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Biologie moléculaire de la cellule	32 La d couverte des effets de position sur l'expression des g nes. Le g ne blanc de la drosophile contr le la production de pigments oculaires et porte le nom de la mutation qui l'a identifi e pour la premi re fois. Les mouches de type sauvage avec un g ne blanc normal (White+) ont une production normale de pigments, ce qui leur donne des yeux rouges, mais si le g ne blanc est mut et inactiv , les mouches mutantes (White ) ne produisent aucun pigment et ont les yeux blancs. Chez les mouches chez lesquelles un g ne blanc normal a t d plac pr s d'une r gion d'h t rochromatine, les yeux sont tachet s, avec des taches rouges et blanches. Les taches blanches repr sentent des lign es cellulaires dans lesquelles le g ne blanc a t r duit au silence par les effets de l'h t rochromatine. En revanche, les taches rouges repr sentent des lign es cellulaires dans lesquelles le g ne blanc est exprim . Au d but du d veloppement, lorsque l'h t rochromatine est form e pour la premi re fois, elle se propage dans l'euchromatine voisine des degr s divers dans diff rentes cellules embryonnaires (voir Figure 4-31). La pr sence de grandes taches de globules rouges et blancs r v le que l' tat de l'activit transcriptionnelle, tel que d termin par l'emballage de ce g ne en chromatine dans ces cellules anc tres, est h rit par toutes les cellules filles. Figure 4 33 Quelques types importants de modifications de la cha ne lat rale des acides amin s covalents (B) PHOSPHORYLATION DE LA S RINE trouv es sur les histones nucl osomales. (A) Trois niveaux diff rents de m thylation de la lysine sont montr s ; Chacun peut tre reconnu par une prot ine de liaison diff rente et peut donc avoir une signification diff rente pour la cellule. Notez que l'ac tylation supprime la charge positive sur la lysine, et que, plus important encore, une lysine ac tyl e ne peut pas tre m thyl e, et vice versa. (b) La phosphorylation de la s rine ajoute une charge n gative une histone. Les modifications des histones qui ne sont pas montr es ici comprennent la monoou dim thylation d'une arginine, la phosphorylation d'une thr onine, l'ajout d'ADP-ribose un acide glutamique et l'ajout d'un groupe ubiquityle, sumoyle ou biotine une lysine. BOA Dans un premier temps, on peut effectuer une recherche des mol cules impliqu es. Cela a t fait au moyen de criblages g n tiques, dans lesquels un grand nombre de mutants sont g n r s, apr s quoi on choisit ceux qui montrent une anomalie du processus en question. Des criblages g n tiques approfondis chez la drosophile, les champignons et les souris ont identifi plus de 100 g nes dont les produits am liorent ou suppriment la propagation de l'h t rochromatine et son h r dit stable en d'autres termes, des g nes qui servent soit d'amplificateurs, soit de suppresseurs de la panachure de l'effet de position. Beaucoup de ces g nes s'av rent coder pour des prot ines chromosomiques non histones qui interagissent avec les histones et sont impliqu es dans la modification ou le maintien de la structure de la chromatine. Nous verrons comment ils fonctionnent dans les sections qui suivent. Les histones du noyau sont modifi es de mani re covalente sur de nombreux sites diff rents Les cha nes lat rales d'acides amin s des quatre histones du noyau du nucl osome sont soumises une vari t remarquable de modifications covalentes, y compris l'ac tylation des lysines, la mono-, la di- et la trim thylation de lysines et la phosphorylation des s rines (Figure 4-33). Un grand nombre de ces modifications de la cha ne lat rale se produisent sur les huit queues d'histones N-terminales relativement peu structur es qui d passent du nucl osome (Figure 4 34). Cependant, il existe galement plus de 20 modifications sp cifiques de la cha ne lat rale sur le noyau globulaire du nucl osome. Tous les types de modifications ci-dessus sont r versibles, une enzyme servant cr er un type particulier de modification, et une autre l' liminer. Ces enzymes sont tr s sp cifiques. Ainsi, par exemple, les groupes ac tyle sont ajout s des lysines sp cifiques par un ensemble de diff rentes histones ac tyltransf rases (HATs) et limin s par un ensemble de complexes d'histones d sac tylases (HDAC). De m me, les groupes m thyles sont ajout s aux cha nes lat rales de lysine par un ensemble d'histones m thyltransf rases diff rentes et limin s par un ensemble d'histones d m thylases. Chaque enzyme est recrut e des sites sp cifiques de la chromatine des moments d finis de l'histoire de vie de chaque cellule. Pour la plupart, le recrutement initial d pend des prot ines r gulatrices de transcription (parfois appel es facteurs de transcription ). Comme nous l'expliquerons au chapitre 7, ces prot ines reconnaissent et se lient des s quences d'ADN sp cifiques dans les chromosomes. Ils sont produits CL : Figure 4 34 La modification covalente des queues d'histones centrales. (A) La structure du nucl osome mettant en vidence l'emplacem
Biologie moléculaire de la cellule	ent des 30 premiers acides amin s dans chacune de ses huit queues d'histones N-terminales (en vert). Ces queues sont non structur es et tr s mobiles, et changeront donc de conformation en fonction d'autres prot ines li es. (b) Des modifications bien document es des quatre prot ines du noyau des histones sont indiqu es. Bien qu'un seul symbole soit utilis ici pour la m thylation (m), chaque lysine (k) ou arginine (R) peut tre m thyl e de plusieurs mani res diff rentes. Notons galement que certaines positions (par exemple, la lysine 9 de H3) peuvent tre modifi es soit par m thylation, soit par ac tylation, mais pas les deux. La plupart des modifications montr es ajoutent une mol cule relativement petite sur les queues d'histones ; l'exception est l'ubiquitine, une prot ine de 76 acides amin s galement utilis e pour d'autres processus cellulaires (voir Figure 3-69). Plus de 20 modifications possibles situ es dans le noyau globulaire des histones ne sont pas repr sent es. (A, PDb : 1kX5 ; b, adapt de H. Santos-Rosa et C. Caldas, Eur. J. Cancer 41:2381-2402, 2005. avec l'autorisation d'Elsevier.) diff rents moments et lieux de la vie d'un organisme, d terminant ainsi o et quand les enzymes modifiant la chromatine agiront. De cette fa on, la s quence d'ADN d termine en fin de compte comment les histones sont modifi es. Mais dans au moins certains cas, les modifications covalentes sur les nucl osomes peuvent persister longtemps apr s la disparition des prot ines r gulatrices de transcription qui les ont induites en premier, fournissant ainsi la cellule une m moire de son histoire de d veloppement. Plus remarquable encore, comme dans le ph nom ne connexe de la panachure de l'effet de position discut ci-dessus, cette m moire peut tre transmise d'une g n ration cellulaire l'autre. Des mod les tr s diff rents de modification covalente se retrouvent sur diff rents groupes de nucl osomes, en fonction la fois de leur position exacte dans le g nome et de l'histoire de la cellule. Les modifications des histones sont soigneusement contr l es, et elles ont des cons quences importantes. L'ac tylation des lysines sur les queues N-terminales rel che la structure de la chromatine, en partie parce que l'ajout d'un groupe ac tyle la lysine supprime sa charge positive, r duisant ainsi l'affinit des queues pour les nucl osomes adjacents. Cependant, les effets les plus profonds des modifications des histones r sident dans leur capacit recruter d'autres prot ines sp cifiques l' tirement modifi de la chromatine. La trim thylation d'une lysine sp cifique sur la queue de l'histone H3, par exemple, attire la prot ine HP1 sp cifique de l'h t rochromatine et contribue l' tablissement et la propagation de l'h t rochromatine. Plus g n ralement, les prot ines recrut es agissent avec les histones modifi es pour d terminer comment et quand les g nes seront exprim s, ainsi que d'autres fonctions chromosomiques. De cette fa on, la structure pr cise de chaque domaine de la chromatine r git la lecture de l'information g n tique qu'il contient, et donc la structure et la fonction de la cellule eucaryote. Expression du g ne H3.3, s gr gation du chromosome H2AZ, r pression transcriptionnelle, inactivation du chromosome X macroH2A La chromatine acquiert une vari t suppl mentaire gr ce l'insertion sp cifique d'un petit ensemble de variantes d'histones En plus des quatre histones standard hautement conserv es, les eucaryotes contiennent galement quelques histostones variantes qui peuvent galement s'assembler en nucl osomes. Ces histones sont pr sentes en quantit s beaucoup plus petites que les principales histones, et elles ont t moins bien conserv es au cours de longues p riodes d' volution. Des variantes sont connues pour chacune des histones centrales, l'exception de H4 ; quelques exemples sont pr sent s dans les figures 4 35. Les histones majeures sont synth tis es principalement pendant la phase S du cycle cellulaire et assembl es en nucl osomes sur les h lices d'ADN filles juste derri re la fourche de r plication (voir Figure 5-32). En revanche, la plupart des variantes d'histones sont synth tis es tout au long de l'interphase. Ils sont souvent ins r s dans la chromatine d j form e, ce qui n cessite un processus d' change d'histones catalys par les complexes de remodelage de la chromatine d pendants de l'ATP discut s pr c demment. Ces complexes de remodelage contiennent des sous-unit s qui les am nent se lier la fois des sites sp cifiques de la chromatine et des chaperons d'histones porteurs d'une variante particuli re. En cons quence, chaque variante d'histones est ins r e dans la chromatine de mani re tr s s lective (voir Figure 4-27). Les modifications covalentes et les variantes d'histones agissent de concert pour contr ler les fonctions chromosomiques Le nombre de marques distinctes possibles sur un nucl osome individuel est en principe norme, et ce potentiel de diversit est encore plus
Biologie moléculaire de la cellule	grand lorsque nous tenons compte des nucl osomes contenant des variants d'histones. Cependant, les modifications d'histones sont connues pour se produire dans des ensembles coordonn s. Plus de 15 ensembles de ce type peuvent tre identifi s dans des cellules de mammif res. Cependant, il n'est pas encore clair combien de types diff rents de chromatine sont fonctionnellement importants dans les cellules. Certaines combinaisons sont connues pour avoir une signification sp cifique pour la cellule en ce sens qu'elles d terminent comment et quand l'ADN contenu dans les nucl osomes doit tre consult ou manipul un fait qui a conduit l'id e d'un code d'histones . Par exemple, un type de marquage signale qu'un tron on de chromatine a t nouvellement r pliqu , un autre signale que l'ADN de cette chromatine a t endommag et a besoin d' tre r par , tandis que d'autres signalent quand et comment l'expression des g nes doit avoir lieu. Diverses prot ines r gulatrices contiennent de petits domaines qui se lient des marques sp cifiques, reconnaissant, par exemple, une lysine 4 trim thyl e sur l'histone H3 (Figure 4 36). Ces domaines sont souvent reli s entre eux sous forme de modules dans un seul grand Figure 4 35 La structure de certaines variantes d'histones par rapport l'histone principale qu'elles remplacent. Les variants d'histones sont ins r s dans les nucl osomes des sites sp cifiques sur les chromosomes par des enzymes de remodelage de la chromatine d pendantes de l'ATP qui agissent de concert avec les chaperons d'histones (voir Figure 4-27). La variante CENP-A (Centromere Protein-A) de l'histone H3 est abord e plus loin dans ce chapitre (voir Figure 4 42) ; d'autres variantes sont abord es au chapitre 7. Les s quences de chaque variante qui sont color es diff remment (par rapport l'histone majeure au-dessus) d signent des r gions avec une s quence d'acides amin s diff rente de cette histone majeure. (Adapt de k. Sarma et D. Reinberg, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6:139 149, 2005. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) Figure 4 36 Comment se lit une marque sur un nucl osome. La figure montre la structure d'un module prot ique (appel domaine INg PHD) qui reconna t sp cifiquement l'histone H3 trim thyl e sur la lysine 4. (A) Un groupe trim thyle. (b) Mod le de remplissage d'espace d'un domaine PHD INg li une queue d'histones (vert, avec le groupe trim thyle surlign en jaune). (C) Un mod le en ruban montrant comment les six acides amin s N-terminaux de la queue H3 sont reconnus. Les lignes rouges repr sentent les liaisons hydrog ne. Il s'agit d'un domaine d'une famille de domaines PHD qui reconnaissent les lysines m thyl es sur les histones ; Diff rents membres de la famille se lient troitement aux lysines situ es diff rentes positions, et ils peuvent faire la distinction entre une lysine monom thyl e, di- et trim thyl e. De la m me mani re, d'autres petits modules prot iques reconnaissent des cha nes lat rales d'histones sp cifiques qui ont t marqu es avec des groupes ac tyle, des groupes phosphate, etc. (Adapt de P.v. Pe a et al., Nature 442:100 103, 2006. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) prot ine ou complexe prot ique, qui reconna t ainsi une combinaison sp cifique de modifications d'histones (Figure 4 37). Le r sultat est un lecteur complexe qui permet des combinaisons particuli res de marquages sur la chromatine d'attirer des prot ines suppl mentaires, afin d'ex cuter une fonction biologique appropri e au bon moment (Figure 4 38). Les marques sur les nucl osomes dues aux ajouts covalents aux histones sont dynamiques, tant constamment limin es et ajout es des taux qui d pendent de leurs localisations chromosomiques. Parce que les queues d'histones s' tendent vers l'ext rieur partir du noyau du nucl osome et sont susceptibles d' tre accessibles m me lorsque la chromatine est condens e, elles sembleraient fournir un format particuli rement appropri pour cr er des marques qui peuvent tre facilement modifi es mesure que les besoins d'une cellule changent. Bien qu'il reste encore beaucoup apprendre sur la signification des diff rentes modifications des histones, quelques exemples bien tudi s de l'information qui peut tre cod e dans la queue de l'histone H3 sont r pertori s dans la figure 4-39. Un complexe de prot ines de lecteur et d' crivain peut se propager Le ph nom ne de panachure effet de position d crit pr c demment exige que certaines formes modifi es de chromatine aient la capacit de se propager sur des distances substantielles le long d'une mol cule d'ADN chromosomique (voir Figure 4 31). Comment est-ce possible ? Les enzymes qui ajoutent ou suppriment des modifications aux histones dans les nucl osomes font partie de complexes multisous-unitaires. Ils peuvent initialement tre amen s dans une r gion particuli re de la chromatine par l'une des prot ines de liaison l'ADN sp cifiques la s quence (r gulateurs de transcription) di
Biologie moléculaire de la cellule	scut es dans les chapitres 6 et 7 (pour un exemple sp cifique, Figure 4 37 Reconnaissance d'une combinaison sp cifique de marques sur un nucl osome. Dans l'exemple pr sent , deux domaines adjacents qui font partie du complexe de remodelage de la chromatine NURF (Nucleosome Remodeling Factor) se lient au nucl osome, le domaine PHD (en rouge) reconnaissant une lysine 4 H3 m thyl e et un autre domaine (un bromodomaine, en bleu) reconnaissant une lysine 16 H4 ac tyl e. Ces deux marques d'histones constituent un mod le unique de modification des histones qui se produit dans des sous-ensembles de nucl osomes dans les cellules humaines. Ici, les deux queues d'histones sont indiqu es par des lignes pointill es vertes, et seulement la moiti d'un nucl osome est montr e. (Adapt de A.J. Ruthenburg et al., Cell 145:692 706, 2011. avec la permission d'Elsevier.) Les modules prot iques s' chafaudent en se liant des modifications sp cifiques des histones prot iques lors de la fixation du nucl osome d'autres composants du noyau, conduisant l'expression g nique, au silen age g nique ou d'autres fonctions biologiques (voir Figure 7 20). Mais apr s qu'une enzyme modificatrice ait crit sa marque sur un ou quelques nucl osomes voisins, des v nements qui ressemblent une r action en cha ne peuvent s'ensuivre. Dans un tel cas, l'enzyme crivaine travaille de concert avec une prot ine de lecteur situ e dans le m me complexe prot ique. La prot ine lectrice contient un module qui reconna t la marque et se lie troitement au nucl osome nouvellement modifi (voir Formation de l'h t rochromatine de la figure, silen age g niqueK 9 Figure 4 38 Sch ma montrant comment une combinaison particuli re de modifications d'histones peut tre reconnue par un complexe de lecteurs. Un grand complexe prot ique qui contient une s rie de modules prot iques, dont chacun reconna t une marque d'histone sp cifique, est illustr sch matiquement (vert). Ce complexe du lecteur ne se liera troitement qu' une r gion de la chromatine qui contient plusieurs des diff rentes marques d'histones qu'elle reconna t. Par cons quent, seule une combinaison sp cifique de marques fera que le complexe se liera la chromatine et attirera les complexes prot iques suppl mentaires (violets) n cessaires pour catalyser une fonction biologique. Figure 4 39 Quelques significations sp cifiques des modifications d'histones. (A) Les modifications de la queue terminale N de l'histone H3 sont repr sent es, r p t es partir de la figure 4-34. (b) La queue H3 peut tre marqu e par diff rents ensembles de modifications qui agissent en combinaison pour transmettre une signification sp cifique. Seul un petit nombre de significations sont connues, y compris les trois exemples pr sent s. Ce qui n'est pas illustr , c'est le fait que, comme nous venons de le sous-entendre (voir Figure 4-38), la lecture d'une marque d'histones implique g n ralement la reconnaissance conjointe de marques d'autres sites sur le nucl osome ainsi que la reconnaissance de la queue H3 indiqu e. De plus, des niveaux sp cifiques de m thylation (groupes mono-, di- ou trim thyle) sont g n ralement n cessaires. Ainsi, par exemple, la trim thylation de la lysine 9 attire la prot ine HP1 sp cifique de l'h t rochromatine, qui induit une onde de propagation de la lysine 9 trim thylation suivie d'une liaison suppl mentaire de HP1, selon le sch ma g n ral qui sera illustr prochainement (voir Figure 4 40). Cependant, une trim thylation synergique de la queue N-terminale de l'histone H4 sur la lysine 20 est galement importante dans ce processus. 4 36), activant une enzyme d' criture attach e et la positionnant pr s d'un nucl osome adjacent. travers de nombreux cycles de lecture- criture de ce type, la prot ine de lecture peut transporter l'enzyme d' criture le long de l'ADN, propageant la marque de main en main le long du chromosome (Figure 4-40). En r alit , le processus est plus compliqu que le sch ma qui vient d' tre d crit. Les lecteurs et les crivains font partie d'un complexe prot ique qui est susceptible de contenir plusieurs lecteurs et crivains, et de n cessiter plusieurs marques sur le nucl osome pour se propager. De plus, bon nombre de ces complexes lecteur- crivain contiennent galement une prot ine de remodelage de la chromatine d pendante de l'ATP (voir Figure 4-26C), et les prot ines de lecture, d' criture et de remodelage peuvent travailler de concert pour d condenser ou condenser de longues tendues de chromatine mesure que le lecteur se d place progressivement le long de l'ADN emball dans un nucl osome. Un processus similaire est utilis pour supprimer les modifications d'histones de r gions sp cifiques de l'ADN ; Dans ce cas, une enzyme effac e , telle qu'une histone d m thylase ou une d sac tylase his-tone, est recrut e dans le complexe. En ce qui concerne le complexe d' criture de la figure 4-40, les prot ines de liaison l'ADN sp cifiques la s quence (r gulateu
Biologie moléculaire de la cellule	rs de transcription) dirigent l'endroit o ces modifications se produisent (voir le chapitre 7). On peut se faire une id e de la complexit des processus ci-dessus partir des r sultats des criblages g n tiques pour les g nes qui am liorent ou suppriment la propagation et la stabilit de l'h t rochromatine, comme en t moignent les effets sur la panachure de l'effet de position chez la drosophile (voir Figure 4-32). Comme indiqu pr c demment, plus de 100 de ces g nes sont connus, et la plupart d'entre eux sont susceptibles de coder pour des sous-unit s dans un ou plusieurs complexes prot iques lecteur- crivain-remodelage. Figure 4 40 Comment le recrutement d'un complexe lecteur- crivain peut propager les modifications de la chromatine le long d'un chromosome. L' crivain est une enzyme qui cr e une modification sp cifique sur une ou plusieurs des quatre histones nucl osomales. Apr s son recrutement un site sp cifique sur un chromosome par une prot ine r gulatrice de transcription, l' crivain collabore avec une prot ine lectrice pour propager sa marque d'un nucl osome l'autre au moyen du complexe lecteur- crivain indiqu . Pour que ce m canisme fonctionne, le lecteur doit reconna tre la m me marque de modification d'histone que celle produite par l' crivain ; On peut montrer que sa liaison cette marque active l' crivain. Dans cet exemple sch matique, une onde de condensation de la chromatine se propage est ainsi induite. Les prot ines suppl mentaires impliqu es, y compris un complexe de remodelage de la chromatine d pendant de l'ATP n cessaire pour repositionner les nucl osomes modifi s, ne sont pas montr es. Les s quences d'ADN barri re bloquent la propagation des complexes lecteur- crivain et s parent ainsi les domaines chromatiniens voisins Le m canisme ci-dessus de propagation des structures de la chromatine soul ve un probl me potentiel. Dans la mesure o chaque chromosome contient une mol cule d'ADN continue et tr s longue, qu'est-ce qui emp che une cacophonie de diaphonie d routante entre des domaines chromatiniens adjacents de structure et de fonction diff rentes ? Les premi res tudes sur la panachure de l'effet de position avaient sugg r une r ponse : certaines s quences d'ADN marquent les limites des domaines de la chromatine et s parent un de ces domaines d'un autre (voir Figure 4-31). Plusieurs de ces s quences barri res ont maintenant t identifi es et caract ris es gr ce l'utilisation de techniques de g nie g n tique qui permettent de supprimer ou d'ins rer des segments d'ADN sp cifiques dans les chromosomes. Par exemple, dans les cellules destin es donner naissance aux globules rouges, une s quence appel e HS4 s pare normalement le domaine actif de la chromatine qui contient le locus de la -globine humaine d'une r gion adjacente de chromatine silencieuse et condens e. Si cette s quence est supprim e, le locus de la -globine est envahi par la chromatine condens e. Cette chromatine r duit au silence les g nes qu'elle recouvre et se propage des degr s diff rents dans diff rentes cellules, provoquant une panachure de l'effet de position similaire celle observ e chez la drosophile. Comme il est d crit au chapitre 7, Les cons quences sont d sastreuses : les g nes de la globine sont mal exprim s et les individus qui portent une telle d l tion ont une forme s v re d'an mie. Dans les exp riences de g nie g n tique, la s quence HS4 est souvent ajout e aux deux extr mit s d'un g ne qui doit tre ins r dans le g nome d'un mammif re, afin de prot ger ce g ne du silence caus par la propagation de l'h t rochromatine. L'analyse de cette s quence barri re r v le qu'elle contient un groupe de sites de liaison pour les enzymes histone ac tylase. tant donn que l'ac tylation d'une cha ne lat rale de lysine est incompatible avec la m thylation de la m me cha ne lat rale, et que des m thylations sp cifiques de la lysine sont n cessaires pour propager l'h t rochromatine, les ac tylases d'histones sont des candidats logiques pour la formation de barri res d'ADN l' talement (Figure 4 41). Cependant, plusieurs autres types de modifications de la chromatine sont connus et peuvent galement prot ger les g nes contre le silen age. Figure 4 41 Quelques m canismes d'action barri re. Ces mod les sont d riv s d'analyses exp rimentales de l'action barri re, et une combinaison de plusieurs d'entre eux peut fonctionner sur un m me site. L'attachement d'une r gion de la chromatine un grand site fixe, tel que le complexe de pores nucl aires illustr ici, peut former une barri re qui arr te la propagation de l'h t rochromatine. La liaison troite des prot ines barri res un groupe de nucl osomes peut rendre cette chromatine r sistante la propagation de l'h t rochromatine. (C) en recrutant un groupe d'enzymes modificatrices d'histones hautement actives, les barri res peuvent effacer les marques d'histones n cessaires la propagation de l'h t rochromatine. Par exemple, une ac tylation puissante
Biologie moléculaire de la cellule	de la lysine 9 sur l'histone H3 entrera en comp tition avec la m thylation de la lysine 9, emp chant ainsi la liaison de la prot ine HP1 n cessaire la formation d'une forme majeure d'h t rochromatine. (bas sur A.g. west et P. Fraser, Hum. Mol. Genet. 14 :R101 R111, 2005. avec l'autorisation d'Oxford University Press.) La chromatine des centrom res r v le comment les variantes d'histones peuvent cr er des structures sp ciales Les nucl osomes porteurs de variants d'histones ont un caract re distinctif et on pense qu'ils sont capables de produire des marques dans la chromatine qui sont exceptionnellement durables. Un exemple important est observ dans la formation et l'h r dit de la structure chromatinienne sp cialis e au centrom re, la r gion de chaque chromosome n cessaire la fixation au fuseau mitotique et la s gr gation ordonn e des copies dupliqu es du g nome en cellules filles chaque fois qu'une cellule se divise. Dans de nombreux organismes complexes, y compris les humains, chaque centrom re est int gr dans un tirement de chromatine centrom rique sp ciale qui persiste tout au long de l'interphase, m me si l'attachement m di par le centrom re au fuseau et le mouvement de l'ADN ne se produisent que pendant la mitose. Cette chromatine contient une variante de l'histone H3 sp cifique du centrom re, connue sous le nom de CENP-A (Centromere Protein-A ; voir Figure 4-35), ainsi que des prot ines suppl mentaires qui regroupent les nucl osomes dans des arrangements particuli rement denses et forment le kin tochore, la structure sp ciale requise pour la fixation du fuseau mitotique (voir Figure 4-19). Une s quence d'ADN sp cifique d'environ 125 paires de nucl otides est suffisante pour servir de centrom re chez la levure S. cerevisiae. Malgr sa petite taille, plus d'une douzaine de prot ines diff rentes s'assemblent sur cette s quence d'ADN ; les prot ines comprennent la variante H3 de l'histone CENP-A, qui, avec les trois autres histones centrales, forme un nucl osome sp cifique du centrom re. Les prot ines suppl mentaires au centom re de la levure attachent ce nucl osome un seul microtubule du fuseau mitotique de la levure (Figure 4-42). Les centrom res des organismes plus complexes sont consid rablement plus grands que ceux des levures bourgeonnantes. Par exemple, les centrom res de la mouche et de l'homme s' tendent sur des centaines de milliers de paires de nucl otides et, bien qu'ils contiennent CENP-A, ils ne semblent pas contenir de s quence d'ADN sp cifique au centrom re. Ces centrom res sont en grande partie constitu s de s quences d'ADN courtes et r p t es, connues sous le nom d'ADN satellite alpha chez l'homme. Mais les m mes s quences r p t es se retrouvent galement d'autres positions (non centrom riques) sur les chromosomes, indiquant qu'ils ne sont pas suffisants pour diriger la formation du centrom re. Le plus frappant, c'est que, dans des cas inhabituels, de nouveaux centrom res humains (appel s n ocentrom res) ont t observ s se former spontan ment sur des chromosomes fragment s. Certaines de ces nouvelles positions taient l'origine euchromatiques et d pourvues d'ADN satellite alpha (Figure 4 43). Il semble que les centrom res des organismes complexes soient d finis par un assemblage de prot ines, plut t que par une s quence d'ADN sp cifique. L'inactivation de certains centrom res et la gen se d'autres de novo semblent avoir jou un r le essentiel dans l' volution. Esp ces diff rentes, m me si elles sont assez proches Figure 4 42 Un mod le pour la structure d'un centrom re simple. (A) Dans la levure Saccharomyces cerevisiae, une s quence d'ADN centrom rique sp ciale assemble un seul nucl osome dans lequel deux copies d'une histone variante, H3 (appel e CENP-A dans la plupart des organismes) remplacent la H3 normale. (b) Comment les s quences peptidiques uniques cette histone variante (voir Figure 4-35) aident assembler des prot ines suppl mentaires, dont certaines forment un kin tochore. Le kin tochore de la levure est inhabituel en ce sens qu'il ne capture qu'un seul microtubule ; les humains ont des centrom res beaucoup plus grands et forment des kin tochores capables de capturer 20 microtubules ou plus (voir Figure 4-43). Le kin tochore est discut en d tail au chapitre 17. (Adapt de A. Joglekar et al., Nat. Cell Biol. 8:581 585, 2006. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) Figure 4 43 : preuves de la plasticit de la formation des centrom res humains. (A) Une s rie de s quences d'ADN satellitaire alpha riches en A-T est r p t e des milliers de fois chaque centrom re humain (en rouge) et est entour e d'h t rochromatine p ricentrique (en marron). Cependant, en raison d'un ancien v nement de rupture et de r union des chromosomes, certains chromosomes humains contiennent deux blocs d'ADN satellite alpha, chacun d'entre eux fonctionnant probablement comme un centrom re dans son chromosome d'origine. Habituellement, les chromosomes avec deux centr
Biologie moléculaire de la cellule	om res fonctionnels ne se propagent pas de mani re stable car ils ne se fixent pas correctement au fuseau et sont bris s pendant la mitose. Dans les chromosomes qui survivent, cependant, l'un des centrom res est devenu inactiv d'une mani re ou d'une autre, m me s'il contient toutes les s quences d'ADN n cessaires. Cela permet au chromosome d' tre propag de mani re stable. (b) Dans une petite fraction (1/2000) des naissances humaines, des chromosomes suppl mentaires sont observ s dans les cellules de la prog niture. Certains de ces chromosomes suppl mentaires, qui se sont form s partir d'un v nement de cassure, sont totalement d pourvus d'ADN satellite alpha, mais de nouveaux centrom res (n ocentrom res) sont apparus partir de ce qui tait l'origine de l'ADN euchromatique. La complexit de la chromatine centrom rique n'est pas illustr e dans ces diagrammes. L'ADN satellite alpha qui forme la chromatine centrom rique chez l'homme est emball dans des blocs altern s de chromatine. Un bloc est form d'une longue cha ne de nucl osomes contenant l'histone variante CENP-A H3 ; l'autre bloc contient des nucl osomes qui sont sp cialement marqu s avec de la dim thyllysine 4 sur l'histone H3 normale. Chaque bloc fait plus d'un millier de nucl osomes. Cette chromatine centrom rique est flanqu e d'une h t rochromatine p ricentrique, comme le montre. La chromatine p ricentrique contient de la lysine 9 m thyl e sur ses histones H3, ainsi que la prot ine HP1, et c'est un exemple d'h t rochromatine classique (voir Figure 4-39). apparent s, ont souvent des nombres diff rents de chromosomes ; voir la figure 4-14 pour un exemple extr me. Comme nous le verrons ci-dessous, des comparaisons d taill es du g nome montrent que, dans de nombreux cas, les changements dans le nombre de chromosomes sont apparus la suite d' v nements de rupture et de r union des chromosomes, cr ant de nouveaux chromosomes, dont certains devaient initialement contenir un nombre anormal de centrom res, soit plus d'un, soit aucun du tout. Pourtant, une h r dit stable exige que chaque chromosome contienne un centrom re, et un seul. Il semble que les centrom res exc dentaires aient d tre inactiv s, et/ou que de nouveaux centrom res aient t cr s, afin de permettre aux ensembles de chromosomes r arrang s d' tre maintenus de mani re stable. Les changements dans l'activit du centrom re dont nous venons de parler, une fois tablis, doivent tre perp tu s travers les g n rations cellulaires suivantes. Quel pourrait tre le m canisme de ce type d'h r dit pig n tique ? Il a t propos que la formation de novo du centrom re n cessite un v nement d'ensemencement initial, impliquant le formation d'une structure ADN-prot ine sp cialis e qui contient des nucl osomes form s avec la variante CENP-A de l'histone H3. Chez l'homme, cet v nement d'ensemencement se produit plus facilement sur les r seaux d'ADN satellite alpha que sur d'autres s quences d'ADN. Les t tram res H3-H4 de chaque nucl osome sur l'h lice d'ADN parentale sont directement h rit s par les h lices d'ADN s urs au niveau d'une fourche de r plication (voir Figure 5-32). Par cons quent, une fois qu'un ensemble de nucl osomes contenant CENP-A a t assembl sur un tron on d'ADN, il est facile de comprendre comment un nouveau centrom re pourrait tre g n r au m me endroit sur les deux chromosomes filles apr s chaque cycle de division cellulaire. Il suffit de supposer que la pr sence de l'histone CENP-A dans un nucl osome h r ditaire recrute s lectivement plus d'histones CENP-A pour ses voisins nouvellement form s. Il existe des similitudes frappantes entre la formation et le maintien des centrom res et la formation et le maintien de certaines autres r gions de l'h t rochromatine. En particulier, le centrom re entier se forme comme une entit tout ou rien, ce qui sugg re que la cr ation de la chromatine centrom rique est un processus hautement coop ratif, s' talant partir d'une graine initiale d'une mani re qui rappelle le ph nom ne de la panachure de l'effet de position que nous avons discut plus t t. Dans les deux cas, une structure chromatinienne particuli re, une fois form e, semble tre directement h rit e sur l'ADN apr s chaque cycle de r plication chromosomique. Un recrutement coop ratif de prot ines, ainsi que l'action des complexes lecteur- crivain, peuvent donc non seulement expliquer la propagation de formes sp cifiques de chromatine dans l'espace le long du chromosome, mais aussi sa propagation travers les g n rations cellulaires, de la cellule m re la cellule fille (Figure 4-44). Des exp riences sur des embryons de grenouille sugg rent que les structures de chromatine activatrices et r pressives peuvent tre h r ditaires pig n tiquement L'h ritage pig n tique joue un r le central dans la cr ation d'organismes multicellulaires. Leurs types cellulaires diff renci s s' tablissent au cours du d veloppement et persistent par la suite, m me travers des cycles
Biologie moléculaire de la cellule	de division cellulaire r p t s. Les filles d'une cellule h patique persistent sous forme de cellules h patiques, celles d'une cellule pidermique sous forme de cellules pidermiques, et ainsi de suite, m me si elles contiennent toutes le m me g nome ; Et cela est d au fait que des mod les distinctifs d'expression g nique sont transmis fid lement de cellule m re cellule fille. La structure de la chromatine joue un r le dans cette transmission pig n tique de l'information d'une g n ration cellulaire l'autre. Un type de preuve provient d' tudes dans lesquelles le noyau d'une cellule d'une grenouille ou d'un t tard est transplant dans un uf de grenouille dont le propre noyau a t retir (un uf nucl ). Dans une s rie d'exp riences classiques r alis es en 1968, il a t d montr qu'un noyau pr lev sur une cellule donneuse diff renci e peut tre reprogramm de cette mani re pour soutenir le d veloppement d'un tout nouveau t tard (voir Figure 7-2). Mais cette reprogrammation ne se produit que difficilement, et elle devient de moins en moins efficace au fur et mesure que l'on utilise des noyaux d'animaux plus g s. Ainsi, par exemple, moins de 2 % des ovules nucl s inject s avec un noyau partir d'une cellule pith liale de t tard se sont d velopp s jusqu'au stade de t tard nageur, contre 35 % lorsque les noyaux du donneur ont t pr lev s la place d'un embryon pr coce (stade gastrula). Avec de nouveaux outils exp rimentaux, la cause de cette r sistance la reprogrammation peut maintenant tre retrac e. Cela se produit, au moins en partie, parce que les structures sp cifiques de la chromatine dans le noyau diff renci d'origine ont tendance persister et tre transmises travers les nombreux cycles de division cellulaire n cessaires au d veloppement embryonnaire. Dans des exp riences sur des embryons de x nope, il a t d montr que des formes sp cifiques de structures chromatiniennes r pressives ou actives persistent travers jusqu' 24 divisions cellulaires, provoquant l'expression mal plac e des g nes. La figure 4-45 d crit bri vement l'une de ces exp riences, Figure 4 44 Comment l'emballage de l'ADN dans la chromatine peut tre h rit apr s la r plication des chromosomes. Dans ce mod le, certains des composants sp cialis s de la chromatine sont distribu s chaque chromosome fr re apr s la duplication de l'ADN, ainsi que les nucl osomes sp cialement marqu s qu'ils lient. Apr s la r plication de l'ADN, les nucl osomes h rit s qui sont sp cialement modifi s, agissant de concert avec les composants h rit s de la chromatine, modifient le mod le de modification des histones sur les nucl osomes nouvellement form s proximit . Cela cr e de nouveaux sites de liaison pour les m mes composants de la chromatine, qui s'assemblent ensuite pour compl ter la structure. Ce dernier processus est susceptible d'impliquer des complexes lecteur- crivain-remodelage op rant dans un d'une mani re similaire celle illustr e pr c demment dans les figures 4 40. injecter normal pas d'injection injecter l'ARNm mutant H3.3 (contr le) Les cellules d'ARNm H3.3 ont t analys es pour l'expression de MyoD et pour l'histone H3.3 sur le promoteur de MyoD ax es sur la chromatine contenant la variante d'histone, H3.3. Nous reviendrons sur ces ph nom nes dans la derni re section du chapitre 22, o nous discuterons des cellules souches et de la mani re dont un type de cellule peut tre converti en un autre. Bien qu'il reste encore beaucoup apprendre sur les fonctions des diff rentes structures de la chromatine, l'emballage de l'ADN en nucl osomes a probablement t crucial pour l' volution des eucaryotes comme nous. Pour former un organisme multicellulaire complexe, les cellules de diff rentes lign es doivent se sp cialiser en modifiant l'accessibilit et l'activit de plusieurs centaines de g nes. Comme d crit au chapitre 21, ce processus d pend de la m moire cellulaire : chaque cellule d tient un enregistrement de son histoire d veloppementale pass e dans les circuits r gulateurs qui contr lent ses nombreux g nes. Cet enregistrement, semble-t-il, est en partie stock dans la structure de la chromatine. Bien que les bact ries aient galement des m canismes de m moire cellulaire, la complexit des circuits de m moire chez les eucaryotes sup rieurs est in gal e. Les strat gies bas es sur des variations locales de la structure de la chromatine, propres aux eucaryotes, peuvent permettre des g nes individuels, une fois activ s ou d sactiv s, de rester dans cet tat jusqu' ce qu'un nouveau facteur agisse pour l'inverser. un extr me, on trouve des structures comme la chromatine centrom rique qui, une fois tablies, sont h rit es de mani re stable d'une g n ration cellulaire l'autre. De m me, le principal type classique d'h t rochromatine, qui contient de longues puces de la prot ine HP1 (voir Figure 4-39), peut persister de mani re stable tout au long de la vie. En revanche, une forme de chromatine condens e c
Biologie moléculaire de la cellule	r e par le groupe de prot ines Polycomb sert faire taire les g nes qui doivent tre maintenus inactifs dans certaines conditions, mais qui sont actifs dans d'autres. Ce dernier m canisme r git l'expression d'un grand nombre de g nes qui codent pour des r gulateurs de transcription importants dans le d veloppement embryonnaire pr coce, comme nous l'avons vu au chapitre 21. Il existe de nombreuses autres variantes de la chromatine, certaines ayant des dur es de vie beaucoup plus courtes, souvent inf rieures au temps de division de la cellule. Nous reviendrons plus en d tail sur la vari t des types de chromatine dans la section suivante. Figure 4 45 : preuves de l'h r dit d'un tat de chromatine activant les g nes. Le g ne MyoD, bien caract ris , code pour une prot ine r gulatrice de transcription ma tresse pour le muscle, myoD (voir p. 399). Ce g ne est normalement activ dans la r gion indiqu e du jeune embryon o se forment les somites. lorsqu'un noyau de cette r gion est inject dans un ovule nucl comme indiqu , de nombreux noyaux de cellules de descendance expriment anormalement la prot ine myoD dans les r gions non musculaires de l'embryon de transplantation nucl aire qui se forme. Cette expression anormale peut tre attribu e au maintien de la r gion promotrice de MyoD dans son tat de chromatine active travers les nombreux cycles de division cellulaire qui produisent l'embryon au stade de blastula une soi-disant m moire pig n tique qui persiste dans ce cas en l'absence de transcription. La chromatine active entourant le promoteur MyoD contient la variante de l'histone H3.3 (voir Figure 4-35) sous une forme m thyl e lys4. Comme indiqu , une surproduction de cette histone caus e par l'injection d'un exc s d'ARNm codant pour la prot ine H3.3 normale augmente la fois l'occupation de H3.3 sur le promoteur MyoD et la production pig n tique de myoD, tandis que l'injection d'un ARNm produisant une forme mutante de H3.3 qui ne peut pas tre m thyl e au lys4 r duit la production pig n tique de myoD. De telles exp riences fournissent la preuve qu'un tat chromatinique h r ditaire sous-tend la m moire pig n tique observ e. (Adapt de R.k. Ng et J.b. gurdon, Nat. Cell Biol. 10:102 109, 2008. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) Dans les chromosomes des eucaryotes, l'ADN est uniform ment assembl en nucl osomes, mais une vari t de structures chromatiniennes diff rentes est possible. Cette vari t est bas e sur un large ensemble de modifications covalentes r versibles des quatre histones dans le noyau du nucl osome. Ces modifications comprennent la mono-, la di- et la trim thylation de nombreuses cha nes lat rales de lysine diff rentes, une r action importante qui est incompatible avec l'ac tylation qui peut se produire sur les m mes lysines. Des combinaisons sp cifiques de modifications marquent de nombreux nucl osomes, r gissant leurs interactions avec d'autres prot ines. Ces marques sont lues lorsque des modules prot iques qui font partie d'un complexe prot ique plus grand se lient aux nucl osomes modifi s dans une r gion de la chromatine. Ces prot ines de lecture attirent ensuite des prot ines suppl mentaires qui remplissent diverses fonctions. Certains complexes prot iques de lecteur contiennent une enzyme modifiant les histones, telle qu'une histone lysine m thylase, qui crit la m me marque que le lecteur reconna t. Un complexe lecteur- crivain-remodeleur de ce type peut propager une forme sp cifique de chromatine le long d'un chromosome. En particulier, on pense que de grandes r gions d'h t rochromatine condens e se forment de cette mani re. L'h t rochromatine se trouve g n ralement autour des centrom res et pr s des t lom res, mais elle est galement pr sente de nombreuses autres positions dans les chromosomes. L'emballage serr de l'ADN dans l'h t rochromatine r duit g n ralement au silence les g nes qu'il contient. Le ph nom ne de la panachure de l'effet de position fournit des preuves solides de l'h r dit des tats condens s de la chromatine d'une g n ration cellulaire l'autre. Un m canisme similaire semble tre responsable du maintien de la chromatine sp cialis e au niveau des centrom res. Plus g n ralement, la capacit de propager des structures sp cifiques de la chromatine travers les g n rations cellulaires rend possible un processus de m moire cellulaire pig n tique qui joue un r le dans le maintien de l'ensemble des diff rents tats cellulaires requis par les organismes multicellulaires complexes. Apr s avoir discut des mol cules d'ADN et de prot ines partir desquelles la fibre chromatinienne est fabriqu e, nous nous tournons maintenant vers l'organisation du chromosome une chelle plus globale et la mani re dont ses diff rents domaines sont dispos s dans l'espace. En tant que fibre de 30 nm, un chromosome humain typique mesurerait toujours 0,1 cm de long et serait capable de couvrir le noyau plus de 100 fois. Il est clair qu'il doit y avoir
Biologie moléculaire de la cellule	un niveau de repliement encore plus lev , m me dans les chromosomes d'interphase. Bien que les d tails mol culaires soient encore en grande partie un myst re, cet emballage d'ordre sup rieur implique presque certainement le pliage de la chromatine en une s rie de boucles et de bobines. Cet emballage chromatinal est fluide, changeant fr quemment en r ponse aux besoins de la cellule. Nous commen ons cette section en d crivant certains chromosomes interphasiques inhabituels qui peuvent tre facilement visualis s. Aussi exceptionnels soient-ils, ces cas particuliers r v lent des caract ristiques que l'on pense repr sentatives de tous les chromosomes interphasiques. De plus, ils fournissent des moyens d' tudier certains aspects fondamentaux de la structure de la chromatine que nous avons abord s dans la section pr c dente. Ensuite, nous d crivons comment un chromosome d'interphase typique est dispos dans le noyau de la cellule de mammif re. Enfin, nous aborderons la compaction d cupl e suppl mentaire que subissent les chromosomes lors du passage de l'interphase la mitose. Les chromosomes sont pli s en grandes boucles de chromatine La structure des chromosomes dans les cellules interphasiques est venue d' tudes sur les chromosomes rigides et norm ment tendus dans les ovocytes d'amphibiens en croissance (ovules immatures). Ces chromosomes tr s inhabituels en brosse de lampe (les plus grands chromosomes connus), appari s en pr paration la m iose, sont clairement visibles m me au microscope optique, o ils sont organis s en une s rie de grandes boucles chromatiniennes manant d'un axe chromosomique lin aire (Figure 4-46 et Figure 4-47). Dans ces chromosomes, une boucle donn e contient toujours la m me s quence d'ADN qui reste tendue de la m me mani re que la croissance de l'ovocyte. Ces chromosomes produisent de grandes quantit s d'ARN pour l'ovocyte et la plupart des g nes Figure 4 46 Un mod le pour les domaines de la chromatine dans un chromosome en brosse de lampe. On voit une petite partie d'une paire de chromatides s urs. Ici, deux doubles h lices d'ADN identiques sont align es c te c te, emball es dans diff rents types de chromatine. L'ensemble des chromosomes en brosse de lampe chez de nombreux amphibiens contient un total d'environ 10 000 boucles ressemblant celles montr es ici. Le reste de l'ADN de chaque chromosome (la grande majorit ) reste tr s condens . Quatre copies de chaque boucle sont pr sentes dans la cellule, puisque chaque chromosome en brosse de lampe est constitu de deux ensembles align s de chromatides appari es. Cette structure quatre brins est caract ristique de ce stade de d veloppement de l'ovocyte, qui s'est arr t au stade diplot ne de la m iose ; voir la figure 17 56. pr sents dans les boucles d'ADN sont activement exprim s. La majorit de l'ADN, cependant, n'est pas en boucle mais reste fortement condens sur l'axe des chromosomes, o les g nes ne sont g n ralement pas exprim s. On pense que les chromosomes interphasiques de tous les eucaryotes sont dispos s de la m me mani re en boucles. Bien que ces boucles soient normalement trop petites et fragiles pour tre facilement observ es au microscope optique, d'autres m thodes peuvent tre utilis es pour d duire leur pr sence. Par exemple, les technologies modernes de l'ADN ont permis d' valuer la fr quence laquelle deux loci le long d'un chromosome interphase sont maintenus ensemble, r v lant ainsi des candidats probables pour les sites de la chromatine qui forment les bases des structures de boucle (Figure 4-48). Ces exp riences et d'autres sugg rent que l'ADN des chromosomes humains est susceptible d' tre organis en boucles de diff rentes longueurs. Une boucle typique peut contenir entre 50 000 et 200 000 paires de nucl otides d'ADN, bien que des boucles d'un million de paires de nucl otides aient galement t sugg r es (Figure 4 49). D'autres informations sont venues d'une autre classe inhabituelle de cellules : les cellules polyt nes des mouches, telles que la drosophile. Certains types de cellules, dans de nombreux organismes, poussent anormalement gros travers plusieurs cycles de synth se de l'ADN sans division cellulaire. De telles cellules, contenant un nombre accru de chromosomes standard, sont dites polyplo des. Dans les glandes salivaires des larves de mouches, ce processus est pouss un degr extr me, cr ant d' normes cellules contenant des centaines ou des milliers de copies de la Figure 4 47 chromosomes en brosse de lampe. (A) Une micrographie optique des chromosomes en brosse de lampe dans un ovocyte d'amphibien. Au d but de la diff renciation ovocytaire, chaque chromosome se r plique pour commencer la m iose, et les chromosomes r pliqu s homologues s'apparient pour former cette structure tr s tendue contenant un total de quatre doubles h lices d'ADN r pliqu es, ou chromatides. Le stade chromosomique de la brosse de lampe persiste pendant des mois ou des ann es, tandis que l'ovocyte
