbone, le domaine de terminaison lib re le produit final une fois que la longueur souhait e d'acide gras a t synth tis e. (B) La structure de l'enzyme dim rique, avec l'indication de l'emplacement des cinq sites actifs dans un monom re. (C) Comment une attache flexible permet au substrat qui reste li au domaine porteur de l'acyle (rouge) d' tre pass d'un site actif un autre dans chaque monom re, allongeant et modifiant s quentiellement l'interm diaire d'acide gras li (jaune). Les cinq tapes sont r p t es jusqu' ce que la longueur finale de la cha ne d'acides gras ait t synth tis e. (Seules les tapes 1 4 sont illustr es ici.) (D) Plusieurs sous-unit s attach es dans le complexe g ant de pyruvate d shydrog nase (9500 kilodaltons, plus grand qu'un ribosome) qui catalyse la conversion du pyruvate en ac tyl CoA. Comme dans (C), un substrat li de mani re covalente maintenu sur une attache flexible (billes rouges avec substrat jaune) est pass en s rie travers des sites actifs sur des sous-unit s (ici tiquet es de 1 3) pour produire les produits finaux. Ici, la sous-unit 1 catalyse la d carboxylation du pyruvate accompagn e de l'ac tylation r ductrice d'un groupe lipoyle li l'une des boules rouges. La sous-unit 2 transf re ce groupe ac tyle au CoA, formant ainsi l'ac tyl-CoA, et la sous-unit 3 r oxyde le groupe lipoyle pour le pr parer au cycle suivant. Seul un dixi me des sous-unit s tiquet es 1 et 3, attach es au noyau form par la sous-unit 2, sont illustr es ici. Cette r action importante a lieu dans la mitochondrie de mammif re, dans le cadre de la voie qui oxyde les sucres en CO2 et H2O (voir page 82). (A C, adapt de T. Maier et al., Quart. Rev. Biophys. 43:373 422, 2010 ; D, d'apr s J.L.S. Milne et al., J. Biol. Chem. 281:4364 4370, 2006.) la cellule, la concentration de r actifs dans ce compartiment peut tre multipli e par 10 par rapport une cellule avec le m me nombre de mol cules d'enzymes et de substrats, mais sans compartimentation. Les r actions limit es par la vitesse de diffusion peuvent ainsi tre acc l r es d'un facteur 10. La cellule r gule les activit s catalytiques de ses enzymes Une cellule vivante contient des milliers d'enzymes, dont beaucoup fonctionnent en m me temps et dans le m me petit volume du cytosol. Par leur action catalytique, ces enzymes g n rent un r seau complexe de voies m taboliques, chacune compos e de cha nes de r actions chimiques dans lesquelles le produit d'une enzyme devient le substrat de la suivante. Dans ce labyrinthe de voies, il existe de nombreux points de ramification (n uds) o diff rentes enzymes se disputent le m me substrat. Le syst me est complexe (voir la figure 2 63) et les contr les sont labor s sont n cessaires pour r guler le moment et la rapidit avec lesquels chaque r action se produit. La r gulation se produit plusieurs niveaux. un certain niveau, la cellule contr le le nombre de mol cules de chaque enzyme qu'elle fabrique en r gulant l'expression du g ne qui code pour cette enzyme (discut au chapitre 7). La cellule contr le galement les activit s enzymatiques en confinant des ensembles d'enzymes des compartiments subcellulaires particuliers, que ce soit en les enfermant dans un compartiment distinct d limit par une membrane (discut dans les chapitres 12 et 14) ou en les concentrant sur un chafaudage prot ique (voir Figure 3-77). Comme nous l'expliquerons plus loin dans ce chapitre, les enzymes sont galement modifi es de mani re covalente pour contr ler leur activit . Le taux de destruction des prot ines par prot olyse cibl e repr sente encore un autre m canisme de r gulation important (voir Figure 6-86). Mais le processus le plus g n ral qui ajuste les vitesses de r action fonctionne par un changement direct et r versible de l'activit d'une enzyme en r ponse aux petites mol cules sp cifiques qu'elle lie. Le type de contr le le plus courant se produit lorsqu'une enzyme lie une mol cule qui n'est pas un substrat un site r gulateur sp cial l'ext rieur du site actif, modifiant ainsi la vitesse laquelle l'enzyme convertit ses substrats en produits. Par exemple, dans le cas de l'inhibition par r troaction, un produit produit un stade avanc dans une voie r actionnelle inhibe une enzyme qui agit plus t t dans la voie. Ainsi, chaque fois que de grandes quantit s du produit final c
Biologie moléculaire de la cellule	ommencent s'accumuler, ce produit se lie l'enzyme et ralentit son action catalytique, limitant ainsi l'entr e ult rieure des substrats dans cette voie r actionnelle (Figure 3 55). Lorsque les voies se ramifient ou se croisent, il y a g n ralement plusieurs points de contr le par diff rents produits finaux, chacun d'entre eux travaillant r guler sa propre synth se (Figure 3 56). L'inhibition par r troaction peut fonctionner presque instantan ment, et elle est rapidement invers e lorsque le niveau du produit baisse. Figure 3 55 Inhibition par r troaction d'une seule voie de biosynth se. Le produit final Z inhibe la premi re enzyme qui est unique sa synth se et contr le ainsi son propre niveau dans la cellule. Il s'agit d'un exemple de r glementation n gative. Figure 3 56 Inhibition r troaction multiple. Dans cet exemple, qui montre les voies de biosynth se de quatre acides amin s diff rents chez les bact ries, les lignes rouges indiquent les positions auxquelles les produits se r alimentent pour inhiber les enzymes. Chaque acide amin contr le la premi re enzyme sp cifique sa propre synth se, contr lant ainsi ses propres niveaux et vitant une accumulation inutile, voire dangereuse, d'interm diaires. Les produits peuvent galement inhiber s par ment l'ensemble initial de r actions communes toutes les synth ses ; Dans ce cas, trois enzymes diff rentes catalysent la r action initiale, chacune inhib e par un produit diff rent. L'inhibition de la r troaction est une r gulation n gative : elle emp che une enzyme d'agir. Les enzymes peuvent galement tre soumises une r gulation positive, dans laquelle une mol cule r gulatrice stimule l'activit de l'enzyme plut t que de l'arr ter. La r gulation positive se produit lorsqu'un produit dans une branche du r seau m tabolique stimule l'activit d'une enzyme dans une autre voie. titre d'exemple, l'accumulation d'ADP active plusieurs enzymes impliqu es dans l'oxydation des mol cules de sucre, stimulant ainsi la cellule convertir plus d'ADP en ATP. Une caract ristique frappante de la r gulation par r troaction positive et n gative est que la mol cule r gulatrice a souvent une forme totalement diff rente de la forme du substrat de l'enzyme. C'est pourquoi l'effet sur une prot ine est appel allost rie (des mots grecs allos, qui signifie autre , et stereos, qui signifie solide ou tridimensionnel ). Au fur et mesure que les biologistes en apprenaient davantage sur la r gulation de la r troaction, ils ont reconnu que les enzymes impliqu es devaient avoir au moins deux sites de liaison diff rents leur surface : un site actif qui reconna t les substrats et un site r gulateur qui reconna t une mol cule r gulatrice. Ces deux sites doivent communiquer d'une mani re ou d'une autre afin que les v nements catalytiques au site actif puissent tre influenc s par la liaison de la mol cule r gulatrice son site s par la surface de la prot ine. On sait maintenant que l'interaction entre des sites s par s sur une mol cule de prot ine d pend d'une Changement de conformation de la prot ine : la liaison l'un des sites provoque un passage d'une forme pli e une forme pli e l g rement diff rente. Lors de l'inhibition par r troaction, par exemple, la liaison d'un inhibiteur un site de la prot ine provoque le d placement de la prot ine vers une conformation qui incapacite son site actif situ ailleurs dans la prot ine. On pense que la plupart des mol cules de prot ines sont allost riques. Ils peuvent adopter deux ou plusieurs conformations l g rement diff rentes, et un d placement de l'une l'autre caus par la liaison d'un ligand peut modifier leur activit . Cela est vrai non seulement pour les enzymes, mais aussi pour de nombreuses autres prot ines, y compris les r cepteurs, les prot ines structurelles et les prot ines motrices. Dans tous les cas de r gulation allost rique, chaque conformation de la prot ine a des contours de surface quelque peu diff rents, et les sites de liaison de la prot ine pour les ligands sont modifi s lorsque la prot ine change de forme. De plus, comme nous le verrons plus loin, chaque ligand stabilisera la conformation laquelle il se lie le plus fortement, et donc, des concentrations suffisamment lev es, aura tendance basculer la prot ine vers la conformation que le ligand pr f re. Les effets de la liaison du ligand sur une prot ine d coulent d'un principe chimique fondamental connu sous le nom de liaison. Supposons, par exemple, qu'une prot ine qui se lie au glucose se lie galement une autre mol cule, X, un endroit loign de la surface de la prot ine. Si le site de liaison de X change de forme dans le cadre du changement de conformation de la prot ine induit par la liaison du glucose, les sites de liaison de X et du glucose sont dits coupl s. Chaque fois que deux ligands pr f rent se lier la m me conformation d'une prot ine allost rique, il d coule des principes thermodynamiques de base que chaque
Biologie moléculaire de la cellule	ligand doit augmenter l'affinit de la prot ine pour l'autre. Par exemple, si le d placement d'une prot ine vers une conformation qui lie le mieux le glucose fait galement en sorte que le site de liaison de X s'adapte mieux X, alors la prot ine liera le glucose plus troitement lorsque X est pr sent que lorsque X est absent. En d'autres termes, X r gulera positivement la liaison du glucose par la prot ine (Figure 3-57). l'inverse, la liaison fonctionne de mani re n gative si deux ligands pr f rent se lier des conformations diff rentes de la m me prot ine. Dans ce cas, la liaison du premier ligand d courage la liaison du deuxi me ligand. Ainsi, si un changement de forme caus par la liaison au glucose diminue l'affinit d'une prot ine pour la mol cule X, la liaison de X doit galement diminuer l'affinit de la prot ine pour le glucose (Figure 3 58). La relation de liaison est quantitativement r ciproque, de sorte que, par exemple, si le glucose a un effet tr s important sur la liaison de X, X a un effet tr s important sur la liaison du glucose. Les relations illustr es dans les figures 3-57 et 3-58 s'appliquent toutes les prot ines et sont la base de toute la biologie cellulaire. Le principe semble si vident r trospectivement que nous le tenons maintenant pour acquis. Mais la d couverte de la liaison dans l' tude de quelques enzymes dans les ann es 1950, suivie d'une analyse approfondie des m canismes allost riques dans les prot ines au d but des ann es 1960, a eu un effet r volutionnaire sur notre compr hension de la biologie. tant donn que la mol cule X dans ces exemples se lie un site de l'enzyme qui est distinct du site o la catalyse se produit, elle n'a pas besoin d'avoir de relation chimique avec le substrat qui se lie au site actif. De plus, comme nous venons de le voir, pour les enzymes qui sont r gul es de cette mani re, la mol cule X peut soit activer l'enzyme (r gulation positive), soit l' teindre (r gulation n gative). Par un tel m canisme, les prot ines allost riques servent d'interrupteurs g n raux qui, en principe, peuvent permettre une mol cule d'une cellule d'affecter le destin de n'importe quelle autre. Une enzyme sous-unit unique r gul e par une r troaction n gative peut tout au plus diminuer de 90 % environ 10 % de son activit en r ponse une augmentation de 100 fois de la concentration d'un ligand inhibiteur qu'elle lie (Figure 3-59, ligne rouge). Les r ponses de ce type ne sont apparemment pas assez nettes pour une r gulation cellulaire optimale, et la plupart des enzymes qui sont activ es ou d sactiv es par la liaison des ligands sont constitu es d'assemblages sym triques de sous-unit s identiques. Avec cet arrangement, la liaison d'une mol cule de ligand un seul site sur une sous-unit peut favoriser un changement allost rique dans l'ensemble de l'assemblage qui aide les sous-unit s voisines se lier au m me ligand. En cons quence, une transition allost rique coop rative se produit (figure 3-59, ligne bleue), permettant Figure 3 57 R gulation positive caus e par le couplage conformationnel entre deux sites de liaison distincts. Dans cet exemple, le glucose et la mol cule X se lient le mieux la conformation ferm e d'une prot ine deux Domaines. Parce que le glucose et la mol cule X conduisent tous deux la prot ine vers sa conformation ferm e, chaque ligand aide l'autre se lier. On dit donc que le glucose et la mol cule X se lient en coop ration la prot ine. Figure 3 58 R gulation n gative caus e par le couplage conformationnel entre deux sites de liaison distincts. Le sch ma ici ressemble celui de la figure pr c dente, mais ici la mol cule X pr f re la conformation ouverte, tandis que le glucose pr f re la conformation ferm e. Parce que le glucose et la mol cule X conduisent la prot ine vers des conformations oppos es (ferm e et ouverte, respectivement), la pr sence de l'un des ligands interf re avec la liaison de l'autre. un changement relativement faible de la concentration du ligand dans la cellule pour faire passer l'ensemble d'une conformation presque enti rement active une conformation presque enti rement inactive (ou vice versa). Les principes d'une transition coop rative tout ou rien sont les m mes pour toutes les prot ines, qu'elles soient enzymes ou non. Ainsi, par exemple, ils sont essentiels l'absorption et la lib ration efficaces de l'O2 par l'h moglobine dans notre sang. Mais ils sont peut- tre plus faciles visualiser pour une enzyme qui forme un dim re sym trique. Dans l'exemple de la figure 3-60, la premi re mol cule d'un ligand inhibiteur se lie avec beaucoup de difficult car sa liaison perturbe une interaction nerg tiquement favorable entre les deux monom res identiques dans le dim re. Cependant, une deuxi me mol cule de ligand inhibiteur se lie maintenant plus facilement, car sa liaison r tablit les contacts monom re-monom re nerg tiquement favorables d'un dim re sym trique (cela inactive galement compl t
Biologie moléculaire de la cellule	ement l'enzyme). Comme alternative ce mod le d'ajustement induit pour une transition allost rique coop rative, nous pouvons consid rer qu'une telle enzyme sym trique n'a que deux conformations possibles, correspondant aux structures enzyme activ e et enzyme d sactiv e de la figure 3-60. Dans cette perspective, la liaison des ligands perturbe un quilibre tout ou rien entre ces deux tats, modifiant ainsi la proportion de mol cules actives. Les deux mod les repr sentent des concepts vrais et utiles. Les prot ines sont r gul es par plus que la liaison r versible d'autres mol cules. Une deuxi me m thode que les cellules eucaryotes utilisent largement pour r guler la fonction d'une prot ine est l'ajout covalent d'une mol cule plus petite une ou plusieurs de ses cha nes lat rales d'acides amin s. La modification r glementaire la plus courante chez les eucaryotes sup rieurs est l'ajout d'un groupe phosphate. Nous utiliserons donc la phosphorylation des prot ines pour illustrer certains des principes g n raux impliqu s dans le contr le de la fonction des prot ines par la modification des cha nes lat rales des acides amin s. Un v nement de phosphorylation peut affecter la prot ine qui est modifi e de trois mani res importantes. Tout d'abord, parce que chaque groupe phosphate porte deux charges n gatives, l'ajout catalys par une enzyme d'un groupe phosphate une prot ine peut provoquer un changement conformationnel majeur de la prot ine en attirant par exemple un groupe de cha nes lat rales d'acides amin s charg es positivement. Cela peut, son tour, affecter la liaison des ligands ailleurs la surface de la prot ine, modifiant consid rablement la Figure 3 60 : une transition allost rique coop rative dans une enzyme compos e de deux sous-unit s identiques. Ce sch ma illustre comment la conformation d'une sous-unit peut influencer celle de sa voisine. La liaison d'une seule mol cule d'un ligand inhibiteur (jaune) une sous-unit de l'enzyme se produit difficilement car elle modifie la conformation de cette sous-unit et perturbe ainsi la sym trie de l'enzyme. Cependant, une fois que ce changement de conformation s'est produit, l' nergie gagn e en r tablissant l'interaction d'appariement sym trique entre les deux sous-unit s rend particuli rement facile pour la deuxi me sous-unit de se lier au ligand inhibiteur et de subir le m me changement de conformation. Parce que la liaison de la premi re mol cule du ligand augmente l'affinit avec laquelle l'autre sous-unit se lie au m me ligand, la r ponse de l'enzyme aux changements de concentration du ligand est beaucoup plus raide que la r ponse d'une enzyme avec une seule sous-unit (voir Figure 3-59 et Vid o 3.10). Figure 3-59 Activit enzymatique en fonction de la concentration du ligand inhibiteur pour les enzymes allost riques mono-sous-unitaires et multisous-unitaires. Pour une enzyme avec une seule sous-unit (ligne rouge), une chute de 90 % d'activit enzymatique 10 % d'activit (indiqu e par les deux points sur la courbe) n cessite une augmentation de 100 fois de la concentration de l'inhibiteur. L'activit enzymatique est calcul e partir de la relation d' quilibre simple K = [IP]/[I][P], o P est la prot ine active, I est l'inhibiteur et IP est la prot ine inactive li e l'inhibiteur. Une courbe identique s'applique toute interaction de liaison simple entre deux mol cules, A et B. En revanche, une enzyme allost rique multisous-unitaire peut r pondre de mani re interruptive un changement de concentration du ligand : la r ponse abrupte est caus e par une liaison coop rative des mol cules de ligand, comme expliqu dans la figure 3-60. Ici, la ligne verte repr sente le r sultat id alis attendu pour la liaison coop rative de deux mol cules de ligand inhibitrices une enzyme allost rique deux sous-unit s, et la ligne bleue montre la r ponse id alis e d'une enzyme quatre sous-unit s. Comme l'indiquent les deux points sur chacune de ces courbes, les enzymes les plus complexes chutent de 90 % 10 % de leur activit sur une plage de concentration d'inhibiteurs beaucoup plus troite que l'enzyme compos e d'une seule sous-unit . l'activit des prot ines. Lorsqu'une deuxi me enzyme limine le groupe phosphate, la prot ine retrouve sa conformation d'origine et restaure son activit initiale. Deuxi mement, un groupe phosphate attach peut faire partie d'une structure que les sites de liaison d'autres prot ines reconnaissent. Comme nous l'avons vu pr c demment, le domaine SH2 se lie une courte s quence peptidique contenant une cha ne lat rale de tyrosine phosphoryl e (voir Figure 3-40B). Plus de dix autres domaines communs fournissent des sites de liaison pour attacher leur prot ine des peptides phosphoryl s dans d'autres mol cules prot iques, chacun reconnaissant une cha ne lat rale d'acides amin s phosphoryl s dans un contexte prot ique diff rent. Troisi mement, l'ajout d'un groupe phosphate peut masquer un site de liaison qui main
Biologie moléculaire de la cellule	tient autrement deux prot ines ensemble, et ainsi perturber les interactions prot ine-prot ine. En cons quence, la phosphorylation et la d phosphorylation des prot ines entra nent tr s souvent l'assemblage et le d sassemblage r gul s des complexes prot iques (voir, par exemple, la figure 15-11). La phosphorylation r versible des prot ines contr le l'activit , la structure et la localisation cellulaire des deux enzymes et de nombreux autres types de prot ines dans les cellules eucaryotes. En fait, cette r gulation est si tendue que plus d'un tiers des quelque 10 000 prot ines d'une cellule de mammif re typique sont cens es tre phosphoryl es un moment donn , beaucoup avec plus d'un phosphate. Comme on pouvait s'y attendre, l'ajout et l' limination de groupes phosphate de prot ines sp cifiques se produisent souvent en r ponse des signaux qui sp cifient un changement dans l' tat d'une cellule. Par exemple, la s rie complexe d' v nements qui se produit lorsqu'une cellule eucaryote se divise est en grande partie chronom tr e de cette mani re (discut e au chapitre 17), et de nombreux signaux m diant les interactions cellule-cellule sont relay s de la membrane plasmique au noyau par une cascade d' v nements de phosphorylation des prot ines (discut s au chapitre 15). Une cellule eucaryote contient une grande collection de prot ines kinases et de prot ines phosphatases La phosphorylation des prot ines implique le transfert catalys par une enzyme du groupe phosphate terminal d'une mol cule d'ATP au groupe hydroxyle sur une cha ne lat rale s rine, thr onine ou tyrosine de la prot ine (Figure 3-61). Une prot ine kinase catalyse cette r action, et la r action est essentiellement unidirectionnelle en raison de la grande quantit d' nergie libre lib r e lorsque la liaison phosphate-phosphate de l'ATP est rompue pour produire de l'ADP (discut au chapitre 2). Une prot ine phosphatase catalyse la r action inverse de l' limination du phosphate, ou d phosphorylation. Les cellules contiennent des centaines de prot ines kinases diff rentes, chacune responsable de la phosphorylation d'une prot ine ou d'un ensemble de prot ines diff rent. Il existe galement de nombreuses prot ines phosphatases diff rentes ; Certaines sont tr s sp cifiques et n' liminent les groupes phosphate que d'une ou de quelques prot ines, tandis que d'autres agissent sur une large gamme de prot ines et sont cibl es sur des substrats sp cifiques par des sous-unit s r gulatrices. L' tat de phosphorylation d'une prot ine tout moment, et donc son activit , d pend des activit s relatives des prot ines kinases et phosphatases qui la modifient. Les prot ines kinases qui phosphorylent les prot ines dans les cellules eucaryotes appartiennent une tr s grande famille d'enzymes qui partagent une s quence catalytique (kinase) d'environ 290 acides amin s. Les diff rents membres de la famille contiennent diff rentes s quences d'acides amin s chaque extr mit de la s quence kinase (par exemple, voir la figure 3-10), et ont souvent de courtes s quences d'acides amin s ins r es dans des boucles l'int rieur de celle-ci. Certaines de ces s quences d'acides amin s suppl mentaires permettent chaque kinase de reconna tre l'ensemble sp cifique de prot ines qu'elle phosphoryle ou de se lier des structures qui la localisent dans des r gions sp cifiques de la cellule. D'autres parties de la prot ine r gulent l'activit de chaque kinase, de sorte qu'elle peut tre activ e et d sactiv e en r ponse diff rents signaux sp cifiques, comme d crit ci-dessous. En comparant le nombre de diff rences de s quence d'acides amin s entre les diff rents membres d'une famille de prot ines, nous pouvons construire un arbre volutif qui est cens refl ter le mod le de duplication et de divergence des g nes qui a donn naissance la famille. La figure 3-62 montre un arbre volutif des prot ines kinases. Les kinases ayant des fonctions connexes sont souvent situ es sur les branches voisines de l'arbre : les prot ines kinases impliqu es dans la signalisation cellulaire qui phosphorylent les cha nes lat rales de tyrosine, par exemple, sont toutes regroup es dans le coin sup rieur gauche de l'arbre. Les autres kinases montr es Figure 3 61 Phosphorylation des prot ines. Plusieurs milliers de prot ines d'une cellule eucaryote typique sont modifi es par l'addition covalente d'un groupe phosphate. (A) La r action g n rale transf re un groupe phosphate de l'ATP une cha ne lat rale d'acides amin s de la prot ine cible par une prot ine kinase. L' limination du groupe phosphate est catalys e par une deuxi me enzyme, une prot ine phosphatase. Dans cet exemple, le phosphate est ajout une cha ne lat rale de s rine ; dans d'autres cas, le phosphate est plut t li au groupe -OH d'une thr onine ou d'une tyrosine dans la prot ine. (B) La phosphorylation d'une prot ine par une prot ine kinase peut augmenter ou diminuer l'activit de la prot ine, en fonction du site de phosphorylation et
Biologie moléculaire de la cellule	de la structure de la prot ine. phosphoryler une cha ne lat rale de s rine ou de thr onine, et beaucoup sont organis s en grappes qui semblent refl ter leur fonction dans la transduction du signal transmembranaire, l'amplification du signal intracellulaire, le contr le du cycle cellulaire, etc. En raison de l'activit combin e des prot ines kinases et des prot ines phosphatases, les groupes phosphate des prot ines se renouvellent continuellement, tant ajout s puis rapidement limin s. De tels cycles de phosphorylation peuvent sembler inutiles, mais ils sont importants pour permettre aux prot ines phosphoryl es de passer rapidement d'un tat un autre : plus le cycle est rapide, plus une population de mol cules prot iques peut changer rapidement son tat de phosphorylation en r ponse un changement soudain de son taux de phosphorylation (voir Figure 15-14). L' nergie n cessaire pour piloter ce cycle de phosphorylation est d riv e de l' nergie libre de l'hydrolyse de l'ATP, dont une mol cule est consomm e pour chaque v nement de phosphorylation. La r gulation de la prot ine kinase Src r v le comment une prot ine peut fonctionner comme un microprocesseur Les centaines de prot ines kinases diff rentes d'une cellule eucaryote sont organis es en r seaux complexes de voies de signalisation qui aident coordonner les activit s de la cellule, piloter le cycle cellulaire et relayer les signaux dans la cellule partir de l'environnement de la cellule. De nombreux signaux extracellulaires impliqu s doivent tre la fois int gr s et amplifi s par la cellule. Les prot ines kinases individuelles (et d'autres prot ines de signalisation) servent de dispositifs d'entr e-sortie, ou microprocesseurs , dans le processus d'int gration. Une partie importante de l'apport ces prot ines de traitement du signal provient du contr le exerc par les phosphates ajout s et limin s par les prot ines kinases et les prot ines phosphatases, respectivement. La famille des prot ines kinases Src (voir Figure 3-10) pr sente un tel comportement. La prot ine Src (prononc e sarc et nomm e d'apr s le type de tumeur, un sarcome, que sa d r gulation peut provoquer) a t la premi re tyrosine kinase tre d couverte. On sait maintenant qu'il fait partie d'une sous-famille de neuf prot ines kinases tr s similaires, que l'on ne trouve que chez les animaux multicellulaires. Comme l'indique l'arbre volutif de la figure 3-62, les comparaisons de s quences sugg rent que les tyrosine kinases en tant que groupe taient une innovation relativement tardive qui s'est ramifi e partir des s rine/thr onine kinases, la sous-famille Src n' tant qu'un sous-groupe des tyrosine kinases cr es de cette mani re. La prot ine Src et ses parents contiennent une courte r gion N-terminale qui devient li e de mani re covalente un acide gras fortement hydrophobe, qui ancre la kinase la face cytoplasmique de la membrane plasmique. Ensuite, le long de la suite lin aire de Figure 3 62 : un arbre volutif de prot ines kinases s lectionn es. Une cellule eucaryote sup rieure contient des centaines de ces enzymes, et le g nome humain code pour plus de 500. Notez que seules quelques-unes d'entre elles, celles dont il est question dans ce livre, sont pr sent es. Figure 3 64 L'activation d'une prot ine kinase de type Src par deux v nements s quentiels. Comme d crit dans le texte, la n cessit de plusieurs v nements en amont pour d clencher ces processus permet la kinase de servir d'int grateur de signal (vid o 3.11). (Adapt de S.C. Harrison et al., Cell 112:737 740, 2003. Avec l'autorisation d'Elsevier.) Figure 3 65 Comment une prot ine kinase de type Src agit comme un dispositif d'int gration de signal. Une perturbation de l'interaction inhibitrice illustr e pour le domaine SH3 (vert) se produit lorsque sa liaison la r gion de liaison orange indiqu e est remplac e par sa liaison de plus haute affinit un ligand activateur. changement qui inactive la prot ine. La structure tridimensionnelle d'un membre prototypique de cette famille, la GTPase monom re appel e Ras, est illustr e aux figures 3 67. La prot ine Ras joue un r le important dans la signalisation cellulaire (voir le chapitre 15). Dans sa forme li e au GTP, il est actif et stimule une cascade de phosphorylations de prot ines dans la cellule. La plupart du temps, cependant, la prot ine est dans sa forme inactive, li e au GDP. Il devient actif lorsqu'il change son GDP contre une mol cule de GTP en r ponse des signaux extracellulaires, tels que des facteurs de croissance, qui se lient aux r cepteurs de la membrane plasmique (voir Figure 15-47). Les prot ines r gulatrices GAP et GEF contr lent l'activit des prot ines de liaison au GTP en d terminant si le GTP ou le GDP est li Les prot ines de liaison au GTP sont contr l es par des prot ines r gulatrices qui d terminent si le GTP ou le GDP est li , tout comme les prot ines phosphoryl es sont activ es et d sactiv es par les prot i
Biologie moléculaire de la cellule	nes kinases et les prot ines phosphatases. Ainsi, Ras est inactiv par une prot ine activatrice de la GTPase (GAP), qui se lie la prot ine Ras et induit Ras hydrolyser sa mol cule GTP li e au GDP, qui reste troitement li , et au phosphate inorganique (Pi), qui est rapidement lib r . La prot ine Ras reste dans sa conformation inactive, li e au GDP, jusqu' ce qu'elle rencontre un facteur d' change nucl otidique (GEF) de guanine, qui se lie GDP-Ras et provoque la lib ration de son GDP. Parce que le site de liaison nucl otidique vide est imm diatement rempli par une mol cule GTP (le GTP est pr sent en grand exc s par rapport au GDP dans les cellules), le GEF active Ras en rajoutant indirectement le phosphate limin par l'hydrolyse du GTP. Ainsi, dans un sens, les r les de GAP et de GEF sont analogues ceux d'une prot ine phosphatase et d'une prot ine kinase, respectivement (Figure 3-68). Les prot ines peuvent tre r gul es par l'ajout covalent d'autres prot ines Les cellules contiennent une famille sp ciale de petites prot ines dont les membres sont attach s de mani re covalente de nombreuses autres prot ines pour d terminer l'activit ou le destin de la deuxi me prot ine. Dans chaque cas, l'extr mit carboxyle de la petite prot ine est li e au groupe amino d'une cha ne lat rale de lysine d'une prot ine cible par une liaison isopeptidique. La premi re prot ine de ce type d couverte, et la plus abondamment utilis e, est l'ubiquitine (Figure 3 69A). L'ubiquitine peut tre attach e de mani re covalente aux prot ines cibles de diverses mani res, chacune ayant une signification diff rente pour les cellules. La forme principale d'addition d'ubiquitine produit des cha nes de polyubiquitine dans lesquelles, une fois que la premi re mol cule d'ubiquitine est attach e la cible, chaque mol cule d'ubiquitine suivante se lie Lys48 de l'ubiquitine pr c dente, cr ant une cha ne d'ubiquitines li es Lys48 qui sont attach es une seule cha ne lat rale de lysine de la prot ine cible. Cette forme de polyubiquitine dirige la prot ine cible vers l'int rieur d'un prot asome, o elle est dig r e en petits peptides (voir Figure 6-84). Dans d'autres circonstances, seulement Des mol cules uniques d'ubiquitine sont ajout es aux prot ines. De plus, certaines prot ines cibles ont t perturb es ? Ce phosphate a-t-il t ajout ? Ce phosphate a-t-il t limin ? P P L'activit de la prot ine kinase de type src ne s'active compl tement que si les r ponses toutes les questions ci-dessus sont oui Figure 3 66 Prot ines de liaison au GTP en tant qu'interrupteurs mol culaires. L'activit d'une prot ine de liaison au GTP ( galement appel e GTPase) n cessite g n ralement la pr sence d'une mol cule GTP troitement li e (switch on ). L'hydrolyse de cette mol cule GTP par la prot ine de liaison au GTP produit du GDP et du phosphate inorganique (Pi), et elle provoque la conversion de la prot ine en une conformation diff rente, g n ralement inactive (arr t off ). La r initialisation du changement n cessite que le PIB troitement li se dissocie. Il s'agit d'une tape lente qui est grandement acc l r e par des signaux sp cifiques ; une fois le PIB dissoci , une mol cule de GTP rebondit rapidement. modifi avec un autre type de cha ne de polyubiquitine. Ces modifications ont des cons quences fonctionnelles diff rentes pour la prot ine cibl e (Figure 3-69B). Des structures apparent es sont cr es lorsqu'un membre diff rent de la famille de l'ubiquitine, tel que SUMO (petit modificateur li l'ubiquitine), est attach de mani re covalente une cha ne lat rale de lysine de prot ines cibles. Il n'est pas surprenant que toutes ces modifications soient r versibles. Les cellules contiennent des ensembles d'enzymes ubiquitylantes et d subiquitylantes (et sumoylantes et d sumoylantes) qui manipulent ces adduits covalents, jouant ainsi des r les analogues aux prot ines kinases et phosphatases qui ajoutent et liminent les phosphates des cha nes lat rales prot iques. Un syst me labor de conjugaison de l'ubiquitine est utilis pour marquer les prot ines Comment les cellules s lectionnent-elles les prot ines cibles pour l'ajout d'ubiquitine ? Dans un premier temps, l'extr mit carboxyle de l'ubiquitine doit tre activ e. Cette activation est accomplie lorsqu'une prot ine appel e enzyme activatrice de l'ubiquitine (E1) utilise l' nergie d'hydrolyse de l'ATP pour se fixer l'ubiquitine elle-m me par le biais d'une liaison covalente haute nergie (un thioester). E1 transmet ensuite cette ubiquitine activ e l'une des enzymes conjugu es l'ubiquitine (E2), chacune agissant en conjonction avec un ensemble de prot ines accessoires (E3) appel es ubiquitine ligases. Il existe environ 30 enzymes E2 structurellement similaires mais distinctes chez les mammif res, et des centaines de prot ines E3 diff rentes qui forment des complexes avec des enzymes E2 sp cifiques. La figure 3-70 illustre le processus utilis pour marquer les p
Biologie moléculaire de la cellule	rot ines pour la d gradation prot asomale. [Des m canismes similaires sont utilis s pour attacher l'ubiquitine (et SUMO) d'autres types de prot ines cibles.] Ici, l'ubiquitine ligase se lie des signaux de d gradation sp cifiques, appel s degrons, dans les substrats prot iques, aidant ainsi E2 former une cha ne de polyubiquitine li e une lysine de la prot ine du substrat. Cette cha ne de polyubiquitine sur une prot ine cible sera ensuite reconnue par un r cepteur sp cifique dans le prot asome, provoquant la destruction de la prot ine cible. Des ubiquitines ligases distinctes reconnaissent diff rents signaux de d gradation, ciblant ainsi des sous-ensembles distincts de prot ines intracellulaires pour la destruction, souvent en r ponse des signaux sp cifiques (voir Figure 6-86). Figure 3 67 La structure de la prot ine Ras dans sa forme li e au GTP. Cette GTPase monom re illustre la structure d'un domaine de liaison au GTP, qui est pr sent dans une grande famille de prot ines de liaison au GTP. Les r gions rouges changent de conformation lorsque la mol cule GTP est hydrolys e en GDP et en phosphate inorganique par la prot ine ; le GDP reste li la prot ine, tandis que le phosphate inorganique est lib r . Le r le particulier de l' h lice de commutation dans les prot ines li es Ras est expliqu dans le texte (voir Figure 3-72 et Vid o 15.7). Figure 3-68 : comparaison de deux principaux m canismes de signalisation intracellulaire dans les cellules eucaryotes. Dans les deux cas, une prot ine de signalisation est activ e par l'ajout d'un groupe phosphate et inactiv e par l' limination de ce phosphate. Notez que l'ajout d'un phosphate une prot ine peut galement tre inhibiteur. (Adapt de E.R. Kantrowitz et W.N. Lipscomb, Trends Biochem. Sci. 15:53-59, 1990.) Les complexes prot iques avec des parties interchangeables utilisent efficacement l'information g n tique L'ubiquitine ligase SCF est un complexe prot ique qui se lie diff rentes prot ines cibles diff rents moments du cycle cellulaire, ajoutant de mani re covalente des cha nes polypeptidiques de polyubiquitine ces cibles. Sa structure en forme de C est form e de cinq sous-unit s prot iques, dont la plus grande sert d' chafaudage sur lequel le reste du complexe est construit. La structure est la base d'un m canisme remarquable (Figure 3 71). une extr mit du C se trouve une enzyme conjugu e l'ubiquitine E2. l'autre extr mit se trouve un bras de liaison au substrat, une sous-unit connue sous le nom de prot ine F-box. Ces deux sous-unit s sont s par es par un espace d'environ 5 nm. Lorsque ce complexe prot ique est activ , la prot ine F-box se lie un site sp cifique sur une prot ine cible, positionnant la prot ine dans l'espace de sorte que certaines de ses cha nes lat rales de lysine entrent en contact avec l'enzyme conjugu e l'ubiquitine. L'enzyme peut ensuite catalyser des ajouts r p t s de polypeptide d'ubiquitine ces lysines (voir Figure 3-71C), produisant des cha nes de polyubiquitine qui marquent les prot ines cibles pour une destruction rapide dans un prot asome. Figure 3 69 Le marquage des prot ines par l'ubiquitine. (A) La structure tridimensionnelle de l'ubiquitine, une petite prot ine de 76 acides amin s. Une famille d'enzymes sp ciales couple son extr mit carboxyle au groupe amino d'une cha ne lat rale de lysine dans une mol cule prot ique cible, formant une liaison isopeptidique. (B) Certains mod les de modification qui ont des significations sp cifiques la cellule. Notez que les deux types de polyubiquitylation diff rent dans la fa on dont les mol cules d'ubiquitine sont li es entre elles. La liaison par Lys48 signifie la d gradation par le prot asome (voir Figure 6-84), tandis que celle par Lys63 a d'autres significations. Les marquages de l'ubiquitine sont lus par des prot ines qui reconnaissent sp cifiquement chaque type de modification. Figure 3 70 Le marquage des prot ines avec l'ubiquitine. (A) L'extr mit C-terminale de l'ubiquitine est initialement activ e en tant li e par une liaison thioester haute nergie une cha ne lat rale cyst ine sur la prot ine E1. Cette r action n cessite de l'ATP, et elle se d roule via un interm diaire covalent AMP-ubiquitine. L'ubiquitine activ e sur E1, galement connue sous le nom d'enzyme activatrice de l'ubiquitine, est ensuite transf r e la cyst ine sur une mol cule E2. (B) L'ajout d'une cha ne de polyubiquitine une prot ine cible. Dans une cellule de mammif re, il existe plusieurs centaines de complexes E2-E3 distincts. Les E2 sont appel s enzymes de conjugaison de l'ubiquitine. Les E3 sont appel s ubiquitine ligases. (Adapt de D.R. Knighton et al., Science 253:407-414, 1991.) Deux des nombreuses prot ines polyubiquityl es possibles cibl es liaison au substrat pour les bras de destruction De cette mani re, des prot ines sp cifiques sont cibl es pour une destruction rapide en r ponse des signaux sp cifiques, aidant ainsi piloter le cycl
Biologie moléculaire de la cellule	e cellulaire (discut au chapitre 17). Le moment de la destruction implique souvent la cr ation d'un mod le sp cifique de phosphorylation sur la prot ine cible qui est n cessaire sa reconnaissance par la sous-unit F-box. Il n cessite galement l'activation d'une ubiquitine ligase SCF qui porte le bras de liaison du substrat appropri . Beaucoup de ces bras (les sous-unit s F-box) sont interchangeables dans le complexe prot ique (voir Figure 3-71B), et il existe plus de 70 g nes humains qui les codent. Comme nous l'avons soulign pr c demment, une fois qu'une prot ine r ussie a volu , son information g n tique a tendance tre dupliqu e pour produire une famille de prot ines apparent es. Ainsi, par exemple, non seulement il existe de nombreuses prot ines F-box, ce qui permet de reconna tre diff rents ensembles de prot ines cibles, mais il existe galement une famille d' chafaudages (connus sous le nom de cullins) qui donnent naissance une famille d'ubiquitine ligases de type SCF. Une machine prot ines comme l'ubiquitine ligase SCF, avec ses pi ces interchangeables, utilise de mani re conomique l'information g n tique des cellules. Elle cr e galement des opportunit s d' volution rapide , dans la mesure o de nouvelles fonctions peuvent voluer pour l'ensemble du complexe simplement en produisant une version alternative de l'une de ses sous-unit s. Les ubiquitines ligases forment une famille diversifi e de complexes prot iques. Certains de ces complexes sont beaucoup plus grands et plus compliqu s que les SCF, mais leur fonction enzymatique sous-jacente reste la m me (Figure 3-71D). Structures d taill es obtenues pour l'un des membres de la famille des prot ines de liaison au GTP, la prot ine EF-Tu, fournissent un bon exemple de la fa on dont les changements allost riques dans les conformations des prot ines peuvent produire de grands mouvements en amplifiant un petit changement conformationnel local. Comme nous le verrons au chapitre 6, EF-Tu est une mol cule abondante qui sert de facteur d' longation (d'o l'EF) dans la synth se des prot ines, chargeant chaque mol cule d'aminoacyl-tRNA sur le ribosome. EF-Tu contient un domaine de type Ras (voir Figure 3-67), et la mol cule d'ARNt forme un complexe serr avec sa forme li e au GTP. Cette mol cule d'ARNt peut transf rer son acide amin la croissance Figure 3 71 La structure et le mode d'action d'une ubiquitine ligase SCF. (A) La structure du complexe ubiquitine ligase cinq prot ines qui comprend une enzyme ubiquitine conjugu e E2. Quatre prot ines forment la portion E3. La prot ine d sign e ici comme prot ine adaptatrice 1 est la prot ine Rbx1/Hrt1, la prot ine adaptatrice 2 est la prot ine Skp1 et la culline est la prot ine Cul1. L'une des nombreuses prot ines F-box diff rentes compl te le complexe. (B) Comparaison du m me complexe avec deux bras de liaison de substrat diff rents, les prot ines F-box Skp2 (en haut) et -trCP1 (en bas), respectivement. (C) La liaison et l'ubiquitylation d'une prot ine cible par l'ubiquitine ligase SCF. Si, comme indiqu , une cha ne de mol cules d'ubiquitine est ajout e la m me lysine de la prot ine cible, cette prot ine est marqu e pour une destruction rapide par le prot asome. (D) Comparaison de SCF (en bas) avec une structure de microscopie lectronique basse r solution d'une ubiquitine ligase appel e complexe favorisant l'anaphase (APC/C ; en haut) la m me chelle. L'APC/C est un grand complexe de 15 prot ines. Comme nous l'avons vu au chapitre 17, ses ubiquitylations contr lent les derniers stades de la mitose. Il est loign de la SCF et contient une sous-unit de cullin (en vert) qui se trouve le long du c t du complexe droite, seulement partiellement visible sur cette vue. Les prot ines E2 ne sont pas repr sent es ici, mais leurs sites de liaison sont indiqu s en orange, ainsi que les sites de liaison du substrat en violet. (A et B, adapt de G. Wu et al., Mol. Cell 11:1445-1456, 2003. Avec l'autorisation d'Elsevier ; D, adapt de P. da Fonseca et al., Nature 470:274-278, 2011. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Figure 3 72 Le grand changement de conformation d'eF-Tu caus par l'hydrolyse du GTP. (A et B) La structure tridimensionnelle d'EF-Tu avec GTP li . Le domaine en haut a une structure similaire celle de la prot ine Ras, et son h lice rouge est l'h lice de commutation, qui se d place apr s l'hydrolyse du GTP. (C) Le changement de conformation de l'h lice de commutation dans le domaine 1 permet aux domaines 2 et 3 de pivoter comme une seule unit d'environ 90 degr s vers le spectateur, ce qui lib re l'ARNt qui tait li cette structure (voir aussi Figure 3-73). (A, adapt de H. Berchtold et al., Nature 365:126-132, 1993. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd. B, avec l'aimable autorisation de Mathias Sprinzl et Rolf Hilgenfeld. Code PDB : 1EFT.) (B) domaine 1 P P P GTP- changement de site de liaison domaine d'h lice 3 domaine 2 PP li GDP lib ration d