Biologie moléculaire de la cellule	accumule une r serve de mat riaux n cessaires son d veloppement final en un nouvel individu. (b) Une r gion largie d'un chromosome similaire, color e avec un r actif fluorescent qui rend les boucles actives dans la synth se de l'ARN clairement visibles. (Avec l'aimable autorisation de Joseph G. Gall.) g nome. De plus, dans ce cas, toutes les copies de chaque chromosome sont align es c te c te dans un registre exact, comme des pailles dans une bo te, pour cr er des chromosomes polyt nes g ants. Ceux-ci permettent de d tecter des caract ristiques que l'on pense partager avec les chromosomes interphases ordinaires, mais qui sont normalement difficiles voir. Lorsque les chromosomes polyt nes des glandes salivaires d'une mouche sont observ s au microscope optique, des bandes sombres altern es distinctes et des interbandes claires sont visibles (Figure 4-50), chacune form e d'un millier de s quences d'ADN identiques dispos es c te c te dans le registre. Environ 95 % de l'ADN des chromosomes polyt nes est en bandes et 5 % en interbandes. Une bande tr s mince peut contenir 3000 paires de nucl otides, tandis qu'une bande paisse peut contenir 200 000 paires de nucl otides dans chacun de ses brins de chromatine. La chromatine dans chaque bande appara t sombre parce que l'ADN est plus condens que l'ADN dans les interbandes ; il peut galement contenir une concentration plus lev e de prot ines (Figure 4 51). Ce motif de bandes semble refl ter le m me type d'organisation d tect dans les chromosomes de lampbrush d'amphibiens d crits pr c demment. Il y a environ 3700 bandes et 3700 interbandes dans l'ensemble complet des chromosomes polyt nes de la drosophile. Les bandes peuvent tre reconnues par leurs diff rentes paisseurs et espacements, et chacune d'entre elles a re u un num ro pour g n rer une carte chromosomique qui a t index e sur la s quence g nomique finie de cette mouche. Les chromosomes polyt nes de la drosophile constituent un bon point de d part pour examiner comment la chromatine est organis e grande chelle. Dans la section pr c dente, nous avons vu qu'il existe de nombreuses formes de chromatine, chacune contenant des nucl osomes avec une combinaison diff rente d'histones modifi es. Des ensembles sp cifiques de prot ines non-histones s'assemblent sur ces nucl osomes pour affecter la fonction biologique de diff rentes mani res. Le recrutement de certaines de ces prot ines non-histones peut se propager sur de longues distances le long de l'ADN, conf rant une structure chromatinienne similaire de larges tendues Le produit de l'ADN n'est obtenu que si les prot ines maintiennent les deux s quences d'ADN proches l'une de l'autre dans la cellule Figure 4 48 M thode de d termination de la position des boucles dans les chromosomes interphasiques. Dans cette technique, connue sous le nom de m thode de capture de la conformation chromosomique (3C), les cellules sont trait es avec du formald hyde pour cr er les r ticulations covalentes ADN-prot ine et ADN-ADN indiqu es. L'ADN est ensuite trait avec une enzyme (une nucl ase de restriction) qui coupe l'ADN en plusieurs morceaux, coupant des s quences nucl otidiques strictement d finies et formant des ensembles d' extr mit s coh sives identiques (voir Figure 8-28). Les extr mit s coh sives peuvent tre amen es se joindre gr ce leur appariement de base compl mentaire. Il est important de noter qu'avant l' tape de ligature montr e, l'ADN est dilu de sorte que les fragments qui ont t conserv s proximit les uns des autres (par r ticulation) sont ceux qui sont les plus susceptibles de se joindre. Enfin, les r ticulations sont invers es et les fragments d'ADN nouvellement ligatur s sont identifi s et quantifi s par PCR (r action en cha ne par polym rase, d crite au chapitre 8). partir des r sultats, combin s des informations sur les s quences d'ADN, on peut d river des mod les pour la conformation interphase des chromosomes. Figure 4 49 Un mod le pour l'organisation d'un chromosome interphasique. Une section d'un chromosome interphase est repr sent e repli e en une s rie de domaines en boucle, chacun contenant peut- tre 50 000 200 000 paires nucl otidiques ou plus d'ADN double h lice condens en une fibre de chromatine. La chromatine dans chaque boucle individuelle est davantage condens e par des processus de repliement mal compris qui sont invers s lorsque la cellule a besoin d'un acc s direct l'ADN emball dans la boucle. Ni la composition de l'axe chromosomique postul , ni la fa on dont la fibre de chromatine pli e y est ancr e ne sont claires. Cependant, dans les chromosomes mitotiques, les bases des boucles chromosomiques sont enrichies la fois en condensines (discut es ci-dessous) et en enzymes de l'ADN topoisom rase II (discut es au chapitre 5), deux prot ines qui peuvent former une grande partie de l'axe en m taphase. bras droit mitotique normal des chromosomes au chromosome 2 m me r gion d' chelle o deux chromo
Biologie moléculaire de la cellule	somes homologues sont s par s bras gauche du chromosome 2 bras gauche du chromosome 3 chromocentre 20 m bras droit du chromosome 3 du g nome (voir Figure 4 40). De telles r gions, o toute la chromatine a une structure similaire, sont s par es des domaines voisins par des prot ines barri res (voir Figure 4-41). basse r solution, le chromosome interphase peut donc tre consid r comme une mosa que de structures chromatiniennes, chacune contenant des modifications nucl osomiques particuli res associ es un ensemble particulier de prot ines non-histones. Les chromosomes polyt nes nous permettent de voir les d tails de cette mosa que de domaines au microscope optique, ainsi que d'observer certains des changements associ s l'expression des g nes. Il existe plusieurs formes de chromatine En colorant les chromosomes polyt nes de la drosophile avec des anticorps, ou en utilisant une technique plus r cente appel e analyse ChIP (immunopr cipitation de la chromatine) (voir chapitre 8), les emplacements des prot ines histones et non-histones dans la chromatine peuvent tre cartographi s sur l'ensemble de la s quence d'ADN du g nome d'un organisme. Une telle analyse chez la drosophile a jusqu' pr sent localis plus de 50 prot ines chromatiniennes diff rentes et modifications d'histones. Les r sultats sugg rent que trois principaux types de chromatine r pressive pr dominent dans cet organisme, ainsi que deux principaux types de chromatine sur les g nes activement transcrits, et que chaque type est associ un complexe diff rent de prot ines non histones. Ainsi, l'h t rochromatine classique contient plus de six de ces prot ines, dont la prot ine d'h t rochromatine 1 (HP1), Figure 4 50 L'ensemble complet des chromosomes polyt nes dans une cellule salivaire de drosophile. Dans ce dessin d'une micrographie optique, les chromosomes g ants ont t tal s pour tre observ s en les crasant contre une lame de microscope. La drosophile a quatre chromosomes, et il y a quatre paires de chromosomes diff rentes pr sentes. Mais chaque chromosome est troitement appari avec son homologue (de sorte que chaque paire appara t comme une seule structure), ce qui n'est pas vrai dans la plupart des noyaux (sauf dans la m iose). Chaque chromosome a subi plusieurs cycles de r plication, et les homologues et tous leurs doublons sont rest s en registre exact les uns avec les autres, ce qui a donn lieu d' normes c bles de chromatine de plusieurs brins d'ADN pais. Les quatre chromosomes polyt nes sont normalement reli s entre eux par des r gions h t rochromatiques proches de leur Centrom res qui s'agr gent pour cr er un seul grand chromocentre (r gion rose). Dans cette pr paration, cependant, le chromocentre a t divis en deux moiti s par la proc dure d' crasement utilis e. (Adapt de T.S. Painter, J. Hered. 25:465 476, 1934. avec la permission d'Oxford University Press.) Figure 4 51 Micrographies de chromosomes polyt nes des glandes salivaires de la drosophile. (A) micrographie optique d'une partie d'un chromosome. L'ADN a t color avec un colorant fluorescent, mais une image invers e est pr sent e ici qui rend l'ADN noir plut t que blanc ; les bandes sont clairement consid r es comme des r gions o la concentration d'ADN augmente. Ce chromosome a t trait par un traitement haute pression afin de montrer plus clairement son motif distinct de bandes et d'interbandes. (b) Une micrographie lectronique d'une petite section d'un chromosome polyt ne de drosophile vu en lame mince. On peut facilement distinguer des bandes d' paisseurs tr s diff rentes, s par es par des interbandes, qui contiennent moins de chromatine condens e. (A, adapt de D.v. Novikov, I. kireev et A.S. belmont, Nat. Methods 4:483-485, 2007. avec la permission de macmillan Publishers ltd ; b, avec l'aimable autorisation de veikko Sorsa.) Figure 4 52 Synth se de l'ARN dans les gonflements de chromosomes polyt nes. Autoradiographie d'une seule bouff e dans un chromosome polyt ne provenant des glandes salivaires de la c cidomyie d'eau douce Chironomus tentans. Comme indiqu au chapitre 1 et d crit en d tail au chapitre 6, la premi re tape de l'expression g nique est la synth se d'une mol cule d'ARN en utilisant l'ADN comme mod le. La partie d condens e du chromosome subit une synth se d'ARN et a t marqu e avec de la 3H-uridine, une mol cule pr curseur de l'ARN qui est incorpor e dans les cha nes d'ARN en croissance. (Avec l'aimable autorisation de Jos bonner.) tandis que la forme dite Polycomb de l'h t rochromatine contient un nombre similaire de prot ines d'un ensemble diff rent (prot ines PcG). En plus des cinq principaux types de chromatine, d'autres formes plus mineures de chromatine semblent tre pr sentes, chacune d'entre elles pouvant tre r gul e diff remment et avoir des r les distincts dans la cellule. L'ensemble des prot ines li es la chromatine un locus donn varie en fonction du type de cellule et de son stade de d veloppement. Ces var
Biologie moléculaire de la cellule	iations rendent l'accessibilit de g nes sp cifiques diff rente dans diff rents tissus, aidant g n rer la diversification cellulaire qui accompagne le d veloppement embryonnaire (d crite au chapitre 21). Les boucles chromatiniennes se d condensent lorsque les g nes qu'elles contiennent sont exprim s Lorsqu'un insecte progresse d'un stade de d veloppement un autre, des gonflements chromosomiques distinctifs apparaissent et les anciennes pouss es reculent dans ses chromosomes polyt nes mesure que de nouveaux g nes s'expriment et que les anciens sont d sactiv s (Figure 4 52). D'apr s l'inspection de chaque bouff e lorsqu'elle est relativement petite et que le motif de bandes est encore discernable, il semble que la plupart des bouff es proviennent de la d condensation d'une seule bande chromosomique. Les fibres de chromatine individuelles qui composent une houppette peuvent tre visualis es au microscope lectronique. Dans les cas favorables, des boucles sont observ es, un peu comme celles observ es dans les chromosomes en brosse lampe d'amphibien. Lorsque les g nes de la boucle ne sont pas exprim s, la boucle prend une structure paissie, peut- tre celle d'une fibre pli e de 30 nm, mais lorsque l'expression des g nes se produit, la boucle devient plus tendue. En micrographie lectronique, la chromatine situ e de part et d'autre de la boucle d condens e semble consid rablement plus compacte, ce qui sugg re qu'une boucle constitue un domaine fonctionnel distinct de la structure de la chromatine. Les observations dans les cellules humaines sugg rent galement que les boucles de chromatine fortement repli es se dilatent pour occuper un volume accru lorsqu'un g ne l'int rieur de celles-ci est exprim . Par exemple, les r gions chromosomiques quiescentes de 0,4 2 millions de paires de nucl otides apparaissent comme des points compacts dans un noyau interphasique lorsqu'elles sont visualis es par microscopie fluorescence. Cependant, on voit que le m me ADN occupe un territoire plus vaste lorsque ses g nes sont exprim s, avec des structures allong es et ponctu es rempla ant le point d'origine. De nouvelles fa ons de visualiser les chromosomes individuels ont montr que chacun des 46 chromosomes interphasiques dans une cellule humaine a tendance occuper son propre territoire discret dans le noyau, c'est- -dire que les chromosomes ne sont pas largement enchev tr s les uns avec les autres (Figure 4-53). Cependant, de telles images ne pr sentent qu'une vue moyenne de l'ADN de chaque chromosome. Les exp riences qui localisent sp cifiquement les r gions h t rochromatiques d'un chromosome r v lent qu'elles sont souvent Figure 4 53 Visualisation simultan e des territoires chromosomiques de tous les chromosomes humains dans un seul noyau interphasique. Ici, un m lange de sondes d'ADN pour chaque chromosome a t marqu de mani re rendre fluorescent un spectre diff rent ; cela permet d'utiliser l'hybridation ADN-ADN pour d tecter chaque chromosome, comme dans la figure 4-10. Des reconstitutions tridimensionnelles ont ensuite t r alis es. Sous la micrographie, chaque chromosome est identifi dans un sch ma de l'image r elle. Notez que les chromosomes homologues (par exemple, les deux copies du chromosome 9) ne sont g n ralement pas co-localis s. (D'apr s m.R. Speicher et N.P. Carter, Nat. Rev. Genet. 6:782-792, 2005. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) Figure 4 54 La distribution des r gions riches en g nes du g nome humain dans un noyau interphasique. Des r gions riches en g nes ont t visualis es l'aide d'une sonde fluorescente qui s'hybride avec la r p tition intercal e d'Alu, qui est pr sente dans plus d'un million d'exemplaires dans le g nome humain (voir page 292). Pour des raisons inconnues, ces s quences se regroupent dans des r gions chromosomiques riches en g nes. Dans cette repr sentation, les r gions enrichies pour la s quence Alu sont vertes, les r gions appauvries pour ces s quences sont rouges, tandis que les r gions moyennes sont jaunes. Les r gions riches en g nes sont largement absentes de l'ADN pr s de l'enveloppe nucl aire. (D'apr s A. bolzer et al., PLoS Biol. 3:826-842, 2005.) troitement associ la lame nucl aire, quel que soit le chromosome examin . Et les sondes d'ADN qui colorent pr f rentiellement les r gions riches en g nes des chromosomes humains produisent une image frappante du noyau interphasique qui refl te probablement diff rentes positions moyennes pour les g nes actifs et inactifs (Figure 4-54). Comment la majeure partie de la chromatine de chaque chromosome interphase est-elle condens e lorsque ses g nes ne sont pas exprim s ? Une extension puissante de la m thode de capture de la conformation chromosomique d crite pr c demment (voir Figure 4-48), qui exploite une technologie de s quen age de l'ADN haut d bit appel e s quen age parall le massif (voir panneau 8-1, pp. 478-481), permet de cartographier les connexions entre tous les diff rents se
Biologie moléculaire de la cellule	gments d'une m gabase (1 Mb) du g nome humain dans les chromosomes interphases humains. Les r sultats r v lent que la plupart des r gions de nos chromosomes sont repli es dans une conformation appel e globule fractal : un arrangement sans n uds qui facilite un tassement maximal tout en pr servant la capacit de la fibre chromatinienne se d plier et se plier (Figure 4-55). La chromatine peut se d placer vers des sites sp cifiques dans le noyau pour modifier l'expression des g nes Une vari t de types d'exp riences diff rents a conduit la conclusion que la position d'un g ne l'int rieur du noyau change lorsqu'il devient fortement exprim . Ainsi, on constate parfois qu'une r gion qui devient tr s activement transcrite s' tend au-del de son territoire chromosomique, comme si elle tait dans une boucle tendue (Figure 4 56). Nous verrons au chapitre 6 que l'initiation de la transcription la premi re tape de l'expression g nique n cessite l'assemblage de plus de 100 prot ines, et il est logique que cela soit facilit dans les r gions du noyau enrichies en ces prot ines. Plus g n ralement, il est clair que le noyau est tr s h t rog ne, avec des r gions fonctionnellement diff rentes vers lesquelles des parties des chromosomes peuvent se d placer lorsqu'elles sont soumises diff rents processus biochimiques, par exemple lorsque leur expression g nique change. C'est de cette question que nous aborderons ensuite. Figure 4 55 Un mod le de globule fractal pour la chromatine interphase. Une extension de la m thode 3C de la figure 4-48, appel e Hi-C, a t utilis e pour mesurer dans quelle mesure chacun des trois mille segments de 1 mb du g nome humain tait situ c t d'un autre de ces segments. Les r sultats confirment le type de mod le pr sent . Dans le globule fractal largi illustr , une r gion de 5 millions de paires de bases se replie de mani re ce que les r gions voisines le long de l'h lice d'ADN unidimensionnelle restent voisines en trois dimensions ; Cela donne lieu des blocs monochromatiques dans cette repr sentation qui sont vidents la fois sur le en surface et en coupe transversale. Le globule fractal est une conformation sans n ud de l'ADN qui permet un empilement dense, tout en conservant la capacit de plier et de d plier facilement n'importe quel locus g nomique. (Adapt de E. lieberman-Aiden et al., Science 326:289-293, 2009. avec l'autorisation de l'AAAS.) Figure 4 56 Un effet de niveaux lev s d'expression g nique sur la localisation intranucl aire de la chromatine. (A) Micrographies fluorescence de noyaux humains montrant comment la position d'un g ne change lorsqu'il devient hautement transcrit. La r gion du chromosome adjacente au g ne (rouge) ne quitte son territoire chromosomique (vert) que lorsqu'elle est tr s active. (b) Repr sentation sch matique d'une grande boucle de chromatine qui se dilate lorsque le g ne est activ et se contracte lorsque le g ne est d sactiv . D'autres g nes qui sont moins activement exprim s peuvent tre montr s par les m mes m thodes pour rester l'int rieur de leur territoire chromosomique lorsqu'ils sont transcrits. (D'apr s J.R. Chubb et w.A. Bickmore, Cell 112:403 406, 2003. avec la permission d'Elsevier.) Les r seaux de macromol cules forment un ensemble d'environnements biochimiques distincts l'int rieur du noyau Dans le chapitre 6, nous d crirons la fonction d'une vari t de sous-compartiments pr sents dans le noyau. Le plus grand et le plus vident d'entre eux est le nucl ole, une structure bien connue des microscopistes m me au XIXe si cle (voir Figure 4-9). Le nucl ole est le site cellulaire de formation des sous-unit s du ribosome, ainsi que l'endroit o se produisent de nombreuses autres r actions sp cialis es (voir Figure 6-42) : il se compose d'un r seau d'ARN et de prot ines concentr s autour des g nes de l'ARN ribosomique qui sont activement transcrits. Chez les eucaryotes, le g nome contient plusieurs copies des g nes de l'ARN ribosomique, et bien qu'ils soient g n ralement regroup s dans un seul nucl ole, ils sont souvent situ s sur plusieurs chromosomes distincts. Une vari t d'organites moins vidents sont galement pr sents l'int rieur du noyau. Par exemple, des structures sph riques appel es corps de Cajal et amas de granules interchromatiniens sont pr sentes dans la plupart des cellules v g tales et animales (Figure 4-57). Comme le nucl ole, ces organites sont compos s de mol cules de prot ines et d'ARN s lectionn es qui se lient ensemble pour cr er des r seaux hautement perm ables d'autres mol cules de prot ines et d'ARN dans le nucl oplasme environnant. De telles structures peuvent cr er des environnements biochimiques distincts en immobilisant des groupes s lectionn s de macromol cules, tout comme le peuvent d'autres r seaux de prot ines et de mol cules d'ARN associ s aux pores nucl aires et l'enveloppe nucl aire. En principe, cela permet aux autres mol cules qui p n trent dans ces espaces d' tre t
Biologie moléculaire de la cellule	rait es avec une grande efficacit par des voies de r action complexes. Hautement perm ables, les r seaux fibreux de 1 m de ce type peuvent ainsi conf rer de nombreux avantages cin tiques de la compartimentation (voir p. 164) aux r actions qui se produisent dans les sous-r gions du noyau (Figure 4-58A). Cependant, contrairement aux compartiments membranaires dans les sous-compartiments nucl aires. La grande quantit de cytoplasme (discut e au chapitre 12), ces sous-compartiments nucl aires manque de sph re ici est un corps de Cajal. Plus une membrane bicouche lipidique est petite, plus elle ne peut ni concentrer ni exclure une petite sph re sp cifique plus fonc e est une mol cule de granule interchromatine. amas de grappes, galement connu sous le nom de chatoiement (voir aussi les figures 6 46). Ces La cellule a une capacit remarquable construire des environnements distincts pour que les per- organites sont du noyau d'une forme de t ches biochimiques complexes efficacement. Ceux que nous avons mentionn s dans le Ovocyte de x nope. (De k.E. Handwerger noyau faciliter divers aspects de l'expression des g nes, et sera discut plus en d tail et J.g. gall, Trends Cell Biol. 16:19-26, au chapitre 6. Ces sous-compartiments, y compris le nucl ole, semblent former 2006. avec l'autorisation d'Elsevier.) seulement au besoin, et ils cr ent une forte concentration locale des nombreuses enzymes et mol cules d'ARN diff rentes n cessaires un processus particulier. De mani re analogue, lorsque l'ADN est endommag par l'irradiation, on observe que l'ensemble des enzymes n cessaires la r paration de l'ADN se rassemblent en foyers discrets l'int rieur du noyau, cr ant ainsi des usines de r paration (voir Figure 5-52). Et les noyaux contiennent souvent des centaines de foyers discrets repr sentant des usines pour la synth se de l'ADN ou de l'ARN (voir Figure 6-47). Il semble probable que toutes ces entit s utilisent le type d'attache illustr dans la figure 4-58B, o de longues longueurs flexibles de cha ne polypeptidique et/ou de longues mol cules d'ARN non codantes sont entrecoup es de sites de liaison sp cifiques qui concentrent les multiples prot ines et autres mol cules n cessaires pour catalyser un processus particulier. Il n'est pas surprenant que les attaches soient galement utilis es pour aider acc l rer les processus biologiques dans le cytoplasme, augmentant ainsi les taux de r action sp cifiques (par exemple, voir Figure 16-18). Existe-t-il galement un cadre intranucl aire, analogue au cytosquelette, sur lequel les chromosomes et les autres composants du noyau sont organis s ? La matrice nucl aire, ou chafaudage, a t d finie comme la mati re insoluble laiss e dans le noyau apr s une s rie d' tapes d'extraction biochimique. De nombreuses prot ines et mol cules d'ARN qui forment ce mat riel insoluble sont susceptibles d' tre d riv es des sous-compartiments fibreux du noyau dont nous venons de parler, tandis que d'autres peuvent tre des prot ines qui aident former la base des boucles chromosomiques ou attacher des chromosomes d'autres structures du noyau. Apr s avoir discut de la structure dynamique des chromosomes interphasiques, nous nous tournons maintenant vers les chromosomes mitotiques. Les chromosomes de presque toutes les cellules eucaryotes deviennent facilement visibles en microscopie optique pendant la mitose, lorsqu'ils s'enroulent pour former des structures tr s condens es. Cette condensation ne r duit la longueur d'un chromosome d'interphase typique que d'environ dix fois, mais elle produit un changement spectaculaire dans l'apparence des chromosomes. La figure 4-59 repr sente un chromosome mitotique typique au stade de m taphase de la mitose (pour les stades de la mitose, voir la figure 17-3). Les deux mol cules d'ADN produites par la r plication de l'ADN pendant l'interphase du cycle de division cellulaire sont pli es s par ment pour produire deux chromosomes s urs, ou chromatides s urs, maintenus ensemble leurs centrom res, comme mentionn pr c demment. Ces chromosomes sont normalement recouverts d'une vari t de mol cules, y compris de grandes quantit s d'ARN-prot ine Figure 4 58 Compartimentation efficace sans membrane bicouche. (A) Illustration sch matique de l'organisation d'un organite subnucl aire sph rique ( gauche) et d'un sous-compartiment postul organis de mani re similaire juste sous l'enveloppe nucl aire ( droite). Dans les deux cas, les ARN et/ou les prot ines (gris) s'associent pour former des structures tr s poreuses, semblables des gels, qui contiennent des sites de liaison pour d'autres prot ines et mol cules d'ARN sp cifiques (objets color s). (b) Comment l'attache d'un ensemble s lectionn de prot ines et de mol cules d'ARN de longues cha nes de polym res flexibles, comme en (A), peut cr er des zones de transit qui acc l rent consid rablement les taux de r actions dans les sous-compartiments du noyau. Les r actions catalys es
Biologie moléculaire de la cellule	d pendront des macromol cules particuli res qui sont localis es par le captage. La m me strat gie pour acc l rer des ensembles complexes de r actions est galement employ e dans des sous-compartiments ailleurs dans la cellule (voir aussi Figure 3-78). Figure 4 59 Un chromosome mitotique typique en m taphase. Chaque chromatide s ur contient l'une des deux mol cules d'ADN s urs identiques g n r es plus t t dans le cycle cellulaire par la r plication de l'ADN (voir aussi Figure 17-21). Figure 4 60 Micrographie lectronique balayage d'une r gion situ e pr s d'une extr mit d'un chromosome mitotique typique. On pense que chaque projection en forme de bouton repr sente la pointe d'un domaine en boucle distinct. Notez que les deux chromatides appari es identiques (dessin es sur la figure 4-59) peuvent tre clairement distingu es. (D'apr s m.P. marsden et U.k. laemmli, Cell 17:849 858, 1979. avec la permission d'Elsevier.) complexes. Une fois ce rev tement enlev , chaque chromatide peut tre vue en micrographie lectronique pour tre organis e en boucles de chromatine manant d'un chafaudage central (Figure 4 60). Des exp riences utilisant l'hybridation de l'ADN pour d tecter des s quences d'ADN sp cifiques d montrent que l'ordre des caract ristiques visibles le long d'un chromosome mitotique refl te au moins approximativement l'ordre des g nes le long de la mol cule d'ADN. La condensation des chromosomes mitotiques peut donc tre consid r e comme le dernier niveau de la hi rarchie de l'empaquetage des chromosomes (Figure 4-61). Le compactage des chromosomes pendant la mitose est un processus hautement organis et dynamique qui sert au moins deux objectifs importants. Tout d'abord, lorsque la condensation est compl te (en m taphase), les chromatides s urs ont t d m l s l'un de l'autre et reposent c te c te. Ainsi, les chromatides s urs peuvent facilement se s parer lorsque l'appareil mitotique commence les s parer. Deuxi mement, la compaction des chromosomes prot ge les mol cules d'ADN relativement fragiles contre la rupture lorsqu'elles sont tir es pour s parer les cellules filles. La condensation des chromosomes interphasiques en chromosomes mitotiques commence au d but de la phase M, et elle est intimement li e la progression du cycle cellulaire. Au cours de la phase M, l'expression des g nes s'arr te et des modifications sp cifiques sont apport es aux histones qui aident r organiser la chromatine lorsqu'elle se compacte. Deux classes de prot ines en forme d'anneau, appel es coh sines et condensines, contribuent ce compactage. La fa on dont ils aident produire les deux chromatides repli es s par ment d'un chromosome mitotique sera discut e au chapitre 17, ainsi que les d tails du cycle cellulaire. r gion courte de 11 nm forme de chromatine perles-sur-une-ficelle chromatine fber de 30 nm R SULTAT NET : CHAQUE MOL CULE D'ADN A T EMBALL E DANS UN CHROMOSOME MITOTIQUE 10 000 FOIS PLUS COURT QUE SA LONGUEUR COMPL TEMENT D PLOY E DE 0,1 M Figure 4 61 Garnissage de la chromatine. Ce mod le montre certains des nombreux niveaux d'empilement de la chromatine postul s pour donner naissance au chromosome mitotique hautement condens . Les chromosomes sont g n ralement d condens s pendant l'interphase, de sorte que les d tails de leur structure sont difficiles visualiser. Les exceptions notables sont les chromosomes sp cialis s en brosse de lampe des ovocytes de vert br s et les chromosomes polyt nes dans les cellules s cr toires g antes des insectes. L' tude de ces deux types de chromosomes interphasiques sugg re que chaque longue mol cule d'ADN d'un chromosome est divis e en un grand nombre de domaines discrets organis s en boucles de chromatine qui sont compact es par un repliement suppl mentaire. Lorsque les g nes contenus dans une boucle sont exprim s, la boucle se d plie et permet la machinerie cellulaire d'acc der l'ADN. Les chromosomes interphasiques occupent des territoires discrets dans le noyau cellulaire ; c'est- -dire qu'ils ne sont pas troitement li s. L'euchromatine constitue la plupart des chromosomes interphasiques et, lorsqu'elle n'est pas transcrite, elle existe probablement sous forme de fibres troitement pli es de nucl osomes compact s. Cependant, l'euchromatine est interrompue par des tron ons d'h t rochromatine, dans lesquels les nucl osomes sont soumis un empilement suppl mentaire qui rend g n ralement l'ADN r sistant l'expression g nique. L'h t rochromatine existe sous plusieurs formes, dont certaines se trouvent dans de grands blocs dans et autour des centrom res et pr s des t lom res. Mais l'h t rochromatine est galement pr sente de nombreuses autres positions sur les chromosomes, o elle peut servir r guler les g nes importants pour le d veloppement. L'int rieur du noyau est tr s dynamique, l'h t rochromatine tant souvent positionn e pr s de l'enveloppe nucl aire et les boucles de chromatine s' loignant de leur territoire chromosomique lorsque le
Biologie moléculaire de la cellule	s g nes sont tr s fortement exprim s. Cela refl te l'existence de sous-compartiments nucl aires, o diff rents ensembles de r actions biochimiques sont facilit s par une concentration accrue de prot ines et d'ARN s lectionn s. Les composants impliqu s dans la formation d'un sous-compartiment peuvent s'auto-assembler en organites discrets tels que des nucl oles ou des corps de Cajal ; Ils peuvent galement tre attach s des structures fixes telles que l'enveloppe nucl aire. Au cours de la mitose, l'expression des g nes s'arr te et tous les chromosomes adoptent une conformation hautement condens e dans un processus qui commence au d but de la phase M pour emballer les deux mol cules d'ADN de chaque chromosome r pliqu sous la forme de deux chromatides repli es s par ment. La condensation s'accompagne de modifications d'histones qui facilitent l'empaquetage de la chromatine, mais l'ach vement satisfaisant de ce processus ordonn , qui r duit la distance de bout en bout de chaque mol cule d'ADN par rapport sa longueur d'interphase d'un facteur suppl mentaire de dix, n cessite des prot ines suppl mentaires. Dans cette derni re section du chapitre, nous donnons un aper u de certaines des fa ons dont les g nes et les g nomes ont volu au fil du temps pour produire la grande diversit des formes de vie modernes sur notre plan te. Le s quen age des g nomes de milliers d'organismes r volutionne notre vision du processus de l' volution, d couvrant une richesse tonnante d'informations non seulement sur les relations familiales entre les organismes, mais aussi sur les m canismes mol culaires par lesquels l' volution s'est d roul e. Il n'est peut- tre pas surprenant que des g nes ayant des fonctions similaires puissent tre trouv s dans un large ventail d' tres vivants. Mais la grande r v lation des 30 derni res ann es a t la mesure dans laquelle les s quences nucl otidiques r elles de nombreux g nes ont t conserv es. Les g nes homologues, c'est- -dire les g nes qui sont similaires la fois dans leur s quence nucl otidique et leur fonction en raison d'une ascendance commune, peuvent souvent tre reconnus travers de vastes distances phylog n tiques. Des homologues indubitables de nombreux g nes humains sont pr sents dans des organismes aussi divers que les vers n matodes, les mouches des fruits, les levures et m me les bact ries. Dans de nombreux cas, la ressemblance est si troite que, par exemple, la partie codant pour les prot ines d'un g ne de levure peut tre substitu e par son homologue humain, m me si les humains et la levure sont s par s par plus d'un milliard d'ann es d'histoire volutive. Comme soulign au chapitre 3, la reconnaissance de la similitude de s quence est devenue un outil majeur pour d duire la fonction des g nes et des prot ines. Bien qu'une correspondance de s quence ne garantisse pas la similitude de fonction, elle s'est av r e tre un excellent indice. Ainsi, il est souvent possible de pr dire la fonction de g nes chez l'homme pour lesquels aucune information biochimique ou g n tique n'est disponible simplement en comparant leurs s quences nucl otidiques avec les s quences de g nes qui ont t caract ris es dans d'autres organismes plus facilement tudi s. En g n ral, les s quences des g nes individuels sont beaucoup plus troitement conserv es que la structure globale du g nome. Les caract ristiques de l'organisation du g nome telles que la taille du g nome, le nombre de chromosomes, l'ordre des g nes le long des chromosomes, l'abondance et la taille des introns et la quantit d'ADN r p titif diff rent consid rablement lorsque l'on compare des organismes loign s, tout comme le nombre de g nes que chaque organisme contient. Un premier obstacle l'interpr tation de la s quence des 3,2 milliards de paires de nucl otides dans le g nome humain est le fait qu'une grande partie de celle-ci est probablement fonctionnellement sans importance. Les r gions du g nome qui codent pour les s quences d'acides amin s des prot ines (les exons) se trouvent g n ralement en segments courts (taille moyenne d'environ 145 paires de nucl otides), de petits lots dans une mer d'ADN dont la s quence nucl otidique exacte est consid r e comme tant la plupart du temps de peu de cons quence. Cet arrangement rend difficile l'identification de tous les exons d'un segment d'ADN, et il est souvent difficile de d terminer exactement o commence et se termine un g ne. Une approche tr s importante pour d chiffrer notre g nome consiste rechercher des s quences d'ADN qui sont troitement similaires entre diff rentes esp ces, en partant du principe que les s quences d'ADN qui ont une fonction sont beaucoup plus susceptibles d' tre conserv es que celles qui n'en ont pas. Par exemple, on pense que les humains et les souris ont diverg d'un anc tre mammif re commun il y a environ 80 106 ans, ce qui est assez long pour que la majorit des nucl otides de leurs g nomes aient t modifi s par des v nements mutati
Biologie moléculaire de la cellule	onnels al atoires. Par cons quent, les seules r gions qui seront rest es troitement similaires dans les deux g nomes sont celles dans lesquelles des mutations auraient alt r la fonction et d savantag les animaux qui les portent, entra nant leur limination de la population par s lection naturelle. De tels morceaux de s quence d'ADN tr s similaires sont connus sous le nom de r gions conserv es. En plus de r v ler les s quences d'ADN qui codent pour des exons et des mol cules d'ARN fonctionnellement importants, ces r gions conserv es comprendront des s quences d'ADN r gulatrices ainsi que des s quences d'ADN dont les fonctions ne sont pas encore connues. En revanche, la plupart des r gions non conserv es refl teront l'ADN dont la s quence est beaucoup moins susceptible d' tre critique pour le fonctionnement. La puissance de cette m thode peut tre augment e en incluant dans de telles comparaisons les g nomes d'un grand nombre d'esp ces dont les g nomes ont t s quenc s, tels que le rat, le poulet, le poisson, le chien et le chimpanz , ainsi que la souris et l'homme. En r v lant ainsi les r sultats d'une tr s longue exp rience naturelle, qui a dur des centaines de millions d'ann es, de telles tudes comparatives de s quen age de l'ADN ont mis en vidence les r gions les plus int ressantes de notre g nome. Les comparaisons r v lent qu'environ 5 % du g nome humain est constitu de s quences conserv es multi-esp ces . notre grande surprise, seulement environ un tiers d'entre eux les s quences codent pour des prot ines (voir tableau 4-1, p. 184). La plupart des s quences conserv es restantes sont constitu es d'ADN contenant des grappes de sites de liaison aux prot ines qui sont impliqu s dans la r gulation des g nes, tandis que d'autres produisent des mol cules d'ARN qui ne sont pas traduites en prot ines mais qui sont importantes pour d'autres fins connues. Mais, m me chez les esp ces les plus tudi es, la fonction de la majorit de ces s quences hautement conserv es reste inconnue. Cette d couverte remarquable a conduit les scientifiques conclure que nous en comprenons beaucoup moins sur la biologie cellulaire des vert br s que nous ne le pensions. Certes, il existe d' normes possibilit s de nouvelles d couvertes, et nous devrions nous attendre de nombreuses autres surprises venir. Les alt rations du g nome sont caus es par des d faillances des m canismes normaux de copie et de maintien de l'ADN, ainsi que par des l ments d'ADN transposables L' volution d pend d'accidents et d'erreurs suivis d'une survie non al atoire. La plupart des changements g n tiques qui se produisent r sultent simplement de d faillances dans les m canismes normaux par lesquels les g nomes sont copi s ou r par s lorsqu'ils sont endommag s, bien que le mouvement des l ments d'ADN transposables (discut ci-dessous) joue galement un r le important. Comme nous l'expliquerons au chapitre 5, les m canismes qui maintiennent les s quences d'ADN sont remarquablement pr cis, mais ils ne sont pas parfaits. Les s quences d'ADN sont h rit es avec une fid lit si extraordinaire que, g n ralement, le long d'une ligne de descendance donn e, seulement environ une paire de nucl otides sur mille est modifi e au hasard dans la lign e germinale tous les millions d'ann es. M me ainsi, dans une population de 10 000 individus diplo des, toutes les substitutions nucl otidiques possibles auront t essay es une vingtaine de reprises au cours d'un million d'ann es un court laps de temps par rapport l' volution des esp ces. Les erreurs dans la r plication de l'ADN, la recombinaison de l'ADN ou la r paration de l'ADN peuvent entra ner soit de simples changements locaux dans la s quence d'ADN ce que l'on appelle des mutations ponctuelles telles que la substitution d'une paire de bases par une autre soit des r arrangements g nomiques grande chelle tels que des d l l tions, des duplications, des inversions et des translocations d'ADN d'un chromosome un autre. En plus de ces d faillances de la machinerie g n tique, les g nomes contiennent des l ments d'ADN mobiles qui sont une source importante de changement g nomique (voir tableau 5-3, p. 267). Ces l ments d'ADN transposables (transposons) sont des s quences d'ADN parasites qui peuvent se propager au sein des g nomes qu'ils colonisent. Ce faisant, ils perturbent souvent la fonction ou modifient la r gulation des g nes existants. l'occasion, ils ont cr des g nes enti rement nouveaux par des fusions entre des s quences de transposons et des segments de g nes existants. Au cours de longues p riodes de l' volution, les v nements de transposition d'ADN ont profond ment affect les g nomes, tel point que pr s de la moiti de l'ADN du g nome humain est constitu e de reliques reconnaissables d' v nements de transposition pass s (Figure 4-62). On pense qu'une plus grande partie de notre g nome provient de transpositions qui se sont produites il y a si longtemps (>108 ans) que
Biologie moléculaire de la cellule	les s quences ne peuvent plus tre retrac es jusqu'aux transposons. Les s quences g nomiques de deux esp ces diff rent proportionnellement la dur e de leur volution Les diff rences entre les g nomes des esp ces vivantes aujourd'hui se sont accumul es sur plus de 3 milliards d'ann es. Bien que nous ne disposions pas d'un enregistrement direct des changements au fil du temps, les scientifiques peuvent reconstruire le processus d' volution du g nome partir de comparaisons d taill es des g nomes d'organismes contemporains. Le cadre d'organisation de base de la g nomique comparative est l'arbre phylog n tique. Un exemple simple est l'arbre d crivant la divergence entre les humains et les grands singes (Figure 4-63). Le principal support de cet arbre provient de comparaisons de s quences de g nes ou de prot ines. Par exemple, les comparaisons entre les s quences de g nes ou de prot ines humaines et celles des grands singes r v lent g n ralement le moins de diff rences entre l'homme et le chimpanz et le plus entre l'homme et l'orang-outan. Pour les organismes troitement apparent s tels que les humains et les chimpanz s, il est relativement facile de reconstruire les s quences g n tiques du dernier anc tre commun teint des deux esp ces (Figure 4 64). L' troite similitude entre les g nes de l'homme et du chimpanz est principalement due au peu de temps disponible pour l'accumulation de mutations dans les deux lign es divergentes, plut t qu' des contraintes fonctionnelles TRANSPOSONS ADN non r p titif c'est- -dire Figure 4 62 Une repr sentation du contenu de la s quence nucl otidique du g nome humain s quenc . Les lINE ( l ments nucl aires intercal s longs), les SINE ( l ments nucl aires intercal s courts), les l ments de type r troviral et les transposons uniquement de l'ADN sont des l ments g n tiques mobiles qui se sont multipli s dans notre g nome en se r pliquant et en ins rant les nouvelles copies dans diff rentes positions. Ces l ments g n tiques mobiles sont discut s au chapitre 5 (voir tableau 5-3, p. 267). Les r p titions de s quences simples sont de courtes s quences de nucl otides (moins de 14 paires de nucl otides) qui sont r p t es encore et encore pendant de longues p riodes. Les duplications segmentaires sont de grands blocs de s quences d'ADN (1000 200 000 paires de nucl otides) qui sont pr sents deux endroits ou plus du g nome. Les blocs d'ADN les plus r p t s dans l'h t rochromatine n'ont pas encore t compl tement s quenc s ; par cons quent, environ 10% des s quences d'ADN humain ne sont pas repr sent es dans ce diagramme. (Donn es reproduites avec l'aimable autorisation de E. margulies.) montrant la relation entre 1,5 l'homme et les grands singes sur la base de donn es de s quence nucl otidique. Comme indiqu , on estime que les s quences des g nomes des quatre millions d'ann es pr c dant les esp ces actuelles diff rent de la s quence du g nome de leur dernier anc tre commun d'un peu plus de 1,5 %. Parce que les changements se produisent ind pendamment sur les deux lign es divergentes, les comparaisons par paires r v lent deux fois la divergence de s quence par rapport au dernier anc tre commun. Par exemple, les comparaisons entre l'homme et l'orang-outan montrent g n ralement des divergences de s quence 1,0 0,5 0,0 d'un peu plus de 3 %, alors que les s quences sont rest es identiques. La preuve de ce point de vue provient de l'observation que les g nomes de l'homme et du chimpanz sont presque identiques m me lorsqu'il n'y a pas de contrainte fonctionnelle sur la s quence nucl otidique, comme en troisi me position des codons synonymes (codons sp cifiant le m me acide amin mais diff rant dans leur troisi me nucl otide). Pour des organismes beaucoup moins troitement apparent s, tels que les humains et les poulets (qui ont volu s par ment pendant environ 300 millions d'ann es), la conservation de la s quence trouv e dans les g nes est presque enti rement due la s lection purificatrice (c'est- -dire la s lection qui limine les individus porteurs de mutations qui interf rent avec des fonctions g n tiques importantes), plut t qu' un temps inad quat pour que les mutations se produisent. Les arbres phylog n tiques construits partir d'une comparaison de s quences d'ADN retracent les relations de tous les organismes Les arbres phylog n tiques bas s sur les donn es de s quence mol culaire peuvent tre compar s aux archives fossiles, et nous obtenons notre meilleure vision de l' volution en int grant les deux approches. Les archives fossiles restent essentielles car elles constituent une source de dates absolues, les comparaisons entre l'homme et le chimpanz montrent des divergences d'environ 1,2 %. (modifi d'apr s F.C. Chen et w.H. li, Am. J. Hum. Genet. 68:444 456, 2001.) Figure 4 64 Retra age de la s quence ancestrale partir d'une comparaison des s quences des r gions codantes des g nes de la leptine humaine et du chimpanz . En lisant de gauche droite et de
Biologie moléculaire de la cellule	haut en bas, un g ne continu est illustr . La leptine est une hormone qui r gule l'apport alimentaire et l'utilisation de l' nergie en r ponse l'ad quation du segment 300 nucl otides d'une r serve de graisse codant pour la leptine. Comme l'indiquent les codons encadr s en vert, seuls 5 nucl otides (sur un total de 120 441) diff rent entre les deux esp ces. De plus, dans une seule des cinq positions, la diff rence de nucl otide entra ne une diff rence dans l'acide amin cod . Pour chacune des cinq positions nucl otidiques variantes, la s quence correspondante chez le gorille est galement indiqu e. Dans deux cas, la s quence, tandis que dans trois cas, elle s'accorde avec la s quence du chimpanz . La s quence du gorille est d'accord avec l'homme : quelle tait la s quence du g ne de la leptine chez le dernier anc tre commun ? L'hypoth se la plus conomique est que l' volution est un nombre minimum de mutations compatible avec les donn es. Ainsi, il semble probable que le chimpanz TACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACATGATCCAAATATCCAACGACCTG prot ine Y Q Q I L T S M P S R N M I Q I S N DLtheleptinsequenceofthelastcommona suivi un chemin n cessitant L'anc tre tait le m me que les s quences de l'homme et du chimpanz lorsqu'ils sont d'accord ; Lorsqu'ils ne sont pas d'accord, la s quence du gorille est utilis e comme d partage. Pour plus de commodit , seuls les 300 premiers nucl otides des s quences codant pour la leptine sont donn s. Les 141 autres sont identiques entre les humains et les chimpanz s. Figure 4 65 Les taux d' volution tr s diff rents des exons et des introns, illustr s par la comparaison d'une partie des g nes de la leptine chez la souris et chez l'homme. Les positions o les s quences diff rent par une substitution d'un seul nucl otide sont encadr es en vert, et les positions qui diff rent par l'ajout ou la suppression de nucl otides sont encadr es en jaune. Notons que, gr ce la s lection purificatrice, la s quence codante de l'exon est beaucoup plus conserv e que la s quence d'intron adjacente. bas sur la d sint gration des radio-isotopes dans les formations rocheuses dans lesquelles les fossiles sont trouv s. Cependant, comme les archives fossiles comportent de nombreuses lacunes, il est difficile d' tablir des temps de divergence pr cis entre les esp ces, m me pour les esp ces qui laissent de bons fossiles avec une morphologie distinctive. Les arbres phylog n tiques dont la chronologie a t calibr e en fonction des archives fossiles sugg rent que les changements dans les s quences de g nes ou de prot ines particuliers ont tendance se produire un rythme presque constant, bien que des taux qui diff rent de la norme jusqu' deux fois soient observ s dans des lign es particuli res. Cela nous fournit une horloge mol culaire pour l' volution, ou plut t un ensemble d'horloges mol culaires correspondant diff rentes cat gories de s quences d'ADN. Comme dans l'exemple de la figure 4-65, l'horloge fonctionne le plus rapidement et r guli rement dans des s quences qui ne sont pas soumises la s lection purificatrice. Il s'agit notamment de parties d'introns d pourvues d' pissage ou de signaux r gulateurs, de la troisi me position dans les codons synonymes et de g nes qui ont t inactiv s de mani re irr versible par mutation (les pseudog nes). L'horloge tourne le plus lentement pour les s quences soumises de fortes contraintes fonctionnelles par exemple, les s quences d'acides amin s des prot ines qui s'engagent dans des interactions sp cifiques avec un grand nombre d'autres prot ines et dont la structure est donc fortement contrainte, ou les s quences nucl otidiques qui codent pour les sous-unit s d'ARN du ribosome, dont d pend toute la synth se des prot ines. l'occasion, un changement rapide est observ dans une s quence auparavant tr s conserv e. Comme nous le verrons plus loin dans ce chapitre, de tels pisodes sont particuli rement int ressants parce qu'on pense qu'ils refl tent des p riodes de forte s lection positive pour les mutations qui ont conf r un avantage s lectif dans la lign e particuli re o le changement rapide s'est produit. Le rythme auquel les horloges mol culaires fonctionnent au cours de l' volution est d termin non seulement par le degr de s lection purificatrice, mais aussi par le taux de mutation. Plus particuli rement, chez les animaux, mais pas chez les plantes, les horloges bas es sur des s quences d'ADN mitochondrial fonctionnellement non contraintes fonctionnent beaucoup plus vite que les horloges bas es sur des s quences nucl aires fonctionnellement non contraintes, car le taux de mutation dans les mitochondries animales est exceptionnellement lev . Les cat gories d'ADN pour lesquelles l'horloge tourne vite sont les plus informatives pour les v nements volutifs r cents ; l'horloge de l'ADN mitochondrial a t utilis e, par exemple, pour documenter la divergence de la lign e n andertalienne par rapport celle de l'Homo sapiens moderne. Po
Biologie moléculaire de la cellule	ur tudier des v nements volutifs plus anciens, il faut examiner l'ADN pour lequel l'horloge fonctionne plus lentement ; ainsi, la divergence des principales branches de l'arbre de la vie bact ries, arch es et eucaryotes a t d duite de l' tude des s quences sp cifiant l'ARN ribosomique. En g n ral, les horloges mol culaires, choisies de mani re appropri e, ont une r solution temporelle plus fine que les archives fossiles, et elles constituent un guide plus fiable de la structure d taill e des arbres phylog n tiques que ne le sont les m thodes classiques de construction d'arbres, qui sont bas es sur des ressemblances familiales dans l'anatomie et le d veloppement embryonnaire. Par exemple, l'arbre g n alogique pr cis des grands singes et des humains n'a pas t tabli jusqu' ce que suffisamment de donn es de s quence mol culaire se soient accumul es dans les ann es 1980 pour produire le pedigree montr pr c demment dans la figure 4-63. Et avec d' normes quantit s de s quences d'ADN maintenant d termin es partir d'une grande vari t de mammif res, beaucoup mieux des estimations de notre relation avec eux sont en cours d'obtention (figures 4-66). Une comparaison des chromosomes de l'homme et de la souris montre comment les structures des g nomes divergent Comme on pouvait s'y attendre, les g nomes de l'homme et du chimpanz sont beaucoup plus similaires que les g nomes de l'homme et de la souris, m me si les trois g nomes ont peu pr s la m me taille et contiennent des ensembles de g nes presque identiques. Les lign es de souris et d'humains ont eu environ 80 millions d'ann es pour diverger travers les mutations accumul es, contre 6 millions d'ann es pour les humains et les chimpanz s. De plus, comme l'indique la figure 4-66, les lign es de rongeurs (repr sent es par le rat et la souris) ont des horloges mol culaires inhabituellement rapides et ont diverg de la lign e humaine plus rapidement que pr vu. Alors que la fa on dont le g nome est organis en chromosomes est presque identique entre les humains et les chimpanz s, cette organisation a consid rablement diverg entre les humains et les souris. Selon des estimations approximatives, un total d'environ 180 v nements de rupture et de r union se sont produits dans les lign es humaines et souris depuis que ces deux esp ces ont partag pour la derni re fois un anc tre commun. Dans le processus, bien que le nombre de chromosomes soit similaire chez les deux esp ces (23 par g nome haplo de chez l'homme contre 20 chez la souris), leurs structures globales diff rent consid rablement. N anmoins, m me apr s le remaniement g nomique approfondi, il existe de nombreux grands blocs d'ADN dans lesquels l'ordre des g nes est le m me chez l'homme et la souris. Ces tron ons de l'ordre des g nes conserv s dans les chromosomes sont appel s r gions de synt nie. La figure 4-67 illustre comment des segments des diff rents chromosomes de souris s'associent l'ensemble des chromosomes humains. Pour des vert br s beaucoup plus loign s, tels que le poulet et l'homme, le nombre d' v nements de rupture et de r union a t beaucoup plus grand et les r gions de synt nie sont beaucoup plus courtes ; de plus, ils sont souvent difficiles discerner en raison de la divergence des s quences d'ADN qu'ils contiennent. Une conclusion inattendue d'une comparaison d taill e des s quences compl tes du g nome de la souris et de l'homme, confirm e par des comparaisons ult rieures entre les g nomes d'autres vert br s, est que de petits blocs de s quences d'ADN sont supprim s et ajout s aux g nomes un rythme tonnamment rapide. Ainsi, si nous supposons que notre anc tre commun avait un g nome de taille humaine (environ 3,2 milliards de paires de nucl otides), les souris auraient perdu un total d'environ 45 % de ce g nome cause des d l tions accumul es au cours des 80 derniers millions d'ann es, tandis que les humains auraient perdu environ 25 %. Cependant, des gains de s quences substantiels provenant de nombreuses petites duplications chromosomiques et de la multiplication des transposons ont compens ces d l tions . En cons quence, on pense que la taille de notre g nome est pratiquement inchang e par rapport celle du dernier anc tre commun des humains et des souris, tandis que le g nome de la souris n'est plus petit que d'environ 0,3 milliard de nucl otides. Figure 4 66 Un arbre phylog n tique montrant les relations volutives de certains mammif res actuels. La longueur de chaque ligne est proportionnelle au nombre de substitutions neutres , c'est- -dire les changements de nucl otides sur des sites o il n'y a pas de s lection purificatrice. (Adapt de g.m. Cooper et al., Genome Res. 15:901-913, 2005. avec la permission de Cold Spring Harbor laboratory Press.) De bonnes preuves de la perte de s quences d'ADN en petits blocs au cours de l' volution peuvent tre obtenues partir d'une comparaison d taill e des r gions de synt nie dans les g nomes humain et de souris.