Biologie moléculaire de la cellule	e l'ARNt GTP site d'hydrolyse de la liaison de l'ARNt G G HOOC NH2 switch helix GTP (A) cha ne polypeptidique uniquement apr s que le GTP li EF-Tu est hydrolys , dissociant l'EF-Tu. tant donn que cette hydrolyse GTP est d clench e par un bon ajustement de l'ARNt la mol cule d'ARNm sur le ribosome, l'EF-Tu sert de facteur qui fait la distinction entre les appariements ARNm-ARNt corrects et incorrects (voir Figure 6-65). En comparant la structure tridimensionnelle d'EF-Tu dans ses formes li es au GTP et au GDP, nous pouvons voir comment se produit le repositionnement de l'ARNt. La dissociation du groupe phosphate inorganique (Pi), qui suit la r action GTP GDP + Pi, provoque un d calage de quelques dixi mes de nanom tre au niveau du site de liaison du GTP-, tout comme elle le fait dans la prot ine Ras. Ce minuscule mouvement, quivalent quelques fois le diam tre d'un atome d'hydrog ne, provoque la propagation d'un changement de conformation le long d'une pi ce cruciale de l'h lice , appel e h lice de commutation, dans le domaine de type Ras de la prot ine. L'h lice de commutation semble servir de verrou qui adh re un site sp cifique dans un autre domaine de la mol cule, maintenant la prot ine dans une conformation ferm e . Le changement de conformation d clench par l'hydrolyse du GTP provoque le d tachement de l'h lice de commutation, permettant des domaines s par s de la prot ine de s' carter, sur une distance d'environ 4 nm (Figure 3-72). Cela lib re la mol cule d'ARNt li e, ce qui permet d'utiliser son acide amin attach (Figure 3-73). Remarquez dans cet exemple comment les cellules ont exploit un simple changement chimique qui se produit la surface d'un petit domaine prot ique pour cr er un mouvement 50 fois plus grand. Les changements de forme spectaculaires de ce type provoquent galement les tr s grands mouvements qui se produisent dans les prot ines motrices, comme nous le verrons ci-dessous. Nous avons vu que les changements conformationnels dans les prot ines jouent un r le central dans la r gulation enzymatique et la signalisation cellulaire. Nous abordons maintenant les prot ines dont la fonction principale est de d placer d'autres mol cules. Ces prot ines motrices g n rent les forces responsables de la contraction musculaire et du rampement et de la nage des cellules. Les prot ines motrices alimentent galement des mouvements intracellulaires plus petite chelle : elles aident d placer les chromosomes vers les extr mit s oppos es de la cellule pendant la mitose (discut au chapitre 17), d placer les organites le long des voies mol culaires l'int rieur de la cellule (discut au chapitre 16) et d placer les enzymes le long d'un brin d'ADN pendant la synth se d'une nouvelle mol cule d'ADN (discut au chapitre 5). Tous ces processus fondamentaux d pendent de prot ines avec des pi ces mobiles qui fonctionnent comme des machines g n ratrices de force. Comment fonctionnent ces machines ? En d'autres termes, comment les cellules utilisent-elles les changements de forme des prot ines pour g n rer des mouvements dirig s ? Si, par exemple, une prot ine doit marcher le long d'un fil troit tel qu'une mol cule d'ADN, elle peut le faire en subissant une s rie de changements conformationnels, tels que ceux illustr s aux figures 3 74. Mais sans rien pour conduire ces changements dans une s quence ordonn e, ils sont parfaitement Figure 3 73 : une mol cule d'ARNt aminoacyle li e eF-Tu. Notez comment la prot ine li e bloque l'utilisation de l'acide amin li l'ARNt (vert) pour la synth se des prot ines jusqu' ce que l'hydrolyse du GTP d clenche les changements conformationnels illustr s la figure 3-72C, dissociant le complexe prot ine-ARNt. EF-Tu est une prot ine bact rienne ; cependant, une prot ine tr s similaire existe chez les eucaryotes, o elle est appel e EF-1 (film 3.12). (Coordonn es d termin es par P. Nissen et al., Science 270:1464 1472, 1995. Code PDB : 1B23.) 162 Chapitre 3 : Les prot ines sont r versibles, et la prot ine ne peut se promener que de mani re al atoire d'avant en arri re le long du fil. Nous pouvons voir cette situation d'une autre mani re. Puisque le mouvement directionnel d'une prot ine fonctionne, les lois de la thermodynamique (discut es au chapitre 2) exigent qu'un tel mouvement utilise de l' nergie gratuite provenant d'une autre source (sinon la prot ine pourrait tre utilis e pour fabriquer une machine mouvement perp tuel). Par cons quent, sans un apport d' nergie, la mol cule de prot ine ne peut qu'errer sans but. Comment la cellule peut-elle rendre unidirectionnelle une telle s rie de changements conformationnels ? Pour forcer tout le cycle se d rouler dans une seule direction, il suffit de rendre irr versible l'un des changements de forme. La plupart des prot ines capables de marcher dans une direction sur de longues distances r alisent ce mouvement en couplant l'un des changements conformationnels l'hydrolyse d'une mol cule d
Biologie moléculaire de la cellule	'ATP troitement li e la prot ine. Le m canisme est similaire celui qui vient d' tre discut et qui entra ne les changements de forme des prot ines allost riques par hydrolyse du GTP. tant donn que l'hydrolyse de l'ATP (ou GTP) lib re une grande quantit d' nergie libre, il est tr s peu probable que la prot ine de liaison aux nucl otides subisse le changement de forme inverse n cessaire pour reculer, car cela n cessiterait qu'elle inverse galement l'hydrolyse de l'ATP en ajoutant une mol cule de phosphate l'ADP pour former de l'ATP. Dans le mod le illustr la figure 3-75A, la liaison l'ATP d place une prot ine motrice de la conformation 1 la conformation 2. L'ATP li est ensuite hydrolys pour produire de l'ADP et du phosphate inorganique (Pi), provoquant un changement de la conformation 2 la conformation 3. Enfin, la lib ration de l'ADP et de Pi li s ram ne la prot ine la conformation 1. Parce que l' nergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP entra ne la transition 2 3, cette s rie de changements conformationnels est effectivement irr versible. Ainsi, l'ensemble du cycle ne va que dans une seule direction, ce qui fait que la mol cule de prot ine se d place continuellement vers la droite dans cet exemple. De nombreuses prot ines motrices g n rent un mouvement directionnel gr ce l'utilisation d'un cliquet unidirectionnel similaire, y compris la prot ine motrice musculaire myosine, direction de Figure 3-74 : une prot ine allost rique marchante . Bien que ses trois conformations diff rentes lui permettent de se d placer de mani re al atoire d'avant en arri re tout en tant li e un fil ou un filament, la prot ine ne peut pas se d placer uniform ment dans une seule direction. Figure 3 75 Comment une prot ine peut marcher dans une direction. (A) Une prot ine motrice allost rique entra n e par l'hydrolyse de l'ATP. La transition entre trois conformations diff rentes comprend une tape entra n e par l'hydrolyse d'une mol cule d'ATP li e, cr ant un cliquet unidirectionnel qui rend l'ensemble du cycle essentiellement irr versible. Par des cycles r p t s, la prot ine se d place donc continuellement vers la droite le long du fil. (B) Visualisation directe d'une prot ine motrice de myosine ambulante par microscopie force atomique grande vitesse ; le temps coul entre les tapes tait inf rieur 0,5 seconde (voir Vid o 16.3). (B, modifi de N. Kodera et al., Nature 468:72-76, 2010. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) qui se propage le long des filaments d'actine (Figure 3-75B), et les prot ines kin sines qui marchent le long des microtubules (toutes deux abord es au chapitre 16). Ces mouvements peuvent tre rapides : certaines des prot ines motrices impliqu es dans la r plication de l'ADN (les h licases d'ADN) se propulsent le long d'un brin d'ADN des vitesses pouvant atteindre 1000 nucl otides par seconde. Les transporteurs membranaires exploitent l' nergie pour pomper des mol cules travers les membranes Jusqu' pr sent, nous avons vu comment les prot ines qui subissent des changements de forme allost rique peuvent agir comme des microprocesseurs (kinases de la famille Src), comme des facteurs d'assemblage (EF-Tu) et comme des g n rateurs de force m canique et de mouvement (prot ines motrices). Les prot ines allost riques peuvent galement exploiter l' nergie d riv e de l'hydrolyse de l'ATP, des gradients d'ions ou des processus de transport d' lectrons pour pomper des ions sp cifiques ou de petites mol cules travers une membrane. Nous consid rons ici un exemple qui sera discut plus en d tail au chapitre 11. Les transporteurs ABC (transporteurs cassette de liaison l'ATP) constituent une classe importante de prot ines de pompe li es la membrane. Chez l'homme, au moins 48 g nes diff rents les codent. Ces transporteurs ont principalement pour fonction d'exporter des mol cules hydrophobes du cytoplasme, servant liminer les mol cules toxiques la surface de la muqueuse du tractus intestinal, par exemple, ou la barri re h mato-enc phalique. L' tude des transporteurs ABC pr sente un int r t intense en m decine clinique, car la surproduction de prot ines de cette classe contribue la r sistance des cellules tumorales aux m dicaments chimioth rapeutiques. Chez les bact ries, les m mes types de prot ines ont principalement pour fonction d'importer des nutriments essentiels dans la cellule. Un transporteur ABC typique contient une paire de sous-unit s couvrant la membrane li es une paire de sous-unit s de liaison l'ATP situ es juste en dessous de la membrane plasmique. Comme dans d'autres exemples que nous avons discut s, l'hydrolyse des mol cules d'ATP li es entra ne des changements conformationnels dans la prot ine, transmettant des forces qui am nent les sous-unit s couvrant la membrane d placer leurs mol cules li es travers la bicouche lipidique (Figure 3-76). Les humains ont invent de nombreux types de pompes m caniques, et il n'est pas
Biologie moléculaire de la cellule	surprenant que les cellules contiennent galement des pompes membrane qui Figure 3 76 Le transporteur abC (aTP-binding cassette), une machine prot ines qui pompe des mol cules travers une membrane. (A) Comment cette grande famille de transporteurs pompe des mol cules dans la cellule des bact ries. Comme indiqu , la liaison de deux mol cules d'ATP fait que les deux domaines de liaison l'ATP se serrent troitement, ouvrant un canal vers l'ext rieur de la cellule. La liaison d'une mol cule de substrat la face extracellulaire du complexe prot ique d clenche alors l'hydrolyse de l'ATP suivie de la lib ration de l'ADP, ce qui ouvre la porte cytoplasmique ; La pompe est ensuite r initialis e pour un autre cycle. (B) Comme nous l'avons vu au chapitre 11, chez les eucaryotes, un processus oppos se produit, provoquant l'expulsion de mol cules de substrat s lectionn es hors de la cellule. (C) La structure d'un transporteur bact rien ABC (voir vid o 11.5). (C, d'apr s R.J. Dawson et K.P. Locher, Nature 443:180-185, 2006. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd ; Code PDB : 2HYD). fonctionner d'autres mani res. Parmi les plus notables, citons les pompes rotatives qui couplent l'hydrolyse de l'ATP au transport des ions H+ (protons). Ces pompes ressemblent des turbines miniatures et sont utilis es pour acidifier l'int rieur des lysosomes et d'autres organites eucaryotes. Comme d'autres pompes ioniques qui cr ent des gradients d'ions, elles peuvent fonctionner en sens inverse pour catalyser la r action ADP + Pi ATP, si le gradient travers leur membrane de l'ion qu'elles transportent est suffisamment raide. L'une de ces pompes, l'ATP synthase, exploite un gradient de concentration de protons produit par les processus de transport d' lectrons pour produire la majeure partie de l'ATP utilis dans le monde vivant. Cette pompe omnipr sente joue un r le central dans la conversion d' nergie, et nous discuterons de sa structure et de son m canisme tridimensionnels au chapitre 14. Les prot ines forment souvent de grands complexes qui fonctionnent comme des machines prot ines Les grandes prot ines form es partir de nombreux domaines sont capables d'ex cuter des fonctions plus labor es que les petites prot ines domaine unique. Mais les grands assemblages de prot ines form s de nombreuses mol cules de prot ines li es entre elles par des liaisons non covalentes effectuent les t ches les plus impressionnantes. Maintenant qu'il est possible de reconstruire la plupart des processus biologiques dans des syst mes acellulaires en laboratoire, il est clair que chacun des processus centraux d'une cellule, tels que la r plication de l'ADN, la synth se des prot ines, le bourgeonnement des v sicules ou la signalisation transmembranaire, est catalys par un ensemble hautement coordonn et li de 10 prot ines ou plus. Dans la plupart de ces machines prot ines, une r action nerg tiquement favorable telle que l'hydrolyse des nucl osides triphosphates li s (ATP ou GTP) entra ne une s rie ordonn e de changements conformationnels dans une ou plusieurs des sous-unit s prot iques individuelles, permettant l'ensemble des prot ines de se d placer de mani re coordonn e. De cette fa on, chaque enzyme peut tre mise directement en position, car la machine catalyse des r actions successives en s rie (Figure 3 77). C'est ce qui se produit, par exemple, dans la synth se des prot ines sur un ribosome (voir le chapitre 6) ou dans la r plication de l'ADN, o un grand complexe multiprot ique se d place rapidement le long de l'ADN (voir le chapitre 5). Les cellules ont d velopp des machines prot ines pour la m me raison que les humains ont invent les machines m caniques et lectroniques. Pour accomplir presque n'importe quelle t che, les manipulations qui sont coordonn es spatialement et temporellement par des processus li s sont beaucoup plus efficaces que l'utilisation de nombreux outils s par s. Les chafaudages concentrent des ensembles de prot ines en interaction Au fur et mesure que les scientifiques ont appris plus de d tails de la biologie cellulaire, ils ont reconnu un degr croissant de sophistication dans la chimie cellulaire. Ainsi, non seulement nous savons maintenant que les machines prot ines jouent un r le pr dominant, mais il est galement devenu clair qu'elles sont tr s souvent localis es des sites sp cifiques de la cellule, tant assembl es et activ es uniquement o et quand elles sont n cessaires. Par exemple, lorsque des mol cules de signalisation extracellulaire se lient des prot ines r ceptrices dans la membrane plasmique, les r cepteurs activ s recrutent souvent un ensemble d'autres prot ines sur la surface interne de la membrane plasmique pour former un grand complexe prot ique qui transmet le signal (discut au chapitre 15). Les m canismes impliquent souvent des prot ines d' chafaudage. Ce sont des prot ines avec des sites de liaison pour plusieurs autres prot ines, et elles servent
Biologie moléculaire de la cellule	la fois lier des ensembles sp cifiques de prot ines en interaction et les positionner des endroits sp cifiques l'int rieur d'une cellule. un extr me se trouvent des chafaudages rigides, tels que le cullin dans l'ubiquitine ligase SCF (voir Figure 3-71). l'autre extr me se trouvent les grandes prot ines d' chafaudage flexibles qui sous-tendent souvent des r gions de membrane plasmique sp cialis e. Il s'agit notamment de l' Figure 3 77 Comment les machines prot ines ex cutent des fonctions complexes. Ces machines sont constitu es de prot ines individuelles qui collaborent pour effectuer une t che sp cifique (vid o 3.13). Le mouvement de ces prot ines est souvent coordonn par l'hydrolyse d'un nucl otide li tel que l'ATP ou le GTP. Les changements conformationnels allost riques directionnels des prot ines qui sont entra n s de cette mani re se produisent souvent dans un grand assemblage de prot ines dans lequel les activit s de plusieurs mol cules prot iques diff rentes sont coordonn es par de tels mouvements au sein du complexe. Discs-large protein (Dlg), une prot ine d'environ 900 acides amin s qui est concentr e dans des r gions sp ciales sous la membrane plasmique dans les cellules pith liales et au niveau des synapses. Dlg contient des sites de liaison pour au moins sept autres prot ines, entrecoup s de r gions de cha ne polypeptidique plus flexible. Une prot ine ancienne, conserv dans des organismes aussi divers que les ponges, les vers, les mouches et les humains, Dlg tire son nom du ph notype mutant de l'organisme dans lequel il a t d couvert pour la premi re fois ; les cellules des disques imaginaux d'un embryon de drosophile avec une mutation du g ne Dlg ne cessent pas de prolif rer quand elles le devraient, et elles produisent des disques inhabituellement grands dont les cellules pith liales peuvent former des tumeurs. Bien qu'incompl tement tudi , Dlg et un grand nombre de prot ines d' chafaudage similaires sont cens es fonctionner comme la prot ine sch matiquement illustr e dans la figure 3-78. En se liant un ensemble sp cifique de prot ines en interaction, ces chafaudages peuvent augmenter le taux de r actions critiques, tout en les confinant la r gion particuli re de la cellule qui contient l' chafaudage. Pour des raisons similaires, les cellules font galement un usage intensif de mol cules d'ARN d' chafaudage, comme nous l'avons vu au chapitre 7. De nombreuses prot ines sont contr l es par des modifications covalentes qui les dirigent vers des sites sp cifiques l'int rieur de la cellule Jusqu' pr sent, nous n'avons d crit que quelques fa ons dont les prot ines sont modifi es post-traductionnellement. Un grand nombre d'autres modifications de ce type se produisent galement, plus de 200 types distincts tant connus. Pour donner une id e de la vari t , le tableau 3-3 pr sente Figure 3 78 Comment la proximit cr e par les prot ines d' chafaudage peut acc l rer consid rablement les r actions dans une cellule. Dans cet exemple, de longues r gions non structur es de la cha ne polypeptidique d'une grande prot ine d' chafaudage connectent une s rie de domaines structur s qui se lient un ensemble de prot ines r actives. Les r gions non structur es servent d' attaches flexibles qui acc l rent consid rablement les taux de r action en provoquant une collision rapide et al atoire de toutes les prot ines li es l' chafaudage. (Pour des exemples sp cifiques d'attache prot ique, voir les figures 3-54 et 16-18 ; pour les mol cules d'ARN d' chafaudage, voir la figure 7-49B.) quelques-uns des groupes modificateurs ayant des r les r glementaires connus. Comme dans les ajouts de phosphate et d'ubiquitine d crits pr c demment, ces groupes sont ajout s puis retir s des prot ines en fonction des besoins de la cellule. On sait maintenant qu'un grand nombre de prot ines sont modifi es sur plus d'une cha ne lat rale d'acides amin s, avec diff rents v nements r gulateurs produisant un mod le diff rent de ces modifications. Un exemple frappant est la prot ine p53, qui joue un r le central dans le contr le de la r ponse d'une cellule des circonstances d favorables (voir Figure 17-62). Gr ce l'un des quatre types d'ajouts mol culaires diff rents, cette prot ine peut tre modifi e 20 sites diff rents. Parce qu'un grand nombre de combinaisons diff rentes de ces 20 modifications sont possibles, le comportement de la prot ine peut en principe tre modifi de nombreuses fa ons. De telles modifications cr ent souvent un site sur la prot ine modifi e qui la lie une prot ine d' chafaudage dans une r gion sp cifique de la cellule, la connectant ainsi via l' chafaudage aux autres prot ines n cessaires une r action ce site. On peut consid rer l'ensemble des modifications covalentes de chaque prot ine comme un code r gulateur combinatoire. Des groupes modificateurs sp cifiques sont ajout s ou supprim s d'une prot ine en r ponse des signaux, et le code modifie ensuit
Biologie moléculaire de la cellule	e le comportement de la prot ine, modifiant l'activit ou la stabilit de la prot ine, de ses partenaires de liaison et/ou de son emplacement sp cifique dans la cellule (Figure 3-79). En cons quence, la cellule est capable de r agir rapidement et avec une grande polyvalence aux changements de sa condition ou de son environnement. Un r seau complexe d'interactions prot iques sous-tend la fonction cellulaire Les biologistes cellulaires sont confront s de nombreux d fis en cette re riche en informations, o un grand nombre de s quences g nomiques compl tes sont connues. L'une d'entre elles est la n cessit de diss quer et de reconstruire chacune des milliers de machines prot iques qui existent dans un organisme tel que le n tre. Pour comprendre ces complexes prot iques remarquables, chacun d'entre eux devra tre reconstitu partir de ses parties prot iques purifi es, afin que nous puissions tudier en d tail son mode de fonctionnement dans des conditions contr l es dans un tube essai, exempt de tout autre composant cellulaire. Rien que cela repr sente une t che norme. Mais nous savons maintenant que chacun de ces sous-composants d'une cellule interagit galement avec d'autres ensembles de macromol cules, cr ant un vaste r seau d'interactions prot ine-prot ine et prot ine-acide nucl ique dans toute la cellule. Pour comprendre la cellule, nous devrons donc galement analyser la plupart de ces autres interactions. Figure 3 79 Modification des prot ines multisites et ses effets. (A) Une prot ine qui porte un ajout post-traductionnel plus d'une de ses cha nes lat rales d'acides amin s peut tre consid r e comme porteuse d'un code r gulateur combinatoire. Des modifications multisites sont ajout es (et supprim es) une prot ine par le biais de r seaux de signalisation, et le code r gulateur combinatoire r sultant sur la prot ine est lu pour modifier son comportement dans la cellule. (B) Le sch ma de certaines modifications covalentes de la prot ine p53. Nous pouvons nous faire une id e de la complexit des r seaux de prot ines intracellulaires partir d'un exemple particuli rement bien tudi d crit au chapitre 16 : les dizaines de prot ines qui interagissent avec le cytosquelette d'actine pour contr ler le comportement des filaments d'actine (voir panneau 16-3, p. 905). L'ampleur de ces interactions prot ine-prot ine peut galement tre estim e de mani re plus g n rale. Une norme quantit d'informations pr cieuses est maintenant disponible gratuitement dans les bases de donn es sur les prot ines sur Internet : des dizaines de milliers de structures prot iques tridimensionnelles et des dizaines de millions de s quences prot iques d riv es des s quences nucl otidiques des g nes. Les scientifiques ont mis au point de nouvelles m thodes d'exploitation de cette grande ressource afin d'accro tre notre compr hension des cellules. En particulier, des outils bio-informatiques informatis s sont combin s la robotique et d'autres technologies pour permettre d' tudier des milliers de prot ines dans une seule s rie d'exp riences. La prot omique est un terme souvent utilis pour d crire une telle recherche ax e sur l'analyse de grands ensembles de prot ines, analogue au terme g nomique d crivant l'analyse grande chelle de s quences d'ADN et de g nes. Une m thode biochimique bas e sur le marquage d'affinit et la spectroscopie de masse s'est av r e particuli rement puissante pour d terminer les interactions de liaison directe entre les nombreuses prot ines diff rentes d'une cellule (voir le chapitre 8). Les r sultats sont compil s et organis s dans des bases de donn es Internet. Cela permet un biologiste cellulaire tudiant un petit ensemble de prot ines de d couvrir facilement quelles autres prot ines de la m me cellule sont susceptibles de se lier cet ensemble de prot ines et donc d'interagir avec celui-ci. Lorsqu'elle est affich e graphiquement sous la forme d'une carte d'interaction prot ique, chaque prot ine est repr sent e par une bo te ou un point dans un r seau bidimensionnel, avec une ligne droite reliant les prot ines qui se lient les unes aux autres. Lorsque des centaines ou des milliers de prot ines sont affich es sur la m me carte, le diagramme de r seau devient d'une complexit d concertante, servant illustrer les normes d fis auxquels sont confront s les scientifiques qui tentent de comprendre la cellule (Figure 3-80). Beaucoup plus utiles sont de petites sous-sections de ces cartes, centr es sur quelques prot ines d'int r t. Nous avons pr c demment d crit la structure et le mode d'action de l'ubiquitine ligase SCF, en l'utilisant pour illustrer comment les complexes prot iques sont construits partir de parties interchangeables (voir Figure 3-71). La figure 3-81 montre un r seau d'interactions prot ine-prot ine pour les cinq prot ines qui forment ce complexe prot ique dans une cellule de levure. Quatre des sous-unit s de cette ligase sont situ es en bas droite de cette figure. L