Biologie moléculaire de la cellule	Le r tr cissement comparatif du g nome de la souris peut tre clairement observ partir de ces comparaisons, avec la perte nette de s quences dispers es dans les longues tendues d'ADN qui sont par ailleurs homologues (Figure 4-68). L'ADN est ajout aux g nomes la fois par la duplication spontan e de segments chromosomiques qui comptent g n ralement des dizaines de milliers de paires de nucl otides (comme nous le verrons bient t) et par l'insertion de nouvelles copies de transposons actifs. La plupart des v nements de transposition sont dupliqu s, car la copie originale du transposon reste l o elle tait lorsqu'une copie est ins r e sur le nouveau site ; voir, par exemple, les figures 5 63. La comparaison des s quences d'ADN d riv es de transposons chez l'homme et la souris r v le facilement certains des ajouts de s quences (Figure 4-69). La raison pour laquelle tous les mammif res ont maintenu une taille de g nome d'environ 3 milliards de paires de nucl otides contenant des ensembles de g nes presque identiques, m me si seulement environ 150 millions de paires de nucl otides semblent tre soumises des contraintes fonctionnelles sp cifiques une s quence. La taille du g nome d'un vert br refl te les taux relatifs d'ajout et de perte d'ADN dans une lign e Chez les vert br s plus loign s, la taille du g nome peut varier consid rablement, apparemment sans effet drastique sur l'organisme ou son nombre de g nes. Ainsi, le g nome du poulet, avec un milliard de paires de nucl otides, ne fait qu'environ un tiers de la taille de 200 000 bases Figure 4 67 Synt nie entre les chromosomes de l'homme et de la souris. Dans ce sch ma, l'ensemble des chromosomes humains est illustr ci-dessus, chaque partie de chaque chromosome tant color e en fonction du chromosome de la souris avec lequel il est synt nique. Le code couleur utilis pour chaque chromosome de souris est indiqu ci-dessous. Les r gions h t rochromatiques tr s r p titives (telles que les centrom res) qui sont difficiles s quencer ne peuvent pas tre cartographi es de cette mani re ; Ceux-ci sont de couleur noire. (Adapt de E.E. Eichler et D. Sankoff, Science 301:793-797, 2003. avec l'autorisation de l'AAAS.) Figure 4 68 Comparaison d'une partie synt nique des g nomes de souris et d'homme. Environ 90% des deux g nomes peuvent tre align s de cette mani re. Notez que bien qu'il y ait un ordre identique des s quences d'index appari es (marques rouges), il y a eu une perte nette d'ADN dans la lign e de la souris qui est intercal e dans toute la r gion. Ce type de perte nette est typique de toutes ces r gions, et il explique le fait que le g nome de la souris contient 14 % moins d'ADN que le g nome humain. (Adapt de mouse genome sequencing Consortium, Nature 420:520-562, 2002. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) 10 000 paires de nucl otides du g nome des mammif res. Un exemple extr me est le poisson-globe, Fugu rubripes (Figure 4-70), qui a un minuscule g nome pour un vert br (0,4 milliard de paires de nucl otides contre 1 milliard ou plus pour de nombreux autres poissons). La petite taille du g nome du Fugu est en grande partie due la petite taille de ses introns. Plus pr cis ment, les introns de Fugu, ainsi que d'autres segments non codants du g nome de Fugu, n'ont pas l'ADN r p titif qui constitue une grande partie des g nomes de la plupart des vert br s bien tudi s. N anmoins, les positions des introns de Fugu entre les exons de chaque g ne sont presque les m mes que dans les g nomes de mammif res (Figure 4 71). Bien qu'initialement un myst re, nous avons maintenant une explication simple pour de si grandes diff rences de taille de g nome entre des organismes similaires : parce que tous les vert br s subissent un processus continu de perte et d'ajout d'ADN, la taille d'un g nome d pend simplement de l' quilibre entre ces processus oppos s agissant sur des millions d'ann es. Supposons, par exemple, que dans la lign e menant Fugu, le taux d'ajout d'ADN ait consid rablement ralenti. Sur de longues p riodes, cela entra nerait un nettoyage majeur du g nome de ce poisson des s quences d'ADN dont la perte pourrait tre tol r e. Le r sultat est un g nome exceptionnellement compact, relativement exempt de d chets et d'encombrement, mais conservant par s lection purificatrice les s quences d'ADN des vert br s qui sont fonctionnellement importantes. Cela fait de Fugu, avec ses 400 millions de paires de nucl otides d'ADN, une ressource pr cieuse pour la recherche sur le g nome visant comprendre les humains. nous pouvons d duire la s quence de certains g nomes anciens Les g nomes des organismes ancestraux peuvent tre d duits, mais la plupart ne peuvent jamais tre observ s directement. L'ADN est tr s stable par rapport la plupart des mol cules organiques, mais il n'est pas parfaitement stable, et sa d gradation progressive, m me dans les meilleures circonstances, signifie qu'il est pratiquement impossible d'extraire
Biologie moléculaire de la cellule	des informations de s quence partir de fossiles vieux de plus d'un million d'ann es. Bien qu'un organisme moderne tel que le crabe fer cheval ressemble remarquablement des anc tres fossiles qui vivaient il y a 200 millions d'ann es, il y a toutes les raisons de croire que le g nome du crabe fer cheval a chang pendant tout ce temps de la m me mani re que dans d'autres lign es volutives, et un rythme similaire. La s lection doit avoir conserv la cl propri t s fonctionnelles du g nome du crabe fer cheval pour expliquer la stabilit morphologique de la lign e. Cependant, les comparaisons entre diff rents organismes actuels montrent que la fraction du g nome soumise la s lection purificatrice est faible ; Par cons quent, il est juste de supposer que le g nome du crabe fer cheval moderne, tout en pr servant des caract ristiques essentielles sa fonction, doit diff rer consid rablement de celui de ses anc tres teints, que nous ne connaissons que par les archives fossiles. Il est possible d'obtenir des informations directes sur les s quences en examinant des chantillons d'ADN provenant de mat riaux anciens si ceux-ci ne sont pas trop anciens. Ces derni res ann es, les progr s techniques ont permis le s quen age de l'ADN partir de fragments d'os exceptionnellement bien conserv s datant de plus de 100 000 ans. Bien que tout ADN aussi ancien soit imparfaitement conserv , une s quence du g nome de N andertal a t reconstruite partir de plusieurs millions de courtes s quences d'ADN, r v lant, entre autres, que nos anc tres humains se sont crois s avec les N andertaliens en Europe et en Europe. Figure 4 69 Une comparaison du groupe de g nes de la -globine dans les g nomes humain et de souris, montrant l'emplacement des l ments transposables. Cette partie du g nome humain contient cinq g nes fonctionnels de type -globine (orange) ; La r gion comparable du g nome de la souris n'en a que quatre. Les positions des s quences humaines Alu sont indiqu es par des cercles verts, et les s quences humaines L1 par des cercles rouges. Le g nome de la souris contient des l ments transposables diff rents mais apparent s : les positions des l ments b1 (qui sont li s aux s quences Alu humaines) sont indiqu es par des triangles bleus, et les positions des l ments L1 de la souris (qui sont li s aux s quences L1 humaines) sont indiqu es par des triangles orange. L'absence d' l ments transposables dans les g nes structurels de la globine peut tre attribu e la s lection purificatrice, qui aurait limin toute insertion compromettant la fonction des g nes. (Avec l'aimable autorisation de Ross Hardison et Webb Miller.) Figure 4 70 Le poisson-globe, Fugu rubripes. (Avec l'aimable autorisation de byrappa venkatesh.) 0,0 100,0 180,0 milliers de paires de nucl otides dont les humains modernes ont h rit des g nes sp cifiques (Figure 4 72). La diff rence moyenne de s quence d'ADN entre les humains et les N andertaliens montre que nos deux lign es ont diverg il y a entre 270 000 et 440 000 ans, bien avant l' poque o l'on pense que les humains ont migr hors d'Afrique. Mais qu'en est-il du d cryptage des g nomes d'anc tres beaucoup plus anciens, ceux pour lesquels aucun chantillon d'ADN utile ne peut tre isol ? Pour des organismes aussi troitement apparent s que l'homme et le chimpanz , nous avons vu que cela ne peut pas tre difficile : la r f rence la s quence du gorille peut tre utilis e pour d terminer lesquelles des quelques diff rences de s quence entre l'homme et le chimpanz sont h rit es de notre anc tre commun il y a environ 6 millions d'ann es (voir Figure 4-64). Et pour un anc tre qui a produit un grand nombre d'organismes diff rents vivants aujourd'hui, les s quences d'ADN de nombreuses esp ces peuvent tre compar es simultan ment pour d chiffrer une grande partie de la s quence ancestrale, ce qui permet aux scientifiques de d river des s quences d'ADN beaucoup plus loin dans le temps. Par exemple, partir des s quences g nomiques actuellement obtenues pour des dizaines de mammif res placentaires modernes, il devrait tre possible de d duire une grande partie de la s quence g nomique de leur anc tre commun vieux de 100 millions d'ann es le pr curseur d'esp ces aussi diverses que le chien, la souris, le lapin, le tatou et l'homme (voir Figure 4-66). Comparaisons de s quences multi-esp ces Identifier des s quences d'ADN conserv es de fonction inconnue La masse de s quences d'ADN maintenant dans les bases de donn es (des centaines de milliards de paires de nucl otides) fournit une ressource riche que les scientifiques peuvent exploiter de nombreuses fins. Cette information peut tre utilis e non seulement pour d chiffrer les voies volutives qui ont conduit aux organismes modernes, mais aussi pour fournir des informations sur le fonctionnement des cellules et des organismes. La d couverte la plus remarquable dans ce domaine provient peut- tre de l'observation qu'une quantit frappante
Biologie moléculaire de la cellule	de s quences d'ADN qui ne codent pas pour une prot ine a t conserv e au cours de l' volution des mammif res (voir le tableau 4-1, p. 184). Cela est le plus clairement r v l lorsque nous alignons et comparons la synth se de l'ADN Figure 4 71 Comparaison des s quences g nomiques des g nes humain et Fugu codant pour la prot ine huntingtine. Les deux g nes (indiqu s en rouge) contiennent 67 exons courts qui s'alignent en correspondance 1:1 l'un par rapport l'autre ; Ces exons sont reli s par des lignes courbes. Le g ne humain est 7,5 fois plus grand que le g ne Fugu (180 000 contre 24 000 paires de nucl otides). La diff rence de taille est enti rement due des introns plus grands dans le g ne humain. La plus grande taille des introns humains est due en partie la pr sence de r trotransposons (discut s au chapitre 5), dont les positions sont repr sent es par des lignes verticales vertes ; les introns du Fugu sont d pourvus de r trotransposons. Chez l'homme, la mutation du g ne huntingtin est l'origine de la maladie de Huntington, une maladie neurod g n rative h r ditaire. (Adapt de S. baxendale et al., Nat. Genet. 10:67 76, 1995. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) Figure 4 72 Les N andertaliens. (A) carte de l'Europe montrant l'emplacement de la grotte en Croatie o la plupart des os utilis s pour isoler l'ADN utilis pour d river la s quence du g nome de N andertal ont t d couverts. (b) Photographie de la grotte de vindija. (C) Photographie des os de vindija, vieux de 38 000 ans. des tudes plus r centes ont r ussi extraire des informations sur les s quences d'ADN de restes d'hominid s consid rablement plus anciens (voir vid o 8.3). (b, avec la permission de Johannes Krause ; C, d'apr s R.E. green et al., Science 328 : 710-722, 2010. R imprim avec la permission de l'AAAS.) Vindija, en Croatie, des blocs de nombreuses esp ces diff rentes, identifiant ainsi un grand nombre de s quences conserv es dites multi-esp ces : certaines d'entre elles codent pour des prot ines, mais la plupart d'entre elles ne le font pas (Figure 4 73). La plupart des s quences conserv es non codantes ainsi d couvertes s'av rent tre relativement courtes, contenant entre 50 et 200 paires de nucl otides. Parmi les plus myst rieuses, on trouve les s quences non codantes dites ultraconserv es , illustr es par plus de 5000 segments d'ADN de plus de 100 nucl otides qui sont exactement les m mes chez l'homme, la souris et le rat. La plupart n'ont subi que peu ou pas de changements depuis que les anc tres des mammif res et des oiseaux ont diverg il y a environ 300 millions d'ann es. La conservation stricte implique que m me si les s quences ne codent pas pour des prot ines, chacune a n anmoins une fonction importante maintenue par la s lection purificatrice. Le casse-t te consiste d m ler ce que sont ces fonctions. De nombreuses s quences conserv es qui ne codent pas pour les prot ines sont maintenant connues pour produire des mol cules d'ARN non traduites, telles que les milliers de longs ARN non codants (ARNlnc) qui sont cens s avoir des fonctions importantes dans la r gulation de la transcription des g nes. Comme nous le verrons galement au chapitre 7, d'autres sont de courtes r gions d'ADN dispers es dans tout le g nome qui se lient directement aux prot ines impliqu es dans la r gulation des g nes. Mais il n'est pas certain de quelle part de l'ADN non codant conserv peut tre expliqu e de cette mani re, et la fonction de la plupart de celui-ci reste un myst re. Cette nigme met en vidence tout ce qu'il nous reste encore apprendre sur les m canismes biologiques fondamentaux qui fonctionnent chez les animaux et d'autres organismes complexes, et sa solution aura certainement de profondes cons quences pour la m decine. Comment les biologistes cellulaires peuvent-ils s'attaquer au myst re de l'ADN conserv non codant ? Traditionnellement, les tentatives de d termination de la fonction d'une s quence d'ADN d routante commencent par l'examen des cons quences de sa perturbation exp rimentale. Mais on peut s'attendre ce que de nombreuses s quences d'ADN cruciales pour un organisme dans la nature n'aient aucun effet notable sur son ph notype dans des conditions de laboratoire : ce qui est n cessaire pour qu'une souris survive dans une cage de laboratoire est bien inf rieur ce qui est n cessaire : 190 000 paires de nucl otides, 100 paires de nucl otides, 10 000 paires de nucl otides Figure 4 73 La d tection de s quences conserv es multi-esp ces. Dans cet exemple, les s quences g nomiques de chacun des organismes pr sent s ont t compar es la r gion indiqu e du g ne humain CFTR (r gulateur de la conductance transmembranaire de la fibrose kystique) ; cette r gion contient un exon et une grande quantit d'ADN intronique. Pour chaque organisme, le pourcentage d'identit avec l'homme pour chaque bloc de 25 nucl otides est trac en vert. De plus, un algorithme informatique a t utilis pour d tecter le
Biologie moléculaire de la cellule	s s quences de cette r gion qui sont les mieux conserv es lorsque les s quences de tous les organismes sont prises en compte. Outre l'exon (bleu fonc sur la ligne en haut de la figure), les positions de trois autres blocs de s quences conserv es multi-esp ces sont indiqu es (bleu p le). La fonction de la plupart de ces s quences dans le g nome humain n'est pas connue. (Avec l'aimable autorisation d'Eric D. green.) pour qu'il r ussisse dans la nature. De plus, les calculs bas s sur la g n tique des populations r v lent qu'un petit avantage s lectif moins de 0,1 % de diff rence de survie peut suffire favoriser fortement la conservation d'une s quence d'ADN particuli re au cours de l' volution. Il ne faut donc pas s' tonner de constater que de nombreuses s quences d'ADN ultraconserv es peuvent tre supprim es du g nome de la souris sans aucun effet notable sur cette souris en laboratoire. Une deuxi me approche importante pour d couvrir la fonction d'une myst rieuse s quence d'ADN non codante utilise des techniques biochimiques pour identifier les prot ines ou les mol cules d'ARN qui se lient elle et/ou toute mol cule d'ARN qu'elle produit. La plus grande partie de cette t che est encore devant nous, mais un d but a t fait (voir p. 435). Compte tenu des informations sur le s quen age du g nome, nous pouvons nous attaquer une autre question intrigante : quelles alt rations de notre ADN ont rendu les humains si diff rents des autres animaux ou d'ailleurs, qu'est-ce qui rend une esp ce individuelle si diff rente de ses parents ? Par exemple, d s que les s quences g nomiques de l'homme et du chimpanz sont devenues disponibles, les scientifiques ont commenc rechercher des changements de s quence d'ADN qui pourraient expliquer les diff rences frappantes entre nous et les chimpanz s. Avec 3,2 milliards de paires de nucl otides comparer chez les deux esp ces, cela peut sembler une t che impossible. Mais le travail a t rendu beaucoup plus facile en limitant la recherche 35 000 s quences conserv es multi-esp ces clairement d finies (un total d'environ 5 millions de paires de nucl otides), repr sentant les parties du g nome les plus susceptibles d' tre fonctionnellement importantes. Bien que ces s quences soient fortement conserv es, elles ne le sont pas parfaitement, et lorsque la version d'une esp ce est compar e celle d'une autre, on constate g n ralement qu'elles se sont loign es d'une petite quantit correspondant simplement au temps coul depuis le dernier anc tre commun. Dans une petite proportion de cas, cependant, on voit des signes d'une pouss e volutive soudaine. Par exemple, certaines s quences d'ADN qui ont t hautement conserv es chez d'autres esp ces de mammif res se sont av r es avoir accumul des changements nucl otidiques exceptionnellement rapidement au cours des 6 millions d'ann es de l' volution humaine depuis que nous avons diverg des chimpanz s. On pense que ces r gions acc l r es par l'homme (HAR) refl tent des fonctions qui ont t particuli rement importantes pour nous rendre diff rents d'une mani re utile. Environ 50 sites de ce type ont t identifi s dans une tude, dont un quart taient situ s proximit de g nes associ s au d veloppement neuronal. La s quence pr sentant le changement le plus rapide (18 changements entre l'homme et le chimpanz , contre seulement deux changements entre le chimpanz et le poulet) a t examin e plus en d tail et s'est av r e coder une mol cule d'ARN non codant de 118 nucl otides, HAR1F (r gion acc l r e humaine 1F), qui est produite dans le cortex c r bral humain un moment critique du d veloppement du cerveau. La fonction de cet ARN HAR1F n'est pas encore connue, mais les r sultats de ce type stimulent les tudes de recherche qui pourraient faire la lumi re sur des caract ristiques cruciales du cerveau humain. Une approche connexe dans la recherche des mutations importantes qui ont contribu l' volution humaine commence galement par des s quences d'ADN qui ont t conserv es au cours de l' volution des mammif res, mais plut t que de d pister les changements acc l r s dans les nucl otides individuels, elle se concentre plut t sur les sites chromosomiques qui ont connu des d l tions au cours des 6 millions d'ann es depuis que notre lign e a diverg de celle des chimpanz s. Plus de 500 s quences de ce type, conserv es parmi d'autres esp ces mais supprim es chez l'homme, ont t d couvertes. Chaque d l tion supprime en moyenne 95 nucl otides de s quence d'ADN. Une seule de ces d l tions affecte une r gion codant pour une prot ine : on pense que les autres modifient les r gions qui affectent l'expression des g nes voisins, une attente qui a t confirm e exp rimentalement dans quelques cas. Une grande partie des r gions r gulatrices pr sum es identifi es de cette mani re se trouvent proximit de g nes qui affectent la fonction neuronale et/ou proximit de g nes impliqu s dans la signalisation des st ro des, ce qui sug
Biologie moléculaire de la cellule	g re que les changements dans le syst me nerveux et dans les fonctions immunitaires ou reproductives ont jou un r le particuli rement important dans l' volution humaine. les mutations dans les s quences d'ADN qui contr lent l'expression des g nes ont entra n de nombreux changements volutifs chez les vert br s La vaste r serve de donn es de s quences g nomiques actuellement accumul es peut tre explor e de bien d'autres fa ons pour r v lent des v nements qui se sont produits il y a des centaines de millions d'ann es. Par exemple, on peut tenter de retracer l'origine des l ments r gulateurs de l'ADN qui ont jou un r le essentiel dans l' volution des vert br s. L'une de ces tudes a commenc par l'identification de pr s de 3 millions de s quences non codantes, d'une longueur moyenne de 28 paires de bases, qui ont t conserv es dans l' volution r cente des vert br s alors qu'elles taient absentes chez des anc tres plus anciens. Chacune de ces s quences non codantes sp ciales est susceptible de repr senter une innovation fonctionnelle propre une branche particuli re de l'arbre g n alogique des vert br s, et on pense que la plupart d'entre elles sont constitu es d'ADN r gulateur qui r git l'expression d'un g ne voisin. partir des s quences g nomiques compl tes, on peut identifier les g nes qui se trouvent le plus pr s et qui semblent donc les plus susceptibles d' tre tomb s sous l'emprise de ces nouveaux l ments r gulateurs. En comparant de nombreuses esp ces diff rentes, avec des temps de divergence connus, on peut galement estimer quand chacun de ces l ments r gulateurs est apparu en tant que caract ristique conserv e. Les r sultats sugg rent des diff rences volutives remarquables entre les diff rentes classes fonctionnelles de g nes (Figure 4-74). Les l ments r gulateurs conserv s qui sont apparus t t dans l' volution des vert br s c'est- -dire il y a environ 300 millions d'ann es, c'est- -dire lorsque la lign e des mammif res s'est s par e de la lign e menant aux oiseaux et aux reptiles semblent tre principalement associ s des g nes qui codent pour des prot ines r gulatrices de transcription et pour des prot ines jouant un r le dans l'organisation du d veloppement embryonnaire. Puis vint une poque o les innovations r gulatrices de l'ADN sont apparues c t des g nes codant pour des r cepteurs de signaux extracellulaires. Enfin, au cours des 100 derniers millions d'ann es, les innovations r glementaires semblent s' tre concentr es dans le voisinage des g nes codant pour des prot ines (telles que les prot ines kinases) qui ont pour fonction de modifier d'autres prot ines post-traductionnellement. De nombreuses questions restent sans r ponse sur ces ph nom nes et ce qu'ils signifient. Une interpr tation possible est que la logique le sch ma de circuit du r seau de r gulation des g nes chez les vert br s a t tablie t t, et que les changements volutifs plus r cents se sont principalement produits par l'ajustement de param tres quantitatifs. Cela pourrait aider expliquer pourquoi, chez les mammif res, par exemple, le plan corporel de base la topologie des tissus et des organes a t largement conserv . La duplication des g nes fournit galement une source importante de nouveaut g n tique au cours de l' volution L' volution d pend de la cr ation de nouveaux g nes, ainsi que de la modification de ceux qui existent d j . Comment cela se produit-il ? Lorsque nous comparons des organismes qui semblent tr s diff rents un primate avec un rongeur, par exemple, ou une souris avec un poisson nous rencontrons rarement des g nes d'une esp ce qui n'ont pas d'homologue dans la r ception des signaux extracellulaires HUMAIN 500 400 300 200 100 0 millions d'ann es avant le pr sent Figure 4 74 Les types de changements dans la r gulation des g nes qui ont pr domin au cours de l' volution de nos anc tres vert br s. Pour produire l'information r sum e dans ce graphique, dans la mesure du possible, le type de g ne r gul par chaque s quence non codante conserv e a t d duit de l'identit de son g ne codant pour la prot ine le plus proche. Le temps de fixation de chaque s quence conserv e a ensuite t utilis pour tirer les conclusions pr sent es. (d'apr s C.b. Lowe et al., Science 333:1019 1024, 2011. avec la permission de l'AAAS.) autre. Les g nes sans homologues homologues sont relativement rares, m me lorsque nous comparons des organismes aussi divergents qu'un mammif re et un ver. D'autre part, nous trouvons fr quemment des familles de g nes qui ont un nombre diff rent de membres dans diff rentes esp ces. Pour cr er de telles familles, les g nes ont t dupliqu s plusieurs reprises, et les copies ont ensuite diverg pour assumer de nouvelles fonctions qui varient souvent d'une esp ce l'autre. La duplication des g nes se produit des taux lev s dans toutes les lign es volutives, contribuant au processus vigoureux d'ajout d'ADN discut pr c demment. Dans une tude d taill
Biologie moléculaire de la cellule	e des duplications spontan es chez la levure, des duplications de 50 000 250 000 paires de nucl otides ont t fr quemment observ es, dont la plupart taient r p t es en tandem. Celles-ci semblaient r sulter d'erreurs de r plication de l'ADN qui ont conduit la r paration inexacte des cassures chromosomiques double brin. Une comparaison des g nomes de l'homme et du chimpanz r v le que, depuis l' poque o ces deux organismes ont diverg , ces duplications segmentaires ont ajout environ 5 millions de paires de nucl otides chaque g nome tous les millions d'ann es, la taille moyenne des duplications tant d'environ 50 000 paires de nucl otides (bien qu'il existe des duplications cinq fois plus grandes). En fait, si l'on compte les nucl otides, Les v nements de duplication ont cr plus de diff rences entre nos deux esp ces que les substitutions de nucl otides uniques. Quel est le sort des g nes nouvellement dupliqu s ? Dans la plupart des cas, il est suppos qu'il y a peu ou pas de s lection, du moins au d but, pour maintenir l' tat dupliqu , car l'une ou l'autre copie peut fournir une fonction quivalente. Par cons quent, de nombreux v nements de duplication sont susceptibles d' tre suivis de mutations de perte de fonction dans l'un ou l'autre g ne. Ce cycle restaurerait fonctionnellement l' tat d'un g ne qui a pr c d la duplication. En effet, il existe de nombreux exemples dans les g nomes contemporains o l'on peut voir qu'une copie d'un g ne dupliqu est devenue irr versiblement inactiv e par de multiples mutations. Au fil du temps, on s'attendrait ce que la similitude de s quence entre un tel pseudog ne et le g ne fonctionnel dont la duplication l'a produit soit rod e par l'accumulation de nombreuses mutations dans le pseudog ne, la relation homologue devenant finalement ind tectable. Une autre solution pour la duplication de g nes est que les deux copies restent fonctionnelles, tout en divergeant dans leur s quence et leur mode d'expression, assumant ainsi des r les diff rents. Ce processus de duplication et de divergence explique presque certainement la pr sence de grandes familles de g nes avec des fonctions connexes dans des organismes biologiquement complexes, et on pense qu'il joue un r le essentiel dans l' volution de la complexit biologique accrue. Un examen de nombreux g nomes eucaryotes diff rents sugg re que la probabilit qu'un g ne particulier subisse un v nement de duplication qui se propage la plupart ou tous les individus d'une esp ce est d'environ 1 % tous les millions d'ann es. Les duplications du g nome entier offrent des exemples particuli rement spectaculaires du cycle duplication-divergence. Une duplication du g nome entier peut se produire tr s simplement : il suffit d'un cycle de r plication du g nome dans une lign e cellulaire germinale sans division cellulaire correspondante. Au d part, le nombre de chromosomes double simplement. De telles augmentations brutales de la plo die d'un organisme sont courantes, en particulier chez les champignons et les plantes. Apr s une duplication du g nome entier, tous les g nes existent sous forme de copies dupliqu es. Cependant, moins que l' v nement de duplication ne se soit produit si r cemment qu'il y ait eu peu de temps pour des modifications ult rieures de la structure du g nome, les r sultats d'une s rie de duplications segmentaires se produisant des moments diff rents sont difficiles distinguer du produit final d'une duplication du g nome entier. Chez les mammif res, par exemple, le r le des duplications du g nome entier par rapport une s rie de duplications fragmentaires de segments d'ADN est assez incertain. N anmoins, il est clair qu'une grande partie de la duplication g n tique s'est produite dans un pass lointain. L'analyse du g nome du poisson-z bre, dans lequel au moins une duplication du g nome entier se serait produite il y a des centaines de millions d'ann es, a jet un peu de lumi re sur le processus de duplication et de divergence des g nes. Bien que de nombreux doublons de g nes de poisson-z bre semblent avoir t perdus par mutation, une fraction significative peut- tre jusqu' 30 50 % a diverg fonctionnellement tandis que les deux Figure 4 75 Comparaison de la structure des globines une cha ne et quatre cha nes. La globine quatre cha nes repr sent e est l'h moglobine, qui est un complexe de deux cha nes de -globine et de deux cha nes de -globine. La globine une cha ne pr sente chez certains vert br s primitifs repr sente un interm diaire dans l' volution de la globine quatre cha nes. li l'oxyg ne, il existe sous forme de monom re ; Sans oxyg ne, il se dim rise. Des copies sont rest es actives. Dans de nombreux cas, la diff rence fonctionnelle la plus vidente entre les g nes dupliqu s est qu'ils sont exprim s dans diff rents tissus ou diff rents stades de d veloppement. Une th orie s duisante pour expliquer un tel r sultat final imagine que des mutations diff
Biologie moléculaire de la cellule	rentes, l g rement d l t res, se produisent rapidement dans les deux copies d'un ensemble de g nes dupliqu s. Par exemple, une copie peut perdre son expression dans un tissu particulier la suite d'une mutation r gulatrice, tandis que l'autre copie perd son expression dans un second tissu. la suite d'un tel v nement, les deux copies de g nes seraient n cessaires pour fournir toute la gamme des fonctions qui taient autrefois fournies par un seul g ne ; Par cons quent, les deux copies seraient d sormais prot g es contre la perte par des mutations inactivatrices. Sur une p riode plus longue, chaque copie pouvait ensuite subir d'autres modifications gr ce auxquelles elle pouvait acqu rir de nouvelles fonctionnalit s sp cialis es. L' volution de la famille des g nes de la globine montre comment les duplications de l'ADN contribuent l' volution des organismes La famille des g nes de la globine fournit un exemple particuli rement bon de la fa on dont la duplication de l'ADN g n re de nouvelles prot ines, car son histoire volutive a t particuli rement bien labor e. Les similitudes indubitables dans la s quence et la structure des acides amin s entre les globines actuelles indiquent qu'elles doivent toutes d river d'un g ne ancestral commun, m me si certains sont maintenant cod s par des g nes largement s par s dans le g nome des mammif res. Nous pouvons reconstruire certains des v nements pass s qui ont produit les diff rents types de mol cules d'h moglobine transportant l'oxyg ne en consid rant les diff rentes formes de la prot ine dans les organismes diff rentes positions sur l'arbre de la vie. Une mol cule comme l'h moglobine tait n cessaire pour permettre aux animaux multicellulaires d'atteindre une grande taille, car les grands animaux ne peuvent pas simplement compter sur la diffusion de l'oxyg ne la surface du corps pour oxyg ner leurs tissus de mani re ad quate. Mais l'oxyg ne joue un r le vital dans la vie de presque tous les organismes vivants, et les prot ines de liaison l'oxyg ne homologues l'h moglobine peuvent tre reconnues m me chez les plantes, les champignons et les bact ries. Chez les animaux, la mol cule porteuse d'oxyg ne la plus primitive est une cha ne polypeptidique de globine d'environ 150 acides amin s que l'on trouve dans de nombreux vers marins, insectes et poissons primitifs. La mol cule d'h moglobine chez les vert br s plus complexes, cependant, est compos e de deux types de cha nes de globine. Il semble qu'il y a environ 500 millions d'ann es, au cours de l' volution continue des poissons, une s rie de mutations et de duplications g n tiques se sont produites. Ces v nements ont permis d' tablir deux g nes de globine l g rement diff rents dans le g nome de chaque individu, codant pour des cha nes et -globine qui s'associent pour former une mol cule d'h moglobine compos e de deux cha nes et de deux cha nes (Figure 4-75). Les quatre sites de liaison l'oxyg ne de la mol cule 2 2 interagissent, permettant un changement allost rique coop ratif de la mol cule lorsqu'elle se lie et lib re de l'oxyg ne, ce qui permet l'h moglobine d'absorber et de lib rer de l'oxyg ne plus efficacement que la version cha ne unique. Encore plus tard, au cours de l' volution des mammif res, le g ne de la cha ne a apparemment subi une duplication et une mutation pour donner naissance une deuxi me cha ne semblable un qui, il y a des millions d'ann es, est synth tis e sp cifiquement chez le f tus. La mol cule d'h moglobine r sultante a une affinit plus lev e pour l'oxyg ne que l'h moglobine adulte et aide ainsi au transfert de l'oxyg ne de la m re au f tus. Le g ne de la nouvelle cha ne de type s'est ensuite dupliqu et a mut nouveau pour produire deux nouveaux g nes, et , la cha ne tant produite plus t t dans le d veloppement (pour former 2 2) que la cha ne f tale, qui forme 2 2. Une duplication du g ne de la cha ne adulte s'est produite encore plus tard, au cours de l' volution des primates, pour donner naissance un g ne de la -globine et donc une forme mineure d'h moglobine ( 2 2) que l'on ne trouve que chez les primates adultes (Figure 4 76). Chacun de ces g nes dupliqu s a t modifi par des mutations ponctuelles qui affectent les propri t s de la mol cule d'h moglobine finale, ainsi que par des changements dans les r gions r gulatrices qui d terminent le moment et le niveau d'expression du g ne. Figure 4 76 Un sch ma volutif pour les cha nes de globine qui transportent l'oxyg ne dans le sang des animaux. Le sch ma met l'accent sur la famille de g nes de la globine de type . Une duplication g nique relativement r cente du g ne de la cha ne a produit g et A, qui sont des cha nes f tales de type de fonction identique. L'emplacement des g nes de la globine dans le g nome humain est indiqu en haut de la figure. En cons quence, chaque globine est fabriqu e en quantit s diff rentes diff rents moments du d veloppement humain. L'h
Biologie moléculaire de la cellule	istoire de ces duplications de g nes se refl te dans l'arrangement des g nes de l'h moglobine dans le g nome. Dans le g nome humain, les g nes issus du g ne d'origine sont dispos s comme une s rie de s quences d'ADN homologues situ es l'int rieur de 50 000 paires de nucl otides les unes des autres sur un seul chromosome. Un groupe similaire de g nes de -globine humaine est situ sur un chromosome s par . Non seulement d'autres mammif res, mais aussi des oiseaux ont leurs groupes de g nes et -globine sur des chromosomes s par s. Chez la grenouille Xenopus, cependant, ils sont ensemble, ce qui sugg re qu'un v nement de translocation chromosomique dans le La lign e des oiseaux et des mammif res a s par les deux groupes de g nes il y a environ 300 millions d'ann es, peu apr s que nos anc tres aient diverg des amphibiens (voir Figure 4-76). Il existe plusieurs s quences d'ADN de globine dupliqu es dans les groupes de g nes et -globine qui ne sont pas des g nes fonctionnels mais des pseudog nes. Ceux-ci ont une similitude de s quence troite avec les g nes fonctionnels, mais ont t d sactiv s par des mutations qui emp chent leur expression en tant que prot ines fonctionnelles. L'existence de tels pseudog nes montre clairement que, comme pr vu, toutes les duplications d'ADN ne conduisent pas un nouveau g ne fonctionnel. Des g nes codant pour de nouvelles prot ines peuvent tre cr s par la recombinaison d'exons Le r le de la duplication de l'ADN dans l' volution ne se limite pas l'expansion des familles de g nes. Il peut galement agir plus petite chelle pour cr er des g nes uniques en encha nant de courts segments d'ADN dupliqu s. Les prot ines cod es par les g nes g n r s de cette mani re peuvent tre reconnues par la pr sence de domaines prot iques similaires r p titifs, qui sont li s de mani re covalente les uns aux autres en s rie. Les immunoglobulines (Figure 4-77), par exemple, ainsi que la plupart des prot ines fibreuses (comme les collag nes) sont cod es par des g nes qui ont volu par duplications r p t es d'une s quence d'ADN primordiale. Dans les g nes qui ont volu de cette mani re, ainsi que dans de nombreux autres g nes, chaque exon s par code souvent une unit de repliement de prot ine individuelle, ou domaine. On pense que l'organisation des s quences codant pour l'ADN en une s rie de tels exons s par s par de longs introns a grandement facilit l' volution de nouvelles prot ines. Les duplications n cessaires pour former un seul g ne codant pour une prot ine avec des domaines r p titifs, par exemple, peuvent facilement se produire en brisant et en r unissant l'ADN n'importe o dans les longs introns de chaque c t d'un exon ; Sans introns, il n'y aurait que quelques sites dans le g ne d'origine o un change recombinatoire entre les mol cules d'ADN pourrait dupliquer le domaine et ne pas le perturber. En permettant la duplication de se produire par recombinaison sur de nombreux sites potentiels plut t que sur quelques-uns, les introns augmentent la probabilit d'un v nement de duplication favorable. Plus g n ralement, les s quences g nomiques nous ont appris que les diff rentes parties des g nes, la fois leurs exons individuels et leurs l ments r gulateurs, ont servi d' l ments modulaires qui ont t dupliqu s et d plac s dans le g nome pour cr er la grande diversit des tres vivants. Ainsi, par exemple, de nombreuses prot ines actuelles sont form es comme une mosa que de domaines d'origines diff rentes, refl tant leur histoire volutive complexe (voir Figure 3-17). Les mutations neutres se propagent souvent pour se fixer dans une population, avec une probabilit qui d pend de la taille de la population Dans les comparaisons entre deux esp ces qui ont diverg l'une de l'autre de plusieurs millions d'ann es, peu importe quels individus de chaque esp ce sont Figure 4 77 Vue sch matique d'une mol cule d'anticorps (immunoglobuline). Cette mol cule est un complexe de deux cha nes lourdes identiques et de deux cha nes l g res identiques. Chaque cha ne lourde contient quatre domaines similaires, li s de mani re covalente, tandis que chaque cha ne l g re contient deux domaines de ce type. Chaque domaine est cod par un exon distinct, et on pense que tous les exons ont volu par la duplication en s rie d'un seul exon ancestral. compar . Par exemple, les s quences d'ADN typiques de l'homme et du chimpanz diff rent les unes des autres d'environ 1 %. En revanche, lorsque la m me r gion du g nome est chantillonn e chez deux humains choisis au hasard, les diff rences sont g n ralement d'environ 0,1 %. Pour les organismes plus loign s, les diff rences interesp ces surpassent encore plus spectaculairement les variations intraesp ces. Cependant, chaque diff rence fixe entre l'homme et le chimpanz (en d'autres termes, chaque diff rence qui est maintenant caract ristique de tous ou presque tous les individus de chaque esp ce) a commenc comme une nouvelle mutation c
Biologie moléculaire de la cellule	hez un seul individu. Si la taille de la la population de croisement dans laquelle la mutation s'est produite est N, la fr quence all le initiale pour une nouvelle mutation serait de 1/(2N) pour un organisme diplo de. Comment une mutation aussi rare se fixe-t-elle dans la population, et devient-elle ainsi une caract ristique de l'esp ce plut t que de quelques individus pars ? La r ponse cette question d pend des cons quences fonctionnelles de la mutation. Si la mutation a un effet d l t re significatif, elle sera simplement limin e par s lection purificatrice et ne se fixera pas. (Dans le cas le plus extr me, l'individu porteur de la mutation mourra sans produire de descendance.) l'inverse, les mutations rares qui conf rent un avantage reproductif majeur aux individus qui en h ritent peuvent se propager rapidement dans la population. Parce que les humains se reproduisent sexuellement et que la recombinaison g n tique se produit chaque fois qu'un gam te est form (discut au chapitre 5), le g nome de chaque individu qui a h rit de la mutation sera une mosa que de recombinaison unique de segments h rit s d'un grand nombre d'anc tres. La mutation s lectionn e ainsi qu'une quantit modeste de s quence voisine finalement h rit e de l'individu chez qui la mutation s'est produite ne seront qu'un l ment de cette immense mosa que. La grande majorit des mutations qui ne sont pas nocives ne le sont pas non plus. Ces mutations s lectivement neutres peuvent galement se propager et se fixer dans une population, et elles contribuent largement au changement volutif des g nomes. Par exemple, comme nous l'avons vu pr c demment, ils expliquent la plupart des diff rences de s quence d'ADN entre les singes et les humains. La propagation des mutations neutres n'est pas aussi rapide que celle des rares mutations fortement avantageuses. Elle d pend d'une variation al atoire du nombre de descendants porteurs de mutations produits par chaque individu porteur de mutations, provoquant des changements dans la fr quence relative de l'all le mutant dans la population. Gr ce une sorte de processus de marche al atoire , l'all le mutant peut ventuellement s' teindre, ou devenir monnaie courante. Cela peut tre mod lis math matiquement pour une population de croisement id alis e, sur l'hypoth se d'une taille de population constante et d'un accouplement al atoire, ainsi que d'une neutralit s lective pour les mutations. Bien qu'aucune des deux premi res hypoth ses ne soit une bonne description de l'histoire de la population humaine, l' tude de ce cas id alis r v le les principes g n raux d'une mani re claire et simple. Lorsqu'une nouvelle mutation neutre se produit dans une population de taille constante N qui subit un accouplement al atoire, la probabilit qu'elle finisse par se fixer est d'environ 1/(2N). En effet, il existe 2N copies du g ne dans la population diplo de, et chacune d'entre elles a une chance gale de devenir la version pr dominante long terme. Pour les mutations qui deviennent fixes, les math matiques montrent que le temps moyen de fixation est d'environ 4N g n rations. Des analyses d taill es des donn es sur la variation g n tique humaine ont sugg r une taille de population ancestrale d'environ 10 000 personnes l' poque o le mod le actuel de variation g n tique tait largement tabli. Avec une population qui a atteint cette taille, la probabilit qu'une nouvelle mutation s lectivement neutre se fixe est faible (1/20 000), tandis que le temps moyen de fixation serait de l'ordre de 800 000 ans (en supposant une dur e de g n ration de 20 ans). Ainsi, bien que nous sachions que la population humaine a norm ment augment depuis le d veloppement de l'agriculture il y a environ 15 000 ans, la plupart de l'ensemble actuel de variantes g n tiques humaines communes refl te le m lange de variantes qui tait d j pr sent bien avant cette poque, lorsque la population humaine tait encore petite. Des arguments similaires expliquent un autre ph nom ne ayant d'importantes implications pratiques pour le conseil g n tique. Dans une communaut isol e descendant d'un petit groupe de fondateurs, comme le peuple d'Islande ou les Juifs de l'Est individu avec un all le rare Europe, des variants g n tiques rares dans l'ensemble de la population humaine peuvent souvent tre pr sents une fr quence lev e, m me si ces variants sont l g rement d l t res (Figure 4 78). On peut apprendre beaucoup des analyses de la variation chez l'hommeM me si les all les du g ne de la variante commune chez l'homme moderne proviennent de variantes pr sentes dans un Le nombre total de variantes actuellement rencontr es, y compris celles qui sont individuellement rares, est tr s grand. De nouvelles mutations neutres se produisent et s'accumulent constamment, m me si aucune d'entre elles n'a eu assez de temps pour se fixer dans la vaste population humaine moderne. partir de comparaisons d taill es des s quences d'ADN d'un grand
Biologie moléculaire de la cellule	nombre d'humains modernes situ s dans le monde entier, les scientifiques peuvent estimer le nombre de g n rations qui se sont coul es depuis l'origine d'une mutation neutre particuli re. partir de ces donn es, il a t possible de cartographier les itin raires des anciennes migrations humaines. Par exemple, en combinant ce type d'analyse g n tique avec des d couvertes arch ologiques, les scientifiques ont pu d duire les routes les plus probables que nos anc tres ont emprunt es lorsqu'ils ont quitt l'Afrique il y a 60 000 80 000 ans (Figure 4-79). Nous nous sommes concentr s sur les mutations qui affectent un seul g ne, mais ce n'est pas la seule source de variation. Une autre source, peut- tre encore plus importante mais manqu e pendant de nombreuses ann es, r side dans les nombreuses duplications et suppressions de grands blocs d'ADN humain. Lorsque l'on compare n'importe quel individu humain avec le g nome de r f rence standard dans la base de donn es, on trouve g n ralement environ 100 diff rences impliquant le gain ou la perte de blocs de s quences longues, totalisant peut- tre 3 millions de paires de nucl otides. Certaines de ces variations du nombre de copies (CNV) seront tr s courantes, refl tant probablement des origines relativement anciennes, tandis que d'autres ne seront pr sentes que chez une petite minorit de personnes (Figure 4-80). En moyenne, pr s de la moiti des CNV contiennent des g nes connus. Les CNV ont t impliqu s dans de nombreux traits humains, notamment le daltonisme, l'infertilit , l'hypertension et une grande vari t de susceptibilit s aux maladies. R trospectivement, ce type de variation n'est pas surprenant, tant donn le r le pr pond rant de l'ajout et de la perte d'ADN dans l' volution des vert br s. Cependant, les variations intrasp cifiques qui ont t caract ris es de mani re plus approfondie sont les polymorphismes mononucl otidiques (SNP). Il s'agit simplement de points dans la s quence du g nome o une grande fraction de la population humaine a un nucl otide, tandis qu'une autre fraction substantielle en a un autre. Pour tre consid r comme Figure 4 78 Comment les effets fondateurs d terminent l'ensemble des variantes g n tiques dans une population d'individus appartenant la m me esp ce. Cet exemple illustre comment un all le rare (rouge) peut s' tablir dans une population isol e, m me si la mutation qui l'a produit n'a aucun avantage s lectif ou est l g rement d l t re. Figure 4 79 Retracer le cours de l'histoire de l'humanit par l'analyse des s quences g nomiques. La carte montre les itin raires des premi res migrations humaines r ussies. Les lignes pointill es indiquent deux itin raires alternatifs que nos anc tres auraient emprunt s pour quitter l'Afrique. Les comparaisons de s quences d'ADN sugg rent que les Europ ens modernes descendent d'une petite population ancestrale qui existait il y a environ 30 000 50 000 ans. En accord, les d couvertes arch ologiques sugg rent que les anc tres des Australiens indig nes modernes (fl ches rouges pleines) et des populations modernes d'Europe et du Moyen-Orient ont atteint leurs destinations il y a environ 45 000 ans. Des tudes encore plus r centes, comparant les s quences g nomiques d'humains vivants avec celles des N andertaliens et d'une autre population teinte du sud de la Sib rie (les Denisoviens), sugg rent que notre sortie d'Afrique tait un peu plus compliqu e, tout en r v lant qu'un certain nombre de nos anc tres se sont crois s avec ces voisins hominid s alors qu'ils se frayaient un chemin travers le monde. (modifi de P. Forster et S. matsumura, Science 308:965-966, 2005.) densit des g nes connus un polymorphisme, les variants doivent tre suffisamment communs pour donner une probabilit raisonnablement lev e que les g nomes de deux individus choisis au hasard diff rent au niveau du site donn ; Une probabilit de 1 % est g n ralement choisie comme seuil. Deux g nomes humains pr lev s au hasard dans la population du monde moderne diff reront environ 2,5 106 sites de ce type (1 pour 1300 paires de nucl otides). Comme nous le d crirons dans l'aper u de la g n tique au chapitre 8, les SNP dans le g nome humain peuvent tre extr mement utiles pour les analyses de cartographie g n tique, dans lesquelles on tente d'associer des traits sp cifiques (ph notypes) des s quences d'ADN sp cifiques des fins m dicales ou scientifiques (voir p. 493). Mais bien qu'utiles en tant que marqueurs g n tiques, il existe de bonnes preuves que la plupart de ces SNP ont peu ou pas d'effet sur la condition physique humaine. C'est comme pr vu, puisque les variants d l t res auront t s lectionn s au cours de l' volution humaine et, contrairement aux SNP, devraient donc tre rares. Dans le contexte des SNP ordinaires h rit s de nos anc tres pr historiques, certaines s quences aux taux de mutation exceptionnellement lev s se distinguent. Un exemple dramatique est fourni par les r p titions de l'AC, qui s
Biologie moléculaire de la cellule	ont omnipr sentes dans le g nome humain et dans les g nomes d'autres eucaryotes. Les s quences avec le motif (CA)n sont r pliqu es avec une fid lit relativement faible en raison d'un glissement qui se produit entre la matrice et les brins nouvellement synth tis s lors de la r plication de l'ADN ; Par cons quent, la valeur pr cise de N peut varier sur une plage consid rable d'un g nome l'autre. Ces r p titions constituent des marqueurs g n tiques id aux bas s sur l'ADN, car la plupart des humains sont h t rozygotes, ayant h rit d'une longueur de r p tition (n) de leur m re et d'une longueur de r p tition diff rente de leur p re. Bien que la valeur de n change suffisamment rarement pour que la plupart des transmissions parent-enfant propagent fid lement les r p titions de l'AC, les changements sont suffisamment fr quents pour maintenir des niveaux lev s d'h t rozygotie dans la population humaine. Ces r p titions et d'autres simples r p titions qui pr sentent une variabilit exceptionnellement lev e constituent donc la base de l'identification des individus par analyse d'ADN dans les enqu tes criminelles, les poursuites en paternit et d'autres applications m dico-l gales (voir les figures 8 39). Alors que la plupart des SNP et des CNV dans la s quence du g nome humain sont consid r s comme ayant peu ou pas d'effet sur le ph notype, un sous-ensemble des variations de la s quence du g nome doit tre responsable des aspects h r ditaires de l'individualit humaine. Nous savons que m me un seul changement nucl otidique qui modifie un acide amin dans une prot ine peut provoquer une maladie grave, comme par exemple dans l'an mie falciforme, qui est caus e par une telle mutation de l'h moglobine (Vid o 4.3). Nous savons galement que le dosage des g nes, c'est- -dire le doublement ou la r duction de moiti du nombre de copies de certains g nes, peut avoir un effet profond sur le d veloppement en modifiant le niveau de produit g nique, tout comme les changements dans les s quences d'ADN r gulatrices. Il y a donc toutes les raisons de supposer que certaines des nombreuses diff rences entre deux tres humains auront des Figure 4 80 D tection des variations du nombre de copies sur le chromosome 17 humain. Lorsque 100 individus ont t test s par une analyse de micropuce ADN qui d tecte le nombre de copies de s quences d'ADN sur toute la longueur de ce chromosome, les distributions indiqu es des ajouts d'ADN (barres vertes) et des pertes d'ADN (barres rouges) ont t observ es par rapport une s quence de r f rence humaine arbitraire. Les barres rouges et vertes les plus courtes repr sentent une occurrence unique parmi les 200 chromosomes examin s, tandis que les barres plus longues indiquent que l'ajout ou la perte tait proportionnellement plus fr quent. Les r sultats montrent les r gions pr f r es o les variations se produisent, et celles-ci ont tendance se trouver dans ou proximit de r gions qui contiennent d j des blocs de duplications segmentaires. La plupart des changements incluent des g nes connus. (Adapt de J.l. Freeman et al., Genome Res. 16:949-961, 2006. avec la permission de Cold Spring Harbor laboratory Press.) effets sur la sant humaine, la physiologie, le comportement et le physique. Un d fi majeur en g n tique humaine est de reconna tre ces variations relativement peu nombreuses qui sont fonctionnellement importantes dans un vaste contexte de variations neutres et sans cons quence. Les comparaisons des s quences nucl otidiques des g nomes actuels ont r volutionn notre compr hension de l' volution des g nes et du g nome. En raison de la fid lit extr mement lev e des processus de r plication et de r paration de l'ADN, les erreurs al atoires dans le maintien des s quences nucl otidiques dans les g nomes se produisent si rarement que seulement environ un nucl otide sur mille est alt r tous les millions d'ann es dans une lign e eucaryote particuli re. Il n'est donc pas surprenant qu'une comparaison des chromosomes de l'homme et du chimpanz qui sont s par s par environ 6 millions d'ann es d' volution r v le tr s peu de changements. Non seulement nos g nes sont essentiellement les m mes, mais leur ordre sur chaque chromosome est presque identique. Bien qu'un nombre substantiel de duplications segmentaires et de d l tions segmentaires se soient produites au cours des 6 derniers millions d'ann es, m me les positions des l ments transposables qui constituent une partie majeure de notre ADN non codant sont pratiquement inchang es. Lorsque l'on compare les g nomes de deux organismes plus loign s, tels qu'un humain et une souris, s par s d'environ 80 millions d'ann es, on trouve beaucoup plus de changements. Aujourd'hui, les effets de la s lection naturelle sont clairement visibles : gr ce la s lection purifiante, les s quences nucl otidiques essentielles, la fois dans les r gions r gulatrices et dans les s quences codantes (exons), ont t hautement conserv es. En revanche,
Biologie moléculaire de la cellule	des s quences non essentielles (par exemple, une grande partie de l'ADN des introns) ont t modifi es un point tel que l'on ne peut plus voir de ressemblance familiale. En raison de la s lection purificatrice, la comparaison des s quences g nomiques de plusieurs esp ces apparent es est un moyen particuli rement puissant de trouver des s quences d'ADN ayant des fonctions importantes. Bien qu'environ 5% du g nome humain ait t conserv la suite d'une s lection purificatrice, la fonction de la majorit de cet ADN (des dizaines de milliers de s quences conserv es multi-esp ces) reste myst rieuse. Les futures exp riences caract risant ses fonctions devraient nous apprendre de nombreuses nouvelles le ons sur la biologie des vert br s. D'autres comparaisons de s quences montrent qu'une grande partie de la complexit g n tique des organismes actuels est due l'expansion d'anciennes familles de g nes. La duplication de l'ADN suivie d'une divergence de s quence a clairement t une source majeure de nouveaut g n tique au cours de l' volution. Sur une chelle de temps plus r cente, les g nomes de deux humains quelconques diff reront l'un de l'autre la fois en raison de substitutions de nucl otides (polymorphismes mononucl otidiques, ou SNP) et en raison de gains et de pertes d'ADN h rit s qui provoquent des variations du nombre de copies (CNV). Comprendre les effets de ces diff rences am liorera la fois la m decine et notre compr hension de la biologie humaine. Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas. Combien de types diff rents de structure de la chromatine sont importants pour les cellules ? Comment chacune de ces structures est-elle tablie et maintenue, et lesquelles ont tendance tre h rit es apr s la r plication de l'ADN ? Pourquoi y a-t-il tant de complexes diff rents de remodelage de la chromatine dans les cellules ? Quels sont leurs r les essentiels, et comment sont-ils charg s sur la chromatine des endroits et des moments pr cis ? Comment les boucles chromosomiques se forment-elles pendant l'interphase, et qu'arrive-t-il ces boucles dans les chromosomes mitotiques condens s ? Quels changements g n tiques nous ont rendus uniques en tant qu' tres humains ? quels autres aspects de notre d veloppement volutif r cent peuvent tre reconstruits en s quen ant l'ADN des restes d'anciens hominid s ? Dans quelle mesure l' norme complexit que nous trouvons en biologie cellulaire est-elle inutile, ayant volu par d rive al atoire ? 4 1 Les femelles humaines ont 23 chromosomes diff rents, les s quences d'ADN servies facilitent la recherche de la fonction, tandis que les hommes humains en ont 24. r gions d'importance alli e. 4 2 Les quatre histones centrales sont des prot ines relativement petites 4 5 On pense que la duplication et la divergence des g nes, avec une tr s forte proportion d'acides amin s charg s positivement, ont jou un r le essentiel dans l' volution de l'augmentation des bioacides ; La charge positive aide les histones se lier troitement la complexit logique. l'ADN, quelle que soit sa s quence nucl otidique. Discutez des probl mes suivants. Les nucl osomes 4 3 se lient si troitement l'ADN qu'ils ne peuvent pas 4 6 ADN isol s du virus bact rien M13 se d placer partir des positions o ils sont assembl s pour la premi re fois. contient 25 % A, 33 % T, 22 % C et 20 % G. Ces r sultats 4 4 Dans une comparaison entre les ADN de parents vous semblent-ils tranges ? Pourquoi ou pourquoi pas ? Comment pourriez-vous des organismes tels que les humains et les souris, en identifiant ces valeurs ? Figure Q4 1 Trois nucl otides de l'int rieur d'un seul brin d'ADN (Probl me 4 7). Les fl ches O aux extr mit s du brin d'ADN indiquent que la structure se poursuit dans les deux sens. 4 7 Un segment d'ADN de l'int rieur d'un seul brin est repr sent sur la figure O Q4 1. Quelle est la polarit de cet ADN de haut en bas ? O sur une base molaire. Quels sont les pourcentages molaires de A, G et T ? dans la lign e humaine (figures Q4 2). Dessinez le chromosome interm diaire qui a r sult de la premi re inversion et indiquez explicitement les segments O inclus dans chaque inversion. (Probl me 4-9). Les blocs de couleurs diff rentes indiquent des segments des chromosomes qui sont homologues dans la s quence d'ADN. 4 10 En supposant que la fibre de chromatine de 30 nm contient environ 20 nucl osomes (200 pb/nucl osome) par 50 nm de longueur, calculez le degr de compactage de l'ADN associ ce niveau de structure de la chromatine. Quelle fraction de la condensation de 10 000 fois qui se produit la mitose ce niveau d'empilement d'ADN repr sente-t-il ? 4 11 Contrairement l'ac tylation des histones, qui est toujours corr l e l'activation des g nes, la m thylation des histones peut conduire une activation transcriptionnelle ou une r pression. Comment pensez-vous que la m me modification la m thylation peut induire des r sultats biologiqu