Biologie moléculaire de la cellule	a sous-unit restante, la prot ine F-box qui lui sert de bras de liaison au substrat, appara t comme un ensemble de 15 produits g niques diff rents qui se lient la prot ine adaptatrice 2 (la prot ine Skp1). En haut et gauche de la figure se trouvent des ensembles d'interactions prot iques suppl mentaires marqu es par des ombres jaunes et vertes : comme indiqu , ces ensembles de prot ines fonctionnent l'origine de la r plication de l'ADN, dans la r gulation du cycle cellulaire, dans la synth se de la m thionine, dans le kin tochore et dans l'assemblage vacuolaire de la H+-ATPase. Nous utiliserons cette figure pour expliquer comment de telles cartes d'interaction prot ique sont utilis es, et ce qu'elles signifient et ne signifient pas. 1. Les cartes d'interaction prot ique sont utiles pour identifier la fonction probable de prot ines non caract ris es auparavant. Des exemples sont les produits des g nes dont l'existence n'a jusqu' pr sent t d duite qu' partir de la s quence du g nome de la levure, qui sont les trois prot ines de la figure qui n'ont pas d'abr viation simple de trois lettres (lettres blanches commen ant par Y). Les trois de ce sch ma sont des prot ines F-box qui se lient Skp1 ; Ceux-ci sont donc susceptibles de fonctionner dans le cadre de l'ubiquitine ligase, servant de liaison au substrat bras qui reconnaissent diff rentes prot ines cibles. Cependant, comme nous le verrons ci-dessous, aucune des deux attributions ne peut tre consid r e comme certaine sans donn es suppl mentaires. 2. Les r seaux d'interaction prot ique doivent tre interpr t s avec prudence car, gr ce l'utilisation efficace de l'information g n tique de chaque organisme par l' volution, la m me prot ine peut tre utilis e dans le cadre de diff rents complexes prot iques ayant diff rents types de fonctions. Ainsi, bien que la prot ine A se lie la prot ine B et que la prot ine B se lie la prot ine C, les prot ines A et C n'ont pas besoin de fonctionner dans le m me processus. Par exemple, nous savons, gr ce des tudes biochimiques d taill es, que les fonctions de Skp1 dans le kin tochore et dans Figure 3 80 : un r seau d'interactions de liaison aux prot ines dans une cellule de levure. Chaque ligne reliant une paire de points (prot ines) indique une interaction prot ine-prot ine. (D'apr s A. Guimer et M. Sales Pardo, Mol. Syst. Biol. 2:42, 2006. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Figure 3 81 : une carte de certaines interactions prot ine-prot ine du SCF, de l'ubiquitine, de la ligase et d'autres prot ines de la levure S. cerevisiae. Les symboles et/ou les couleurs utilis s pour les cinq prot ines de la ligase sont ceux de la figure 3-71. Notez que 15 prot ines F-box diff rentes sont repr sent es (violet) ; ceux avec des lettres blanches (commen ant par Y) sont connus partir de la s quence du g nome comme des cadres de lecture ouverts. Pour plus de d tails, voir le texte. (Avec l'aimable autorisation de Peter Bowers et David Eisenberg, UCLA-DOE Institute for Genomics and Proteomics, UCLA.) L'assemblage vacuolaire H+- ATPase (ombrage jaune) est s par de sa fonction dans l'ubiquitine ligase SCF. En fait, seules les trois fonctions restantes de Skp1 illustr es dans le diagramme la synth se de la m thionine, la r gulation du cycle cellulaire et l'origine de la r plication (ombrage vert) impliquent l'ubiquitylation. 3. Dans les comparaisons inter-esp ces, les prot ines pr sentant des mod les d'interactions similaires dans les deux cartes d'interaction prot ique sont susceptibles d'avoir la m me fonction dans la cellule. Ainsi, mesure que les scientifiques g n rent des cartes de plus en plus d taill es pour plusieurs organismes, les r sultats deviendront de plus en plus utiles pour d duire la fonction des prot ines. Ces comparaisons cartographiques seront un outil particuli rement puissant pour d chiffrer les fonctions des prot ines humaines, car une grande quantit d'informations directes sur la fonction des prot ines peut tre obtenue partir du g nie g n tique, des analyses mutationnelles et g n tiques dans des organismes exp rimentaux tels que les levures, les vers et les mouches qui ne sont pas r alisables chez l'homme. Que nous r serve l'avenir ? Il est probable qu'il y ait de l'ordre de 10 000 prot ines diff rentes dans une cellule humaine typique, chacune d'entre elles interagissant avec 5 10 partenaires diff rents. Malgr les normes progr s r alis s ces derni res ann es, nous ne pouvons pas encore pr tendre comprendre m me les cellules connues les plus simples, telles que la petite bact rie Mycoplasma form e partir d'environ 500 produits g niques (voir Figure 1-10). Comment alors peut-on esp rer comprendre un humain ? De toute vidence, une grande partie de la nouvelle biochimie sera essentielle, dans laquelle chaque prot ine d'un ensemble particulier d'interaction est purifi e afin que sa chimie et ses interactions puissent tre diss qu es dans un tube essa
Biologie moléculaire de la cellule	i. Mais en outre, des m thodes plus puissantes d'analyse des r seaux seront n cessaires, bas es sur des outils math matiques et informatiques qui n'ont pas encore t invent s, comme nous le soulignerons au chapitre 8. De toute vidence, il reste de nombreux d fis merveilleux relever pour les g n rations futures de biologistes cellulaires. Les prot ines peuvent former des dispositifs chimiques extr mement sophistiqu s, dont les fonctions d pendent en grande partie des propri t s chimiques d taill es de leurs surfaces. Les sites de liaison des ligands sont form s comme des cavit s de surface dans lesquelles des cha nes lat rales d'acides amin s positionn es avec pr cision sont rassembl es par repliement des prot ines. De cette fa on, les cha nes lat rales d'acides amin s normalement non r actives peuvent tre activ es pour former et rompre des liaisons covalentes. Les enzymes sont des prot ines catalytiques qui acc l rent consid rablement les vitesses de r action en liant les tats de transition haute nergie pour un chemin de r action sp cifique ; Ils peuvent galement effectuer simultan ment la catalyse acide et la catalyse de base. Les taux de r actions enzymatiques sont souvent si rapides qu'ils ne sont limit s que par la diffusion. Les taux ne peuvent tre encore augment s que si les enzymes qui agissent s quentiellement sur un substrat sont jointes en un seul complexe multienzymatique, ou si les enzymes et leurs substrats sont attach s des chafaudages prot iques, ou autrement confin s la m me partie de la cellule. Les prot ines changent de forme de mani re r versible lorsque les ligands se lient leur surface. Les changements allost riques de conformation des prot ines produits par un ligand affectent la liaison d'un deuxi me ligand, et cette liaison entre deux sites de liaison de ligand fournit un m canisme crucial pour r guler les processus cellulaires. Les voies m taboliques, par exemple, sont contr l es par la r gulation de la r troaction : certaines petites mol cules inhibent et d'autres petites mol cules activent les enzymes au d but d'une voie. Les enzymes ainsi contr l es forment g n ralement des assemblages sym triques, permettant aux changements conformationnels coop ratifs de cr er une r ponse abrupte aux changements dans les concentrations des ligands qui les r gulent. La d pense d' nergie chimique peut entra ner des changements unidirectionnels dans la forme des prot ines. En couplant les changements de forme allost rique l'hydrolyse de l'ATP, par exemple, les prot ines peuvent faire un travail utile, comme g n rer une force m canique ou se d placer sur de longues distances dans une seule direction. Les structures tridimensionnelles des prot ines ont r v l comment un petit changement local caus par l'hydrolyse du nucl oside triphosphate est amplifi pour cr er des changements majeurs ailleurs dans la prot ine. Par de tels moyens, ces prot ines peuvent servir de dispositifs d'entr e-sortie qui transmettent des informations, de facteurs d'assemblage, de moteurs ou de pompes li es une membrane. Des machines prot ines tr s efficaces sont form es en incorporant de nombreuses mol cules de prot ines diff rentes dans des assemblages plus grands qui coordonnent les mouvements allost riques des composants individuels. De telles machines effectuent la plupart des r actions importantes dans les cellules. Les prot ines sont soumises de nombreuses modifications post-traductionnelles r versibles, telles que l'ajout covalent d'un phosphate ou d'un groupe ac tyle une cha ne lat rale d'acides amin s sp cifique. L'ajout de ces groupes modificateurs est utilis pour r guler l'activit d'une prot ine, en modifiant sa conformation, sa liaison d'autres prot ines et son emplacement l'int rieur de la cellule. Une prot ine typique d'une cellule interagit avec plus de cinq partenaires diff rents. Gr ce la prot omique, les biologistes peuvent analyser des milliers de prot ines dans une seule s rie d'exp riences. Un r sultat important est la production de cartes d taill es d'interaction prot ique, qui visent d crire toutes les interactions de liaison entre les milliers de prot ines distinctes d'une cellule. Cependant, la compr hension de ces r seaux n cessitera une nouvelle biochimie, gr ce laquelle de petits ensembles de prot ines en interaction peuvent tre purifi s et leur chimie diss qu e en d tail. De plus, de nouvelles techniques de calcul seront n cessaires pour faire face l' norme complexit . Quelles sont les fonctions de la quantit tonnamment grande de cha nes polypeptidiques d pli es trouv es dans les prot ines ? Combien de types de fonctions prot iques restent d couvrir ? Quelles sont les approches les plus prometteuses pour les d couvrir ? Quand les scientifiques seront-ils en mesure de prendre n'importe quelle s quence d'acides amin s et de pr dire avec pr cision la fois les conformations tridimensionnelles de cette prot ine et ses propri t s chimiques ? Que
Biologie moléculaire de la cellule	lles perc es seront n cessaires pour atteindre cet objectif important ? Existe-t-il des moyens de r v ler le fonctionnement d taill d'une machine prot ines qui ne n cessitent pas la purification de chacun de ses composants en grande quantit , de sorte que les fonctions de la machine puissent tre reconstitu es et diss qu es l'aide de techniques chimiques dans un tube essai ? Quels sont les r les des dizaines de types diff rents de modifications covalentes des prot ines qui ont t trouv s en plus de ceux num r s dans le tableau 3-3 ? Lesquels sont essentiels au fonctionnement cellulaire et pourquoi ? Pourquoi l'amylo de est-elle toxique pour les cellules et comment contribue-t-elle aux maladies neurod g n ratives telles que La maladie d'Alzheimer ? Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas. 3 1 Chaque brin d'une feuille de est une h lice avec deux acides amin s par tour. 3-2 Des r gions intrins quement d sordonn es de prot ines peuvent tre identifi es l'aide de m thodes bioinformatiques pour rechercher dans les g nes des s quences d'acides amin s cod es qui poss dent une hydrophobicit lev e et une faible charge nette. 3 3 boucles de polypeptide qui d passent de la surface d'une prot ine forment souvent les sites de liaison d'autres mol cules. 3 4 Une enzyme atteint un taux maximal une concentration lev e de substrat parce qu'elle a un nombre fixe de sites actifs o le substrat se lie. 3 5 Des concentrations plus lev es d'enzyme donnent lieu un taux de renouvellement plus lev . 3 6 Les enzymes qui subissent des transitions allost riques coop ratives sont invariablement constitu es d'assemblages sym triques de plusieurs sous-unit s. 3 7 L'ajout et l' limination continus de phosphates par les prot ines kinases et les prot ines phosphatases constituent un gaspillage d' nergie, puisque leur action combin e consomme de l'ATP, mais c'est une cons quence n cessaire d'une r gulation efficace par phosphorylation. Discutez des probl mes suivants. 3-8 R fl chissez la phrase suivante. Pour produire une mol cule de chaque type possible de cha ne polypeptidique, d'une longueur de 300 acides amin s, il faudrait plus d'atomes qu'il n'en existe dans l'univers. tant donn la taille de l'univers, pensez-vous que cette affirmation pourrait tre correcte ? tant donn que le comptage des atomes est une affaire d licate, consid rez le probl me du point de vue de la masse. La masse de l'univers observable est estim e environ 1080 grammes, un ordre de grandeur pr s. En supposant que le domaine de r p tition moyen d'un tel kelch est illustr la figure Q3 1. Classeriez-vous ce domaine comme un domaine de type in-line ou plug-in ? 7 Figure Q3 1 Le domaine de r p tition kelch de D. dendroides (Probl me 3 10). Les sept h lices individuelles sont cod es par couleur et tiquet es. Les terminaisons Nand C- sont indiqu es par N et C. La titine 3-11, qui a un poids mol culaire d'environ 3 106, est le plus grand polypeptide jamais d crit. Les mol cules de titine s' tendent des filaments pais du muscle au disque Z ; On pense qu'ils agissent comme des ressorts pour maintenir les filaments pais centr s dans le sarcom re. La titine est compos e d'un grand nombre de s quences r p t es d'immunoglobulines (Ig) de 89 acides amin s, chacun d'entre eux tant repli en un domaine d'environ 4 nm de longueur (Figure Q3-2A). Vous soup onnez que le comportement lastique de la titine est caus par le d pliage s quentiel (et le repliement) de domaines Ig individuels. Vous testez cette hypoth se l'aide du microscope force atomique, qui vous permet de pr lever une extr mit d'une mol cule de prot ine et de la tirer avec une force mesur e avec pr cision. Pour un fragment de titine contenant sept r p titions du domaine Ig, cette exp rience donne la courbe force/extension en dents de scie illustr e la figure Q3-2B. Si l'exp rience est r p t e dans une solution d'ur e 8 M (un d naturant prot ique), les pics disparaissent et l'extension mesur e devient beaucoup plus longue pour une force donn e. Si l'exp rience est r p t e apr s que la prot ine a t r ticul e par un traitement au glutarald hyde, une fois Encore une fois, les pics disparaissent mais l'extension devient beaucoup plus petite pour une force donn e. La masse d'un acide amin est de 110 daltons, quelle serait la masse d'une mol cule de chaque type possible de cha ne polypeptidique de 300 acides amin s de longueur ? Est-ce plus grand que la masse de l'univers ? Prot ines homologues consiste effectuer une recherche dans la base de donn es l'aide d'une courte s quence de signature indiquant la fonction prot ique particuli re. Pourquoi est-il pr f rable d'effectuer une recherche avec une s quence courte plut t qu'avec une s quence longue ? N'avez-vous pas plus de chances 0 pour un hit dans la base de donn es avec une longue s quence ? 3 10 Le motif dit kelch se compose d'une feuille de qua
Biologie moléculaire de la cellule	tre brins, qui forme ce que l'on appelle une pro- Figure Q3 2 Comportement lastique de la titine (Probl me 3 11). (A) Le peller. Il est g n ralement r p t quatre sept fois, structure d'un domaine Ig individuel. (B) Force dans les piconewtons par rapport la formation d'un domaine de r p tition kelch dans une prot ine multidomaine. Extension en nanom tres obtenue par microscopie force atomique. un. Les donn es sont-elles coh rentes avec votre hypoth se selon laquelle le comportement lastique de la titine est d au d ploiement s quentiel de domaines Ig individuels ? Expliquez votre raisonnement. b. L'extension de chaque v nement putatif dans le domaine est-elle de l'ampleur laquelle vous vous attendriez ? (Dans une cha ne polypeptidique tendue, les acides amin s sont espac s de 0,34 nm.) C.Pourquoi chaque pic successif de la figure Q3-2B est-il un peu plus lev que le pr c dent ? D.Pourquoi la force s'effondre-t-elle si brusquement apr s chaque pic ? Le virus du sarcome de Rous (VRS) 3-12 est porteur d'un oncog ne appel Src, qui code pour une prot ine tyrosine kinase active en permanence qui conduit une prolif ration cellulaire incontr l e. Normalement, Src porte un groupe d'acides gras attach (myristoylate) qui lui permet de se lier la face cytoplasmique de la membrane plasmique. Une version mutante de Src qui ne permet pas la fixation du myristoylate ne se lie pas la membrane. L'infection des cellules par le VRS codant pour la forme normale ou mutante de Src conduit au m me niveau lev d'activit de la prot ine tyrosine kinase, mais la Src mutante ne provoque pas de prolif ration cellulaire. un. En supposant que le Src normal est enti rement li la membrane plasmique et que le Src mutant est distribu dans tout le cytoplasme, calculez leurs concentrations relatives au voisinage de la membrane plasmique. Aux fins de ce calcul, supposons que la cellule est une sph re d'un rayon (r) de 10 m et que le Src mutant est distribu dans toute la cellule, tandis que le Src normal est confin une couche de 4 nm d' paisseur imm diatement sous la membrane. [Pour ce probl me, supposons que la membrane n'a pas d' paisseur. Le volume d'une sph re est (4/3) r3.] b. La cible (X) de la phosphorylation par Src r side dans la membrane. Expliquez pourquoi le mutant Src ne provoque pas la prolif ration cellulaire. 3 13 Un anticorps se lie une autre prot ine avec une constante d' quilibre, K, de 5 109 M 1. Lorsqu'il se lie une deuxi me prot ine apparent e, il forme trois liaisons hydrog ne de moins, r duisant son affinit de liaison de 11,9 kJ/mole. Qu'est-ce que le K pour sa liaison la deuxi me prot ine ? (La variation de l' nergie libre est li e la constante d' quilibre par l' quation G = 2,3 RT log K, o R est 8,3 10 3 kJ/(mole K) et T est 310 K.) 3 14 La prot ine SmpB se lie une esp ce sp ciale d'ARNt, l'ARNt, pour liminer les prot ines incompl tes fabriqu es partir d'ARNm tronqu s chez les bact ries. Si la liaison de SmpB l'ARNtm est repr sent e par la fraction li e l'ARNtm en fonction de la concentration de SmpB, on obtient une courbe sym trique en forme de S, comme le montre la figure Q3 3. Cette courbe est une repr sentation visuelle d'une relation tr s utile entre Kd et la concentration, qui a une large applicabilit . L'expression g n rale de la fraction de ligand li est d riv e de l' quation de Kd(Kd = [Pr][L]/[Pr L]) en substituant ([L]TOT [L]) [Pr L] et en r arrangeant. Parce que la concentration totale du ligand ([L]TOT) est gale au ligand libre ([L]) plus le ligand li ([Pr L]), 1,0 Figure Q3 3 Fraction de l'ARNm li en fonction de la concentration de SmpB (probl me 3 14). concentration de SmpB (M) Pour SmpB et tmRNA, la fraction li e = [SmpB tmRNA]/[tmRNA]TOT = [SmpB]/([SmpB] + Kd). l'aide de cette relation, calculez la fraction d'ARNm li e aux concentrations de SmpB gale 104 Kd, 103 Kd, 102 Kd, 101 Kd, Kd, 10 1 Kd, 10 2 Kd, 10 3 Kd et 10 4 Kd. 3 15 De nombreuses enzymes ob issent une cin tique de Michaelis-Menten simple, qui est r sum e par l' quation o Vmax = vitesse maximale, [S] = concentration du substrat et Km = constante de Michaelis. Il est instructif d'ins rer quelques valeurs de [S] dans l' quation pour voir comment le taux est affect . Quels sont les taux pour [S] gaux z ro, gaux Km et gaux la concentration infinie ? 3 16 L'enzyme hexokinase ajoute un phosphate au D-glucose mais ignore son image miroir, le L-glucose. Supposons que vous soyez capable de synth tiser l'hexokinase enti rement partir d'acides amin s D, qui sont l'image miroir des acides amin s L normaux. un. En supposant que l'enzyme D se replie en une conformation stable, quelle relation s'attendriez-vous ce qu'elle ait avec l'enzyme L normale ? b.Do-vous supposer que l'enzyme D ajouterait un phosphate au L-glucose, et ignorerait le D-glucose ? 3 17 Comment pensez-vous qu'une mol cule d'h moglobine est capable de lier efficacement l