Biologie moléculaire de la cellule	es diff rents ? 4 12 Pourquoi un chromosome deux centrom res (un chromosome dicentrique) est-il instable ? Un centrom re de secours ne serait-il pas une bonne chose pour un chromosome, lui donnant deux chances de former un kin tochore et de se fixer aux microtubules pendant la mitose ? Cela n'aiderait-il pas s'assurer que le chromosome n'est pas laiss pour compte lors de la mitose ? 4 13 Regardez les deux colonies de levures sur la figure Q4 3. Chacune de ces colonies contient environ 100 000 cellules descendant d'une seule cellule de levure, l'origine quelque part au milieu de l'amas. Une colonie blanche se forme lorsque le g ne Ade2 est exprim partir de sa position chromosomique normale. Lorsque le g ne Ade2 est d plac vers un emplacement pr s d'un t lom re, il est emball dans l'h t rochromatine et inactiv dans la plupart des cellules, donnant naissance des colonies qui sont principalement rouges. Dans ces colonies majoritairement rouges, des secteurs blancs se d ploient partir du milieu de la colonie. Dans les secteurs rouge et blanc, la colonie blanche Ade2 de cellules de levure colonie rouge de cellules de levure avec des secteurs blancs Figure Q4 3 Effet de la position sur l'expression du g ne Ade2 de la levure (Probl me 4 13). Le g ne Ade2 code pour l'une des enzymes de la biosynth se de l'ad nosine, et l'absence du produit du g ne Ade2 conduit l'accumulation d'un pigment rouge. Par cons quent, une colonie de cellules qui expriment Ade2 est blanche, et une colonie compos e de cellules dans lesquelles le g ne Ade2 n'est pas exprim est rouge. Le g ne est toujours situ pr s des t lom res. Expliquez pourquoi des secteurs blancs se sont form s pr s du bord de la colonie rouge. Sur la base des mod les observ s, que pouvez-vous conclure sur la propagation de l' tat transcriptionnel du g ne Ade2 de la m re vers les cellules filles dans cette exp rience ? 4 14 morceaux d'ADN mobiles des l ments transposables qui s'ins rent dans les chromosomes et s'accumulent au cours de l' volution repr sentent plus de 40 % du g nome humain. Les l ments transposables de quatre types les l ments nucl aires intercal s longs (LINE), les l ments nucl aires intercal s courts (SINE), les r trotransposons r p tition terminale longue (LTR) et les transposons d'ADN sont ins r s plus ou moins al atoirement dans le g nome humain. Ces l ments sont remarquablement rares dans les quatre groupes de g nes hom obox, HoxA, HoxB, HoxC et HoxD, comme illustr pour HoxD dans la figure Q4-4, ainsi que dans une r gion quivalente du chromosome 22, qui n'a pas de cluster Hox. Chaque grappe Hox a une longueur d'environ 100 kb et contient 9 11 g nes, dont l'expression diff rentielle le long de l'axe ant ropost rieur de l'embryon en d veloppement tablit le plan corporel de base pour les humains (et pour les autres animaux). Pourquoi pensez-vous que les l ments transposables sont si rares dans les amas de Hox ? Figure Q4 4 l ments et g nes transposables dans les r gions 1-mb des chromosomes 2 et 22 (Probl me 4 14). Les lignes bleues qui se projettent vers le haut indiquent les exons de g nes connus. Les lignes rouges qui se projettent vers le bas indiquent les l ments transposables ; ils sont si nombreux (constituant plus de 40% du g nome humain) qu'ils fusionnent en presque un bloc solide en dehors des amas Hox. (Adapt de E. lander et al., Nature 409:860 921, 2001. avec la permission de macmillan Publishers ltd.) Armstrong l (2014) pig n tique. New York : guirlande Science. Hartwell l, Hood l, goldberg ml et al. (2010) genetics : From genes to genomes, 4th ed. boston, mA : mcgraw Hill. Jobling m, Hollox E, Hurles m et al. (2014) G n tique volutive humaine, 2e d. New York : guirlande Science. Strachan T & Read AP (2010) G n tique mol culaire humaine, 4e d. New York : guirlande Science. La structure et la fonction de l'ADN Avery OT, macleod Cm & mcCarty m (1944) tudes sur la nature chimique de la substance induisant la transformation des types de pneumocoques. J. Exp. Med. 79, 137 158. meselson m & Stahl Fw (1958) La r plication de l'ADN chez Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA 44, 671 682. watson JD & Crick FHC (1953) Structure mol culaire des acides nucl iques. Une structure pour l'acide nucl ique d soxyribose. Nature 171, 737-738. ADN chromosomique et son empaquetage dans la fibre de chromatine Andrews AJ & luger k (2011) Structure(s) et stabilit des nucl osomes : variations sur un th me. Annu. R v. Biophys. 40, 99 117. Avvakumov N, Nourani A & C t J (2011) Chaperons d'histones : modulateurs des marques de chromatine. Mol. Cell 41, 502 514. Deal Rb, Henikoff Jg & Henikoff S (2010) Cin tique l' chelle du g nome du renouvellement des nucl osomes d termin e par marquage m tabolique des histones. Science 328, 1161 1164. grigoryev SA & woodcock Cl (2012) Organisation de la chromatine - la fibre de 30 nm. Exp. Cell Res. 318, 1448 1455. li g, levitus m, bustamante C & w
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Biologie moléculaire de la cellule	ient un codon mais pas l'acide amin qu'il sp cifie, ou celles qui modifient un acide amin sans affecter l'activit de la prot ine cod e par le g ne). Apr s correction de ces mutations silencieuses, on constate qu'un seul g ne qui code pour une prot ine de taille moyenne (~103 paires de nucl otides codants) accumule une mutation (pas n cessairement une mutation qui inactiverait la prot ine) environ une fois toutes les 106 g n rations de cellules bact riennes. En d'autres termes, les bact ries pr sentent un taux de mutation d'environ trois changements nucl otidiques pour 1010 nucl otides par g n ration cellulaire. R cemment, il est devenu possible de mesurer le taux de mutation germinale directement chez des organismes plus complexes et sexuellement reproducteurs tels que les humains. Dans ce cas, les g nomes complets d'une famille parents et prog niture ont t directement s quenc s, et une comparaison minutieuse a r v l qu'environ 70 nouvelles mutations mononucl otidiques sont apparues dans les lign es germinales de chaque prog niture. Normalis la taille du g nome humain, le taux de mutation est d'un changement de nucl otide pour 108 nucl otides par g n ration humaine. Il s'agit d'une l g re sous-estimation car certaines mutations seront l tales et seront donc absentes de la descendance ; Cependant, comme relativement peu du g nome humain contient des informations critiques, cette consid ration n'a qu'un faible effet sur le taux de mutation r el. On estime qu'environ 100 divisions cellulaires se produisent dans la lign e germinale entre le moment de la conception et le moment de la production des ovules et des spermatozo des qui forment la g n ration suivante. Ainsi, le taux de mutation humaine, exprim en termes de divisions cellulaires (au lieu de g n rations humaines), est d'environ 1 mutation/1010 nucl otides/division cellulaire. Bien que E. coli et les humains diff rent consid rablement dans leurs modes de reproduction et dans leurs temps de g n ration, lorsque les taux de mutation de chacun sont normalis s un seul cycle de r plication de l'ADN, ils sont la fois extr mement faibles et un facteur de trois l'un de l'autre. Nous verrons plus loin dans le chapitre que les m canismes de base qui assurent ces faibles taux de mutation ont t conserv s depuis le tout d but de l'histoire des cellules sur Terre. De faibles taux de mutation sont n cessaires la vie telle que nous la connaissons tant donn que de nombreuses mutations sont d l t res, aucune esp ce ne peut se permettre de les laisser s'accumuler un rythme lev dans ses cellules germinales. Bien que la fr quence de mutation observ e soit faible, on pense n anmoins qu'elle limite le nombre de prot ines essentielles sur lesquelles tout organisme peut compter peut- tre 30 000. De plus, la probabilit qu'au moins un composant critique subisse une mutation dommageable devient catastrophiquement lev e. Dans le prolongement du m me argument, une fr quence de mutation dix fois plus lev e limiterait un organisme environ 3000 g nes essentiels. Dans ce cas, l' volution aurait t limit e des organismes consid rablement moins complexes qu'une mouche des fruits. Les cellules d'un animal ou d'une plante reproduction sexu e sont de deux types : les cellules germinales et les cellules somatiques. Les cellules germinales transmettent l'information g n tique du parent la prog niture ; les cellules somatiques forment le corps de l'organisme (Figure 5 1). Nous avons vu que les cellules germinales doivent tre prot g es contre des taux lev s de mutation pour maintenir l'esp ce. Cependant, les cellules somatiques des organismes multicellulaires doivent galement tre prot g es des changements g n tiques pour maintenir correctement la structure organis e du corps. Les modifications nucl otidiques dans les cellules somatiques peuvent donner naissance des cellules variantes, dont certaines, par s lection naturelle locale , prolif rent rapidement aux d pens du reste de l'organisme. Dans un cas extr me, il en r sulte une prolif ration cellulaire incontr l e que l'on conna t sous le nom de cancer, une maladie qui cause (en Europe et en Am rique du Nord) plus de 20% des d c s humains chaque ann e. Ces d c s sont dus en grande partie une accumulation de modifications dans les s quences d'ADN des cellules somatiques, comme nous l'avons vu au chapitre 20. Une augmentation significative de la fr quence des mutations provoquerait probablement une augmentation d sastreuse de l'incidence du cancer en acc l rant la vitesse laquelle les variantes des cellules somatiques apparaissent. Ainsi, tant pour la perp tuation d'une esp ce poss dant un grand nombre de g nes (stabilit des cellules germinales) que pour la pr vention des cancers r sultant de mutations dans les cellules somatiques (stabilit des cellules somatiques), les organismes multicellulaires comme nous d pendent de la fid lit remarquablement lev e avec laquelle leurs s quences
Biologie moléculaire de la cellule	d'ADN sont r pliqu es et maintenues. Dans toutes les cellules, les s quences d'ADN sont maintenues et r pliqu es avec une grande fid lit . Le taux de mutation, environ un changement de nucl otide pour 1010 nucl otides chaque fois que l'ADN est r pliqu , est peu pr s le m me pour des organismes aussi diff rents que les bact ries et les humains. En raison de cette pr cision remarquable, la s quence du g nome humain (environ 3,2 109 paires de nucl otides) est inchang e ou modifi e par seulement quelques nucl otides chaque fois qu'une cellule humaine typique se divise. Cela permet la plupart des humains de transmettre des instructions g n tiques pr cises d'une g n ration l'autre, et aussi d' viter les changements dans les cellules somatiques qui conduisent au cancer. Tous les organismes dupliquent leur ADN avec une pr cision extraordinaire avant chaque division cellulaire. Dans cette section, nous explorons comment une machine de r plication labor e atteint cette pr cision, tout en dupliquant l'ADN des vitesses aussi lev es que 1000 nucl otides par seconde. Comme nous l'avons vu au chapitre 1, la mod lisation de l'ADN est le m canisme utilis par la cellule pour copier la s quence nucl otidique d'un brin d'ADN en une s quence d'ADN compl mentaire (Figure 5-2). Ce processus n cessite la s paration de l'h lice d'ADN en deux brins de matrice, et implique la reconnaissance de chaque nucl otide dans les brins de matrice d'ADN par un nucl otide compl mentaire libre (non polym ris ). La s paration des Figure 5 1 Les cellules germinales et les cellules somatiques remplissent des fonctions fondamentalement diff rentes. Chez les organismes reproduction sexu e, les cellules germinales (rouges) propagent l'information g n tique dans la g n ration suivante. Les cellules somatiques (en bleu), qui forment le corps de l'organisme, sont n cessaires la survie des cellules germinales mais ne laissent pas eux-m mes de descendance. Figure 5 2 La double h lice de l'ADN agit comme un mod le pour sa propre duplication. tant donn que le nucl otide A ne s'appariera avec succ s qu'avec T et G qu'avec C, chaque brin d'ADN peut servir de mod le pour sp cifier la s quence de nucl otides dans son brin compl mentaire par appariement des bases d'ADN. De cette fa on, une mol cule d'ADN double h lice peut tre copi e avec pr cision. l'h lice d'ADN expose les groupes donneur et accepteur de liaison hydrog ne sur chaque base d'ADN pour l'appariement des bases avec le nucl otide libre entrant appropri , l'alignant pour sa polym risation catalys e par une enzyme dans une nouvelle cha ne d'ADN. La premi re enzyme polym risant les nucl otides, l'ADN polym rase, a t d couverte en 1957. Les nucl otides libres qui servent de substrats pour cette enzyme se sont av r s tre des d soxyribonucl osides triphosphates, et leur polym risation en ADN a n cessit une matrice d'ADN simple brin. Les figures 5 3 et 5 4 illustrent le m canisme par tapes de cette r action. La fourche de r plication de l'ADN est asym trique Lors de la r plication de l'ADN l'int rieur d'une cellule, chacun des deux brins d'ADN d'origine sert de mod le pour la formation d'un tout nouveau brin. Parce que chacune des deux filles d'une cellule en division h rite d'une nouvelle double h lice d'ADN contenant un brin original et un nouveau brin (Figure 5-5), la double h lice d'ADN est dite r pliqu e de mani re semi-conservatrice . Comment cet exploit est-il accompli ? 3 fin du brin 5 fin du brin Figure 5 3 La chimie de la synth se de l'ADN. L'ajout d'un d soxyribonucl otide l'extr mit 3 d'une cha ne polynucl otidique (le brin d'amorce) est la r action fondamentale par laquelle l'ADN est synth tis . Comme indiqu , l'appariement de bases entre un d soxyribonucl oside triphosphate entrant et un brin d'ADN existant (le brin matrice) guide la formation du nouveau brin d'ADN et lui conf re une s quence nucl otidique compl mentaire. La mani re dont la paire de bases de nucl otides compl mentaires est illustr e la figure 4-4. Direction de la croissance de la cha ne Figure 5 4 Synth se de l'ADN catalys e par l'ADN polym rase. (A) L'ADN polym rase catalyse l'ajout progressif d'un d soxyribonucl otide l'extr mit 3 -OH d'une cha ne polynucl otidique, le brin d'amorce en croissance qui est appari un brin matrice existant. Le brin d'ADN nouvellement synth tis polym rise donc dans la direction 5 3, comme le montre galement la figure pr c dente. tant donn que chaque d soxyribonucl oside triphosphate entrant doit s'apparier au brin matrice pour tre reconnu par l'ADN polym rase, ce brin d termine lequel des quatre d soxyribonucl otides possibles (A, C, G ou T) sera ajout . La r action est provoqu e par un changement important et favorable de l' nergie libre, caus par la lib ration de pyrophosphate et son hydrolyse ult rieure en deux mol cules de phosphate inorganique. (B) Structure de l'ADN polym rase complex e avec l'ADN (orange), telle que
Biologie moléculaire de la cellule	d termin e par cristallographie aux rayons X (Vid o 5.1). Le brin d'ADN matrice est le brin le plus long et l'ADN nouvellement synth tis est le plus court. (C) Sch ma de principe de l'ADN polym rase, bas sur la structure en (B). La g om trie correcte de la paire de bases d'un d soxyribonucl oside triphosphate entrant correct provoque le resserrement de la polym rase autour de la paire de bases, initiant ainsi la r action d'addition de nucl otides (sch ma du milieu (C)). La dissociation du pyrophosphate d tend la polym rase, permettant la translocation de l'ADN par un nucl otide de sorte que le site actif de la polym rase est pr t recevoir le prochain d soxyribonucl oside triphosphate. Des analyses effectu es au d but des ann es 1960 sur des chromosomes r plicatifs entiers ont r v l une r gion localis e de r plication qui se d place progressivement le long de la double h lice de l'ADN parental. En raison de sa structure en forme de Y, cette r gion active est appel e fourche de r plication (Figure 5-6). la fourche de r plication, un complexe multienzymatique contenant l'ADN polym rase synth tise l'ADN des deux nouveaux brins filles. Initialement, le m canisme le plus simple de r plication de l'ADN semblait tre la croissance continue des deux nouveaux brins, nucl otide par nucl otide, la fourche de r plication lorsqu'elle se d place d'une extr mit l'autre d'une mol cule d'ADN. Mais en raison de l'orientation antiparall le des deux brins d'ADN dans la double h lice de l'ADN (voir figure 5-2), ce m canisme n cessiterait qu'un brin fille polym rise dans la direction 5 3 et l'autre dans la direction 3 5. Une telle fourche de r plication n cessiterait deux types distincts d'enzymes d'ADN polym rase. Cependant, aussi attrayant que puisse tre ce mod le, les ADN polym rases aux fourches de r plication ne peuvent synth tiser que dans la direction 5 3. Comment, alors, un brin d'ADN peut-il cro tre dans la direction 3 5 ? La r ponse a t sugg r e pour la premi re fois par les r sultats d'une exp rience r alis e la fin des ann es 1960. Les chercheurs ont ajout de la 3H-thymidine hautement radioactive aux bact ries en division pendant quelques secondes, de sorte que seul l'ADN r pliqu le plus r cemment celui juste derri re la fourche de r plication est devenu radiomarqu . Cette exp rience a r v l l'existence transitoire de morceaux d'ADN de 1000 2000 nucl otides de long, maintenant commun ment appel s fragments d'Okazaki, la fourche de r plication en croissance. (R plication similaire Figure 5 5 La nature semi-conservatrice de la r plication de l'ADN. Dans un cycle de r plication, chacun des deux brins d'ADN est utilis comme matrice pour la formation d'un brin d'ADN compl mentaire. Les brins d'origine restent donc intacts travers de nombreuses g n rations de cellules. Des interm diaires ont t trouv s plus tard chez les eucaryotes, o ils ne mesurent que 100 200 nucl otides de long.) Il a t d montr que les fragments d'Okazaki ne sont polym ris s que dans le sens de la cha ne 5 3 et qu'ils sont assembl s apr s leur synth se pour cr er de longues cha nes d'ADN. Une fourche de r plication a donc une structure asym trique (Figure 5 7). Le brin fille de l'ADN qui est synth tis en continu est connu sous le nom de brin principal. Sa synth se pr c de l g rement la synth se du brin fille qui est synth tis de mani re discontinue, connu sous le nom de brin retard . Pour le brin retard , la direction de la polym risation nucl otidique est oppos e la direction globale de la croissance de la cha ne d'ADN. La synth se de ce brin par un m canisme discontinu de r tro-couture signifie que la r plication de l'ADN ne n cessite que le type 5 3 de l'ADN polym rase. La haute fid lit de la r plication de l'ADN n cessite plusieurs m canismes de relecture Comme nous l'avons vu ci-dessus, la fid lit de la copie de l'ADN pendant la r plication est telle qu'il n'y a qu'une erreur pour 1010 nucl otides copi s. Cette fid lit est beaucoup plus lev e que ce quoi on pourrait s'attendre de la pr cision de l'appariement de bases compl mentaires. Les paires de bases compl mentaires standard (voir Figure 4-4) ne sont pas les seules possibles. Par exemple, avec de petits changements dans la g om trie de l'h lice, deux liaisons hydrog ne peuvent se former entre G et T dans l'ADN. De plus, des formes tautom riques rares des quatre bases de l'ADN apparaissent transitoirement dans des rapports de 1 partie 104 ou 105. Ces formes s'apparient sans changement dans la g om trie de l'h lice : la forme tautom rique rare de C s'apparie avec A au lieu de G, par exemple. Si l'ADN polym rase ne faisait rien de sp cial lorsqu'un d sappariement se produisait entre un d soxyribonucl oside triphosphate entrant et la matrice d'ADN, le mauvais nucl otide tait souvent incorpor dans la nouvelle cha ne d'ADN, produisant des mutations fr quentes. Cependant, la haute fid lit de la r plication de l'ADN d pend
Biologie moléculaire de la cellule	non seulement de l'appariement initial des bases, mais aussi de plusieurs m canismes de relecture qui agissent s quentiellement pour corriger les erreurs initiales qui auraient pu se produire. Figure 5 6 Deux fourches de r plication se d pla ant dans des directions oppos es sur un chromosome circulaire. Une zone active de r plication de l'ADN se d place progressivement le long d'une mol cule d'ADN en r plique, cr ant un ADN en forme de Y structure connue sous le nom de fourche de r plication : les deux bras de chaque Y sont les deux mol cules d'ADN filles, et la tige du Y est l'h lice d'ADN parentale. Dans ce sch ma, les brins parentaux sont orange ; Les brins nouvellement synth tis s sont rouges. 1 m (Micrographie avec l'aimable autorisation de J r me Vinograd.) Figure 5 7 La structure d'une fourche de r plication de l'ADN. gauche, fourche de r plication avec l'ADN nouvellement synth tis en rouge et des fl ches indiquant la direction 5 3 de la synth se de l'ADN. Parce que les deux brins d'ADN filles sont polym ris s dans la direction 5 3, l'ADN synth tis sur le brin retard doit tre initialement constitu d'une s rie de courtes mol cules d'ADN, appel es fragments d'Okazaki, du nom du scientifique qui les a d couvertes. droite, la m me fourchette peu de temps apr s. Sur le brin en retard, les fragments d'Okazaki sont synth tis s s quentiellement, ceux les plus proches de la fourche tant les plus r cents. L'ADN polym rase effectue la premi re tape de relecture juste avant qu'un nouveau nucl otide ne soit ajout de mani re covalente la cha ne de croissance. Notre connaissance de ce m canisme provient de l' tude de plusieurs ADN polym rases diff rentes, dont une produite par un virus bact rien, T7, qui se r plique l'int rieur d'E. coli. Le nucl otide correct a une affinit plus lev e pour la polym rase en mouvement que le nucl otide incorrect, car l'appariement correct est plus favorable nerg tiquement. De plus, apr s la liaison du nucl otide, mais avant que le nucl otide ne soit ajout de mani re covalente la cha ne de croissance AAAAAAAAAA, l'enzyme doit subir un changement de conformation au cours duquel son emprise se resserre autour du site actif (voir Figure 5-4). Parce que ce changement se produit plus facilement avec un appariement de bases correct qu'incorrect, il permet la polym rase de rev rifier la g om trie exacte de la paire de bases avant de catalyser l'ajout du nucl otide. Les nucl otides mal appari s sont plus difficiles ajouter et donc plus susceptibles de se diffuser avant que la polym rase ne puisse les ajouter par erreur. La r action suivante de correction d'erreur, connue sous le nom de relecture exonucl olytique, a lieu imm diatement apr s les rares cas o un otide nucl olytique incorrect est ajout de mani re covalente la cha ne de croissance. Les enzymes de l'ADN polym rase sont des r sidus non appari s ou mal appari s l'extr mit de l'amorce, continuant jusqu' ce que suffisamment de nucl otides aient t retir s pour r g n rer un 3 -OH ter moins correctement appari en bases qui peut amorcer la synth se de l'ADN. De cette fa on, l'ADN polym rase fonctionne comme une enzyme auto-correctrice attach e l'ADN polym rase qui limine ses propres erreurs de polym risation lorsqu'elle recule les mastications pour cr er une base le long de l'ADN (Figure 5-8 et Figure 5-9). appari 3 -OH sur l'appr t Les propri t s autocorrectrices de l'ADN polym rase d pendent de sa n cessit d'une terminaison d'amorce parfaitement appari e en bases, et il n'est apparemment pas possible pour une telle enzyme de commencer la synth se de novo, sans une amorce existante. En revanche, les enzymes ARN polym rase impliqu es dans la transcription des g nes n'ont pas besoin d'un m canisme de relecture exonucl olytique aussi efficace : les erreurs de fabrication de l'ARN ne sont pas transmises la g n ration suivante, et la mol cule d'ARN d fectueuse occasionnelle qui est produite n'a aucune signification long terme. Les ARN polym rases sont ainsi capables de d marrer de nouvelles cha nes polynucl otidiques sans amorce. L'ADN polym rase reprend le processus d'ajout de nucl otides l'extr mit 3 -OH du brin d'amorce appari e de bases Figure 5 8 Relecture exonucl olytique par l'ADN polym rase pendant la r plication de l'ADN. Dans cet exemple, un C est accidentellement incorpor l'extr mit 3'OH croissante d'une cha ne d'ADN. La partie de l'ADN polym rase qui limine le nucl otide mal incorpor est un membre sp cialis d'une grande classe d'enzymes, connues sous le nom d'exonucl ases, qui clivent les nucl otides un par un partir des extr mit s des polynucl otides. Figure 5 9 dition par l'ADN polym rase. ADN polym rase complex e avec la matrice d'ADN dans le mode de polym risation ( gauche) et le mode d' dition ( droite). Les sites catalytiques pour les r actions exonucl olytiques (E) et de polym risation (P) sont indiqu s. En mode d' dition, l'ADN nouv
Biologie moléculaire de la cellule	ellement synth tis se dissocie transitoirement de la matrice et entre dans le site d' dition o se trouve le nucl otide le plus r cemment ajout limin catalytiquement. Il y a une fr quence d'erreur d'environ une erreur pour 104 v nements de polym risation, la fois dans la synth se de l'ARN et dans le processus s par de traduction des s quences d'ARNm en s quences prot iques. Ce taux d'erreur est plus de 100 000 fois sup rieur celui de la r plication de l'ADN, o , comme nous l'avons vu, une s rie de processus de relecture rend le processus exceptionnellement pr cis (tableau 5-1). Seule la r plication de l'ADN dans la direction 5 3 permet une correction efficace des erreurs Le besoin de pr cision explique probablement pourquoi la r plication de l'ADN ne se produit que dans la direction 5 3. S'il y avait une ADN polym rase qui ajoutait des d soxyribonucl osides triphosphates dans la direction 3 5, l'extr mit 5 croissante de la cha ne, plut t que le mononucl otide entrant, devrait fournir le triphosphate activateur n cessaire la liaison covalente. Dans ce cas, les erreurs de polym risation ne pouvaient pas tre simplement hydrolys es, car l'extr mit 5' nue de la cha ne ainsi cr e mettrait imm diatement fin la synth se de l'ADN (voir Figure 5-3). Il n'est donc possible de corriger une base inadapt e que si elle a t ajout e l'extr mit 3 d'une cha ne d'ADN. Bien que le m canisme de r trosu age pour la r plication de l'ADN semble complexe, il pr serve la direction de polym risation de 5 3 qui est n cessaire pour la relecture exonucl olytique. Malgr ces mesures de protection contre les erreurs de r plication de l'ADN, les ADN polym rases commettent parfois des erreurs. Cependant, comme nous le verrons plus loin, les cellules ont encore un autre Figure 5 10 Synth se de l'amorce d'ARN. Une vue sch matique de la r action catalys e par l'ADN primase, l'enzyme qui synth tise les courtes amorces d'ARN fabriqu es sur le brin retard en utilisant l'ADN comme matrice. Contrairement l'ADN polym rase, cette enzyme peut d marrer une nouvelle cha ne polynucl otidique en joignant deux nucl osides triphosphates. La primase synth tise un court polynucl otide dans la direction 5 3, puis s'arr te, rendant l'extr mit 3 de cette amorce disponible pour l'ADN polym rase. Chance de corriger ces erreurs par un processus appel r paration de m sappariement dirig e par brin. Avant de discuter de ce m canisme, cependant, nous d crivons les autres types de prot ines qui fonctionnent la fourche de r plication. Une enzyme sp ciale de polym risation de nucl otides synth tise de courtes mol cules d'amorce d'ARN sur le brin retard Pour le brin principal, une amorce n'est n cessaire qu'au d but de la r plication : une fois qu'une fourche de r plication est tablie, l'ADN polym rase est continuellement pr sent e avec une extr mit de cha ne appari e de bases sur laquelle ajouter de nouveaux nucl otides. Du c t lent de la fourche, cependant, chaque fois que l'ADN polym rase compl te un court fragment d'ADN Okazaki (ce qui prend quelques secondes), elle doit commencer synth tiser un fragment compl tement nouveau un site plus loin le long du brin mod le (voir Figure 5-7). Un m canisme sp cial produit le brin d'amorce appari par base requis par les mol cules d'ADN polym rase. Le m canisme d pend d'une enzyme appel e ADN primase, qui utilise des ribonucl osides triphosphates pour synth tiser de courtes amorces d'ARN sur le brin retard (Figure 5 10). Chez les eucaryotes, ces amorces mesurent environ 10 nucl otides de long et sont fabriqu es des intervalles de 100 200 nucl otides sur le brin retard . La structure chimique de l'ARN a t pr sent e au chapitre 1 et est d crite en d tail au chapitre 6. Ici, nous notons seulement que l'ARN a une structure tr s similaire l'ADN. Un brin d'ARN peut former des paires de bases avec un brin d'ADN, g n rant une double h lice hybride ADN-ARN si les deux s quences nucl otidiques sont compl mentaires. Ainsi, le m me principe de mod lisation utilis pour la synth se de l'ADN guide la synth se des amorces d'ARN. Parce qu'une amorce d'ARN contient un nucl otide correctement appari avec un groupe 3'-OH une extr mit , il peut tre allong par l'ADN polym rase cette extr mit pour commencer un fragment d'Okazaki. La synth se de chaque fragment d'Okazaki se termine lorsque cette ADN polym rase se heurte l'amorce d'ARN attach e l'extr mit 5 du fragment pr c dent. Pour produire une cha ne d'ADN continue partir des nombreux fragments d'ADN form s sur le brin retard , un syst me sp cial de r paration de l'ADN agit rapidement pour effacer l'ancienne amorce d'ARN et la remplacer par ADN. Une enzyme appel e ADN ligase relie ensuite l'extr mit 3 du nouveau fragment d'ADN l'extr mit 5 du pr c dent pour terminer le processus (figures 5-11 et 5-12). Pourquoi pourrait-on pr f rer une amorce d'ARN effa able une amorce d'ADN qui n'aurait pas besoin d' tre effac e
Biologie moléculaire de la cellule	? L'argument selon lequel une polym rase autocorrectrice ne peut pas d marrer des cha nes de novo implique galement l'inverse : une enzyme qui recommence des cha nes ne peut pas tre efficace pour s'autocorriger. Ainsi, toute enzyme qui amorce la synth se des fragments d'Okazaki fera n cessairement une copie relativement impr cise (au moins une erreur sur 105). M me si les copies conserv es dans le produit final ne constituaient que 5 % du g nome total (par exemple, 10 nucl otides par fragment d'ADN de 200 nucl otides), l'augmentation du taux de mutation global qui en r sulterait serait norme. Il semble donc probable que l'utilisation de l'ARN plut t que de l'ADN pour l'amor age apporte un avantage puissant la cellule : les ribonucl otides de l'amorce marquent automatiquement ces s quences comme copie suspecte liminer et remplacer efficacement. Figure 5 11 La synth se de l'un des nombreux fragments d'ADN sur le brin retard . Chez les eucaryotes, les amorces d'ARN sont fabriqu es des intervalles espac s d'environ 200 nucl otides sur le brin retard , et chaque amorce d'ARN mesure environ 10 nucl otides de long. Cette amorce est effac e par une enzyme sp ciale de r paration de l'ADN (une ARNase H) qui reconna t un brin d'ARN dans une h lice ARN/ADN et le fragmente ; cela laisse des lacunes qui sont combl es par l'ADN polym rase et l'ADN ligase. L'ADN polym rase s'ajoute une nouvelle amorce d'ARN pour d marrer un nouveau scellement de fragments d'Okazaki par l'ADN ligase rejoint un nouveau fragment d'Okazaki la cha ne en croissance Des prot ines sp ciales aident ouvrir la double h lice de l'ADN devant la fourche de r plication Pour que la synth se de l'ADN se poursuive, la double h lice de l'ADN doit tre ouverte ( fondue ) devant la fourche de r plication afin que les d soxyribonucl osides triphosphates entrants puissent former des paires de bases avec les brins matrices. Cependant, la double h lice de l'ADN est tr s stable dans des conditions physiologiques ; Les paires de bases sont si solidement verrouill es en place qu'il faut des temp ratures approchant celles de l'eau bouillante pour s parer les deux brins dans un tube essai. Pour cette raison, deux types suppl mentaires de prot ines de r plication les h licases d'ADN et les prot ines de liaison l'ADN simple brin sont n cessaires pour ouvrir la double h lice et fournir les matrices d'ADN simple brin appropri es pour que l'ADN polym rase puisse la copier. Les h licases d'ADN ont d'abord t isol es en tant que prot ines qui hydrolysent l'ATP lorsqu'elles sont li es des brins uniques d'ADN. Comme d crit au chapitre 3, l'hydrolyse de l'ATP peut modifier la forme d'une mol cule de prot ine d'une mani re cyclique qui permet la prot ine d'effectuer un travail m canique. Les h licases d'ADN utilisent ce principe pour se propulser rapidement le long d'un seul brin d'ADN. Lorsqu'ils rencontrent une r gion de double h lice, ils continuent se d placer le long de leur brin, s parant ainsi l'h lice des vitesses allant jusqu' 1000 paires de nucl otides par seconde (Figure 5 13 et Figure 5 14). Les deux brins d'ADN ont des polarit s oppos es et, en principe, une h licase Figure 5 12 La r action catalys e par l'ADN ligase. Cette enzyme scelle une liaison phosphodiester rompue. Comme on l'a vu, l'ADN ligase utilise une mol cule d'ATP pour activer l'extr mit 5 au niveau de l'entaille ( tape 1) avant de former la nouvelle liaison ( tape 2). De cette fa on, la r action d'entaille nerg tiquement d favorable est entra n e par le couplage au processus nerg tiquement favorable d'hydrolyse de l'ATP. pouvait d rouler la double h lice de l'ADN en se d pla ant dans la direction 5 3 le long d'un brin 5 3 ou dans la direction 3 5 le long de l'autre. En fait, les deux types d'ADN h licase existent. Dans les syst mes de r plication les mieux compris chez les bact ries, une h licase se d pla ant de 5' 3' le long du mod le de brin retard semble avoir le r le pr dominant, pour des raisons qui deviendront claires sous peu. Les prot ines de liaison l'ADN simple brin (SSB), galement appel es prot ines d stabilisatrices d'h lice, se lient troitement et coop rer avec l'ADN monocat naire expos sans couvrir les bases, qui restent donc disponibles sous forme de matrices. Ces prot ines sont incapables d'ouvrir directement une longue h lice d'ADN, mais elles aident les h licases en stabilisant la conformation simple brin d roul e. De plus, gr ce une liaison coop rative, ils enrobent et redressent les r gions de l'ADN simple brin, qui se produisent r guli rement dans la matrice brin retard , emp chant ainsi la formation des courtes h lices en pingle cheveux qui se forment facilement dans l'ADN simple brin (Figure 5-15 et Figure 5-16). Si elles ne sont pas limin es, ces h lices en pingle cheveux peuvent entraver la synth se de l'ADN catalys e par l'ADN polym rase. Un anneau coulissant maintient une ADN polym rase en mouve
Biologie moléculaire de la cellule	ment sur l'ADN elles seules, la plupart des mol cules d'ADN polym rase ne synth tisent qu'une courte cha ne de nucl otides avant de tomber de la matrice d'ADN. La tendance se dissocier rapidement d'une mol cule d'ADN permet une mol cule d'ADN polym rase qui n'a Figure 5 13 Un test pour les enzymes d'ADN h licase. Un court fragment d'ADN est recuit en un long brin d'ADN simple pour former une r gion d'ADN en double h lice. La double h lice est fondue lorsque l'h licase court le long du brin unique d'ADN, lib rant le court fragment d'ADN dans une r action qui n cessite la pr sence la fois de la prot ine h licase et de l'ATP. Le mouvement rapide de l'h licase est aliment par son hydrolyse de l'ATP (sch matiquement illustr e la figure 3-75A). Comme indiqu , de nombreuses h licases d'ADN sont compos es de six sous-unit s. Figure 5 14 La structure d'une h licase d'ADN. (A) Sch ma de la prot ine 5 en tant qu'anneau hexam re dessin l' chelle avec une fourche de r plication. (B) Structure d taill e de l'h licase r plicative du bact riophage T7, d termin e par diffraction des rayons X. Six sous-unit s identiques se lient et hydrolysent l'ATP de mani re ordonn e pour propulser cette mol cule, comme un moteur rotatif, le long d'un seul brin d'ADN qui passe travers le trou central. Le rouge indique les mol cules d'ATP li es dans la structure (Vid o 5.2). (Code PDB : 1E0J.) a termin la synth se d'un fragment d'Okazaki sur le brin retard recycler rapidement, afin de commencer la synth se du fragment d'Okazaki suivant sur le m me brin. Cependant, cette dissociation rapide rendrait difficile pour la polym rase la synth se des longs brins d'ADN produits une fourche de r plication s'il n'y avait pas une prot ine accessoire (appel e PCNA chez les eucaryotes) qui fonctionne comme une pince coulissante r gul e. Cette pince maintient la polym rase fermement sur l'ADN lorsqu'il se d place, mais la lib re d s que la polym rase p n tre dans une r gion double brin de l'ADN. Comment une pince coulissante peut-elle emp cher la polym rase de se dissocier sans en m me temps entraver le mouvement rapide de la polym rase le long de la mol cule d'ADN ? La structure tridimensionnelle de la prot ine clamp, d termin e par diffraction des rayons X, a r v l qu'il s'agissait d'un grand anneau autour de la double h lice de l'ADN. Une face de l'anneau se lie l'arri re de l'ADN polym rase, et l'ensemble de l'anneau glisse librement le long de l'ADN lorsque la polym rase se d place. L'assemblage de la pince autour de l'ADN n cessite l'hydrolyse de l'ATP par un complexe prot ique sp cial, le chargeur de pince, qui hydrolyse l'ATP lorsqu'il charge la pince sur une jonction amorce-matrice (Figure 5 17). Sur le mod le du brin principal, l'ADN polym rase en mouvement est troitement li e la pince, et les deux restent associ es pendant tr s longtemps. L'ADN polym rase sur le mod le du brin retard utilise galement la pince, mais chaque fois que la polym rase atteint l'extr mit 5 du fragment d'Okazaki pr c dent, la polym rase se lib re de la pince et se dissocie de la matrice. Cette mol cule de polym rase s'associe ensuite une nouvelle pince qui est assembl e sur l'amorce d'ARN du fragment d'Okazaki suivant. r gion simple brin de la matrice d'ADN avec de courtes r gions d'" pingles cheveux appari es de bases Figure 5 15 L'effet des prot ines de liaison l'ADN simple brin (prot ines SSb) sur la structure de l'ADN simple brin. Parce que chaque mol cule de prot ine pr f re se lier c t d'une mol cule pr c demment li e, de longues rang es de cette prot ine se forment sur un seul brin d'ADN. Cette liaison coop rative redresse la matrice d'ADN et facilite le processus de polym risation de l'ADN. Les h lices en pingle cheveux montr es dans le l'ADN du brin r sulte d'une appariement fortuite de r gions courtes de s quence nucl otidique compl mentaire ; elles sont similaires aux courtes h lices qui se forment g n ralement dans les mol cules d'ARN (voir Figure 1 6). Figure 5 16 Prot ine de liaison monocat naire humaine li e l'ADN. (A) Vue de face des deux domaines de liaison l'ADN de la prot ine (appel s RPA) qui couvrent un total de huit nucl otides. Notez que les bases de l'ADN restent expos es dans ce complexe prot ine-ADN. (B) Sch ma montrant la structure tridimensionnelle, avec le brin d'ADN (orange) vu de face. (Code PDB : 1JMC.) Figure 5 17 La pince coulissante r gul e qui maintient l'ADN polym rase sur l'ADN. (A) La structure de la prot ine clamp d'E. coli, telle que d termin e par cristallographie aux rayons X, avec une h lice d'ADN ajout e pour indiquer comment la prot ine s'adapte l'ADN (vid o 5.3). (B) Illustration sch matique montrant comment la pince (avec des sous-unit s rouges et jaunes) est charg e sur l'ADN pour servir d'attache une mol cule d'ADN polym rase en mouvement. La structure du chargeur pince (vert fonc ) ressemble un crou vis, (A) (B) pince coulissante chargeur pinc
Biologie moléculaire de la cellule	e 5 ATPADPPi ATPATP+ ADN + ADN polym rase 3 5 5 5 3 3 RECYCLAGE DU CHARGEUR DE PINCE LIB R LIAISON ATP CHARGEUR DE PINCE OUVRE LA PINCE COULISSANTE ADN ENGAG DANS LA PINCE L'HYDROLYSE ATP VERROUILLE LA PINCE COULISSANTE AUTOUR DE L'ADN ET LIB RE LA PINCE CHARGEUR D'ADN POLYM RASE SE LIE LA PINCE COULISSANTE + avec ses filetages correspondant aux rainures de l'ADN double brin. Le chargeur se lie une mol cule de serrage libre, for ant un espace dans son anneau de sous-unit s afin que cet anneau puisse glisser autour de l'ADN. Le chargeur pince, gr ce sa structure en forme d' crou vis, reconna t la r gion de l'ADN qui est double brin et s'y verrouille, en se resserrant autour du complexe d'un brin mod le avec un brin allong (amorce) fra chement synth tis . Il porte la pince le long de cette r gion double brin jusqu' ce qu'il rencontre l'extr mit 3 de l'amorce, moment o le chargeur hydrolyse l'ATP et lib re la pince, lui permettant de se refermer autour de l'ADN et de se lier l'ADN polym rase. Dans la r action simplifi e illustr e ici, le chargeur de pince se dissocie en solution une fois que la pince a t assembl e. Lors d'une v ritable fourche de r plication, le chargeur de pince reste proche de la polym rase de sorte que, sur le brin dormant, il est pr t assembler une nouvelle pince au d but de chaque nouveau fragment d'Okazaki (voir Figure 5 18). (A, d'apr s X.P. Kong et al., Cell 69:425-437, 1992. Avec l'autorisation d'Elsevier ; B, adapt de B.A. Kelch et al., Science 334:1675-1680, 2011. Avec l'autorisation de l'AAAS. Code PDB : 3BEP.) Les prot ines une fourche de r plication coop rent pour former une machine de r plication Bien que nous ayons discut de la r plication de l'ADN comme si elle tait effectu e par un m lange de prot ines agissant toutes ind pendamment, en r alit , la plupart des prot ines sont maintenues ensemble dans un complexe multienzymatique vaste et ordonn qui synth tise rapidement l'ADN. Ce complexe peut tre compar une minuscule machine coudre compos e de parties prot iques et aliment e par l'hydrolyse du nucl oside triphosphate. Comme une machine coudre, le complexe de r plication reste probablement stationnaire par rapport son environnement imm diat ; l'ADN peut tre consid r comme une longue bande de tissu qui est rapidement enfil e travers elle. Bien que le complexe de r plication ait t tudi de mani re plus intensive chez E. coli et plusieurs de ses virus, un complexe tr s similaire fonctionne galement chez les eucaryotes, comme nous le verrons ci-dessous. La figure 5 18 r capitule les fonctions des sous-unit s de la machine de r plication. l'avant de la fourche de r plication, l'h licase d'ADN ouvre l'h lice d'ADN. Deux mol cules d'ADN polym rase travaillent la fourche, l'une sur le brin principal et l'autre sur le brin retard . Alors que la mol cule d'ADN polym rase sur le brin principal peut fonctionner de mani re continue, la mol cule d'ADN polym rase sur le brin retard doit red marrer de courts intervalles, en utilisant une courte amorce d'ARN fabriqu e par une mol cule d'ADN primase. L'association troite de tous ces composants prot iques augmente l'efficacit de la r plication et est rendue possible par un repliement du brin retard , comme le montre la figure 5-18A. Cette disposition facilite galement le chargement de la pince de polym rase chaque fois qu'un fragment d'Okazaki est synth tis : le chargeur de la pince et la mol cule d'ADN polym rase brin retard sont maintenus en place dans le cadre de la machine prot ines m me lorsqu'ils se d tachent de leur matrice d'ADN. Les prot ines de r plication sont ainsi li es entre elles en une seule grande Figure 5 18 Une fourchette de r plication bact rienne. (A) Ce sch ma montre une vue actuelle de la arrangement des prot ines de r plication une fourche de r plication lors de la synth se de l'ADN. L'ADN du brin retard est pli pour amener la mol cule d'ADN polym rase du brin retard en un complexe avec la mol cule d'ADN polym rase du brin principal. Ce pliage rapproche galement l'extr mit 3 de chaque fragment d'Okazaki termin du site de d part du fragment d'Okazaki suivant. Parce que la mol cule d'ADN polym rase brin retard reste li e au reste des prot ines de r plication, elle peut tre r utilis e pour synth tiser des fragments successifs d'Okazaki. Dans ce sch ma, il est sur le point de l cher son fragment d'ADN termin et de passer l'amorce d'ARN qui vient d' tre synth tis e. Des prot ines suppl mentaires (non illustr es) aident maintenir les diff rents composants prot iques de la fourchette ensemble, ce qui leur permet de fonctionner comme une machine prot ines bien coordonn e (Vid o 5.4 et Vid o 5.5). (B) Une micrographie lectronique montrant la machine de r plication du bact riophage T4 alors qu'il se d place le long d'un mod le synth tisant l'ADN derri re lui. (C) Une interpr tation de la micrographie est donn e dans le croquis : notez en
Biologie moléculaire de la cellule	particulier la boucle d'ADN sur le brin retard . Apparemment, les prot ines de r plication se sont partiellement d tach es de l'avant m me de la fourche de r plication lors de la pr paration de cet chantillon pour la microscopie lectronique. (B, avec l'aimable autorisation de Jack Griffith ; voir P.D. Chastain et al., J. Biol. Chem. 278:21276 21285, 2003.) unit (masse mol culaire totale >106 daltons), permettant l'ADN d' tre synth tis des deux c t s de la fourche de r plication de mani re coordonn e et efficace. Sur le brin retard , la machine de r plication de l'ADN laisse derri re elle une s rie de fragments d'Okazaki non scell s, qui contiennent encore l'ARN qui a amorc leur synth se leurs extr mit s 5. Comme nous l'avons vu pr c demment, cet ARN est limin et l'espace qui en r sulte est combl par des enzymes de r paration de l'ADN qui op rent derri re la fourche de r plication (voir la figure 5-11). Un syst me de r paration des incompatitudes dirig par brin supprime les erreurs de r plication qui s' chappent de la machine de r plication Comme indiqu pr c demment, des bact ries telles que E. coli sont capables de se diviser une fois toutes les 30 minutes, ce qui rend relativement facile le d pistage de grandes populations pour trouver une cellule mutante rare qui est modifi e dans un processus sp cifique. Une classe int ressante de mutants se compose de ceux qui pr sentent des alt rations dans les g nes dits mutateurs, ce qui augmente consid rablement le taux de mutation spontan e. Il n'est pas surprenant que l'un de ces mutants fabrique une forme d fectueuse de l'exonucl ase de relecture de 3 5 qui fait partie de l'enzyme ADN polym rase (voir les figures 5-8 et 5-9). L'ADN polym rase mutante ne se relit plus efficacement, et de nombreuses erreurs de r plication qui auraient autrement t limin es s'accumulent dans l'ADN. L' tude d'autres mutants d'E. coli pr sentant des taux de mutation anormalement lev s a mis au jour un syst me de relecture qui supprime les erreurs de r plication commises par la polym rase qui ont t manqu es par l'exonucl ase de relecture. Ce syst me de r paration des m sappariements dirig vers les brins d tecte le potentiel de distorsion de l'h lice de l'ADN d au d calage entre des paires de bases non compl mentaires. Si le syst me de relecture reconnaissait simplement une discordance dans l'ADN nouvellement r pliqu et corrigeait au hasard l'un des deux nucl otides non appari s, il corrigerait par erreur le brin mod le d'origine pour correspondre l'erreur exactement la moiti du temps, ne parvenant ainsi pas r duire le taux d'erreur global. Pour tre efficace, un tel syst me de relecture doit tre capable de distinguer et d' liminer le nucl otide non appari uniquement sur le brin nouvellement synth tis , o l'erreur de r plication s'est produite. Le m canisme de distinction des brins utilis par le syst me de relecture des m sappariements chez E. coli d pend de la m thylation des r sidus A s lectionn s dans l'ADN. Des groupes m thyles sont ajout s tous les r sidus A de la s quence GATC, mais pas avant un certain temps apr s que le A a t incorpor dans une cha ne d'ADN nouvellement synth tis e. En cons quence, les seules s quences GATC qui n'ont pas encore t m thyl es se trouvent dans les nouveaux brins juste derri re une fourche de r plication. La reconnaissance de ces GAT non m thyl s permet de distinguer transitoirement les nouveaux brins d'ADN des anciens, si n cessaire si l'on veut liminer s lectivement leurs m sappariements. Le processus en trois tapes implique la reconnaissance d'un brin nouvellement synth tis , l'excision de la partie contenant le d calage et la resynth se du segment excis en utilisant l'ancien brin comme mod le. Ce syst me de r paration des m sappariements dirig par un brin r duit le nombre d'erreurs commises lors de la r plication de l'ADN par un facteur suppl mentaire de 100 1000 (voir tableau 5-1, p. 244). Un syst me de relecture de d calage similaire fonctionne dans les cellules eucaryotes, mais utilise une strat gie diff rente pour distinguer le nouveau brin de l'ancien (Figure 5-19). L'ADN brin retard nouvellement synth tis contient transitoirement des entailles (avant qu'elles ne soient scell es par l'ADN ligase) et ces entailles ( galement appel es cassures simple brin) fournissent le signal qui dirige le syst me de relecture des m sappariements vers le brin appropri . Cette strat gie exige galement que l'ADN nouvellement synth tis sur le brin principal soit entaill transitoirement ; La fa on dont cela se produit n'est pas certaine. L'importance de la relecture des m sappariements chez l'homme est observ e chez les individus qui h ritent d'une copie d fectueuse d'un g ne de r paration des m sappariements (ainsi que d'un g ne fonctionnel sur l'autre copie du chromosome). Ces personnes ont une pr disposition marqu e certains types de cancers. Par exemple, dans un type de cancer du c lon appel
Biologie moléculaire de la cellule	cancer du c lon h r ditaire sans polypose (HNPCC), la mutation spontan e d'un g ne fonctionnel produit un clone de cellules somatiques qui, parce qu'elles sont d ficientes en relecture des m sappariements, accumulent des mutations inhabituellement rapidement. La plupart des cancers apparaissent dans des cellules qui ont accumul plusieurs mutations (voir pp. 1096-1097), et les cellules d ficientes en relecture des m sappariements ont donc un risque consid rablement accru de devenir canc reuses. Heureusement, la plupart d'entre nous h ritent de deux bonnes copies de chaque g ne qui code pour une prot ine de relecture de m sappariement ; Cela nous prot ge, car il est tr s peu probable que les deux copies mutent dans la m me cellule. Lorsqu'une fourche de r plication se d place le long de l'ADN double brin, elle cr e ce que l'on a appel le probl me d'enroulement . Les deux brins parentaux, qui sont enroul s l'un autour de l'autre, doivent tre d roul s et s par s pour que la r plication se produise. Pour chaque 10 paires de nucl otides r pliqu es la fourche, un tour complet de la double h lice parentale doit tre d roul . En principe, ce d roulement peut tre r alis en faisant tourner rapidement l'ensemble du chromosome devant une fourche en mouvement ; cependant, cela est nerg tiquement tr s d favorable (en particulier pour les chromosomes longs) et, au lieu de cela, l'ADN devant une fourche de r plication devient surenroul (Figure 5 20). Le surenroulement, son tour, est continuellement soulag par des prot ines appel es ADN topoisom rases. Une topoisom rase d'ADN peut tre consid r e comme une nucl ase r versible qui s'ajoute de mani re covalente un phosphate de squelette d'ADN, brisant ainsi une liaison phosphodiester dans un brin d'ADN. Cette r action est r versible et la liaison phosphodiester se reforme lorsque la prot ine part. Un type de topoisom rase, appel topoisom rase I, produit une rupture transitoire de brin ; cette rupture dans le squelette du phosphodiester permet aux deux sections de l'h lice d'ADN de chaque c t de l'entaille de tourner librement l'une par rapport l'autre, en utilisant la liaison phosphodiester dans le brin oppos l'entaille comme point de pivotement (Figure 5 21). Toute tension dans l'h lice de l'ADN entra nera cette rotation dans la direction qui soulage la tension. Par cons quent, la r plication de l'ADN peut se produire avec la rotation d'une courte longueur d'h lice, la partie situ e juste devant la fourche. Parce que la liaison covalente qui relie la prot ine de l'ADN topoisom rase un phosphate d'ADN conserve sa rotation, la contrainte de torsion s'accumule Figure 5 19 R paration d'un m sappariement dirig par un toron. (A) Les deux prot ines montr es sont pr sentes la fois dans les bact ries et les cellules eucaryotes : MutS se lie sp cifiquement une paire de bases non appari es, tandis que MutL scanne l'ADN voisin la recherche d'une entaille. Une fois que MutL trouve une entaille, il d clenche la d gradation du brin entaill tout au long de l'incompatibilit . Parce que les entailles sont en grande partie confin es aux brins nouvellement r pliqu s chez les eucaryotes, les erreurs de r plication sont limin es de mani re s lective. Chez les bact ries, une prot ine suppl mentaire dans le complexe (MutH) entaille les s quences GATC non m thyl es (et donc nouvellement r pliqu es), commen ant ainsi le processus illustr ici. Chez les eucaryotes, MutL contient une activit d'entaille d'ADN qui aide l' limination du brin endommag . (B) La structure de la prot ine MutS li e une m sappariement de l'ADN. Cette prot ine est un dim re, qui saisit la double h lice de l'ADN comme indiqu , pliant l'ADN la paire de bases non appari e. Il semble que la prot ine MutS scanne l'ADN la recherche de m sappariements en testant des sites qui peuvent tre facilement pli s, qui sont ceux avec un paire de bases anormale. (Code PDB : 1EWQ.) Figure 5 20 Le probl me de l'enroulement qui se pose lors de la r plication de l'ADN. (A) Pour une fourche de r plication bact rienne se d pla ant 500 nucl otides par seconde, l'h lice d'ADN parentale devant la fourche doit tourner 50 tours par seconde. (B) Si les extr mit s de la double h lice de l'ADN restent fixes (ou difficiles tourner), la tension s'accumule devant la fourche de r plication lorsqu'elle devient surenroul e. Une partie de cette tension peut tre absorb e par le super-enroulement, par lequel la double h lice de l'ADN se tord sur elle-m me (voir Figure 6-19). Cependant, si la tension continue de s'accumuler, la fourche de r plication finira par s'arr ter, car un d roulement suppl mentaire n cessite plus d' nergie que ce que l'h licase peut fournir. Notez que dans (A), la ligne pointill e repr sente environ 20 tours d'ADN. une extr mit de la double h lice de l'ADN ne peut pas tourner par rapport l'autre extr mit topoisom rase avec tyrosine au site actif CH2 OH CH2 OH L'ADN topoisom ra
Biologie moléculaire de la cellule	se se lie de mani re covalente un phosphate d'ADN, brisant ainsi une liaison phosphodiester dans un brin d'ADN, les deux extr mit s de la double h lice de l'ADN peuvent maintenant tourner l'une par rapport l'autre, soulageant ainsi la tension accumul e Figure 5 21 La r action r versible d'entaille de l'ADN catalys e par une enzyme eucaryote de l'ADN topoisom rase I. Comme indiqu , ces enzymes forment transitoirement une liaison covalente unique avec l'ADN ; cela permet une rotation libre de l'ADN autour des liaisons de squelette covalentes li es au phosphate bleu. CH2HO, l' nergie de la liaison phosphodiester d'origine est stock e dans la liaison phosphotyrosine, ce qui rend la r action r versible CH2 OH La reformation spontan e de la liaison phosphodiester r g n re la fois l'h lice de l'ADN et la topoisom rase de l'ADN l' nergie de la liaison phosphodiester cliv e, la refermeture est rapide et ne n cessite pas d'apport d' nergie suppl mentaire. cet gard, le m canisme de r union diff re de celui catalys par l'enzyme ADN ligase, discut pr c demment (voir Figure 5-12). Un deuxi me type d'ADN topoisom rase, la topoisom rase II, forme une liaison covalente aux deux brins de l'h lice d'ADN en m me temps, ce qui rend Figure 5 22 La r action de passage de l'h lice de l'ADN catalys e par l'ADN topoisom rase II. Contrairement aux topoisom rases de type I, les enzymes de type II hydrolysent l'ATP (rouge), qui est n cessaire pour lib rer et r initialiser l'enzyme apr s chaque cycle. Les topoisom rases de type II sont en grande partie confin es aux cellules prolif rantes des eucaryotes ; C'est en partie pour cette raison qu'ils ont t des cibles efficaces pour les m dicaments anticanc reux. Certains de ces m dicaments inhibent la topoisom rase II la troisi me tape de la figure et produisent ainsi des niveaux lev s de cassures double brin qui tuent les cellules qui se divisent rapidement. Les petits cercles jaunes repr sentent les phosphates de l' pine dorsale de l'ADN qui se lient de mani re covalente la topoisom rase (voir la figure 5-21). rupture double brin dans l'h lice. Ces enzymes sont activ es par des sites sur les chromosomes o deux doubles h lices se croisent, comme celles g n r es par le superenroulement devant une fourche de r plication (voir Figure 5 20). Une fois qu'une mol cule de topoisom rase II se lie un tel site de croisement, la prot ine utilise l'hydrolyse de l'ATP pour effectuer efficacement l'ensemble de r actions suivant : (1) elle brise une double h lice de mani re r versible pour cr er une porte d'ADN ; (2) il fait passer la deuxi me double h lice voisine travers cette ouverture ; et (3) il referme ensuite la cassure et se dissocie de l'ADN. Aux points de croisement g n r s par le superenroulement, le passage de la double h lice travers la porte se produit dans la direction qui r duira le superenroulement. De cette fa on, les topoisom rases de type II peuvent soulager la tension d'enroulement g n r e devant une fourche de r plication. Leur m canisme r actionnel permet galement aux topoisom rases d'ADN de type II de s parer efficacement deux cercles d'ADN imbriqu s (Figure 5 22). La topoisom rase II pr vient galement les graves probl mes d'enchev trement de l'ADN qui se poseraient autrement au cours de l'ADN r plication. Ce r le est bien illustr par des cellules de levure mutantes qui produisent, la place de la topoisom rase II normale, une version inactive au-dessus de 37 C. Lorsque les cellules mutantes sont r chauff es cette temp rature, leurs chromosomes filles restent entrelac s apr s la r plication de l'ADN et sont incapables de se s parer. L' norme utilit de la topoisom rase II pour d m ler les chromosomes peut tre facilement appr ci e par quiconque a eu du mal enlever un enchev trement d'une ligne de p che sans l'aide de ciseaux. Une grande partie de ce que nous savons sur la r plication de l'ADN a d'abord t d riv e d' tudes de syst mes multienzymatiques bact riens et bact riophages purifi s capables de r pliquer l'ADN in vitro. Le d veloppement de ces syst mes dans les ann es 1970 a t grandement facilit par l'isolement pr alable de mutants dans une vari t de g nes de r plication ; Ces mutants ont t exploit s pour identifier et purifier les prot ines de r plication correspondantes. Le premier syst me de r plication chez les mammif res qui a r pliqu avec pr cision l'ADN in vitro a t d crit au milieu des ann es 1980, et des mutations dans les g nes codant pour presque tous les composants de la r plication ont maintenant t isol es et analys es chez la levure Saccharomyces cerevisiae. En cons quence, on sait beaucoup de choses sur l'enzymologie d taill e de la r plication de l'ADN chez les eucaryotes, et il est clair que les caract ristiques fondamentales de la r plication de l'ADN y compris la g om trie de la r plication-fourche et l'utilisation d'une machine de r plication multi-prot ines ont t conserv es au cours du long
Biologie moléculaire de la cellule	processus volutif qui a s par les bact ries des eucaryotes. Il y a plus de composants prot iques dans les machines de r plication eucaryotes que dans les analogues bact riens, m me si les fonctions de base sont les m mes. Ainsi, par exemple, la prot ine eucaryote de liaison simple brin (SSB) est form e de trois sous-unit s, alors qu'une seule sous-unit se trouve chez les bact ries. De m me, l'ADN primase eucaryote est incorpor dans une enzyme multi-sous-unitaire qui contient galement une polym rase appel e ADN polym rase -primase. Ce complexe prot ique commence chaque fragment d'Okazaki sur le brin retard avec de l'ARN, puis prolonge l'amorce d'ARN avec une courte longueur d'ADN. ce stade, les deux principales ADN polym rases r plicatives eucaryotes, Pol et Pol , entrent en jeu : Pol compl te chaque fragment d'Okazaki sur le brin retard et Pol prolonge le brin principal. La complexit accrue de la machinerie de r plication eucaryote refl te probablement l'inversion de l'attachement covalent de la topoisom rase qui restaure une double h lice orange intacte et des contr les plus labor s. Par exemple, le maintien ordonn de diff rents types de cellules et de tissus chez les animaux et les plantes exige que la r plication de l'ADN soit troitement r gul e. De plus, la r plication de l'ADN eucaryote doit tre coordonn e avec le processus labor de la mitose, comme nous le verrons au chapitre 17. Comme nous le verrons dans la section suivante, la machinerie de r plication eucaryote a la complication suppl mentaire de devoir se r pliquer travers les nucl osomes, l'unit structurelle r p titive des chromosomes discut e au chapitre 4. Les nucl osomes sont espac s d'environ 200 paires de nucl otides le long de l'ADN, ce qui, comme nous le verrons, explique pourquoi de nouveaux fragments d'Okazaki sont synth tis s sur le brin retard des intervalles de 100 200 nucl otides chez les eucaryotes, au lieu de 1000 2000 nucl otides comme chez les bact ries. Les nucl osomes peuvent galement agir comme des barri res qui ralentissent le mouvement des mol cules d'ADN polym rase, ce qui peut expliquer pourquoi les fourches de r plication eucaryotes ne se d placent qu'environ un dixi me plus vite que les fourches de r plication bact riennes. La r plication de l'ADN a lieu au niveau d'une structure en forme de Y appel e fourche de r plication. Une enzyme d'ADN polym rase auto-correctrice catalyse la polym risation nucl otidique dans une direction de 5 3, copiant un brin de matrice d'ADN avec une fid lit remarquable. Comme les deux brins d'une double h lice d'ADN sont antiparall les, cette synth se d'ADN de 5 3 peut avoir lieu en continu sur un seul des brins une fourche de r plication (le brin principal). Sur le brin retard , de courts fragments d'ADN doivent tre fabriqu s par un processus de r tro-couture . Parce que l'ADN polym rase autocorrectrice ne peut pas d marrer une nouvelle cha ne, ces fragments d'ADN brin retard sont amorc s par de courtes mol cules d'amorce d'ARN qui sont ensuite effac es et remplac es par l'ADN. La r plication de l'ADN n cessite la coop ration de nombreuses prot ines. Il s'agit notamment de (1) l'ADN polym rase et l'ADN primase pour catalyser la polym risation du nucl oside triphosphate ; (2) les h licases d'ADN et les prot ines de liaison l'ADN monocat naire (SSB) pour aider ouvrir l'h lice d'ADN afin qu'elle puisse tre copi e ; (3) L'ADN ligase et une enzyme qui d grade les amorces d'ARN pour sceller ensemble l'ADN brin retard synth tis de mani re discontinue Fragments; et (4) les topoisom rases d'ADN pour aider soulager les probl mes d'enroulement h lico dal et d'enchev trement de l'ADN. Beaucoup de ces prot ines s'associent les unes aux autres une fourche de r plication pour former une machine de r plication tr s efficace, travers laquelle les activit s et les mouvements spatiaux des composants individuels sont coordonn s. Nous avons vu comment un ensemble de prot ines de r plication g n re rapidement et avec pr cision deux doubles h lices d'ADN filles derri re une fourche de r plication. Mais comment cette machinerie de r plication est-elle assembl e en premier lieu, et comment les fourches de r plication sont-elles cr es sur une mol cule d'ADN double brin intacte ? Dans cette section, nous expliquons comment les cellules initient la r plication de l'ADN et comment elles r gulent soigneusement ce processus pour s'assurer qu'il se d roule non seulement aux bonnes positions sur le chromosome, mais aussi au moment appropri de la vie de la cellule. Nous discutons galement de quelques-uns des probl mes particuliers que la machinerie de r plication dans les cellules eucaryotes doit surmonter. Il s'agit notamment de la n cessit de reproduire les mol cules d'ADN extr mement longues pr sentes dans les chromosomes eucaryotes, ainsi que de la difficult de copier des mol cules d'ADN troitement complex es avec des histones dans les nucl osomes.
Biologie moléculaire de la cellule	Comme nous l'avons vu pr c demment, la double h lice de l'ADN est normalement tr s stable : les deux brins d'ADN sont solidement verrouill s par de nombreuses liaisons hydrog ne form es entre les bases de chaque brin. Pour commencer la r plication de l'ADN, la double h lice doit d'abord tre ouverte et les deux brins s par s pour exposer les bases non appari es. Comme nous le verrons, le processus de r plication de l'ADN est commenc par des prot ines initiatrices sp ciales qui se lient l'ADN double brin et s parent les deux brins, brisant les liaisons hydrog ne entre les bases. brin de t te de fourche 1 de fourche 2 brin de t te brin de fourche 1 de fourche 2 Figure 5 23 Une bulle de r plication form e par l'initiation d'une fourche de r plication. Ce diagramme d crit les principales tapes du lancement des fourches de r plication aux origines de r plication. La structure form e la derni re tape, dans laquelle les deux brins de l'h lice d'ADN parental ont t s par s l'un de l'autre et servent de matrices pour la synth se de l'ADN, s'appelle une bulle de r plication. Figure 5 24 R plication de l'ADN d'un g nome bact rien. Il faut environ 30 minutes E. coli pour dupliquer son g nome de 4,6 106 paires de nucl otides. Pour simplifier, aucun fragment d'Okazaki n'est montr sur le brin retard . Ce qui se passe lorsque les deux fourches de r plication se rapprochent l'une de l'autre et entrent en collision la fin du cycle de r plication n'est pas bien compris, bien que les machines de r plication soient d mont es dans le cadre du processus. Les positions auxquelles l'h lice d'ADN est ouverte pour la premi re fois sont appel es origines de r plication (Figure 5 23). Dans les cellules simples comme celles des bact ries ou des levures, les origines sont sp cifi es par des s quences d'ADN de plusieurs centaines de paires de nucl otides. Cet ADN contient la fois de courtes s quences qui attirent les prot ines initiatrices et des tron ons d'ADN particuli rement faciles ouvrir. Nous avons vu sur la figure 4-4 qu'une paire de bases A-T est maintenue ensemble par moins de liaisons hydrog ne qu'une paire de bases G-C. Par cons quent, l'ADN riche en paires de bases A-T est relativement facile s parer, et les r gions d'ADN enrichies en paires de bases A-T se trouvent g n ralement aux origines de r plication. Bien que le processus de base de l'initiation de la r plication-fourche d crit dans la figure 5-23 soit fondamentalement le m me pour les bact ries et les eucaryotes, la mani re d taill e dont ce processus est effectu et r gul diff re entre ces deux groupes d'organismes. Nous consid rons d'abord le cas le plus simple et le mieux compris chez les bact ries, puis nous nous tournons vers la situation plus complexe que l'on trouve chez les levures, les mammif res et autres eucaryotes. Les chromosomes bact riens ont g n ralement une origine unique de r plication de l'ADN Le g nome d'E. coli est contenu dans une seule mol cule d'ADN circulaire de 4,6 106 paires de nucl otides. La r plication de l'ADN commence une seule origine de r plication, et les deux fourches de r plication qui y sont assembl es se poursuivent ( environ 1000 nucl otides par seconde) dans des directions oppos es jusqu' ce qu'elles se rencontrent peu pr s mi-chemin du chromosome (Figure 5-24). Le seul point o E. coli peut contr ler la r plication de l'ADN est l'initiation : une fois les fourches assembl es l'origine, elles synth tisent l'ADN une vitesse relativement constante jusqu' ce que la r plication soit termin e. Par cons quent, il n'est pas surprenant que l'initiation de la r plication de l'ADN soit fortement r gul e. Le processus commence lorsque les prot ines initiatrices (dans leur tat li l'ATP) se lient en plusieurs copies des sites d'ADN sp cifiques situ s l'origine de la r plication, enroulant l'ADN autour des prot ines pour former un grand complexe prot ine-ADN qui d stabilise la double h lice adjacente. Ce complexe attire ensuite deux h licases d'ADN, chacune li e un chargeur d'h licase, et celles-ci sont plac es autour de brins uniques d'ADN adjacents dont les bases ont t expos es par l'assemblage du complexe prot ine-ADN initiateur. Le chargeur h licase est analogue au chargeur pince que nous avons rencontr ci-dessus ; Il a la t che suppl mentaire de garder l'h licase sous une forme inactive jusqu' ce qu'il soit correctement charg sur une fourche de r plication naissante. Une fois les h licases charg es, les chargeurs se dissocient et les h licases commencent d rouler l'ADN, exposant suffisamment d'ADN simple brin pour que l'ADN primase synth tise les premi res amorces d'ARN (Figure 5 25). Cela conduit rapidement l'assemblage des prot ines restantes pour cr er deux fourches de r plication, avec des machines de r plication qui se d placent, par rapport l'origine de la r plication, dans des directions oppos es. Ils continuent synth tiser l'ADN jusqu' ce que toute la matric
Biologie moléculaire de la cellule	e d'ADN en aval de chaque fourche ait t r pliqu e. Chez E. coli, l'interaction de la prot ine initiatrice avec l'origine de la r plication est soigneusement r gul e, l'initiation ne se produisant que lorsque suffisamment de nutriments sont disponibles pour que la bact rie puisse compl ter un cycle complet de r plication. L'initiation est galement contr l e pour s'assurer qu'un seul cycle de r plication de l'ADN se produit pour chaque division cellulaire. Une fois la r plication initi e, la prot ine initiatrice est inactiv e par l'hydrolyse de sa mol cule ATP li e, et l'origine de la r plication conna t une p riode r fractaire . La p riode r fractaire est caus e par un retard dans la m thylation des nucl otides A nouvellement incorpor s l'origine (Figure 5 26). L'initiation ne peut pas se reproduire tant que les A ne sont pas m thyl s et que la prot ine initiatrice n'est pas restaur e son tat li l'ATP. Les chromosomes eucaryotes contiennent de multiples origines de r plication Nous avons vu comment deux fourches de r plication commencent une seule origine de r plication chez les bact ries et se d placent dans des directions oppos es, s' loignant de l'origine jusqu' ce que tout l'ADN du chromosome circulaire unique soit r pliqu . Le g nome bact rien est suffisamment petit pour que ces deux fourches de r plication puissent dupliquer le g nome en 30 minutes environ. En raison de la taille beaucoup plus grande de la plupart des chromosomes eucaryotes, une strat gie diff rente est n cessaire pour permettre leur r plication en temps opportun. Une m thode pour d terminer le mod le g n ral de r plication des chromosomes eucaryotes a t d velopp e au d but des ann es 1960. Les cellules humaines en culture sont marqu es pendant une courte p riode avec de la 3H-thymidine de sorte que l'ADN synth tis pendant cette p riode devient hautement radioactif. Les cellules sont ensuite lys es doucement, et l'ADN est tir la surface d'une lame de verre recouverte d'une mulsion photographique. Le d veloppement de l' mulsion r v le le mod le de l'ADN marqu gr ce une technique connue sous le nom d'autoradiographie. Le temps allou au marquage radioactif est choisi pour permettre chaque fourche de r plication de se d placer de plusieurs microm tres le long de l'ADN, de sorte que l'ADN r pliqu puisse tre d tect au microscope optique sous forme de lignes de grains d'argent, m me si la mol cule d'ADN elle-m me est trop mince pour tre visible. Figure 5 25 Les prot ines qui initient la r plication de l'ADN chez les bact ries. Le m canisme mis en vidence a t tabli par des tudes in vitro avec des m langes de prot ines hautement purifi es. Pour la r plication de l'ADN d'E. coli, la prot ine initiatrice majeure, l'h licase et la primase sont respectivement les prot ines dnaA, dnaB et dnaG. Dans un premier temps, plusieurs mol cules de la prot ine initiatrice se lient des s quences d'ADN sp cifiques l'origine de la r plication et d stabilisent la double h lice en formant une structure compacte dans laquelle l'ADN est troitement enroul autour de la prot ine. Ensuite, deux h licases sont introduites par des prot ines de charge h licase (les prot ines dnaC), qui inhibent les h licases jusqu' ce qu'elles soient correctement charg es l'origine de la r plication. Les prot ines de charge h licase emp chent les h lices d'ADN r plicatives de p n trer de mani re inappropri e dans d'autres segments d'ADN simple brin dans le g nome bact rien. Aid s par la prot ine de liaison simple brin (non illustr e), les h licases charg es ouvrent l'ADN, permettant ainsi aux primases d'entrer et de synth tiser les amorces initiales. Dans les tapes suivantes, deux fourches de r plication compl tes sont assembl es l'origine et se d placent dans des directions oppos es. L'initiateur Les prot ines sont d plac es lorsque la fourche gauche se d place travers elles (non illustr ). Les origines h mim thyl es enti rement m thyl es sont des origines r sistantes l'initiation L'initiation se produit si des origines suffisantes deviennent pleinement ressources sont disponibles pour compl ter la m thylation, ce qui en fait un cycle de r plication de l'ADN nouveau comp tent pour l'initiation De cette fa on, la vitesse et la direction du mouvement de la fourche de r plication peuvent tre d termin es (Figure 5 27). D'apr s la vitesse laquelle les traces d'ADN r pliqu augmentent en longueur avec l'augmentation du temps de marquage, on estime que les fourches de r plication eucaryotes se d placent environ 50 nucl otides par seconde. C'est environ vingt fois plus lent que la vitesse laquelle les fourches de r plication bact rienne se d placent, ce qui refl te peut- tre la difficult accrue de r pliquer l'ADN qui est emball troitement dans la chromatine. Un chromosome humain de taille moyenne contient une seule mol cule d'ADN lin aire d'environ 150 millions de paires de nucl otides. Il faudrait 0,02 seconde/nucl otid
Biologie moléculaire de la cellule	e 150 106 nucl otides = 3,0 106 secondes (environ 35 jours) pour r pliquer une telle mol cule d'ADN d'un bout l'autre avec une seule fourche de r plication se d pla ant une vitesse de 50 nucl otides par seconde. Comme on pouvait s'y attendre, les exp riences autoradiographiques qui viennent d' tre d crites r v lent que de nombreuses fourches, appartenant des bulles de r plication s par es, se d placent simultan ment sur chaque chromosome eucaryote. Il existe aujourd'hui des m thodes beaucoup plus rapides et plus sophistiqu es pour surveiller l'initiation de la r plication de l'ADN et suivre le mouvement des fourches de r plication de l'ADN travers des g nomes entiers. L'une d'entre elles utilise des micror seaux d'ADN, des grilles de la taille d'un timbre-poste parsem es de centaines de milliers de fragments de s quences d'ADN connues. Comme nous le verrons en d tail au chapitre 8, chaque fragment d'ADN diff rent est plac une position unique sur la puce ADN, et des g nomes entiers peuvent ainsi tre repr sent s de mani re ordonn e. Si un chantillon d'ADN d'un groupe de cellules r pliquantes est bris et hybrid en une puce repr sentant le g nome de cet organisme, la quantit de chaque s quence d'ADN peut tre d termin e. tant donn qu'un segment d'un g nome qui a t r pliqu contiendra deux fois plus d'ADN qu'un segment non r pliqu , la r plication-initiation et le mouvement de la fourche peuvent tre surveill s avec pr cision sur l'ensemble d'un g nome (Figure 5-28). Des exp riences de ce type ont montr ce qui suit : (1) Environ 30 000 50 000 origines de r plication sont utilis es chaque fois qu'une cellule humaine se divise. (2) Le g nome humain a beaucoup plus d'origines potentielles (peut- tre dix fois plus) que celle-ci, et diff rents types de cellules utilisent diff rents ensembles d'origines. Cela peut permettre une cellule de coordonner ses origines actives avec d'autres caract ristiques de ses chromosomes, telles que Figure 5 26 La m thylation de l'origine de la r plication d'E. coli cr e une p riode r fractaire pour l'initiation de l'ADN. La m thylation de l'ADN se produit au niveau des s quences GATC, dont 11 se trouvent l'origine de la r plication (couvrant environ 250 paires de nucl otides). Dans son tat h mim thyl , l'origine de la r plication est li e une prot ine inhibitrice (Seq A, non illustr e), qui bloque la capacit des prot ines initiatrices d rouler l'ADN d'origine. Finalement, (environ 15 minutes apr s le d but de la r plication), les origines h mim thyl es deviennent enti rement m thyl es par une enzyme ADN m thylase ; Seq A se dissocie alors. Une seule enzyme, la m thylase Dam, est responsable de la m thylation de toutes les s quences GATC d'E. coli. Un d calage de m thylation apr s la r plication des s quences GATC est galement utilis par le syst me de relecture des m sappariements d'E. coli pour distinguer le brin d'ADN nouvellement synth tis du brin d'ADN parental ; dans ce cas, les s quences GATC pertinentes sont dispers es dans tout le chromosome, et elles ne sont pas li es par Seq A. Figure 5 27 Les exp riences qui ont d montr le mod le selon lequel les fourches de r plication se forment et se d placent sur les chromosomes eucaryotes. Le nouvel ADN produit dans des cellules humaines en culture a t bri vement marqu avec une impulsion de thymidine hautement radioactive (3H-thymidine). (A) Dans cette exp rience, les cellules ont t lys es et l'ADN a t tir sur une lame de verre qui a ensuite t recouverte d'une mulsion photographique. Apr s plusieurs mois, l' mulsion a t d velopp e, r v lant une ligne de grains d'argent sur l'ADN radioactif. L'ADN brun de cette figure n'est montr que pour aider l'interpr tation de l'autoradiographie ; l'ADN non marqu est invisible dans de telles exp riences. (B) Cette exp rience tait la m me, sauf qu'une incubation suppl mentaire dans un milieu non marqu a permis de r pliquer de l'ADN suppl mentaire, avec un niveau de radioactivit plus faible. Les paires de pistes sombres de (B) pr sentent des grains d'argent qui s'effilent dans des directions oppos es, d montrant un mouvement de fourche bidirectionnel partir d'une origine de r plication centrale o une bulle de r plication se forme (voir Figure 5 23). On pense qu'une fourche de r plication ne s'arr te que lorsqu'elle rencontre une fourche de r plication se d pla ant dans la direction oppos e ou lorsqu'elle atteint l'extr mit du chromosome ; de cette fa on, tout l'ADN est finalement r pliqu . 258 Chapitre 5 : R plication, r paration et recombinaison de l'ADN La culture de cellules arr t es avant le d but de la r plication de l'ADN permet la r plication de commencer fragmenter l'ADN, s parer les brins et marquer fuorescent les g nes sont exprim s. Les origines exc dentaires fournissent galement des sauvegardes en cas de d faillance d'une origine principale. (3) Comme chez les bact ries, les fourches de r plication se form
Biologie moléculaire de la cellule	ent par paires et cr ent une bulle de r plication lorsqu'elles se d placent dans des directions oppos es pour s' loigner d'un point d'origine commun, ne s'arr tant que lorsqu'elles entrent en collision frontale avec une fourche de r plication se d pla ant dans la direction oppos e ou lorsqu'elles atteignent une extr mit chromosomique. De cette fa on, de nombreuses fourches de r plication fonctionnent ind pendamment sur chaque chromosome et forment pourtant deux h lices d'ADN filles compl tes. Chez les eucaryotes, la r plication de l'ADN n'a lieu qu'au cours d'une partie du cycle cellulaire Lorsqu'elles se d veloppent rapidement, les bact ries r pliquent leur ADN presque continuellement. En revanche, la r plication de l'ADN dans la plupart des cellules eucaryotes ne se produit qu'au cours d'une partie sp cifique du cycle de division cellulaire, appel e phase de synth se de l'ADN ou phase S (Figure 5-29). Dans une cellule de mammif re, la phase S dure g n ralement environ 8 heures ; dans les cellules eucaryotes plus simples telles que les levures, la phase S peut tre aussi courte que 40 minutes. la fin, chaque chromosome a t r pliqu pour produire deux copies compl tes, qui restent jointes au niveau de leurs centrom res jusqu' la phase M (M pour mitose), qui suit peu apr s. Dans le chapitre 17, nous d crivons le syst me de contr le qui ex cute le cycle cellulaire, et nous expliquons pourquoi l'entr e dans chaque phase du cycle n cessite que la cellule ait termin avec succ s la phase pr c dente. Dans les sections suivantes, nous explorons comment la r plication des chromosomes est coordonn e dans la phase S du cycle cellulaire. Diff rentes r gions du m me chromosome se r pliquent des moments distincts de la phase S Dans les cellules de mammif res, la r plication de l'ADN dans la r gion situ e entre une origine de r plication et la suivante ne devrait normalement prendre qu'environ une heure, compte tenu de la vitesse laquelle une fourche de r plication se d place et des plus grandes distances mesur es entre les origines de r plication. Pourtant, la phase S dure g n ralement environ 8 heures dans une cellule de mammif re. Cela implique que les origines de r plication ne sont pas toutes activ es simultan ment ; en effet, les origines de r plication sont activ es dans des grappes d'environ 50 origines de r plication adjacentes, chacune d'entre elles n' tant r pliqu e que pendant une petite partie de l'intervalle total de la phase S. Figure 5 28 Utilisation de micror seaux d'ADN pour surveiller la formation et la progression des fourches de r plication. Pour cette exp rience, une population de cellules est synchronis e de sorte qu'elles commencent toutes se r pliquer en m me temps. L'ADN est collect et hybrid la puce ADN ; L'ADN qui a t r pliqu une fois donne un signal d'hybridation (carr s vert fonc ) deux fois plus lev que celui de l'ADN non r pliqu (carr s vert clair). Les taches sur ces micror seaux repr sentent des s quences cons cutives le long d'un segment d'un chromosome dispos s de gauche droite, de haut en bas. Seuls 81 points sont montr s ici, mais les r seaux r els contiennent des centaines de milliers de s quences qui couvrent un g nome entier. Comme on peut le voir, la r plication commence l'origine et se d roule de mani re bidirectionnelle. Pour simplifier, une seule origine est indiqu e ici. Dans les cellules humaines, la r plication commence 30 000 50 000 origines situ es dans tout le g nome. En utilisant cette approche, il est possible d'observer la formation et la progression de chaque fourche de r plication sur un g nome. Figure 5 29 Les quatre phases successives d'un cycle cellulaire eucaryote standard. Pendant les phases G1, S et G2, la cellule se d veloppe continuellement. Pendant la phase M, la croissance s'arr te, le noyau se divise et la cellule se divise en deux. La r plication de l'ADN est confin e la partie du cycle cellulaire connue sous le nom de phase S. G1 est l' cart entre la phase M et la phase S ; G2 est l' cart entre la phase S et la phase M. Il semble que l'ordre dans lequel les origines de r plication sont activ es d pend, en partie, de la structure chromatinienne dans laquelle r sident les origines. Nous avons vu au chapitre 4 que l'h t rochromatine est un tat particuli rement condens de la chromatine, tandis que l'euchromatine, o se produit la plupart des transcriptions, a une conformation moins condens e. L'h t rochromatine a tendance se r pliquer tr s tard dans la phase S, ce qui sugg re que le moment de la r plication est li l'empaquetage de l'ADN dans la chromatine. Une fois initi es, cependant, les fourches de r plication semblent se d placer des vitesses comparables tout au long de la phase S, de sorte que l' tendue de la condensation chromosomique semble influencer le moment o les fourches de r plication sont initi es, plut t que leur vitesse une fois form es. Un grand complexe multisous-unitaire se lie aux or
Biologie moléculaire de la cellule	igines eucaryotes de la r plication Apr s avoir vu qu'un chromosome eucaryote est r pliqu l'aide de nombreuses origines de r plication, dont chacune se d clenche un moment caract ristique de la phase S du cycle cellulaire, nous nous tournons vers la nature de ces origines de r plication. Nous avons vu plus haut dans ce chapitre que les origines de la r plication ont t pr cis ment d finies chez les bact ries comme des s quences d'ADN sp cifiques qui attirent des prot ines initiatrices, qui assemblent ensuite la machinerie de r plication de l'ADN. Nous verrons que c'est le cas pour la levure bourgeonnante unicellulaire S. cerevisiae, mais cela ne semble pas tre strictement vrai pour la plupart des autres eucaryotes. Pour les levures bourgeonnantes, l'emplacement de chaque origine de r plication sur chaque chromosome a t d termin . Le chromosome particulier repr sent sur la figure 5-30 le chromosome III de S. cerevisiae est l'un des plus petits chromosomes connus, avec une longueur inf rieure 1/100 de celle d'un chromosome humain typique. Ses principales origines sont espac es en moyenne de 30 000 paires de nucl otides, mais seul un sous-ensemble de ces origines est utilis par une cellule donn e. N anmoins, ce chromosome peut tre r pliqu en 15 minutes environ. La s quence d'ADN minimale requise pour diriger l'initiation de la r plication de l'ADN chez S. cerevisiae a t d termin e en prenant un segment d'ADN qui couvre une origine de r plication et en testant des fragments d'ADN de plus en plus petits pour leur capacit fonctionner comme des origines. La plupart des s quences d'ADN qui peuvent servir d'origine de r plication contiennent (1) un site de liaison pour une grande prot ine initiatrice multi-sous-unitaire appel e ORC, pour complexe de reconnaissance d'origine ; (2) un tron on d'ADN riche en As et Ts et donc facile fondre ; et (3) au moins un site de liaison pour les prot ines qui facilitent la liaison ORC, probablement en ajustant la structure de la chromatine. Chez les bact ries, une fois que la prot ine initiatrice est correctement li e l'origine unique de r plication, l'assemblage des fourches de r plication semble suivre plus ou moins automatiquement. Chez les eucaryotes, la situation est significativement diff rente en raison d'un profond probl me que les eucaryotes ont r pliquer les chromosomes : avec autant d'endroits pour commencer la r plication, comment le processus est-il r gul pour s'assurer que tout l'ADN est copi une seule fois et une seule fois ? La r ponse r side dans la mani re s quentielle dont l'h licase r plicative est d'abord charg e sur les origines, puis activ e pour initier la r plication de l'ADN. Cette question est discut e en d tail au chapitre 17, o nous consid rons la machinerie qui sous-tend le cycle de division cellulaire. En bref, pendant la phase G1, les h licases r plicatives sont charg es sur l'ADN c t de l'ORC pour cr er un complexe pr r pliquant. Ensuite, lors du passage de la phase G1 la phase S, des prot ines kinases sp cialis es entrent en jeu pour activer les h licases. L'ouverture r sultante de la double h lice permet le chargement des prot ines de r plication restantes, y compris les ADN polym rases. Origines de la r plication du t lom re du centom re Figure 5 30 Les origines de la r plication de l'ADN sur le chromosome III de la levure S. cerevisiae. Ce chromosome, l'un des plus petits chromosomes eucaryotes connus, porte un total de 180 g nes. Comme indiqu , il contient 18 origines de r plication, bien qu'elles soient utilis es avec des fr quences diff rentes. Ceux en rouge sont g n ralement utilis s dans moins de 10 % des divisions cellulaires, tandis que ceux en vert sont utilis s environ 90 % du temps. Figure 5 31 Initiation de la r plication de l'ADN chez les eucaryotes. Ce m canisme garantit que chaque origine de r plication n'est activ e qu'une seule fois par cycle cellulaire. Une origine de r plication ne peut tre utilis e que si un complexe pr r plicatif s'y forme en phase G1. Au d but de la phase S, des kinases sp cialis es phosphorylent Mcm et ORC, activant le premier et inactivant le second. Un nouveau complexe pr r plicatif ne peut pas se former l'origine tant que la cellule n'est pas pass e la phase G1 suivante, lorsque l'ORC li a t d phosphoryl . Notez que l'h licase Mcm eucaryote se d place le long du mod le du brin avant, tandis que l'h licase bact rienne se d place le long du mod le du brin retard (voir Figure 5 25). Lorsque les fourches commencent bouger, les ORC sont d plac s, et les nouveaux ORC se lient rapidement aux origines nouvellement r pliqu es. Les prot ines kinases qui d clenchent la r plication de l'ADN emp chent simultan ment l'assemblage de nouveaux complexes pr r plicatifs jusqu' ce que la phase M suivante r initialise le cycle entier (pour plus de d tails, voir pp. 974-975). Ils le font, en partie, en phosphorylant l'ORC, ce qui le rend incapable d'accepter de n
Biologie moléculaire de la cellule	ouvelles h licases. Cette strat gie offre une seule fen tre d'opportunit pour la formation de complexes pr r plicatifs (phase G1, lorsque l'activit kinase est faible) et une seconde fen tre pour leur activation puis leur d sassemblage (phase S, lorsque l'activit kinase est lev e). tant donn que ces deux phases du cycle cellulaire s'excluent mutuellement et se produisent dans un ordre prescrit, chaque origine de r plication peut se d clencher une seule fois au cours de chaque cycle cellulaire. Les caract ristiques du g nome humain qui sp cifient les origines de la r plication restent d couvrir Par rapport la situation des levures bourgeonnantes, les d terminants des origines de la r plication chez d'autres eucaryotes ont t difficiles d couvrir. Il a t possible d'identifier des s quences d'ADN humain sp cifiques, chacune d'une longueur de plusieurs milliers de nucl otides, qui sont suffisantes pour servir d'origines de r plication. Ces origines continuent de fonctionner lorsqu'elles sont d plac es vers une autre r gion chromosomique par des m thodes d'ADN recombinant, tant qu'elles sont plac es dans une r gion o la chromatine est relativement non condens e. Cependant, les comparaisons de ces s quences d'ADN n'ont pas r v l de s quences d'ADN sp cifiques qui marquent les origines de la r plication. Malgr cela, un ORC humain tr s similaire l'ORC de la levure se lie aux origines de la r plication et initie la r plication de l'ADN chez l'homme. De nombreuses autres prot ines qui fonctionnent dans le processus d'initiation chez la levure ont galement un r le central chez l'homme. Il semble donc probable que les m canismes d'initiation de la levure et de l'homme soient similaires, mais la structure de la chromatine, l'activit transcriptionnelle ou une propri t du g nome autre qu'une s quence d'ADN sp cifique joue un r le central dans l'attraction de l'ORC et la sp cification des origines de la r plication chez les mammif res. Ces id es pourraient galement aider expliquer comment une cellule de mammif re donn e choisit laquelle des nombreuses origines possibles utiliser lorsqu'elle r plique son g nome et comment ce choix pourrait diff rer d'une cellule l'autre. De toute vidence, nous avons beaucoup d couvrir sur le processus fondamental d'initiation de la r plication de l'ADN. De nouveaux nucl osomes sont assembl s derri re la fourche de r plication Plusieurs autres aspects de la r plication de l'ADN sont sp cifiques aux eucaryotes. Comme nous l'avons vu au chapitre 4, les chromosomes eucaryotes sont compos s de m langes peu pr s gaux d'ADN et de prot ines. La duplication chromosomique n cessite donc non seulement la r plication de l'ADN, mais aussi la synth se et l'assemblage de nouvelles prot ines chromosomiques sur l'ADN derri re chaque fourche de r plication. Bien que nous soyons loin de comprendre ce processus en d tail, nous commen ons apprendre comment l'unit fondamentale de l'emballage de la chromatine, le nucl osome, est dupliqu e. La cellule a besoin d'une grande quantit de nouvelle prot ine d'histone, peu pr s gale en masse l'ADN nouvellement synth tis , pour fabriquer les nouveaux nucl osomes dans chaque cycle cellulaire. Pour cette raison, la plupart des organismes eucaryotes poss dent plusieurs copies du g ne pour chaque histone. Les cellules de vert br s, par exemple, ont environ 20 ensembles de g nes r p t s, la plupart contenant les g nes qui codent pour les cinq histones (H1, H2A, H2B, H3 et H4). Contrairement la plupart des prot ines, qui sont fabriqu es en continu, les histones sont synth tis es principalement en phase S, lorsque le niveau d'ARNm des histones augmente d'environ cinquante fois en raison de l'augmentation de la transcription et de la diminution de la d gradation de l'ARNm. Les principaux ARNm des histones sont d grad s en quelques minutes lorsque la synth se de l'ADN s'arr te la fin de la phase S. Le m canisme d pend des propri t s sp ciales des 3 extr mit s de ces ARNm, comme nous l'avons vu au chapitre 7. En revanche, les prot ines d'histones elles-m mes sont remarquablement stables et peuvent survivre toute la vie d'une cellule. Le lien troit entre la synth se de l'ADN et la synth se des histones semble refl ter un m canisme de r troaction qui surveille le niveau d'histones libres pour s'assurer que la quantit d'histones produite correspond exactement la quantit de nouvel ADN synth tis . Au fur et mesure qu'une fourche de r plication progresse, elle doit passer travers les nucl osomes parentaux. Dans la cellule, une r plication efficace n cessite des complexes de remodelage de la chromatine (discut s au chapitre 4) pour d stabiliser les interfaces ADN-histones. Aid s par de tels complexes, les fourches de r plication peuvent transiter efficacement la chromatine m me tr s condens e. Lorsqu'une fourche de r plication passe travers la chromatine, les histones sont d plac es transitoirement, laissant environ 600 pai
Biologie moléculaire de la cellule	res de nucl otides d'ADN non nucl osomique dans son sillage. Le r tablissement des nucl osomes derri re une fourche mobile se produit d'une mani re intrigante. Lorsqu'un nucl osome est travers par une fourche de r plication, l'octam re d'histones semble tre bris en un t tram re H3-H4 et deux dim res H2A-H2B (discut au chapitre 4). Le t tram re H3-H4 reste vaguement associ l'ADN et est distribu au hasard l'un ou l'autre duplex fille, mais les dim res H2A-H2B sont compl tement lib r s de l'ADN. Des t tram res H3-H4 fra chement fabriqu s sont ajout s l'ADN nouvellement synth tis pour remplir les espaces , et les dim res H2A-H2B dont la moiti sont anciens et l'autre moiti nouveaux sont ensuite ajout s au hasard pour compl ter les nucl osomes (Figure 5-32). La formation de nouveaux nucl osomes derri re une fourche de r plication a une cons quence importante sur le processus de r plication de l'ADN lui-m me. Comme l'ADN polym rase synth tise de mani re discontinue le brin retard (voir pp. 253-254), la longueur de chaque fragment d'Okazaki est d termin e par le point o l'ADN polym rase est bloqu e par un nucl osome nouvellement form . Ce couplage troit entre la duplication des nucl osomes et la r plication de l'ADN explique pourquoi la longueur des fragments d'Okazaki chez les eucaryotes (~200 nucl otides) est approximativement la m me que la longueur de r p tition des nucl osomes. 262 Chapitre 5 : R plication, r paration et recombinaison de l'ADN Le dim re H2A-H2B est d plac devant la fourche de r plication L'ajout ordonn et rapide de nouveaux t tram res H3-H4 et dim res H2A-H2B derri re une fourche de r plication n cessite des chaperons d'histones ( galement appel s facteurs d'assemblage de la chromatine). Ces complexes multisous-unitaires lient les histones tr s basiques et ne les lib rent pour l'assemblage que dans le contexte appropri . Les chaperons d'histones, ainsi que leurs cargaisons, sont dirig s vers l'ADN nouvellement r pliqu par une interaction sp cifique avec la pince coulissante eucaryote appel e PCNA (voir Figure 5-32B). Ces pinces sont laiss es derri re des fourches de r plication mobiles et restent sur l'ADN assez longtemps pour que les chaperons d'histones puissent accomplir leurs t ches. La t lom rase r plique les extr mit s des chromosomes Nous avons vu pr c demment que la synth se du brin retard au niveau d'une fourche de r plication doit se produire de mani re discontinue par un m canisme de r tro-couture qui produit de courts fragments d'ADN. Ce m canisme rencontre un probl me particulier lorsque la fourche de r plication atteint l'extr mit d'un chromosome lin aire. L'amorce finale de l'ARN synth tis e sur la matrice brin retard ne peut pas tre remplac e par l'ADN car il n'y a pas d'extr mit 3 -OH disponible pour la polym rase de r paration. Sans un m canisme pour r soudre ce probl me, l'ADN serait perdu aux extr mit s de tous les chromosomes chaque fois qu'une cellule se divise. Les bact ries r solvent ce probl me de r plication finale en ayant des mol cules d'ADN circulaires comme chromosomes (voir Figure 5-24). Les eucaryotes le r solvent d'une mani re diff rente : ils ont des s quences nucl otidiques sp cialis es aux extr mit s de leurs chromosomes qui sont incorpor es dans des structures appel es t lom res (discut es au chapitre 4). Les t lom res contiennent de nombreuses r p titions en tandem d'une courte s quence similaire dans des organismes aussi divers que les protozoaires, les champignons, les plantes et les mammif res. Chez l'homme, la s quence de l'unit de r p tition est GGGTTA, et elle est r p t e environ un millier de fois chaque t lom re. Les s quences d'ADN des t lom res sont reconnues par des prot ines de liaison l'ADN sp cifiques une s quence qui attirent une enzyme, appel e t lom rase, qui reconstitue ces s quences chaque fois qu'une cellule se divise. La t lom rase reconna t l'extr mit d'une s quence de r p tition d'ADN de t lom re existante et l'allonge dans la direction 5 3, en utilisant une matrice d'ARN qui est un composant de l'enzyme elle-m me pour synth tiser de nouvelles copies de la r p tition (Figure 5-33). La partie enzymatique de la t lom rase ressemble d'autres transcriptases inverses, des prot ines qui synth tisent l'ADN l'aide d'un mod le d'ARN, bien que, dans ce cas, l'ARN de la t lom rase contribue galement des groupes fonctionnels pour rendre la catalyse plus efficace. Apr s l'extension du brin d'ADN parental par la t lom rase, la r plication du brin retard l'extr mit du chromosome peut tre compl t e par les ADN polym rases conventionnelles, en utilisant ces extensions comme matrice pour synth tiser le brin compl mentaire (Figure 5 34). Figure 5 32 Formation de nucl osomes derri re une fourche de r plication. Les t tram res parentaux H3-H4 sont distribu s au hasard aux mol cules d'ADN filles, avec des nombres peu pr s gaux h rit s par chaque fille. En revanche, les dim res H2A-
Biologie moléculaire de la cellule	H2B sont lib r s de l'ADN lors du passage de la fourche de r plication. Cette lib ration commence juste devant la fourche de r plication et est facilit e par les complexes de remodelage de la chromatine qui se d placent avec la fourche. Les chaperons d'histones (NAP1 et CAF1) restaurent le compl ment complet des histones aux mol cules filles en utilisant la fois les histones parentales et les histones nouvellement synth tis es. Bien que certains nucl osomes filles ne contiennent que des histones parentales ou que des histones nouvellement synth tis es, la plupart sont des hybrides d'anciens et de nouveaux. Pour simplifier, la double h lice de l'ADN est repr sent e par une seule ligne rouge. (Adapt de J.D. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 5e d. Cold Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004.) reste de la prot ine t lom raseARN t lom rase R gion de l'ARN de la t lom rase utilis comme matrice paume - site actif de la prot ine t lom rase reste de l'ADN des t lom res chromosomiques synth tis s Les t lom res sont emball s dans des structures sp cialis es qui prot gent les extr mit s des chromosomes Les extr mit s des chromosomes posent un probl me suppl mentaire aux cellules. Comme nous le verrons dans la prochaine partie de ce chapitre, lorsqu'un chromosome est accidentellement cass , la cassure est rapidement r par e (voir Figure 5-45). Les t lom res doivent tre clairement distingu s de ces cassures accidentelles ; Sinon, la cellule tentera de r parer les t lom res, provoquant des fusions de chromosomes et d'autres anomalies g n tiques. Les t lom res ont plusieurs caract ristiques pour viter que cela ne se produise. Une nucl ase sp cialis e m che l'extr mit 5 d'un t lom re, laissant une extr mit monobrin saillante. Cette extr mit saillante, combin e aux r p titions GGGTTA dans les t lom res, attire un groupe de prot ines qui forment une coiffe chromosomique protectrice connue sous le nom de shelterine. En particulier, la shelterine cache les t lom res des d tecteurs de dommages de la cellule qui surveillent en permanence l'ADN. Lorsque les t lom res humains sont artificiellement r ticul s et observ s par microscopie lectronique, on observe des structures appel es boucles en T dans lesquelles l'extr mit saillante des t lom res s'enroule et se replie dans l'ADN duplex de la s quence de r p tition des t lom res (Figure 5-35). On pense que les boucles en T sont r gul es par la shelterine et offrent une protection suppl mentaire aux extr mit s des chromosomes. incompl te, nouvellement synth tis e, direction du brin retard de synth se des t lom res AACCCC 5 TELOMERASE EXTENDS 3 END t lom rase avec matrice d'ARN li e Figure 5 33 Structure d'une portion de t lom rase. La t lom rase est un grand complexe prot ine-ARN. L'ARN (en bleu) contient une s quence de mod les pour synth tiser de nouvelles r p titions de t lom res d'ADN. La r action de synth se lui-m me est effectu par le domaine de transcriptase inverse de la prot ine, repr sent en vert. Une transcriptase inverse est une forme sp ciale d'enzyme polym rase qui utilise une matrice d'ARN pour fabriquer un brin d'ADN ; la t lom rase est la seule porter avec elle sa propre matrice d'ARN. La t lom rase poss de galement plusieurs domaines prot iques suppl mentaires (non illustr s) qui sont n cessaires l'assemblage de l'enzyme aux extr mit s des chromosomes. (Modifi d'apr s J. Lingner et T.R. Cech, Curr. Opin. Genette. Dev. 8:226-232, 1998. Avec l'autorisation d'Elsevier.) Figure 5 34 R plication des t lom res. On voit ici les r actions qui synth tisent les s quences r p titives qui forment les extr mit s des chromosomes (t lom res) de divers organismes eucaryotes. L'extr mit 3 du brin d'ADN parental est prolong e par la synth se de l'ADN l'aide d'un mod le d'ARN ; cela permet au brin d'ADN fille incomplet qui lui est associ d' tre tendu dans sa direction 5. Ce brin incomplet et retard est pr sum tre compl t par l'ADN polym rase , qui porte une ADN primase comme l'une de ses sous-unit s (film 5.6). La s quence de t lom res illustr e est celle du cili Tetrahymena, dans lequel ces r actions ont t d couvertes pour la premi re fois. Parce que les processus qui d veloppent et r tr cissent chaque s quence de t lom res ne sont qu'approximativement quilibr s, une extr mit chromosomique contient un nombre variable de r p titions t lom riques. Il n'est pas surprenant que de nombreuses cellules aient des m canismes hom ostatiques qui maintiennent le nombre de ces r p titions dans une plage limit e (Figure 5-36). Dans la plupart des cellules somatiques humaines en division, cependant, les t lom res se raccourcissent progressivement, et il a t propos que cela fournisse un m canisme de comptage qui aide pr venir la prolif ration illimit e de cellules rebelles dans les tissus adultes. Dans sa forme la plus simple, cette id e soutient que nos cellules somatiques commencent dans l'embryon ave
Biologie moléculaire de la cellule	c un ensemble complet de r p titions t lom riques. Celles-ci sont ensuite rod es des degr s divers dans diff rents types de cellules. Certaines cellules souches, notamment celles des tissus qui doivent tre reconstitu s un rythme lev tout au long de la vie, comme la moelle osseuse ou la muqueuse intestinale, conservent la pleine activit de la t lom rase. Cependant, dans de nombreux autres types de cellules, le niveau de t lom rase est r duit de sorte que l'enzyme ne peut pas tout fait suivre la duplication chromosomique. Ces cellules perdent 100 200 nucl otides de chaque t lom re chaque fois qu'elles se divisent. Apr s de nombreuses g n rations cellulaires, les cellules descendantes h ritent de chromosomes d pourvus de fonction t lom re et, en raison de ce d faut, activent une r ponse de dommages l'ADN, ce qui les fait se retirer d finitivement du cycle cellulaire et cesser de se diviser un processus appel s nescence cellulaire r plicative (discut au chapitre 17). En th orie, un tel m canisme pourrait fournir une protection contre la prolif ration cellulaire incontr l e de cellules anormales dans les tissus somatiques, contribuant ainsi nous prot ger contre le cancer. fraction des extr mit s chromosomiques Figure 5 35 Une boucle en T l'extr mit d'un chromosome de mammif re. (A) Micrographie lectronique de l'ADN l'extr mit d'un chromosome humain en interphase. Le chromosome a t fix , d prot in et artificiellement paissi avant d' tre observ . La boucle que l'on voit ici a une longueur d'environ 15 000 paires de nucl otides. (B) Structure d'une boucle en T. L'insertion de l'extr mit 3 monocat naire dans les r p titions duplex est effectu e, et la structure maintenue, par des prot ines sp cialis es. (D'apr s J.D. Griffith et al., Cell 97:503-514, 1999. Avec l'autorisation d'Elsevier.) Figure 5 36 Une d monstration que les cellules de levure contr lent la longueur de leurs t lom res. Dans cette exp rience, le t lom re une extr mit d'un chromosome particulier est artificiellement rendu plus long ( gauche) ou plus court ( droite) que la moyenne. Apr s de nombreuses divisions cellulaires, le chromosome se r tablit, montrant une longueur moyenne de t lom res et une distribution de longueur typique des autres chromosomes de la cellule de levure. Un m canisme de r troaction similaire pour contr ler la longueur des t lom res a t propos pour les cellules germinales des animaux. L'id e que la longueur des t lom res agit comme un b ton de mesure pour compter les divisions cellulaires et ainsi r guler la dur e de vie de la lign e cellulaire a t test e de plusieurs fa ons. Pour certains types de cellules humaines cultiv es en culture tissulaire, les r sultats exp rimentaux soutiennent une telle th orie. Les fibroblastes humains prolif rent normalement pendant environ 60 divisions cellulaires en culture avant de subir une s nescence cellulaire r plicative. Comme la plupart des autres cellules somatiques Chez l'homme, les fibroblastes ne produisent que de faibles niveaux de t lom rase, et leurs t lom res raccourcissent progressivement chaque fois qu'ils se divisent. Lorsque la t lom rase est fournie aux fibroblastes en ins rant un g ne de t lom rase actif, la longueur des t lom res est maintenue et de nombreuses cellules continuent maintenant prolif rer ind finiment. Il a t propos que ce type de contr le de la prolif ration cellulaire puisse contribuer au vieillissement d'animaux comme nous. Ces id es ont t test es en produisant des souris transg niques qui sont totalement d pourvues de t lom rase. Les t lom res des chromosomes de souris sont environ cinq fois plus longs que les t lom res humains, et les souris doivent donc tre lev es sur trois g n rations ou plus avant que leurs t lom res n'aient r tr ci la longueur humaine normale. Il n'est donc peut- tre pas surprenant que les premi res g n rations de souris se d veloppent normalement. Cependant, les souris des g n rations suivantes d veloppent progressivement plus de d fauts dans certains de leurs tissus hautement prolif ratifs. De plus, ces souris pr sentent des signes de vieillissement pr matur et ont une tendance prononc e d velopper des tumeurs. ces gards et d'autres, ces souris ressemblent aux humains atteints de la maladie g n tique dysk ratose cong nitale. Les personnes atteintes de cette maladie sont porteuses d'une copie fonctionnelle et d'une copie non fonctionnelle du g ne de l'ARN de la t lom rase ; Ils ont des t lom res raccourcis pr matur ment et meurent g n ralement d'une insuffisance m dullaire progressive. Ils d veloppent galement des cicatrices pulmonaires et une cirrhose du foie et pr sentent des anomalies dans diverses structures pidermiques, notamment la peau, les follicules pileux et les ongles. Les observations ci-dessus d montrent que le contr le de la prolif ration cellulaire par le raccourcissement des t lom res pr sente un risque pour un organisme, car toutes les cellu
Biologie moléculaire de la cellule	les qui commencent perdre les extr mit s de leurs chromosomes n'arr tent pas de se diviser. Certains deviennent apparemment g n tiquement instables, mais continuent se diviser, donnant naissance des cellules variantes qui peuvent conduire au cancer. De toute vidence, l'utilisation du raccourcissement des t lom res comme m canisme de r gulation n'est pas infaillible et, comme de nombreux m canismes dans la cellule, semble trouver un quilibre entre les avantages et les risques. Les prot ines qui initient la r plication de l'ADN se lient des s quences d'ADN l'origine de la r plication pour catalyser la formation d'une bulle de r plication avec deux fourches de r plication se d pla ant vers l'ext rieur. Le processus commence lorsqu'un complexe prot ine-ADN initiateur se forme et charge ensuite une h licase d'ADN sur la matrice d'ADN. D'autres prot ines sont ensuite ajout es pour former la machine de r plication multienzymatique qui catalyse la synth se de l'ADN chaque fourche de r plication. Chez les bact ries et certains eucaryotes simples, les origines de r plication sont sp cifi es par des s quences d'ADN sp cifiques qui ne font que quelques centaines de paires de nucl otides. Chez d'autres eucaryotes, comme les humains, les s quences n cessaires pour sp cifier une origine de r plication de l'ADN semblent tre moins bien d finies, et l'origine peut s' tendre sur plusieurs milliers de paires de nucl otides. Les bact ries ont g n ralement une origine unique de r plication dans un chromosome circulaire. Avec des vitesses de fourche allant jusqu' 1000 nucl otides par seconde, ils peuvent r pliquer leur g nome en moins d'une heure. La r plication de l'ADN eucaryote n'a lieu que dans une partie du cycle cellulaire, la phase S. La fourche de r plication chez les eucaryotes se d place environ 10 fois plus lentement que la fourche de r plication bact rienne, et les chromosomes eucaryotes beaucoup plus longs n cessitent chacun de nombreuses origines de r plication pour compl ter leur r plication dans une phase S, qui dure g n ralement 8 heures dans les cellules humaines. Les diff rentes origines de r plication dans ces chromosomes eucaryotes sont activ es dans une s quence, d termin e en partie par la structure de la chromatine, les r gions les plus condens es de la chromatine commen ant g n ralement leur r plication en dernier. Une fois la fourche de r plication pass e, la structure de la chromatine est reform e par l'ajout de nouvelles histones aux anciennes histones qui sont directement h rit es par chaque mol cule d'ADN fille. Les eucaryotes r solvent le probl me de la r plication des extr mit s de leurs chromosomes lin aires avec une structure terminale sp cialis e, le t lom re, maintenue par une enzyme sp ciale de polym risation nucl otidique appel e t lom rase. La t lom rase tend l'un des brins d'ADN l'extr mit d'un chromosome en utilisant une matrice d'ARN qui fait partie int grante de l'enzyme elle-m me, produisant une s quence d'ADN hautement r p t e qui s' tend g n ralement sur des milliers de paires de nucl otides chaque extr mit du chromosome. Les t lom res ont des structures sp cialis es qui les distinguent des extr mit s cass es des chromosomes, garantissant qu'ils ne sont pas r par s par erreur. Le maintien de la stabilit g n tique dont un organisme a besoin pour sa survie n cessite non seulement un m canisme extr mement pr cis de r plication de l'ADN, mais aussi des m canismes de r paration des nombreuses l sions accidentelles dont souffre continuellement l'ADN. La plupart de ces changements spontan s dans l'ADN sont temporaires parce qu'ils sont imm diatement corrig s par un ensemble de processus qui sont collectivement appel s r paration de l'ADN. Sur les dizaines de milliers de changements al atoires cr s chaque jour dans l'ADN d'une cellule humaine par la chaleur, les accidents m taboliques, les radiations de toutes sortes et l'exposition des substances dans l'environnement, seuls quelques-uns (moins de 0,02 %) s'accumulent sous forme de mutations permanentes dans la s quence d'ADN. Les autres sont limin s avec une efficacit remarquable par la r paration de l'ADN. L'importance de la r paration de l'ADN est vidente partir de l'investissement important que les cellules font dans les enzymes qui la r alisent : plusieurs pour cent de la capacit de codage de la plupart des g nomes est consacr uniquement aux fonctions de r paration de l'ADN. L'importance de la r paration de l'ADN est galement d montr e par l'augmentation du taux de mutation qui suit l'inactivation d'un g ne de r paration de l'ADN. De nombreuses prot ines de r paration de l'ADN et les g nes qui les codent dont nous savons maintenant qu'ils fonctionnent dans un large ventail d'organismes, y compris les humains ont t identifi s l'origine chez les bact ries par l'isolement et la caract risation de mutants qui pr sentaient un taux de mutation accru ou une sensibilit accrue aux agents endom
Biologie moléculaire de la cellule	mageant l'ADN. Des tudes r centes sur les cons quences d'une diminution de la capacit de r paration de l'ADN chez l'homme ont tabli un lien entre de nombreuses maladies humaines et une diminution de la r paration (tableau 5 2). Ainsi, nous avons vu pr c demment que des d fauts dans un g ne humain dont le produit fonctionne normalement pour r parer les paires de bases non appari es r sultant d'erreurs de r plication de l'ADN peuvent conduire une pr disposition h r ditaire aux cancers du c lon et de certains autres organes, refl tant un taux de mutation accru. Dans une autre maladie humaine, le xeroderma pigmentosum (XP), les individus atteints ont une sensibilit extr me aux rayons ultraviolets car ils sont incapables de r parer certains photoproduits de l'ADN. Ce d faut de r paration entra ne une augmentation du taux de mutation qui entra ne des l sions cutan es graves et une susceptibilit accrue aux cancers de la peau. Enfin, les mutations dans les g nes Brca1 et Brca2 compromettent un type de r paration de l'ADN connu sous le nom de recombinaison homologue et sont une cause de cancer h r ditaire du sein et de l'ovaire. Sans r paration de l'ADN, les dommages spontan s l'ADN modifieraient rapidement les s quences d'ADN Bien que l'ADN soit un mat riau tr s stable, comme requis pour le stockage de l'information g n tique, il s'agit d'une mol cule organique complexe qui est susceptible, m me dans des conditions cellulaires normales, de changements spontan s qui conduiraient des mutations si elle n' tait pas r par e (figure 5-37 et voir tableau 5-3). Par exemple, l'ADN de chaque Figure 5 37 Un r sum des alt rations spontan es qui n cessitent une r paration de l'ADN. Les sites de chaque nucl otide modifi s par des dommages oxydatifs spontan s (fl ches rouges), une attaque hydrolytique (fl ches bleues) et une m thylation (fl ches vertes) sont repr sent s, la largeur de chaque fl che indiquant la fr quence relative de chaque v nement (voir le tableau 5 3). (D'apr s T. Lindahl, Nature 362:709-715, 1993. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) La cellule humaine perd environ 18 000 bases puriques (ad nine et guanine) chaque jour parce que ses liaisons N-glycosyle avec le d soxyribose s'hydrolysent, une r action spontan e appel e d puration. De m me, une d samination spontan e de la cytosine en uracile dans l'ADN se produit un rythme d'environ 100 bases par cellule et par jour (Figure 5-38). Les bases de l'ADN sont galement parfois endommag es par une rencontre avec des m tabolites r actifs produits dans la cellule, y compris les formes r actives de l'oxyg ne et le donneur de m thyle haute nergie S-ad nosylm thionine, ou par l'exposition des produits chimiques dans l'environnement. De m me, le rayonnement ultraviolet du soleil peut produire une liaison covalente entre deux bases pyrimidines adjacentes dans l'ADN pour former, par exemple, des dim res de thymine (Figure 5-39). S'ils ne sont pas corrig s lors de la r plication de l'ADN, la plupart de ces changements devraient conduire soit la suppression d'une ou de plusieurs paires de bases, soit une substitution de paires de bases dans la cha ne d'ADN fille (Figure 5 40). Les mutations se propageraient ensuite travers les g n rations cellulaires suivantes. Un taux aussi lev de changements al atoires dans la s quence d'ADN aurait des cons quences d sastreuses. La double h lice de l'ADN se r pare facilement La structure en double h lice de l'ADN est parfaitement adapt e la r paration car elle porte deux copies distinctes de toute l'information g n tique, une dans chacun de ses deux brins. Ainsi, lorsqu'un brin est endommag , le brin compl mentaire conserve une copie intacte de la m me information, et cette copie est g n ralement utilis e pour restaurer les s quences nucl otidiques correctes sur le brin endommag . Une indication de l'importance d'une h lice double brin pour le stockage s r de l'information g n tique est que toutes les cellules l'utilisent ; seuls quelques petits virus utilisent de l'ADN ou de l'ARN simple brin comme mat riel g n tique. Les types de processus de r paration d crits dans cette section ne peuvent pas fonctionner sur de tels acides nucl iques, et une fois endommag s, le risque qu'un changement nucl otidique permanent se produise dans ces g nomes monocat naires de virus est donc tr s lev . Il semble que seuls les organismes dot s de minuscules g nomes (et donc de minuscules cibles pour les dommages l'ADN) peuvent se permettre de coder leur information g n tique dans une mol cule autre qu'une double h lice d'ADN. Figure 5 38 D puration et d samination. Ces r actions sont deux des r actions chimiques spontan es les plus fr quentes qui cr ent de graves dommages l'ADN dans les cellules. La d purination peut lib rer de la guanine (illustr e ici), ainsi que de l'ad nine, partir de l'ADN. Le principal type de r action de d samination convertit la cytosine en une base d'ADN alt r e, l'uracile (il
Biologie moléculaire de la cellule	lustr e ici), mais la d samination se produit galement sur d'autres bases. Ces r actions ont normalement lieu dans l'ADN double h lice ; Pour plus de commodit , un seul brin est montr . Figure 5 39 Le type le plus courant de dim res de thymine. Ce type de dommage se produit dans l'ADN des cellules expos es l'irradiation ultraviolette (comme dans la lumi re du soleil). Un dim re similaire se formera entre deux bases pyrimidines voisines (r sidus C ou T) dans l'ADN. Les cellules ont plusieurs voies pour r parer leur ADN l'aide de diff rentes enzymes qui agissent sur diff rents types de l sions. La figure 5 41 montre deux des voies les plus courantes. Dans les deux cas, les dommages sont excis s, la s quence d'ADN d'origine est restaur e par une ADN polym rase qui utilise le brin non endommag comme mod le, et une cassure restante dans la double h lice est scell e par l'ADN ligase (voir Figure 5-12). Les deux voies diff rent dans la mani re dont elles liminent les dommages de l'ADN. La premi re voie, appel e r paration par excision de base, implique une batterie d'enzymes appel es glycosylases d'ADN, chacune d'entre elles pouvant reconna tre un type sp cifique de base alt r e dans l'ADN et catalyser son limination hydrolytique. Il existe au moins six types de ces enzymes, y compris celles qui liminent les Cs d samin s, les As d samin s, diff rents types de bases alkyl es ou oxyd es, les bases anneaux ouverts et les bases dans lesquelles une double liaison carbone-carbone a t accidentellement convertie en une liaison simple carbone-carbone. Comment une base alt r e est-elle d tect e dans le contexte de la double h lice ? Une tape cl est un retournement m di par une enzyme du nucl otide alt r de l'h lice, ce qui permet l'ADN glycosylase de sonder toutes les faces de la base pour d tecter les dommages (Figure 5 42). On pense que ces enzymes voyagent le long de l'ADN en utilisant le retournement de base pour valuer l' tat de chaque base. Une fois qu'une enzyme trouve la base endommag e qu'elle reconna t, elle limine cette base de son sucre. La dent manquante cr e par l'action de l'ADN glycosylase est reconnue par une enzyme appel e endonucl ase AP (AP pour apurinique ou apyrimidinique, endo pour signifier que la nucl ase se clive l'int rieur de la cha ne polynucl otidique), qui coupe le squelette phospodiester, apr s quoi l'espace r sultant est r par (voir Figure 5-41A). La d puration, qui est de loin le type de dommage le plus fr quent subi par l'ADN, laisse galement un sucre d soxyribose avec une base manquante. Les d purinations sont directement r par es en commen ant par l'endonucl ase AP, en suivant la moiti inf rieure de la voie de la figure 5-41A. a G a t remplac par un A Figure 5 40 Comment les modifications chimiques des nucl otides produisent des mutations. (A) La d samination de la cytosine, si elle n'est pas corrig e, entra ne la substitution d'une base une autre lorsque l'ADN est r pliqu . Comme le montre le Figure 5 38, la d samination de la cytosine produit de l'uracile. L'uracile diff re de la cytosine par ses propri t s d'appariement de bases et s'apparie pr f rentiellement avec l'ad nine. La machinerie de r plication de l'ADN ajoute donc une ad nine lorsqu'elle rencontre un uracile sur le brin matrice. (B) La d purination peut entra ner la perte d'une paire de nucl otides. Lorsque la machinerie de r plication rencontre une purine manquante sur le brin mod le, elle peut passer au nucl otide complet suivant, comme illustr ici, produisant ainsi une d l tion de nucl otide dans le brin nouvellement synth tis . De nombreux autres types de dommages l'ADN (voir Figure 5-37), s'ils ne sont pas corrig s, produisent galement des mutations lorsque l'ADN est r pliqu . G C TATCCDNAh lice avec base manquanteCGAGT Une h lice GGGDNA avec espace nucl otidique unique C G A G T A G GDNA POLYM RASE AJOUTE UN NOUVEAU NUCL OTIDE, L'ADN LIGASE SCELLE NICK G C T C A T C C H lice d'ADN avec espace nucl otidique 12 Figure 5 41 Une comparaison de deux principales voies de r paration de l'ADN. (A) R paration par excision de base. Cette voie commence par une ADN glycosylase. Ici, l'enzyme uracile ADN glycosylase limine une cytosine d samin e accidentellement dans l'ADN. Apr s l'action de cette glycosylase (ou d'une autre ADN glycosylase qui reconna t un autre type de dommage), le phosphate de sucre avec la base manquante est coup par l'action s quentielle de l'endonucl ase AP et d'une phosphodiest rase. (Ces m mes enzymes commencent directement la r paration des sites d purin s.) L'espace d'un seul nucl otide est ensuite combl par l'ADN polym rase et l'ADN ligase. Le r sultat net est que l'U qui a t cr par d samination accidentelle est restaur en une endonucl ase C. AP est ainsi nomm e parce qu'elle reconna t tout site dans l'h lice de l'ADN qui contient un sucre d soxyribose avec une base manquante ; De tels sites peuvent r sulter soit de la perte d'une purine (si
Biologie moléculaire de la cellule	tes apuriens), soit d'une pyrimidine (sites apyrimidiniques). (B) R paration par excision de nucl otides. Chez les bact ries, une fois qu'un complexe multienzymatique a reconnu une l sion telle qu'un dim re de pyrimidine (voir Figure 5-39), une incision est pratiqu e de chaque c t de la l sion, et une h licase d'ADN associ e retire ensuite toute la partie du brin endommag . La machinerie de r paration de l'excision chez les bact ries laisse l'espace de 12 nucl otides indiqu . Chez l'homme, une fois que l'ADN endommag est reconnu, une h licase est recrut e pour d rouler localement le duplex d'ADN. Ensuite, la nucl ase d'excision p n tre et se clive de chaque c t des dommages, laissant un espace d'environ 30 nucl otides. La machinerie de r paration par excision de nucl otides chez les bact ries et les humains peut reconna tre et r parer de nombreux types diff rents de dommages l'ADN. La deuxi me voie de r paration majeure est appel e r paration par excision de nucl otides. Ce m canisme peut r parer les dommages caus s par presque tous les changements importants dans la structure de la double h lice de l'ADN. Ces l sions volumineuses comprennent celles cr es par la r action covalente des bases de l'ADN avec de gros hydrocarbures (tels que le benzopyr ne, canc rig ne, pr sent dans la fum e de tabac, le goudron de houille et les gaz d' chappement diesel), ainsi que les divers dim res de pyrimidine (T-T, T-C et C-C) caus s par la lumi re du soleil. Dans cette voie, un grand complexe multienzymatique scanne l'ADN la recherche d'une distorsion dans la double h lice, plut t que d'un changement de base sp cifique. Une fois qu'il a trouv une l sion, il clive le squelette phosphodiester du brin anormal des deux c t s de la distorsion, et une h licase d'ADN enl ve l'oligonucl otide simple brin contenant la l sion. Le grand espace produit dans l'h lice de l'ADN est ensuite r par par l'ADN polym rase et l'ADN ligase (voir Figure 5-41B). Une alternative aux processus de r paration par excision de bases et de nucl otides est l'inversion chimique directe des dommages l'ADN, et cette strat gie est utilis e de mani re s lective pour l' limination rapide de certaines l sions hautement mutag nes ou cytotoxiques. Par exemple, la l sion d'alkylation O6-m thylguanine voit son groupe m thyle limin par transfert direct un r sidu cyst ine dans la prot ine de r paration elle-m me, qui est d truite dans la r action. Dans un autre exemple, les groupes m thyles dans les l sions d'alkylation 1-m thylad nine et 3-m thylcytosine sont br l s par une d m thylase d pendante du fer, avec lib ration de formald hyde partir de l'ADN m thyl et r g n ration de la base native. Le couplage de la r paration par excision de nucl otides la transcription garantit que l'ADN le plus important de la cellule est R par efficacement Tout l'ADN d'une cellule est sous surveillance constante pour d tecter les dommages, et les m canismes de r paration que nous avons d crits agissent sur toutes les parties du g nome. Cependant, les cellules ont un moyen de diriger la r paration de l'ADN vers les s quences d'ADN qui sont les plus n cessaires. Pour ce faire, ils associent l'ARN polym rase, l'enzyme qui transcrit l'ADN en ARN comme premi re tape de l'expression des g nes, la voie de r paration par excision de nucl otides. Comme nous l'avons vu ci-dessus, ce syst me de r paration peut corriger de nombreux types de dommages l'ADN. L'ARN polym rase se bloque au niveau des l sions de l'ADN et, gr ce l'utilisation de prot ines de couplage, dirige la machinerie de r paration de l'excision vers ces sites. Chez les bact ries, o les g nes sont relativement courts, l'ARN polym rase bloqu e peut tre dissoci e de l'ADN ; l'ADN est r par et le g ne est retranscrit depuis le d but. Chez les eucaryotes, o les g nes peuvent tre extr mement longs, une r action plus complexe est utilis e pour sauvegarder l'ARN polym rase, r parer les dommages, puis red marrer la polym rase. L'importance de la r paration par excision coupl e la transcription est observ e chez les personnes atteintes du syndrome de Cockayne, qui est caus par un d faut dans ce couplage. Ces personnes souffrent d'un retard de croissance, d'anomalies squelettiques, d'un retard neuronal progressif et d'une sensibilit s v re la lumi re du soleil. On pense que la plupart de ces probl mes proviennent de mol cules d'ARN polym rase qui sont bloqu es de fa on permanente sur des sites de dommages l'ADN qui se trouvent dans des g nes importants. La chimie des bases de l'ADN facilite la d tection des dommages La double h lice de l'ADN semble optimale pour la r paration. Comme indiqu ci-dessus, il contient une copie de sauvegarde de toutes les informations g n tiques. Tout aussi important, la nature des quatre bases de l'ADN rend tr s claire la distinction entre les bases intactes et endommag es. Par exemple, chaque v nement de d samination possible dans l'ADN produit une ba