Biologie moléculaire de la cellule	'oxyg ne dans les poumons, tout en le lib rant efficacement dans les tissus ? 3 18 La synth se des nucl otides puriques AMP et GMP se fait par une voie ramifi e commen ant par le 5-phosphate de ribose (R5P), comme le montre sch matiquement la figure Q3 4. En utilisant les principes de l'inhibition de la r troaction, proposer une strat gie r glementaire pour cette voie qui assure un approvisionnement ad quat en AMP et en GMP et minimise l'accumulation des interm diaires (A-I) lorsque les approvisionnements en AMP et en GMP sont ad quats. 0 0.25 0.5 0.75 Figure Q3 4 Sch ma de principe de la voie m tabolique pour la synth se de l'AMP et de la GMP partir de R5P (probl me 3 18). Berg JM, Tymoczko JL & Stryer L (2011) Biochimie, 7e d. New York : WH Freeman.Branden C & Tooze J (1999) Introduction la structure des prot ines, 2e d. New York : Garland Science. Dickerson RE (2005) Pr sent au d luge : comment la biologie mol culaire structurale est n e. Sunderland, MA : Sinauer. Kuriyan J, Konforti B & Wemmer D (2013) Les mol cules de la vie : principes physiques et chimiques. New York : Garland Science. Perutz M (1992) Structure des prot ines : nouvelles approches de la maladie et de la th rapie. New York : WH Freeman. Petsko GA & Ringe D (2004) Structure et fonction des prot ines. Londres : New Science Press.Williamson M (2011) Comment fonctionnent les prot ines. New York : Garland Science.La forme et la structure des prot ines Anfinsen CB (1973) Principes qui r gissent le repliement des cha nes prot iques. Science 181, 223 230. Caspar DLD & Klug A (1962) Principes physiques dans la construction de virus r guliers. Printemps froid Harb. Symp. Quant. Biol. 27, 1 24. Dill KA & MacCallum JL (2012) Le probl me du repliement des prot ines, 50 ans apr s. Science 338, 1042 1046. Eisenberg D (2003) La d couverte de l'h lice alpha et de la feuille b ta, les principales caract ristiques structurelles des prot ines. Proc. Natl Acad. Sci. tats-Unis 100, 11207 11210. Fraenkel-Conrat H & Williams RC (1955) Reconstitution du virus de la mosa que active du tabac partir de ses composants inactifs en prot ines et en acides nucl iques. Proc. Natl Acad. Sci. USA 41, 690 698. Goodsell DS & Olson AJ (2000) Sym trie structurelle et fonction prot ique. Annu. R v. Biophys. Biomol. Struct. 29, 105 153. Greenwald J & Riek R (2010) Biologie de l'amylo de : structure, fonction et r gulation. Structure 18, 1244 1260. Harrison SC (1992) Virus. Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 293 299. Hudder A, Nathanson L & Deutscher MP (2003) Organisation du cytoplasme des mammif res. Mol. Cellule. Biol. 23, 9318 9326. Kato M, Han TW, Xie S et al. (2012) Formation acellulaire de granules d'ARN : des domaines de s quence de faible complexit forment des fibres dynamiques au sein des hydrogels. Cellule 149, 753 767. Koga N, Tatsumi-Koga R, Liu G et al. (2012) Principes de conception de structures prot iques id ales. Nature 491, 222 227. Li P, Banjade S, Cheng H-C et al. (2012) Transitions de phase dans l'assemblage de prot ines de signalisation multivalentes. Nature 483, 336 340. Lindquist, SL & Kelly, JW (2011) Approches chimiques et biologiques pour adapter la prot ostasie afin d'am liorer les maladies de mauvais repliement et d'agr gation des prot ines - progr s et pronostic. Printemps froid Harb. Perspect. Biol. 3, A004507. Maji SK, Perrin MH, Sawaya MR et al. (2009) Amylo des fonctionnelles comme stockage naturel d'hormones peptidiques dans les granules s cr toires hypophysaires. Science 325, 328-332. Nelson R, Sawaya MR, Balbirnie M et al. (2005) Structure de l' pine crois e des fibrilles de type amylo de. Nature 435, 773 778. Nomura M (1973) Assemblage de ribosomes bact riens. Science 179, 864 873. Oldfield CJ & Dunker AK (2014) Prot ines intrins quement d sordonn es et r gions prot iques intrins quement d sordonn es. Annu. R v. Biochem. 83, 553 584. Orengo, CA & Thornton JM (2005) Familles de prot ines et leur volution - une perspective structurelle. Annu. R v. Biochem. 74, 867 900. Pauling L & Corey RB (1951) Configurations de cha nes polypeptidiques avec des orientations privil gi es autour de liaisons simples : deux nouvelles feuilles pliss es. Proc. Natl Acad. Sci. USA 37, 729 740. Pauling L, Corey RB & Branson HR (1951) La structure des prot ines : deux configurations h lico dales li es l'hydrog ne de la cha ne polypeptidique. Proc. Natl Acad. Sci. USA 37, 205 211. Prusiner SB (1998) Prions. Proc. Natl Acad. Sci. tats-Unis 95, 13363 13383. Toyama BH & Weissman JS (2011) Structure amylo de : diversit conformationnelle et cons quences. Annu. R v. Biochem. 80, 557 585. Zhang C & Kim SH (2003) Vue d'ensemble de la g nomique structurale : de la structure la fonction. Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 28 32. Alberts B (1998) La cellule en tant que collection de machines prot ines : pr parer la prochaine g n ration de biologistes mol culaires. Cellule 92, 291 294. Benkovic SJ (1992) An
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Biologie moléculaire de la cellule	l'espace minuscule d'une cellule ? Les r ponses plusieurs de ces questions ont commenc merger dans les ann es 1940. cette poque, les chercheurs ont d couvert, partir d' tudes sur des champignons simples, que l'information g n tique consiste en grande partie en des instructions pour fabriquer des prot ines. Les prot ines sont des macromol cules incroyablement polyvalentes qui remplissent la plupart des fonctions cellulaires. Comme nous l'avons vu au chapitre 3, ils servent d' l ments constitutifs des structures cellulaires et forment les enzymes qui catalysent la plupart des r actions chimiques de la cellule. Ils r gulent galement l'expression des g nes (Chapitre 7), et ils permettent aux cellules de communiquer entre elles (Chapitre 15) et de se d placer (Chapitre 16). Les propri t s et les fonctions des cellules et des organismes sont d termin es dans une large mesure par les prot ines qu'elles sont capables de fabriquer. Des observations minutieuses de cellules et d'embryons la fin du XIXe si cle ont permis de reconna tre que l'information h r ditaire est port e par des chromosomes des structures filiformes dans le noyau d'une cellule eucaryote qui deviennent visibles par microscopie optique lorsque la cellule commence se diviser (Figure 4-1). Plus tard, lorsque l'analyse biochimique est devenue possible, on a d couvert que les chromosomes taient constitu s d'acide d soxyribonucl ique (ADN) et de prot ines, les deux tant pr sents peu pr s en quantit s gales. Pendant de nombreuses d cennies, on a pens que l'ADN n' tait qu'un Figure 4 1 Chromosomes dans les cellules. (A) Deux cellules v g tales adjacentes photographi es au microscope optique. L'ADN a t color avec un colorant fluorescent (DAPI) qui se lie celui-ci. L'ADN est pr sent dans les chromosomes, qui ne deviennent visibles en tant que structures distinctes au microscope optique que lorsqu'ils deviennent des structures compactes en forme de saucisse en pr paration de la division cellulaire, comme le montre la gauche. La cellule de droite, qui ne se divise pas, contient des chromosomes identiques, mais ils ne peuvent pas tre clairement distingu s cette phase du cycle de vie de la cellule, car ils sont dans une conformation plus tendue. (b) Sch ma des contours des deux cellules avec leurs chromosomes. (A, avec l'aimable autorisation de Peter Shaw.) l ment. Cependant, l'autre avanc e cruciale r alis e dans les ann es 1940 a t l'identification de l'ADN comme vecteur probable de l'information g n tique. Cette perc e dans notre compr hension des cellules est venue d' tudes sur l'h r dit chez les bact ries (Figure 4-2). Mais au d but des ann es 1950, la fa on dont les prot ines pouvaient tre sp cifi es par des instructions dans l'ADN et la fa on dont cette information pouvait tre copi e pour tre transmise d'une cellule l'autre semblaient compl tement myst rieuses. L' nigme a t soudainement r solue en 1953, lorsque James Watson et Francis Crick ont d riv le m canisme de leur mod le de structure de l'ADN. Comme indiqu au chapitre 1, la d termination de la structure en double h lice de l'ADN a imm diatement r solu le probl me de la fa on dont l'information de cette mol cule pouvait tre copi e ou r pliqu e. Il a galement fourni les premiers indices sur la fa on dont une mol cule d'ADN pourrait utiliser la s quence de ses sous-unit s pour coder les instructions de fabrication des prot ines. Aujourd'hui, le fait que l'ADN soit le mat riel g n tique est si fondamental pour la pens e biologique qu'il est difficile d'appr cier l' norme vide intellectuel qui a t combl par cette d couverte r volutionnaire. Nous commen ons ce chapitre en d crivant la structure de l'ADN. Nous voyons comment, malgr sa simplicit chimique, la structure et les propri t s chimiques de l'ADN le rendent id al comme mati re premi re des g nes. Nous examinons ensuite comment les nombreuses prot ines des chromosomes organisent et emballent cet ADN. L'empilement doit tre fait de mani re ordonn e afin que les chromosomes puissent tre r pliqu s et r partis correctement entre les deux cellules filles chaque division cellulaire. Et il doit galement permettre l'acc s l'ADN chromosomique, la fois pour les enzymes qui r parent les dommages l'ADN et pour les prot ines sp cialis es qui dirigent l'expression de ses nombreux g nes. Au cours des deux derni res d cennies, il y a eu une r volution dans notre capacit d terminer l'ordre exact des sous-unit s dans les mol cules d'ADN. Par cons quent, nous connaissons maintenant le ARN, prot ine, ADN, lipides, glucidesCellules vivantes de la souche R cultiv es en pr sence soit de cellules de la souche S tu es par la chaleur, soit de mol cules acellulaires test es pour la transformation des cellules de la souche Rextrait des cellules de la souche S CONCLUSION : Mol cules qui peuvent CONCLUSION : La mol cule qui porte l'information h r ditaire porte l'information h r ditaire pr sente dans les ce
Biologie moléculaire de la cellule	llules de souche S. est l'ADN. Figure 4 2 Premi re d monstration exp rimentale que l'ADN est le mat riel g n tique. Ces exp riences, men es dans les ann es 1920 (A) et 1940 (b), ont montr que l'ajout d'ADN purifi une bact rie modifiait les propri t s de celle-ci et que ce changement tait fid lement transmis aux g n rations suivantes. Deux souches troitement apparent es de la bact rie Streptococcus pneumoniae diff rent l'une de l'autre par leur apparence au microscope et leur pathog nicit . Une souche semble lisse (S) et provoque la mort lorsqu'elle est inject e chez la souris, et l'autre semble rugueuse (R) et n'est pas l tale. Une premi re exp rience montre qu'une substance pr sente dans la souche S peut changer (ou transformer) la souche R en souche S et que ce changement est h rit par les g n rations suivantes de bact ries. Cette exp rience, dans laquelle la souche R a t incub e avec diverses classes de mol cules biologiques purifi es partir de la souche S, identifie la substance active comme tant de l'ADN. s quence des 3,2 milliards de paires de nucl otides qui fournissent l'information n cessaire la production d'un adulte humain partir d'un uf f cond , ainsi que les s quences d'ADN de milliers d'autres organismes. Des analyses d taill es de ces s quences fournissent des informations passionnantes sur le processus d' volution, et c'est sur ce sujet que le chapitre se termine. Il s'agit du premier de quatre chapitres qui traitent des m canismes g n tiques de base, c'est- -dire de la mani re dont la cellule maintient, r plique et exprime l'information g n tique contenue dans son ADN. Dans le chapitre suivant (chapitre 5), nous aborderons les m canismes par lesquels la cellule r plique et r pare avec pr cision l'ADN ; Nous d crivons galement comment les s quences d'ADN peuvent tre r arrang es par le processus de recombinaison g n tique. L'expression des g nes, c'est- -dire le processus par lequel l'information cod e dans l'ADN est interpr t e par la cellule pour guider la synth se des prot ines, est le sujet principal du chapitre 6. Dans le chapitre 7, nous d crivons comment l'expression de ce g ne est contr l e par la cellule pour s'assurer que chacune des milliers de prot ines et de mol cules d'ARN crypt es dans son ADN n'est fabriqu e qu'au bon moment et au bon endroit dans la vie d'une cellule. Dans les ann es 1940, les biologistes avaient du mal concevoir comment l'ADN pouvait tre du mat riel g n tique. La mol cule semblait trop simple : un long polym re compos de seulement quatre types de sous-unit s nucl otidiques, qui se ressemblent chimiquement. Au d but des ann es 1950, l'ADN a t examin par analyse par diffraction des rayons X, une technique permettant de d terminer la structure atomique tridimensionnelle d'une mol cule (voir le chapitre 8). Les premiers r sultats de diffraction des rayons X indiquaient que l'ADN tait compos de deux brins du polym re enroul s en h lice. L'observation que l'ADN tait double brin a fourni l'un des principaux indices qui ont conduit au mod le Watson-Crick pour la structure de l'ADN qui, d s qu'il a t propos en 1953, a mis en vidence le potentiel de r plication et de stockage d'informations de l'ADN. Une mol cule d'ADN est constitu e de deux cha nes compl mentaires de nucl otides Une mol cule d'acide d soxyribonucl ique (ADN) se compose de deux longues cha nes polynucl otidiques compos es de quatre types de sous-unit s nucl otidiques. Chacune de ces cha nes est connue sous le nom de cha ne d'ADN ou de brin d'ADN. Les cha nes sont antiparall les l'une l'autre, et des liaisons hydrog ne entre les parties de base des nucl otides maintiennent les deux cha nes ensemble (Figure 4 3). Comme nous l'avons vu au chapitre 2 (panneau 2-6, pp. 100-101), les nucl otides sont compos s d'un sucre cinq atomes de carbone auquel sont attach s un ou plusieurs groupes phosphate et une base contenant de l'azote. Dans le cas des nucl otides de l'ADN, le sucre est du d soxyribose attach un seul groupe phosphate (d'o le nom d'acide d soxyribonucl ique), et la base peut tre soit l'ad nine (A), la cytosine (C), la guanine (G) ou la thymine (T). Les nucl otides sont li s de mani re covalente dans une cha ne travers les sucres et les phosphates, qui forment ainsi un squelette d'alternance sucre-phosphate-sucre-phosphate. Parce que seule la base diff re dans chacun des quatre types de sous-unit s nucl otidiques, chaque cha ne polynucl otidique de l'ADN est analogue un collier sucre-phosphate (l' pine dorsale), partir duquel pendent les quatre types de perles (les bases A, C, G et T). Ces m mes symboles (A, C, G et T) sont couramment utilis s pour d signer soit les quatre bases, soit les quatre nucl otides entiers, c'est- -dire les bases avec leurs groupes sucre et phosphate attach s. La fa on dont les nucl otides sont li s entre eux donne un brin d'ADN une polarit chimique. Si nous consid rons chaque sucre comme un bloc avec un bouton
Biologie moléculaire de la cellule	saillant (le phosphate 5) d'un c t et un trou (l'hydroxyle 3) de l'autre (voir figure 4-3), chaque cha ne compl te, form e de boutons imbriqu s avec des trous, aura toutes ses sous-unit s align es dans la m me orientation. De plus, les deux extr mit s de la cha ne seront facilement distinguables, car l'une a un trou (l'hydroxyle 3) et l'autre un bouton (le phosphate 5) son extr mit . Cette polarit dans une cha ne d'ADN est indiqu e par le fait qu'une extr mit est l'extr mit 3 et l'autre l'extr mit 5, noms d riv s de l'orientation du sucre d soxyribose. En ce qui concerne les l ments constitutifs de l'ADN de la capacit de transport d'informations du brin d'ADN ADN, la cha ne de nucl otides dans un brin d'ADN, tant la fois directionnelle et lin aire, peut tre lue peu pr s de la m me mani re que les lettres de cette page. La structure tridimensionnelle de l'ADN la double h lice de l'ADN d coule des caract ristiques chimiques et structurelles de ses deux cha nes polynucl otidiques. Parce que ces deux cha nes sont maintenues ensemble par une liaison hydrog ne entre les bases des diff rents brins, toutes les bases sont l'int rieur de la double h lice, et les squelettes sucre-phosphate sont l'ext rieur (voir Figure 4-3). Dans chaque cas, une base deux cycles plus volumineuse (une piine ; voir panneau 2-6, p. 100-101) est associ e une base un seul cycle (une pyrimidine) : A s'apparie toujours avec T, et G avec C (Figure 4-4). Cet appariement de bases compl mentaire permet aux paires de bases d' tre emball es dans l'arrangement nerg tiquement le plus favorable l'int rieur de la double h lice. Dans cet arrangement, chaque paire de bases est de largeur similaire, maintenant ainsi les squelettes sucre-phosphate une distance constante le long de la mol cule d'ADN. Pour maximiser l'efficacit de l'empilement des paires de bases, les deux squelettes sucre-phosphate s'enroulent l'un autour de l'autre pour former une double h lice droiti re, avec un tour complet tous les dix paires de bases (Figure 4 5). Les membres de chaque paire de bases ne peuvent s'embo ter dans la double h lice que si les deux brins de l'h lice sont antiparall les, c'est- -dire seulement si la polarit d'un brin est orient e l'oppos de celle de l'autre brin (voir figures 4-3 et 4-4). Une cons quence de la structure de l'ADN et des exigences d'appariement des bases est que chaque brin d'une mol cule d'ADN contient une s quence de nucl otides qui est exactement compl mentaire la s quence nucl otidique de son brin partenaire. Figure 4 3 L'ADN et ses l ments constitutifs. L'ADN est compos de quatre types de nucl otides, qui sont li s de mani re covalente en une cha ne polynucl otidique (un brin d'ADN) avec un squelette sucre-phosphate partir duquel les bases (A, C, g et T) s' tendent. Une mol cule d'ADN est compos e de deux brins d'ADN antiparall les maintenus ensemble par des liaisons hydrog ne entre les bases appari es. Les pointes de fl ches aux extr mit s des brins d'ADN indiquent les polarit s des deux brins. Dans le sch ma en bas gauche de la figure, la mol cule d'ADN est montr e redress e ; En r alit , il est d form en un double h lice, comme indiqu droite. Pour plus de d tails, reportez-vous la Figure 4 5 et la vid o 4.1. La structure de l'ADN fournit un m canisme pour l'h r dit La d couverte de la structure de l'ADN a imm diatement sugg r des r ponses aux deux questions les plus fondamentales sur l'h r dit . Premi rement, comment l'information permettant de sp cifier un organisme pourrait-elle tre transport e sous une forme chimique ? Et deuxi mement, comment cette information pourrait-elle tre dupliqu e et copi e de g n ration en g n ration ? La r ponse la premi re question est venue de la prise de conscience que l'ADN est un polym re lin aire de quatre types diff rents de monom res, enfil s dans une s quence d finie comme les lettres d'un document crit dans une criture alphab tique. La r ponse la deuxi me question provenait de la nature double brin de la structure : parce que chaque brin d'ADN contient une s quence de nucl otides qui est exactement compl mentaire la s quence nucl otidique de son brin partenaire, chaque brin peut agir comme un mod le, ou un moule, pour la synth se d'un nouveau brin compl mentaire. En d'autres termes, si nous d signons les deux brins d'ADN comme S et S, le brin 0,34 nm Figure 4 4 Paires de bases compl mentaires dans la double h lice de l'ADN. Les formes et les structures chimiques des bases ne permettent aux liaisons hydrog ne de se former efficacement qu'entre A et T et entre g et C, car les atomes capables de former des liaisons hydrog ne (voir panneau 2-3, pp. 94-95) peuvent alors tre rapproch s sans d former la double h lice. Comme indiqu , deux liaisons hydrog ne se forment entre A et T, tandis que trois se forment entre g et C. Les bases ne peuvent s'apparier de cette mani re que si les deux cha nes polynucl otidiques qui les contie
Biologie moléculaire de la cellule	nnent sont antiparall les l'une l'autre. Figure 4 5 La double h lice de l'ADN. Un mod le de remplissage spatial de 1,5 tour de la double h lice de l'ADN. Chaque tour d'ADN est compos de 10,4 paires de nucl otides, et la distance centre centre entre les paires de nucl otides adjacentes est de 0,34 nm. L'enroulement des deux brins l'un autour de l'autre cr e deux rainures dans la double h lice : la rainure la plus large est appel e la rainure principale, et la plus petite la rainure mineure, comme indiqu . Une courte section de la double h lice vue de c t , montrant quatre paires de bases. Les nucl otides sont li s entre eux de mani re covalente par des liaisons phosphodiester qui relient le groupe 3-hydroxyle (-OH) d'un sucre au groupe 5'-hydroxyle du sucre suivant. Ainsi, chaque brin polynucl otidique a une polarit chimique ; c'est- -dire que ses deux extr mit s sont chimiquement diff rentes. L'extr mit 5 du polym re d'ADN est par convention souvent repr sent e avec un groupe phosphate, tandis que l'extr mit 3 est repr sent e avec un hydroxyle. Le S peut servir de mod le pour la fabrication d'un nouveau brin S, tandis que le brin S peut servir de mod le pour la fabrication d'un nouveau brin S (figures 4-6). Ainsi, l'information g n tique de l'ADN peut tre copi e avec pr cision par le processus magnifiquement simple dans lequel le brin S se s pare du brin S, et chaque brin s par sert alors de mod le pour la production d'un nouveau brin partenaire compl mentaire qui est identique son ancien partenaire. La capacit de chaque brin d'une mol cule d'ADN servir de mod le pour la production d'un brin compl mentaire permet une cellule de copier ou de r pliquer son g nome avant de le transmettre ses descendants. Nous d crirons l' l gante machinerie que la cellule utilise pour accomplir cette t che au chapitre 5. Les organismes diff rent les uns des autres parce que leurs mol cules d'ADN respectives ont des s quences nucl otidiques diff rentes et, par cons quent, portent des messages biologiques diff rents. Mais comment l'alphabet nucl otidique est-il utilis pour faire des messages, et que pr cise-t-il ? Comme nous l'avons vu ci-dessus, on savait bien avant que la structure de l'ADN ne soit d termin e que les g nes contiennent le Instructions pour la production de prot ines. Si les g nes sont constitu s d'ADN, l'ADN doit donc d'une mani re ou d'une autre coder des prot ines (Figure 4-7). Comme nous l'avons vu au chapitre 3, les propri t s d'une prot ine, qui sont responsables de sa fonction biologique, sont d termin es par sa structure tridimensionnelle. Cette structure est d termin e son tour par la s quence lin aire des acides amin s qui la composent. La s quence lin aire des nucl otides dans un g ne doit donc d'une mani re ou d'une autre pr ciser la s quence lin aire des acides amin s dans une prot ine. La correspondance exacte entre l'alphabet nucl otidique de quatre lettres de l'ADN et l'alphabet des acides amin s de vingt lettres des prot ines le code g n tique n'est pas du tout vidente d'apr s la structure de l'ADN, et il a fallu plus d'une d cennie apr s la d couverte de la double h lice avant qu'elle ne soit labor e. Dans le chapitre 6, nous d crirons ce code en d tail au cours de l' laboration du processus d'expression g nique, par lequel une cellule convertit la s quence nucl otidique d'un g ne d'abord en s quence nucl otidique d'une mol cule d'ARN, puis en s quence d'acides amin s d'une prot ine. La r serve compl te d'informations dans l'ADN d'un organisme s'appelle son g nome, et elle sp cifie toutes les mol cules et prot ines d'ARN que l'organisme synth tisera jamais. (Le terme g nome est galement utilis pour d crire l'ADN qui porte cette information.) La quantit d'informations contenues dans les g nomes est stup fiante. La s quence nucl otidique d'un tr s petit g ne humain, crite dans l'alphabet nucl otidique de quatre lettres, occupe un quart de page de texte (Figure 4-8), tandis que la s quence compl te des nucl otides dans le g nome humain remplirait plus d'un millier de livres de la taille de celui-ci. En plus d'autres informations critiques, il comprend environ 21 000 g nes codant pour des prot ines, qui (par pissage alternatif ; voir p. 415) donnent naissance un nombre beaucoup plus grand de prot ines distinctes. Chez les eucaryotes, l'ADN est enferm dans un noyau cellulaire Comme d crit au chapitre 1, presque tout l'ADN d'une cellule eucaryote est s questr dans un noyau qui, dans de nombreuses cellules, occupe environ 10 % du volume total de la cellule. Ce compartiment est d limit par une enveloppe nucl aire form e de deux lipides concentriques Figure 4 6 L'ADN comme mod le pour sa propre duplication. parce que le nucl otide A ne s'apparie avec succ s qu'avec T et que g s'apparie avec C, chaque brin d'ADN peut servir de mod le pour sp cifier la s quence de nucl otides dans son brin compl mentaire. De cette fa on, l'ADN double h lice peut tre cop