Biologie moléculaire de la cellule	se non naturelle , qui peut tre directement reconnue et limin e par une glycosylase d'ADN sp cifique. L'hypoxanthine, par exemple, est la base de purine la plus simple capable de s'apparier sp cifiquement avec C, mais l'hypoxanthine est le produit de d samination directe de A (Figure 5-43A). L'ajout d'un deuxi me groupe amino l'hypoxanthine Figure 5 42 La reconnaissance d'un nucl otide inhabituel dans l'ADN par retournement de base. La famille d'enzymes ADN glycosylase reconna t des bases sp cifiques inappropri es dans la conformation montr e. Chacune de ces enzymes clive la liaison glycosyle qui relie une base reconnue particuli re (jaune) au sucre de base, l' liminant de l'ADN. (A) Mod le de b ton ; (B) mod le de remplissage d'espace. Figure 5 43 La d samination des nucl otides de l'ADN. Dans chaque cas, l'atome d'oxyg ne qui est ajout dans cette r action avec l'eau est color en rouge. (A) Les produits de d samination spontan e de A et G sont reconnaissables comme non naturels lorsqu'ils apparaissent dans l'ADN et sont donc facilement trouv s et r par s. La d samination de C U a galement t illustr e dans la figure 5-38 ; T n'a pas de groupe amino enlever. (B) Environ 3 % des nucl otides C de l'ADN des vert br s sont m thyl s pour aider contr ler l'expression des g nes (discut au chapitre 7). Lorsque ces nucl otides 5-m thyl C sont d samin s accidentellement, ils forment le nucl otide naturel T. Cependant, ce T sera associ un G sur le brin oppos , formant une paire de bases non appari es. produit G, qui ne peut pas tre form partir de A par d samination spontan e, et dont le produit de d samination (xanthine) est galement unique. Comme nous l'avons vu au chapitre 6, on pense que l'ARN, sur une chelle de temps volutive, a servi de mat riel g n tique avant l'ADN, et il semble probable que le code g n tique ait t initialement port dans les quatre nucl otides A, C, G et U. Cela soul ve la question de savoir pourquoi le U de l'ARN a t remplac dans l'ADN par du T (qui est du 5-m thylU). Nous avons vu que la d samination spontan e de C le convertit en U, mais que cet v nement est rendu relativement inoffensif par l'uracile ADN glycosylase. Cependant, si l'ADN contenait de l'U comme base naturelle, le syst me de r paration ne serait pas en mesure de distinguer un C d samorc d'un U naturel. Une situation particuli re se produit dans l'ADN des vert br s, dans laquelle des nucl otides C s lectionn s sont m thyl s des s quences CG sp cifiques associ es des g nes inactifs (voir le chapitre 7). La d samination accidentelle de ces nucl otides C m thyl s produit le nucl otide naturel T (Figure 5-43B) dans une paire de bases non appari es avec un G sur le brin d'ADN oppos . Pour aider r parer les nucl otides C m thyl s d samin s, une ADN glycosylase sp ciale reconna t une paire de bases non appari es impliquant T dans la s quence T-G et supprime le T. Ce m canisme de r paration de l'ADN doit cependant tre relativement inefficace, car les nucl otides C m thyl s sont des sites exceptionnellement courants pour les mutations dans l'ADN des vert br s. Il est frappant de constater que, m me si seulement environ 3 % des nucl otides C de l'ADN humain sont m thyl s, les mutations de ces nucl otides m thyl s repr sentent environ un tiers des mutations base unique observ es dans les maladies humaines h r ditaires. Si l'ADN d'une cellule subit de lourds dommages, les m canismes de r paration dont nous avons parl sont souvent insuffisants pour y faire face. Dans ces cas, une strat gie diff rente est mise en jeu, une strat gie qui comporte un certain risque pour la cellule. Les ADN polym rases r plicatives tr s pr cises se bloquent lorsqu'elles rencontrent de l'ADN endommag et, en cas d'urgence, les cellules utilisent des polym rases de secours polyvalentes, mais moins pr cises, appel es polym rases de transl sion, pour se r pliquer travers les dommages l'ADN. Les cellules humaines ont sept polym rases de transl sion, dont certaines peuvent reconna tre un type sp cifique de l sion de l'ADN et ajouter correctement le nucl otide n cessaire pour restaurer la s quence initiale. D'autres ne font que de bonnes suppositions , surtout lorsque la base du mod le a t consid rablement endommag e. Ces enzymes ne sont pas aussi pr cises que les polym rases r plicatives normales lorsqu'elles copient une s quence d'ADN normale. D'une part, les polym rases de transl sion manquent d'activit de relecture exonucl olytique ; De plus, beaucoup sont beaucoup moins discriminants que la polym rase r pliquative dans le choix du nucl otide incorporer initialement. C'est probablement pour cette raison que chacune de ces polym rases de transl sion a la possibilit d'ajouter seulement un ou quelques nucl otides avant que la polym rase r pliquative tr s pr cise ne reprenne la synth se de l'ADN. Malgr leur utilit pour permettre la r plication de l'ADN fortement endommag , ces polym rases de transl si
Biologie moléculaire de la cellule	on pr sentent, comme indiqu ci-dessus, des risques pour la cellule. Ils sont probablement responsables de la plupart des mutations de substitution de base et de d l tion d'un seul nucl otide qui s'accumulent dans les g nomes ; bien qu'ils produisent g n ralement des mutations lors de la copie d'ADN endommag (voir Figure 5-40), ils cr ent probablement aussi des mutations, un faible niveau, sur l'ADN non endommag . De toute vidence, il est important pour la cellule de r guler troitement ces polym rases, en ne les lib rant qu'aux sites de dommages l'ADN. Il reste d couvrir exactement comment cela se produit pour chaque polym rase de transl sion, mais un mod le conceptuel est donn dans la figure 5-44. Le principe de ce mod le s'applique de nombreux processus de r paration de l'ADN discut s dans ce chapitre : parce que les enzymes qui effectuent ces r actions sont potentiellement dangereuses pour le g nome, elles ne doivent tre mises en jeu qu'aux sites de dommage. Un type particuli rement dangereux de dommages l'ADN se produit lorsque les deux brins de la double h lice sont cass s, ne laissant aucun brin matrice intact pour permettre une Figure 5 44 Les ADN polym rases de transl sion peuvent utiliser des matrices endommag es. Selon ce mod le, une polym rase r pliquative bloqu e sur un site de l sion de l'ADN est reconnue par la cellule comme ayant besoin d' tre sauv e. Des enzymes sp cialis es modifient de mani re covalente la pince coulissante (typiquement, elle est ubiquityl e voir la figure 3-69) qui lib re l'ADN polym rase r pliquative et, avec l'ADN endommag , attire une transl sion polym rase sp cifique ce type de dommage. Une fois que l'ADN endommag est contourn , la modification covalente de la pince est supprim e, la polym rase de transl sion se dissocie et la polym rase r pliquative est remise en jeu. limination des modifications covalentes, rechargement de l'ADN polym rase r plicative, la synth se de l'ADN continue la r paration. Les rayonnements ionisants, les erreurs de r plication, les agents oxydants et d'autres m tabolites produits dans la cellule provoquent des ruptures de ce type. Si ces l sions n' taient pas r par es, elles entra neraient rapidement la d gradation des chromosomes en fragments plus petits et la perte de g nes lorsque la cellule se divise. Cependant, deux des m canismes ont volu pour faire face ce type de dommages (figures 5 45). La plus simple comprendre est la jonction d'extr mit non homologue, dans laquelle les extr mit s bris es sont simplement rassembl es et r unies par ligature de l'ADN, g n ralement avec la perte de nucl otides au site de jonction (Figure 5-46). Ce m canisme d'assemblage, qui peut tre consid r comme une solution rapide et sale la r paration des cassures double brin, est courant dans les cellules somatiques de mammif res. Bien qu'un changement dans la s quence d'ADN (une mutation) se produise au site de la rupture, si peu du g nome des mammif res est essentiel la vie que ce m canisme est apparemment une solution acceptable au probl me de la r unification des chromosomes bris s. Au moment o un humain atteint l' ge de 70 ans, la cellule somatique typique contient plus de 2000 cicatrices de ce type, r parties dans tout son g nome, repr sentant des endroits o l'ADN a t r par de mani re inexacte par une jonction d'extr mit non homologues. Mais la jonction d'extr mit s non homologues pr sente un autre danger : parce qu'il ne semble pas y avoir de m canisme pour s'assurer que deux extr mit s jointes taient l'origine c te c te dans le g nome, la jonction d'extr mit s non homologues peut parfois g n rer des r arrangements dans lesquels un chromosome bris devient attach de mani re covalente un autre. Cela peut se traduire par des chromosomes deux centrom res et des chromosomes d pourvus de centrom res ; les deux traitements du traitement des extr mit s 5 L'ADN se termine par la d l tion nucl ase des dommages de la s quence d'ADN r par s avec pr cision l'aide de chromatides s urs car les types de matrice des chromosomes aberrants sont mal s par s lors de la division cellulaire. Comme nous l'avons vu pr c demment, la structure sp cialis e des t lom res emp che les extr mit s naturelles des chromosomes d' tre confondues avec de l'ADN cass et d' tre r par es de cette mani re. Un type beaucoup plus pr cis de r paration des cassures double brin se produit dans l'ADN nouvellement r pliqu (Figure 5-45B). Ici, l'ADN est r par l'aide de la chromatide s ur comme mod le. Cette r action est un exemple de recombinaison homologue, et nous examinerons son m canisme plus loin dans ce chapitre. La plupart des organismes utilisent la fois la jonction d'extr mit s non homologues et la recombinaison homologue pour r parer les cassures double brin de l'ADN. La jonction d'extr mit s non homologues pr domine chez l'homme ; la recombinaison homologue n'est utilis e que pendant et peu de temps apr s la r plicat
Biologie moléculaire de la cellule	ion de l'ADN (dans les phases S et G2), lorsque des chromatides s urs sont disponibles pour servir de matrices. l'ADN r par a g n ralement subi une d l tion des nucl otides (A) Figure 5 45 Deux fa ons de r parer les cassures double brin. (A) La jonction d'extr mit non homologue modifie la s quence d'ADN d'origine lors de la r paration d'un chromosome cass . La d gradation initiale des extr mit s de l'ADN bris es est importante car les nucl otides au site de la cassure initiale sont souvent endommag s et ne peuvent pas tre ligatur s. La jonction d'extr mit s non homologues a g n ralement lieu lorsque les cellules n'ont pas encore dupliqu leur ADN. (B) La r paration des cassures double brin par recombinaison homologue est plus difficile accomplir, mais restaure la s quence d'ADN d'origine. Elle a g n ralement lieu apr s que l'ADN a t dupliqu (lorsqu'un mod le duplex est disponible) mais avant que la cellule ne se soit divis e. Les d tails de la voie de recombinaison homologue sont pr sent s dans la section suivante (voir Figure 5-48). Figure 5 46 Jonction d'extr mit non homologue. (A) Un r le central est jou par la prot ine Ku, un h t rodim re qui saisit les extr mit s des chromosomes bris s. Les prot ines suppl mentaires montr es sont n cessaires pour maintenir les extr mit s cass es ensemble pendant qu'elles sont trait es et finalement assembl es de mani re covalente. (B) Structure tridimensionnelle d'un h t rodim re Ku li l'extr mit d'un fragment d'ADN duplex. La prot ine Ku est galement essentielle la jonction de V(D)J, un processus de recombinaison sp cifique par lequel la diversit des anticorps et des r cepteurs des lymphocytes T est g n r e dans les lymphocytes B et T en d veloppement (voir le chapitre 24). La jonction V(D)J et la jonction d'extr mit non homologue pr sentent de nombreuses similitudes dans le m canisme, mais la premi re repose sur des cassures double brin sp cifiques produites d lib r ment par la cellule. (B, d'apr s J.R. Walker, R.A. Corpina et J. Goldberg, Nature 412:607-614, 2001. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) Les dommages l'ADN retardent la progression du cycle cellulaire Nous venons de voir que les cellules contiennent plusieurs syst mes enzymatiques capables de reconna tre et de r parer de nombreux types de dommages l'ADN (film 5.7). En raison de l'importance de conserver l'ADN intact et non endommag De g n ration en g n ration, les cellules eucaryotes ont un m canisme suppl mentaire qui maximise l'efficacit de leurs enzymes de r paration de l'ADN : elles retardent la progression du cycle cellulaire jusqu' ce que la r paration de l'ADN soit termin e. Comme nous l'avons vu en d tail au chapitre 17, la progression ordonn e du cycle cellulaire est arr t e si l'ADN endommag est d tect , et elle red marre lorsque les dommages ont t r par s. Ainsi, dans les cellules de mammif res, la pr sence de dommages l'ADN peut bloquer l'entr e de G1 dans la phase S, elle peut ralentir la phase S une fois qu'elle a commenc , et elle peut bloquer la transition de la phase G2 la phase M. Ces d lais facilitent la r paration de l'ADN en fournissant le temps n cessaire pour que la r paration soit termin e. Les dommages l'ADN entra nent galement une synth se accrue de certaines enzymes de r paration de l'ADN. Cette r ponse d pend de prot ines de signalisation sp ciales qui d tectent les dommages l'ADN et r gulent la hausse les enzymes de r paration de l'ADN appropri es. L'importance de ce m canisme est r v l e par le ph notype des humains qui naissent avec des d fauts dans le g ne qui code pour la prot ine ATM. Ces personnes sont atteintes de la maladie de l'ataxie t langiectasie (TA), dont les sympt mes comprennent une neurod g n rescence, une pr disposition au cancer et une instabilit du g nome. La prot ine ATM est une grande kinase n cessaire pour g n rer les signaux intracellulaires qui sonnent l'alarme en r ponse de nombreux types de dommages spontan s l'ADN (voir Figure 17-62), et les individus pr sentant des d fauts dans cette prot ine souffrent donc des effets de l sions d'ADN non r par es. L'information g n tique ne peut tre stock e de mani re stable dans les s quences d'ADN que parce qu'un grand nombre d'enzymes de r paration de l'ADN analysent en permanence l'ADN et remplacent les nucl otides endommag s. La plupart des types de r paration de l'ADN d pendent de la pr sence d'une copie distincte de l'information g n tique dans chacun des deux brins de la double h lice de l'ADN. Une l sion accidentelle sur un brin peut donc tre coup e par une enzyme de r paration et un brin corrig resynth tis par r f rence l'information contenue dans le brin non endommag . La plupart des dommages aux bases de l'ADN sont excis s par l'une des deux principales voies de r paration de l'ADN. Dans la r paration par excision de bases, la base alt r e est limin e par une enzyme ADN glycosylase, suivie d'une excision du phosphate de sucre
Biologie moléculaire de la cellule	r sultant. Dans la r paration par excision de nucl otides, une petite section du brin d'ADN entourant les dommages est retir e de la double h lice de l'ADN sous forme d'oligonucl otide. Dans les deux cas, l'espace laiss dans l'h lice de l'ADN est combl par l'action s quentielle de l'ADN polym rase et de l'ADN ligase, en utilisant le brin d'ADN non endommag comme matrice. Certains types de dommages l'ADN peuvent tre r par s par une strat gie diff rente, l'inversion chimique directe des dommages, qui est effectu e par des prot ines de r paration sp cialis es. Lorsque les dommages l'ADN sont excessifs, une classe sp ciale d'ADN polym rases impr cises, appel es polym rases de transl sion, est utilis e pour contourner les dommages, permettant la cellule de survivre mais cr ant parfois des mutations permanentes sur les sites des dommages. D'autres syst mes de r paration critiques, bas s sur l'assemblage d'extr mit s non homologues ou la recombinaison homologue, scellent les cassures doubles brin accidentelles qui se produisent dans l'h lice de l'ADN. Dans la plupart des cellules, un niveau lev de dommages l'ADN provoque un retard dans le cycle cellulaire, ce qui garantit que les dommages l'ADN sont r par s avant qu'une cellule ne se divise. Dans les deux sections pr c dentes, nous avons discut des m canismes qui permettent aux s quences d'ADN dans les cellules d' tre maintenues de g n ration en g n ration avec tr s peu de changements. Dans cette section, nous explorons plus en d tail l'un des m canismes de r paration de l'ADN, un ensemble diversifi de r actions connues collectivement sous le nom de recombinaison homologue. La caract ristique cl de la recombinaison homologue ( galement connue sous le nom de recombinaison g n rale) est un change de brins d'ADN entre une paire de s quences d'ADN duplex homologues, c'est- -dire des segments de double h lice qui sont tr s similaires ou identiques dans la s quence nucl otidique. Cet change permet un segment d'ADN duplex d'agir comme mod le pour restaurer des informations perdues ou endommag es sur un deuxi me segment d'ADN duplex. Parce que le mod le de r paration n'est pas limit au brin compl mentaire celui contenant les dommages, la recombinaison homologue peut r parer de nombreux types de dommages l'ADN. C'est, par exemple, le principal moyen de r parer avec pr cision les cassures double brin, comme pr sent dans la section pr c dente (voir Figure 5 45B). Les cassures double brin peuvent r sulter de radiations et de produits chimiques r actifs, mais la plupart du temps, elles r sultent de fourches de r plication de l'ADN qui se bloquent ou se brisent ind pendamment de toute cause externe. La recombinaison homologue corrige avec pr cision ces accidents et, parce qu'ils se produisent pendant pr s de chaque cycle de r plication de l'ADN, ce m canisme de r paration est essentiel pour chaque cellule prolif rante. La recombinaison homologue est peut- tre le m canisme de r paration de l'ADN le plus polyvalent disponible pour la cellule ; le caract re passe-partout de la r paration recombinatoire explique probablement pourquoi son m canisme et les prot ines qui l'ex cutent ont t conserv s dans pratiquement toutes les cellules de la Terre. De plus, nous verrons que la recombinaison homologue joue un r le particulier dans les organismes reproduction sexu e. Au cours de la m iose, une tape cl dans la production de gam tes (spermatozo des et ovules), elle catalyse l' change ordonn de bits d'information g n tique entre les chromosomes maternels et paternels correspondants (homologues) pour cr er de nouvelles combinaisons de s quences d'ADN dans les chromosomes transmis la prog niture. La vision actuelle de la recombinaison homologue en tant que m canisme critique de r paration de l'ADN dans toutes les cellules a volu lentement depuis sa d couverte initiale en tant qu' l ment cl du processus sp cialis de m iose chez les plantes et les animaux. La reconnaissance ult rieure que la recombinaison homologue se produit galement chez les organismes unicellulaires l'a rendue beaucoup plus propice aux analyses mol culaires. Ainsi, la plupart de ce que nous savons de la biochimie de la recombinaison g n tique provient l'origine d' tudes sur les bact ries, en particulier d'E. coli et de ses virus, ainsi que d'exp riences avec des eucaryotes simples tels que les levures. Pour ces organismes avec des temps de g n ration courts et des g nomes relativement petits, il a t possible d'isoler un grand nombre de mutants pr sentant des d fauts dans leurs processus de recombinaison. La prot ine alt r e chez chaque mutant a ensuite t identifi e et, finalement, tudi e biochimiquement. De proches parents de ces prot ines ont t trouv s chez des eucaryotes plus complexes, notamment des mouches, des souris et des humains, et plus r cemment, il a t possible d'analyser directement la recombinaison homologue chez ces esp ces galement. Ces tudes
Biologie moléculaire de la cellule	r v lent que les processus fondamentaux qui catalysent la recombinaison homologue sont communs toutes les cellules. La caract ristique de la recombinaison homologue est qu'elle n'a lieu qu'entre des duplex d'ADN qui ont des r gions tendues de similarit de s quence (homologie). Il n'est pas surprenant que l'appariement de bases sous-tend cette exigence, et que deux duplex d'ADN qui subissent une recombinaison homologue chantillonnent la s quence d'ADN de l'autre en s'engageant dans un appariement de bases tendu entre un brin simple d'un duplex d'ADN et le brin simple compl mentaire de l'autre. Il n'est pas n cessaire que la correspondance soit parfaite, mais elle doit tre tr s proche pour que la recombinaison homologue r ussisse. Dans sa forme la plus simple, ce type d'interaction d'appariement de bases peut tre imit dans un tube essai en permettant une double h lice d'ADN de se reformer partir de ses brins simples s par s. Ce processus, appel renaturation ou hybridation de l'ADN, se produit lorsqu'une collision al atoire rare juxtapose des s quences nucl otidiques compl mentaires sur deux brins simples d'ADN correspondants, permettant la formation d'un court tron on de double h lice entre eux. Cette tape h lice-nucl ation relativement lente est suivie d'une tape de fermeture clair tr s rapide, car la r gion de la double h lice est tendue pour maximiser le nombre d'interactions d'appariement de bases (Figure 5 47). L'hybridation de l'ADN peut cr er une r gion de double h lice d'ADN compos e de brins provenant de deux mol cules d'ADN duplex diff rentes, condition qu'elles soient compl mentaires, ou presque. Comme nous le verrons sous peu, la formation d'une telle mol cule hybride, connue sous le nom d'h t roduplex, est une caract ristique essentielle de la recombinaison homologue. L'hybridation de l'ADN et la formation d'h t roduplex sont galement la base de nombreuses m thodes utilis es pour tudier les cellules, et nous discuterons de ces utilisations au chapitre 8. L'ADN d'une cellule vivante est presque enti rement sous forme stable en double h lice, de sorte que la r action d crite dans la figure 5-47 se produit rarement in vivo. Au lieu de cela, comme nous le verrons, la recombinaison homologue est provoqu e par un ensemble de r actions soigneusement contr l es qui permettent deux duplex d'ADN d' chantillonner les s quences de l'autre sans se dissocier compl tement en brins uniques. Nous avons vu dans la section pr c dente que la jonction d'extr mit non homologue se produit sans matrice et laisse g n ralement une mutation au site o une cassure double brin est r par e. En revanche, la recombinaison homologue peut r parer les cassures double brin avec pr cision, sans aucune perte ou alt ration des nucl otides au site de r paration. Pour que la recombinaison homologue fasse ce travail de r paration, l'ADN bris doit tre apport proximit d'un ADN homologue mais ininterrompu, qui peut servir de mod le pour la r paration. Pour cette raison, la recombinaison homologue se produit souvent juste apr s la r plication de l'ADN, lorsque les deux mol cules d'ADN filles sont proches l'une de l'autre et que l'une peut servir de mod le pour la r paration de l'autre. Comme nous le verrons, le processus de r plication de l'ADN lui-m me cr e un risque particulier d'accidents n cessitant ce type de r paration. La voie la plus simple par laquelle la recombinaison homologue peut r parer les cassures double brin est illustr e la figure 5-48. Essentiellement, le duplex d'ADN bris et le duplex matrice effectuent une danse des brins de sorte que l'un des brins endommag s peut utiliser le brin compl mentaire du duplex d'ADN intact comme matrice pour la r paration. Tout d'abord, les extr mit s de l'ADN bris sont m ch es, ou r s qu es , par des nucl ases sp cialis es pour produire des extr mit s 3 monobrin en surplomb. L' tape suivante est l' change de brins ( galement appel invasion de brins), au cours de laquelle l'une des extr mit s 3 monocat naires de la mol cule d'ADN endommag e se fraye un chemin dans le duplex matrice et la recherche de s quences homologues par appariement de bases. Nous d crivons en d tail cette r action remarquable dans la section suivante. Une fois que l'appariement stable des bases est tabli (ce qui termine l' tape d' change de brins), une ADN polym rase pr cise tend le brin envahisseur en utilisant les informations fournies par la mol cule matrice non endommag e, restaurant ainsi l'ADN endommag . Les derni res tapes d placement des brins, synth se de r paration suppl mentaire et ligature restaurent les deux doubles h lices d'ADN d'origine et terminent le processus de r paration. La recombinaison homologue ressemble d'autres r actions de r paration de l'ADN en ce qu'une Figure 5 47 Hybridation de l'ADN. Les doubles h lices d'ADN peuvent se reformer partir de leurs brins s par s dans une r action qui d pend de la collision al atoire d
Biologie moléculaire de la cellule	e deux brins d'ADN compl mentaires. La grande majorit de ces collisions ne sont pas productives, comme le montre la gauche, mais quelques-unes aboutissent une r gion courte o des paires de bases compl mentaires se sont form es (nucl ation en h lice). Une fermeture clair rapide conduit ensuite la formation d'une double h lice compl te. Gr ce ce processus d'essais et d'erreurs, un brin d'ADN trouvera son partenaire compl mentaire m me au milieu de millions de brins d'ADN non correspondants. L'ADN polym rase utilise une matrice vierge pour restaurer l'ADN endommag . Cependant, au lieu d'utiliser le brin compl mentaire partenaire comme matrice, comme cela se produit dans la plupart des voies de r paration de l'ADN, la recombinaison homologue exploite un brin compl mentaire partir d'un duplex d'ADN distinct. L' change de brins est effectu par la prot ine RecA/Rad51 De toutes les tapes de la recombinaison homologue, l' change de brins est la plus difficile imaginer. Comment le simple brin envahisseur chantillonne-t-il rapidement un duplex d'ADN pour l'homologie ? Une fois l'homologie trouv e, comment l' change se produit-il ? Comment la stabilit inh rente la double h lice du mod le est-elle surmont e ? Les r ponses ces questions sont venues d' tudes biochimiques et structurales de la prot ine qui r alise ces exploits, appel e RecA chez E. coli et Rad51 chez pratiquement tous les organismes eucaryotes. Pour catalyser l' change de brins, RecA se lie d'abord de mani re coop rative au brin unique envahisseur, formant un filament prot ine-ADN qui force l'ADN dans une configuration inhabituelle : des groupes de trois nucl otides cons cutifs sont maintenus comme s'ils taient dans une double h lice d'ADN conventionnelle mais, entre les triplets adjacents, le squelette de l'ADN est d tordu et tir (Figure 5-49). Ce filament prot ine-ADN inhabituel se lie ensuite l'ADN duplex Figure 5 48 M canisme de r paration des cassures double brin par recombinaison homologue. Il s'agit de la m thode privil gi e pour r parer les cassures double brin de l'ADN qui se produisent peu de temps apr s la r plication de l'ADN, alors que les mol cules d'ADN filles sont toujours maintenues proches les unes des autres. En g n ral, la recombinaison homologue peut tre consid r e comme une s rie flexible de r actions, le chemin exact diff rant d'un cas l'autre. Par exemple, la dur e du patch de r paration peut varier consid rablement en fonction de l' tendue du traitement 5 et de la nouvelle synth se de l'ADN, indiqu e en vert. d'une mani re qui tire le duplex, le d stabilise et facilite la s paration des brins. Le simple brin envahisseur peut alors chantillonner la s quence du duplex par appariement de bases conventionnel. Ceci L' chantillonnage se produit dans des blocs de nucl otides tripl s : si une correspondance de triplet est trouv e, le triplet adjacent est chantillonn , et ainsi de suite. De cette fa on, les m sappariements conduisent rapidement la dissociation et seule une extension prolong e de l'appariement des bases (au moins 15 nucl otides) stabilise le brin envahisseur et conduit l' change de brins. RecA hydrolyse l'ATP, et les tapes d crites ci-dessus n cessitent que chaque monom re RecA le long du filament soit dans l' tat li l'ATP. Cependant, la recherche elle-m me ne n cessite pas d'hydrolyse de l'ATP ; Au lieu de cela, le processus se produit par simple collision mol culaire, ce qui permet d' chantillonner rapidement de nombreuses s quences potentielles. Cependant, une fois la r action d' change de brins termin e, l'hydrolyse de l'ATP est n cessaire pour d sassembler RecA du complexe de mol cules d'ADN. ce stade, l'ADN polym rase et l'ADN ligase de r paration peuvent compl ter le processus de r paration, comme le montre la figure 5-48. Bien que la r paration pr cise des cassures double brin, qui peuvent r sulter de radiations ou de r actions chimiques, soit une fonction cruciale de la recombinaison homologue, son r le le plus important est peut- tre de sauver les fourches de r plication de l'ADN bloqu es ou cass es. De nombreux types d' v nements peuvent provoquer la rupture d'une fourche de r plication, et nous ne consid rons ici qu'un seul exemple : une entaille ou un trou d'un seul brin dans l'h lice de l'ADN parental juste avant une fourche de r plication. Lorsque la fourche atteint cette l sion, elle se d sagr ge, ce qui entra ne la rupture d'un chromosome fille intact. La fourche cass e peut tre r par e sans probl me (Figure 5-50) en utilisant les m mes r actions de recombinaison homologue de base que nous avons d crites ci-dessus pour la r paration des cassures double brin. Avec de l g res modifications, l'ensemble des r actions d crites dans les figures 5-48 et 5-50 - connu collectivement sous le nom de recombinaison homologue - peut r parer avec pr cision de nombreux types diff rents de dommages l'ADN. Les cellules r gulent soigneusement l'utilisation de la recom
Biologie moléculaire de la cellule	binaison homologue dans la r paration de l'ADN Bien que la recombinaison homologue r solve parfaitement le probl me de la r paration pr cise des cassures double brin et d'autres types de dommages l'ADN, elle pr sente Figure 5 49 Invasion des brins catalys e par la prot ine RecA. Notre compr hension de cette r action repose en partie sur des structures d termin es par des tudes de diffraction des rayons X de RecA li de l'ADN simple et double brin. Ces structures d'ADN (illustr es sans la prot ine RecA) se trouvent sur le c t gauche du sch ma. En commen ant par le haut, RecA li l'ATP s'associe l'ADN monocat naire, le maintenant sous une forme allong e o des groupes de trois bases sont s par s les uns des autres par une colonne vert brale tir e et tordue. Dans l' tape suivante, le brin simple li RecA se lie ensuite l'ADN duplex, ce qui le d stabilise et permet au brin unique d' chantillonner sa s quence par appariement de bases, trois bases la fois. Si aucune correspondance n'est trouv e, le brin d'ADN li RecA se dissocie rapidement et commence une nouvelle recherche. Si une correspondance tendue est trouv e, la structure est d sassembl e par hydrolyse de l'ATP, ce qui entra ne la dissociation de RecA et l' change d'un seul brin d'ADN contre un autre, formant ainsi un h t roduplex. (Code PDB : 3CMX.) Figure 5 50 R paration d'une fourche de r plication cass e par recombinaison homologue. Lorsqu'une fourche de r plication mobile rencontre une rupture simple brin, elle s'effondre, mais peut tre r par e par recombinaison homologue. Le processus utilise bon nombre des r actions illustr es la figure 5-48 et suit les m mes tapes de base. Les brins verts repr sentent la nouvelle synth se de l'ADN qui a lieu apr s la rupture de la fourche de r plication. Ce chemin permet la fourche de d passer le site qui a t entaill sur le mod le d'origine en utilisant le duplex non endommag comme mod le pour synth tiser l'ADN. (Adapt de M.M. Cox, Proc. Natl Acad. Sci. USA 98:8173 8180, 2001. Avec l'autorisation de l'Acad mie nationale des sciences.) certains dangers pour la cellule car elle r pare parfois les dommages en utilisant le mauvais morceau du g nome comme mod le. Par exemple, il arrive qu'un chromosome humain cass soit r par l'aide de l'homologue de l'autre parent au lieu de la chromatide s ur comme mod le. tant donn que la s quence de s quence d'ADN des chromosomes maternel et paternel diff re de nombreuses positions le long de leur longueur, ce type de r paration peut convertir la s quence de l'ADN r par de la s quence maternelle la s quence paternelle ou vice versa. Le r sultat de ce type de recombinaison errante est connu sous le nom de perte d'h t rozygotie. Cela peut avoir de graves cons quences si l'homologue utilis pour la r paration contient une mutation d l t re, car l' v nement de recombinaison d truit la bonne copie. La perte d'h t rozygotie, bien que rare, est une tape critique dans la formation de nombreux cancers (discut e dans Chapitre 20). Les cellules se donnent beaucoup de mal pour minimiser le risque d'accidents de ce type ; En effet, presque toutes les tapes de la recombinaison homologue sont soigneusement r glement es. Par exemple, la premi re tape, le traitement des extr mit s cass es, est coordonn e avec le cycle cellulaire : les enzymes nucl ases qui effectuent ce processus ne sont activ es (en partie, par phosphorylation) que dans les phases S et G2 du cycle cellulaire, lorsqu'un duplex fille (soit sous la forme d'un chromosome partiellement r pliqu , soit d'une chromatide s ur enti rement r pliqu e) peut servir de mod le pour la r paration (voir Figure 5-50). La proximit des deux chromosomes filles d favorise l'utilisation d'autres s quences g nomiques dans le processus de r paration. La charge de RecA ou de Rad52 sur les extr mit s de l'ADN trait et la r action d' change de brins qui s'ensuit sont galement troitement contr l es. Bien que ces prot ines puissent elles seules effectuer ces tapes in vitro, une s rie de prot ines accessoires, dont Rad52, est n cessaire dans les cellules eucaryotes pour garantir l'efficacit et la pr cision de la recombinaison homologue (Figure 5 51). Il existe de nombreuses prot ines accessoires de ce type, et la fa on exacte dont elles coordonnent et contr lent la recombinaison homologue reste un myst re. Nous savons que les enzymes qui catalysent la r paration recombinatoire sont produites des niveaux relativement lev s chez les eucaryotes et sont dispers es dans tout le noyau sous une forme inactive. En r ponse aux dommages l'ADN, elles convergent rapidement vers les sites de dommages l'ADN, s'activent et forment des usines de r paration o de nombreuses l sions sont apparemment rassembl es et r par es (Figure 5-52). Dans le chapitre 20, nous verrons que trop et trop peu de recombinaison homologue peuvent conduire au cancer chez l'homme, la premi re par r paration l'aide de la
Biologie moléculaire de la cellule	mauvaise matrice (comme d crit ci-dessus) et la seconde par une augmentation du taux de mutation caus e par une r paration inefficace de l'ADN. De toute vidence, un quilibre d licat s'est mis en place pour contr ler ce processus sur l'ADN non endommag , tout en lui permettant d'agir efficacement et rapidement sur les l sions d'ADN d s qu'elles se pr sentent. Il n'est pas surprenant que des mutations dans les composants qui effectuent et r gulent la recombinaison homologue soient responsables de plusieurs formes h r ditaires de cancer. Deux d'entre elles, les prot ines Brca1 et Brca2, ont t d couvertes pour la premi re fois parce que Figure 5 51 Structure d'une partie de la prot ine Rad52. Cette structure en forme de beignet est compos e de 11 sous-unit s. L'ADN monocat naire a t mod lis dans le sillon profond qui longe la surface de la prot ine. Rad52 aide charger Rad51 sur l'ADN simple brin pour former le filament de nucl oprot ine qui effectue l' change de brins. Rad52 agit galement plus tard pour reformer la double h lice et compl ter la r action de recombinaison homologue. (Extrait de M.R. Singleton et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:13492 13497, 2002. Avec l'autorisation de l'Acad mie nationale des sciences.) Des mutations dans leurs g nes entra nent une augmentation consid rable de la fr quence du cancer du sein. Parce que ces mutations provoquent une r paration inefficace par recombinaison homologue, l'accumulation de dommages l'ADN peut, dans une petite proportion de cellules, donner naissance un cancer. Brca1 r gule une tape pr coce du traitement des pointes cass es ; sans lui, ces extr mit s ne sont pas trait es correctement pour la recombinaison homologue et sont r par es de mani re inexacte par la voie d'assemblage des extr mit s non homologues (voir Figure 5-45). Brca2 se lie la prot ine Rad51, emp chant sa polym risation sur l'ADN, et la maintenant ainsi sous une forme inactive jusqu' ce qu'elle soit n cessaire. Normalement, en cas de dommages l'ADN, Brca2 aide amener rapidement la prot ine Rad51 vers les sites endommag s et, une fois en place, la lib rer sous sa forme active sur l'ADN simple brin. Nous avons vu que la recombinaison homologue comprend un groupe de r actions, y compris le traitement des extr mit s cass es, l' change de brins, la synth se limit e de l'ADN et la ligature, pour changer des s quences d'ADN entre deux doubles h lices de s quence nucl otidique similaire. Apr s avoir discut de son r le dans la r paration pr cise de l'ADN endommag , nous nous tournons maintenant vers la recombinaison homologue comme moyen de g n rer des mol cules d'ADN qui portent de nouvelles combinaisons de g nes la suite de l' change d lib r de mat riel entre diff rents chromosomes. Bien que cela se produise parfois par accident dans les cellules mitotiques (et soit souvent pr judiciable), il est Une partie fr quente et n cessaire de la m iose, qui se produit chez les organismes reproduction sexu e tels que les champignons, les plantes et les animaux. Ici, la recombinaison homologue fait partie int grante du processus par lequel les chromosomes sont r partis en cellules germinales (spermatozo des et ovules chez les animaux). Nous discutons en d tail du processus de m iose au chapitre 17 ; Dans les sections suivantes, nous expliquons comment la recombinaison homologue au cours de la m iose produit le croisement chromosomique et la conversion g nique, ce qui donne des chromosomes hybrides contenant des informations g n tiques provenant la fois des homologues maternels et paternels (Figure 5-53). Le crossing-over et la conversion g nique sont tous deux g n r s par des m canismes de recombinaison homologue qui, la base, ressemblent ceux utilis s pour r parer les cassures double brin. La recombinaison m iotique commence par une rupture double brin programm e La recombinaison homologue dans la m iose commence par un trait audacieux : une prot ine sp cialis e (appel e Spo11 chez la levure bourgeonnante) brise les deux brins de la double h lice de l'ADN dans l'un des chromosomes recombinants (Figure 5-54). Comme une topoisom rase, Spo11, apr s avoir catalys cette r action, reste li de mani re covalente au site bris du site du g ne du croisement de conversion Figure 5 52 Exp rience d montrant la localisation rapide des prot ines de r paration des cassures double brin de l'ADN. Des fibroblastes humains ont t irradi s par l'X pour produire des cassures double brin de l'ADN. Avant que les rayons X ne frappent les cellules, elles ont t travers es travers une grille microscopique avec des barres absorbant les rayons X espac es de 1 m. Cela a produit un motif ray de dommages l'ADN, permettant une comparaison de l'ADN endommag et non endommag dans le m me noyau. (A) ADN total dans un noyau de fibroblaste color avec le colorant DAPI. (B) Sites de synth se de l'ADN nouveau d la r paration de dommages l'ADN, indiqu s par l'incorporation de B
Biologie moléculaire de la cellule	udR (un analogue de la thymidine) et la coloration ult rieure avec des anticorps marqu s par fluorescence contre BudR (vert). (C) Localisation du complexe Mre11 dans l'ADN endommag telle que visualis e par les anticorps contre la sous-unit Mre11 (rouge). Mre11 est une nucl ase qui traite l'ADN endommag en pr paration de la recombinaison homologue (voir Figure 5-48). (A), (B) et (C) ont t trait s 30 minutes apr s l'irradiation par rayons X. (D'apr s B.E. Nelms et al., Science 280:590-592, 1998. Avec l'autorisation de l'AAAS.) Figure 5 53 Le croisement chromosomique se produit dans la m iose. La m iose est le processus par lequel une cellule diplo de donne naissance quatre cellules germinales haplo des, comme d crit en d tail au chapitre 17. La m iose produit des cellules germinales dans lesquelles les informations g n tiques paternelle et maternelle (rouge et bleu) ont t r assorties par des croisements de chromosomes. De plus, de nombreuses r gions courtes de conversion g nique se produisent, comme indiqu . Figure 5 54 La recombinaison homologue au cours de la m iose peut g n rer des croisements de chromosomes. Une fois que la prot ine sp cifique de la m iose Spo11 et le complexe Mre11 cassent l'ADN duplex et traitent les extr mit s, la recombinaison homologue peut se poursuivre le long de voies alternatives. L'un d'eux (c t droit de la figure) ressemble beaucoup la r action de r paration de la cassure double brin illustr e la figure 5-48 et aboutit des chromosomes qui ont t r par s mais n'ont pas t crois s. L'autre (c t gauche avec des cassures de brins comme indiqu par les fl ches bleues) passe par une double jonction de Holliday et produit deux chromosomes qui se sont crois s. Au cours de la m iose, une recombinaison homologue a lieu entre les homologues des chromosomes maternels et paternels lorsqu'ils sont maintenus troitement ensemble (voir Figure 17 54). ADN (voir Figure 5 21). Une nucl ase sp cialis e d grade ensuite rapidement les extr mit s li es par Spo11, liminant la prot ine ainsi que l'ADN et laissant 3 extr mit s monocat naires saillantes. ce stade, de nombreuses r actions de recombinaison ressemblent celles d crites ci-dessus pour la r paration des cassures double brin ; En effet, certaines des m mes prot ines sont utilis es pour les deux processus. Cependant, plusieurs prot ines sp cifiques de la m iose les dirigent pour effectuer leurs t ches quelque peu diff remment, ce qui entra ne les r sultats distinctifs observ s pour la m iose. Une autre diff rence importante est que, dans la m iose, la recombinaison se produit de pr f rence entre les homologues chromosomiques maternels et paternels plut t qu'entre les duplex d'ADN identiques nouvellement r pliqu s qui s'apparient dans la r paration des cassures double brin. Dans les sections qui suivent, nous d crivons plus en d tail les aspects de la recombinaison homologue qui sont particuli rement importants pour la m iose. Un interm diaire connu sous le nom de jonction de Holliday ou d' change de brins crois s est d'une importance particuli re dans la m iose (Figure 5 55). Chaque jonction de Holliday peut adopter plusieurs conformations et un ensemble sp cial de prot ines de recombinaison se lie l'isom re ouvert et sym trique et le stabilise ainsi. Les prot ines sp cialis es qui se lient aux jonctions de Holliday peuvent catalyser une r action connue sous le nom de migration de branche (Figure 5-56), par laquelle l'ADN est enroul travers la jonction de Holliday en brisant et en reformant continuellement des paires de bases (Figure 5-57). De cette fa on, les prot ines de jonction Holliday utilisent l'hydrolyse de l'ATP pour tendre la r gion de l'ADN h t roduplex initialement cr e par la r action d' change de brins. Dans la m iose, les r gions h t roduplex migrent souvent des milliers de nucl otides partir du site d'origine de la rupture double brin. Comme le montre la figure 5-54, les jonctions de Holliday se produisent g n ralement par paires, appel es jonctions de Holliday doubles. Comme le montre la figure 5 54, la recombinaison homologue a deux r sultats fondamentaux au cours de la m iose. Chez l'homme, environ 90 % des cassures double brin produites au cours de la m iose sont r solues comme des non-croisements (voir le c t droit de la figure 5-54). Ici, les deux duplex d'ADN d'origine se s parent l'un de l'autre sous une forme inalt r e, l'exception d'une r gion d'h t roduplex qui s'est form e pr s du site de la cassure double brin d'origine. Cet ensemble de r actions ressemble celui d crit ci-dessus pour la r paration des cassures double brin (voir Figure 5 48). L'autre r sultat est plus profond : une double jonction Holliday est form e et est cliv e par des enzymes sp cialis es pour cr er un croisement (voir le c t gauche de la figure 5-54). Les deux parties originales de chaque chromosome en amont et en aval Figure 5 55 A Jonction Holliday. La structure initialement form e (A)
Biologie moléculaire de la cellule	est g n ralement dessin e avec deux brins qui se croisent, comme sur la figure 5-54. Une isom risation de la jonction Holliday produit une structure ouverte et sym trique qui est li e par des prot ines sp cialis es. Ces prot ines d placent les jonctions de Holliday par un ensemble coordonn de r actions de migration de branches (voir Figure 5-57 et Vid o 5.8). (D) Structure de la jonction de Holliday dans la forme ouverte repr sent e en (B). La jonction Holliday porte le nom du scientifique qui a t le premier proposer sa formation. (Code PDB : 1DCW.) Direction de la migration des branches Figure 5 56 Vue simplifi e de la migration de branche. Dans la migration de branche, les paires de bases sont continuellement rompues et form es au fur et mesure que le point de branche se d place. Bien que la migration des branches puisse se produire spontan ment sur des mol cules d'ADN nues, le processus est inefficace et la branche se d place d'avant en arri re au hasard. Dans la cellule, la migration des branches est effectu e l'aide de prot ines sp cialis es et de l'hydrolyse de l'ATP pour s'assurer que, comme indiqu , la branche se d place rapidement et dans une direction. Comme le montre la figure 5-57, les migrations de branches se produisent souvent aux jonctions de Holliday, o deux r actions de migration de branches sont coupl es. Figure 5 57 Mouvement des branches catalys par des enzymes une jonction Holliday par migration des branches. Chez E. coli, un t tram re de la prot ine RuvA (vert) et deux hexam res de la prot ine RuvB (jaune) se lient la forme ouverte de la jonction. La prot ine RuvB, qui ressemble aux h licases hexam res utilis es dans la r plication de l'ADN (Figure 5-14), utilise l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP pour enrouler rapidement l'ADN travers la jonction de Holliday, tendant ainsi la r gion h t roduplex comme indiqu . La prot ine RuvA coordonne ce mouvement, enfilant les brins d'ADN pour viter l'enchev trement. (Codes PDB : 1IXR, 1C7Y.) des deux jonctions de Holliday sont ainsi chang es, cr ant deux chromosomes qui se sont crois s. Comment la cellule d cide-t-elle quelles cassures double brin induites par Spo11 se r solvent en tant que croisements ? La r ponse n'est pas encore connue, mais nous savons que la d cision est importante. Les croisements relativement peu nombreux qui se forment sont r partis le long des chromosomes de telle sorte qu'un croisement dans une position inhibe le croisement dans les r gions voisines. Appel contr le de croisement, ce m canisme de r gulation fascinant mais mal compris assure la distribution peu pr s uniforme des points de croisement le long des chromosomes. Il garantit galement que chaque chromosome, aussi petit soit-il, subit au moins un croisement chaque m iose. Pour de nombreux organismes, environ deux croisements par chromosome se produisent au cours de chaque m iose, un sur chaque bras. Comme nous l'avons vu en d tail au chapitre 17, ces croisements jouent un r le m canique important dans la bonne s gr gation des chromosomes pendant la m iose. Qu'un v nement de recombinaison m iotique soit r solu comme un croisement ou un non-croisement, la machinerie de recombinaison laisse derri re elle une r gion h t roduplex o un brin avec la s quence d'ADN de l'homologue paternel est appari une base avec un brin de l'homologue maternel (Figure 5-58). Ces r gions h t roduplex peuvent tol rer un petit pourcentage de paires de bases non appari es et, en raison de la migration des branches, elles s' tendent souvent des milliers de paires de nucl otides. Les nombreux v nements non crois s qui se produisent dans la m iose produisent ainsi des sites dispers s dans les cellules germinales o de courtes s quences d'ADN d'un homologue ont t coll es dans l'autre homologue. Les r gions h t roduplex marquent les sites de conversion g nique potentielle, o les quatre chromosomes haplo des produits par la m iose contiennent trois copies d'une s quence d'ADN d'un homologue et une seule copie de cette s quence de l'autre homologue (voir Figure 5-53), comme expliqu ci-dessous. Figure 5 58 H t roduplex form s au cours de la m iose. L'ADN h t roduplex est pr sent aux sites de recombinaison qui sont r solus soit sous forme de croisements, soit de non-croisements. Parce que les s quences d'ADN des chromosomes maternels et paternels diff rent de nombreuses positions le long de leurs longueurs, les h t roduplex contiennent souvent un petit nombre de m sappariements de paires de bases. Figure 5 59 Conversion g nique caus e par la correction des m sappariements. Dans ce processus, l'ADN h t roduplex se forme aux sites de recombinaison homologue entre les chromosomes maternels et paternels. Si les s quences d'ADN maternel et paternel sont l g rement diff rentes, la r gion h t roduplex comprendra des paires de bases non appari es, qui peuvent ensuite tre corrig es par la machinerie de r paration des m sappariements d'ADN (voir Figure 5-19)
Biologie moléculaire de la cellule	. Une telle r paration peut effacer les s quences nucl otidiques sur le brin paternel ou maternel. La cons quence de cette r paration de m sappariement est la conversion g nique, d tect e comme une d viation de la s gr gation de copies gales des all les maternels et paternels qui se produit normalement dans la m iose. Chez les organismes reproduction sexu e, c'est une loi fondamentale de la g n tique que, l'exception de l'ADN mitochondrial, qui n'est h rit que par la m re, chaque parent apporte une contribution g n tique gale une prog niture. Un ensemble complet de g nes nucl aires est h rit du p re et un ensemble complet est h rit de la m re. Cette loi sous-tend la r partition pr cise des chromosomes vers les cellules germinales (ovules et spermatozo des) qui a lieu pendant la m iose. Ainsi, lorsqu'une cellule diplo de d'un parent subit une m iose pour produire quatre cellules germinales haplo des, exactement la moiti des g nes r partis entre ces quatre cellules devraient tre maternels (g nes h rit s de la m re de ce parent) et l'autre moiti paternelle (g nes h rit s du p re de ce parent). Chez certains organismes (les champignons, par exemple), il est possible de r cup rer et d'analyser les quatre gam tes haplo des produits partir d'une seule cellule par m iose. Des tudes sur de tels organismes ont r v l de rares cas dans lesquels le morcellement des g nes viole les r gles g n tiques standard. Parfois, par exemple, la m iose produit trois copies de la version maternelle d'un g ne et une seule copie de l'all le paternel. Les versions alternatives du m me g ne sont appel es all les, et c'est la divergence par rapport leur distribution attendue au cours de la m iose qui est connue sous le nom de conversion g nique. Des tudes g n tiques montrent que seules de petites sections de l'ADN subissent g n ralement une conversion g nique et, dans de nombreux cas, seule une partie d'un g ne est modifi e. Plusieurs voies dans la cellule peuvent conduire la conversion g nique, mais l'une des plus importantes d coule d'une cons quence particuli re de la recombinaison au cours de la m iose. Nous avons vu que les croisements et les non-croisements produisent des r gions h t roduplex de l'ADN. Si les deux brins qui composent une r gion h t roduplex n'ont pas de s quences nucl otidiques identiques, des paires de bases non appari es se forment, et celles-ci sont souvent r par es par le syst me de r paration des m sappariements de la cellule (voir Figure 5 19). Cependant, le syst me de r paration des m sappariements ne peut pas faire la distinction entre les brins paternel et maternel et choisira au hasard le brin utiliser comme mod le. En cons quence, un all le sera perdu et l'autre dupliqu (Figure 5-59), ce qui entra nera une conversion nette d'un all le l'autre. Ainsi, la conversion g nique, consid r e l'origine comme une myst rieuse d viation des r gles de la g n tique, peut tre consid r e comme une simple cons quence des m canismes de recombinaison homologue. La recombinaison homologue d crit un ensemble flexible de r actions aboutissant l' change de s quences d'ADN entre une paire de mol cules d'ADN duplex identiques ou presque identiques. Dans toutes les cellules, ce processus est essentiel pour la r paration sans erreur des dommages chromosomiques, en particulier les cassures double brin et les fourches de r plication cass es ou bloqu es. La recombinaison homologue est galement responsable du croisement des chromosomes qui se produit pendant la m iose. La recombinaison homologue se produit par diverses voies, mais elles ont en commun une tape d' change de brins par laquelle un seul brin d'un duplex d'ADN envahit un second duplex et des paires de bases avec un brin tout en d pla ant l'autre. Cette r action, catalys e par la famille de prot ines RecA/Rad51, ne peut se produire que si le brin envahisseur peut former une courte s rie de paires de nucl otides cons cutives avec l'un des brins du duplex. Cette exigence garantit que la recombinaison homologue ne se produit qu'entre des s quences d'ADN identiques ou tr s similaires. LA SYNTH SE DE L'ADN COMBLE LE VIDE, CR ANT UNE COPIE SUPPL MENTAIRE DE L'ALL LE ROUGE DE Lorsqu'il est utilis comme m canisme de r paration, la recombinaison homologue se produit entre une mol cule d'ADN endommag e et sa mol cule s ur r cemment dupliqu e, le duplex non endommag agissant comme un mod le pour r parer la copie endommag e sans probl me. Dans la m iose, la recombinaison homologue est initi e par des cassures double brin d lib r es et soigneusement r gul es et se produit pr f rentiellement entre les chromosomes homologues plut t que les chromatides s urs nouvellement r pliqu es. Le r sultat peut tre soit deux chromosomes qui se sont crois s (c'est- -dire des chromosomes dans lesquels l'ADN de chaque c t du site d'appariement de l'ADN provient de deux homo-logs diff rents) ou deux chromosomes non crois s. Dans ce dernier cas, les deux
Biologie moléculaire de la cellule	chromosomes qui en r sultent sont identiques aux deux homologues d'origine, l'exception de modifications relativement mineures de la s quence d'ADN au site de recombinaison. Nous avons vu que la recombinaison homologue peut entra ner l' change de s quences d'ADN entre les chromosomes. Cependant, l'ordre des g nes sur les chromosomes en interaction reste g n ralement le m me apr s la recombinaison homologue, dans la mesure o les s quences de recombinaison doivent tre tr s similaires pour que le processus se produise. Dans cette section, nous d crivons deux types de recombinaison tr s diff rents : la transposition ( galement appel e recombinaison transpositionnelle) et la recombinaison conservatrice sp cifique au site, qui ne n cessitent pas de r gions substantielles d'homologie d'ADN. Ces deux types de r actions de recombinaison peuvent modifier l'ordre des g nes le long d'un chromosome et peuvent provoquer des types inhabituels de mutations qui introduisent des blocs entiers de s quences d'ADN dans le g nome. La transposition et la recombinaison conservatrice sp cifique au site sont en grande partie d di es au d placement d'une grande vari t de segments sp cialis s d'ADN collectivement appel s l ments g n tiques mobiles d'une position dans un g nome une autre. Nous verrons que la taille des l ments g n tiques mobiles peut varier de quelques centaines des dizaines de milliers de paires de nucl otides, et que chacun porte g n ralement un ensemble unique de g nes. Souvent, l'un de ces g nes code pour une enzyme sp cialis e qui catalyse le mouvement de cet l ment seulement, rendant ainsi ce type de recombinaison possible. Pratiquement toutes les cellules contiennent des l ments g n tiques mobiles (connus officieusement sous le nom de g nes sautants ). Comme expliqu au chapitre 4, au cours des chelles de temps de l' volution, ils ont eu un effet profond sur la formation des g nomes modernes. Par exemple, pr s de la moiti du g nome humain peut tre attribu e ces l ments (voir Figure 4-62). Au fil du temps, des mutations al atoires ont modifi leurs s quences nucl otidiques et, par cons quent, seulement quelques-uns des de nombreuses copies de ces l ments de notre ADN sont encore actives et capables de se d placer. Le reste sont des fossiles mol culaires dont l'existence fournit des indices frappants sur notre histoire volutive. Les l ments g n tiques mobiles sont souvent consid r s comme des parasites mol culaires (ils sont galement appel s ADN go ste ) qui persistent parce que les cellules ne peuvent pas s'en d barrasser ; Ils ont certainement failli envahir notre propre g nome. Cependant, les l ments d'ADN mobiles peuvent apporter des avantages la cellule. Par exemple, les g nes qu'ils portent sont parfois avantageux, comme dans le cas de la r sistance aux antibiotiques dans les cellules bact riennes, discut e ci-dessous. Le mouvement des l ments g n tiques mobiles produit galement de nombreuses variantes g n tiques dont d pend l' volution, car, en plus de se d placer eux-m mes, les l ments g n tiques mobiles r organisent parfois les s quences voisines du g nome de l'h te. Ainsi, les mutations spontan es observ es chez la drosophile, les humains et d'autres organismes sont souvent dues au mouvement d' l ments g n tiques mobiles. Bien que bon nombre de ces mutations soient d l t res pour l'organisme, certaines seront avantageuses et pourront se propager dans toute la population. Il est presque certain qu'une grande partie de la vari t de la vie que nous voyons autour de nous provient l'origine du mouvement d' l ments g n tiques mobiles. Dans cette section, nous pr sentons les l ments g n tiques mobiles et d crivons les m canismes qui leur permettent de se d placer dans un g nome. Nous verrons que certains de ces l ments se d placent par des m canismes de transposition et d'autres par une recombinaison conservatrice sp cifique au site. Nous commen ons par la transposition, car il existe de nombreux autres exemples connus de ce type de mouvement. Gr ce la transposition, des l ments g n tiques mobiles peuvent s'ins rer dans n'importe quelle s quence d'ADN Les l ments mobiles qui se d placent par transposition sont appel s transposons, ou l ments transposables. Lors de la transposition, une enzyme sp cifique, g n ralement cod e par le transposon lui-m me et g n ralement appel e transposase, agit sur des s quences d'ADN sp cifiques chaque extr mit du transposon, l'amenant s'ins rer dans un nouveau site d'ADN cible. La plupart des transposons ne sont que modestement s lectifs dans le choix de leur site cible, et ils peuvent donc s'ins rer dans de nombreux endroits diff rents d'un g nome. En particulier, il n'existe pas d'exigence g n rale de similitude de s quence entre les extr mit s de l' l ment et la s quence cible. La plupart des transposons ne bougent que rarement. Chez les bact ries, o il est possible de mesurer la fr quence avec pr cision, les tran