Biologie moléculaire de la cellule	i avec pr cision, chaque h lice d'ADN parentale produisant deux h lices d'ADN filles identiques. Figure 4 7 La relation entre l'information g n tique contenue dans l'ADN et les prot ines. (Discut au chapitre 1.) Figure 4 7 La s quence nucl otidique du g ne de la -globine humaine. par convention, une s quence de nucl otides est crite de son extr mit 5 son extr mit 3, et elle doit tre lue de gauche droite en lignes successives sur la page comme s'il s'agissait d'un texte anglais normal. Ce g ne porte l'information pour la s quence d'acides amin s de l'un des deux types de sous-unit s de la mol cule d'h moglobine ; Un g ne diff rent, le g ne de la -globine, porte l'information pour l'autre. (L'h moglobine, la prot ine qui transporte l'oxyg ne dans le sang, a quatre sous-unit s, deux de chaque type.) Un seul des deux brins de la double h lice de l'ADN contenant le g ne de la -globine est repr sent ; L'autre brin a la s quence compl mentaire exacte. Les s quences d'ADN surlign es en jaune montrent les trois r gions du g ne qui sp cifient la s quence d'acides amin s de la prot ine -globine. nous verrons au chapitre 6 comment la cellule pisse ces trois s quences au niveau de l'ARN messager afin de synth tiser une prot ine de -globine pleine longueur. membranes bicouches (figures 4 9). Ces membranes sont perfor es intervalles r guliers par de grands pores nucl aires, travers lesquels les mol cules se d placent entre le noyau et le cytosol. L'enveloppe nucl aire est directement connect e au vaste syst me de membranes intracellulaires appel r ticulum endoplasmique, qui s' tendent partir de celui-ci dans le cytoplasme. Et il est m caniquement soutenu par un r seau de filaments interm diaires appel lame nucl aire un mince maillage semblable du feutre juste sous la membrane nucl aire interne (voir Figure 4-9B). L'enveloppe nucl aire permet aux nombreuses prot ines qui agissent sur l'ADN d' tre concentr es l o elles sont n cessaires dans la cellule et, comme nous le verrons dans les chapitres suivants, elle maintient galement les enzymes nucl aires et cytosoliques s par es, une caract ristique cruciale pour le bon fonctionnement des cellules eucaryotes. L'information g n tique est port e dans la s quence lin aire des nucl otides de l'ADN. Chaque mol cule d'ADN est une double h lice form e de deux brins antiparall les compl mentaires de nucl otides maintenus ensemble par des liaisons hydrog ne entre des paires de bases G-C et A-T. La duplication de l'information g n tique se produit par l'utilisation d'un brin d'ADN comme matrice pour la formation d'un brin compl mentaire. L'information g n tique stock e dans l'ADN d'un organisme contient les instructions pour toutes les mol cules et prot ines d'ARN que l'organisme synth tisera jamais et on dit qu'elle constitue son g nome. Chez les eucaryotes, l'ADN est contenu dans le noyau cellulaire, un grand compartiment d limit par une membrane. La fonction la plus importante de l'ADN est de transporter des g nes, l'information qui sp cifie toutes les mol cules et prot ines d'ARN qui composent un organisme, y compris des informations sur quand, dans quels types de cellules et en quelle quantit chaque mol cule d'ARN et prot ine doit tre fabriqu e. L'ADN nucl aire des eucaryotes est divis en chromosomes, et dans cette section, nous voyons comment les g nes sont g n ralement dispos s sur chaque chromosome. De plus, nous d crivons les s quences d'ADN sp cialis es qui sont n cessaires pour qu'un chromosome soit dupliqu avec pr cision en tant qu'entit distincte et transmis d'une g n ration l'autre. Nous sommes galement confront s au s rieux d fi de l'emballage de l'ADN. Si les doubles h lices comprenant les 46 chromosomes d'une cellule humaine pouvaient tre mises bout bout, elles atteindraient environ 2 m tres ; pourtant, le noyau, qui contient l'ADN, n'a qu'un diam tre d'environ 6 m. D'un point de vue g om trique, cela quivaut entasser 40 km (24 miles) de fil extr mement fin dans une balle de tennis. La t che complexe d'empaquetage de l'ADN est accomplie par des prot ines sp cialis es qui se lient l'ADN et le plient, g n rant une s rie de bobines et de boucles organis es qui fournissent des niveaux d'organisation de plus en plus lev s et emp chent l'ADN de devenir un enchev trement ing rable. tonnamment, bien que l'ADN soit tr s compact , il reste n anmoins accessible aux nombreuses enzymes de la cellule qui le r pliquent, le r parent et utilisent ses g nes pour produire des mol cules d'ARN et des prot ines. r ticulum endoplasmique pore nucl aire membrane nucl aire externe membrane nucl aire enveloppe nucl aire lamina nucl aire microtubule centrosome nucl ole ADN et prot ines associ es (chromatine), plus de nombreuses mol cules d'ARN et de prot ines 2 m (A) (B) enveloppe nucl aire h t rochromatineh t rochromatine Figure 4 9 Vue en coupe transversale d'un noyau cellulaire typique. (A) Micrographie lectronique d'une lame mince
Biologie moléculaire de la cellule	travers le noyau d'un fibroblaste humain. (b) Sch ma montrant que l'enveloppe nucl aire est constitu e de deux membranes, la externe tant continue avec la membrane du r ticulum endoplasmique (RE) (voir aussi les figures 12 7). L'espace l'int rieur du r ticulum endoplasmique (la lumi re du RE) est color en jaune ; Il est continu avec l'espace entre les deux membranes nucl aires. Les bicouches lipidiques des membranes nucl aires interne et externe sont connect es chaque pore nucl aire. Un r seau en forme de feuille de filaments interm diaires (brun) l'int rieur du noyau forme la lame nucl aire (marron), fournissant un support m canique l'enveloppe nucl aire (pour plus de d tails, voir le chapitre 12). L'h t rochromatine coloration fonc e contient des r gions d'ADN sp cialement condens es qui seront discut es plus tard. (A, avec l'aimable autorisation de Jordan et J. McGovern.) L'ADN eucaryote est emball dans un ensemble de chromosomes Chaque chromosome d'une cellule eucaryote se compose d'une seule mol cule d'ADN lin aire extr mement longue ainsi que des prot ines qui plient et emballent le fil d'ADN fin en une structure plus compacte. En plus des prot ines impliqu es dans l'emballage, les chromosomes sont galement associ s de nombreuses autres prot ines (ainsi qu' de nombreuses mol cules d'ARN). Ceux-ci sont n cessaires aux processus d'expression des g nes, de r plication de l'ADN et de r paration de l'ADN. Le complexe de l'ADN et des prot ines troitement li es est appel chromatine (du grec chroma, couleur , en raison de ses propri t s de coloration). Les bact ries n'ont pas de compartiment nucl aire sp cial, et elles portent g n ralement leurs g nes sur une seule mol cule d'ADN, qui est souvent circulaire (voir Figure 1-24). Cet ADN est galement associ des prot ines qui l'emballent et le condensent, mais elles sont diff rentes des prot ines qui remplissent ces fonctions chez les eucaryotes. Bien que l'ADN bact rien et les prot ines qui l'accompagnent soient souvent appel s chromosomes bact riens, ils n'ont pas la m me structure que les chromosomes eucaryotes, et on en sait moins sur la fa on dont l'ADN bact rien est emball . Par cons quent, notre discussion sur la structure des chromosomes se concentrera presque enti rement sur les chromosomes eucaryotes. l'exception des gam tes (ovules et spermatozo des) et de quelques types de cellules hautement sp cialis s qui ne peuvent pas se multiplier et qui n'ont pas d'ADN (par exemple, les globules rouges) ou qui ont r pliqu leur ADN sans terminer la division cellulaire (par exemple, les m gacaryocytes), chaque noyau de cellule humaine contient deux copies de chaque chromosome, l'une h rit e de la m re et l'autre du p re. Les chromosomes maternels et paternels d'une paire sont appel s chromosomes homologues (homologues). Les seules paires de chromosomes non homologues sont les chromosomes sexuels chez les hommes, o un chromosome Y est h rit du p re et un chromosome X de la m re. Ainsi, chaque cellule humaine contient un total de 46 chromosomes 22 paires communes aux m les et aux femelles, plus deux chromosomes dits sexuels (X et Y chez les m les, deux X chez les femelles). Ces chromosomes humains peuvent tre facilement distingu s en peignant chacun d'une couleur diff rente l'aide d'une technique bas e sur l'hybridation de l'ADN (Figure 4 10). Dans cette m thode (d crite en d tail au chapitre 8), un court brin d'acide nucl ique marqu avec un colorant fluorescent sert de sonde qui s lectionne sa s quence d'ADN compl mentaire, allumant le chromosome cible n'importe quel endroit o il se lie. La peinture chromosomique est le plus souvent effectu e l' tape du cycle cellulaire appel e mitose, lorsque les chromosomes sont particuli rement compacts et faciles visualiser (voir ci-dessous). Une autre fa on plus traditionnelle de distinguer un chromosome d'un autre est de les colorer avec des colorants qui r v lent un motif frappant et reproductible de bandes le long de chaque chromosome mitotique (Figure 4-11). Ces mod les de bandes refl tent probablement des variations dans la structure de la chromatine, mais leur base n'est pas bien comprise. N anmoins, le motif des bandes sur chaque type de chromosome est unique et a fourni les premiers moyens d'identifier et de num roter chaque chromosome humain de mani re fiable. Figure 4 10 L'ensemble complet des chromosomes humains. Ces chromosomes, provenant d'une femelle, ont t isol s d'une cellule en division nucl aire (mitose) et sont donc tr s compact s. Chaque chromosome a t peint d'une couleur diff rente pour permettre son identification sans ambigu t au microscope fluorescence, en utilisant une technique appel e caryotype spectral . La peinture chromosomique peut tre r alis e en exposant les chromosomes une grande collection de mol cules d'ADN dont la s quence correspond des s quences d'ADN connues du g nome humain. L'ensemble des s quences co
Biologie moléculaire de la cellule	rrespondant chaque chromosome est coupl une combinaison diff rente de colorants fluorescents. Les mol cules d'ADN d riv es du chromosome 1 sont marqu es avec une combinaison de colorants sp cifique, celles du chromosome 2 avec une autre, et ainsi de suite. parce que l'ADN marqu ne peut former des paires de bases, ou s'hybrider, qu'avec le chromosome partir duquel il a t d riv , chaque chromosome est marqu avec une combinaison diff rente de colorants. Pour de telles exp riences, les chromosomes sont soumis des traitements qui s parent les deux brins d'ADN double h lice d'une mani re qui permet l'appariement des bases avec l'ADN marqu simple brin, mais maintient la structure globale du chromosome relativement intacte. (A) Les chromosomes visualis s tels qu'ils se sont r pandus l'origine de la cellule lys e. Les m mes chromosomes sont align s artificiellement dans leur ordre num rique. Cette disposition de l'ensemble complet des chromosomes est appel e caryotype. (Adapt de N. mcNeil et T. Ried, Expert Rev. Mol. Med. 2:1 14, 2000. avec l'autorisation de Cambridge University Press.) Figure 4 11 Les motifs de bandes des chromosomes humains. Les chromosomes 1 22 sont num rot s par ordre approximatif de taille. Une cellule humaine typique contient deux de chacun de ces chromosomes, plus deux chromosomes sexuels : deux chromosomes X chez une femme, un chromosome X et un chromosome Y chez un homme. Les chromosomes utilis s pour fabriquer ces cartes ont t color s un stade pr coce de la mitose, lorsque les chromosomes sont incompl tement compact s. La ligne rouge horizontale repr sente la position du centrom re (voir Figure 4-19), qui appara t comme une constriction sur les chromosomes mitotiques. Les boutons rouges sur les chromosomes 13, 14, 15, 21 et 22 indiquent les positions des g nes qui codent pour les grands ARN ribosomiques (discut s au chapitre 6). Ces motifs de bandes sont obtenus en colorant les chromosomes avec une coloration giemsa, et ils peuvent tre observ s au microscope optique. (Adapt de U. Francke, Cytogenet. Genete cellulaire. 31:24 32, 1981. avec la permission de l'auteur.) Figure 4 12 Chromosomes humains aberrants. (A) Deux chromosomes humains normaux, 4 et 6. (b) Chez un individu porteur d'une translocation chromosomique quilibr e, la double h lice d'ADN d'un chromosome s'est crois e avec la double h lice d'ADN de l'autre chromosome en raison d'un v nement de recombinaison anormal. La technique de peinture chromosomique utilis e sur les chromosomes de chacun des ensembles permet d'identifier m me de courts morceaux de chromosomes qui ont t transloqu s, un v nement fr quent dans les cellules canc reuses. (Avec l'aimable autorisation de Zhenya Tang et du NIgmS Human genetic Cell Repository de l'Institut Coriell pour la recherche m dicale : gm21880.) L'affichage des 46 chromosomes humains la mitose est appel caryotype humain. Si des parties des chromosomes sont perdues ou sont commut es entre les chromosomes, ces changements peuvent tre d tect s soit par des changements dans les motifs de bandes, soit, avec une plus grande sensibilit , par des changements dans le motif de peinture des chromosomes (Figure 4 12). Les cytog n ticiens utilisent ces alt rations pour d tecter les anomalies chromosomiques h r ditaires et pour r v ler les r arrangements chromosomiques qui se produisent dans les cellules canc reuses lorsqu'elles voluent vers la malignit (voir le chapitre 20). Les chromosomes contiennent de longues cha nes de g nes Les chromosomes portent des g nes, les unit s fonctionnelles de l'h r dit . Un g ne est souvent d fini comme un segment d'ADN qui contient les instructions pour fabriquer une prot ine particuli re (ou un ensemble de prot ines troitement apparent es), mais cette d finition est trop troite. Les g nes qui codent pour les prot ines sont en effet la majorit , et la plupart des g nes avec des ph notypes mutants clairs tombent sous cette rubrique. En outre, il existe de nombreux g nes d'ARN des segments d'ADN qui g n rent une mol cule d'ARN fonctionnellement significative, au lieu d'une prot ine, comme produit final. Nous en dirons plus sur les g nes de l'ARN et leurs produits plus tard. Comme on pouvait s'y attendre, il existe une certaine corr lation entre la complexit d'un organisme et le nombre de g nes dans son g nome (voir tableau 1-2, p. 29). Par exemple, certaines bact ries simples n'ont que 500 g nes, contre environ 30 000 pour les humains. Les bact ries, les arch es et certains eucaryotes unicellulaires, comme les levures, ont des g nomes concis, compos s d'un peu plus que des cha nes de g nes troitement emball s. Cependant, les g nomes des plantes et des animaux multicellulaires, ainsi que de nombreux autres eucaryotes, contiennent, en plus des g nes, une grande quantit d'ADN intercal dont la fonction est mal comprise (Figure 4 13). Une partie de cet ADN suppl mentaire est cruciale pour le bon contr le de l'expressio
Biologie moléculaire de la cellule	n des g nes, ce qui peut expliquer en partie pourquoi il y en a tant dans les organismes multicellulaires, dont les g nes doivent tre activ s et d sactiv s selon des r gles compliqu es au cours du d veloppement (discut es dans les chapitres 7 et 21). Les diff rences dans la quantit d'ADN intercal e entre les g nes, bien plus que les diff rences dans le nombre de g nes, expliquent les variations tonnantes de la taille du g nome que nous observons lorsque nous comparons une esp ce une autre (voir Figure 1-32). Par exemple, le g nome humain est 200 fois plus grand que celui de la levure Saccharomyces cerevisiae, mais 30 fois plus petit que celui de certaines plantes et amphibiens et 200 fois plus petit que celui d'une esp ce d'amibe. De plus, en raison des diff rences dans la quantit d'ADN non codant, les g nomes d'organismes troitement apparent s (poissons osseux, par exemple) peuvent varier de plusieurs centaines de fois leur contenu en ADN, m me s'ils contiennent peu pr s le m me nombre de g nes. Quel que soit l'exc dent Figure 4 13 L'arrangement des g nes dans le g nome de S. cerevisiae par rapport aux humains. (A) S. cerevisiae est une levure bourgeonnante largement utilis e pour le brassage et la p tisserie. Le g nome de cet eucaryote unicellulaire est r parti sur 16 chromosomes. Une petite r gion d'un chromosome a t s lectionn e arbitrairement pour montrer sa forte densit de g nes. (b) Une r gion du g nome humain de longueur gale au segment de levure en (A). Les g nes humains sont beaucoup moins denses et la quantit de s quences d'ADN intercal es est beaucoup plus importante. Ce n'est pas d montr dans cet chantillon d'ADN humain que la plupart des g nes humains sont beaucoup plus longs que les g nes de levure (voir Figure 4-15). L'ADN peut faire l'affaire, il semble clair que ce n'est pas un grand handicap pour une cellule eucaryote d'en porter une grande quantit . La fa on dont le g nome est divis en chromosomes diff re galement d'une esp ce eucaryote l'autre. Par exemple, alors que les cellules de l'homme ont 46 chromosomes, celles de certains petits cerfs n'en ont que 6, tandis que celles de la carpe commune en contiennent plus de 100. M me des esp ces troitement apparent es avec des tailles de g nome similaires peuvent avoir des nombres et des tailles de chromosomes tr s diff rents (Figure 4-14). Ainsi, il n'y a pas de relation simple entre le nombre de chromosomes, la complexit de l'organisme et la taille totale du g nome. Au contraire, les g nomes et les chromosomes des esp ces modernes ont chacun t fa onn s par une histoire unique d' v nements g n tiques apparemment al atoires, influenc s par des pressions de s lection mal comprises au cours de longues p riodes d' volution. La s quence nucl otidique du g nome humain montre comment nos g nes sont organis s Avec la publication de la s quence d'ADN compl te du g nome humain en 2004, il est devenu possible de voir en d tail comment les g nes sont dispos s le long de chacun de nos chromosomes (Figure 4 15). Il faudra de nombreuses d cennies avant que l'information contenue dans la s quence du g nome humain ne soit enti rement analys e, mais elle a d j stimul de nouvelles exp riences qui ont eu des effets majeurs sur le contenu de chaque chapitre de ce livre. (A) chromosome 22 humain dans sa conformation mitotique, compos de deux mol cules d'ADN double brin, chacune de 48 106 paires de nucl otides de long 10% du bras chromosomique ~40 g nes (B) 10 1% du bras chromosomique contenant 4 g nes (C) un g ne de 3,4 104 paires de nucl otides (D) intron d'exon Figure 4 14 Deux esp ces de cerfs troitement apparent es avec des nombres chromosomiques tr s diff rents. Dans l' volution du muntjac indien, les chromosomes s par s ont d'abord fusionn , sans avoir d'effet majeur sur l'animal. Ces deux esp ces contiennent un nombre similaire de g nes. (Photo de muntjac chinois avec l'aimable autorisation de Deborah Carreno, Natural wonders Photography.) Figure 4 15 L'organisation des g nes sur un chromosome humain. (A) Le chromosome 22, l'un des plus petits chromosomes humains, contient 48 106 paires de nucl otides et repr sente environ 1,5 % du g nome humain. la majeure partie du bras gauche du chromosome 22 est constitu e de courtes s quences r p t es d'ADN qui sont emball es dans une forme particuli rement compacte de chromatine (h t rochromatine) dont il est question plus loin dans ce chapitre. (b) Une expansion d cupl e d'une partie du chromosome 22, avec environ 40 g nes indiqu s. Ceux en brun fonc sont des g nes connus et ceux en rouge sont des g nes pr dits. (C) Une partie largie de (b) montrant quatre g nes. (D) L'arrangement intron-exon d'un g ne typique est montr apr s une expansion suppl mentaire d cupl e. Chaque exon (en rouge) code pour une partie de la prot ine, tandis que la s quence d'ADN des introns (en gris) est relativement peu importante, comme nous l'avons vu en d tail au chapitre 6. Le g nome humain (3