Biologie moléculaire de la cellule	sposons se d placent g n ralement une fois toutes les 105 divisions cellulaires. Un mouvement plus fr quent d truirait probablement le g nome de la cellule h te. Sur la base de leur structure et de leur m canisme de transposition, les transposons peuvent tre regroup s en trois grandes classes : les transposons d'ADN uniquement, les r trotransposons de type r troviral et les r trotransposons non r troviraux. Les diff rences entre elles sont bri vement d crites dans le tableau 5-4, et chaque classe sera examin e tour de r le. Les transposons ADN seul, ainsi nomm s parce qu'ils n'existent que sous forme d'ADN pendant leur mouvement, pr dominent chez les bact ries et sont en grande partie responsables de la propagation de la r sistance aux antibiotiques dans les souches bact riennes. Lorsque des antibiotiques comme la p nicilline et la streptomycine sont devenus largement disponibles dans les ann es 1950, la plupart des bact ries l'origine de maladies humaines y taient sensibles. Aujourd'hui, la situation est diff rente : les antibiotiques tels que la p nicilline (et ses d riv s modernes) ne sont plus efficaces contre de nombreuses souches bact riennes modernes, y compris celles qui causent la gonorrh e et la pneumonie bact rienne. La propagation de la r sistance aux antibiotiques est due en grande partie aux g nes qui codent pour des enzymes inactivatrices d'antibiotiques qui sont port es par les transposons (Figure 5-60). Bien que ces l ments mobiles ne puissent se transposer qu' l'int rieur des cellules qui les portent d j , ils peuvent tre d plac s d'une cellule une autre par d'autres m canismes connus collectivement sous le nom de transfert horizontal de g nes (voir Figure 1-19). Une fois introduit dans une nouvelle cellule, un transposon peut s'ins rer dans le g nome et tre fid lement transmis toutes les cellules de descendance par les processus normaux de r plication de l'ADN et de division cellulaire. Les transposons d'ADN uniquement peuvent se d placer d'un site donneur un site cible par transposition copier-coller (Figure 5 61). Ici, le transposon est litt ralement excis d'un endroit sur un g nome et ins r dans un autre. Cette r action produit une courte duplication de la s quence d'ADN cible au site d'insertion ; Ces s quences de r p tition directe qui flanquent le transposon servent d'enregistrements pratiques des v nements de transposition ant rieurs. Tel Les signatures fournissent souvent des indices pr cieux pour identifier les transposons dans les s quences g nomiques. Lorsqu'un transposon d'ADN coup -coll est excis de son emplacement d'origine, il laisse derri re lui un trou dans le chromosome. Cette l sion peut tre parfaitement cicatris e par une r paration recombinatoire des cassures double brin (voir Figure 5 48), condition que le chromosome vienne d' tre r pliqu et qu'une copie identique de la s quence h te endommag e soit disponible. Alternativement, une r action d'assemblage d'extr mit non homologue peut refermer la cassure ; dans ce cas, la s quence d'ADN qui flanquait l'origine le transposon est alt r e, produisant une mutation au site chromosomique partir duquel le transposon a t excis (voir Figure 5-45). Remarquablement, le m me m canisme utilis pour exciser les transposons coup s-coll s de l'ADN s'est av r fonctionner dans le d veloppement de syst mes immunitaires de courtes r p titions directes de s quences d'ADN cibles dans le chromosome B Figure 5 60 Trois des nombreux transposons d'ADN uniquement trouv s dans les bact ries. Chacun de ces l ments d'ADN mobiles contient un g ne qui code pour une transposase, une enzyme qui effectue la rupture de l'ADN et les r actions d'assemblage n cessaires au d placement de l' l ment. Chaque transposon porte galement de courtes s quences d'ADN (indiqu es en rouge) qui ne sont reconnues que par la transposase cod e par cet l ment et sont n cessaires au mouvement de l' l ment. De plus, deux des trois l ments mobiles pr sent s portent des g nes qui codent pour des enzymes qui inactivent les antibiotiques ampicilline (AmpR) un d riv de la p nicilline et t tracycline (TetR). On pense que l' l ment transposable Tn10, montr dans le diagramme du bas, a volu partir de l'atterrissage fortuit de deux l ments mobiles beaucoup plus courts de chaque c t d'un g ne de r sistance la t tracycline. Figure 5 61 Transposition par copier-coller. Les transposons d'ADN uniquement peuvent tre reconnus dans les chromosomes par les s quences d'ADN r p t es invers es (rouge) pr sentes leurs extr mit s. Ces s quences, qui peuvent tre aussi courtes que 20 nucl otides, sont tout ce qui est n cessaire pour que l'ADN entre eux soit transpos par l'enzyme transposase particuli re associ e l' l ment. Le mouvement copier-coller d'un l ment transposable uniquement de l'ADN d'un site chromosomique un autre commence lorsque la transposase rassemble les deux s quences d'ADN invers es, formant une boucl
Biologie moléculaire de la cellule	e d'ADN. L'insertion dans le chromosome cible, galement catalys e par la transposase, se produit un endroit al atoire par la cr ation de cassures chelonn es dans le chromosome cible (pointes de fl ches violettes). Suite la r action de transposition, les espaces monobrin cr s par les cassures d cal es sont r par s par l'ADN polym rase et la ligase (noire). En cons quence, le site d'insertion est marqu par une courte r p tition directe de la s quence d'ADN cible, comme indiqu . Bien que la rupture du chromosome donneur (vert) soit r par e, ce processus modifie souvent la s quence d'ADN, provoquant une mutation au site d'origine de l' l ment transposable excis (non repr sent ). vert br s, catalysant les r arrangements de l'ADN qui produisent la diversit des anticorps et des r cepteurs des lymphocytes T. Connu sous le nom de recombinaison V(D)J, ce processus sera abord au chapitre 24. Trouv e uniquement chez les vert br s, la recombinaison V(D)J est une nouveaut volutive relativement r cente, mais on pense qu'elle est d riv e des transposons copier-coller beaucoup plus anciens. Certains virus utilisent un m canisme de transposition pour se d placer dans les chromosomes de la cellule h te Certains virus sont consid r s comme des l ments g n tiques mobiles car ils utilisent des m canismes de transposition pour int grer leur g nome dans celui de leur cellule h te. Cependant, contrairement aux transposons, ces virus codent des prot ines qui emballent leur information g n tique dans des particules virales qui peuvent infecter d'autres cellules. De nombreux virus qui s'ins rent dans un chromosome h te le font en employant l'un des deux premiers m canismes num r s dans le tableau 5-4 ; savoir, en se comportant comme des transposons d'ADN uniquement ou comme des r trotransposons de type r troviral. En effet, une grande partie de notre connaissance de ces m canismes provient d' tudes sur des virus particuliers qui les emploient. La transposition joue un r le cl dans le cycle de vie de nombreux virus. Les plus notables sont les r trovirus, qui comprennent le virus humain du sida, le VIH. l'ext rieur de la cellule, un r trovirus existe sous la forme d'un g nome d'ARN simple brin emball dans une coquille prot ique ou une capside avec une enzyme de transcriptase inverse cod e par le virus. Au cours de la , l'ARN viral p n tre dans une cellule et est converti en une mol cule d'ADN double brin par l'action de cette enzyme cruciale, capable de polym riser l'ADN sur un ARN ou une matrice d'ADN (Figure 5 62). Le terme r trovirus fait r f rence la capacit du virus inverser le flux habituel d'informations g n tiques, qui va normalement de l'ADN l'ARN (voir la figure 1-4). Une fois que la transcriptase inverse a produit une mol cule d'ADN double brin, des s quences sp cifiques pr s de ses deux extr mit s sont reconnues par un Figure 5 62 Le cycle de vie d'un r trovirus. Le g nome du r trovirus est constitu d'une mol cule d'ARN (en bleu) qui a g n ralement une longueur comprise entre 7000 et 12 000 nucl otides. Il est emball l'int rieur d'une capside prot ique, qui est entour e d'une enveloppe base de lipides qui contient des prot ines d'enveloppe cod es par le virus (vert). l'int rieur d'une cellule infect e, l'enzyme transcriptase inverse (cercle rouge) fait d'abord une copie d'ADN de la mol cule d'ARN viral, puis un deuxi me brin d'ADN, g n rant une copie d'ADN double brin du g nome de l'ARN. L'int gration de cette double h lice d'ADN dans le chromosome de l'h te est ensuite catalys e par une enzyme int grase cod e par le virus. Cette int gration est n cessaire la synth se de nouvelles mol cules d'ARN viral par l'ARN polym rase de la cellule h te, l'enzyme qui transcrit l'ADN en ARN (voir le chapitre 6). transposase appel e int grase. L'int grase ins re ensuite l'ADN viral dans le chromosome par un m canisme similaire celui utilis par les transposons d'ADN coup s et coll s (voir Figure 5-61). Les r trotransposons de type r troviral ressemblent aux r trovirus, mais n'ont pas d'enveloppe prot ique Une grande famille de transposons appel s r trotransposons de type r troviral (voir le tableau 5-4) se d placent dans et hors des chromosomes par un m canisme similaire celui utilis par les r trovirus. Ces l ments sont pr sents dans des organismes aussi divers que les levures, les mouches et les mammif res ; contrairement aux virus, ils n'ont pas la capacit intrins que de quitter leur cellule r sidente, mais sont transmis tous les descendants de cette cellule par les processus normaux de r plication de l'ADN et de division cellulaire. La premi re tape de leur transposition est la transcription de l'ensemble du transposon, produisant une copie de l'ARN de l' l ment qui mesure g n ralement plusieurs milliers de nucl otides. Ce transcrit, qui est traduit sous forme d'ARN messager par la cellule h te, code pour une enzyme transcriptase inverse. Cette enzyme effectue une copie d'ADN dou
Biologie moléculaire de la cellule	ble brin de la mol cule d'ARN via un interm diaire hybride ARN-ADN, refl tant pr cis ment les premiers stades de l'infection par un r trovirus (voir Figure 5-62). Comme un r trovirus, la mol cule d'ADN lin aire double brin s'int gre ensuite dans un site sur le chromosome l'aide d'une enzyme int grase qui est galement cod e par l' l ment. La structure et les m canismes de ces int grases ressemblent beaucoup ceux des transposases des transposons d'ADN seul. Une grande partie du g nome humain est compos e de r trotransposons non r troviraux Une fraction importante de nombreux chromosomes de vert br s est constitu e de s quences d'ADN r p t es. Dans les chromosomes humains, ces r p titions sont principalement des versions mut es et tronqu es de r trotransposons non r troviraux, le troisi me grand type de transposon (voir tableau 5-4). Bien que la plupart de ces transposons dans le g nome humain soient immobiles, quelques-uns conservent la capacit de se d placer. Des mouvements relativement r cents de l' l ment L1 (parfois appel LINE ou l ment nucl aire long intercal ) ont t identifi s, dont certains entra nent des maladies humaines ; par exemple, un type particulier d'h mophilie r sulte d'une insertion de L1 dans le g ne codant pour la prot ine de coagulation sanguine Facteur VIII (voir Figure 6 24). se lie l'ARN L1 Les r trotransposons non r troviraux se trouvent dans de nombreux organismes et se d placent via un m canisme distinct de 5 qui n cessite un complexe d'une endonucl ase et d'une transcriptase inverse. Comme l'illustre la figure 5-63, l'ARN et la transcriptase inverse CLIVAGE DU PREMIER BRIN jouent un r le beaucoup plus direct dans l' v nement de recombinaison que dans les r trotransposons de type retroviral d crits ci-dessus. L'inspection de la s quence du g nome humain r v le que la majeure partie des non-r troactifs de la famille des l ments nucl aires intercal s courts ne portent pas leurs r trotransposons viraux par exemple, les nombreuses copies de l' l ment Alu, un ADN cible de la m mographie, poss dent des g nes d'endonucl ase ou de transcriptase inverse. N anmoins, ils ont r ussi s'amplifier pour devenir des constituants majeurs de notre g nome, probablement en piratant des enzymes cod es par d'autres transposons. Ensemble, les LINE et les SINE repr sentent plus de 30 % du g nome humain (voir Figure 4-62) ; Il y a 500 000 exemplaires du premier et plus d'un million du second. Figure 5 63 Transposition par un r trotransposon non r troviral. La transposition de l' l ment L1 (rouge) commence lorsqu'une endonucl ase attach e la transcriptase inverse L1 (vert) et l'ARN L1 (bleu) entaille l'ADN cible au point o l'insertion aura lieu. Ce clivage lib re une extr mit d'ADN 3'OH dans l'ADN cible, qui est ensuite utilis e comme amorce pour l' tape de transcription inverse illustr e. Cela g n re une copie d'ADN simple brin de l' l ment 3 qui est directement li e l'ADN cible. Dans les r actions ult rieures, le traitement ult rieur de la copie d'ADN simple brin entra ne la g n ration d'une nouvelle copie d'ADN double brin de l' l ment L1 qui est ins r e au site de l'entaille initiale. Nous avons d crit plusieurs types d' l ments transposables : (1) les transposons d'ADN uniquement, dont le mouvement est bas sur des r actions de rupture et d'assemblage de l'ADN ; (2) les r trotransposons de type r troviral, qui se d placent galement par rupture et jonction de l'ADN, mais o l'ARN joue un r le cl en tant que matrice pour g n rer le substrat de recombinaison de l'ADN ; et (3) les r trotransposons non r troviraux, dans lesquels une copie de l'ARN de l' l ment est essentielle l'incorporation de l' l ment dans l'ADN cible, agissant comme un mod le direct pour un v nement de transcription inverse amorc par la cible de l'ADN. Curieusement, diff rents types de transposons pr dominent dans diff rents organismes. Par exemple, la grande majorit des transposons bact riens sont de type ADN uniquement, et quelques-uns sont galement pr sents dans le cas des r trotransposons non r troviraux. Chez les levures, les principaux l ments mobiles sont des r trotransposons de type r troviral. Chez la drosophile, on trouve tous des transposons bas s sur l'ADN, r troviraux et non r troviraux. Enfin, le g nome humain contient les trois types de transposons, mais comme nous le verrons ci-dessous, leurs histoires volutives sont tonnamment diff rentes. Les s quences g nomiques r v lent les moments approximatifs auxquels les l ments transposables se sont d plac s La s quence nucl otidique du g nome humain fournit un riche enregistrement fossile de l'activit des transposons au cours de l' volution. En comparant soigneusement les s quences nucl otidiques des quelque 3 millions de restes d' l ments transposables dans le g nome humain, il a t possible de reconstruire largement les mouvements des transposons dans les g nomes de nos anc tres au cours des derni res centaines de millions
Biologie moléculaire de la cellule	d'ann es. Par exemple, les transposons de l'ADN uniquement semblent avoir t tr s actifs bien avant la divergence des humains et des singes de l'Ancien Monde (il y a 25 35 millions d'ann es), mais parce qu'ils ont progressivement accumul des mutations inactivatrices, ils sont en sommeil dans la lign e humaine depuis cette poque. De m me, bien que notre g nome soit jonch de reliques de r trotransposons de type r troviral, aucun ne semble tre actif aujourd'hui. On pense qu'une seule famille de r trotransposons de type r troviral s'est transpos e dans le g nome humain depuis la divergence de l'homme et du chimpanz il y a environ 6 millions d'ann es. Les r trotransposons non r troviraux sont galement anciens, mais contrairement d'autres types, certains se d placent encore dans notre g nome, comme mentionn pr c demment. Par exemple, on estime que le mouvement de novo d'un l ment Alu est observ une fois sur 100 200 naissances humaines. Le mouvement des r trotransposons non r troviraux est responsable d'une fraction petite mais significative des nouvelles mutations humaines, peut- tre deux mutations sur mille. La situation chez la souris est tr s diff rente. Bien que les g nomes de la souris et de l'homme contiennent peu pr s la m me densit que les trois types de transposons, les deux types de r trotransposons toujours activement dans le g nome de la souris, tant responsables d'environ 10 % des nouvelles mutations. Bien que nous commencions peine comprendre comment les mouvements des transposons ont fa onn les g nomes des mammif res actuels, il a t sugg r que des pics d'activit de transposition auraient pu tre responsables d' v nements critiques de sp ciation pendant le rayonnement des lign es de mammif res partir d'un anc tre commun, un processus qui a commenc il y a environ 170 millions d'ann es. l'heure actuelle, nous ne pouvons que nous demander combien de nos qualit s humaines uniques sont n es de l'activit pass e des nombreux l ments g n tiques mobiles dont les restes se trouvent aujourd'hui dispers s dans nos chromosomes. Un autre type de m canisme de recombinaison, connu sous le nom de recombinaison conservatrice sp cifique au site, r organise d'autres types d' l ments d'ADN mobiles. Dans cette voie, la rupture et la jonction se produisent deux sites sp ciaux, un sur chaque ADN participant Figure 5 64 Deux types de r arrangement de l'ADN produits par une recombinaison conservatrice sp cifique au site. La seule diff rence entre les r actions en (A) et (B) est l'orientation relative des deux courts sites d'ADN (indiqu s par des fl ches) o un v nement de recombinaison sp cifique au site se produit. Gr ce une r action d'int gration, une mol cule d'ADN circulaire peut tre incorpor e dans une deuxi me mol cule d'ADN ; par la r action inverse (excision), il peut sortir pour reformer le cercle d'ADN d'origine. De nombreux virus bact riens entrent et sortent de leurs chromosomes h tes de cette mani re. La recombinaison conservatrice sp cifique au site peut galement inverser un segment sp cifique d'ADN dans un chromosome. Un exemple bien tudi d'inversion de l'ADN par recombinaison sp cifique au site se produit chez la bact rie Salmonella typhimurium, un organisme qui est une cause majeure d'intoxication alimentaire chez l'homme ; comme d crit dans la section suivante, l'inversion d'un segment d'ADN modifie le type de flagelle produit par la bact rie. mol cule. Selon les positions et les orientations relatives des deux sites de recombinaison, l'int gration, l'excision ou l'inversion de l'ADN peuvent se produire (Figure 5-64). La recombinaison conservatrice sp cifique au site est effectu e par des enzymes sp cialis es qui brisent et rejoignent deux doubles h lices d'ADN des s quences sp cifiques sur chaque mol cule d'ADN. Le m me syst me enzymatique qui relie deux mol cules d'ADN peut souvent les s parer nouveau, r tablissant avec pr cision la s quence des deux mol cules d'ADN d'origine (voir Figure 5-64A). La recombinaison conservatrice sp cifique au site est souvent utilis e par les virus ADN pour d placer leurs g nomes dans et hors des g nomes de leurs cellules h tes. Lorsqu'il est int gr dans son g nome h te, l'ADN viral est r pliqu en m me temps que l'ADN de l'h te et est fid lement transmis toutes les cellules descendantes. Si la cellule h te subit des dommages (par exemple, par l'irradiation UV), le virus peut inverser la r action de recombinaison sp cifique au site, exciser son g nome et l'emballer en une particule virale. De cette fa on, de nombreux virus peuvent se r pliquer passivement en tant que composant du g nome de l'h te, mais peuvent galement quitter le navire en perdition en excisant leurs g nomes et en les enveloppant dans une couche protectrice jusqu' ce qu'une nouvelle cellule h te saine soit rencontr e. Plusieurs caract ristiques distinguent la recombinaison conservatrice sp cifique au site de la transposition. Tout d'abord
Biologie moléculaire de la cellule	, la recombinaison conservatrice sp cifique au site n cessite des s quences d'ADN sp cialis es sur l'ADN du donneur et du receveur (d'o le terme sp cifique au site). Ces s quences contiennent des sites de reconnaissance pour la recombinase particuli re qui catalysera le r arrangement. En revanche, la transposition exige seulement que le transposon ait une s quence sp cialis e ; pour la plupart des transposons, l'ADN r cepteur peut tre de n'importe quelle s quence. Deuxi mement, les m canismes de r action sont fondamentalement diff rents. Les recombinases qui catalysent la recombinaison conservatrice sp cifique au site ressemblent aux topoisom rases en ce sens qu'elles forment des liaisons covalentes transitoires de haute nergie avec l'ADN et utilisent cette nergie pour compl ter les r arrangements de l'ADN (voir Figure 5 21). Ainsi, toutes les liaisons phosphate qui sont rompues lors d'un v nement de recombinaison sont restaur es son ach vement (d'o le terme conservateur). La transposition, en revanche, ne se fait pas par le biais d'un interm diaire prot ine-ADN joint de mani re covalente, et ce processus laisse des lacunes dans l'ADN qui doivent tre r par par des ADN polym rases. La recombinaison conservatrice sp cifique au site peut tre utilis e pour activer ou d sactiver des g nes De nombreuses bact ries utilisent une recombinaison conservatrice sp cifique au site pour contr ler l'expression de g nes particuliers. Un exemple bien tudi se produit chez les bact ries Salmonella et est connu sous le nom de variation de phase. Le changement dans l'expression g nique r sulte de l'inversion occasionnelle d'un morceau d'ADN sp cifique de 1000 paires de nucl otides, provoqu e par une recombinase conservatrice sp cifique du site cod e dans le g nome de Salmonella. Ce changement modifie l'expression de la prot ine flagelline la surface cellulaire, pour laquelle la bact rie poss de deux g nes diff rents (Figure 5-65). L'inversion de l'ADN modifie l'orientation d'un promoteur (une s quence d'ADN qui dirige la transcription d'un g ne) situ dans le segment d'ADN invers . Avec le promoteur dans une orientation, les bact ries synth tisent un type de flagelline ; Avec le promoteur dans l'autre orientation, ils synth tisent l'autre type. La r action de recombinaison est r versible, ce qui permet aux populations bact riennes de passer d'un type de flagelline l'autre. Les inversions ne se produisent que rarement, et parce que de tels changements dans le g nome seront copi s fid lement au cours de tous les cycles de r plication ult rieurs, des clones entiers de bact ries auront un type de flagelline ou l'autre. La variation de phase aide prot ger la population bact rienne contre la r ponse immunitaire de son h te vert br . Si l'h te fabrique des anticorps contre un type de flagelline, quelques bact ries dont la flagelline a t alt r e par l'inversion des g nes seront toujours en mesure de survivre et de se multiplier. Comme de nombreux m canismes utilis s par les cellules et les virus, la recombinaison sp cifique d'un site a t mise contribution par les scientifiques pour tudier une grande vari t de probl mes. Pour d chiffrer les r les de g nes et de prot ines sp cifiques dans des organismes multicellulaires complexes, des techniques de g nie g n tique sont utilis es pour produire des vers, des mouches et des souris portant un g ne codant pour une enzyme de recombinaison sp cifique au site ainsi qu'un ADN cible soigneusement con u avec les sites d'ADN que cette enzyme reconna t. Au moment opportun, le g ne codant pour l'enzyme peut tre activ pour r organiser la s quence d'ADN cible. Un tel r arrangement est largement utilis pour supprimer un g ne sp cifique dans un tissu particulier d'un organisme multicellulaire (Figure 5-66). Il est particuli rement utile lorsque le g ne d'int r t joue un r le cl dans le d veloppement pr coce de nombreux tissus, et qu'une d l tion compl te du g ne de la lign e germinale entra nerait la mort Figure 5 65 Commutation de l'expression g nique par inversion de l'ADN chez les bact ries. La transcription altern e de deux g nes de la flagelline chez une bact rie Salmonella est caus e par un v nement de recombinaison conservateur sp cifique au site qui inverse un petit segment d'ADN contenant un promoteur. Dans une orientation, le promoteur active la transcription du g ne de la flagelline H2 ainsi que celle d'une prot ine r pressive qui bloque l'expression du g ne de la flagelline H1. Les promoteurs et les r presseurs sont d crits en d tail au chapitre 7 ; Ici, nous notons simplement qu'un promoteur est n cessaire pour exprimer un g ne en prot ine et qu'un r presseur bloque que cela se produise. Lorsque le promoteur est invers , il ne se retourne plus sur H2 ou le r presseur, et le g ne H1, qui est ainsi lib r de la refoulement, est exprim la place. La r action d'inversion n cessite des s quences d'ADN sp cifiques (rouge) et une enzyme recombinase qui est co
Biologie moléculaire de la cellule	d e dans le segment d'ADN inversible. Ce m canisme de recombinaison sp cifique au site n'est activ que rarement (environ une fois sur 105 divisions cellulaires). Par cons quent, la production de l'une ou l'autre flagelline a tendance tre fid lement h rit e dans chaque clone de cellules. DANS DES TISSUS SP CIFIQUES (p. ex., FOIE) G ne de la recombinase Cre G ne d'int r t G ne d'int r t supprim du chromosome et perdu lors de la division des cellules h patiques DANS D'AUTRES TISSUS, LE G NE D'INT R T S'EXPRIME NORMALEMENTCre recombinase g ne d'int r t ARNm (par exemple, promoteur actif uniquement dans le foie) prot ine d'int r t Figure 5 66 Comment une enzyme de recombinaison conservatrice sp cifique au site de bact ries est utilis e pour supprimer des g nes sp cifiques de tissus de souris particuliers. Cette approche n cessite l'insertion de deux mol cules d'ADN sp cialement modifi es dans la lign e germinale de l'animal. Le premier contient le g ne d'une recombinase (dans ce cas, la recombinase Cre du bact riophage P1) sous le contr le d'un promoteur sp cifique au tissu, ce qui garantit que la recombinase n'est exprim e que dans ce tissu. La deuxi me mol cule d'ADN contient le g ne d'int r t flanqu de sites de reconnaissance (dans ce cas, les sites LoxP) pour la recombinase. La souris est con ue de telle sorte qu'il s'agit de la seule copie de ce g ne. Par cons quent, si la recombinase n'est exprim e que dans le foie, le g ne d'int r t y sera supprim , et seulement l . La r action qui excise le g ne est la m me que celle illustr e la figure 5-64A. Comme d crit au chapitre 7, de nombreux promoteurs sp cifiques aux tissus sont connus ; De plus, bon nombre de ces promoteurs ne sont actifs qu' des moments pr cis du d veloppement. Ainsi, il est possible d' tudier l'effet de la suppression de g nes sp cifiques diff rents moments du d veloppement de chaque tissu. Comment la r plication de l'ADN s'oppose-t-elle tous les autres processus qui se produisent simultan ment sur les chromosomes, tr s t t dans le d veloppement. La m me strat gie peut galement tre utilis e pour inclure de mani re inappropri e la r paration de l'ADN et l'expression g nique d'un g ne sp cifique dans un tissu d'int r t ; Ici, la suppression d clench e rejoint la transcription ? un fort promoteur transcriptionnel du g ne d'int r t. Avec cet outil, on peut en principe d terminer l'influence de n'importe quelle prot ine dans n'importe quel tissu souhait d'un Quelle est la base de l'animal faible. fr quence des erreurs de r plication de l'ADN observ es dans toutes les cellules ? Est-ce le mieux que les cellules puissent faire compte tenu de la vitesse de r plication et des limites de la biologie mol culaire Les g nomes de presque tous les organismes contiennent des l ments g n tiques mobiles qui peuvent d placer la diffusion ? Ce taux de mutation d'une position dans le g nome une autre tait-il soit par transpositionnelle, soit par conserva-s lection dans l' volution pour fournir une variation g n tique ? processus de recombinaison sp cifiques au site. Dans la plupart des cas, ce mouvement est al atoire et se produit une fr quence tr s basse. Les l ments g n tiques mobiles comprennent les transposons, qui se d placent l'int rieur d'une seule cellule (et ses descendants), ainsi que les virus dont le g nome peut s'int grer dans les g nomes de leurs cellules h tes. moyens de le r parer. Y a-t-il encore Il existe trois classes de transposons : les transposons ADN seul, les r trovi d'autres fa ons non d couvertes que les cellules r trotransposons de type ral, et les r trotransposons non r troviraux. Tous, sauf le dernier, ont pour r parer l'ADN ? avoir des parents proches parmi les virus. Bien que les virus et les l ments transposables puissent tre consid r s comme des parasites, bon nombre des nouveaux arrangements de s quences d'ADN qui Les nombreux transposons morts produits par leurs v nements de recombinaison sp cifiques au site ont jou un r le important dans le g nome humain fournissent toute cr ation de la variation g n tique cruciale pour l' volution des cellules et des organismes. Avantages pour l'homme ? Quelles d clarations sont vraies ? Expliquez pourquoi ou pourquoi pas.5 1 Les diff rentes cellules de votre corps ont rarement des g nomes avec la m me s quence nucl otidique. 5 2 Chez E. coli, o la fourche de r plication se d place 500 paires de nucl otides par seconde, l'ADN devant la fourche en l'absence de topoisom rase devrait tourner pr s de 3000 tours par minute. 5 3 Dans une bulle de r plication, le m me brin d'ADN parental sert de brin mod le pour la synth se du brin principal dans une fourche de r plication et de matrice pour la synth se du brin retard dans l'autre fourche. 5 4 Lorsque des fourches de r plication bidirectionnelle d'origines adjacentes se rencontrent, un brin de t te se heurte toujours un brin de retard. 5 5 m canismes de r paration de l'ADN d pendent
Biologie moléculaire de la cellule	tous de l'existence de deux copies de l'information g n tique, une dans chacun des deux chromosomes homologues. Discutez des probl mes suivants. 5 6 Pour d terminer la reproductibilit des mesures de fr quence de mutation, vous effectuez l'exp rience suivante. Vous inoculez chacune des 10 cultures avec une seule bact rie E. coli, vous laissez les cultures se d velopper jusqu' ce qu'elles contiennent chacune 106 cellules, puis vous mesurez le nombre de cellules dans chaque culture qui portent une mutation dans votre g ne d'int r t. Vous avez t tellement surpris par les premiers r sultats que vous avez r p t l'exp rience pour les confirmer. Les deux s ries de r sultats pr sentent la m me variabilit extr me, comme le montre le tableau Q5 1. En supposant que le taux de mutation est constant, pourquoi pensez-vous qu'il y a tant de variation dans les fr quences des cellules mutantes dans diff rentes cultures ? 5 7 enzymes de r paration de l'ADN r parent pr f rentiellement les bases non appari es sur le brin d'ADN nouvellement synth tis , en utilisant l'ancien brin d'ADN comme matrice. Si les incompatibilit s taient r par es sans tenir compte du brin servant de mod le, la r paration des incompatibilit s r duirait-elle les erreurs de r plication ? Un tel syst me de r paration des m sappariements entra nerait-il moins de mutations, plus de mutations ou le m me nombre de mutations qu'il y aurait eu sans aucune r paration ? Expliquez vos r ponses. 5 8 Discutez de l'affirmation suivante : Le primade est une enzyme b cl e qui fait beaucoup d'erreurs. Finalement, les amorces d'ARN qu'il fabrique sont remplac es par de l'ADN fabriqu par une polym rase de plus grande fid lit . C'est du gaspillage. Il serait plus conome en nergie si une ADN polym rase en faisait une copie pr cise en premier lieu. 5 9 Si l'ADN polym rase n cessite une amorce parfaitement appari e afin d'ajouter le nucl otide suivant, comment se fait-il que des nucl otides non appari s chappent cette exigence et deviennent des substrats pour les enzymes de r paration des m sappariements ? 5 10 Le laboratoire que vous avez rejoint tudie le cycle de vie d'un virus animal qui utilise de l'ADN circulaire double brin comme g nome. Votre projet consiste d finir l'emplacement de la ou des origines de la r plication et d terminer si la r plication se d roule dans un ou les deux sens en s' loignant d'une origine (r plication unidirectionnelle ou bidirectionnelle). Pour atteindre votre objectif, vous avez ouvert des cellules infect es par le virus, isol des g nomes viraux r pliquants, les avez cliv s avec une nucl ase de restriction qui coupe le g nome un seul endroit pour produire une mol cule lin aire partir du cercle, et examin les mol cules r sultantes au microscope lectronique. Certaines des mol cules que vous avez observ es sont illustr es sch matiquement dans la figure Q5 1. (Notez qu'il est impossible de distinguer l'orientation d'une mol cule d'ADN par rapport une autre au microscope lectronique.) Vous devez pr senter vos conclusions au reste du laboratoire demain. Comment r pondrez-vous aux deux questions que votre conseiller vous a pos es ? Y a-t-il une origine unique de r plication ou plusieurs origines ? La r plication est-elle unidirectionnelle ou bidirectionnelle ? Figure Q5 1 Formes parentales et r pliquantes d'un virus animal (Probl me 5 10). 5 11 Vous tudiez la synth se de l'ADN dans les cellules de culture tissulaire, en utilisant la 3H-thymidine pour marquer radioactivement les fourches de r plication. En brisant les cellules de mani re ce que certains brins d'ADN puissent tre tir s, de tr s longs brins d'ADN peuvent tre isol s intacts et examin s. Vous superposez l'ADN avec une mulsion photographique et l'exposez pendant 3 6 mois, une proc dure connue sous le nom d'autoradiographie. Parce que l' mulsion est sensible aux missions radioactives, l'ADN marqu 3H appara t sous forme de traces de grains d'argent. Parce que l' tirement r duit la r plication Figure Q5 2 tude autoradiographique de la r plication de l'ADN dans des cellules cultiv es (Probl me 5 11). (A) Ajout de thymidine marqu e au 3H imm diatement apr s la lib ration du bloc de synchronisation. (B) Ajout de thymidine marqu e 3H 30 minutes apr s la lib ration du bloc de synchronisation. bulles, les duplex filles se trouvent c te c te et ne peuvent pas tre distingu s les uns des autres. Vous pr traitez les cellules pour les synchroniser au d but de la phase S. Dans la premi re exp rience, vous rel chez le bloc de synchronisation et ajoutez imm diatement de la 3H-thymidine. Apr s 30 minutes, vous lavez les cellules et changez de milieu de sorte que la concentration totale de thymidine soit la m me qu'auparavant, mais que seulement un tiers de celle-ci soit radioactive. Apr s 15 minutes suppl mentaires, vous pr parez l'ADN pour l'autoradiographie. Les r sultats de cette exp rience sont pr sent s la figure Q5 2A. Dans la deuxi m
Biologie moléculaire de la cellule	e exp rience, vous rel chez le bloc de synchronisation, puis attendez 30 minutes avant d'ajouter de la 3H-thymidine. Apr s 30 minutes en pr sence de 3H-thymidine, vous changez nouveau de milieu pour r duire la concentration de thymidine radioactive et incubez les cellules pendant 15 minutes suppl mentaires. Les r sultats de la deuxi me exp rience sont pr sent s la figure Q5 2B. A. Expliquez pourquoi, dans les deux exp riences, certaines r gions des traces sont denses en grains d'argent (fonc s), tandis que d'autres sont moins denses (clairs). b. Dans la premi re exp rience, chaque piste a une section sombre centrale avec des sections claires chaque extr mit . Dans la deuxi me exp rience, la section sombre de chaque piste a une section claire une seule extr mit . Expliquez la raison de cette diff rence. C. Estimez la vitesse de mouvement de la fourche ( m/min) dans ces exp riences. Les estimations des deux exp riences concordent-elles ? Pouvez-vous utiliser ces informations pour valuer le temps qu'il faudrait pour r pliquer l'ensemble du g nome ? Si vous comparez la fr quence des seize s quences de dinucl otides possibles dans les g nomes d'E. coli et de l'homme, il n'y a pas de diff rences frappantes, l'exception d'un dinucl otide, 5-CG-3. La fr quence des dinucl otides CG dans le g nome humain est significativement plus faible que chez E. coli et nettement plus faible que pr vu par hasard. Pourquoi pensez-vous que les dinucl otides CG sont sous-repr sent s dans le g nome humain ? 5 13 Avec l' ge, on pense que les cellules somatiques accumulent des cicatrices g nomiques la suite de la r paration impr cise des cassures double brin par jonction d'extr mit non homologue (NHEJ). Des estimations bas es sur la fr quence des cassures dans les fibroblastes humains primaires sugg rent qu' l' ge de 70 ans, chaque cellule somatique humaine pourrait porter quelque 2000 mutations induites par NHEJ en raison d'une r paration impr cise. Si ces mutations taient distribu es au hasard dans le g nome, combien de g nes codant pour la prot ine pro-tein s'attendriez-vous tre affect s ? Vous attendriez-vous ce que la fonction cellulaire soit compromise ? Pourquoi ou pourquoi pas ? (Supposons que 2 % du g nome 1,5 % codant pour des prot ines et 0,5 % r gulateur est une information cruciale.) 5 14 Dessiner la structure de la double jonction de Holliday qui r sulterait de l'invasion des brins par les deux extr mit s du duplex bris dans le duplex homologue intact illustr la figure Q5 3. tiquetez l'extr mit gauche de chaque brin dans la jonction de Holliday 5' ou 3' afin que la relation avec les duplex parentaux et recombinants soit claire. Indiquez comment la synth se de l'ADN serait utilis e pour combler les lacunes d'un seul brin dans votre double jonction de Holliday. (Probl me 5 14).5 15 En plus de corriger les m sappariements de l'ADN, le syst me de r paration des m sappariements a pour fonction d'emp cher recombinaison homologue de se produire entre des s quences similaires mais non identiques. Pourquoi la recombinaison entre des s quences similaires, mais non identiques, poserait-elle un probl me pour les cellules humaines ? La cr recombinase 5-16 est une enzyme sp cifique au site qui catalyse la recombinaison entre deux sites d'ADN LoxP. La recombinase Cre associe deux sites LoxP dans la m me orientation, casse les deux duplex au m me point de chaque site LoxP et joint les extr mit s avec de nouveaux partenaires de sorte que chaque site LoxP soit r g n r , comme le montre sch matiquement la figure Q5 4A. Sur la base de ce m canisme, pr dire l'arrangement des s quences qui seront g n r es par la recombinaison sp cifique du site m di e par Cre pour chacun des deux ADN illustr s sur la figure Q5 4B. Figure Q5 4 Recombinaison sp cifique au site m di e par la recombinase Cre (Probl me 5 16). (A) Repr sentation sch matique de la recombinaison sp cifique au site Cre/LoxP. Les s quences LoxP de l'ADN sont repr sent es par des triangles color s de sorte que l' v nement de recombinaison sp cifique au site peut tre suivi plus facilement. En r alit , leurs s quences d'ADN sont identiques. (B) Substrats d'ADN contenant deux arrangements de sites LoxP. Brown TA (2007) G nomes 3. New York : Garland Science. Friedberg EC, Walker GC, Siede W et al. (2005) R paration de l'ADN et mutagen se. Washington, DC : ASM Press. Haber JE (2013) Stabilit du g nome : r paration et recombinaison de l'ADN. New York : Garland Science. Hartwell L, Hood L, Goldberg ML et al. (2010) G n tique : des g nes aux g nomes. Boston : McGraw Hill. Stent GS (1971) G n tique mol culaire : un r cit introductif. San Francisco : WH Freeman. Watson J, Baker T, Bell S et al. (2013) Biologie mol culaire du g ne, 7e d. Menlo Park, CA : Benjamin Cummings. La maintenance des s quences d'ADN Conrad DF, Keebler J, DePristo M et al. (2011) Variation des taux de mutation l' chelle du g nome au sein et entre les familles hum
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Biologie moléculaire de la cellule	heurs de localiser avec certitude le d but et la fin des g nes, et encore moins de d chiffrer quand et o chaque g ne s'exprime dans la vie de l' Figure 6 1 Le chemin de l'ADN la prot ine. Le flux d'informations g n tiques de l'ADN l'ARN (transcription) et de l'ARN la prot ine (traduction) se produit dans toutes les cellules vivantes. chromosome X humain : 155 millions de paires de bases nucl otidiques (~5% du g nome) Longueur totale de cette section = 1,25 million de paires de nucl otides Figure 6 2 Repr sentation sch matique d'une petite partie du chromosome X humain. Comme r sum dans la l gende, les g nes codant pour les prot ines connus (commen ant par Abcd1 et se terminant par F8) sont repr sent s en gris fonc , avec des r gions codantes (exons) indiqu es par des barres qui s' tendent au-dessus et au-dessous de la ligne centrale. Les ARN non codants dont les fonctions sont connues sont indiqu s par des diamants violets. Les triangles jaunes indiquent les positions dans les r gions codant pour les prot ines o les s quences du g nome de N andertal codent pour un acide amin diff rent de celui du g nome humain. L' tendue des triangles jaunes dans le g ne Txtl1 semble avoir t s lectionn e positivement depuis la divergence de l'Homo sapiens avec les N andertaliens il y a environ 200 000 ans. Notez que la plupart des prot ines sont identiques entre nous et notre parent teint. L'histogramme bleu indique dans quelle mesure des parties du g nome humain sont conserv es avec d'autres esp ces de vert br s. Il est probable que D'autres g nes, actuellement non reconnus, se trouvent galement dans cette partie du g nome humain. Les g nes dont la mutation provoque une condition humaine h r ditaire sont indiqu s par des parenth ses rouges. Le g ne Abcd1 code pour une prot ine qui importe des acides gras dans le peroxysome ; Les mutations du g ne provoquent une d mylination des nerfs, ce qui peut entra ner des troubles de la cognition et du mouvement. L'incontinentia pigmenti est une maladie de la peau, des cheveux, des ongles, des dents et des yeux. L'h mophilie A est un trouble de la coagulation caus par des mutations du g ne du facteur VIII, qui code pour une prot ine de coagulation sanguine. Parce que les hommes n'ont qu'une seule copie du chromosome X, la plupart des conditions montr es ici n'affectent que les hommes ; les femelles qui h ritent de l'un de ces g nes d fectueux sont souvent asymptomatiques parce qu'une prot ine fonctionnelle est fabriqu e partir de leur autre chromosome X. (Avec l'aimable autorisation d'Alex Williams, obtenu de l'Universit de Californie, Genome Browser, http://genome.ucsc.edu). Pourtant, les cellules de notre corps le font automatiquement, des milliers de fois par seconde. Les probl mes auxquels les cellules sont confront es dans le d codage des g nomes peuvent tre appr ci s en consid rant une infime partie du g nome humain (Figure 6-2). La r gion illustr e repr sente moins de 1/2000e de notre g nome et comprend au moins 48 g nes codant pour des prot ines et 6 g nes pour des ARN non codants. Lorsque nous consid rons l'ensemble du g nome humain, nous ne pouvons que nous merveiller de la capacit de nos cellules traiter rapidement et avec pr cision de telles quantit s d'informations. Dans ce chapitre, nous expliquons comment les cellules d codent et utilisent les informations de leurs g nomes. On a beaucoup appris sur la fa on dont les instructions g n tiques crites dans un alphabet de seulement quatre lettres les quatre nucl otides diff rents de l'ADN dirigent la formation d'une bact rie, d'une mouche des fruits ou d'un humain. N anmoins, nous avons encore beaucoup d couvrir sur la fa on dont l'information stock e dans le g nome d'un organisme produit m me la bact rie unicellulaire la plus simple avec 500 g nes, sans parler de la fa on dont elle dirige le d veloppement d'un humain avec environ 30 000 g nes. Il reste norm ment d'ignorance ; De nombreux d fis fascinants attendent donc la prochaine g n ration de biologistes cellulaires. La transcription et la traduction sont les moyens par lesquels les cellules lisent ou expriment les instructions g n tiques dans leurs g nes. tant donn que de nombreuses copies d'ARN identiques peuvent tre fabriqu es partir du m me g ne, et que chaque mol cule d'ARN peut diriger la synth se de nombreuses mol cules prot iques identiques, les cellules peuvent synth tiser une grande quantit de prot ines partir d'un g ne lorsque cela est n cessaire. Mais les g nes peuvent tre transcrits et traduits avec des efficacit s diff rentes, ce qui permet la cellule de produire de grandes quantit s de certaines prot ines et d'infimes quantit s d'autres (Figure 6-3). De plus, comme nous le verrons dans le chapitre suivant, Figure 6 3 Les g nes peuvent tre exprim s avec diff rentes efficacit s. Dans cet exemple, le g ne A est transcrit beaucoup plus efficacement que le g ne B et chaque mol cule d'ARN qu'il produit est
Biologie moléculaire de la cellule	galement traduite plus fr quemment. Cela fait que la quantit de prot ine A dans la cellule est beaucoup plus grande que celle de la prot ine B. une cellule peut modifier (ou r guler) l'expression de chacun de ses g nes en fonction de ses besoins, le plus souvent en contr lant la production de son ARN. La premi re tape d'une cellule pour lire une partie n cessaire de ses instructions g n tiques consiste copier une partie particuli re de sa s quence nucl otidique d'ADN un g ne dans une s quence de nucl otides d'ARN (Figure 6 4). L'information contenue dans l'ARN, bien que copi e sous une autre forme chimique, est toujours crite essentiellement dans le m me langage que dans l'ADN le langage d'une s quence nucl otidique. D'o le nom donn la production de mol cules d'ARN sur l'ADN est la transcription. Comme l'ADN, l'ARN est un polym re lin aire compos de quatre types diff rents de sous-unit s nucl otidiques li es entre elles par des liaisons phosphodiester (voir Figure 6-4). Il diff re chimiquement de l'ADN deux gards : (1) les nucl otides de l'ARN sont des ribonucl otides, c'est- -dire qu'ils contiennent du sucre ribose (d'o le nom d'acide ribonucl ique) plut t que du d soxyribose ; (2) bien que, comme l'ADN, l'ARN contienne les bases ad nine (A), guanine (G) et cytosine (C), il contient la base uracile (U) au lieu de la thymine (T) dans l'ADN (Figure 6-5). Puisque U, comme T, peut apparier des bases par liaison hydrog ne avec A (Figure 6-6), les propri t s compl mentaires d'appariement de bases d crites pour l'ADN dans les chapitres 4 et 5 s'appliquent galement l'ARN (dans l'ARN, G s'apparie avec C et A se couple avec U). On retrouve galement d'autres types de paires de bases dans l'ARN : par exemple, G s'apparie parfois avec U. Bien que ces diff rences chimiques soient l g res, l'ADN et l'ARN diff rent consid rablement dans leur structure globale. Alors que l'ADN est toujours pr sent dans les cellules sous la forme d'une h lice double brin, l'ARN est simple brin. Une cha ne d'ARN peut donc se replier dans une forme particuli re, tout comme une cha ne polypeptidique se replie pour former la forme finale d'une prot ine (Figure 6-7). Comme nous le verrons plus loin dans ce chapitre, la capacit de se plier en formes tridimensionnelles complexes permet certaines mol cules d'ARN d'avoir des fonctions structurelles et catalytiques pr cises. La transcription produit de l'ARN compl mentaire un brin d'ADN L'ARN d'une cellule est fabriqu par transcription de l'ADN, un processus qui pr sente certaines similitudes avec le processus de r plication de l'ADN discut au chapitre 5. La transcription commence par l'ouverture et le d roulement d'une petite partie de la double h lice de l'ADN pour exposer les bases de chaque brin d'ADN. L'un des deux brins de la double h lice de l'ADN sert alors de matrice pour la synth se d'une mol cule d'ARN. Comme dans la r plication de l'ADN, la s quence nucl otidique de la cha ne d'ARN est d termin e par l'appariement de bases compl mentaires entre les nucl otides entrants et l'ADN Figure 6 4 Une courte longueur d'ARN. La liaison chimique phosphodiester entre les nucl otides de l'ARN est la m me que celle de l'ADN. Figure 6 5 La structure chimique de l'ARN. (A) L'ARN contient le sucre ribose, qui diff re du d soxyribose, le sucre utilis dans l'ADN, par la pr sence d'un groupe -OH suppl mentaire. (B) L'ARN contient la base uracile, qui diff re de la thymine, la base quivalente dans l'ADN, par l'absence d'un groupe -CH3. Figure 6 6 Uracil forme des paires de bases avec l'ad nine. L'absence d'un groupe m thyle dans U n'a aucun effet sur l'appariement des bases ; ainsi, les paires de bases U-A ressemblent troitement aux paires de bases T-A (voir Figure 4-4). mod le. Lorsqu'une bonne correspondance est tablie (A avec T, U avec A, G avec C et C avec G), le ribonucl otide entrant est li de mani re covalente la cha ne d'ARN en croissance dans une r action catalys e par voie enzymatique. La cha ne d'ARN produite par la transcription le transcrit est donc allong e d'un nucl otide la fois, et elle a une s quence nucl otidique qui est exactement compl mentaire au brin d'ADN utilis comme matrice (Figure 6-8). La transcription, cependant, diff re de la r plication de l'ADN de plusieurs mani res cruciales. Contrairement un brin d'ADN nouvellement form , le brin d'ARN ne reste pas li l'hydrog ne au brin de matrice d'ADN. Au lieu de cela, juste derri re la r gion o les ribonucl otides sont ajout s, la cha ne d'ARN est d plac e et l'h lice d'ADN se reforme. Ainsi, les mol cules d'ARN produites par la transcription sont lib r es de la matrice d'ADN sous forme de brins simples. De plus, parce qu'elles ne sont copi es qu' partir d'une r gion limit e de l'ADN, les mol cules d'ARN sont beaucoup plus courtes que les mol cules d'ADN. Une mol cule d'ADN dans un chromosome humain peut mesurer jusqu' 250 millions de paires de nucl otides ; en revanche, la
Biologie moléculaire de la cellule	plupart des ARN ne mesurent pas plus de quelques milliers de nucl otides, et beaucoup sont consid rablement plus courts. Les enzymes qui effectuent la transcription sont appel es ARN polym rases. Comme l'ADN polym rase qui catalyse la r plication de l'ADN (discut e au chapitre 5), les ARN polym rases catalysent la formation des liaisons phosphodiester qui relient les nucl otides entre eux pour former une cha ne lin aire. L'ARN polym rase se d place pas pas le long de l'ADN, d roulant l'h lice d'ADN juste devant le site actif de polym risation afin d'exposer une nouvelle r gion du brin matrice pour les Figure 6 7 L'ARN peut se replier en structures sp cifiques. L'ARN est en grande partie monocat naire, mais il contient souvent de courts segments de nucl otides qui peuvent former des paires de bases conventionnelles avec des s quences compl mentaires trouv es ailleurs sur la m me mol cule. Ces interactions, ainsi que d'autres interactions non conventionnelles de paires de bases, permettent une mol cule d'ARN de se replier en une structure tridimensionnelle d termin e par sa s quence de nucl otides (vid o 6.1). Sch ma d'une structure d'ARN repli montrant uniquement les interactions conventionnelles entre paires de bases. (B) Structure avec des interactions de paires de bases conventionnelles (rouge) et non conventionnelles (vert). Structure d'un ARN r el, qui catalyse son propre pissage (voir p. 324). Chaque interaction conventionnelle de paire de bases est indiqu e par un chelon dans la double h lice. Les bases dans d'autres configurations sont indiqu es par des chelons cass s. appariement de bases. De cette fa on, la cha ne d'ARN en croissance est prolong e d'un nucl otide la fois dans la direction 5 3 (Figure 6-9). Les substrats sont des ribonucl osides triphosphates (ATP, CTP, UTP et GTP) ; comme dans la r plication de l'ADN, l'hydrolyse des liaisons haute nergie fournit l' nergie n cessaire pour faire avancer la r action (voir la figure 5-4 et la vid o 6.2). La lib ration presque imm diate du brin d'ARN de l'ADN au fur et mesure de sa synth se signifie que de nombreuses copies d'ARN peuvent tre faites partir du m me g ne dans un laps de temps relativement court, la synth se de mol cules d'ARN suppl mentaires commen ant avant que les mol cules d'ARN pr c dentes ne soient termin es (Figure 6 10). Lorsque les mol cules d'ARN polym rase se suivent de pr s de cette mani re, chacune se d pla ant environ 50 nucl otides par seconde, plus d'un millier de transcrits peuvent tre synth tis s en une heure partir d'un seul g ne. Bien que l'ARN polym rase catalyse essentiellement la m me r action chimique que l'ADN polym rase, il existe des diff rences importantes entre les activit s des deux enzymes. Tout d'abord, et c'est le plus vident, l'ARN polym rase catalyse la liaison des ribonucl otides, et non des d soxyribonucl otides. Deuxi mement, contrairement aux ADN polym rases impliqu es dans la r plication de l'ADN, les ARN polym rases peuvent d marrer une cha ne d'ARN sans amorce. Cette diff rence est consid r e comme possible parce que la transcription n'a pas besoin d' tre aussi pr cise que la r plication de l'ADN (voir Tableau 5-1, p. 244). Les ARN polym rases commettent environ une erreur pour 104 nucl otides copi s dans l'ARN (contre un taux d'erreur pour la copie directe par l'ADN polym rase d'environ un sur 107 nucl otides) ; et les cons quences d'une erreur de transcription de l'ARN sont beaucoup moins importantes car l'ARN ne stocke pas de mani re permanente l'information g n tique dans les cellules. Enfin, contrairement aux ADN polym rases, qui fabriquent leurs produits en segments qui sont ensuite cousus ensemble, les ARN polym rases sont absolument processives ; c'est- -dire que la m me ARN polym rase qui commence une mol cule d'ARN doit la terminer sans se dissocier de la matrice d'ADN. Bien qu'elles ne soient pas aussi pr cises que les ADN polym rases qui r pliquent l'ADN, les ARN polym rases ont n anmoins un m canisme de relecture modeste. Si un ribonucl otide incorrect est ajout la cha ne d'ARN en croissance, la polym rase peut revenir en arri re et le site actif de l'enzyme peut effectuer une r action d'excision qui ressemble l'inverse de la r action de polym risation, sauf qu'une mol cule d'eau remplace le pyrophosphate et qu'un nucl oside monophosphate est lib r . tant donn que l'ADN et l'ARN polym rases effectuent toutes deux une polym risation nucl otidique d pendante de la matrice, on pourrait s'attendre ce que les deux types d'enzymes soient structurellement li s. Cependant, les tudes cristallographiques aux rayons X r v lent que, outre le fait de contenir un ion Mg2+ critique au site catalytique, les deux enzymes sont tr s diff rentes. Les enzymes de polym risation nucl otidique d pendantes semblent tre apparues au moins deux fois au cours de l' volution pr coce des cellules. Une lign e a conduit la courte r gion de l'h lice ADN/ARN 5 5
Biologie moléculaire de la cellule	direction de Figure 6 8 La transcription de l'ADN produit une mol cule d'ARN simple brin qui est compl mentaire un brin de la double h lice de l'ADN. Notez que la s quence de bases dans la mol cule d'ARN produite est la m me que la s quence de bases dans le brin d'ADN non matrice, sauf qu'un U remplace chaque base T dans l'ADN. Figure 6 9 L'ADN est transcrit par l'enzyme ARN polym rase. L'ARN polym rase (bleu p le) se d place pas pas le long de l'ADN, d roulant l'h lice d'ADN son site actif indiqu par le Mg2+ (rouge), qui est n cessaire la catalyse. Au fur et mesure de sa progression, la polym rase ajoute des nucl otides un par un la cha ne d'ARN au site de polym risation, en utilisant un brin d'ADN expos comme matrice. Le transcrit d'ARN est donc une copie compl mentaire de l'un des deux brins d'ADN. Une courte r gion d'h lice ADN/ARN (d'une longueur d'environ neuf paires de nucl otides) ne se forme que de mani re transitoire, et une fen tre d'h lice ADN/ARN se d place donc le long de l'ADN avec la polym rase lorsque la double h lice de l'ADN se reforme derri re elle. Les nucl otides entrants se pr sentent sous la forme de ribonucl osides triphosphates (ATP, UTP, CTP et GTP), et l' nergie stock e dans leurs liaisons phosphate-phosphate fournit la force motrice de la r action de polym risation (voir Figure 5 4). La figure, bas e sur une structure cristallographique aux rayons X, montre une vue en coupe de la polym rase : la partie faisant face au spectateur a t d coup e pour r v ler l'int rieur (film 6.3). (Adapt de P. Cramer et al., Science 288:640-649, 2000 ; Code PDB : 1HQM.) les ADN polym rases modernes et les transcriptases inverses discut es au chapitre 5, ainsi qu' quelques ARN polym rases de virus. L'autre lign e a form toutes les ARN polym rases modernes dont nous discutons dans ce chapitre. Les cellules produisent diff rentes cat gories de mol cules d'ARN La majorit des g nes port s dans l'ADN d'une cellule sp cifient la s quence d'acides amin s des prot ines ; les mol cules d'ARN qui sont copi es partir de ces g nes (qui dirigent finalement la synth se des prot ines) sont appel es mol cules d'ARN messager (ARNm). Le produit final d'autres g nes, cependant, est la mol cule d'ARN elle-m me. Ces ARN sont connus sous le nom d'ARN non codants car ils ne codent pas pour les prot ines. Chez un eucaryote unicellulaire bien tudi , la levure Saccharomyces cerevisiae, plus de 1200 g nes (plus de 15% du total) produisent de l'ARN comme produit final. Les humains peuvent produire de l'ordre de dix mille ARN non codants. Ces ARN, comme les prot ines, servent de composants enzymatiques, structurels et r gulateurs pour une grande vari t de processus dans la cellule. Dans le chapitre 5, nous avons rencontr l'un d'entre eux comme le mod le port par l'enzyme t lom rase. Bien que de nombreux ARN non codants soient encore myst rieux, nous verrons dans ce chapitre que les mol cules de petit ARN nucl aire (ARNnb) dirigent l' pissage des pr -ARNm pour former l'ARNm, que les mol cules d'ARN ribosomique (ARNr) forment le c ur des ribosomes et que les mol cules d'ARN de transfert (ARNt) forment les adaptateurs qui s lectionnent les acides amin s et les maintiennent en place sur un ribosome pour les incorporer dans une prot ine. Dans le chapitre 7, nous verrons que les mol cules de microARN (miARN) et les mol cules de petits ARN interf rents (siRNA) servent de r gulateurs cl s de l'expression des g nes eucaryotes, et que les ARN interagissant avec piwi (piARN) prot gent les lign es germinales animales des transposons ; nous discutons galement des ARN longs non codants (ARNlnc), un ensemble diversifi d'ARN dont les fonctions viennent d' tre d couvertes (Tableau 6 1). Figure 6 10 Transcription de deux g nes observ e au microscope lectronique. La micrographie montre que de nombreuses mol cules d'ARN polym rase transcrivent simultan ment chacun des deux g nes adjacents. Les mol cules d'ARN polym rase sont visibles sous la forme d'une s rie de points le long de l'ADN avec les transcrits nouvellement synth tis s (fils fins) qui leur sont attach s. Les mol cules d'ARN (ARN ribosomiques) montr es dans cet exemple ne sont pas traduites en prot ines, mais sont utilis es directement comme composants des ribosomes, les machines sur lesquelles la traduction a lieu. On pense que les particules l'extr mit 5 (l'extr mit libre) de chaque transcrit d'ARNr refl tent les d buts de l'assemblage des ribosomes. partir de la longueur relative des transcrits nouvellement synth tis s, on peut d duire que les mol cules d'ARN polym rase transcrivent de gauche droite. (Avec l'aimable autorisation d'Ulrich Scheer.) Chaque segment d'ADN transcrit est appel une unit de transcription. Chez les eucaryotes, une unit de transcription porte g n ralement l'information d'un seul g ne, et code donc soit pour une seule mol cule d'ARN, soit pour une seule prot ine (ou un groupe de prot ines apparent es si le trans
Biologie moléculaire de la cellule	crit d'ARN initial est piss de plus d'une mani re pour produire diff rents ARNm). Chez les bact ries, un ensemble de g nes adjacents est souvent transcrit sous forme d'unit ; la mol cule d'ARNm r sultante porte donc l'information pour plusieurs prot ines distinctes. Dans l'ensemble, l'ARN repr sente quelques pour cent du poids sec d'une cellule, tandis que les prot ines en repr sentent environ 50 %. La majeure partie de l'ARN dans les cellules est de l'ARNr ; L'ARNm ne repr sente que 3 5 % de l'ARN total dans une cellule de mammif re typique. Le La population d'ARNm est compos e de dizaines de milliers d'esp ces diff rentes, et il n'y a en moyenne que 10 15 mol cules de chaque esp ce d'ARNm pr sentes dans chaque cellule. Les signaux cod s dans l'ADN indiquent l'ARN polym rase o commencer et s'arr ter Pour transcrire un g ne avec pr cision, l'ARN polym rase doit reconna tre o commencer et o finir sur le g nome. La fa on dont les ARN polym rases effectuent ces t ches diff re quelque peu entre les bact ries et les eucaryotes. Parce que les processus chez les bact ries sont plus simples, nous en discutons en premier. L'initiation de la transcription est une tape particuli rement importante dans l'expression des g nes, car c'est le point principal o la cellule r gule quelles prot ines doivent tre produites et quel rythme. L'enzyme centrale de l'ARN polym rase bact rienne est un complexe multi-sous-unit s qui synth tise l'ARN en utilisant la matrice d'ADN comme guide. Une sous-unit suppl mentaire appel e facteur sigma ( ) s'associe l'enzyme centrale et l'aide lire les signaux de l'ADN qui lui indiquent o commencer la transcription (Figure 6 11). Ensemble, facteur et l'enzyme centrale sont connus sous le nom d'holoenzyme ARN polym rase ; ce complexe n'adh re que faiblement l'ADN bact rien lorsque les deux entrent en collision, et une holoenzyme glisse g n ralement rapidement le long de la longue mol cule d'ADN puis se dissocie. Cependant, lorsque l'holoenzyme de la polym rase glisse dans une s quence sp ciale de nucl otides indiquant le point de d part de la synth se de l'ARN appel e promoteur, la polym rase se lie troitement, car son facteur de tablit des contacts sp cifiques avec les bords des bases expos es l'ext rieur de la double h lice de l'ADN ( tape 1 de la figure 6-11A). L'holoenzyme ARN polym rase troitement li e au niveau d'un promoteur ouvre la double h lice pour exposer un court tron on de nucl otides sur chaque brin ( tape 2 de la figure 6-11A). La r gion de l'ADN non appari (environ 10 nucl otides) s'appelle la bulle de transcription et elle est stabilis e par la liaison de facteur aux bases non appari es sur l'un des brins expos s. L'autre brin d'ADN expos agit ensuite comme un mod le pour l'appariement de bases compl mentaires avec les ribonucl otides entrants, dont deux sont reli s par la polym rase pour commencer une cha ne d'ARN ( tape 3 de la figure 6-11A). La dizaine de premiers nucl otides d'ARN est synth tis e l'aide d'un m canisme de scrunching , dans lequel l'ARN polym rase reste li e au promoteur et attire l'ADN en amont dans son site actif, largissant ainsi la bulle de transcription. Ce processus cr e un stress consid rable et les ARN courts sont souvent lib r s, ce qui soulage le stress et force la polym rase, qui reste en place, recommencer la synth se. Finalement, ce processus d'initiation abortive est surmont et le stress g n r par le froissement aide l'enzyme centrale se lib rer de ses interactions avec l'ADN promoteur ( tape 4 de la figure 6-11A) et liminer le facteur ( tape 5 de la figure 6-11A). ce stade, la polym rase commence descendre dans l'ADN, synth tisant l'ARN, de mani re progressive : la polym rase avance d'une paire de bases pour chaque nucl otide ajout . Au cours de ce processus, la bulle de transcription se dilate continuellement l'avant de la polym rase et se contracte l'arri re. L' longation de la cha ne se poursuit ( une vitesse d'environ 50 nucl otides/s pour les ARN polym rases bact riennes) jusqu' ce que l'enzyme rencontre un deuxi me signal, le terminateur ( tape 6 de la figure 6-11A), o la polym rase arr te et lib re la fois la mol cule d'ARN nouvellement fabriqu e et la matrice d'ADN ( tape 7 de la figure 6-11A). L'enzyme polym rase libre se r associe ensuite un facteur de libre pour former une holoenzyme qui peut recommencer le processus de transcription ( tape 8 de la figure 6-11A). Le processus d'initiation de la transcription est compliqu et n cessite que l'ARN polym rase, l'holoenzyme et l'ADN subissent une s rie de changements conformationnels. On peut voir ces changements comme l'ouverture et le positionnement de l'ADN dans le site actif, suivi d'un resserrement successif de l'enzyme autour de l'ADN et de l'ARN pour s'assurer qu'il ne se dissocie pas avant d'avoir fini de transcrire un g ne. Si une ARN polym rase se dissocie pr matur ment, elle doit recommencer au niveau d