Biologie moléculaire de la cellule	,2 109 paires de nucl otides) est l'ensemble de l'information g n tique appartenant notre esp ce. La quasi-totalit de ce g nome est r partie sur les 22 autosomes diff rents et les 2 chromosomes sexuels (voir figures 4-10 et 4-11) trouv s dans le noyau. Une fraction infime du g nome humain (16 569 paires de nucl otides, en plusieurs copies par cellule) se trouve dans les mitochondries (pr sent es au chapitre 1 et discut es en d tail au chapitre 14). Le terme s quence du g nome humain fait r f rence la s quence nucl otidique compl te de l'ADN dans les 24 chromosomes nucl aires et les mitochondries. tre diplo de, somatique humaine Le noyau cellulaire contient environ deux fois la quantit haplo de d'ADN, soit 6,4 109 paires de nucl otides, lorsqu'il ne duplique pas ses chromosomes en pr paration de la division. (Adapt de l'International Human genome Sequencing Consortium, Nature 409:860-921, 2001. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) La premi re caract ristique frappante du g nome humain est le peu de code (seulement quelques pour cent) pour les prot ines (tableau 4-1 et figure 4-16). Il est galement noter que pr s de la moiti de l'ADN chromosomique est constitu e de morceaux d'ADN mobiles qui se sont progressivement ins r s dans les chromosomes au cours de l' volution, se multipliant comme des parasites dans le g nome (voir Figure 4-62). Nous aborderons en d tail ces l ments transposables dans les chapitres suivants. Une deuxi me caract ristique notable du g nome humain est la grande taille moyenne des g nes, soit environ 27 000 paires de nucl otides. Comme nous l'avons vu ci-dessus, un g ne typique porte dans sa s quence lin aire de nucl otides l'information n cessaire la s quence lin aire des acides amin s d'une prot ine. Seulement environ 1300 paires de nucl otides sont n cessaires pour coder une prot ine de taille moyenne (environ 430 acides amin s chez l'homme). La majeure partie de la s quence restante d'un g ne est constitu e de longs segments d'ADN non codant qui interrompent les segments d'ADN relativement courts qui codent pour la prot ine. Comme nous le verrons en d tail au chapitre 6, les s quences codantes sont appel es exons ; les s quences interm diaires (non codantes) dans les g nes sont appel es introns (voir Figure 4 15 et Tableau 4 1). La majorit des g nes humains sont donc constitu s d'une longue cha ne d'exons et d'introns altern s, la plupart des g nes tant constitu s d'introns. En revanche, la majorit des g nes d'organismes g nome concis n'ont pas d'introns. Cela explique la taille beaucoup plus petite de leurs g nes (environ un vingti me de celle des g nes humains), ainsi que la fraction beaucoup plus lev e d'ADN codant dans leurs chromosomes. Figure 4 16 chelle du g nome humain. S'il tait dessin avec un espace de 1 mm entre chaque paire de nucl otides, comme en (A), le g nome humain s' tendrait sur 3200 km (environ 2000 miles), assez loin pour s' tendre travers le centre de l'Afrique, le site de nos origines humaines (ligne rouge en b). cette chelle, il y aurait, en moyenne, un g ne codant pour une prot ine tous les 150 m. Un g ne moyen s' tendrait sur 30 m, mais la somme des s quences codantes de ce g ne ne repr senterait qu'un peu plus d'un m tre. En plus des introns et des exons, chaque g ne est associ des s quences d'ADN r gulatrices, qui sont charg es de s'assurer que le g ne est activ ou d sactiv au bon moment, exprim au niveau appropri et uniquement dans le bon type de cellule. Chez l'homme, les s quences r gulatrices d'un g ne typique sont r parties sur des dizaines de milliers de paires de nucl otides. Comme on pouvait s'y attendre, ces s quences r gulatrices sont beaucoup plus compress es chez les organismes g nomes concis. Nous abordons le fonctionnement des s quences d'ADN r gulatrices au chapitre 7. Les recherches de la derni re d cennie ont surpris les biologistes en d couvrant qu'en plus des 21 000 g nes codant pour des prot ines, le g nome humain contient plusieurs milliers de g nes qui codent pour des mol cules d'ARN qui ne produisent pas de prot ines, mais ont plut t une vari t d'autres fonctions importantes. Ce que l'on sait jusqu' pr sent de ces mol cules sera pr sent dans les chapitres 6 et 7. Enfin, et ce n'est pas le moins important, la s quence nucl otidique du g nome humain a r v l que les archives d'informations n cessaires la production d'un humain semblent tre dans un tat de chaos alarmant. Comme l'a d crit un commentateur de notre g nome : D'une certaine mani re, il peut ressembler votre garage/chambre/r frig rateur/vie : tr s individualiste, mais n glig ; peu de signes d'organisation ; beaucoup d'encombrement accumul (appel camelote par les non-initi s) ; pratiquement rien n'a jamais t jet ; et les quelques objets de valeur vidente parpill s sans discernement, apparemment n gligemment, un peu partout. Nous discuterons de la fa on dont cela se serait produit dans les derni
Biologie moléculaire de la cellule	res sections de ce chapitre intitul Comment les g nomes voluent . Chaque mol cule d'ADN qui forme un chromosome lin aire doit contenir un centrom re, deux t lom res et des origines de r plication Pour former un chromosome fonctionnel, une mol cule d'ADN doit tre capable de faire plus que simplement porter des g nes : elle doit tre capable de se r pliquer, et les copies r pliqu es doivent tre s par es et partitionn es de mani re fiable en cellules filles chaque division cellulaire. Ce processus se produit travers une s rie ordonn e d' tapes, collectivement connues sous le nom de cycle cellulaire, qui pr voit une s paration temporelle entre la duplication des chromosomes et leur s gr gation en deux cellules filles. Le cycle cellulaire est bri vement r sum dans la figure 4-17, et il est discut en d tail au chapitre 17. Bri vement, au cours d'une longue interphase, les g nes sont exprim s et les chromosomes sont r pliqu s, les deux r pliques restant ensemble comme une paire de chromatides s urs. Pendant tout ce temps, les chromosomes sont tendus et une grande partie de leur chromatine existe sous forme de longs fils dans le noyau, de sorte que les chromosomes individuels ne peuvent pas tre facilement distingu s. Ce n'est que pendant une p riode de mitose beaucoup plus br ve que chaque chromosome se condense de sorte que ses deux chromatides s urs peuvent tre s par es et distribu es aux deux noyaux filles. Les chromosomes hautement condens s d'une cellule en division sont connus sous le nom de chromosomes mitotiques (Figure 4-18). C'est sous cette forme que les chromosomes sont le plus facilement visualis s ; En fait, les images de chromosomes montr es jusqu' pr sent dans le chapitre sont des chromosomes en mitose. Chaque chromosome fonctionne comme une unit structurelle distincte : pour qu'une copie soit transmise chaque cellule fille lors de la division, chaque chromosome doit tre capable de se r pliquer, et les copies nouvellement r pliqu es doivent ensuite tre s par es et partitionn es Figure 4 17 Une vue simplifi e du cycle cellulaire eucaryote. Pendant l'interphase, la cellule exprime activement ses g nes et synth tise donc des prot ines. De plus, pendant l'interphase et avant la division cellulaire, l'ADN est r pliqu et chaque chromosome est dupliqu pour produire deux mol cules d'ADN s urs troitement appari es (appel es chromatides s urs). Une cellule avec un seul type de chromosome, pr sente dans les copies maternelles et paternelles, est illustr e ici. Une fois la r plication de l'ADN termin e, la cellule peut entrer en phase M, lorsque la mitose se produit et que le noyau est divis en deux noyaux filles. Au cours de cette tape, les chromosomes se condensent, l'enveloppe nucl aire se d compose et le fuseau mitotique se forme partir de microtubules et d'autres prot ines. Les chromosomes mitotiques condens s sont captur s par le fuseau mitotique, et un ensemble complet de chromosomes est ensuite tir chaque extr mit de la cellule en s parant les membres de chaque paire de chromatides s urs. Une enveloppe nucl aire se reforme autour de chaque ensemble de chromosomes et, dans la derni re tape de la phase m, la cellule se divise pour produire deux cellules filles. la majeure partie du cycle cellulaire est pass e en interphase ; La phase M est br ve en comparaison, n'occupant qu'environ une heure dans de nombreuses cellules de mammif res. enveloppe nucl aire entourant le noyau INTERPHASE M PHASE INTERPHASE correctement dans les deux cellules filles. Ces fonctions de base sont contr l es par trois types de s quences nucl otidiques sp cialis es dans l'ADN, chacune d'entre elles se liant des prot ines sp cifiques qui guident la machinerie qui r plique et s pare les chromosomes (Figure 4 19). Des exp riences sur des levures, dont les chromosomes sont relativement petits et faciles manipuler, ont permis d'identifier les l ments minimaux de la s quence d'ADN responsables de chacune de ces fonctions. Un type de s quence nucl otidique agit comme une origine de r plication de l'ADN, l'endroit o la duplication de l'ADN commence. Les chromosomes eucaryotes contiennent de nombreuses origines de r plication pour garantir que l'ensemble du chromosome peut tre r pliqu rapidement, comme discut en d tail au chapitre 5. Apr s la r plication de l'ADN, les deux chromatides s urs qui forment chaque chromosome restent attach es l'une l'autre et, au fur et mesure que le cycle cellulaire se poursuit, se condensent davantage pour produire des chromosomes mitotiques. La pr sence d'une deuxi me s quence d'ADN sp cialis e, appel e centrom re, permet d'attirer une copie de chaque chromosome dupliqu et condens dans chaque cellule fille lorsqu'une cellule se divise. Un complexe prot ique appel kin tochore se forme au niveau du centrom re et attache les chromosomes dupliqu s au fuseau mitotique, ce qui leur permet d' tre s par s (voir le chapitre 17). La troisi me s quence d'ADN sp c
Biologie moléculaire de la cellule	ialis e forme les t lom res, les extr mit s d'un chromosome. Les t lom res contiennent des s quences nucl otidiques r p t es qui permettent aux extr mit s des chromosomes d' tre r pliqu es efficacement. Les t lom res remplissent galement une autre fonction : les s quences r p t es d'ADN des t lom res, ainsi que les r gions adjacentes, forment des structures qui prot gent l'extr mit du chromosome contre la confusion avec la cellule avec une mol cule d'ADN bris e n cessitant une r paration. Nous abordons la fois ce type de r paration et la structure et la fonction des t lom res au chapitre 5. Dans les cellules de levure, les trois types de s quences n cessaires la propagation d'un chromosome sont relativement courts (g n ralement moins de 1000 paires de bases chacune) et n'utilisent donc qu'une infime fraction de la capacit de transport d'information d'un chromosome. Bien que les s quences de t lom res soient assez simples et courtes chez tous les eucaryotes, les s quences d'ADN qui forment les centrom res et les origines de r plication chez les organismes plus complexes sont beaucoup plus longues que leurs homologues levures. Par exemple, des exp riences sugg rent qu'un centrom re humain peut contenir jusqu' un million de paires de nucl otides et qu'il peut ne pas n cessiter un tron on d'ADN avec une s quence nucl otidique d finie. Au lieu de cela, comme nous le verrons plus loin dans ce chapitre, on pense qu'un centrom re humain est constitu d'une grande structure prot ine-acide nucl ique qui se r p te r guli rement et qui peut tre h rit e lorsqu'un chromosome se r plique. Figure 4 18 Un chromosome mitotique. Un chromosome mitotique est un chromosome dupliqu condens dans lequel les deux nouveaux chromosomes, appel s chromatides s urs, sont toujours li s ensemble (voir Figure 4 17). La r gion r tr cie indique la position du centrom re. (Avec l'aimable autorisation de Terry D. Allen.) Figure 4 19 Les trois s quences d'ADN n cessaires la production d'un chromosome eucaryote qui peut tre r pliqu puis s gr gu avec pr cision lors de la mitose. Chaque chromosome a plusieurs origines de r plication, un centrom re et deux t lom res. Voici la s quence d' v nements qu'un chromosome typique suit au cours du cycle cellulaire. L'ADN se r plique en interphase, en commen ant par les origines de la r plication et en proc dant de mani re bidirectionnelle partir des origines travers le chromosome. En phase m, le centrom re attache les chromosomes dupliqu s au fuseau mitotique de sorte qu'une copie du g nome entier est distribu e chaque cellule fille pendant la mitose ; La structure sp ciale qui attache le centrom re au fuseau est un complexe prot ique appel kin tochore (vert fonc ). Le centrom re aide galement maintenir les chromosomes dupliqu s ensemble jusqu' ce qu'ils soient pr ts tre s par s. Les t lom res forment des capuchons sp ciaux chaque extr mit du chromosome. Tous les organismes eucaryotes ont des fa ons sp ciales d'emballer l'ADN dans les chromosomes. Par exemple, si les 48 millions de paires de nucl otides d'ADN du chromosome 22 humain pouvaient tre dispos es en une longue double h lice parfaite, la mol cule s' tendrait sur environ 1,5 cm si elle tait tir e d'un bout l'autre. Mais le chromosome 22 ne mesure qu'environ 2 m de long en mitose (voir figures 4-10 et 4-11), ce qui repr sente un rapport de compactage de bout en bout de plus de 7000 fois. Cet exploit remarquable de compression est r alis par des prot ines qui enroulent et plient successivement l'ADN des niveaux d'organisation de plus en plus lev s. Bien que beaucoup moins condens que les chromosomes mitotiques, l'ADN des chromosomes interphases humains est toujours tr s dense. En lisant ces sections, il est important de garder l'esprit que la structure des chromosomes est dynamique. Nous avons vu que chaque chromosome se condense un degr extr me dans la phase M du cycle cellulaire. Beaucoup moins visibles, mais d'un int r t et d'une importance normes, des r gions sp cifiques des chromosomes interphases se d condensent pour permettre l'acc s des s quences d'ADN sp cifiques pour l'expression des g nes, la r paration et la r plication de l'ADN, puis se recondensent lorsque ces processus sont termin s. L'empaquetage des chromosomes est donc r alis de mani re permettre un acc s rapide, localis et la demande l'ADN. Dans les sections suivantes, nous aborderons les prot ines sp cialis es qui rendent ce type d'emballage possible. Les nucl osomes sont une unit de base de la structure des chromosomes eucaryotesLes prot ines qui se lient l'ADN pour former des chromosomes eucaryotes sont traditionnellement divis es en deux classes : les histones et les prot ines chromosomiques non-histones, chacune contribuant peu pr s la m me masse un chromosome que l'ADN. Le complexe des deux classes de prot ines avec l'ADN nucl aire des cellules eucaryotes est connu sous le nom de chromatine (Figure 4-
Biologie moléculaire de la cellule	20). Les histones sont responsables du premier et du plus fondamental niveau de l'empilement chromosomique, le nucl osome, un complexe prot ine-ADN d couvert en 1974. Lorsque les noyaux interphasiques sont ouverts tr s doucement et que leur contenu est examin au microscope lectronique, la majeure partie de la chromatine semble se pr senter sous la forme d'une fibre d'un diam tre d'environ 30 nm (Figure 4-21A). Si cette chromatine est soumise des traitements qui la font se d plier partiellement, elle peut tre vue au microscope lectronique comme une s rie de perles sur un fil (Figure 4-21B). La cha ne est de l'ADN, et chaque perle est une particule de noyau de nucl osome qui se compose d'ADN enroul autour d'un noyau d'histones (vid o 4.2). L'organisation structurelle des nucl osomes a t d termin e apr s les avoir d'abord isol s de la chromatine d pli e par digestion avec des enzymes particuli res (appel es nucl ases) qui d composent l'ADN en coupant entre les nucl osomes. Apr s une digestion de courte dur e, l'ADN expos entre les particules du noyau du nucl osome, l'ADN de liaison, est d grad . Chaque particule centrale de nucl osome individuelle est constitu e d'un complexe de huit prot ines d'histones, soit deux mol cules d'histones H2A, Figure 4 20 Chromatine. Comme illustr , la chromatine est constitu e d'ADN li la fois aux prot ines histones et non histones. La masse de prot ines histones pr sente est peu pr s gale la masse totale de prot ines non-histones, mais, comme sch matiquement indiqu ici, cette derni re classe est compos e d'un grand nombre d'esp ces diff rentes. Au total, un chromosome est compos d'environ un tiers d'ADN et de deux tiers de prot ines en masse. H2B, H3 et H4 et de l'ADN double brin de 147 paires de nucl otides. L'octam re d'histones forme un noyau prot ique autour duquel l'ADN double brin est enroul (Figure 4 22). La r gion de l'ADN de liaison qui s pare chaque particule centrale de nucl osome de la suivante peut varier en longueur, de quelques paires de nucl otides environ 80. (Le terme nucl osome fait techniquement r f rence une particule de noyau de nucl osome plus l'un de ses liants d'ADN adjacents, mais il est souvent utilis comme synonyme de particule de noyau de nucl osome.) En moyenne, les nucl osomes se r p tent donc des intervalles d'environ 200 paires de nucl otides. Par exemple, une cellule humaine diplo de avec 6,4 109 paires de nucl otides contient environ 30 millions de nucl osomes. La formation de nucl osomes convertit une mol cule d'ADN en un fil de chromatine sur environ un tiers de sa longueur initiale. La structure de la particule centrale du nucl osome r v le comment l'ADN est emball La structure haute r solution d'une particule de noyau de nucl osome, r solue en 1997, a r v l un noyau d'histones en forme de disque autour duquel l'ADN tait troitement enroul dans une bobine gauche de 1,7 tour (Figure 4-23). Les quatre histones qui composent le noyau du nucl osome sont des prot ines relativement petites (102 135 acides amin s), et elles partagent un motif structurel, connu sous le nom de repli des histones, form de trois h lices reli es par deux boucles (Figure 4-24). Lors de l'assemblage d'un nucl osome, les repliements d'histones se lient d'abord les uns aux autres pour former des dim res H3-H4 et H2A-H2B, et les dim res H3-H4 se combinent pour former des t tram res. Un t tram re H3-H4 se combine ensuite avec deux dim res H2A-H2B pour former le noyau compact de l'octam re, autour duquel l'ADN est enroul . L'interface entre l'ADN et les histones est vaste : 142 liaisons hydrog ne se forment entre l'ADN et le noyau des histones dans chaque nucl osome. Pr s de la moiti de ces liaisons se forment entre le squelette d'acides amin s des histones et le squelette sucre-phosphate de l'ADN. De nombreuses interactions hydrophobes et liaisons salines maintiennent galement l'ADN et les prot ines ensemble dans le nucl osome. Plus d'un cinqui me des acides amin s de chacune des histones centrales sont soit de la lysine, soit de l'arginine (deux acides amin s avec des cha nes lat rales basiques), et leurs charges positives peuvent efficacement Figure 4 22 Organisation structurelle du nucl osome. Un nucl osome contient un noyau prot ique compos de huit mol cules d'histones. Dans les exp riences biochimiques, la particule centrale du nucl osome peut tre lib r e de la chromatine isol e par la digestion de l'ADN de liaison avec une nucl ase, une enzyme qui d compose l'ADN. (La nucl ase peut d grader l'ADN de liaison expos , mais ne peut pas attaquer l'ADN enroul troitement autour du noyau du nucl osome.) Apr s dissociation du nucl osome isol en son noyau prot ique et son ADN, la longueur de l'ADN qui a t enroul autour du noyau peut tre d termin e. Cette longueur de 147 paires de nucl otides est suffisante pour enrouler 1,7 fois autour du noyau d'histones. Figure 4 21 Nucl osomes vus au microscope lectronique
Biologie moléculaire de la cellule	. (A) La chromatine isol e directement d'un noyau interphasique appara t au microscope lectronique sous la forme d'un fil d'environ 30 nm d' paisseur. (b) Cette micrographie lectronique montre une longueur de chromatine qui a t exp rimentalement d compress e, ou d condens e, apr s isolement pour montrer les nucl osomes. (A, avec l'aimable autorisation de Barbara Hamkalo ; b, avec l'aimable autorisation de Victoria Foe.) histones de base linker L'ADN du nucl osome perles sur une corde Le nucl osome comprend une forme de chromatine ~ 200 paires de nucl otides d'ADN Figure 4 23 Structure d'une particule centrale de nucl osome, d termin e par des analyses de diffraction des rayons X des cristaux. Chaque histone est color e selon le sch ma de la figure 4-22, avec la double h lice de l'ADN en gris clair. (Adapt de k. luger et al., Nature 389:251 260, 1997. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) neutraliser le squelette d'ADN charg n gativement. Ces nombreuses interactions expliquent en partie pourquoi l'ADN de pratiquement n'importe quelle s quence peut tre li sur un noyau d'octam re d'histones. Le chemin de l'ADN autour du noyau d'histones n'est pas lisse ; au contraire, plusieurs plis sont observ s dans l'ADN, comme on peut s'y attendre de la surface non uniforme de l'ADN. Figure 4 24 L'organisation structurale globale des histones centrales. (A) Chacune des histones centrales contient une queue N-terminale, qui est sujette plusieurs formes de modification covalente, et une r gion de repliement des histones, comme indiqu . (b) La structure du pli des histones, qui est form par les quatre histones centrales. (C) Les histones 2A et 2b forment un dim re par une interaction connue sous le nom de poign e de main . Les histones H3 et H4 forment un dim re par le m me type d'interaction. (D) L'octam re d'histone finale sur l'ADN. Notez que les huit queues N-terminales des histones d passent de la structure centrale en forme de disque. Leurs conformations sont tr s flexibles et servent de sites de liaison pour des ensembles d'autres prot ines. noyau. La flexion n cessite une compression substantielle du sillon mineur de l'h lice d'ADN. Certains dinucl otides dans le sillon mineur sont particuli rement faciles comprimer, et certaines s quences nucl otidiques se lient plus troitement au nucl osome que d'autres (Figure 4 25). Cela explique probablement certains cas frappants, mais inhabituels, de positionnement tr s pr cis des nucl osomes le long d'un tron on d'ADN. Cependant, la pr f rence de s quence des nucl osomes doit tre suffisamment faible pour permettre d'autres facteurs de dominer, dans la mesure o les nucl osomes peuvent occuper l'une des nombreuses positions par rapport la s quence d'ADN dans la plupart des r gions chromosomiques. En plus de son repliement d'histones, chacune des histones du noyau a une queue d'acide amin N-terminal, qui s' tend partir du noyau d'ADN-histones (voir Figure 4-24D). Ces queues d'histones sont soumises plusieurs types diff rents de modifications covalentes qui, leur tour, contr lent des aspects critiques de la structure et de la fonction de la chromatine, comme nous le verrons bient t. En raison de leur r le fondamental dans la fonction de l'ADN en contr lant la structure de la chromatine, les histones sont parmi les prot ines eucaryotes les mieux conserv es. Par exemple, la s quence d'acides amin s de l'histone H4 d'un pois ne diff re de celle d'une vache qu' 2 des 102 positions. Cette forte conservation volutive sugg re que les fonctions des histones impliquent presque tous leurs acides amin s, de sorte qu'un changement de position est d l t re pour la cellule. Mais en plus de cette conservation remarquable, les organismes eucaryotes produisent galement de plus petites quantit s d'histostones de base variantes sp cialis es qui diff rent par la s quence d'acides amin s des principales. Comme nous le verrons plus loin, ces variantes, combin es au nombre tonnamment lev de modifications covalentes qui peuvent tre ajout es aux histones dans les nucl osomes, donnent naissance une vari t des structures de la chromatine dans les cellules. Les nucl osomes ont une structure dynamique et sont fr quemment soumis des changements catalys s par des complexes de remodelage de la chromatine d pendants de l'ATP Pendant de nombreuses ann es, les biologistes ont pens qu'une fois form dans une position particuli re sur l'ADN, un nucl osome resterait fixe en place en raison de l'association tr s troite entre ses histones centrales et l'ADN. Si cela tait vrai, cela poserait des probl mes pour les m canismes de lecture g n tique, qui n cessitent en principe un acc s facile de nombreuses s quences d'ADN sp cifiques. Cela entraverait galement le passage rapide de la transcription et de la r plication de l'ADN travers la chromatine. Mais les exp riences cin tiques montrent que l'ADN d'un nucl osome isol se d roule partir de chaq