Biologie moléculaire de la cellule	u promoteur. Comment les signaux de terminaison dans l'ADN arr tent-ils l'allongement de la polym rase ? Pour la plupart des g nes bact riens, un signal de terminaison consiste en une cha ne de paires de nucl otides A-T pr c d es d'une s quence d'ADN sym trique en deux fois, qui, lorsqu'elle est transcrite en ARN, se replie en une structure en pingle cheveux par appariement de bases Watson-Crick (voir Figure 6-11A). Lorsque la polym rase transcrit travers un terminateur, la formation de l' pingle cheveux aide d sengager le transcrit d'ARN du site actif ( tape 7 de la Figure 6 11A). Le processus de terminaison fournit un exemple d'un th me commun dans ce chapitre : le repliement de l'ARN en structures sp cifiques affecte de nombreuses tapes du d codage du g nome. Comme nous venons de le voir, les processus d'initiation et de terminaison de la transcription impliquent une s rie compliqu e de transitions structurelles dans les mol cules de prot ines, d'ADN et d'ARN. Les signaux cod s dans l'ADN qui sp cifient ces transitions sont souvent difficiles reconna tre pour les chercheurs. En effet, une comparaison de nombreux promoteurs bact riens diff rents r v le un degr surprenant de variation. N anmoins, ils contiennent tous des s quences apparent es, refl tant des aspects de l'ADN qui sont reconnus directement Figure 6 11 Le cycle de transcription de l'ARN polym rase bact rienne. (A) l' tape 1, l'holoenzyme ARN polym rase (enzyme du noyau de la polym rase plus facteur) assemble puis localise une s quence d'ADN promoteur (voir Figure 6 12). La polym rase ouvre (d roule) l'ADN la position o la transcription doit commencer ( tape 2) et commence la transcription ( tape 3). Cette synth se initiale de l'ARN (initiation abortive) est relativement inefficace car des transcrits courts et improductifs sont souvent lib r s. Cependant, une fois que l'ARN polym rase a r ussi synth tiser environ 10 nucl otides d'ARN, elle rompt ses interactions avec l'ADN promoteur ( tape 4) et finit par lib rer facteur, mesure que la polym rase se resserre autour de l'ADN et passe au mode d' longation de la synth se de l'ARN, se d pla ant le long de l'ADN ( tape 5). Pendant le mode d' longation, la transcription est hautement processive, la polym rase quittant la matrice d'ADN et ne lib rant l'ARN nouvellement transcrit que lorsqu'elle rencontre un signal de terminaison ( tapes 6 et 7). Les signaux de terminaison sont g n ralement cod s dans l'ADN, et beaucoup fonctionnent en formant une structure en forme d' pingle cheveux de l'ARN qui d stabilise l'emprise de la polym rase sur l'ARN. Chez les bact ries, toutes les mol cules d'ARN sont synth tis es par un seul type d'ARN polym rase, et le cycle d crit sur la figure s'applique donc la production d'ARNm ainsi que d'ARN structurels et catalytiques. (B) Image bidimensionnelle d'une ARN polym rase bact rienne allong e, d termin e par microscopie force atomique (voir Figure 9 33). (C) Interpr tation de l'image en (B). (Adapt de K.M. Herbert et al., Annu. Rev. Biochem. 77:149-176, 2008.) fr quence du nucl otide dans chaque position (%) s quence et logo de s quence pour la principale classe de promoteurs d'E. coli. (A) Sur la base d'une comparaison de 300 promoteurs, les fr quences de chacun des quatre nucl otides chaque position dans le promoteur sont donn es. La s quence consensus, illustr e sous le graphique, refl te le nucl otide le plus commun trouv chaque position dans la collection de promoteurs. Ces promoteurs sont caract ris s par deux s quences d'ADN hexam riques : la s quence -35 et la s quence -10, nomm es d'apr s leur emplacement approximatif par rapport au point de d part de la transcription (d sign +1). La s quence de nucl otides entre les hexam res -35 et -10 ne montre pas de similitudes significatives entre les promoteurs. Pour plus de commodit , la s quence nucl otidique d'un seul brin d'ADN est montr e ; En r alit , les promoteurs sont doublement touch s par le facteur . Ces caract ristiques communes sont souvent r sum es sous la forme d'une s quence de consensus (figure 6-12). Une s quence de nucl otides consensuelle est d riv e en comparant de nombreuses s quences ayant la m me fonction de base et en comptant les nucl otides les plus courants trouv s chaque position. Il sert donc de r sum ou de moyenne d'un grand nombre de s quences nucl otidiques individuelles. Une fa on plus pr cise d'afficher la gamme de s quences d'ADN reconnues par une prot ine consiste utiliser un logo de s quence, qui r v le les fr quences relatives de chaque nucl otide chaque position (Figure 6-12C). Les s quences d'ADN des promoteurs bact riens individuels diff rent de mani re d terminer leur force (le nombre d' v nements d'initiation par unit de temps du promoteur). Les processus volutifs ont affin chacun d'entre eux pour initier aussi souvent que n cessaire et ont ainsi cr un large ventail de forces de promoteur. Les promoteurs des
Biologie moléculaire de la cellule	g nes qui codent pour des prot ines abondantes sont beaucoup plus forts que ceux associ s aux g nes qui codent pour des prot ines rares, et les s quences nucl otidiques de leurs promoteurs sont responsables de ces diff rences. l'instar des promoteurs bact riens, les terminateurs de transcription ont galement un large ventail de s quences, le potentiel de former une structure d'ARN en pingle cheveux tant la caract ristique commune la plus importante. tant donn qu'un nombre presque illimit de s quences nucl otidiques ont ce potentiel, les s quences terminatrices sont encore plus h t rog nes que les s quences promoteurs. Nous avons discut en d tail des promoteurs et des terminateurs bact riens pour illustrer un point important concernant l'analyse des s quences g nomiques. Bien que nous en sachions beaucoup sur les promoteurs et les terminateurs bact riens et que nous puissions construire des s quences consensus qui r sument leurs caract ristiques les plus saillantes, leur variation dans la s quence nucl otidique rend difficile de les localiser avec certitude simplement ADN. Les nucl otides repr sent s sur la figure sont reconnus par facteur, une sous-unit de l'ARN polym rase holoenzyme. (B) La distribution de l'espacement entre les hexam res 35 et 10 trouv s dans les promoteurs d'E. coli. (C) Un logo de s quence affichant les m mes informations que dans le panneau (A). Ici, la hauteur de chaque lettre est proportionnelle la fr quence laquelle cette base appara t cette position dans une grande vari t de s quences de promoteurs. La hauteur totale de toutes les lettres chaque position est proportionnelle au contenu d'information (exprim en bits) cette position. Par exemple, le contenu informatif total d'une position qui peut tol rer plusieurs bases diff rentes est faible (voir les trois derni res bases des s quences 35), mais statistiquement sup rieur l'al atoire. ADN du g ne a du chromosome E. coli par analyse de la s quence nucl otidique d'un g nome. Il est encore plus difficile de localiser des s quences analogues dans les g nomes eucaryotes, en partie cause de l'exc s d'ADN transport dans ces g nomes. Souvent, nous avons besoin d'informations suppl mentaires, dont certaines proviennent d'exp riences directes, pour localiser et interpr ter avec pr cision les signaux d'ADN courts dans les g nomes. Comme le montre la figure 6-11, les s quences promotrices sont asym triques, ce qui garantit que l'ARN polym rase ne peut se lier que dans une seule orientation. Parce que la polym rase ne peut synth tiser l'ARN que dans la direction 5 3, l'orientation du promoteur sp cifie le brin utiliser comme matrice. Les s quences du g nome r v lent que le brin d'ADN utilis comme matrice pour la synth se de l'ARN varie d'un g ne l'autre, en fonction de l'orientation du promoteur (Figure 6 13). Apr s avoir examin la transcription chez les bact ries, nous nous tournons maintenant vers la situation chez les eucaryotes, o la synth se des mol cules d'ARN est une affaire beaucoup plus labor e. Contrairement aux bact ries, qui contiennent un seul type d'ARN polym rase, les noyaux eucaryotes en ont trois : l'ARN polym rase I, l'ARN polym rase II et l'ARN polym rase III. Les trois polym rases sont structurellement similaires les unes aux autres et partagent certaines sous-unit s communes, mais elles transcrivent diff rentes cat gories de g nes (tableau 6-2). Les ARN polym rases I et III transcrivent les g nes codant pour l'ARN de transfert, l'ARN ribosomique et divers petits ARN. L'ARN polym rase II transcrit la plupart des g nes, y compris tous ceux qui codent pour les prot ines, et notre discussion ult rieure se concentre donc sur cette enzyme. L'ARN polym rase II eucaryote pr sente de nombreuses similitudes structurelles avec l'ARN polym rase bact rienne (Figure 6 14). Mais il existe plusieurs diff rences importantes dans la fa on dont les enzymes bact riennes et eucaryotes fonctionnent, dont deux nous concernent imm diatement. 1. Alors que l'ARN polym rase bact rienne ne n cessite qu'un seul facteur d'initiation de la transcription ( ) pour commencer la transcription, les ARN polym rases eucaryotes n cessitent de nombreux facteurs de ce type, collectivement appel s facteurs de transcription g n raux. 2. L'initiation de la transcription eucaryote doit avoir lieu sur l'ADN qui est emball dans des nucl osomes et des formes d'ordre sup rieur de la structure de la chromatine (d crites au chapitre 4), caract ristiques qui sont absentes des chromosomes bact riens. Figure 6 13 Directions de transcription le long d'une courte portion d'un chromosome bact rien. Certains g nes sont transcrits l'aide d'un brin d'ADN comme matrice, tandis que d'autres sont transcrits l'aide de l'autre brin d'ADN. La direction de la transcription est d termin e par le promoteur au d but de chaque g ne (pointes de fl ches vertes). Ce diagramme montre environ 0,2 % (9000 paires de bases) du chromosome
Biologie moléculaire de la cellule	E. coli. Les g nes transcrits de gauche droite utilisent le brin d'ADN inf rieur comme matrice ; Ceux transcrits de droite gauche utilisent le brin sup rieur comme mod le. L'ARN polym rase II n cessite un ensemble de facteurs de transcription g n raux Les facteurs de transcription g n raux aident positionner correctement l'ARN polym rase eucaryote au niveau du promoteur, aident s parer les deux brins d'ADN pour permettre le d but de la transcription et lib rent l'ARN polym rase du promoteur pour d marrer son mode d' longation. Les prot ines sont g n rales car elles sont n cessaires presque tous les promoteurs utilis s par l'ARN polym rase II. Elles sont constitu es d'un ensemble de prot ines en interaction not es arbitrairement TFIIA, TFIIB, TFIIC, TFIID, et ainsi de suite (TFII signifiant facteur de transcription pour la polym rase II ). Au sens large, les facteurs de transcription g n raux eucaryotes remplissent des fonctions quivalentes celles du facteur chez les bact ries ; en effet, les parties du TFIIF ont la m me structure tridimensionnelle que les parties quivalentes du . La figure 6-15 illustre comment les facteurs de transcription g n raux s'assemblent au niveau des promoteurs utilis s par l'ARN polym rase II, et le tableau 6-3 r sume leurs activit s. Le processus d'assemblage commence lorsque TFIID se lie une courte s quence d'ADN en double h lice principalement compos e de nucl otides T et A. Pour cette raison, cette s quence est connue sous le nom de s quence TATA, ou bo te TATA, et la sous-unit de TFIID qui la reconna t est appel e TBP (pour TATA-binding protein). La bo te TATA est g n ralement situ e 25 nucl otides en amont du site de d but de la transcription. Ce n'est pas la seule s quence d'ADN qui signale le d but de la transcription (Figure 6-16), mais pour la plupart des promoteurs de la polym rase II, c'est la plus importante. La liaison du TFIID Figure 6 15 Initiation de la transcription d'un g ne eucaryote par l'ARN polym rase II. Pour commencer la transcription, l'ARN polym rase n cessite plusieurs facteurs de transcription g n raux. (A) Le promoteur contient une s quence d'ADN appel e bo te TATA, qui est situ e 25 nucl otides du site o la transcription est initi e. (B) Par l'interm diaire de sa sous-unit TBP, TFIID reconna t et lie la bo te TATA, ce qui permet ensuite la liaison adjacente de TFIIB (C). Par souci de simplicit , la distorsion de l'ADN produite par la liaison de TFIID (voir Figure 6 17) n'est pas repr sent e. (D) Le reste des facteurs de transcription g n raux, ainsi que l'ARN polym rase elle-m me, s'assemblent au niveau du promoteur. (E) TFIIH utilise ensuite l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP pour s parer la double h lice de l'ADN au point de d part de la transcription, exposant localement le brin matrice. TFIIH phosphoryle galement l'ARN polym rase II, modifiant sa conformation de sorte que la polym rase est lib r e des facteurs g n raux et peut commencer la phase d' longation de la transcription. Comme on le voit, le site de phosphorylation est une longue queue polypeptidique C-terminale, galement appel e domaine C-terminal (CTD), qui s' tend partir de la mol cule de polym rase. Le sch ma d'assemblage montr sur la figure a t d duit d'exp riences effectu es in vitro, et l'ordre exact dans lequel les facteurs de transcription g n raux s'assemblent sur les promoteurs varie probablement d'un g ne l'autre in vivo. Les facteurs de transcription g n raux sont tr s conserv s ; Certains de ceux provenant de cellules humaines peuvent tre remplac s dans des exp riences biochimiques par les facteurs correspondants de levures simples. Figure 6 14 Similitude structurelle entre une ARN polym rase bact rienne et une ARN polym rase II eucaryote. Les r gions des deux ARN polym rases qui ont des structures similaires sont indiqu es en vert. La polym rase eucaryote est plus grande que l'enzyme bact rienne (12 sous-unit s au lieu de 5), et une partie de la Les r gions sont indiqu es en gris. Les sph res bleues repr sentent les atomes de Zn qui servent de composants structurels aux polym rases, et la sph re rouge repr sente l'atome de Mg pr sent sur le site actif, o la polym risation a lieu. Les ARN polym rases de toutes les cellules modernes (bact ries, arch es et eucaryotes) sont troitement li es, ce qui indique que les caract ristiques de base de l'enzyme taient en place avant la divergence des trois principales branches de la vie. (Avec l'aimable autorisation de P. Cramer et R. Kornberg.) d but de la transcription TATA box (D) UTP, ATP CTP, GTP FACTOR RELEASE provoque une grande distorsion de l'ADN de la bo te TATA (Figure 6 17). On pense que cette distorsion sert de rep re physique pour l'emplacement d'un promoteur actif au milieu d'un tr s grand g nome, et qu'elle rapproche les s quences d'ADN des deux c t s de la distorsion pour permettre les tapes ult rieures d'assemblage des prot ines. D'autres facteurs s'assemblent ensuite,
Biologie moléculaire de la cellule	avec l'ARN polym rase II, pour former un complexe complet d'initiation de la transcription (voir Figure 6 15). Le plus compliqu des facteurs de transcription g n raux est TFIIH. Compos de neuf sous-unit s, il est presque aussi grand que l'ARN polym rase II elle-m me et, comme nous le verrons sous peu, effectue plusieurs tapes enzymatiques n cessaires l'initiation de la transcription. Apr s avoir form un complexe d'initiation de transcription sur l'ADN promoteur, l'ARN polym rase II doit acc der au brin matrice au point de d part de la transcription. Le TFIIH, qui contient une h licase d'ADN comme l'une de ses sous-unit s, rend cette tape possible en hydrolysant l'ATP et en d roulant l'ADN, exposant ainsi le brin matrice. Ensuite, l'ARN polym rase II, comme la polym rase bact rienne, reste au niveau du promoteur en synth tisant de courtes longueurs d'ARN jusqu' ce qu'elle subisse une s rie de changements conformationnels qui lui permettent de s' loigner du promoteur et d'entrer dans la phase d' longation de la transcription. Une tape cl de cette transition est l'ajout de groupes phosphate la queue de l'ARN polym rase (connue sous le nom de domaine CTD ou C-terminal). Chez l'homme, le CTD se compose de 52 r p titions en tandem d'une sous-unit de TFIID C/T C/T A N T/A C/T TFIID Figure 6 16 S quences consensus trouv es proximit des points de d part de l'ARN polym rase II eucaryote. Le nom donn chaque s quence consensuelle (premi re colonne) et le facteur de transcription g n ral qui la reconna t (derni re colonne) sont indiqu s. N indique n'importe quel nucl otide, et deux nucl otides s par s par une barre oblique indiquent une probabilit gale de l'un ou l'autre nucl otide la position indiqu e. En r alit , chaque s quence consensus est une repr sentation abr g e d'un histogramme similaire celui de la figure 6-12. Pour la plupart des points de d part de la transcription de l'ARN polym rase II, seules deux ou trois des quatre s quences sont pr sentes. Par exemple, de nombreux promoteurs de la polym rase II ont une s quence de bo te TATA, mais ceux qui n'ont g n ralement pas de s quence INR forte . Bien que la plupart des s quences d'ADN qui influencent l'initiation de la transcription soient situ es en amont du point de d part de la transcription, quelques-unes, comme le DPE illustr sur la figure, sont situ es dans la r gion transcrite. s quence de sept acides amin s, qui s' tend partir de la structure centrale de l'ARN polym rase. Lors de l'initiation de la transcription, la s rine situ e en cinqui me position dans la s quence de r p tition (Ser5) est phosphoryl e par TFIIH, qui contient une prot ine kinase dans l'une de ses sous-unit s (voir Figure 6 15D et E). La polym rase peut alors se d sengager de l'ensemble des facteurs de transcription g n raux. Au cours de ce processus, il subit une s rie de changements conformationnels qui resserrent son interaction avec l'ADN, et il acquiert de nouvelles prot ines qui lui permettent de transcrire sur de longues distances, dans certains cas pendant de nombreuses heures, sans se dissocier de l'ADN. Une fois que la polym rase II a commenc allonger la transcription de l'ARN, la plupart des facteurs de transcription g n raux sont lib r s de l'ADN afin qu'ils soient disponibles pour initier un autre cycle de transcription avec une nouvelle mol cule d'ARN polym rase. Comme nous le verrons bient t, la phosphorylation de la queue de l'ARN polym rase II a une fonction suppl mentaire : elle fait en sorte que les composants de la machinerie de traitement de l'ARN se chargent sur la polym rase et soient ainsi positionn s pour modifier l'ARN nouvellement transcrit lorsqu'il merge de la polym rase. La polym rase II n cessite galement des prot ines activatrices, m diatrices et modificatrices de la chromatine Des tudes de l'ARN polym rase II et de ses facteurs de transcription g n raux agissant sur des matrices d'ADN dans des syst mes in vitro purifi s ont permis d' tablir le mod le d'initiation de la transcription que nous venons de d crire. Cependant, comme nous l'avons vu au chapitre 4, l'ADN des cellules eucaryotes est emball dans des nucl osomes, qui sont ensuite dispos s dans des structures chromatiniennes d'ordre sup rieur. Par cons quent, l'initiation de la transcription dans une cellule eucaryote est plus complexe et n cessite plus de prot ines que sur l'ADN purifi . Tout d'abord, les prot ines r gulatrices de g nes connues sous le nom d'activateurs transcriptionnels doivent se lier des s quences sp cifiques de l'ADN (appel es amplificateurs) et aider attirer l'ARN polym rase II au point de d part de la transcription (Figure 6 18). Nous abordons le r le de ces activateurs au chapitre 7, car ils sont l'un des principaux moyens par lesquels les cellules r gulent l'expression de leurs g nes. Ici, nous notons simplement que leur pr sence sur l'ADN est n cessaire l'initiation de la transcription dans une cellule eucaryote. De
Biologie moléculaire de la cellule	uxi mement, l'initiation de la transcription eucaryote in vivo n cessite la pr sence d'un grand complexe prot ique connu sous le nom de m diateur, qui permet aux prot ines activatrices de communiquer correctement avec la polym rase II et avec les facteurs de transcription g n raux. Enfin, l'initiation de la transcription dans une cellule eucaryote n cessite g n ralement le recrutement d'enzymes modifiant la chromatine, y compris les complexes de remodelage de la chromatine et Figure 6 17 Structure tridimensionnelle de la TbP (prot ine de liaison TATA) li e l'ADN. Le TBP est la sous-unit du facteur de transcription g n ral TFIID qui est responsable de la reconnaissance et de la liaison la s quence de la bo te TATA dans l'ADN (en rouge). On pense que la courbure unique de l'ADN caus e par la TBP des plis dans la double h lice s par s par de l'ADN partiellement d roul sert de point de rep re qui aide attirer les autres facteurs de transcription g n raux (Vid o 6.4). Le TBP est une cha ne polypeptidique unique qui est repli e en deux domaines tr s similaires (bleu et vert). (Adapt de J.L. Kim et al., Nature 365:520-527, 1993. Avec l'autorisation de Macmillan Publishers Ltd.) d but de (site de liaison pour FACTEURS DE TRANSCRIPTION G N RAUX, ARN POLYM RASE, M DIATEUR, COMPLEXES DE REMODELAGE DE LA CHROMATINE ET ENZYMES MODIFIANT LES HISTONES L'ARN polym rase se lie des enzymes modifiant les histones. Comme nous l'avons vu au chapitre 4, les deux types d'enzymes peuvent augmenter l'acc s l'ADN de la chromatine et, ce faisant, ils facilitent l'assemblage de la machinerie d'initiation de la transcription sur l'ADN. Comme l'illustre la figure 6-18, de nombreuses prot ines (bien plus de 100 sous-unit s individuelles) doivent s'assembler au point de d part de la transcription pour initier la transcription dans une cellule eucaryote. L'ordre d'assemblage de ces prot ines ne semble pas suivre une voie prescrite ; Au contraire, l'ordre diff re d'un g ne l'autre. En effet, certains de ces diff rents complexes prot iques peuvent tre apport s l'ADN sous forme de sous-ensembles pr form s. Pour commencer la transcription, l'ARN polym rase II doit tre lib r e de ce grand complexe de prot ines. En plus des tapes d crites la figure 6-14, cette lib ration n cessite souvent la prot olyse in situ de la prot ine activatrice. Nous reviendrons sur certaines de ces questions, y compris le r le des complexes de remodelage de la chromatine et des enzymes modifiant les histones, dans le chapitre 7, o nous discuterons de la fa on dont les cellules eucaryotes r gulent le processus d'initiation de la transcription. Une fois que l'ARN polym rase a initi la transcription, elle se d place de mani re saccad e, s'arr tant sur certaines s quences d'ADN et transcrivant rapidement d'autres. Les ARN polym rases en allongement, la fois bact riennes et eucaryotes, sont associ es une s rie de facteurs d' longation, des prot ines qui diminuent la probabilit que l'ARN polym rase se dissocie avant d'atteindre la fin d'un g ne. Ces facteurs s'associent g n ralement l'ARN polym rase peu de temps apr s l'initiation et aident la polym rase se d placer travers la grande vari t de s quences d'ADN diff rentes que l'on trouve dans les g nes. Les ARN polym rases eucaryotes doivent galement faire face la structure de la chromatine lorsqu'elles se d placent le long d'un mod le d'ADN, et elles sont g n ralement aid es par des complexes de remodelage de la chromatine d pendants de l'ATP qui se d placent avec la polym rase ou peuvent simplement rechercher et sauver la polym rase occasionnellement bloqu e. De plus, les chaperons d'histones aident en d sassemblant partiellement les nucl osomes devant une ARN polym rase en mouvement et en les assemblant derri re. Lorsque l'ARN polym rase se d place le long d'un g ne, certaines des enzymes qui lui sont li es modifient les histones, laissant derri re un enregistrement de l'emplacement de la polym rase. Bien que l'on ne sache pas exactement comment la cellule utilise ces informations, cela peut aider Figure 6 18 Initiation de la transcription par l'ARN polym rase II dans une cellule eucaryote. L'initiation de la transcription in vivo n cessite la pr sence de prot ines activatrices de la transcription. Comme d crit au chapitre 7, ces prot ines se lient de courtes s quences sp cifiques de l'ADN. Bien qu'un seul soit montr ici, un g ne eucaryote typique utilise de nombreuses prot ines activatrices de transcription, qui, en combinaison, d terminent son taux et son mod le de transcription. Agissant parfois une distance de plusieurs milliers de paires de nucl otides (indiqu e par la mol cule d'ADN en pointill s), ces prot ines aident l'ARN polym rase, les facteurs de transcription g n raux et le m diateur s'assembler au niveau du promoteur. De plus, les activateurs attirent les complexes de remodelage de la chromatine d pendants de l'ATP et les enzymes modifiant les hi
Biologie moléculaire de la cellule	stones. L'un des r les principaux du m diateur est de coordonner l'assemblage de toutes ces prot ines au niveau du promoteur afin que la transcription puisse commencer. Comme nous l'avons vu au chapitre 4, l' tat par d faut de la chromatine est une fibre condens e (voir Figure 4-28), et il est probable que ce soit la forme d'ADN sur laquelle la plupart des transcriptions sont initi es. Pour simplifier, la chromatine n'est pas repr sent e sur cette figure. transcrire un g ne encore et encore une fois qu'il est devenu actif pour la premi re fois. Il peut galement tre utilis pour coordonner l' longation de la transcription avec le traitement de l'ARN tel qu'il merge de l'ARN polym rase, un sujet que nous aborderons plus loin dans ce chapitre. Il existe encore un autre obstacle l'allongement des ARN polym rases, la fois bact riennes et eucaryotes, qui s'applique galement aux ADN polym rases, comme nous l'avons vu au chapitre 5 (voir Figure 5-20). Pour d crire ce probl me plus en d tail, nous devons d'abord consid rer une propri t subtile inh rente la double h lice de l'ADN appel e superenroulement de l'ADN. Le superenroulement de l'ADN est le nom donn une conformation que l'ADN adopte en r ponse la tension superh lico dale ; alternativement, la cr ation de boucles ou de bobines dans une mol cule d'ADN double h lice peut cr er une telle tension. La figure 6 19 illustre pourquoi. Il y a environ 10 paires de nucl otides pour chaque tour h lico dal d'une double h lice d'ADN. Si nous imaginons une h lice dont les deux extr mit s sont fix es l'une par rapport l'autre (comme elles le sont dans un cercle d'ADN, comme un chromosome bact rien, ou dans une boucle troitement serr e, comme on pense qu'il existe dans les chromosomes eucaryotes), une grande superbobine d'ADN se formera pour compenser chaque 10 paires de nucl otides qui sont ouvertes (d roul es). La formation de cette superbobine est nerg tiquement favorable car elle restaure une torsion h lico dale normale aux r gions appari es de base qui restent, qui auraient autrement besoin d' tre enroul es en raison des extr mit s fixes. L'ARN polym rase cr e une tension superh lico dale lorsqu'elle se d place le long d'un tron on d'ADN ancr ses extr mit s (voir Figure 6 19C). Tant que la polym rase n'est pas libre de tourner rapidement (ce qui est peu probable compte tenu de la taille des ARN polym rases et de leurs transcrits attach s), une polym rase en mouvement g n re une tension superh lico dale positive dans l'ADN devant elle et une tension h lico dale n gative derri re elle. Pour les eucaryotes, on pense que cette situation offre un bonus : bien que la tension superh lico dale positive en avant de la polym rase forme l'h lice de l'ADN ADN extr mit libre ADN extr mit s fx es Figure 6 19 La tension superh lico dale de l'ADN provoque le surenroulement de l'ADN. (A) Pour une mol cule d'ADN une extr mit libre (ou une entaille dans un brin qui sert de pivot), la double h lice de l'ADN tourne d'un tour pour chaque 10 paires de nucl otides ouvertes. (B) Si la rotation est emp ch e, la tension superh lico dale est introduite dans l'ADN par l'ouverture de l'h lice. Dans l'exemple pr sent , l'h lice d'ADN contient 10 spires h lico dales, dont l'une est ouverte. Une fa on de s'adapter la tension cr e serait d'augmenter la torsion h lico dale de 10 11 paires de nucl otides par tour dans la double h lice qui reste. L'h lice d'ADN, cependant, r siste une telle d formation de mani re lastique, pr f rant soulager la tension superh lico dale en se pliant en boucles super-enroul es. En tant que r sultat, une superbobine d'ADN se forme dans la double h lice de l'ADN pour chaque 10 paires de nucl otides ouvertes. La superbobine form e dans ce cas est une superbobine positive. (C) Le surenroulement de l'ADN est induit par un suivi prot ique travers la double h lice de l'ADN. Les deux extr mit s de l'ADN montr es ici sont incapables de tourner librement l'une par rapport l'autre, et on suppose que la mol cule de prot ine est galement emp ch e de tourner librement lorsqu'elle se d place. Dans ces conditions, le mouvement de la prot ine provoque l'accumulation d'un exc s de tours h lico daux dans l'h lice de l'ADN devant la prot ine et l'apparition d'un d ficit de tours h lico daux dans l'ADN derri re la prot ine, comme on le voit. plus difficile ouvrir, la tension devrait faciliter le d ballage partiel de l'ADN dans les nucl osomes, dans la mesure o la lib ration de l'ADN du noyau d'histones permet de rel cher cette tension. Toute prot ine qui se propulse seule le long d'un brin d'ADN d'une double h lice, comme une h licase d'ADN ou une ARN polym rase, a tendance g n rer une tension superh lico dale. Chez les eucaryotes, les enzymes de l'ADN topoisom rase liminent rapidement cette tension superh lico dale (voir pp. 251-253). Mais chez les bact ries, une topoisom rase sp cialis e appel e ADN gyrase utilise l' nergie de l'hy
Biologie moléculaire de la cellule	drolyse de l'ATP pour pomper en continu des superbobines dans l'ADN, maintenant ainsi l'ADN sous tension constante. Il s'agit de superbobines n gatives, ayant l'inverse des superbobines positives qui se forment lorsqu'une r gion de l'h lice de l'ADN s'ouvre (voir Figure 6-19B). Chaque fois qu'une r gion d'h lice s'ouvre, elle supprime ces superbobines n gatives de l'ADN bact rien, r duisant ainsi la tension superh lico dale. L'ADN gyrase rend donc l'ouverture de l'h lice d'ADN chez les bact ries nerg tiquement favorable par rapport l'ouverture de l'h lice dans l'ADN qui n'est pas surenroul . Pour cette raison, il facilite les processus g n tiques chez les bact ries, tels que l'initiation de la transcription par l'ARN polym rase bact rienne, qui n cessitent l'ouverture de l'h lice (voir Figure 6-11). L' longation de la transcription chez les eucaryotes est troitement li e au traitement de l'ARN Nous avons vu que les ARNm bact riens sont synth tis s par l'ARN polym rase en commen ant et en s'arr tant des endroits sp cifiques du g nome. La situation chez les eucaryotes est sensiblement diff rente. En particulier, la transcription n'est que la premi re de plusieurs tapes n cessaires la production d'une mol cule d'ARNm mature. D'autres tapes critiques sont la modification covalente des extr mit s de l'ARN et l' limination des s quences d'intron qui sont limin es du milieu du transcrit de l'ARN par le processus d' pissage de l'ARN (Figure 6 20). Les deux extr mit s des ARNm eucaryotes sont modifi es : par coiffage l'extr mit 5 et par polyad nylation l'extr mit 3 (Figure 6-21). Ces extr mit s sp ciales permettent la cellule d' valuer si les deux extr mit s d'une mol cule d'ARNm sont pr sentes (et si le message est donc intact) avant d'exporter l'ARN du noyau et de le traduire Figure 6 20 Comparaison des tapes menant du g ne la prot ine chez les eucaryotes et les bact ries. Le niveau final d'une prot ine dans la cellule d pend de l'efficacit de chaque tape et des taux de d gradation des mol cules d'ARN et de prot ines. (A) Dans les cellules eucaryotes, la mol cule d'ARNm r sultant de la transcription contient la fois des s quences codantes (exon) et non codantes (intron). Avant de pouvoir tre traduit en prot ine, les deux extr mit s de l'ARN sont modifi es, les introns sont limin s par une r action d' pissage de l'ARN catalys e enzymatiquement, et l'ARNm r sultant est transport du noyau au cytoplasme. Pour plus de commodit , les tapes de cette figure sont repr sent es comme se d roulant une la fois ; En r alit , beaucoup se produisent simultan ment. Par exemple, la coiffe d'ARN est ajout e et l' pissage commence avant la fin de la transcription. En raison du couplage entre la transcription et le traitement de l'ARN, les transcrits primaires intacts les ARN complets qui, en th orie, seraient produits si aucun traitement n'avait eu lieu ne sont que rarement trouv s. (B) Chez les procaryotes, la production d'ARNm est beaucoup plus simple. L'extr mit 5 d'une mol cule d'ARNm est produite par l'initiation de la transcription, et l'extr mit 3 est produite par la fin de la transcription. tant donn que les cellules procaryotes n'ont pas de noyau, la transcription et la traduction ont lieu dans un compartiment commun, et la traduction d'un ARNm bact rien commence souvent avant que sa synth se ne soit termin e. fin de la s quence de la s quence primaire de transcrit de la 7-m thylguanosine non codante de l'ARNm procaryote 5 Figure 6 21 Comparaison des structures des mol cules d'ARNm procaryotes et eucaryotes. (A) Les extr mit s 5 et 3 d'un ARNm bact rien sont les extr mit s non modifi es de la cha ne synth tis e par l'ARN polym rase, qui initie et termine la transcription ces points, respectivement. Les extr mit s correspondantes d'un ARNm eucaryote sont form es par l'ajout d'une coiffe 5 et par le clivage du transcrit pr -ARNm pr s de l'extr mit 3 et l'ajout d'une queue poly-A, respectivement. La figure illustre galement une autre diff rence entre les ARNm procaryotes et eucaryotes : les ARNm bact riens peuvent contenir les instructions pour plusieurs prot ines diff rentes, tandis que les ARNm eucaryotes contiennent presque toujours les informations pour une seule prot ine. (B) La structure de la coiffe l'extr mit 5 des mol cules d'ARNm eucaryotes. Notez la liaison inhabituelle de 5 5 du 7-m thyle G avec le reste de l'ARN. De nombreux ARNm eucaryotes portent une modification suppl mentaire : la m thylation du groupe 2-hydroxyle du sucre ribose l'extr mit 5 du transcrit primaire (voir Figure 6 23). en prot ines. L' pissage de l'ARN relie les diff rentes parties d'une s quence codant pour une prot ine, et il donne aux eucaryotes la capacit de synth tiser plusieurs prot ines diff rentes partir du m me g ne. Une strat gie simple a volu pour coupler toutes les tapes de traitement de l'ARN ci-dessus l' longation de la transcription. Comme nous l'avons vu pr c de
Biologie moléculaire de la cellule	mment, une tape cl de l'initiation de la transcription par l'ARN polym rase II est la phosphorylation de la queue de l'ARN polym rase II, galement appel e CTD (domaine C-terminal). Cette phosphorylation, qui se d roule progressivement au fur et mesure que l'ARN polym rase initie la transcription et se d place le long de l'ADN, aide non seulement dissocier l'ARN polym rase II des autres prot ines pr sentes au point de d part de la transcription, mais permet galement un nouvel ensemble de prot ines de s'associer la queue de l'ARN polym rase qui fonctionnent dans l' longation de la transcription et le traitement de l'ARN. Comme nous le verrons plus loin, on pense que certaines de ces prot ines de traitement sautent de la queue de la polym rase sur la mol cule d'ARN naissante pour commencer la traiter lorsqu'elle merge de l'ARN polym rase. Ainsi, nous pouvons voir l'ARN polym rase II dans son mode d' longation comme une usine d'ARN qui non seulement se d place le long de l'ADN en synth tisant une mol cule d'ARN, mais traite galement l'ARN qu'elle produit (Figure 6 22). Compl tement tendu, le CTD est pr s de 10 fois plus long que le reste de l'ARN polym rase. En tant que domaine prot ique flexible, il sert d' chafaudage ou d'attache, tenant une vari t de prot ines proximit afin qu'elles puissent agir rapidement en cas de besoin. Cette strat gie, qui acc l re consid rablement le rythme global d'une s rie de r actions cons cutives, est couramment utilis e dans la cellule (voir les figures 4-58 et 16-18). Le capping de l'ARN est la premi re modification des pr -ARNm eucaryotes D s que l'ARN polym rase II a produit environ 25 nucl otides d'ARN, l'extr mit 5 de la nouvelle mol cule d'ARN est modifi e par l'ajout d'une coiffe constitu e d'un nucl otide de guanine modifi (voir Figure 6 21B). Trois enzymes, agissant successivement, effectuent la r action de coiffage : l'une (une phosphatase) limine un phosphate de l'extr mit 5 de l'ARN naissant, une autre (une guanyl transf rase) ajoute une GMP dans Figure 6-22 L'ARN polym rase II eucaryote en tant qu' usine ARN . Lorsque la polym rase transcrit l'ADN en ARN, elle porte sur sa queue des prot ines de traitement de l'ARN qui sont transf r es l'ARN naissant au moment opportun. La queue contient 52 r p titions en tandem d'une s quence de sept acides amin s, et il y a deux s rines dans chaque r p tition. Les prot ines de coiffage se lient d'abord la queue de l'ARN polym rase lorsqu'elle est phosphoryl e sur Ser5 de la r p tition de l'heptade tard dans le processus d'initiation de la transcription (voir Figure 6 15). Cette strat gie garantit que la mol cule d'ARN est efficacement coiff e d s que son extr mit 5' merge de l'ARN polym rase. Au fur et mesure que la polym rase continue de transcrire, sa queue est largement phosphoryl e sur les positions Ser2 par une kinase associ e la polym rase allong e et est finalement d phosphoryl e sur les positions Ser5. Ces modifications suppl mentaires attirent des prot ines d' pissage et de traitement 3 extr mit s de la polym rase en mouvement, les positionnant pour agir sur l'ARN nouvellement synth tis lorsqu'il merge de l'ARN polym rase. Il existe de nombreuses enzymes de traitement de l'ARN, et toutes ne voyagent pas avec la polym rase. Pour l' pissage de l'ARN, par exemple, la queue ne porte que quelques composants critiques ; une fois transf r s une mol cule d'ARN, ils servent de site de nucl ation pour les composants restants. Lorsque l'ARN polym rase II a fini de transcrire un g ne, il est lib r de l'ADN, les phosphatases solubles liminent les phosphates sur sa queue et il peut relancer la transcription. Seule la forme enti rement d phosphoryl e de l'ARN polym rase II est capable de commencer la synth se de l'ARN au niveau d'un promoteur. une liaison inverse (5 5 au lieu de 5 3), et une troisi me (m thyltransf rase) ajoute un groupe m thyle la guanosine (figures 6-23). Parce que les trois enzymes se lient la queue de l'ARN polym rase phosphoryl e en position Ser5 la modification ajout e par TFIIH lors de l'initiation de la transcription elles sont pr tes modifier l'extr mit 5 du transcrit naissant d s qu'il merge de la polym rase. La coiffe 5m thyle signifie l'extr mit 5 des ARNm eucaryotes, et ce point de rep re aide la cellule distinguer les ARNm des autres types de mol cules d'ARN pr sentes dans la cellule. Par exemple, les ARN polym rases I et III produisent des ARN non coiff s pendant la transcription, en partie parce que ces polym rases n'ont pas de CTD. Dans le noyau, la coiffe se lie un complexe prot ique appel CBC (cap-binding complex), qui, comme nous le verrons dans les sections suivantes, aide un futur ARNm tre trait et export . La coiffe 5m thyle joue galement un r le important dans la traduction des ARNm dans le cytosol, comme nous le verrons plus loin dans le chapitre. 5 fin de la transcription de l'ARN naissant Comme nous l'a
Biologie moléculaire de la cellule	vons vu au chapitre 4, les s quences codant pour les prot ines des g nes eucaryotes sont g n ralement interrompues par des s quences interm diaires non codantes (introns). D couverte en 1977, cette caract ristique des g nes eucaryotes a surpris les scientifiques, qui ne connaissaient jusque-l que les g nes bact riens, qui consistent g n ralement en un tron on continu d'ADN codant qui est directement transcrit en ARNm. En contraste marqu , les g nes eucaryotes se sont r v l s tre divis s en petits morceaux de s quence codante (s quences exprim es ou exons) entrecoup s de s quences interm diaires ou d'introns beaucoup plus longs ; ainsi, la partie codante d'un g ne eucaryote n'est souvent qu'une petite fraction de la longueur du g ne (Figure 6 24). Les s quences d'intron et d'exon sont transcrites en ARN. Les s quences d'intron sont retir es de l'ARN nouvellement synth tis par le processus d' pissage de l'ARN. La grande majorit de l' pissage de l'ARN qui a lieu dans les cellules fonctionne dans la production d'ARNm, et notre discussion sur l' pissage se concentre sur ce que l'on appelle l' pissage de l'ARNm pr curseur (ou pr -ARNm). Ce n'est qu'apr s que l'ajout du groupe m thyle aux 5 et 3 extr mit s a eu lieu et que l'app t de la base est appel ARNm. Figure 6 23 Les r actions qui coiffent l'extr mit 5 de chaque mol cule d'ARN synth tis e par l'ARN polym rase II. La coiffe finale contient une nouvelle liaison 5' 5' ajouter un groupe m thyle au ribose entre le r sidu 7-m thyl G charg positivement et l'extr mit 5' du transcrit d'ARN (voir Figure 6-21B). La lettre N repr sente l'un des quatre ribonucl otides, bien que le nucl otide qui commence une cha ne d'ARN soit g n ralement une purine (un A ou un G). (D'apr s A.J. Shatkin, BioEssays 7:275-277, 1987. Avec l'autorisation de Wiley-Liss, Inc., une filiale de John Wiley & Sons, Inc.) Exons CH3 2000 200 000 paires de nucl otides Chaque v nement d' pissage limine un intron, proc dant deux r actions s quentielles de transfert de phosphoryle appel es transest rifications ; ceux-ci relient deux exons tout en retirant l'intron entre eux sous forme de lariat (Figure 6 25). La machinerie qui catalyse l' pissage des pr -ARNm est complexe, compos e de cinq mol cules d'ARN suppl mentaires et de plusieurs centaines de prot ines, et elle hydrolyse de nombreuses mol cules d'ATP par pissage. Cette complexit garantit que l' pissage est pr cis, tout en tant suffisamment flexible pour faire face l' norme vari t d'introns trouv s dans une cellule eucaryote typique. Il peut sembler inutile d' liminer un grand nombre d'introns par pissage de l'ARN. En tentant d'expliquer pourquoi cela se produit, les scientifiques ont soulign que l'arrangement exon-intron semblerait faciliter l' mergence de prot ines nouvelles et utiles sur des chelles de temps volutives. Ainsi, la pr sence de nombreux introns dans l'ADN permet la recombinaison g n tique de combiner facilement les exons de diff rents g nes, permettant aux g nes de nouvelles prot ines d' voluer plus facilement par la combinaison de parties de g nes pr existants. L'observation, d crite au chapitre 3, que de nombreuses prot ines dans les cellules actuelles ressemblent des patchworks compos s d'un ensemble commun de domaines prot iques, soutient cette id e (voir pp. 121-122). L' pissage de l'ARN pr sente galement un avantage actuel. Le les transcrits de nombreux g nes eucaryotes (estim s 95 % des g nes chez l'homme) sont piss s de plus d'une fa on, permettant ainsi au m me g ne de produire un ensemble correspondant de prot ines diff rentes (Figure 6 26). Plut t que d' tre le processus de gaspillage qu'il aurait pu sembler premi re vue, l' pissage de l'ARN permet aux eucaryotes d'augmenter le potentiel de codage de leurs g nomes. Nous reviendrons sur cette id e dans ce chapitre et dans le suivant, mais nous devons d'abord d crire la machinerie cellulaire qui accomplit cette t che remarquable. O(A) (B) 5 5 AOH AHO 3 5 exon s quence intron 3 exon 2 Figure 6 24 Structure de deux g nes humains montrant l'arrangement des exons et des introns. (A) Le g ne relativement petit de la -globine, qui code pour une sous-unit de l'h moglobine, une prot ine transportant l'oxyg ne, contient 3 exons (voir aussi Figure 4-7). (B) Le g ne du facteur VIII, beaucoup plus grand, contient 26 exons ; il code pour une prot ine (facteur VIII) qui fonctionne dans la voie de coagulation sanguine. La forme la plus r pandue d'h mophilie r sulte de mutations de ce g ne. Figure 6 25 La r action d' pissage du pr -ARNm. (A) Dans la premi re tape, un nucl otide d'ad nine sp cifique dans la s quence de l'intron (indiqu en rouge) attaque le site d' pissage 5 et coupe le squelette sucre-phosphate de l'ARN ce stade. L'extr mit 5' coup e de l'intron devient li e de mani re covalente au nucl otide ad nine, comme indiqu en d tail en (B), cr ant ainsi une boucle dans la mol cule d'ARN. L'extr mit libre 3 -OH lib r e de
Biologie moléculaire de la cellule	la s quence d'exons r agit ensuite avec le d but de la s quence d'exons suivante, joignant les deux exons ensemble et lib rant la s quence d'intron sous la forme d'un lariat. Les deux s quences d'exons sont ainsi jointes en une s quence de codage continue. La s quence d'intron lib r e est finalement d compos e en nucl otides uniques, qui 5 3 sont recycl s. TRANSCRIPTION, PISSAGE ET CLIVAGE/POLYAD NYLATION 3 Le m canisme d' pissage du pr -ARNm illustr la figure 6-24 exige que la machinerie d' pissage reconnaisse trois parties de la mol cule d'ARN pr curseur : le site d' pissage 5, le site d' pissage 3 et le point de branche dans la s quence d'intron qui forme la base du lariat excis . Il n'est pas surprenant que chaque site ait une s quence nucl otidique consensuelle qui est similaire d'un intron l'autre et fournit la cellule des indices sur l'endroit o l' pissage doit avoir lieu (Figure 6 27). Cependant, ces s quences consensus sont relativement courtes et peuvent s'adapter une grande variabilit de s quence ; comme nous le verrons sous peu, la cellule int gre des types d'informations suppl mentaires pour finalement choisir exactement o , sur chaque mol cule d'ARN, l' pissage doit avoir lieu. La grande variabilit des s quences consensuelles d' pissage repr sente un d fi particulier pour les scientifiques qui tentent de d chiffrer les s quences du g nome. La taille des introns varie d'environ 10 nucl otides plus de 100 000 nucl otides, et choisir les limites pr cises de chaque intron est une t che difficile, m me avec l'aide d'ordinateurs puissants. La possibilit d'un pissage alternatif aggrave le probl me de la pr diction des s quences prot iques uniquement partir d'une s quence g nomique. Cette difficult est l'un des principaux obstacles l'identification de tous les g nes d'une s quence g nomique compl te, et c'est l'une des principales raisons pour lesquelles nous ne connaissons que le nombre approximatif de prot ines diff rentes produites par le g nome humain. L' pissage de l'ARN est effectu par l' pissage Contrairement aux autres tapes de la production d'ARNm que nous avons abord es, les tapes cl s de l' pissage de l'ARN sont effectu es par des mol cules d'ARN plut t que par des prot ines. Les mol cules d'ARN sp cialis es reconnaissent les s quences nucl otidiques qui sp cifient o l' pissage doit se produire et catalysent galement la chimie de l' pissage. Ces mol cules d'ARN sont relativement courtes (moins de 200 nucl otides chacune), et il y en a cinq, U1, U2, U4, U5 et U6. Connu sous le nom de snRNA (small nuclear RNAs), chacun est complex avec au moins sept sous-unit s prot iques pour former un snRNP (small nuclear ribonucleoprotein). AG GURAGU YURAC .... YYYYYYYYYY G G 5 3 partie d'un transcrit primaire exon 1 intron exon 2 partie de l'ARNm exon 1 exon 2Figure 6 26 pissage alternatif du g ne -tropomyosine chez le rat. -tropomyosine est une prot ine enroul e (voir Figure 3-9) qui effectue plusieurs t ches, notamment la r gulation de la contraction dans les cellules musculaires. Le transcrit primaire peut tre piss de diff rentes mani res, comme indiqu sur la figure, pour produire des ARNm distincts, qui donnent ensuite naissance des prot ines variantes. Certains des mod les d' pissage sont sp cifiques certains types de cellules. Par exemple, la -tropomyosine produite dans le muscle stri est diff rente de celle fabriqu e partir du m me g ne dans le muscle lisse. Les pointes de fl ches dans la partie sup rieure de la figure marquent les sites o le clivage et l'ajout de poly-A forment les 3 extr mit s des ARNm matures. Figure 6 27 Les s quences nucl otidiques consensuelles d'une mol cule d'ARN qui signalent le d but et la fin de la plupart des introns chez l'homme. Les trois blocs de s quences nucl otidiques illustr s sont n cessaires pour liminer une s quence d'introns. Ici, A, G, U et C sont les nucl otides standard de l'ARN ; R signifie purines (A ou G) ; et Y signifie pyrimidines (C ou U). Le A surlign en rouge forme le point de branche du lariat produit par pissage (voir figure 6-25). Seuls le GU au d but de l'intron et le AG sa fin sont des nucl otides invariants dans les s quences de consensus d' pissage. Plusieurs nucl otides diff rents peuvent occuper les positions restantes, bien que les nucl otides indiqu s soient pr f r s. Les distances le long de l'ARN entre les trois s quences consensus d' pissage sont tr s variables ; Cependant, la distance entre le point de d rivation et la jonction 3 est g n ralement beaucoup plus courte que celle entre la jonction 5 et le point de branchement. Ces snRNP forment le c ur de l' pissage, le grand assemblage de mol cules d'ARN et de prot ines qui effectue l' pissage des pr -ARNm dans la cellule. Au cours de la r action d' pissage, la reconnaissance de la jonction d' pissage 5, du site de branchement et de la jonction d' pissage 3 est r alis e en grande partie par appariement de
Biologie moléculaire de la cellule	bases entre les ARNsn et les s quences d'ARN consensus dans le substrat pr -ARNm. L' pissage est une machine complexe et dynamique. Lorsqu'ils sont tudi s in vitro, quelques composants de l' pissage s'assemblent sur le pr -ARNm et, au fur et mesure que la r action d' pissage se poursuit, de nouveaux composants entrent et ceux qui ont d j accompli leur t che sont largu s (Figure 6 28). Cependant, de nombreux scientifiques pensent qu' l'int rieur de la cellule, l' pissage est un assemblage l che et pr existant de tous les composants capturant, pissant et lib rant l'ARN en tant qu'unit coordonn e, et subissant des r arrangements importants chaque fois qu'un pissage est effectu . partie intronique d'un transcrit de pr -ARNm 5 3 U1, U4 a excis la s quence d'intron sous la forme d'un lariat 3 (l'ARN de l'intron sera d grad dans le noyau ; les snRNP exon 1 exon 2 Le snRNP U1 forme des paires de bases avec la jonction d' pissage 5 (voir Figure 6 29) et la BBP (prot ine de liaison au point de branche) et U2AF (facteur auxiliaire U2) reconnaissent le site du point de branche. Le snRNP U2 d place BBP et U2AF et forme des paires de bases avec la s quence de consensus du site de branche-point. Le triple snRNP U4/U6 U5 entre dans la r action. Dans ce triple snRNP, les snRNA U4 et U6 sont maintenus ensemble par des interactions de paires de bases. Des r arrangements ult rieurs brisent les paires de bases U4/U6, permettant U6 de d placer U1 la jonction d' pissage 5 (voir Figure 6 29). Cela cr e le site actif qui catalyse la premi re r action de phosphoryl-transf rase. Des r arrangements ARN-ARN suppl mentaires cr ent le site actif pour la deuxi me r action de phosphoryl-transf rase, qui compl te ensuite l' pissage (voir Figure 6-25A). Figure 6 28 Le m canisme d' pissage des pr -ARNm. L' pissage de l'ARN est catalys par un assemblage de snRNP (illustr sous forme de cercles color s) ainsi que d'autres prot ines (dont la plupart ne sont pas repr sent es), qui constituent ensemble l' pissage. L' pissage reconna t les signaux d' pissage sur une mol cule de pr -ARNm, rapproche les deux extr mit s de l'intron et fournit l'activit enzymatique pour les deux tapes de r action requises (voir la figure 6-25A et la vid o 6.5). Comme indiqu , un ensemble de prot ines appel complexe de jonction exon (EJC) reste sur la mol cule d'ARNm piss e ; Son r le ult rieur sera discut sous peu. L' pissage utilise l'hydrolyse de l'ATP pour produire une s rie complexe de r arrangements ARN-ARN L'hydrolyse de l'ATP n'est pas n cessaire pour la chimie de l' pissage de l'ARN en soi, car les deux r actions de transest rification pr servent les liaisons phosphate haute nergie. Cependant, une hydrolyse extensive de l'ATP est n cessaire pour l'assemblage et les r arrangements de l' pissage. Certaines des prot ines suppl mentaires qui composent le splic osome utilisent l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP pour briser les interactions ARN-ARN existantes afin de permettre la formation de nouvelles. Chaque pissage r ussi n cessite environ 200 prot ines, si l'on inclut celles qui forment les snRNP. Quel est le but de ces r arrangements ? Tout d'abord, ils permettent d'examiner les signaux d' pissage sur le pr -ARN par les snRNP plusieurs fois au cours de l' pissage. Par exemple, le snRNP U1 reconna t initialement le site d' pissage 5' par appariement de bases conventionnel ; au fur et mesure que l' pissage se poursuit, ces paires de bases sont rompues (en utilisant l' nergie de l'hydrolyse de l'ATP) et U1 est remplac par U6 (Figure 6 29). Ce type de r arrangement ARN-ARN (dans lequel la formation d'une interaction ARN-ARN n cessite la perturbation d'une autre) se produit plusieurs fois pendant l' pissage et permet aux pissages de v rifier et de rev rifier les signaux d' pissage, augmentant ainsi la pr cision globale de l' pissage. Deuxi mement, les r arrangements qui ont lieu dans l' pissage cr ent les sites actifs pour les deux r actions de transest rification. Ces deux sites actifs sont cr s, l'un apr s l'autre, et seulement apr s que les signaux d' pissage sur le pr -ARNm aient t v rifi s plusieurs reprises. Cette progression ordonn e garantit que les accidents d' pissage ne se produisent que rarement. L'une des caract ristiques les plus surprenantes de l' pissage est la nature des sites catalytiques : ils sont form s la fois par des mol cules de prot ines et d'ARN, bien que les mol cules d'ARN catalysent la chimie r elle de l' pissage. Dans la derni re section de ce chapitre, nous abordons en termes g n raux les propri t s structurelles et chimiques des mol cules d'ARN qui leur permettent d'agir comme catalyseurs. Une fois la chimie d' pissage termin e, les snRNP restent li s au lariat. Le d sassemblage de ces snRNP du lariat (et les uns des autres) n cessite une autre s rie de r arrangements ARN-ARN qui n cessitent une hydrolyse de l'ATP, ramenant ainsi les snRNA leur configuration d'origine afi
Biologie moléculaire de la cellule	n qu'ils puissent tre r utilis s dans une nouvelle r action. la fin d'un pissage, l' pissage dirige un ensemble de prot ines pour qu'elles se lient l'ARNm pr s de la position pr c demment occup e par l'intron. Appel es complexes de jonction d'exon (EJC), ces prot ines marquent le site d'un v nement d' pissage r ussi et, comme nous le verrons plus loin dans ce chapitre, influencent le destin ult rieur de l'ARNm. D'autres propri t s du pr -ARNm et de sa synth se aident expliquer le choix des sites d' pissage appropri s Comme nous l'avons vu, les s quences d'introns varient norm ment en taille, certaines d passant 100 000 nucl otides. Si la s lection du site d' pissage tait d termin e uniquement par les snRNP agissant sur une mol cule d'ARN pr form e et sans prot ine, nous nous attendrions des erreurs d' pissage fr quentes, telles que le saut d'exon et l'utilisation de sites d' pissage cryptiques (Figure 6 30). Les m canismes de fid lit int gr s dans l' pissage pour supprimer les erreurs sont toutefois compl t s par deux strat gies suppl mentaires qui augmentent encore la pr cision de l' pissage. La premi re est une cons quence simple du couplage de l' pissage la transcription. Au fur et mesure que la transcription se poursuit, la queue phosphoryl e de l'ARN polym rase porte plusieurs composants de l' pissage (voir Figure Figure 6 29 L'un des nombreux r arrangements qui ont lieu dans l' pissage du pr -ARNm. Cet exemple provient de la levure Saccharomyces cerevisiae, chez laquelle les s quences nucl otidiques impliqu es sont l g rement diff rentes de celles des cellules humaines. L' change de snRNP U1 contre U6 snRNP se produit juste avant la premi re r action de transfert de phosphoryle (voir Figure 6 28). Cet change n cessite que le site d' pissage 5 soit lu par deux snRNP diff rents, augmentant ainsi la pr cision de la s lection du site d' pissage 5 par l' pissage. partie de l'exon 2 exon 1 exon 3 exon 1 6 22), et ces composants sont transf r s directement de la polym rase la L'ARN en tant qu'ARN merge de la polym rase. Cette strat gie aide la cellule garder une trace des introns et des exons : par exemple, les snRNP qui s'assemblent un site d' pissage 5 ne sont initialement pr sent s qu'avec le seul site d' pissage 3 qui merge ensuite de la polym rase ; Les sites potentiels plus en aval n'ont pas encore t valu s. La coordination de la transcription avec l' pissage est particuli rement importante pour viter un saut d'exon inappropri . Une strat gie appel e d finition de l'exon aide galement les cellules choisir les sites d' pissage appropri s. La taille des exons a tendance tre beaucoup plus uniforme que la taille des introns, avec une moyenne d'environ 150 paires de nucl otides chez une grande vari t d'organismes eucaryotes (figures 6 31). Gr ce la d finition des exons, la machinerie d' pissage peut rechercher les s quences d'exons de taille relativement homog ne. Au fur et mesure que la synth se de l'ARN se poursuit, un groupe de composants suppl mentaires (notamment les prot ines SR, ainsi nomm es parce qu'elles aident marquer chaque site d' pissage 3 et 5, en commen ant l'extr mit 5 de l'ARN (Figure 6-32). Ces prot ines, leur tour, recrutent l'ARNsn U1, qui marque la limite de l'exon en aval, et l'ARNnb U2, qui sp cifie l'ARNn en amont. En marquant sp cifiquement les exons de cette mani re et en tirant ainsi parti de la taille relativement uniforme des exons, la cellule augmente la pr cision avec laquelle elle d pose les composants d' pissage initiaux sur l'ARN naissant et vite ainsi les sites d' pissage vit s de justesse . La fa on dont les prot ines SR discriminent les s quences d'exons des s quences d'intron n'est pas comprise en d tail ; cependant, on sait que certaines des prot ines SR se lient pr f rentiellement des s quences d'ARN sp cifiques dans les exons, appel es amplificateurs d' pissage. En principe, tant donn que n'importe lequel des nombreux codons diff rents peut tre utilis pour coder pour un acide amin donn , il est possible de faire voluer la s quence nucl otidique de l'exon de mani re former un site de liaison pour une prot ine SR, sans n cessairement affecter la s quence d'acides amin s sp cifi e par l'exon. Le marquage des limites de l'exon et de l'intron et l'assemblage du c osome de l' pi commencent sur une mol cule d'ARN alors qu'elle est encore allong e par l'ARN polym rase son extr mit 3. Cependant, la chimie r elle de l' pissage peut avoir lieu plus tard. Ce retard signifie que les s quences d'intron ne sont pas n cessairement retir es d'une mol cule de pr -ARNm dans l'ordre dans lequel elles se produisent le long de la cha ne d'ARN. Figure 6 30 Deux types d'erreurs d' pissage. (A) Saut d'exon. (B) S lection cryptique du site d' pissage. Les signaux d' pissage cryptiques sont des s quences nucl otidiques d'ARN qui ressemblent troitement de v ritables signaux d' pissage et sont parfois util

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