Biologie moléculaire de la cellule	ue extr mit un rythme d'environ quatre fois par seconde, restant expos pendant 10 50 millisecondes avant que la structure partiellement d ball e ne se referme. Ainsi, la majeure partie de l'ADN d'un nucl osome isol est en principe disponible pour se lier d'autres prot ines. Pour la chromatine dans une cellule, un rel chement suppl mentaire des contacts ADN-histones est clairement n cessaire, car les cellules eucaryotes contiennent une grande vari t de complexes de remodelage de la chromatine d pendants de l'ATP. Ces complexes comprennent une sous-unit qui hydrolyse l'ATP (une ATPase li e au cours de l' volution aux h licases d'ADN discut s au chapitre 5). Cette sous-unit se lie la fois au noyau prot ique du nucl osome et l'ADN double brin qui s'enroule autour de lui. En utilisant l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP pour d placer cet ADN par rapport au noyau, le complexe prot ique modifie temporairement la structure d'un nucl osome, rendant l'ADN moins troitement li au noyau d'histones. Gr ce des cycles r p t s d'hydrolyse de l'ATP qui tirent le noyau du nucl osome le long de la double h lice de l'ADN, les complexes de remodelage peuvent catalyser le glissement des nucl osomes. De cette fa on, ils peuvent repositionner les nucl osomes pour exposer des r gions sp cifiques de l'ADN, les rendant ainsi disponibles pour d'autres prot ines de la cellule (Figure 4 26). De plus, en coop rant avec une vari t d'autres prot ines qui se lient aux histones et servent de chaperons d'histones, certains complexes de remodelage sont capables d' liminer tout ou partie du noyau du nucl osome d'un nucl osome, catalysant soit un change de ses histones H2A-H2B, soit l' limination compl te du noyau octam rique de l'ADN (Figure 4-27). la suite de ces processus, les mesures r v lent qu'un nucl osome typique est remplac sur l'ADN toutes les une ou deux heures l'int rieur de la cellule. ADN du noyau d'histone du nucl osome (octam re d'histone) DAnucl otides AA, TT et TA pr f r s ici (sillon mineur l'int rieur) (sillon mineur l'ext rieur) Figure 4 25 La courbure de l'ADN dans un nucl osome. L'h lice de l'ADN effectue 1,7 tours serr s autour de l'octam re d'histone. Ce sch ma illustre comment la petite rainure est comprim e l'int rieur du tour. En raison des caract ristiques structurelles de la mol cule d'ADN, les dinucl otides indiqu s sont pr f rentiellement log s dans un sillon mineur aussi troit, ce qui aide expliquer pourquoi certaines s quences d'ADN se lient plus troitement que d'autres au noyau du nucl osome. Les cellules contiennent des dizaines de complexes diff rents de remodelage de la chromatine d pendants de l'ATP qui sont sp cialis s pour diff rents r les. La plupart sont de grands complexes prot iques qui peuvent contenir 10 sous-unit s ou plus, dont certaines se lient des modifications sp cifiques sur les histones (voir Figure 4-26C). L'activit de ces complexes est soigneusement contr l e par la cellule. Lorsque les g nes sont activ s et d sactiv s, les complexes de remodelage de la chromatine sont amen s des r gions sp cifiques de l'ADN o ils agissent localement pour influencer la structure de la chromatine (discut au chapitre 7 ; voir galement les figures 4 40 ci-dessous). Bien que certaines s quences d'ADN se lient plus troitement que d'autres au noyau du nucl osome (voir Figure 4-25), l'influence la plus importante sur le positionnement des nucl osomes semble tre la pr sence d'autres prot ines troitement li es sur l'ADN. Certaines prot ines li es favorisent la formation d'un nucl osome adjacent celles-ci. D'autres cr ent des obstacles qui forcent les nucl osomes se d placer ailleurs. Les positions exactes des nucl osomes le long d'un tron on d'ADN d pendent donc principalement de la pr sence et de la nature d'autres prot ines li es l'ADN. Et en raison de la pr sence de complexes de remodelage de la chromatine d pendants de l'ATP, l'arrangement des nucl osomes sur l'ADN peut tre tr s dynamique, changeant rapidement en fonction des besoins de la cellule. Bien que d' normes cha nes de nucl osomes se forment sur l'ADN chromosomique, la chromatine dans une cellule vivante adopte probablement rarement la forme tendue perles sur astring . Au lieu de cela, les nucl osomes sont empil s les uns sur les autres, g n rant des r seaux dans lesquels l'ADN est encore plus fortement condens . Ainsi, lorsque les noyaux sont lys s tr s doucement sur une grille de microscope lectronique, une grande partie de la chromatine se pr sente sous la forme d'une fibre d'un diam tre d'environ 30 nm, ce qui est consid rablement plus large que la chromatine sous forme de billes sur une ficelle (voir Figure 4-21). Figure 4 26 Le glissement des nucl osomes catalys par des complexes de remodelage de la chromatine d pendants de l'ATP. (A) En utilisant l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP, on pense que le complexe de remodelage pousse sur l'ADN de son nucl osome li et rel che sa fix
Biologie moléculaire de la cellule	ation au noyau du nucl osome. Chaque cycle de liaison l'ATP, d'hydrolyse de l'ATP et de lib ration des produits ADP et Pi d place ainsi l'ADN par rapport l'octam re d'histones dans la direction de la fl che sur ce sch ma. Il faut de nombreux cycles de ce type pour produire le glissement des nucl osomes illustr . (b) La structure d'un dim re li aux nucl osomes des deux sous-unit s ATPase identiques (en vert) qui font glisser les nucl osomes d'avant en arri re dans la famille ISw1 des complexes de remodelage de la chromatine. (C) La structure d'un grand complexe de remodelage de la chromatine, montrant comment on pense qu'il s'enroule autour d'un nucl osome. mod lis en vert est le complexe RSC de levure, qui contient 15 sous-unit s, dont une ATPase et au moins quatre sous-unit s avec des domaines qui reconnaissent des histones sp cifiques modifi es de mani re covalente. (b, d'apr s l.R. Racki et al., Nature 462:1016 1021, 2009. avec la permission de macmillan Publishers ltd ; C, adapt de A.E. leschziner et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 104:4913 4918, 2007.) 192 Chapitre 4 : ADN, chromosomes et g nomes La fa on dont les nucl osomes sont organis s en r seaux condens s n'est pas claire. La structure d'un t tranucl osome (un complexe de quatre nucl osomes) obtenue par cristallographie aux rayons X et microscopie lectronique haute r solution de la chromatine reconstitu e a t utilis e pour soutenir un mod le en zigzag pour l'empilement de nucl osomes dans une fibre de 30 nm (Figure 4-28). Mais la cryomicroscopie lectronique de noyaux soigneusement pr par s sugg re que la plupart des r gions de la chromatine sont moins r guli rement structur es. Qu'est-ce qui fait que les nucl osomes s'empilent si troitement les uns sur les autres ? Les liaisons nucl osome-tonucl osome qui impliquent des queues d'histones, plus particuli rement la queue H4, constituent un facteur important (Figure 4 29). Un autre facteur important est une histone suppl mentaire qui est souvent pr sente dans un rapport de 1 1 avec des noyaux de nucl osomes, connu sous le nom de Figure 4-28 Un mod le en zigzag pour la 30histone H1. Cette histone de liaison est plus grande que les histones de base individuelles nm fibre de chromatine. (A) La conformation de deux des quatre nucl osomes en a et il a t consid rablement moins bien conserv au cours de l' volution. Un seul t tranucl osome, partir d'une mol cule de structure H1, se lie chaque nucl osome, entrant en contact avec l'ADN et la prot ine, d termin par cristallographie aux rayons X. et la modification du chemin de l'ADN lorsqu'il sort du nucl osome. Ce changement dans (b) le sch ma de l'ensemble du t tranucl osome ; on pense que la voie de sortie de l'ADN aide l'ADN nucl osomale compact (Figure 4 30). Le quatri me nucl osome n'est pas visible, tant empil sur le nucl osome inf rieur et derri re lui dans ce sch ma. (C) Illustration sch matique d'une structure en zigzag possible qui pourrait expliquer la fibre de chromatine de 30 nm. (A, code PDb : 1Zbb ; C, adapt de C.l. woodcock, Nat. Struct. Mol. Biol. 12:639-640, 2005. avec l'autorisation de macmillan Publishers ltd.) La plupart des organismes eucaryotes fabriquent plusieurs prot ines d'histone H1 de s quences d'acides amin s apparent es mais tout fait distinctes. La pr sence de nombreuses autres prot ines de liaison l'ADN, ainsi que de prot ines qui se lient directement aux histones, est certaine d'ajouter des caract ristiques suppl mentaires importantes tout ensemble de nucl osomes. Un g ne est une s quence nucl otidique d'une mol cule d'ADN qui agit comme une unit fonctionnelle pour la production d'une prot ine, un ARN structurel ou une mol cule d'ARN catalytique ou r gulatrice. Chez les eucaryotes, les g nes codant pour les prot ines sont g n ralement compos s d'une cha ne d'introns et d'exons altern s associ s des r gions r gulatrices de l'ADN. Un chromosome est form partir d'une seule mol cule d'ADN extr mement longue qui contient un r seau lin aire de nombreux g nes, li s un grand ensemble de prot ines. Le g nome humain contient 3,2 109 paires de nucl otides d'ADN, r parties entre 22 autosomes diff rents (pr sents en deux copies chacun) et 2 chromosomes sexuels. Seul un petit pourcentage de cet ADN code pour des prot ines ou des mol cules d'ARN fonctionnelles. Une mol cule d'ADN chromosomique contient galement trois autres types de s quences nucl otidiques importantes : les origines de r plication et les t lom res permettent la mol cule d'ADN d' tre r pliqu e efficacement, tandis qu'un centrom re attache les mol cules d'ADN s urs au fuseau mitotique, assurant leur s gr gation pr cise aux cellules filles pendant la phase M du cycle cellulaire. L'ADN des eucaryotes est troitement li une masse gale d'histones, qui forment des r seaux r p t s de particules d'ADN et de prot ines appel es nucl osomes. Le nucl osome est compos d'un noyau octam rique de prot ines d'histones autour duquel s
Biologie moléculaire de la cellule	'enroule la double h lice de l'ADN. Les nucl osomes sont espac s d'environ 200 paires de nucl otides, et ils sont g n ralement regroup s ( l'aide de mol cules d'histone H1) en r seaux quasi-r guliers pour former une fibre de chromatine de 30 nm. Bien que compacte, la structure de la chromatine doit tre tr s dynamique pour permettre l'acc s l'ADN. Il y a un certain d ballage et r emballage spontan s de l'ADN dans le nucl osome lui-m me ; cependant, la strat gie g n rale pour modifier de mani re r versible la structure locale de la chromatine comprend des complexes de remodelage de la chromatine induits par l'ATP. Les cellules contiennent un grand nombre de ces complexes, qui sont cibl s sur des r gions sp cifiques de la chromatine au moment opportun. Les complexes de remodelage collaborent avec des chaperons d'histones pour permettre aux noyaux de nucl osomes d' tre repositionn s, reconstitu s avec diff rentes histones ou compl tement retir s pour exposer l'ADN sous-jacent. Figure 4 29 Un mod le du r le jou par les queues d'histones dans la compaction de la chromatine. (A) Un sch ma montre les points de sortie approximatifs des huit queues d'histones, une de chaque prot ine d'histone, qui s' tendent partir de chaque nucl osome. La structure r elle est montr e sa droite. Dans la structure haute r solution du nucl osome, les queues sont en grande partie non structur es, ce qui sugg re qu'elles sont tr s flexibles. (b) Comme indiqu , on pense que les queues d'histones sont impliqu es dans des interactions entre les nucl osomes qui aident les regrouper. (A, Code PDb : 1k X5.) Figure 4 30 Comment l'histone de liaison se lie au nucl osome. La position et la structure de l'histone H1 sont repr sent es. La r gion du noyau H1 contraint 20 paires de nucl otides suppl mentaires d'ADN partir du noyau du nucl osome et est importante pour le compactage de la chromatine. (A) Sch matique, et (b) structure d duite pour un seul nucl osome partir d'une structure d termin e par microscopie lectronique haute r solution d'une fibre de chromatine reconstitu e (C). (b et C, adapt de F. Song et al., Science 344:376-380, 2014.) Apr s avoir d crit comment l'ADN est emball dans les nucl osomes pour cr er une fibre de chromatine, nous nous tournons maintenant vers les m canismes qui cr ent diff rentes structures de chromatine dans diff rentes r gions du g nome d'une cellule. Les m canismes de ce type ont une vari t de fonctions importantes dans les cellules. Plus frappant encore, certains types de structure de la chromatine peuvent tre h r ditaires ; c'est- -dire que la structure peut tre directement transmise d'une cellule ses descendants. Parce que la m moire cellulaire qui en r sulte est bas e sur une structure de chromatine h rit e plut t que sur un changement de s quence d'ADN, il s'agit d'une forme d'h ritage pig n tique. Le pr fixe epi signifie on en grec ; c'est appropri , car l' pig n tique repr sente une forme d'h r dit qui se superpose l'h ritage g n tique bas sur l'ADN. Dans le chapitre 7, nous pr senterons les nombreuses fa ons dont l'expression des g nes est r gul e. Nous y discutons en d tail de l'h ritage pig n tique et pr sentons plusieurs m canismes diff rents qui peuvent le produire. Ici, nous ne nous int ressons qu' un seul, celui bas sur la structure de la chromatine. Nous commen ons cette section en passant en revue les observations qui ont d montr pour la premi re fois que les structures de la chromatine peuvent tre h r ditaires. Nous d crivons ensuite une partie de la chimie qui rend cela possible la modification covalente des histones dans les nucl osomes. Ces modifications ont de nombreuses fonctions, dans la mesure o elles servent de sites de reconnaissance pour des domaines prot iques qui lient des complexes prot iques sp cifiques diff rentes r gions de la chromatine. Histones ainsi ont des effets sur l'expression des g nes, ainsi que sur de nombreux autres processus li s l'ADN. Gr ce de tels m canismes, la structure de la chromatine joue un r le important dans le d veloppement, la croissance et le maintien de tous les organismes eucaryotes, y compris nous-m mes. Des tudes au microscope optique dans les ann es 1930 ont distingu deux types de chromatine dans les noyaux interphasiques de nombreuses cellules eucaryotes sup rieures : une forme tr s condens e, appel e h t rochromatine, et tout le reste, qui est moins condens , appel euchromatine. L'h t rochromatine repr sente une forme particuli rement compacte de la chromatine (voir Figure 4-9), et nous commen ons enfin comprendre ses propri t s mol culaires. Elle est fortement concentr e dans certaines r gions sp cialis es, notamment au niveau des centrom res et des t lom res introduits pr c demment (voir la figure 4-19), mais elle est galement pr sente de nombreux autres endroits le long des chromosomes, des endroits qui peuvent varier en fonction de l' tat physiologique de la cellule. Dans une cel
Biologie moléculaire de la cellule	lule de mammif re typique, plus de 10 % du g nome est emball de cette mani re. L'ADN de l'h t rochromatine contient g n ralement peu de g nes, et lorsque les r gions euchromatiques sont converties en un tat h t rochromatique, leurs g nes sont g n ralement d sactiv s en cons quence. Cependant, nous savons maintenant que le terme h t rochromatine englobe plusieurs modes distincts de compaction de la chromatine qui ont des implications diff rentes pour l'expression des g nes. Ainsi, l'h t rochromatine ne doit pas tre consid r e comme une simple encapsulation d'ADN mort , mais plut t comme un descripteur de domaines compacts de la chromatine qui partagent la caract ristique commune d' tre exceptionnellement r sistants l'expression g nique. L' tat h t rochromatique est auto-propag Par la rupture et la r union des chromosomes, qu'elles soient provoqu es par un accident g n tique naturel ou par un artifice exp rimental, un morceau de chromosome normalement euchromatique peut tre transloqu dans le voisinage de l'h t rochromatine. Remarquablement, cela provoque souvent le silence l'inactivation des g nes normalement actifs. Ce ph nom ne est appel effet de position. Il refl te une propagation de l' tat h t rochromatique dans la r gion euchromatique d'origine, et il a fourni des indices importants sur les m canismes qui cr ent et maintiennent l'h t rochromatine. Reconnus pour la premi re fois chez la drosophile, les effets de position ont maintenant t observ s chez de nombreux eucaryotes, y compris les levures, les plantes et les humains. Au d but du d veloppement de l'embryon, l'h t rochromatine se forme et se propage dans l'euchromatine voisine des degr s divers dans diff rentes cellules Clone de cellules avec clone de cellules avec clone de cellules avec g ne 1 G nes inactifs 1, 2 et 3 inactifs Aucun g ne inactiv Figure 4 31 La cause de la variation, de l'effet de position chez la drosophile. (A) L'h t rochromatine (en vert) est normalement emp ch e de se propager dans les r gions adjacentes de l'euchromatine (en rouge) par des s quences d'ADN barri re, dont nous parlerons sous peu. Chez les mouches qui h ritent de certains r arrangements chromosomiques, cependant, cette barri re n'est plus pr sente. (b) Au cours du d veloppement pr coce de ces mouches, l'h t rochromatine peut se propager dans l'ADN chromosomique voisin, en proc dant sur diff rentes distances dans diff rentes cellules. Cette propagation s'arr te rapidement, mais le mod le tabli de l'h t rochromatine est par la suite h rit , de sorte que de grands clones de cellules de descendance sont produits qui ont les m mes g nes voisins condens s en h t rochromatine et donc inactiv s (d'o l'apparence panach e de certaines de ces mouches ; voir Figure 4-32). Bien que le terme talement soit utilis pour d crire la formation d'une nouvelle h t rochromatine proche de l'h t rochromatine existante auparavant, le terme n'est peut- tre pas tout fait exact. Il existe des preuves que pendant l'expansion, la condensation de l'ADN en h t rochromatine peut sauter certaines r gions de la chromatine, pargnant ainsi les g nes qui s'y trouvent des effets r pressifs. Dans les v nements de rupture et de r union chromosomiques du type de celui que nous venons de d crire, la zone de silen age, o l'euchromatine est convertie en un tat h t rochromatique, s' tend sur diff rentes distances dans diff rentes cellules pr coces de l'embryon de mouche. Remarquablement, ces diff rences se perp tuent ensuite pour le reste de la vie de l'animal : dans chaque cellule, une fois que la condition h t rochromatique est tablie sur un morceau de chromatine, elle a tendance tre h rit e de mani re stable par toute la descendance de cette cellule (Figure 4-31). Ce ph nom ne remarquable, appel effet de position a t reconnue pour la premi re fois gr ce une analyse g n tique d taill e de la perte marbr e de pigment rouge dans l' il de la mouche (figure 4-32). Il partage des caract ristiques avec la propagation tendue de l'h t rochromatine qui inactive l'un des deux chromosomes X chez les mammif res femelles. L aussi, un processus al atoire agit dans chaque cellule de l'embryon pr coce pour dicter quel chromosome X sera inactiv , et ce m me chromosome X reste alors inactif dans toute la descendance de la cellule, cr ant une mosa que de diff rents clones de cellules dans le corps adulte (voir Figure 7-50). Ces observations, prises ensemble, pointent vers une strat gie fondamentale de formation de l'h t rochromatine : l'h t rochromatine engendre plus d'h t rochromatine. Cette r troaction positive peut fonctionner la fois dans l'espace, provoquant la propagation de l' tat h t rochromatique le long du chromosome, et avec le temps, travers les g n rations cellulaires, propageant l' tat h t rochromatique de la cellule m re ses filles. Le d fi consiste expliquer les m canismes mol culaires qui sous-tendent ce comportement remarquable. Figure 4

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